CN107663539B - 环状RNA circ-PTGR1的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了环状RNA circ‑PTGR1的用途，本发明首先证实了环状RNA circ‑PTGR1的客观存在；通过检测肝癌病人血清外泌体中环状RNA circ‑PTGR1表达情况，发现其表达水平上调；收集肝癌细胞系LM3分泌的外泌体与对照组PBS分别加至肝癌细胞系97L和HepG2中，其细胞迁移、细胞侵袭能力均显著升高；干扰circPTGR1能拮抗LM3外泌体对低转移细胞迁移、侵袭能力的促进作用。环状RNA circ‑PTGR1基因及其表达产物作为诊断肝癌的标志物，使肝癌诊断更加准确、快速，作为制备治疗肝癌药物的靶基因为治疗肝癌提供了新的治疗靶点和治疗途径。

Description

环状RNA circ-PTGR1的用途
技术领域
本发明涉及一种环状RNA，具体涉及环状RNA circ-PTGR1的用途。
背景技术
原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC，以下简称肝癌)是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一。全球每年约有74万患者被新诊断为肝细胞癌，同时约有69万患者死于肝癌。其中我国占到了全球每年新发病例的55％，成为全世界肝癌最高的地区之一。
环状RNA(circular RNA，circRNA)是区别于传统线性RNA的RNA家族新成员，是不具有5’末端帽子和3’末端poly(A)尾巴、并以共价键形成环形结构的非编码RNA分子。最新研究表明circRNA具有闭合环状结构，主要通过非典型可变剪切加工产生，广泛存在于各种生物细胞中，具有结构稳定，难以被RNase R酶降解、表达丰度高、物种间保守性好、表达具有组织及时空特异性等特征，这些特点使得circRNA在新型疾病诊断与治疗方法的开发应用上具有广阔的前景。
外泌体(exosome)是脂质双分子层膜性囊泡，是由活细胞内多泡体(multivesicular body，MVB)与细胞膜融合后释放到细胞外隙或生物体液中，大小介于30～100nm之间，包含有蛋白质、RNA、microRNA和DNA片段等多种成分，可以调节受体细胞行为，可作为生物标志物用于诊断人类疾病。外泌体在外周血、尿液、唾液、腹水、羊水等体液中具有很高的丰度。复旦大学肿瘤研究所的黄胜林及何祥火课题组首次发现了外泌体内含有大量circRNA，外泌体中的circRNA比外泌体来源细胞中的circRNA丰富得多。血清外泌体也含有大量完整稳定的circRNA，并且结直肠癌病人血清外泌体中的circRNA与正常人差异明显，肿瘤来源的exo-circRNA有望成为癌症检测的潜在生物标志物。肿瘤来源或肿瘤相关的外泌体是调控肿瘤发生发展的重要机制，对肿瘤外泌体的分析和检测可以辅助肿瘤的早期诊断、疗效评价和预后分析。
circ-PTGR1a(CircBase ID：hsa_circ_0003731)其在基因组上的定位为：chr9:114341075-114348445，相应的线性基因为PTGR1(NM_001146108)，环化序列有442个碱基，包含PTGR1基因的第五、第六和第七个外显子。circ-PTGR1b(CircBase ID：hsa_circ_0008043)其在基因组上的定位为：chr9:114332370-114348445，相应的线性基因为PTGR1(NM_001146108)，环化序列有670个碱基，包含PTGR1基因的第五、第六、第七、第八和第九个外显子。circ-PTGR1c(CircBase ID：hsa_circ_0088030)，其在基因组上的定位为：chr9:114337013-114348445，相应的线性基因为PTGR1(NM_001146108)，环化序列有643个碱基，包含PTGR1基因的第五、第六、第七和第八个外显子。有报道PTGR1在肝癌中表达上调。
发明内容
本发明的目的在于根据发明人对由PTGR1基因表达的3个环状RNA circ-PTGR1(hsa_circ_0003731、hsa_circ_0008043、hsa_circ_0088030)在人肝癌细胞中的表达及对肝癌细胞生物功能的调节作用的研究，提供基于环状RNA circ-PTGR1(hsa_circ_0003731、hsa_circ_0008043、hsa_circ_0088030)基因及其表达产物在肝癌的诊断和治疗方面的用途。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案：
一种肝癌诊断试剂盒，所述肝癌诊断试剂盒包括检测环状RNA circ-PTGR1的试剂，所述环状RNA circ-PTGR1包括CircBase ID为hsa_circ_0003731的环状RNA、CircBaseID为hsa_circ_0008043的环状RNA和CircBase ID为hsa_circ_0088030的环状RNA中的至少一种。
环状RNA hsa_circ_0003731的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，环状RNA hsa_circ_0008043的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，环状RNA hsa_circ_0088030的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
