CN113215158A

CN113215158A - 一种用于肿瘤治疗靶点和诊断生物标志物的circPTEN1及其应用

Info

Publication number: CN113215158A
Application number: CN202110570178.XA
Authority: CN
Inventors: 尹玉新; 梁会; 郑林
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2021-05-25
Filing date: 2021-05-25
Publication date: 2021-08-06
Anticipated expiration: 2041-05-25
Also published as: CN113215158B

Abstract

本发明提供了一种用于肿瘤治疗靶点和诊断生物标志物的circPTEN1及其应用，属于生物技术领域。用于肿瘤治疗靶点和诊断生物标志物的circPTEN1，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，为PTEN mRNA第1～5外显子反向剪接形成的新的环状RNA。circPTEN1高表达显著抑制结直肠癌细胞的迁移和侵袭，circPTEN1的表达水平与结直肠癌患者淋巴结转移和远处转移呈负相关，且circPTEN1低表达的结直肠癌患者预后较差。因此，circPTEN1作为肿瘤治疗靶点和诊断生物标志物应用到肿瘤治疗、肿瘤诊断以及肿瘤预后作用评估中，并为治疗相关的药物及诊断产品提供了新思路和新策略。

Description

一种用于肿瘤治疗靶点和诊断生物标志物的circPTEN1及其应用

技术领域

本发明属于生物技术技术领域，具体涉及一种用于肿瘤治疗靶点和诊断生物标志物的circPTEN1及其应用。

背景技术

PTEN基因是人类肿瘤中最常发生突变的抑癌基因之一，其突变或缺失与人类多种肿瘤的发生发展密切相关。以往的研究证明，PTEN蛋白可以通过去磷酸化去磷酸化PtdIns(3,4,5)P3而抑制PI3K/Akt信号级联反应，进而控制细胞增殖、侵袭，并促进细胞凋亡。PTEN基因除了具有抑癌功能外，还参与细胞代谢和抗病毒天然免疫等多种生物学过程。近年来发现，除了传统PTEN蛋白，PTEN基因可由非AUG密码子起始编码三种N端延伸PTEN家族新亚型蛋白(PTENα、PTENβ和PTENε)，这些新亚型蛋白具有不同的肿瘤生物学功能。尽管如此，目前对典型PTEN蛋白和PTEN亚型蛋白的探索并不能完全揭示该基因参与肿瘤发生发展过程的多样性，PTEN蛋白家族的抑癌机制也缺乏深入研究。总的来说，以往对PTEN基因的研究主要集中在探讨传统的PTEN蛋白和N端延伸的PTEN亚型蛋白的抑癌功能上，而对PTEN基因产生的非编码RNA的研究鲜有报道。

只有不到2％的人类基因组序列是蛋白质编码基因，而人类转录组大多数序列是非编码RNA，即没有编码蛋白质的能力。circRNA是一类由mRNA前体反向剪接形成的不具有5’帽子和3’poly(A)尾的单链闭合的新型非编码RNA分子。随着RNAseq技术和生物信息学分析技术的不断更新和完善，大量的circRNA被发现广泛表达于真核生物中，例如在真核细胞中就有近10％的基因转录可以剪接产生circRNA并发挥生物学功能。circRNA在真核细胞中发挥着广泛的生物学功能，例如作用于miRNA“海绵”、蛋白质“海绵”、调节mRNA的稳定性、调节亲本基因转录，此外，有研究表明部分circRNA具有翻译功能蛋白的能力。多项研究表明，circRNA在肿瘤的发生发展和侵袭或转移中起着至关重要的作用。

结直肠癌是全球高发的消化道恶性肿瘤之一，其发病率在所有恶性肿瘤中居第三位，死亡率居第二位。结直肠癌肝转移是导致患者死亡的主要原因，约1/2的结直肠癌患者在病程中会出现结直肠癌肝转移。然而，超过一半的病例和死亡是由可改变的危险因素引起的，如吸烟、不健康的饮食、高饮酒、缺乏体育锻炼和超重等，通过适当的筛查和监测，也可以降低结直肠癌发病率和死亡率。虽然已经采用了综合治疗，但结直肠癌的预后仍然很差，其主要原因是初诊时间较晚，肝转移的频率较高，这可能是由于缺乏早期诊断和有效的靶向治疗药物所致。因此，有效的诊断和治疗方法对于结直肠癌的研究具有重要意义。

近年来，circRNA被广泛报道参与结直肠癌的发生发展。Zhou等人发现hsa_circ_100859通过“海绵”吸附miR-217/HIF-1α途径在结直肠癌的进程中起促进作用，Zheng等人发现circPPP1R12A编码的蛋白通过Hippo-Yap信号促进结直肠癌的发生和转移，另外，Yang等人也认为circPTK2是早期诊断转移性结直肠癌的生物标记物。circRNA参与结直肠癌进程的机制复杂多样，除了部分circRNA以吸附miRNA或编码蛋白的方式促进结直肠癌进程外，一些circRNA也可以对结直肠癌的发生发展起抑制作用。例如，Geng等人发现hsa_circ_0009361作为miR-582的“海绵”通过调节APC2的表达抑制结直肠癌进展，Li等人研究表明，circITGA7通过调节RAS途径和上调其宿主基因ITGA7的转录来抑制结直肠癌的生长和转移，提示circITGA7可作为治疗大肠癌的潜在靶点。但总的来说，大多数circRNA在结直肠癌的过程和发病机制中的具体作用仍不清楚。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种新的环状RNA，即一种circPTEN1，能够作为肿瘤治疗靶点和诊断生物标志物应用到肿瘤治疗、诊断和预后评价中。

