CN113209312B - 一种抑制转录因子mef2c表达的试剂在制备治疗瘢痕疙瘩的药物中的应用 - Google Patents

一种抑制转录因子mef2c表达的试剂在制备治疗瘢痕疙瘩的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种抑制转录因子MEF2C表达的试剂在制备治疗瘢痕疙瘩的药物中的应用，涉及皮肤损伤修复技术领域。本发明通过抑制转录因子MEF2C基因的表达，有效降低瘢痕疙瘩成纤维细胞合成I型胶原蛋白和III型胶原蛋白的表达，减少细胞外基质的沉积、改善瘢痕疙瘩组织。本发明还提供了低MEF2C表达的瘢痕疙瘩成纤维细胞的细胞系以及治疗瘢痕疙瘩的药物。

Description

一种抑制转录因子MEF2C表达的试剂在制备治疗瘢痕疙瘩的 药物中的应用
技术领域
本发明属于皮肤损伤修复技术领域，具体涉及一种抑制转录因子MEF2C表达的试剂在制备治疗瘢痕疙瘩的药物中的应用。
背景技术
瘢痕疙瘩(keloid)是一种与遗传及免疫功能等因素有关的皮肤成纤维细胞异常增生性疾病，它以成纤维细胞过度增殖和胶原为主的细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)成分过度沉积为病理特征，又被认为是一种皮肤良性结缔组织肿瘤。它是创伤、烧伤、感染、痤疮、毛囊炎、耳部打孔或手术伤口等皮肤损伤皮肤损伤后，继发的一种病理性伤口愈合反应。与增生性瘢痕局限在原伤口区域内不同，瘢痕疙瘩病变明显超出原损伤范围，边缘常呈蟹足状，向周围正常组织侵入性生长，自始至终不退化和单纯手术治疗后常发生复发现象。瘢痕疙瘩是人类所特有的疾病，其发病存在种族差异，在黑色和黄色人种中发病率更高，在黄种人群的发病率高达4～16％，尤以青年人多见，存在家族遗传易感性。该病是一种难治性皮肤病，不仅影响患者的外在形象，而且常伴瘙痒和疼痛，严重影响患者的生活质量，若皮肤损伤巨大还有可能对运动功能产生影响。迄今尚无彻底治愈的方法，其治疗主要为对症治疗，尽管治疗方法较多，但都不能达到根治，而且容易复发。因而，阐明瘢痕疙瘩的分子发病机理，针对其发病的特异性环节研究和开发治疗瘢痕疙瘩的新药已成为研究热点。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种抑制转录因子MEF2C表达的试剂在制备治疗瘢痕疙瘩的药物中的应用，以转录因子MEF2C作为瘢痕疙瘩的生物标志物，通过靶向特异抑制瘢痕疙瘩中高表达的转录因子MEF2C，抑制成纤维细胞合成分泌I型胶原细胞外基质和III型胶原细胞外基质，以及控制MEF2C所调控的下游靶基因，达到控制和治疗瘢痕疙瘩的目标。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种抑制转录因子MEF2C表达的试剂在制备治疗瘢痕疙瘩的药物中的应用。
优选的，所述抑制转录因子MEF2C表达的试剂包括双链MEF2C的干扰RNA或携带干扰MEF2C表达的干扰基因慢病毒。
优选的，利用所述双链MEF2C的干扰RNA，以瞬时转染方法抑制瘢痕疙瘩细胞的靶基因MEF2C表达和抑制MEF2C蛋白表达。
优选的，所述双链MEF2C的干扰RNA的核苷酸序列包括MEF2C siRNA-1或MEF2CsiRNA-2；所述MEF2C siRNA-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述MEF2C siRNA-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选的，利用所述携带干扰MEF2C表达的干扰基因慢病毒，以稳定转染方法抑制瘢痕疙瘩细胞的靶基因MEF2C表达和抑制MEF2C蛋白表达。
优选的，所述瘢痕疙瘩细胞包括瘢痕疙瘩成纤维细胞。
本发明还提供了一种低表达MEF2C的瘢痕疙瘩成纤维细胞的细胞系。
本发明还提供了上述细胞系的构建方法，向瘢痕疙瘩成纤维细胞中导入重组表达载体，所述重组表达载体的序列中包含双链MEF2C的干扰RNA；所述双链MEF2C的干扰RNA的核苷酸序列包括MEF2C siRNA-1或MEF2C siRNA-2；所述MEF2C siRNA-1的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，所述MEF2C siRNA-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选的，所述重组表达载体包括质粒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒。
