TR201806936T4 - Anti-dll3 antikoru. - Google Patents

Anti-dll3 antikoru. Download PDF

Info

Publication number
TR201806936T4
TR201806936T4 TR2018/06936T TR201806936T TR201806936T4 TR 201806936 T4 TR201806936 T4 TR 201806936T4 TR 2018/06936 T TR2018/06936 T TR 2018/06936T TR 201806936 T TR201806936 T TR 201806936T TR 201806936 T4 TR201806936 T4 TR 201806936T4
Authority
TR
Turkey
Prior art keywords
antibody
seq
dll3
amino acid
acid sequence
Prior art date
Application number
TR2018/06936T
Other languages
English (en)
Inventor
Yoshida Kenji
Aburatani Hiroyuki
Ishikawa Shumpei
Original Assignee
Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Univ Tokyo
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=44319091&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=TR201806936(T4) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Chugai Pharmaceutical Co Ltd, Univ Tokyo filed Critical Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Publication of TR201806936T4 publication Critical patent/TR201806936T4/tr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3023—Lung
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4703—Regulators; Modulating activity

Abstract

Mevcut buluş, bir antikanser ajanıyla ilgilidir.

Description

TARFNAME ANTI-DLL3 ANTIKORU Teknik Alan tarihinde basvurusu yapilmistir) dayanarak rüçhan talep etmektedir.
Mevcut bulus bir antikanser ajaniyla ilgilidir.
Teknigin Arka Plani Küçük hücreli akciger kanseri, tüm akciger kanseri insidansinin yaklasik % 20isinden sorumludur. Küçük hücreli akciger kanseri hizla ilerler ve birçok vakada tani kondugunda lenf nodu metastazi veya uzak metastaz ortaya çikmis oldugundan cerrahi olarak çikarilmasi zordur. Bu kanser erken asamalarinda bir antikanser ajanina karsi yüksek yanit oranlari sergilemektedir. Bu nedenle kemoterapi, kanseri tedavi etmek için ilk seçenek olarak kabul edilmektedir. Ancak kanser kemoterapiye hemen dirençli hale gelmekte ve % 5 ya da daha düsük bir 3 yillik sagkalim orani ile tekrarlamaktadir. Bu nedenle yeni bir tedaviye ihtiyaç vardir.
Delta-benzeri 3 (DLL3), Notch ligand ailesi üyelerine ait bir tip I membran proteindir.
DLL3 normal somit olusumu ve desenlendirme için gereklidir. DLL3'teki mutasyonlar otozomal çekinik spondilolakostal disostoz hastalarinda kaburga defektlerine veya spondilolize neden olmaktadir [Patent Disi Literatürler 1 ve 2]. DLL1 hücre yüzeyi üzerinde Iokalizedir ve Notch'e baglanirken, DLL3 agirlikli olarak Golgi cisimcigine lokalize olur ve Notchia baglanmaz (Patent Disi Literatürler 3 ve 4).
DLL3 geninin kromozomdaki artisini ve bu genin pankreatik kanser hücre dizilerinde artan ekspresyonunu [Patent Disi Literatür 5] ve bazi glioma vakalarinda artan DLL3 ekspresyonunu [Patent Disi Literatür 6] bildiren Önceki çalismalar mevcuttur. Bununla birlikte, hücre yüzeyindeki DLL3 proteininin sayisi henüz bildirilmemistir. Antikora bagli hücre aracili sitotoksisite (ADCC) indükleme kabiliyetine sahip defukosile antikorlar için bile 104 düzeyindeki modifiye edilmemis antikorlar veya antijen molekülleri için 105 veya daha fazla antijen molekülünün ekspresyonu bu antikorlari kullanarak hücre yüzeyindeki antijen moleküllerini hedeflemek için veya ADCC aktivitesinin anti-tümör mekanizmasi altinda kanser hücrelerini öldürmek için gereklidir [Patent Disi Literatür 7]. Bu nedenle, DLL3'ün antikorlara dayali bir terapötik hedef olarak uygun olup olmadigi belirsizdir.
Fare anti-DLL3 monoklonal antikorlari (MAB4315, R & D Systems, lnc.) halihazirda bir arastirma reaktifi olarak piyasada mevcuttur.
Patent Disi Literatür Atif Listesi Asagidaki baska belgelere de deginilmektedir: küçük hücreli akciger kanserinde tümör baslatici kapasitesini düzenleyen Achaete- Scute Complex Homologue l; ve o Gliomanin teshisi, prognozu ve tedavisi için yöntemler ile ilgili Bulusun Kisa Açiklamasi Teknik Problem Mevcut bulusun bir amaci, yeni bir antikor, bu antikoru içeren bir anti-kanser ajani ve bunu kullanarak kanseri teshis etmek için bir yöntem saglamaktir.
Problemin Çözümü Mevcut bulus sahipleri, küçük hücreli akciger kanserinde DLL3 mRNA ekspresyonunun arttigini kesfetmistir. Fetal beyin haricindeki tüm normal dokularda ekspresyonu düsüktür. Mevcut bulus sahipleri, DLL3 proteinine karsi monoklonal antikorlar hazirlamistir. Antikora baglanabilme özelligine göre ölçülen hücre yüzeyi üzerindeki antijen seviyesi, ekspres eden hücre basina sadece 104 Beklenmedik bir sekilde mevcut bulusun sahipleri, hücre zarinda kararli bir sekilde yer alan ve ADCC'yi indükleyen bir aktiviteye sahip olan hücre disi alanin C ucuna yakin bir karakteristik epitop yoluyla DLL3'e baglanan bir antikorun bulundugunu kesfettiler. Spesifik olarak, mevcut bulusun sahipleri bir anti-tümör aktivitesine sahip olan bir antikor için ardisik taramalar gerçeklestirmistir. Ayrica mevcut bulus sahipleri, toksinle konjuge edilen bir antikorun, DLL3 ekspres eden hücrelere karsi sitotoksik bir aktiviteye sahip oldugunu kesfetmistir. Bu bulgulardan, mevcut bulus sahipleri, anti- DLL3 antikorunun, DLL3 ekspres eden birincil veya metastatik kanserin teshisi, önlenmesi ve tedavisinde yararli oldugunu bulmustur. Bu bulgulara dayanarak, mevcut bulus tamamlanmistir.
Buna göre, mevcut bulus etken madde olarak DLL3 proteinine baglanan bir antikoru içeren bir farmasötik kompozisyon saglamaktadir ki burada antikor sitotoksik bir aktiviteye sahiptir. Mevcut bulus ayrica kanserin tedavisi için bir yöntemde kullanilmak üzere bulusun farmasötik bir bilesimini saglamaktadir ki burada anti- kanser ajani akciger kanserini hedeflemektedir.
Mevcut bulusun farmasötik bilesimi, DLL3 proteinine baglanan bir antikor içermektedir ki burada antikor bir sitotoksik aktiviteye sahiptir. Ozellikle tercih edilen sekliyle sitotoksik aktivite, antikora bagimli hücre aracili bir sitotoksik aktivitedir (ADCC aktivitesi). Yine tercih edilen sekliyle, antikor bir internalizasyon aktivitesine sahiptir. Yine tercih edilen sekliyle, antikor bir sitotoksik madde ile konjuge edilmektedir. Yine tercih edilen sekliyle, antikor DIZI ID NO: 1'de belirtilen amino asit dizisine sahip insan DLL3'ünde 216 ila 492. amino asitlerin arasindaki bir bölgeyi tanimaktadir.
Baska bir yönüyle, bulusun farmasötik bilesimi, asagidakilerin herhangi birinde tarif edilen DLL3 proteinine baglanan antikorlardan seçilen bir antikor içermektedir: (1) DIZI ID NO: 12rde belirtilen amino asit dizisine sahip agir zincir CDRl, DIZI ID NO: 13'te belirtilen amino asit dizisine sahip agir zincir CDR2 ve DIZI ID NO: 14ite belirtilen amino asit dizisine sahip agir zincir CDRS'ü içeren bir agir zincir degisken bölgesini ve DIZI ID NO: 18ide belirtilen amino asit dizisine sahip hafif zincir CDR1, DIZI ID NO: 19rda belirtilen amino asit dizisine sahip hafif zincir CDR2 ve DIZI ID NO: 20ide belirtilen amino asit dizisine sahip hafif zincir CDR3'ü içeren bir hafif zincir degisken bölgesini içeren bir antikor; (2) DIZI ID NO: 24'te belirtilen amino asit dizisine sahip agir zincir CDR1, DIZI ID NO: 251te belirtilen amino asit dizisine sahip agir zincir CDR2 ve DIZI ID NO: 26ida belirtilen amino asit dizisine sahip agir zincir CDR3*ü içeren bir agir zincir degisken bölgesini ve DIZI ID NO: 30*da belirtilen amino asit dizisine sahip hafif zincir CDR1, DIZI ID NO: 31ide belirtilen amino asit dizisine sahip hafif zincir CDR2 ve DIZI ID NO: 32'de belirtilen amino asit dizisine sahip hafif zincir CDRS'Ü içeren bir hafif zincir degisken bölgesini içeren bir antikor; (3) DIZI ID NO: 36'da belirtilen amino asit dizisine sahip agir zincir CDR1, DIZI ID NO: 37'de belirtilen amino asit dizisine sahip agir zincir CDR2 ve DIZI ID NO: 38rde belirtilen amino asit dizisine sahip agir zincir CDR3*ü içeren bir agir zincir degisken bölgesini ve DIZI ID NO: 42'de belirtilen amino asit dizisine sahip hafif zincir CDR1, DIZI ID NO: 43'de belirtilen amino asit dizisine sahip hafif zincir CDR2 ve DIZI ID NO: 44'te belirtilen amino asit dizisine sahip hafif zincir CDRSiü içeren bir hafif zincir degisken bölgesini içeren bir antikor; (4) DIZI ID NO: 48'de belirtilen amino asit dizisine sahip agir zincir CDR1, DIZI ID NO: 495da belirtilen amino asit dizisine sahip agir zincir CDR2 ve DIZI ID NO: 50ide belirtilen amino asit dizisine sahip agir zincir CDR3i`u içeren bir agir zincir degisken bölgesini ve DIZI ID NO: 54*te belirtilen amino asit dizisine sahip hafif zincir CDR1, DIZI ID NO: 55'te belirtilen amino asit dizisine sahip hafif zincir CDR2 ve DIZI ID NO: 56,da belirtilen amino asit dizisine sahip hafif zincir CDR3'ü içeren bir hafif zincir degisken bölgesini içeren bir antikor; (5) (1) ila (4) antikorlarinin herhangi birinin baglandigi DLL3 proteinindeki ile ayni epitopa baglanan bir antikor.
Mevcut bulusun farmasötik bir bilesimi, yukarida DLL3'e baglanan ve sitotoksik aktiviteye sahip olan bir aktif bilesen olarak yukarida tarif edilen antikorlardan herhangi birini içerebilir. Mevcut bulus, ayni zamanda, bulusun bir farmasötik kompozisyonunun, kanseri tedavi etmek için bir yöntemde kullanilmasini saglamaktadir ki burada anti-kanser ajani akciger kanserini hedef almaktadir.
Ayrica, asagidakileri içeren, kanser teshisi için bir yöntem de anlatilmaktadir: (a) test edilen bir hastadan izole edilmis bir numunenin saglanmasi; ve (b) numunede DLL3 proteini veya DLL3 geninin ekspresyon seviyesinin saptanmasi. Tercih edilen sekliyle, mevcut bulusun teshis yöntemi, akciger kanseri teshisine yöneliktir.
Ayrica, yukarida tarif edilen antikorlardan herhangi birini içeren kanser için bir teshis ajani da anlatilmaktadir. çizimlerin Kisa Açiklamasi ekspresyonunu göstermektedir. baglanmasini göstermektedir. baglanmasini ve hücreye bagli antikorun çalisma hacmini göstermektedir. göstermektedir (konsantrasyon: 2.5 pg/ml). aktivitesinin antikor konsantrasyon bagimliligini göstermektedir. sekonder antikoru Mab-ZAP'nin alinmasiyla hücre büyümesinin inhibisyonunu göstermektedir. antikorunun baglanmasini göstermektedir. [Sekil 8] Sekil 8, bir çözünebilir DLL3 proteinine bir rekombinant anti-DLL3 insan kimerik antikorunun baglanmasini ve bir anti-DLL3 kimerik antikorunun bir fare antikoru ile çözünür bir DLL3 proteinine karsi baglanma rekabetini göstermektedir. bir anti-DLL3 antikoru tarafindan taninan bir alani göstermektedir. yüzeyi üzerindeki DLL3 proteinine baglanmasini göstermektedir. hücreler DLL3 / BaF3 ve NCI-H1184'e karsi antikor konsantrasyonu bagimliligini göstermektedir. fare düsük-fukoz antikorunun ADCC aktivitesinin antikor konsantrasyon bagimliligini göstermektedir.
Düzenlemelerin Açiklamasi DLL3"un (Delta-benzeri 3) amino asit dizisi teknik alanda bilinmektedir. Ornegin, insan DLL3'ün amino asit dizisi DIZI ID NO: 1 (NM_016941) 'de belirtildigi gibidir ve fare DLL3"un amino asit dizisi DIZI ID NO: 2'de (NM_OO7866) belirtildigi gibidir.
Mevcut bulusta kullanilan DLL3 proteini, yukarida tarif edilen diziye sahip olan bir DLL3 proteini olabilir veya bir veya daha fazla amino asidin modifikasyonu ile yukarida tarif edilen diziden üretilmis bir diziye sahip olan modifiye bir protein olabilir.
Bir veya daha fazla amino asidin modifikasyonu ile yukarida açiklanan diziden türetilmis bir diziye sahip olan modifiye protein örnekleri amino asit dizisine % 70 veya daha fazla, tercih edilen sekliyle % 80 veya daha fazla, daha tercih edilen sekliyle % 90 veya daha fazla, hatta daha tercih edilen sekliyle % 95 veya daha fazla homolojiye sahip olan polipeptidleri içerebilir. Alternatif olarak, bu DLL3 proteinlerinin kismi peptitleri kullanilabilir.
Mevcut bulusta kullanilan DLL3 proteini, kökeni açisindan sinirli degildir ve tercih edilen sekliyle bir insan DLL3 proteindir.
Anti-DLL3 antikoru Mevcut bulusta kullanilan anti-DLL3 antikorunun sadece DLL3 proteinine baglanmasi ve özellikle kaynagi, türü, sekli vb. ile sinirli olmamasi gerekmektedir, ancak sitotoksik bir aktiviteye sahiptir. Spesifik olarak, insan disinda bir hayvandan türetilmis bir antikor (örnegin bir fare, siçan veya deve antikoru), bir insandan türetilmis antikor, bir kimerik antikor veya bir insanlastirilmis antikor gibi bir antikor kullanilabilir.
Mevcut bulusta kullanilan anti-DLL3 antikoru, bir poliklonal veya monoklonal antikor olabilir ve tercih edilen sekliyle bir monoklonal antikordur.
Mevcut bulusta kullanilan anti-DLL3 antikoru tercih edilen sekliyle bir anti-insan DLL3 antikorudur. Antiinsan DLL3 antikoru, insan DLL3iüne spesifik olarak baglanan bir antikor olabilir veya insan DLL3'üne ve yani sira insan disi hayvandan t'L'iretilmis DLL3'e (ör., fare DLL3) baglanan bir antikor olabilir.
Mevcut bulusta kullanilan anti-DLL3 antikoru, teknik alanda bilinen araçlar kullanilarak bir poliklonal veya monoklonal antikor olarak elde edilebilir. Mevcut bulusta kullanilan anti-DLL3 antikoru özellikle tercih edilen sekliyle bir memeliden elde edilen monoklonal antikordur.
Memeliden elde edilen monoklonal antikor, Örnegin hibridomalar tarafindan üretilenleri ve bir genetik mühendisligi yaklasimi ile bir antikor geni içeren ekspresyon vektörleri ile dönüstürülmüs konakçilar tarafindan 'üretilenleri kapsamaktadir.
Mevcut bulusun anti-DLL3 antikoru, polietilen glikol (PEG) gibi Çesitli moleküller ile modifiye edilebilir. Daha sonra tarif edildigi gibi, mevcut bulusun anti-DLL3 antikoru ayrica bir sitotoksik aktiviteye sahip bir kemoterapötik ajan, bir radyoaktif kimyasal veya benzeri ile modifiye edilebilir.
