ES2674420T3 - Anticuerpos anti-DLL3 - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo que se une a la proteína DLL3 como principio activo, en la que el anticuerpo tiene una actividad citotóxica.

Description

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DESCRIPCION

Anticuerpos anti-DLL3 Campo de la invención

La presente solicitud reivindica la prioridad basada en la solicitud de patente japonesa N.° 2010-019391 (presentada el 29 de enero de 2010).

La presente invención se refiere a un agente anticanceroso Antecedentes de la técnica

El cáncer de pulmón microcítico representa aproximadamente el 20 % de la incidencia global de cáncer de pulmón. El cáncer de pulmón microcítico progresa rápidamente y es difícil extirparlo quirúrgicamente porque en muchos casos la metástasis a los ganglios linfáticos o la metástasis a distancia ya se ha producido en el momento del diagnóstico. Este cáncer muestra altas tasas de respuesta a un agente anticanceroso en su etapa inicial. Por lo tanto, la quimioterapia se considera la primera opción para tratar el cáncer. El cáncer, sin embargo, se vuelve resistente inmediatamente a la quimioterapia y reaparece, lo que resulta en una tasa de supervivencia a los 3 años del 5 % o inferior. Por lo tanto, existe necesidad de una nueva terapia.

La proteína delta-like 3 (DLL3) es una proteína de membrana de tipo I que pertenece a la familia de ligandos de Notch. DLL3 es necesaria para la formación y desarrollo del patrón normal de somitas. Las mutaciones en DLL3 provocan defectos costales o espondilolisis en pacientes con disostosis espondilocostal autosómica recesiva [Bibliografía No de patente 1 y 2]. DLL1 se localiza en la superficie de la célula y se une a Notch, mientras que DLL3 se localiza predominantemente en el aparato de Golgi y no se une a Notch [Bibliografía No de patente 3 y 4].

Existen estudios previos que describen la amplificación del gen DLL3 en el cromosoma y el aumento de la expresión de este gen en líneas celulares de cáncer de páncreas [Literatura No de patente 5] y una mayor expresión de DLL3 en algunos casos de glioma [Literatura No de patente 6]. Sin embargo, la cantidad de proteína DLL3 en la superficie celular todavía no se ha descrito. Se requiere la expresión de 105 o más moléculas de antígeno para moléculas de anticuerpos no modificados o incluso del orden de 104 moléculas de antígeno para los anticuerpos defucosilados que tienen una mayor capacidad de inducir citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), para dirigir las moléculas de antígeno en la superficie celular usando tales anticuerpos o para destruir células cancerosas mediante el mecanismo antitumoral de la actividad ADCC [Literatura No de patente 7]. Por lo tanto, no está claro si DLL3 es adecuado como diana terapéutica basada en anticuerpos.

Los anticuerpos monoclonales anti-DLL3 de ratón (MAB4315, R&D Systems, Inc.) ya están comercializados como reactivos de investigación.

Lista de citas

Bibliografía No de patente

Bibliografía No de patente 1: Bulman, M. P. et al. (2000) Nat Genet 24, 438-441.

Bibliografía No de patente 2: Turnpenny, P. D. et al. (2003) J Med Genet 40, 333-339.

Bibliografía No de patente 3: Geffers, I. et al. (2007) J Cell Biol 178, 465-476.

Bibliografía No de patente 4: Ladi, E. et al. (2005) J Cell Biol 170, 983-992.

Bibliografía No de patente 5: Phillips, H. S. (2006) Cancer Cell 9, 157-173.

Bibliografía No de patente 6: Mulledndore, M. E. (2009) Clin Cancer Res 15, 2291-2301.

Bibliografía No de patente 7: Kenya Shitara (2009) YAKUGAKU ZASSHI 129, 3-9.

Los siguientes documentos adicionales también se mencionan:

• Millipore “Anti-Delta 3, clon 1E7.2”, cita de Internet, páginas 1-3, XP002697359;

• Tianyun et al (2009) Cancer Research, 69 (3): 845-854 que se refiere al homólogo del complejo Achaete-Scute 1 como regulador de la capacidad de iniciación tumoral en el cáncer de pulmón microcítico humano; y

• WO2007/111733 que se refiere a métodos para el diagnóstico, pronóstico y tratamiento del glioma.

Resumen de la invención Problema técnico

Un objeto de la presente invención es proporcionar un nuevo anticuerpo, un agente anticanceroso que comprende el mismo, y un método para diagnosticar el cáncer usando el mismo.

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Solución al problema

Los presentes inventores encontraron que la expresión del ARNm de DLL3 aumentaba en el cáncer de pulmón microcítico. Su expresión fue baja en todos los tejidos normales a excepción del cerebro fetal. Los presentes inventores prepararon anticuerpos monoclonales contra la proteína DLL3. El nivel de antígeno en la superficie celular medido en función de la capacidad de unión al anticuerpo fue solo inferior a 104 por célula con expresión. Inesperadamente, los presentes inventores encontraron que un anticuerpo que se unía a DLL3 a través de un epítopo característico en las proximidades del extremo C del dominio extracelular residía de manera estable en la membrana celular y tenía una actividad inductora de ADCC. Específicamente, los presentes inventores seleccionaron sucesivamente un anticuerpo que tiene una actividad antitumoral. Además, los presentes inventores encontraron que un anticuerpo conjugado con toxina tenía una actividad citotóxica contra células que expresan DLL3. A partir de estos hallazgos, los presentes inventores encontraron que el anticuerpo anti-DLL3 era útil en el diagnóstico, prevención y tratamiento del cáncer primario o metastásico que expresaba DLL3. En base a estos hallazgos, se ha completado la presente invención.

Por consiguiente, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo que se une a la proteína DLL3 como un principio activo, en la que el anticuerpo tiene una actividad citotóxica. La presente invención proporciona además una composición farmacéutica de la invención para su uso en un método para tratar el cáncer, en la que el agente anticanceroso se dirige al cáncer de pulmón.

La composición farmacéutica de la presente invención comprende un anticuerpo que se une a la proteína DLL3, en la que el anticuerpo tiene una actividad citotóxica. De forma particularmente preferible, la actividad citotóxica es una actividad citotóxica celular dependiente de anticuerpos (actividad ADCC). También preferiblemente, el anticuerpo tiene una actividad de internalización. También preferiblemente, el anticuerpo está conjugado con una sustancia citotóxica. También preferiblemente, el anticuerpo reconoce una región de los aminoácidos 216 a 492 en la DLL3 humana que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1.

En otro aspecto, la composición farmacéutica de la invención comprende un anticuerpo seleccionado de anticuerpos que se unen a la proteína DLL3 descrita en cualquiera de los siguientes:

(1) un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la CDR1 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 12, la CDR2 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 13 y la CDR3 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 14, y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR1 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 18, la cDR2 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 19, y la CDR3 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 20;

(2) un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la CDR1 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 24, la CDR2 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 25 y la CDR3 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 26, y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR1 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 30, la cDR2 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 31, y la CDR3 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 32;

(3) un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la CDR1 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 36, la CDR2 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 37 y la CDR3 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 38, y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR1 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 42, la CDR2 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 43, y la CDR3 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 44;

(4) un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la CDR1 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 48, la CDR2 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 49 y la CDR3 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 50, y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR1 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 54, la CDR2 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 55 y la CDR3 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 56;

y

(5) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el de la proteína DLL3 al que se une cualquiera de los anticuerpos (1) a (4).

Una composición farmacéutica de la presente invención puede comprender cualquiera de los anticuerpos descritos anteriormente como un principio activo que se une a DLL3 y tiene actividad citotóxica. La presente invención también proporciona el uso de una composición farmacéutica de la invención en un método para tratar el cáncer, en el que el agente anticanceroso se dirige al cáncer de pulmón.

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También se hace referencia a un método para diagnosticar el cáncer, que comprende las siguientes etapas:

(a) proporcionar una muestra aislada de un sujeto de prueba; y

(b) detectar el nivel de expresión de la proteína DLL3 o del gen DLL3 en la muestra. Preferiblemente, el método de diagnóstico está destinado al diagnóstico del cáncer de pulmón. También se hace referencia a un agente de diagnóstico para el cáncer que comprende cualquiera de los anticuerpos descritos anteriormente.

Breve descripción de los dibujos

[Figura 1] La Figura 1 muestra una mayor expresión de DLL3 en el cáncer de pulmón microcítico y en el cerebro del feto.

[Figura 2] La Figura 2 muestra la unión de un anticuerpo monoclonal anti-DLL3 a una proteína DLL3 soluble. [Figura 3] La Figura 3 muestra la unión de un anticuerpo a la proteína DLL3 en una membrana celular y el recambio del anticuerpo unido a la célula.

[Figura 4] La Figura 4 muestra la inducción de ADCC por un anticuerpo anti-DLL3 (concentración: 2,5 pg/ml). [Figura 5] La Figura 5 muestra la dependencia de la concentración de anticuerpo de una actividad de ADCC contra las células diana DLL3/BaF3 (a) y NCI-H1184 (b).

[Figura 6] La Figura 6 muestra la inhibición del crecimiento celular mediante la absorción de un anticuerpo anti- DLL3 y un anticuerpo secundario anti-ratón Mab-ZAP marcado con toxina.

[Figura 7] La Figura 7 muestra la unión de un anticuerpo recombinante anti-DLL3 a la proteína DLL3 en la superficie celular.

[Figura 8] La Figura 8 muestra la unión de un anticuerpo quimérico humano recombinante anti-DLL3 a una proteína DLL3 soluble y la competencia por la unión de un anticuerpo quimérico anti-DLL3 con un anticuerpo de ratón contra una proteína DLL3 soluble.

[Figura 9] La Figura 9 muestra la estructura esquemática de las proteínas DLL3 de longitud completa y solubles y un sitio reconocido por un anticuerpo anti-DLL3.

[Figura 10] La Figura 10 muestra la unión de un anticuerpo quimérico humano recombinante anti-DLL3 DL306 a la proteína DLL3 en la superficie celular.

[Figura 11] La Figura 11 muestra la dependencia de la concentración de anticuerpo de la actividad de ADCC de un anticuerpo quimérico humano anti-DLL3 contra las células diana DLL3/BaF3 y NCI-H1184.

[Figura 12] La Figura 12 muestra la dependencia de la concentración de anticuerpo de la actividad ADCC de un anticuerpo anti-DLL3 de ratón con una baja proporción de residuos de fucosa contra las células diana DLL3/BaF3 y NCI-H1184.

Descripción de las realizaciones

DLL3

La secuencia de aminoácidos de DLL3 (Delta-like 3) es conocida en la técnica. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de DLL3 humana es expuesta en la SEQ ID NO: 1 (NM_016941), y la secuencia de aminoácidos de DLL3 de ratón es expuesta en la SEQ ID NO: 2 (NM_007866).

La proteína DLL3 usada en la presente invención puede ser una proteína DLL3 que tiene la secuencia descrita anteriormente o puede ser una proteína modificada que tiene una secuencia derivada de la secuencia descrita anteriormente mediante la modificación de uno o más aminoácidos. Los ejemplos de la proteína modificada que tiene una secuencia derivada de la secuencia descrita anteriormente mediante la modificación de uno o más aminoácidos pueden incluir polipéptidos que tienen 70 % o más, preferiblemente 80 % o más, más preferiblemente 90 % o más, incluso más preferiblemente 95 % o más homología con la secuencia de aminoácidos. En otra alternativa, pueden usarse péptidos parciales de estas proteínas DLL3.

La proteína DLL3 usada en la presente invención no está limitada por su origen y es preferiblemente una proteína humana DLL3.

Anticuerpo anti-DLL3

El anticuerpo anti-DLL3 usado en la presente invención solo necesita unirse a la proteína DLL3 y no está particularmente limitado por su origen, tipo, forma, etc., pero tiene una actividad citotóxica. Específicamente, se puede usar un anticuerpo, tal como un anticuerpo derivado de un animal no humano (por ejemplo, un anticuerpo de ratón, rata o camello), un anticuerpo derivado de un ser humano, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado. El anticuerpo anti-DLL3 usado en la presente invención puede ser un anticuerpo policlonal o monoclonal y es preferiblemente un anticuerpo monoclonal.

El anticuerpo anti-DLL3 usado en la presente invención es preferiblemente un anticuerpo anti-DLL3 humana. El anticuerpo anti-DLL3 humana puede ser un anticuerpo que se une específicamente a la DLL3 humana o puede ser un anticuerpo que se une a la DLL3 humana así como la DLL3 derivada de un animal no humano (por ejemplo, DLL3 de ratón).

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El anticuerpo anti-DLL3 usado en la presente invención se puede obtener como un anticuerpo policlonal o monoclonal usando medios conocidos en la técnica. El anticuerpo anti-DLL3 usado en la presente invención es particularmente preferiblemente un anticuerpo monoclonal derivado de mamífero. El anticuerpo monoclonal derivado de mamífero abarca, por ejemplo, los producidos por hibridomas y los producidos por hospedadores transformados con vectores de expresión que contienen un gen de anticuerpo mediante un enfoque de ingeniería genética.

El anticuerpo anti-DLL3 de la presente invención se puede modificar con varias moléculas tales como polietilenglicol (PEG). Como se describe más adelante, el anticuerpo anti-DLL3 de la presente invención también se puede modificar con un agente quimioterapéutico, un producto químico radioactivo o similar, que tiene una actividad citotóxica.

Los ejemplos del anticuerpo usado en la presente invención, que reconoce DLL3 y se une a los mismos, pueden incluir los siguientes anticuerpos:

(1) un anticuerpo (DL301) que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la CDR1 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 12, la CDR2 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 13, y la CDR3 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 14, y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR1 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 18, la cDR2 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 19, y la CDR3 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 20;

(2) un anticuerpo (DL306) que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la CDR1 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 24, la CDR2 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 25, y la CDR3 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 26, y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR1 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 30, la CDR2 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 31, y la CDR3 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 32;

(3) un anticuerpo (DL309) que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la CDR1 de

la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 36, la CDR2 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 37, y la CDR3 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 38, y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR1 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 42, la CDR2 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 43, y la

CDR3 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 44;

(4) un anticuerpo (DL312) que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la CDR1 de

la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 48, la CDR2 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 49 y la CDR3 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 50, y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR1 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 54, la CDR2 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 55, y la

CDR3 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 56; y

(5) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el de la proteína DLL3 al que se une cualquiera de los anticuerpos (1) a (4).

Los anticuerpos (1) a (5) pueden contener regiones constantes. Las regiones constantes utilizadas no están particularmente limitadas, y se puede usar cualquier región constante. Los ejemplos preferibles de las regiones constantes usadas en la presente invención pueden incluir regiones constantes derivadas de seres humanos. Por ejemplo, una región constante derivada de IgG1 humana, derivada de IgG2 humana, derivada de IgG3 humana o derivada de IgG4 humana puede usarse como una región constante de la cadena pesada. Además, por ejemplo, la región constante derivada de la cadena k humana o derivada de cadena A humana puede usarse como una región constante de la cadena ligera. Las regiones constantes usadas en la presente invención pueden ser regiones constantes que tienen una secuencia nativa o pueden ser regiones constantes modificadas que tienen una secuencia derivada de la secuencia nativa mediante la modificación de uno o más aminoácidos.

Los anticuerpos (1) a (5) pueden contener FR (regiones estructurales). Las FR utilizadas no están particularmente limitadas, y se puede usar cualquier FR siempre que el anticuerpo resultante mantenga su actividad de unión contra la DLL3 humana. Los ejemplos preferibles de las FR usadas en la presente invención pueden incluir FR derivadas de anticuerpos humanos. Dado que la técnica de reemplazo de FR con la actividad de unión a antígeno de un anticuerpo mantenido es conocida en la técnica, los expertos en la materia pueden seleccionar FR de manera apropiada. Las FR usadas en la presente invención pueden ser FR que tienen una secuencia nativa o pueden ser FR que tienen una secuencia derivada de la secuencia nativa mediante la modificación de uno o más aminoácidos.

Los ejemplos de la región variable de la cadena pesada que comprende la CDR1 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 12, la CDR2 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 13 y la CDR3 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos

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expuesta en la SEQ ID NO: 14 pueden incluir una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 9. Además, ejemplos de la cadena pesada que comprende la región variable de la cadena pesada pueden incluir una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 10 u 11.

Los ejemplos de la región variable de la cadena pesada que comprende la CDR1 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 24, la CDR2 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 25 y la CDR3 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 26 pueden incluir una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 21. Además, los ejemplos de la cadena pesada que comprenden la región variable de la cadena pesada pueden incluir una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 22 o 23.

Los ejemplos de la región variable de la cadena pesada que comprende la CDR1 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 36, la CDR2 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 37 y la CDR3 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 38 pueden incluir una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 33. Además, los ejemplos de la cadena pesada que comprenden la región variable de la cadena pesada pueden incluir una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 34 o 35.

Los ejemplos de la región variable de la cadena pesada que comprende la CDR1 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 48, la CDR2 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 49 y la CDR3 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 50 pueden incluir una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 45. Además, los ejemplos de la cadena pesada que comprende la región variable de la cadena pesada pueden incluir una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 46 o 47.

Los ejemplos de la región variable de la cadena ligera que comprende la CDR1 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 18, la CDR2 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 19, y la CDR3 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 20 pueden incluir una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 15. Además, los ejemplos de la cadena ligera que comprende la región variable de la cadena ligera pueden incluir una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 16 o 17.

Los ejemplos de la región variable de la cadena ligera que comprende la CDR1 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 30, la CDR2 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 31, y la CDR3 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 32 pueden incluir una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 27. Además, los ejemplos de la cadena ligera que comprende la región variable de la cadena ligera pueden incluir una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 28 o 29.

Los ejemplos de la región variable de la cadena ligera que comprende la CDR1 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 42, la CDR2 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 43, y la CDR3 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 44 pueden incluir una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 39. Además, los ejemplos de la cadena ligera que comprende la región variable de la cadena ligera pueden incluir una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 40 o 41.

Los ejemplos de la región variable de la cadena ligera que comprende la CDR1 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 54, la CDR2 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 55, y la CDR3 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 56 pueden incluir una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 51. Además, los ejemplos de la cadena ligera que comprende la región variable de la cadena ligera pueden incluir una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 52 o 53.

