CN114366812B - CHIR-99021或BML-284在制备恢复ddx24敲低的脑血管发育的产品中的应用 - Google Patents

CHIR-99021或BML-284在制备恢复ddx24敲低的脑血管发育的产品中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药产品应用技术领域，公开了DDX24缺失或功能异常导致的脑血管发育畸形及其应用。血管发育早期，DDX24在血管内皮细胞中高表达。DDX24缺失抑制斑马鱼和小鼠脑血管发育。机制研究表明，DDX24缺失下调脑血管内皮细胞中GPR124的表达，进而抑制Wnt/β‑catenin信号传导。当在脑血管发育期间激活Wnt通路，可挽回由DDX24缺失引起的血管异常。我们的研究结果显示，DDX24是早期血管发育的调节因子，是脑血管系统发育所必需的。

Description

CHIR-99021或BML-284在制备恢复ddx24敲低的脑血管发育的 产品中的应用
技术领域
本发明属于医药产品应用技术领域，更具体地，涉及DDX24缺失或功能异常导致的脑血管发育畸形及其应用。
背景技术
血管系统网络的形成是胚胎发育的一个重要环节，其受关键信号分子的精确调控，不同组织部位血管发育调控表现出高度异质性。对于脑血管发育，经典Wnt/β-catenin信号通路的激活是必需的，该通路的失活表现出脑血管发育缺陷。然而，尽管对脑血管发育的研究取得了巨大的进展，但调节脑血管发育必要信号通路的上游分子很少被报道，其机制尚不完整。
血管发育异常会导致血管畸形。血管畸形可发生在各种类型的血管中，如动脉、毛细血管、静脉或淋巴管，对患者的生活质量产生严重影响，甚至威胁生命。该疾病无有效的治疗方法，目前主要通过介入干预或手术切除病变部位，对患者损伤大。在此之前，我们发现了一种新的血管畸形类型——MOVLD综合征，该综合征表现为多器官的静脉和淋巴管缺陷。该疾病与RNA解螺旋酶DDX24功能异常相关，然而，DDX24功能紊乱是否以及如何影响血管发育还需要进一步研究。解析血管畸形中信号分子的改变有助于更深入地理解疾病过程，更重要的是，有助于开发更好的治疗方法来对抗这种难治性疾病。
DDX24是RNA解旋酶家族的成员，被认为与核糖体生物合成相关。该家族的成员在调控RNA代谢中至关重要，并与多种疾病相关，包括肿瘤、病毒感染和代谢性疾病。尽管有报道称小鼠DDX24基因的缺陷导致胚胎致死，但关于其在血管发育中的作用我们仍是未知的。因此，我们利用细胞、斑马鱼和小鼠模型阐明DDX24在早期血管发育中的作用，并揭示DDX24缺乏诱导血管畸形的机制。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的上述问题，首先提供DDX24基因或其表达产物在制备促进脑血管新生和/或发育的功能产品中的应用。
本发明的第二个目的是提供DDX24基因或其表达产物在制备辅助诊断脑血管发育相关疾病的功能产品中的应用。
本发明的第三个目的是提供对DDX24基因或者其表达产物具有促进作用的功能产品在制备预防和/或治疗脑血管发育缺陷的产品方面的应用。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
DDX24基因或其表达产物在制备促进脑血管新生和/或发育的功能产品中的应用，所述功能产品对DDX24基因或者其表达产物的表达量具有促进作用。
血管畸形由于其广泛的病变和复杂的临床表现，难以诊断和治疗。之前已经确定RNA解旋酶DDX24是一种新发现的血管畸形——MOVLD综合征的候选致病基因，然而，DDX24是否以及如何调节血管发育在很大程度上并不清楚。在此，我们发现DDX24在早期发育中的斑马鱼和小鼠系统中广泛表达。DDX24缺乏损害斑马鱼和小鼠脑血管发育。在机制上，我们发现DDX24缺乏下调脑血管内皮细胞中GPR124的表达，进而抑制Wnt/β-cateinin信号传导。Wnt通路的激活能减轻脑中DDX24缺乏引起的血管异常。这些发现表明DDX24是脑血管发育所必需的，并阐明了DDX24介导的脑血管畸形的潜在机制。