作为本发明所述的肝癌诊断试剂盒的优选实施方式，所述试剂包括扩增环状RNAcirc-PTGR1的引物。
作为本发明所述的肝癌诊断试剂盒的优选实施方式，所述引物包括由如SEQ IDNO:4和SED ID NO:5所示的DNA序列组成的引物对、由如SEQ ID NO:6和SED ID NO:7所示的DNA序列组成的引物对、由如SEQ ID NO:8和SED ID NO:9所示的DNA序列组成的引物对、以及由如SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示的DNA序列组成的引物对中的至少一种。
本发明还提供了一种治疗肝癌的药物组合物，所述药物组合物包括抑制或阻止肝癌细胞系分泌外泌体的试剂。
本发明还提供了一种治疗肝癌的药物组合物，所述药物组合物包括抑制或阻止circ-PTGR1基因表达的试剂，或者与circ-PTGR1基因表达产物结合，使circ-PTGR1基因表达产物失去活性的试剂；
所述circ-PTGR1基因包括circ-PTGR1a基因、circ-PTGR1b基因和circ-PTGR1c基因中的至少一种。
circ-PTGR1a的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，circ-PTGR1b的核苷酸序列如SEQID NO:2所示，circ-PTGR1c的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
作为本发明所述的药物组合物的优选实施方式，所述试剂包括用于沉默circ-PTGR1基因表达的shRNA或siRNA。
作为本发明所述的药物组合物的优选实施方式，所述shRNA的核苷酸序列如SEQID NO:18所示。
本发明还提供了环状RNA circ-PTGR1在制备肝癌诊断试剂盒的用途，所述环状RNA circ-PTGR1的CircBase ID为hsa_circ_0003731、hsa_circ_0008043或hsa_circ_0088030。
本发明还提供了肝癌细胞系分泌的外泌体作为靶点在制备治疗肝癌的药物中的用途。
本发明还提供了circ-PTGR1基因及其表达产物作为靶点在制备治疗肝癌的药物中的用途，所述circ-PTGR1基因包括circ-PTGR1a基因、circ-PTGR1b基因和circ-PTGR1c基因中的至少一种。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明首先设计特异的环状RNA引物进行RT-PCR、一代测序实验证实circ-PTGR1基因的客观存在；
(2)本发明通过检测肝癌病人血清外泌体中circ-PTGR1(hsa_circ_0003731、hsa_circ_0008043、hsa_circ_0088030)基因表达情况，发现其表达水平上调，因此，可以作为肝癌的诊断标志；
(3)本发明对肝癌细胞系LM3分泌的外泌体进行体外细胞功能学的研究，通过将提取的肝癌细胞系LM3分泌的外泌体与对照组PBS加分别加至肝癌细胞系97L和HepG2中，发现其细胞迁移、细胞侵袭能力均显著升高，因此，肝癌细胞系分泌的外泌体可以作为肝癌的治疗靶点；
(4)本发明对肝癌细胞系外泌体的circ-PTGR1(hsa_circ_0003731、hsa_circ_0008043、hsa_circ_0088030)基因进行体外细胞功能学的研究，通过将同时干扰hsa_circ_0003731、hsa_circ_0008043、hsa_circ_0088030及相应的线性基因PTGR1的基因序列特异性shRNA转染到LM3肝癌细胞系，以建立该基因表达下调的细胞株；提取LM3-shcirc-PTGR1细胞稳定株及转染了空载的对照细胞株分泌的外泌体分别加至低转移肝癌细胞系97L和HepG2细胞中，发现干扰circ-PTGR1能拮抗LM3外泌体对低转移细胞迁移、侵袭能力的促进作用。circ-PTGR1(hsa_circ_0003731、hsa_circ_0008043、hsa_circ_0088030)基因及其表达产物可以应用在制备治疗肝癌的药物中。
circ-PTGR1(hsa_circ_0003731、hsa_circ_0008043、hsa_circ_0088030)基因及其表达产物作为诊断肝癌的标志物，使肝癌诊断更加准确、快速、作为制备治疗肝癌药物的靶基因为治疗肝癌提供了新的治疗靶点和治疗途径。
附图说明
图1为本发明实施例1中circ-PTGR1(hsa_circ_0003731、hsa_circ_0008043、hsa_circ_0088030)的结构示意图。
图2为本发明实施例1中circ-PTGR1(hsa_circ_0003731、hsa_circ_0008043、hsa_circ_0088030)基因表达产物的琼脂糖凝胶电泳图。
图3为本发明实施例1中circ-PTGR1(hsa_circ_0003731、hsa_circ_0008043、hsa_circ_0088030)环化位点的测序峰图。
图4为本发明实施例2中QPCR检测肝癌病人血清外泌体中circ-PTGR1(hsa_circ_0003731、hsa_circ_0008043、hsa_circ_0088030)表达结果对比图。
图5为本发明实施例3中LM3肝癌细胞系分泌的外泌体促进低转移肝癌细胞系97L和HepG2细胞迁移能力实验结果示意图。
图6为本发明实施例4中LM3肝癌细胞系分泌的外泌体促进低转移肝癌细胞系97L和HepG2细胞侵袭能力实验结果示意图。