本发明提供了一种用于肿瘤治疗靶点和诊断生物标志物的circPTEN1，所述circPTEN1的核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示。

本发明提供了一种用于诊断肿瘤发生或肿瘤预后评估的试剂盒，包括与所述circPTEN1特异性互补配对的分子探针或用于扩增所述circPTEN1的引物对。

本发明提供了所述circPTEN1或抑制翻译调节因子EIF4A3表达的试剂在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。

优选的，所述肿瘤包括结直肠癌。

优选的，所述肿瘤包括原发瘤和转移瘤。

本发明提供了一种用于抗肿瘤的药物，所述药物以所述circPTEN1为活性成分。

优选的，所述肿瘤包括结直肠癌。

本发明提供了一种抑制TGFβ/Smad4通路介导的EMT相关基因表达的试剂在制备抑制肿瘤迁移的药物中的应用；所述试剂包括所述circPTEN1。

本发明提供了一种用于抑制肿瘤转移的药物，所述所述circPTEN1为活性成分。

本发明提供了一种用于肿瘤治疗靶点和诊断生物标志物的circPTEN1，所述circPTEN1的核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示。本发明首次公开PTEN mRNA第1-5外显子反向剪接形成的环状RNA(circPTEN1)，circPTEN1的表达具有明显的人鼠进化保守性，同时还具有耐受RNA酶R消化及放线菌素D处理的特点。circPTEN1在肿瘤组织和细胞中表达下调，且circPTEN1低表达的肿瘤患者预后较差，circPTEN1的表达水平与结直肠癌患者淋巴结转移和远处转移呈负相关；本发明体外实验和活体动物实验均证明：无论是稳定表达circPTEN1的肿瘤细胞系，还是内源circPTEN1敲除细胞系，均可以证明circPTEN1高表达显著抑制结直肠癌细胞的迁移和侵袭，而对细胞凋亡、增殖和克隆形成能力无显著影响。因此，本发明基于这一新型环状RNA(circPTEN1)核酸序列，可以为肿瘤治疗，尤其是转移瘤的临床治疗或预防方面提供一种新的药物靶点，为提前诊断肿瘤的发生提供了新的思路和策略。

本发明提供了一种抑制TGFβ/Smad4通路介导的EMT相关基因表达的试剂在制备抑制肿瘤迁移的药物中的应用；所述试剂包括所述circPTEN1。实验研究表明，翻译调节因子EIF4A3与circPTEN上游侧翼序列结合，实现负向调控circPTEN的表达。因此，抑制EIF4A3的表达从而上调circPTEN的表达，同时基于circPTEN的高表达抑制结直肠癌细胞的迁移和侵袭，从而实现抑制肿瘤迁移的目的。

同时，本发明提供了一种抑制TGFβ/Smad4通路介导的EMT相关基因表达的试剂在制备抑制肿瘤迁移的药物中的应用，所述试剂包括所述circPTEN1。本发明实施例证明，circPTEN1主要定位于细胞浆，通过结合Smad4，进而抑制TGFβ/Smad4通路介导的EMT相关基因的表达，最终达到抑制肿瘤转移的目的。