本发明还提供DDX24基因或其表达产物在制备辅助诊断脑血管发育相关疾病的功能产品中的应用，所述功能产品可检测DDX24基因或者其表达产物中DDX24的表达量。
优选的，所述脑血管发育相关疾病是指血管发育畸形、血管瘤、血脑屏障发育不全。
本发明通过试验研究发现DDX24在内皮细胞中的表达显著高于非内皮细胞，且在大脑中只在内皮细胞中表达。因此，优选的，所述DDX24基因或者其表达产物用于促进大脑中血管内皮细胞的发育。
通过动物模型试验研究发现，DDX24敲低或敲除显示出脑血管发育缺陷，其中在斑马鱼模型中表现为中央动脉数量和长度减少。此外，我们观察到中央动脉出芽延迟和抑制，通过体外试验验证DDX24的缺失损害脑血管内皮细胞的出芽。
因此，优选的，所述促进大脑中内皮细胞的发育表现为：
(1)延缓和/或消除脑血管数量和长度减少，和/或
(2)延缓和/或消除脑血管内皮细胞出芽延迟和抑制。
另外，本发明还提供物质A在制备辅助诊断脑血管发育缺陷的产品方面的应用，所述物质A用于检测DDX24基因或者其表达产物中DDX24的表达量。
本发明还提供对DDX24基因或者其表达产物具有促进作用的功能产品在制备预防和/或治疗脑血管发育缺陷的产品方面的应用。
本发明通过试验研究发现GPR124在DDX24缺失的脑血管内皮细胞系和斑马鱼头部中下调。我们进一步证实，DDX24通过GPR124介导的Wnt/β-catenin信号通路调节脑血管发育。应用Wnt/β-catenin信号通路激活剂可缓解DDX24缺失造成的脑血管发育缺陷。我们的数据证明DDX24在脑血管新生中的重要性，并提示DDX24是脑血管畸形的潜在致病基因。
到目前为止，对血管畸形的治疗，主要是通过介入治疗或手术，临床效果有限。探索血管畸形的致病基因和潜在机制有助于开发损伤小、安全有效的治疗方法。例如，近年来，通过探索已鉴定了几个血管畸形致病基因，以及相关的分子信号通路改变，基于此开发了针对血管畸形的药物，具有良好的疗效和安全性，其中包括mTOR抑制剂——雷帕霉素。在我们的研究中，药物激活Wnt通路可减轻DDX24缺乏介导的血管异常。鉴于DDX24主要位于核仁内，难以靶向，Wnt通路可能是治疗DDX24功能障导致的血管异常的合适靶点。因此，优选的，上述功能产品包括以下任一种：
(i)以DDX24或GPR124或Wnt通路基因转录本为靶序列，且能够促进DDX24或GPR124或Wnt通路基因表达产物的表达或基因转录的分子；
(ii)能表达或者形成(i)中所述分子的构建体；
(iii)含有DDX24或GPR124或Wnt通路基因互补序列，且能够在转入体内后形成促进DDX24或GPR124或Wnt通路基因表达产物的表达或基因转录的分子的构建体；
(iv)激活DDX24或GPR124或Wnt通路基因序列后的免疫相关细胞、其分化细胞或构建体。
更优选的，所述功能产品用于激活Wnt/β-catenin信号通路。
更优选的，所述功能产品为包括但不限于CHIR-99021、BML-284，HLY78，IQ1，BIO(C16H10BrN3O2)，锂盐(包括但不限于氯化锂，碳酸锂，乳清酸锂)，丙戊酸，白雀木醇(L-Quebrachitol)，香草酸甲酯，抗KDD1抗体，DKK1疫苗，R-spondin蛋白。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明旨在探讨DDX24在脑血管发育中的作用及其调控机制。我们数据表明，血管发育早期，DDX24在血管内皮细胞中高表达。DDX24缺失抑制斑马鱼和小鼠脑血管发育。机制研究表明，DDX24缺乏下调脑血管内皮细胞中GPR124的表达，进而抑制Wnt/β-cateinin信号传导。当我们在斑马鱼上激活Wnt通路，由DDX24引起的血管异常可被挽回。我们的研究结果显示，DDX24是脑血管发育所必要的调节因子，其主要通过GPR124/Wnt/β-cateinin通路发挥其功能。
附图说明