Mevcut bulusta kullanilan, DLL3"u taniyan ve ona baglanan antikorun örnekleri, asagidaki antikorlari içerebilir: 1. DIZI ID NO: 12'de belirtilen amino asit dizisine sahip agir zincir CDR1, DIZI ID NO: 13ite belirtilen amino asit dizisine sahip agir zincir CDR2 ve DIZI ID NO: 14'te belirtilen amino asit dizisine sahip agir zincir CDR3'Ü içeren bir agir zincir degisken bölgesini ve DIZI ID NO: 18'de belirtilen amino asit dizisine sahip hafif zincir CDR1, DIZI ID NO: 19Sda belirtilen amino asit dizisine sahip hafif zincir CDR2 ve DIZI ID NO: 20tde belirtilen amino asit dizisine sahip hafif zincir CDRS'ü içeren bir hafif zincir degisken bölgesini içeren bir antikor (DL301); 2. DIZI ID NO: 24ite belirtilen amino asit dizisine sahip agir zincir CDR1, DIZI ID NO: 25'te belirtilen amino asit dizisine sahip agir zincir CDR2 ve DIZI ID NO: 26'da belirtilen amino asit dizisine sahip agir zincir CDR3!i'.i içeren bir agir zincir degisken bölgesini ve DIZI ID NO: 307da belirtilen amino asit dizisine sahip hafif zincir CDR1, DIZI ID NO: 31'de belirtilen amino asit dizisine sahip hafif zincir CDR2 ve DIZI ID NO: 32ide belirtilen amino asit dizisine sahip hafif zincir CDR3*Ü içeren bir hafif zincir degisken bölgesini içeren bir antikor (DL306); 3. DIZI ID NO: 36'da belirtilen amino asit dizisine sahip agir zincir CDR1, DIZI ID NO: 37*de belirtilen amino asit dizisine sahip agir zincir CDR2 ve DIZI ID NO: 38'de belirtilen amino asit dizisine sahip agir zincir CDR3'ü içeren bir agir zincir degisken bölgesini ve DIZI ID NO: 42ide belirtilen amino asit dizisine sahip hafif zincir CDR1, DIZI ID NO: 431te belirtilen amino asit dizisine sahip hafif zincir CDR2 ve DIZI ID NO: 44'te belirtilen amino asit dizisine sahip hafif zincir CDRSiü içeren bir hafif zincir degisken bölgesini içeren bir antikor (DL309); 4. DIZI ID NO: 48'de belirtilen amino asit dizisine sahip agir zincir CDR1, DIZI ID NO: 49'da belirtilen amino asit dizisine sahip agir zincir CDR2 ve DIZI ID NO: 501de belirtilen amino asit dizisine sahip agir zincir CDRß'u içeren bir agir zincir degisken bölgesini ve DIZI ID NO: 54'te belirtilen amino asit dizisine sahip hafif zincir CDR1i DIZI ID NO: 55'te belirtilen amino asit dizisine sahip hafif zincir CDR2 ve DIZI ID NO: 56'da belirtilen amino asit dizisine sahip hafif zincir CDR3IJ içeren bir hafif zincir degisken bölgesini içeren bir antikor (DL312); ve . (1) ila (4) antikorlarinin herhangi birinin baglandigi DLL3 proteinindeki ile ayni epitopa baglanan bir antikor. (1) ila (5) antikorlari, sabit bölgeler içerebilir. Kullanilan sabit bölgeler özellikle sinirli degildir ve herhangi bir sabit bölge kullanilabilir. Mevcut bulusta kullanilan sabit bölgelerin tercih edilen örnekleri, insandan elde edilen sabit bölgeleri içerebilir. Örnegin, bir insan lgG1-t`urevli, insan IgGZ-türevli, insan IgGS-türevli veya insan örnegin insan K zincirinden türetilmis veya insan A zincirden türetilmis sabit bölge hafif zincir sabit bölgesi olarak kullanilabilir. Mevcut bulusta kullanilan sabit bölgeler bir dogal diziye sahip olan sabit bölgeler olabilir veya bir veya daha fazla amino asitin modifikasyonu ile dogal diziden türetilmis bir diziye sahip olan degistirilmis sabit bölgeler olabilir. (1) ila (5) antikorlari, FRerr içerebilir. Kullanilan FR'Ier, özellikle sinirli degildir ve ortaya çikan antikor, insan DLL3'e karsi baglanma aktivitesini korudugu sürece herhangi bir FR kullanilabilir. Mevcut bulusta kullanilan FR'Ierin tercih edilen örnekleri, insan antikoru türevli FR'leri içerebilir. Bir antikorun antijen baglanma aktivitesi ile FR replasmaninin teknigi teknik alanda bilindiginden, teknik alanda uzman kisiler FR'Ieri uygun sekilde seçebilir. Mevcut bulusta kullanilan FR*Ier bir dogal diziye sahip olan FRrler olabilir veya bir veya daha fazla amino asitin modifikasyonu ile dogal diziden türetilmis bir diziye sahip olan FR'Ier olabilir.
DIZI ID NO: 12tde belirtilen amino asit dizisine sahip agir zincir CDR1, DIZI ID NO: 13*de belirtilen amino asit dizisine sahip agir zincir CDR2 ve DIZI ID NO: 14'de belirtilen amino asit dizisine sahip agir zincir CDRS'ü içeren bir agir zincir degisken bölgesinin örnekleri DIZI ID NO: @da belirtilen amino asit dizisine sahip bir agir zincir degisken bölgesini içerebilir. Ayni zamanda, agir zincir degisken bölgesini içeren agir zincir örnekleri, DIZI ID NO: 10 veya 11'in amino asit dizisine sahip bir agir zincir içerebilir.
DIZI ID NO: 24'te belirtilen amino asit dizisine sahip agir zincir CDR1, DIZI ID NO: 253te belirtilen amino asit dizisine sahip agir zincir CDR2 ve DIZI ID NO: 26'da belirtilen amino asit dizisine sahip agir zincir CDR3iü içeren bir agir zincir degisken bölgesinin örnekleri DIZI ID NO: 21*de belirtilen amino asit dizisine sahip bir agir zincir degisken bölgesini içerebilir.
Ayni zamanda, agir zincir degisken bölgesini içeren agir zincir örnekleri, DIZI ID NO: 22 veya 23'ün amino asit dizisine sahip bir agir zincir içerebilir.
DIZI ID NO: 36'da belirtilen amino asit dizisine sahip agir zincir CDR1, DIZI ID NO: 37ide belirtilen amino asit dizisine sahip agir zincir CDR2 ve DIZI ID NO: 38'de belirtilen amino asit dizisine sahip agir zincir CDRSIÜ içeren bir agir zincir degisken bölgesinin örnekleri DIZI ID NO: 33'te belirtilen amino asit dizisine sahip bir agir zincir degisken bölgesini içerebilir. Ayni zamanda, agir zincir degisken bölgesini içeren agir zincir örnekleri, DIZI ID NO: 34 veya 35'in amino asit dizisine sahip bir agir zincir içerebilir.
DIZI ID NO: 48yde belirtilen amino asit dizisine sahip agir zincir CDR1, DIZI ID NO: 49*da belirtilen amino asit dizisine sahip agir zincir CDR2 ve DIZI ID NO: 50'de belirtilen amino asit dizisine sahip agir zincir CDRS'ü içeren bir agir zincir degisken bölgesinin örnekleri DIZI ID NO: 45lte belirtilen amino asit dizisine sahip bir agir zincir Ayni zamanda, agir zincir degisken bölgesini içeren agir zincir örnekleri, DIZI ID NO: 46 veya 47'nin amino asit dizisine sahip bir agir zincir içerebilir.
DIZI ID NO: 18'de belirtilen amino asit dizisine sahip hafif zincir CDR1, DIZI ID NO: 195da belirtilen amino asit dizisine sahip hafif zincir CDR2 ve DIZI ID NO: 20rde belirtilen amino asit dizisine sahip hafif zincir CDRßfü içeren bir hafif zincir degisken bölgesinin örnekleri DIZI ID NO: 15=te belirtilen amino asit dizisine sahip bir hafif zincir degisken bölgesini içerebilir. Ayni zamanda, hafif zincir degisken bölgesini içeren hafif zincir örnekleri, DIZI ID NO: 16 veya 17'nin amino asit dizisine sahip bir hafif zincir içerebilir.
DIZI ID NO: 30rda belirtilen amino asit dizisine sahip hafif zincir CDR1, DIZI ID NO: 31'de belirtilen amino asit dizisine sahip hafif zincir CDR2 ve DIZI ID NO: 32'de belirtilen amino asit dizisine sahip hafif zincir CDRS'ü içeren bir hafif zincir degisken bölgesinin örnekleri DIZI ID NO: 27rde belirtilen amino asit dizisine sahip bir hafif zincir degisken bölgesini içerebilir. Ayni zamanda, hafif zincir degisken bölgesini içeren hafif zincir örnekleri, DIZI ID NO: 28 veya 29'un amino asit dizisine sahip bir hafif zincir içerebilir.
DIZI ID NO: 42rde belirtilen amino asit dizisine sahip hafif zincir CDR1, DIZI ID NO: 43›te belirtilen amino asit dizisine sahip hafif zincir CDR2 ve DIZI ID NO: 44ite belirtilen amino asit dizisine sahip hafif zincir CDRB'ü içeren bir hafif zincir degisken bölgesinin örnekleri DIZI ID NO: 39'da belirtilen amino asit dizisine sahip bir hafif zincir degisken bölgesini içerebilir. Ayni zamanda, hafif zincir degisken bölgesini içeren hafif zincir örnekleri, DIZI ID NO: 40 veya 41'in amino asit dizisine sahip bir hafif zincir içerebilir.
DIZI ID NO: 54ite belirtilen amino asit dizisine sahip hafif zincir CDR1, DIZI ID NO: 553te belirtilen amino asit dizisine sahip hafif zincir CDR2 ve DIZI ID NO: 56'da belirtilen amino asit dizisine sahip hafif zincir CDR3'ü içeren bir hafif zincir degisken bölgesinin örnekleri DIZI ID NO: 51'de belirtilen amino asit dizisine sahip bir hafif zincir degisken bölgesini içerebilir. Ayni zamanda, hafif zincir degisken bölgesini içeren hafif zincir örnekleri, DIZI ID NO: 52 veya 53'ün amino asit dizisine sahip bir hafif zincir içerebilir.
Mevcut bulusta, "mevcut bulusun antikoruna esdeger bir aktiviteye sahip" ifadesi buna karsilik gelen DLL3-ekspres eden hücrelere karsi bir DLL3 baglama aktivitesine, bir internalizasyon aktivitesine ve/veya bir sitotoksik aktiviteye (ADCC faaliyeti, vb.) sahip olmak anlamina gelmektedir. Mevcut bulusta, esdeger aktivitenin, özdes bir aktivite olmasi zorunlu degildir ve antikorlar (1) ila (12)'den herhangi birinin aktivitesine kiyasla örnegin % 50 veya daha fazla, tercih edilen sekliyle % 70 veya daha fazla, daha da tercih edilen sekliyle % 90 veya daha fazla aktivite olabilir.
Aktivitenin `üst sinirinin örnekleri, özellikle bunlarla sinirli olmamak üzere, % 1000 100 veya daha azini içerebilir.
Bir veya daha fazla amino asidin ikamesi, silinmesi, eklenmesi ve / veya insersiyonu ile mevcut bulusun antikorundan türetilen bir antikor ayrica mevcut bulusun kapsamina dahil edilmistir ve yapay olarak hazirlanabilir veya dogal olarak meydana gelebilir. Polipeptide bir mutasyonun dahil edilmesine yönelik bir usul'ün örnekleri, bölgeye yönelik mutagenezi içermektedir (Hashimoto-Gotoh, T. ve ark.(1995) Gene Bu, belirli bir polipeptide islevsel olarak esdeger bir polipeptidin hazirlanmasi için teknik alanda uzman kisilerce iyi bilinen yöntemlerden biridir. Teknik alanda uzman kisiler, bu gibi bir yöntem kullanarak mevcut bulusun antikorunda bir mutasyonu uygun sekilde ekleyebilir ve böylece, antikora islevsel olarak esdeger bir antikoru hazirlayabilirler. Buna ilaveten, dogal dünyada da amino asit mutasyonlari olusabilir.
Bir veya daha fazla amino asitin mutasyonuyla mevcut bulusun antikorunun amino asit dizisinden türetilen bir amino asit dizisine sahip olan ve islevsel olarak antikora esdeger olan böyle bir antikor ayni zamanda mevcut bulusun antikoru tarafindan kapsanmaktadir.
Böyle bir varyantta mutasyona ugramis amino asitlerin sayisi genellikle 50 amino asit içinde, tercih edilen sekliyle 30 amino asit içinde, daha tercih edilen sekliyle 10 amino asit içinde (örnegin 5 amino asit içinde) bulunmaktadir.
Mutasyona ugratilacak amino asit kalintilari için, bu mutasyonun, ayni yan zincir özelligine sahip olan amino asitler arasinda konservatif olarak gerçeklestirilmesi tercih edilmektedir. Ornegin, amino asit yan zincirlerinin özelliklerine dayanan asagidaki siniflandirma olusturulmustur: hidrofilik amino asitler (R, D, N, C, E, O, G, H, K, 8, ve T), hidrofilik amino asitler (R, D, N, C, E, O, G, H, K, 8, ve T), bir alifatik yan zincire sahip amino asitler (G, A, V, L, I, ve P), hidroksi grubu içeren bir yan zincire sahip olan amino asitler (S, T, ve Y), sülfür atomu içeren bir yan zincire sahip amino asitler (C ve M), karboksilik asit ve amid içeren bir yan zincire sahip amino asitler (D, N, E ve O), baz içeren bir yan zincire sahip amino asitler (R, K ve H), ve aromatik grup içeren bir yan zincire sahip olan amino asitler (H, F, Y ve W) (parantez içindeki tüm semboller, amino asitlerin tek harfli kodlarini temsil etmektedir).
Belirli bir amino asit dizisinden bir veya daha fazla amino asit kalintisinin silinmesi ve / veya eklenmesi ve / veya bunun diger amino asitler ile ikamesi yoluyla modifiye edilen bir amino asit dizisine sahip bir polipeptit orijinal polipeptitin biyolojik aktivitesini korumak için hali hazirda bilinmektedir (Mark, D. F. ve ark., Proc. Natl. Acad. Sci.
Spesifik olarak, belirli bir polipeptidi olusturan bir amino asit dizisindeki amino asitler, ayni grup içinde siniflandirilan amino asitlerle ikame edildiginde, genellikle polipeptidin aktivitesini sürdürdügü söylenmektedir. Mevcut bulusta, yukarida tarif edilen ayni amino asit grubu içindeki amino asitler arasindaki ikame, konservatif ikame olarak adlandirilmaktadir.
Mevcut bulus, ayni zamanda, (1) ila (4) arasindaki antikorlardan herhangi birinin baglandigi ayni epitopa baglanan bir antikoru içeren, bulusun bir farmas'otik kompozisyonunu da saglamaktadir. Antikorlar (1) ila (4)*ün spesifik örnekleri, asagida Spesifik olarak, mevcut bulus, ayni zamanda bu antikorlarin herhangi biri tarafindan taninan ayni epitopu taniyan bir antikoru da kullanabilir.
Bir analit antikorunun, belirli bir antikor ile bir epitopu paylasip paylasmadigi, ayni epitopa yönelik rekabete dayali olarak dogrulanabilir. Antikorlar arasindaki rekabet, çapraz bloklama analizi veya benzeri bir analiz ile tespit edilmektedir. Çapraz bloklama analizi, tercih edilen sekliyle, örnegin rekabetçi ELISA analizidir.
Spesifik olarak, çapraz bloklama analizi, rekabet eden bir aday antikorun varliginda veya yoklugunda bir mikrotiter plakanin kuyucuklari üzerinde kaplanmis DLL3 proteinlerinin önden inkübe edilmesini ve daha sonra buna mevcut bulusun anti-DLL3 antikorunun eklenmesini içermektedir. Her kuyucukta DLL3 proteinine baglanmis mevcut bulusun anti-DLL3 antikorunun miktari ayni epitopa baglanmak için yarisan aday rakip antikorun (analit antikor) baglanma kapasitesi ile dolayli olarak iliskilidir.
Spesifik olarak, ayni epitop için analit antikorunun afinitesinin daha yüksek olmasi DLL3 proteini ile kapli kuyucuga baglanan mevcut bulusun anti-DLL3 antikorunun miktarinin daha küçük olmasi ile ve DLL3 proteini ile kapli kuyucuga baglanan analit antikorunun miktarinin daha fazla olmasi ile sonuçlanmaktadir.
Kuyuya baglanan her bir antikorun miktari, antikorun önceden isaretlenmesiyle kolayca belirlenebilir. Örnegin, bir biyotinlenmis antikor, bir avidin-peroksidaz konjugesi ve uygun bir substrat kullanilarak analiz edilebilir. Enzim (örn., Peroksidaz) isaretlemesini kullanan çapraz bloklama analizi, özellikle rekabetçi ELISA analizi olarak adlandirilmaktadir.
Antikor, baska algilanabilir veya ölçülebilir isaretleme materyallerinden herhangi biri ile isaretlenebilir. Spesifik olarak, örnegin radyoaktif isaretleme veya floresan isaretleme teknik alanda bilinmektedir.
Ayrica, analit antikoru, mevcut bulusun anti-DLL3 antikorundan farkli bir türden türetilen sabit bölgelere sahip oldugunda, kuyucuga baglanan herhangi bir antikorun miktari, herhangi bir sabit bölgeyi taniyan etiketli bir antikor kullanilarak da ölçülebilir.
Alternatif olarak, ayni türden türetilmis olsa da, sinif açisindan farklilik gösteren antikorlar bile, her bir sinifi ayirt eden antikorlar kullanilarak kuyuya baglanan ilgili miktarlari için ölçülebilir.
Rakip antikorun yoklugunda gerçeklestirilen kontrol testinde elde edilen baglanma aktivitesine kiyasla, aday antikorun, anti-DLL3 antikorunun baglanmasini en az % 20, tercih edilen sekliyle en az % 30, daha tercih edilen sekliyle en az % 50, daha da tercih edilen sekliyle en az % 80 bloke edebilmesi sartiyla, bu aday antikor, bu bulusun anti-DLLB antikorunun baglandigi temelde ayni epitopa baglanan bir antikor olarak veya ayni epitopa baglanmaya yönelik olarak yarisan bir antikor olarak belirlenmektedir.
Mevcut bulusun bir farmasötik kompozisyonunda kullanilan antikorun diger örnekleri, insan DLL3'ünde (DIZI ID NO: 1) amino asitler 27'den 175'e kadar olan bir bölgeyi taniyan bir antikoru ve insan DLL3'ünde amino asitler 216 ila 492'e kadar olan bir bölgeyi taniyan bir antikoru içerebilir.
Mevcut bulusun farmasötik bir kompozisyonunda kullanilan antikorunun baska bir yönüne ait örnekler insan DLL3'üne baglanan ancak DIZI ID NO: 6'nin amino asit dizisinden olusan bir polipeptide (DLL3deIta1-Fc) veya DIZI ID NO: Tinin amino asit dizisinden olusan bir polipeptide (DLL3deIta2-Fc) baglanmayan bir antikoru, ve/veya ve insan DLL3'üne baglanan ve ayrica DIZI ID NO: 6'nin amino asit dizisinden olusan polipeptide (DLL3deIta1-Fc) ve DIZI ID NO: 7'nin amino asit dizisinden olusan polipeptide (DLLSdeItaZ-Fc) baglanan bir antikoru içerebilirler.
