CN112439068A - snord78分子在诊断和/或治疗食管鳞癌中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及snord78分子在诊断和/或治疗食管鳞癌中的用途。具体地，本发明涉及snord78分子的抑制剂用于制备治疗食管鳞癌的药物中的用途，以及一种或多种特异地检测snord78表达水平的引物和/或探针在制备用于诊断食管鳞癌患者的试剂和/或在制备用于诊断食管鳞癌早期患者淋巴结转移的试剂中的用途。

Description

snord78分子在诊断和/或治疗食管鳞癌中的用途

技术领域

本发明涉及食管鳞癌诊断和/或治疗的技术领域。具体涉及snord78分子在诊断和/或治疗食管鳞癌中的用途。

背景技术

食管癌是我国常见的恶性肿瘤之一。2018年中国癌症报告显示，食管癌发病率和死亡率在我国癌症中分居第六位和第四位。食管癌有两种病理类型：食管鳞癌与食管腺癌。在我国，90％以上的食管癌为食管鳞癌。尽管诊疗技术有所发展，但食管鳞癌发病隐匿，进展迅速等特点，导致其五年生存率仅为10-30％。早期食管鳞癌可以通过内镜下切除达到根治并保留食管功能的目的，但其绝对禁忌是淋巴结转移，即使原发病变切除的非常完整，一旦转移而没有追加治疗则可能导致本已早诊的病例贻误了治疗。因而筛选与食管鳞癌早期淋巴结转移预后相关的分子标志物对食管鳞癌的早诊早治具有重要意义。肿瘤转移是一个复杂的多基因参与、调控的过程，涉及到一系列与转移相关的分子的异常表达，因此从分子水平上寻找与肿瘤转移相关的分子标志物，已经成为肿瘤分子分型、预测肿瘤转移以及实施个体化治疗的基础和重要依据。

小核仁RNA(snoRNA)是一类在真核细胞中广泛存在的长度约为60～300nt的非编码RNA，由内含子编码，能与特定的蛋白质结合形成复合物在细胞中稳定存在。它们的主要功能是指导rRNA的2’-O甲基化及假尿嘧啶化修饰，影响rRNA的成熟，从而影响蛋白质的合成。研究发现snoRNA在肿瘤的发生发展中也起着非常重要的作用，Chang等最新报道了snoRNA与恶性肿瘤的关系，他们发现snoRNA h5sn2在正常脑膜组织中高表达，而在脑膜瘤组织中低表达，这提示我们snoRNA h5sn2的表达丢失对脑膜瘤的发生有一定的促进作用。Dong等在筛选6q14.3位点中的抑癌基因时发现，U50在前列腺癌细胞中低表达，提高其表达水平可以抑制前列腺癌细胞的克隆形成能力。Liao等研究发现，血清中snoRNA可以稳定存在而不被RNA酶降解。进一步研究发现，NSCLC(非小细胞肺癌)患者血清中snord33与snord76的表达水平明显高于健康人，联合检测snord33、snord66和snord76的表达水平具有早期诊断肺癌的意义，其检测的灵敏度和特异度分别达到83.78％和95.45％。因而研究snoRNA在肿瘤发生发展中的作用可以为肿瘤诊断治疗提供新线索。而在食管鳞癌的研究中还未见有关于snoRNA的报道。

发明内容

本发明第一方面涉及snord78分子的抑制剂在制备用于治疗和/或预防食管鳞癌的药物中的用途，其中所述snord78分子的序列如SEQ ID NO：1所示：

5’-GUGUAAUGAUGUUGAUCAAAUGUCUGACCUGAAAUGAGCAUGUAGACAAAGGUAACACUGAAGAA-3’(SEQ ID NO：1)。

所述snord78分子的编码基因定位于1号染色体，含有65个核苷酸，由GAS5内含子编码，其中snord78分子的编码基因在基因组上的全长显示在GenBank登录号为：NR_003944.2，第173865622～173865686bp序列，65bp。

在本文中，snord78分子的抑制剂是指能够降低、抑制、减弱或消除snord78分子表达的分子。

在一个具体的实施方案中，所述snord78分子的抑制剂是核酸分子。

在一个更具体的实施方案中，所述snord78分子的抑制剂是与snord78序列互补的反义核酸分子，优选是小干扰RNA(siRNA)。

术语“小干扰RNA(siRNA)”指为双链RNA剂的核酸分子。siRNA通过特异地指导宿主细胞中的酶而发挥作用，从而切割靶标RNA。凭借siRNA序列的特异性，以及其与RNA靶标的同源性，siRNA能够引起靶标RNA链的切割，从而失活靶标RNA分子。在哺乳动物中，siRNA是大约19-25个核苷酸的长度。