附图说明

图1为circPTEN1反向剪接位点序列的Sanger测序图；

图2为circPTEN1反向剪接的扩增产物聚丙烯酰胺凝胶图；

图3为circPTEN1的Northernblot结果图；

图4为验证circPTEN1的稳定性的RNA酶R消化实验结果图；

图5为检测circPTEN1的半衰期的放线菌素D处理结果图；

图6为检测circPTEN1细胞浆和细胞核分布情况的RT-PCR结果图；

图7为检测circPTEN1细胞浆和细胞核分布情况的FISH结果图；

图8为检测circPTEN1在肠癌组织和癌旁组织表达水平的RT-PCR结果图；

图9为检测circPTEN1在肠癌组织和癌旁组织表达水平的FISH结果图；

图10为分析circPTEN1表达水平与肠癌患者生存期的结果图；

图11为检测EIF4A3与circPTEN1侧翼序列结合关系的质谱结果图；

图12为检测EIF4A3与circPTEN1侧翼序列结合关系的RIP结果图

图13为分析EIF4A3水平与circPTEN1水平关系的结果图；

图14为分析EIF4A3水平对circPTEN1表达水平的影响的结果图；

图15为揭示circPTEN1与Smad4结合关系的质谱结果图；

图16为验证circPTEN1与Smad4结合关系的RIP结果图

图17为揭示circPTEN1直接结合Smad4的EMSA结果图；

图18为揭示circPTEN1直接结合Smad4 MH2结构域的RIP结果图；

图19为揭示circPTEN1直接结合Smad4 MH2结构域的EMSA结果图；

图20为检测circPTEN1对TGFβ介导Smad复合物形成影响的结果图；

图21为检测circPTEN1对TGFβ介导Smad2/Samd3细胞核分布影响的结果图；

图22为检测circPTEN1对TGFβ介导的EMT的相关转录因子表达水平的影响结果图；

图23为检测circPTEN1对TGFβ介导的EMT标志物表达水平的影响结果图；

图24为检测circPTEN1对肠癌侵袭和转移能力影响的Transwell结果图；

图25为检测circPTEN1对肠癌侵袭和转移能力影响的3D瘤体形成实验结果图；

图26为检测circPTEN1对肠癌肺转移能力影响的小鼠体内实验结果图；

图27为检测circPTEN1对肠癌肝能力影响的小鼠体内实验结果图。

具体实施方式

本发明提供了一种用于肿瘤治疗靶点和诊断生物标志物的circPTEN1，所述circPTEN1的核苷酸序列如SEQ ID NO:28(ccacaggctcccagacatgacagccatcatcaaagagatcgttagcagaaacaaaaggagatatcaagaggatggattcgacttagacttgacctatatttatccaaacattattgctatgggatttcctgcagaaagacttgaaggcgtatacaggaacaatattgatgatgtagtaaggtttttggattcaaagcataaaaaccattacaagatatacaatctttgtgctgaaagacattatgacaccgccaaatttaattgcagagttgcacaatatccttttgaagaccataacccaccacagctagaacttatcaaacccttttgtgaagatcttgaccaatggctaagtgaagatgacaatcatgttgcagcaattcactgtaaagctggaaagggacgaactggtgtaatgatatgtgcatatttattacatcggggcaaatttttaaaggcacaagaggccctagatttctatggggaagtaaggaccagagacaaaaag)所示。所述circPTEN1PTEN mRNA第1～5外显子反向剪接形成的环状RNA。circPTEN1的表达具有明显的人鼠进化保守性，耐受RNA酶R消化及放线菌素D处理，具有较高的稳定性。

本发明实验证明，circPTEN1的表达水平在肿瘤组织与癌旁组织中呈显著性差异，因此，可以作为肿瘤诊断生物标志物应用于肿瘤治疗中。且circPTEN1低表达的结直肠癌患者预后较差，说明circPTEN1本身可以作为评估肿瘤预后作用的标志物。因此，本发明提供了一种用于诊断肿瘤发生或肿瘤预后评估的试剂盒，包括与所述circPTEN1特异性互补配对的分子探针或用于扩增所述circPTEN1的引物对。

本发明实验证明，circPTEN1高表达显著抑制结直肠癌细胞的迁移和侵袭，而对细胞凋亡、增殖和克隆形成能力无显著影响，因此，circPTEN1作为肿瘤治疗靶点应用于抗肿瘤中。并且翻译调节因子EIF4A3与circPTEN1上游侧翼序列结合，进而抑制circPTEN1的表达，因此，抑制翻译调节因子EIF4A3表达的试剂实现上调circPTEN1的表达。基于此，本发明提供了所述circPTEN1或抑制翻译调节因子EIF4A3表达的试剂在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。

本发明还提供了一种抗肿瘤的药物，以circPTEN1为活性成分，还包括药学上可接受的辅料。所述辅料优选包括一种或多种的药用赋形剂或药用载体。所述药用载体优选包括慢病毒、腺相关病毒等。本发明对所述药物的剂型没有特殊限定，采用医学上可接受的剂型即可，例如胶囊剂，片剂或注射液等。在本发明中，所述肿瘤优选包括结直肠癌。所述肿瘤优选包括原发瘤和转移瘤。

本发明实验证明，circPTEN1的表达水平与结直肠癌患者淋巴结转移和远处转移呈负相关。因此，本发明提供了一种用于抑制肿瘤转移的药物，以circPTEN1为活性成分。

本发明实验证明，circPTEN1主要定位于细胞浆，结合Smad4，进而抑制TGFβ/Smad4通路介导的EMT相关基因的表达，最终抑制肿瘤转移同时本发明还提供了一种抑制TGFβ/Smad4通路介导的EMT相关基因表达的试剂在制备抑制肿瘤迁移的药物中的应用。所述试剂优选包括所述circPTEN1。所述TGFβ/Smad4通路介导的EMT相关基因优选包括Snail、Slug和/或ZEB1基因。所述药物还包括药学上接受的辅料。所述辅料优选包括一种或多种的药用赋形剂或药用载体。所述药用载体优选包括慢病毒、腺相关病毒等。本发明对所述药物的剂型没有特殊限定，采用医学上可接受的剂型即可，例如胶囊剂、片剂或注射液等。本发明对所述药物的制备方法没有特殊限制采用本领域所熟知的核酸药物的制备方法即可。

下面结合实施例对本发明提供的一种用于肿瘤治疗靶点和诊断生物标志物的circPTEN1及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

PTEN基因来源的环状RNA(circPTEN1)的发现与鉴定

在本实施案例中，利用生物信息手段结合PCR扩增技术确定PTEN基因来源的环状RNA(circPTEN)的存在并对其进行生物学特征的鉴定，具体内容如下：

1.PTEN基因来源的环状RNA(circPTEN)的发现

利用circBase(http://www.circbase.org)数据库分析发现，PTEN基因可剪接形成8种的circRNA，分别是hsa_circ_0002232、hsa_circ_0002934、hsa_circ_0003058、hsa_circ_0019058、hsa_circ_0019059、hsa_circ_0019060、hsa_circ_0094342和hsa_circ_0094343。