En la presente invención, la frase “que tiene una actividad equivalente a la del anticuerpo de la presente invención” se refiere a que tiene una actividad de unión a DLL3, una actividad de internalización y/o una actividad citotóxica (actividad ADCC, etc.) contra las células que expresan DLL3 equivalente a la misma. En la presente invención, no se requiere necesariamente que la actividad equivalente sea una actividad idéntica y puede ser, por ejemplo, 50 % o más, preferiblemente 70 % o más, más preferiblemente 90 % o más de actividad comparada con la actividad de

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cualquiera de los anticuerpos (1) a (12). Los ejemplos del límite superior de la actividad pueden incluir, pero no se limitan particularmente a, 1000 % o menos, 500 % o menos, 300 % o menos, 150 % o menos y 100 % o menos.

Un anticuerpo derivado del anticuerpo de la presente invención mediante la sustitución, deleción, adición y/o inserción de uno o más aminoácidos también se incorpora en el alcance de la presente invención y puede prepararse artificialmente o presentarse de forma natural. Los ejemplos de un método para introducir una mutación en el polipéptido incluyen mutagénesis dirigida al sitio (Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275, Zoller, MJ, and Smith, M. (1983) Methods Enzymol. 100, 468-500, Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 94419456, Kramer W, and Fritz HJ (1987) Methods. Enzymol. 154, 350-367, Kunkel, TA (1985) Proc Natl Acad Sci USA. 82, 488-492, Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766). Este es uno de los métodos bien conocidos por los expertos en la materia para preparar un polipéptido funcionalmente equivalente a un cierto polipéptido. Los expertos en la materia pueden introducir apropiadamente una mutación en el anticuerpo de la presente invención usando dicho método y de ese modo preparar un anticuerpo funcionalmente equivalente al anticuerpo. Además, las mutaciones de aminoácidos pueden ocurrir en el mundo natural. Tal anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo de la presente invención mediante la mutación de uno o más aminoácidos y es funcionalmente equivalente al anticuerpo también está abarcado por el anticuerpo de la presente invención.

El número de aminoácidos mutados en dicha variante generalmente es de 50 aminoácidos, preferiblemente es de 30 aminoácidos, más preferiblemente es de 10 aminoácidos (por ejemplo, es de 5 aminoácidos).

Para que los restos de aminoácidos se muten, se prefiere que esta mutación se realice conservativamente entre aminoácidos que tengan la misma propiedad de cadena lateral. Por ejemplo, se ha establecido la siguiente clasificación basada en las propiedades de las cadenas laterales de aminoácidos:

aminoácidos hidrófobos (A, I, L, M, F, P, W, Y y V), aminoácidos hidrófilos (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S y T ),

aminoácidos que tienen una cadena lateral alifática (G, A, V, L, I y P),

aminoácidos que tienen una cadena lateral que contiene un grupo hidroxi (S, T e Y)

aminoácidos que tienen una cadena lateral que contiene átomos de azufre (C y M),

aminoácidos que tienen una cadena lateral que contiene ácido carboxílico y amida (D, N, E y Q),

aminoácidos que tienen una cadena lateral que contiene una base (R, K y H), y

aminoácidos que tienen una cadena lateral aromática que contiene un grupo aromático (H, F, Y y W)

(todos los símbolos dentro de los paréntesis representan códigos de una sola letra de aminoácidos).

Se sabe ya que un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos modificada a partir de cierta secuencia de aminoácidos mediante la deleción y/o adición de uno o más restos de aminoácidos y/o la sustitución del mismo por otros aminoácidos mantiene la actividad biológica del polipéptido original (Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666, Zoller, M. J. and Smith, M., Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500, Wang, A. et al., Science 224, 1431-1433, Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-6413). Específicamente, cuando los aminoácidos en una secuencia de aminoácidos que constituyen un cierto polipéptido se sustituyen por aminoácidos clasificados en el mismo grupo, generalmente se dice que es probable que el polipéptido mantenga su actividad. En la presente invención, la sustitución entre aminoácidos dentro del mismo grupo de aminoácidos descrito anteriormente se denomina sustitución conservativa.

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica de la invención que comprende un anticuerpo que se une al mismo epítopo al que se une cualquiera de los anticuerpos (1) a (4). Los ejemplos específicos de los anticuerpos (1) a (4) pueden incluir los anticuerpos DL301, DL306, DL309 y DL312 descritos a continuación en los Ejemplos. Específicamente, la presente invención también puede emplear un anticuerpo que reconoce el mismo epítopo que el reconocido por cualquiera de estos anticuerpos.

Si un anticuerpo analito comparte o no un epítopo con un cierto anticuerpo puede confirmarse basándose en su competencia por el mismo epítopo. La competencia entre los anticuerpos se detecta mediante el ensayo de bloqueo cruzado o similar. El ensayo de bloqueo cruzado es preferiblemente, por ejemplo, ensayo de ELISA competitivo.

Específicamente, el ensayo de bloqueo cruzado implica preincubar proteínas DLL3 revestidas en los pocillos de una placa de microtitulación en presencia o ausencia de un anticuerpo competidor candidato y luego añadir al mismo el anticuerpo anti-DLL3 de la presente invención. La cantidad del anticuerpo anti-DLL3 de la presente invención unido a la proteína DLL3 en cada pocillo se correlaciona indirectamente con la capacidad de unión del anticuerpo competidor candidato (anticuerpo analito) que compite con la misma por la unión al mismo epítopo. Específicamente, la mayor afinidad del anticuerpo analito por el mismo epítopo da como resultado una menor cantidad del anticuerpo anti-DLL3 de la presente invención unido al pocillo recubierto con proteína DLL3 y, en su lugar, una mayor cantidad del anticuerpo analito unido al pocillo recubierto con proteína DLL3.

La cantidad de cada anticuerpo unido al pocillo se puede determinar fácilmente marcando el anticuerpo por adelantado. Por ejemplo, un anticuerpo biotinilado puede ensayarse usando un conjugado de avidina-peroxidasa y un sustrato apropiado. El ensayo de bloqueo cruzado que usa marcaje enzimático (por ejemplo, peroxidasa) se

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denomina particularmente ensayo ELISA competitivo. El anticuerpo puede marcarse con cualquiera de otros materiales de marcaje detectables o medibles. Específicamente, por ejemplo, el marcaje radioactivo o fluorescente es conocido en la técnica.

Además, cuando el anticuerpo analito tiene regiones constantes derivadas de una especie diferente de la del anticuerpo anti-DLL3 de la presente invención, la cantidad de cualquier anticuerpo unido al pocillo también puede medirse usando un anticuerpo marcado que reconoce cualquier región constante. Como alternativa, incluso los anticuerpos que difieren en clase, aunque derivados de la misma especie, se pueden medir para sus respectivas cantidades unidas al pozo usando anticuerpos que discriminan cada clase.

Siempre que el anticuerpo candidato pueda bloquear la unión del anticuerpo anti-DLL3 en al menos un 20 %, preferiblemente al menos un 30 %, más preferiblemente al menos un 50 %, incluso más preferiblemente al menos un 80 %, en comparación con la actividad de unión obtenida en la prueba de control realizada en ausencia del anticuerpo competidor, este anticuerpo candidato se determina como un anticuerpo que se une sustancialmente al mismo epítopo al que se une el anticuerpo anti-DLL3 de la presente invención o como un anticuerpo que compite con el mismo por la unión al mismo epítopo.

Otros ejemplos del anticuerpo empleado en una composición farmacéutica de la presente invención pueden incluir un anticuerpo que reconoce una región de los aminoácidos 27 a 175 de la DLL3 humana (SEQ ID NO: 1) y un anticuerpo que reconoce una región de los aminoácidos 216 a 492 de la DLL3 humana. Los ejemplos de otro aspecto del anticuerpo empleado en una composición farmacéutica de la presente invención pueden incluir un anticuerpo que se une a la DLL3 humana pero que no se une a un polipéptido (DLL3delta1-Fc) que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 o un polipéptido (DLL3delta2-Fc) que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7, y un anticuerpo que se une a la DLL3 humana y también se une al polipéptido (DLL3delta1-Fc) que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 y el polipéptido (DLL3delta2-Fc) que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7.

El anticuerpo empleado en una composición farmacéutica de la presente invención tiene actividades tales como una actividad ADCC y una actividad de internalización y, como tal, es útil como un fármaco farmacéutico, particularmente, un agente anticanceroso, en el que el cáncer es cáncer de pulmón. El anticuerpo tiene una actividad citotóxica.

Anticuerpo anti-DLL3 genéticamente recombinante

El anticuerpo a administrar a los humanos se puede convertir en un anticuerpo genéticamente recombinante que se ha diseñado artificialmente, por ejemplo, con el fin de reducir la heteroantigenicidad en humanos. El anticuerpo genéticamente recombinante abarca, por ejemplo, anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados. Estos anticuerpos modificados genéticamente se pueden producir usando un método conocido en la técnica.

(1) Anticuerpo quimérico

Los anticuerpos quiméricos se refieren a anticuerpos que comprenden regiones variables y constantes de diferentes orígenes ligados entre sí. Por ejemplo, los anticuerpos quiméricos heterogéneos de ratón-humano son anticuerpos que comprenden las regiones variables de la cadena pesada y ligera de un anticuerpo de ratón y las regiones constantes de la cadena pesada y ligera de un anticuerpo humano. Los ADN que codifican la región variable del anticuerpo de ratón se ligan con ADN que codifican la región constante del anticuerpo humano, y los productos de ligación se pueden incorporar en vectores de expresión para preparar vectores recombinantes que expresan el anticuerpo quimérico. Las células transformadas con estos vectores (células recombinantes) se pueden cultivar para la expresión del inserto de ADN para obtener los anticuerpos quiméricos producidos durante el cultivo.

Las regiones constantes del anticuerpo humano se usan como las regiones constantes de los anticuerpos quiméricos. Por ejemplo, Cy1, Cy2, Cy3, Cy4, Cp, Có, Cal, Ca2 y Cs se pueden usar como regiones constantes de la cadena pesada. Además, Ck y CA se pueden usar como regiones constantes de la cadena ligera. Las secuencias de aminoácidos de estas regiones constantes y las secuencias de nucleótidos que las codifican son conocidas en la técnica. Además, uno o más aminoácidos en las regiones constantes del anticuerpo humano se pueden sustituir, delecionar, añadir y/o insertar para mejorar la estabilidad del propio anticuerpo o de su producción.

(2) Anticuerpo humanizado

En general, los anticuerpos quiméricos comprenden regiones variables de anticuerpos derivados de animales no humanos y regiones constantes derivadas de anticuerpos humanos. Por el contrario, los anticuerpos humanizados comprenden regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de anticuerpos derivados de animales no humanos, regiones estructurales (FR) derivadas de anticuerpos humanos, y regiones constantes derivadas de anticuerpos humanos. Los anticuerpos humanizados también se llaman anticuerpos humanos reconfigurados. Específicamente, por ejemplo, los anticuerpos humanizados que comprenden CDR de anticuerpos de animales no humanos (por ejemplo, ratón) injertados en anticuerpos humanos son conocidos en la técnica. Los anticuerpos

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humanizados son útiles como principios activos para un agente terapéutico de la presente invención, debido a su antigenicidad reducida en el cuerpo humano.

Cada región variable de anticuerpo normalmente comprende 3 CDR flanqueadas por 4 FR. Las regiones CDR determinan sustancialmente la especificidad de unión del anticuerpo. Las CDR tienen diversas secuencias de aminoácidos. Por otro lado, las secuencias de aminoácidos que constituyen las FR a menudo exhiben una alta homología entre los anticuerpos que tienen diferentes especificidades de unión. Por lo tanto, en general, la especificidad de unión de un determinado anticuerpo puede trasplantarse supuestamente a otros anticuerpos mediante injerto de la CDR.

También se conocen enfoques generales de recombinación génica para obtener los anticuerpos humanizados. Específicamente, por ejemplo, la PCR de extensión solapada se conoce en la técnica como un método para injertar CDR de anticuerpo de ratón en FR humanas. La PCR de extensión de solapamiento emplea cebadores para la síntesis de FR de anticuerpos humanos que comprende una secuencia de nucleótidos adicional que codifica cada CDR de anticuerpo de ratón que se va a injertar. Los cebadores están preparados para cada una de los 4 FR. En el injerto de CDR de ratón en las FR humanas, en general, es supuestamente ventajoso seleccionar FR humanas altamente homólogas a las FR de ratón para mantener las funciones de la CDR. Específicamente, generalmente se prefiere usar FR humanas que comprenden secuencias de aminoácidos altamente homólogas a las de las FR adyacentes a las CDR de ratón a injertar.

Además, las secuencias de nucleótidos a ligar están diseñadas de manera que están conectadas en el marco. Las secuencias de nucleótidos que codifican FR humanas se sintetizan individualmente usando sus cebadores respectivos. Como resultado, se obtienen productos que comprenden el ADN codificador de CDR de ratón añadido a cada secuencia de codificación de FR. La secuencia de nucleótidos que codifica la CDR de ratón en cada producto está diseñada de tal manera que la secuencia de nucleótidos se superpone con otra. Posteriormente, las partes de la CDR superpuestas se hibridan entre sí para la reacción de síntesis de la cadena complementaria. A través de esta reacción, las secuencias de FR humana se ligan a través de las secuencias de CDR de ratón.

Por último, el gen de longitud completa de la región variable que comprende 3 CDR y 4 FRs ligadas se amplifica con cebadores que se hibridan respectivamente con sus extremos 5 'y 3' y comprenden una secuencia de reconocimiento adicional para una enzima de restricción apropiada. El ADN así obtenido y el ADN que codifica la región constante del anticuerpo humano pueden insertarse en vectores de expresión de manera que se fusionen en el marco para preparar vectores para la expresión del anticuerpo humanizado. Los hospedadores se transforman con estos vectores para establecer células recombinantes, que luego se cultivan para la expresión del ADN que codifica el anticuerpo humanizado para producir los anticuerpos humanizados en los cultivos de las células cultivadas (véase la Publicación de Patente Europea N.° EP 239400 y la Publicación Internacional N.° WO 96/02576).

Los anticuerpos humanizados así preparados pueden evaluarse para sus actividades de unión para el antígeno mediante ensayo cualitativo o cuantitativo. Como resultado, las FR de anticuerpo humano se pueden seleccionar preferiblemente de modo que permitan que las CDR formen un sitio de unión a un antígeno favorable cuando se ligan a través de las CDR. Si es necesario, los restos de aminoácidos de las FR pueden estar sustituidos de manera que las CDR del anticuerpo humanizado formen un sitio de unión al antígeno apropiado. Por ejemplo, se puede introducir una mutación en la secuencia de aminoácidos de la FR aplicando el método de PCR usado en el injerto de la CDR de ratón en las FR humanas. Específicamente, se puede introducir una mutación de una secuencia de nucleótidos parcial en los cebadores que se hibridan con la secuencia de nucleótidos de la FR. La secuencia de nucleótidos de la FR sintetizada usando tales cebadores contiene la mutación así introducida. Los anticuerpos variantes que tienen el o los aminoácidos sustituidos se pueden evaluar en cuanto a sus actividades de unión para el antígeno mediante el mismo ensayo que antes para seleccionar secuencias FR variantes que tengan la propiedad deseada (Sato, K. et al., Cancer Res, 1993, 53, 851-856).

(3) Anticuerpo polivalente

El anticuerpo presente en una composición farmacéutica de la presente invención abarca no solo anticuerpos bivalentes tipificados por IgG (IgG1, IgG2, IgG4, etc.) sino también anticuerpos monovalentes o anticuerpos polivalentes tipificados por IgM siempre que estos anticuerpos se unan a la proteína DLL3. El anticuerpo polivalente que puede estar presente en una composición farmacéutica de la presente invención abarca anticuerpos polivalentes que tienen sitios de unión al antígeno, todos los cuales son iguales entre sí o algunos o todos son diferentes entre sí.

(4) Anticuerpo de bajo peso molecular

El anticuerpo presente en una composición farmacéutica de la presente invención no está limitado a moléculas de anticuerpo completas y puede ser un anticuerpo de bajo peso molecular o una forma modificada del mismo siempre que el anticuerpo se una a la proteína DLL3.

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El anticuerpo de bajo peso molecular abarca un fragmento de anticuerpo deficiente en una porción del anticuerpo completo (por ejemplo, IgG completa). Tal deficiencia parcial de la molécula de anticuerpo se acepta siempre que el fragmento de anticuerpo resultante sea capaz de unirse al antígeno DLL3. Se prefiere que el fragmento de anticuerpo empleado en una composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención contenga una o ambas regiones variables de la cadena pesada (VH) y variables de la cadena ligera (VL). También se prefiere que el fragmento de anticuerpo empleado en una composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención contenga CDR. El número de CDR contenidas en el fragmento de anticuerpo empleado en una composición farmacéutica de la presente invención no está particularmente limitado y es preferiblemente al menos 6 CDR: CDR1, CDR2 y la CDR3 de la cadena pesada y CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera.

La secuencia de aminoácidos de VH o VL puede contener sustitución, deleción, adición y/o inserción. Además, el fragmento de anticuerpo que puede emplearse en una composición farmacéutica de la presente invención puede ser deficiente en una porción de uno o ambas de VH y VL siempre que el fragmento de anticuerpo resultante sea capaz de unirse al antígeno DLL3. Además, su región variable puede ser quimerizada o humanizada. Los ejemplos específicos del fragmento de anticuerpo pueden incluir Fab, Fab', F(ab')2 y Fv. Además, ejemplos específicos del anticuerpo de bajo peso molecular pueden incluir Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv (Fv de cadena sencilla), diacuerpo, sc(Fv)2 ((Fv)2 de cadena sencilla), y scFv-Fc. En la presente invención, el anticuerpo de bajo peso molecular es preferiblemente un diacuerpo o sc(Fv)2. Estos multímeros de anticuerpos (por ejemplo, dímeros, trímeros, tetrámeros y polímeros) también están abarcados por el anticuerpo de bajo peso molecular que se puede emplear en una composición farmacéutica de la presente invención.

Dichos fragmentos del anticuerpo se pueden obtener tratando enzimáticamente el anticuerpo para formar fragmentos de anticuerpos. Las enzimas digestivas rompen el fragmento de anticuerpo en una posición particular para dar fragmentos de anticuerpo que tienen una estructura particular. Por ejemplo, la papaína, la pepsina o la plasmina se conocen en la técnica como enzimas para formar los fragmentos de anticuerpos. La digestión con papaína da F(ab)2 o Fab, mientras que la digestión con pepsina da F(ab')2 o Fab'. Como alternativa, se construyen genes que codifican estos fragmentos de anticuerpo, y estos genes se pueden introducir en vectores de expresión y luego se pueden expresar en células hospedadoras apropiadas (véase, p.ej., Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976, Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology (1989) 178, 497-515, Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1986) 121, 652-663, Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology (1986) 121, 663-669, Bird, R. E. et al., TIBTECH (1991) 9, 132-137).

