CN103421886B

CN103421886B - Ciz1基因的用途及其相关药物

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Publication number: CN103421886B
Application number: CN201210162599.XA
Authority: CN
Inventors: 韩海雄; 孙琴; 谭畅; 沈浩; 金杨晟; 瞿红花; 曹跃琼
Original assignee: SHANGHAI GENECHEM CO Ltd
Current assignee: SHANGHAI GENECHEM TECHNOLOGY Co.,Ltd.
Priority date: 2012-05-21
Filing date: 2012-05-21
Publication date: 2018-10-12
Anticipated expiration: 2032-05-21
Also published as: CN103421886A

Abstract

本发明公开了CIZ1基因的用途及其相关药物。本发明公开了CIZ1基因在制备或筛选肝癌、肺癌、乳腺癌和胶质瘤的肿瘤治疗药物中的用途。本发明还进一步构建了可降低肿瘤细胞中CIZ1基因表达的分离的核酸分子、CIZ1基因干扰核酸构建体、CIZ1基因干扰慢病毒并公开了他们的用途。本发明提供的核酸分子、核酸构建体、或者CIZ1基因干扰慢病毒能够特异性抑制CIZ1基因的表达，尤其是慢病毒，能够高效侵染靶细胞，高效率地抑制靶细胞中CIZ1基因的表达，进而抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡，在肿瘤治疗中具有重要意义。

Description

CIZ1基因的用途及其相关药物

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及CIZ1基因的用途及其相关药物。

背景技术

DNA复制的起始是哺乳动物细胞周期中的一个主要控制点，也是癌症中许多不受调控的基因产物的作用点（Hanahan D,Weinberg RA.The hallmarks ofcanser.Cell.2000;100(1):57-70.）。DNA复制起始过程受细胞周期蛋白质依赖蛋白质激酶(CDK，)家族的调控，且该家族在G1期到S期的转变过程中起着非常重要的作用（Bell SP，Dutta A.DNA replication in eukaryotic cells.Annu Rev Biochem.）。CDK抑制剂中有两个家族在G1期细胞周期蛋白调控中，对CDK起负调节作用（HunterT,Pines J.Cyclinsand cancer.II:CyclinD and CDK inhibitors come of age.Cell.1994;79(4):573–582.Sherr CJ,Roberts JM.Inhibitors of mammalian G，cyclin-dependentkinases.Genes Dev 1995;9:1149-1163）。Cip/Kip家族抑制剂由结构相似的几个蛋白P21^Cip1/Waf1，P27^Kip1和P57^Kip2组成，这些蛋白结合和抑制多种CDK/cycin复合物激酶(Sherr,C.J.G1phase progression:cycling on cue.Cell.1994;79:551-555.)。其中P21^Cip1/Waf1在细胞生成负调节过程中起关键作用，已经发现它参与生成停止后少突角质细胞的分化（Zezula J,Casaccia-Bonnefil P，Ezhevsky，SA,et al.p21Cip1is required for thedifferentiation of oligodendrocytes independently of cell cyclewithdrawal.EMBO Rep.2001；2(1)：27-34.），和其他细胞类型的终末分化（Parker SB,Eichele G，Zhang P，Rawls A,etal.p53-independent expression of p21Cip1in muscleand other terminally differentiating cells.Science.1995;267:1024-1027.）等。

已有研究表明，P21^Cip1相互作用锌指蛋白1（CIZ1,P21^Cip1interacting zinc-finger protein1）在DNA复制起始阶段发挥作用，体外分析显示Ciz1蛋白质正向调节DNA复制的起始（Coverley D,Marr J,Ainscough J.Ciz 1promotes mammalian DNAreplication.Cell Sci.2005;118(Pt 1):101-112.）。Mitsui等人通过一种细胞周期蛋白质E-P21的改良的酵母双杂交方法筛选方法鉴定了人CIZ1，同时采用生物化学分析的方法也证实了其与p21的相互作用（Mitsui K,Matsumoto A,Ohtsuka S,Ohtsubo M,YoshimuraA.Cloning and characterization of a novel p21cip1/waf1-interacting zincfinger protein,Ciz1.Biochem.Biophys.Res.Com.1999;264:457-464.）。提示CIZ1在转录中的潜在作用，但其功能未被确定。最近，有人使用一种肿瘤发生模型从人神经管细胞瘤来源的cDNA文库中分离得到CIZ1基因（Warder DE,Keherly M J.Ciz 1,Cip 1interactingzinc finger protein 1 binds the consensus DNA sequence ARYSR(0-2)YYAC.J.Biomed.Sci.2003;10:406-417.）。这两项研究都表明，CIZ1与哺乳动物细胞增殖过程有关。有研究学者提出，在细胞发育过程中不适当次数的Ciz1错误剪切，会加速不恰当调控的DNA复制，引起癌细胞系的形成和发展（Rahman FA,Ainscough JF,Copeland N,Coverley D.Cancer-associated missplicing of exon 4 influences the subnucleardistribution of the DNA replication factor CIZ1.Hum.Mutat.2007;28(10):993–1004.）。同时，Hollander等发现Ciz1蛋白是一种DNA结合因子，它通过调节雌激素受体（ER）的转录活性和募集目的基因的染色体来共调节ER,以促进乳腺癌细胞对雌激素的敏感性，另外，在乳腺癌细胞中过表达Ciz1基因，能促进乳腺癌细胞生成速率和肿瘤形成能力（denHollander P，Rayala SK,Coverley D,Kumar R.Ciz1,a Novel DNA-binding coactivatorof the estrogen receptor alpha,confers hypersensitivity to estrogenaction.Cancer Res.2006；66(22):11021–9.）。因此，CIZ1与肿瘤的发生、发展具有一定的关系，有望成为肿瘤基因治疗的一个新靶点。