图1显示了DDX24在斑马鱼和新生小鼠中的表达模式，图A到图E为通过整体原位杂交检测ddx24 mRNA在不同发育时间点的表达，其中图A显示ddx24mRNA存在于早期胚胎中；图B显示在受精后24小时(24hpf)ddx24 mRNA在头部和躯干广泛表达；B’是B中躯干区域的放大，图C是胚胎躯干部位的横切面，显示ddx24在背主动脉(DA)和后主静脉(PCV)区域(箭头)表达；图D和图E是分别在48和72hpf，ddx24表达局限于头部和心脏区域(箭头)；图F是qRT-PCR检测斑马鱼发育过程中不同时间点ddx24 mRNA的表达；图G为通过qRT-PCR检测流式分选的48hpfTg(fli1a:EGFP)斑马鱼GFP+(血管内皮细胞)和GFP-(非血管内皮细胞)中ddx24 mRNA的表达；图H为出生后第5天小鼠各器官中DDX24(绿色)和异凝集素B4(IB4，红色)的免疫荧光染色；通过荧光图谱分析检测DDX24和IB4的共定位；标尺：图A至图E为200μm，图H为20μm。数据用平均值±SD表示，P值用非配对t检验，**P<0.01；
图2显示DDX24敲除突变斑马鱼构建；图A为CRISRP/Cas9靶位点位置和序列(下划线)，前间隔序列邻近基序(PAM)序列显示为红色，ddx24敲除突变体为在靶位点附近16个碱基对的基因组片段缺失；图B为DNA测序显示敲除突变体DNA片段的缺失；图C为免疫印迹显示敲除突变体Ddx24蛋白水平的缺失；图D为ddx24敲除突变及野生型斑马鱼生存曲线；
图3显示DDX24缺乏损害斑马鱼脑血管内皮细胞出芽；图A为野生型(WT)、ddx24+/-和ddx24-/-Tg(fli1a:EGFP)胚胎在受精后3天时后脑血管的侧面和背面激光共焦图像及示意图，箭头表示中央动脉(CtA)，图B至图D为Tg(fli1a:EGFP)斑马鱼后脑CtA高度、侧位数量、背位数量的定量分析；图E为受精后36小时的对照组胚胎和受精后47小时的ddx24敲低胚胎中CtA出芽的高倍共聚焦图像，红色方块指示前端细胞；图F为CtA出芽数量和丝状伪足数量的统计图；图G和图H为转染DDX24 siRNA(siDDX24)或对照siRNA(siNC)36小时后的脑微血管内皮细胞(HCMEC)进行划痕实验的代表性图像(G)和定量(H)，蓝线表示初始划痕轮廓，红线表示划痕后16小时的轮廓；图I为转染对照或DDX24 siRNA的脑微血管内皮细胞3D出芽实验的代表性图像；图J为出芽的数量和长度的统计；标尺：图A、E(左)、G、I中的标尺为100μm，图E(右)中的标尺为20μm；数据用平均值±SD表示；通过非配对t检验(F)、单因素方差分析(B、C、D、J)和双因素方差分析(H)进行统计，ns，无显著性，*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001和****P<0.0001；
图4显示DDX24缺失抑制小鼠脑血管发育；图A为构建诱导型Ddx24基因敲除小鼠的实验策略；图B为他莫昔芬处理的出生后5天小鼠基因型及肝脏中DDX24蛋白表达；图C为小鼠出生前他莫昔芬诱导和样本分析时间；图D为胚胎第14.5天对照组和Ddx24敲除组胚胎的代表性图像；图E为小鼠脑血管发育分析时间示意图；图F为出生后5天Ddx24敲除幼鼠和同窝对照幼鼠的脑切片IB4染色的皮层区域血管图像；图G和图H为大脑皮层区域血管面积(G)和血管连接数(H)；标尺：D、F为1mm，H、K为100μm；数据用平均值±SD表示；通过非配对t检验进行统计，*P<0.05；
图5为对DDX24缺失的血管内皮细胞RNA测序揭示对关键血管发育通路的影响；图A火山图显示了DDX24 siRNA转染(DDX24-KD)和对照siRNA转染(Control)的HUVECs、HCMECs之间的差异表达基因；灰点代表无显著改变的基因，蓝点代表下调的基因，红点代表上调的基因；P值<0.05，log2(FoldChange)≥0.6被认为是差异表达基因；图B和图C显示尖端细胞标记基因(B)和血管发育相关通路(C)在DDX24-KD和对照细胞中的差异表达；