图7为本发明实施例5中构建好的稳定细胞株荧光显微镜图。
图8为本发明实施例5中LM3-shcirc-PTGR1细胞株表达circ-PTGR1的结果对比图。
图9为本发明实施例6中LM3-shcirc-PTGR1细胞株分泌的外泌体拮抗LM3外泌体对低转移细胞迁移能力的促进作用。
图10为本发明实施例7中LM3-shcirc-PTGR1细胞株分泌的外泌体拮抗LM3外泌体对低转移细胞侵袭能力的促进作用。
具体实施方式
本发明首先通过实际能扩增环状RNA的特异引物，PCR扩增出来PTGR1基因的环状RNA，并通过一代测序的方法测定出来了PTGR1基因表达的3个环状RNA的准确环化位点，确定了PTGR1基因表达的3个环状RNA hsa_circ_0003731、hsa_circ_0008043、hsa_circ_0088030，分别由442个核苷酸、670个核苷酸、643个核苷酸组成的，具有闭合环状结构的环状RNA分子，本发明所述环状RNA circ-PTGR1(hsa_circ_0003731、hsa_circ_0008043、hsa_circ_0088030)的结构示意图如图1所示。
进一步，本发明通过采用荧光定量PCR的方法检测circ-PTGR1(hsa_circ_0003731、hsa_circ_0008043、hsa_circ_0088030)基因在肝癌病人血清中的表达差异，结果显示circ-PTGR1(hsa_circ_0003731、hsa_circ_0008043、hsa_circ_0088030)在肝癌病人血清中的表达水平与正常人血清中的表达水平相比显著上调，故可制作检测该基因表达变化的试剂盒以用于诊断肝癌。
接着，我们对肝癌细胞系LM3分泌的外泌体进行体外细胞功能学的研究，通过将提取的肝癌细胞系LM3分泌的外泌体与对照PBS分别加至肝癌细胞系97L和HepG2中，发现其细胞迁移、细胞侵袭能力均显著升高，因此，肝癌细胞系分泌的外泌体可以作为肝癌的治疗靶点。
然后，我们对肝癌细胞系外泌体的circ-PTGR1(hsa_circ_0003731、hsa_circ_0008043、hsa_circ_0088030)基因进行了体外细胞功能的研究，通过将同时干扰hsa_circ_0003731、hsa_circ_0008043、hsa_circ_0088030及相应的线性基因PTGR1的基因序列特异性shRNA转染到LM3肝癌细胞系，以建立该基因表达下调的细胞株。提取LM3-shcirc-PTGR1细胞稳定株及转染了空载的对照细胞株分泌的外泌体分别加至低转移肝癌细胞系97L和HepG2细胞中，发现干扰circ-PTGR1能拮抗LM3外泌体对低转移细胞迁移、侵袭能力的促进作用。cir-PTGR1(hsa_circ_0003731、hsa_circ_0008043、hsa_circ_0088030)基因及其表达产物可以应用在制备治疗肝癌的药物中。
本发明所涉及的技术均为分子克隆常规技术手段，其中涉及的酶、引物、试剂以及反应条件在未做说明的情况下均可根据本领域技术人员的经验进行合理选择，其中涉及试剂耗材属于市售的普通产品，其中涉及的检测手段以及仪器均为本领域技术人员所熟知并熟练掌握。
下面通过实施例和试验例对本发明的技术方案做进一步的说明，但不应理解为对本发明的限制。
实施例1
RT-PCR检测circ-PTGR1(hsa_circ_0003731、hsa_circ_0008043、hsa_circ_0088030)基因在肝癌细胞中的表达。
具体实验方案如下：
1、RNA的提取
1)细胞处理：取LM3细胞1×107个，4℃1×PBS洗一次，6孔板每孔加入1mL Trizol，用1mL枪头反复吹打10次，收集到EP管内。
2)加入200μL氯仿，上下用力颠倒混匀30秒，静置3分钟。
3)4℃，12000g，离心15分钟。此时可见裂解液分三层：上层为水相的RNA；中层为DNA、脂类等；下层为细胞残渣、蛋白、多糖等。
4)取上清到新的EP管内，加入等体积的异丙醇，混匀，静置10分钟后，4℃，12000g，离心10分钟。
5)小心去掉上清，注意不要丢失RNA沉淀，加入1mL75％乙醇，上下颠倒，使沉淀块重悬起。
6)4℃，12000g，离心10分钟，小心去掉上清，尽量吸干管壁的液体，注意不要丢失RNA沉淀，若沉淀松动可再次离心。晾干约15分钟，至管壁无液体。
7)加入适量体积(20～30μL)的DEPC水溶解RNA，58℃水浴10分钟。
8)微量定量检测仪Nano-100定量，根据定量结果进行逆转录(A206/A280＝1.8～2.1)。
2、cDNA逆转录
1)实验体系
M-MLV Reverse Transcriptase
Figure BDA0001424957640000071
置于冰上，5分钟后，加入
Figure BDA0001424957640000072
3、引物：环状RNA引物为反向引物，同时设计一对正向引物做对照，RT-PCR时设计一组gDNA模板对照，证实环状RNA来自转录后剪切，而不是基因融合等突变。同时检测线性基因GAPDH作为阴性对照，使用的引物如下序列(如SEQ ID NO:4至15所示)
SEQ ID NO:4 hsa_circ_0003731-F divergent GATTGTTATTTTGATAATAGTTGTGGA
SEQ ID NO:5 hsa_circ_0003731-R divergent CAACTGTCCCCAGAGCCAA
