CN110742899A

CN110742899A - miR-140在制备抑制乳腺癌增殖和迁移药物中的用途

Info

Publication number: CN110742899A
Application number: CN201910723840.3A
Authority: CN
Inventors: 郭志刚; 胡志刚; 鲁潇
Original assignee: Nanjing Normal University
Current assignee: Nanjing Normal University
Priority date: 2019-08-06
Filing date: 2019-08-06
Publication date: 2020-02-04

Abstract

本发明公开了miR‑140在制备抑制乳腺癌增殖和迁移药物中的用途。miR‑140可以通过直接结合到FEN1的3′UTR来抑制FEN1的蛋白表达，从而导致DNA修复受损，并使肿瘤细胞的增殖和迁移受到抑制。在裸鼠移植瘤模型中进一步发现过表达miR‑140可以增加乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性，其中，与阿霉素的联合作用效果最佳。该发明为在临床上利用miR‑140来诊断和治疗乳腺癌，以及提供药物靶点方面提供了应用价值。

Description

miR-140在制备抑制乳腺癌增殖和迁移药物中的用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及miR-140在制备抑制乳腺癌增殖和迁移药物中的用途。

背景技术

乳腺癌的种类很多，其类型性质各异，不同的现代药物被用来治疗乳腺癌，可以使用抗雌激素如雷洛昔芬或他莫昔芬对乳腺癌进行药物治疗，也可根据病人的情况使用化疗药物治疗，化疗药物包括5-氟尿嘧啶、紫杉醇、铂类药物(顺铂、卡铂)、阿霉素、环磷酰胺等。化学治疗的作用原理通常是借由干扰细胞分裂的机制来抑制癌细胞的生长或积累肿瘤细胞的DNA损伤诱导肿瘤细胞凋亡，多数的化疗药物都没有专一性，所以会同时杀死进行细胞分裂的正常组织细胞。化学疗法通常两种或以上的药物联合使用，称做“综合化学疗法”，大多数癌症患者的化疗都是使用这样的方式进行治疗。肿瘤产生耐药性是化疗过程中导致肿瘤治疗失败的一个重要因素。逆转肿瘤细胞的耐药性，提高肿瘤细胞对药物的敏感性，是肿瘤治疗研究领域的一大热门。化疗药物能够通过加剧肿瘤细胞的DNA损伤，从而起到杀死肿瘤细胞的作用。而DNA损伤修复能力的提高与肿瘤化疗过程中耐药性的产生有关。

靶向治疗是从90年代后期开始在治疗某些类型癌症上取得了明显的效果，与化学治疗一样可以有效治疗癌症，但是副作用与化疗相较之下减少许多。乳腺癌最常见的靶向治疗药物是赫赛汀，适用于HER2过度表达的转移性乳腺癌。靶向治疗比传统的治疗手段具有靶向性的优点，可以分析特定的癌细胞与正常细胞中的某些基因的表达差异来设计特定的治疗药物，由于靶向治疗具有更高的精准性并对正常细胞的副作用较小，因此目前很多科研工作者和医疗人员都比较重视此治疗方法。但目前用于靶向治疗的特效药很少。

MicroRNA(miRNA)是一组长度为18-25nt左右的小分子非编码RNA，可以通过调节下游靶基因来调控相关生物学过程。基于一种miRNA可以调控多种下游靶基因这一特性，赋予了miRNA功能的多样性。miRNA主要通过切割而降解靶基因的mRNA或者抑制靶基因的翻译来参与细胞内的调控。大量研究表明miRNA能够作为癌基因或抑癌基因参与肿瘤的发生发展。

FEN1作为一种结构特异性的金属多功能核酸内切酶，参与了DNA复制和DNA损伤修复两种途径。在DNA复制中，FEN1参与了冈崎片段的成熟；而在碱基切除修复(BER)过程中，FEN1则参与长片段碱基切除修复的过程。此外，FEN1还具有维持基因组稳定性和端粒稳定性的功能。

发明内容

发明目的：本发明目的是提供一种miR-140或含有miR-140的表达载体在制备抑制乳腺癌药物中的用途，用于解决现有技术中乳腺癌增殖和迁移的难题。

技术方案：本发明提供一种miR-140或含有miR-140的表达载体在制备抑制乳腺癌药物中的用途。

进一步地，所述药物为抑制乳腺癌增殖和迁移的药物。

进一步地，所述miR-140序列如SEQ ID NO：1所示。

SEQ ID NO：1：5’-cagugguuuuacccuaugguag-3’

进一步地，所述药物的制剂形式为液体制剂、颗粒制剂、片剂或胶丸。

进一步地，所述药物还包括药学上可接受的载体。

进一步地，所述miR-140的启动子与转录因子或抑制因子Ying Yang1结合，所述Ying Yang1序列如SEQ ID NO：2所示。

进一步地，所述结合的位点为site4，site4序列如SEQ ID NO：3所示。

SEQ ID NO：3：

全部序列为site4 chip实验Qpcr的引物识别的序列，其中，大写部分为-(235-225)序列)。

进一步地，所述miR-140过表达。

FEN1在多种不同的肿瘤中都是高表达的，而在正常细胞中低表达。通过抑制FEN1表达能够降低肿瘤细胞的增殖能力，同时增强肿瘤细胞对化疗药的敏感性，因此FEN1能够作为肿瘤治疗的一个潜在的靶点。

所述FEN1用于PCR扩增的引物为：

FEN1-F：5’-cggggtaccaatgggaattcaaggcctggc-3’-F(SEQ ID NO：4)

FEN1-R：5’-tgctctagattattttccccttttaaacttcc-3’-R(SEQ ID NO：5)

miR-140可以通过直接结合到FEN1的3′UTR来抑制FEN1的蛋白表达，从而导致DNA修复受损，并使肿瘤细胞的增殖和迁移受到抑制。在裸鼠移植瘤模型中进一步发现过表达miR-140可以增加乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性，其中，与阿霉素的联合作用效果最佳。利用乳腺癌阿霉素耐药细胞株，发现过表达miR-140可以逆转乳腺癌的耐药性，使乳腺癌耐药细胞重新对阿霉素敏感。此外，过表达FEN1可以减轻miR-140导致的乳腺癌细胞DNA损伤的积累和降低乳腺癌细胞对化疗药物阿霉素的敏感性，从而证明miR-140对乳腺癌细胞的损伤的积累，以及对化疗药物的影响是通过下调FEN1发挥作用的。

另外，通过生物信息学分析和实验的验证，证明了转录因子/抑制因子Ying Yangl(YY1)直接与miR-140启动子结合，激活miR-140表达，并找到了最优的结合位点site4。YY1可以直接与FEN1的启动子结合抑制FEN1的表达，而本发明证明YY1还可以通过激活表达miR-140来间接抑制FEN1的表达，在乳腺癌耐阿霉素细胞中，miR-140低表达，而YY1高表达。在阿霉素耐药条件下，YY1结合miR-140启动子的能力显著下降。

有益效果：本发明研究结果表明，miR-140通过抑制FEN1来抑制DNA损伤修复，进而抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移，增强乳腺癌细胞对化疗药物敏感性和降低其耐药性。miR-140能够作为一种新的乳腺癌辅助治疗的抗肿瘤因子，为制备治疗乳腺癌的药物设计和筛选提供新的靶点和思路。

