CN116754768B - Ddx24在维持内皮细胞的核仁稳态中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于疾病治疗技术领域，公开了DDX24在维持内皮细胞的核仁稳态中的应用。在这里，我们证明了DDX24在体外形成生物大分子凝聚物，突变形式DDX24E271K在MOVLD综合征患者组织和培养的内皮细胞中进入核仁减少，核仁/核质比例(即核仁中的分离常数)降低，且改变了核仁形态。此外，DDX24直接与NPM1相互作用，作为核仁颗粒成分(GC)中的募员蛋白调节其相分离行为。在功能上，我们表明，无论是突变还是敲低DDX24都会导致核糖体生物合成功能障碍，从而导致内皮细胞迁移增强。我们的发现表明了在血管畸形疾病中，DDX24突变可通过调节NPM1的相分离行为影响内皮细胞的核仁结构和功能。
Description
技术领域
本发明涉及疾病治疗技术领域，更具体地，涉及DDX24在维持内皮细胞的核仁稳态中的应用。
背景技术
核仁是独特的无膜核体，主要参与核糖体生物合成，并在核糖核蛋白(RNP)复合物组装、DNA损伤应答、细胞周期控制和应激反应中发挥重要作用。数百种分子驻留在核仁中，组成由纤维中心(FC)、致密纤维成分(DFC)和颗粒成分(GC)构成的有序多层结构维持着核仁正常功能。核磷蛋白(NPM1)是核仁颗粒成分中的标志蛋白，参与核糖体的生物合成。由于核仁各层的支架蛋白具有不同的粘弹性和表面张力特性，核仁的各亚区域间显示出不相容性并与周围核质的空间分离。GC层是一个动态结构，主要负责rRNA加工和核糖体组装。GC层标志蛋白NPM1的相分离行为与错误折叠蛋白的存贮和核糖体前体组装等核仁稳态功能密切相关。干扰核仁稳态可能会导致包括DEAD-box螺旋酶在内的大量核仁蛋白丰度的变化。这些分子在支持动态架构的同时，显示出恒定的流动性并与周围环境持续交换以维持核仁稳态。
细胞核仁的生物物理性质研究表明，核仁通过液-液相分离(LLPS)形成和维持。这个模型将核仁材料特性与其多样化的功能紧密结合。例如，当细胞处于长时间的热应激下时，核仁中蛋白质的流动性减少会破坏其恢复错误折叠蛋白的能力。核仁的这种功能障碍可能会导致疾病发生。例如，在神经退行性疾病的情况下，异常表达的二肽重复多肽破坏了NPM1相分离及其在核糖体组装中的功能，从而诱导细胞毒性。这些机制性发现促使我们重新审视与核仁蛋白功能失调相关的许多疾病的病理学。
血管异常是一组异质性疾病，其特征是内皮细胞的增殖、迁移和生存发生改变，通常由基因突变引起。然而，核仁稳态与血管异常情况下内皮功能之间的联系仍然缺失。此前，我们发现了一种特殊类型的血管畸形，称为多器官静脉和淋巴缺陷综合征(MOVLD)，患者表现出危及生命的症状，目前缺乏有效的治疗方法。我们的工作将DDX24的p.Glu271Lys突变(DDX24E271K)与这种疾病相关联，并证明DDX24功能障碍能促进内皮细胞迁移。
DDX24属于一个大型的ATP依赖性RNA解旋酶家族，其中许多成员都含有内在无序区域(IDRs)，并能通过LLPS调控含RNA的无膜细胞器。DDX24主要定位于细胞核仁，广泛表达于人类组织中，已被鉴定为细胞存活的必需基因，对小鼠胚胎发育也至关重要。尽管如此，目前尚未报道DDX24是否能发生相分离或参与维持核仁稳态。此外，DDX24突变介导的血管异常的机制仍然不明确。
发明内容
为了克服现有技术存在的上述问题，本发明首先提供核仁形态变化与内皮细胞中DDX24浓度的关系，并在此基础上研究内皮细胞核仁形态变化和血管异常之间的相关性，从而试图寻找疾病早期微小变化的生物标志物，以期在疾病的早期阶段对其进行干预和治疗。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
