CN117568476A - 结直肠癌诊断、转移预测及免疫治疗预后评估circRNA标志物及治疗药物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于结直肠癌诊断、转移预测和免疫治疗预后评估circRNA标志物及其应用以及结直肠癌治疗药物。本发明发现了一种与结直肠癌密切相关的circRNA，并证明了该分子表达水平与结直肠癌患者的PD‑1抗体治疗疗效密切相关，还证明了该分子能促进结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力，并影响结直肠癌细胞的增殖能力和结直肠癌患者对PD‑1抗体治疗的敏感性，表明该分子可以作为结直肠癌诊断、转移预测和PD‑1抗体治疗预后评估的标志物，以及作为结直肠癌治疗靶点，通过干预该circRNA分子表达和PD‑1抗体联合治疗可显著提升治疗效果，丰富了结直肠癌的诊断治疗手段。

Description

结直肠癌诊断、转移预测及免疫治疗预后评估circRNA标志物 及治疗药物

技术领域

本发明属于生物医药领域。更具体地，涉及一种用于结直肠癌诊断、转移预测、免疫治疗预后评估、筛选结直肠癌免疫治疗敏感人群的circRNA标志物，及结直肠癌治疗药物。

背景技术

结直肠癌是一种常见的会严重威胁人类健康的消化道恶性肿瘤，其发病率在全球各种恶性肿瘤中高居第三位，死亡率高居第二位。肿瘤进展和转移是结直肠癌患者的主要死亡原因，而免疫逃逸是肿瘤进展和转移的重要机制。肿瘤细胞表面上高表达的程序性死亡受体配体1(PD-L1)与免疫细胞表面的程序性死亡受体(PD-1)作用后激活免疫抑制信号，导致肿瘤免疫逃逸。临床上，应用PD-1抗体阻断PD-1/PD-L1通路的免疫治疗已经在多种肿瘤的治疗中取得了成功，包括转移性结直肠癌。目前认为，PD-1抗体治疗的效果在dMMR/MSI-H型结直肠癌中可能更好，FDA也已批准Nivolumab和Pembrolizumab用于转移性MSI-H型结直肠癌的治疗。然而，并不是所有的dMMR/MSI-H型结直肠癌患者对PD-1/PD-L1阻断治疗均具有应答。并且，到目前为止，免疫检查点抑制剂治疗pMMR/MSS型结直肠癌无明显效果，而此类患者却在转移性结直肠癌患者中占绝大多数。因此，针对结直肠癌患者的肿瘤转移预测及预后判断至关重要。然而，目前临床上仍缺乏预测结直肠癌PD-1抗体疗效的分子标志物。

环状RNA(Circular RNA，circRNA)是一类区别于传统线性RNA的非编码RNA，它们由共价闭合的环状结构形成，不具备5’端和3’端结构，可以防止被RNA核酸外切酶降解，因而具有结构稳定、半衰期长、高度保守性等特征，可以成为理想的生物标志物。近年来，circRNA被发现广泛存在哺乳动物体内，在细胞分化、细胞周期和表观遗传调控等多种生理病理过程中发挥了重要作用，也与包括肿瘤在内的多种疾病息息相关。

目前，与结直肠癌相关的circRNA仍有很多未被发现，研究寻找这些circRNA可以为结直肠癌的转移预测和预后判断提供理论依据。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷和不足，提供一种用于结直肠癌诊断、转移预测、免疫治疗预后评估、筛选结直肠癌免疫治疗敏感人群的circRNA标志物，以及结直肠癌治疗药物。

本发明的第一个目的是提供检测hsa_circ_0003681表达的试剂在制备结直肠癌诊断和/或转移预测产品中的应用。

本发明的第二个目的是提供检测hsa_circ_0003681表达的试剂在制备结直肠癌免疫治疗预后评估产品或在制备筛选结直肠癌免疫治疗敏感人群的产品中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种用于结直肠癌诊断、转移预测、免疫治疗预后评估或筛选结直肠癌免疫治疗敏感人群的试剂盒