本发明另一方面涉及一种或多种特异地检测受试者样本中snord78分子表达水平的引物和/或探针在制备用于诊断和/或预后食管鳞癌的试剂中的用途。

在一些实施方案中，受试者样本是癌组织样本。在一些实施方案中，受试者样本是食管鳞癌组织。在具体的实施方案中，食管鳞癌组织是通过活检的方式获得的，或者外科切除的食管鳞癌组织。在另一些具体的实施方案中，当用于食管鳞癌的诊断时，样本还包括癌旁组织。癌旁组织是指距离所述癌组织边缘2cm以外的食管鳞癌组织。当所述癌组织中snord78的表达水平显著高于所述癌旁组织中snord78的表达水平时，指示所述受试者患有所述食管鳞癌。

在一些实施方案中，受试者样本是受试者的血清样本。在另一些具体的实施方案中，当用于食管鳞癌的诊断时，样本还包括健康对照的血清样本。当所述受试者的血清样本中snord78的表达水平显著高于健康对照的血清样本的表达水平时，指示所述受试者患有所述食管鳞癌。在具体的实施方案中，所述健康对照是未患有食管鳞癌的个体。

在本说明书的上下文中，预后是指预测食管鳞癌的可能病程和结局。预后既包括判断疾病的特定后果(如康复、某种症状、体征、并发症)，也包括提供时间线索(如预测某段时间内发生某种结局的可能性)。当从疾病演进过程的角度考虑时，预后包括例如缓解率、复发率、病残率。当从疾病终极状态的角度考虑时，预后包括例如治愈率、生存率、病死率。当从预后时间考虑时，预后包括例如近期病死率、远期病死率(参见刘振华主编的《肿瘤预后学》)。

本发明另一方面涉及一种或多种特异地检测受试者样本中snord78分子表达水平的引物和/或探针在制备用于诊断食管鳞癌早期淋巴结转移的试剂中的用途。

在一些实施方案中，受试者样本是癌组织样本。在一些实施方案中，受试者样本是食管鳞癌组织。在具体的实施方案中，食管鳞癌组织是通过活检的方式获得的，或者外科切除的食管鳞癌组织。在另一些具体的实施方案中，当用于食管鳞癌早期淋巴结转移的诊断时，样本还包括淋巴结非转移食管鳞癌组织，淋巴结非转移食管鳞癌组织是指未出现淋巴结转移的食管鳞癌组织。当所述癌组织中snord78的表达水平显著高于淋巴结非转移组织中snord78的表达水平时，指示所述受试者患有食管鳞癌早期淋巴结转移。

如本领域中所用，食管癌(包括食管鳞癌)分期分为Tis：高度不典型增生；T1：癌症侵犯黏膜固有层、粘膜肌层或粘膜下层，并被细分为T1a(癌症侵犯黏膜固有层或粘膜肌层)和T1b(癌侵犯粘膜下层)；T2：癌侵犯固有肌层；T3：癌症侵犯外膜；T4：癌侵入局部结构并且被细分类为T4a：癌侵入相邻结构例如胸膜，心包膜，奇静脉，膈肌或腹膜，T4b：癌侵入主要相邻结构，例如主动脉，椎体或气管(参见第八版食管癌TNM分期标准)。早期食管鳞癌指T1期食管癌鳞癌。