本发明通过实验验证DDX24与核仁形态之间的关系，在敲低DDX24后，核仁大小增大，核仁畸形明显。值得注意的是，DDX24敲低后，DDX24的核仁/核质比率在DDX24缺乏时显著下降，这可以通过重新引入DDX24WT而不是DDX24E271K来挽救，与患者组织的发现一致。单纯过表达DDX24WT也影响了DDX24的核仁/核质比例。这些结果强调了DDX24对维持正常核仁形态的作用。因此当确定内皮细胞中DDX24的表达量，就可确定核仁形态。
通常，核糖体生物合成的功能障碍，称为核糖体病，是由核糖体装配因子或r蛋白的突变引起的。许多研究已经证明，核糖体生物合成的缺陷会导致5sRNP的积累，它与Hdm2结合并触发p53信号通路的激活。然而，最近的研究表明，核仁的液态特性对核糖体亚基的装配和转运很重要。从这个角度来看，核糖体病可能是由于核仁物质性质改变而引起的。我们的数据显示，由DDX24E271K引起的核仁内NPM1流动性降低会阻碍rRNA生物合成并影响核糖体大亚基的转运，导致5.8srRNA在核仁中积累。此外，改变NPM1相分离行为的下游效应可能汇聚到p53信号通路上，因为DDX24已被鉴定为p53的激活剂，以影响细胞功能。我们的工作增加了关于如何通过核仁募员蛋白(本文中为DDX24)调节核仁相分离行为，并最终影响核仁稳态的认识。
因此，本发明首先提供用于检测内皮细胞核仁中DDX24的表达量的物质在制备血管异常相关疾病的诊断功能产品中的应用。
本发明还提供用于检测内皮细胞核中DDX24的核仁/核质比例(即核仁中的分离常数)的物质在制备血管异常相关疾病的诊断功能产品中的应用。
优选的，所述血管异常相关疾病为MOVLD综合征。
本发明还提供用于检测内皮细胞核仁中DDX24的表达量的物质在制备判断内皮细胞核仁形态变化的功能产品中的应用。
本发明还提供用于检测内皮细胞核中DDX24的核仁/核质比例(即核仁中的分离常数)的物质在制备判断内皮细胞核仁形态变化的功能产品中的应用。
优选的，所述用于检测内皮细胞核仁中DDX24的表达量的物质，或者用于检测内皮细胞核中DDX24的核仁/核质比例(即核仁中的分离常数)的物质为DDX24抗体。
优选的，所述用于检测内皮细胞核仁形态变化的物质为DDX24抗体。
此前，我们报道过敲低DDX24会导致内皮细胞迁移增强。在这里，我们在DDX24缺乏的内皮细胞系HUVECs中外源性表达DDX24WT或DDX24E271K来拯救细胞表型。与上述NPM1相分离行为变化一致，重新表达DDX24E271K几乎没有任何区别，而DDX24WT抵消了敲低DDX24时的迁移增加(图6f，g)。增强的细胞迁移也与NPM1的敲低相关。总之，我们的数据阐明了DDX24在维持核仁稳态中的重要作用，即通过DDX24的突变或减少表达降低核仁支架蛋白NPM1的流动性会损害核糖体生物合成，并最终影响内皮细胞的功能。
在目前的工作中，我们揭示了DDX24通过与NPM1相互作用，作为募员蛋白维持核仁稳态。影响DDX24 LLPS性质的突变可以将其效应传导到NPM1的相分离行为，并破坏核糖体的生物合成，最终导致血管异常。
MOVLD综合征的特点是起病隐匿，病变位置较深，对常规介入治疗反应不佳，使诊断和治疗都具有挑战性。检测早期微小变化并监测疾病进展的生物标志物对于此类疾病的治疗干预至关重要。最近，核仁蛋白结构和定位的改变已成为诊断病毒感染、癌症和衰老等疾病极具应用前景的生物标志物。例如，在神经退行性疾病中，在患者组织和小鼠模型中观察到核仁肿胀和核仁蛋白转位，并与帕金森氏病和阿尔茨海默氏病相关。据我们所知，迄今为止没有研究将核仁形态与血管异常相关联。我们的结果强调了内皮细胞中杂乱的NPM1染色指示的核仁形态变化和/或降低的核仁DDX24浓度作为MOVLD综合征的潜在生物标志物。
因此，本发明还提供用于检测内皮细胞核仁形态变化的物质在制备诊断MOVLD综合征的功能产品中的应用。