SEQ ID NO:6 hsa_circ_0008043-F divergent CTCTGAAGGACTTGCTGAAATGG
SEQ ID NO:7 hsa_circ_0008043-R divergent CAGAAATGGAGTGCGTTGTCC
SEQ ID NO:8 hsa_circ_0088030-F divergent TACATATAACAGAACCGGCCCA
SEQ ID NO:9 hsa_circ_0088030-R divergent CAGAAATGGAGTGCGTTGTCC
SEQ ID NO:10 hsa_circ_PTGR1-F convergent GAAGCACTTTGTTGGCTATCCTAC
SEQ ID NO:11 hsa_circ_PTGR1-R convergent TGCCCCATCATTGTATCACCT
SEQ ID NO:12 hsa-GAPDHdivergent-F TCCTCACAGTTGCCATGTAGACCC
SEQ ID NO:13 hsa-GAPDHdivergent-R TGCGGGCTCAATTTATAGAAACCGGG
SEQ ID NO:14 hsa-GAPDHconvergent-F GAGTCAACGGATTTGGTCGT
SEQ ID NO:15 hsa-GAPDHconvergent-R GACAAGCTTCCCGTTCTCAG
4、PCR：以GAPDA作为内对照。PCR的反应体系：每个反应管中分别加入2μL 10×Buffer、2μL 2 mMdNTP、0.8μL 25mM MgS04、1μL 10pmol/μL正向引物、1μL 10 pmol/μL反向引物、2μL甘油、0.4μL Taq酶、1μL cDNA模板补ddH2O至20μL。PCR反应条件如下：94℃，5分钟预变性；94℃，20秒变性；60℃，30秒退火；72℃，30秒延伸；35个循环72℃，10分钟。2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，结果见图2，图2中环状RNA引物为反向引物(黑色三角形符号)，同时设计一对正向引物做对照(白色三角形符号)，RT-PCR设立一组gDNA模板对照，证实circRNA来自转录后剪切，而不是基因融合等突变。同时检测线性基因GAPDH作为阴性对照。将图2中的RT-PCR产物送测序公司测序，能明确检测到环化位点，结果见图3，测序结果显示环化位点，证实circPTGR1(hsa_circ_0003731、hsa_circ_0008043、hsa_circ_0088030)发生环化。
实施例2
一步QPCR检测肝癌病人血清外泌体中circPTGR1(hsa_circ_0003731、hsa_circ_0008043、hsa_circ_0088030)的表达情况
1、血清外泌体提取
1)取1mL血清至1.5mL EP管中。
2)4℃，3000xg离心15min，以去除细胞，不要碰到沉淀。
3)转移上清至新的离心管中，4℃，12000xg离心25min，以去除细胞残片，不要碰到沉淀。
4)转移上清至新的离心管中，加入0.25mL ExoQuick。
5)低速涡旋振荡或移液器混合，直至完全混匀样本，置于4℃冰箱孵育30min。
6)孵育后，将样品以4℃，13000xg离心2min。
7)小心吸出并弃去上清，4℃，1500xg离心2min，尽量吸取残留液体，管底的沉淀即为外泌体，加入100μL 0.22μm过滤器过滤后的1×PBS重悬外泌体。
2、外泌体RNA提取
1)加750μL LYSIS Buffer至分离的外泌体中，涡旋振荡15sec。。
2)室温静置5min。
3)加入400μL无水乙醇，涡旋振荡10sec。短暂离心，收集管壁液体。
4)转移600μL混合液至柱子中，13000rpm，离心1min。
5)小心倒弃收集管中的滤液将柱子装回收集管中，将剩余的混合液转移至柱子中，13000rpm，离心1min。
6)小心倒弃收集管中的滤液将柱子装回收集管中，加入400μL WASH Buffer，13000rpm，离心1min。
7)小心倒弃收集管中的滤液将柱子装回收集管中，加入400μL WASH Buffer，13000rpm，离心1min。
8)小心倒弃收集管中的滤液将柱子装回收集管中，13000rpm离心空柱2min甩干柱子的基质。
9)丢弃收集管，将柱子装入1.5ml RNase-free离心管中。加入15～30μL ELUTIONBuffer至柱子的膜中央，2000rpm，离心2min。13000rpm，离心1min。
10)将RNA样本保存于－80℃备用。
3、一步RT-PCR
1)实验体系
Figure BDA0001424957640000091
选用实施例1的hsa_circ_0003731divergent、hsa_circ_0008043divergent、hsa_circ_0088030divergent引物扩增环状RNA circ-PTGRA(hsa_circ_0003731、hsa_circ_0008043、hsa_circ_0088030)；U6引物扩增内参基因。
U6引物
正向引物：
SEQ ID NO:16：CTCGCTTCGGCAGCACA
反向引物：
SEQ ID NO:17：AACGCTTCACGAATTTGCGT
2)反应条件
第一步逆转录：42℃，5min；95℃，5sec。
第二步PCR：95℃，5sec；60℃，30sec；40个循环。
第三步60-95℃溶解曲线。
3)上机进行目标基因扩增
RT-PCR相对定量
