CN115837079A - Igf2bp1高表达在食管癌检测和治疗中的应用 - Google Patents
Igf2bp1高表达在食管癌检测和治疗中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115837079A CN115837079A CN202111098953.2A CN202111098953A CN115837079A CN 115837079 A CN115837079 A CN 115837079A CN 202111098953 A CN202111098953 A CN 202111098953A CN 115837079 A CN115837079 A CN 115837079A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- igf2bp1
- igf2bp
- cells
- protein
- expression level
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 101000599778 Homo sapiens Insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 1 Proteins 0.000 title claims abstract description 108
- 102100037924 Insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 1 Human genes 0.000 title claims abstract description 108
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 91
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 title claims abstract description 22
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 title claims abstract description 22
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 61
- 108010019691 inhibin beta A subunit Proteins 0.000 claims abstract description 60
- 102100027004 Inhibin beta A chain Human genes 0.000 claims abstract description 55
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims abstract description 49
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 43
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 37
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 28
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 18
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 17
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 claims abstract description 13
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 12
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 5
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 claims description 66
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 46
- OZEADOPONHLEDS-UHFFFAOYSA-N 2-[(5-bromothiophen-2-yl)methylideneamino]benzamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CC=C1N=CC1=CC=C(Br)S1 OZEADOPONHLEDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 claims description 21
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 20
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 claims description 16
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims description 14
- 101000599782 Homo sapiens Insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 3 Proteins 0.000 claims description 9
- 101150047915 Igf2bp1 gene Proteins 0.000 claims description 9
- 102100037920 Insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 3 Human genes 0.000 claims description 9
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 claims description 9
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 claims description 9
- 102100037919 Insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 2 Human genes 0.000 claims description 8
- 101000599779 Homo sapiens Insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 2 Proteins 0.000 claims description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 208000010507 Adenocarcinoma of Lung Diseases 0.000 claims description 3
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims description 3
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 3
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 201000005249 lung adenocarcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 claims 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 claims 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 abstract description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 196
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 67
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 32
- 238000003197 gene knockdown Methods 0.000 description 28
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 28
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 27
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 27
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 26
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 26
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 23
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 22
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 20
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 description 19
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 16
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 14
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 13
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 13
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 13
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 12
- RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N actinomycin D Natural products CC1OC(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C2CCCN2C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)NC4C(=O)NC(C(N5CCCC5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)C(C(C)C)C(=O)OC4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 12
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 12
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 12
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 11
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 11
- 102100025751 Mothers against decapentaplegic homolog 2 Human genes 0.000 description 10
- 101710143123 Mothers against decapentaplegic homolog 2 Proteins 0.000 description 10
- 102000044126 RNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 10
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 10
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 10
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 10
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 10
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 10
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 10
- 102000000574 RNA-Induced Silencing Complex Human genes 0.000 description 9