Mevcut bulusun bir farmasötik kompozisyonunda kullanilan antikor, bir ADCC aktivitesi ve bir internalizasyon aktivitesi gibi aktivitelere sahiptir ve bu nedenle, bir farmasötik ilaç olarak, özellikle bir antikanser ajani olarak faydalidir ki burada kanser akciger kanseridir.
Antikor bir sitotoksik aktiviteye sahiptir.
Genetik olarak rekombinant anti-DLL3 antikoru Insanlara uygulanacak olan antikor, Örnegin, insanlarda heteroantigenikligin azaltilmasi amaciyla, yapay olarak tasarlanmis olan, genetik olarak rekombinant bir antikora dönüstürülebilir. Genetik olarak rekombinant antikor, örnegin kimerik antikorlari ve insanlastirilmis antikorlari kapsamaktadir. Bu tasarlanmis antikorlar, teknik alanda bilinen bir yöntem kullanilarak üretilebilir. (l) Kimerik antikor Kimerik antikorlar, birbirleriyle baglanmis farkli kökenlerin degisken ve sabit bölgelerini içeren antikorlara karsilik gelmektedir. Ornegin, fare-insan heterojen kimerik antikorlari, bir fare antikorunun agir ve hafif zincir degisken bölgelerini ve bir insan antikorunun agir ve hafif zincir sabit bölgelerini içeren antikorlardir. Fare antikorunun degisken bölgesini kodlayan DNA'lar, insan antikorunun sabit bölgesini kodlayan DNA'Iar ile baglanmakta ve ligasyon ürünleri, kimerik antikor ekspres eden rekombinant vektörlerin hazirlanmasi için ekspresyon vektörlerine dahil edilebilmektedir. Bu vektörlerle dönüstürülen hücreler (rekombinant hücreler), kültür sirasinda üretilen kimerik antikorlarin elde edilmesi için DNA insersiyonunun ekspresyonu için kültürlenebilir.
Insan antikoru sabit bölgeleri, kimerik antikorlarin sabit bölgeleri olarak kullanilmaktadir. Ornegin agir zincir sabit bölgeleri olarak Cv1, Cv2, Cv3, Cv4, Cu, Cö, Coi1, Coi2 ve Ce kullanilabilir. Ayrica CK ve CA hafif zincir sabit bölgeleri olarak kullanilabilir. Bu sabit bölgelerin amino asit dizileri ve bunlari kodlayan nükleotid dizileri teknik alanda bilinmektedir. Ayrica, insan antikoru sabit bölgelerindeki bir veya daha fazla amino asit, antikorun kendisinin veya 'üretiminin stabilitesini gelistirmek için ikame edilebilir, silinebilir, eklenebilir ve/veya yerlestirilebilir. (2) Insanlastirilmis Antikor Genel olarak, kimerik antikorlar insan disi hayvandan t'üretilmis antikor degisken bölgelerini ve insan antikorundan türetilmis sabit bölgeleri içermektedir. Buna karsilik, Insanlastirilmis antikorlar, insan disi hayvandan türetilmis antikor tamamlayiciligi belirleyici bölgeleri (CDR'Ier), insan antikoruyla türetilmis çerçeve bölgelerini (FR'ler) ve insan antikoru türevli sabit bölgeleri içermektedir. Insanlastirilmis antikorlar ayrica yeniden sekillendirilmis insan antikorlari olarak da adlandirilmaktadir. Spesifik olarak, örnegin insan antikorlarina asilanmis insan disi hayvan (ör., fare) antikor CDR'lerini içeren insanlastirilmis antikorlar, teknik alanda bilinmektedir. Insanlastirilmis antikorlar, insan vücudundaki azalmis antijenikliklerinden ötürü mevcut bulusun bir terapötik maddesi için etken etken maddeler olarak faydalidir.
Her antikor degisken bölgesi genellikle 4 FR ile çevrilmis 3 CDR içermektedir. CDR bölgeleri büyük oranda antikorun baglanma özgüll'ug'un'u belirlemektedir. CDR'Ier çok çesitli amino asit dizilerine sahiptir. Diger taraftan, FR'leri olusturan amino asit dizileri siklikla farkli baglanma özgullüklerine sahip olan antikorlar arasinda yüksek homoloji sergilemektedir. Bu nedenle, genel olarak, belirli bir antikorun baglanma özgüllügünün, CDR asilamasi yoluyla baska antikorlara nakledildigi söylenebilir.
Insanlastirilmis antikorlarin elde edilmesi için genel gen rekombinasyon yaklasimlari da bilinmektedir. Spesifik olarak, örnegin, Ortüsen Uzatmali PCR, teknik alanda fare antikor CDR'Ierinin insan FR'lerine asilanmasi için bir yöntem olarak bilinmektedir.
Ortüsen Uzatmali PCR, asilanacak her fare antikoru CDR'sini kodlayan ek bir nükleotit dizisi içeren insan antikoru FR sentezi için primerler kullanmaktadir.
Primerler 4 FR'nin her biri için hazirlanmaktadir. Genel olarak insan FR'lerine asilanan fare CDR'sinde, CDR islevlerini korumak amaciyla fare FR'lerine yüksek ölçüde homolog olan insan FR'lerinin seçilmesi avantajlidir. Spesifik olarak, asilanacak fare CDR'lerine bitisik FR'lerinkine oldukça benzer amino asit dizileri içeren insan FR'lerinin kullanilmasi tercih edilmektedir.
Ayrica, baglanacak olan nükleotit dizileri, çerçeveye baglanacak sekilde tasarlanmaktadir. Insan FR-kodlayan nükleotid dizileri, ilgili primerleri kullanilarak ayri ayri sentezlenmektedir. Sonuç olarak, her bir FR-kodlama dizisine eklenen fare CDR- kodlayan DNA'yi içeren ürünler elde edilmektedir. Her üründe fare CDR-kodlayan nükleotid dizisi, nükleotid dizisinin bir digeriyle üst üste gelecegi sekilde tasarlanmaktadir. Bunun hemen ardindan, üst üste gelen CDR bölümleri, tamamlayici zincir sentez reaksiyonu için birbirine tavlanmaktadir. Bu reaksiyon yoluyla, insan FR dizileri fare CDR dizileri yoluyla baglanmaktadir.
Son olarak, 3 CDR ve 4 FR baglanmis degisken bölgenin tam uzunlukta geni sirasiyla 5 've 3' uçlarina tavlanir ve uygun bir kisitlama enzimi için ek tanima dizisi içeren primerlerle güçlendirilmektedir. Bu sekilde elde edilen DNA ve insan antikoru sabit bölge kodlayan DNA, insanlastirilmis antikor ekspresyonu için vektörlerin hazirlanmasina yönelik çerçeve içinde kaynastirilacak sekilde ekspresyon vektörlerine eklenebilir. Konakçilar, daha sonra kültürlenmis hücrelerin kültürlerine insanlastirilmis antikorlari üretmek için insanlastirilmis antikor kodlayan DNA'nin ekspresyonu için kültürlenen rekombinant hücreler olusturmak üzere bu vektörler ile dönüstürülebilir (Bkz Avrupa Patent Yayini no. EP 239400 ve Uluslar Arasi yayin Bu sekilde hazirlanan insanlastirilmis antikorlar, kalitatif veya kantitatif analizlerle antijen için baglanma aktiviteleri için degerlendirilebilirler. Sonuç olarak, insan antikoru FR'Ieri, CDR'Ier yoluyla baglandiginda CDR'lerin uygun bir antijen baglama bölgesi olusturmasina izin verecek sekilde seçilebilir. Gerekli olmasi halinde, FR amino asit kalintisi (lari), insanlastirilmis antikorun CDR'lerinin uygun bir antijen baglanma bölgesi olusturacagi sekilde ikame edilebilir. Ornegin, fare CDR asilamalarinda kullanilan PCR yöntemini insan FR'Ierine uygulayarak FR'nin amino asit dizisine bir mutasyon eklenebilir.
Spesifik olarak, bir kismi nükleotit dizisinin bir mutasyonu, FR nükleotit dizisine baglanan primerler içine yerlestirilebilir. Bu gibi primerler kullanilarak sentezlenen FR nükleotid dizisi, bu sekilde dahil edilen mutasyonu içermektedir. Ikame edilmis amino asit(ler)e sahip varyant antikorlar, arzu edilen özellige sahip varyant FR dizilerini seçmek için yukaridaki gibi ayni analizle antijen için baglanma aktiviteleri için (3) Polivalent antikor Mevcut bulusun bir farmasötik kompozisyonunda bulunan antikor, sadece lgG (Ith, DLL3 proteinine baglandigi sürece lgM ile tipiklestirilmis tek degerli antikorlari veya çok degerlikli antikorlari da kapsamaktadir. Mevcut bulusun bir farmasötik kompozisyonunda bulunabilecek polivalent antikor, hepsi birbiriyle ayni olan ya da bir kismi ya da hepsi birbirinden farkli olan antijen baglanma bölgelerine sahip olan polivalent antikorlari kapsamaktadir. (4) Düsük moleküler antikor Mevcut bulusun bir farmasötik kompozisyonunda bulunan antikor, tüm antikor molekülleri ile sinirli degildir ve antikor, DLL3 proteinine baglandigi sürece, düsük moleküllü bir antikor veya bunun modifiye edilmis bir formu da olabilir.
Düsük moleküllü antikor, tüm antikorun (örn., tüm lgG) bir kisminda eksik olan bir antikor parçasini kapsamaktadir. Antikor molekülünün bu türden kismi eksikligi, ortaya çikan antikor parçasi, DLL3 antijenine baglanabildigi sürece kabul edilmektedir. Mevcut bulusa göre bir farmasötik kompozisyonda kullanilan antikor parçasinin, bir ya da her iki agir zincir degisken (VH) ve hafif zincir degisken (VL) bölgesi içermesi tercih edilmektedir. Ayrica mevcut bulusa göre bir farmasötik kompozisyonda kullanilan antikor parçasinin CDR içermesi de tercih edilmektedir.
Mevcut bulusun bir farmasötik kompozisyonunda kullanilan antikor parçasinda bulunan CDR'Ierin sayisi, özellikle sinirlandirilmis degildir ve tercih edilen sekliyle en az 6 CDR'dir: agir zincir CDR1, CDR2 ve CDR3 ve hafif zincir CDR1, CDR2 ve VH ya da VL'nin amino asit dizisi, ikame, silme, ekleme ve / veya insersiyonu da içerebilir.
Ayrica, mevcut bulusun bir farmasötik kompozisyonda kullanilabilecek antikor parçasi, elde edilen antikor parçasi, DLL3 antijenine baglanabildigi sürece, VH ve VL'nin birinin veya her ikisinin bir kisminda eksik olabilir. Buna ilaveten degisken bölgesi, kimerize edilebilir veya insanlastirilabilir. Antikor parçasinin spesifik örnekleri, Fab, Fab', F(ab')2 ve Fv'yi içerebilir. Ayrica, düsük moleküler antikorun spesifik örnekleri arasinda FFab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv (tek zincirli Fv), Diabody, sc(Fv)2 (tek zincirli (Fv)2) ve scFv-FC yer alabilir. Mevcut bulusta, düsük moleküler antikor tercih edilen sekliyle Diabody veya sc(Fv)2'dir. Bu antikor multimerleri (örn., dimerler, trimerler, tetramerler ve polimerler) de, ayrica mevcut bulusun birfarmasötik kompozisyonunda kullanilabilecek düsük moleküllü antikor tarafindan kapsanmaktadir.
Antikorun bu gibi parçalari, antikor parçalari olusturmak için antikorun enzimatik olarak isleme tabi tutulmasiyla elde edilebilir. Sindirim enzimleri, belirli bir yapiya sahip antikor parçalari vermek üzere belirli bir pozisyonda antikor fragmanini ayirmaktadir. Ornegin, papain, pepsin veya plazmin, teknik alanda antikor parçalarini olusturmaya yarayan enzim olarak bilinmektedir. Papain sindirimi F(ab)2 veya Fab verirken, pepsin sindirimi ise F(ab ')2 veya Fab' vermektedir. Alternatif bir sekilde, bu antikor parçalarini kodlayan genler olusturulmakta ve bu genler, ekspresyon vektörlerine dahil edilebilmekte ve daha sonra uygun konakçi hücrelerde ekspres Enzimatik olarak elde edilen antikor parçalari için genetik mühendisligi yaklasiminin kullanilmasi, antikorun istege bagli bir bölümünü silebilir. Mevcut bulusa göre olan düsük moleküllü antikor, ortaya çikan antikor parçasi DLL3 için baglanma afinitesine sahip oldugu sürece istege bagli bölgeden yoksun olabilir. i) Diabody Diabody, gen füzyonu ile olusturulan iki degerli bir antikor parçasini ifade etmektedir WO 93/11161). Diabody, iki polipeptid zinciri içeren bir dimerdir. Genellikle, dimeri olusturan polipeptit zincirlerinin her biri, ayni zincir üzerindeki bir baglayici vasitasiyla baglanan agir ve hafif zincir degisken bölgelerini içermektedir. Diabody'deki baglayici, genellikle ayni zincir üzerindeki agir ve hafif zincir degisken bölgeleri arasinda eslesmeye izin vermek üzere oldukça kisadir. Spesifik olarak, baglayiciyi olusturan amino asit kalintilarinin sayisi, örnegin yaklasik 5 kalintidir. Bu nedenle, ayni polipeptit zinciri üzerinde kodlanan agir ve hafif zincir degisken bölgeleri, tek bir zincir degisken bölge parçasini birlikte olusturamaz. Bunun yerine, baska bir tek Zincirli degisken bölge parçasi ile esleserek bir dimer olustururlar. Sonuç olarak, Diabody iki antijen baglama bölgesine sahiptir.
ScFv, antikorun agir ve hafif zincir degisken bölgelerini baglayarak elde edilmektedir.
ScFv'de, agir ve hafif zincir degisken bölgeleri, bir baglayici vasitasiyla, tercih edilen sekliyle bir peptit baglayici vasitasiyla baglanmaktadir (Huston, J. 8. ve ark., Proc. bölgeleri, mevcut tarifnamede tarif edilen antikorlarin herhangi birinden türetilebilir.
Degisken bölgeleri baglayan peptit baglayici özellikle sinirli degildir. Örnegin, yaklasik 3 ila 25 kalintidan olusan istege bagli tek Zincirli bir peptit, baglayici olarak kullanilabilir. Spesifik olarak, örnegin daha sonra tarif edilen bir peptit baglayici kullanilabilir.
Her iki zincirin degisken bölgeleri, örnegin, PCR ile baglanabilir. Birincisi, antikorun agir zincir veya agir zincir degisken bölgesini ve antikorun hafif zincirini veya hafif zincir degisken bölgesini kodlayan DNA dizilerini kodlayan DNA dizileri, butun veya istenen kismi amino asit dizisini kodlayan DNA'lar, PCR ile degisken bölgelerin baglanmasi için sablonlar olarak kullanilmaktadir.
Agir zincir degisken bölge kodlayan DNA ve hafif zincir degisken bölge kodlayan DNA, çogaltilacak her bir DNA'nin her iki terminal dizisine karsilik gelen dizilere sahip olan bir çift primer kullanilarak PCR ile ayri ayri çogaltilmaktadir. Hemen ardindan, peptit baglayici kismi kodlayan DNA hazirlanmaktadir. Peptid baglayicisini kodlayan DNA da PCR kullanilarak sentezlenebilir. Ayri ayri sentezlenen her degisken bölgenin çogaltim ürününe baglanabilen nükleotid dizileri, bu PCR'de kullanilan primerlerin 5, dizilerine sirasiyla eklenmektedir. Ardindan, PCR reaksiyonu, [agir zincir degisken bölge DNA] - [peptit baglayici DNA] - [hafif zincir degisken bölge DNA]'nin her bir DNAisini ve montaj PCR'i için primerler kullanilarak gerçeklestirilmektedir.
Montaj PCR için primerler, [agir zincir degisken bölge DNA'sinin] 5' dizisine baglanan bir primer ve [hafif zincir degisken bölge DNA'sinin] 3' dizisine baglanan bir primerin kombinasyonunu icermektedir. Spesifik olarak, montaj PCR için primerler, sentezlenecek scFv'nin tam uzunlukta dizisini kodlayan DNA'yi çogaltabilme kapasitesine sahip bir primer kümesidir.
Bunun tersine, [peptit baglayici DNA], her degisken bölge DNA'sina baglanabilen ek bir nükleotit dizisi içermektedir. Sonuç olarak, bu DNA'Iar baglanmakta ve dahasi, son olarak, montaj PCR'si için primerler kullanilarak tam uzunlukta bir scFv amplifikasyon ürününe hazirlanmaktadir. ScFv-kodlayan DNA bir kez hazirlandiktan sonra, bu DNA'yi ve ekspresyon vektörleri ile dönüstürülen hücreleri (rekombinant hücreler) içeren ekspresyon vektörleri, rutin bir yönteme göre elde edilebilir. Ayrica, elde edilen rekombinant hücreler scFv'yi elde etmek için scFv-kodlayan DNA'nin ekspresyonu için kültüre alinabilir. iii) scFv-FC ScFv-Fc, scFv'ye kaynasmis bir Fc bölgesini içeren düsük moleküllü bir antikordur kökeni özellikle sinirlandirilmamistir ve örnegin lgM'den türetilen scFv kullanilabilir.