附图说明

图1为miR-140直接影响FEN1的表达，(A)qPCR检测四种乳腺癌细胞中过表达miR-140对FEN1 mRNA水平的影响，(B)WestonBlotting检测四种乳腺癌细胞中过表达miR-140对FEN1蛋白水平的影响，(C)miR-140与FEN1的3′UTR的结合序列，矩形框区域内是FEN1 3′UTR与miR-140结合位点的突变碱基(D)HEK-293中过表达野生型(WT)或突变型(MT)FEN1的3′UTR荧光素酶报告质粒及miR-140或阴性参照核进行荧光素酶活性分析；

图2为FEN1与miR-140在肿瘤的表达检测与预后关系，(A)和(B)分别是TCGA数据库中FEN1和miR-140在乳腺癌与癌旁组织中的相对表达差异，(C)和(D)分别是FEN1和miR-140的表达与患者预后的关系，(ns，无显著性差异，**，P＜0.01；***，P＜0.001)；

图3为miR-140对细胞增殖的影响，(A)qPCR检测稳转细胞系中的miR-140的表达量，(B)连续细胞计数，测量细胞的增殖速率，(C)结晶紫染色后，比较克隆形成的数量，(D)是(C)克隆数量的统计分析(ns，无显著性差异，**，P＜0.01；***，P＜0.001)；

图4为稳转miR-140后MCF-7细胞的迁移程度，(A)细胞划痕培养24h拍照分析，(B)划痕的迁移效率统计图，(C)将细胞培养道Transwell小室48h，结晶紫染色后拍照，(D)结晶紫染色后的数量统计，(ns，无显著性差异，**，P＜0.01；***，P＜0.001)；

图5为miR-140对细胞周期的影响，(A)图为细胞免疫荧光实验检测Ki67在稳转miR-140与其阴性对照细胞中的表达情况；图示中的标尺为20μm，(B)是图(A)的定量图，来自三次独立重复试验(C)和(E)是流式细胞术分析在瞬时转染miR-140与其阴性对照细胞在sub-G1、G1、S或G2-M期细胞的分布情况，(D)和(F)直方图分别代表(C)和(E)中一次典型实验的分析结果，(ns，无显著性差异，**，P＜0.01；***，P＜0.001)；

图6为过表达miR-140，观察裸鼠肿瘤模型的情况，(A)对不同组的miR-140裸鼠皮下肿瘤的体积，(B)不同药物处理组裸鼠皮下剖出的肿瘤块图片，(C)肿瘤块重量记录，(D)图B中的肿瘤切片H&E、FEN1、Ki67、Cleaved-caspase3的染色情况，(ns，无显著性差异，**，P＜0.01；***，P＜0.001)；

图7为细胞中过表达miR-140对不同化疗药物的敏感性比较，(A-D)MTT检测MCF-7细胞过表达miR-140后采用不同浓度的5FU、Paclitaxel、Cisplatin、Camptothecin等化疗药物处理后检测细胞的存活率，(E)和(F)是MCF-7与MB231过表达miR-140后采用不同浓度的ADR处理后检测细胞的存活率，(ns，无显著性差异，**，P＜0.01；***，P＜0.001)；

图8为过表达miR-140对细胞凋亡的影响，(A)细胞形态学分析MCF-7过表达miR-140加入ADR后观察细胞状态，(B)典型的流式细胞点状图显示不同转染下的AnnexinV和PI共染MCF-7凋亡细胞的情况，(C)直方图显示对(B)图的统计结果，(D)典型的流式细胞点状图显示不同转染下的AnnexinV和PI共染MB231凋亡细胞的情况，(E)直方图显示对(D)图的统计结果，(ns，无显著性差异，**，P＜0.01；***，P＜0.001)；

图9为miR-140与FEN1在耐药细胞中对药物抵抗的影响，(B)用qPCR检测MCF-7-ADR-140是否稳定过表MCF-7-ADR-140，(A)细胞形态学分析，miR-140和FEN1对MCF-7-ADR抵抗ADR处理时的细胞状态，(C)细胞活力测定，使用MTT检测细胞存活率，(ns，无显著性差异，**，P＜0.01；***，P＜0.001)。

具体实施方式

本发明涉及的底物及引物序列见表1。

表1本发明涉及的底物及引物序列

1、实验方法：

1.1细胞的复苏、传代、冻存

细胞的来源及培养基成分等均列于下表2(以下论述皆以10cm皿细胞为例)：

表2细胞的来源及培养基类型

所有的细胞使用培养基培养前，加入10％的血清和1％的青霉素和链霉素。所有细胞均培养在37℃，5％CO₂的恒温培养箱中，并且在培养箱底部要放置一个盛有灭菌超纯水的托盘，以确保培养箱保持合适的湿度。

细胞的复苏：将细胞从液氮罐中快速并小心取出，谨防液氮冻伤。将冻存管快速放进37℃水浴锅使其迅速融化，将融化的冻存液置于无菌的离心管中，并加1mL新鲜培养基，1000rpm离心2min，吸出上清，再使用1mL新鲜培养基轻柔的吹悬细胞沉淀，并转移至事先加好培养基的细胞培养皿中进行培养。

细胞的传代：待细胞生长至皿中密度约为80-90％时，吸除培养皿里的细胞培养基，并顺着细胞培养皿内壁缓慢加入PBS，谨防用力过猛将细胞从培养皿中吹落。清洗细胞2次，之后加入0.25％的胰酶(含0.02％EDTA)进行细胞消化，在显微镜下随时观察细胞形态，待大部分细胞变圆后，及时吸走胰酶，并在培养皿中加入新鲜培养基2-3mL终止消化，之后吹悬细胞，并分到2-3个培养皿中继续培养(传代时一盘细胞传代几盘细胞取决于细胞浓度及状态)。

细胞的冻存：将长满且状态良好的细胞消化之后，用培养基吹悬并转移至离心管中，1000rpm，2min离心后去上清，用事先配好的冻存液吹悬细胞，将细胞分装入冻存管中，每管冻存液约为1～1.5mL，并在冻存管上清楚的标明细胞的名称，冻存时间及操作者，将冻存管放置于冻存盒中。将冻存盒放置于-80℃冰箱。第二天取出置于液氮罐中长期保存或暂时放于-80℃冰箱短期保存。冻存液的配方如下：50％培养基+40％胎牛血清+10％DMSO。

1.2实验中药物的准备

本实验中主要用到的化疗药物及来源见下表3：

表3本实验中主要用到的化疗药物及来源

药品名称(英文)	药品名称(中文)	药品来源	药品溶剂
				Paclitaxel	paclitaxel	Selleck	DMSO
Camptothecin	喜树碱	Selleck	DMSO
				Doxorubicin	阿霉素	Selleck	DMSO
Cisplatin	顺铂	Selleck	DMSO
				5FU	5氟尿嘧啶	Selleck	DMSO

1.3细胞计数

(1)将细胞从培养箱中取出，在超净台中吸掉细胞培养基，并向10cm细胞皿加入2mL的PBS清洗细胞2次，去掉PBS后加入1mL胰酶，缓慢晃动，使胰酶均匀的覆盖整个细胞皿，当显微镜下观察到细胞大部分变圆，立即吸走胰酶，加3mL培养基终止消化，并轻轻吹悬细胞，重复轻轻吹打细胞，使之充分消化成单个细胞。