- 108010016790 RNA-Induced Silencing Complex Proteins 0.000 description 9
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 9
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 9
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 9
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 9
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 8
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 7
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 7
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 7
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 7
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 description 6
- 206010027458 Metastases to lung Diseases 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N actinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 6
- 230000004709 cell invasion Effects 0.000 description 6
- 229960000640 dactinomycin Drugs 0.000 description 6
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 6
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 6
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 6
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 6
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101710159080 Aconitate hydratase A Proteins 0.000 description 5
- 101710159078 Aconitate hydratase B Proteins 0.000 description 5
- 102100024365 Arf-GAP domain and FG repeat-containing protein 1 Human genes 0.000 description 5
- 206010061534 Oesophageal squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 5
- 108700020471 RNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 5
- 101710105008 RNA-binding protein Proteins 0.000 description 5
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 5
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 5
- 208000036765 Squamous cell carcinoma of the esophagus Diseases 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 208000007276 esophageal squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 5
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 5
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 4
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 4
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 4
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 4
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 4
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 3
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101800005151 Cholecystokinin-8 Proteins 0.000 description 3
- 102400000888 Cholecystokinin-8 Human genes 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 3
- 101000988591 Homo sapiens Minor histocompatibility antigen H13 Proteins 0.000 description 3
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 3
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 3
- 108010087230 Sincalide Proteins 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 238000010609 cell counting kit-8 assay Methods 0.000 description 3
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 3
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 3
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 3
- RWVGQQGBQSJDQV-UHFFFAOYSA-M sodium;3-[[4-[(e)-[4-(4-ethoxyanilino)phenyl]-[4-[ethyl-[(3-sulfonatophenyl)methyl]azaniumylidene]-2-methylcyclohexa-2,5-dien-1-ylidene]methyl]-n-ethyl-3-methylanilino]methyl]benzenesulfonate Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C(=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C)C=2C(=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C)C=C1 RWVGQQGBQSJDQV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 3
- NVKAWKQGWWIWPM-ABEVXSGRSA-N 17-β-hydroxy-5-α-Androstan-3-one Chemical compound C1C(=O)CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CC[C@H]21 NVKAWKQGWWIWPM-ABEVXSGRSA-N 0.000 description 2
- NOIIUHRQUVNIDD-UHFFFAOYSA-N 3-[[oxo(pyridin-4-yl)methyl]hydrazo]-N-(phenylmethyl)propanamide Chemical compound C=1C=CC=CC=1CNC(=O)CCNNC(=O)C1=CC=NC=C1 NOIIUHRQUVNIDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 2
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 2
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 2
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 2
- 102000014429 Insulin-like growth factor Human genes 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 2
- 208000007433 Lymphatic Metastasis Diseases 0.000 description 2
- VQAYFKKCNSOZKM-IOSLPCCCSA-N N(6)-methyladenosine Chemical compound C1=NC=2C(NC)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O VQAYFKKCNSOZKM-IOSLPCCCSA-N 0.000 description 2
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102100023085 Serine/threonine-protein kinase mTOR Human genes 0.000 description 2
- 108010065917 TOR Serine-Threonine Kinases Proteins 0.000 description 2
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 2
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000010219 correlation analysis Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 2
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 230000007705 epithelial mesenchymal transition Effects 0.000 description 2
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 2
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 2
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 2
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 238000010827 pathological analysis Methods 0.000 description 2
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 2
- 238000006748 scratching Methods 0.000 description 2
- 230000002393 scratching effect Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 2
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004491 Antisense DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 1
- 239000011547 Bouin solution Substances 0.000 description 1
- 108091028690 C-myc mRNA Proteins 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 102100034235 ELAV-like protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 108010040476 FITC-annexin A5 Proteins 0.000 description 1