El uso de un enfoque de ingeniería genética para los fragmentos de anticuerpos obtenidos enzimáticamente puede eliminar una porción arbitraria del anticuerpo. El anticuerpo de bajo peso molecular de acuerdo con la presente invención puede carecer de una región arbitraria siempre que el fragmento de anticuerpo resultante tenga afinidad de unión por DLL3.

i) Diacuerpo

El diacuerpo se refiere a un fragmento de anticuerpo bivalente construido mediante fusión génica (p.ej., Holliger P et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993), EP404.097 y WO 93/11161). El diacuerpo es un dímero que comprende dos cadenas polipeptídicas. Habitualmente, cada una de las cadenas polipeptídicas que constituyen el dímero comprende regiones variables de la cadena pesada y ligera unidas a través de un enlazador en la misma cadena. El enlazador en el diacuerpo es generalmente demasiado corto para permitir el emparejamiento entre regiones las variables de la cadena pesada y ligera en la misma cadena. Específicamente, el número de restos de aminoácidos que constituyen el enlazador es, por ejemplo, aproximadamente 5 restos. Por lo tanto, las regiones variables de la cadena pesada y ligera codificadas en la misma cadena polipeptídica no pueden formar juntas un fragmento de región variable monocatenario. En cambio, forman un dímero emparejando con otro fragmento de región variable de la cadena sencilla. Como resultado, el diacuerpo tiene dos sitios de unión al antígeno.

ii) scFv

El scFv se obtiene uniendo las regiones variables de la cadena pesada y ligera del anticuerpo. En el scFv, las regiones variables de la cadena pesada y ligera se unen a través de un enlazador, preferiblemente, un enlazador peptídico (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 1988, 85, 5879-5883). Las regiones variables de la cadena pesada y ligera en el scFv pueden derivarse de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente memoria descriptiva. El enlazador peptídico que une las regiones variables no está particularmente limitado. Por ejemplo, se puede usar un péptido arbitrario de cadena sencilla de aproximadamente 3 a 25 restos como enlazador. Específicamente, por ejemplo, se puede usar un enlazador peptídico descrito más adelante.

Las regiones variables de ambas cadenas se pueden unir, por ejemplo, mediante PCR. Primero, de las secuencias de ADN que codifican la cadena pesada o la región variable de la cadena pesada del anticuerpo y las secuencias de ADN que codifican la cadena ligera o la región variable de la cadena ligera del anticuerpo, los ADN que codifican la secuencia de aminoácidos completa o parcial deseada se usan como moldes para unir las regiones variables por PCR.

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El ADN que codifica la región variable de la cadena pesada y el ADN que codifica la región variable de la cadena ligera se amplifican por separado mediante PCR usando un par de cebadores que tienen secuencias que corresponden a ambas secuencias terminales de cada ADN a amplificar. Posteriormente, se prepara el ADN que codifica la parte del enlazador peptídico. El ADN que codifica el enlazador peptídico también puede sintetizarse usando PCR. Las secuencias de nucleótidos que se pueden unir al producto de amplificación de cada región variable sintetizada por separado se añaden respectivamente a las secuencias 5' de los cebadores usados en esta PCR. Posteriormente, la reacción de PCR se realiza usando cada ADN de [ADN de la región variable de la cadena pesada] - [ADN del enlazador peptídico] - [ADN de la región variable de la cadena ligera] y cebadores para la PCR de ensamblaje.

Los cebadores para la PCR de ensamblaje comprenden la combinación de un cebador de hibridación con la secuencia 5' del [ADN de la región variable de la cadena pesada] y un cebador de hibridación con la secuencia 3' del [ADN de la región variable de la cadena ligera]. Específicamente, los cebadores para la PCR de ensamblaje son un conjunto de cebadores que es capaz de amplificar el ADN que codifica la secuencia de longitud completa del scFv a sintetizar. Por el contrario, el [ADN del enlazador peptídico] contiene una secuencia de nucleótidos adicional que se puede unir a cada ADN de la región variable. Como resultado, estos ADN se unen y, adicionalmente, se preparan finalmente en un producto de amplificación de scFv de longitud completa usando los cebadores para la PCR de ensamblaje. Una vez que se prepara el ADN que codifica scFv, se pueden obtener vectores de expresión que contienen este ADN y células transformadas con los vectores de expresión (células recombinantes) de acuerdo con un método rutinario. Además, las células recombinantes resultantes se pueden cultivar para la expresión del ADN que codifica scFv para obtener el scFv.

iii) scFv-Fc

El scFv-Fc es un anticuerpo de bajo peso molecular que comprende una región Fc fusionada a scFv (Cellular & Molecular Immunology 2006; 3: 439-443). El origen del scFv utilizado en el scFv-Fc no está particularmente limitado, y, por ejemplo, se puede usar scFv derivado de IgM. Además, el origen del Fc no está particularmente limitado, y, por ejemplo, se puede usar Fc derivado de IgG humana (IgG1 humana, etc.). Por tanto, los ejemplos de un aspecto preferible del scFv-Fc pueden incluir scFv-Fc que comprende un fragmento scFv de anticuerpo IgM unido a CH2 (por ejemplo, Cy2) y CH3 (por ejemplo, Cy3) de IgG1 humana a través de la región bisagra (Hy) de IgG1 humana.

iv) sc(Fv)2

El sc(Fv) 2 es un anticuerpo de bajo peso molecular que tiene una única cadena que comprende dos regiones variables de la cadena pesada (VH) y dos regiones variables de la cadena ligera (VL) unidas a través de enlazadores o similares (Hudson et al., J Immunol. Methods 1999; 231: 177-189). El sc(Fv)2 se puede preparar, por ejemplo, uniendo scFvs a través de un enlazador. En general, se necesitan tres enlazadores para unir cuatro regiones variables de anticuerpos.

Además, el sc(Fv)2 es preferiblemente un anticuerpo en el que dos VH y dos VL se alinean como VH, VL, VH y VL (es decir, [VH]-enlazador-[VL]-enlazador-[VH]-enlazador-[VL]) en este orden comenzando en el extremo N del polipéptido monocatenario.

El orden de dos VH y dos VL no está particularmente limitado a la disposición descrita anteriormente y puede ser de cualquier orden de disposición. Ejemplos del mismo también pueden incluir las siguientes disposiciones:

[VL]-enlazador-[VH]-enlazador-[VH]-enlazador-[VL]

[VH]-enlazador-[VL]-enlazador-[VL]-enlazador-[VH]

[VH]-enlazador-[VH]-enlazador-[VL]-enlazador-[VL]

[VL]-enlazador-[VL]-enlazador-[VH]-enlazador-[VH]

[VL]-enlazador-[VH]-enlazador-[VL]-enlazador-[VH]

Por ejemplo, se puede usar un enlazador peptídico arbitrario o un enlazador compuesto sintético (p. ej., enlazadores divulgados en la referencia Protein Engineering, 9 (3), 299-305, 1996) que se puede introducir mediante ingeniería genética, como el enlazador que une las regiones variables del anticuerpo. Se puede usar una pluralidad de los mismos o diferentes enlazadores. En la presente invención, el enlazador peptídico es preferible. La longitud del enlazador peptídico no está particularmente limitada y puede seleccionarse apropiadamente por los expertos en la materia de acuerdo con el propósito. El número de restos de aminoácidos que constituyen el enlazador peptídico es habitualmente de 1 a 100 aminoácidos, preferiblemente de 3 a 50 aminoácidos, más preferiblemente de 5 a 30 aminoácidos, particularmente preferiblemente de 12 a 18 aminoácidos (por ejemplo, 15 aminoácidos).

La secuencia de aminoácidos que constituye el enlazador peptídico puede ser una secuencia arbitraria siempre que esta secuencia no inhiba el efecto de unión del scFv. Por ejemplo, las siguientes secuencias de aminoácidos se pueden usar para el enlazador peptídico:

Ser

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Gly ■

Ser

Gly ■

Gly ■

Ser

Ser ■

Gly ■ Gly

Gly ■

Gly ■

Gly ■

Ser (SEQ ID NO: 61)

Ser ■

Gly ■ Gly ■ Gly (SEQ ID NO: 62)

Gly ■

Gly ■

Gly ■

Gly Ser (SEQ ID NO: 63)

Ser ■

Gly ■ Gly ■ Gly Gly (SEQ ID NO: 64)

Gly ■

Gly ■

Gly ■

Gly Gly ■ Ser (SEQ ID NO: 65)

Ser ■

Gly ■ Gly ■ Gly Gly ■ Gly (SEQ ID NO: 66)

Gly ■

Gly ■

Gly ■

Gly ■ Gly ■ Gly ■ Ser (SEQ ID NO: 67)

Ser ■

Gly ■ Gly ■ Gly Gly ■ Gly ■ Gly (SEQ ID NO: 68)

(Gly

■ Gly ■ Gly ■ Gly ■ Ser) n

(Ser

■ Gly ■ Gly ■ Gly ■ Gly) n

[n representa un número entero de 1 o más].

La secuencia de aminoácidos del enlazador peptídico puede seleccionarse apropiadamente por los expertos en la materia de acuerdo con el propósito. Por ejemplo, el número entero n que determina la longitud del enlazador peptídico es habitualmente de 1 a 5, preferiblemente de 1 a 3, más preferiblemente de 1 o 2.

Por consiguiente, los ejemplos de un aspecto particularmente preferible del sc(Fv)2 que puede emplearse en una composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención pueden incluir los siguientes sc(Fv)2:

[VH]-enlazador peptídico (15 aminoácidos)-[VL]-enlazador peptídico (15 aminoácidos)-[VH] enlazador peptídico (15 aminoácidos)-[VL].

Como alternativa, las regiones variables también se pueden unir utilizando el enlazador sintetizado químicamente (agente de reticulación química). Los agentes de reticulación habitualmente usados en la reticulación de compuestos peptídicos o similares se pueden usar en la presente invención. Por ejemplo, los agentes de reticulación química como se muestran a continuación son conocidos en la técnica. Estos agentes de reticulación están disponibles comercialmente:

N-hidroxisuccinimida (NHS),

suberato de disuccinimidilo (DSS),

suberato de bis(sulfosuccinimidilo) (BS3),

ditiobis(propionato de succinimidilo) (DSP),

ditiobis(propionato de sulfosuccinimidilo) (DTSSP),

etilenglicol bis(succinato de succinimidilo) (EGS),

etilenglicol bis(succinato de sulfosuccinimidilo) (sulfo-EGS),

tartrato de disuccinimidilo (DST), tartrato de disulfosuccinimidilo (sulfo-DST),

bis[2-(succinimidoxicarboniloxi)etil]sulfona (BSOCOES), y

bis[2-(sulfosuccinimidoxicarboniloxi)etil]sulfona (sulfo-BSOCOES), etc.

Actividad del anticuerpo anti-DLL3

(1) Actividad citotóxica

Para el tratamiento de enfermedades proliferativas celulares tales como el cáncer, se prefiere que el anticuerpo mantenga su actividad efectora. Específicamente, el anticuerpo preferible de acuerdo con la presente invención tiene una afinidad de unión por DLL3 y funciones efectoras. El anticuerpo empleado tiene actividad citotóxica. Las funciones efectoras del anticuerpo empleado en una composición farmacéutica de la invención pueden abarcar una actividad citotóxica celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y una actividad citotóxica dependiente del complemento (CDC). El anticuerpo terapéutico empleado en una composición farmacéutica de la invención puede poseer de manera particularmente preferible una actividad ADCC como funciones efectoras.

El anticuerpo usado para el propósito terapéutico es un anticuerpo que tiene una actividad citotóxica.

Los ejemplos de la actividad citotóxica de acuerdo con la presente invención pueden incluir actividades ADCC y CDC. En la presente invención, la actividad ADCC implica la actividad de dañar células diana a través de la unión de las células que llevan el receptor Fcy (inmunocitos, etc.) a través de los receptores Fcy a los dominios Fc de anticuerpos unidos específicamente a los antígenos de la superficie celular de las células diana. Por otro lado, la actividad CDC implica una actividad citotóxica mediada por el sistema del complemento. Si

Si el anticuerpo anti-DLL3 tiene o no una actividad ADCC o tiene una actividad CDC, se puede determinar mediante un método conocido en la técnica (por ejemplo, Current protocols in Immunology, Chapter 7. Immunologic studies in humans, Editor, John E, Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc., (1993)). Específicamente, se preparan primero las células efectoras, una solución de complemento y las células diana.

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i) Preparación de las células efectoras

Se extirpan los bazos de ratones CBA/N o similares, y las células del bazo se separan de los mismos en un medio RPMI1640 (fabricado por Invitrogen Corp.). Las células se pueden lavar con este medio que contiene 10 % de suero fetal bovino (FBS, fabricado por HyClone Laboratories, Inc.) y luego se ajusta a una concentración celular de 5 * 106 células/ml para preparar células efectoras.

ii) Preparación de la solución del complemento

El complemento Baby Rabbit (fabricado por CEDARLANE Laboratories Ltd.) se puede diluir 10 veces con un medio (fabricado por Invitrogen Corp.) que contiene 10 % de FBS para preparar una solución de complemento.

iii) Preparación de las células diana

Las células que expresan las proteínas DLL3 se pueden cultivar a 37 °C durante 1 hora, junto con 51Cr-cromato sódico 0,2 mCi (fabricado por GE Healthcare Bio-Sciences Corp.), en un medio DMEM que contiene 10 % de FBS para marcar radiactivamente las células diana. Las células transformadas con genes que codifican la proteína DLL3, las líneas celulares de cáncer de pulmón microcítico o similares se pueden usar como las células que expresan las proteínas DLL3. Las células así marcadas radiactivamente pueden lavarse tres veces con un medio RPMI1640 que contiene 10 % de SFB y ajustarse a una concentración celular de 2x105 células/ml para preparar las células diana.

La actividad ADCC o CDC puede analizarse e mediante el método descrito a continuación. Para el ensayo de actividad ADCC, las células diana y el anticuerpo anti-DLL3 (50 pl cada uno) se añaden a una placa de 96 pocilios con fondo en U (fabricada por Becton, Dickinson and Company) y se hacen reaccionar durante 15 minutos en hielo. A continuación, se añaden 100 pl de las células efectoras a la placa, y las células se cultivan durante 4 horas en una incubadora de CO2. La concentración final del anticuerpo se establece en 0 o 10 pg/ml. Después del cultivo, se recogen 100 pl del sobrenadante y se mide la radioactividad usando un contador gamma (COBRA II AUTO-GAMMA, MODELO D5005, fabricado por Packard Instrument Company). La actividad citotóxica (%) puede calcularse basándose en la fórmula de cálculo (A - C)/(B - C) x 100 usando el valor obtenido. En la fórmula, A representa la radiactividad (cpm) de cada muestra; B representa la radioactividad (cpm) de una muestra complementada con NP- 40 al 1 % (fabricado por Nacalai Tesque, Inc.); y C representa la radiactividad (cpm) de una muestra que contiene solo las células diana.

Por otro lado, para el ensayo de actividad de CDC, las células diana y el anticuerpo anti-DLL3 (50 pl cada uno) se añaden a una placa de 96 pocillos de fondo plano (fabricada por Becton, Dickinson and Company) y reaccionan durante 15 minutos sobre hielo. A continuación, se añaden 100 pl de la solución del complemento a la placa, y las células se cultivan durante 4 horas en una incubadora de CO2. La concentración final del anticuerpo se establece en 0 o 3 pg/ml. Después del cultivo, se recogen 100 pl del sobrenadante y se mide la radiactividad usando un contador gamma. La actividad citotóxica se puede calcular de la misma manera que en el ensayo de actividad ADCC.

Por el contrario, en el ensayo de actividad citotóxica utilizando conjugados de anticuerpos, las células diana y los conjugados de anticuerpo anti-DLL3 (50 pl cada uno) se añaden a una placa de 96 pocillos de fondo plano (fabricada por Becton, Dickinson and Company) y reaccionan durante 15 minutos en hielo. Las células se cultivan durante 1 a 4 horas en una incubadora de CO2. La concentración final del anticuerpo se establece en 0 o 3 pg/ml. Después del cultivo, se recogen 100 pl del sobrenadante y se mide la radioactividad usando un contador gamma. La actividad citotóxica se puede calcular de la misma manera que en el ensayo de actividad ADCC.

(2) Anticuerpo conjugado

El anticuerpo puede conjugarse con una sustancia citotóxica tal como un agente quimioterapéutico, un péptido tóxico o un producto químico radiactivo. Dicho anticuerpo modificado (en lo sucesivo, denominado conjugado de anticuerpo) se puede obtener modificando químicamente el anticuerpo obtenido. Un método para la modificación del anticuerpo ya está establecido en la técnica.

Los ejemplos del agente quimioterapéutico cuya actividad citotóxica funciona a través de la conjugación con el anticuerpo anti-DLL3 pueden incluir los siguientes agentes quimioterapéuticos: azaribina, anastrozol, azacitidina, bleomicina, bortezomib, briostatina-1, busulfán, camptotecina, 10-hidroxicamptotecina, carmustina, celebrex, clorambucilo, cisplatino, irinotecán, carboplatino, cladribina, ciclofosfamida, citarabina, dacarbazina, docetaxel, dactinomicina, daunomicina glucurónido, daunorrubicina, dexametasona, dietilestilbestrol, doxorrubicina, glucurónido de doxorrubicina, epirrubicina, etinilestradiol, estramustina, etopósido, glucurónido etopósido, floxuridina, fludarabina, flutamida, fluorouracilo, fluoximesterona, gemcitabina, caproato de hidroxiprogesterona, hidroxiurea, idarrubicina, ifosfamida, leucovorina, lomustina, mecloretamina, acetato de medroxiprogesterona, acetato de megestrol, melfalán, mercaptopurina, metotrexato, mitoxantrona, mitramicina, mitomicina, mitotano, fenilbutirato, prednisona, procarbazina, paclitaxel, pentostatina, semustina, estreptozocina, tamoxifeno, taxanos, taxol, propionato de testosterona, talidomida, tioguanina, tiotepa, tenipósido, topotecán, mostaza de uracilo, vinblastina, vinorrelbina, vincristina.