优选的，所述用于检测内皮细胞核仁形态变化的物质为DDX24抗体。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
我们证明了DDX24在体外形成生物大分子凝聚物，突变形式DDX24E271K在MOVLD综合征患者组织和培养的内皮细胞中进入核仁较少，改变了核仁形态。此外，DDX24直接与NPM1相互作用，作为核仁颗粒成分(GC)中的募员蛋白调节其相分离行为。在功能上，我们表明，无论是突变还是敲低DDX24都会导致核糖体生物合成功能障碍，从而导致内皮细胞迁移增强。我们的发现表明了在血管畸形环境中，DDX24突变如何通过调节NPM1的相分离行为影响内皮细胞的核仁结构和功能。
本发明研究了DDX24E271K体外和细胞内引起的核仁形态和LLPS性质的变化，以及由此产生的功能后果。DDX24通过控制其相关核仁蛋白NPM1的相分离行为来维持核仁稳态是必要的。我们的发现揭示了血管异常的一种新机制，为这类疾病提供了有希望的诊断标记物和治疗靶点。
附图说明
图1观察到患者样本和带有DDX24 p.Glu271Lys突变的内皮细胞系HUVECs中核仁表型异常；a，来自MOVLD患者的肝脏FFPE切片中DDX24(黄色)、NPM1(红色)和CD34(绿色)的代表性免疫荧光图像，插入图表示更高倍视野；DAPI(蓝色)染DNA，b，肝脏FFPE切片中单个细胞中DDX24核仁强度/DDX24核质强度比值的定量；c，肝脏FFPE切片中每个高倍视野(HPF)内正常核仁细胞/总细胞比值的定量；d，e，HUVECs中DDX24(绿色)、NPM1(红色)的代表性免疫荧光图像(d)和敲低和重新表达实验中单个细胞中DDX24核仁强度/DDX24核质强度比值的定量(e)；箭头指示DDX24敲低细胞中扩大的核仁，星号指示减少的DDX24核仁/核质强度比值，比例尺，如图所示；数据在(b，e)中显示中位数、四分位数和最大/最小值；数据在(c)中显示为均值±标准差；每个样本n>500个细胞(b)；每个样本n>4个HPF(c)；每组n>35个细胞，来自2次独立实验汇总(e)；(c)使用普通单因素方差分析和Dunnett多重比较检验，其余使用Kruskal-Wallis检验和Dunn多重比较检验。NS，不显著；*P≤0.05，****P≤0.0001；
图2为DDX24在体外通过液-液相分离形成生物分子凝聚物；a，DDX24的结构域组织和内源性无序结构域分析，红线表示p.Glu271Lys突变(E271K)的位置；b，4μM DDX24WT蛋白(Alexa Fluor 488)在所示缓冲液条件下凝聚物形成的代表性图像；c，4μM DDX24WT蛋白(Alexa Fluor 488)或4μM DDX24E271K蛋白(Alexa Fluor 488)在含有指定乙酸钠浓度的缓冲液中凝聚物形成的代表性图像；d，10μM DDX24WT蛋白或10μM DDX24E271K蛋白在Tris-NaClLLPS缓冲液(20mM Tris，1mM TCEP，pH 8.0)中含有指定NaCl浓度的液滴形成的代表性图像，有或没有rRNA(100μg/mL)的存在；e，从(d)中图像定量DDX24WT或DDX24E271K凝聚物形成的程度；f，g，10μM DDX24WT蛋白(Alexa Fluor 488)或10μM DDX24E271K蛋白(Alexa Fluor488)与rRNA(100μg/mL)在Tris-NaCl LLPS缓冲液(20mM Tris，150mM NaCl，1mM TCEP，pH8.0)中液滴形成的代表性共焦图像(f)和两种DDX24结构分配系数的定量(g)；h，在与(f)相同的LLPS缓冲液中光漂白前后DDX24WT-A488或DDX24E271K-A488液滴的共焦显微镜图像；i，DDX24WT-A488或DDX24E271K-A488在(h)中液滴FRAP恢复曲线；ROI＝液滴中心1μm圆形区域；比例尺，如图所示；数据显示为均值±标准差；图(b、c、d、f、h)中的图像代表2次独立实验；每组n≥4个HPF来自2次独立实验汇总(e、g)；每组n≥5个液滴(i)；(e)使用Mann-Whitney检验和Bonferroni-Dunn多重比较检验进行；双尾Student’st检验用于(g、i)；NS，不显著；*P≤0.05，**P≤0.01，****P≤0.0001；