- 230000004668 G2/M phase Effects 0.000 description 1
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 1
- 101000925870 Homo sapiens ELAV-like protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001076292 Homo sapiens Insulin-like growth factor II Proteins 0.000 description 1
- 101000960626 Homo sapiens Mitochondrial inner membrane protease subunit 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000575639 Homo sapiens Ribonucleoside-diphosphate reductase subunit M2 Proteins 0.000 description 1
- 101000702394 Homo sapiens Signal peptide peptidase-like 2A Proteins 0.000 description 1
- 101000828788 Homo sapiens Signal peptide peptidase-like 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000960621 Homo sapiens U3 small nucleolar ribonucleoprotein protein IMP3 Proteins 0.000 description 1
- 101150002416 Igf2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102100025947 Insulin-like growth factor II Human genes 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- VQAYFKKCNSOZKM-UHFFFAOYSA-N NSC 29409 Natural products C1=NC=2C(NC)=NC=NC=2N1C1OC(CO)C(O)C1O VQAYFKKCNSOZKM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011794 NU/NU nude mouse Methods 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 238000001358 Pearson's chi-squared test Methods 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 108091036407 Polyadenylation Proteins 0.000 description 1
- 208000020584 Polyploidy Diseases 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 229940079156 Proteasome inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 102100026006 Ribonucleoside-diphosphate reductase subunit M2 Human genes 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241001116459 Sequoia Species 0.000 description 1
- 101710168942 Sphingosine-1-phosphate phosphatase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100030684 Sphingosine-1-phosphate phosphatase 1 Human genes 0.000 description 1
- 208000000102 Squamous Cell Carcinoma of Head and Neck Diseases 0.000 description 1
- 208000034254 Squamous cell carcinoma of the cervix uteri Diseases 0.000 description 1
- 238000012233 TRIzol extraction Methods 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 206010064390 Tumour invasion Diseases 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003816 antisense DNA Substances 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000009400 cancer invasion Effects 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 238000003783 cell cycle assay Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 201000006612 cervical squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000749 co-immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000012137 double-staining Methods 0.000 description 1
- 238000005553 drilling Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000010201 enrichment analysis Methods 0.000 description 1
- 230000029578 entry into host Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005081 epithelial layer Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005206 flow analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003517 fume Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000000459 head and neck squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000000887 hydrating effect Effects 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000010832 independent-sample T-test Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000002608 insulinlike Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 229940057995 liquid paraffin Drugs 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000005243 lung squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000012976 mRNA stabilization Effects 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 201000011591 microinvasive gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000010232 migration assay Methods 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000003207 proteasome inhibitor Substances 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 238000000730 protein immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000012340 reverse transcriptase PCR Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000004085 squamous epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 230000004960 subcellular localization Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 230000002477 vacuolizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及IGF2BP1高表达在食管癌检测和治疗中的应用。具体地，本发明涉及靶向IGF2BP的试剂在制备治疗癌症的药物中的用途，其中所述靶向IGF2BP的试剂是抑制和/或降低IGF2BP基因和/或蛋白的表达水平、或抑制IGF2BP与INHBA mRNA结合的试剂，优选地，所述IGF2BP为IGF2BP1。另一方面，本发明涉及用于检测来自受试者样品的IGF2BP表达水平的检测剂在制备用于诊断和/或预后食管癌的试剂中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及食管癌的诊断和治疗的领域。具体地，本发明涉及IGF2BP1高表 达在食管癌检测和治疗中的应用。
背景技术
食管鳞癌是威胁人类健康的主要恶性肿瘤之一，食管鳞癌分子靶向药物的研 究和应用远远落后于其它肿瘤，迄今尚无有效的靶向药推荐用于食管鳞癌的临床 治疗。因此，鉴定食管鳞癌中异常改变的分子，阐明其作用机制，对于食管鳞癌 标志物的鉴定及靶向抑制研究具有重要意义。
侵袭性生长和远端转移是恶性肿瘤共同的特征，也是导致晚期肿瘤死亡的主 要原因。侵袭转移是个多步骤的连续过程，涉及众多信号通路，其中与TGF-β信 号通路关系最密切，该通路的活化可以使细胞丧失极性、粘附降低，间质成分增 多，促进侵袭转移的核心步骤上皮-间充质转化(Epithelial-Mesenchymal transition， EMT)。激活该通路的配体是个超家族，具有组织特异性，配体与受体结合后， 最终活化下游Smad2/3磷酸化入核，促进靶基因转录。肿瘤侵袭转移与患者的预 后密切相关，因此鉴定影响食管鳞癌细胞侵袭迁移的分子并阐明其作用机制，是 食管鳞癌研究的一个关键方面。
胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白(Insulin-like growth factor-2 mRNA-binding protein,IGF2BP)是高度保守的RNA结合蛋白，其家族成员包括 IGF2BP1、IGF2BP2和IGF2BP3三个成员。这三个基因的氨基酸序列同源性高达 56％，尤其是IGF2BP1和IGF2BP3的序列同源性达到73％。IGF2BP蛋白包含了6 个功能结构域：从N端至C端分别有2个RNA识别模体(RRM)和4个 hnRNP-Khomology(KH)结构域。
IGF2BP蛋白的功能是结合RNA，体外研究发现KH结构域是介导RNA结合 的主要结构域，而RRM模体主要以靶RNA依赖的方式稳定IGF2BP-RNA复合物。 结构分析发现KH3/4结构域可以形成反向平行的假二聚体构象，以便于它们各自 与RNA结合。IGF2BP是N6-,甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)结合蛋白， 以m6A依赖的方式结合靶RNA，其KH3-4双结构域对于识别RNA分子上GG (m6A)C序列不可或缺。如IGF2BP1可以以m6A依赖的方式结合至少3000个转录 本。IGF2BP1还可以招募其他分子如ELAV-样RNA结合蛋白1(ELAVL1)，以稳 定其结合的RNA分子。