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El agente quimioterapéutico es preferiblemente un agente quimioterapéutico de bajo peso molecular. Es poco probable que el agente quimioterapéutico de bajo peso molecular interfiera con las funciones del anticuerpo incluso después de su conjugación con el anticuerpo. En la presente invención, el agente quimioterapéutico de bajo peso molecular habitualmente tiene un peso molecular de 100 a 2000, preferiblemente de 200 a 1000. Todos los agentes quimioterapéuticos ilustrados anteriormente son agentes quimioterapéuticos de bajo peso molecular. Estos agentes quimioterapéuticos de acuerdo con la presente invención abarcan profármacos que se convierten in vivo en agentes quimioterapéuticos activos. La activación del profármaco puede ser por conversión enzimática o conversión no enzimática.

Además, el anticuerpo puede modificarse con el péptido tóxico. Los ejemplos del péptido tóxico pueden incluir los siguientes: cadena de la toxina A de la difteria (Langone J. J., et al., Methods in Enzymology, 93, 307-308, 1983), exotoxina de Pseudomonas (Nature Medicine, 2, 350-353, 1996), cadena A de la ricina (Fulton R. J., et al., J. Biol. Chem., 261, 5314-5319, 1986; Sivam G., et al., Cancer Res., 47, 3169-3173, 1987; Cumber A. J. et al., J. Immunol. Methods, 135, 15-24, 1990; Wawrzynczak E. J., et al., Cancer Res., 50, 7519-7562, 1990; Gheeite V., et al., J. Immunol. Methods, 142, 223-230, 1991); cadena A de la ricina deglicosilada (Thorpe P. E., et al., Cancer Res., 47, 5924-5931, 1987); cadena A de la abrina (Wawrzynczak E. J., et al., Br. J. Cancer, 66, 361-366, 1992; Wawrzynczak E. J., et al., Cancer Res., 50, 7519-7562, 1990; Sivam G., et al., Cancer Res., 47, 3169-3173, 1987; Thorpe P. E., et al., Cancer Res., 47, 5924-5931, 1987); gelonina (Sivam G., et al., Cancer Res., 47, 3169-3173, 1987; Cumber A. J. et al., J. Immunol. Methods, 135, 15-24, 1990; WawrzynczakE. J., et al., Cancer Res., 50, 7519-7562, 1990; Bolognesi A., et al., Clin. exp. Immunol., 89, 341-346, 1992) ; PAP-s; proteína antiviral de semillas de fitolaca (Bolognesi A., et al., Clin. exp. Immunol., 89, 341-346, 1992); briodina (Bolognesi A., et al., Clin. exp. Immunol., 89, 341-346, 1992); saporina (Bolognesi A., et al., Clin. exp. Immunol., 89, 341-346, 1992); momordina (Cumber A. J., et al., J. Immunol. Methods, 135, 15-24, 1990; Wawrzynczak E. J., et al., Cancer Res., 50, 7519-7562, 1990; Bolognesi A., et al., Clin. exp. Immunol., 89, 341-346, 1992); momorcochina (Bolognesi A., et al., Clin. exp. Immunol., 89, 341346, 1992); diantina 32 (Bolognesi A., et al., Clin. exp. Immunol., 89, 341-346, 1992); diantina 30 (Stirpe F., Barbieri L., FEBS letter 195, 1-8, 1986); modecina (Stirpe F., Barbieri L., FEBS letter 195, 1-8, 1986); viscumina (Stirpe F., Barbieri L., FEBS letter 195, 1-8, 1986); volkesina (Stirpe F., Barbieri L., FEBS letter 195, 1-8, 1986); dodecandrina (Stirpe F., Barbieri L., FEBS letter 195, 1-8, 1986); tritina (Stirpe F., Barbieri L., FEBS letter 195, 1-8, 1986); luffina (Stirpe F., Barbieri L., FEBS letter 195, 1-8, 1986); trichokirina (Casellas P., et al., Eur. J. Biochem. 176, 581-588, 1988; Bolognesi A., et al., Clin. exp. Immunol., 89, 341-346, 1992).

En la presente invención, el producto químico radiactivo se refiere a un producto químico que contiene un radioisótopo. El radioisótopo no está particularmente limitado, y se puede usar cualquier radioisótopo. Por ejemplo,

. 32n 14~ 125, 3,, 131 186^ 188,-,

se pueden usar P, C, I, H, I, Re o Re.

En otro aspecto, se pueden usar uno o dos o más agentes quimioterapéuticos de bajo peso molecular y uno o dos o más péptidos tóxicos en combinación en la modificación del anticuerpo. El anticuerpo anti-DLL3 puede conjugarse con el agente quimioterapéutico de bajo peso molecular a través de un enlace covalente o no covalente. Un método para preparar dicho anticuerpo conjugado con agente quimioterapéutico es conocido en la técnica.

Un agente proteínico o toxina se puede conjugar con el anticuerpo mediante un enfoque de ingeniería genética. Específicamente, por ejemplo, el ADN que codifica el péptido tóxico y el ADN que codifica el anticuerpo anti-DLL3 se fusionan en el marco entre sí, y este ADN fusionado se puede incorporar en vectores de expresión para construir vectores recombinantes. Los vectores se introducen en células hospedadoras apropiadas, y las células transformadas resultantes se cultivan. Las células pueden expresar el inserto de ADN para obtener anticuerpos anti- DLL3 conjugados con péptidos tóxicos como proteínas de fusión. Para obtener proteínas de fusión con anticuerpos, el agente proteínico o toxina generalmente se localiza en el lado C-terminal del anticuerpo. Se puede permitir que un enlazador peptídico intervenga entre el anticuerpo y el agente proteínico o toxina.

(3) Anticuerpo biespecífico

Además, el anticuerpo presente en una composición farmacéutica de la presente invención puede ser un anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico se refiere a un anticuerpo que tiene, en la misma molécula de anticuerpo, regiones variables que reconocen diferentes epítopos. En la presente invención, el anticuerpo biespecífico puede tener sitios de unión al antígeno que reconocen diferentes epítopos en la molécula de DLL3. Por lo tanto, dos de tales moléculas de anticuerpo biespecíficas pueden unirse a una molécula de DLL3. Como resultado, se puede esperar un efecto citotóxico más fuerte.

Como alternativa, el anticuerpo biespecífico presente en una composición farmacéutica de la presente invención puede tener sitios de unión al antígeno, uno de los cuales reconoce DLL3 y el otro reconoce una sustancia citotóxica. La sustancia citotóxica abarca específicamente, por ejemplo, un agente quimioterapéutico, un péptido tóxico y un producto químico radiactivo. Tal anticuerpo biespecífico se une a las células que expresan DLL3, mientras que captura la sustancia citotóxica. Como resultado, se puede permitir que la sustancia citotóxica actúe directamente sobre las células que expresan DLL3. Específicamente, el anticuerpo biespecífico que reconoce la sustancia citotóxica puede dañar específicamente las células tumorales e inhibir el crecimiento de las células tumorales.

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Además, en la presente invención, se puede usar un anticuerpo biespecífico que comprende un sitio de unión a DLL3 combinado con un sitio de unión al antígeno que reconoce un antígeno distinto de DLL3. El sitio de unión a antígeno que puede combinarse con un anticuerpo biespecífico de este tipo reconoce, por ejemplo, un antígeno que se expresa específicamente en la superficie de las células cancerosas diana, como con DLL3, pero es diferente de DLL3.

Un método para producir el anticuerpo biespecífico es conocido en la técnica. Por ejemplo, dos anticuerpos que difieren en el antígeno reconocido de ese modo pueden unirse para preparar el anticuerpo biespecífico. Cada uno de los anticuerpos unidos puede ser 1/2 molécula que tiene cadenas pesadas y ligeras o puede ser una 1/4 de molécula que consiste en cadenas pesadas. Como alternativa, se pueden fusionar diferentes hibridomas productores de anticuerpos monoclonales para preparar células de fusión que producen anticuerpos biespecíficos. Además, el anticuerpo biespecífico se puede preparar mediante un enfoque de ingeniería genética.

La actividad de unión al antígeno del anticuerpo se puede determinar usando medios conocidos en la técnica (Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Por ejemplo, puede usarse ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas), EIA (inmunoensayo enzimático), RIA (radioinmunoensayo) o fluoroinmunoensayo.

(4) Modificación de la cadena de azúcar

El anticuerpo empleado en una composición farmacéutica de la presente invención puede ser un anticuerpo que tiene una cadena de azúcar modificada. Se sabe que las actividades citotóxicas de los anticuerpos se pueden potenciar modificando sus cadenas de azúcar. Por ejemplo, en la técnica se conocen anticuerpos glicosilados (WO 99/54342, etc.), anticuerpos deficientes en fucosa añadidos a sus cadenas de azúcar (WO 00/61739, WO 02/31140, etc.) y anticuerpos que tienen una cadena de azúcar que tiene GlcNAc bisecante (WO 02/79255, etc.) como el anticuerpo que tiene una cadena de azúcar modificada.

(5) Actividad de internalización

Además, el anticuerpo presente en una composición farmacéutica de la presente invención puede tener una actividad de internalización. En la presente invención, el “anticuerpo que tiene una actividad de internalización” significa un anticuerpo que se transporta a las células (citoplasmas, vesículas, otros orgánulos, etc.) a través de su unión a DLL3.

Si el anticuerpo tiene o no una actividad de internalización puede confirmarse mediante un método generalmente conocido por los expertos en la materia y puede confirmarse mediante, por ejemplo, un método que implica poner en contacto anticuerpos anti-DLL3 unidos al material de marcaje con células que expresan DLL3 y confirmar si el material de marcaje está incorporado o no en las células, o un método que implica poner en contacto anticuerpos anti-DLL3 conjugados con sustancia citotóxica con células que expresan DLL3 y confirmar si se induce o no la muerte de las células que expresan DLL3.

Más específicamente, la actividad de internalización del anticuerpo anti-DLL3 puede analizarse mediante, por ejemplo, un método descrito en los Ejemplos.

El anticuerpo que tiene una actividad de internalización puede conjugarse, por ejemplo, con la sustancia citotóxica y usarse como una composición farmacéutica tal como un agente anticanceroso descrito más adelante.

Preparación de anticuerpo anti-DLL3

1. Preparación de anticuerpo anti-DLL3 usando hibridoma productor de anticuerpos monoclonales

Los hibridomas productores de anticuerpos monoclonales se pueden preparar de acuerdo con una técnica conocida en la técnica de la siguiente manera: primero, los animales se inmunizan con proteínas DLL3 o péptidos parciales de los mismos (que se describirán más adelante) usados como antígenos sensibilizantes de acuerdo con un método de inmunización habitual. Los inmunocitos obtenidos se fusionan con células parentales conocidas en la técnica mediante un método de fusión celular habitual para obtener hibridomas. Estos hibridomas se rastrean adicionalmente para detectar células que producen el anticuerpo de interés mediante un método de selección habitual para seleccionar hibridomas que producen el anticuerpo anti-DLL3. El anticuerpo monoclonal anti-DLL3 deseado se obtiene a partir de los hibridomas seleccionados. Específicamente, el anticuerpo monoclonal anti-DLL3 se prepara de la siguiente manera:

(1) Preparación de la proteína DLL3

Primero, los genes DLL3 pueden expresarse para obtener proteínas DLL3 usadas como antígenos sensibilizantes para la obtención de anticuerpos. Específicamente, la secuencia del gen que codifica la DLL3 se inserta en vectores de expresión conocidos en la técnica, con los que luego se transforman las células hospedadoras apropiadas. A

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continuación, las proteínas humanas DLL3 de interés se purifican a partir de las células hospedadoras o un sobrenadante de cultivo de las mismas mediante un método conocido en la técnica. Las proteínas DLL3 naturales purificadas o las proteínas de fusión que comprenden el polipéptido parcial deseado de la proteína DLL3 fusionada con un polipéptido diferente pueden usarse como inmunógenos. Por ejemplo, los fragmentos Fc de anticuerpo, etiquetas peptídicas, etc. se pueden usar para producir las proteínas de fusión usadas como inmunógenos. Los vectores de expresión para las proteínas de fusión se pueden preparar fusionando, en el marco, dos o más genes que codifican respectivamente los fragmentos polipeptídicos deseados e insertando este gen de fusión en vectores de expresión. El método para preparar las proteínas de fusión se describe en Molecular Cloning 2nd ed. (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. Prensa, 1989).

Las proteínas DLL3 así purificadas se pueden usar como antígenos sensibilizantes para la inmunización de mamíferos. Los péptidos parciales de DLL3 también pueden usarse como antígenos sensibilizantes. Por ejemplo, los siguientes péptidos se pueden usar como antígenos sensibilizantes:

La región y el tamaño del péptido parcial de DLL3 utilizado no están limitados. El número de aminoácidos que constituyen el péptido que sirve como antígeno sensibilizante es preferiblemente al menos 3 o más, por ejemplo, 5 o más o 6 o más. Más específicamente, se pueden usar péptidos de 8 a 50 restos, preferiblemente de 10 a 30 restos como antígenos sensibilizantes.

(2) Inmunización con proteína DLL3

Los mamíferos se inmunizan con las proteínas DLL3 o sus péptidos parciales como antígenos sensibilizantes. Los mamíferos inmunizados no están particularmente limitados. Para obtener el anticuerpo monoclonal por el método de fusión celular, se prefiere que los animales inmunizados se seleccionen teniendo en cuenta la compatibilidad con las células parentales utilizadas en la fusión celular. En general, los roedores son preferibles como los animales inmunizados. Específicamente, se pueden usar ratones, ratas, hámsters o conejos como animales inmunizados. Además, se pueden usar monos o similares como animales inmunizados.

Estos animales pueden inmunizarse con los antígenos sensibilizantes de acuerdo con un método conocido en la técnica. Por ejemplo, un método general puede implicar la inmunización de los mamíferos con los antígenos sensibilizantes mediante inyección intraperitoneal o subcutánea. Específicamente, los antígenos sensibilizantes se administran a los mamíferos varias veces a intervalos de 4 a 21 días. Los antígenos sensibilizantes se diluyen con PBS (solución salina tamponada con fosfato), solución salina o similares en una relación de dilución apropiada y se usan en la inmunización. Además, los antígenos sensibilizantes se pueden administrar junto con un adyuvante. Por ejemplo, los antígenos se pueden mezclar con un adyuvante completo de Freund para la emulsificación para preparar antígenos sensibilizantes. Además, se puede usar un vehículo apropiado en la inmunización con los antígenos sensibilizantes. Particularmente, cuando se usan péptidos parciales que tienen un peso molecular pequeño como antígenos sensibilizantes, se prefiere que los péptidos antigénicos sensibilizantes se unan a proteínas vehículo tales como la albúmina o la hemocianina de la lapa californiana y se usen en la inmunización.

(3) Inmunización con ADN

El anticuerpo monoclonal también se puede obtener mediante inmunización con ADN. La inmunización con ADN es un método de inmunoestimulación que implica: inmunizar animales mediante la administración de ADN vector que se ha construido en una forma capaz de expresar genes que codifican proteína antigénica en los animales inmunizados; y permitir que los animales inmunizados expresen los antígenos inmunizantes in vivo. Se puede esperar que la inmunización con ADN sea superior a los métodos generales de inmunización usando la administración de antígenos proteicos de la siguiente manera:

- pueda proporcionar inmunoestimulación con estructuras de proteínas de membrana (por ejemplo, DLL3) mantenidas; y

- elimine la necesidad de purificar antígenos inmunizantes.

Para obtener el anticuerpo monoclonal que se usará en la presente invención mediante la inmunización con ADN, primero, los animales se inmunizan mediante la administración del ADN del vector de expresión de la proteína DLL3. El ADN que codifica DLL3 se puede sintetizar mediante un método conocido en la técnica tal como PCR. El ADN obtenido se inserta en vectores de expresión apropiados, con los cuales los animales se inmunizan mediante administración. Por ejemplo, los vectores de expresión comercializados, tales como pcDNA3.1, pueden usarse como los vectores de expresión. Del mismo modo, un método generalmente usado puede usarse para administrar los vectores a los animales. Por ejemplo, partículas de oro con los vectores de expresión adsorbidos se pueden insertar en las células usando una pistola de genes para realizar la inmunización de aDn.

(4) Preparación del hibridoma

Se confirma un aumento en la cantidad del anticuerpo deseado en el suero de los mamíferos así inmunizados. Seguidamente, los inmunocitos se recogen de los mamíferos y se someten a fusión celular. Particularmente, las

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células del bazo se pueden usar como inmunocitos preferidos.

Las células de mieloma de mamífero se usan en la fusión celular con los inmunocitos. Se prefiere que las células de mieloma tengan un marcador de selección apropiado para el cribado. El marcador de selección se refiere a un carácter que puede sobrevivir (o no puede sobrevivir) en condiciones de cultivo particulares. Por ejemplo, la deficiencia de hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (en lo sucesivo, abreviado como deficiencia de HGPRT) o deficiencia de timidina quinasa (en lo sucesivo, abreviado como deficiencia de TK) es conocida en la técnica como el marcador de selección. Las células que tienen la deficiencia de HGPRT o TK son sensibles a la hipoxantina- aminopterin-timidina (en lo sucesivo, abreviado como sensible a HAT). Las células sensibles a HAT se destruyen en un medio selectivo de HAT porque no pueden sintetizar ADN. Por el contrario, estas células, cuando se fusionan con células normales, pueden crecer incluso en el medio selectivo HAT porque pueden continuar la síntesis de ADN mediante el uso de la ruta silvestre de las células normales.

Las células que tienen la deficiencia de HGPRT o TK se pueden seleccionar en un medio que contenga 6-tioguanina u 8-azaguanina (en lo sucesivo, abreviado como 8AG) para la deficiencia de HGPRT o 5-bromodesoxiuridina para la deficiencia de TK. Las células normales se destruyen en dicho medio porque incorporan estos análogos de pirimidina en sus ADN. Por el contrario, las células deficientes en estas enzimas pueden sobrevivir en el medio selectivo porque no pueden incorporar los análogos de pirimidina en sí mismas. Además, un marcador de selección denominado resistencia a G418 imparte a las células resistencia al antibiótico 2-desoxiestreptamina (análogo de gentamicina) a través de un gen de resistencia a la neomicina. En la técnica se conocen diversas células de mieloma adecuadas para la fusión celular. Por ejemplo, las siguientes células de mieloma se pueden usar en la producción del anticuerpo monoclonal para uso en composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención:

P3 (P3x63Ag8. 653) (J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550),

P3x63Ag8U. 1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7),

NS-1 (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519),

MPC-11 (Margulies. D. H. et al., Cell (1976) 8, 405-415),

SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270),

FO (de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21),

S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323),

R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133) o similares.