本发明还提供了一种治疗瘢痕疙瘩的药物，所述药物的有效成分包括抑制转录因子MEF2C表达的试剂。
本发明提供了一种抑制转录因子MEF2C表达的试剂在制备治疗瘢痕疙瘩的药物中的应用，通过抑制转录因子MEF2C基因的表达，有效降低瘢痕疙瘩成纤维细胞合成I型胶原蛋白和III型胶原蛋白的表达，减少细胞外基质的沉积、改善瘢痕疙瘩组织。
在本发明中，当抑制MEF2C基因的表达后，低表达MEF2C瘢痕疙瘩成纤维细胞可抑制成纤维细胞合成分泌I型胶原蛋白和II型胶原蛋白等细胞外基质以及控制MEF2C所调控的下游靶基因，有效抑制和控制瘢痕疙瘩成纤维细胞的特性，达到控制和治疗瘢痕疙瘩的治疗效果。在本发明实施例中，利用siRNA(MEF2C siRNA-1或MEF2C siRNA-2)能够促进瘢痕疙瘩成纤维细胞中MEF2C低表达指的是成纤维细胞中MEF2C的mRNA表达量至少降低50％，从而减少瘢痕疙瘩中胶原蛋白的含量，达到减少瘢痕疙瘩体积的治疗目的。
附图说明
图1显示与正常皮肤组织相比，瘢痕疙瘩组织强阳性表达MEF2C蛋白，其中A为正常皮肤和瘢痕疙瘩MEF2C免疫组织化学染色图，B为免疫化学染色结果定量分析；
图2显示与正常皮肤组织相比，瘢痕疙瘩组织显著高表达MEF2C蛋白，其中A为Western blot分析正常皮肤和瘢痕疙瘩组织MEF2C蛋白表达，B为定量分析Western blot结果；
图3显示与正常皮肤成纤维细胞相比，瘢痕疙瘩成纤维细胞铺展、体积大和形态不规则，其中左侧图为低倍镜图(100×)，右侧为高倍镜图(200×)；
图4显示与正常皮肤成纤维细胞相比，瘢痕疙瘩成纤维细胞高表达MEF2C(红色)且位于细胞核(DAPI，蓝色)中，其中A为细胞免疫双荧光染色观察瘢痕疙瘩成纤维细胞MEF2C表达图，B为MEF2C阳性率定量分析图；
图5示与正常成纤维细胞相比，瘢痕疙瘩成纤维细胞高表达MEF2C、Collagen I和Collagen III的mRNA，其中A为MEF2C、Collagen I和Collagen III的mRNA RT-PCR电泳图，B为电泳结果半定量分析图；
图6显示5ng/ml、10ng/ml和20ng/ml的TGF-β1均显著提高瘢痕疙瘩成纤维细胞MEF2C、Collagen I和Collagen III蛋白表达，其中A为Western blot分析不同浓度TGF-β1对瘢痕疙瘩成纤维细胞MEF2C等蛋白表达的影响，B、C和D分别为MEF2C、Collagen I和Collagen III蛋白在不同浓度TGF-β1刺激下表达量的变化定量分析结果；
图7显示3种MEF2C siRNA均对MEF2C有干扰效果，但其中MEF2C siRNA-1和MEF2CsiRNA-2对抑制Collagen I和Collagen III蛋白表达的效果最为显著，其中A为Westernblot分析siRNA干扰瘢痕疙瘩成纤维细胞MEF2C蛋白后对Collagen I和Collagen III蛋白表达的影响；B、C和D分别为3种MEF2C的siRNA对MEF2C、Collagen I和Collagen III蛋白表达的影响。
具体实施方式
本发明提供了一种抑制转录因子MEF2C表达的试剂在制备治疗瘢痕疙瘩的药物中的应用。
本发明所述抑制转录因子MEF2C表达的试剂优选包括双链MEF2C的干扰RNA或携带干扰MEF2C表达的干扰基因慢病毒。在本发明中，利用所述双链MEF2C的干扰RNA，优选以瞬时转染方法抑制瘢痕疙瘩细胞的靶基因MEF2C表达和抑制MEF2C蛋白表达；且所述双链MEF2C的干扰RNA的核苷酸序列优选包括MEF2C siRNA-1或MEF2C siRNA-2；所述MEF2CsiRNA-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示(5’-CATGCGACTTTCTGAAGGA-3’)，所述MEF2CsiRNA-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示(5’-GCTGTAGCAGTTCGTACGA-3’)。
在本发明中，瘢痕疙瘩主要组成细胞成纤维细胞高表达MEF2C，应用上述干扰RNA干扰后，可显著抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞MEF2C的表达量，减少瘢痕疙瘩中胶原蛋白的含量，达到减少瘢痕疙瘩体积的治疗目的。本发明对所述瞬时转染的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规瞬时转染方法即可。