RNA干扰（RNA interference,RNAi）即用核苷酸组成的短的双链RNA(dsRNA)进行转录后基因沉默。它可高效、特异地阻断体内特定基因的表达，导致其降解，从而引起生物体内特异基因的沉默，使细胞表现出某种基因表型的缺失，是近年来新兴的一种常用的研究基因功能、寻找疾病治疗方法的实验室技术。研究表明，长度为21-23nt的双链RNA能够在转录和转录后水平特异性的引起RNAi（Tuschl T，Zamore PD,Sharp PA,Bartel DP.RNAi:double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to23nucleotide intervals.Cell 2000;101:25-33.）。肿瘤患者虽经化疗、放疗和综合治疗，但五年生存率仍很低，如能对肿瘤发病和进展有关的基因进行干预，将能为肿瘤的治疗开辟新途径。近年来，RNAi已成为肿瘤的基因治疗的有效策略。利用RNAi技术可以抑制原癌基因、突变的抑癌基因、细胞周期相关基因、抗凋亡相关基因等的表达来抑制肿瘤进程（Uprichard,Susan L.The therapeutic potential of RNA interference.FEBS Letters2005;579:5996-6007.）。

为了深入研究CIZ1在肿瘤发生中的调节功能，本发明选取肝癌、肺癌、乳腺癌和胶质瘤细胞模型，以RNAi为手段研究CIZ1在肝癌、肺癌、乳腺癌和胶质瘤发生和发展中的作用。

发明内容

本发明的目的在于公开与CIZ1基因相关的用途及药物。

本发明第一方面，以RNA干扰为手段，研究了CIZ1基因在肿瘤发生和发展中的作用，公开了CIZ1基因在制备或筛选肿瘤治疗药物，或者在制备肿瘤诊断药物中的用途。

进一步的，所述肿瘤选自肝癌、肺癌、乳腺癌和胶质瘤。

较佳的，所述CIZ1基因来源于人。

CIZ1基因用于制备或筛选肿瘤治疗药物包括两方面的内容：其一，将CIZ1基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于制备肿瘤治疗药物或制剂；其二，将CIZ1基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗药物或制剂。

所述将CIZ1基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标具体是指：将CIZ1基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞产生RNA干扰作用的靶标，从而能降低肿瘤细胞中CIZ1基因的表达水平。

所述将CIZ1基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗药物或制剂具体是指：将CIZ1基因作为作用对象对药物或制剂进行筛选，以找到可以抑制或促进CIZ1基因表达的药物作为肿瘤治疗备选药物。如之后所述的CIZ1基因小分子干扰RNA即是以CIZ1基因为作用对象筛选获得的，可用作具有抑制肿瘤细胞增殖作用的药物。诸如抗体药物，小分子药物等也可将CIZ1基因作为作用对象。

所述将CIZ1基因用于制备肿瘤诊断药物，是指将CIZ1基因表达产物作为一项肿瘤诊断指标应用于肿瘤诊断药物的制备。

所述肿瘤治疗药物包含能够抑制CIZ1基因的转录或翻译，或能够抑制CIZ1蛋白的表达或活性的分子。

进一步，所述肿瘤治疗药物能有效降低肿瘤细胞中CIZ1基因的表达水平。从而抑制肿瘤细胞的增殖、生长、增殖、分化和/或存活。

所述肿瘤治疗药物可选自但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病毒。

所述核酸分子包括但不限于：反义寡核苷酸、双链RNA（dsRNA）、核酶、核糖核酸内切酶III制备的小干扰RNA（esiRNA）或者短发夹RNA（shRNA）。

所述双链RNA、核酶、esiRNA或者shRNA含有CIZ1基因的启动子序列或CIZ1基因的信息序列。

所述肿瘤治疗药物的施用量为足够降低CIZ1基因的转录或翻译，或者足够降低CIZ1蛋白的表达或活性的剂量。以使CIZ1基因的表达至少被降低50%、80%、90%、95%或99%。