Ayrica Fc'nin kökeni özellikle sinirlandirilmamistir ve örnegin insan IgG'sinden (insan ait örnekler, insan lgG1'inin mentese bölgesi (Hy) yoluyla insan lgG1 CH2'ye (örn., Cy2) ve CH3'e (örn., Cy3) baglanan bir lgM antikoru scFv parçasini içeren scFv-Fc'yi içerebilir.
Sc(Fv)2, iki agir zincir degisken bölge (VH) ve baglayicilar veya benzerleri ile baglanan iki hafif zincir degisken bölge (VL) içeren bir tek zincire sahip düsük 80 (Fv)2, örnegin, scFvs'leri bir baglayici yoluyla baglayarak hazirlanabilir. Dört antikor degisken bölgesini baglamak için genellikle üç baglayici gerekmektedir.
Ayrica, sc(Fv)2 tercih edilen sekliyle iki VH ve iki VL'nin VH, VL, VH ve VL olarak hizalandigi bir antikordur (yani, [VH] -baglayici- [VL] -baglayici- [VH] -baglayici- [VL]) bu sirayla, tek zincirli polipeptidin N-ucundan baslayarak.
Iki VH ve iki VL'nin sirasi, özellikle yukarida açiklanan düzenlemeyle sinirli degildir ve herhangi bir düzenleme sirasi olabilir. Bunun örnekleri asagidaki düzenlemeleri de içerebilir: Omegin, genetik mühendisligi tarafindan sunulabilecek bir rasgele peptit baglayici referansinda açiklanan baglayicilar), antikor degisken bölgelerini baglayan baglayicilar olarak kullanilabilirler. Çok sayida ayni veya farkli baglayici kullanilabilir.
Mevcut bulusta, peptit baglayici tercih edilmektedir. Peptid baglayicinin uzunlugu özellikle sinirlandirilmamistir ve amaca uygun olarak teknik alanda uzman kisilerce uygun bir biçimde seçilebilir. Peptit baglayicisini olusturan amino asit kalintilarinin sayisi genellikle 1 ila 100 amino asit, tercih edilen sekliyle 3 ila 50 amino asit, daha tercih edilen sekliyle 5 ila 30 amino asit, özellikle tercih edilen sekliyle 12 ila 18 amino asittir (om, 15 amino asit).
Peptit baglayicisini olusturan amino asit dizisi, bu dizi scFv'nin baglanma etkisini engellemedigi sürece rastgele seçilmis bir dizi olabilir. Ornegin peptit baglayici için asagidaki amino asit dizileri kullanilabilir: Gly . Gly i Gly . Ser (DIZI ID NO:61) Ser - Gly - Gly ~ Gly (DIZI ID NO: 62) Gly - Gly - Gly - Gly - Ser (DIZI ID NO: 63) Ser - Gly - Gly - Gly - Gly (DIZI ID NO: 64) Gly - Gly ' Gly - Gly - Gly - Ser (DIZI ID NO: 65) Ser . Gly ° Gly - Gly ° Gly - Gly (DIZI ID NO: 66) Gly - Gly ° Gly ° Gly - Gly - Gly ° Ser (DIZI ID NO:67) Ser - Gly - Gly - Gly - Gly ' Gly - Gly (DIZI ID NO: 68) Peptid baglayicinin uzunlugu özellikle sinirlandirilmamistir ve amaca uygun olarak teknik alanda uzman kisilerce uygun bir biçimde seçilebilir. Ornegin, peptit baglayicinin uzunlugunu belirleyen tam sayi n genellikle 1 ila 5, tercih edilen sekliyle 1 ila 3, daha tercih edilen sekliyle 1 veya 2'dir.
Buna göre, mevcut bulusa göre bir farmasötik bilesimde kullanilabilen sc (Fv)2'nin özellikle tercih edilen bir yönüne ait örnekler asagidaki sc (Fv) 2'yi içerebilir: peptid baglayici (15 amino asit)-[VL].
Alternatif olarak, degisken bölgeler, kimyasal olarak sentezlenen baglayici (kimyasal çapraz baglama maddesi) kullanilarak da baglanabilir. Genellikle peptit bilesiklerinin veya benzerlerinin çapraz baginda kullanilan çapraz baglama ajanlari da bu bulusta kullanilabilir. Ornegin, asagida gösterilen kimyasal çapraz baglama ajanlari teknik alanda bilinmektedir. Bu çapraz baglama ajanlari ticari olarak piyasadan temin edilebilir: N-hidroksisüksinimit (NHS), disüksinimidil suberat (DSS), bis (sülfosüksinimidil) suberat (883), ditiyobis (süksinimidil propionat) (DSP), ditiyobis (sülfosüksinimidil propiyonat) (DTSSP), etilen glikol bis (süksinimidil süksinat) (EGS), etilen glikol bis (sülfosüksinimidil süksinat) (sülfo-EGS), disüksinimidil tartrat (DST), disülfosüksinimidil tartrat (sülfo-DST), bis [2-(s'uksinimoksikarboniloksi)etil] sülfon (BSOCOES) ve bis[2-(sülfos'uksinimidooksikarboniloksi)etil]s`uifon (sülfo-BSOCOES) vb.
Anti-DLL3 Antikoru Aktivitesi (l) Sitotoksik aktivite Kanser gibi hücre proliferatif hastaliklarin tedavisi için, antikorun efektör aktivitesini sürdürmesi tercih edilmektedir. Spesifik olarak, bu bulusa göre tercih edilen antikorun her ikisi de DLL3 ve efektör fonksiyonlari için bir baglanma afinitesine sahiptir.
Kullanilan antikor sitotoksik aktiviteye sahiptir. Bulusun bir farmasötik kompozisyonunda kullanilan antikorun efektör fonksiyonlari, bir antikora bagimli hücre aracili sitotoksik (ADCC) aktiviteyi ve bir komplemente bagimli sitotoksik (CDC) aktiviteyi kapsayabilir. Bulusun farmasötik bir bilesiminde kullanilan terapötik antikor, özellikle tercih edilen sekliyle efektör fonksiyonlar olarak bir ADCC aktivitesine sahip olabilir.
Terapötik amaç için kullanilan antikor bir sitotoksik aktiviteye sahip olan bir antikordur.
Mevcut bulusa göre sitotoksik aktivitenin örnekleri, ADCC ve CDC aktivitelerini içerebilir.
Mevcut bulusta ADCC aktivitesi, Fcv reseptörleri araciligiyla Fcv reseptörü tasiyan hücrelerin (immünositler, vb.) hedef hücrelerin hücre yüzey antijenlerine spesifik olarak baglanan antikorlarin Fc bölgelerine baglanmasi vasitasiyla hedef hücrelere hasar verilmesi aktivitesi anlamina gelmektedir. Diger taraftan CDC aktivitesi, tamamlayici sistemin aracilik ettigi bir sitotoksik aktivite anlamina gelmektedir.
Anti-DLLS antikorunun bir ADCC aktivitesine sahip olup olmadigi ya da bir CDC aktivitesine sahip olup olmadigi, teknik alanda bilinen bir yöntem ile belirlenebilir (örnek olarak, Current protocols in lmmunology, Chapter 7. lmmunologic studies in humans, Editor, John E, Coligan ve ark., `John Wiley & Sons, Inc., (1993)).
Spesifik olarak, ilk olarak efektör hücreler, bir tamamlayici çözelti ve hedef hücreler hazirlanmaktadir. i) Efektör hücrelerin hazirlanmasi Dalaklar CBA/N farelerinden veya benzerlerinden kesilir ve dalak hücreleri bir RPMI164O ortaminda (lnvitrogen Corp. tarafindan imal edilir) ayrilir. Hücreler % 10 fetal sigir serumu (Hyclone Laboratories, Inc. tarafindan imal edilen FBS) ihtiva eden bu ortam ile yikanabilir ve daha sonra efektör hücreleri hazirlamak için 5x106 hücre/mlilik bir hücre konsantrasyonuna ayarlanirlar. ii) Tamamlayici çözeltinin hazirlanmasi Baby Rabbit Complement (CEDARLANE Laboratories Ltd. tarafindan üretilmistir), bir tamamlayici çözelti hazirlamak için % 10 FBS içeren bir ortamla (lnvitrogen Corp. tarafindan üretilmistir) 10 kat seyreltilebilir. iii) Hedef hücrenin hazirlanmasi DLL3 proteinlerini ekspres eden hücreler, hedef hücrelerin radyoaktif olarak isaretlenmesi için % 10 FBS içeren bir DMEM ortaminda, 0.2 mCi510r-sodyum kromat (GE Healthcare Bio-Sciences Corp. tarafindan üretilmistir) ile birlikte 1 saat boyunca 37 °C'de kültürlenebilir. DLL3 protein kodI ayan genler, küçük hücreli akciger kanseri hücre soylari veya benzerleri ile dönüstürülen hücreler, DLL3 proteinlerini ekspres eden hücreler olarak kullanilabilir.
Bu sekilde radyo-etiketlenen hücreler, % 10 FBS içeren bir RPMI164O ortami ile üç kez yikanabilir ve hedef hücreleri hazirlamak için 22x105hücre/ml'lik bir hücre konsantrasyonuna ayarlanabilir.
ADCC veya CDC aktivitesi, asagida açiklanan bir yöntemle analiz edilebilir. ADCC aktivite analizi için, hedef hücreler ve anti-DLL3 antikoru (her biri 50 pl), U tabanli 96 kuyucuklu bir plakaya (Becton, Dickinson ve Company tarafindan üretilmis) eklenmekte ve buz üzerinde 15 dakika boyunca reaksiyona sokulmaktadir. Ardindan, 100 pl efektör hücreler plakaya eklenir ve hücreler bir COZ inkübatöründe 4 saat süreyle kültüre alinir. Antikorun nihai konsantrasyonu 0 ya da 10 pg/ml'ye ayarlanmistir. Kültürden sonra, 100 pl süpernatan toplanir ve radyoaktivite bir gama sayaci (Packard Instrument Company tarafindan imal edilen COBRA ll AUTO- GAMMA, MODEL D5005) kullanilarak ölçülür. Sitotoksik aktivite (%), elde edilen deger kullanilarak hesaplama formülüne [(A - C) / (B - C) x 100] göre hesaplanabilir.
Bu formülde, A her örnekten radyoaktiviteyi (cpm) temsil etmekte; B, % 1 NP-4O (Nacalai Tesque, Inc. tarafindan imal edilmis) ile takviye edilmis bir örnekten radyoaktiviteyi (cpm) temsil etmekte; ve C sadece hedef hücreleri içeren bir örnekten radyoaktiviteyi (cpm) temsil etmektedir.
Diger taraftan, CDC aktivite analizi için, hedef hücreler ve anti-DLL3 antikoru (her biri 50 pl), düz tabanli 96 kuyucuklu bir plakaya (Becton, Dickinson ve Company tarafindan üretilmis) eklenmekte ve buz üzerinde 15 dakika boyunca reaksiyona sokulmaktadir.
Ardindan, 100 ul tamamlayici çözelti plakaya eklenir ve hücreler bir 002 inkübatöründe 4 saat süreyle kültüre alinir. Antikorun nihai konsantrasyonu 0 ya da 3 ug/ml'ye ayarlanmistir.
Kültürden sonra, 100 ul süpernatan toplanir ve radyoaktivite bir gama sayaci kullanilarak ölçülür. Sitotoksik aktivite, ADCC aktivite analizinde oldugu gibi hesaplanabilir.
Bunun tersine, antikor konjugatlari kullanarak gerçeklestirilen sitotoksisite aktivitesi analizi için, hedef hücreler ve anti-DLL3 antikoru konjugatlari (her biri 50 pl), düz tabanli 96 kuyucuklu bir plakaya (Becton, Dickinson ve Company tarafindan üretilmis) eklenmekte ve buz üzerinde 15 dakika boyunca reaksiyona sokulmaktadir.
Hücreler bir C02 inkübatöründe 1 ila 4 saat süreyle kültüre alinmaktadir. Antikorun nihai konsantrasyonu 0 ya da 3 ug/ml'ye ayarlanmistir. Kültürden sonra, 100 ul süpernatan toplanir ve radyoaktivite bir gama sayaci kullanilarak ölçülür. Sitotoksik aktivite, ADCC aktivite analizinde oldugu gibi hesaplanabilir. (2) Konjüge antikor Antikor, bir kemoterapötik ajan, toksik bir peptit veya bir radyoaktif kimyasal gibi bir sitotoksik madde ile konjuge edilebilir. &'3er bir modifiye antikor (bundan sonra, bir antikor konjugesi olarak anilacaktir) elde edilen antikoru kimyasal olarak modifiye ederek elde edilebilir. Antikor modifikasyonu için bir yöntem, teknik alanda önceden olusturulmustur.
Sitotoksik aktivitesi, anti-DLL3 antikoruna baglanma yoluyla islev gören kemoterapötik ajanin örnekleri, asagidaki kemoterapötik ajanlari içerebilir: azaribin, anastrozol, azasitidin, bleomisin, bortezomib, bryostatin-1, busulfan, kamptotesin, 10- hidroksikamptotesin, karmustin, celebrex, klorambusil, sisplatin, irinotekan, karboplatin, kladribin, siklofosfamid, sitarabin, dakarbazin, dosetaksel, daktinomisin, daunomisin glukuronid, daunorubisin, deksametazon, dietilstilbestrol, doksorubisin, doksorubisin glukuronid, epirubisin, etinil estradiol, estramustin, etoposid, etoposid glukuronid, floksuridin, fludarabin, flutamid, fluorourasil, flooksimesteron, gemsitabin, hidroksiprogesteron kaproat, hidroksiüre, idarubisin, ifosfamid, lökovorin, lomustin, mekloretamin, medroksiprogesteron asetat, megestrol asetat, melfalan, merkaptopurin, metotreksat, mitoksantron, mithramisin, mitomisin, mitotan, fenilbütirat, prednizon, prokarbazin, paklitaksel, pentostatin, semustin, streptozosin, tamoksifen, taksanlar, taksol, testosteron propionat, talidomid, tioguanin, tiotepa, teniposid, topotekan, urasil hardal, vinblastin, vinorelbin, vinkristin.
Kemoterapötik ajan tercih edilen sekliyle düsük moleküllü bir kemoterapötik ajandir.
Düsük moleküllü kemoterapötik ajanin, antikorla birlesmesinden sonra bile antikor islevlerine müdahale etmesi olasi degildir. Mevcut bulusta, düsük moleküllü arasinda bir moleküler agirliga sahiptir. Yukarida örneklenen kemoterap'otik ajanlarin tümü, düsük moleküllü kemoterapotik ajanlardir. Mevcut bulusa göre olan bu kemoterapötik maddeler, in vivo olarak aktif kemoterapötik ajanlara dönüstürülen Ön ilaçlari kapsamaktadir. On ilaç aktivasyonu enzimatik olmayan dönüsüm veya enzimatik dönüsüm olabilir.
Ayrica, antikor toksik peptit ile modifiye edilebilir. Toksik peptide Örnekler asagidakileri içerebilir: Difteri toksin A Zinciri (Langone J. J., ve ark., Methods in (Stirpe F., Barbieri L., FEBS letter 195, 1-8, 1986); Tritin (Stirpe F., Barbieri L., FEBS Mevcut bulusta, radyoaktif kimyasal bir radyoizotop içeren bir kimyasal anlamina gelmektedir. Radyoizotop `özellikle sinirlandirilmamistir ve herhangi bir radyoizotop Baska bir düzenlemede, bir ya da iki ya da daha fazla düsük moleküllü kemoterapötik ajan ve bir ya da iki ya da daha fazla toksik peptit, antikor modifikasyonunda kombinasyon halinde kullanilabilir. Anti-DLL3 antikoru, kovalent ya da kovalent olmayan bag yoluyla düsük moleküllü kemoterapötik ajana konjuge edilebilir. Bu gibi bir kematerap'otik ajan konjuge antikorun hazirlanmasi için bir yöntem teknik alanda bilinmektedir.
Bir proteinli ajan ya da toksin, bir genetik mühendisligi yaklasimi ile antikora konjuge edilebilir. Spesifik olarak, 'örnek olarak, toksik peptidi kodlayan DNA ve anti- DLL3 antikorunu kodlayan DNA, birbiriyle çerçeve içinde kaynastirilir ve bu kaynasmis DNA, rekombinant vektörler olusturmak Için ekspresyon vektorleri içine yerlestirilebilir. Vektörler uygun konak hücre içine yerlestirilir ve elde edilen transforme edilmis hücreler kültüre edilir. DNA eki, füzyon proteinleri olarak toksik peptit konjuge anti-DLL3 antikorlari elde etmek için hücreler tarafindan ekspres edilebilir. Antikor-füzyon proteinlerinin elde edilmesi için, proteinli ajan ya da toksin genel olarak antikorun C-terminali tarafinda bulunmaktadir. Bir peptit baglayicinin, antikor ve proteinli ajan ya da toksin arasina girmesine izin verilebilir. (3) Bispesifik antikor Buna ek olarak, mevcut bulusun bir farmas'otik kompozisyonunda bulunan antikor, bispesifik bir antikor olabilir. Bispesifik antikor ile ayni antikor molekülünde farkli epitoplari taniyan degisken bölgelere sahip olan bir antikor ifade edilmektedir. Mevcut bulusta, bispesifik antikor, DLL3 molekülü üzerindeki farkli epitoplari taniyan antijen baglanma alanlarina sahip olabilir. Böylece, bu gibi iki bispesifik antikor molekülü bir DLL3 molekülüne baglanabilir. Sonuç olarak, daha güçlü sitotoksik etki beklenebilir.