目标基因的相对表达量计算公式为：2-△△Ct＝2-((△Ct)Test-(△Ct)Control)。Ct目的为目标基因Ct值，Ct管家为管家基因Ct值。△Ct＝Ct目的-Ct管家，表示各样本目的基因相对管家基因的相对Ct值，△△Ct＝(△Ct)Test-(△Ct)Control，表示处理组相对对照组进行归一化，2-△△Ct表示处理组相对对照组的相对表达量，表示目的基因相对表达倍数。
一步RT-PCR检测肝癌病人血清和正常人血清外泌体中环状RNA circ-PTGR1(hsa_circ_0003731、hsa_circ_0008043、hsa_circ_0088030)和U6的表达水平，结果见图4，在肝癌病人血清和正常人血清外泌体中检测环状RNA circ-PTGR1(hsa_circ_0003731、hsa_circ_0008043、hsa_circ_0088030)的表达，结果显示，环状RNA circ-PTGR1(hsa_circ_0003731、hsa_circ_0008043、hsa_circ_0088030)在肝癌病人血清外泌体中显著上调。N：正常人血清外泌体，T：肝癌病人血清外泌体。
实施例3
肝癌细胞系LM3分泌的外泌体对低转移肝癌细胞系97L和HepG2细胞迁移能力影响实验。
1、肝癌细胞系LM3分泌的外泌体的提取
1)LM3细胞株复苏后，待细胞长至80％以上密度时，吸去培养基，用PBS洗2遍，换成无血清培养基培养24-48小时后，收集培养基。
2)收集200mL LM3细胞株无血清培养基至50mL EP管中。
3)4℃，600xg离心5min，以去除细胞，不要碰到沉淀。
4)转移上清至新的离心管中，4℃，12000xg离心25min，以去除细胞残片，不要碰到沉淀。
5)按培养基：ExoQuick-TC＝5：1的比例，加入ExoQuick-TC。
6)低速涡旋振荡混合，直至完全混匀样本，置于4℃冰箱孵育过夜。
7)孵育后，将样品以4℃，1500xg离心30min。
8)小心吸出并弃去上清液，4℃，1500xg离心2min，尽量吸取残留液体，管底的沉淀即为外泌体，加入100μL 0.22μm过滤器过滤后的1×PBS重悬外泌体。
2、肝癌细胞系LM3分泌的外泌体对低转移肝癌细胞系97L和HepG2细胞迁移影响的测定。
1)胰酶分别消化肝癌细胞系97L和HepG2成单细胞悬液，计数，分别用含10μg/mL(每mL培养基中含10μg蛋白含量的外泌体)LM3外泌体的无血清培养基和含与加入外泌体等体积的1×PBS的无血清培养基调整细胞浓度至1×106个/皿。
2)加入100μL细胞悬液至小室上室，在下室中加入600μL含不同浓度胎牛血清的完全培养基。37℃、5％CO2培养箱中孵育24小时。
3)取出小室，用棉签擦去上室的细胞，4％多聚甲醛固定10分钟，PBS洗涤一次，结晶紫染色10分钟，PBS洗涤一次，显微镜观测并拍照。
结果见图5，肝癌细胞系LM3分泌的外泌体对低转移肝癌细胞系97L和HepG2促进细胞迁移能力，加入肝癌细胞系LM3分泌的外泌体后转移肝癌细胞系97L和HepG2细胞生长示意图。
实施例4
肝癌细胞系LM3分泌的外泌体对低转移肝癌细胞系97L和HepG2细胞侵袭能力影响实验。
1)将Matrigel置于4℃中过夜溶解，用预冷的基础培养基按Matrigel：培养基＝1:3的比例稀释，取40μL加入预冷的Transwell小室中，动作要慢，避免产生气泡。
2)37℃孵育2小时使Matrigel凝固。
3)分别在上下室加入100μL和600μL基础培养基，37℃水合过夜，次日吸去培养基。
4)实验肝癌细胞系97L和HepG2细胞胰酶消化后，取适量细胞悬液，800rpm离心15分钟。
5)吸去上清，分别用含10μg/mL(每mL培养基中含10μg蛋白含量的外泌体)LM3外泌体的无血清培养基和含与加入外泌体等体积的1×PBS的无血清培养基调整细胞浓度至1×106个/皿，取100μL加入至小室上室，在下室中加入600μL完全培养基。
6)放入培养箱中培养24、48小时后，取出小室，用棉签擦去上室的细胞，4％多聚甲醛固定15分钟，PBS洗涤一次，1％结晶紫染色10分钟，PBS洗涤一次，显微镜观测是否穿过小孔，如有穿过，终止其它实验组，拍照并统计穿过的细胞数。
7)结果见图6，肝癌细胞系LM3分泌的外泌体对低转移肝癌细胞系97L和HepG2促进细胞侵袭能力，加入肝癌细胞系LM3分泌的外泌体后转移肝癌细胞系97L和HepG2细胞生长示意图。
实施例5
LM3-shcirc-PTGR1慢病毒及其稳定细胞系构建
1、shcirc-PTGR1慢病毒载体构建：在上海捷瑞公司合成发卡结构的shRNA序列，通过多克隆位点插入到pSicoR-Ef1a-mCh-Puro载体，重组质粒通过测序进行鉴定。shcirc-PTGR1的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示。Control阴性对照为未插入序列的pSicoR-Ef1a-mCh-Puro空载体。
2、慢病毒包装
1)转染前24小时，用胰酶消化对数生长期的293T细胞，传代到10cm细胞培养皿，37℃、5％CO2培养箱内培养。24小时待细胞密度达70％～80％时即可用于转染。细胞状态对于病毒包装至关重要，因此需要保证良好的细胞状态和较少的传代次数。
2)转染前将细胞培养基更换为无血清培养基。
3)向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA溶液(pSicoR-sh-PTGR1载体10μg，pGag/pol载体5μg、pRev载体5μg、pVSV载体5μg)，与相应体积的Opti-MEM混合均匀，调整总体积为1.5mL。