本领域技术人员结合公知常识，根据snord78的核苷酸序列可以自行制备特异性的探针或引物对。

在一个具体的实施方案中，所述引物为SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的引物。

其中，用于snord78反转录的引物的序列如SEQ ID NO：2所示：

5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTACCTTTG-3’(SEQ ID NO：2)；

snord78正义引物的序列如SEQ ID NO：3所示，序列为：

5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’(SEQ ID NO：3)；

snord78反义引物的序列如SEQ ID NO：4所示，序列为：

5’-GTGTAATGATGTTGATCAAATGTCTGAC-3’(SEQ ID NO：4)。

在另一方面，本发明提供了一种诊断食管鳞癌的方法，包括步骤：

a)提供来自个体的食管鳞癌癌组织和癌旁组织或食管鳞癌患者血清和健康人血清的样品；和

b)确定样品中snord78分子的表达水平；

c)比较癌组织和癌旁组织或食管鳞癌患者和健康人血清的样品中snord78分子的表达水平。

具体地，在本发明的一个实施方案中，检测待测样品的步骤包括：

1)收集食管鳞癌早期淋巴结转移与非转移的标本；

2)基因芯片检测上述标本，筛选与食管鳞癌早期淋巴结转移相关的基因：snord78；

3)芯片数据处理：单因素分析所得有统计学差异的snoRNA；

4)芯片数据验证：利用根据snord78基因序列设计的引物qRT-PCR扩增；

5)PCR数据收集及处理：采用U6 RNA作为内标，进行归一化处理。

在一个具体的实施方案中，所述受试者是哺乳动物，优选是人。

在另一方面，本发明提供了一种治疗和/或预防哺乳动物食管鳞癌的方法，包括向遭受食管鳞癌的患者给药治疗有效量的snord78分子的抑制剂。

如本文中所使用的“治疗有效量”指有效预防、缓解、减少或改善疾病症状或延长被治疗患者的生存的一种(或多种化合物)的最低浓度或量。治疗有效量还是治疗有利作用超过试剂的任何有毒或有害作用的量。更具体地，关于癌症治疗，治疗有效量指具有以下作用的量(1)减小肿瘤的尺寸(或优选消除)；(2)抑制(即，在一定程度上减缓，优选停止)肿瘤转移；(3)在一定程度上抑制(即，在一定程度上减缓，优选停止)肿瘤生长；和/或，(4)在一定程度上减轻(或优选消除)一种或多种与癌症有关的症状。

附图说明

图1：显示了16例食管鳞癌早期淋巴结转移标本与14例淋巴结非转移标本的microRNA芯片分析结果。从芯片结果可以看出，snord78在食管鳞癌早期淋巴结转移标本中的表达相对于淋巴结非转移标本中的表达更高。横坐标代表病例的淋巴结转移情况，其中N代表淋巴结转移的标本，P代表原位癌，无淋巴结转移。其中U78_s_st和U78_x_st均代表snord78，是芯片中针对snord78的不同探针编号。

图2：显示了snord78在两例正常食管组织、一株永生化的食管上皮细胞系及十株食管鳞癌细胞系中的表达水平，可以发现snord78在食管鳞癌细胞系中的表达明显高于其在正常食管组织及永生化食管上皮细胞中的表达。

图3：显示了snord78在另外独立于芯片的食管鳞癌早期淋巴结转移标本与非转移标本中的表达情况。

图4：显示了snord78在食管鳞癌患者配对的癌与癌旁组织中的表达情况。

图5：显示了snord78在健康人及食管鳞癌患者血清中的表达情况。

图6：显示了snord78在T1期食管鳞癌淋巴结转移患者血清与非转移患者血清中的表达情况。

图7：显示了snord78的表达水平与食管鳞癌患者生存预后的关系，可以发现snord78在食管鳞癌患者组织中的表达与病人的生存预后密切相关，snord78表达越低，病人的生存预后越好。

图8A至图8D：显示了snord78低表达体外抑制细胞的侵袭和迁移能力。图8A：KYSE30细胞系分别加入snord78的小干扰RNA(si snord78)、小干扰RNA对照序列(sisnoRNA对照，阴性对照，NC)后，抑制细胞的体外侵袭和迁移能力细胞染色示意图；图8B：KYSE150细胞系分别加入NC对照，si snord78后，抑制细胞的体外侵袭和迁移能力细胞染色示意图；图8C：KYSE30细胞系分别加入si snoRNA对照，si snord78后，抑制细胞的体外侵袭和迁移能力柱状示意图；图8D:KYSE150细胞系分别加入si snoRNA对照，si snord78后，抑制细胞的体外侵袭和迁移能力柱状示意图。

图9：显示了用snord78分子的抑制剂敲降snord78体外抑制细胞的增殖能力。分别为：KYSE30细胞系分别加入si snoRNA对照，si snord78后，抑制细胞的体外增殖能力示意图(左侧)；和KYSE150细胞系分别加入si snoRNA对照，si snord78后，抑制细胞的体外增殖能力示意图(右侧)。

图10A至图10C：显示了用snord78分子的抑制剂敲降snord78体外抑制细胞的克隆形成能力。图10A：KYSE30、KYSE150细胞系分别加入si snoRNA对照，si snord78后，体外抑制细胞的克隆形成能力示意图；图10B和图10C：KYSE30(图10B)、KYSE150(图10C)细胞系分别加入si snoRNA对照，si snord78后，体外抑制细胞的克隆形成能力柱状示意图。