Alternatif olarak, mevcut bulusun bir farmasötik kompozisyonunda bulunan bispesifik antikor, biri DLL3*ü taniyan ve digeri bir sitotoksik maddeyi taniyan antijen baglayici bölgelere sahip olabilir. Sitotoksik madde, özellikle, bir kemoterapötik ajan, bir toksik peptit ve bir radyoaktif kimyasal içermektedir. Böyle bir bispesifik antikor, sitotoksik maddeyi yakalarken, DLL3 ekspres eden hücrelere baglanir. Sonuç olarak, sitotoksik maddenin dogrudan DLL3 ekspres eden hücreler üzerinde hareket etmesine izin verilebilir. Spesifik olarak, sitotoksik maddeyi taniyan bispesifik antikor, spesifik olarak tümör hücrelerine zarar verebilir ve tümör hücrelerinin büyümesini engelleyebilir.
Ayrica, mevcut bulusta, DLL3tten baska bir antijeni taniyan bir antijen baglanma bölgesi ile birlestirilmis bir DLL3-baglama bölgesi içeren bir bispesifik antikor kullanilabilir. Bu gibi bir bispesifik antikorda bununla birlestirilebilen antijen baglanma bölgesine örnek olarak hedef kanser hücrelerinin yüzeyinde spesifik olarak ifade edilen bir antijen, DLL3tte oldugu gibi fakat DLLS'ten farkli olarak.
Bispesifik antikor üretmek için bir yöntem, teknik alanda bilinmektedir. Ornek olarak, antijen bakimindan farklilik gösteren iki antikor, bu sekilde bispesifik antikoru hazirlamak için baglanabilir. Baglanan antikorlarin her biri, agir ve hafif zincirlere sahip olan bir 1/2 molekül ya da agir zincirlerden olusan bir 114 molekül olabilir.
Alternatif olarak, farkli monoklonal antikor üreten hibridomlar, bispesifik antikorlari üreten füzyon hücrelerini olusturmak için kaynasabilir. Ayrica, bispesifik antikor, bir genetik mühendisligi yaklasimi ile hazirlanabilir.
Antikorun antijen baglanma aktivitesi, teknik alanda bilinen yöntemler kullanilarak belirlenebilir (Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, , EIA (enzim immunanaliz), RIA (radyoimmunanaliz) ya da floroimmünanaliz kullanilabilir. (4) Seker zincirinin modifikasyonu Mevcut bulusun bir farmasötik kompozisyonunda kullanilan antikor, modifiye bir seker zincirine sahip bir antikor olabilir. Antikorlarin sitotoksik aktivitelerinin, seker Zincirlerini degistirerek arttirilabilecegi bilinmektedir. `Ornek olarak, glikosile edilmis antikorlar (WO 99/54342 ve benzerleri), fukozda eksik antikorlarin seker zincirlerine sahip bir seker zincirine sahip olan antikorlar (WO 02/79255 ve benzerleri) teknik alanda modifiye seker zincirine sahip antikor olarak bilinmektedir.
Ayrica, mevcut bulusun bir farmasötik kompozisyonunda bulunan antikor internalizasyon aktivitesine sahip olabilir. Mevcut bulusta, “internalizasyon aktivitesine sahip antikor” ile, DLL3!e baglanarak hücreye (sitoplazmalar, veziküller, organeller ve benzerleri) tasinan bir antikor ifade edilmektedir.
Antikorun bir internalizasyon aktivitesine sahip olup olmadigi, teknik alanda uzman kisiler tarafindan genel olarak bilinen bir yöntem ile dogrulanabilir ve örnek olarak isaretleme malzemesine bagli anti-DLL3 antikorlarinin DLL3-ifade eden hücrelerle temas ettirilmesi ve isaretleme malzemesinin hücreler içine dahil edilip edilmediginin teyit edilmesi ile ilgili bir yöntem ile ya da DLL3 ifade eden hücreler ile sitotoksik madde ile konjuge edilmis anti-DLL3 antikorlarinin temas ettirilmesini ve DLL3-ifade eden hücrelerin ölümünün uyarilip baslatilmadigini teyit eden bir yöntem ile dogrulanabilir.
Daha spesifik olarak, anti-DLL3 antikorunun internalizasyon aktivitesi, Örnek olarak Ornekleride tarif edilen bir yöntem ile analiz edilebilir.
Bir internalizasyon aktivitesine sahip antikor, Örnek olarak sitotoksik madde ile konjuge edilebilir ve daha sonra tarif edilecek olan bir antikanser ajani gibi bir farmasötik kompozisyon olarak kullanilabilir.
Anti-DLL3 antikorunun hazirlanmasi hazirlanmasi Monoklonal antikor üreten hibridomlar, teknik alanda bilinen bir teknige göre asagidaki gibi hazirlanabilir: ilk olarak, hayvanlara, normal bir bagisiklik kazandirma yöntemine göre duyarlilastirici antijenler olarak kullanilan DLL3 proteinleri ya da bunlarin kismi peptitleri ile (daha sonra açiklanacaktir) bagisiklik kazandirilir. Elde edilen immünositler, hibridomlari elde etmek için olagan bir hücre füzyon teknigi ile teknik alanda bilinen parental hücreler ile kaynastirilir. Bu hibridomlar, anti-DLLS antikorunu üreten hibridomlari seçmek Için olagan bir tarama yöntemiyle ilgilenilen antikoru üreten hücreler için daha fazla taranir. Istenen anti-DLLS monoklonal antikor, seçilen hibridomlardan elde edilir. Spesifik olarak, anti-DLL3 monoklonal antikor asagidaki gibi hazirlanir: (l) DLL3 proteininin hazirlanmasi Ilk olarak, DLL3 genleri, antikor elde etmek için duyarlilastirici antijenler olarak kullanilan DLL3 proteinlerini elde etmek için ekspres edilebilir. Spesifik olarak, DLL3- kodlayan gen dizisi, ilgili konak hücrelerin daha sonra transforme edildigi teknik alanda bilinen ekspresyon vektörleri içine yerlestirilmektedir. Daha sonra, ilgili insan DLL3 proteinleri teknik alanda bilinen bir yöntem ile konak hücrelerden ya da bunun bir kültür üst fazindan saflastirilmaktadir. Farkli bir polipeptid ile kaynasmis olan DLL3 proteininin istenen kismi polipeptidini içeren saflastirilmis dogal DLL3 proteinleri veya füzyon proteinleri immünojenler olarak kullanilabilir. Ornek olarak, immünojenler olarak kullanilan füzyon proteinlerini üretmek için antikor Fc parçalari, peptit etiketleri ve benzerleri kullanilabilir. Füzyon proteinleri için ekspresyon vektörleri, istenen polipeptid parçalarini kodlayan ve bu füzyon genini ekspresyon vektörlerine yerlestiren, sirasiyla iki veya daha fazla genin çerçeve halinde birlestirilmesiyle hazirlanabilir. Füzyon proteinlerinin hazirlanma yöntemi Molecular Cloning ikinci baski'da (Sambrook, J. ve ark., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) tarif edilmektedir.
Bu sekilde saflastirilan DLL3 proteinleri memelilerin immünizasyonu için duyarlilastirici antijenler olarak kullanilabilir. DLL3rün kismi peptitleri de duyarlilastirici antijenler olarak kullanilabilir. Ornek olarak, asagidaki peptitler duyarlilastirici antijenler olarak kullanilabilir: Kullanilan DLL3 kismi peptidinin bölgesi ve boyutu sinirli degildir. Duyarlilastirici bir antijen olarak islev gören peptidi olusturan amino asitlerin sayisi tercih edilen sekliyle en az 3 ya da daha fazla, örnek olarak 5 ya da daha fazla veya 6 ya da daha fazladir.
Daha spesifik olarak 8 ila 50 kalinti içeren peptitler, tercih edilen sekliyle 10 ila 30 kalinti olan peptitler duyarlilastirici antijenler olarak kullanilabilir. (2) DLL3 proteini ile immünizasyon Memeliler, duyarlilastirici antijenler olarak DLL3 proteinleri ya da bunlarin kismi peptitleri ile bagisiklik kazanmaktadir. Bagisiklik kazandirilmis memeliler bilhassa sinirli degildir. Monoklonal antikorun hücre füzyon yöntemi ile elde edilmesi için, bagisiklik kazanmis hayvanlarin, hücre füzyonunda kullanilan parental hücrelerle uyumlulugu göz önüne alinarak seçilmesi tercih edilmektedir. Genel olarak, kemirgenler bagisiklik kazandirilmis hayvanlar olarak tercih edilir. Spesifik olarak, fareler, siçanlar, hamsterler ya da tavsanlar, bagisiklik kazandirilmis hayvanlar olarak kullanilabilir. Ek olarak, bagisiklik kazandirilmis hayvanlar olarak maymunlar ya da benzerleri kullanilabilir.
Bu hayvanlara, teknik alanda bilinen bir yönteme göre duyarlilastirici antijenler ile bagisiklik kazandirilabilir. Ornek olarak, genel bir yöntem, memelilerin, intraperitonal ya da subkütan enjeksiyon yoluyla duyarlilastirici antijenlerle bagisik kazandirilmasini icerebilir. Spesifik olarak, duyarlilastirici antijenler, memelilere 4 ila 21 günlük araliklarla birkaç kez uygulanmaktadir. Duyarlilastirici antijenler, uygun bir seyreltme oraninda PBS (fosfat tamponlu salih), salin ya da benzerleri ile seyrelmekte de bagisiklik kazandirmada kullanilmaktadir. Ayrica, duyarlilastirici antijenler bir adjuvan ile birlikte uygulanabilir. Ornek olarak antijenler, duyarlilastirici antijenlerin hazirlanmasi için bir Freund'un tam adjuvani ile emülsiyonlastirma için karistirilabilir. Ayrica, duyarlilastirici antijenler ile bagisiklik kazandirmada uygun bir tasiyici kullanilabilir. Ozellikle, küçük bir molekül agirligina sahip kismi peptitler duyarlilastirici antijenler olarak kullanildiginda, duyarlilastirici antijen peptitlerinin, albumin ya da anahtar deligi limpet hemosiyanin gibi tasiyici proteinlere baglanmasi ve bagisiklik kazandirmada kullanilmasi tercih edilmektedir. (3) DNA immünizasyonu Monoklonal antikor, DNA immünizasyonuyla da elde edilebilir. DNA immünizasyonu, asagidakileri içeren bir immünostimülasyon yöntemidir: bagisiklik kazandirilmis hayvanlarda antijenik protein kodlayan genleri ekspres edebilen bir formda yapilandirilmis vektör DNAJnin uygulanmasiyla hayvanlara bagisiklik kazandirmak; ve bagisiklik kazandirilmis hayvanlarin in vivo olarak bagisiklik kazandirici antijenleri ekspres etmesine izin vermek.
DNA immünizasyonunun, asagidaki gibi protein antijenlerinin uygulanmasini kullanarak genel immünizasyon yöntemlerinden daha üstün olmasi beklenebilir: - korunan membran proteini (örnek olarak DLL3) yapilari ile immünostimülasyon saglayabilir; ve - bagisiklik kazandirici antijenlerin saflastirilmasi ihtiyacini ortadan kaldirir.
Mevcut bulusta kullanilacak monoklonal antikorun DNA immünizasyonu ile elde edilmesi için, ilk olarak hayvanlara, DLL3 protein ekspresyon vektörü DNA'sinin uygulanmasi için bagisiklik kazandirilmaktadir. DLL3 kodlayan DNA, PCR gibi teknik alanda bilinen bir yöntem ile sentezlenebilir.
Elde edilen DNA, uygulanmasi yoluyla hayvanlara bagisiklik kazandirilan uygun ekspresyon vektörlerine yerlestirilir. Ornek olarak, pcDNA3.1 gibi ticari olarak temin edilebilen ekspresyon vektörleri, ekspresyon vekt'orleri olarak kullanilabilir. Benzer sekilde, vektörlerin hayvanlara uygulanmasi için genellikle kullanilan bir yöntem kullanilabilir. Ornek olarak, üzerinde absorbe edilen ekspresyon vektörleri ile altin partikülleri, DNA immünizasyonunu gerçeklestirmek için bir gen tabancasi kullanilarak hücrelere yerlestirilebilir. (4) Hibridomun hazirlanmasi Istenen antikor miktarindaki bir artis, bu sekilde bagisiklik kazandirilan memelilerin serumunda dogrulanmaktadir. Daha sonra, immünositler memelilerden toplanmakta ve hücre füzyonuna tabi tutulmaktadir. Ozellikle, tercih edilen immünositler olarak dalak hücreleri kullanilabilir.
Memeli miyelom hücreleri, immünositler ile hücre füzyonunda kullanilmaktadir.
Miyelom hücrelerinin, tarama için uygun bir seçim isaretçisine sahip olmasi tercih edilmektedir. Seçim isareti, belirli kültür kosullari altinda hayatta kalabilen (ya da hayatta kalamayacak) bir karakteri ifade etmektedir.
Ornek olarak, hipoksantin-guanin fosforibosiltransferaz eksikligi (bundan sonra, HGPRT eksikligi olarak kisaltilacaktir) ya da timidin kinaz eksikligi (bundan sonra TK eksikligi olarak kisaltilacaktir), bu alanda seçim isaretleri olarak bilinmektedir. HGPRT ya da TK eksikligine sahip olan hücreler, hipoksantin-aminopterin-timidine karsi duyarlidir (bundan sonra, HAT-duyarli olarak kisaltilacaktir). HAT-duyarli hücreler, HAT-duyarli hücreler, bir HAT seçici ortaminda öldürülür çünkü DNA sentezleyemezler. Aksine, normal hücrelerle kaynastirildiginda bu hücreler, HAT seçici ortamda bile büyüyebilir çünkü normal hücrelerin kurtarma yolunu kullanarak DNA sentezine devam edebilirler.
HGPRT veya TK eksikligine sahip olan hücreler, HGPRT eksikligi için 6-tioguanin ya da 8-azaguanin (bundan sonra, 8AG olarak kisaltilacaktir) ya da TK eksikligi için 5,- bromodeoksiüridin içeren bir ortamda seçilebilir. Normal hücreler boyle bir ortamda öldürülür çünkü bu pirimidin analoglarini DNA'larina dahil ederler. Tersine, bu enzimleri eksik olan hücreler seçici ortamda hayatta kalabilirler çünkü pirimidin analoglarini buraya dahil edemezler. Ek olarak, G418 direnci olarak adlandirilan bir seçim isareti, bir neomisin direnç geni yoluyla hücrelere, 2-deoksistreptamin antibiyotigine (gentamisin analogu) direnç kazandirmaktadir. Hücre füzyonu için uygun çesitli miyelom hücreleri teknik alanda bilinmektedir. Örnek olarak, asagidaki miyelom hücreleri mevcut bulusa göre bir farmasötik kompozisyonda kullanim için olan monoklonal antikorun üretiminde kullanilabilir: Topics in Microbiology and lmmunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler. G. ve Milstein, 131-133) ya da benzerleri.
Temel olarak, immünositlerin miyelom hücreleri ile hücre füzyonu, teknik alanda bilinen bir yönteme göre gerçeklestirilebilir, örnek olarak, Kohler ve Milstein ve ark.
(Kohler. G. ve Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46).
Daha spesifik olarak, hücre füzyonu, örnek olarak, bir hücre füzyon promotörünün varliginda olagan bir besin kültür ortami içinde gerçeklestirilebilir. Ornek olarak, füzyon promotörü olarak polietilen glikol (PEG) ya da Japonya hemaglütinasyon virüsü (HVJ) kullanilabilir. Ayrica, arzu edildiginde, füzyon etkinligini arttirmak için dimetil sülfoksit gibi bir yardimci madde de buraya eklenebilir.
Immünositler ve kullanilan miyeloma hücreleri arasindaki oran istege göre ayarlanabilir. Ornek olarak, immünositlerin miktarinin, miyeloma hücrelerinin 1 ila 10 katina ayarlanmasi tercih edilmektedir. Ornek olarak, miyeloma hücre dizisinin büyümesi için uygun bir RPMl164O ya da MEM kültür ortami yani sira bu tür bir hücre kültüründe kullanilan alisilmis bir kültür ortami da hücre füzyonunda kültür ortami olarak kullanilabilir. Ayrica, serum (örnek olarak fetal dana serumu (FCS)) ile takviye edilen bir çözelti, kültür ortamina ilave edilebilir.
Hücre füzyonu için, immünositler ve miyeloma hücreleri, kültür ortamindaki önceden belirlenmis miktarlarda iyice karistirilir ve daha sonra ilgilenilen füzyon hücrelerini (hibridomlar) olusturmak üzere Önceden yaklasik 37 cC'ye isitilmis bir PEG çözeltisi ile karistirilmaktadir.
Hücre füzyon yönteminde, örnek olarak 1000 ila 6000 derecesinde ortalama moleküler agirliga sahip PEG, genellikle % 30 ila % 60 (agirlik/hacim) konsantrasyonunda ilave edilebilir. Daha sonra, yukarida örneklenen uygun kültür ortami, hibridomlara sirayla ilave edilmekte ve karisim santrifüjlenmekte, ardindan üst faz uzaklastirilmaktadir.
Bu prosedür, hibridom büyümesi için uygun olmayan hücre füzyon ajanlarini ya da benzerlerini uzaklastirmak için tekrarlanmaktadir.
Bu sekilde elde edilen hibridomlar, hücre füzyonu içinde kullanilan miyeloma hücrelerinin seçim markeri için uygun bir seçici kültür ortaminin kullanilmasiyla seçilebilir. Ornek olarak, HGPRT ya da TK eksikligine sahip olan hücreler, bir HAT kültür ortami (hipoksantin, aminopterin ve timidin içeren kültür ortami) içinde hibridomlarin kültüre edilmesiyle seçilebilir. Spesifik olarak, HAT-duyarli miyeloma hücreleri, hücre füzyonunda kullanildiginda, sadece HAT kültür ortaminda normal hücrelerle kaynasmis hücreler seçici olarak büyütülebilir. HAT kültür ortamini kullanan kültürleme, ilgili hibridomlar disindaki hücreleri (kaynasmamis hücreler) öldürecek kadar uzun bir süre boyunca sürdürülür. Spesifik olarak, kültürleme genellikle ilgi konusu hibridomlari seçmek için birkaç gün ila birkaç hafta süreyle gerçeklestirilebilir. Daha sonra, ilgili antikoru üreten hibridomlar, normal bir sinirlayici seyreltme yöntemi ile tek klonlar olarak taranabilir ve klonlanabilir.
