CN109694411A - 抗-ciz1抗体 - Google Patents

Abstract

CIZ1在小细胞肺癌和其他多种癌症中呈现癌症特异性高表达。制备的抗体，能够与细胞表面的CIZ1全长蛋白质和变异体和/或其片断的抗原决定簇特异性结合，在体外和体内抑制肿瘤生长，应用于癌症的治疗与检测。

Description

抗-CIZ1抗体

技术领域

本发明公布一种抗-CIZ1抗体的制备和使用方法

背景技术

Cdkn 1A-interacting zinc finger protein 1(Ainscough，Rahman et al.)是一种能够与p21^Cip1/Wafl结合的锌指蛋白，是Mitsui等于1999年发现的(Mitsui，Matsumotoet al.1999)。CIZ1不仅能够与CDK2(Cyclin-dependent kinase 2)抑制剂p21^Cip1/Wafl结合，而且还能够与CDK2、cyclin A、cyclin E、CDC6(Cell division cycle 6)、雌激素受体α(estrogen receptor-α)，以及其他多种蛋白质结合。CIZ1在DNA复制与细胞生长的过程中起作用，并且与癌症、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)、肌肉张力障碍症(dystonia)、以及类风湿关节炎(rheumatoid arthritis)等疾病相关(Liu，Niu et al.2016；Pauzaite，Thacker et al.2016)。

CIZ1全长蛋白质(NP_036259.2)有898个氨基酸(序列号码1)，可以分为位于N端的DNA复制域和位于C端的核基质锚定域两个部分。人的CIZ1基因位于9q34，其DNA大约38kb。人全长CIZ1mRNA有18个外显子(NM_001257975.1)，经过不同的剪切，形成2.7-3.2kb的mRNA转录产物。

CIZ1参与DNA复制前复合物和复制体的形成。在细胞周期的G1期CIZ1与cyclin E结合，促进Cdc6的召集。同时，C1Z1通过其核基质结合功能稳定复制前复合物和复制体。CIZ1在细胞周期的G0/G1期保持低水平，但是在早S期显著增加，并在晚S期达到峰值。抑制CIZ1不仅能够显著降低细胞生长率，而且还能够减少细胞进入S期的比例(Coverley，Marret al.2005)。

CIZ1在多种恶性肿瘤中呈现高表达，包括肺癌(Higgins，Roper et al.2012)，Ewing肿瘤(Rahman，Ainscough et al.2007；Rahman，Aziz et al.2010)，结肠癌(Yin，Wanget al.2013；Wang，Wang et al.2014)，胆囊癌(Zhang，Wang et al.2015)，前列腺癌(Liu，Ren et al.2015)，乳腺癌(den Hollander and Kumar 2006；den Hollander，Rayala etal.2006)，胃癌(Kim，Hahn et al.2004)，肝细胞癌(Lei，Wu et al.2016；Wu，Lei etal.2016)，肝脏未分化胚胎肉瘤(Hu，Chen et al.2012)。

CIZ1与雌激素受体结合增加其下游靶基因的表达，促进乳腺癌的发生(denHollander，Rayala et al.2006)。CIZ1能够与beta-catenin T cell factor 4(TCF4)结合，调控Int/Wingless(Wnt)信号传导系统(Zhang，Wang et al.2015)。CIZ1的过量表达增加Wnt靶基因c-Myc，Snail和Cyclin D1的表达，促进胆囊癌细胞的生长和迁移。

CIZ1能够作用于p53下游靶点DNA damage-regulated gene 1(PDRG1)，后者在结直肠癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、子宫癌中高表达。CIZ1能够诱导肿瘤相关基因AKT和PSA/KLK3的表达(Liu，Ren et al.2015)。

CIZ1过量表达促进多种癌症细胞的生长、转移、侵袭、集落形成、以及在动物模型中促进肿瘤生长(Yin，Wang et al.2013；Liu，Ren et al.2015；Zhang，Wang et al.2015)。而抑制CIZ1的表达能够在动物模型中降低肿瘤的形成(Zhang，Wang et al.2015)。

CIZ1mRNA剪切变异体与癌症相关，例如，缺失第四个外显子的CIZ1剪接变异体CIZ1ΔE4(序列号码2)独特地出现在Ewing肿瘤细胞中(Rahman，Ainscough et al.2007)；缺失第14外显子3’端最后24个核苷酸的变异体CIZ1Δ14b(序列号码3)特异性地出现在肺癌中(Higgins，Roper et al.2012)。

