CN108179194B

CN108179194B - 一种肿瘤分子标志物circBIRC6及其抑制剂和用途

Info

Publication number: CN108179194B
Application number: CN201810179866.1A
Authority: CN
Inventors: 黄剑飞; 李洁莹
Original assignee: Affiliated Hospital of Nantong University
Current assignee: Affiliated Hospital of Nantong University
Priority date: 2018-03-05
Filing date: 2018-03-05
Publication date: 2021-07-09
Anticipated expiration: 2038-03-05
Also published as: CN108179194A; WO2019169710A1

Abstract

本发明公开了一种肿瘤分子标志物circBIRC6及其抑制剂和用途。本发明首先证实circBIRC6基因的存在，通过检测胃癌病人中该基因表达情况，发现其表达水平显著上调。本发明通过应用circBIRC6抑制剂，在细胞水平上成功对人胃癌细胞中的circBIRC6进行敲降，使胃癌细胞的增殖及侵袭迁移能力下降，为胃癌治疗提供有效新方法。本发明系统适用于circBIRC6异常表达的多种癌症。

Description

一种肿瘤分子标志物circBIRC6及其抑制剂和用途

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种肿瘤分子标志物circBIRC6及其抑制剂和用途。

背景技术

胃癌（gastric cancer，GC）是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，据最新发布的世界卫生组织癌控项目统计数据，全世界每年有高达700万的患者死于癌症，其中胃癌患者约占70万。全球每年胃癌的新发病例约934,000，其中我国新发病例约占全球总数的40%（近40万），其发病率和死亡率约是世界平均水平的2倍多。目前临床上胃癌的早期诊断率低于10%，通常被发现时已经是晚期或已经出现转移，约50%-70%的进展期胃癌患者在术后会出现复发，五年生存率低于30%。随着细胞、分子水平对肿瘤发病机制进一步的阐明和分子生物学技术的发展，肿瘤治疗进入了一个全新分子靶向治疗时代。与全身化放疗相比，靶向治疗可以高效、选择性地杀伤肿瘤细胞，减少对正常组织损伤，不良反应小。故探索新的治疗策略及治疗靶点，成为胃癌研究最受关注的领域之一。

人类基因组测序计划完成以后，科学家们研究发现蛋白编码基因在转录组中所占的比重远远低于不编码蛋白的ncRNAs(noncoding RNAs，ncRNAs)，测序结果显示约80%以上的转录产物为ncRNA。最开始大部分的ncRNA被认为是基因组转录的“噪音”，并没有引起研究者的注意。但随着测序技术的发展和研究的深入，越来越多的证据表明ncRNA不仅可作为调节因子在细胞多个水平控制基因的表达、维持端粒的延伸，还可以一定程度上指导分子的修复，在生命活动及疾病发生中发挥重要的生物学功能。目前在人体内被发现具有调控基因表达作用的ncRNA主要包括微小RNA（microRNAs，miRNA），长度>200nt的lncRNAs（longnoncoding RNAs，lncRNAs）和新近发现的环状RNA（Circular RNAs，circRNAs）。circRNA是一类广泛存在于人体细胞中的内源性ncRNA分子，它们可以在转录和转录后水平通过结合miRNA或其他分子并抑制其功能，从而调控基因的表达。目前研究认为circRNA是由特殊的可变剪切产生，其3'和5'末端以共价连接成闭合的环状结构，因此它的结构相对稳定，不易降解，这使其具备了成为一类高效ceRNA的可能性。与其他类型ceRNA相比，circRNA不易被RNase和miRNA降解，且大多数circRNA表达水平很高，单个circRNA分子上可能含有大量MRE，能够瞬间结合或释放大量miRNA，因此，circRNA可以非常高效且稳定地发挥其ceRNA功能。由于circRNA可调节肿瘤细胞的增殖和侵袭，因此其在多种肿瘤的发生发展中发挥了重要的作用，可作为诊断和预测肿瘤生长、侵袭的潜在生物标志物。新近研究证实，hsa_circ_002059在胃癌组织中表达显著下调，其表达水平不仅与胃癌患者的性别、年龄相关，还与其TNM分期及有无远处转移均相关。因此，circRNA可能是胃癌精准诊疗的新靶点。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种肿瘤分子标志物circBIRC6，满足胃癌的使用需求。本发明的另一目的是提供一种circBIRC6基因在制备用于胃癌诊断的试剂中的应用。本发明的还有一目的是提供一种circBIRC6基因的抑制剂及其药物用途。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种肿瘤分子标志物circBIRC6，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的肿瘤分子标志物circBIRC6，为环状RNA，hsa_circ_0053441，定位人类2号染色体32602655～32620661区域，由BIRC6基因转录后经剪切形成。