Ilgili antikorun taranmasi ve bunlarin tek klonlari olarak klonlanmasi, teknik alanda bilinen antijen-antikor reaksiyonuna dayanan bir tarama yöntemi ile gerçeklestirilebilir.
Ornek olarak, antijenler, polistiren ya da benzerlerinden yapilmis boncuklar ya da ticari olarak temin edilebilen 96-kuyucuklu mikrotitre plakasi gibi bir tasiyiciya baglanir ve hibridomlarin kültür üst fazi ile reaksiyona sokulur. Daha sonra, tasiyici yikanir ve ardindan enzim isaretli ikincil antikorlar ya da benzerleri ile reaksiyona sokulur. Kültür üst fazi, duyarlilastirici antijenler ile reaktif olan bir ilgili antikoru içerdiginde, ikincil antikorlar, bu antikor araciligi ile tasiyiciya baglanir. Son olarak, kültür süpernataninda ilgili antikorun varligini belirlemek için tasiyici araciligi ile baglanan ikincil antikorlar teSpit edilir. Antijene baglanma yetenegine sahip istenen antikoru üreten hibridomlar, sinirlayici bir seyreltme yöntemi ya da benzeri ile klonlanabilir. Bu taramada, immünizasyonda kullanilan DLL3 proteinleri ya da büyük ölçüde ayni olan DLL3 proteinleri tercih edilen sekliyle antijenler olarak kullanilabilir.
Ornek olarak, DLL3, çözünür DLL3 ya da benzerini ekspres eden hücre dizileri, antijenler olarak kullanilabilir.
Uluslararasi Yayin No. WO 03/104453'te tarif edilen bir yöntem, insan DLL3re karsi antikorun üretiminde kullanilabilir.
Ayrica, insan olmayan hayvanlara antijenlerle bagisiklik kazandirilmasi ile hibridomlarin elde edilmesi için bir yönteme ek olarak, ilgili antikoru elde etmek için antijenler ile insan Ienfositleri duyarli hale getirilebilir.
Spesifik olarak, insan Ienfositleri ilk olarak in vitro olarak DLL3 proteinleri ile duyarlilastirilir. Daha sonra, duyarlilastirilmis Ienfositler uygun füzyon partnerleri ile kaynastirilir. Ornek olarak, yasamlari boyunca bölünebilen insandan türetilmis miyeloma hücreleri, füzyon ortaklari olarak kullanilabilir (bakiniz. 1-59878 sayili Japon Patent Yayini).
Buna ek olarak, insan antikor genlerinin tüm içerigine sahip olan transgenik hayvanlara DLL3 proteinlerinin antijen olarak uygulanmasi ya da hayvanlarda DLL3 ekspres etmek için yapilmis DNA ile hayvanlara bagisiklik kazandirilmasi ile anti- DLL3 insan antikoru elde edilebilir. Bagisiklik kazandirilmis hayvanlardan elde edilen antikor üreten hücreler, uygun füzyon partnerleri ile hücre füzyonu ya da Epstein-Barr virüsü ile enfeksiyon gibi bir uygulama ile ölümsüzlestirilebilir. Bu sekilde elde edilen Ölümsüzlestirilmis hücrelerden, DLL3 proteinine karsi insan antikorlari izole edilebilir 94/02602). Ayrica, ölümsüzlestirilmis hücreler ayrica, ilgili reaksiyon spesifitesine sahip antikorlari üreten hücreler olarak da klonlanabilir. Transgenik hayvanlar bagisiklik kazandirilmis hayvanlar olarak kullanildiginda, hayvanlarin bagisiklik sistemleri insan DLL3'ünü yabanci olarak tanir.
Böylece, insan DLL3*e karsi insan antikorlari kolaylikla elde edilebilir. (5) Hibridomdan monoklonal antikorun elde edilmesi Bu sekilde hazirlanan monoklonal antikor üreten hibridomlar, alisilmis bir kültür ortaminda alt kültürlenebilir. Dahasi, hibridomlar ayrica sivi nitrojen içinde uzun bir süre boyunca saklanabilir.
Hibridomlar, olagan bir yönteme göre kültürlenir ve ilgi konusu monoklonal antikor, bunun kültür süpernatanindan elde edilebilir. Alternatif olarak, hibridomlar, bunlarla uyumlu ve yetistirilen memelilere uygulanir ve monoklonal antikor da asitik akiskanlar formunda elde edilebilir. Eski usul, yüksek derecede saf antikorlarin elde edilmesi için uygundur 2. Genetik mühendisligi yaklasimiyla anti-DLL3 antikorunun hazirlanmasi (l) Antikor geninin klonlanmasi Antikor, antikor üreten hücrelerden klonlanan antikor genleri kullanilarak bir genetik mühendislik yaklasimi ile hazirlanabilir. Klonlanmis antikor genleri, uygun vektörlere yerlestirilebilir ve konaklarin transformasyonu ile antikor olarak ekspres edilebilir.
Antikor geni izolasyonu, vektörlere yerlestirilmesi ve konak hücrelerin transformasyonu için yöntemler halihazirda yayimlanmistir (bakiniz örnek olarak Ornek olarak, anti-DLL3 antikorunun degisken bölgelerini kodlayan cDNAlar, anti- DLL3 antikor üreten hibridom hücrelerinden elde edilebilir. Bu amaçla, genellikle toplam RNA'Iar ilk olarak hibridomlardan ekstrakte edilir. Ornek olarak, hücrelerden mRNA ekstrakte etmek için asagidaki yöntemler kullanilabilir: - Guanidin ultrasantrifüjeme yöntemi (Chirgwin, J. M. ve ark., Biochemistry (1979) Ekstre edilen mRNArlar, mRNA Saflastirma Kiti (GE Healthcare Bio-Sciences Corp. tarafindan imal edilmis) ya da benzerleri kullanilarak saflastirilabilir. Alternatif olarak, hücrelerden toplam mRNAlari dogrudan ekstrakte etmek için QuickPrep mRNA Saflastirma Kiti (GE Healthcare Bio-Sciences Corp. tarafindan imal edilmis) gibi bir kit de ticari olarak temin edilebilir. Toplam mRNAilar, böyle bir kit kullanilarak hibridomlardan elde edilebilir. Elde edilen mRNA*Iardan, antikor degisken bölge kodlayan cDNAilar, ters transkriptaz kullanilarak sentezlenebilir. Bu prosedürde, antikor genleri için ortak olan dizilerden seçilen rastgele 15 ila 30 baz dizileri primerler olarak kullanilabilir. cDNA*Iar, AMV Ters Transkriptaz Birinci-iplikli cDNA Sentez Kiti (Seikagaku Corp. tarafindan imal edilmis) ya da benzerleri kullanilarak sentezlenebilir. Ayrica, 5'-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech Laboratories, Inc. tarafindan imal edilmis) ve 5'-RACE amplifikasyonu için kullanilabilir.
Buna ek olarak, daha sonra tarif edilecek olan uygun kisitlama enzim bölgeleri, cDNA sentezinin sirasinda cDNA'larin her iki ucuna ilave edilebilir.
Elde edilen PCR ürünlerinden, ilgilenilen cDNA parçalari saflastirilir ve daha sonra vektör DNAilari ile baglanir. Bu sekilde hazirlanan rekombinant vektörler E. coli ya da benzeri içine yerlestirilir. Koloni seçiminden sonra, istenen rekombinant vektörler, koloni olusturan E. coli'den hazirlanabilir. Daha sonra cDNA, teknik alanda bilinen bir yöntemle, örnek olarak dideoksinükleotid zincir sonlandirma yöntemi ile dizilenebilir.
Ayrica, antikor degisken bölge kodlayan genlerin elde edilmesi için cDNA kütüphaneleri kullanilabilir. Ilk olarak, cDNA kütüphaneleri elde etmek için sablon olarak antikor üreten hücrelerden çikarilan mRNA,Iar ile cDNA,Iar sentezlenir.
Ticari olarak temin edilebilen bir kit, cDNA kütüphanesi sentezinde uygun sekilde kullanilmaktadir. Gerçekte, sadece az sayida hücreden çok küçük miktarlarda mRNA elde edilir. Bu nedenle, dogrudan saflastirma, düsük verimle sonuçlanmaktadir.
Böylece, antikor genlerinden arinmis oldugu gösterilen tasiyici RNA'lar genellikle buna ilave edilir, ardindan mRNA saflastirilir. Alternatif olarak, RNA'lar antikor üreten hücrelerden belirli miktarlarda ekstrakte edilebildiginde, tasiyici RNA'lar kullanilmadan verimli ekstraksiyon elde edilebilir. Ornek olarak 10 ya da daha fazla veya 30 ya da daha fazla, tercih edilen sekliyle 50 ya da daha fazla antikor üreten hücreden RNA ekstraksiyonu için, tasiyici RNA'larin ilave edilmesi gerekli olmayabilir.
Antikor genleri, sablon olarak elde edilen cDNA kütüphaneleriyle PCR ile güçlendirilir.
Antikor genlerinin PCR amplifikasyonu için primerler teknik alanda bilinmektedir.
Ornek olarak, insan antikor geni amplifikasyonu için primerler, makalenin (J. Mol. tasarlanabilir. Bu primerler, bir immünoglobulin alt sinifi temelinde farkli bir nükleotit dizisine sahiptir. Böylece, alt sinifi bilinmeyen cDNA kütüphaneleri sablon olarak kullanildiginda, PCR, her olasilik göz önüne alinarak primerlerin seçilmesi ile gerçeklestirilir.
Spesifik olarak, örnegin, insan IgG-kodlayan genlerin elde edilmesi amaciyla, yl ila y4 agir zincirleri ve K ve )\ hafif zincirleri kodlayan genlerin her birini amplifiye edebilen primerler kullanilabilir. Destek bölgesine karsilik gelen bir kisma baglanan primerler genellikle lgG degisken bölge genlerini amplifiye etmek için 3* primerleri olarak kullanilir. Bunun yani sira, her bir alt sinif için uygun olan primerler, 5› primerler olarak kullanilabilir.
Bu agir ve hafif zincir alt siniflari için gen amplifikasyonu için primerlerden elde edilen PCR ürünleri, ayri ayri bagimsiz kütüphaneleri olarak hazirlanir. Bu sekilde sentezlenen kütüphaneler, kombinasyon halinde agir ve hafif zincirleri içeren immünoglobulinleri yeniden sekillendirmek için kullanilabilir. Ilgili antikor, bir endeks olarak yeniden sekillendirilmis immünoglobulinlerin DLL3 için baglanma aktiviteleri ile taranabilir. (2) Antikor geninin konak hücreye yerlestirilmesi Anti-DLL3 antikorunun üretilmesi için, klonlanmis antikor genleri, bu genlerin, ekspresyon kontrol bölgelerinin kontrolü altinda ekspres edildigi sekilde ekspresyon vektörlerine dahil edilebilir. Antikor ekspresyonu için ekspresyon kontrol bölgeleri, örnek olarak, arttiricilar ve promotörler içermektedir. Ardindan, uygun konak hücreler, anti-DLL3 antikor kodlayan DNA'yi ekspres eden rekombinant hücreleri elde etmek Için bu ekspresyon vektörleri ile transforme edilebilir.
Antikor gen ekspresyonu için, antikor agir zincir ve hafif zincir kodlayan DNAllar, farkli ekspresyon vektörlerinde ayri olarak dahil edilebilir. Ayni konak hücre, agir zincir ve hafif zincir içeren vektörler ile birlikte transfekte edilebilir ve böylece agir ve hafif zincirleri içeren antikor moleküllerini ekspres edebilir. Alternatif olarak, agir zincir ve hafif zincir kodlayan DNA'Iar, konak hücrelerin transforme edildigi tek ekspresyon vektörlerine dahil edilebilir (bkz. Uluslararasi Yayin No. WO 94111523).
Teknik alanda, izole edilmis antikor genlerinin antikor hazirlama için uygun konaklara sokulmasi için konaklarin ve ekspresyon vektörlerinin birçok kombinasyonu bilinmektedir. Bu ifade sistemlerinin tümü mevcut bulusa uygulanabilir. Okaryotik hücreler konak olarak kullanildiginda, hayvan, bitki veya mantar hücreleri kullanilabilir. Spesifik olarak, mevcut bulusta kullanilabilecek hayvan hücrelerinin örnekleri asagidaki hücreleri içerebilir: i) CHO, COS, miyelom, BHK (bebek hamster böbregi), Hela, Vero, HEK293, Ba/F3, HL-60, Jurkat ve SK-HEP1 hücreleri gibi memeli hücreleri; ii) Xenopus oocytes gibi amfibi hücreleri; ve iii) sf9, sf21 ve Tn5 gibi böcek hücreleri.
Teknik alanda bitki hücreleri için, Nicotiana (örnek olarak Nicotiana tabacum) cinsinden türetilen hücreleri içeren, antikor gen ekspresyon sistemleri bilinmektedir.
Kültürlenmis kallus hücreleri, bitki hücre transformasyonunda kullanilabilir.
Buna ek olarak, mantar hücreleri olarak asagidaki hücreler kullanilabilir: Saccharomyces (örnek olarak Saccharomyces cerevisiae) cinsi gibi mayalardan ve Pichia (örnek olarak Pichia pastoris) cinsi filamentoz mantarlardan türetilen hücreler ve Aspergillus (örnek olarak Aspergillus niger) cinsinden türetilen hücreler.
Alternatif olarak, prokaryotik hücreleri kullanan antikor gen ekspresyon sistemleri de teknik alanda bilinmektedir. Ornek olarak, bakteri hücreleri kullanildiginda, E. coli, Bacillus subtilis ya da benzerlerinden türetilen bakteri hücreleri mevcut bulusta kullanilabilir.
Memeli hücrelerini kullanan gen ekspresyonu için, yararli bir promoter rutin olarak kullanilir, ekspres edilecek antikor geni ve 3'-asagi akisina yerlestirilmis bir poli A sinyali fonksiyonel olarak baglanabilir. Promotör/güçlendiricinin ornekleri, bir insan sitomegalovirüsünün hemen erken promoter/güçlendiricisini içerebilir.
Ayrica, antikor ekspresyonunda örnek olarak virüs promotörleri/güçlendiricileri ya da memeli hücresi türevli promotörler/güçlendiriciler (örnek olarak insan uzama faktörü 1d (HEF1ci)) kullanilabilir.
Promotörü/güçlendiricisi kullanilabilen virüslerin örnekleri, spesifik olarak retrovirüs, polyomavirüs, adenovirüs ve simian virüs 40 (SV40) içerebilir. yöntemine göre kullanilabilir. Ayrica, HEF1oi promotörü/güçlendiricisi, Mizushima ve ekspresyonunda kolayliklar kullanilabilir.
Antikorlar, hayvan hücreleri kullanilarak üretildiginde, antikorun agir veya hafif zincir geninin sinyal dizisi, tercih edilen sekliyle hücre disi salgilama için gerekli bir sinyal dizisi olarak kullanilmaktadir. Ayrica, IL-3 ya da lL-6 gibi bir salgilama proteininin sinyal dizisi kullanilabilir.
E. coli kullanilarak gen ekspresyonu için, rutin olarak kullanilan yararli bir promotör, antikor salgilamasi için bir sinyal dizisi ve ekspres edilecek antikor geni fonksiyonel olarak baglanabilir.
Promotörün örnekleri, lacZ ve araB promotörlerini içerebilir. LacZ promotörü, Ward ve arkinin (Nature ( yöntemine göre kullanilabilir. yöntemi ile ilgilenilen gen ekspresyonunda kullanilabilir.
Antikorlar E. coli periplazmasinda üretildiginde, antikor salgilamasi için bir pelB sinyal periplazmada üretilen antikorlar ayrilir ve daha sonra, üre ve guanidin hidroklorür gibi protein denatüranlari kullanilarak, sonuçta ortaya çikan antikorlar istenen baglama aktivitesine sahip olacak sekilde tekrar katlanmaktadir.
SV40, polyomavirüs, adenovirüs, sigir papilloma virüsü (BPV) ya da benzerlerinden türetilen bir replikasyon kaynagi, ekspresyon vektörlerine yerlestirilebilir. Ayrica. konak hücre sistemlerinde bir gen kopya sayisini arttirmak için ekspresyon vektörlerine bir seçim isareti yerlestirilebilir. Spesifik olarak, aminoglikozid fosfotransferaz (APH) geni, timidin kinaz (TK) geni, E. coli ksantin-guanin fosforibosiltranferaz (Ecogpt) geni ve dihidrofolat redüktaz (dhfr) geni gibi seçim isaretçileri kullanilabilir. (3) Konak hücreden antikor elde edilmesi Konak hücreler bu ekspresyon vektörleri ile dönüstürülmekte ve dönüstürülen konak hücreler daha sonra, ilgi konusu antikoru üretmek için in vitro ya da in vivo kültürlenmektedir. Konak hücrelerin kültürü, teknik alanda bilinen bir yönteme göre gerçeklestirilmektedir. Ornek olarak bir DMEM, MEM, RPMI164O ya da IMDM kültür ortami kullanilabilir ve fetal buzagi serumu (FCS) gibi serum ile takviye edilmis bir çözelti ile kombinasyon halinde kullanilabilir.
Bu sekilde ekspres edilen ve üretilen antikorlar, tek basina ya da uygun kombinasyon halinde, teknik alanda bilinen olagan protein saflastirma yöntemleri kullanilarak saflastirilabilir. Ornek olarak, afinite ya da kromatografik kolonlar (örnek olarak protein A kolonlari), filtreler, ultrafiltrasyon, tuzla çökelme ve diyaliz, antikorlari ayirmak ve saflastirmak için uygun bir sekilde seçilebilir ve birlestirilebilir (Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).