具体实施方式

本发明人运用microRNA基因芯片及qRT-PCR技术对食管鳞癌早期淋巴结转移与非转移标本进行了研究。本发明人出人意料的发现，snord78在食管鳞癌早期淋巴结转移标本中的表达水平显著高于非转移标本中的表达(参见图1)。在另外独立的患者组织标本中再次予以检测，得到了一致的结果。因此，该基因可以作为一个很好的预测食管鳞癌早期淋巴结转移风险的模型。通过该模型，可以将经过内镜下切除的早期食管鳞癌患者分为淋巴结转移和非淋巴结转移两种类型，不同的类型后续追加不同的治疗方案，淋巴结转移类型患者后续还需进一步的放化疗等治疗手段以保证本已早诊的患者病情不会加重，非淋巴结转移类型患者则只需定期复查以保证患者没有过度治疗。在将该基因应用于相应的基因芯片或试剂盒后，可快速地对哺乳动物包括人的食管鳞癌早期患者进行淋巴结转移和非淋巴结转移的区分，可快速的判断其是否有淋巴结转移的风险，从而对预测食管鳞癌早期淋巴结转移与否模型的改变具有划时代意义。

在本发明的一个实施方案中，使用能够特异性地检测snord78分子表达水平的引物和/或探针，可快速地诊断哺乳动物包括人的食管鳞癌，从而对食管鳞癌治疗模式的改变具有划时代意义。

在本发明的另一个具体实施方案中描述了本发明涉及的检测方法，其主要包括标本收集并提取snoRNA、基因芯片制作、杂交及qRT-PCR验证等步骤。基因芯片检测主要用于筛选与食管鳞癌早期淋巴结转移相关的基因，筛选出的基因通过qRT-PCR进行结果验证。鉴于发明人已经找到和食管鳞癌早期淋巴结转移相关的基因，在今后临床应用中，仅运用提取标本中的snoRNA及qRT-PCR两种技术即可。这两种方法对于本领域的技术人员为常规操作。因此，该模型在临床中容易被推广。

具体地，本发明涉及的snord78分子检测方法主要包括标本收集并提取snoRNA、基因芯片制作、杂交及qRT-PCR验证等步骤。基因芯片检测主要用于筛选与食管鳞癌早期淋巴结转移相关的基因，筛选出的基因通过qRT-PCR进行结果验证。鉴于发明人已经找到和食管鳞癌早期淋巴结转移相关的基因，在今后临床应用中，仅运用提取标本中的snoRNA及qRT-PCR两种技术即可。这两种方法对于本领域的技术人员为常规操作。因此，该模型在临床中容易被推广。

在本发明的另一个具体实施方案中还描述了检测待测样品中snord78表达情况的方法，其包括如下步骤：

1)收集食管鳞癌早期淋巴结转移与非转移的标本，

2)基因芯片检测上述标本，筛选与食管鳞癌早期淋巴结转移相关的基因：snord78，，

3)芯片数据处理：单因素分析所得有统计学差异的snoRNA，

4)芯片数据验证：利用根据snord78基因序列设计的引物qRT-PCR扩增，

5)PCR数据收集及处理：采用U6 RNA作为内标，进行归一化处理。

在本发明的另一个具体实施方案中，本发明人研究了snord78对食管鳞癌细胞系体外侵袭迁移和增殖能力的影响。结果表明用snord78的抑制剂处理食管鳞癌细胞可抑制食管鳞癌细胞的体外侵袭、迁移和生长能力。因此，本发明所述的snord78的抑制剂可用于治疗患有食管鳞癌的患者。

本发明将利用下述实施例进行进一步的描述，但本发明并不局限于这些实施例。

在下述实施例中，若非特别说明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。除非另外指明，本发明实施例中涉及的RT-PCR、PCR等操作均按照“分子克隆实验指南(第三版)”(科学出版社，2002[美]J.萨姆布鲁克D.W拉塞尔著，黄培堂等译)及厂商说明书进行，细胞培养、细胞传代、细胞复苏及冻存、细胞转染及免疫荧光测定等操作均按照“动物细胞培养--基本技术指南(第四版)”(科学出版社，2000，[英]弗雷谢尼(R.I.)著，章静波等译)及厂商说明书进行操作。

实施例1：检测snord78基因表达情况的方法

1、Trizol法提取组织总RNA

(1)样本来源

食管鳞癌早期淋巴结转移与非转移患者的癌及癌旁组织样本、血清样本，以及健康人血清样本均来源于中国医学科学院肿瘤医院，有足够的福尔马林石蜡包埋组织，以便获得充足的snoRNA，有完备的医学书写记录和随访记录。将其分成两组进行microRNA芯片检测，筛选和食管鳞癌早期淋巴结转移相关的snoRNA。选择另外独立的食管鳞癌早期淋巴结转移与非转移福尔马林固定石蜡包埋组织，验证芯片结果。

(2)样本处理

在铝箔中将1cm²大小左右的组织样本敲碎，移至已加入钢珠的Eppendorf管中，使用研磨仪(30 1/s，8min)进行研磨，此步操作应尽可能在低温液氮环境下操作，细菌、细胞样本不用研磨；