与PTEN mRNA的传统线性剪接不同的是，hsa_circ_0002232是由PTEN基因(chr10：89624210-89693008)编码mRNA的第1外显子的后半部分和第2、3、4、5外显子通过反向剪接而成，其成熟序列长度为508bp(参见图1)。

进一步通过设计跨环化接头位点的外扩型引物(Divergent primer，F:actgtaaagctggaaagggacg，SEQ ID NO:1，R:gctaacgatctctttgatgatggc，SEQ ID NO:2)，在NCM460细胞中通过PCR成功扩增出接头附近长约171bp的序列并进行Sanger测序，检测到PTEN第1外显子和第5外显子的3’端和5’端反向剪接序列(参见图1)。可见，本实施例成功鉴定了hsa_circ_0002232的存在，由于该circRNA来源于PTEN基因，将其命名为circPTEN1(SEQ ID NO:28)。

扩增反应条件：

(1)95℃5min；

(2)95℃1min；

(3)55℃40S；

(4)72℃30S；

(5)72℃5min；

(2)-(4)37个循环。

2.PTEN基因来源的环状RNA(circPTEN)环化鉴定和保守性分析

首先，设计跨剪接位点的外扩型引物(Divergentprimer，SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2)用于鉴定及特异性检测circPTEN，同时在第5外显子上设计内收型引物(Convergentprimer，PTEN F:ATTGCAGAGTTGCACAATATCC，SEQ ID NO:7；PTENR:AATAATACACATAGCGCCTCTG，SEQ ID NO:8)用于检测PTENmRNA，在正常结肠上皮细胞系DLD1和LoVo中验证了circPTEN的环化特征。因为circPTEN是在转录后剪接水平形成的环状RNA，所以其剪接位点序列不存在于基因组上，为了排除观察到的circPTEN的头尾剪接是由反式剪接、基因组重排或PCR产物产生的等诸多可能性，用设计的外扩型及内收型引物分别扩增circPTEN和PTENmRNA。在DLD1和LoVo细胞cDNA及基因组DNA(gDNA)中通过PCR扩增(扩增程序如上所述)及琼脂糖凝胶电泳。

结果显示，外扩型引物仅能在cDNA上扩增出条带，在gDNA上不能扩增出条带，而内收型引物在cDNA和gDNA上均能扩增出PTEN基因(参见图2)。这些结果说明，circPTEN不是通过基因组重排形成的，而是在转录后水平通过反向剪切形成的环状RNA，而且应用外扩型引物可以特异性检测circPTEN。

3.circPTEN的Northernblot验证

Northernblot实验是一种有效的特异性检测RNA的杂交技术，是检测RNA的金标准。使用探针可对内源性的circPTEN和PTEN mRNA做定量和定性检测。本实施例参照DIGNorthern Starter Kit标记及杂交检测试剂盒(Roche，12039672910)的说明书，合成跨circPTEN环化接头位点的引物，采用体外转录法进行地高辛(DIG)标记的RNA探针合成反应，采用酶联免疫方法及CDP-Star进行杂交分子的底物化学发光检测。

具体步骤如下：以GAPDH探针为内参对照探针，分别使用与环化接头杂交的circPTEN探针和用与外显子2～5杂交的PTEN mRNA探针进行检测。结果在RNase R-组成功检测了到内源性的circPTEN(508nt)和宿主基因PTEN(8515nt)，这也与circBase数据库的对circPTEN的注释相符。同时，在RNase R+组中却只能检测到circPTEN条带，检测不到PTENmRNA的条带，从而鉴定了内源性的circPTEN的存在(参见图3)。

circPTEN1探针的具体核苷酸序列如下：

F:taatacgactcactataggggataagttctagctgtggtggg(SEQ ID NO:3)；其中划线碱基为T7启动子序列；

R:ctgtaaagctggaaagggacg(SEQ ID NO:4)；

PTEN探针的具体核苷酸序列如下：

F:taatacgactcactatagggtctagggcctcttgtgcc(SEQ ID NO:5)；其中划线碱基为T7启动子序列；

R:gctatgggatttcctgcag(SEQ ID NO:6)。

4.circPTEN的稳定性验证

4.1 circRNA缺乏游离的5’末端和3’末端，有其独特的闭合环状结构，因而能够抵抗核酸外切酶RNA酶R(RNase R)的消化作用，因RNA酶R能够消化几乎所有的线性RNA分子，但不易消化circRNA，故RNA酶R消化实验广泛用于circRNA的稳定性鉴定实验，以证明其具有环形结构。本实验首先在结直肠细胞NCM460中提取总RNA，应用RNA酶R消化处理后，再应用RT-PCR方法分别检测了circPTEN以及线性PTEN mRNA的水平。结果表明，与PTEN mRNA相比，circPTEN的确能够耐受RNA酶R的消化(参见图4)。

circPTEN F:actgtaaagctggaaagggacg(SEQ ID NO:1)；

circPTEN R:gctaacgatctctttgatgatggc(SEQ ID NO:2)；

PTEN F:attgcagagttgcacaatatcc(SEQ ID NO:7)；

PTEN R:aataatacacatagcgcctctg(SEQ ID NO:8)；

GAPDH F:agaaggctggggctcatttg(SEQ ID NO:9)；

GAPDH R:aggggccatccacagtcttc(SEQ ID NO:10)。

4.2用放线菌素D(Actinomycin D)抑制结直肠癌细胞NCM460新生RNA的合成，以此来验证circPTEN的稳定性。通过qRT-PCR检测circPTEN和PTEN mRNA的24h内降解速率，结果表明，PTEN mRNA已几乎降解完全，而circPTEN的半衰期大于24h，这说明circPTEN具有很高的稳定性(参见图5)。