图6显示DDX24通过GPR124介导的Wnt信号调控脑血管发育；图A为与对照组相比，DDX24敲低的HCMEC细胞中差异表达的Wnt通路基因列表；图B为对照组或ddx24敲低组Tg(kdrl:mCherry；7xTCF-Xia.Siam:GFP)胚胎在脑血管发育过程中典型激光共聚焦图像，荧光光谱分析法检测mCherry阳性细胞中GFP的表达；图C为转染对照或DDX24 siRNA的HCMEC中DDX24和GPR124的蛋白质印迹分析；图D为ddx24-/-或对照斑马鱼中gpr124和Wnt靶基因的qRT-PCR分析；图E为经DMSO或Wnt激活剂CHIR-99021和BML-284处理的受精后72小时对照或ddx24 Morpholino注射胚胎脑血管的典型激光共聚焦图像，箭头表示CtA；图F和图G，经药物处理的斑马鱼CtA数量(F)和节间血管畸形(G)的统计；标尺：100μm，数据用平均值±SD表示；通过非配对t检验(D)和单因素方差分析(C、F、G、I、J、K)进行统计，ns，无显著性，*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001和****P<0.0001；
图7为DDX24调节脑血管发育的模式图；DDX24缺失的斑马鱼或小鼠表现出脑血管内皮细胞出芽抑制，脑血管发育受损；主要机制为DDX24缺失下调血管内皮细胞GPR124表达，从而失活Wnt通路；激活Wnt通路可缓解DDX24缺失导致的脑血管发育异常。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例以及实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料；所用的设备，如无特殊说明，均为常规实验设备。
细胞系和细胞培养：人脑微血管内皮细胞系HCMEC/D3由畅君雷教授(中国科学院深圳先进技术研究院)赠送。细胞在添加有5％胎牛血清(FBS，#0025，ScienCell)、1％内皮细胞生长因子(ECGS，#1052，ScienCell)的内皮细胞培养基(ECM，#1001，ScienCell)中于37℃、5％CO2潮湿培养箱中培养。
下述研究得到中山大学附属第五医院的批准。对于所有动物实验，均获得中山大学附属第五医院实验动物伦理委员会的许可。
统计分析：使用GraphPad Prism软件进行统计分析。数据以平均值±标准差表示，两组之间的比较采用非配对t检验，单因素方差分析用于比较两组以上的数据。在测试两个不同因素的影响时，使用双因素方差分析。P值<0.05被认为具有统计学意义，*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001和****P<0.0001。
实施例1 DDX24在发育中的斑马鱼和小鼠中的表达模式
1、整体原位杂交
通过PCR制备ddx24反义探针模版，并使用T7 RNA聚合酶(#10881767001，Roche)、用地高辛标记UTP(#11277073910，Roche)进行体外转录，所用PCR引物序列为ddx24_F：5′-GAGATCATCATCGCCACACCAGGC-3′，ddx24_T7_R：5′-TAATACGACTCACTATATGCGGTGCACATACGTCTCTGAGGT-3′。具体地，胚胎用4％多聚甲醛固定并置于甲醇溶液中-20℃储存。在复水、渗透和预杂交后，将含探针的杂交缓冲液加入胚胎中65℃过夜，然后洗涤并用封闭缓冲液(含2％山羊血清及2mg/ml BSA的PBS溶液)封闭。然后与碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体(#11093274910，Roche)孵育，将其洗涤，添加NBT/BCIP底物(#11697411001，Roche)用于显色。然后将胚胎置入甘油中，并在徕卡S9D显微镜上成像。
2、qRT-PCR基因表达分析
使用TRIzol试剂提取总RNA，并通过NanoDrop(ThermoFisher Scientific)定量。cDNA由iScriptTM gDNA Clear cDNA Synthesis Kit(#1725035，Bio-Rad)合成，实时定量PCR使用using iTaqTM Universal