图3为DDX24与核仁颗粒成分中的NPM1相互作用；a，b，甲醇固定的HUVECs在与DMSO、放线菌素-D(50ng/ml)或黄酮吡啶醇(1μM)孵育1小时后的代表性共焦图像(a)和图像的绘图轮廓显示在(b)中；c，用抗DDX24抗体或对照同型匹配IgG免疫沉淀的HUVECs细胞裂解液上DDX24和NPM1的免疫印迹；d，e，DDX24WT与NPM1结合的SPR响应图(d)和NPM1与DDX24WT结合的SPR响应图(e)；KD值是从3次独立实验中计算得出的平均值；比例尺，如图所示；图(a、b)中的图像代表2次独立实验；(c)中的印迹代表从2个生物重复获得的数据；
图4为DDX24与NPM1和rRNA形成异型液滴；a，由8μM DDX24WT蛋白(Alexa Fluor488)、20μM NPM1(Alexa Fluor 594)和100μg/mL rRNA在LLPS缓冲液(20mM Tris，150mMNaCl，1mM TCEP，pH 8.0)中形成的相分离结构融合事件的代表性共焦图像；b，c，0.125μMDDX24WT蛋白(Alexa Fluor 488)或0.125μM DDX24E271K蛋白(Alexa Fluor 488)与NPM1(20μM)和rRNA(100μg/mL)在与上述相同的缓冲液中形成液滴的代表性共焦图像(b)和两种DDX24结构分配系数的定量(c)；d，DDX24WT和DDX24E271K相关蛋白的网络分析，蛋白-蛋白相互作用数据来自STRING数据库；AP-MS评分是根据LC-MS获得的归一化光谱计数计算的；e，示意图说明E271K突变影响DDX24的亚核定位；标尺条，如图所示；数据显示为均值±标准差；图(a、b)中的图像代表2次独立实验；每组n≥4个HPF来自2次独立实验汇总(c)；n＝2次独立实验(d)；双尾Student’s t检验用于(c)；NS，不显著；**P≤0.01；
图5为DDX24敲低和DDX24E271K降低了NPM1在核仁中的流动性；a，20μM NPM1(AlexaFluor 594)、100μg/mL rRNA和DDX24WT(Alexa Fluor 488)或DDX24E271K(Alexa Fluor 488)滴定系列形成的液滴的代表性共聚焦显微镜图像；b，在光漂白前后，包含(a)中8μM DDX24WT(Alexa Fluor 488)或DDX24E271K(Alexa Fluor 488)的液滴的代表性共聚焦显微镜图像；c，从FRAP曲线测量的NPM1在(a)中滴定系列中的移动分数变化；d，e，HUVECs转染DDX24构建物如图所示的活细胞NPM1-DsRed FRAP实验的代表性共聚焦图像(d)和这些细胞的FRAP曲线(e)；f，经过靶向DDX24的siRNA滴定敲低后293T细胞中NPM1-DsRed的FRAP曲线；g，h，HUVECs转染靶向DDX24或杂乱对照siRNA的活细胞NPM1-DsRed FRAP实验的代表性共聚焦图像(g)和这些细胞的FRAP曲线(h)；FRAP ROI＝选定核仁或液滴中心1μm圆形区域；比例尺，如图所示；数据显示为均值±标准差；图(a、b、d、g)中的图像代表2次独立实验；(c)中每组n≥3个液滴；(e、f、h)中每组n≥3个细胞；(c)使用Bonferroni-Dunn多重比较检验的Welch t检验；(e)使用Tukey多重比较检验的普通单向ANOVA；(f)使用Dunnett多重比较检验的普通单向ANOVA；(h)使用双尾Student t检验；*P≤0.05，**P≤0.01，****P≤0.0001；