本发明的第四个目的是提供hsa_circ_0003681或hsa_circ_0003681表达抑制剂在制备结直肠癌治疗药物中的应用。

本发明的第五个目的是提供一种用于治疗结直肠癌的药物。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明通过分析结直肠癌患者血浆中hsa_circ_0003681(即circPHLPP2)的表达情况后发现，circPHLPP2的表达水平和PD-1抗体治疗疗效呈显著负相关性，且血浆中circPHLPP2高表达的患者的总生存率显著低于circPHLPP2低表达的患者；本发明通过RNase R消化实验和放线菌素D处理实验验证了circPHLPP2的稳定性；本发明通过transwell实验证明了过表达circPHLPP2的结直肠癌细胞(SW480和HCT116细胞)的迁移和侵袭能力显著增强；本发明通过动物实验证明了敲降circPHLPP2可抑制体内结直肠癌细胞生长并提高PD-1抗体的疗效。以上结果表明，circPHLPP2可以作为结直肠癌诊断、转移预测、PD-1抗体免疫治疗预后评估以及筛选免疫治疗敏感人群的一种标志物。因此，本发明申请保护SEQ ID NO:1所示的circRNA标志物hsa_circ_0003681(circPHLPP2)的以下应用：

检测hsa_circ_0003681表达的试剂在制备结直肠癌诊断和/或转移预测产品中的应用。

检测hsa_circ_0003681表达的试剂在制备结直肠癌免疫治疗预后评估产品或在制备筛选结直肠癌免疫治疗敏感人群的产品中的应用。优选地，所述免疫治疗是PD-1抗体治疗。

作为一种可实施方案，所述检测hsa_circ_0003681表达的试剂为针对hsa_circ_0003681的特异性引物。

优选地，所述特异性引物包括如SEQ ID NO:2所示的上游引物和如SEQ ID NO:3所示的下游引物。

基于此，本发明提供一种用于结直肠癌诊断、转移预测、免疫治疗预后评估或筛选结直肠癌免疫治疗敏感人群的试剂盒；所述试剂盒含有检测hsa_circ_0003681表达的试剂。

作为一种可实施方案，所述检测hsa_circ_0003681表达的试剂为针对hsa_circ_0003681的特异性引物。

优选地，所述特异性引物包括如SEQ ID NO:2所示的上游引物和如SEQ ID NO:3所示的下游引物。

进一步地，作为一种可实施方案，所述检测hsa_circ_0003681表达的试剂还包括PCR扩增酶(如2×GoTaq qPCR Master Mix)，无酶水。

优选地，所述试剂盒还包含荧光定量qPCR所需试剂。

所述试剂盒的检测待测样本的体系为：2×GoTaq qPCR Master Mix 5μL，上游引物0.4μL，下游引物0.4μL，无酶水2.2μL，cDNA 2μL，共10μL。

优选地，所述试剂盒检测待测样本的qPCR反应程序为：95℃10min；95℃15sec；60℃1min；重复循环50次；40℃30s；4℃保存。

本发明通过动物实验证明了敲降hsa_circ_0003681可抑制体内结直肠癌细胞生长并提高PD-1抗体的疗效，表明hsa_circ_0003681是一个结直肠癌治疗靶点，因此，本发明申请保护hsa_circ_0003681表达抑制剂在治疗结直肠癌中的应用。

基于此，本发明提供一种用于治疗结直肠癌的药物，所述药物包括hsa_circ_0003681表达抑制剂。

本发明还提供一种用于免疫治疗不敏感型结直肠癌的治疗药物，所述药物包括hsa_circ_0003681表达抑制剂与免疫治疗药物。

具体地，在本发明的实验方案中，所述免疫治疗是指PD-1抗体治疗。作为可实施方案之一，所述PD-1抗体治疗是指瑞戈非尼和PD-1抗体组合用药治疗。因此，上述免疫治疗药物是指瑞戈非尼和PD-1抗体。作为可选择方案之一，所述PD-1抗体为特瑞普利单抗。