本发明利用所述携带干扰MEF2C表达的干扰基因慢病毒，优选以稳定转染方法抑制瘢痕疙瘩细胞的靶基因MEF2C表达和抑制MEF2C蛋白表达。本发明所述瘢痕疙瘩细胞包括瘢痕疙瘩成纤维细胞。
本发明还提供了一种低表达MEF2C的瘢痕疙瘩成纤维细胞的细胞系。本发明利用上述双链MEF2C的干扰RNA或携带干扰MEF2C表达的干扰基因慢病毒或其它病毒抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的靶基因MEF2C表达后，能够获得一种低表达MEF2C的瘢痕疙瘩成纤维细胞。本发明所述细胞系降低了成纤维细胞中MEF2C的表达水平，改造瘢痕疙瘩成纤维细胞的细胞学特性，降低了细胞外基质相关基因(Collagen I和Collagen III)表达，同时还能抑制胶原的过度合成，可达到治疗瘢痕疙瘩的目的。
本发明还提供了上述细胞系的构建方法，向瘢痕疙瘩成纤维细胞中导入重组表达载体，所述重组表达载体的序列中包含双链MEF2C的干扰RNA；所述双链MEF2C的干扰RNA的核苷酸序列包括MEF2C siRNA-1或MEF2C siRNA-2；所述MEF2C siRNA-1的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，所述MEF2C siRNA-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明对所述重组表达载体的类型并没有特殊限定，采用任何能够将siRNA或核苷酸序列导入到载体的类型均可，优选包括质粒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒。本发明对所述重组表达载体的构建方法并没有特殊限定，利用本领域的常规构建方法即可。
本发明还提供了一种治疗瘢痕疙瘩的药物，所述药物的有效成分包括抑制转录因子MEF2C表达的试剂。本发明所述抑制转录因子MEF2C表达的试剂优选与上述相同，在此不再赘述。本发明所述药物的剂型优选包括针剂、注射剂或皮肤贴膜剂。
本发明还提供了一种治疗瘢痕疙瘩的方法，将抑制转录因子MEF2C表达的试剂(有效成分为双链MEF2C的干扰RNA)，通过皮下注射、静脉注射或皮肤贴膜的形式使瘢痕疙瘩部位吸收所述试剂，从而起到治疗瘢痕疙瘩的目的。
下面结合实施例对本发明提供的一种抑制转录因子MEF2C表达的试剂在制备治疗瘢痕疙瘩的药物中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
人体瘢痕疙瘩组织中MEF2C蛋白的差异性表达
1.1收集20例瘢痕疙瘩组织样本，包括前胸后背的瘢痕疙瘩10例，耳部瘢痕疙瘩10例。瘢痕疙瘩组织样本均来自吉林大学中日联谊医院皮肤科。所获取的组织经福尔马林固定制作蜡块组织标本及组织切片，进行组织免疫化学染色。
免疫组化方法：步骤4-5，8-9使用UltraSensitiveTM SP(Mouse/Rabbit)IHC免疫组织化学试剂盒(迈新生物技术开发有限公司，KIT-9710)，按说明书进行。
(1)石蜡组织切片厚度4μm；
(2)按常规步骤切片脱蜡水化；
(3)采用高温高压法组织抗原修复；
(4)用3％过氧化氢阻断内源性过氧化物酶；
(5)10％BSA封闭；
(6)加一抗(MEF2C，1:200，Abcam)；
(7)4℃冰箱过夜反应；
(8)与辣根酶标羊抗小鼠/兔IgG聚合物反应；
(9)DAB显色；
(10)苏木素复染，透明；
(11)中性树胶封片；
(12)拍照分析结果。
免疫组织化学染色中，瘢痕疙瘩组织均高表达MEF2C，与正常皮肤组织相比均有统计学意义(图1)。
1.2从人体瘢痕组织中提取蛋白质，Western Blot方法比较分析正常皮肤组织和瘢痕疙瘩组织中MEF2C蛋白的表达
按常规Western Blot方法进行，步骤简述：(1)提取蛋白：组织置于碾磨器中，倒入适当液氮，进行碾磨。按照PMSF：RIPA＝1:100的比例配置裂解液，黏膜组织中加入300～500μl裂解液，置于冰上充分裂解；冰上裂解30min；将低温离心机提前预冷，将收集的液体置于离心机中，12000rmp，4℃，离心15min；收集上清于EP管中，-80℃保存。
(2)BCA方法绘制标准蛋白曲线，测蛋白浓度。
(3)配胶：按常规配方配分离胶(浓度10％，10ml)和浓缩胶(5％浓度，3ml)。
(4)蛋白上样：蛋白样品中加入5×蛋白上样缓冲液，煮沸5min后，每孔上样40μg蛋白。
(5)进行蛋白质电泳浓缩、分离和转模，转模后用5％脱脂奶粉封闭。
