CN115245575B - 血管平滑肌细胞特异性ddx24及其下游分子在血管发育中的应用 - Google Patents

血管平滑肌细胞特异性ddx24及其下游分子在血管发育中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及血管平滑肌细胞(VSMC)特异性DDX24及其下游分子在血管发育中的应用。发现DDX24敲低通过使细胞周期停滞在G1期而抑制VSMC增殖，VSMC中的DDX24通过直接结合和稳定范可尼贫血互补组蛋白A(FANCA)mRNA来调节FANCA的表达。敲低FANCA也影响了VSMC的细胞周期和增殖，而过表达FANCA减轻了VSMC中由于DDX24缺乏引起的缺陷。本发明为DDX24在VSMC介导的血管发育中起关键作用提供了首要证据，并为VSMC相关病理状况提供了潜在治疗靶点。

Description

血管平滑肌细胞特异性DDX24及其下游分子在血管发育中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，更具体地，涉及血管平滑肌细胞特异性DDX24及其下游分子在血管发育中的应用。
背景技术
血管平滑肌细胞(VSMC)由于其多功能性和可塑性，在血管发育的各个阶段起着至关重要的作用。在血管发育的早期阶段，VSMC表现出迁移和增殖能力增强。同时，VSMC与内皮细胞(EC)形成丰富的间隙连接，这对于血管成熟和血管重塑至关重要。VSMC发育涉及几种关键的信号通路。例如，血小板衍生生长因子(PDGF-BB)和转化生长因子-β(TGF-β)作为重要的化学引诱剂，在VSMC的增殖和分化中发挥多种功能。这些信号通路缺陷可能导致血管畸形(VM)或其他血管疾病，如冠状动脉疾病，缺血性脑卒中和烟雾病等。因此，确定影响VSMC发育和功能的分子对于提高我们对胚胎发育的理解和治疗相关疾病至关重要。
DEAD-box RNA解旋酶(DDX)主要调控RNA代谢，在无数的生物过程中至关重要，例如细胞生长和器官发育。DDXs表达失调主要见于癌症和颅面疾病。最近的突破揭示了DDXs的关键作用，即认识到DDX21和DDX5在胚胎淋巴管生成和病理性血管重塑中的重要性，但DDXs在VSMC介导的血管发育中的作用仍未确定。之前发现DDX24中的功能丧失突变与内脏或MOVLD综合征的主要血管异常有关。DDX24纯合敲除的小鼠胚胎从胚胎日E 8.5起显示出缺陷，并在E14.5之前死亡，这表明DDX24在胚胎发育中具有不可或缺的作用。然而，DDX24如何参与血管发育和MOVLD致病的具体机制仍待探索。
范可尼贫血互补组蛋白A(FANCA)是范可尼贫血补体组家族的成员，已知其参与DNA修复和复制叉的维持。有关FANCA的血管疾病已从范可尼贫血扩展到其他疾病，包括骨髓(BM)衰竭，发育缺陷和癌症易感性。FANCA敲除小鼠表现出严重的生长劣势和生育能力降低。然而，FANCA在血管发育中的功能及其调节作用机制仍需要被揭开。
发明内容
为了克服现有技术存在的上述问题，本发明提供了DDX24基因或其表达产物与血管平滑肌功能之间的研究内容。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
DDX24基因或其表达产物在制备调控血管平滑肌细胞功能的产品中的应用，所述血管平滑肌细胞功能包括：(1)细胞周期；(2)细胞增殖；(3)细胞分化；和(4)细胞凋亡。
本方法的研究思路如下：本发明首先研究了VSMC中DDX24与胚胎发育的相关性，发现VSMC中(不是EC中)的Ddx24是胚胎发育所必需的；VSMC中Ddx24的敲除会导致胚胎中脉管系统的异常；并通过胚胎实验发现VSMC中的Ddx24敲除可诱导胚胎外组织的血管缺陷。
而后，研究了DDX24对VSMC细胞周期和增殖的调控，同时，进一步探究了DDX24介导的细胞周期调控的分子机制，结果显示DDX24通过与FANCA的mRNA结合来调节VSMC细胞周期并增强其稳定性，FANCA位于DDX24的下游，调节VSMC的细胞周期和增殖功能。