另外，作为一种可实施方案，所述hsa_circ_0003681表达抑制剂为sh-circPHLPP2，所述sh-circPHLPP2的序列如下：

sense sequence(SEQ ID NO:14)：

ccggTGGTGAGAAATATGAAACACActcgagTGTGTTTCATATTTCTCACCAt ttttg

antisense sequence(SEQ ID NO:15)：

aattcaaaaaTGGTGAGAAATATGAAACACActcgagTGTGTTTCATATTTCTCA CCA

本发明具有以下有益效果：

根据本发明研究结果，circRNA标志物hsa_circ_0003681(circPHLPP2)的表达水平和结直肠癌患者的PD-1抗体治疗疗效呈显著负相关性，且血浆中circPHLPP2高表达的患者的总生存率显著低于circPHLPP2低表达的患者；本发明验证了circPHLPP2的稳定性，证明了过表达circPHLPP2的结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力显著增强，而且，敲降circPHLPP2可抑制体内结直肠癌细胞生长并提高PD-1抗体的疗效。以上结果表明，hsa_circ_0003681(circPHLPP2)可以作为结直肠癌诊断、转移预测、PD-1抗体免疫治疗预后评估以及筛选免疫治疗敏感人群的一种标志物，以及结直肠癌(包括免疫治疗不敏感型结直肠癌)治疗靶点。该分子的发现，为进一步研究结直肠癌的发病机理，探索结直肠癌的治疗方案提供了新的实验理论基础和新的方向，并可将其应用于制备结直肠癌转移预测和/或PD-1抗体治疗预后评估和/或筛选结直肠癌PD-1抗体治疗敏感人群的试剂盒，丰富了结直肠癌的诊断治疗手段。

附图说明

图1为在治疗无效(PD)和治疗有效(PR)的患者血浆中差异表达的circRNA。

图2为circPHLPP2的环状结构示意图。

图3为circPHLPP2扩增片段的琼脂糖凝胶电泳图；上图中circPHLPP2组为SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:3所示的引物扩增的结果，mPHLPP2组为SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的引物扩增的结果，GAPDH组为SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示的引物扩增的结果；下图中circPHLPP2组为SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的引物扩增的结果，mPHLPP2组为SEQ IDNO:10和SEQ ID NO:11所示的引物扩增的结果，GAPDH组为SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示的引物扩增的结果。

图4为Sanger测序分析显示circPHLPP2的反向剪接位点的示意图。

图5为分别使用随机引物和oligo dT引物反转录为模板cDNA后用RT-qPCR检测circPHLPP2和PHLPP2 mRNA的表达水平(*P<0.05)。

图6为circPHLPP2的RT-qPCR溶解曲线。

图7为RNase R消化验证circPHLPP2的稳定性(*P<0.05)。

图8为放线菌素D处理验证circPHLPP2的稳定性(*P<0.05)。

图9为circPHLPP2在PD-1抗体治疗无效的结直肠癌患者血浆中和治疗有效的患者血浆中显著差异表达(P<0.001)。

图10为circPHLPP2表达与结直肠癌患者总生存期相关性的Kaplan-Meier分析结果的示意图。

图11为Transwell实验检测敲降circPHLPP2对结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力影响的示意图(****P<0.0001)。

图12为在MC38和CT26细胞敲低circPHLPP2的表达后，将细胞移植到小鼠的皮下，肿瘤治疗结束后的肿瘤图片和肿瘤重量(*P<0.05，**P<0.01)。

图13为在MC38和CT26细胞敲低circPHLPP2的表达后，将细胞移植到小鼠的皮下，在肿瘤治疗期间的肿瘤生长曲线(*P<0.05，**P<0.01)。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

以下实施例所用血浆或细胞样本来源如下：

血浆样本来源：经中山大学肿瘤防治中心伦理委员会批准，征得患者知情同意，收集结直肠癌患者的血浆样本，包括9例PD-1抗体治疗无效(PD)和5例PD-1抗体治疗有效(PR)患者的血浆。