用于circBIRC6检测的特异性反向PCR引物为：

上游序列为：5’- ATCATCAGCCTGCCTCATCT -3’；

下游序列为：5’- CTGGAGTTTGCAGAGCAGTG-3’。

所述的circBIRC6在制备肿瘤诊断试剂中的应用。

所述肿瘤为circBIRC6异常表达的肿瘤。

所述的circBIRC6的抑制剂，为siRNA 分子，所述siRNA分子的序列如下所示(含overhangs)：

F：5’- GAACCUUGCUAAACCAGGU UU -3’；

R：5’- ACCUGGUUUAGCAAGGUUC UU -3’；

所述的抑制剂在抑制肿瘤中circBIRC6异常表达的应用。

所述的抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。

有益效果：与现有的技术相比，本发明首次证实了一个新的circBIRC6基因的客观存在，通过检测胃癌患者中该基因表达情况，发现其表达水平明显上调，该circBIRC6可作为肿瘤的诊断标记物。为肿瘤精准诊疗提供新的思路。此外通过CCK8法、Transwell小室等技术，在体外试验中研究下调circBIRC6表达对胃癌细胞增殖侵袭等生物学行为的影响，发现特异性的siRNA序列可以有效抑制人胃癌细胞中circBIRC6的表达。circBIRC6是诊疗精准诊疗的一个靶点，在用于制备多种肿瘤（如胃癌、肠癌、乳腺癌等）诊断试剂盒和治疗药物中将具有广泛的应用。

附图说明

图1是胃癌组织和配对的良性切缘组织中环状RNA表达情况的聚类分析图；

图2是circBIRC6基因和内参GAPDH基因的实时定量PCR扩增曲线图；

图3是circBIRC6基因和内参GAPDH基因的实时定量PCR溶解曲线图；

图4是实时荧光定量PCR检测circBIRC6在胃癌及良性切缘组织中的表达图；

图5是siRNA对胃癌细胞中circBIRC6的干扰效率图；

图6是siRNA干扰circBIRC6后胃癌细胞的生长曲线图；

图7是siRNA干扰circBIRC6后胃癌细胞的侵袭迁移能力结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1

1.样本采集及处理

胃癌样本和相应的良性切缘组织取自南通大学附属医院2015年-2016年的胃癌患者。外科手术治疗，切除病变组织。在胃癌病灶和远离病灶部位5cm处分别切取黄豆样大小组织一块，用手术刀切成厚度不超过0.5cm的组织小块，浸泡入1mL RNA later保存液(赛默飞)中，放入-80℃超低温冰箱中备用。每例样本都经过组织病理学证实。

2.二代测序

用6对胃癌患者（按Lauren分型：3例肠型胃癌，3例弥漫性胃癌）的新鲜癌组织和相应的良性粘膜上皮组织（使用Agilent 2200进行质控），通过Hiseq平台的第二代测序(Nextgeneration sequencing，NGS)对这6对样本的基因全转录组进行高通量分析，共鉴定出4262个circRNA，经TMM，Median，DESeq等算法统计之后，有125个fold change >1.5，（差异circRNA聚类分析图见图1））其中，circBIRC6在胃癌中高表达，该circBIRC6基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示，为环状RNA（hsa_circ_0053441），定位人类2号染色体32602655～32620661区域，由BIRC6基因转录后经反向剪切形成。