(2)再超净台内将消化的细胞收集到离心管中，在离心管中轻轻吹打混匀。然后从离心管中吸取10μL细胞悬液于200μL离心管中，在超净台之外，将10μL的台盼蓝与之混合，吹均匀。将全部20μ的混合溶液缓慢加入到细胞计数板，将计数板平行插入细胞计数仪中。用配套的细胞计数仪计数细胞。为保证数据的可靠性，转动细胞计数仪的旋钮，分别读取不同视野中的细胞个数，再取平均值，并且每个样品要重复3次上述计数过程。加入台盼蓝后，整个计数过程最好不要超5min。如果需要计数的细胞样品浓度过高，可按照合适比例稀释后再进行测定。细胞样品浓度过高或过低都可能导致测量不准确。

1.4细胞瞬时转染慢病毒感染与鉴定

(1)将状态良好的细胞分到12孔板或者6孔板中，此处以12孔板为例。首先将细胞消化，具体过程参照之前的操作步骤，将消化好的细胞的细胞转移到离心管中或直接在细胞培养皿中进行操作，可依据个人习惯。将约2×105个细胞转移到12孔板中。转染一种质粒一般设立三个平行孔，作为组内重复。每次转染要有阴性对照即转染空载质粒等，将12孔板中每个孔加入1mL的培养基，用移液器吹打每个孔，注意谨防污染，然后将12孔板拿出超净台，在平桌上左右、前后晃动12孔板，使细胞均匀的分布在12孔板内。将12孔板静止2min，然后轻轻移至显微镜下，观察沉降后的细胞是否均匀的分布在12孔板内。如果细胞挤在一起会影响转染效率，如果分布不均匀要重新晃动12孔板。第二天显微镜下观察细胞的密度。细胞密度在70％左右时可对细胞进行转染。

(2)转染前，去除12孔板内的旧培养基，加入新鲜的无血清无双抗的培养基，放入培养培养箱中，提前饥饿细胞约2个小时。

(3)取适量1.5mL离心管中，每个管中加入300μLOpti-MEM，并做好标记。转染一种质粒对应两个离心管，在一个离心管中加入脂质体(2μL每孔，如果转染三个孔就加入6μL脂质体)，静止5min，让脂质体充分扩散。对应的离心管中加入miR-140RNAmimic或目的质粒(5ng每孔，按照实际转染孔数计算加入的mimic的量)，阴性对照组亦是如此，只是将质粒换成相应的空载质粒或者无义质粒。将两个离心管中的物质混合。将混合物静止20min。将混合物按每孔200μL的量加入12孔板中，6h(可按照转染细胞的种类适当延长或者缩短时间)后将板内的培养基去除。加入新鲜的含有血清和双抗的培养基，继续培养48h收取细胞样。

所述miR-140RNAmimic为成熟体序列的双链，序列如下：

5’-cagugguuuuacccuaugguag-3’

3’-gtcaccaaaatgggataccatc-5’。

1.5慢病毒感染与鉴定

本实验中用到过表达miR-140慢病毒由公司购买，事先已经进行过滴度测定。

(1)慢病毒感染实验要在生物安全柜进行操作，实验前做好安全防护，在接种好的，状态良好的六孔板中细胞密度达到约为40-50％时，进行病毒感染实验。

(2)病毒感染细胞前，弃去原来的培养基，加入1-2mL新鲜培养基，按1∶1000的比例加polybrene2μL，再均匀加入适量慢病毒悬液，继续培养48h。

(3)48h后，荧光显微镜下仔细观察病毒感染后的细胞，观察细胞有无荧光以及荧光的强度与密度，若荧光强度、密度适中，说明病毒感染成功，可以换新鲜的培养液，并且加入适量的特定药物进行药筛，本实验是嘌呤霉素药筛，MCF7和MB231细胞按1∶1000加即可。

(4)药筛2-3天，待没加病毒的阴性细胞全死亡，加病毒细胞中的荧光强度逐渐增强，结束药筛，此时稳转细胞株建立，可将其进行扩大培养并冻存细胞。

(5)用WesternBlot或qPCR方法进行鉴定病毒感染效果。由于本实验慢病毒过表达miR-140，所以使用qPCR的方法进行检测。

1.6药物敏感性实验

(1)准备适量的96孔板，在每个96孔板的边缘排孔中加入300μL灭菌的PBS或灭菌ddH₂O。

(2)根据1.3的步骤对细胞计数，并稀释细胞，使每孔的细胞数为4000个，并且每孔的培养基总量为200μL，轻微摇晃振荡，使细胞在培养板中分散均匀。待细胞贴壁24h之后，加入梯度稀释的各种药物。其中paclitaxel的浓度梯度为0，0.1，0.5，1，5，10μM；阿霉素的浓度梯度为0，0.05，0.1，0.5，1，5μM；喜树碱、5FU、顺铂的浓度设置为：0，5，10，50，100，200μM。

(3)加药48h后，吸掉含药的培养基，并用PBS清洗2-3遍，每个孔加入200μL新鲜的培养基及10μLCell^TMCountingKit-8(CCK8)试剂，孵育3-4h后，在450nm处读取相应的OD值，并以溶剂孔读数作为100％，计算药物对细胞的生长的抑制作用。

1.7克隆形成实验

(1)在细胞超净台中用移液枪轻轻的将皿中的旧的培养基吸走用无菌的1×PBS清洗2次，并消化细胞。

(2)用培养基终止消化，用枪轻轻吹悬，然后吸取到15mL细胞离心管中，1000rpm左右，室温离心2min。

(3)吸走上清后再加相对应的培养基吹打后，取20μL加入等体积的台盼蓝，用细胞计数仪进行计数如果需要接种的细胞少，可多加点新的培养基稀释细胞，以提高准确率。

(4)根据计数后的结果，每个六孔板的孔约接300-500个细胞，并加入2mL左右的新鲜培养基摇匀。

(5)在37℃，5％CO₂的恒温培养箱里面培养细胞10-15天右。

(6)直至六孔板中出现大小适宜的克隆细胞团，用结晶紫染液进行染10-15min，用双蒸水清洗2-3次直至清洗干净，拍照保存。

1.8细胞周期检测

(1)将生长状态良好的细胞弃掉细胞培养基，预冷的PBS清洗细胞2-3次，并用胰酶进行消化细胞。

(2)用1-2mL培养基吹悬细胞，并将细胞转移至离心管中，用1000rpm，离心2min进行离心。

(3)再用1mLPBS吹悬细胞并离心，重复清洗细胞3次。

(4)最后一次离心后，去除上清，加入1mLPBS吹悬细胞并缓慢加入3mL冰乙醇，用移液枪将细胞温和吹均匀，并将离心管置于-20℃过夜打孔。

(5)第二天，将含有细胞悬液的离心管取出，用冰PBS清洗细胞2次，吸取0.5mLPI/RNase染液将约为1×106个细胞轻轻吹悬至均匀，在室温孵育30min。

(6)将200目的滤膜置于流式管上方，移液枪吸取细胞，吸取前先进行吹打，防止细胞结团，并将枪头抵在滤膜上过滤细胞团块，收集的细胞悬液用流式细胞仪进行检测。

1.9细胞凋亡检测

(1)将细胞培养基吸取到一个干净的15mL离心管中，用PBS清洗细胞2次吸除PBS，用胰酶消化细胞，用2mL培养基吹悬细胞，将细胞悬液转移到离心管中。

(2)1000rpm室温离心3min，去除上清，用冰PBS继续清洗细胞2次并去除上清。

(3)用BD的凋亡试剂盒中的1×bindingbuffer重悬细胞(100μL中含有约为1×10⁵个细胞)，只加溶剂的细胞将作为实验的阴性对照，实验组的分成三部分，分别用AnnexinV-FITC或propidium iodide(PI)进行单染，其余样品均加入AnnexinV-FITC和propidiumiodide(PI)染液进行双染色，室温避光孵育染色15min。