图6显示DDX24维持核仁稳态和HUVECs的正常功能；a，b，在EU掺入30分钟后，对照或siDDX24 siRNA转染HUVECs的代表性共聚焦图像(a)和不同应激处理后新生RNA合成的定量(b)；c，qPCR分析检查了靶向DDX24或杂乱siRNA的siRNA转染HUVECs中47S rRNA 01/A′位点的处理；未处理的01/A’位点水平归一化到7SK RNA水平；d，e，NPM1(红色)和5.8s rRNA(蓝色)在对照或siDDX24 siRNA转染HUVECs中的代表性共聚焦图像(d)和不同应激处理后5.8s rRNA核仁平均强度的定量(e)；f，g，敲低和重新表达试验中迁移HUVECs的代表性相差显微镜图像(f)和每个高倍视野细胞数的定量(g)；比例尺，如图所示。数据显示为均值±标准差。图(a、d、e)中的图像代表2次独立实验；(b)中每组n≥6个HPF汇总自2次独立实验；中n＝9汇总自3次独立实验；(e)中每组n≥12个细胞汇总自2次独立实验；(g)中每组n＝4个HPF汇总自2次独立实验。除(b)外，使用Dunnett多重比较检验的普通单向ANOVA。NS，不显著；*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001，****P≤0.0001。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1 DDX24突变和缺失改变核仁形态
之前发现DDX24突变(DDX24E271K)与一种特殊类型的血管畸形MOVLD相关。在对MOVLD患者的肝活检组织切片进行DDX24免疫染色后，我们观察到DDX24蛋白在核仁分布呈分散状(图1a，b)。这伴随着NPM1染色模糊不清，显示出核仁形态的改变和正常结构的破坏(图1c)。
为了验证DDX24与核仁形态之间的关系，我们通过在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中敲低DDX24并外源性表达DDX24WT或DDX24E271K建立细胞模型。在敲低DDX24后，核仁大小增大，核仁畸形明显(图1d)。值得注意的是，DDX24敲低后，DDX24的核仁/核质比率在DDX24缺乏时显著下降，这可以通过重新引入DDX24WT而不是DDX24E271K(图1e)来挽救，与患者组织的发现一致。总之，这些结果强调了DDX24对维持正常核仁形态的作用。
实施例2 DDX24展现相分离行为
我们使用无序程度预测工具IUPRED对DDX24蛋白与其他DEAD-box蛋白进行序列分析，发现其N端结构域(NTD)、C端结构域(CTD)和解旋酶核心内插入片段是潜在内在无序区域(IDR)(图2a)。DDX24E271K突变位于插入区域的IDR内，而不影响核仁定位序列(NoLS)，提示突变可能干扰DDX24的相分离性质。
为了评估DDX24体外发生相分离的能力，我们用纯化的全长DDX24WT和DDX24E271K蛋白并用Alexa Fluor 488标记纯化的蛋白进行了LLPS筛选测试。有趣的是，在低离子强度或拥挤剂条件下，DDX24在15分钟内就形成凝聚结构(图2b)。然而，在较高的离子强度下，DDX24WT和DDX24E271K的凝聚物都以离子强度依赖的方式被破坏(图2c)，表明DDX24的同型凝聚主要是由静电相互作用驱动的。野生型和突变型DDX24表现相似，说明DDX24通过分子间静电相互作用在体外形成同型凝聚物，而不受E271K突变状态的影响。