基于CIZ1在癌症发生发展中的作用，CIZ1及其变异体可以作为癌症诊断标准物或者治疗靶点。

发明内容

一般认为，CIZ1位于细胞核内的核基质中(Mitsui，Matsumoto et al.1999；Ainscough，Rahman et al.2007)。但是，当CIZ1和p21^Cip1/Wafl共转染到细胞中，两者都从细胞核转位到细胞质(Mitsui，Matsumoto et al.1999)。这些结果都不能排除部分CIZ1及其变异体在某个阶段分布于细胞表面。而且在CIZ1及其变异体降解的过程中，其片断可以通过Major Histocompatibility Complex(MHC)系统(Konig 2002；van Kasteren，Overkleeff et al.2014)或者其他途径递呈到细胞表面。位于细胞表面的CIZ1及其变异体蛋白质及其片断可以作为治疗或者诊断抗体发展的靶点。

本项发明，是用位于细胞表面的CIZ1全长与变异体蛋白质及其片断作为免疫原制备具有治疗和诊断功能的抗体。

根据本项发明，细胞表面高水平表达CIZ1及其变异体蛋白质及其片断的肿瘤细胞，例如小细胞肺癌NCI-H69和NCI-H526免疫BALB/c小鼠，免疫小鼠的脾脏中的B细胞与SP20小鼠骨髓瘤细胞融合，分泌抗体的杂交瘤细胞用CIZ1及其变异体蛋白质及其片断进行筛选。挑选与CIZ1及其变异体蛋白质及其片断反应滴度高的杂交瘤扩大培养，制备杂交瘤抗体。

根据本项发明，制备的抗体以不同浓度加入到培养中的不同肿瘤细胞中，用MTS方法检测细胞活性，从而检测所制备的抗体对不同的肿瘤细胞生长的特异性抑制作用。

根据本项发明，制备的抗体与肿瘤细胞孵育反应，结合在肿瘤细胞表面的抗体再与荧光标记的二抗结合，经过荧光激活细胞分离仪对细胞进行分析，从而确定制备抗体特异性结合于肿瘤细胞表面。

根据本项发明，用肿瘤细胞皮下注射的方法在裸鼠上建立肿瘤，待肿瘤生长到一定体积时，制备的抗体以一定的剂量注射到载瘤小鼠。记录载瘤小鼠的肿瘤体积变化，确定制备抗体对实验动物肿瘤的治疗功能。同时记录载瘤小鼠的体重变化，确定制备抗体对实验动物没有严重的副作用。

根据本项发明，用RT-PCR和特定的引物，获得制备抗体的基因序列并推导出抗体的蛋白质序列。将制备抗体的基因序列和蛋白质序列与数据库中所有抗体序列进行分析，确定制备抗体序列的特异性，确定制备抗体是新分子实体(NME)，确定制备抗体的CDR区(Complementarity Determining Regions)和FR区(Framework Regions)。

根据本项发明，制备的抗体可以是全长抗体、多特异抗体(multispecificantibody)、双特异抗体(bispecific antibody)、单价抗体(monovalent antibody)、多价抗体(multivalent antibody)、抗独特型抗体(anti-idiotypic antibody)、微型双功能抗体(diabody)、Fab片段、F(ab’)2片段、Fv片段、ScFv片段，和其他免疫反应片断，以及融合蛋白质。根据本项发明，制备的抗体可以是IgA，IgD，IgE，IgG，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgM。

根据本项发明，制备的抗体包括抗体与细胞毒性物质相连接(Antibody DrugConjugates，ADC)。

根据本项发明，制备的抗体为药品组成成分，用于癌症的治疗。

根据本项发明，制备的抗体为诊断试剂盒的组成成分，用于癌症的诊断和检测。

根据本项发明，制备的抗体可以作为单独治疗药物，可以与其他治疗药物和治疗方法联合用于癌症治疗。

根据本项发明，制备的抗体可以用于嵌合抗原受体细胞免疫疗法(ChimericAntigen Receptor Cell Immunotherapy)。

附图说明

图1抗-CIZ1抗体特异性抑制肿瘤细胞生长

抗-CIZ1抗体B3A11以1-100μg/ml浓度分别加入到培养中Hela(A)，A549(B)，MCF7(C)和H69(D)中，继续细胞培养72小时，细胞活性用MTS方法检测。结果表明，抗-CIZ1抗体B3A11对人宫颈癌Hela细胞的生长没有作用，对人非小细胞肺癌A549细胞的生长没有作用，对人乳腺腺癌MCF7细胞具有比较弱的抑制作用，而对小细胞肺癌细胞H69的生长具有特异性显著抑制作用。