(4)过滤前，在每1.5mLEP管中再加入400μL1×bindingbuffer，用移液枪吹打几次，防止细胞成团，将200目滤膜置于流式管上方，用移液枪吸取细胞，并将枪头抵在滤膜上过滤掉细胞团块，细胞悬液在1h内快速使用流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.10细胞总RNA提取与miRNA纯化

(1)Trizol裂解细胞：以六孔板为例，在每个孔内接种1×10⁶个细胞，培养过夜，次日弃去培养液，用1×PBS清洗两遍后每孔加入500μLTrizol室温裂解30min，将细胞裂解液移入RNaseFree的1.5mL离心管内。

(2)氯仿分离RNA：按照VTrizol∶V氯仿＝5∶1的比例在管内加入100μL氯仿，涡旋混匀后，室温静置10min，12000rpm 4℃离心15min。离心结束后管内液体分为三层，取最上层水相移入新的RNaseFree离心管内。

(3)异丙醇沉淀RNA：按照V Trizol∶V异丙醇＝2∶1的比例，在管内加入250μL异丙醇，颠倒混匀后，室温静置20min，12000rpm4℃离心10min。离心结束后，弃上清，可见底部RNA沉淀。

(4)乙醇清洁RNA：往管内加入500μL75％乙醇溶液(RNaseFreeddH₂O配制)，弹起底部沉淀，7500rpm 4℃离心10min，弃上清，重复清洁一次。

(5)RNaseFreeddH₂O溶解RNA：将RNA沉淀室温干燥10min后，加入20-30μLRNaseFreeddH₂O溶解，使用微量分光光度计测定所提RNA浓度及纯度，并记录。提取完成后，RNA可放至-80℃保存，避免反复冻融。当再次使用使需重新测定RNA浓度。

1.11荧光实时定量PCR(Real-timePCR)检测细胞mRNA及miRNA相对表达量(相关目的基因或miRNA进行荧光定量检测的引物见表1中编号4-11)

(1)逆转录：mRNA根据以下体系进行逆转录(10μL体系)RNA、1μg；5×RTmix、1μL；RNaseFreeddH₂O、至10μL；逆转录程序：42℃、15min；85℃、5s；12℃、∞逆转录后cDNA浓度为100nM，-20℃保存。

miRNA根据以下体系进行逆转录(10μL体系，逆转录酶不含Oligo-dT)

第一步解旋：RNA、1μg；miRNARTPrimer 1μL

RNaseFreeddH₂O至4.4μL RNA与

miRNARTPrimer解旋程序70℃，

10min，冰浴、2min。

第二步逆转录，在第一步解旋体系中加入以下试剂：dNTP0.8μL；RTenzyme、0.2μL；RNaseFreeddH₂O至5.6μL；

逆转录程序：42℃、60min；85℃、5s12℃、∞，

产物可放于-80℃保存。

(2)荧光实时定量PCR：

mRNA所转录的全转录组cDNA根据以下体系进行Real-timePCR(20μL体系)：

Primer-F(10nM)、0.4μL；Primer-R(10nM)、0.4μL

cDNA、4μL；SYBGreen、10μL；ddH₂O、至20μL；

mRNA所转录的全转录组cDNA Real-time PCR反应程序如下

mRNA所转录的miRNA-cDNA根据以下体系进行Real-timePCR(20μL体系)

Primer-F(10nM)、0.8μL；Primer-R(10nM)、0.8μL；

miRNA-cDNA、4μL；SYBGreen、10μL；RNaseFreeddH₂O、至20μL；

mRNA所转录的miRNA-cDNA Real-time PCR反应程序如下

融解曲线检测温度为70℃至95℃，升温速率为0.4℃/次，恒温时间为1s/次。将所得Ct值用于统计学分析。

1.12细胞免疫荧光

(1)提前将直径约1cm的细胞爬片用75％的酒精浸泡，使用前将爬片在酒精灯上短暂炙烤灭菌，并置于12孔板中。(2)将状态良好的细胞用胰酶消化，用培养基吹悬细胞，并将适量的细胞接种到每个孔中，摇晃均匀后，在培养箱进行过夜贴壁培养。(3)当细胞密度适合实验之后，根据实验需求加药本实验使用的药物主要H₂O₂和阿霉素对其进行处理。待细胞处理结束后，用PBS清洗细胞3次并去掉PBS。(4)每个孔加入1mL左右的4％多聚甲醛使液体覆盖爬片室温浸泡30min，将细胞固定。(5)吸走多于的液体，用PBS室温清洗细胞爬片3次，每次浸泡10min并吸走PBS。(6)加入提前配置好的0.5％Triton-X100溶液浸没细胞爬片室温浸泡15min，将细胞进行打孔。(7)吸走多余的液体，PBS清洗3次，每次10min，去掉PBS。(8)在12孔板中，每孔加入约1mL的5％BSA，浸没细胞爬片，室温下孵育1h，进行封闭。(9)将封闭液吸走，用吸水纸将爬片四周的液体吸净，加入事先配好的一抗，本实验主要用的一抗是γH2AX和53BP1，抗体需要的稀释比例参考说明书，4℃冰箱过夜。(10)第二天用PBST(含0.1％Tween 20)漂洗细胞爬片3次，每次15min并去掉PBST。(11)在细胞爬片上滴加事先配好的荧光二抗，二抗的稀释比例参考说明书，37℃避光孵育1-2h。(12)PBST(含0.1％Tween20)漂洗细胞爬片3次，每次15min。(13)用吸液器将残余液体吸干，在爬片上滴加50-100μLDAPI染液，DAPI的稀释比例参照说明书，室温染色约15min。(14)PBS浸没细胞爬片，清洗3次，每次10min。(15)将一滴抗荧光淬灭剂滴加于载玻片上，细胞爬片捞出后，用吸水纸吸走周围液体。将有细胞的一面向下扣向淬灭剂。用指甲油在细胞爬片的周围封边，尽量不要让指甲油过多的滴加到细胞爬片上，封片为了防止拍照时爬片发生移动，拍照视野不容易固定。为防止荧光淬灭，应尽快用荧光显微镜拍照，若需保存，则短期保存于4℃。

1.13细胞中蛋白表达检测

1.13.1细胞总蛋白提取以12孔板为例

(1)当细胞在培养皿中的生长密度达到80-90％时，是提取细胞总蛋白的最佳时期。在超净台中吸除培养皿中的培养液，并用灭菌的PBS清洗细胞2次，并吸除PBS。(2)取1mL的蛋白裂解液，并加入5μL200×PMSF及10μL100×的cocktail。将配制好的蛋白裂解液加入到12孔板中，每个孔大约加入100μL，若细胞量比较多，将适当增加细胞裂解液的用量。轻轻摇晃，使细胞裂解液均匀覆盖孔板。置于冰上，裂解约30min。(3)将裂解好的细胞用细胞刮全部刮下来，并将所有的细胞裂解液转移至新的1.5mLEP管中，12000rpm，4℃，离心10min。(4)将离心后的上清液小心吸取到一个新的1.5mLEP管中，即为细胞的蛋白样品。

1.13.2蛋白免疫印迹(Blot)