本发明第二方面公开了一种降低肿瘤细胞中CIZ1基因的表达水平的分离的核酸分子，所述核酸分子包含以下任一：

1）双链RNA，所述双链RNA中含有能够在严紧条件下与CIZ1基因杂交的核苷酸序列；

2)shRNA，所述shRNA中含有能够在严紧条件下与CIZ1基因杂交的核苷酸序列；

所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链与CIZ1基因中15-27个连续的核苷酸基本相同，而所述第二链与第一链基本互补。较佳的，所述第一链与CIZ1基因中19-23个连续的核苷酸基本相同；更佳的，所述第一链与CIZ1基因中19、20或者21个连续的核苷酸基本相同。

进一步的，所述双链RNA为小干扰RNA。

所述shRNA包含正义RNA片段和反义RNA片段，所述正义RNA片段与CIZ1基因中15-27个连续的核苷酸基本相同，而所述反义RNA片段与正义RNA片段基本互补，且所述正义RNA片段和反义RNA片段中间由茎环片段分隔。所述shRNA经酶切后可成为小干扰RNA进而起到特异性沉默肿瘤细胞中内源CIZ1基因的表达的作用。较佳的，所述正义RNA片段与CIZ1基因中19-23个连续的核苷酸基本相同；更佳的，所述正义RNA片段与CIZ1基因中19、20或者21个连续的核苷酸基本相同。

所述shRNA的茎环片段的序列可选自以下任一：UUCAAGAGA、AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU和CCACACC。本发明具体列举了以UUCAAGAGA为茎环。

所述双链RNA的第一链或所述shRNA的正义RNA片段的序列与CIZ1基因中的靶序列基本相同。

所述CIZ1基因中的靶序列即为所述小干扰RNA特异性沉默CIZ1基因表达时，与所述的小干扰RNA互补结合的mRNA片段所对应的CIZ1基因片段的序列。

较佳的，所述CIZ1基因中的靶序列含有SEQ ID NO:1-13中之任一序列。

如本发明的实施例列举的，所述shRNA的序列含有SEQ ID NO:14：GCACUUAGUGCUGCAACAGAAUUCAAGAGAUUCUGUUGCAGCACUAAGUGC

所述分离的核酸分子可用于制备预防或治疗肿瘤的药物。进一步的，所述肿瘤选自肝癌、肺癌、乳腺癌和胶质瘤之任一。

当用作治疗肿瘤的药物或制剂时，是将安全有效量的所述核酸分子施用于哺乳动物。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明第三方面，公开了一种CIZ1基因干扰核酸构建体，包含编码2）所述shRNA基因片段，能产生所述shRNA。

所述的人CIZ1基因干扰核酸构建体可以是将编码前述人CIZ1基因shRNA的基因片段克隆入已知载体获得。进一步的，所述CIZ1基因干扰核酸构建体为CIZ1基因干扰慢病毒载体。

所述干扰慢病毒载体可由将编码所述shRNA的DNA片段克隆入慢病毒载体后获得。

所述干扰慢病毒载体经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒后，感染肿瘤细胞，并进而转录出所述shRNA。

所述干扰慢病毒载体还可含有启动子序列和/或编码肿瘤细胞中可被检测的标记物的核苷酸序列。所述可被检测的标记物如绿色荧光蛋白（GFP）。

所述慢病毒载体可选自以下任一：pLKO.1-puro、pLKO.1-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-tGFP、pLKO.1-CMV-Neo、pLKO.1-Neo、pLKO.1-Neo-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-TagCFP、pLKO.1-puro-CMV-TagYFP、pLKO.1-puro-CMV-TagRFP、pLKO.1-puro-CMV-TagFP635、pLKO.1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO.1-puro-UbC-TagFP635、pLKO-puro-IPTG-1xLacO、pLKO-puro-IPTG-3xLacO、pLP1、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BLOCK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNA1.2/V5-GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP和Lenti6.2/N-Lumio/V5-GW/lacZ。

本发明实施例具体列举了以pGCSIL-GFP为载体构建的CIZ1基因干扰慢病毒载体，命名为pGCSIL-GFP-CIZ1-siRNA。

本发明第四方面，公开了一种CIZ1基因干扰慢病毒，为将能够在肿瘤细胞中经转录成为所述shRNA的核苷酸片段克隆入慢病毒载体后，在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。该慢病毒可感染肿瘤细胞并产生特异性沉默CIZ1基因的所述小分子干扰RNA，从而抑制肿瘤细胞的增殖。