Dolayisiyla, burada tarif edilen antikoru kodlayan bir gen de ifade edilmektedir. Ayrica geni içeren bir vektör de açiklanmaktadir. Ayrica, vektörü tasiyan bir konakçi hücre de açiklanmistir. Ayrica, konak hücreyi kültürleme asamasini içeren, gen tarafindan kodlanan bir antikorun üretilmesi için bir yöntem de açiklanmistir. 3. Transgenik hayvan ile antikor üretimi Konak hücrelere ek olarak, transgenik hayvanlar ayrica rekombinant antikor üretiminde de kullanilabilir. Spesifik olarak, ilgilenilen antikor, bu antikoru kodlayan gen ile transfekte edilmis hayvanlardan elde edilebilir. Ornek olarak, antikor genleri, füzyon genlerini olusturmak için sütte özel olarak üretilen proteinleri kodlayan genlere Çerçeve içine yerlestirilebilir.
Ornek olarak, keçi ß kazein, sütün içinde salgilanan proteinler olarak kullanilabilir.
Antikor gen yerlesimine sahip füzyon genlerini içeren DNA parçalari, keçi embriyolarina enjekte edilmektedir, dolayisi ile disi keçilere yerlestirilmektedir.
Embriyolari alan keçiler tarafindan dogurulan transgenik keçilerin (ya da bunlarin soyundan) ürettigi sütlerden, istenilen antikor süt proteini ile bir füzyon proteini olarak elde edilebilir. Ayrica, transgenik keçilerde, hormon, transgenik keçilerden üretilen istenilen antikoru içeren sütün miktarini arttirmak için uygun bir sekilde kullanilabilir Farmasötik kompozisyon Küçük hücreli akciger kanseri dokularindan DLL3 yüksek oranda ekspres edildigi içini anti-DLL3 antikoru bir kanser hücresine özgü sitotoksik aktiviteye sahiptir. Boylece, anti-DLL3 antikoru, DLL3 ekspres eden akciger kanserinin tedavisinde yararlidir.
Spesifik olarak, mevcut bulus etken madde olarak DLL3 proteinine baglanan bir antikoru içeren bir farmasötik kompozisyon saglamaktadir ki burada antikor sitotoksik bir aktiviteye sahiptir. Bir düzenlemede, farmas'otik kompozisyon hücre büyüme inhibit'orü, 'özellikle bir antikanser ajanidir. Tercih edilen sekliyle, mevcut bulusun hücre büyüme inhibitörü ve antikanser ajani, akciger kanseri olan ya da muhtemelen akciger kanseri olan bir hastaya uygulanmaktadir.
Mevcut bulusun farmas'otik kompozisyonunda kullanilan anti-DLL3 antikoru (örnek olarak antikanser ajan), bilhassa sinirlandirilmamistir ve örnek olarak yukarida tarif edilen ve sitotoksik aktiviteye sahip olan anti-DLL3 antikorlarinin herhangi biri kullanilabilir.
Mevcut bulusun farmasötik kompozisyonunda kullanilan anti-DLL3 antikoru (örnek olarak antikanser ajan), bilhassa sinirli degildir ve örnek olarak yukarida tarif edilen anti-DLLS antikorlarinin herhangi biri kullanilabilir.
Mevcut bulusun farmasötik kompozisyonu, bir etken madde olarak bir sitotoksik madde ile konjuge edilmis anti-DLL3 antikorunu içerebilir. Bu farmasötik kompozisyon, örnek olarak hücre büyüme inhibitörü, özellikle bir antikanser ajani olarak kullanilabilir. Tercih edilen sekliyle, hücre büyüme inhibitörü ve antikanser ajan, kanseri olan ya da muhtemelen kanseri olan bir hastaya uygulanmaktadir.
Mevcut bulusta «bir etken madde olarak sitotoksik madde ile konjuge edilmis anti- DLL3 antikorunu içeren» ifadesi, ana bir etken madde olarak sitotoksik madde ile konjuge edilmis anti-DLL3 antikorunu içeren ve sitotoksik madde ile konjuge edilmis anti-DLL3 antikorunun içerigini sinirlamayan anlamina gelmektedir.
Mevcut bulugun farmasötik kompozisyonu ile hedeflenen hastalik kanser oldugunda, hedeflenen kanser ve akciger kanseri, özellikle küçük hücreli akciger kanseridir.
Kanser birincil odaklardan ve metastatik odaklardan herhangi biri olabilir.
Mevcut bulusun farmasötik kompozisyonu, hastaya oral ya da parenteral olarak uygulanabilir. Parenteral uygulama tercih edilmektedir. Böyle bir uygulama yönteminin spesifik örnekleri, enjeksiyon, transnazal, pulmoner ve transdermal uygulamalari içermektedir. Enjeksiyon uygulamasinin örnekleri, mevcut bulusun farmasötik kompozisyonunun sistemik ya da lokal olarak uygulanabilecegi intravenöz, intramüsküler, intraperitoneal ve subkütan enjeksiyonlari içermektedir.
Ayrica, uygulama yöntemi hastanin yasina ya da semptomlarina bagli olarak uygun sekilde seçilebilir. Mevcut bulusun farmasötik bilesiminin dozu, örnek olarak vücut agirligi kg'i basina dozaj 0.0001 mg ila 1000 mg arasindaki bir doz araliginda araliktan seçilebilir. Bununla birlikte, mevcut bulusun farmasötik kompozisyonu, bu dozlar ile sinirli degildir.
Mevcut bulusun farmasötik kompozisyonu, standart bir yönteme (örnek olarak Remington's Pharmaceutical Science, en son baski, Mark Publishing Company, Easton, ABD) göre formüle edilebilir ve ayrica farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyicilari ve katki maddelerini içerebilir. Bunlara örnek olarak, bunlarla sinirli olmamakla birlikte, surfaktanlar, yardimci maddeler, renklendirici ajanlar, aroma ajanlari, koruyucular, stabilize ediciler, tamponlar, süspanse edici ajanlar, tonisite ajanlar, baglayicilar, dagiticilar, lubrikanlar, akis promotörleri ve corrigentler dahildir.
Rutin olarak kullanilan diger tasiyicilar uygun sekilde kullanilabilir. Bu tasiyicilarin spesifik örneklerine hafifi susuz silisik asit, laktoz, kristalin selüloz, mannitol, nisasta, karmeloz kalsiyum, karmeloz sodyum, hidroksipropilselüloz, hidroksipropilmetilselüloz, polivinil asetal dietilaminoasetat, polivinil pirolidon, jelatin, orta zincirli yag asidi trigliserit, polioksietilen hidrojen eklenmis hint yagi 60, beyaz seker, karboksimetilselüloz, misir nisastasi ve inorganik tuzlar dahildir.
DLL3 ekspres eden hücrelerle temas halinde, mevcut bulusun bir farmasötik kompozisyonunda bulunan anti-DLL3 antikoru, DLL3 ekspres eden hücrelere zarar verebilir veya bunlarin büyümesini engelleyebilir. Anti-DLL3 antikorunu kullanan böyle bir yöntem de mevcut bulusun kapsamina dahil edilmektedir. Kullanilan antikor bilhassa sinirli degildir ve örnek olarak yukarida tarif edilen antikorlardan herhangi biri kullanilabilir. Anti-DLL3 antikorunun baglandigi hücreler, hücreler DLL3 ekspres ettikleri sürece bilhassa sinirli degildir. Mevcut bulusta, DLL3 ifade eden hücreler tercih edilen sekliyle kanser hücreleridir, daha tercih edilen sekliyle akciger kanseri hücreleri, özellikle tercih edilen sekliyle küçük hücreli akciger kanseri hücreleridir. in vitro olarak antikor ilave edilmesi ile gerçeklestirilmektedir. “Temas” ayni zamanda, vücutlarinda DLL3 ekspres eden hücrelerle implante edilen insan disi hayvanlara ya da endojen olarak DLL3 ekspres eden kanser hücrelerine sahip olan hayvanlara anti- DLL3 antikoru uygulanmasiyla da gerçeklestirilmektedir.
Asagida gösterilen yöntemler, tercih edilen sekliyle, DLL3 ekspres eden hücrelerde anti-DLL3 antikorunun temasi ile ortaya çikan sitotoksisitenin degerlendirilmesi ya da tespit edilmesi için kullanilmaktadir. Sitotoksik aktiviteyi in vitro degerlendirmek ya da tespit etmek için yöntemlerin örnekleri, yukarida tarif edilen ADCC veya CDC aktivite analizini içerebilir. Anti-DLL3 antikorunun bir ADCC aktivitesine sahip olup olmadigi ya da bir CDC aktivitesine sahip olup olmadigi, teknik alanda bilinen bir yöntem ile belirlenebilir (örnegin, Current protocols in lmmunology, Chapter 7. Immunologic studies in humans, Editor, .John E, Coligan ve ark., John Wiley & Sons, lnc., (1993)). Aktivite analizinde, anti-DLL3 antikorununkine benzer bir izotipe sahip olan ve hücrelere baglanmayan antikorlar, anti-DLL3 antikorunda oldugu gibi kontrol antikorlari olarak kullanilmaktadir. Anti-DLL3 antikoru kontrol antikorlarininkinden daha güçlü bir sitotoksik aktivite sergilediginde, anti-DLL3 antikorunun aktiviteye sahip oldugu belirlenebilir.
Bir antikorun izotipi, bu antikorun amino asit dizisinde agir zincir sabit bölgesinin dizisine dayali olarak tanimlanmaktadir. Antikor izotipi, in vivo olarak antikor üreten B hücrelerinin olgunlasmasi sirasinda kromozom üzerindeki genetik rekombinasyonun neden oldugu sinif degisimine bagli olarak belirlenmektedir.
Izotipteki fark, antikorlarin fizyolojik/patolojik fonksiyonlari arasindaki farki yansitmaktadir. Spesifik olarak, örnek olarak sitotoksik aktivitenin siddetinin sadece antijen ekspresyon seviyelerinden degil, ayni zamanda antikor izotipleri tarafindan da etkilendigi bilinmektedir. Bu nedenle, yukarida tarif edilen sitotoksit aktivite analizi için, kontrol olarak kullanilan antikorlarin, analit antikorununkine özdes bir izotipe sahip olmasi tercih edilir.
Buna ek olarak, in vivo olarak sitotoksik aktivitenin degerlendirilmesi ya da tespit edilmesi için, örnek olarak DLL3 ekspres eden kanser hücreleri, insan olmayan test hayvanlarina intradermal ya da subkütan olarak nakledilmektedir. Daha sonra, analit antikoru intravenöz ya da intraperitonal olarak günlük olarak ya da uygulama gününden ya da ertesi günden birkaç gün araliklarla uygulanmaktadir. Sitotoksik aktivite, zaman içinde tümör boyutlarinin ölçülmesiyle belirlenebilir. Buna benzer bir izotipe sahip olan kontrol antikorlari, in vitro degerlendirmede ayni sekilde uygulanmaktadir. Anti-DLL3 antikoru uygulanan grup, kontrol antikoru uygulanan gruptan önemli ölçüde daha küçük bir tümör boyutuna sahip oldugunda, anti-DLL3 antikoru, sitotoksik aktiviteye sahip olacak sekilde belirlenebilir. Insan olmayan test hayvani olarak fareler kullanildiginda, tercih edilen sekliyle timüs bezi genetik olarak eksik olan ve dolayisiyla T Ienfositlerin fonksiyonlarindan yoksun olan çiplak (nu/nu) fareler kullanilabilir. Bu farelerin kullanimi, test edilen hayvanlarin sitotoksik aktivitesinin degerlendirilmesinde/tespit edilmesinde test hayvanlarinin endojen T lenfositlerinin katilimini ekarte edebilir.
Teshis ilaci (teshis yöntemi) Ayrica, kanseri teshis etmek için, DLL3 proteinini ya da DLL3 proteinini kodlayan bir genin tespit edilmesini içeren bir yöntem de metinde anilmaktadir. DLL3 ekspresyonunun, kanser dokularinda veya kanser hücre dizilerinde belirgin olarak artmis oldugu teyit edilmistir. Böylece, DLL3, kanserin spesifik tespiti için bir belirteç olarak yararlidir.
Teshis yönteminin spesifik bir örnegi, kanseri teshis etmek için asagidaki adimlari kapsayan bir yöntem içerebilir: (a) test edilen bir hastadan izole edilmis bir numunenin saglanmasi; ve (b) numunede DLL3 proteini veya DLL3 geninin ekspresyon seviyesinin saptanmasi.
Yöntem ayrica, (0) test hastasinin, DLL3 proteininin ya da DLL3 geninin ekspresyon seviyesine dayanarak kansere sahip olma olasiligini degerlendirme adimini da içerebilir.
DLL3 proteininin veya DLL3 proteinini kodlayan genin tespit edilmesi Ayrica, bir numunedeki DLL3 proteininin saptanmasiyla kanserin teshis edildigi bir yöntem de açiklanmaktadir. DLL3 protein tespitinin, DLL3 proteinini taniyan bir antikor kullanilarak yapilmasi tercih edilmektedir.
Tespit kantitatif veya kalitatif tespiti kapsamaktadir. Kalitatif tespit örnekleri asagidaki analizleri içerebilir: - DLL3 proteininin varligini ya da yoklugunu basit bir sekilde belirlemek için analiz, - DLL3 proteininin önceden belirlenmis bir miktarindan daha fazla miktarda varligini veya yoklugunu belirlemek için analiz, - DLL3 proteininin miktarini baska bir numunede (örnek olarak bir kontrol numunesi) bulunanlarla karsilastirmak için analiz.
Bununla birlikte, kantitatif tespitin örnekleri, bir DLL3 protein konsantrasyonunun ölçülmesini ve DLL3 proteininin miktarinin ölçülmesini içerebilir.
Test numunesi, DLL3 proteinini ihtiva etmesi muhtemel oldugu sürece özellikle sinirlandirilmamistir. Spesifik olarak, memeliler gibi canli vücutlardan toplanan numuneler tercih edilmektedir. insanlardan toplanan numuneler daha çok tercih edilmektedir. Test numunesinin spesifik örnekleri arasinda kan, interstisyel sivi, plazma, ekstravasküler sivi, serebrospinal sivi, eklem sivisi, plevral sivi, serum, lenf, tükürük, idrar ve dokular yer almaktadir. Tercih edilen sekliyle numune, canli bir vücuttan toplanan dokularin ya da hücrelerin sabitlendigi bir preparasyon ya da bir hücre kültür ortami gibi, test numunesinden elde edilen bir numunedir.
Teshis edilen kanser, belirli sinirlamalar olmaksizin herhangi bir kanser olabilir.
Spesifik örnekleri arasinda akciger kanserini, özellikle de küçük hücreli akciger kanserini içerebilir. Bu kanserlerin herhangi bir birincil odak noktasi ve metastatik odak noktasi teshis edilebilir.
Test numunesinde protein tespit edildiginde, kanser bir endeks düzeyi ile teshis edilir.
Spesifik olarak, test numunesinde tespit edilen DLL3 protein miktari bir negatif kontrolden ya da saglikli bir bireyinkinden daha büyük oldugunda, test hastasinin kanser oldugu ya da ileride muhtemelen kanser olacagi gösterilmektedir. Spesifik olarak, ayrica, kanseri teshis etmek için asagidaki adimlari içeren, bir yöntem de açiklanmistir: (l) bir test hastasindan toplanan biyolojik bir numunede DLL3 ekspresyon seviyesini tespit etmek, ve (2) adim (1)'de tespit edilen DLL3 ekspresyon seviyesinin bir kontrolünki ile karsilastirilmasi, burada DLL3 ekspresyon seviyesi kontrolünkinden daha yüksek oldugunda, test hastasinin kanserli oldugu belirlenmektedir.
Kontrol, karsilastirma için bir referans numuneyi ifade etmektedir ve saglikli bireylerin negatif kontrollerini ve biyolojik numunelerini kapsamaktadir. Negatif kontroller, saglikli bireylerin biyolojik numunelerinin toplanmasi ve gerekirse bunlarin karistirilmasiyla elde edilmektedir.
Kontrolde DLL3 ekspresyon seviyesi, test hastasinin biyolojik numunesinde DLL3 ekspresyon seviyesinin tespiti ile paralel olarak tespit edilebilir. Alternatif olarak, saglikli bireylerin çok sayida biyolojik numunelerinin DLL3 ekspresyon seviyesi, saglikli bireylerde standart ekspresyon seviyesini istatistiksel olarak belirlemek için Önceden tespit edilebilir. Spesifik olarak, örnek olarak ortalama ± 2 x standart sapma (S.S) ya da ortalama ± 3 x standart sapma (SS) verileri de standart deger olarak kullanilabilir. Istatistiksel olarak, ortalama ± 2 x standart sapma (8.8) ve ortalama ± 3 x standart sapma (SS), sirasiyla saglikli bireylerin % 80'nini ve % 90!nini kapsamaktadir.
Alternatif olarak, kontrolde DLL3 ekspresyon seviyesi bir ROC egrisi kullanilarak ayarlanabilir. ROC egrisi ya da alici isletin karakteristik egrisi, ordinatta saptama hassasiyetini ve absiste yalanci pozitiflik oranlarini (yani “1-spesifiklik”) gösteren bir grafiktir. ROC egrisi, biyolojik numunelerde DLL3 ekspresyon seviyesinin tespit edilmesi için bir dizi degisken referans degerinde hassasiyetteki ve yalanci pozitiflik oranindaki degisikliklerin çizilmesi ile elde edilebilir.
ROC egrisini elde etmek için “referans deger”, istatistiksel analiz için geçici olarak kullanilan sayisal bir degerdir. Genel olarak, ROC egrisini elde etmek için «referans deger» tüm seçilebilir referans degerlerini kapsayabilecek bir aralik içinde seri olarak degisir. Ornek olarak, referans degeri analiz edilen popülasyonda ölçülen minimum ve maksimum DLL3 degerlerin arasinda degisebilir.