(1)在上述细胞裂解液中加入6×loadingbuffer，混匀后至沸水中煮约5min。取出后，用离心机短暂离心，将蒸发凝固在管壁的液滴离心至管底。根据实验需要检测的蛋白大小，制备相应浓度的SDS-PAGE凝胶，分离胶的浓度越高，越有利于小蛋白的分离。本文中所涉及到的蛋白均可以用12％的分离胶来进行实验。

(2)将配置好的胶板放于垂直电泳槽中，将电泳槽中加入1×runningbuffer，将胶板上的梳子垂直小心拔出，每个样品取10μL上样，调节电压及电流，恒压80V跑约半个小时电泳；待样品跑出浓缩胶后，marker开始分离，调节电压至120V继续跑分离胶，根据目的蛋白的大小调节具体跑胶的时间长短。若目的蛋白较大，则可根据实际情况加大电压，并且适当延长电泳时间，一般情况下当看到溴酚蓝快要跑出胶板的底部时，即可以停止电泳。

(3)电泳结束后，将胶板取出，冲洗掉上面的泡沫及buffer，剥离PAGE胶，剥胶的时候要小心，防止将胶撕破，将胶平铺在转膜夹上。将已被甲醇激活的PVDF膜覆盖胶上，小心将气泡赶走，装进转膜电泳槽，电泳槽中提前加入预冷的1×transbuffer，100V恒压转膜60min。根据蛋白的大小可以调节转膜的电压及转膜的时长。

(4)转膜结束后，迅速将膜取出放进事先配好的5％脱脂奶粉或者5％BSA溶液中进行封闭，封闭液要用PBS配置，常温摇床孵育1.5h。

(5)封闭结束后，将膜从封闭液中取出，用PBS清洗三次，然后根据目的蛋白的大小将PVDF膜小心剪开，注意设置内参蛋白。将剪取的膜浸泡在相应的抗体中，4℃过夜孵育一抗，一抗的稀释比例参照说明书。

(6)第二天将一抗吸出回收，用PBST(含0.1％Tween20)洗膜3次，每次15min。

(7)常温孵育二抗，一般1-2h即可，PBST(含0.1％Tween20)洗膜3次，每次15min，二抗回收。

(8)将膜取出正面朝上均匀滴加配好的ECL显影液，显色液现配现用，放进成像仪暗箱中曝光，保存图像。

1.13.3 Bradford法测定蛋白浓度

(1)将预先配制好的BSA标准蛋白溶液(1.47mg/mL)用1×PBS按照0，0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5mg/mL进行稀释，制作标准曲线。(2)将标准蛋白样品依次加到96孔板中，每孔加10μL，每个样品重复上样3次，操作时要小心，避免产生气泡，使测量误差偏大。(3)先将待测样品用PBS稀释10倍，主要是防止蛋白样品浓度过高，超过标曲最大浓度，导致测量不准确。然后将稀释过的样品依次加入96孔板中，3次重复上样。(4)将Bradford染液使用双蒸水稀释5倍，染液使用时要现用现配。每个样品孔中加入200μL稀释好的染液，室温静置1-2min。(5)使用酶标仪进行测量OD值，所用的波长为595nm，并绘制标准曲线，计算出待测样品的蛋白浓度。

1.14免疫组化

(1)将从裸鼠皮下剥离出的组织块或肿瘤块交由谷歌生物公司制成石蜡切片。(2)石蜡切片置于60℃的烘箱烘烤，4-6h后取出。(3)将烘干的切片置于二甲苯中进行脱蜡，共2次，每次10min；之后依次转移至100％、90％、80％、70％、50％等不同浓度的乙醇溶液中分别脱水两次，每次5min，最后用ddH₂O₅min，共清洗两次。用吸水纸小心吸干切片周围上的多余水分。(4)选取合适的组织区域，用阻水笔沿着组织的外缘小心地圈出一个闭合的区域，将切片浸；泡于3％H₂O₂中，室温避光孵育约10-15min。(5)PBS漂洗切片3次，每次约5min。(6)用吸水纸吸干切片的多余水分，将圈中的区域滴上抗原修复液，使其覆盖整个组织区域，37℃，15min。(7)用1×PBS小心漂洗切片3次，每次约5min。(8)将切片浸泡于事先配好的3％BSA封闭液中摇床缓慢摇动室温封闭1h。(9)将切片上的多余液体吸走，并用吸水纸小心将液体吸干，在组织样上方滴加一抗(一抗用3％BSA封闭液进行稀释，稀释比例参展说明书)至覆盖样品，4℃孵育过夜。此步骤可设置阴性对照，即在阴性样品上方，只孵育等量的BSA溶液进行对照。(10)第二天，去除抗体盒复温约45min，用PBST(含0.1％Tween20)清洗玻片3次，每次约10min。(11)用吸水纸吸干玻片上的水分，在组织上方滴加相应的二抗，37℃孵育约1-2h，阴性对照也滴加相应的二抗。用PBST清洗玻片，步骤同上。(12)将配好的DAB(有毒，操作时注意实验规范)滴加到组织样上，覆盖即可，避光染色约2min(可在显微镜下观察组织的染色情况，及时终止反应)。(13)用ddH₂O反面冲洗切片，终止反应。(14)沥干切片上的水分后，用苏木素复染，染色约2min，在显微镜下观察组织出现颜色区分时，即可加入1％的盐酸甲醇分化液，分化时间约5-20s，依情况而定。(15)使用ddH₂O终止反应。(16)将玻片依次浸泡于50％、70％、90％、100％的乙醇中进行脱水，各2次每次约3min最后在通风橱中将切片置于二甲苯中浸泡2次每次约3min。(17通风橱中自然晾干玻片，并在组织上滴加适量中性树脂盖玻片覆盖其上，注意尽量避免气泡。(18)显微镜下观察并拍照。

1.15、质粒构建

(1)设计引物：通过查找相关目的基因序列的CDS区资料，设计并合成合适目的基因的引物。(2)目的基因扩增：根据目的基因的引物，以及目的基因的大小，设计适宜的退火温度，延伸时间的PCR扩增条件，进行PCR扩增。(3)跑胶：将PCR产物取一部分加入loadingbuffer点样，加到提前做好的琼脂糖胶中，100V，30min，根据marker指示的大小确定扩增条带的大小，(若没出现条带，可以改变优化扩增条件，重新扩增)。(4)纯化目的基因：使用axygen纯化试剂盒进行PCR产物的纯化。(5)酶切：将纯化后的目的基因和需连接的载体使用相同的酶在37℃水浴锅中酶切过夜(这里使用NEB的酶)。(6)胶回收：将酶切后的产物全部点加到核酸胶中，跑胶，将带有酶切产物的胶切割下来(切下来的胶尽量小，以免降低回收效率)。(7)酶连：目的基因和载体回收纯化后，16℃酶连4-6h。(8)转化、涂板：将酶连产物取出加到感受态细胞DH5-α中，扩大培养后涂在带相应抗性的平板上；(9)挑取单克隆、送测序公司测序。