以上实验进一步证实，circPTEN具有环化生物学特征和能够耐受RNA酶R消化及放线菌素D处理，具有较高的稳定性。

5.circPTEN的亚细胞定位

由于circRNA功能的发挥与其定位密切相关，外显子来源的circRNA通常定位于细胞浆，而内含子来源的circRNA多数定位于细胞核。因为上述实验结果证明，circPTEN是外显子来源的circRNA，推测其可能定位于细胞浆，为了验证此推论并探究circPTEN的具体亚细胞定位情况，本实验进行了核浆分离实验和细胞RNAFISH实验，具体步骤如下。

首先按照核浆分离试剂盒PARIS^TM Kit(Life Technologies)的说明书操作，分别提取细胞质和细胞核的RNA，用随机引物进行反转录得到细胞质、细胞核的cDNA文库，并通过所述外扩型引物进行RT-PCR实验(内参基因GAPDH引物同上，U1为细胞核内参，具体引物序列如下：U1 F:gggagataccatgatcacgaaggt，(SEQ ID NO：11)；U1 R:ccacaaattatgcagtcgagtttccc(SEQ ID NO：12)。结果发现circPTEN在细胞核和细胞浆均有表达，但主要富集在结直肠癌细胞的细胞浆中(参见图6)。

RNA荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)，是一种重要的非放射性原位杂交技术，可以对circPTEN进行相对定性、定量和定位分析。本实验通过吉玛基因公司设计合成了特异性针对circPTEN剪接位点的探针(tcatgtctgggagcctgtggctttttgtctctggtcctta，SEQ ID NO:13)，其5’和3’端带有Cy3红色标记。通过细胞RNAFISH实验检测到DLD1、LoVo、HT29和HCT116等结直肠癌细胞的胞浆中有丰富的circPTEN的表达(参见图7)。因此，核浆分离实验和细胞RNA FISH实验均表明circPTEN主要分布在细胞浆。

实施例2

circPTEN在结直肠癌组织中的表达

在本实施案例中，利用qRT-PCR和FISH实验揭示了circPTEN在结直肠癌组织中表达下调并与患者临床病理指标及预后有关，具体内容如下：

1.qRT-PCR和FISH实验揭示circPTEN在结直肠癌组织中表达下调

1.1 qRT-PCR揭示circPTEN在结直肠癌组织表达降低。前期circPTEN的鉴定实验揭示了circPTEN是一种由PTEN通过反向剪接产生的在结直肠癌中表达的丰富而稳定的circRNA。为了进一步探究circPTEN与结直肠癌的关系，在150对新鲜结直肠癌组织及其配对的癌旁组织即正常黏膜组织中，用qRT-PCR检测circPTEN的表达水平(引物序列为SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2)，以β-actin为内参(β-actin F:ctgggacgacatggagaaaa，SEQ ID NO:14；β-actin R:aaggaaggctggaagagtgc，SEQ ID NO:15)，相比于癌旁组织的平均值，采用2^-△△Ct方法分别计算circPTEN在结直肠癌组织及癌旁组织的相对表达量。

结果显示与配对的癌旁组织相比，circPTEN在150对结直肠癌组织中的表达水平显著下调(参见图8)，且在80％(120/150)的结直肠癌病人中，circPTEN表达水平显著降低(参见图8)。

1.2 FISH证明circPTEN结直肠癌组织表达降低。为了进一步证实circPTEN在结直肠癌组织的表达水平是否降低，本实验选取4例结直肠癌组织石蜡标本，将所述吉玛基因公司设计合成的针对circPTEN剪接位点的5’和3’端带有Cy3标记的探针用于RNA FISH实验。

结果表明，与配对的癌旁正常黏膜组织相比，circPTEN在结直肠癌组织中的探针信号强度明显较弱，进一步验证了circPTEN结直肠癌组织的表达水平是显著下调的(参见图9)。

2.circPTEN在结直肠癌组织中的表达与患者临床病理指标的关系

为了探究circPTEN在结直肠癌中的潜在作用及其临床病理意义，根据circPTEN的表达水平中位数将样本分为高表达组和低表达组，并统计分析了circPTEN的相对表达量与结直肠癌患者的临床病理指标及预后之间的关系。

结果表明，circPTEN的表达水平与结直肠癌肿瘤的淋巴结转移(P＝0.0003)、远处转移(P＝0.0296)呈负相关；而与其他临床病理特征如患者的性别、年龄、肿瘤大小、分化程度、浸润深度等无明显相关性(P>0.05)(参见表1)。其中淋巴结转移是发生肝转移的重要前期指标，提示circPTEN可能参与了结直肠癌进展的调控，并可能成为患者预后的预测指标。