(6)一抗孵育：MEF2C(1：2000，Abcam)，Collagen I(1:5000，Abcam)，Collagen III(1:5000，Abcam)，4℃过夜。
(7)二抗孵育：将二抗(1:5000，山羊抗兔Ig G-HRP抗体，中国北京中杉金桥生物有限公司)稀释后，与膜共同孵育显色，最后ECL显色液反应显色，在凝胶图像分析仪拍照。
结果显示与正常组织相比瘢痕组织显著高表达MEF2C蛋白(P＜0.01)(图2)。
实施例2
2.1分离培养患者瘢痕疙瘩成纤维细胞
瘢痕疙瘩成纤维细胞和正常皮肤成纤维细胞的分离培养釆用I型胶原酶消化法。大体步骤如下：
(1)手术中切下的瘢痕疙瘩或正常皮肤组织置入含有无菌缓冲液的离心管中，反复漂洗3～5次，至液体清亮为止。对于直径大于2cm的瘢痕疙瘩组织，仅留取距离瘢痕边缘0.5cm以内的边缘部位组织用于细胞培养。
(2)组织移至无菌培养皿中，用眼科剪去除皮下脂肪组织。将瘢痕疙瘩的部分真皮深层切除(约占整个真皮层的1/4)，正常皮肤的真皮层则全层保留。
(3)组织切成宽约1～2mm的皮条，加入0.2％中性蛋白酶溶液，4℃消化过夜。
过夜后，用眼科镊将表皮层和真皮层撕开，接着将真皮层反复剪切至泥状，加入10体积的0.2％I型胶原酶溶液，37℃摇床消化3～5小时，至大的组织块消失。
(4)入等量完全培养基终止消化，用吸管上下反复吹吸，以使夹裹在未彻底消化的纤维中的细胞游离。将上述液体用80目滤网过滤，滤掉未彻底消化组织。
(5)过滤液1200g，离心5min。弃上清，保留沉淀，并加入完全培养基重悬细胞。细胞计数后按1×105个/ml的密度接种细胞至培养瓶中，置入37℃含有5％CO2的培养箱中培养。5天后首次换液，以后每天换一次液。如无特殊说明，使用完全培养基培养细胞，细胞长至完全融合后用胰蛋白酶溶液消化，按1：2传代。
(6)细胞传至第3代时，进行各种检测和处理。通过倒置相差显微镜鉴定瘢痕疙瘩成纤维细胞的形态。
倒置相差显微镜显示的瘢痕疙瘩成纤维细胞形态，该细胞形态肥大，体积明显大于正常的成纤维细胞(图3)。细胞免疫荧光鉴定结果显示分离培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞细胞核中显著高表达MEF2C(图4)。
2.2对比瘢痕疙瘩成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞中的MEF2C的mRNA表达水平
通过RNA提取试剂盒提取瘢痕疙瘩成纤维细胞、正常皮肤成纤维细胞的总RNA，反转录为cDNA，通过PCR检测各组成纤维细胞的MEF2C、Collagen I和Collagen III的mRNA表达。
通过RNA提取试剂盒提取成纤维细胞(瘢痕疙瘩成纤维细胞，正常皮肤成纤维细胞)的总RNA，逆转录为cDNA，逆转录体系为：500ng总RNA，1μl寡聚胸腺嘧啶18引物(Anchored Oligo(dT)18primer)(0.5μg/μl)，10μl 2×TS反应混合液(TS Reaction Mix)，1μl转运酶混合物(ransScript RT/RI Enzyme Mix)T以及1μl gDNA去除剂(gDNARemover)，用双蒸水将体系补充至20μl。逆转录反应温度设定为：42℃反应15分钟，85℃反应5分钟，停止反应逐渐降温至4℃。
通过PCR检测各组MEF2C、CollagenI和Collagen III的表达，所用引物均由上海生物工程有限公司合成提供。引物序列如下：
MEF2C-R(SEQ ID NO.3)：5’-CGAGATGCCAGTCTCCATCC-3’，
MEF2C-F(SEQ ID NO.4)：5’-AGCAGACCTGGTGAGTTTCG-3’；
Collagen I-R(SEQ ID NO.5)：5’-GGTGGTGGTTATGACTTTGG-3’，
Collagen I-F(SEQ ID NO.6)：5’-GTTCTTGGCTGGGATGTTTT-3’；
Collage III-R(SEQ ID NO.7)：5’-GCTCTGCTTCATCCCACTATTA-3’，
Collage III-F(SEQ ID NO.8)：5:’-TGCGAGTCCTCCTACTGCTAC-3’；
GAPDH-R(SEQ ID NO.9)：5’-CGCTCTCTGCTCCTCCTGTT-3’，
GAPDH-F(SEQ ID NO.10)：5’-CCATGGTGTCTGAGCGATGT-3’。
反应体系为：10μl绿色主混合聚合酶(