因此，本发明还提供了DDX24基因或其表达产物在制备治疗由血管平滑肌细胞发育异常以及功能失调引起的疾病的功能产品中的应用，所述血管平滑肌细胞功能包括：(1)细胞周期；(2)细胞增殖；(3)细胞分化；和(4)细胞凋亡，所述功能产品对DDX24基因或其表达产物的表达量具有促进作用。
优选的，所述血管平滑肌细胞发育异常以及功能失调引起的疾病包括高血压、动脉粥样硬化、动脉瘤、肺动脉高压、移植血管病、血管成形术后再狭窄、冠状动脉疾病、缺血性脑卒中、烟雾病和血管发育畸形。
优选的，所述功能产品包括以下任一种：
(i)以DDX24或FANCA，或DDX24或FANCA转录本为靶序列，且能够增强以DDX24或FANCA基因表达产物的表达；
(ii)含有DDX24或FANCA，或DDX24或FANCA互补序列且能够在转入体内后形成增强DDX24或FANCA基因表达产物的构建体；
(iii)过表达DDX24或FANCA基因序列的免疫相关细胞、其分化细胞或构建体。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明发现，DDX24敲低通过使细胞周期停滞在G1期而抑制VSMC增殖，VSMC中的DDX24通过直接结合和稳定FANCA mRNA来调节FANCA的表达。敲低FANCA也影响了VSMC的细胞周期和增殖，而过表达FANCA减轻了VSMC中由于DDX24缺乏引起的缺陷。本发明为DDX24在VSMC介导的血管发育中起关键作用提供了首要证据，并为VSMC相关病理状况提供了潜在治疗靶点。
附图说明
图1为VSMC中特异性敲除Ddx24验证，a：获得Tagln-Cre+；Ddx24flox/flox小鼠的交配策略示意图。此策略可产生4种不同的基因型小鼠；b：Tagln-Cre+；Ddx24flox/flox雄鼠与Ddx24flox/flox雌鼠交配所得子代的基因型鉴定；c：免疫荧光染色展示E12.5的对照组CTL和实验组CKO胚胎心脏切片的DDX24敲低验证，红色示DDX24，绿色示ACTA2，蓝色示DAPI；d：免疫荧光染色展示E12.5的CTL和CKO胚胎DA切片的DDX24敲低验证，红色示DDX24，绿色示ACTA2，蓝色示DAPI，比例尺＝20μm；
图2为VSMC特异性敲除DDX24胚胎致死性，a：Tagln-Cre小鼠交配得到的各个时期的各种基因型胚胎的大体展示，其中Tagln-Cre+；Ddx24flox/flox胚胎的尺寸从E12.5开始显著减小；b：头臀长测量对图a胚胎进行大小定量(n＝5个胚胎/组)；c：测量从E10.5到E14.5的存活CKO胚胎百分比；d：Cdh5-Cre交配得到的E13.5各种基因型胚胎的大体展示；e：头臀长测量胚胎大小，*P>0.05(n＝3个胚胎/组)；图e采用非配对t检验统计，n表示b，c和e中的生物学独立样本(胚胎)数，a和d比例尺2mm；
图3为CKO胚胎显示血管缺陷分析，其中，a：全组织免疫荧光染色展示E11.5的CTL和CKO胚胎。红色示IB4，绿色示ACTA2；b，c：对ACTA2+血管面积(b)和头部总血管分支点进行定量(c)(图a)，图b，*P<0.05(n＝3个胚胎/组)；d：对ISV血管长度进行定量*P<0.05(n＝3个胚胎/组)；e，f：对尾部血管面积和总血管分支点进行定量，*P<0.05(n＝3个胚胎/组)；g：免疫荧光染色展示E11.5的CTL和CKO胚胎的横切和纵切的DA形态，红色示IB4，绿色示ACTA2，蓝色示DAPI；h：对DA切片的血管壁厚度进行定量(图g)；i：对DA切片的ACTA2+细胞覆盖率进行定量(图g)，**P<0.01(n＝3个胚胎/组)；以上结果用均数±标准误(mean±s.e.m)展示，图b、c、h和i采用非配对t检验统计，n表示b-f和h-i中的生物学独立样本数(胚胎)；比例尺，100μm(图a)和200μm(图g)；