IGF2BP主要定位于细胞质，与mRNA结合形成核糖核蛋白颗粒-RNA复合物 (mRNA-ribonucleoprotein,mRNP)聚集于核周边。IGF2BPs和其他RNA结合蛋 白(RNA-bindingproteins,RBPs)一样，以RNA依赖的方式与其他RBP相互作用， 但与其他RBP主要稳定胞质mRNA不同是，IGF2BPs更倾向于结合新和成的RNA。 IGF2BP1在压力条件下招募其他RBP形成应激性颗粒，以稳定其结合的RNA。 IGF2BPs对靶mRNA的调控是个动态的可逆过程，该过程受到磷酸化调节。 IGF2BP1-3均是mTOR的底物，在小鼠中mTOR介导的磷酸化是IGF2BP1-3主要 的磷酸化位点，这三个蛋白的磷酸化位点均位于RRM2和KH1之间的连接区域[单 位点IMP1(Ser181)、IMP3(Ser183)或者IMP2双位点(Ser162/Ser164)]。这些研究 表明，IGF2BP的翻译后修饰调控了其对mRNA的调控，结果使得mRNA从mRNP 解离，进而被降解或者促进翻译。
发明内容
本发明人意想不到地发现，IGF2BP1-3在食管鳞癌中的表达显著上调；体外实 验表明，敲降IGF2BP1显著抑制了细胞的侵袭和迁移；体内实验结果显示，敲降 IGF2BP1可以明显降低食管癌细胞的肺转移瘤形成能力。
在分子水平，IGF2BP1正向调控TGF-β-Smad通路。利用RIP-seq结合实时PCR 验证对IGF2BP1的下游靶mRNA分子进行筛选，发现TGF-β-Smad通路的INHBA 在3个稳定敲降IGF2BP1细胞系中均下调，采用RIP-PCR和RNA-pull down正反 向均验证了IGF2BP1与INHBAmRNA的相互作用。蛋白水平检测显示敲降 IGF2BP1后INHBA蛋白下调。利用放线菌素D抑制转录，测定IGF2BP1敲降后 INHBA的mRNA降解的半衰期，发现敲降组INHBA mRNA半衰期显著缩短，证 明IGF2BP1结合INHBA mRNA后增强了其稳定性。而且，敲降INHBA后显著抑 制食管鳞癌细胞侵袭和迁移，而在敲降IGF2BP1的细胞中过表达INHBA则可回 复侵袭受抑制的表型。以上结果表明，IGF2BP1通过结合并稳定INHBA mRNA， 活化INHBA-Smad2/3通路，促进食管癌细胞侵袭迁移。
为了探索IGF2BP1高表达作为食管鳞癌治疗靶点的可能性，我们检测了 IGF2BP1的小分子抑制剂BTYNB对食管鳞癌细胞的抑制效果，发现BTYNB同时 抑制了IGF2BP1高表达和低表达细胞系的增殖和集落形成，流式分析显示， BTYNB可以促进细胞凋亡、细胞周期G2/M期阻滞和异倍体的形成。
基于上述结果，在第一方面，本发明提供了靶向IGF2BP1的试剂在制备治疗 癌症的药物中的用途，其中所述靶向IGF2BP1的试剂是抑制和/或降低IGF2BP1 基因和/或蛋白的表达水平、或抑制IGF2BP1与INHBA mRNA结合的试剂。
在一个实施方案中，本发明提供了靶向IGF2BP1的试剂在制备治疗癌症的药 物中的用途，其中所述靶向IGF2BP1的试剂是抑制和/或降低IGF2BP1基因和/或 蛋白的表达水平、或抑制IGF2BP1与INHBA mRNA结合的试剂；其中所述癌症 为与INHBA表达相关的癌症，优选地，所述癌症选自食管癌、乳腺癌、结直肠癌、 宫颈鳞癌、肺鳞癌、头颈鳞癌、肺腺癌、胃癌。
在本发明优选的实施方案中，抑制和/或降低IGF2BP1基因表达水平的试剂是 核酸。
在本发明的另一方面，抑制和/或降低IGF2BP1基因表达水平的试剂选自与IGF2BP基因序列互补的反义核酸分子，优选为IGF2BP1基因反向互补的单链RNA 分子，其可特异性结合和抑制内源性IGF2BP1基因。
在本发明优选的实施方案中，抑制和/或降低IGF2BP1蛋白表达水平是通过用 干扰RNA敲降IGF2BP1蛋白的表达水平。当在体内引入时，干扰RNA与其他蛋 白质形成RNA诱导沉默复合物(“RISC”)并启动称为RNA干扰(RNAi)的过程。 在RNAi过程中，RISC合并单链干扰RNA或双链干扰RNA的一条链。并入的链 充当RISC识别互补的mRNA转录物的模板。一旦确定互补mRNA，RISC中的蛋 白质组分激活并切割mRNA，导致靶基因表达的敲降。用于敲降靶基因表达的干 扰RNA分子的非限制性实例包括siRNA、短发夹RNA(shRNA)、单链干扰RNA 和微RNA(miRNA)。使用这些干扰RNA的方法是本领域技术人员公知的。
在本发明优选的实施方案中，敲降IGF2BP蛋白表达水平的干扰RNA选自 siRNA、shRNA、单链干扰RNA和微RNA。
在本发明优选的实施方案中，其中制IGF2BP与INHBA mRNA结合的试剂为 BTYNB。
在本发明的另一方面，提供了用于检测来自受试者样品的IGF2BP表达水平的 检测剂在制备用于诊断和/或预后食管癌的试剂中的用途，优选地，所述IGF2BP 选自IGF2BP1、IGF2BP2和IGF2BP3。
在优选的实施方案中，所述的IGF2BP表达水平为IGF2BP基因表达水平，和 /或IGF2BP蛋白表达水平；优选地，所述IGF2BP基因表达水平为IGF2BP mRNA 的水平。
在本发明优选的实施方案中，检测IGF2BP基因表达水平的检测剂包括但不限 于特异性结合IGF2BP基因的引物和/或探针。
可以使用本领域技术人员公知的任何方法检测IGF2BP基因的表达水平，这样 的方法包括但不限于：Northern Blot、聚合酶链式反应、逆转录酶PCR、定量实时 PCR、纳米阵列、微阵列、放射自显影或原位杂交。
尤其是，可以用实时定量RT-PCR(qRT-PCR)。在一些实施方案中，qRT-PCR 可以被用于对IGF2BP mRNA进行检测和定量。qRT-PCR是本领域技术人员熟知 的且容易获得的技术，且不需要详细的说明。例如可以使用商品化可获得的基于 qRT-PCR的方法(如
阵列)，基于本领域公知的IGF2BP的序列，很容易 设计引物和/或探针。
在本发明优选的实施方案中，检测IGF2BP蛋白表达水平的检测剂包括但不限 于特异性结合IGF2BP蛋白的抗体。
可以使用本领域技术人员公知的任何方法检测IGF2BP蛋白的表达水平，这样 的方法包括但不限于：Western Blot、免疫印迹、ELISA、质谱法。
在本发明的一个实施方案中，所述的样品为肿瘤样品。
术语
除非本文有具体说明，否则本文中使用的术语具有本领域普通技术人员通常 理解的含义。
如本文中所述，IGF2BP是指胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白(Insulin-likegrowth factor-2mRNA-binding protein)，其是高度保守的RNA结合蛋白，其家族 成员包括IGF2BP1、IGF2BP2和IGF2BP3三个成员。这三个基因的氨基酸序列同 源性高达56％，尤其是IGF2BP1和IGF2BP3的序列同源性达到73％。
如本文所述的“INHBA”，也称为抑制素βA，是转化生长因子-β(TGF-β)超 家族的一员，能以内分泌的方式负调控垂体前叶卵泡刺激素的合成和分泌。已报 到其与多种癌症相关，包括但不限于，CN112301133A报道了其与乳癌患者的预后 相关；CN112442535A报道了其与肺腺癌分子分型和/或评估其生存风险相关； CN110295230A公开了INHBA和SPP1作为早期胃癌诊断标记物的用途。 CN110269864A公开了其在抗结直肠癌中的用途。
如本文所述的“样品”，可以为源自食管癌患者的任何生物样品，其中包含核 酸和/蛋白质。这种样品的实例包含液体(包含血液、血浆、血清、尿液、精液)、 组织、细胞样品、器官、活检样品、肿瘤样品等。优选地，样品为组织、细胞的 活检样品，更优选地，样品为活检的食管癌组织样品。样品可以根据常规的技术 进行收集，并直接用于诊断或贮存。肿瘤样品可以是新鲜的、冷冻的或者石蜡包 埋的。通常地，可用的肿瘤样品是冷冻的或者石蜡包埋的，大多数时候是石蜡包 埋的。
如本文所述的“参考样品”，可以为源自对照的样品，所述对照为健康受试者 或者可以为已知具有或不具有淋巴结转移的食管癌患者，所述参考样品包括但不 限于，包含液体(包含血液、血浆、血清、尿液、精液)、组织、细胞样品、器官、 活检样品、肿瘤样品等。优选地，样品为组织、细胞的活检样品，更优选地，样 品为活检的食管癌组织样品。优选地，参考样品池包含源自至少一名(优选地为 数名，更优选地为至少5名，更优选地至少6名，至少7名，至少8名，至少9 名，至少10名)对照的样品。
本文中所用的术语“引物”指的是与模板杂交并用于引发与目标互补的多核 苷酸的聚合的短多核苷酸，通常具有游离的3’OH基团。
本文中所用的术语“探针”指的是在基于杂交的试验中，用于检测与探针互 补的多核苷酸序列的短多核苷酸，探针可以由在此限定的多核苷酸的“片段”组 成。
本文中的术语“抗体”按最广义使用，指包含两个重链和两个轻链的任何免 疫球蛋白(Ig)分子，以及其任何片段、突变体、变体或衍生物，只要该片段、突变 体、变体或衍生物表现出所需要的生物学活性(例如，表位结合活性)。
如本文所用，“抑制”和/或“降低”IGF2BP的表达水平，指与施用所述“抑 制”和/或“降低”试剂之前的参考水平相比，IGF2BP表达水平降低至少10％， 例如降低至少约10％，或至少约20％，或至少约30％，或至少约40％，或至少约 50％，或至少约60％，或至少约70％，或至少约80％，或至少约90％或多至且包 括100％的降低(即与参考样品相比不存在的水平)，或与参考水平相比在10-100％ 之间的任何降低；优选地，所述参考水平，可以指施用本发明的试剂治疗前的水 平。
术语“治疗”或“处理”包括在受试者如人中治疗本文所述的疾病或病症， 并且包括：(i)抑制疾病或病症，即阻止其发生；(ii)缓解疾病或病症，即引起病症 消退；(iii)减缓疾病的进展；和/或(iv)抑制、缓解或减缓疾病或病症的一种或多种 症状的进展。
如本文所用，术语“敲降”是指与不包含减少表达的遗传修饰的对应对照细 胞中靶mRNA或相应蛋白质的表达相比，遗传修饰细胞中靶mRNA或相应蛋白质 表达的可测量的降低。本领域技术人员将容易理解如何使用各种遗传方法，例如 siRNA、shRNA、miRNA、反义RNA或其他RNA介导的抑制技术，以基于本文 所述细节敲降靶多核苷酸序列或其部分。
术语“干扰RNA”是指RNA核酸分子，其是双链或单链的，并且能够实现 针对敲降靶基因表达的RNA干扰机制的诱导。
如本文所用的术语，“siRNA”是双链RNA，其长度通常小于30个核苷酸。 通过siRNA的基因沉默开始于siRNA的一条链并入称为RNA诱导沉默复合物 (RISC)的核糖核蛋白复合物中。并入RISC中的链识别与并入的siRNA链至少部分 互补的mRNA分子，且然后RISC切割这些靶mRNA或抑制其翻译。
术语“miRNA”是小的非编码RNA分子，其可以与mRNA分子内的互补序 列杂交，从而导致mRNA的切割，或通过缩短其聚(A)尾巴使mRNA不稳定。
术语“单链干扰RNA”可以与双链siRNA类似的方式实现mRNA沉默，尽 管效率低于双链siRNA。单链干扰RNA通常具有约19至约49个核苷酸的长度。
术语“短发夹RNA或小发夹RNA(shRNA)”是具有紧密发夹转角的人工RNA 分子，其可用于通过其在细胞中产生的siRNA沉默靶基因表达。shRNA在细胞中 的表达通常通过质粒载体或通过病毒或细菌载体实现。合适的载体包括但不限于 腺相关病毒(AAV)、腺病毒和慢病毒。shRNA是siRNA的有利介质，因为它具有 相对低的降解和转换率。
术语“拮抗剂抗体”在最广泛的意义上使用，并且包括抑制或降低该抗体所 结合的抗原(例如，IGF2BP)的生物活性的抗体。因此，IGF2BP拮抗剂抗体涵盖结 合IGF2BP并且以任何有意义的程度(包括显著地)阻断、抑制、抵消、拮抗、降低 IGF2BP激动剂活性的抗体。
术语“患者”、“受试者”、“个体”等在本文中可互换使用，并且无论是 体外还是原位，是指可适用于本文所述的方法的任何动物或其细胞。在某些非限 制性实施方案中，患者、受试者或个体是人。
术语“治疗”或“处理”包括在受试者如人中治疗本文所述的疾病或病症， 并且包括：(i)抑制疾病或病症，即阻止其发生；(ii)缓解疾病或病症，即引起病症 消退；(iii)减缓疾病的进展；和/或(iv)抑制、缓解或减缓疾病或病症的一种或多种 症状的进展。
术语“施用”或“给予”治疗剂如降低IGF2BP表达的试剂包括引入或递送治 疗剂以执行预期功能的任何途径。可以通过适合于递送药剂的任何途径进行施用。 因此，递送途径可包括静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下递送。在一些实施方案中 降低IGF2BP表达的试剂直接施用于肿瘤，例如，通过注射到肿瘤中。
以下将结合附图以及具体实施例进一步说明本发明的实施方案，但是，不应 理解为将本发明的范围限于这些具体实施例。
附图说明
图1.IGF2BP1-3蛋白在食管鳞癌组织及癌旁正常鳞状上皮的表达情况；
图2.组织芯片连续切片中IGF2BP1-3蛋白在食管鳞癌组织及癌旁正常鳞状 上皮的表达情况；
图3.TCGA RNA-seq数据库食管鳞癌中IGF2BP1-3 mRNA表达情况；显示 11例正常食管上皮组织和81例食管鳞癌组织中IGF2BP1-3 mRNA的表达情况。 “**”代表P<0.01；“****”代表P<0.0001。
图4.敲降IGF2BP1可显著抑制食管鳞癌细胞的侵袭和迁移；其中，图4的A 显示瞬时敲降IGF2BP1后的生长曲线图。转染siRNA 24小时后，消化细胞，各实 验组按每孔1000个细胞接种于6个96孔板中，待细胞贴壁后每24小时加CCK-8 测定OD450值，绘制生长曲线图；图4的B和C显示Transwell侵袭和迁移实验。 分别接种KYSE30和TE1细胞各1×105个于Transwell上室中，下室加30％FBS 的RPMI-1640，24至36小时收集上室，固定染色后扫描拍照计数。“***”代表P <0.001；“**”代表P<0.01；图4的D显示划痕实验。瞬时转染siRNA 48至72 小时后，待细胞汇合度为100％时，用10μM枪头划线造成划痕，分别在0、24、 48小时拍照，直至有划痕完全愈合。上述实验siRNA终浓度均为100nM。