4)将Lipofectamine 2000试剂轻柔摇匀，取60μL Lipofectamine 2000试剂在另一管中与1.5mL Opti-MEM混合，在室温下温育5分钟。
5)将稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine 2000进行混合，轻轻地颠倒混匀，不要振荡。
6)混合后，在室温下温育20分钟，以便形成DNA与Lipofectamine 2000稀释液的转染复合物。
7)将DNA与Lipofectamine 2000混合液转移至293T细胞的培养液中，混匀，于37℃、5％CO2培养箱内培养。
8)培养6小时后吸去含有转染混合物的培养基，每瓶细胞中加入含有10％血清的细胞培养基10mL，于37℃、5％CO2培养箱内继续培养48小时。
3、病毒的收货及浓缩
1)收集转染后48小时和72小时(转染即可为0小时计起)的293T细胞上清液。
2)于4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片。
3)以0.45μm滤器过滤上清液于50mL离心管中。
4)把病毒粗提液样品加入到过滤杯中(最多19mL)，盖上盖子。将过滤杯插到过滤液收集管中。
5)组合好后，做好平衡，放在转头上。
6)在5000g离心，至需要的病毒浓缩体积。通常需要的时间为10-15分钟。
7)离心结束后，过滤杯中的即为病毒浓缩液。
8)将病毒浓缩液移出，分装后保存在病毒管中，可在4℃保存一周，或－80℃长期保存。取其中一支进行病毒生物学滴度测定。
4、慢病毒感染细胞
1)根据细胞的量将细胞在1.5mL管中离心收集然后用100～200μL的无血清培养液稀释细胞沉淀，以细胞完全沉浸在培养基中为准。
2)吸取pSicoR-sh-PTGR1病毒液加入细胞中，将1.5mL管放在37℃培养箱中孵育30分钟。另取pSicoR-GFP空载体对照病毒感染做对照细胞系。
3)将管中混合溶液吸出加到培养皿中或孔里。
4)加入足量的新鲜培养液。
5)12小时后换液。
6)48小时后加入2μg/mL puromycin进行稳定株筛选。
5、稳定细胞株鉴定：构建好的稳定细胞株荧光显微镜下拍照观察，GFP阳性率>95％，同时收取部分细胞QPCR检测，证实circ-PTGR1的knockdown效率>70％。结果见图5和图6，将同时干扰3个环状RNA hsa_circ_0003731、hsa_circ_0008043、hsa_circ_0088030特异的shRNA序列构建到pSicoR-Ef1a-mCh-Puro慢病毒载体上，通过慢病毒构建LM3稳定细胞株，结果显示GFP阳性率>95％，QPCR检测证实circ-PTGR1(hsa_circ_0003731、hsa_circ_0008043、hsa_circ_0088030)被有效干扰，表达降低到20％左右。
实施例6
LM3-shcirc-PTGR1细胞株分泌的外泌体对低转移肝癌细胞系97L和HepG2细胞迁移能力影响的测定。
1、LM3-shcirc-PTGR1细胞株及转染空载的对照肝癌细胞株外泌体的提取
1)LM3-shcirc-PTGR1细胞株及转染空载的对照肝癌细胞株细胞复苏后，待细胞长至80％以上密度时，吸去培养基，用PBS洗2遍，换成无血清培养基培养24-48小时后，收集培养基。
2)取200mL LM3-shcirc-PTGR1细胞株无血清培养基至50mL EP管中。取200mL转染空载的对照肝癌细胞株无血清培养基至50mL EP管中。
3)4℃，600xg离心5min，以去除细胞，不要碰到沉淀。
4)转移上清至新的离心管中，4℃，1200xg离心25min，以去除细胞残片，不要碰到沉淀。
5)按培养基：ExoQuick-TC＝5：1的比例，加入ExoQuick-TC。
6)低速涡旋振荡混合，直至完全混匀样本，置于4℃冰箱孵育过夜。
7)孵育后，将样品以4℃，1500xg离心30min。
8)小心吸出并弃去上清，4℃，1500xg离心2min，尽量吸取残留液体，管底的沉淀即为外泌体，加入100μL 0.22μm过滤器过滤后的1×PBS重悬外泌体。
2、分泌的外泌体对低转移肝癌细胞系97L和HepG2细胞迁移影响的测定。
1)胰酶分别消化肝癌细胞系97L和HepG2成单细胞悬液，计数，分别用含10μg/mL(每mL培养基中含10μg蛋白含量的外泌体)LM3-shcirc-PTGR1细胞株外泌体的无血清培养基和含转染空载的对照肝癌细胞分泌的外泌体无血清培养基调整细胞浓度至1×106个/皿。
2)加入100μL细胞悬液至小室上室，在下室中加入600μL含不同浓度胎牛血清的完全培养基。37℃、5％CO2培养箱中孵育24小时。
3)取出小室，用棉签擦去上室的细胞，4％多聚甲醛固定10分钟，PBS洗涤一次，结晶紫染色10分钟，PBS洗涤一次，显微镜观测并拍照。结果见图9，LM3-shcirc-PTGR1细胞株分泌的外泌体，干扰circPTGR1能拮抗LM3外泌体对低转移细胞迁移能力的促进作用，加入LM3-shcirc-PTGR1细胞株分泌的外泌体后转移肝癌细胞系97L和HepG2细胞生长示意图。
实施例7
LM3-shcirc-PTGR1细胞株分泌的外泌体对低转移肝癌细胞系97L和HepG2细胞侵袭能力影响的测定。
1)将Matrigel置于4℃中过夜溶解，用预冷的基础培养基按Matrigel：培养基＝1:3的比例稀释，取40μL加入预冷的Transwell小室中，动作要慢，避免产生气泡。