图4为VSMC中DDX24诱导胚胎外血管重塑分析，a(左图)：E10.5和E11.5时CTL和CKO围绕着YS胚胎的大体展示；a(右图)：卵黄囊的血管长度定量，E10.5，CTL与CKO比较，E10.5：*P<0.05(n＝3个胚胎/组)，E11.5：****P<0.0001(n＝3个胚胎/组)；b(左图)：全组织免疫荧光ACTA2染色展示E10.5和E11.5时CTL和CKO胚胎的卵黄囊；b(右图)：卵黄囊的血管长度定量，E10.5：*P>0.05(n＝3个胚胎/组)，E11.5：*P<0.05(n＝3个胚胎/组)；c：E10.5和E12.5，CTL和CKO胎盘的大体展示；d(左图)：H&E染色展示E10.5和E12.5的CTL和CKO胎盘，虚线标记为的边界，直线表示迷路层的厚度；d(右图)：迷路层的厚度定量，E10.5：*P<0.05(n＝3胚胎)，E12.5：*P<0.05(n＝3个胚胎/组)，LB，迷路层；e(左图)：免疫荧光染色展示E10.5和E12.5 CTL和CKO胚胎胎盘，红色示IB4，绿色示ACTA2；e(右图)：胎盘血管面积的定量，E10.5：*P<0.05(n＝3个胚胎/组)，E12.5：***P<0.001(n＝3个胚胎/组)；以上结果用均数±标准误(mean±s.e.m)展示，图a、b、d和e采用双因素方差分析检验统计，n表示a、b、d和e中的生物独立样本数，比例尺，2mm(a，c)或者200μm(b，d，e)；
图5为DDX24对VSMC细胞周期和增殖的调控分析，a(左侧和中间)：免疫荧光染色展示E11.5的CTL和CKO胚胎的DA和心脏切片情况，红色示EdU，绿色示ACTA2，蓝色示DAPI，白色箭头示血管壁中EdU和ACTA2阳性细胞；a(右图)：EdU和ACTA2阳性细胞的定量(图a)，DA中，*P<0.05(n＝4个胚胎/组)，HT中，*P<0.05(n＝4)；b：细胞流式分析展示从E11.5 CTL和CKO胚胎DA或心脏组织分离细胞的阳性ACTA2细胞，流式细胞图(左)和ACTA2阳性细胞的定量(右)，DA中，CTL和CKO胚胎，*P<0.05(n＝3个胚胎/组)；c：通过PI染色和细胞流式分析展示对从E11.5 CTL和CKO胚胎DA或心脏分离细胞的细胞周期情况，流式细胞图(左)和G1期分布的定量(右)，*P<0.05(n＝3个胚胎/组)；d：气泡图展示对DDX24-siRNA敲低的HUASMC和对照组的RNA测序结果的KEGG通路富集的前10个信号通路，每个气泡代表1个信号通路，其大小代表基因数多少，颜色表示p值，通路按富集因子排名；e-f：通过PI染色和流式进行细胞周期对HUASMC DDX24-siRNA敲低组和对照组细胞进行分析，流式细胞图(e)和细胞周期分布的定量(f)，**P<0.05和**P<0.01，实验进行3次独立重复；g：HUASMC DDX24-siRNA组和对照组细胞的细胞增殖实验，使用Incucyte每4小时测量一次每个细胞系的增殖，****P<0.0001(NC与siDDX24-1)和****P<0.0001(NC与siDDX24-2)，实验进行3次独立重复；图a，b和c通过双因素方差分析检验统计，图f采用配对t检验统计，图e通过重复测量测量方差分析检验统计，n表示图a、b、c、e和g中的生物独立样本数(胚胎)，比例尺，200μm(a)；
图6为CKO胚胎中VSMC功能减弱分析，a：免疫荧光染色展示E11.5的CTL和CKO组胚胎DA和心脏切片情况，红色示EdU，绿色示ACTA2，蓝色示DAPI，DA：**P<0.01和HT：P＝ns(n＝3个胚胎/组)；右图为EdU和ACTA2阳性细胞的定量图，*P<0.05(n＝3个胚胎/组)；b：免疫荧光染色展示E11.5的CTL和CKO组胚胎DA和心脏切片情况，红色示Ki67，绿色示ACTA2，蓝色示DAPI，DA：**P<0.01和HT：*P<0.05(n＝3个胚胎/组)；c：，细胞流式分析展示E11.5 CTL和CKO胚胎心脏组织分离的细胞中阳性ACTA2细胞的数量。流式细胞图(左)和ACTA2阳性细胞的定量(右)，*P>0.05(n＝3个胚胎/组)；d：PI染色和细胞流式分析展示E11.5 CTL和CKO胚胎心脏分离细胞的细胞周期情况，流式细胞图(左)和G1期分布的定量(右)，**P<0.01和P>0.05(n＝3个胚胎/组)，结果用均数±标准误(mean±s.e.m)展示，图a、b、c和d进行非配对t检验统计，比例尺，200μm(a)和20μm(b)；