图2抗-CIZ1抗体特异性结合肿瘤细胞表面

小细胞肺癌细胞H69分别与PBS(A)，mouse IgG1(B)和抗-CIZ1抗体B3A11抗体(C)在4℃反应30分钟，然后结合再与荧光标记的二抗结合，处理的细胞用荧光激活细胞分离仪分析。结果确定抗-CIZ1抗体B3A11特异性结合于小细胞肺癌细胞H69的细胞表面。

图3抗-CIZ1抗体在实验动物模型中抑制肿瘤生长

小细胞肺癌H69细胞移植到5-6周龄的雌性nu/nu裸鼠的右侧腹部皮下，建立小细胞肺癌移植模型。当肿瘤体积生长到大约100mm³时，载瘤小鼠被随机分为两组，一组作为对照组，注射等体积的PBS，另一组为实验组，每只小鼠注射10mg/kg的抗-CIZ1抗体B3A11。每周注射两次。所有注射均为腹腔注射，注射体积均为200ml。肿瘤体积每周测量两次。实验结果证明，抗-CIZ1抗体B3A11在动物模型中能够显著抑制小细胞肺癌H69肿瘤生长。

具体实施方式

1.抗体制备

细胞表面高水平表达CIZ1及其变异体蛋白质及其片断的肿瘤细胞，例如小细胞肺癌NCI-H69(American Type Culture Collection(ATCC)，Virginia，USA)免疫BALB/c小鼠，免疫小鼠的脾脏中的B细胞与SP20小鼠骨髓瘤细胞(中国科学院细胞库，中国，上海)融合，分泌抗体的杂交瘤细胞用CIZ1及其变异体蛋白质及其片断进行筛选。挑选与CIZ1及其变异体蛋白质及其片断反应滴度高的杂交瘤扩大培养，利用培养上清制备杂交瘤抗体，用于抗体筛选。

培养的杂交瘤细胞注射到经弗氏不完全佐剂预免的Balb/c小鼠腹腔，制备含抗体的腹水。

抗体用蛋白质A凝胶(MabSelect，GE Healthcare，USA)亲和纯化。纯化的抗体用SDS-PAGE电泳检查，纯度大于90％，纯化抗体用Bradford方法定量(北京索莱宝科技有限公司，北京，中国)。

2.杂交瘤筛选

分泌抗体的杂交瘤用酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)进行筛选。合成CIZ1全长蛋白质和变异体蛋白质的多肽片断并进行KLH藕联(南京金斯瑞生物科技有限公司，南京，中国)。KLH多肽预先包被到96孔板，杂交瘤培养上清加入到稀释的孵育并洗涤之后，加入HRP标记的二抗，用ELISA方法检测抗体与特定肽段结合。我们获得4株杂交瘤，其中一株编号B3A11滴度最高。B3A11被选择进行后续工作。

3.肿瘤细胞生长抑制实验

制备的B3A11抗体以1-100μg/ml浓度加入到培养中的Hela，MCF7，A549，H69肿瘤细胞中，用MTS方法检测细胞活性(CellTiter 96AQ_ueous Non-Radioactive CellProliferation Assay kit；Promega，USA)，从而检测所制备的抗体对不同的肿瘤细胞生长的特异性抑制作用。

B3A11抗体对人宫颈癌Hela细胞的生长没有作用，对人非小细胞肺癌A549细胞的生长没有作用，对人乳腺腺癌MCF7细胞具有比较弱的抑制作用，而对小细胞肺癌细胞H69具有特异性强烈生长抑制作用(图1)。

4.荧光激活细胞分离(fluorescence activated cell sorting，FACS)

B3A11抗体与肿瘤细胞H69在4℃反应30分钟，经洗涤之后，结合在肿瘤细胞表面的抗体再与荧光标记的二抗(天津三箭生物技术股份有限公司，中国天津)结合，经过荧光激活细胞分离仪(FACSAria II，BD Biosciences，USA)对细胞进行分析，确定B3A11抗体特异性结合于小细胞肺癌细胞H69的细胞表面(图2)。