Básicamente, la fusión celular de los inmunocitos con las células de mieloma se realiza de acuerdo con un método conocido en la técnica, por ejemplo, el método de Kohler y Milstein et al. (Kohler. G. y Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46).

Más específicamente, la fusión celular puede realizarse, por ejemplo, en un medio de cultivo nutriente habitual en presencia de un promotor de fusión celular. Por ejemplo, se puede usar polietilenglicol (PEG) o el virus hemaglutinante de Japón (HVJ) como el promotor de fusión. Además, se puede añadir un auxiliar, tal como dimetilsulfóxido, si se desea, para mejorar la eficacia de la fusión.

La relación entre los inmunocitos y las células de mieloma utilizadas puede establecerse arbitrariamente. Por ejemplo, se prefiere que la cantidad de inmunocitos se establezca de 1 a 10 veces mayor que la de las células de mieloma. Por ejemplo, un medio de cultivo RPMI1640 o MEM adecuado para el crecimiento de la línea celular de mieloma así como un medio de cultivo habitual usado en este tipo de cultivo celular se puede usar como el medio de cultivo en la fusión celular. Además, una solución suplementada con suero (por ejemplo, suero de ternera fetal (FCS)) se puede agregar al medio de cultivo.

Para la fusión celular, los inmunocitos y las células de mieloma se mezclan bien en las cantidades predeterminadas en el medio de cultivo y luego se mezclan con una solución de PEG precalentada a aproximadamente 37 °C para formar las células de fusión (hibridomas) de interés. En el método de fusión celular, por ejemplo, generalmente se puede añadir PEG con un peso molecular promedio del orden de 1000 a 6000 a una concentración de 30 a 60 % (p/v). Posteriormente, el medio de cultivo apropiado ejemplificado anteriormente se añade secuencialmente a los hibridomas, y la mezcla se centrifuga, seguido de la eliminación del sobrenadante. Este procedimiento se repite para eliminar los agentes de fusión celular o similares desfavorables para el crecimiento del hibridoma.

Los hibridomas así obtenidos pueden seleccionarse mediante el uso de un medio de cultivo selectivo apropiado para el marcador de selección de las células de mieloma utilizadas en la fusión celular. Por ejemplo, las células que tienen la deficiencia de HGPRT o TK pueden seleccionarse cultivando los hibridomas en un medio de cultivo HAT (medio de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina). Específicamente, cuando se usan células de mieloma sensibles a HAT en la fusión celular, solo las células fusionadas con éxito con células normales pueden cultivarse selectivamente en el medio de cultivo HAT. El cultivo que utiliza el medio de cultivo HAT se continúa durante un tiempo lo suficientemente largo como para destruir células (células no fusionadas) distintas de los hibridomas de interés. Específicamente, el cultivo generalmente puede realizarse durante unos pocos días a unas pocas semanas para seleccionar los hibridomas de interés. Posteriormente, los hibridomas que producen el

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anticuerpo de interés pueden cribarse y clonarse como clones individuales mediante un método de dilución limitante habitual.

El cribado del anticuerpo de interés y la clonación como clones individuales del mismo se puede realizar preferiblemente mediante un método de cribado basado en la reacción antígeno-anticuerpo conocida en la técnica. Por ejemplo, los antígenos se unen a un vehículo tal como perlas hechas de poliestireno o similar o una placa de microtitulación de 96 pocillos comercializada y se hace reaccionar con el sobrenadante de cultivo de los hibridomas. Posteriormente, el vehículo se lava y luego se hace reaccionar con anticuerpos secundarios marcados con enzimas o similares. Cuando el sobrenadante del cultivo contiene el anticuerpo de interés reactivo con los antígenos sensibilizantes, los anticuerpos secundarios se unen al vehículo a través de este anticuerpo. Finalmente, los anticuerpos secundarios unidos al vehículo pueden detectarse para determinar la presencia del anticuerpo de interés en el sobrenadante del cultivo. Los hibridomas que producen el anticuerpo deseado capaz de unirse al antígeno se pueden clonar mediante un método de dilución limitante o similar. En esta selección, las proteínas DLL3 usadas en la inmunización o las proteínas DLL3 sustancialmente idénticas a las mismas se pueden usar preferiblemente como los antígenos. Por ejemplo, las líneas celulares que expresan DLL3, DLL3 soluble, o similares se pueden usar como los antígenos.

Un método descrito en la Publicación Internacional N.° WO 03/104453 puede usarse en la producción del anticuerpo contra la DLL3 humana.

Asimismo, además del método para obtener los hibridomas inmunizando animales no humanos con los antígenos, los linfocitos humanos pueden sensibilizarse con los antígenos para obtener el anticuerpo de interés. Específicamente, los linfocitos humanos se sensibilizan primero con las proteínas DLL3 in vitro. Posteriormente, los linfocitos sensibilizados se fusionan con las parejas de fusión apropiadas. Por ejemplo, las células de mieloma derivadas de humanos capaces de dividirse a lo largo de sus vidas pueden usarse como parejas de fusión (véase la Publicación de Patente Japonesa N.° 1-59878).

Además, el anticuerpo humano anti-DLL3 también se puede obtener administrando las proteínas DLL3 como antígenos a animales transgénicos que tienen todos los repertorios de genes de anticuerpos humanos o inmunizando los animales con ADN que se ha construido para expresar DLL3 en los animales. Las células productoras de anticuerpos de los animales inmunizados se pueden inmortalizar mediante tratamiento tal como fusión celular con parejas de fusión apropiadas o infección con el virus de Epstein-Barr. A partir de las células inmortalizadas así obtenidas, pueden aislarse anticuerpos humanos contra la proteína DLL3 (véanse las publicaciones internacionales números WO 94/25585, WO 93/12227, WO 92/03918 y WO 94/02602). Además, las células inmortalizadas también se pueden clonar como células que producen anticuerpos que tienen la especificidad de reacción de interés. Cuando se utilizan animales transgénicos como animales inmunizados, los sistemas inmunitarios de los animales reconocen la DLL3 humana como extraña. Por lo tanto, los anticuerpos humanos contra la DLL3 humana se pueden obtener fácilmente.

(5) Obtención del anticuerpo monoclonal a partir del hibridoma

Los hibridomas productores de anticuerpos monoclonales así preparados pueden subcultivarse en un medio de cultivo habitual. Además, los hibridomas también se pueden almacenar durante un largo período en nitrógeno líquido.

Los hibridomas se cultivan según un método habitual, y el anticuerpo monoclonal de interés se puede obtener a partir del sobrenadante de cultivo del mismo. Como alternativa, los hibridomas se administran a mamíferos compatibles con los mismos y se multiplican, y el anticuerpo monoclonal también se puede obtener en forma de fluidos ascíticos. El primer método es adecuado para obtener anticuerpos altamente puros.

2. Preparación de anticuerpos anti-DLL3 mediante un enfoque de ingeniería genética

(1) Clonación del gen del anticuerpo

El anticuerpo puede prepararse mediante un enfoque de ingeniería genética usando genes de anticuerpos clonados a partir de células productoras de anticuerpos. Los genes de anticuerpos clonados pueden incorporarse en vectores apropiados y expresarse como anticuerpos mediante la transformación de hospedadores. Los métodos para el aislamiento del gen del anticuerpo, la introducción en vectores, y la transformación de células hospedadoras ya se han establecido (véase p.ej., Vandamme, A. M. et al., Eur. J. Biochem. (1990) 192, 767-775).

Por ejemplo, los ADNc que codifican las regiones variables del anticuerpo anti-DLL3 se pueden obtener a partir de las células de hibridoma que producen anticuerpos anti-DLL3. Con este fin, generalmente, se extraen primero los ARN totales de los hibridomas. Por ejemplo, se pueden usar los siguientes métodos para la extracción del ARNm de las células:

- método de ultracentrifugación con guanidina (Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294 - 5299), y

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- método AGPC (Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159).

Los ARNm extraídos pueden purificarse usando el kit de purificación de ARNm (fabricado por GE Healthcare BioSciences Corp.) o similares. Como alternativa, también está comercializado un kit para extraer directamente los ARNm totales de las células, tal como el kit de purificación de ARNm QuickPrep (fabricado por GE Healthcare BioSciences Corp.). Los ARNm totales se pueden obtener a partir de los hibridomas usando dicho kit. A partir de los ARNm obtenidos, los ADNc que codifican la región variable del anticuerpo pueden sintetizarse usando transcriptasa inversa. En este procedimiento, se pueden usar secuencias arbitrarias de 15 a 30 bases seleccionadas de secuencias comunes con los genes del anticuerpo como cebadores. Los ADNc pueden sintetizarse usando el kit AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis (fabricado por Seikagaku Corp.) o similares. Además, el kit 5'-Ampli FINDER RACE (fabricado por Clontech Laboratories, Inc.) y 5'-RACE PCR (Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002; y Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) puede usarse para la síntesis y amplificación del ADNc. Además, los sitios de enzimas de restricción apropiados descritos más adelante pueden introducirse en ambos extremos de los ADNc en el curso de dicha síntesis de ADNc.

A partir de los productos de PCR obtenidos, los fragmentos de ADNc de interés se purifican y posteriormente se ligan con los ADN del vector. Los vectores recombinantes así preparados se introducen en E. coli o similares. Después de la selección de la colonia, los vectores recombinantes deseados pueden prepararse a partir de E. coli que ha formado la colonia. A continuación, el ADNc se puede secuenciar mediante un método conocido en la técnica, por ejemplo, un método de terminación de la cadena de didesoxinucleótido.

Además, las bibliotecas de ADNc se pueden usar para obtener los genes que codifican la región variable del anticuerpo. Primero, los ADNc se sintetizan con ARNm extraídos de las células productoras de anticuerpos como moldes para obtener bibliotecas de ADNc. Un kit comercializado se usa convenientemente en la síntesis de la biblioteca de ADNc. En realidad, los ARNm de solo un pequeño número de células se obtienen en cantidades muy pequeñas. Por lo tanto, su purificación directa da como resultado bajos rendimientos. De este modo, habitualmente se añaden los ARN portadores que se han demostrado que están libres de los genes del anticuerpo, seguido de la purificación del ARNm. Como alternativa, cuando los ARN se pueden extraer en cantidades determinadas de las células productoras de anticuerpos, se puede lograr una extracción eficiente sin usar ARN portadores. La adición de los ARN portadores puede ser innecesaria para la extracción de ARN de, por ejemplo, 10 o más o 30 o más, preferiblemente 50 o más células productoras de anticuerpos.

Los genes del anticuerpo se amplifican mediante PCR con las bibliotecas de ADNc obtenidas como moldes. Los cebadores para la amplificación por PCR de los genes del anticuerpo son conocidos en la técnica. Por ejemplo, los cebadores para la amplificación del gen de anticuerpo humano pueden diseñarse basándose en la divulgación del artículo (J. Mol. Biol. (1991) 222, 581-597) o similar. Estos cebadores tienen una secuencia de nucleótidos que difiere en la subclase de inmunoglobulina. Por lo tanto, cuando se usan como moldes bibliotecas de ADNc cuya subclase es desconocida, la PCR se realiza seleccionando cebadores teniendo en cuenta todas las posibilidades.

Específicamente, por ejemplo, con el fin de obtener genes que codifican IgG humana, se pueden usar cebadores, que son capaces de amplificar cada uno de los genes que codifican las cadenas pesadas y1 a y4 y las cadenas ligeras k y A. Los cebadores que se hibridan con una porción correspondiente a la región de bisagra se usan generalmente como cebadores 3' para amplificar genes de región variable de IgG. Por otro lado, los cebadores apropiados para cada subclase se pueden usar como cebadores 5'.

Los productos de PCR obtenidos a partir de los cebadores para la amplificación de genes para estas subclases de cadena pesada y ligera se preparan como sus respectivas bibliotecas independientes. Las bibliotecas así sintetizadas se pueden usar para remodelar inmunoglobulinas que comprenden las cadenas pesada y ligera en combinación. El anticuerpo de interés puede seleccionarse en función de las actividades de unión de las inmunoglobulinas remodeladas para DLL3 como referencia.

(2) Introducción del gen del anticuerpo en la célula hospedadora

Para producir el anticuerpo anti-DLL3, los genes del anticuerpo clonado se pueden incorporar en vectores de expresión de manera que estos genes se expresen bajo el control de las regiones de control de la expresión. Las regiones de control de la expresión para la expresión del anticuerpo abarcan, por ejemplo, potenciadores y promotores. Posteriormente, las células hospedadoras apropiadas pueden transformarse con estos vectores de expresión para obtener células recombinantes que expresan el ADN que codifica el anticuerpo anti-DLL3.

Para la expresión del gen del anticuerpo, los ADN que codifican la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo se pueden incorporar por separado en diferentes vectores de expresión. La misma célula hospedadora se puede cotransfectar con los vectores incorporados a la cadena pesada y a la cadena ligera y, por lo tanto, se les permite expresar moléculas de anticuerpo que comprenden las cadenas pesada y ligera. Como alternativa, los ADN que codifican cadenas pesadas y ligeras pueden incorporarse en vectores de expresión únicos, con los que se transforman las células hospedadoras (véase la Publicación Internacional N.° WO 94/11523).

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En la técnica se conocen muchas combinaciones de hospedadores y vectores de expresión para introducir los genes de anticuerpos aislados en hospedadores apropiados para la preparación de anticuerpos. Todos estos sistemas de expresión se pueden aplicar a la presente invención. Cuando se utilizan células eucariotas como hospedadores, se pueden usar células de animales, plantas u hongos. Específicamente, los ejemplos de las células animales que pueden usarse en la presente invención pueden incluir las siguientes células:

i) células de mamífero tales como células CHO, COS, mieloma, BHK (riñón de hámster bebé), Hela, Vero, HEK293, Ba/F3, HL-60, Jurkat y SK-HEP1;

ii) células de anfibios tales como ovocitos de Xenopus; y

iii) células de insecto tales como: células sf9, sf21 y Tn5.

En el caso de las células vegetales, en la técnica se conocen sistemas de expresión de genes de anticuerpos que implican células derivadas del género Nicotiana (p.ej., Nicotiana tabacum). Las células de callo cultivadas se pueden usar en la transformación de células vegetales.

Además, como células fúngicas se pueden usar las siguientes células:

células derivadas de levaduras como el género Saccharomyces (p.ej., Saccharomyces cerevisiae) y hongos filamentosos del género Pichia (p.ej., Pichia pastoris) y células derivadas del género Aspergillus (p.ej., Aspergillus niger).

Como alternativa, los sistemas de expresión de genes de anticuerpos que usan células procariotas también son conocidos en la técnica. Por ejemplo, cuando se usan células bacterianas, se pueden usar en la presente invención células bacterianas derivadas de E. coli, Bacillus subtilis o similares.

Para la expresión génica usando células de mamífero, se puede ligar funcionalmente un promotor útil utilizado rutinariamente, el gen del anticuerpo a expresar, y una señal de poli A situada en dirección 3'. Los ejemplos del promotor/potenciador pueden incluir un promotor/potenciador temprano inmediato de citomegalovirus humano.

Además, por ejemplo, pueden usarse promotores/potenciadores de virus o promotores/potenciadores derivados de células de mamífero (por ejemplo, el factor de elongación humano 1a (HEF1a)) en la expresión del anticuerpo. Los ejemplos de los virus cuyo promotor/potenciador puede usarse pueden incluir específicamente retrovirus, poliomavirus, adenovirus y el virus de simio 40 (SV40).

El promotor/potenciador SV40 puede usarse de acuerdo con el método de Mulligan et al. (Nature (1979) 277.108). Además, el promotor/potenciador HEF1a puede usarse fácilmente en la expresión génica de interés mediante el método de Mizushima et al. (Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322).

Cuando se producen anticuerpos usando células animales, la secuencia señal del gen de la cadena pesada o ligera del anticuerpo se usa preferiblemente como una secuencia señal requerida para la secreción extracelular. Además, se puede usar la secuencia señal de una proteína secretora tal como IL-3 o IL-6.

Para la expresión génica usando E. coli, se puede ligar funcionalmente un promotor útil utilizado rutinariamente, una secuencia señal para la secreción de anticuerpos, y el gen del anticuerpo que se va a expresar. Los ejemplos del promotor pueden incluir promotores lacZ y araB. El promotor lacZ puede usarse de acuerdo con el método de Ward et al. (Nature (1989) 341, 544-546; y fAsEBJ. (1992) 6, 2422-2427). Como alternativa, el promotor araB puede usarse en la expresión génica de interés mediante el método de Better et al. (Science (1988) 240, 1041-1043).

Cuando se producen anticuerpos en el periplasma de E. coli, puede usarse una secuencia de señal pelB (Lei, S. P. et al., J. Bacteriol. (1987) 169, 4379) para la secreción de anticuerpos. A continuación, los anticuerpos producidos en el periplasma se separan y luego se vuelven a plegar mediante el uso de desnaturalizantes de proteínas tales como urea y hidrocloruro de guanidina de modo que los anticuerpos resultantes tienen la actividad de unión deseada.

En los vectores de expresión puede insertarse un origen de replicación derivado de SV40, poliomavirus, adenovirus, virus del papiloma bovino (BPV) o similares. Además, se puede insertar un marcador de selección en los vectores de expresión para aumentar el número de copias de un gen en los sistemas de células hospedadoras. Específicamente, se pueden usar marcadores de selección, como el gen de la aminoglucósido fosfotransferasa (APH), el gen de la timidina quinasa (TK), el gen de la E. coli xantina-guanina fosforribosiltransferasa (Ecogpt), y el gen de la dihidrofolato reductasa (dhfr).

(3) Obtención de anticuerpos de la célula hospedadora

Las células hospedadoras se transforman con estos vectores de expresión, y las células hospedadoras transformadas se cultivan in vitro o in vivo para producir el anticuerpo de interés. El cultivo de las células hospedadoras se realiza de acuerdo con un método conocido en la técnica. Por ejemplo, se puede usar un medio de cultivo DMEM, MEM, RPMI1640 o IMDM y se puede usar en combinación con una solución complementada con

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suero tal como suero de ternera fetal (FCS).

Los anticuerpos así expresados y producidos pueden purificarse usando, solo o en combinación apropiada, métodos de purificación de proteínas habituales conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden seleccionarse columnas de afinidad o de cromatografía (por ejemplo, columnas de proteína A), filtros, ultrafiltración, separación de sales y diálisis y combinarse apropiadamente para separar y purificar los anticuerpos (Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).