图7为VSMC中敲低DDX24伴随多数基因下调，a(上图)：免疫荧光染色展示E11.5的CTL和CKO组胚胎DA和心脏切片情况，红色示TUNEL，绿色示ACTA2，蓝色示DAPI；a(下图)：TUNEL和ACTA2阳性细胞的定量，**P<0.01和*P<0.05(n＝3个胚胎/组)；b-c：RT-qPCR检测HUASMC和HUVSMC中DDX24-siRNA敲低组和对照组中DDX24的转录情况，内参基因为GAPDH，***P<0.001和****P<0.0001(n＝3)；d：Western blot检测HUASMC和HUVSMC中DDX24-siRNA敲低组和对照组中的DDX24蛋白质表达水平，内参蛋白为β-actin；e：气泡图展示对DDX24-siRNA敲低的HUVSMC和对照组的RNA测序结果的KEGG通路富集的前10个信号通路，每个气泡代表1个信号通路，其大小代表基因数多少，颜色表示p值大小，通路按富集因子排序；f：PI染色和流式细胞分析对HUVSMC DDX24-siRNA敲低组和对照组细胞进行细胞周期分析和定量，*P<0.05，实验进行3次生物学重复；g：HUVSMC DDX24-siRNA敲低组和对照组的细胞增殖功能测定，使用Incucyte每4小时测量一次每个细胞系的增殖情况。****P<0.0001；图a，b，c和f通过非配对t检验统计，图g通过重复测量方差分析统计，结果用均数±标准误(mean±s.e.m)展示，比例尺，200μm(a)；
图8为在VSMC中DDX24结合和调控FANCA mRNA，a：复杂圆环图展示HUASMC DDX24-siRNA敲低组与对照组细胞RNA测序的KEGG通路富集情况，从外到内为通路名称、基因数、上下调控基因点和富集程度，信号通路根据富因子顺时针排列(从DNA复制开始)，第二个圆形图的颜色表示p值；b：HUASMC DDX24-siRNA敲低组和对照组细胞RNA测序的周期相关基因的差异倍数展示，颜色深浅表示差异倍数大小，范可尼贫血(FA)通路的基因用红色标记；c：Western blot检测HUASMC DDX24-siRNA敲低组和对照组细胞中FANCA蛋白表达水平；d：通过实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)验证RIP-Seq发现的DDX24结合分子，通过input进行标准化，结果用均数±标准误(mean±s.e.m)展示，**P<0.05(每组n＝3)；e：通过RT-qPCR检测添加放线菌素D(50μg/mL)处理后，HUASMC DDX24-siRNA敲低组和对照组细胞中FANCA的转录情况，通过GAPDH进行标准化，***P<0.001(NC versus siDDX24-1)，****P<0.0001(NCversus siDDX24-2)；f：Western blot检测CTL和CKO组胚胎的DA中DDX24，FANCA及VSMC分化标志物ACTA2，CNN1和Smoothelin在E11.5的蛋白质表达水平；g：Western blot检测CTL和CKO胚胎中DDX24和FANCA的蛋白质表达水平，DDX24(****P<0.0001)，FANCA(*P<0.05)，Smoothelin(*P<0.05)(n＝2个胚胎/组)；h：免疫荧光染色展示E11.5的CTL和CKO组胚胎DA中FANCA的蛋白表达情况，红色示FANCA，绿色示ACTA2，蓝色示DAPI，*P<0.05(n＝3)；i-j：通过PI染色对HUASMC DDX24-siRNA敲低组，HUASMC DDX24-siRNA敲低及FANCA-OE过表达组和对照组进行细胞周期分析，流式图(i)和G1分布的定量(j)，**P<0.01和***P<0.001(n＝3)，FA，范可尼贫血，PMOM，黄体酮介导的卵母细胞成熟，ALA，α-亚麻酸；图d和e通过双因素方差分析统计，图g，h和j通过非配对t检验统计，比例尺，200μm(h)；