1.16双荧光素酶报告实验

(1)裂解细胞：将报告基因细胞裂解液充分混匀后，按如下方式加入报告基因细胞裂解液，充分裂解细胞。

a.对于贴壁细胞：吸尽细胞培养液后，参考下表加入适量的报告基因细胞裂解液；对于悬浮细胞：离心去上清后，参考下表加入适量报告基因细胞裂解液。

器皿类型96孔板 48孔板 24孔板 12孔板 6孔板报告基因细胞裂解液(微升/孔)100 150 200 300 500

注：如果萤光素酶的表达水平比较低，可以尝试使用更少的裂解液，例如6孔板的每孔用量可以最小为100微升。

b.充分裂解后，10,000-15,000g离心3-5分钟，取上清用于测定。

注：细胞裂解后可以立即测定萤光素酶，也可以先冻存，待以后再测定。冻存样品需融解，并达到室温后再进行测定。

(2)融解萤火虫萤光素酶检测试剂和海肾萤光素酶检测缓冲液，并达到室温。海肾萤光素酶检测底物(100X)置于冰浴或冰盒上备用。

(3)按照每个样品需100微升的量，取适量海肾萤光素酶检测缓冲液，按照1∶100加入海肾萤光素酶检测底物(100X)配制成海肾萤光素酶检测工作液。例如，1毫升海肾萤光素酶检测缓冲液中加入10微升海肾萤光素酶检测底物(100X)充分混匀后即可配制成约1毫升海肾萤光素酶检测工作液。

(4)按仪器操作说明书开启化学发光仪或具有检测化学发光功能的多功能酶标仪，将测定间隔设为2秒，测定时间设为10秒。

(5)每个样品测定时，取样品20-100微升(如果样品量足够，请加入100微升；如果样品量不足可以适当减少用量，但同批样品的使用量宜保持一致)。

(6)加入100微升萤火虫萤光素酶检测试剂，用枪打匀或用其它适当方式混匀后测定RLU(relative light unit)。以报告基因细胞裂解液为空白对照。

(7)在完成上述测定萤火虫萤光素酶步骤后，加入100微升海肾萤光素酶检测工作液，用枪打匀或用其它适当方式混匀后测定RLU(relative light unit)。

(8)在以海肾萤光素酶为内参的情况下，用萤火虫萤光素酶测定得到的RLU值除以海肾萤光素酶测定得到的RLU值。根据得到的比值来比较不同样品间目的报告基因的激活程度。如果以萤火虫萤光素酶为内参，也可以进行类似计算。

1.17动物实验

(1)提前一周从南大模式所购买4周左右的的BALB/c裸鼠，使之能提前适应饲养环境。(2)同时大量培养MCF-7与MB231已经稳转NC和miR-140的细胞系，将细胞扩大培养，当其生长至足够实验用量且状态良好时，用胰酶消化细胞，将同一种细胞收集在15mL离心管中。(3)取出10μL细胞悬液，用细胞计数仪计数。(4)提前取出分装的基质胶冰上融化，基质胶和细胞悬液体积1∶1混合，每个小鼠皮下注射250万个细胞，注射体积为100μL。(5)注意观察小鼠皮下肿瘤的生长情况，待肿瘤长至50m3时，将裸鼠随机均分成2组。(6)同时测量并记录小鼠肿瘤的长和宽及体重，并计算肿瘤的体积，计算公式为：长×宽²/2。(7)成瘤后27天，在每组随机取出一只小鼠，将其处死，并小心剖出皮下的肿瘤，制成石蜡切片，为后续的免疫组化实验做准备。

1.18细胞侵袭实验

(1)配制结晶紫染液：取结晶紫0.05g溶于甲醇制成0.5％的结晶紫溶液，用时用PBS溶液1∶5-8成0.1％的结晶紫染液。(2)transwell侵袭孔的制备：将BD matrigel和无血清培养基以1∶8的比例稀释，吸取80μl加入transwell的上室中，放置于培养箱中至少30分钟。(3)细胞离心：将细胞消化、离心、无血清重悬、并稀释成5×105个/ml的细胞悬液。(4)下室加培养基：Transwell板中加入500μl含20％FBS的完全培养基，将小室放入板中。(5)上室接种细胞：在transwell小室中加入200μl的细胞悬液，将Transwell板37℃下于CO2(含量5％)培养箱中培养48h。(6)染色：将小室取出，用PBS洗去培养基，结晶紫染色10min；自来水将表面的结晶紫洗除干净，用棉签将上室中接种侧的细胞擦除干净，于显微镜下对非细胞接种侧拍照。(7)结果分析：每种处理随机取5个视野，进行细胞计数，以细胞数量反应细胞的迁移能力。

1.19细胞存活性实验

(1)将细胞消化接种：用含10％胎小牛血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔2000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul。(2)培养细胞：同一般的培养条件，培养2天(可根据试验目的和要求决定培养时间)。(3)呈色：培养2天后，每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS配)20ul。继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。(4)比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

1.20数据处理与统计

以上实验数据用Excel进行整理，Origin8或Graphprism软件进行统计学分析，两组数据之间的差异分析使用的是样本平均值比较的t检验，多组数据差异采取的是单因素方差分析。*p＜0.05表示差异显著，**p＜0.01表示差异非常显著，***p＜0.001表示差异极其显著。

两种药物联合使用的作用分析运用了Compusyn软件，用等效线图解法做出最终判定。

2、实验结果

2.1miR-140靶向并下调FEN1的表达

通过实验验证miR-140是否可以调控FEN1的表达。委托广州锐博生物公司合成miR-140的mimic以及miRNA的阴性对照。

通过瞬时转染miR-140的mimic与阴性对照，将miR-140的mimic转染不同类型的乳腺癌细胞系，包括MCF-7、MB231、T47D、Bcap37，并检测miR-140对FEN1蛋白和mRNA水平的影响。数据显示，这四种细胞系中，过表达miR-140都可以明显下调FEN1蛋白水平而不影响FEN1的mRNA水平(图1A、B)。这说明miR-140对FEN1的调控作用是通过抑制靶基因的翻译来调控FEN1的表达。接下来，进一步探究miR-140对FEN1表达的影响是否与Targetscan预测的miR-140与FEN1的3′UTR直接结合有关。构建了含有与miR-140结合的FEN1的3′UTR序列，并且在FEN1与miR-140完全互补配对的位点序列，突变了三个碱基(图1C FEN1MT33′UTR中右侧的AAU)。即构建了pMIR-FEN1-3′UTR-WT与pMIR-FEN1-3′UTR-MUT的双荧光素酶报告系统表达质粒。HEK-293细胞中分别转染两种质粒，共转染miR-140或阴性参照及Renilla。接着我们进行了荧光素酶报告分析和突变分析。将测得的结果一个萤火虫荧光素酶产生的光信号，记为RL1，海肾荧光素酶产生的信号，记为RL2。RL1/RL2将数据均一化后，每两组之间用ANOVA检测，发现，过表达pMIR-FEN1-3′UTR-WT和miR-140组与阴性参照组相比荧光值降低即miR-140能够与FEN1的3′UTR结合并下调萤火虫荧光素酶的表达。而过表达pMIR-FEN1-3′UTR-MUT和miR-140组与参照组对比，荧光值不变，即突变后FEN1的3′UTR不与miR-140结合(图1D)。

其中，pMIR-FEN1-3′UTR-WT的引物序列为：

pMIR-FEN1-3′UTR-WT-F：5’-gctaactagtgctcaggaaaatatgt-3’-F(SEQ ID NO：：6)

pMIR-FEN1-3′UTR-WT-R：5’-gctaaagcttctccctctcttctcc-3’-R(SEQ ID NO：7)

pMIR-FEN1-3′UTR-MUT的引物序列为：

pMIR-FEN1-3′UTR-MUT-F：5’-cattaaactgcctgagaagatttttgagcctgacatattttcctgagctaaaacagg-3’-F(SEQ ID NO：8)

pMIR-FEN1-3′UTR-MUT-R：

5’-cctgttttagctcaggaaaatatgtcaggctcaaaaatcttctcaggcagtttaatg-3’-R(SEQID NO：9)