所述PD-1抗体治疗的方案为：口服瑞戈非尼80mg，第1天到第21天；静脉滴注特瑞普利单抗240mg，每3周一次，持续用药直至出现肿瘤进展或者不可耐受为止。

细胞来源：HCT116细胞、SW480细胞、MC38细胞、CT26细胞均购自广州赛库生物技术有限公司。

以下实施例中PCR反应所用引物及其序列如下表所示：

表1引物序列

实施例1用于结直肠癌转移预测和PD-1抗体治疗预后评估的circRNA筛选

为了确定参与结直肠癌进展和抗PD-1耐药的潜在circRNA，我们对9例PD-1抗体治疗无效(PD)和5例PD-1抗体治疗有效(PR)患者的血浆进行了circRNA芯片分析，circRNA微阵列由上海康成生物工程有限公司完成。所有样本制备和芯片杂交均按照Arraystar公司(Rockville,MD,USA)的规程进行。使用随机引物法(Arraystar Super RNA Labeling Kit)将富集的circRNA扩增并转录成荧光cRNA。标记的cRNA与Human circRNA Array V2(8×15k，Arraystar)杂交。最后，用Agilent Scanner G2505C扫描阵列，并用Agilent FeatureExtraction software(11.0.1.1版)进行分析。随机方差模型用于识别差异表达基因，采用配对t检验计算P值。患者血浆的circRNA差异图谱如图1所示，按照log2FC≥5和P值≤0.05的阈值分析筛选得到一个与PD-1抗体治疗效果表现高度相关的circRNA：hsa_circ_0003681(log2FC＝5,pValue＝1.57E-05)。hsa_circ_0003681来源于PHLPP2基因的2-3号外显子，因而将其命名为circPHLPP2，其结构如图2所示。

实施例2目的circRNA的鉴定

1.hsa_circ_0003681序列及检测引物设计

hsa_circ_0003681序列位于16号染色体71736500-71748704的位置，其cDNA序列如SEQ ID NO:1所示。

SEQ ID NO:1

AGAAATATGAAACGCAATGGGAGCAGAAATTGTTTGAATAGGAGAAGTAGGTTTGGTTCTCGAGAAAGAGACTGGCTAAGAGAAGATGTAAAGAGAGGCTGTGTTTACCTTTATGGAGCAGACACTACCACTGCCACTACAACCACCACCACCTCCTCTTCCTCTTCCTCCTCCTCCTCTTCCTCTGACTTACATCTCGTCCTTTGCACTGTAGAGACACCAGCATCAGAAATATGTGCTGGAGAGGGAAGAGAAAGTCTTTATTTACAGCTTCATGGAGACCTGGTCAGGAGACTGGAACCTACTGAACGACCTCTTCAGATCGTTTATGATTACTTATCCAGGCTGGGATTTGATGATCCTGTGCGCATACAGGAGGAGGCTACAAATCCTGACCTCGGCTGTATGATTCGATTTTATGGTG

根据环状RNA由pre-RNA反向剪接形成的特性，设计了针对circPHLPP2的环化位点的特异性检测引物，序列如表1中SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。

2.Sanger测序进行成环验证

(1)PCR扩增模板构建

a.cDNA合成：

使用RNA Quick Purification kit(Esscience，货号：RN001A)，分别从HCT116结直肠癌细胞和MC38结直肠癌细胞中提取总RNA，使用PrimeScript^TM RT reagent Kit(TaKaRa，货号：RR037A)试剂盒对所提取的总RNA进行反转录反应，反应体系如下表2所示：

表2

(注：若对circRNA反转录，则使用Random 6mers随机引物；若对mRNA反转录，则使用Oligo dT Primer引物)

反转录反应步骤依次为：37℃孵育15min(反转录反应)、85℃孵育5sec(反转录酶的失活反应)、4℃保温。

b.gDNA提取：使用PureLink^TM基因组DNA小提试剂盒(Thermo Fisher，货号：K182001)，并按照试剂盒说明书的方法提取HCT116结直肠癌细胞和MC38结直肠癌细胞的基因组DNA(gDNA)。

(2)PCR扩增

利用表1的6对引物分别对合成的cDNA和gDNA进行PCR扩增，PCR反应体系如下表3所示：

表3

(注：cDNA或gDNA的浓度可根据实验需要进行调整)