图9为VSMC中敲低DDX24导致多数基因转录下调分析，a：饼图展示DDX24-siRNA敲低的VSMC细胞和对照组细胞的RNA测序结果中上下调基因的分布情况；b：RT-qPCR检测HUVSMC中DDX24-siRNA敲低组和对照组DDX24和FA通路基因FANCA，FANCB，FANCD2，BRCA1和BRIP1等基因的转录水平，内参基因为GAPDH，**P<0.01,***P<0.001和****P<0.0001(n＝3)；结果用均数±标准误(mean±s.e.m)展示，图b通过非配对t检验统计；
图10为FANCA敲低导致VSMC细胞周期停滞和细胞功能抑制，a-b：免疫荧光染色展示E11.5的CTL和CKO组胚胎DA中FANCA的蛋白表达情况(a)以及荧光强度定量(b)，红色示FANCA，绿色示ACTA2以及蓝色示DAPI，**P<0.01(n＝3个胚胎/组)；c-d：RT-qPCR检测HUVSMC和HUASMC中FANCA-siRNA敲低组和对照组中FANCA的转录情况，内参基因为GAPDH，*P<0.05和***P<0.001(n＝3)；e：PI染色和流式分析对HUVSMC FANCA-siRNA敲低组和对照组细胞进行细胞周期检测和定量。*P<0.05(n＝3)；f-g：HUASMC(f)和HUVSMC(g)FANCA-siRNA敲低组和对照组的细胞增殖试验，使用Incucyte每4小时测量一次每个细胞系的增殖情况。****P<0.0001(n＝＝3)；h-i：HUASMC(h)和HUVSMC(i)FANCA-OE慢病毒过表达FANCA组和对照组细胞增殖试验，使用Incucyte每4小时测量一次每个细胞系的增殖情况，****P<0.0001，进行3次生物学独立重复试验；图b，c，d和e通过非配对t检验统计，图f、g、h和i通过重复测量方差分析统计，结果用均数±标准误(mean±s.e.m)展示。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1 VSMC中DDX24与胚胎发育的相关性研究
1、实验过程：
1.1小鼠育种和基因分型
Tagln-Cre；Ddx24flox/flox小鼠是通过将Ddx24flox/flox小鼠(从Gempharmatech购买)与Tagln-Cre转基因小鼠(从杰克逊实验室购买)杂交而获得的。在进行条件基因灭活实验时，雄性Tagln-Cre；Ddx24flox/+小鼠与雌性Ddx24flox/flox小鼠杂交。所有小鼠品系都保存在C57BL/6背景上。胚胎日(E)0.5被定义为检测到阴道塞的那一天的中午。基因分型是通过聚合酶链反应(PCR)进行的，使用来自小鼠尾巴或胚胎蛋黄囊的基因组DNA。PCR中使用的引物是GCTGCCACGACCAAGTGACAGCAATG和GTAGTTATTCGCATCAGCTACAC。
1.2苏木素/伊红染色和免疫荧光分析
将胚胎用4％多聚甲醛在4℃下过夜固定并包埋在石蜡中。使用徕卡RM2245切片机收集5m的连续切片。按照标准方案进行HE染色，并使用P250μFLASH III获取图像。对于IF，通过使用电饭煲在柠檬酸缓冲液(10mM，pH6.0)中在100℃下加热20分钟，对切片进行脱蜡和抗原修复。在封闭(0.3％Triton+1％BSA+10％山羊血清在PBS中)30分钟后，然后将切片与抗αSM-actin(abcam，抗兔，1：200)，抗IB4(Invitrogen，1：200)，抗Ki67(abcam，抗兔，1：200)或抗DDX24(1：500，抗兔，Bethyl)一起孵育。然后将切片用二抗(488nm抗兔二抗或647nm抗鼠二抗，1：250稀释，Invitrogen)在室温下在封闭缓冲液中稀释1小时染色。将切片浸入封片剂(DAPI)中以可视化细胞核。使用共聚焦显微镜(LSM880，蔡司)对用IF染色的切片进行成像。