Por lo tanto, también se hace referencia a un gen que codifica el anticuerpo descrito en la presente memoria. También se divulga un vector que comprende el gen. También se divulga una célula hospedadora que porta el vector. También se divulga un método para producir un anticuerpo codificado por el gen, que comprende la etapa de cultivar la célula hospedadora.

3. Producción de anticuerpos mediante un animal transgénico

Además de las células hospedadoras, los animales transgénicos también pueden usarse en la producción de anticuerpos recombinantes. Específicamente, el anticuerpo de interés se puede obtener a partir de animales transfectados con los genes que codifican este anticuerpo de interés. Por ejemplo, los genes del anticuerpo pueden insertarse en el marco en genes que codifican proteínas específicamente producidas en la leche para construir genes de fusión. Por ejemplo, la p caseína de cabra puede usarse como proteína secretada en la leche. Los fragmentos de ADN que contienen los genes de fusión que tienen el inserto del gen de anticuerpo se inyectan en embriones de cabra, que a su vez se introducen en cabras hembras. A partir de leche producida por cabras transgénicas (o progenie de las mismas) por las cabras que han recibido los embriones, el anticuerpo deseado puede obtenerse como una proteína de fusión con la proteína de la leche. Además, en las cabras transgénicas, la hormona se puede usar de manera apropiada para aumentar la cantidad de leche que contiene el anticuerpo deseado producido a partir de las cabras transgénicas (Ebert, K. M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702).

Composición farmacéutica

Dado que DLL3 está altamente expresada en tejidos de cáncer de pulmón microcítico, el anticuerpo anti-DLL3 tiene una actividad citotóxica específica de células cancerígenas. Por lo tanto, el anticuerpo anti-DLL3 es útil en el tratamiento del cáncer de pulmón que expresa DLL3.

Específicamente, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo que se une a la proteína DLL3 como un principio activo, en el que el anticuerpo tiene actividad citotóxica. En una realización, la composición farmacéutica es un inhibidor del crecimiento celular, particularmente, un agente anticanceroso. Preferiblemente, el inhibidor de crecimiento celular y el agente anticanceroso de la presente invención se administran a un sujeto que tiene cáncer de pulmón o que posiblemente tiene cáncer de pulmón.

El anticuerpo anti-DLL3 usado en la composición farmacéutica (por ejemplo, agente anticanceroso) de la presente invención no está particularmente limitado, y, por ejemplo, puede usarse cualquiera de los anticuerpos anti-DLL3 descritos anteriormente que tienen actividad citotóxica.

En la presente invención, la frase “que comprende el anticuerpo que se une a DLL3 como un principio activo” significa que comprende el anticuerpo anti-DLL3 como principio activo principal y no limita el contenido del anticuerpo anti-DLL3.

La composición farmacéutica de la presente invención puede comprender un anticuerpo anti-DLL3 conjugado con una sustancia citotóxica como principio activo. Esta composición farmacéutica puede usarse como, por ejemplo, un inhibidor del crecimiento celular, particularmente, un agente anticanceroso. Preferiblemente, el inhibidor del crecimiento celular y el agente anticanceroso se administran a un sujeto que tiene cáncer o posiblemente tiene cáncer.

En la presente invención, la frase “que comprende el anticuerpo anti-DLL3 conjugado con sustancia citotóxica como principio activo” significa que comprende el anticuerpo anti-DLL3 conjugado con sustancia citotóxica como principio activo principal y no limita el contenido del anticuerpo anti-DLL3 conjugado con sustancia citotóxica.

Cuando la enfermedad objetivo de la composición farmacéutica de la presente invención es el cáncer, el cáncer objetivo es el cáncer de pulmón, particularmente el cáncer de pulmón microcítico. El cáncer puede ser cualquiera de los focos primarios y focos metastásicos.

La composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse por vía oral o parenteral a un paciente. La administración parenteral es preferible. Los ejemplos específicos de dicho método de administración incluyen administraciones por inyección, transnasales, pulmonares y transdérmicas. Los ejemplos de administración de inyección incluyen inyecciones intravenosas, intramusculares, intraperitoneales y subcutáneas, a través de las cuales la composición farmacéutica de la presente invención se puede administrar sistémica o localmente. Además,

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el método de administración puede seleccionarse apropiadamente según la edad o los síntomas del paciente. La dosis de la composición farmacéutica de la presente invención se puede seleccionar entre un intervalo de dosis de, por ejemplo, 0,0001 mg a 1000 mg por kg de peso corporal por dosificación. Como alternativa, la dosis se puede seleccionar entre un intervalo de, por ejemplo, 0,001 a 100.000 mg por cuerpo. Sin embargo, la composición farmacéutica de la presente invención no está limitada a estas dosis.

La composición farmacéutica de la presente invención se puede formular de acuerdo con un método estándar (p.ej., Remington's Pharmaceutical Science, última edición, Mark Publishing Company, Easton, EE. UU.) y puede contener adicionalmente vehículos o aditivos farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos de los mismos incluyen, pero no se limitan a, tensioactivos, excipientes, agentes colorantes, agentes aromatizantes, conservantes, estabilizantes, tampones, agentes de suspensión, agentes de tonicidad, aglutinantes, disgregantes, lubricantes, promotores de flujo y correctores. Otros vehículos usados rutinariamente se pueden usar apropiadamente. Ejemplos específicos de los vehículos pueden incluir ácido silícico anhidro ligero, lactosa, celulosa cristalina, manitol, almidón, carmelosa cálcica, carmelosa sódica, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, dietilaminoacetato de polivinilacetal, polivinilpirrolidona, gelatina, triglicéridos de ácidos grasos de cadena media, aceite de ricino hidrogenado y polioxietilenado 60, azúcar blanco, carboximetilcelulosa, almidón de maíz y sales inorgánicas.

Tras el contacto con las células que expresan DLL3, el anticuerpo anti-DLL3 presente en una composición farmacéutica de la presente invención puede dañar las células que expresan DLL3 o inhibir su crecimiento. Tal método que usa el anticuerpo anti-DLL3 también se incorpora en el alcance de la presente invención. El anticuerpo usado no está particularmente limitado, y, por ejemplo, puede usarse cualquiera de los anticuerpos descritos anteriormente. Las células a las que se une el anticuerpo anti-DLL3 no están particularmente limitadas siempre que las células expresen DLL3. En la presente invención, las células que expresan DLL3 son preferiblemente células cancerosas, más preferiblemente células de cáncer de pulmón, particularmente preferiblemente células de cáncer de pulmón microcítico.

El “contacto” se realiza, por ejemplo, añadiendo el anticuerpo a un medio de cultivo de células que expresan DLL3 cultivadas in vitro. El “contacto” también se realiza administrando el anticuerpo anti-DLL3 a animales no humanos implantados con células que expresan DLL3 en sus cuerpos o a animales que tienen endógenamente células cancerosas que expresan DLL3.

Los métodos que se muestran a continuación se usan preferiblemente para evaluar o determinar la citotoxicidad causada en las células que expresan DLL3 por el contacto del anticuerpo anti-DLL3. Ejemplos de los métodos para evaluar o determinar la actividad citotóxica in vitro puede incluir el ensayo de la actividad ADCC o CDC descrito anteriormente. Si el anticuerpo anti-DLL3 tiene o no una actividad ADCC o tiene una actividad CDC puede determinarse mediante un método conocido en la técnica (por ejemplo, Current protocols in Immunology, Capítulo 7. Immunologic studies in humans, Editor, John E, Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc., (1993)). En el ensayo de actividad, los anticuerpos que tienen un isotipo idéntico al del anticuerpo anti-DLL3 y no se unen a las células se usan como anticuerpos de control de la misma manera que en el anticuerpo anti-DLL3. Cuando el anticuerpo anti- DLL3 exhibe una actividad citotóxica más fuerte que la de los anticuerpos de control, se puede determinar que el anticuerpo anti-DLL3 tiene la actividad.

El isotipo de un anticuerpo se define basándose en la secuencia de la región constante de la cadena pesada en la secuencia de aminoácidos de este anticuerpo. El isotipo del anticuerpo finalmente se determina dependiendo del cambio de clase causado por la recombinación genética en el cromosoma durante la maduración de los linfocitos B productores de anticuerpos in vivo. La diferencia en el isotipo refleja la diferencia entre las funciones fisiológicas/patológicas de los anticuerpos. Específicamente, se sabe que, por ejemplo, la potencia de la actividad citotóxica está influenciada no solo por los niveles de expresión del antígeno sino por los isotipos del anticuerpo. Por lo tanto, para el ensayo de actividad citotóxica descrito anteriormente, se prefiere que los anticuerpos usados como controles tengan un isotipo idéntico al del anticuerpo analito.

Además, para evaluar o determinar la actividad citotóxica in vivo, por ejemplo, las células cancerosas que expresan DLL3 se trasplantan por vía intradérmica o subcutánea a animales de experimentación no humanos. A continuación, el anticuerpo analito se administra por vía intravenosa o intraperitoneal a los mismos a diario o a algunos intervalos de unos pocos días desde el día de la administración o al día siguiente. La actividad citotóxica puede determinarse midiendo los tamaños del tumor a lo largo del tiempo. Los anticuerpos de control que tienen un isotipo idéntico a los mismos se administran de la misma manera en la evaluación in vitro. Cuando el grupo al que se ha administrado el anticuerpo anti-DLL3 tiene un tamaño tumoral significativamente menor que el del grupo al que se ha administrado el anticuerpo de control, se puede determinar que el anticuerpo anti-DLL3 tiene la actividad citotóxica. Cuando se usan ratones como animales no humanos de experimentación, preferiblemente se pueden usar ratones desnudos (nu/nu), que son genéticamente deficientes en la glándula del timo y por lo tanto carecen de las funciones de los linfocitos T. El uso de estos ratones puede excluir la participación de los linfocitos T endógenos de los animales de experimentación en la evaluación/determinación de la actividad citotóxica de los anticuerpos administrados.

Fármaco diagnóstico (método de diagnóstico)

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También se hace referencia a un método para diagnosticar el cáncer, que comprende detectar la proteína DLL3 o un gen que codifica la proteína DLL3. Se ha confirmado que la expresión de DLL3 aumenta notablemente en tejidos cancerosos o líneas celulares cancerosas. Por lo tanto, DLL3 es útil como un marcador para la detección específica de cáncer.

Un ejemplo específico del método de diagnóstico puede incluir un método para diagnosticar el cáncer, que comprende las siguientes etapas:

(a) proporcionar una muestra aislada de un sujeto de prueba; y

(b) detectar el nivel de expresión de la proteína DLL3 o el gen DLL3 en la muestra.

El método puede comprender además la etapa de

(c) evaluar la posibilidad de que el sujeto de prueba tenga cáncer, basándose en el nivel de expresión de la proteína DLL3 o el gen DLL3.

Detección de la proteína DLL3 o del gen que codifica la proteína DLL3

También se divulga un método en el que el cáncer se diagnostica mediante la detección de la proteína DLL3 en una muestra. Se prefiere que la detección de la proteína DLL3 se realice usando un anticuerpo que reconoce la proteína DLL3.

La detección abarca la detección cuantitativa o cualitativa. Los ejemplos de la detección cualitativa pueden incluir los siguientes ensayos:

- ensayo para determinar simplemente la presencia o ausencia de la proteína DLL3,

- ensayo para determinar la presencia o ausencia de más de una cantidad predeterminada de la proteína DLL3, y

- ensayo para comparar la cantidad de la proteína DLL3 con la contenida en otra muestra (p. ej., una muestra de control).

Por otro lado, los ejemplos de la detección cuantitativa pueden incluir la medición de una concentración de proteína DLL3 y la medición de la cantidad de la proteína DLL3.

La muestra de ensayo no está particularmente limitada siempre que la muestra contenga la proteína DLL3. Específicamente, son preferibles las muestras recogidas de cuerpos vivos tales como mamíferos. Las muestras recogidas de humanos son más preferibles. Los ejemplos específicos de la muestra de ensayo pueden incluir sangre, fluido intersticial, plasma, fluido extravascular, líquido cefalorraquídeo, líquido sinovial, líquido pleural, suero, linfa, saliva, orina y tejidos. La muestra es preferiblemente una muestra obtenida de la muestra de ensayo, tal como una preparación en la que se fijan tejidos o células recogidas de un cuerpo vivo, o un medio de cultivo celular.

El cáncer diagnosticado puede ser cualquier cáncer sin limitaciones particulares. Los ejemplos específicos de los mismos pueden incluir cáncer de pulmón, particularmente, cáncer de pulmón microcítico. Se puede diagnosticar cualquiera de los focos primarios y focos metastásicos de estos cánceres.

Cuando se detecta la proteína en la muestra de ensayo, se diagnostica el cáncer con su nivel como referencia. Específicamente, cuando la cantidad de proteína DLL3 detectada en la muestra de ensayo es mayor que la de un control negativo o un individuo sano, se demuestra que el sujeto de prueba tiene cáncer o muy posiblemente tenga cáncer en el futuro. Específicamente, también se divulga un método para diagnosticar el cáncer, que comprende las siguientes etapas:

(1) detectar el nivel de expresión de DLL3 en una muestra biológica recogida de un sujeto de prueba, y

(2) comparar el nivel de expresión de DLL3 detectado en la etapa (1) con el de un control, en el que cuando el nivel de expresión de DLL3 es mayor que el del control, se determina que el sujeto de prueba tiene cáncer.

El control se refiere a una muestra de referencia para comparación y abarca controles negativos y muestras biológicas de individuos sanos. Los controles negativos se pueden obtener recogiendo muestras biológicas de individuos sanos y mezclarlos, si es necesario. El nivel de expresión de DLL3 en el control se puede detectar en paralelo con la detección del nivel de expresión de DLL3 en la muestra biológica del sujeto de prueba. Como alternativa, el nivel de expresión de DLL3 en un gran número de muestras biológicas de individuos sanos se puede detectar de antemano para determinar estadísticamente el nivel de expresión estándar en individuos sanos. Específicamente, por ejemplo, la media ± 2 * desviación estándar (D.E.) o la media ± 3 * desviación estándar (D.E.) también se puede usar como el valor estándar. Estadísticamente, la media ± 2 * desviación estándar (D.E.) y la media ± 3 * desviación estándar (D.E.) incluyen valores de 80 % y 90 % de los individuos sanos, respectivamente.

Como alternativa, el nivel de expresión de DLL3 en el control se puede fijar usando una curva ROC. La curva ROC, o curva característica operativa del receptor, es un gráfico que muestra la sensibilidad de detección en la ordenada y

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las tasas de falsos positivos (es decir, “especificidad 1”) en la abscisa. La curva ROC se puede obtener representando los cambios en la sensibilidad y la tasa de falsos positivos en una serie de valores de referencia variables para determinar el nivel de expresión de DLL3 en muestras biológicas.

El “valor de referencia” para obtener la curva ROC es un valor numérico utilizado temporalmente para el análisis estadístico. En general, el “valor de referencia” para obtener la curva ROC se varía en serie dentro de un intervalo que puede cubrir todos los valores de referencia seleccionables. Por ejemplo, el valor de referencia puede variarse entre los valores medidos mínimos y máximos medidos de DLL3 en una población a analizar.

Se puede seleccionar un valor estándar que se puede esperar que ofrezca la sensibilidad y precisión de detección deseadas en función de la curva ROC obtenida. El valor estándar establecido estadísticamente en función de la curva ROC o similar también se denomina valor de corte. En un método para detectar el cáncer basado en el valor de corte, la etapa (2) descrita anteriormente comprende comparar el nivel de expresión de DLL3 detectado en la etapa (1), con el valor de corte. A continuación, cuando el nivel de expresión de DLL3 detectado en la etapa (1) es mayor que el valor de corte, se detecta cáncer en el sujeto de prueba.

El nivel de expresión de DLL3 se puede determinar mediante un método arbitrario. Específicamente, el nivel de expresión de DLL3 puede determinarse evaluando la cantidad de ARNm de DLL3, la cantidad de proteína DLL3 o la actividad biológica de la proteína DLL3. La cantidad de ARNm de DLL3 o proteína DLL3 se puede determinar mediante un método como se describe en la presente memoria descriptiva.

El sujeto de prueba es particularmente preferiblemente un ser humano. Cuando se usa un animal no humano como sujeto de prueba, la proteína DLL3 a detectar se deriva de esta especie animal.

Un método para detectar la proteína DLL3 contenida en la muestra de ensayo no está particularmente limitado y es preferiblemente un método de detección inmunológica que usa el anticuerpo anti-DLL3 como se ilustra a continuación:

ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), inmunoensayo enzimático (EIA), fluoroinmunoensayo (FIA), inmunoensayo luminiscente (LIA), inmunoprecipitación (IP), inmunoanálisis turbidimétrico (TIA),

Western blot (WB),

método inmunohistoquímico (IHC),

inmunodifusión radial única (SRID),

Dot Blot, y Slot blot.

Entre estos enfoques, el método inmunohistoquímico (IHC) es un método de ensayo inmunológico preferible para diagnosticar el cáncer, que comprende la etapa de detectar proteínas DLL3 en cortes en los que se fijan tejidos o células obtenidas de un paciente que tiene cáncer. Los métodos inmunológicos descritos anteriormente, tales como el método inmunohistoquímico (IHC), son generalmente conocidos por los expertos en la materia.

Dado que DLL3 es una proteína de membrana cuya expresión se potencia de una manera específica de las células cancerígenas, las células cancerosas o los tejidos cancerosos pueden detectarse usando el anticuerpo anti-DLL3. Las células cancerosas contenidas en células o tejidos recogidos de cuerpos vivos se detectan mediante el análisis inmunohistológico.

Los tejidos cancerosos también pueden ser detectados in vivo usando el anticuerpo anti-DLL3. Este método comprende específicamente las etapas de: (1) administrar, a un sujeto de prueba, un anticuerpo marcado con material de marcaje (por ejemplo, radioisótopo) que se une a la proteína DLL3; y (2) detectar la acumulación del material de marcaje. El anticuerpo puede marcarse de manera detectable para rastrear el anticuerpo administrado en el cuerpo vivo. Por ejemplo, el anticuerpo puede marcarse con un material fluorescente o luminiscente o un radioisótopo, y puede rastrearse su comportamiento in vivo. El anticuerpo marcado con el material fluorescente o luminiscente se puede observar usando un endoscopio o peritoneoscopio. La localización del anticuerpo puede obtenerse mediante el rastreo de la radioactividad del radioisótopo. La localización in vivo del anticuerpo anti-DLL3 representa la presencia de células cancerosas.