所述CIZ1基因干扰慢病毒可用于制备预防或治疗肿瘤的药物。进一步的，所述肿瘤选自肝癌、肺癌、乳腺癌和胶质瘤之任一。

本发明第五方面，公开了所述核酸分子的分离的靶标寡核苷酸片段，其序列为SEQIDNO：1-13中任意一条序列。

所述的靶标寡核苷酸片段可以用于研制可以沉默CIZ1基因表达的分子（如CIZ1基因小分子干扰RNA）或药物的筛选与制备。

本发明第六方面，还公开了一种用于预防或治疗肿瘤的药物组合物，其有效物质含有所述降低肿瘤细胞中CIZ1基因的表达水平的分离的核酸分子，所述CIZ1基因干扰核酸构建体，和/或所述CIZ1基因干扰慢病毒。

进一步的，所述药物组合物含有1~99wt%所述双链RNA、shRNA、CIZ1基因干扰核酸构建体或CIZ1基因干扰慢病毒，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

在制备这些组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括:乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、等。制剂还可包括:湿润剂、乳化剂、防腐剂(如羟基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味剂等。

所述药物组合物用于预防或治疗对象体内肿瘤时，可将有效剂量的所述的药物组合物施用于对象中。

所述肿瘤可选自肝癌、肺癌、乳腺癌和胶质瘤之任一。

采用该方法，所述肿瘤的生长、增殖、复发和/或转移被抑制。进一步的，所述肿瘤的生长、增殖、复发和/或转移的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%的部分被抑制。

进一步的，采用该方法的对象为人。

本发明第七方面，公开了一种用于降低肿瘤细胞中的CIZ1基因表达的试剂盒，所述试剂盒包括：存在于容器中的所述降低肿瘤细胞中CIZ1基因的表达水平的分离的核酸分子，所述CIZ1基因干扰核酸构建体，和/或所述CIZ1基因干扰慢病毒。

本发明还进一步公开了一种肿瘤辅助诊断试剂盒，所述试剂盒包括CIZ1基因的表达产物和/或CIZ1基因的表达产物特异性结合的抗体。

所述诊断试剂盒中还可进一步包括其他免疫检测反应所需要的常规试剂，如带标记物的二抗、洗涤液、稀释液、显色液、终止液、阴性对照、阳性对照等。

综上所述，本发明设计了针对CIZ1基因的13个RNAi靶序列，构建相应的CIZ1 RNAi载体，其中对应编码序列SEQ ID NO.4的RNAi载体pGCSIL-GFP-CIZ1-siRNA能够显著下调CIZ1基因在mRNA水平和蛋白水平的表达。使用慢病毒（lentivirus，简写为Lv）作为基因操作工具携带RNAi载体pGCSIL-GFP-CIZ1-siRNA能够靶向地将针对CIZ1基因的RNAi序列高效导入人肝癌SMMC7721细胞、肺癌H1299细胞、乳腺癌MCF-7细胞和胶质瘤U87细胞，降低CIZ1基因的表达水平，显著抑制上述肿瘤细胞的增殖能力。因此慢病毒介导的CIZ1基因沉默是恶性肿瘤潜在的临床非手术治疗方式。

本发明提供的核酸分子、慢病毒能够特异性抑制CIZ1基因的表达，尤其是慢病毒，能够高效侵染靶细胞，高效率地抑制靶细胞中CIZ1基因的表达，进而抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡，在肿瘤治疗中具有重要意义。

附图说明

图1表示pGCSIL-GFP质粒DNA图谱

图2表示CIZ1-RNAi慢病毒侵染人肝癌SMMC7721细胞、肺癌H1299细胞、乳腺癌MCF-7细胞和胶质瘤U87细胞5天后，CIZ1 mRNA的表达水平显著降低

图3表示CIZ1-RNAi慢病毒侵染人肝癌SMMC7721细胞5天后，引起细胞增殖抑制

图4表示CIZ1-RNAi慢病毒侵染人肺癌H1299细胞5天后，引起细胞增殖抑制

图5表示CIZ1-RNAi慢病毒侵染人乳腺癌MCF-7细胞5天后，引起细胞增殖抑制

图6表示CIZ1-RNAi慢病毒侵染人胶质瘤U87细胞5天后，引起细胞增殖抑制

图7使用CIZ1抗体在不同肿瘤组织组织样本上的免疫组化检测结果a、b、c为肺癌，d、e、f为乳腺癌

具体实施方式

发明人发现，采用RNAi方法下调CIZ1基因的表达后可有效地抑制肺癌、乳腺癌、胶质瘤细胞的增殖，这一研究成果表明CIZ1基因可作为这些肿瘤治疗的靶点。发明人进一步合成和测试了多种针对CIZ1基因的siRNA，筛选出了可有效抑制CIZ1的表达进而抑制人肝癌SMMC7721、肺癌H1299细胞、乳腺癌MCF-7细胞和胶质瘤U87细胞增殖和生长的siRNA，在此基础上完成了本发明。