Figure BDA0003051846800000091
Green Master Mix 2×)，0.5μl上游引物(upstream primer，10μM)，0.5ul下游引物(downstream primer，10μM)，1000ngcDNA，用双蒸水将体系补充至25μl。反应温度设定为：95℃预变性反应2分钟，然后以95℃变性反应30秒、56℃复性反应30秒、72℃延伸反应30秒为一个循环共反应30～40个循环。
第一代或第二代瘢痕疙瘩成纤维细胞及正常皮肤成纤维细胞中提取蛋白及mRNA，发现瘢痕疙瘩成纤维细胞与正常组织相比较均显著高表达MEF2C、Collagen I和CollagenIII的mRNA和相应蛋白(P＜0.01)(图5)。
实施例3
TGF-β1刺激后，瘢痕疙瘩成纤维细胞上调MEF2C、Collagen I和Collagen III蛋白的表达。
用收集到的第2代至第4代瘢痕疙瘩成纤维细胞，观察TGF-β1对瘢痕疙瘩成纤维细胞MEF2C、Collagen I和Collagen III蛋白表达的影响。TGF-β1处理浓度分别为1ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml和20ng/ml。Western blot步骤参考实施实例2。
结果如图6所示，瘢痕疙瘩成纤维细胞的MEF2C、Collagen I和Collagen III的蛋白水平，在TGF-β1诱导下呈不同程度的增高，而且在TGF-β1 5ng/ml的时候改变最明显(P＜0.01)。实验结果表明TGF-β1促进瘢痕疙瘩成纤维细胞MEF2C、Collagen I和Collagen III蛋白的合成。
实施例4
siRNA转染瘢痕疙瘩成纤维细胞分析MEF2C siRNA对成纤维细胞Collagen I和Collagen Ⅲ蛋白表达的影响。
所述有效的MEF2C的siRNA为：MEF2C siRNA-1(SEQ ID NO.1)：5’-CATGCGACTTTCTGAAGGA-3’，
MEF2C siRNA-2(SEQ ID NO.2)：5’-GCTGTAGCAGTTCGTACGA-3’，
MEF2C siRNA-3(SEQ ID NO.11)：5’-CGTAGCAACTCCTACTTTA-3’。此siRNA由广州市锐博生物科技有限公司委托合成产品编号为stB0007066A、stB0007066B和stB0007066C。
转染步骤：1.siRNA的转染浓度：MEF2C siRNA转染浓度是50nM。
2.使用lipofectamine2000(lipo2000，Invitrogen)转染：(1)转染前一天，接种5×104个/ml细胞至细胞培养板中，使转染时的细胞密度能够达到30～50％。
(2)对于每个转染样品，按如下步骤准备siRNA-lipo2000混和液：a.稀释转染试剂lipo2000：使用前，将lipo2000转染试剂轻轻摇匀，然后取适量，用不含血清的优化培养基(Opti-MEMI)稀释，轻轻混和，室温孵育5min；b.稀释siRNA：用不含血清的Opti-MEMI稀释siRNA，轻轻混和；c.稀释好的lipo2000经过5min的孵育后，将之与上述(b)稀释好的siRNA轻轻混和，室温培养20min以形成siRNA-lipo2000混和液，溶液可能会有浑浊，不过不会影响转染。
(3)将siRNA-lipo2000混和液加入含有细胞以及培养液的细胞培养板中，轻轻摇晃，使之混和。
(4)将培养板置于37℃的CO2培养箱中培养至检测时间(24～48h)。
(5)蛋白水平的检测。
结果如图7所示，显示MEF2C siRNA-1和MEF2C siRNA-2均对瘢痕疙瘩成纤维细胞的细胞外基质Collagen I和Collagen III蛋白表达有不同程度的抑制作用，尤其MEF2CsiRNA-2抑制作用更显著(P＜0.01)。
由以上实施例可知，瘢痕疙瘩主要组成细胞成纤维细胞高表达MEF2C，应用MEF2C的siRNA干扰显著抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞MEF2C的表达量，可以减少瘢痕疙瘩中胶原蛋白的含量，达到减少瘢痕疙瘩体积的治疗目的。结果说明，利用siRNA等通过干扰MEF2C蛋白表达可以抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞胶原蛋白的合成，获得有效促进瘢痕疙瘩治疗效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 吉林大学