Figure SMS_1
Green Supermix(#1725125，Bio-Rad)，通过Bio-Rad CFX96检测，并使用Bio-Rad Manager软件进行分析。所用引物序列见表1。
表1 qRT-PCR引物序列
Gene Species Forward primer Revere primer
ddx24 Zebrafish CAGACGTTTGTGTTCTCCGC GTCAGGTCGATGACCTTGGG
kdrl Zebrafish TCCCCTTACCCTGGCTTACA GTGGGCCTCTGAGATGGTTC
adgra2 Zebrafish TACAGAACTGCGTGAGCTGTC AGAGTGCAACTGAGGCCAAG
lef1 Zebrafish CTGTATATGAAAGAGATGCGCG CTTGCGGGCTAATTCGTAATAC
tcf15 Zebrafish AGCACCCAGAGAAAAGGGATAA TTGCTAGGAGTGTCGCTCAC
actb Zebrafish CCGTGACATCAAGGAGAAGC TACCGCAAGATTCCATACCC
DDX24 Human GCTCAGAAACCTGGAGCAGT TAAATCTCCGAGGTACGTGG
ADGRA2 Human GGCATCACCCTGCACTACTC GCGATCAAATAGAACCGGAGCA
GAPDH Human GCAAATTCCATGGCACCGT TCGCCCCACTTGATTTTGG
3、免疫荧光
在冰上解剖出生后小鼠，取各器官在在4％多聚甲醛中4℃固定过夜。然后将组织在30％蔗糖溶液中4℃处理48小时。将组织包埋在Tissue Tek O.C.T.中，并使用MicromHM525 NX Cryostat(ThermoFisher)进行冠状切片，切片厚度为40μm。用1x PBS漂洗切片，然后用4％多聚甲醛固定30分钟。用PBST(含1％Triton X-100的PBS溶液)漂洗三次，每次10分钟，切片用5％BSA封闭溶液室温下孵育1小时，然后与抗DDX24抗体(#ab201080，Abcam，1:200稀释)、IsolectinB4-Alexa FluorTM 568(#I21411,ThermoFisher,1:250稀释)在4℃下孵育过夜。然后添加Dylight 488偶联的二抗(#A23220，Abbkine，1:200稀释度)。使用细胞核染料DAPI复染。用卡尔蔡司LSM 880激光共聚焦显微镜成像。
结果：为了研究DDX24在血管发育中的潜在作用，我们首先利用整体原位杂交技术检测DDX24在斑马鱼发育过程中的表达模式。ddx24 mRNA的表达可早在128-细胞期检测到，表明母体基因表达(图1A)。在受精后24小时(24hpf)，即早期血管发育时，ddx24在头部和躯干中普遍表达(图1B，C)。在48hpf时，ddx24的表达局限于头部和心脏区域(图1D)，在72hpf时其表达水平进一步降低(图1E)。实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析证实，ddx24mRNA在12和24hpf时达到峰值，然后逐渐降低(图1F)。为了进一步证实ddx24是否在血管内皮细胞中表达，我们使用荧光激活细胞分选(FACS)从48hpfTg(flk1:EGFP)斑马鱼中分离出内皮细胞，并显示ddx24在内皮细胞中的表达显著高于非内皮细胞(图1G)。
在新生小鼠中，通过免疫荧光检测DDX24在不同器官中的表达。我们发现DDX24在主动脉及不同器官的血管中均有表达，值得注意的是DDX24在大脑中的表达局限于血管内皮细胞(图1H)。综上所述，这些数据表明DDX24在早期血管发育中表达，提示DDX24可能在血管发育中发挥作用。
实施例2 DDX24缺失抑制斑马鱼脑血管发育
1、斑马鱼模型