PCR反应程序如下表4所示：

表4

(3)凝胶电泳

将1g琼脂粉溶于100mL 1×TAE Buffer中，配制1％的琼脂糖凝胶，将装有琼脂糖凝胶的锥形瓶口用锡纸或纱布封住，放入微波炉，中高火煮至液体澄清，用流水冲洗瓶壁至触手不烫。将梳子插入制胶板，倒入琼脂糖凝胶，待胶凝固。拔去梳子，将胶放入电泳槽，倒入1×TAE Buffer至没过胶。将4μL 6×DNA Loading Buffer(GenStar，货号：E106)与20μLPCR产物混匀，加入样品孔中。将电泳仪电压调至120V，跑15～30min。结束后将胶放入凝胶成像仪中观察条带结果。如图3所示，证实了circPHLPP2的反向剪接序列。

(4)Sanger测序

用干净刀片切胶，使用SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega，货号：A9281)进行胶回收及PCR产物纯化，将HCT116结直肠癌细胞cDNA的PCR扩增产物(circPHLPP2组)送Sanger测序，由广州吉赛生物科技股份有限公司完成。

结果如图4所示，由我们设计的针对circPHLPP2的环化位点的特异性引物序列所得PCR产物的测序结果，与Circbase中的circPHLPP2环化位点序列相同，Circbase中的环化位点序列如下：

TCGATTTTATGGTGAGAAATATGAAACGCA

3.验证circPHLPP2的环状结构

从HCT116结直肠癌细胞中提取总RNA，分别使用随机引物和oligo dT引物反转录为circPHLPP2和PHLPP2 mRNA的模板cDNA，之后通过RT-qPCR定量circPHLPP2和PHLPP2mRNA的表达水平。图5的结果表明，circPHLPP2缺乏polyA尾，即circPHLPP2具有环状结构(*P<0.05)。

RT-qPCR具体方法步骤为：将上述得到的反转录反应液加入到下一步的Real TimePCR反应体系中，使用Promega的荧光定量PCR的试剂盒(qPCR Master Mix，货号：A6001)进行RT-qPCR反应。

RT-qPCR反应体系如下表5所示：

表5

RT-qPCR反应程序如下：

将反应所需的成分配置完后，在PCR仪上于95℃预加热10min，使模板DNA充分变性，然后进入扩增循环。在每一个循环中，先于95℃保持15秒钟使模板变性，然后将温度降到复性温度(60℃)，保持1min，使引物与模板充分退火并延伸，完成一个循环。重复循环50次。再在40℃保持30秒进行冷却。最后，在4℃保存。

4.引物特异性验证

RT-qPCR的结果显示，circPHLPP2的溶解曲线如图6所示，溶解曲线呈单峰波，说明引物特异性好。

以上验证实验证明了如SEQ ID NO:2所示的hsa_circ_0003681-F引物和如SEQ IDNO:3所示的hsa_circ_0003681-R引物可以特异性地扩增出circPHLPP2，可以用于检测circPHLPP2(hsa_circ_0003681)的表达。

实施例3RNase R消化和放线菌素D处理验证cricRNA的稳定性

RNase R消化验证：提取HCT116结直肠癌细胞总RNA，将10U RNase R(Geneseed，货号：R0301)加入到2.5μg total RNA中(Mock组则不加RNase R)，37℃下孵育15分钟。然后，通过RT-qPCR定量circPHLPP2和PHLPP2 mRNA的水平。图7的结果显示，circPHLPP2不会被RNase R降解(*P<0.05)。

使用放线菌素D(MCE，货号：MCE HY-17559)处理测定circRNA的稳定性：将HCT116结直肠癌细胞接种到六孔板中，当六孔板中细胞达到60％汇合时，分别用5μg/mL放线菌素D或相同体积的DMSO(对照组)处理细胞，分别在处理0、4、8、12、24h后收集细胞，提取总RNA，通过RT-qPCR定量circPHLPP2和PHLPP2 mRNA的水平。由图8可知，经放线菌素D处理后，circPHLPP2比线性mRNA更稳定(*P<0.05)，因此circPHLPP2可以作为理想的标志物。