5.肿瘤动物模型

小细胞肺癌H69细胞移植到5-6周龄的雌性nu/nu裸鼠(中国医学科学院实验动物中心，中国北京)的右侧腹部皮下，建立小细胞肺癌移植模型。当肿瘤体积生长到大约100mm³时，载瘤小鼠被随机分为两组，一组作为对照组，注射等体积的PBS，另一组为实验组，每只小鼠注射10mg/kg的B3A11抗体。每周注射两次。所有注射均为腹腔注射，注射体积均为200μl。肿瘤体积每周测量两次，用卡尺测量肿瘤的长和宽，按照公式：肿瘤体积＝(长x宽²)/2计算肿瘤体积(Tomayko and Reynolds 1989)。同时每周测量两次载瘤小鼠的体重。B3A11抗体在动物模型中能够显著抑制小细胞肺癌H69肿瘤生长，两组动物的肿瘤体积具有统计学上显著差异(图3)。两组动物的体重没有显著差异，说明B3A11抗体没有严重的副作用。

6.抗体序列测定与分析

从杂交瘤细胞中提取RNA(RNeasy Micro Kit，QIAGEN，USA)并进行cDNA合成(First Strand cDNA Synthesis Kit，ThermoFisher)。按照文献序列合成扩增抗体轻链可变区和重链可变区的PCR引物(Fields，O′Connell et al.2013)，并进行PCR反应。PCR产物进行序列测定(南京金斯瑞生物科技有限公司，南京，中国)。

获得抗-CIZ1抗体B3A11轻链可变区mRNA序列(序列号码4)；获得抗-CIZ1抗体B3A11重链可变区mRNA序列(序列号码6)；从mRNA序列推导出蛋白质序列。获得抗-CIZ1抗体B3A11轻链可变区蛋白质氨基酸序列(序列号码5)；获得抗-CIZ1抗体B3A11重链可变区蛋白质氨基酸序列(序列号码7)

将抗体的基因序列和蛋白质序列与数据库中所有抗体序列进行分析，确定制备抗体序列的特异性，确定抗-CIZ1抗体B3A11的CDR区和FR区(http：//www.imgt.org/)，确定抗-CIZ1抗体B3A11是新分子实体(NME)。

序列表

序列号码1：人CIZ1全长蛋白质氨基酸序列

序列号码2：人CIZ1变异体CIZ1ΔE4蛋白质氨基酸序列

序列号码3：人CIZ1变异体CIZ1-14b蛋白质氨基酸序列

序列号码4：抗-CIZ1抗体B3A11轻链可变区mRNA序列

序列号码5：抗-CIZ1抗体B3A11轻链可变区蛋白质氨基酸序列

序列号码6：抗-CIZ1抗体B3A11重链可变区mRNA序列

序列号码7：抗-CIZ1抗体B3A11重链可变区蛋白质氨基酸序列

参考文献

Ainscough，J.F.，F.A.Rahman，et al.(2007).″C-terminal domains deliverthe DNA replication factor Ciz1 to the nuclear matrix.″J Cell Sci120(Pt 1)：115-124.

Coverley，D.，J.Marr，et al.(2005).″Ciz1 promotes mammalian DNAreplication.″J Cell Sci118(Pt1)：101-112.

den Hollander，P.and R.Kumar(2006).″Dynein light chain 1 contributesto cell cycle progression by increasing cyclin-dependent kinase 2activity inestrogen-stimulated cells.″CancerRes66(11)：5941-5949.

den Hollander，P.，S.K.Rayala，et al.(2006).″Ciz1，a Novel DNA-bindingcoactivator of the estrogen receptor alpha，confers hypersensitivity toestrogen action.″Cancer Res66(22)：11021-11029.

Fields，C.，D.O′Connell，et al.(2013).″Creation of recombinant antigen-binding molecules derived from hybridomas secreting specific antibodies.″Nat Protoc8(6)：1125-1148.

Higgins，G.，K.M.Roper，et al.(2012).″Variant Ciz1 is a circulatingbiomarker for early-stage lung cancer.″Proc Natl Acad Sci USA109(45)：E3128-3135.

Hu，X.，H.Chen，et al.(2012).″Molecular cytogenetic characterization ofundifferentiated embryonal sarcoma of the liver：a case report and literaturereview.″Mol Cytogenet5(1)：26.