3.组织RNA提取

（1）取直径0.5cm左右的组织标本，加入1mL的Trizol迅速研磨，尽量研磨完全。（在培养瓶或六孔板中加入1mL的Trizol裂解细胞，收集在EP管中）。（2）将研磨好的混合液瞬时离心。（3）将液体吹打混合，加入200µL氯仿（三氯甲烷，Trizol：氯仿=1:0.2）。（4）盖紧盖子，用力振荡（涡旋振荡）15s，置于冰上静置2-3min。（5）12000r/min，15min，4℃离心，样品分三层（下层：红色有机相蛋白；中间层：DNA；上层：水相RNA）。（统筹安排：期间配置后面要用的75%乙醇，1mL 75%乙醇=750µL无水乙醇+250µL DEPC水）。（6）小心吸取上层液相（约500µL），移入1.5mL离心管。（7）加入500µL异丙醇沉淀RNA（与吸取的上层液相1:1），颠倒混匀，冰上孵育15min。（8）12000r/min，10min，4℃离心，可见管底有胶状沉淀。（9）弃去上清，留胶状沉淀，加入1mL步骤5中配置的75%无水乙醇洗涤，温和震荡，颠倒混匀。（10）7500r/min，10min，4℃离心（统筹安排：期间打开烘箱预热加温至55℃）。（11）弃上清，用吸纸尽量吸去残留液体保留沉淀，盖好盖子准备烘干。（12）打开离心管盖子，放入预热好的烘箱，6-8min，至沉淀变透明。（13）盖好盖子，取出，依次加入30µL DEPC水，充分吹打混匀，盖好盖子置于55℃烘箱，6-8min，得到RNA原液。（14）用紫外分光光度计测量溶液浓度和纯度，A260/A280在1 .8～2 .0范围内可认为总RNA纯度可靠。分装后保存在-80℃冰箱待用。

4.总RNA逆转录

浓度和纯度符合要求的RNA样本才可以用于下一步检测。逆转录反应体系为：5×Reactive Buffer 4μL，OligoDT primer 2μL，dNTPs（10 mM）2μL，RNase inhibitor（20μ/μL）1μL，Reverse Transcriptase（200μ/μL）1μL，Total RNA 根据RNA浓度算的相应体积，RNase-free H₂O 补足至20μL。逆转录试剂盒购于美国赛默飞公司，并按照该试剂盒方法进行。

5.实时荧光定量PCR检测

（1）选取GAPDH做内参以控制样本间的差异。

（2）引物序列如下：

circBIRC6（divergent引物）

F：5’-ATCATCAGCCTGCCTCATCT-3’

R：5’-CTGGAGTTTGCAGAGCAGTG-3’

GAPDH

F：5’-AACGGATTTGGTCGTATTGGG-3’

R：5’-CCTGGAAGATGGTGATGGGAT-3’

实时荧光定量PCR反应体系为：SYBR GreenⅠmix（Rox） 10μL，cDNA 3μL，ForwardPrimer 1μL，Reverse Primer 1μL，RNase-free H₂O 5μL。RNA Master SYBR Green I购于瑞士Roche公司。

（3）体系配置完成后混匀，瞬时离心(注意避光)。反应条件如下：95℃ 10min，95℃15s，58℃ 30s，72℃ 30s。

（4）一个40个循环，通过溶解曲线评估PCR反应的特异性。

（5）最后得到组织样本中circBIRC6和GAPDH表达水平的扩增曲线(图2)和溶解曲线(图3)，从溶解曲线中可以了解到该曲线为较窄的单一峰，没有引物二聚体和杂带的干扰。样本cDNA的Ct 值≤30，RNA(即cDNA)质量合格。

6 .胃癌组织circBIRC6表达水平分析

借助qRT-PCR技术，验证circBIRC6在胃癌组织及其配对良性切缘组织中的表达，发现circBIRC6在胃癌组织中显著高表达(图4)。

实施例2

1.siRNA设计

针对人circBIRC6的siRNA序列及阴性对照siRNA（negative control，NC），由广州伯信公司设计并完成，序列如下：

(含overhangs) circBIRC6的siRNA序列

F：5’- GAACCUUGCUAAACCAGGU UU -3’；

R：5’- ACCUGGUUUAGCAAGGUUC UU -3’；

阴性对照siRNA序列

F：5’- UUCUCCGAACGUGUCACGU dTdT-3’；

R: 5’- ACGUGACACGUUCGGAGAA dTdT-3’。

2.细胞复苏：（1）从-80℃超低温冰箱中取出HS-578T、LCC、MDA-MB-453、MCF-7和MCF-10A细胞的冻存管，放到37℃水浴箱中快速摇动，使细胞在1min内完全解冻。（2）取出冻存管，用酒精消毒后，放入超净台。（3）吸取细胞悬液至15mL的离心管中，添加10mL RPMI-1640或DMEM培养液，混合均匀，1000rpm离心5min。（4）吸去上清液，取2mL含10%胎牛血清的培养液混匀细胞，加到细胞培养瓶中，再添加适量培养液，于37℃，5%CO₂的细胞培养箱中培养，次日更换一次培养液，继续培养。