本发明提供了一系列干扰CIZ1基因的小干扰RNA（siRNA）序列，shRNA序列、构建了可产生所述shRNA序列的慢病毒载体，并获得了特异性沉默CIZ1基因表达的慢病毒。本发明研究发现，针对CIZ1基因设计的小干扰RNA及RNAi慢病毒，稳定并特异地下调CIZ1基因的表达，并有效地抑制人肿瘤细胞的增殖。本发明表明CIZ1基因可促进肿瘤细胞生长，有望成为肿瘤早期诊断和治疗的靶点。而且，通过RNAi方式沉默CIZ1基因的表达，可作为抑制肿瘤发展的有效手段。

本发明的设计思路为：

本发明通过如下方法来筛选获得一种CIZ1基因RNAi慢病毒：从Genbank中调取CIZ1基因序列；预测siRNA位点；合成针对CIZ1基因的有效的siRNA序列，两端含酶切位点粘端的双链DNA Oligo；慢病毒载体双酶切后与双链DNA Oligo连接，构建表达CIZ1基因siRNA序列的RNAi质粒；将RNAi质粒和慢病毒包装需要的辅助载体（Packing Mix，Sigma-aldrich公司）共转染人胚肾细胞293T，产生重组慢病毒颗粒，制得高效沉默CIZ1基因的慢病毒。

基于上述方法，本发明提供了13个干扰CIZ1基因的有效靶点（具体如SEQ ID NO1-13所示），构建了特异干扰CIZ1基因的慢病毒。

同时本发明还具体公开了一种CIZ1基因RNAi慢病毒（CIZ1-RNAi）及其制备与应用。

本研究发现，利用慢病毒介导的RNAi方法，在降低CIZ1基因在肿瘤细胞中的表达后，可以有效抑制肿瘤细胞的增殖。本研究表明，CIZ1基因是一个原癌基因，可促进肿瘤细胞增殖，在肿瘤发生和发展中具有重要的生物学功能，CIZ1基因可以为肿瘤治疗的靶标，慢病毒介导的CIZ1基因特异性沉默可作为肿瘤治疗的一种新手段。

下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件，如［美］Sambrook.J等著；黄培堂等译。分子克隆试验指南，第三版。北京：科学出版社2002中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。

实施例1：针对人CIZ1基因RNAi慢病毒的制备

1.筛选针对人CIZ1基因的有效的siRNA靶点

从Genbank调取CIZ1（NM 012127.2或NM 001131016.1或NM 001131017.1或NM001131018.1或NM 001131015.1）基因信息；利用上海吉凯基因化学技术有限公司的设计软件Genechem设计针对CIZ1基因（NM 012127.2）的有效的siRNA靶点。在CIZ1基因的编码序列（CDS）区域内，每隔一个碱基起始获得21个碱基的序列，表1列出了其中13条针对CIZ1基因的有效siRNA靶点序列。

表1靶向于人CIZ1基因的siRNA靶点序列

针对siRNA靶点（以SEQ ID NO：4为例）合成两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo序列（表2）；以Age I和EcoR I限制性内切酶作用于pGCSIL-GFP载体（上海吉凯基因化学技术有限公司提供，图1），使其线性化，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切片段。

表2两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo

通过T4DNA连接酶将双酶切线性化（酶切体系如表4所示，37℃，反应1h）的载体DNA和纯化好的双链DNAOligo连接，在适当的缓冲体系（连接体系如表5所示）中于16℃连接过夜，回收连接产物。将连接产物转化氯化钙制备的新鲜的大肠杆菌感受态细胞（转化操作参考：分子克隆实验指南第二版55-56页）。在连接转化产物长出菌克隆表面沾一下，溶于10μlLB培养基，混匀取1μl作为模板；在以慢病毒载体中RNAi序列的上下游，设计通用PCR引物（上游引物序列：5’-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3’（SEQ ID NO：15）；下游引物序列：5’-GTAATACGGTTATCCACGCG-3’（SEQ ID NO：16），进行PCR鉴定实验（PCR反应体系如表6-1，反应条件如表6-2）。对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析，比对正确的克隆即为构建成功的含有SEQ ID NO.4的RNAi载体，命名为pGCSIL-GFP-CIZ1-siRNA。