图5.敲降IGF2BP1后显著抑制KYSE30细胞在BALB/c-nu鼠的肺转移；其 中图5的A为尾静脉注射稳定敲降细胞后形成的肺转移瘤和肺组织HE切片代表 图。将稳定敲降对照序列和IGF2BP1的细胞系KYSE30按1×106个注射入小鼠的 尾静脉中，每组10只小鼠，饲养6周后，处死小鼠取肺组织，经Bouin氏固定液 固定后，计数肺转移瘤数目。图5的B为两组小鼠肺转移瘤数目统计结果。“***” 代表差别有统计学意义，P<0.001。
图6.敲降IGF2BP1下调INHBA和Smad2/3蛋白水平；瞬时转染IGF2BP1 siRNA(终浓度100nM)48小时后，进行Western blot实验。
图7.敲降INHBA抑制食管鳞癌细胞侵袭和迁移；图7的A和图7的B显示 瞬时敲降INHBA Transwell实验。在食管鳞癌细胞系KYSE30和TE1中瞬时敲降 INHBA(siRNA终浓度为100nM)48小时后，消化细胞，取1×105个细胞接种于 Transwell上室中，下室加入含30％血清的RPMI 1640培养基，24至36小时取上 室固定、染色后，拍照计数。“***”代表P<0.001。
图8.过表达INHBA可以回复IGF2BP1敲降后侵袭减弱的表型；图8的A和 图8的B显示稳定敲降IGF2BP1的细胞中INHBA Transwell回复实验。将稳定敲 降IGF2BP1和对照NS的细胞系接种于12孔板中，待贴壁后，分别转染1μg pcDNA3.1或pcDNA3.1-INHBA质粒24小时后，消化细胞，按1×105个细胞接种 于Transwell上室中，下室加入含30％血清的RPMI1640培养基，24至36小时取 上室固定、染色后，拍照计数。“***”代表P<0.001。
图9.INHBA正向调控Smad2/3蛋白表达；图9的A表示瞬时敲降INHBA后 Smad2/3蛋白表达检测；图9的B显示在稳定敲降IGF2BP1的细胞中回复INHBA 后Smad2/3蛋白表达水平。
图10.食管癌和其它鳞癌中INHBA mRNA水平与预后的关系；TCGA转录组 测序(RNA-seq)数据库中，INHBA mRNA表达与预后的关系。图10的A：宫颈 鳞癌预后；图10的B：头颈鳞癌预后；图10的C：肺鳞癌预后；图10的D：食 管癌预后(未区分鳞癌和腺癌)。此图为Kaplan-Meier Plotter网站在线分析生成。
图11.IGF2BP1的小分子抑制剂BTYNB抑制食管鳞癌细胞侵袭和迁移；图 11的A和图11的B显示加BTYNB和溶剂对照处理后Transwell实验。消化对数 生长期食管鳞癌细胞，分别接种KYSE30和TE1细胞各1×105个于Transwell上室 中，下室加30％FBS的1640，并在下室中加入BTYNB或DMSO(终浓度为20μM)， 24至36小时收集上室，固定染色后扫描拍照计数。图11的C显示Western blot 检测分子改变。接种KYSE30和TE1细胞于12孔板中，密度为50％，待细胞贴壁 后，加BTYNB或DMSO(终浓度为20μM)，48小时后消化收集细胞，进行Western Blot检测。
图12.IGF2BP1的小分子抑制剂BTYNB抑制食管鳞癌细胞集落形成；
消化食管鳞癌细胞，按每孔3000个细胞接种于6孔板中，待细胞贴壁后加入 DMSO(溶剂对照)不同浓度的BTYNB，每个浓度组设3个复孔，Parental为未 加药物及溶剂组，10～14天后形成肉眼可见的集落时，固定、结晶紫染色，晾干后 拍照计数。“***”代表P<0.001；“*”代表P<0.05。
图13.IGF2BP1的小分子抑制剂BTYNB抑制食管鳞癌细胞增殖；
消化食管鳞癌细胞，按每孔3000个细胞接种于96孔板中，待细胞贴壁后加 入DMSO(溶剂对照)不同浓度的BTYNB，每个浓度组设3个复孔，Parental为 未加药物及溶剂组，72小时弃培养基加CCK-8，酶标仪测定OD450值。KYSE30、 TE1、Eca109为IGF2BP1高表达细胞系；KYSE70、KYSE150、TE10为IGF2BP1 低表达细胞系。“***”代表差别有统计学意义，P<0.001。
图14.IGF2BP1的小分子抑制剂BTYNB促进食管鳞癌细胞凋亡和多核形成；
消化食管鳞癌细胞，按30％密度接种于6孔板中，待细胞贴壁后加入DMSO (溶剂对照)和BTYNB(10μM)，每组设3个复孔，Parental为未加药物及溶剂 组，48小时分别收集细胞，进行预处理。图14的A为细胞凋亡检测，用Annexin V-FITC和PI双染后流式上机检测凋亡；图14的B为细胞周期检测，细胞经固定 后，PI染色上机检测细胞周期。
具体实施方式
以下结合实施例用于进一步描述，但这些实施例并非限制的范围。
实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照原料或商 品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
实施例1 RNA结合蛋白IGF2BP1-3在食管鳞癌中显著上调
本研究所使用的311例食管鳞癌组织和癌旁正常组织均经过病理学诊断标准， 为临床诊断后的手术残余组织，常规使用福尔马林固定并用石蜡包埋。患者术前 未接受过放疗和化疗，并已签署知情同意书。
本发明人利用组织芯片免疫组织化学检测了RNA结合蛋白IGF2BP1、 IGF2BP2和IGF2BP3在食管鳞癌组织和癌旁正常鳞状上皮的表达。简言之，显微 镜下观察组织整体的HE切片，选择肿瘤组织中3至5个癌巢清晰的位置，正常的 组织中选择2至3个含有正常鳞状上皮的位置，并用记号笔做好标记。根据需求 设计阵点排布，进行切片，并利用获自Abcam公司的IGF2BP1抗体(ab184305)、 Abcam公司的IGF2BP2抗体(ab124930)、Abcam公司的IGF2BP3抗体(ab179807)、 以及获自中杉金桥公司的二抗PV-9000(ZSGB-BIO)进行免疫组织化学实验。
我们的结果表明，癌旁正常鳞状上皮细胞中，此家族的3个分子除IGF2BP2 在间质有表达外，在食管上皮细胞层均无信号，而在肿瘤组织中表达均显著上调 (细胞浆中表达)(参见图1)，连续切片免疫组化结果显示，IGF2BP1-3表达有 一致的趋势(参见图2)。
进一步地，我们利用TCGA数据库的转录组测序数据分析了食管鳞癌及正常 食管上皮组织中IGF2BP1-3 mRNA的表达差异，发现在食管鳞癌中IGF2BP1-3 mRNA表达水平均高于正常组织(图3)，提示食管鳞癌中IGF2BP1-3蛋白表达 上调是由转录水平增高所致。
进一步地，我们通过组织芯片免疫组织化学检测了311例食管鳞癌组织和9 例癌旁正常食管上皮组织中IGF2BP1的表达，结果显示，IGF2BP1在正常组织中 不表达，在食管鳞癌组织中显著上调(表1)。
表1.IGF2BP1在正常食管上皮和食管鳞癌组织中存在差异表达
我们进一步对IGF2BP1蛋白表达水平与食管鳞癌患者的临床病理特征参数之 间的相关性进行了统计分析，结果如表2。IGF2BP1蛋白表达水平与肿瘤浸润深度 相关(P<0.05)，T3-4期肿瘤中IGF2BP1表达(53.7％)高于T1-2期(39.3％)； 而与年龄、性别、分化程度、淋巴结转移、病理分期没有显著相关性。
表2.食管鳞癌组织中IGF2BP1蛋白表达与临床病理特征的相关性分析
实施例2 IGF2BP1在体外促进食管鳞癌细胞的侵袭和迁移
我们选取增殖和侵袭能力较强的细胞系KYSE30和侵袭能力较强的TE1进行 了增殖和侵袭迁移能力的表型检测。食管鳞癌细胞系KYSE30、KYSE70、KYSE150、 KYSE180、KYSE450和KYSE510由日本京都大学Shimada教授惠赠，TE1、TE4、 TE10购自于ATCC，ECa109购自于中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心， 以上细胞系均经过STR遗传学验证；293FT细胞由本实验室保存。
食管鳞癌细胞系使用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基培养；293FT细胞 用含10％胎牛血清的D-MEM高糖培养基培养(含0.1mM的非必须氨基酸、2mM 谷氨酰胺、500μg/mLG418)。以上细胞均置于37℃含5％CO2的孵箱中培养。
结果显示，采用siRNA干扰瞬时敲降IGF2BP1后，敲降组相较于对照组7天 之内的生长曲线并无显著差异(图4的A)；而其侵袭(图4的B和图4的C) 和迁移(图4的D)却受到了显著的抑制。这些实验结果表明，IGF2BP1体外不 影响食管鳞癌细胞KYSE30和TE1的增殖，但促进它们侵袭和迁移。
实施例3 IGF2BP1促进食管鳞癌细胞在裸鼠体内的肺转移
我们利用慢病毒构建了稳定敲降IGF2BP1和对照干扰序列的KYSE30细胞系， 经Western Blot验证敲降效果和Transwell侵袭实验后(结果未出示)，经尾静脉 注射入裸鼠体内，6周后观察肺转移瘤形成情况。发现shIGF2BP1和对照shNS组 小鼠均形成了肉眼可见的肺转移瘤(两组各有两只小鼠肺部未形成肉眼可见的转 移灶)，shIGF2BP1组肺转移瘤数目显著减少(图5)。结果表明敲降IGF2BP1 可以抑制KYSE30细胞在裸鼠体内形成肺转移瘤。
实施例4 IGF2BP1通过INHBA-Smad通路促进食管鳞癌细胞的侵袭和迁移
根据文献报道，IGF2BP1为RNA结合蛋白，但其在食管鳞癌中的功能和直接 下游靶分子均无报道。因此，为了寻找其在食管癌中结合的靶RNA分子，进而阐 明其促进侵袭和迁移的分子机制，我们利用RIP(RNA结合蛋白免疫沉淀)联合 高通量二代测序技术，鉴定IGF2BP1结合的RNA分子，通过对IP和Input样品 做差异分析，从差异倍数和显著水平两方面进行评估，以logFC的绝对值>1且 FDR<0.01作为标准，选取IP相对于Input上调的基因为蛋白结合基因，筛选出8091 个基因。
4.1 IGF2BP1可以结合INHBA mRNA并增强其稳定性
我们挑取与侵袭迁移相关的分子进一步验证。通过RIP-PCR实验验证了测序 的结果，在KYSE30和TE1细胞中，用IGF2BP1的特异性抗体做RNA蛋白免疫 共沉淀，PCR可以检测出INHBA mRNA的表达。此外，为了验证结合的真实性， 我们做了RNA pull-down实验，用生物素标记的INHBA DNA探针(与mRNA互 补)结合INHBA mRNA，再用链霉亲和素磁珠捕获DNA-RNA-蛋白复合物，Western blot在KYSE30和TE1中均检测到了IP复合物中的IGF2BP1蛋白，说明IGF2BP1 确实可以与INHBA的mRNA结合。而在KYSE30、TE1(有侵袭迁移表型)以及KYSE450细胞中(IGF2BP1高表达)中，稳定敲降IGF2BP1均可显著抑制INHBA mRNA的表达(结果未示出)。
另一方面，我们在稳定敲降IGF2BP1的KYSE30和TE1细胞系中加入转录抑 制剂放线菌素D(ActD)，每间隔2小时收集细胞，最后将各组细胞裂解提取RNA 逆转录后，荧光定量PCR检测敲降组和对照组中各时刻的INHBA相对表达量， 并拟合出RNA表达量随时间的变化曲线，计算出敲降组和对照组中INHBA mRNA 的半衰期。结果显示，与对照组相比，敲降IGF2BP1组细胞中INHBA mRNA半 衰期显著缩短(结果未示出)，说明敲降IGF2BP1后，INHBAmRNA降解加快， 稳定性显著降低。
随后，我们在KYSE30和TE1细胞中瞬时敲降IGF2BP1，观察到INHBA蛋 白表达下调。鉴于INHBA的蛋白编码产物属于TGF-β超家族成员，我们检测了 TGF-β-Smad2/3通路的下游分子Smad2/3，发现Smad2/3确实也发生了下调(图6)。
以上结果表明，IGF2BP1可以与INHBA mRNA结合，并促进其mRNA稳定， 从而使INHBA蛋白翻译增加，进而上调TGF-β-Smad2/3通路。
4.2过表达INHBA可以回复IGF2BP1敲降后侵袭减弱的表型
INHBA，也称为抑制素βA，是转化生长因子-β(TGF-β)超家族的一员，能以 内分泌的方式负调控垂体前叶卵泡刺激素的合成和分泌。前面我们证实了INHBA 是IGF2BP1的直接下游分子，且其上调TGF-β-Smad2/3通路活性，而此通路和侵 袭运动密切相关。据此我们用Transwell实验在食管鳞癌细胞KYSE30和TE1中检 测了INHBA对侵袭运动的影响，结果显示，瞬时敲降INHBA后，细胞侵袭和迁 移受到抑制(图7)；而在稳定敲降IGF2BP1的细胞中瞬时过表达INHBA，可以 部分回复侵袭运动受到抑制的表型(图8)；Western blot检测敲降INHBA后 Smad2/3下调(图9的A)，过表达INHBA可回复Smad2(图9的B)。
上述结果表明，IGF2BP1通过INHBA上调TGF-β-Smad2/3通路活性，从而促 进食管鳞癌细胞的侵袭和迁移。
4.3 INHBA在食管癌和其它鳞癌中上调且与预后相关
我们对TCGA数据库中81例食管鳞癌组织和11例癌旁正常组织的转录组测序 数据分析后，发现其在肿瘤中表达升高，在癌旁正常组织中几乎不表达；组织芯 片RNA原位杂交的结果也证实了RNA-seq的结果，同时我们也得到了更加详细的 原位信息：INHBA在食管鳞癌组织的间质和癌巢边缘表达，而在癌旁正常上皮层 和间质均为阴性(结果未显示)。
此外，我们利用在线生存分析网站Kaplan-Meier Plotter，分析了TCGA数据库 中宫颈鳞癌、肺鳞癌、头颈鳞癌和食管癌的RNA-seq数据，结果显示INHBA mRNA 表达量均与预后相关：高表达预后差，总生存时间短(图10)。
实施例5 IGF2BP1的小分子抑制剂BTYNB抑制食管鳞癌细胞侵袭、迁移 和增殖