3.细胞传代培养：（1）紫外灯消毒超净台30分钟，将所需液体提前拿出，待温度升至室温后酒精消毒瓶口放入超净台，打开酒精灯。（2）将长满细胞的培养瓶中的旧培养液弃去，PBS冲洗一遍，加入1mL含0.02%EDTA+0.25%胰酶消化液，消化3～5分钟，显微镜下观察细胞状态，当细胞变圆，间隙变大时，加入5mL含10%胎牛血清的 RPMI-1640或DMEM培养液终止消化，用吸管反复吹打瓶底。（3）将吹散的细胞悬液分装至新的培养瓶，再加入适量培养液，置于37℃，5%CO₂的细胞培养箱中继续培养。

4.细胞计数法：（1）将细胞消化后，制备成细胞悬液，用酒精棉球将盖玻片擦干净，放到细胞计数板上。（2）吹打细胞悬液使其混匀，取10μL轻轻注入盖玻片和计数板的交界处。（3）在显微镜下读取计数板四角大方格的细胞数，细胞压到线时，只计左侧和上方者，不计右侧和下方。

（4）计算：细胞密度（个/mL）＝（4大格细胞数之和/4）×10⁴。

5.细胞冻存：（1）选择对数生长期的细胞，冻存前24h换液。（2）常规消化细胞，制备成细胞悬液，离心1000r/min，5min。（3）吸去上清，加入冻存液，冻存液中细胞的终密度为5×10⁶/mL，轻轻吹打混匀。（4）将细胞悬液分装到无菌的冻存管中，每管1mL。（5）将冻存管封好，标明细胞名称、冻存时间等信息。（6）冻存：4℃放置30min，-20℃放置30min，置于-80℃冰箱中，可保存3个月左右，如长期保存则放入液氮罐。

6.胃癌细胞的培养：（1）按上述复苏方法从-80℃冰箱取出胃癌细胞，37℃快速解冻，吸出细胞悬液，用RPMI-1640培养液漂洗后，低速离心，加入含10%胎牛血清的 RPMI-1640培养液混匀细胞，移入25cm²培养瓶中，37℃，5%CO₂的细胞培养箱中培养。（2）次日更换细胞培养液，继续培养待细胞生长达90%融合后，细胞传代培养。（3）经过几次传代后部分细胞可冻存，部分细胞继续培养，准备试验用。

7.LipofectamineTM3000（购于美国Invitrogen公司）转染siRNA（转染效率的判定）

（1）转染前一天，取对数生长期的胃癌细胞，按4~5×10⁴/孔的密度接种在六孔培养板上，加入2mL含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基。（2）37℃，5%CO₂的细胞培养箱中培养，24h内胃癌细胞融合率达到约70%。（3）以250μlRPMI-1640稀释5μl LipofectamineTM3000，轻轻混匀。（4）室温孵育5min后，混合稀释的siRNA和稀释的LipofectamineTM3000，轻轻混合均匀，在室温下孵育20min，以便允许复合物siRNA-LipofectamineTM3000的形成。（5）6孔板内培养液弃去，PBS洗涤细胞两遍，将混匀的复合物加入到每个包含细胞的孔中，轻轻前后摇动培养板混合，使其充分混匀，每孔加2mL RPMI-1640，放入培养箱。（6）6小时后换液，加入2mL含10%胎牛血清的 RPMI-1640培养基。（7）37℃、5%CO₂培养48小时，至细胞生长到孔板面积约80~90%时收取细胞，通过qRT-PCR检测siRNA序列对胃癌细胞circBIRC6表达情况的干扰效率，结果表明circBIRC6的特异性siRNA可以有效抑制circBIRC6的表达（图5）。

8.细胞增殖实验（CCK-8实验）

（1）消化收集转染后48h的各组细胞，离心待用。（2）用1640完全培养基重悬细胞，将细胞密度调整至30000个/mL。（3）每孔加入100µL细胞悬液，每组设5个复孔，轻轻拍打96孔板，使细胞分布均匀。（4）待细胞贴壁后（约24h），分别在24、48、72、96h加入CCK-8试剂（每孔10µL），轻轻拍打96孔板，放入培养箱1h后取出，在酶标仪上检测450nm下的吸光度值，注意酶标仪的线性范围。（5）用 Graphpad prism统计处理所测数据，绘制折线图（图6），结果显示经siRNA干扰circBIRC6后胃癌细胞的增殖活力下降。