构建pGCSIL-GFP-Scr-siRNA阴性对照质粒，阴性对照siRNA靶序列为5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’（SEQ ID NO：17）。构建pGCSIL-GFP-Scr-siRNA阴性对照质粒时，针对Scr siRNA靶点合成两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNAOligo序列（表3）,其余构建方法、鉴定方法及条件均同pGCSIL-GFP-CIZ1-siRNA。

表3两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo

通过T4DNA连接酶将双酶切线性化（酶切体系如表4所示，37℃，反应1h）的载体

表4pGCSIL-GFP质粒酶切反应体系

试剂	体积(μl)
		pGCSIL-GFP质粒(1μg/μl)	2.0
10×buffer	5.0
		100×BSA	0.5
Age I(10U/μl)	1.0
		EcoR I(10U/μl)	1.0
dd H₂O	40.5
		Total	50.0

表5载体DNA和双链双链DNA Oligo连接反应体系

试剂	阳性对照(μl)	自连对照(μl)	连接组(μl)
				线性化的载体DNA(100ng/μl)	1.0	1.0	1.0
退火的双链DNA Oligo(100ng/μl)	1.0		1.0
				10×T4噬菌体DNA连接酶缓冲液	1.0	1.0	1.0
T4噬菌体DNA连接酶	1.0	1.0	1.0
				dd H₂O	16.0	17.0	16.0
Total	20.0	20.0	20.0

表6-1PCR反应体系

试剂	体积(μl)
		10×buffer	2.0
dNTPs(2.5mM)	0.8
		上游引物	0.4
下游引物	0.4
		Taq聚合酶	0.2
模板	1.0
		ddH₂O	15.2
Total	20.0

表6-2PCR反应体系程序设定

2.包装CIZ1-siRNA慢病毒

以Qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取RNAi质粒pGCSIL-GFP-CIZ1-siRNA的DNA，配制成100ng/μl储存液。转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的人胚肾细胞293T细胞，以含10%胎牛血清的DMEM完全培养基调整细胞密度为1.5×10⁵细胞/ml，接种于6孔板，37℃，5%CO₂培养箱内培养。待细胞密度达70%-80%时即可用于转染。转染前2h，吸出原有培养基，加入1.5ml新鲜的完全培养基。按照Sigma-aldrich公司的MISSION Lentiviral PackagingMix试剂盒的说明，向一灭菌离心管中加入Packing Mix（PVM）20μl，PEI 12μl，无血清DMEM培养基400μl，取20μl上述抽提的质粒DNA，加至上述PVM/PEI/DMEM混合液。将上述转染混和物在室温下孵育15min，转移至人胚肾细胞293T细胞的培养基中，37℃，5%CO₂培养箱内培养16h。弃去含有转染混和物的培养介质，PBS溶液洗涤，加入完全培养基2ml，继续培养48h。收集细胞上清液，Centricon Plus-20离心超滤装置（Millipore）纯化和浓缩慢病毒，步骤如下：（1）4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；（2）0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；（3）4000g离心，10-15min，至需要的病毒浓缩体积；（4）离心结束后，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开，将过滤杯倒扣在样品收集杯上，离心2min离心力不超过1000g；（5）把离心杯从样品收集杯上移开，样品收集杯中的即为病毒浓缩液。将病毒浓缩液分装后于-80摄氏度保存。病毒浓缩液中含有的siRNA序列为SEQ IDNO:14。对照慢病毒的包装过程同CIZ1-siRNA慢病毒，仅以pGCSIL-GFP-Scr-siRNA载体代替pGCSIL-GFP-CIZ1-siRNA载体。

实施例2：实时荧光定量RT-PCR法检测CIZ1基因的沉默效率

处于对数生长期的人肝癌SMMC7721、肺癌H1299细胞、乳腺癌MCF-7细胞和胶质瘤U87细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液（细胞数约为5×10⁴/ml）接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约30%。根据侵染复数（MOI，SMMC7721：20，H1299:10，MCF-7:20，U87:10）值，加入适宜量的实施例1制备的病毒，培养24h后更换培养基，待侵染时间达到5天后，收集细胞。根据Invitrogen公司的Trizol操作说明书，抽提总RNA。根据Promega公司的M-MLV操作说明书，将RNA逆转录获得cDNA（逆转录反应体系见表6，42℃反应1h，然后在70℃水浴锅中水浴10min使逆转录酶失活）。

采用TP800型Real time PCR仪（TAKARA）进行实时定量检测。CIZ1基因的引物如下：上游引物5’-GCCAAACAATCCTTGCGAC-3’（SEQ ID NO：18）和下游引物5’-CAACCCACAGCGTCCACT-3’（SEQ ID NO：19）。以管家基因GAPDH为内参，引物序列如下：上游引物5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’（SEQ ID NO：20）和下游引物5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’（SEQ ID NO：21）。按表7中的比例配置反应体系。