Se puede usar un nucleido emisor de positrones como radioisótopo para marcar el anticuerpo para la detección in vivo del cáncer Por ejemplo, el anticuerpo puede marcarse con un nucleido emisor de positrones tal como 18F, 55Co, 64Cu, 66Ga, 68Ga, 76Br, 89Zr y 124I. Un método conocido en la técnica (Acta Oncol. 32, 825-830, 1993) puede usarse en el marcaje del anticuerpo anti-DLL3 con estos nucleidos emisores de positrones.

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El anticuerpo anti-DLL3 marcado con el nucleido emisor de positrones se administra a humanos o animales. A continuación, la radiación emitida por el radionucleido se mide de manera no invasiva utilizando PET (tomógrafo de emisión de positrones) y se convierte en imágenes mediante un enfoque de tomografía computarizada. El aparato PET está diseñado para obtener datos de forma no invasiva sobre el comportamiento in vivo de fármacos o similares. El PET puede obtener imágenes cuantitativas de la intensidad de la radiación como intensidad de la señal. Mediante tal uso del PET, las moléculas de antígeno altamente expresadas en un cáncer particular pueden detectarse sin recoger muestras de pacientes. El anticuerpo anti-DLL3 puede radiomarcarse con un nucleido de vida corta usando un nucleido emisor de positrones tal como 11C, 13N, 150, 18F y 45Ti, además de los nucleidos descritos anteriormente.

Se han llevado a cabo actividades de investigación y desarrollo, por ejemplo, sobre técnicas para producir nucleidos de vida corta usando un ciclotrón médico y los nucleidos descritos anteriormente o produciendo compuestos de radiomarcaje de vida corta. El anticuerpo anti-DLL3 puede marcarse con diversos radioisótopos mediante estas técnicas. El anticuerpo anti-DLL3 administrado a los pacientes se acumula en focos primarios y focos metastásicos de acuerdo con la especificidad del anticuerpo anti-DLL3 para tejidos patológicos en cada sitio. Cuando el anticuerpo anti-DLL3 se marca con el nucleido emisor de positrones, se puede detectar su radiactividad para detectar la presencia de focos primarios y focos metastásicos en base a la localización de la radioactividad. Un valor activo de radiación gamma o emisión de positrones de 25 a 4000 keV se puede usar apropiadamente para el uso diagnóstico. Además, también se puede esperar un efecto terapéutico seleccionando un nucleido apropiado y administrando el nucleido seleccionado en cantidades mayores. Un nucleido que proporciona un valor de radiación gamma o emisión de positrones de 70 a 700 keV se puede usar para obtener el efecto anticancerígeno atribuido a la radiación.

Detección del polinucleótido que codifica la proteína DLL3

En un aspecto alternativo del método, se detecta la expresión del polinucleótido de DLL3. El polinucleótido detectado no está particularmente limitado y es preferiblemente ARNm. La detección abarca la detección cuantitativa o cualitativa. Los ejemplos de detección cualitativa pueden incluir los siguientes procedimientos de ensayo:

- ensayo para determinar simplemente determinar la presencia o ausencia del ARNm de DLL3,

- ensayo para determinar la presencia o ausencia de más de una cantidad predeterminada del ARNm de DLL3, y

- ensayo para comparar la cantidad del ARNm de DLL3 con la contenida en otra muestra (p. ej., una muestra de control).

Por otro lado, los ejemplos de la detección cuantitativa pueden incluir la medición de una concentración de ARNm de DLL3 y la medición de la cantidad de ARNm de DLL3.

Se puede usar una muestra arbitraria que contenga el ARNm de DLL3 como muestra de ensayo. Las muestras recogidas de cuerpos vivos tales como mamíferos son preferibles. Las muestras recogidas de humanos son más preferibles. Los ejemplos específicos de la muestra de ensayo pueden incluir sangre, fluido intersticial, plasma, fluido extravascular, líquido cefalorraquídeo, líquido sinovial, líquido pleural, suero, linfa, saliva, orina y tejidos. La muestra es preferiblemente una muestra obtenida de la muestra de ensayo, tal como una preparación en la que se fijan tejidos o células recogidas de un cuerpo vivo, o un medio de cultivo celular. Estas muestras están abarcadas por la muestra de ensayo.

La hibridación in situ se usa preferiblemente para la muestra obtenida a partir de la muestra de ensayo, tal como una preparación en la que se fijan tejidos o células recogidas de un cuerpo vivo, o un medio de cultivo celular. La hibridación in situ se ha desarrollado como un enfoque para confirmar la presencia o ausencia o distribución de ADN o ARN particular en células o tejidos, y la fuerza de su expresión. Este método emplea los principios en los que un ácido nucleico de sonda que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de ácido nucleico particular intracelular tiene la propiedad de formar específicamente un complejo. La sonda se marca previamente con un radioisótopo (RI), una sustancia antigénica (hapteno) o similares. Como resultado, el sitio de hibridación puede distinguirse a través de la detección del marcador. Por lo tanto, la hibridación in situ se usa, por ejemplo, en la detección de ADN o ARN intracelular o similares. Preferiblemente, se puede usar RI para el marcaje de la sonda. Por ejemplo, se puede usar más preferiblemente el marcaje de fluorescencia con una sustancia no radiactiva tal como biotina o hapteno (por ejemplo, digoxigenina). Por ejemplo, un método de detección por hibridación in situ de fluorescencia llamada FISH se usa de manera particularmente preferible.

El cáncer diagnosticado es cáncer de pulmón, en particular, cáncer de pulmón microcítico. Se puede diagnosticar cualquiera de los focos primarios y focos metastásicos de estos cánceres.

Una especie animal arbitraria que expresa el gen DLL3 puede usarse como sujeto de prueba. El sujeto de prueba es particularmente preferiblemente un ser humano. Cuando se usa una especie animal no humana como sujeto de prueba, el gen DLL3 que se detectará se deriva de esta especie animal.

En lo sucesivo, se describirá un aspecto específico del método de detección. Primero, se prepara una muestra a partir de un sujeto de prueba. Posteriormente, se detecta el ARNm de DLL3 contenido en la muestra. En el método,

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también se puede detectar el ADNc sintetizado a partir del ARNm. Cuando se detecta el ARNm de DLL3 o el ADNc que codifica DLL3 en la muestra de ensayo, se diagnostica que el sujeto de prueba posiblemente tenga cáncer. Por ejemplo, cuando la cantidad de ARNm de DLL3 o ADNc que codifica DLL3 detectada en la muestra de ensayo es mayor que en controles negativos o individuos sanos, se demuestra que el sujeto de prueba tiene cáncer o es altamente posible que tenga cáncer en el futuro.

Un método para detectar el ARNm es conocido en la técnica. Los ejemplos específicos del método que pueden usarse incluyen: hibridación de ácido nucleico usando muestras inmovilizadas en una fase sólida seleccionada de chips de genes, matrices de ADNc, y filtros de membrana; RT-PCR; PCR en tiempo real; método de resta; método de visualización diferencial; hibridación diferencial; e hibridación cruzada.

El método de detección puede automatizarse usando varios detectores automáticos. Tal automatización logra la detección de una gran cantidad de muestras en poco tiempo.

Kit para el diagnóstico del cáncer

También se describe un fármaco de diagnóstico o un kit para diagnóstico de cáncer, que comprende un reactivo para detectar proteína DLL3 en una muestra de ensayo. El fármaco de diagnóstico comprende al menos el anticuerpo anti-DLL3.

El reactivo para el diagnóstico del cáncer se puede combinar con otros factores utilizados en la detección de DLL3 para preparar un kit para el diagnóstico del cáncer. Específicamente, también se divulga un kit para el diagnóstico de cáncer, que comprende: un anticuerpo que se une a DLL3; y un reactivo para detectar la unión del anticuerpo a DLL3 y puede comprender además una muestra de control que comprende una muestra biológica que contiene DLL3. En el kit se puede incluir un manual para la instrucción de los procedimientos de ensayo.

Ejemplos

En lo sucesivo, la presente invención se describirá más específicamente con referencia a los Ejemplos. Sin embargo, la presente invención no pretende limitarse a estos ejemplos.

[Ejemplo 1] Aumento de la transcripción de DLL3 (tipo delta 3) en el cáncer de pulmón microcítico

La distribución de la expresión génica del ARNm de DLL3 humana en cánceres clínicos, líneas celulares de cáncer y diversos órganos normales se analizó utilizando Human Exon 1.0 ST Array (Affymetrix, Inc.). En el análisis de expresión, los ARN totales utilizados se derivaron de sitios tumorales en 13 casos de tejidos de cáncer de pulmón microcítico aislados, 3 tipos de líneas celulares de cáncer de pulmón microcítico y 49 tipos de tejidos normales (adquiridos de Clontech Laboratories, Inc Ambion, Inc., Stratagene Corp., Cell Applications, Inc., Panomics, Inc., CHEMICON y BioChain Institute, Inc.). Todos los sitios tumorales en tejidos de cáncer clínico aislado y líneas celulares de cáncer (adquiridos de ATCC) se sometieron a extracción de ARN total usando Trizol (Invitrogen Corp.) de acuerdo con el protocolo incluido en el producto. El experimento de análisis de la expresión génica se llevó a cabo usando 1 pg de cada ARN total así obtenido de acuerdo con el GeneChip Whole Transcript (WT) Sense Target Labeling Assay Manual (Affymetrix, Inc.). Los datos del Human Exon 1.0 ST Array Data se digitalizaron utilizando el software ExACT (Exon Array Computational Tool) proporcionado por Affymetrix, Inc.

En Human Exon 1.0 ST Array estaban presentes 13 conjuntos de sondas básicas para DLL3. La media de los valores de expresión se determinó a partir de estos conjuntos de sondas, y el nivel de expresión génica se comparó entre los tejidos. Los datos de expresión obtenidos de los tejidos normales, los sitios del tumor en tejidos de cáncer de pulmón microcítico aislados, y las líneas celulares de cáncer de pulmón microcítico se muestran en la Figura 1.

Se encontró que la expresión del gen DLL3 humano estaba notablemente aumentada en los sitios tumorales en tejidos aislados de cáncer de pulmón microcítico y líneas celulares de cáncer de pulmón microcítico, en comparación con los tejidos normales, excepto el cerebro fetal. Estos resultados prometen la efectividad de la terapia usando un agente antitumoral dirigido molecularmente al DLL3 humano, es decir, la posibilidad de reducir el tamaño del tumor sin dañar los tejidos normales.

[Ejemplo 2] Clonación de ADNc y preparación de células recombinantes

El ADNc de DLL3 humano (NM_016941) expuesto en las SEQ ID NOs: 1 y 57 se amplificó por PCR a partir de una biblioteca de ADNc de cerebro fetal humano y se clonó en vectores de expresión pMCN para mamíferos. El vector pMCN logra la expresión de un gen extraño bajo el control de un promotor de CMV de ratón (GenBank: U68299). El vector pMCN tiene un gen de resistencia a geneticina. Se transformó una línea celular CHO DG44 (Invitrogen Corp.) con el vector de expresión de DLL3 humano. Las células resistentes a los fármacos se seleccionaron en presencia de geneticina. Las células clonadas que expresan establemente la proteína humana DLL3 se seleccionaron usando anticuerpos anti-DLL3 comercializados (R & D Systems, Inc., MAB4315) para establecer células DLL3 humana/DG. Asimismo, una línea de linfocitos pro B dependiente de IL-3 de ratón, Ba/F3, se transformó en el vector de expresión

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de DLL3 humano para establecer células DLL3 humana/BaF3.

El ADNc de DLL3 de ratón (NM_007866) expuesta en las SEQ ID N°: 2 y 58 se amplificó por PCR a partir de una biblioteca de ADNc fetal de ratón y se clonó en vectores de expresión pMCN para mamíferos. Se transformó una línea celular Ba/F3 con el vector de expresión de DLL3 de ratón. Las células resistentes a los fármacos se seleccionaron en presencia de geneticina. Las células que expresan la proteína DLL3 de ratón se seleccionaron usando anticuerpos comercializados (R & D Systems, Inc., MAB4315) para establecer células DLL3/BaF3 de ratón.

El ADNc de DLL1 humano (NM_005618) expuesto en las SEQ ID NOs: 3 y 59 se amplificó por PCR a partir de una biblioteca de ADNc de bazo humano y se clonó en vectores de expresión pMCN para mamíferos. Se transformó una línea celular Ba/F3 con el vector de expresión de DLL1 humano. Las células resistentes a los fármacos se seleccionaron en presencia de geneticina. Las células que expresan la proteína DLL1 humana se seleccionaron usando anticuerpos comercializados (R & D Systems, Inc., MAB1818) para establecer células DLL1 humana/BaF3.

El ADNc de Notch1 humano (NM_017617) expuesto en la SEQ ID NOs: 4 y 60 se amplificó por PCR a partir de una línea de células de cáncer de mama, biblioteca de ADNc DU4475 y se clonó en vectores de expresión pMCN para mamíferos. Se transformó una línea celular DG44 con el vector de expresión Notch1 humano. Las células resistentes a los fármacos se seleccionaron en presencia de geneticina. Las células que expresan la proteína Notch1 humana se seleccionaron usando anticuerpos comercializados (GeneTex Inc., GTX23294) para establecer células Notch1 humana/DG44.

Las líneas celulares que producen una proteína DLL3 soluble o su proteína variante de deleción N-terminal se prepararon con el fin de obtener inmunógenos para la obtención de anticuerpos anti-DLL3 y determinar epítopos para los anticuerpos obtenidos. La secuencia extracelular de DLL3 humana está compuesta por un dominio DSL con motivo de unión al receptor Notch (números 176-215 en la secuencia de aminoácidos) y seis dominios similares a EGF (1: 216-249, 2: 274-310, 3: 312 -351, 4: 353 - 389, 5: 391 - 427, y 6: 429 - 465).

Se preparó y clonó ADNc que codifica una molécula quimérica de humana DLL3-Fc (SEQ ID NO: 5) que consiste en una región extracelular de DLL3 humana (27-492 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1) y la región constante de un anticuerpo IgG2a de ratón en vectores de expresión pMCN para mamíferos. Se transformó una línea celular DG44 con el vector de expresión de DLL3 humana-Fc. Las células resistentes a los fármacos se seleccionaron en presencia de geneticina. Los clones con un alto nivel de expresión de la proteína DLL3 humana-Fc se seleccionaron mediante ELISA usando anticuerpos anti-ratón para establecer células DG44 productoras de DLL3 humana-Fc.

Se preparó y clonó ADNc que codifica una molécula quimérica de DLL3delta1 humana-Fc (SEQ ID NO: 6) que consiste en una secuencia parcial de la región extracelular de DLL3 humana (176-492 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1) y la región constante de un anticuerpo IgG2a de ratón en vectores de expresión pMCN para mamíferos. Se transformó una línea celular DG44 con el vector de expresión de DLL3delta1 humana-Fc. Las células resistentes a los fármacos se seleccionaron en presencia de geneticina. Los clones con un alto nivel de expresión de la proteína DLL3delta1 humana-Fc se seleccionaron mediante ELISA usando anticuerpos anti-ratón para establecer células DG44 productoras de DLL3delta1 humana-Fc.

Se preparó y clonó ADNc que codifica una molécula quimérica de DLL3delta2 humana-Fc (SEQ ID NO: 7) que consiste en una secuencia parcial de la región extracelular de DLL3 humana (216-492 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1) y la región constante de un anticuerpo IgG2a de ratón en vectores de expresión pMCN para mamíferos. Se transformó una línea celular DG44 con el vector de expresión de DLL3delta2 humana-Fc. Las células resistentes a los fármacos se seleccionaron en presencia de geneticina. Los clones con un alto nivel de expresión de la proteína DLL3delta2 humana-Fc se seleccionaron mediante ELISA usando anticuerpos anti-ratón para establecer células DG44 productoras de DLL3delta2 humana-Fc.

Se preparó y clonó ADNc que codifica una molécula quimérica de DLL3-Fc de ratón (SEQ ID NO: 8) que consiste en una región extracelular de DLL3 de ratón (33-490 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2) y las secuencias de la región constante de un anticuerpo IgG2a de ratón en vectores de expresión pMCN para mamíferos. Se transformó una línea celular DG44 con el vector de expresión de DLL3-Fc de ratón. Las células resistentes a los fármacos se seleccionaron en presencia de geneticina. Los clones con un alto nivel de expresión de la proteína DLL3-Fc de ratón se seleccionaron mediante ELISA usando anticuerpos anti-ratón para establecer células DG44 productoras de DLL3-Fc de ratón.

Cada proteína de interés se purificó a partir del sobrenadante de cultivo de la línea celular productora de la proteína de fusión Fc mediante cromatografía en columna de afinidad con proteína G y cromatografía de filtración en gel. La concentración de la proteína purificada se determinó por ensayo de proteína DC (Bio-Rad Laboratories, Inc.) con la IgG conocida por su concentración como patrón.

[Ejemplo 3] Obtención del anticuerpo anti-DLL3 y análisis de la internalización de epítopos y anticuerpos

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Se inmunizaron ratones Balb/c de seis a siete semanas (Charles River Laboratories Japan, Inc.) y MRL/MpJJmsSIc- Ipr/lpr (Japan SLC, Inc.). Para la estimulación inicial, las proteínas antigénicas preparadas en una emulsión usando un adyuvante completo de Freund (Becton, Dickinson and Company), se administraron por vía subcutánea a los mismos a una dosis de 0,1 mg de DLL3 humana-Fc/cabeza. Dos semanas más tarde, una emulsión de antígeno preparada usando un adyuvante incompleto de Freund se administró por vía subcutánea a los mismos a una dosis de 0,05 mg/cabeza un total de 3 a 6 veces una vez a la semana. Se administraron 0,05 mg de las proteínas antigénicas por vía intravenosa a cada ratón individual en el cual se había confirmado que tenía un aumento en el título de anticuerpos en su suero. Tres días más tarde, las células del bazo se extrajeron y mezclaron con células de mieloma de ratón P3-X63Ag8U1 (ATCC) a una relación de recuento celular de aproximadamente 3:1. Estas células se fusionaron mediante el método de polietilenglicol (PEG). Después de la eliminación de PEG por centrifugación, las células se suspendieron en un medio RPMI1640 que contenía 1 x suplemento de medio HAT (Sigma-Aldrich Corp.), 0,5 x BM-Condimed H1 Hybridoma, suplemento de clonación (Roche Diagnostics GmbH) y 10 % de suero bovino fetal para ajustar la concentración celular. A continuación, las células se sembraron en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Se confirmó la formación de colonias de hibridoma, y la presencia o ausencia de anticuerpos anti-DLL3 contenidos en el sobrenadante del cultivo se analizó a continuación mediante ELISA usando una placa recubierta con DLL3 humana-Fc. Las células de hibridoma contenidas en pocillos positivos se clonaron por el método de dilución limitante para establecer líneas de hibridoma que producen los anticuerpos anti-DLL3. Los anticuerpos monoclonales se isotiparon utilizando IsoStrip (Roche Diagnostics GmbH).