我们将食管鳞癌细胞KYSE30和TE1接种于Transwell上室，在下室中加入 IGF2BP1的小分子抑制剂BTYNB进行侵袭和迁移实验，发现BTYNB处理后细胞 的侵袭和迁移能力受到显著抑制(图11的A和图11的B)。Western blot结果显 示，BTYNB处理后IGF2BP1下游分子INHBA和Smad2/3下调(图11的C)。
BTYNB购自Cayman公司，货号为25623，其是IMP1与c-Myc mRNA结合的 抑制剂，可抑制IGF2BP1/IMP1。
我们用IGF2BP1的小分子抑制剂BTYNB设置不同的浓度梯度处理食管鳞癌细 胞KYSE30和TE1，进行集落形成实验，发现BTYNB处理后细胞的克隆形成受 到显著抑制(图12)，并且随着浓度的增加，形成的集落依次减少，终浓度为20 μM时，几乎无明显肉眼可见的克隆形成。
同时我们检测了BTYNB对IGF2BP1高表达细胞系(KYSE30、TE1、Eca109) 和低表达细胞系(KYSE70、KYSE150、TE10)增殖的影响，用DMSO、5μM和 10μM分别处理96孔板细胞，72小时后CCK-8测定OD450值，结果显示IGF2BP1 高表达组和低表达组细胞增殖均受到抑制，但高表达组更为明显，10μM组抑制率 均在50％以下(图13)。
我们用10μM的IGF2BP1的小分子抑制BTYNB处理KYSE30和TE1细胞48 小时，分别进行流式凋亡检测和细胞周期检测，发现BTYNB可促进凋亡发生，尤 其是早期凋亡(图14的A)；周期分析显示BTYNB处理组细胞各时期的DNA 含量均显著增加(图14的B)，光镜下观察加药后细胞形态异常，多核且核增大， 推测可能有异倍体和多倍体形成。
上述体外实验结果表明，IGF2BP1的小分子抑制剂BTYNB可以抑制食管鳞癌 细胞的增殖和克隆形成、并且促进凋亡和异倍体的形成。
结论：
我们的上述研究得出以下结论：
1)食管鳞癌中IGF2BP1-3蛋白表达显著升高；
2)高表达的IGF2BP1体外可以促进食管鳞癌细胞的侵袭、迁移以及伤痕愈合 能力，但不影响增殖和集落形成；敲降IGF2BP1可以抑制食管鳞癌细胞在裸鼠体 内的肺转移瘤形成能力；
3)IGF2BP1在食管鳞癌细胞中可以结合并稳定INHBA mRNA，从而促进其蛋 白表达，上调TGF-β-Smad2/3通路，增强食管鳞癌细胞侵袭和迁移的能力；
4)IGF2BP1的小分子抑制剂BTYNB体外可以抑制食管鳞癌细胞的增殖、集 落形成，促进凋亡和多核的形成。
实验材料与方法：
1)实验材料
临床组织标本
本研究所使用的311例食管鳞癌组织和癌旁正常组织均经过病理学诊断标准， 为临床诊断后的手术残余组织，常规使用福尔马林固定并用石蜡包埋。患者术前 未接受过放疗和化疗，并已签署知情同意书。
细胞系及培养条件
食管鳞癌细胞系KYSE30、KYSE70、KYSE150、KYSE180、KYSE450和 KYSE510由日本京都大学Shimada教授惠赠，TE1、TE4、TE10购自于ATCC， ECa109购自于中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心，以上细胞系均经过 STR遗传学验证；293FT细胞由本实验室保存。
食管鳞癌细胞系使用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基培养；293FT细胞用 含10％胎牛血清的D-MEM高糖培养基培养(含0.1mM的非必须氨基酸、2mM 谷氨酰胺、500μg/mLG418)。以上细胞均置于37℃含5％CO2的孵箱中培养。
实验动物及饲养条件
3周龄SPF级雌性BALB/c-nu/nu小鼠购自于北京华阜康生物科技股份有限公司。放置于温度242℃，相对湿度60％的超净生物层流架内饲养。
敲降序列
DNA探针
| 探针名称 | 序列 | SEQ ID NO |
| 正义-INHBA-1 | Biotin-GGCAGAAATGAATGAACTTAT | 13 |
| 反义-INHBA-1 | Biotin-ATAAGTTCATTCATTTCTGCC | 14 |
2)实验方法
细胞总RNA提取、逆转录、细胞DNA提取、以及过表达质粒构建采用本领 域公知的方法，并结合试剂盒的说明书进行。类似地，慢病毒载体构建、质粒提 取、实时荧光定量PCR也采用本领域公知的方法，并结合试剂盒的说明书进行。
体外细胞实验
(1)瞬时敲降(siRNA干扰)和过表达外(质粒DNA)
1)消化对数生长期细胞接种于12孔板中，使其贴壁后密度为30％至50％ (siRNA干扰)或70至90％(过表达质粒)。
2)配制转染体系：
siRNA:2.5μL lipofectamine 3000+100μL Opti-MEM
或过表达质粒:2μL lipofectamine 3000+2μL P3000+100μL Opti-MEM
5μL siRNA(20μM)/1μg质粒DNA+100μL Opti-MEM
室温孵育5分钟
3)将上述两份体系混匀，室温孵育15分钟。
4)换液：弃去原培养基，用1×PBS清洗1次，加入0.8mL无血清无抗生素 的RPMI1640培养基，将转染复合物滴加入培养板中，混匀，放入培养箱中培养。
5)6小时后更换为完全培养基，继续培养48小时后，胰酶消化收集细胞，进 行后续实验。
(2)构建稳定敲降细胞系
1)铺板：消化对数期293FT细胞接种于6孔板中，密度为50％。
2)转染包装质粒：待细胞贴壁形态展开后，配制转染体系：
孵育5分钟后，将两份溶液合并，混匀，孵育15分钟。
弃去培养基，PBS清洗细胞一次后(操作轻柔，以防细胞脱落)，加入不含 血清和抗生素的1.5mL DMEM培养基。将转染复合物小心缓慢滴加至培养板中。 6小时后换液，加入1.5mL含30％FBS的DMEM培养基。
3)收集病毒：24小时后收病毒上清，4℃保存，补加1.5mL含30％FBS的 DMEM培养基，48小时后再次收集上清，将两次上清合并，0.45μm滤膜过滤分 装后，-80℃保存。
4)感染细胞：感染前一天接种至12孔板中，密度为50％，待细胞贴壁后， 换液，加入0.5mL新鲜的1640培养基，0.5mL病毒上清和助染剂polybrene(终 浓度为8μg/mL)。24小时后更换为完全培养基，继续培养24小时后，将细胞传 代至6孔板中。
5)抗性筛选：待细胞贴壁后，加入终浓度为1μg/mL嘌呤霉素进行筛选， 为感染细胞作为阴性对照组，筛选4至6天后获得稳定敲降细胞，收取部分细胞 提蛋白，WesternBlot检测敲降效果，确认有效后，获得的稳定敲降细胞可用于后 续实验。
(3)细胞生长曲线测定
1)接种细胞：消化各处理组细胞，加入完全培养基终止后，取20μL细胞悬 液加入至细胞计数板计数。计算各组细胞所需的总数，取相应体积细胞悬液，加 入培养基调整细胞密度为1×104个/mL。按每孔100μL细胞悬液(1000个细胞) 接种于96孔板中，设置4个复孔，共接种6板，置于培养箱中。
2)CCK8检测：待细胞完全贴壁后，取其中一板，弃培养基，每孔加入100μL CCK8工作液(在不含血清和抗生素的RPMI 1640培养基中加入10％CCK8)混匀， 置于37℃避光孵育1小时后，用酶标仪检测在450nm处的吸光值，并记为0天。 之后每隔24小时检测一板96孔板的OD450值，直至第5天。
3)数据分析：以天数为横坐标，以0至5天的OD 450值的平均值为纵坐标， 绘制细胞的生长曲线，比较各组差异。
(4)平板克隆形成实验
1)接种细胞：消化各处理组细胞，加入完全培养基终止后，取20μL细胞悬 液加入至细胞计数板计数。加入培养基调整细胞密度为1×104个/mL。按每孔100μL 细胞悬液(1000个细胞)接种于6孔板中，设置3个复孔，置于培养箱中培养7 至14天后。若观察药物处理对克隆形成的影响，则每孔接种3000至5000个细胞， 同时加入不同终浓度的药物，加入相同量的溶剂作为对照组，培养7至14天(以 细胞种类和药物处理不同而定)。
2)固定和染色：待形成肉眼可见的细胞克隆时，弃培养基，加PBS清洗两次， 加甲醇固定30分钟后，0.1％结晶紫染色30分钟，流水冲洗，晾干，扫描存图。
3)数据分析：计数各孔克隆数，各组取3个复孔的平均值，比较差异。
(5)细胞周期检测(试剂盒法)
1)弃培养基，PBS清洗细胞，胰酶37℃消化，加培养基终止后收集细胞，1000 rpm，离心5分钟，弃上清。
2)PBS重悬细胞沉淀，1000rpm，离心5分钟，重复一次。
3)加入1mL 70％无水乙醇(-20℃保存)重悬细胞沉淀，4℃固定过夜。
4)1000rpm，离心5分钟，去除乙醇。加PBS重悬细胞，1000rpm，离心5 分钟，弃上清。
5)加0.5mL工作液(500μL测定缓冲液中加入25μL PI Solution和2.5μL RNaseSolution，避光配制)，涡旋混匀，37℃避光孵育30分钟。涡旋分散，4℃ 避光孵育30分钟后，流式细胞仪上机检测。
6)使用Modifit软件进行数据分析各细胞周期的细胞所占百分比。
(6)细胞侵袭迁移实验
1)基质胶包被(迁移实验不铺胶)：用不含血清和抗生素的RPMI 1640培养 基按1:33比例稀释Matrigel胶(提前化好)，取50μL加于Transwell小室底部膜 上，避免产生气泡，用于迁移实验的小室加入50μL不含血清和抗生素的RPMI 1640培养基，将Transwell板放入37℃培养箱中1小时，使Matrigel聚合成凝胶， 使用前弃掉上层未凝固液体。
2)制备细胞悬液：胰酶消化细胞，终止消化后1000rpm离心5分钟，弃去培 养液，加1mL PBS 1000rpm离心5分钟，洗2次。用无血清1640培养基重悬细 胞，充分混匀，取20μL细胞悬液加入计数板中计数，调整细胞密度至5至 7.5×105/mL。
3)接种细胞：每组各取200μL(1至1.5×105个细胞)细胞悬液分别加入包 被基质胶(用于侵袭实验)和不包被基质胶(用于迁移实验)的Transwell小室中， 吹打混匀，下室中加入750μL含30％FBS的1640培养基(观察药物对细胞侵袭 迁移影响时，在下室中加入相应浓度的药物)，避免加入过程中在下层培养液和 小室间产生气泡。
4)培养细胞：将接种好细胞的Transwell板放入培养箱中，培养24至48小 时(依肿瘤细胞侵袭迁移能力和处理因素而定)。
5)结果统计：取出Transwell小室，弃培养基，PBS洗2次，用固定液(甲 醇和丙酮按1:1比例配制)固定30分钟，0.1％结晶紫染色20分钟，棉签擦掉上层 未穿过膜的细胞，流水冲洗干净，晾干。切下小室底部的纤维膜，放在载玻片上， 滴加中性树脂封片液，加盖玻片封片晾干后扫描拍照，100倍放大取上中下左右五 个视野，截取相同大小的图片，用ImageJ软件处理图片并计算细胞面积，将得到 的面积取平均值，用于比较组间差异。
(7)细胞划痕实验
1)用Marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀划3道横线，横穿过孔。
2)消化离心各组细胞，接种于6孔板中，混匀，使其贴壁后密度为100％。
3)待细胞贴壁汇合度为100％时，用10μL枪头垂直于培养板背后的横线划痕， 每孔划3道，保证力度一致。
4)用PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，加入无血清RPMI 1640培养基。
5)放入37℃5％CO2培养箱培养。分别在0、24、48小时观察伤痕愈合情况 并拍照。
RIP-PCR实验
(1)细胞裂解：取培养好的细胞，密度为90％在(2×107个细胞，约4个10cm 皿)，PBS洗2次，细胞铲收集细胞，1000rpm离心3分钟，加400μL RIP裂解 液(与细胞沉淀量一样，现加入蛋白酶抑制剂和RNA酶抑制剂)。冰上裂解5分 钟，-80℃冻存。
(2)磁珠-抗体孵育：取50μL磁珠，用洗涤缓冲液清洗3次，分2份，磁 性分离，各加500μL洗涤缓冲液重悬磁珠，分别加2μg IgG抗体和目的蛋白RIP 抗体，室温旋转孵育30分钟。500μL洗涤缓冲液清洗3次，磁性分离，加入现配 好的RIP共沉淀缓冲液(洗涤缓冲液加0.5M EDTA，RNA酶抑制剂)。
(3)ProteinA/G磁珠捕获抗原抗体复合物：-80℃取出细胞裂解物，迅速化 冻，12000rpm 4℃离心10分钟。取2份10％上清作为Input，1份存于-80℃用于 RNA提取，1份加5×蛋白上样缓冲液95℃变性5分钟，存于-20℃。其余上清均 为2份，1份加入孵育好的含有IgG阴性对照抗体(属性与IP组抗体一致)的磁 珠，1份加入含有目的蛋白RIP抗体的磁珠，4℃旋转孵育4小时。
(4)沉淀复合物：500μL洗涤缓冲液清洗复合物5次，磁性分离，弃上清， 500μL洗涤缓冲液重悬，去50μL复合物作为Input，磁性分离弃上清，加1×蛋 白上样缓冲液，95℃变性5分钟。-20℃保存。其余复合物磁性分离，弃上清后备 用。
(5)蛋白酶K消化：将配制好的蛋白酶K缓冲液(洗涤缓冲液加入10％SDS 和proteinase K)加入复合物沉淀中，55℃消化30分钟。
(6)RNA提取：磁性分离复合物，取上清，加入TRIzol提取试剂和氯仿， 混匀后，12000rpm 4℃离心10分钟，取上层液体，加异丙醇沉淀RNA，12000rpm 4℃离心10分钟，小心弃上清，加1mL75％乙醇8000rpm 4℃离心5分钟，弃上 清，室温晾干乙醇，加无RNase的水溶解RNA沉淀，测浓度和纯度。-80℃保存。
(7)RT-PCR或送测序：取RNA送测序或逆转录后进行PCR，检测目的基 因条带。
以上实验过程均需使用无RNase的枪头、离心管，操作避免RNase污染。
RNA-pulldown(DNA探针法)
(1)准备细胞：准备2个10cm皿细胞，用1×PBS缓冲液清洗2至3次，随 后放入紫外交联仪交联(150-300mJ/cm2，30秒)。