(3)在研磨后的Eppendorf管中加入1ml Trizol(Invitrogen，15596-026)，振荡混匀；

(4)将混匀后溶液移至一新Eppendorf管中，加入200μl氯仿，振荡混匀；

(5)离心：4℃，12000rpm，15min；

(6)将离心后上清液移至一新Eppendorf管中，加入500μl异丙醇，轻轻混匀，室温静置15min；

(7)离心：4℃，12000rpm，15min；

(8)倒掉上清液，加入1ml 75％乙醇，振荡混匀；

(9)离心：4℃，7500rpm，5min；

(10)倒掉上清液，并在超净台中将乙醇挥发干净；

(11)加入40～60μl DEPC H2O，65℃5min助溶；

(12)-20℃冷冻保存。

2、用Qiagen试剂盒提取血清RNA

(1)样本来源

食管鳞癌早期淋巴结转移与非转移血清样本来源于中国医学科学院肿瘤医院，有足够的血清，以便获得充足的snoRNA，有完备的医学书写记录和随访记录。用QIAampCirculating Nucleic Acid Kit(Qiagen,55114)，提取步骤按照试剂盒所附说明进行。

3、总RNA质量检测

(1)NanoDrop(Gene Company Limited)测定总RNA浓度(2μl总RNA上样)，

(2)1.5％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量

上样总体积约为6～8μl。

甲醛变性琼脂糖凝胶：30ml 1×TBE缓冲液中加入0.45g琼脂糖，微波炉中加热溶化，轻轻摇动使琼脂糖充分混匀(肉眼观察无颗粒状悬浮物)，冷却至60℃左右时加入600μl甲醛，混匀，倒入RNA专用的制胶器中(7.5×5.5cm)，室温静置30min左右即可使用。

电泳条件：120～130V，15～20min。

4、snoRNA逆转录：(采用的试剂盒，公司，货号)

(1)逆转录反应体系

(2)逆转录程序：16℃30min，37℃30min，70℃10min，4℃冷藏待用。

5、snoRNA实时PCR反应

(1)snoRNA实时PCR反应体系(SYBR Premix Ex Taq^TMII,TaKaRa,RR820A)

模版(cDNA) 上述逆转录反应体系20μl中的1μl

MgCl2 1.6μl

引物snoRNA正义引物 0.6μl(10μM)

对于snord78:SEQ ID NO：3

反义引物 0.6μl(10μM)

对于snord78:SEQ ID NO：4

DNA Master SYBR Green I MIX 2μl

加无核酸酶H₂O 至20μl

(2)snoRNA实时PCR程序(CFX96、Biorad)

(3)snoRNA实时PCR产物1.5％非变性(不加甲醛)琼脂糖凝胶电泳检测

snoRNA实时PCR产物 2～4μl

2×加样缓冲液 4μl

总体积约为6～8μl。

非变性琼脂糖凝胶：80ml 1×TBE缓冲液中加入1.2g琼脂糖，微波炉中加热溶化，轻轻摇动使琼脂糖充分混匀(肉眼观察无颗粒状悬浮物)，冷却至60℃左右时加入2μl EB(原液)混匀，倒入制胶器中(15×15cm)，室温静置30min左右即可使用。

电泳条件：100V，25～30min。

6、数据收集及处理：

采用U6 RNA作为内标，进行归一化处理。

结果参见图2至图7：snord78在食管鳞癌组织中相较于癌旁正常组织高表达，且snord78高表达与T1期食管鳞癌淋巴结转移密切相关。通过绘制Kaplan-Meier曲线及LogRank检验分析发现，snord78表达越高，T1期食管鳞癌患者的生存时间越短，预后越差。Snord78在食管鳞癌患者血清中表达相较于健康人中表达更高，且snord78在血清中的表达可以预测T1期食管鳞癌患者的淋巴结转移情况，即snord78在血清中表达越高，越易发生淋巴结转移。

实施例2：使用snord78分子的抑制剂处理食管鳞癌细胞可抑制其侵袭迁移和增殖的生物学作用研究

1、实验步骤

(1)细胞培养

人食管鳞癌细胞系：KYSE30，KYSE150(京都大学Shimada Y教授馈赠)，RPMI1640培养基(Gibco)，含10％胎牛血清(FBS，Gibco)，37℃、5％CO2培养。