2)37℃孵育2小时使Matrigel凝固。
3)分别在上下室加入100μL和600μL基础培养基，37℃水合过夜，次日吸去培养基。
4)实验肝癌细胞系97L和HepG2细胞胰酶消化后，取适量细胞悬液，800rpm离心15分钟。
5)吸去上清，分别用含10μg/mL(每mL培养基中含10μg蛋白含量的外泌体)LM3-shcirc-PTGR1细胞株分泌的外泌体的无血清培养基和含含转染空载的对照肝癌细胞分泌的外泌体无血清培养基调整细胞浓度至1×106个/皿，取100μL加入至小室上室，在下室中加入600μL完全培养基。
6)放入培养箱中培养24、48小时后，取出小室，用棉签擦去上室的细胞，4％多聚甲醛固定15分钟，PBS洗涤一次，1％结晶紫染色10分钟，PBS洗涤一次，显微镜观测是否穿过小孔，如有穿过，终止其它实验组，拍照并统计穿过的细胞数。
7)结果见图10，LM3-shcirc-PTGR1细胞株分泌的外泌体，干扰circPTGR1能拮抗LM3外泌体对低转移细胞侵袭能力的促进作用，加入LM3-shcirc-PTGR1细胞株分泌的外泌体后转移肝癌细胞系97L和HepG2细胞生长示意图。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州永诺生物科技有限公司
<120> 环状RNA circ-PTGR1的用途
<160> 18
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 442
<212> DNA
<213> 人类
<400> 1
agttgtggaa agtaaaaatg tagccctacc aaaaggaact attgtactgg cttctccagg 60
ctggacaacg cactccattt ctgatgggaa agatctggaa aagctgctga cagagtggcc 120
agacacaata ccactgtctt tggctctggg gacagttggc atgccaggcc tgactgccta 180
ctttggccta cttgaaatct gtggtgtgaa gggtggagaa acagtgatgg ttaatgcagc 240
agctggagct gtgggctcag tcgtggggca gattgcaaag ctcaagggct gcaaagttgt 300
tggagcagta gggtctgatg aaaaggttgc ctaccttcaa aagcttggat ttgatgtcgt 360
ctttaactac aagacggtag agtctttgga agaaaccttg aagaaagcgt ctcctgatgg 420
ttatgattgt tattttgata at 442
<210> 2
<211> 670
<212> DNA
<213> 人类
<400> 2
agttgtggaa agtaaaaatg tagccctacc aaaaggaact attgtactgg cttctccagg 60
ctggacaacg cactccattt ctgatgggaa agatctggaa aagctgctga cagagtggcc 120
agacacaata ccactgtctt tggctctggg gacagttggc atgccaggcc tgactgccta 180
ctttggccta cttgaaatct gtggtgtgaa gggtggagaa acagtgatgg ttaatgcagc 240
agctggagct gtgggctcag tcgtggggca gattgcaaag ctcaagggct gcaaagttgt 300
tggagcagta gggtctgatg aaaaggttgc ctaccttcaa aagcttggat ttgatgtcgt 360
ctttaactac aagacggtag agtctttgga agaaaccttg aagaaagcgt ctcctgatgg 420
ttatgattgt tattttgata atgtaggtgg agagttttca aacactgtta tcggccagat 480
gaagaaattt ggaaggattg ccatatgtgg agccatctct acatataaca gaaccggccc 540
acttccccca ggcccacccc cagagattgt tatctatcag gagcttcgca tggaagcttt 600
tgtcgtctac cgctggcaag gagatgcccg ccaaaaagct ctgaaggact tgctgaaatg 660
ggtcttagag 670
<210> 3
<211> 551
<212> DNA
<213> 人类
<400> 3
agttgtggaa agtaaaaatg tagccctacc aaaaggaact attgtactgg cttctccagg 60
ctggacaacg cactccattt ctgatgggaa agatctggaa aagctgctga cagagtggcc 120
agacacaata ccactgtctt tggctctggg gacagttggc atgccaggcc tgactgccta 180
ctttggccta cttgaaatct gtggtgtgaa gggtggagaa acagtgatgg ttaatgcagc 240