(2)裂解细胞：加入1mL pulldown缓冲液(150mM KCl、0.5％NP-40、25mM Tris-HClpH7.4、0.5mM DTT、蛋白酶体抑制剂和80U/mL RNA酶抑制剂)吹打 混匀，4℃旋转裂解细胞30分钟。随后放入4℃离心机中12000rpm离心10分钟， 取上清转移至无RNase的EP管中，备用。
(3)孵育探针：(2)中上清取40μL作为Input，其余分为等量两份。一份 加入1μM生物素标记的正义DNA探针(sense)，另一份加入1μM生物素标记 的反义DNA探针(Anti-sense)。4℃旋转孵育2小时。
(4)封闭磁珠：用含有1mg/mL酵母tRNA和1mg/mL BSA的pulldown缓 冲液重悬链霉亲和素磁珠20μL，并放入4℃旋转孵育1小时。
(5)链霉亲和素磁珠捕获探针-RNA-蛋白复合物：封闭后用pulldown缓冲液 洗涤磁珠三次，磁性分离，弃上清。将(3)中孵育好的复合物加入磁珠中，4℃ 旋转孵育2小时。
(6)沉淀复合物：将孵育复合物的EP管置于磁力架上，磁性分离，弃上清。 加入pulldown缓冲液洗涤3次，弃上清。
(7)将(3)中的Input和(6)中获得的样品分成等量两份。一份加入TRIzol， 用于提取RNA；一份加入1×蛋白上样缓冲液，100℃变性10分钟，用于Western Blot 检测目的蛋白。
(8)RT-PCR和Western Blot：TRIzol提取RNA，测定浓度和纯度，取适量 RNA逆转录后，进行RT-PCR，产物经1％琼脂糖胶电泳，成像仪观察给组有无目 的基因条带，并存图；Western Blot检测Input和实验组中相互作用蛋白的表达。
以上实验过程均需使用无RNase的枪头、离心管，操作避免RNase污染。
内源性Co-IP实验
(1)细胞裂解：收集2个10cm皿细胞，用预冷的PBS洗涤细胞两次，用细 胞刮刀将细胞从培养皿刮下，1000rpm离心5分钟，弃上清，加1mL非变性裂解 液4℃旋转裂解30分钟。
(2)抗体孵育：12000rpm，4℃离心10分钟，取2％上清作为Input，加5× 蛋白上样缓冲液，95℃变性5分钟，-20℃保存。其余上清蛋白定量后均为2份，1 份加IgG阴性对照抗体(种属来源与IP组抗体一致)，1份加目的蛋白IP抗体， 1mg总蛋白加1μg抗体，4℃旋转孵育过夜。
(3)ProteinA/G磁珠捕获抗原抗体复合物：取50μL磁珠，用PBST清洗3 次，磁性分离，弃上清，均分为2份，分别加入对照组和IP组的复合物中，4℃旋 转孵育2小时。
(4)沉淀复合物：磁性分离复合物，用PBST清洗4至6次，弃上清，加20 μL 1×蛋白上样缓冲液，100℃变性10分钟。
(5)SDS-PAGE凝胶电泳：按照目的蛋白大小配制相应浓度的分离胶，上样 电泳，进行Western Blot检测。
(6)考马斯亮蓝染色、切胶、质谱鉴定：若需要质谱鉴定，则不进行Western Blot，用考马斯亮蓝染色后，切下IP组差异条带，和IgG对照组全泳道条带送质 谱鉴定。
MSP-PCR
(1)引物设计：针对启动序列内含子区3个CG位点分别设计3对甲基化(M 引物)和非甲基化(U引物)MSP引物。
(2)提取基因组DNA：消化收集细胞，按试剂盒提取DNA，测浓度和纯度。
(3)重亚硫酸盐转化DNA(Epitect Fast DNA Bisulfite Kit,QIAGEN Catalogno. 59824)。
1)重亚硫酸盐转化DNA：
2)纯化转化的DNA
3)RT-PCR：取转化好的DNA 1μL作为模板，分别加M引物和U引物进行 PCR扩增。
4)核酸电泳和成像：配制2％琼脂糖胶进行核酸电泳，紫外成像仪观察目的 条带的大小和特异性并存图。
RNA半衰期测定
(1)铺板细胞：将实验组和对照组细胞接种于12孔板中，密度为50％。
(2)加转录抑制剂处理：待细胞贴壁后，换液，加入放线菌素D(ActD)， 终浓度为5μmol/L。0小时、2小时、4小时、6小时，每隔2小时加入ActD，6 小时后胰酶消化收集细胞，1000rpm离心5分钟，弃上清，加入1×PBS 1000rpm 离心5分钟洗涤，弃上清。
(3)RNA提取：按试剂盒流程提取RNA，测浓度和纯度。
(4)实时荧光定量PCR：取1.5μg RNA逆转录后，加相同量模板进行实时 PCR，测定各时刻目的基因的CT值，设置3个复孔，并用GAPDH作为内参。
(5)数据处理：先计算实验组和对照组细胞各时刻目的基因的相对表达量(相 对于GAPDH表达量)，再用0时刻的相对表达量进行标准化后，计算获得的相 对表达量数值(2-ΔΔCT)拟合降解曲线和方程，求出mRNA降解常数Kdecay，按公 式t1/2＝ln2/Kdecay计算半衰期。
Western Blot实验
采用常规方法进行细胞蛋白提取、定量，以及SDS-PAGE电泳和蛋白印迹。
细胞免疫荧光实验
(1)细胞接种：将直径为18mm无菌玻璃盖玻片放入12孔板中，加入1640 培养基(确保玻片与培养板之间无气泡)，消化对数生长期细胞，接种至板中， 使其贴壁后汇合度在30％至50％。
(2)固定：待细胞贴壁形态完全展开后，弃培养基，1×PBS清洗3次，4％ 多聚甲醛室温固30分钟。
(3)破膜：弃固定液，加入1×PBS清洗细胞3次。加入0.5％Triton-X 100 溶液(1×PBST配制)，室温孵育30分钟，使胞内抗原充分暴露。
(4)封闭：1×PBS清洗3次，加5％BSA溶液(1×PBST溶液配制)室温封 闭1小时。
(5)一抗孵育：加入的一抗，4℃孵育过夜。
(6)二抗孵育：1×PBST清洗3次，加入5％BSA封闭液稀释的荧光二抗， 室温避光孵育1小时。
(7)脱水：避光条件下，1×PBST清洗3次，依次经过75％、85％、100％酒 精梯度脱水，每次5分钟。
(8)封片：避光取出玻片并晾干，滴加含DAPI的抗猝灭封片剂于载玻片上， 将玻片倒扣在载玻片上封片，-80℃冰箱保存，使用激光共聚焦显微镜60×油镜进 行拍照观察。
免疫组织化学相关实验
(1)组织芯片制备
1)阵点选择和标记：显微镜下观察组织整体的HE切片，选择肿瘤组织中3 至5个癌巢清晰的位置，正常的组织中选择2至3个含有正常鳞状上皮的位置， 并用记号笔做好标记。
2)标记蜡块：根据HE切片上的标记，在对应病理的蜡块上找到相同的位置， 并用记号笔标记。
3)设计芯片：根据需求设计阵点排布，每套芯片包含多例肿瘤组织和若干例 癌旁正常鳞状上皮组织的多个阵点，并设计芯片门的位置用于定位病例。
4)组织芯片制作：将石蜡65℃融化后置于模具之中，制作空白受体蜡块，用 1mm孔径的打孔针按设计的阵列打孔，并弃去空白芯。然后在标记好的组织蜡块 位置上进行打孔钻取目标组织，对照阵列排布图，将其转移至受体蜡块上打好的 相应位置针孔内。阵列完成后，使用融化好的液体石蜡封闭暴露的组织。
5)切片：将制备好的组织芯片蜡块放置于4℃冰箱放置30分钟，切片机切取 4μm厚度的白片，并小心贴于阳离子防脱玻片上，65℃干燥箱中过夜。
(2)免疫组织化学实验
1)脱蜡：使用鼓风式烘箱，72℃，15rpm转速下烘烤组织切片1小时，使石 蜡充分融化，取出后立即放入二甲苯中，脱蜡15分钟，重复3次。
2)水化：取出切片，依次放入100％、85％、75％的乙醇中梯度水化，各5分 钟。
3)洗片：将切片依次放入PBST溶液、PBS缓冲液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中洗片，每次 5分钟。
4)抗原修复：枸橼酸钠修复液(pH 6.0)，用微波炉中高火加热3.5分钟后， 将切片放入预热的修复液中，微波炉解冻档加热20分钟，取出后自然冷却至室温； 或将切片放入EDTA修复液(pH 8.0/pH 9.0)中，高压修复2.5分钟。
5)洗片：将切片依次放入PBST溶液、PBS缓冲液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中洗片，每次 5分钟。
6)灭活内源性过氧化物酶：将3％过氧化氢滴加于切片上，室温避光封闭15 分钟。
7)洗片：将切片依次放入PBST溶液、PBS缓冲液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中洗片，每次 5分钟。
8)一抗孵育：用免疫组化石蜡笔在组织芯片边缘画出封闭的阻水圈，将抗体 稀释液稀释的一抗滴加于组织表面，小心均匀涂开抗体液，使其完全覆盖组织， 置于湿盒中4℃孵育过夜。
9)洗片：将切片依次放入PBST溶液、PBS缓冲液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中洗片，每次 5分钟。
10)PV-9000反应增强液：滴加PV-9000反应增强液于组织芯片上，使其均 匀覆盖组织，置于湿盒中37℃孵育20分钟。
11)洗片：将切片依次放入PBST溶液、PBS缓冲液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中洗片，每次 5分钟。
12)酶标二抗孵育：滴加PV9000酶标二抗于组织芯片，使其均匀覆盖组织， 置于湿盒中37℃孵育30分钟。
13)洗片：将切片依次放入PBST溶液、PBS缓冲液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中洗片，每次 5分钟。
14)DAB显色：现配DAB染色液(滴加1滴50×DAB浓缩液于1mL DAB 底物液中，混匀)，滴加于组织表面，使其迅速均匀覆盖组织，显微镜下观察， 当组织着色与背景对比显著时，立即弃掉显色液，将切片放于蒸馏水中终止显色。
15)复染：滴加苏木素染液至组织表面，复染10至15s后，自来水冲洗。
16)返蓝：将切片置于1％氨水中反应8至10分钟，使组织充分返蓝。
17)梯度脱水：将切片依次放入75％、85％、100％乙醇中梯度各5分钟。
18)封片：将切片放置于通风橱中晾干后，滴加中性树脂封片剂于切片上， 加盖盖玻片封片，室温放置使封片剂扩散均匀并凝固。
19)扫描存图：使用Nano Zoomer数字化病理切片扫描仪扫描组织芯片，并 存图。
(3)评分原则
1)阅片质量控制：发生严重脱片的阵点、组织阵点中无癌巢或无正常上皮、 癌巢中细胞严重空泡化，有上述情况的阵点不评分。
2)评分标准：首先明确目的蛋白的亚细胞定位(细胞核、细胞浆、细胞膜)， 分别根据阳性信号的强度和阳性信号的肿瘤细胞所占的面积进行评分，染色强度 设定为0、1、2、3分四个等级，面积设定0、1、2、3四个等级：
每个阵点的积分为强度×面积的得分，每个病例的最后得分按多个阵点的强度面积积分均值计算，大于等于3分的病例定义为表达阳性病例。
裸鼠肺转移实验
(1)SPF级3周龄雌性BALB/c-nu/nu裸鼠饲养一周，实验前一天称重，按体 重随机分为实验组和对照组，每组10只。
(2)消化对数生长期稳定表达pLKO.1-shIGF2BP1和对照组pLKO.1-shNS的 食管鳞癌KYSE30细胞，加入完全培养基终止，充分混匀细胞悬液，取20μL加 入细胞计数板计数。根据细胞总量，用1×PBS溶液稀释，使细胞悬液浓度为5×106个/mL。置于冰上备用，并在30分钟内使用。
(3)将细胞充分混匀吹散后(防止细胞成团)，1mL注射器吸取200μL细 胞悬液(即1×106个/只)尾静脉缓慢注入裸鼠体内，观察半小时，小鼠无异常情 况后放入笼中。
(4)6周后采用颈椎脱臼法处死小鼠取完整肺组织，经Bouin氏固定液(固 定时间不超过24小时)固定后观察肺转移情况，计数肺转移瘤数目，拍照。
(5)将固定好的对照组和实验组小鼠肺组织送病理切片，并进行HE染色。
统计分析
使用IBM SPSS Statistics 23.0软件进行统计学分析，实验数据以P<0.05视为具有统计学意义。采用Fisher精确检验分析蛋白在肿瘤组织与正常组织中的表达 差异；蛋白表达水平与临床病理参数的相关性分析使用Pearson卡方检验；两组间 的比较用独立样本T检验，两组以上使用ANOVA检验。RStudio软件(1.1463) 用于GO和Pathway富集分析。
序列表
<110> 中国医学科学院肿瘤医院
<120> IGF2BP1高表达在食管癌检测和治疗中的应用
<130> 310196CG
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> siIGF2BP1-1
<400> 1
gcagtggtga atgtcaccta t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> siIGF2BP1-2
<400> 2
cctggcccat aataactttg t 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> siG3BP1-1
<400> 3
agtgcgagaa caacgaataa a 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> siG3BP1-2
<400> 4
tatggaaaga actcttctta t 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> siINHBA-1
<400> 5
ggcagaaatg aatgaactta t 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> siINHBA-2
<400> 6
aggcactttc ctacccaatt a 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> siMETTL3-1
<400> 7