表6逆转录反应体系

试剂	体积(μl)
		5×RT buffer	4.0
10mM dNTPs	2.0
		RNasin	0.5
M-MLV-RTase	1.0
		DEPC H₂O	3.5
Total	11.0

表7Real-time PCR反应体系

试剂	体积(μl)
		SYBR premix ex taq:	10.0
上游引物（2.5μM）：	0.5
		下游引物（2.5μM）：	0.5
cDNA	1.0
		ddH₂O	8.0
Total	20.0

设定程序为两步法Real-time PCR：预变性95℃，15s；之后每一步变性95℃，5s；退火延伸60℃，30s；共进行45个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。PCR结束后，95℃变性1min，然后冷却至55℃，使DNA双链充分结合。从55℃开始到95℃，每一步增加0.5℃，保持4s,同时读取吸光值，制作熔解曲线。采用2-^ΔΔCt分析法计算侵染了CIZ1 mRNA的表达丰度。侵染对照病毒（Lv-Scr-siRNA）的细胞作为对照。实验结果（图2）表明，人肝癌SMMC7721细胞、肺癌H1299细胞、乳腺癌MCF-7细胞和胶质瘤U87细胞中CIZ1 mRNA的表达水平下调了67.2%、84.3%、84.2%和79.7%%。

实施例3：检测侵染CIZ1-siRNA慢病毒的肿瘤细胞的增殖能力

处于对数生长期的人肝癌SMMC7721细胞、肺癌H1299细胞、乳腺癌MCF-7细胞和胶质瘤U87细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液（细胞数约为5×10⁴/ml）接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约30%。根据侵染复数（MOI，SMMC7721：20，H1299:10，MCF-7:20，U87:10），加入适宜量的病毒，培养24h后更换培养基，待侵染时间达到5天后，收集处于对数生长期的各实验组细胞。完全培养基重悬成细胞悬液（2×10⁴/ml），以细胞密度约为2000个/孔，接种96孔板。每组5个复孔，每孔100μl。铺好板后，置37℃、5%CO₂培养箱培养。从铺板后第二天开始，每天用Cellomics仪器（Thermo Fisher）检测读板一次，连续检测读板5天。通过调整Cellomics arrayscan的输入参数，准确地计算出每次扫描孔板中的带绿色荧光的细胞的数量，对数据进行统计绘图，绘出细胞增殖曲线（结果如图3-图6所示）。结果表明，慢病毒侵染组各肿瘤在细胞体外培养5天后，增殖速度显著减缓，远低于对照组肿瘤细胞的增殖速度，活力细胞数目分别下降了43.2%、99.9%、75.5%和74.7%，表明CIZ1基因沉默导致肿瘤细胞增值能力被抑制。

实施例4肿瘤细胞中CIZ1基因过表达的试验

组织样本：人乳腺癌，肺癌的组织样本

CIZ1抗体：购自Sigma公司

试验方法：

取出组织芯片，将组织芯片在60℃恒温箱中烘烤30分钟。然后对组织芯片脱蜡，脱蜡过程为：二甲苯15分钟，二甲苯：乙醇=1:1混液中，无水乙醇中，95%乙醇中，85%乙醇中，75%乙醇中，蒸馏水中依次浸泡10分钟；然后用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H₂O₂，室温封闭10分钟；抗原修复在微波炉里高火加热0.01M柠檬酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入，低火维持20分钟；自然冷却至室温后，置入蒸馏水中浸泡10分钟；10%血清（TBS配制）封闭30分钟；吸弃血清，勿洗加入CIZ1抗体（1：100稀释）孵育过夜；TBS洗2遍，每次5分钟；加入HRP标记的羊抗兔二抗，室温孵育60分钟；TBS洗4遍，每次5分钟；加入DAB染色，直到显浅黄色为止，放入蒸馏水中终止反应；用苏木浸30秒，清水漂洗7-8遍；脱水封片，于75%乙醇，85%乙醇，95%乙醇，无水乙醇，二甲苯：乙醇=1:1混液，二甲苯中，依次浸置5分钟；取出后，滴加30ul中性树胶，用盖玻片封片，晾干，观察结果，拍照。（结果如图7）

结果表明：

使用CIZ1抗体对不同肿瘤组织进行免疫组化表达检测，结果发现，在人乳腺癌，肺癌的组织样本中，都能发现CIZ1基因编码蛋白的高表达。图中深灰色代表表达阳性。基于此实验结果，认为可通过检测组织细胞CIZ1基因的表达来辅助诊断癌症。