实施例4circPHLPP2分别在PD-1抗体治疗无效与治疗有效的患者血浆中的表达水平对比

使用NucleoZOL(MN，货号：740404.200)提取血浆总RNA，以λpolyA作为外参(TAKARA，货号：3789)，按照实施例2所述的方法进行RT-qPCR，分别检测PD-1抗体治疗无效与治疗有效的患者血浆中circPHLPP2的表达水平。检测结果如图9所示，circPHLPP2在治疗无效的患者血浆中的表达水平相比在治疗有效的患者血浆中的表达水平显著上调，且该表达差异具有统计学意义(P<0.001)，表明circPHLPP2可以用作结直肠癌免疫治疗(PD-1抗体治疗)预后评估及诊断的标志物。

实施例5circPHLPP2的表达水平与结直肠癌患者预后生存率及免疫治疗敏感性的相关性

收集接受PD-1抗体治疗前的患者血浆，根据患者的circPHLPP2表达水平，将其分为circPHLPP2高表达组和低表达组。将两组患者分别给予PD-1抗体治疗后，绘制Kaplan-Meier曲线，用log-rank检验比较两组患者的生存差异。

结果如图10所示，circPHLPP2低表达的患者的生存率显著高于circPHLPP2高表达的患者的生存率，说明circPHLPP2的表达水平与结直肠癌患者的预后相关，是结直肠癌患者预后的影响因素，circPHLPP2低表达的患者对免疫治疗更敏感，更适合采用免疫治疗方案。

实施例6circPHLPP2对结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力的影响

将全长的人circPHLPP2基因插入到pLC5载体中(重组质粒)作为实验组，将pLC5空载体作为对照组，上述pLC5空载体和重组质粒由广州吉赛生物科技股份有限公司提供。

(一)过表达circPHLPP2的结直肠癌细胞的构建

(1)待10cm细胞培养皿中的HEK293T细胞密度达70％～80％时进行细胞转染，转染前2h将细胞培养基更换为基础培养基；

(2)无菌离心管中加入重组质粒和包装质粒(psPAX2和pMD2.G)共10μg，与相应体积的Opti-MEM混合均匀，取适量Lipofectamine3000在另一管中与Opti-MEM混合稀释，将两管混合后在室温下温育15分钟，将转染混合液转移至293T细胞的培养液中混匀，于37℃，5％ CO₂细胞培养箱中培养8h；

(3)吸去混合培养基，PBS清洗1次。每瓶细胞中加入10mL培养基，于37℃、5％CO₂培养箱内继续培养48小时；

(4)收集上清于15mL离心管中，2000rpm、10min离心，去掉细胞碎片，用0.22μm滤膜进行过滤，分装冻存于-80℃，用于慢病毒转染；

(5)按5×10⁵个细胞/孔的密度将HCT116和SW480细胞接种于6孔板中，组别设置：circPHLPP2(过表达)组、pLC5(对照)组。待细胞贴壁后，轻轻吸去培养基，小心加入1mL含5μg/mL Polybrene(聚凝胺)的Opti-MEM培养基，再加入计算出的病毒量(病毒所需体积＝细胞MOI*种板量/病毒滴度，HCT116和SW480细胞的MOI均为10，病毒滴度均为1×10⁸TU/mL)，轻轻混匀后放入细胞培养箱培养8h；

(6)吸去上清，加入新鲜培养基，放回培养箱中继续培养48h；

(7)用3μg/mL的嘌呤霉素筛选稳定转染的HCT116和SW480细胞，RT-qPCR验证转染效率。

(二)Transwell实验表征circPHLPP2对结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力的影响：

(1)实验前将Transwell小室放在24孔板中，用完全培养基浸泡1h；

(2)待上述稳定转染的HCT116和SW480细胞处于对数生长期时，用胰酶将细胞消化后用无血清培养基洗3次，计数，将细胞稀释成浓度为1×10⁵/mL的无血清细胞悬液；

(3)在Transwell小室的上部加入200μL细胞悬液，在小室的下部加入600μL含20％FBS的培养基或100％ FBS。待细胞培养14～16h后，终止培养，吸去培养基。

(4)用PBS轻轻洗涤细胞后，加入适量甲醇固定约20分钟；

(5)吸去甲醇，加入结晶紫染液染色30分钟；

(6)用PBS洗净染液，用棉签擦去小室内表面细胞，显微镜下观察，计数。

结果如图11所示，过表达circPHLPP2的HCT116和SW480细胞的迁移和侵袭能力显著增加，结果具有统计学差异(****P<0.0001)，说明circPHLPP2可以促进结直肠癌细胞的迁移和侵袭。临床上可以circPHLPP2表达水平进行结直肠癌细胞转移预测。