由于RNA结合蛋白(RBPs)和RNA分子之间的相互作用已被证明有助于促进LLPS，而DDX24是一种RNA解旋酶，因此我们测试了rRNA是否会促进DDX24的相分离。事实上，100μg/mL的rRNA显著促进了DDX24凝聚物的相分离(图2d)。由DDX24E271K/rRNA形成的异型凝聚物的液滴占比面积略高于野生型(图2e)，且分离常数(通过浓缩相与稀释相荧光强度之比计算)对于DDX24E271K显著降低(图2f，g)，呼应了细胞中核仁/核质比例的降低。
为了探究DDX24介导的核仁/核质分配的潜在机制，我们接下来探究了DDX24/rRNA凝聚物的动态特性。体外荧光漂白后恢复(FRAP)分析显示，DDX24WT和DDX24E271K在凝聚物内都相对流动性不高，90秒内荧光恢复25％，呈凝胶状(图2h，i)。总之，我们的结果表明，野生型DDX24可以通过LLPS与rRNA形成低流动性凝聚物，而DDX24E271K影响了其进入凝聚物。
实施例3 DDX24与NPM1相互作用作为募员蛋白参与核仁颗粒组分组成
蛋白分布在核仁的不同区域以发挥不同的功能。与FBL和UBF(分别为DFC和FC的标记)在核仁内形成珠状结构的不同，DDX24均匀分布在核仁内(图3a，b上)。为了进一步研究DDX24的亚细胞定位，我们通过用低剂量的放线菌素D(RNA聚合酶I抑制剂)或氟伏派瑞多(RNA聚合酶II抑制剂)来干扰HUVECs的核仁结构，从而导致“核仁分离”，即DFC与GC分离的情况。在这些情况下，FBL和UBF都从NPM1外壳内脱离，而DDX24仍然保留在内部(图3a，b中和下)。因此，DDX24似乎是GC的大分子网络中众多蛋白质之一。
为了表征DDX24在GC中的作用，我们通过共免疫沉淀(co-IP)实验研究了它与支架蛋白NPM1的相互作用，并证明了它们之间的直接相互作用(图3c)。表面等离子共振(SPR)分析进一步验证了这两种蛋白质之间亚纳摩尔级别的亲和力(图3d、e)。总之，我们的结果阐明了DDX24在GC中的定位高度依赖于它与支架蛋白NPM1的关联。
实施例4 DDX24E271K更少地分配到NPM1/rRNA液滴
为了进一步研究DDX24在多组分凝聚物中的相分离行为，我们采用了一种已经建立的GC层的体外重构系统。如预期的那样，NPM1(20μM)、DDX24(10μM)和rRNA(100μg/ml)在Tris-NaCl LLPS缓冲液(20mM Tris，150mM NaCl，1mM TCEP，pH 8.0)中形成凝聚物，其表现出典型的液滴特征，如液滴融合所示(图4a)。随后，我们通过监测液滴形成和浊度来滴定NPM1和DDX24，绘制了一个2D相图。与SURF6和其他非核糖体核仁蛋白类似，如前所述，无论是野生型还是突变型DDX24都降低了NPM1的LLPS临界浓度，但两种结构造成的差异不具有统计学差异。
我们推断，DDX24被招募到NPM1/rRNA滴液中主要是由于与蛋白质和RNA的异型相互作用。因此，我们观察了DDX24突变是否会影响生理条件下其在核仁的分配。我们首先用定量免疫蛋白印记测量了HUVECs中内源性DDX24的蛋白质浓度。值得注意的是，在生理浓度下(DDX24为125nM，NPM1为20μM)，DDX24E271K比DDX24WT更少地分配到浓缩相中(图4b、c)，符合MOVLD患者组织中看到的差异。为了更好地指定DDX24E271K在体内的突变效应，我们进行了免疫共沉淀(Co-IP)实验，随后进行LC-MS鉴定。我们发现DDX24WT主要与来自FBL(DFC的标记)的蛋白质相关联，而DDX24E271K更多地与NCL(GC的标记)相关联(图4d、e)。不同核仁区域的相互作用蛋白的转变证明了DDX24E271K突变产生的相分离性质的改变。这些结果表明，DDX24可以与NPM1和rRNA在体外形成多组分液滴，而DDX24E271K减少了进入核仁液滴，即核仁中的分离常数下降。
实施例5 DDX24E271K降低了NPM1生物大分子凝聚物中的流动性