9.细胞迁移与侵袭实验（transwell小室法）

（1）消化收集转染后48h的各组细胞，离心待用。（2）用1640基培重悬细胞，调整细胞密度至5×10⁴/mL。（3）在24孔板中加入600µL的完全培养基，放入小室，充分浸润，取100µL的细胞悬液至加入Transwell小室的上室。（4）做侵袭实验时，提前一天将50µL基质胶（50µL Matrigel基质胶混合于300µL1640基培中）沿小室侧壁加入上室，轻拍24孔板，使其均匀分布于小室底面，不能有气泡，然后放入培养箱第二天用。（5）常规培养48-72h后取出，1×PBS洗2次，4%的多聚甲醛固定20min，1×PBS洗2次。（6）在24孔板中加入500µL的结晶紫染液，放入小室，10min后取出，1×PBS洗2次，倒置小室，用棉签轻轻擦去上室内未穿过去的细胞。（7）用倒置显微镜观察结果（各取5个视野，计算平均数），用Graphpad prism统计处理所测数据，绘制折线图（图7），结果显示经siRNA干扰circBIRC6后胃癌细胞的侵袭迁移能力下降。

序列表

<110> 南通大学附属医院

<120> 一种肿瘤分子标志物circBIRC6及其抑制剂和用途

<130> 100

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 709

<212> DNA

<213> Human

<400> 1

ctaaaccagg tggacaggtg aaatgtcagt atatctctgc tgtggataaa gttatatttg 60

tggatgatta tgcagtaggg tgtaggaagg accttaatgg aatcttgttg ttagacactg 120

ctctgcaaac tccagtttca aagcaggatg atgtggttca gcttgaatta cccgttacag 180

aggcacagca gctcttatca gcatgtttag aaaaggtaga tatttctagt acagagggtt 240

atgatttgtt catcacacag ctcaaagatg gtttaaaaaa tacatctcat gagactgcag 300

caaaccacaa agttgctaag tgggccacag ttacatttca tcttcctcat catgtgttga 360

agtccattgc cagtgccatt gtaaatgaac tcaagaaaat aaatcaaaat gttgctgcct 420

tacctgtggc gtcctcagtg atggacagat tgtcttacct cttacctagt gcacgtccag 480

aactcggagt ggggccaggc cgttctgtag acagatcact gatgtatagt gaagctaaca 540

gacgggagac atttacctca tggcctcatg taggctatag gtgggcacaa ccagatccca 600

tggctcaagc tggattttat catcagcctg cctcatctgg agatgataga gccatgtgtt 660

ttacttgtag tgtatgcctc gtttgttggg aacctactga tgaaccttg 709

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> circBIRC6(divergent引物FArtificial)

<400> 2

atcatcagcc tgcctcatct 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> circBIRC6(divergent引物RArtificial)

<400> 3

ctggagtttg cagagcagtg 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> GAPDH F(Artificial)

<400> 4

aacggatttg gtcgtattgg g 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> GAPDH R(Artificial)

<400> 5

cctggaagat ggtgatggga t 21

Claims

1.一种肿瘤分子标志物circBIRC6在制备用于胃癌诊断试剂中的应用，其特征在于，所述circBIRC6为环状RNA，hsa_circ_0053441，定位人类2号染色体32602655～32620661区域，由BIRC6基因转录后经剪切形成，其cDN A序列如SEQ ID NO.1所示；

用于肿瘤分子标志物circBIRC6检测的特异性反向PCR引物为：

上游序列为：5'- ATCATCAGCCTGCCTCATCT -3' ；

下游序列为：5'- CTGGAGTTTGCAGAGCAGTG-3'。

2.一种权利要求1所述的肿瘤分子标志物circBIRC6的抑制剂，其特征在于，所述抑制剂为siRNA分子，所述siRNA分子的序列如下所示：

F：5'- GAACCUUGCUAAACCAGGU UU -3' ；

R：5'- ACCUGGUUUAGCAAGGUUC UU -3'。

3.权利要求2所述的肿瘤分子标志物circBIRC6的抑制剂在制备抗胃癌药物中的应用。