斑马鱼按照标准条件进行饲养，所有斑马鱼实验程序均获得中山大学附属第五医院制定的《动物实验机构伦理准则》的批准。AB野生型和Tg(fli1a:EGFP)、Tg(kdrl:mCherry)转基因斑马鱼品系购买自国家斑马鱼资源中心，Tg(7xTCF-Xla.Siam:GFP)ia4转基因斑马鱼品系由中国海洋大学赵龙教授赠送。Morpholino(MO)显微注射实验中，将1.5ngddx24MO(5’-TAATCTGTGCCCCTGTTC-3’)或标准对照MO(5’-CCTCTTACTCAGTTACAATTATA-3’)注射至1-4细胞期胚胎的卵黄囊中。所有Morpholino均从Gene Tools公司订购。
Ddx24敲除突变斑马鱼由南京歆佳医药科技有限公司通过CRISPR/Cas9技术构建。靶序列设计在第3号外显子，位于解螺旋酶结构域及ATP结合结构域上游，具体靶序列为5’-GAAGAGCCGTCACTGGAGCC-3’。应用高分辨率溶解曲线鉴定基因型，所用引物序列为正向5’-AGTCTCTGCTGCCCCTCA-3’，反向5’-CACCAGCAGATCCCTCCAG-3’。
2、图像采集与数据分析
对于斑马鱼图像采集，将指定阶段的麻醉胚胎固定在3％甲基纤维素(#M0387，Sigma-Aldrich)中进行成像，并使用卡尔蔡司LSM 880激光共聚焦显微镜拍摄Z-stack图像。脑中央动脉表型使用蔡司ZEN软件进行定量，丝状伪足的数量和长度使用ImageJ进行定量。
3、体外实验
对于3D血管内皮细胞出芽实验，将细胞以150个细胞/微珠的浓度与
Figure SMS_2
微珠(#C3275，Sigma-Aldrich)孵育4小时，在此期间每20分钟摇晃一次，然后使其粘附过夜。然后将包被了细胞的微珠以250微珠/ml的浓度重悬在纤维蛋白原溶液中(2mg/ml，#F823833，Macklin)。将500μl纤维蛋白原/微珠铺于含有0.625U凝血酶(#HY-114164，MedChemExpress)的24孔板中形成凝胶，将其置于37℃培养箱中10-15分钟加速凝固。凝胶凝固后，向每个孔中添加1ml含有10ng/ml VEGF的内皮细胞培养基(ECM，#10020，PeproTech)。3天后，使用相差显微镜拍摄图像，使用ImageJ软件(https://imagej.nih.gov/ij/)测量每个微珠上出芽的数量和长度。
对于细胞划痕实验，将血管内皮细胞接种到96孔细胞培养板中。待细胞长满后使用划痕器(#4493,Essen BioScience)划痕。通过IncuCyte S3(Essen BioScience)捕获和分析图像。
结果：为了探讨DDX24在脑血管发育中的作用，我们首先在斑马鱼模型中研究了DDX24缺乏对血管发育的影响。我们使用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建ddx24敲除(KO)突变体(图2A)。我们筛选到了导致蛋白翻译提前终止的16bp缺失突变(图2A，图2B)，并通过免疫印迹验证了斑马鱼Ddx24蛋白水平的缺失(图2C)。ddx24-/-斑马鱼胚胎在受精后7天内全部死亡，我们未能得到成年纯合ddx24敲除斑马鱼。
我们观察了DDX24缺失是否影响脑血管的发育。斑马鱼后脑血管新生是从29hpf开始的，中央动脉(CtA)从原始后脑通道(PHBC)出芽迁移至后脑，在约48hpf形成功能性管腔和特征性拱形结构。我们在72hpf观察到ddx24敲除突变体脑血管发育缺陷，表现为CtA数量减少和延伸长度降低(图3A至图3D)。回溯至CtA出芽时期，我们观察到ddx24敲低组CtA出芽抑制，与36hpf野生型胚胎相比，47hpfddx24敲低胚胎表现出CtA出芽数量和CtA丝状伪足数量减少(图3E和图3F)。
接下来，为了在体外验证DDX24在脑血管发育中的作用，我们使用了人脑微血管内皮细胞(HCMEC)系HCMEC/D3，该细胞系已被广泛用于脑血管内皮细胞研究，并适用于脑血管内皮细胞相关的机制和药物研究。HCMEC中转染DDX24或对照siRNA，发现DDX24敲低降低内皮细胞迁移(图3G和3H)和出芽(图3I和3J)能力。这些数据表明，DDX24缺失损害脑血管发育。