非核糖体核仁蛋白可以作为募员蛋白调节GC内的大分子相互作用网络，微调核仁物质状态。为了进一步探究由两种结构与NPM1/rRNA形成的液滴的组成变化，我们用恒定浓度的NPM1(20μM)和rRNA(100μg/ml)滴定DDX24WT或DDX24E271K(图5a)。然而，在非生理浓度下，NPM1和DDX24的分离常数在两种结构之间几乎没有差异，表明DDX24E271K并未改变体外DDX24/NPM1/rRNA液滴的整体结构。
然而，FRAP分析显示，在DDX24E271K存在下，与DDX24WT相比，NPM1分子的流动性整个系列中都较低(图5b，c)，并且在8μM时差异最为明显。与体外发现一致，在过表达DDX24E271K的HUVECs的核仁中，与空载体或DDX24WT转染的相比，NPM1分子的流动性下降(图5d，e)。
为了评估受不同浓度DDX24影响的核仁内NPM1的相分离行为，我们进行了梯度敲低DDX24以模拟DDX24E271K核仁分配的减少。有趣的是，活细胞FRAP结果显示，当功能性WTDDX24蛋白浓度降低时，核仁内NPM1分子的动态变得不那么流动(图5f)。在HUVECs中敲低DDX24时也得到了类似结果(图5g，h)。因此，我们的结果表明，无论是DDX24突变还是表达降低都可以减少体外形成的生物凝聚物和活细胞中核仁内NPM1的流动性。
实施例6 DDX24E271K破坏内皮细胞的核糖体生成和迁移功能
由DDX24E271K引起的支架蛋白NPM1流动性降低可能对核仁产生重大的表型后果，最终使细胞产生病理性改变。为了研究DDX24E271K对HUVECs的病理影响，我们使用Pol I和PolII抑制剂作为阳性对照，观察了通过敲低DDX24获得核仁DDX24降低的HUVECs中新生RNA的生物合成。正如预期的那样，降低核仁DDX24干扰了HUVECs中全局RNA的生物合成，重现了RNA聚合酶抑制剂的效应(图6a，b)。此外，我们检查了01/A’位点的切割以反映前体rRNA的加工，并发现在DDX24缺乏的HUVECs中未加工的47s转录本大大减少(图6c)。最后，我们通过检测5.8s rRNA来研究60S亚基的成熟。免疫荧光显微镜数据显示，核仁DDX24降低使得5.8srRNA在核仁中积累，表明60s亚基成熟受损，(图6d，e)。
DEAD-box家族中三分之一的解旋酶含有对介导LLPS至关重要的IDRs，协助区域化处理各种RNA处理反应，如DDX3X和DDX4。然而，DDX24在之前的研究中并未被预测会相分离。事实上，DDX24是其家族中独特的成员，它在解旋酶核心结构域内有一个IDR插入，而DDX24E271K恰好发生在IDR中。我们的数据表明，尽管DDX24单独在细胞内的生理浓度下不太可能相分离，但它可以被招募到NPM1/rRNA液滴中并保持高水平的分配。IDRs中的突变可能影响生物分子凝聚物的一般相性质，诱发相分离功能障碍并促成疾病的发生。同样，我们在这里发现，在IDR中的DDX24E271K干扰了它进入NPM1/rRNA液滴的分配，并导致NPM1相分离行为异常。总之，我们的工作强调了在表型解释过程中评估IDR区中的基因突变对相分离影响的重要性，特别是在核仁蛋白中LLPS性质对其稳态至关重要的突变。通过基因编辑或小分子药物调节核仁LLPS性质，可能为血管畸形等疾病的治疗干预提供一个新的视角。
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1.DDX24抗体在制备判断内皮细胞核仁形态变化的功能产品中的应用，所述DDX24抗体用于检测内皮细胞核仁中DDX24的表达量，所述判断内皮细胞核仁形态变化为当DDX24敲低时，内皮细胞核仁变大，核仁畸形。
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