1.3全组织免疫荧光染色
将胚胎或卵黄囊固定在4％多聚甲醛(PFA)溶液中15分钟，然后转移到冷PBS中。它们储存在-20℃的甲醇中。为了对脉管系统进行染色，小心地取出胚胎并在PBS中轻轻冲洗组织，在室温下封闭(0.3％Triton+1％BSA+10％山羊血清在PBS中)1小时，然后与Isolectin IB4 Alexa 
Figure BDA0003693414000000092
594染料偶联物(1：200稀释在PBS中，0.3％Triton和0.2％BSA)在4℃下孵育过夜。使用卡尔蔡司LSM 880共聚焦显微镜对胚胎进行成像。
2、实验结果
2.1、VSMC特异性敲除Ddx24诱导胚胎致死性
为了探索DDX24在VSMC发育中的具体作用，通过Ddx24flox/flox转基因小鼠与VSMC特异性Cre小鼠(Tagln-Cre)交配产生Ddx24条件性敲除(CKO)小鼠(见图1a)。来自怀孕胚胎的基因型鉴定验证了Cre和flox的表达(见图1b)。通过对CKO(Tagln-Cre+，Ddx24flox/flox)小鼠组织的免疫荧光分析确认了敲除后DDX24蛋白的表达(见图1c，1d)。
Heterozygote杂合胚胎(Tagln-Cre+；Ddx24flox/+)与对照胚胎(Tagln-Cre+，Ddx24flox/+或Tagln-Cre-，Ddx24flox/+形态上并无明显差异，图2a)。CKO胚胎从E11.5出现形态学改变表现为苍白表型，提示血管形成异常(图2a)。此外，自E12.5以来，通过冠臀长度测量发现突变胚胎的大小与对照胚胎相比显著下降(图2b)，同时CKO胚胎的存活率下降(图2c)。自E14.5开始无表达Tagln-Cre+，Ddx24flox/flox胚胎存活(表1)。这些发现表明，VSMC中的DDX24对于早期胚胎发育是必不可少的。
表1E10.5到E14.5胚胎及出生小鼠的基因型统计
Tagln-Cre+；Ddx24flox/+公鼠和Ddx24flox/flox母鼠交配得到的子代基因型分布
Figure BDA0003693414000000091
Figure BDA0003693414000000101
为了确定内皮DDX24在胚胎发育中是否至关重要，我们将Ddx24flox/flox小鼠与Cdh5-Cre小鼠繁殖，其中Cre重组酶在EC中特异性表达。出乎意料的是，Cdh5-Cre+；Ddx24flox/flox小鼠大多是可存活的，尽管出生率略低于预期比率(数据见表2)。此外，纯合敲除胚胎没有表现出明显形态异常(见图2d，2e)，表明内皮细胞中的Ddx24敲除对胚胎存活和发育影响不大。总之，以上数据表明，VSMC中而不是EC中的Ddx24是胚胎发育所必需的。
表2出生后小鼠的基因型
Cdh5-Cre+；Ddx24flox/+雄性和Cdh5-Cre+；Ddx24flox/+雌性小鼠交配后代的基因型分布
Figure BDA0003693414000000102
2.2、DdX24 CKO胚胎显示血管缺陷
由于CKO胚胎中表型异常和致死性的发生时间与血管发育的时间高度吻合，因此我们试图确定VSMC中DdX24缺乏导致的胚胎致死的根本原因。
免疫染色显示CKO胚胎：1)VSMC覆盖的血管面积减少(图3a，3b)和头部血管分支点减少(图3c)；2)肌节间的血管长度减少(图3d)；和3)尾部血管面积和分支点减少(图3e，3f)。此外，在背主动脉(DA)等主要大血管中，VSMC中Ddx24的下调导致血管壁更薄(图3g，3h)和VSMC覆盖减少(图3i)。综上所述，VSMC中Ddx24的敲除会导致胚胎中脉管系统的异常。
2.3、VSMC DDX24诱导胚胎外血管重塑