gcaagtatgt tcactatgaa a 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> siMETTL3-2
<400> 8
gccaaggaac aatccattgt t 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> siMETTL14-1
<400> 9
ccatgtactt acaagccgat a 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> siMETTL14-2
<400> 10
gctaatgttg acattgactt a 21
<210> 11
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> shIGF2BP1-F
<400> 11
ccggctccaa agttcgtatg gttatctcga gataaccata cgaactttgg agttttttg 59
<210> 12
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> shIGF2BP1-R
<400> 12
aattcaaaaa actccaaagt tcgtatggtt atctcgagat aaccatacga actttggag 59
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 正义-INHBA-1
<400> 13
ggcagaaatg aatgaactta t 21
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义-INHBA-1
<400> 14
ataagttcat tcatttctgc c 21
Claims (10)
1.靶向IGF2BP1的试剂在制备治疗癌症的药物中的用途，其中所述靶向IGF2BP的试剂是抑制和/或降低IGF2BP基因和/或蛋白的表达水平、或抑制IGF2BP与INHBA mRNA结合的试剂。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述癌症为与INHBA表达相关的癌症，优选地，所述癌症选自食管癌、乳腺癌、结直肠癌、宫颈鳞癌、肺鳞癌、头颈鳞癌、肺腺癌、胃癌；优选地，所述食管癌是食管鳞癌。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中抑制和/或降低IGF2BP1基因和/或蛋白的表达水平的试剂选自与IGF2BP1基因序列互补的反义核酸分子、敲降IGF2BP1蛋白表达水平的干扰RNA和拮抗IGF2BP1蛋白功能的拮抗剂抗体。
4.根据权利要求3所述的用途，其中敲降IGF2BP1蛋白表达水平的干扰RNA选自siRNA、shRNA、单链干扰RNA和微RNA。
5.根据权利要求1或2所述的用途，其中抑制IGF2BP1与INHBA mRNA结合的试剂为BTYNB。
6.用于检测来自受试者样品的IGF2BP表达水平的检测剂在制备用于诊断和/或预后食管癌的试剂中的用途；优选地，所述食管癌是食管鳞癌。
7.根据权利要求6所述的用途，其中所述IGF2BP选自IGF2BP1、IGF2BP2和IGF2BP3。
8.根据权利要求6或7所述的用途，其中所述的IGF2BP表达水平为IGF2BP基因表达水平，和/或IGF2BP蛋白表达水平；优选地，所述IGF2BP基因表达水平为IGF2BP mRNA的水平。
9.根据权利要求6或7所述的用途，其中所述的样品为肿瘤样品。
10.根据权利要求8或9所述的用途，其中检测IGF2BP基因表达水平的检测剂选自特异性结合IGF2BP基因的引物和/或探针；和/或检测IGF2BP蛋白表达水平的检测剂为特异性结合IGF2BP蛋白的抗体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111098953.2A CN115837079A (zh) | 2021-09-18 | 2021-09-18 | Igf2bp1高表达在食管癌检测和治疗中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111098953.2A CN115837079A (zh) | 2021-09-18 | 2021-09-18 | Igf2bp1高表达在食管癌检测和治疗中的应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115837079A true CN115837079A (zh) | 2023-03-24 |
Family
ID=85575121
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111098953.2A Pending CN115837079A (zh) | 2021-09-18 | 2021-09-18 | Igf2bp1高表达在食管癌检测和治疗中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115837079A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117924479A (zh) * | 2024-03-25 | 2024-04-26 | 中国医学科学院基础医学研究所 | 一种抗inhba的单克隆抗体及其应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN203275415U (zh) * | 2013-03-20 | 2013-11-06 | 江苏元化生命科技有限公司 | 一种检测食管鳞癌标志物的蛋白质芯片及其试剂盒 |
| CN112439068A (zh) * | 2019-09-04 | 2021-03-05 | 中国医学科学院肿瘤医院 | snord78分子在诊断和/或治疗食管鳞癌中的用途 |
-
2021
- 2021-09-18 CN CN202111098953.2A patent/CN115837079A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN203275415U (zh) * | 2013-03-20 | 2013-11-06 | 江苏元化生命科技有限公司 | 一种检测食管鳞癌标志物的蛋白质芯片及其试剂盒 |
| CN112439068A (zh) * | 2019-09-04 | 2021-03-05 | 中国医学科学院肿瘤医院 | snord78分子在诊断和/或治疗食管鳞癌中的用途 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| JUAN-JUAN WANG 等: "Elevated expression of the RNA-binding protein IGF2BP1 enhances the mRNA stability of INHBA to promote the invasion and migration of esophageal squamous cancer cells", JUAN-JUAN WANG, 29 August 2023 (2023-08-29), pages 1 - 14, XP021323387, DOI: 10.1186/s40164-023-00429-8 * |
| JUAN-JUAN WANG 等: "RNA-Binding Protein IGF2BP1 Enhances mRNA Stability and Translation Efficiency of INHBA to Promote the Invasion and Migration of Esophageal Squamous Cancer Cells", pages 8 - 9, Retrieved from the Internet <URL:https://www.researchsquare.com/article/rs-673905/v1> * |
| XIAODAN WU等: "Long Non-Coding RNA CCAT2 Promotes the Development of Esophageal Squamous Cell Carcinoma by Inhibiting miR-200b to Upregulate the IGF2BP2/TK1 Axis", FRONTIERS IN ONCOLOGY, vol. 11, 27 July 2021 (2021-07-27), pages 4 * |
| 邢学忠: "IGF2BP3与食管鳞癌临床和预后的相关研究", 中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑, 15 September 2008 (2008-09-15) * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117924479A (zh) * | 2024-03-25 | 2024-04-26 | 中国医学科学院基础医学研究所 | 一种抗inhba的单克隆抗体及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Luo et al. | Amplification and overexpression of CTTN (EMS1) contribute to the metastasis of esophageal squamous cell carcinoma by promoting cell migration and anoikis resistance | |
| Zhang et al. | MicroRNA‐657 promotes tumorigenesis in hepatocellular carcinoma by targeting transducin‐like enhancer protein 1 through nuclear factor kappa B pathways | |
| CN110257515B (zh) | 一种用于乳腺癌诊断的分子标志物及其应用 | |
| JP2023123748A (ja) | 転移性癌の診断及び治療の方法 | |
| Jiang et al. | Over expression of amphiregulin promoted malignant progression in gastric cancer | |
| CN110172462B (zh) | 一种对肿瘤的发生和发展具有促进作用的基因及其表达产物和应用 | |
| CN107164554B (zh) | Asprv1作为生物标志物在喉鳞癌诊疗中的应用 | |
| CN107267616B (zh) | 一种非编码基因生物标记物在肝癌中的应用 | |
| CN115837079A (zh) | Igf2bp1高表达在食管癌检测和治疗中的应用 | |
| JP6566933B2 (ja) | ガンを治療するための療法のための標的として使用するためのｆａｌｚ | |
| Lai et al. | Engrailed-2 might play an anti-oncogenic role in clear-cell renal cell carcinoma | |
| Li et al. | LINC00271 inhibits epithelial-mesenchymal transition of papillary thyroid cancer cells by downregulating trefoil factor 3 expression | |
| KR20110046987A (ko) | 암의 진단 및 치료를 위한 ｅＩＦ３ｍ의 용도 | |
| CN106995857B (zh) | 生物标记物ensg00000267416在癌症中的应用 | |
| CN114540490B (zh) | Lcdr作为预防和/或治疗癌症的药物的治疗靶点中的应用 | |
| CN110628911B (zh) | 上皮性卵巢癌的诊治靶标基因及其应用 | |
| CN114807364A (zh) | YRNA片段hY4F作为分子标志物在制备肺癌诊断试剂中的应用及抗肺癌药物 | |
| US20220145395A1 (en) | Transpochimeric Gene Transcripts (TCGTS) As Cancer Biomarkers | |
| CN114032236A (zh) | 一种TMEM2的shRNA及其应用 | |
| US10865415B2 (en) | Prevention, diagnosis and treatment of cancer overexpressing GPR160 | |
| CN110742899A (zh) | miR-140在制备抑制乳腺癌增殖和迁移药物中的用途 | |
| CN114561466B (zh) | Fto在诊治骨肉瘤中的应用 | |
| CN113101368B (zh) | Slc7a8在食管鳞癌辅助诊断、癌前预警和靶向治疗中的应用 | |
| CN113604568B (zh) | Hpv16整合靶点联合铁死亡调控基因在制备宫颈癌早期治疗试剂盒中的应用 | |
| CN111705060B (zh) | 一种NCAPD2基因的shRNA及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |