CN110628911A

CN110628911A - 上皮性卵巢癌的诊治靶标基因及其应用

Info

Publication number: CN110628911A
Application number: CN201910998374.XA
Authority: CN
Inventors: 韩阳阳; 孙晨晨; 李佳莹; 梁建群
Original assignee: Weifang Medical University
Current assignee: Weifang Medical University
Priority date: 2019-10-21
Filing date: 2019-10-21
Publication date: 2019-12-31
Anticipated expiration: 2039-10-21
Also published as: CN110628911B

Abstract

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种上皮性卵巢癌的诊治靶标基因及其应用。本发明研究发现FOXL2在恶性的上皮性卵巢肿瘤中高表达，并且其表达水平与恶性程度正相关，抑制其表达能够显著抑制卵巢癌上皮细胞系SKOV3的增殖，促进其凋亡，说明FOXL2可以作为临床治疗卵巢上皮细胞癌的候选靶标分子，为开展卵巢上皮细胞癌的临床治疗研究提供了实验依据。

Description

上皮性卵巢癌的诊治靶标基因及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种上皮性卵巢癌的诊治靶标基因及其应用。

背景技术

卵巢癌是女性生殖系统常见的三大恶性肿瘤之一，根据不同的细胞起源，可以将其分为上皮细胞癌，间质细胞癌和生殖细胞癌，在临床上，约90％的卵巢癌属于上皮性卵巢癌。2018年新发布的《Global Cancer Statistics》数据表明，在世界范围内新增卵巢癌患者295,414例，死亡184,799例，死亡率高达62.56％，居妇科肿瘤致死率第一位。

上皮性卵巢癌是目前致死率最高的妇科恶性肿瘤，绝大多数患者确诊时已属于中晚期，尽管当前上皮性卵巢癌的手术治疗及联合化疗都取得了很大进步，但中位无进展生存时间仍停留在18个月左右，即使接受了满意的初次肿瘤细胞减灭术和以铂类药物为基础的联合化疗，仍有大约70％的患者在2年内复发。目前临床上为了有效降低上皮性卵巢癌的高复发率和耐药率，常用的治疗方法包括剂量密集型化疗、腹腔化疗、造血干细胞支持的超大剂量化疗等，但这些方法均未能达到理想的治疗效果。近年来，分子靶向药物的基础研究和临床应用研究发展迅速，为卵巢癌的治疗提供了新的策略，但目前仍缺少卵巢癌的发生发展中起关键作用的过程和调控相关过程的关键靶标分子。因此，寻找卵巢上皮细胞癌治疗的关键靶标分子是解决目前卵巢癌治疗瓶颈的关键，具有重要的现实意义。

FOXL2(winged helix/forkhead transcription factor gene 2)是近年来发现的一种转录因子，属于翼状螺旋/叉头转录因子超基因家族成员。FOXL2基因存在于细胞核内，是一个大小为2.7kb的单外显子基因，位于3q23(3号染色体2区3带)区域，包含一个特有的forkhead DNA结构域(该结构域含有101个氨基酸，位于第54-148位残基区域之间)和一个与此分离的多聚丙氨酸肽段(n＝14)。

作为一类转录因子，FOXL2在卵巢生长发育及功能维持方面的重要作用已经毋庸置疑。已经证实的受其直接或间接调控的下游基因包括性别决定相关基因(SOX9)，卵泡生长和激活相关基因(FSHB，FST，KITL，CDKN1B)，排卵相关基因(SERPINE2，HAS2，PTGER2)以及凋亡相关基因(TNF-R1，FAS，TRAIL-R，BCL2A1，FOS)等。此外，前人研究还表明FOXL2与卵巢早衰(Premature Ovarian Failure,POF)密切相关。但目前还未有关于FOXL2作为上皮性卵巢癌治疗的靶标分子的报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种上皮性卵巢癌的诊治靶标基因及其应用。本发明研究发现，FOXL2在卵巢上皮细胞癌病理组织中高表达；FOXL2被敲低后，卵巢上皮细胞癌的生长减慢、迁移降低、凋亡增加，由此确定，FOXL2可以作为上皮性卵巢细胞癌治疗的靶标分子。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供FOXL2基因及其表达产物作为靶标在制备诊断和/或治疗上皮性卵巢癌的药物中的应用。

本发明的第二方面，提供特异性检测FOXL2基因及其表达产物的试剂在制备如下1)-3)任一项产品中的应用；

1)用于诊断上皮性卵巢癌的产品；

2)用于判断上皮性卵巢癌是否转移的产品；

3)用于判断上皮性卵巢癌是否复发的产品。

上述应用中，所述产品采用实时荧光定量PCR、RT-PCR、免疫组化、原位杂交或基因芯片方法检测FOXL2基因及其表达产物。

上述应用中，所述产品包括：基因芯片和试剂盒。

上述应用中，实时荧光定量PCR检测FOXL2基因的产品中含有一对特异性扩增FOXL2基因的引物。

优选的，所述一对特异性扩增FOXL2基因的引物的序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示。

本发明的第三方面，提供抑制和/或干扰FOXL2基因表达的试剂在制备治疗上皮性卵巢癌的药物中的应用。

上述应用中，所述抑制和/或干扰FOXL2基因表达的试剂包括：siRNA、shRNA、miRNA。

优选的，所述siRNA的序列为：

sense：CGAAGUUCCCGUUCUACGATT(SEQ ID NO.3)

anti-sense：UCGUAGAACGGGAACUUCGCG(SEQ ID NO.4)

本发明的有益效果：

本发明研究证实FOXL2在恶性的卵巢肿瘤中高表达，并且其表达水平与恶性程度正相关，首次证实抑制其表达能够显著抑制卵巢癌细胞SKOV3的增殖，促进其凋亡，说明FOXL2可以作为临床治疗卵巢上皮细胞癌的候选靶标分子，为开展卵巢上皮细胞癌的临床治疗研究提供了实验依据。

附图说明

图1为免疫组化检测FOXL2在正常及恶性卵巢组织中的表达水平；FOXL2卵巢肿瘤组织中高表达(A-D)，在正常组织中低表达(E和F)。

图2为培养的卵巢上皮细胞癌细胞系SKOV3的DIC照片；其中，左图10×，右图20×。

图3为RNAi干扰FOXL2的表达后基因表达水平的检测。

图4为RNAi干扰FOXL2的表达后SKOV3细胞的增殖受到显著抑制。

图5为RNAi干扰FOXL2的表达后SKOV3细胞的凋亡显著增加。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分所介绍的，卵巢癌是目前致死率最高的妇科恶性肿瘤，而在临床上，约90％的卵巢癌属于上皮性卵巢癌。近10年来卵巢癌的患病率呈明显上升趋势，而其死亡率并无明显改善，根本原因是没有找到在卵巢癌的发生发展中起关键作用的过程和调控相关过程的关键靶标分子。因此，寻找卵巢上皮细胞癌治疗的关键靶标分子是解决目前卵巢癌治疗瓶颈的关键，具有重要的现实意义。

基于此，本发明的目的是寻找一种能够作为上皮性卵巢细胞癌治疗的靶标分子。本发明首先利用免疫组化技术，证实FOXL2在卵巢上皮细胞癌病理切片中高表达。以卵巢上皮细胞癌细胞系SKOV3为研究材料，利用RNAi技术干扰FOXL2基因的表达，并用细胞生物学技术(MTT、流式细胞术)分别检测了FOXL2 RNAi细胞的生长、迁移和凋亡，证实FOXL2被敲低后，卵巢上皮细胞癌SKOV3的生长减慢、迁移降低、凋亡增加。本发明以卵巢上皮细胞癌的治疗为切入点，成功寻找到FOXL2这一靶标分子，为开展卵巢上皮细胞癌的临床治疗研究提供实验依据。

在本发明的一种实施方案中，所采用的证实FOXL2为卵巢肿瘤的潜在治疗靶标包括以下步骤：

(1)检测FOXL2在卵巢肿瘤中的表达水平

以正常人类卵巢组织为对照，用免疫组化技术检测卵巢恶性肿瘤中FOXL2的表达水平。

(2)RNAi在细胞水平干扰FOXL2的表达

将验证后的FOXL2 siRNA用lipfectamine 3000转染进入卵巢上皮细胞癌SKOV3中，用QPCR及WB检测敲低的效果，选择合适的进行后续实验。

(3)在细胞水平检测FOXL2敲低后细胞的增殖凋亡。

RNAi敲低FOXL2，用MTT、流式细胞术分别检测卵巢上皮细胞癌SKOV3的增殖及凋亡状态。

免疫组化实验及RNAi敲低FOXL2表达后卵巢上皮细胞癌的细胞功能实验，证实FOXL2在恶性的卵巢肿瘤中高表达，并且抑制其表达能够显著抑制卵巢癌细胞SKOV3的增殖，促进其凋亡，说明FOXL2可以作为临床治疗卵巢上皮细胞癌的候选靶标分子。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。

实施例1：免疫组化检测FOXL2在恶性卵巢组织中的表达水平

不同来源的组织切片于60℃下处理30min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ下各10min脱蜡，无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ、95％乙醇、80％乙醇、70％乙醇梯度复水，置于PBS洗3次，2min/次。使用0.1％、PH 7的枸橼酸盐缓冲液加热对切片进行抗原修复，完成后PBS洗2次，3min/次。滴加3％过氧化氢于37℃环境下作用20min，置于PBS洗3次，5min/次。滴加10％BSA于湿盒中室温孵育1h后，弃掉BSA试剂，滴加FOXL2抗体(Abcam：#ab5096)羊抗人一抗试剂(工作浓度1:250)37℃条件下孵育80min，置于PBS洗3次，5min/次。使用山羊二步法检测试剂盒根据使用说明滴加二抗，37℃条件下孵育20min，置于PBS洗3次，3min/次。滴加新鲜配置DAB显色液，镜下观察，终止显色。苏木素染色盐酸酒精分化后，梯度酒精脱色，二甲苯透明。中性树胶封片，显微镜观察结果。

结果见图1，由图1可以看出，FOXL2卵巢肿瘤组织中高表达(A-D)，在正常组织中低表达(E和F)。

实施例2：RNAi干扰FOXL2的表达

(1)细胞系SKOV3的培养

卵巢上皮细胞癌细胞系SKOV3(ATCC，USA)使用含有13％胎牛血清、100U/ml青霉素、100mg/L链霉素的DMEM高糖培养基培养于37℃、5％CO₂条件下无菌CO₂恒温培养箱。每两天更换新鲜培养液，待细胞融合度达到90％，使用0.25％胰蛋白酶进行消化、传代。

卵巢上皮细胞癌SKOV3的DIC照片见图2(左10×，右20×)。

(2)RNAi干扰FOXL2的表达

使用DMEM培养基(含体积分数13％的FBS、1％的双抗)将SKOV 3细胞置于温度37℃、5％CO₂的细胞恒温培养箱中培养，培养24h后换液，弃去不贴壁的细胞，待贴壁细胞融合度达80％～90％后传代培养。将细胞消化后铺于在6孔板，采用脂质体Lipofectamin3000Reagent转染试剂将靶向siRNA(所述靶向siRNA为sense：CGAAGUUCCCGUUCUACGATT；anti-sense：UCGUAGAACGGGAACUUCGCG，所述序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示)。转染入SKOV 3细胞。其中阴性对照为10nm的Negative siRNA，siRNA浓度分别为10nm和30nm，每组设三个重复。

(3)QPCR检测RNAi后FOXL2的表达

(a)RNA提取及cDNA合成

向转染后的六孔板中每孔加入500μl TransZol收集细胞，按照TransZol说明书操作提取细胞总RNA(表1)，按照TransScript All-in-One First-Strand cDNA SynthesisSuperMix for qRNA(One-Step gDNA Removal)反转录试剂盒说明书将细胞总RNA逆转录为cDNA。

表1：RNAi后提取SKOV3细胞RNA质量检测

	Negative	10nM	30nM
				浓度(ng/μl)	115.4	123.6	112.0
A260	2.884	3.090	2.800
				A280	1.311	1.405	1.289
A260/A280	2.200	2.200	2.170

(b)QPCR检测FOXL2的表达显著降低

qPCR反应总体积为20μl，包括7.8μl的Nuclease-free Water，10μl的2×TopGreen qPCR SuperMix，特定的正向引物(qFOXL2-F，如SEQ ID NO.1所示)和反向引物(qFOXL2-R，如SEQ ID NO.2所示)(10μm)各0.4μl，1μl的第一链cDNA以及0.4μl PassiveRefrence Dye染料。使用7500software对qPCR反应条件进行设置:95℃预变性30sec，95℃变性5sec，59.5℃退火30sec，40个循环，每个循环结束后进行荧光信号收集，本实验用2－ΔΔCt来表示样本中基因的表达量，结果见图3。

qFOXL2-F：AAGAGGCTCACGCTGTCCG；(SEQ ID NO.1)

qFOXL2-R：AGTAGTTGCCCTTGCGCTC。(SEQ ID NO.2)

实施例3：RNAi干扰FOXL2后SKOV3细胞生物学功能检测

(1)RNAi干扰FOXL2后卵巢癌细胞增殖显著降低

取对数生长期SKOV3细胞以6×10³/孔的密度铺于96孔板，每孔100μl培养液，于37℃、5％CO₂细胞恒温培养箱中过夜培养，当细胞融合度达70％-80％时，对每组5个复孔进行脂质体转染(FOXL2 siRNA终浓度为10nM或30nM)，同时设置单Lipfectime和转染NegativesiRNA的为阴性对照。转染后继续培养达到24h、48h后，按照10μl/孔分别加入(5mg/L)MTT，37℃、5％CO₂下继续培养4h后吸出上清液，每孔加入二甲基亚砜100μl，微量振荡器振荡约10min，镜下观察甲瓒结晶全部溶解后，使用酶标仪在570nm波长处测定每孔的吸光度(A570值)；结果见图4。

由图4可以看出，RNAi干扰FOXL2表达后，SKOV3增殖受到显著抑制。

(2)RNAi干扰FOXL2后卵巢癌细胞凋亡显著增加

细胞经处理后(FOXL2 siRNA终浓度为10nM或30nM，同时设置单Lipfectime和转染Negative siRNA的为阴性对照)，消化，500×g 4℃离心5min，收集细胞(2×10⁵～10⁶)；加入3ml预冷PBS，500×g，4℃离心5min，收集细胞；加入100μl预冷1×Annexin V BindingBuffer，重悬细胞；加入5μl Annexin V-FITC和5μl lPI，轻轻混匀，室温避光反应15min；加入400μl预冷1×Annexin V Binding Buffer，轻轻混匀，将样品于冰上放置，1h内用流式细胞仪检测并导出，结果见图5。

由图5可以看出，RNAi干扰FOXL2表达后，SKOV3凋亡显著增加。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 潍坊医学院

<120> 上皮性卵巢癌的诊治靶标基因及其应用

<130> 2019

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aagaggctca cgctgtccg 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agtagttgcc cttgcgctc 19

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgaaguuccc guucuacgat t 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ucguagaacg ggaacuucgc g 21

Claims

1.FOXL2基因及其表达产物作为靶标在制备诊断和/或治疗上皮性卵巢癌的药物中的应用。

2.特异性检测FOXL2基因及其表达产物的试剂在制备如下1)-3)任一项产品中的应用；

1)用于诊断上皮性卵巢癌的产品；

2)用于判断上皮性卵巢癌是否转移的产品；

3)用于判断上皮性卵巢癌是否复发的产品。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产品采用实时荧光定量PCR、RT-PCR、免疫组化、原位杂交或基因芯片方法检测FOXL2基因及其表达产物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产品包括：基因芯片和试剂盒。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，实时荧光定量PCR检测FOXL2基因的产品中含有一对特异性扩增FOXL2基因的引物。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述一对特异性扩增FOXL2基因的引物的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

7.抑制和/或干扰FOXL2基因表达的试剂在制备治疗上皮性卵巢癌的药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抑制和/或干扰FOXL2基因表达的试剂包括：siRNA、shRNA或miRNA。