Kim，N.S.，Y.Hahn，et al.(2004).″Gene cataloging and expressionprofiling in human gastric cancer cells by expressed sequence tags.″Genomics83(6)：1024-1045.

Konig，R.(2002).″Interactions between MHC molecules and co-receptorsof the TCR.″Curr OpinImmunol14(1)：75-83.

Lei，L.，J.Wu，et al.(2016).″CIZ1 interacts with YAP and activates itstranscriptional activity in hepatocellular carcinoma cells.″Tumour Biol37(8)：11073-11079.

Liu，Q.，N.Niu，et al.(2016).″The Role of Cdkn1A-Interacting Zinc FingerProtein 1(CIZ1)in DNA Replication and Pathophysiology.″Int J Mol Sci17(2)：212.

Liu，T.，X.Ren，et al.(2015).″Ciz1 promotes tumorigenicity of prostatecarcinoma cells.″FrontBiosci(Landmark Ed)20：705-715.

Mitsui，K.，A.Matsumoto，et al.(1999).″Cloning and characterization of anovel p21(Cip1/Wafl)-interacting zinc finger protein，ciz1.″Biochem Biophys ResCommun264(2)：457-464.

Pauzaite，T.，U.Thacker，et al.(2016).″Emerging Roles for Ciz1 in CellCycle Regulation and as a Driver of Tumorigenesis.″Biomolecules7(1).

Rahman，F.，J.F.Ainscough，et al.(2007).″Cancer-associated missplicingof exon 4 influences the subnuclear distribution of the DNA replicationfactor CIZ1.″Hum Mutat28(10)：993-1004.

Rahman，F.A.，N.Aziz，et al.(2010).″Differential detection ofalternatively spliced variants of Ciz1 in normal and cancer cells using acustom exon-junction microarray.″BMC Cancer10：482.

Tomayko，M.M.and C.P.Reynolds(1989).″Determination of subcutaneoustumor size in athymic(nude)mice.″Cancer Chemother Pharmacol24(3)：148-154.

van Kasteren，S.I.，H.Overkleeft，et al.(2014).″Chemical biology ofantigen presentation by MHC molecules.″Curr Opin Immunol26：21-31.

Wang，D.Q.，K.Wang，et al.(2014).″Ciz1 is a novel predictor of survivalin human colon cancer.″Exp Biol Med(Maywood)239(7)：862-870.

Wu，J.，L.Lei，et al.(2016).″CIZ1 is upregulated in hepatocellularcarcinoma and promotes the growth and migration of the cancer cells.″Tumour Biol37(4)：4735-4742.

Yin，J.，C.Wang，et al.(2013).″CIZ1 regulates the proliferation，cycledistribution and colony formation of RKO human colorectal cancer cells.″Mol Med Rep8(6)：1630-1634.

Zhang，D.，Y.Wang，et al.(2015).″CIZ1 promoted the growth and migrationof gallbladder cancer cells.″Tumour Biol36(4)：2583-2591.

Claims (10)

1.分离的抗体，能够与细胞表面的CIZ1全长蛋白质(序列号码1)和变异体(序列号码2；序列号码3)和/或其片断特异性结合。

2.根据权利要求1，所述抗体包括，全长抗体、多特异抗体(multispecific antibody)、双特异抗体(bispecific antibody)、单价抗体(monovalent antibody)、多价抗体(multivalent antibody)、抗独特型抗体(anti-idiotypic antibody)、微型双功能抗体(diabody)、Fab片段、F(ab′)₂片段、Fv片段、ScFv片段，和其他免疫反应片断，以及融合蛋白质。

3.根据权利要求1，所述抗体是嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、灵长类来源抗体，和其他动物来源抗体。

4.根据权利要求1，所述抗体是IgA、IgD、IgE、IgG、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM。

5.根据权利要求1，所述抗体的轻链可变区具有列于序列号码5的氨基酸序列，重链可变区具有列于序列号码7的氨基酸序列。

6.根据权利要求1，所述抗体包括抗体与细胞毒性物质相连接(ADC)。

7.根据权利要求1，所述抗体为药品组成成分，用于癌症的治疗。

8.根据权利要求1，所述抗体为诊断试剂盒的组成成分，用于癌症的诊断和检测。

9.根据权利要求1，所述抗体用于嵌合抗原受体细胞免疫疗法。

10.根据权利要求1，所述抗体作为单独治疗药物，作为联合治疗药物与其他治疗药物和治疗方法联合用于癌症治疗。