(2)细胞瞬时转染

使用Lipofectamine 2000(Invitrogen、货号11668019)试剂，进行siRNA转染。

si snoRNA瞬时转染：

si snord78的序列

5'-GACCUGAAAUGAGCAUGUA-3'(SEQ ID NO：5)，在广州锐博公司合成。

(I)si snoRNA配制：在20nmol的双链si snoRNA中加入1000μl 1×通用缓冲液(DEPC水，用DEPC处理去离子水后高压灭菌获得)，得到浓度为20μM的si snoRNA母液，置-20℃保存。

(II)取生长状态良好的细胞，于转染前一天将细胞接种于60mm培养皿中(不加抗生素)，转染时细胞密度达到30％左右。

(III)准备以下复合体：A液：将适当浓度的si snoRNA稀释于500μl无血清培养基中，轻轻混匀；B液：取10μl Lipofectamine 2000(用前轻柔混匀)稀释于500μl无血清培养基中，混匀。室温孵育5min。

(IV)将稀释的脂质体与稀释的si snoRNA混合，轻轻混匀，室温孵育20分钟(复合体于室温6小时内会保持稳定)。

(V)将混合后的复合物1000μl加入细胞培养皿内，加无血清培养基至5ml，轻轻混匀。6小时后弃去原培养基，换含10％血清的培养基。

(3)样本总RNA提取

a)Trizol法提取细胞总RNA

(I)取生长状态良好的细胞，待细胞密度达到80％-90％时，倾出瓶中的培养液，用PBS洗2次；

(II)加入1mL Trizol，轻轻晃动，置于冰上15分钟；

(III)将混匀后溶液移至经DEPC处理的Eppendorf管中，加入200μl氯仿，振荡混匀；

(IV)离心：4℃，12000rpm，15min；

(V)将离心后上清液移至一新Eppendorf管中，加入500μl异丙醇，轻轻混匀，室温静置15min；

(VI)离心：4℃，12000rpm，15min；

(VII)倒掉上清液，加入1ml 75％乙醇，振荡混匀；

(VIII)离心：4℃，7500rpm，5min；

(IX)倒掉上清液，并在超净台中将乙醇挥发干净；

(X)加入40～60μl DEPC H₂O，65℃5min助溶；

(XI)-20℃冷冻保存。

b)总RNA质量检测

(I)NanoDrop测定总RNA浓度(2μl总RNA上样)，

(II)1.5％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，

总体积约为6～8μl

甲醛变性琼脂糖凝胶：30ml 1×TBE缓冲液中加入0.45g琼脂糖，微波炉中加热溶化，轻轻摇动使琼脂糖充分混匀(肉眼观察无颗粒状悬浮物)，冷却至60℃左右时加入600μl甲醛，混匀，倒入RNA专用的制胶器中(7.5×5.5cm)，室温静置30min左右即可使用。

电泳条件：120～130V，15～20min。

c)snoRNA逆转录：

逆转录反应体系参见表1。

表1：逆转录反应体系

总RNA	100ng
		snoRNA反转录引物	1μl(1μM)
DEPC H<sub>2</sub>O至12.3μl
		65℃变性5min，冰浴5min
5×1<sup>st</sup>缓冲液	4μl
		0.1M DTT	2μl
dNTPs	0.5μl(各10mM)
		RNase抑制剂	0.2μl(40U/μl)
M-MLV	1μl(200U/μl)
			共20μl体系

逆转录程序：16℃30min，37℃30min，70℃10min，4℃。

d)snoRNA实时PCR反应

snoRNA实时PCR反应体系参见表2，snoRNA实时PCR程序参见表3.

表2：snoRNA实时PCR反应体系

表3：snoRNA实时PCR程序

酶激活	95℃，10min
			扩增反应	95℃，15s	变性
	60℃，30s	退火、延伸
				74℃，3s	荧光检测
	共40个循环
			溶解曲线	75～95℃

snoRNA实时PCR产物1.5％非变性(不加甲醛)琼脂糖凝胶电泳检测。snoRNA实时PCR产物2～4μl。

2×加样缓冲液4μl

总体积约为6～8μl

非变性琼脂糖凝胶：80ml 1×TBE缓冲液中加入1.2g琼脂糖，微波炉中加热溶化，轻轻摇动使琼脂糖充分混匀(肉眼观察无颗粒状悬浮物)，冷却至60℃左右时加入2μl EB(原液)混匀，倒入制胶器中(15×15cm)，室温静置30min左右即可使用。