表1circPTEN1表达水平与临床指标的结果

3.circPTEN低表达的结直肠癌患者预后较差

本实验进一步分析了上述150对结直肠癌患者的circPTEN表达水平和生存率的关系。根据circPTEN的表达水平中位数将样本分为高表达组和低表达组，连续监测50个月后，经过Kaplan-Meier生存分析发现，circPTEN1低表达的结直肠癌患者总生存期明显短于高表达患者(Log-ranktest，P＝0.0073)(参见图10)。这些结果提示circPTEN1可能是一种具有抑癌性质的circRNA并参与结直肠癌的发生和发展，进而它可能作为判断结直肠癌患者预后情况的潜在指标之一。

实施例3

在本实施案例中，利用RNApulldown、RIP、Western blot和qRT-PCR等实验揭示了circPTEN1的表达水平受EIF4A3的调节，具体内容如下：

为了探究circPTEN1的表达水平为何在结直肠癌组织中下调，即探究调节circPTEN1表达水平的具体因素，首先从circRNA的形成机制进行分析。circRNA的形成机制主要包括内含子配对驱动的环化和RBP驱动的环化，即circRNA的上下游侧翼内含子含有反向互补序列的Alu序列或者有RBP结合在侧翼内含子中，都能调控circRNA的剪接环化。许多RBP(如QKI、FUS和ADAR1等)均可与环化外显子周围的内含子序列结合，进而促进或抑制circRNA的环化。但通过查询基因组网站UCSC(http://genome.ucsc.edu/)，在circPTEN1上下游各1kb并没有发现反向互补Alu序列，由此，便尝试探究了circPTEN1的表达水平是否受到RBP的调节。

1.RNApulldown证明EIF4A3与circPTEN1上游序列结合

因为RBP是结合在circRNA的侧翼序列内的，所以为了探究circPTEN1的表达水平是否受到RBP的调节，针对circPTEN1上下游各1000bp设计合成了biotin标记的探针(Upstream F/Upstream R、Downstream F/Downstream R)，并利用该探针进行RNApulldown实验，其中Antisense为阴性对照探针(Upstream control F/Upstream controlR、Downstream control F/Downstream control R)。将pulldown的电泳结果进一步经银染染色后，切下凝胶并送测质谱，结果在circPTEN1上游正义链探针组检测到含有EIF4A3的多条特异性肽段。

所述探针的核苷酸序列：

Upstream F:taatacgactcactatagggctgaagaaaaaggaggagagagatg(SEQ ID NO:16)；

Upstream R:gcggtcccgtccgcctct(SEQ ID NO:17)；

Upstream control F:taatacgactcactatagggctgaagaaaaaggaggag agagatg(SEQID NO:24)；

Upstream control R:gcggtcccgtccgcctct(SEQ ID NO:25)；

DownstreamF:taatacgactcactataggggtaagttattttttgatgtttttcctttc(SEQ IDNO:18)；

Downstream R:atgagtttttctatctatctggagg(SEQ ID NO:19)；

Downstream control F:taatacgactcactatagggatgagtttttctatctat ctggagg(SEQ ID NO:26)；

Downstream control R:gtaagttattttttgatgtttttcctttc(SEQ ID NO:27)。

结果初步表明，EIF4A3能够与circPTEN的上游侧翼序列特异性结合，但不能与下游侧翼序列结合(参见图11)。真核起始因子EIF4A3是转录后调控的重要调节因子，可以与RNA结合，形成外显子连接复合物，进而参与外显子的剪接过程。既然EIF4A3参与外显子剪接，就也有可能调控circPTEN的形成。RNA pulldown提示EIF4A3很可能是一种潜在结合并调节circPTEN的RBP。

2.RIP揭示EIF4A3与circPTEN上游结合的具体位点

为了进一步明确EIF4A3与circPTEN具体结合位点，接下来，用EIF4A3的抗体进行了RIP实验。Western blot结果证明，募集到目标蛋白EIF4A3(参见图12中A)。采用qRT-PCR实验检测，以H19 lncRNA为阳性对照，检测转录本EIF4A3基因表达量所占input的相对丰度后，发现EIF4A3可以与circPTEN上游的2个潜在结合位点(f和g)结合(见图12中B)，从而进一步明确了结合的具体位点。

EIF4A3基因的扩增引物如下：

EIF4A3 F:cttggtgaaacgtgatgaattgac(SEQ ID NO:20)；

EIF4A3 R:cattgaggatacagtgaagttgg(SEQ ID NO:21)。

综上所述，通过circPTEN上下游和截断体的RNA pulldown以及RIP实验等，从正反面都证明了EIF4A3与circPTEN上游侧翼序列的f和g段结合位点存在结合，

3.EIF4A3在结直肠癌组织的表达水平上调

为了进一步探究EIF4A3与circPTEN上游侧翼序列的这种结合是否能够调控circPTEN在结直肠癌组织的差异性表达，首先通过StarBase(http://starbase.sysu.edu.cn/index.php)数据库预测，发现EIF4A3在471例结直肠癌样本和41正常样本中的表达水平上调，而前期结果已表明circPTEN在结直肠癌组织中的表达水平下调，所以推测EIF4A3可能对circPTEN的表达发挥负向调控作用。为了验证这个推论，首先应用qRT-PCR检测了60对结直肠癌组织样本中EIF4A3的表达水平(所用引物同SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21所示引物)，发现EIF4A3在结直肠癌组织中的表达显著高于相应的癌旁正常组织，即EIF4A3在结直肠癌组织中的表达水平确实是上调的(参见图13中左图)。