除胚胎本身之外，CKO卵黄囊的表型从E10.5开始显示出原发性血管丛的严重缺陷(见图4a)。IB4/α-SMA的整体组织免疫荧光染色展示了E11.5时卵黄囊中脉管系统的明显缺失(图4b)。此外，在胎盘的迷宫层中也观察到血管缺失，迷路层血管对于妊娠期间的气体和营养交换至关重要(图4c)。H&E染色显示CKO胎盘的母体与胚胎界面组织(labyrinth)层厚度减小，血管形成减少(图4d)。通过免疫荧光分析发现迷宫层中的血管面积减少也证实了这一点(图4e)。总之，VSMC中的Ddx24敲除可诱导胚胎外组织的血管缺陷。实施例2、DDX24对VSMC细胞周期和增殖的相关性
1、实验过程
1.1细胞培养
从ScienCell(Carlsbad，CA)购买的人脐静脉平滑肌细胞(HUVSMC)和人脐动脉平滑肌细胞(HUASMC)；并在平滑肌细胞培养基(SMCM，#1010，ScienCell)中生长，并补充了5％胎牛血清(FBS，#0025，ScienCell)，1％平滑肌细胞生长补充剂(SMCGS，#1051，ScienCell)，并在37℃下在5％CO2的条件下生长。
1.2siRNA转染
对照siRNA和siRNA购买自锐博公司。按照制造商的协议使用Neon转染系统(Invitrogen)将siRNA递送到VSMC中。48小时后，收获VSMC以提取总RNA用于qRT-PCR以验证目的基因敲低水平。
1.3慢病毒感染
VSMC适当浓度铺板后，按照MOI(multiplicity of infection)，即感染复数为30计算适量浓度病毒在4mg/ml聚苯乙烯存在下感染细胞8小时，随后替换新鲜培养基并在37℃下培养细胞48小时。
1.4RNA提取和qRT-PCR
使用
Figure BDA0003693414000000121
试剂(Invitrogen)提取VSMC的总RNA。cDNA合成通过使用
Figure BDA0003693414000000122
III.RT SuperMix进行qPCR(Vazyme)进行。使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme)和QuantStudioTM 7Flex Real-Time PCR仪器(美国赛默飞科技)进行实时荧光定量PCR。
1.5蛋白质提取和免疫印迹
如前所述分离蛋白质提取物并测量蛋白质浓度。VSMC在冰上的裂解缓冲液(Beyotime)中裂解。使用增强型BCA蛋白测定试剂盒(#P0010测定蛋白质浓度)测量浓度。对于蛋白质印迹分析，将25-40μg蛋白质置于每泳道10％SDS-PAGE凝胶中，然后转移到PVDF膜上。将膜用5％BSA在Tris缓冲盐水中封闭1.5小时，用含有0.05％吐温-20的Tris缓冲盐水洗涤，并与兔多克隆抗DDX24抗体(1：500)或抗FANCA(Abcam，1：200)在4℃下孵育过夜。次日再次洗涤膜并用二抗(抗兔辣根过氧化物酶偶联二抗，1：2000，Invitrogen，US)室温孵育1小时。最后，使用ECL试剂(Millipore，US)检测膜并暴露于X射线胶片中曝光。
1.6细胞周期分析
为了确定细胞周期，流式细胞术测定使用丙啶(#C1052；Beyotime)根据制造商的协议对双链DNA进行染色。
1.7RNA测序和生物信息学分析
使用TRIzol(Sigma，US)从VSMC中提取总RNA，并使用BGISEQ-500平台对cDNA样品进行测序，单端50-bp读取长度，每个样品30×106次读取。主成分分析使用统计包和图进行，并在R(版本4.1)中使用ggplot2包和circliize包。KEGG扩充是使用clusterProfiler包。使用TBtools执行的热图。
1.8RNA免疫沉淀分析
对于每个RIP反应，收获107个细胞并用PBS洗涤，然后在冰上的RIP裂解缓冲液中裂解1小时。用1ml TRIZOL试剂(Invitrogen)提取1/10裂解物以提取总RNA作为输入，保存1/50裂解物用于蛋白质印迹以检测蛋白质表达，并将剩余的裂解物与指定的抗体和蛋白A/G-琼脂糖珠在4℃下孵育过夜。将正常的兔IgG作为阴性对照RIP反应。用相同的RIP裂解缓冲液洗涤与RNA结合的珠子5次，然后对1/10的微珠进行蛋白质印迹分析以确定IP的效率，用1ml TRIZOL试剂提取剩余的珠子以提取RIP结合的RNA。