实施例3 DDX24缺失抑制小鼠脑血管发育
1、小鼠模型
动物饲养和所有实验程序均获得中山大学附属第五医院制定的《动物实验机构伦理准则》批准(项目编号：00028)。将动物小鼠放在明/暗周期(14/10小时)，恒温(26℃)，可以随意获取食物和水的环境。
Ddx24KO小鼠是基于Cre-loxP系统构建。LoxP-Ddx24小鼠是由上海南方模式生物科技股份有限公司(中国上海)利用CRISPR/Cas9技术在C57BL/6J小鼠背景下构建，我们获得了在Ddx24基因3和5号外显子的两侧具有LoxP位点的小鼠。CAG-CreERTM小鼠是从Jackson实验室购买。通过将Ddx24flox/flox与CAG-CreERTM小鼠交配产生可诱导的Ddx24敲除小鼠。为了诱导Cre活性，从受精后8.5到10.5天每天一次给小鼠腹腔注射75mg/kg体重的他莫昔芬(#HY-13757A，MedChemExpress，20mg/ml溶于乙醇/玉米油中)，或从出生后1到3天每天一次给新生幼鼠注射30μl他莫昔芬(2mg/ml溶于乙醇/玉米油中)。
用于基因型鉴定的引物为：Ddx24-flox_F:TGCAAGAATGGAGTGACTGGGAAC，Ddx24-flox_R:CAAGCACATGCTGTGTTCTGTG；CAG-Cre_F:TGCCACGACCAAGTGACAGCAATG，CAG-Cre_R:ACCAGAGACGGAAATCCATCGCTC。对于Ddx24野生型、杂合、纯合flox预期扩增片段大小分别为416bp、416/500bp和500bp。对于CAG-CreERTM的基因分型，仅在转基因小鼠中检测到377bp的PCR产物。
2、免疫荧光
在冰上解剖出生后小鼠，将大脑在4％多聚甲醛中4℃固定过夜。然后将组织在30％蔗糖溶液中4℃处理48小时。将组织包埋在Tissue Tek O.C.T.中，并使用MicromHM525 NX Cryostat(ThermoFisher)进行冠状切片，切片厚度为40μm。用1x PBS漂洗切片，然后用4％PFA固定30分钟。用PBST(含1％Triton X-100的PBS溶液)漂洗三次，每次10分钟，切片用5％BSA封闭溶液室温下孵育1小时，之后加入IsolectinB4-Alexa FluorTM 568(#I21411,ThermoFisher,1:250稀释)在4℃下孵育过夜。漂洗后用卡尔蔡司LSM 880激光共聚焦显微镜成像。每个样本至少拍摄4个层面，血管面积、血管连接数量使用AngioTool(版本0.6a，https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home)进行定量。
结果：为了验证DDX24在小鼠血管发育中的作用，我们通过将Ddx24flox/flox小鼠与他莫昔芬诱导的CAG-CreERTM转基因小鼠杂交产生DDX24-KO小鼠(图4A)。他莫昔芬注射导致CAG-Cre+/-；Ddx24flox/flox(Ddx24-/-)小鼠中DDX24蛋白显著减少(图4B)。为了研究DDX24缺失对早期血管形成的影响，从胚胎期(E)8.5到E10.5天，每天注射他莫昔芬一次以诱导Cre活性。与先前的报道的一致，DDX24缺乏导致胚胎致死(图4C和4D)。因此，我们在小鼠出生后注射他莫昔芬，以评估出生后的血管发育(图4E)。对出生后第5天小鼠脑血管染色发现，与Ddx24+/+(WT)同窝小鼠相比，Ddx24-/-小鼠脑血管血管面积和连接数量显著减少(图4F至4H)。上述结果说明在哺乳动物模型中DDX24缺失抑制脑血管发育。
实施例4 DDX24通过Wnt信号调控脑血管发育
1、RNA测序
使用TRIzol试剂(#15596018，Invitrogen)提取细胞总RNA。然后每组样本构建RNA测序文库，使用Illumina HiSeq 6000测序仪进行测序。对原始序列读数进行质量控制(QC)，然后将过滤后的数据与参考基因组比对。基因表达变化倍数≥1.5和P值<0.05认为差异表达。RNA测序数据保存在NCBI-Gene Expression Omnibus数据库中(编号：GSE185261)。