实施例7circPHLPP2对结直肠癌细胞的增殖能力和对PD-1抗体治疗的敏感性的影响

1、构建circPHLPP2敲降的小鼠模型

小鼠的circPHLPP2敲降质粒(sh-circPHLPP2)由上海吉凯基因构建完成，所用慢病毒载体为hU6-MCS-CMV-Puromycin(载体编号为GV112)，所用sh-circPHLPP2的序列为：

sense sequence(SEQ ID NO:14)：

ccggTGGTGAGAAATATGAAACACActcgagTGTGTTTCATATTTCTCACCAt ttttg

antisense sequence(SEQ ID NO:15)：

aattcaaaaaTGGTGAGAAATATGAAACACActcgagTGTGTTTCATATTTCTCA CCA

按实施例6所述的方法，将慢病毒转染至MC38和CT26细胞中，分别用5μg/mL和10μg/mL的嘌呤霉素筛选稳定转染的MC38和CT26细胞，RT-qPCR验证转染效率。

将40只C57BL/6小鼠随机分为control IgG组，control anti-PD-1组，sh-circPHLPP2 IgG组和sh-circPHLPP2 anti-PD-1组，每组10只，用1×PBS将转染了circPHLPP2敲降质粒或空载体的MC38细胞或CT26细胞密度调整至1×10⁶个/mL，在小鼠背部右侧皮下注射150μL上述细胞悬液，构建荷瘤小鼠模型。

2、治疗方案

当肿瘤大小达100mm³时，每三天腹腔注射一次50μg PD-1抗体(Bio X Cell,WestLebanon,NH,USA，货号：BE0146)或0.1mL PBS，每3天评估一次肿瘤大小，一共5次。治疗结束后的肿瘤图片和肿瘤重量如图12所示，肿瘤生长曲线如图13所示，结果表明，在多个肿瘤治疗模型中，敲低circPHLPP2不仅可通过抑制小鼠结直肠癌细胞(MC38细胞和CT26细胞)的增殖实现对体内肿瘤生长的抑制，还可以进一步提高PD-1抗体的疗效(*P<0.05，**P<0.01)，表明抑制circPHLPP2的表达可以用于结直肠癌的治疗。同时，circPHLPP2的表达水平会影响患者对PD-1抗体治疗的敏感性，因此，可将circPHLPP2用于制备筛选结直肠癌PD-1抗体治疗敏感人群的试剂盒中。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.检测hsa_circ_0003681表达的试剂在制备结直肠癌诊断和/或转移预测产品中的应用。

2.检测hsa_circ_0003681表达的试剂在制备结直肠癌免疫治疗预后评估产品或在制备筛选结直肠癌免疫治疗敏感人群的产品中的应用。

3.根据权利要求1或2所述应用，其特征在于，所述检测hsa_circ_0003681表达的试剂为针对hsa_circ_0003681的特异性引物。

4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述特异性引物包括如SEQ ID NO:2所示的上游引物和如SEQ ID NO:3所示的下游引物。

5.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述免疫治疗是PD-1抗体治疗。

6.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是用于结直肠癌诊断、转移预测、免疫治疗预后评估或筛选结直肠癌免疫治疗敏感人群的试剂盒；所述试剂盒含有检测hsa_circ_0003681表达的试剂。

7.根据权利要求6所述试剂盒，其特征在于，所述检测hsa_circ_0003681表达的试剂为针对hsa_circ_0003681的特异性引物。

8.hsa_circ_0003681或hsa_circ_0003681表达抑制剂在制备结直肠癌治疗药物中的应用。

9.一种用于治疗结直肠癌的药物，其特征在于，所述药物包括hsa_circ_0003681表达抑制剂。

10.一种用于免疫治疗不敏感型结直肠癌的治疗药物，其特征在于，所述药物包括hsa_circ_0003681表达抑制剂与免疫治疗药物。