1.9统计分析
数据表示为SD±平均值，并使用Prism软件(Graphpad)使用不成对t检验进行统计分析。与p值<0.05的差异被认为是显着的。
2、实验结果
2.1、DDX24对VSMC细胞周期和增殖的调控
为了探索DDX24在发育中胚胎的细胞功能，我们检查了DDX24敲除时VSMC的增殖功能和凋亡功能。免疫荧光分析表明，在CKO胚胎中，由EdU或Ki67标记的增殖型VSMC显著减少(见图5a和图6a和6b)，DA和心脏中的VSMC数量明显下降(图5b和6c)并且细胞处于细胞周期G1期停滞阶段(图5c和图6d)。TUNEL染色表明DA和心脏组织中VSMC凋亡增加(见图7a)。
为了验证由于DDX24缺乏而介导的细胞缺陷，我们在两个不同的VSMC细胞系中进行了RNA-seq，即人脐动脉平滑肌细胞(HUASMC)和人脐静脉平滑肌细胞(HUVSMC)，在两个细胞系中均进行了DDX24敲低(见7b和7d)。KEGG最显著富集的通路为“DNA复制”和“细胞周期”(图5d和见图7e)。细胞周期流式分析证实了DDX24缺陷导致VSMC中G1期的停滞(图5e，5f和图7f)。DDX24缺陷细胞系中抑制的增殖功能也通过增殖测定得到验证，结果与体内EdU或Ki67分析相一致(图5g和图7g)。综上所述，这些数据表明DDX24调控了VSMC的细胞周期和增殖。
2.2、DDX24结合FANCA的mRNA对VSMC细胞周期和增殖的调控
为了进一步探究DDX24介导的细胞周期调控的分子机制，RNA-seq结果表明，VSMC中DDX24的敲低导致175个基因下调，其中细胞周期相关基因高度富集(图8a和图9a)，尤其FA通路中的几个基因减少(图8b)。qRT-PCR和蛋白质印迹证实，在DDX24敲低时，FANCA的mRNA和蛋白质都下调(图8c和图9b)。为了确定FANCA的mRNA是否可以被RNA结合蛋白DDX24直接靶向结合，我们进行了RNA免疫沉淀测序(RIP-seq)，然后进行了RIP-qRT-PCR验证(图8d)。结合RNA-seq和RIP-seq结果，我们发现FA家族分子中只有FANCA的mRNA可以与DDX24蛋白结合并被DDX24调节表达。从机制上，我们证明了在VSMC中敲低DDX24促进了FANCA mRNA降解(图8e)。重要的是，我们在CKO小鼠的组织中得到了相一致的结果(图8f和图10a，10b)。值得注意的是，收缩型VSMC标记物的表达也被下调(图8f)。总而言之，DDX24通过与FANCA的mRNA结合来调节VSMC细胞周期并增强其稳定性。
随后，我们试图探索FANCA在VSMC中的功能，因为它尚未被报道。通过siRNA敲低HUASMC和HUVSMC中的FANCA(图10c和10d)后，细胞周期分析显示，缺乏FANCA导致细胞G1期停滞(图8g和图10e)，伴随着显著细胞增殖功能受损(图10f和10g)，与DDX24敲低表型一致。相反，过表达FANCA的VSMC表现增殖功能增强(图10h和10i)。最后，FANCA的过表达能够缓解由DDX24缺乏引起的细胞周期G1期停滞(图8h)。总之，FANCA位于DDX24的下游，调节VSMC的细胞周期和增殖功能。

Claims (2)

1.DDX24基因或其表达产物在制备调控血管平滑肌细胞功能的产品中的应用，其特征在于，所述血管平滑肌细胞功能包括：(1)细胞周期；(2)细胞增殖；(3)细胞分化；和(4)细胞凋亡。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述功能产品包括以下任一种：
(i)含有DDX24，或DDX24互补序列且能够在转入体内后形成增强DDX24基因表达产物的构建体；
(ii)过表达DDX24基因序列的免疫相关细胞、其分化细胞或构建体。
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