电泳条件：100V，25～30min。

(4)细胞侵袭能力分析

原理是根据肿瘤细胞侵袭时具有运动性和方向性的特点。肿瘤细胞接触基质面后会通过一系列机制向某一个方向运动。

a)对于KYSE30和KYSE150细胞，分别稀释基质胶(Matrigel)(BD Biosciences、356234)至500μg/mL，将100μL加在8μm孔聚碳酯膜的transwell小室上室，37℃5％CO2培养箱中孵育1h，吸去水相备用，

b)取转染后48小时，生长状态良好的肿瘤细胞，消化，以一定密度重悬，

c)分别将200μL含有15×10⁴或者10×10⁴个细胞的KYSE30或者KYSE150细胞悬液种植于每个transwell小室上室，向下室中加入800μL含10％血清的培养液，于37℃5％CO2培养箱中培养12小时，

d)取出小室，刮去上层未发生迁移的细胞，

e)以70％的甲醇固定膜上的细胞，15分钟，

f)以0.5％结晶紫(甲醇配制)染色20分钟，蒸馏水清洗，

g)显微镜下计数小室下表面的细胞数，进行统计学分析，同时拍照。

(5)肿瘤细胞迁移分析

原理是根据肿瘤细胞迁移时具有运动性和方向性的特点。肿瘤细胞会通过一系列机制向某一个方向运动。

a)取转染后48小时，生长状态良好的肿瘤细胞，消化，以一定密度重悬，

b)分别将200μL含有15×10⁴或者10×10⁴个细胞的KYSE30或者KYSE150细胞悬液种植于每个transwell小室上室，向下室中加入800μL含10％血清的培养液，于37℃5％CO2培养箱中培养10小时，

c)取出小室，刮去上层未发生迁移的细胞，

d)以70％的甲醇固定膜上的细胞，15分钟，

e)以0.5％结晶紫(甲醇配制)染色20分钟，蒸馏水清洗，

f)显微镜下计数小室下表面的细胞数，进行统计学分析，同时拍照。

(6)细胞增殖能力分析

实时无标记动态细胞分析技术(RTCA，Real Time Cellular Analysis)原理是将微电极阵列整合在细胞培养板的每个细胞生长孔底部，当贴壁生长在微电极表面的细胞引起贴壁电极界面阻抗的改变时，这种改变与细胞的实时功能状态改变呈相关性，通过实时动态的电极阻抗检测可以获得细胞生理功能相关的生物学信息，包括细胞生长、伸展、形态变化、死亡和贴壁等。

a)转染后24小时，生长状态良好的肿瘤细胞，消化，以一定密度重悬

b)以每孔1000个细胞接种于xCELLigence RTCA MP E-plate 96孔板(Roche、5232368001)，以4h为细胞贴壁时间，对得到的生长曲线用RTCA Software 1.2.1进行细胞指数标准化分析细胞的增殖情况。

(7)细胞克隆形成能力分析

转染24h后收集各组细胞，于每皿1000个细胞接种于35mm培养皿中，37℃，5％CO₂孵箱中培养14天，每隔5～6天换液一次，形成肉眼可见的细胞集落。1×PBS漂洗3次，甲醇固定10min，用0.5％结晶紫染色20min，冲洗干燥，照相并统计克隆数。

(8)统计学分析

实验数据采用SPSS10.0软件包(SPSS,Chicago,IL)进行双侧Student’s t检验，p<0.05为差异具有显著性。

结果

(1)用化学合成成熟si snoRNA转染食管鳞癌细胞系低表达目的snoRNA

采用lipofectamine 2000，单独转染时以终浓度为10μM的si snord78 RNA或snoRNA-NC对KYSE30或者KYSE150细胞进行瞬时转染；转染后48小时收集细胞。通过实时PCR检测snord78表达水平。转染之后snord78的表达在KYSE30、KYSE150细胞系中分别相对对照降低了30.8％±0.57％、49.5％±0.55％，结果表明转染之后snord78在KYSE30和KYSE150细胞系中表达水平显著降低，表明转染程序及体系适合进行snoRNA低表达的相应研究。

(2)snord78低表达对KYSE30和KYSE150细胞系的体外侵袭能力的影响

采用Transwell侵袭实验进行肿瘤细胞体外侵袭能力的研究。转染后48小时，将KYSE30或者KYSE150细胞消化，用无血清的RPMI1640重悬，分别以15×10⁴和10×10⁴的数量种植于含100μL基质胶的Transwell小室上室，将800μl含有10％血清的RPMI1640加入小室下室，37℃培养12小时，细胞进入8μm孔聚碳酯膜的下层。0.5％结晶紫染色，在显微镜下可见膜上被染成紫色的细胞(图8A、图8B)，计数聚碳酯膜下表面的细胞数，经过计算转染sisnord78后的KYSE30、KYSE150细胞穿过膜的细胞数分别为对照的61.0％±1.8％，54.0％±1.5％。结果表明，与对照细胞相比，snord78低表达的KYSE30和KYSE150细胞体外侵袭能力明显减弱(图8C、图8D)，经统计学分析，差异具有显著性。