Claims

1.CIZ1基因作为药物或制剂针对乳腺癌细胞的作用靶标在筛选乳腺癌治疗药物中的用途；CIZ1基因作为药物或制剂针对乳腺癌细胞的作用靶标具体是指：将CIZ1基因作为药物或制剂针对乳腺癌细胞产生RNA干扰作用的靶标，从而能降低乳腺癌细胞中CIZ1基因的表达水平；将CIZ1基因作为药物或制剂针对乳腺癌细胞的作用靶标应用于筛选乳腺癌治疗药物具体是指：将CIZ1基因作为作用对象对药物或制剂进行筛选，以找到可以抑制CIZ1基因表达的药物作为乳腺癌治疗备选药物；所述靶标的序列如SEQ ID NO：4所示。

2.如权利要求1所述CIZ1基因的用途，其特征在于，所述CIZ1基因来源于人。

3.一种降低乳腺癌细胞中CIZ1基因的表达水平的分离的核酸分子，所述核酸分子包含以下任一：

1)双链RNA，所述双链RNA中含有能够在严紧条件下与CIZ1基因杂交的核苷酸序列；所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链与CIZ1基因中的靶序列基本相同，而所述第二链与第一链基本互补，所述CIZ1基因中的靶序列如SEQ ID NO:4所示；

2)shRNA，所述shRNA中含有能够在严紧条件下与CIZ1基因杂交的核苷酸序列；所述shRNA包含正义RNA片段和反义RNA片段，所述正义RNA片段与CIZ1基因中的靶序列基本相同，而所述反义RNA片段与正义RNA片段基本互补,且所述正义RNA片段和反义RNA片段中间由茎环片段分隔；所述CIZ1基因中的靶序列如SEQ ID NO:4所示。

4.如权利要求3所述的分离的核酸分子，其特征在于，所述茎环片段的序列选自以下任一：UUCAAGAGA、AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU和CCACACC。

5.如权利要求3-4任一所述的分离的核酸分子，其特征在于，所述CIZ1基因来源于人。

6.如权利要求5所述的分离的核酸分子，其特征在于，所述shRNA的序列含有SEQ IDNO:14。

7.一种CIZ1基因干扰核酸构建体，包含编码权利要求3-6任一权利要求所述的核酸分子中的shRNA的基因片段，能产生所述shRNA。

8.如权利要求7所述CIZ1基因干扰核酸构建体，其特征在于，所述CIZ1基因干扰核酸构建体为干扰慢病毒载体。

9.如权利要求8所述CIZ1基因干扰核酸构建体，其特征在于，所述干扰慢病毒载体还含有启动子序列和/或编码肿瘤细胞中可被检测的标记物的核苷酸序列。

10.如权利要求8或9所述CIZ1基因干扰核酸构建体，其特征在于，所述干扰慢病毒载体由将编码所述shRNA的基因片段克隆入慢病毒载体后获得，所述慢病毒载体选自以下任一：pLKO.1-puro、pLKO.1-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-tGFP、pLKO.1-CMV-Neo、pLKO.1-Neo、pLKO.1-Neo-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-TagCFP、pLKO.1-puro-CMV-TagYFP、pLKO.1-puro-CMV-TagRFP、pLKO.1-puro-CMV-TagFP635、pLKO.1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO.1-puro-UbC-TagFP635、pLKO-puro-IPTG-1xLacO、pLKO-puro-IPTG-3xLacO、pLP1、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BLOCK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNA1.2/V5-GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP和Lenti6.2/N-Lumio/V5-GW/lacZ。

11.一种CIZ1基因干扰慢病毒，为将权利要求8-10任一权利要求所述的干扰慢病毒载体，在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。

12.一种分离的如权利要求3-6任一权利要求所述核酸分子的靶标寡核苷酸片段，其序列为SEQ ID NO：4所示。

13.一种用于预防或治疗肿瘤的药物组合物，所述肿瘤选自肝癌、肺癌、乳腺癌或胶质瘤，其有效物质含有权利要求3-6任一权利要求所述核酸分子，权利要求7-10任一权利要求所述CIZ1基因干扰核酸构建体，和/或权利要求11所述CIZ1基因干扰慢病毒。

14.如权利要求13所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中还含有药学上可接受的载体或赋形剂。

15.一种用于降低肿瘤细胞中的CIZ1基因表达的试剂盒，所述肿瘤选自肝癌、肺癌、乳腺癌或胶质瘤，所述试剂盒包括：存在于容器中的权利要求3-6任一权利要求所述核酸分子，权利要求7-10任一权利要求所述CIZ1基因干扰核酸构建体，和/或权利要求11所述CIZ1基因干扰慢病毒。