由于前期实验揭示circPTEN在结直肠癌组织中的表达水平下调，所以我们进一步通过对EIF4A3和circPTEN在结直肠癌组织中的表达水平进行相关性分析，发现二者确实呈负相关关系，这提示EIF4A3可能负向调控circPTEN的表达水平(参见图13中右图)。综合前面的结果，我们推测EIF4A3可能通过结合circPTEN上游而抑制circPTEN的形成，进而负向调控circPTEN的表达水平。

4.EIF4A负向调控circPTEN在结直肠癌中的表达

为了进一步在细胞内证实EIF4A3负向调控circPTEN表达水平的推论，我们在DLD1和LoVo细胞中做了EIF4A3敲低和过表达回复实验，Western blot结果显示，EIF4A3敲低和过表达水平都很显著。

用qRT-PCR检测了中敲低或过表达EIF4A3后circPTEN的表达水平。因为考虑到过表达是针对基因CDS区的，所以在做敲低实验时，选择EIF4A3的3’UTR设计shRNA的target序列。通过感染shRNA病毒敲低EIF4A3的DLD1和LoVo细胞，结果表明，circPTEN的表达水平显著上调，在该敲低细胞中通过导入pcDNA3.1-3×Flag-C-EIF4A3载体重新过表达EIF4A3后，经qRT-PCR检测发现circPTEN的表达水平又得到回复(参见图14)。由此可见，EIF4A3确实能够负向调控circPTEN的表达水平。再结合前期RIP、pulldown和组织的qRT-PCR结果等，表明EIF4A3确实是通过与circPTEN上游侧翼序列结合来抑制circPTEN的表达。

sh-EIF4A3 target sequence1:gccaccaccttctctagtaac(SEQ ID NO:22)；

sh-EIF4A3 target sequence2:ggtctgtcactcatgggttta(SEQ ID NO:23)。

实施例4

circPTEN1通过结合Smad4，拮抗TGFβ/Smad通路实验

1.circPTEN1与Smad4结合

为了探究circPTEN1的生物学功能，首先进行了RNA pulldown，并进一步通过质谱检测circPTEN1的结合蛋白，质谱分析结果显示，circPTEN1可能结合Smad4(参考图15)。TGFβ/Smad通路是调控肿瘤进展的重要分子通路。TGFβ刺激条件下，Smad2/Smad3磷酸化，磷酸化后的Smad2/Smad3与Smad4结合，进而形成Smad复合物，Smad复合物进入细胞核，通过调控基因转录，调节肿瘤的发生发展。所以Smad4是TGFβ/Smad通路发挥功能的关键分子。进一步，以Smad4抗体进行RIP，验证了Smad4与circPTEN1的结合(参考图17)。此外，体外环化合成了Biotin标记的circPEN1，并由SF9纯化得到了FLAG标签的Smad4蛋白，通过EMSA验证了Smad4与circPTEN1的结合(参考图17)。

2.circPTEN1与Smad4 MH2结构域结合

Smad4蛋白主要分为两个结构，即N端的MH1结构域和C端的MH2结构域，Smad4主要通过MH1结构域结合DNA，通过MH2结合Smad2/Smad3。分别纯化了Smad4的MH1和MH2结构域蛋白，通过RIP，分别检测他们与circPTEN1的结合，结果揭示Smad4通过MH2结构域结合circPTEN1(参考图18)。进一步通过EMSA验证了Smad4的MH2结构域与circPTEN1的直接结合(参考图19)。

3.circPTEN1拮抗TGFβ/Smad通路

circPTEN1结合Smad4的MH2结构域，Smad4的MH1结构域也是Smad2/Smad3结合的位置，所以进一步通过免疫共沉淀检测circPTEN1对Smad复合物形成的影响，结果显示circPTEN1拮抗TGFβ介导的Smad2/Smad3与Smad4的结合(参考图20)。进一步检测circPTEN1是否会影响Smad复合物在细胞核的分布，结果显示circPTEN1下调TGFβ介导的细胞核内Smad2/Smad3的分布(参考图21)。

4.CircPTEN1下调TGFβ/Smad通路介导的EMT

TGFβ介导Smad复合物入核后，通过结合DNA，调控基因转录，多项研究报道，Smad复合物可上调EMT相关基因Snail，Slug，ZEB1等基因的表达，促进EMT。前述结果表明，circPTEN1下调TGFβ介导的细胞核内Smad2/Smad3的分布，所以通过RT-PCR检测了circPTEN1水平对等上述基因表达水平的影响，结果显示，circPTEN1下调Snail，Slug，ZEB1基因的表达(参考图22)。进一步检测了circPTEN1对上皮和间质标志物表达水平的影响，结果显示，TGFβ刺激条件下，上皮标志物E-cadherin下调，间质标志物N-cadherin上调，这一过程可以被过表达circPTEN1逆转(参考图23)，这直接说明circPTEN1可逆转TGFβ/Smad通路介导的EMT。