Cada anticuerpo monoclonal IgG se purificó a partir de los sobrenadantes de cultivo de los hibridomas establecidos mediante cromatografía en columna de afinidad con proteína G y tratamiento de desalinización. La concentración del anticuerpo purificado se determinó por ensayo de proteína DC.

La DLL3 humana-Fc, la DLL3 de ratón-Fc, la DLL3delta1 humana-Fc y la DLL3delta2 humana-Fc se inmovilizaron por separado en un inmunoplaca Nunc (439454). Posteriormente, la superficie sin reaccionar de la placa se bloqueó con una solución que contenía albúmina de suero bovino. Después del lavado, cada solución diluida de anticuerpo ajustada a una concentración apropiada se añadió a la misma y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. La solución de reacción se eliminó de la placa. Después de lavar con TBS que contiene Tween 20, se añadieron anticuerpos anti IgK de ratón marcados con fosfatasa alcalina a la placa y se incubaron durante 1 hora. Después del lavado de la placa, se añadió a la misma un sustrato de fosfatasa alcalina Sigma 104 y se incubó a temperatura ambiente. Después de la incubación, se midió la absorbancia a una longitud de onda de 405 nm y una longitud de onda de referencia de 655 nm. Los resultados se muestran en la Figura 2. Todos los anticuerpos purificados se unieron a la DLL3 humana-Fc de una manera dependiente de la dosis. Los anticuerpos monoclonales DL301, DL302, DL306 y DL312 y el anticuerpo comercializado MAB4315 se unieron a la DLL3-Fc de ratón. El anticuerpo comercialmente disponible MAB4315 se unió a la DLL3delta1 humana-Fc, pero no se unió a la DLL3delta2 humana- Fc, lo que demuestra que su epítopo estaba localizado en el dominio DSL. Los anticuerpos DL303, DL304, DL307 y DL311 no se unen ni a DLL3delta1 humana-Fc ni a DLL3delta2 humana-Fc. Por lo tanto, los epítopos predichos para estos anticuerpos se localizan entre los restos 27 y 175 en la secuencia de aminoácidos de SeQ ID NO: 1. DL301, DL302, DL305, DL306, DL308, DL309 y DL312 se unieron tanto a DLL3delta1 humana-Fc como a DLL3delta2 humana-Fc, lo que demuestra que los epítopos para estos anticuerpos se localizaron en los restos 216-492 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. En la Figura 9 se muestra la estructura esquemática de la proteína DLL3 de longitud completa y la proteína de fusión DLL3-Fc soluble y un sitio reconocido por cada anticuerpo anti- DLL3.

La unión de cada anticuerpo monoclonal a la DLL3 humana expresada en una membrana celular y el comportamiento de un complejo de anticuerpo monoclonal anti-DLL3 humana en la membrana celular se analizaron por citometría de flujo. Las células DLL3 humanas/BaF3 se suspendieron en un tampón FACS (PBS que contenía suero bovino fetal al 1 % y azida sódica al 0,05 %). La suspensión celular de 1 x 106 células/ml se hicieron reaccionar con el anticuerpo monoclonal (concentración final: 5 pg/ml) a 4 °C durante 30 minutos. Después de la centrifugación y la eliminación del sobrenadante, las células se lavaron una vez con un tampón FACS. Se añadieron anticuerpos IgG (H+L) anti-ratón marcados con FITC (Beckman Coulter, Inc.) y se incubaron a 4 °C durante 30 minutos. Los anticuerpos FITC sin reaccionar se eliminaron mediante centrifugación. A continuación, las células se resuspendieron y se analizaron usando un citómetro de flujo FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company). Con el fin de analizar el movimiento o la desaparición del complejo de DLL3-anticuerpo de la membrana celular, se suspendieron células DLL3/BaF3 humanas en un medio de cultivo RPMI1640 que contenía suero bovino fetal al 10 % (FBS) e IL3 de ratón. La suspensión celular de 1 x 106 células/ml se mezcló con el anticuerpo monoclonal (concentración final: 5 pg/ml) y se hicieron reaccionar a 37 °C durante 1 hora o 4 horas en una incubadora de CO2. Después de la reacción, la cantidad de anticuerpo unido a la membrana celular se analizó mediante citometría de flujo de la misma manera que anteriormente. La media geométrica de los valores de intensidad de fluorescencia (X Media Geo) en un gráfico de histograma celular se determinó usando el software analítico CELLQuest Pro incluido en FACSCalibur. Todos los anticuerpos monoclonales anti-DLL3 aislados se unieron a DLL3 en las células (Figura 3 (a)). La reacción del anticuerpo con las células a 4 °C inhibe la fluidez de la membrana, tal como la captación celular del complejo de DLL3-anticuerpo de la membrana celular. La reacción del anticuerpo con las células a 37 °C puede causar la absorción celular del complejo anticuerpo-DLL3 y el sombreado (liberación de la membrana celular) resultante de la digestión con proteasa o similares. La cantidad de cada anticuerpo monoclonal unido a la membrana celular como resultado de la incubación a 37 °C durante 1 hora o 4 horas se muestra en la Figura 3(b) como un valor

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relativo en comparación con la de 4 °C. Como resultado de la incubación a 37 °C, se disminuyó la cantidad de anticuerpo DL303, DL304, DL305, DL308, DL309 o MAB4315 en la superficie de la membrana celular. Estos resultados sugieren la internalización o el sombreado del complejo DLL3-anticuerpo. Por el contrario, como resultado de la incubación a 37 °C, la cantidad del anticuerpo DL301, DL306, DL307, DL311 o DL312 en la superficie de la membrana celular apenas cambió o aumentó. El último resultado demostró que estos anticuerpos podían residir de manera estable en la forma de un complejo DLL3 en la membrana celular.

El número de la proteína DLL3 en la superficie celular se determinó usando un QIFIKIT (DAKO, F0479) para la determinación cuantitativa del antígeno de superficie celular mediante citometría de flujo. El análisis se realizó con el anticuerpo anti-DLL3 DL303 (concentración final: 5 pg/ml) como anticuerpo primario de acuerdo con el protocolo incluido en el mismo. Los números del antígeno en las superficies de las células DLL3 humanas/BaF3, NCI-H1184 (ATCC), NCI-H1436 (ATCC) y Y79 (banco de células Riken) fueron aproximadamente 9000, 7000, 6000 y 3000, respectivamente.

[Ejemplo 4] Inducción de la actividad ADCC por los anticuerpos anti-DLL3 e inhibición del crecimiento mediada por el complejo anticuerpo-toxina

Cada anticuerpo anti-DLL3 se examinó para determinar su actividad inductora de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) contra células que expresan DLL3 marcadas con calceína. DLL3 humana/BaF3 que expresa DLL3 y líneas celulares de cáncer de pulmón microcítico NCI-H1184 (ATCC) se cultivaron por separado durante 90 minutos en presencia de 20 pg/ml de calceína-AM (Dojindo, 349-07201), a continuación se centrifugaron y se lavaron para preparar células diana marcadas con calceína. Las células diana fueron sembradas a razón de 1 x 104 células/pocillo a una placa de 96 pocillos (Coster 3799). Posteriormente, se añadió al anticuerpo ajustado a una concentración final apropiada y se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se añadieron células efectoras a razón de 5 x 104 células/pocillo. La placa de reacción se incubó a 37 °C en una incubadora de CO2. Las células efectoras utilizadas fueron células NK92 que expresan una molécula quimérica de FcyR3 de ratón-FcYR3 humano (WO 2008/093688). Después de 4 horas de incubación, la placa se centrifugó y se recogieron 100 pl del sobrenadante del cultivo de cada pocillo. La intensidad de fluorescencia se midió usando ARVO SX (Wallac).

La actividad inductora de ADCC se calculó de acuerdo con la siguiente fórmula:

ADCC [%] = (A-C) / (B-C) x 100,

en la que A representa la intensidad de fluorescencia en cada pocillo; B representa la media de la intensidad de fluorescencia en el sobrenadante de células lisadas con Nonidet P-40 con la concentración final de 1 %; y C representa la media de intensidad de fluorescencia en un pocillo suplementado con solo un medio. La media y la desviación estándar se calcularon a partir de tres mediciones en cada condición experimental. La Figura 4 muestra la actividad inductora de ADCC del anticuerpo añadido a la concentración final de 2,5 pg/ml frente a las células DLL3/BaF3. No se confirmó actividad ADCC para los anticuerpos de control IgG1 e IgG2b, mientras que la actividad inductora de ADCC se confirmó en DL301, DL306 y DL312. No se confirmó actividad inductora de ADCC distinta en el anticuerpo monoclonal comercializado MAB4315. La Figura 5 muestra que los anticuerpos DL301, DL306 y D312 inducen ADCC contra DLL3/BaF3 y NCI-H1184 de una manera dependiente de la dosis.

Cada anticuerpo monoclonal anti-DLL3 se evaluó para determinar su captación celular usando un anticuerpo secundario anti-ratón marcado con toxina Mab-ZAP (Advanced Targeting Systems). Las células DLL3/BaF3 se sembraron a razón de 5 x 103 células/pocillo a una placa de 96 pocillos. Posteriormente, se añadieron al anticuerpo monoclonal ratón anti-DLL3 de ratón y Mab-ZAP (concentración final: 1 pg/ml) y se incubaron a 37 °C en una incubadora de CO2. Cuatro días después, se añadió a esto el Cell Count Reagent SF (Nacalai Tesque, Inc.). La absorbancia se midió a 450 nm y a una longitud de onda de control de 620 nm usando un lector de microplacas para determinar el crecimiento celular (Figura 6). La adición del anticuerpo monoclonal anti-DLL3 y Mab-ZAP a las células inhibió el crecimiento celular. Los anticuerpos DL301, DL306 y DL312 en los que se confirmó que tenían una actividad inductora de ADCC permanecieron en grandes cantidades en células que expresan DLL3 después de mezclarse con las células y cultivarse a 37 °C, y exhibieron un bajo efecto inhibidor del crecimiento provocado por la absorción celular del complejo Mab-ZAP.

[Ejemplo 5] Clonación de la región variable del anticuerpo y preparación del anticuerpo recombinante

Se preparó una biblioteca SMART 5'-RACE cDNA (Clontech Laboratories, Inc.) a partir de los ARN totales de los hibridomas que producen cada anticuerpo anti-DLL3. La preparación del ARN total se realizó usando la columna RNeasy Mini (Qiagen). La preparación de la biblioteca de ADNc siguió las instrucciones del fabricante. Las secuencias que codifican las regiones variables del anticuerpo (VH y VL) se amplificaron por PCR usando cebadores complementarios a secuencias que codifican las regiones constantes del anticuerpo. Los fragmentos así amplificados por PCR se clonaron en pCR2.1TOPO y se secuenciaron. Se construyeron vectores de expresión de anticuerpos quiméricos que contienen las secuencias que codifican VH y VL obtenidas y las secuencias que codifican la región constante de la IgG1 humana. Las secuencias que codifican la cadena ligera y la cadena pesada se incorporaron en un vector de expresión para células de mamífero y se transcribieron bajo el control de un

promotor de CMV de ratón. La Tabla 1 muestra las SEQ ID NOs de las secuencias de la región variable del anticuerpo identificadas y sus secuencias de CDR, secuencias del anticuerpo de ratón de longitud completa y las secuencias del anticuerpo quimérico.

Claims (8)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   1. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo que se une a la proteína DLL3 como principio activo, en la que el anticuerpo tiene una actividad citotóxica.
2. 2. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la actividad citotóxica es una actividad citotóxica celular dependiente de anticuerpos (actividad ADCC).
3. 3. La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en la que el anticuerpo tiene una actividad de internalización.
4. 4. La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el anticuerpo está conjugado con una sustancia citotóxica.
5. 5. La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el anticuerpo reconoce una región de los aminoácidos 216 a 492 en la DLL3 humana que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1.
6. 6. La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el anticuerpo se selecciona de anticuerpos que se unen a la proteína DLL3 descrita en cualquiera de los siguientes:

   (1) un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la CDR1 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 12, la CDR2 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 13 y la CDR3 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 14, y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR1 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 18, la CDR2 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 19, y la CDR3 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 20;

   (2) un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la CDR1 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 24, la CDR2 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 25 y la CDR3 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 26, y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR1 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 30, la CDR2 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 31, y la CDR3 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 32;

   (3) un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la CDR1 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 36, la CDR2 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 37 y la CDR3 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 38, y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR1 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 42, la CDR2 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 43, y la CDR3 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 44;

   (4) un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la CDR1 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 48, la CDR2 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 49 y la CDR3 de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 50, y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR1 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 54, la cDR2 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 55 y la CDR3 de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 56;

   y

   (5) un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el de la proteína DLL3 al que se une cualquiera de los anticuerpos (1) a (4).
7. 7. Una composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso en un método para tratar el cáncer, en la que el agente anticanceroso se dirige al cáncer de pulmón.

   Puntuación de la expresión génica

   Caso de cáncer 1

   Caso de cáncer 2

   Caso de cáncer 3 I

   Caso de cáncer 4 I

   Caso de cáncer 5

   Caso de cáncer 6 I -i

   Caso de cáncer 7 Caso de cáncer 8 Caso de cáncer 9 Caso de cáncer 10 Caso de cáncer 11 Caso de cáncer 12 Caso de cáncer 13 Línea cel.NCI-H209 Linea cel. NCI-H1184 Línea cel NCI-H1672

   imagen1

   3 cl

   — ií.

   Puntuación de la expresión génica

   Cerebro Córtex Hipocampo Diencéfalo Hipotálamo i Cerebelo Hipófisis Nervio oeriférico Órgano olfativo Glándula salivar Amígdala Glándula tiroidea Músculo esquel. Corazón Piel T ráquea Pulmón Lengua Esófago Estómago ntestino delgado Intestino grueso Páncreas Hígado Vesícula biliar Glánd.suprarrenal Riñón Vejiga Bazo Adipocito Arteria Vena

   Ganglio linfático Médula ósea Leuc. periférico Macrófago Monocito Glánd. mamaria Ovario Útero Placenta Cervix uterino Próstata Testículos Cerebro fetal Intest. grueso fetal Hígado fetal Pulmón fetal Estómago fetal

   Expresión del gen DLL3 en tejido normal

   CO

   DLL3 humana Fe

   imagen2

   imagen3

   DLL3 de ratón Fe
8. 2.0 I

   —C—DL301

   m i i

   —0—01304

   ir> o

   ~úr- 01302

   o o 1.5 \

   —W— DL303

   < i í

   —O- DL308

   CU O 1.0 1

   -«♦—01309

   c CtJ ¡

   -■•—01305

   jQ

   — •*— OL306

   O <s> O o.s j

   —*--0007

   <

   «««••« 01311

   o.o i

   —01312

   1

   imagen4

   ~«fr~ MAB4315

   10 100 3000

   Anticuerpo monoclonal [ng/ml]

   —0—OL301 -O— 0L304 -£r-01302 —DL303 -0—01308

   --•--01309

   -•■--01305 -•*—01306 -•*—01307 DL311 -w— DL312 -•+••• MAB4315

   —O— 01301 —O— 01304 —C¡— 0L302 —DL303 01308 —♦—01309 —■—01305 —DL306 --*—01307

   •••♦•• 0L311 OL312

   DLL3delta 2 humana Fe

   imagen5

   —O— DL301 —O— DL304 —ü— 01302 —h— 01303 -0—01308 —♦—01309 -•■—DL305 -•*--01306 —DL307 01311 # 01312

   —f— MA8431S

   ••••+••• MA84315

   Anticuerpo unido a la superficie celular (%)

   X Media geo

   DL301

   DL302

   DL303

   DL304

   DL305

   DL306

   DL307

   DL308

   DL309

   DL311

   DL312

   MAB4315

   H1 i-i Ni N> u> r-o eo en

   en O en O en o o o o o O O

   O

   O

   O

   o O o o

   -f—

   i —--- _i_ _i_ _1_ _i

   imagen6

   DL302

   DL303

   DL304

   DL305

   DL306

   e

   0L307 DL308

   DL309

   DL311

   DL312

   MAB4315

   Sin anticuerpo j>gj

   ■ □

   UJ

   eo ■E.

   o°

   0°

   p°

   ir

   3*

   cu cu '-J "U —p —p

   p p

   4-‘ H-»

   3" zr

   □

   •p.

   o°

   Fig.3

   ji

   (Q

   ADCC[%]

   . M »—4 NJ

   Cn o en o en o

   imagen7

   100

   (a)

   Célula diana: DLL3/BaF3

   imagen8

   (b)

   Célula diana: NCI-H1184

   imagen9

   Adición de MabZAP

   TI

   CQ

   b>

   Absorbancia (A450/620)

   imagen10

   O

   Vj

   102

   (a) DLL3 humana/BaF3

   anticuerpo quimérico DL301

   imagen11

   (b) Ba/F3

   imagen12

   128 0 128

   imagen13

   g

   anticuerpo quimérico DL309

   imagen14

   anticuerpo quimérico DL312

   imagen15

   Anticuerpo monoclonal de ratón [ng/ml]

   eou

   imagen16

   imagen17

   imagen18

   Unión del anticuerpo quimérico DL301

   104

   Dominio DSL

   Dominio EGF <

   •-

   imagen19

   Región transmembrana

   Sitio del epítopo

   DL303

   DL304

   DL307

   DL311

   J

   MAB4315

   DL301

   DL302

   DL305

   DL306

   DL308

   DL309

   DL312

   imagen20

   imagen21

   DLL3-FC DLL3delta1-Fc DLL3delta2-Fc

   105

   (a) DLL humana/BaF3

   (b) Ba/F3

   imagen22

   106

   imagen23

   Anticuerpo quimérico humano [pg/ml]

   —o—DL301 -o- DL306 -*• -DL309 —h—DL312

   imagen24

   Anticuerpo quimérico humano [pg/ml]

   107

   imagen25

   Anticuerpo lgG2a defucosilado de ratón [pg/ml]

   30

   H1184

   -O- DL301 —O—DL306 -k- DL312

   imagen26

   Anticuerpo lgG2a defucosilado de ratón [pg/ml]

   DL301

   DL306

   DL312