<120> 一种抑制转录因子MEF2C表达的试剂在制备治疗瘢痕疙瘩的药物中的应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
catgcgactt tctgaagga 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
gctgtagcag ttcgtacga 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
cgagatgcca gtctccatcc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
agcagacctg gtgagtttcg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
ggtggtggtt atgactttgg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 6
gttcttggct gggatgtttt 20
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 7
gctctgcttc atcccactat ta 22
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 8
tgcgagtcct cctactgcta c 21
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 9
cgctctctgc tcctcctgtt 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 10
ccatggtgtc tgagcgatgt 20
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 11
cgtagcaact cctacttta 19

Claims (10)

1.一种抑制转录因子MEF2C表达的试剂在制备治疗瘢痕疙瘩的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述抑制转录因子MEF2C表达的试剂包括双链MEF2C的干扰RNA或携带干扰MEF2C表达的干扰基因慢病毒。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，利用所述双链MEF2C的干扰RNA，以瞬时转染方法抑制瘢痕疙瘩细胞的靶基因MEF2C表达和抑制MEF2C蛋白表达。
4.根据权利要求2或3所述应用，其特征在于，所述双链MEF2C的干扰RNA包括MEF2CsiRNA-1或MEF2C siRNA-2；所述MEF2C siRNA-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述MEF2C siRNA-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.根据权利要求2所述应用，其特征在于，利用所述携带干扰MEF2C表达的干扰基因慢病毒，以稳定转染方法抑制瘢痕疙瘩细胞的靶基因MEF2C表达和抑制MEF2C蛋白表达。
6.根据权利要求3或5所述应用，其特征在于，所述瘢痕疙瘩细胞包括瘢痕疙瘩成纤维细胞。
7.一种低表达MEF2C的瘢痕疙瘩成纤维细胞系。
8.权利要求7所述成纤维细胞系的构建方法，其特征在于，向瘢痕疙瘩成纤维细胞中导入重组表达载体，所述重组表达载体的序列中包含双链MEF2C的干扰RNA；所述双链MEF2C的干扰RNA包括MEF2C siRNA-1或MEF2C siRNA-2；所述MEF2C siRNA-1的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述MEF2C siRNA-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
9.根据权利要求8所述构建方法，其特征在于，所述重组表达载体包括质粒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒。
10.一种治疗瘢痕疙瘩的药物，其特征在于，所述药物的有效成分包括抑制转录因子MEF2C表达的试剂。
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