agctggagct gtgggctcag tcgtggggca gattgcaaag ctcaagggct gcaaagttgt 300
tggagcagta gggtctgatg aaaaggttgc ctaccttcaa aagcttggat ttgatgtcgt 360
ctttaactac aagacggtag agtctttgga agaaaccttg aagaaagcgt ctcctgatgg 420
ttatgattgt tattttgata atgtaggtgg agagttttca aacactgtta tcggccagat 480
gaagaaattt ggaaggattg ccatatgtgg agccatctct acatataaca gaaccggccc 540
acttccccca g 551
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gattgttatt ttgataatag ttgtgga 27
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
caactgtccc cagagccaa 19
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ctctgaagga cttgctgaaa tgg 23
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cagaaatgga gtgcgttgtc c 21
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tacatataac agaaccggcc ca 22
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cagaaatgga gtgcgttgtc c 21
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gaagcacttt gttggctatc ctac 24
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tgccccatca ttgtatcacc t 21
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tcctcacagt tgccatgtag accc 24
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tgcgggctca atttatagaa accggg 26
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gagtcaacgg atttggtcgt 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
gacaagcttc ccgttctcag 20
<210> 16
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ctcgcttcgg cagcaca 17
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
aacgcttcac gaatttgcgt 20
<210> 18
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
aactgaagaa agcgtctcct gatttcaaga gaatcaggag acgctttctt cttttttc 58

Claims (2)

1.扩增环状RNA circ-PTGR1的引物在制备肝癌诊断试剂盒的用途，其特征在于，所述环状RNA circ-PTGR1的CircBase ID 为 hsa_circ_0003731、hsa_circ_0008043或hsa_circ_0088030；所述引物包括由如SEQ ID NO:4和SED ID NO:5所示的DNA序列组成的引物对、由如SEQ ID NO:6和SED ID NO:7所示的DNA序列组成的引物对、以及由如SEQ ID NO:8和SED ID NO:9所示的DNA序列组成的引物对中的至少一种。
2.抑制环状RNA circ-PTGR1基因表达的shRNA在制备治疗肝癌的药物中的用途，其特征在于，所述环状RNA circ-PTGR1包括CircBase ID为hsa_circ_0003731的环状RNA、CircBase ID为hsa_circ_0008043的环状RNA和CircBase ID为hsa_circ_0088030的环状RNA中的至少一种；CircBase ID为hsa_circ_0003731的环状RNA的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示，CircBase ID为hsa_circ_0008043的环状RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，CircBase ID为hsa_circ_0088030的环状RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示。
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