2、蛋白质印迹
在含有蛋白酶抑制剂混合物的RIPA裂解缓冲液中裂解细胞。采用BCA法测定蛋白质浓度。蛋白质通过5-20％SDS-PAGE凝胶分离并转移到PVDF膜上。本研究使用了以下一抗：抗人DDX24(#A300-697，Bethyl Laboratories)、抗小鼠DDX24(#ab201080，Abcam)、抗斑马鱼Ddx24(#EM1902，中国杭州华安生物)、抗GPR124(#AF9073，Affinity)、抗β-actin(#4970，Cell Signaling Technology)。
3、药物治疗
小分子化合物的应用在6孔板中进行，每组约20只胚胎。本研究使用了以下药物：CHIR-99021(#HY-10182A，MedChemExpress)、BML-284(#HY-19987，MedChemExpress)。所有药物均溶DMSO中。对于CHIR-99021或BML-284治疗，药物分别稀释至1μM或10ng/ml的最终浓度，Tg(fli1a:EGFP)胚胎在5至72hpf之间暴露于药物中，然后进行表型分析。以单独含有DMSO的胚胎培养液作为对照。
结果：为了探索DDX24调控血管发育的机制，我们对DDX24敲低的脑血管内皮细胞HCMEC及非脑血管内皮细胞HUVEC进行了RNA测序。与对照组相比，DDX24敲除的HUVEC和HCMEC中分别有1110和1071个基因差异表达(图5A)。我们发现尖端细胞标记基因在DDX24缺失的HUVEC中上调，但在HCMEC中降低(图5B)。通过比较VEGF、Wnt和Notch等重要血管发育相关通路基因的表达水平，我们发现，在DDX24缺失的HUVEC中，VEGF通路的上调占主导地位，而在DDX24缺失的HCMEC中，Wnt通路的下调占主导地位(图5C)，DDX24可能通过Wnt通路调控脑血管发育。实际上，文献报道，Wnt/β-catenin信号通路在脑血管发育期间大量激活，是脑血管发育所必需的。
图6A列出差异表达的Wnt通路基因，显示Wnt通路基因的下调。使用Wnt/β-catenin报告斑马鱼品系Tg(7xTCF-Xla.Siam:GFP)ia4，我们观察到GFP荧光在33和48hpf野生型胚胎的PHBC和CTA中的表达，但在Ddx24缺失的胚胎中低或没有表达(6B)。此外，在差异表达的基因中，我们注意到ADGRA2(GPR124)的显著下调。GPR124是位于内皮细胞上的Wnt通路共受体，非VEGF依赖的脑血管发育调控基因。我们通过免疫印迹或实时荧光定量PCR证实GPR124在DDX24缺失的HCMEC细胞系和斑马鱼头部中下调(图6C和6D)。这些结果表明DDX24可能通过下调GPR124进而失活Wnt通路从而调控脑血管发育。
为了进一步验证DDX24对脑血管发育的调控依赖于Wnt通路，我们应用两种不同的Wnt通路激活剂CHIR-99021和BML-284处理斑马鱼，这两种药物都可上调Wnt通路靶基因。我们发现Wnt通路激活剂处理的ddx24敲低斑马鱼脑血管发育有所恢复(图6E和6F)。Wnt通路激活剂对斑马鱼躯干血管发育无明显的作用。上述结果表明，DDX24通过GPR124介导的Wnt通路调控脑血管发育。
综上，如图7所示，DDX24缺失的斑马鱼或小鼠表现出脑血管内皮细胞出芽抑制，脑血管发育受损；主要机制为DDX24缺失下调血管内皮细胞GPR124表达，从而失活Wnt通路；激活Wnt通路可缓解DDX24缺失导致的脑血管发育异常。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (1)

1.对DDX24基因或者其表达产物具有促进作用的功能产品在制备恢复ddx24敲低的脑血管发育的产品方面的应用，其特征在于，所述功能产品为CHIR-99021，BML-284。
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