2.2 FEN1与miR-140在乳腺癌中的表达水平及预后关系

通过数据库(TCGA)分析，发现FEN1的mRNA水平在乳腺癌中是高表达的，而miR-140在乳腺癌中是低表达的(图2A、B)。Kaplan Meier对乳腺癌患者的生存分析显示低表达FEN1的患者预后更好，而患者中高表达miR-140的预后比miR-140低表达的更好(图2C、D)。

2.3miR-140抑制MCF-7和MB231的细胞增殖及克隆形成

前期实验已证明miR-140可以抑制FEN1的表达，于是猜测miR-140在乳腺癌细胞中是作为抑癌基因存在。由于肿瘤细胞的一个主要特点是快速增殖。肿瘤细胞增殖能力越强，恶性程度就越高，患者的复发转移风险也就越高。肿瘤细胞的增殖能力，是肿瘤恶性程度的一个重要指标。于是过表达miR-140检测肿瘤细胞的迁移增殖等。首先用miR-140与阴性对照的慢病毒感染MCF-7和MB231细胞，筛选稳转细胞系。得到MCF-7-NC、MCF-7-140以及MB31-NC、MB231-140四种稳转细胞系。首先使用qPCR进行验证，确定稳转miR-140的细胞系构建成功(图3A)。为了进一步探究miR-140对乳腺癌细胞增殖能力的影响，将两种稳定过表达miR-140的乳腺癌细胞系MCF-7-140和MB231-140与其相对应的阴性对照细胞进行细胞增殖能力的比较。发现过表达miR-140的两种细胞系增殖速率明显低于其相应的阴性对照细胞系(图3B)。将四种细胞计数后以每个孔1000个细胞均分到六孔板中，连续培养10天，克隆形成实验同样发现过表达miR-140后的细胞形成的克隆数量明显减少(图3C、D)。以上研究表明过表达miR-140降低了乳腺癌细胞的增殖速率。

2.4 miR-140对MCF-7的细胞迁移的影响

对MCF-7-NC与MCF-7-140细胞进行细胞划痕(图4A、B)和Transwell细胞侵袭实验(图4C、D)，实验结果表明，稳转miR-140的MCF-7细胞的迁移能力明显低于MCF-7-NC细胞。

2.5过表达miR-140对细胞周期的影响

前期实验证明了过表达miR-140抑制乳腺癌细胞的增殖速率。于是进一步检测miR-140对细胞周期的影响。Ki67在细胞增殖的过程中活跃表达，但在增殖停止的时候就表达沉默，所以可以作为细胞增殖状态的标志。乳腺癌细胞的Ki67荧光染色同样说明了过表达miR-140后，细胞的增殖受到了极为显著的抑制(图5A、B)。进一步通过流式细胞仪分析miR-140对细胞周期的影响。为了防止稳转的细胞系中所带的绿色荧光对流式细胞分析技术造成干扰，采用瞬时转染，在MCF-7和MB231细胞中瞬时转染miR-140。通过细胞流式技术检测了两种乳腺癌细胞在瞬时转染miR-140后细胞周期的变化情况。如(图5C、E)经典的细胞流式直方图模拟出细胞周期各个时期的影像，(图5D、F)分别是MCF-7和MB231细胞中的细胞各个时期分布比例的统计结果

2.6过表达miR-140在裸鼠肿瘤模型中的作用

在上述的细胞体外实验中，已经发现过表达miR-140后，细胞的增殖和迁移变缓。所以进一步检测过表达miR-140在体内是否对肿瘤组织也有这样显著的抑制作用，使用裸鼠进行体外移植肿瘤实验来进行验证。首先给约为5周的裸鼠随机分组，分别注射MCF-7-140和MCF-7-NC、MB231-140和MB231-NC细胞约为2.5×10⁶个，采用皮下注入，待肿瘤长至约50mm³后，每隔三天记录裸鼠肿瘤的体积及体重变化，并密切关注小鼠的生存情况。图6A是裸鼠皮下肿瘤块体积的生长变化情况。待肿瘤块长到一定体积之后，将所有的小鼠处死并将肿瘤块取出拍照(图6B)并对肿瘤块称重进行统计分析(图6C)。这些结果表明，在小鼠体内也验证了miR-140可以抑制肿瘤细胞的增殖。图6D显示的是对小鼠皮下注射MCF-7-140及MCF-7-NC细胞形成的肿瘤进行组织切片进行的H&E、FEN1、Ki67、Cleaved-caspase3染色结果。如图所示，过表达miR-140的肿瘤组织中，FEN1明显减少、Ki67显著减少，而Cleaved-caspase3是明显增加的。这说明过表达miR-140在体内也可以抑制肿瘤细胞的生长，诱导更多的DNA损伤，并且会增加细胞凋亡率。

2.7细胞中过表达miR-140对不同化疗药物的敏感性分析

化疗是用可以杀死癌细胞的化学药物治疗癌症。由于癌细胞与正常细胞之间相比较最大的不同之处在于癌细胞进行快速的细胞分裂及增殖，所以化疗药物的作用原理通常是借助干扰细胞分裂的机制来抑制癌细胞的增殖，比如抑制DNA的复制或是阻止染色体分离。大多数的化疗药物都没有专一性，会在杀伤肿瘤细胞的同时杀死进行细胞分裂的正常组织细胞，因而常伤害需要进行分裂以维持正常功能的健康组织。所以提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，使用低剂量的化疗药物达到可以杀伤肿瘤的效果，可以降低化疗药物对正常组织细胞的伤害。为了进一步探究miR-140会不会影响乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性，用MCF-7-NC与MCF-7-140细胞中进行验证。在两种MCF-7细胞中分别用5FU、紫杉醇(Paclitaxel)、顺铂(Cisplatin)、喜树碱(Camptothecin)、阿霉素(ADR)处理，使用MTT进行检测两种细胞在不同药物及不同药物浓度处理下培养48h然后检测细胞的存活率。结果证明MCF-7中过表达miR-140可以增加细胞对阿霉素的敏感性(图7E)，而对其他药物的增敏效果不明显(图7A-D)。阿霉素是临床上广泛使用的一种抗肿瘤抗生素，其可抑制RNA和DNA的合成，对RNA的抑制作用最强，抗瘤谱较广泛，对多种肿瘤均有杀伤作用，属于周期非特异性的药物。阿霉素是治疗乳腺癌时常用的化疗药物。于是又在MB231细胞中进一步验证miR-140对阿霉素的增敏作用(图7F)，得到的结果与MCF-7细胞中的效果一致。

2.8过表达miR-140增加阿霉素导致的细胞凋亡

鉴于之前的研究，过表达miR-140后，细胞周期发生了阻滞，细胞的DNA损伤程度也显著增加，肿瘤细胞ADR处理更加敏感，于是猜测过表达miR-140的乳腺癌经过ADR处理后促进肿瘤细胞凋亡，从而使其对ADR更加敏感。于是通过细胞形态学分析，发现过表达miR-140的细胞加入ADR处理后明显比参照组细胞数量更少，细胞形态更差。在MCF-7-140和MCF-7-140中过表达FEN1后再加入ADR处理，乳腺癌细胞对ADR的抵抗能力明显改善，细胞状态有所好转(图8A)。进一步通过流式细胞仪检测细胞凋亡。之前使用的过表达miR-140的细胞系是病毒感染的稳转细胞系，带有绿色荧光，为了避免荧光的影响，通过瞬时转染过表达miR-140，以及同时过表达miR-140和FEN1后再用ADR处理24h。将待测细胞，用AnnexinV-FITC和PI对细胞进行双染，接着使用流式细胞仪检测细胞凋亡的情况，发现过表达miR-140后加入ADR细胞的凋亡率显著高于NC组的细胞，在过表达miR-140的细胞中同时过表达FEN1，发现凋亡率有明显降低(图8B-E)