实施例5

circPTEN1抑制TGFβ介导的结直肠癌的侵袭和转移

1.细胞水平检测circPTEN1对结直肠癌侵袭转移能力的调节

前述结果说明，circPTEN1拮抗TGFβ/Smad通路介导的EMT，提示circPTEN1抑制癌症的侵袭和转移。首先通过Transwell检测了circPTEN1对结直肠癌细胞侵袭转移能力的影响，结果显示敲低circPTEN1促进TGFβ介导的肠癌细胞的侵袭转移，这一现象可以被circPTEN1过表达逆转(参考图24)。此外，用3D瘤体成型实验检测circPTEN1对结直肠癌转移能力的调控，结果类似于Transwell(参考图25)，即circPTEN1抑制TGFβ介导的肠癌侵袭和转移。

2.小鼠水平检测circPTEN1对肠癌转移的调控

接下来检测了体内环境下，circPTEN1对肠癌转移的调控。CircPTEN1敲低细胞尾静脉注射小鼠检测其对肺转移的影响，脾脏原位注射检测其对肝转移的影响(具体方法参见文献：doi:10.1038/s41467-019-12651-2.PMID:31619685)。结果显示，敲低circPTEN1可促进结直肠癌细胞肺转移以及肝转移的能力(参见图26和图27)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 北京大学

<120> 一种用于肿瘤治疗靶点和诊断生物标志物circPTEN1及其应用

<160> 28

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

actgtaaagc tggaaaggga cg 22

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gctaacgatc tctttgatga tggc 24

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

taatacgact cactataggg gataagttct agctgtggtg gg 42

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctgtaaagct ggaaagggac g 21

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

taatacgact cactataggg tctagggcct cttgtgcc 38

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gctatgggat ttcctgcag 19

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

attgcagagt tgcacaatat cc 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aataatacac atagcgcctc tg 22

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agaaggctgg ggctcatttg 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aggggccatc cacagtcttc 20

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gggagatacc atgatcacga aggt 24

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ccacaaatta tgcagtcgag tttccc 26

<210> 13

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tcatgtctgg gagcctgtgg ctttttgtct ctggtcctta 40

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ctgggacgac atggagaaaa 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

aaggaaggct ggaagagtgc 20

<210> 16

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

taatacgact cactataggg ctgaagaaaa aggaggagag agatg 45

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gcggtcccgt ccgcctct 18

<210> 18

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

taatacgact cactataggg gtaagttatt ttttgatgtt tttcctttc 49

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

atgagttttt ctatctatct ggagg 25

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

cttggtgaaa cgtgatgaat tgac 24

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

cattgaggat acagtgaagt tgg 23

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gccaccacct tctctagtaa c 21

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ggtctgtcac tcatgggttt a 21

<210> 24

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

taatacgact cactataggg ctgaagaaaa aggaggagag agatg 45

<210> 25

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gcggtcccgt ccgcctct 18

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<211> 45

<212> DNA

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<400> 26

taatacgact cactataggg atgagttttt ctatctatct ggagg 45

<210> 27

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

gtaagttatt ttttgatgtt tttcctttc 29

<210> 28

<211> 508

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

ccacaggctc ccagacatga cagccatcat caaagagatc gttagcagaa acaaaaggag 60

atatcaagag gatggattcg acttagactt gacctatatt tatccaaaca ttattgctat 120

gggatttcct gcagaaagac ttgaaggcgt atacaggaac aatattgatg atgtagtaag 180

gtttttggat tcaaagcata aaaaccatta caagatatac aatctttgtg ctgaaagaca 240

ttatgacacc gccaaattta attgcagagt tgcacaatat ccttttgaag accataaccc 300

accacagcta gaacttatca aacccttttg tgaagatctt gaccaatggc taagtgaaga 360

tgacaatcat gttgcagcaa ttcactgtaa agctggaaag ggacgaactg gtgtaatgat 420

atgtgcatat ttattacatc ggggcaaatt tttaaaggca caagaggccc tagatttcta 480

tggggaagta aggaccagag acaaaaag 508

Claims

1.一种用于肿瘤治疗靶点和诊断生物标志物的circPTEN1，其特征在于，所述circPTEN1的核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示。

2.一种用于诊断肿瘤发生或肿瘤预后评估的试剂盒，其特征在于，包括与权利要求1所述circPTEN1特异性互补配对的分子探针或用于扩增权利要求1所述circPTEN1的引物对。

3.权利要求1所述circPTEN1或抑制翻译调节因子EIF4A3表达的试剂在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。

4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述肿瘤包括结直肠癌。

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述肿瘤包括原发瘤和转移瘤。

6.一种用于抗肿瘤的药物，其特征在于，所述药物以权利要求1所述circPTEN1为活性成分。

7.根据权利要求6所述药物，其特征在于，所述肿瘤包括结直肠癌。

8.一种抑制TGFβ/Smad4通路介导的EMT相关基因表达的试剂在制备抑制肿瘤迁移的药物中的应用；所述试剂包括权利要求1所述circPTEN1。

9.一种用于抑制肿瘤转移的药物，其特征在于，以权利要求1所述circPTEN1为活性成分。