(3)snord78低表达对KYSE30和KYSE150细胞系的体外迁移能力的影响

采用Transwell迁移实验进行肿瘤细胞体外迁移能力的研究。转染后48小时，将KYSE30或者KYSE150细胞消化，用无血清的RPMI1640重悬，分别以15×10⁴和10×10⁴的数量种植于Transwell小室上室，将800μl含有10％血清的RPMI1640加入小室下室，37℃培养10小时，细胞进入8μm孔聚碳酯膜的下层。0.5％结晶紫染色，在显微镜下可见膜上被染成紫色的细胞(图8A、图8B)，计数聚碳酯膜下表面的细胞数，经过计算转染si snord78后的KYSE30、KYSE150细胞穿过膜的细胞数分别为对照的45.0％±0.8％，51.0％±1.9％。结果表明，与对照细胞相比，snord78低表达的KYSE30和KYSE150细胞体外迁移能力明显减弱(图8C，图8D)，经统计学分析，差异具有显著性。

(4)snord78低表达对KYSE30和KYSE150细胞系增殖能力的影响

采用xCELLigence RTCA MP系统进行肿瘤细胞增殖能力的研究。转染后24小时，将KYSE30或者KYSE150细胞消化，用10％血清的RPMI1640重悬，以每孔1000个细胞接种于xCELLigence RTCA MP E-plate 96孔板，以4h为细胞贴壁时间，对得到的生长曲线用RTCASoftware 1.2.1进行细胞指数标准化分析细胞的增殖情况。结果表明，与对照细胞相比，snord78低表达的KYSE30和KYSE150细胞体外增殖能力明显减弱(图9)，经统计学分析，差异具有显著性。

采用种植平板克隆实验进行肿瘤细胞克隆形成能力的研究。转染后24h小时，将KYSE30或者KYSE150细胞消化，用10％血清的RPMI1640重悬，于每皿1000个细胞接种于35mm培养皿中，37℃，5％CO₂孵箱中培养14天，每隔5～6天换液一次，形成肉眼可见的细胞集落。1×PBS漂洗3次，甲醇固定10min，用0.5％结晶紫染色20min，冲洗干燥，照相并统计克隆数(图10A)。经过计算转染si snord78后的KYSE30、KYSE150细胞克隆数分别为对照的62.5％±1.5％，41.8％±0.9％。结果表明，与对照细胞相比，snord78低表达的KYSE30和KYSE150细胞体外克隆形成能力明显减弱(图10B和图10C)，经统计学分析，差异具有显著性。

序列表

<110> 中国医学科学院肿瘤医院

<120> snord78分子在诊断和/或治疗食管鳞癌中的用途

<130> 360105CG

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 65

<212> RNA

<213> 人

<400> 1

guguaaugau guugaucaaa ugucugaccu gaaaugagca uguagacaaa gguaacacug 60

aagaa 65

<210> 2

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(52)

<223> snord78反转录引物

<400> 2

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgactacctt tg 52

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(16)

<223> snord78正义引物

<400> 3

gtgcagggtc cgaggt 16

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(28)

<223> snord78反义引物

<400> 4

gtgtaatgat gttgatcaaa tgtctgac 28

<210> 5

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_RNA

<222> (1)..(19)

<223> si snord78

<400> 5

gaccugaaau gagcaugua 19

Claims (9)

1.snord78分子的抑制剂在制备用于治疗和/或预防受试者中食管鳞癌的药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述snord78分子的抑制剂是降低、抑制、减弱或消除snord78分子表达的分子，优选为核酸分子。

3.根据权利要求2所述的用途，其中所述snord78分子的抑制剂是与snord78序列互补的反义核酸分子，优选是siRNA，优选地，为SEQ ID NO：5所示的siRNA。

4.一种或多种特异地检测受试者样本中snord78分子表达水平的引物和/或探针在制备用于诊断和/或预后食管鳞癌的试剂中的用途。

5.一种或多种特异地检测受试者样本中snord78分子表达水平的引物和/或探针在制备用于诊断食管鳞癌早期淋巴结转移的试剂中的用途。

6.根据权利要求4或5所述的用途，其中所述受试者样本是癌组织样本或血清样本。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的用途，其中所述受试者是哺乳动物，优选是人。

8.一种用于食管鳞癌诊断或预后的试剂盒，其包含用于特异地检测受试者样本中snord78表达水平的引物和/或探针。

9.如权利要求8所述的用于食管鳞癌诊断或预后的试剂盒，其中所述引物是如SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的引物。

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