2.9 miR-140通过下调FEN1逆转耐药肿瘤的耐药性

为了进一步探究miR-140对MCF-7细胞ADR耐药性的影响。用miR-140的慢病毒感染MCF-7-ADR细胞，筛选得到MCF-7-ADR稳定过表达miR-140的细胞系即MCF-7-ADR-140细胞系(图9B)。此外，在ADR处理48h后，细胞形态学分析显示和细胞活力测定都表明miR-140可以逆转MCF-7-ADR细胞对阿霉素的药物抵抗而过表达FEN1则减弱了miR-140的这种作用(图9A、C)。

因此，miR-140的过表达显著抑制MCF-7细胞和MB231细胞的增殖，并且在裸鼠体内移植肿瘤也证明过表达miR-140的乳腺癌异种移植瘤的生长速度明显低于由对照组细胞产生的肿瘤。不仅如此免疫组化也表明了过表miR-140的乳腺癌异种移植瘤中的FEN1蛋白质含量受损。这些结果表明，miR-140通过抑制FEN1表达和诱导DNA损伤，至少可以部分抑制了肿瘤的发生与发展。

乳腺癌细胞对常规化疗产生的耐药性仍然是乳腺癌治疗过程中的一大障碍

本发明发现过表达miR-140使MCF-7对包括阿霉素在内的多种化疗药物更加敏感，其中过表达miR-140的MCF-7细胞对阿霉素最为敏感。miR-140在MCF-7和MB231细胞中促进阿霉素诱导的细胞凋亡，而过表达FEN1可逆转细胞凋亡。即FEN1的下调增强了化疗药物诱导的细胞凋亡，而过表达FEN1则抑制了部分化疗药物诱导的细胞凋亡。

此外，本研究证明miR-140可以克服乳腺癌细胞对阿霉素的耐药性，而这一特性被进一步过表达FEN1而减弱。过表达miR-140可降低阿霉素处理后MCF-7-ADR细胞中的DNA损伤修复能力。总的来说，研究数据清楚地表明，miR-140有助于提高乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性，并克服乳腺癌细胞的耐药性。

此外，本研究证明YY1与miR-140的启动子结合而正调控miR-140的表达，进一步抑制FEN1的表达。这一结果表明YY1可以通过直接与FEN1的启动子结合而抑制FEN1的表达，也可以上调miR-140的表达而间接抑制了FEN1的表达。本研究的实验证明与野生型MCF-7细胞相比，MCF-7-ADR细胞中的YY1是高表达的，而miR-140表达量是下调的。进一步的Chip实验表明，在MCF-7-ADR的细胞中YY1与miR-140启动子的结合效率下降，即YY1对miR-140的调控作用降低，使得miR-140在耐阿霉素的乳腺癌细胞中的表达降低。

综上所述，本研究证明了miR-140通过调控FEN1表达从而对乳腺癌细胞的DNA修复、基因组稳定性、药物敏感性和耐药性起一定调控作用。本发明的研究结果确定miR-140的功能与乳腺癌发生发展与治疗的相关性，这对乳腺癌化疗过程有一定的意义。因此，乳腺癌细胞内源性miR-140的激动剂开发使用是一种全新的思路。

序列表

<110> 南京师范大学

<120> miR-140在制备抑制乳腺癌增殖和迁移药物中的用途

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

cagugguuuu acccuauggu ag 22

<210> 2

<211> 1244

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 2

atggcctcgg gcgacaccct ctacatcgcc acggacggct cggagatgcc ggccgagatc 60

gtggagctgc acgagatcga ggtggagacc atcccggtgg agaccatcga gaccacagtg 120

gtgggcgagg aggaggagga ggacgacgac gacgaggacg gcggcggtgg cgaccacggc 180

ggcgggggcg gccacgggca cgccggccac caccaccacc accatcacca ccaccaccac 240

ccgcccatga tcgctctgca gccgctggtc accgacgacc cgacccaggt gcaccaccac 300

caggaggtga tcctggtgca gacgcgcgag gaggtggtgg gcggcgacga ctcggacggg 360

ctgcgcgccg aggacggctt cgaggatcag attctcatcc cggtgcccgc gccggccggc 420

ggcgacgacg actacattga acaaacgctg gtcaccgtgg cggcggccgg caagagcggg 480

gcggcggctc gtcgtcgtcg ggaggcggcc gcgtcaagaa gggcggcggc aagaagagcg 540

gcaagaagag ttacctcagc ggcggggccg gcgcggcggg cggcggcggc gccgacccgg 600

gcaacaagaa gtgggagcag aagcaggtgc agatcaagac cctggagggc gagttctcgg 660

tcaccatgtg gtcctcagat gaaaaaaaag atattgacca tgagacagtg gttgaagaac 720

agatcattgg agagaactca cctcctgatt attcagaata tatgacagga aagaaacttc 780

ctcctggagg aatacctggc attgacctct cagatcccaa acaactggca gaatttgcta 840

gaatgaagcc aagaaaaatt aaagaagatg atgctccaag aacaatagct tgccctcata 900

aaggctgcac aaagatgttc agggataact cggccatgag aaaacatctg cacacccacg 960

gtcccagagt ccacgtctgt gcagaatgtg gcaaagcttt tgttgagagt tcaaaactaa 1020

aacgacacca actggttcat actggagaga agccctttca gtgcacgttc gaaggctgtg 1080

ggaaacgctt ttcactggac ttcaatttgc gcacacatgt gcgaatccat accggagaca 1140

ggccctatgt gtgccccttc gatggttgta ataagaagtt tgctcagtca actaacctga 1200

aatctcacat cttaacacat gctaaggcca aaaacaacca gtga 1244

<210> 3

<211> 129

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 3

tgcctggcac ataataggca taaggttgcc aggaaataga aatacagata ctcaattcaa 60

tttgatcttc agataatcaa aaaatacttt ttttagtata aatatgtccc attctgtatt 120

tgggacata 129

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cggggtacca atgggaattc aaggcctggc 30

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgctctagat tattttcccc ttttaaactt cc 32

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gctaactagt gctcaggaaa atatgt 26

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gctaaagctt ctccctctct tctcc 25

<210> 8

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cattaaactg cctgagaaga tttttgagcc tgacatattt tcctgagcta aaacagg 57

<210> 9

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cctgttttag ctcaggaaaa tatgtcaggc tcaaaaatct tctcaggcag tttaatg 57

Claims

1.miR-140或含有miR-140的表达载体在制备抑制乳腺癌药物中的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于：所述药物为抑制乳腺癌增殖和迁移的药物。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于：所述miR-140序列如SEQ ID NO：1所示。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于：所述药物的制剂形式为液体制剂、颗粒制剂、片剂或胶丸。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于：所述药物还包括药学上可接受的载体。

6.如权利要求1所述的用途，其特征在于：所述miR-140的启动子与转录因子或抑制因子Ying Yang1结合，所述Ying Yang1序列如SEQ ID NO：2所示。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于：所述结合的位点为site4，site4序列如SEQID NO：3所示。

8.如权利要求1所述的用途，其特征在于：所述miR-140过表达。