Istenilen tespit hassasiyetini ve kesinligini sunmasi beklenen standart bir deger, elde edilen ROC egrisine bagli olarak seçilebilir. ROC egrisine ya da benzerine dayanan istatistiksel olarak belirlenen standart deger bir esik degeri olarak da adlandirilmaktadir. Esik degerine dayanarak kanseri tespit etmek için bir yöntemde, yukarida tarif edilen adim (2), adim (1)*de tespit edilen SLLS ekspresyon seviyesinin esik degeri ile karsilastirmasini içermektedir. Daha sonra, adim (1 )de tespit edilen DLL3 ekspresyon seviyesi esik degerinden daha yüksek oldugunda, test hastasinda kanser teshis edilmektedir.
DLL3'ün ekspresyon seviyesi, rastgele seçilmis bir yöntemle belirlenebilir. Spesifik olarak, DLL3"un ekspresyon seviyesi, DLL3 mRNA miktarinin, DLL3 protein miktarinin ya da DLL3 proteininin biyolojik aktivitesinin degerlendirilmesi ile tespit edilmektedir. DLL3 mRNA ya da protein miktari, mevcut spesifikasyonda tarif edildigi gibi bir yöntem ile tespit edilebilir.
Test edilen hasta özellikle tercih edilen sekliyle bir insandir. Test numunesi olarak insan olmayan bir hayvan kullanildiginda, tespit edilecek olan DLL3 proteini bu hayvan türünden t'uretilmektedir.
Test numunesinde bulunan DLL3 proteinini tespit etmek için bir yöntem, özellikle sinirlandirilmamistir ve tercih edilen sekliyle, asagida örneklendigi gibi anti-DLL3 antikorunun kullanildigi bir imm'unolojik tespit yöntemidir: Enzime bagli immünosorbent analizi (ELISA), radyoimmünanaliz (RlA), enzim immunanaliz (ElA), floroimmünoanaliz (FlA), immünopresipitasyon (IP), türbidimetrik immünanaliz (TIA) Western blot (WB), immünohistokimyasal (lHC) yöntem, tek radyal immünodifüzyon Bu yaklasimlar arasinda, immünohistokimyasal (lHC) yontem kanserin teshisi için tercih edilen bir immünolojik analiz yöntemidir, kansere sahip bir hastadan elde edilen dokularin ya da hücrelerin sabitlendigi bölümlerde DLL3 proteinlerinin tespit edilmesi adimini içermektedir. Immünohistokimyasal (lHC) yöntem gibi yukarida tarif edilen immünulojik yöntemler, genel olarak teknik alanda uzman kisiler tarafindan bilinmektedir.
DLL3, ekspresyonu kanser hücresine özgü bir sekilde artan bir membran protein oldugundan, kanser hücreleri ya da kanser dokulari anti-DLL3 antikoru kullanilarak tespit edilebilir. Canli vücutlardan toplanan hücrelerde ya da dokularda bulunan kanser hücreleri, immünohistolojik analiz ile tespit edilmektedir.
Kanser dokulari ayrica anti-DLL3 antikoru kullanilarak in vivo olarak da tespit edilebilir. Bu yöntem spesifik olarak su adimlardan olusur:(1) bir test hastasina, DLL3 proteinine baglanan bir isaretleme materyali (örnek olarak radyoizotop) isaretli antikor uygulamak ve (2) isaretleme materyalinin birikimini tespit etmek. Antikor, canli vücuduna uygulanan antikorun izlenmesi için, tespit edilebilir bir sekilde isaretlenebilir. Örnek olarak, antikor bir floresan ya da Iuminesan materyal ya da bir radyoizotop ile isaretlenebilir ve onun in vivo hareketi takip edilebilir. Floresan ya da kullanilarak gözlenebilir. Antikorun lokalizasyonu, radyoizotopun radyoaktivitesinin izlenmesi ile görüntülenebilir. Anti-DLL3 antikorunun in vivo lokalizasyonu, kanser hücrelerinin varligini temsil etmektedir.
Pozitron yayan bir nüklit, in vivo kanser tespiti için antikor isaretlenmesinde 768r, 8QZr ve 124l gibi bir pozitron yayan nüklit ile isaretlenebilir. Teknik alanda yayan nüklitler ile isaretlenmesinde kullanilabilir.
Pozitron yayan nüklit ile isaretlenmis anti-DLL3 antikoru insanlara ya da hayvanlara uygulanmaktadir. Daha sonra, radyonüklid tarafindan yayilan radyasyon, PET (pozitron emisyon tomografisi) kullanilarak müdahalesiz olarak ölçülür ve bilgisayarli tomografik yaklasim ile görüntülere dönüstürülür. PET aparati, in vivo ilaç davranisi ya da benzeri ile ilgili verileri müdahalesiz bir sekilde elde etmek için tasarlanmistir.
PET, sinyal yogunlugu olarak radyasyon yogunlugunu nicel olarak görüntüleyebilir.
PET'in bu sekilde kullanilmasiyla, özellikle kanserde yüksek oranda ekspres edilen antijen molekülleri, hastalardan numune alinmadan tespit edilebilir. Anti-DLL3 pozitron yayan nüklit kullanilarak kisa ömürlü bir nüklit ile radyo- isaretlenebilir.
Ornek olarak, tibbi siklotron ve yukarida tarif edilen nüklitler kullanilarak kisa ömürlü nüklitlerin üretilmesi ya da kisa ömürlü radyo isaretleme bilesiklerinin üretilmesi tekniklerine iliskin arastirma ve gelistirme çalismalari yapilmistir. Anti-DLL3 antikoru, bu tekniklerle çesitli radyoizotoplar ile isaretlenebilir. Hastalara uygulanan anti-DLL3 antikoru, her bir bölgedeki patolojik dokular için anti-DLL3 antikorunun özgüllügüne göre birincil odaklarda ve metastatik odaklarda birikmektedir. Anti-DLL3 antikoru pozitron yayan nüklit ile isaretlendiginde, radyoaktivitenin Iokalizasyonuna bagli olarak birincil odaklarin ve metastatik odaklarin varligini saptamak için radyoaktivitesi tespit edilebilir. Tanisal kullanim için 25 ila 4000 keV'lik gama radyasyonu ya da pozitron emisyonunun aktif bir degeri kullanilabilir. Ayrica, uygun bir nüklit seçilmesi ve seçilen nüklidin daha büyük miktarlarda verilmesiyle de terapötik etki beklenebilir.
Radyasyona atfedilen antikanser etkisinin elde edilmesi için 70 ila 700 kthlik bir gama radyasyonu ya da pozitron emisyon degeri saglayan bir nüklit kullanilabilir.
DLL3 proteinini kodlayan polinükleotitin tespit edilmesi Yöntemin alternatif bir yönünde, DLL3 polinükleotid ekspresyonu tespit edilmektedir. Tespit edilen polinükleotid bilhassa sinirli degildir ve tercih edilen sekliyle mRNAidir. Tespit kantitatif veya kalitatif tespiti kapsamaktadir. Kalitatif tespit örnekleri asagidaki analiz prosedürlerini içerebilir: - DLL3 mRNAinin varligini ya da yoklugunu basit bir sekilde tespit etmek için analiz, - DLL3 mRNAinin önceden belirlenmis bir miktarindan daha fazla miktarda varligini veya yoklugunu belirlemek için analiz ve - DLL3 mRNAinin miktarini baska bir numunede (örnek olarak bir kontrol numunesi) bulunanlarla karsilastirmak için analiz.
Bununla birlikte, kantitatif tespitin örnekleri, bir DLL3 mRNA konsantrasyonunun ölçülmesini ve DLL3 mRNA miktarinin ölçülmesini içerebilir. Test numunesi olarak DLL3 mRNA'sini ihtiva etme olasiligi bulunan rastgele seçilmis bir numune kullanilabilir. Memeliler gibi canli vücutlardan toplanan numuneler tercih edilmektedir. insanlardan toplanan numuneler daha çok tercih edilmektedir. Test numunesinin spesifik örnekleri arasinda kan, interstisyel sivi, plazma, ekstravasküler sivi, serebrospinal sivi, eklem sivisi, plevral sivi, serum, lenf, tükürük, idrar ve dokular yer almaktadir. Tercih edilen sekliyle numune, canli bir vücuttan toplanan dokularin ya da hücrelerin sabitlendigi bir preparasyon ya da bir hücre kültür ortami gibi, test numunesinden elde edilen bir numunedir. Bu numuneler, test numunesi tarafindan kapsanmaktadir.
In situ hibridizasyon tercih edilen sekliyle, test numunesinden elde edilen numune için, örnegin bir canli vücuttan toplanan dokularin veya hücrelerin sabitlendigi bir preparasyon veya bir hücre kültür ortami için kullanilir. In situ hibridizasyon, hücreler ya da dokularda belirli DNA ya da RNA'nin varligini ya da yoklugunu ya da dagilimini ve ekspresyonunun siddetini dogrulamak için bir yaklasim olarak gelistirilmistir. Bu yöntem, hücre içi 'özel bir nükleik asit dizisine tamamlayici olan bir nükleotid dizisine sahip olan bir prob nükleik asidin spesifik olarak bir kompleks olusturma 'özelligine sahip oldugu prensipleri kullanmaktadir. Prob önceden bir radyoizotop (RI), bir antijenik madde (hapten) ya da benzeri ile isaretlenir. Sonuç olarak, hibridizasyon bölgesi isaretin saptanmasiyla ayiit edilebilir. Dolayisiyla in situ hibridizasyon, 'örnek olarak hücre içi DNA ya da RNA'nin ya da benzerlerinin tespitinde kullanilmaktadir.
Tercih edilen sekliyle, prob isaretleme için Rl kullanilabilir. Ornek olarak, biyotin ya da hapten (örnek olarak digoksigenin) gibi radyoaktif olmayan bir maddeyle floresan isaretleme daha tercih edilen sekliyle kullanilabilir. Ornek olarak FISH olarak adlandirilan floresan in situ hibridizasyon ile bir tespit yöntemi 'özellikle tercih edilen sekliyle kullanilmaktadir.
Teshis edilen kanser akciger kanseri, 'özellikle de küçük hücreli akciger kanseridir. Bu kanserlerin herhangi bir birincil odak noktasi ve metastatik odak noktasi teshis edilebilir.
Test hastasi olarak DLL3 genini ekspres eden rastgele seçilmis bir hayvan türü kullanilabilir. Test edilen hasta Özellikle tercih edilen sekliyle bir insandir. Test numunesi olarak insan olmayan bir hayvan kullanildiginda, tespit edilecek olan DLL3 geni bu hayvan türünden türetilmektedir.
Asagida, teshis yönteminin spesifik bir yönü tarif edilmektedir. Ilk olarak, bir test hastasindan bir numune hazirlanmaktadir. Daha sonra, numunede bulunan DLL3 mRNA tespit edilmektedir. Mevcut bulusta, mRNArdan sentezlenen cDNA da ayrica tespit edilebilmektedir. Test numunesinde DLL3 mRNA ya da DLL3 kodlayan cDNA tespit edildiginde, test hastasinda muhtemelen kanser teshis edilmektedir. Ornegin, test hastasinda tespit edilen DLL3 mRNA ya da DLL3 kodlayan cDNA miktari, negatif kontrollerde ya da saglikli bireylerde tespit edilenden daha büyükse, test hastasinin kanserli oldugu ya da yüksek olasilikli gelecekte kanser olacagi gösterilmektedir. mRNA,yi tespit etmek için bir yöntem, teknik alanda bilinmektedir. Kullanilabilecek yöntemin spesifik örnekleri arasinda sunlar bulunmaktadir: gen çipleri, cDNA dizileri ve membran filtrelerden seçilen bir kati faz 'üzerinde hareketsizlestirilmis numuneler kullanilarak nükleik asit hibridizasyonu; PT-PCR; gerçek zamanli PCR; çikarimli yöntem; diferansiyel gösterim yöntemi; diferansiyel hibridizasyon ve çapraz hibiridizasyon.
Bu bulusun tespit yöntemi çesitli otomatik dedektörler kullanilarak otomatiklestirilebilir. Bu tür bir otomasyon, çok sayida numunenin kisa sürede algilanmasini saglar.
Kanser teshisi için kit Ayrica, bir test numunesindeki DLL3 proteinini tespit etmek için bir reaktif içeren, bir teshis ilaci ya da kanser teshisi için bir kit tarif edilmektedir. Teshis ilaci, en azindan anti-DLL3 antikorunu içermektedir.
Kanser teshisi için reaktif, kanser teshisi için bir kit hazirlamak için DLL3 saptamasinda kullanilan diger faktörlerle birlestirilebilir. Spesifik olarak ayrica, DLL3ie baglanan bir antikor ve antikorun DLL3te baglanmasinin saptanmasi için bir reaktif ve ayrica, DLL3 içeren bir biyolojik numune içeren bir kontrol numunesini içeren bir kanser teshis kiti açiklanmaktadir. Analiz prosedürlerinin talimati için bir el kitabi da kite dahil edilebilir.
Ornekler Buradan sonra, mevcut bulus, Orneklerin referansi ile daha spesifik olarak açiklanmaktadir. Bununla birlikte, mevcut bulusun bu örnekler ile sinirli olmasi amaçlanmamaktadir. transkripsiyonu Klinik kanserlerde, kanser hücre dizilerinde ve çesitli normal organlarda insan DLL3 mRNAtsinin gen ekspresyon dagilimi, Human Exon kullanilarak analiz edilmistir. Ekspresyon analizinde kullanilan toplam RNAilar, 13 olguda küçük hücreli kanser dokularindaki, 3 tip küçük hücreli kanser hücre dizisindeki ve 49 tip normal dokulardaki tümör bölgelerinden elde edilmistir (Clontech Laboratories, Inc., Ambion, Inc., Stratagene Corp., Cell Applications, Inc., Panomics, dokularindaki ve kanser hücre dizilerindeki (ATCCtden satin alinmistir) tüm tümör bölgeleri, ürüne dahil edilen protokole göre Trizol (Invitrogen Corp.) kullanilarak toplam RNA ekstraksiyonuna tabi tutulmustur.
Gen ekspresyonu analizinin deneyi, GeneChip Whol Transcript (WT) Sense Target Labeling Assay Manual (Affymetrix, Inc.)!a göre elde edilen her bir toplam RNAinin 1 pg'i kullanilarak gerçeklestirilmistir. Human Exon 1.0 ST Array Verileri, Affymetrix Inc. tarafindan temin edilen ExACT(Exon Array Computational Tool) yazilimi kullanilarak sayisallastirilmistir.
Human Exon 1.0 ST Array üzerinde DLL3 için 13 çekirdek prob seti ayarlanmistir.
Ekspresyon degerlerinin ortalamasi, bu prob ayarlarindan tespit edilmistir ve sokular arasinda gen ekspresyon seviyesi karsilastirilmistir. Normal dokulardan, izole edilmis küçük hücreli akciger kanseri dokularindaki tümör bölgelerinden ve küçük hücreli akciger kanseri hücre dizilerinden elde edilen ekspresyon verileri Sekil 1tde gösterilmektedir.
Fetal beynin disindaki normal dokularla karsilastirildiginda, izole edilmis küçük hücreli akciger kanseri tümör bölgelerinde ve küçük hücreli akciger kanseri hücre dizilerinde insan DLL3 gen ekspresyonunun belirgin sekilde arttigi bulunmustur. Bu sonuçlar, insan DLL3iü moleküler bir sekilde hedefleyen bir antitümör ajani kullanilarak, yani normal dokulara zarar vermeden tümörün boyutunu küçültme olasiligi olan terapinin etkililigini vaat etmektedir.
DIZI ID NO: 1 ve 57tde ifade edilen insan DLL3 cDNAisi (NM_O16941) bir insan fetal beyni cDNA kütüphanesinden PCR ile büyütülmüs ve memeliler için pMCN ekspresyon vektörlerine klonlanmistir. pMCN vektörü, bir fare CMV promotörünün (Gen Bankasi: U68299) kontrolü altinda yabanci bir genin ekspresyonunu elde etmektedir. pMCN vekt'orü bir Geneticin direnç genine sahiptir. Bir CHO hücre dizisi DG44 (Invitrogen Corp.) insan DLL3 ekspresyon vektörü ile dönüstürülmüstür. Ilaç dirençli hücreler, Geneticin varliginda seçilmistir. Insan DLL3 proteinini kararli bir sekilde ekspres eden klonlanmis hücreler, insan DLL3 / DG hücrelerini olusturmak Için ticari olarak temin edilebilen anti-DLL3 antikorlari (R&D Systems, Inc., MAB4315) kullanilarak seçilmistir.
Benzer sekilde, bir fare IL-3re bagimli pro B hücre dizisi Ba/F3, insan DLL3/BaF3 hücrelerini olusturmak için insan DLL3 ekspresyon vektörüne dönüstürülmüstür.
CDNA kütüphanesinden PCR ile büyütülmüs ve memeliler için pMCN ekspresyon vektörlerine klonlanmistir. Bir hücre dizisi Ba/F3, fare DLL3 ekspresyon vektörü ile dönüstürülmüstür. Ilaç dirençli hücreler, Geneticin varliginda seçilmistir. Fare DLL3 proteinini ekspres eden hücreler, fare DLL3/BaF3 hücrelerini kurmak için ticari olarak temin edilebilen antikorlar (R&D Systems, Inc., MAB4315) kullanilarak seçilmistir. dalak CDNA kütüphanesinden PCR ile büyütülmüs ve memeliler Için pMCN ekspresyon vektörlerine klonlanmistir. Bir hücre dizisi Ba/F3, insan DLL1 ekspresyon vektbrü ile dönüstürülmüstür. Ilaç dirençli hücreler, Geneticin varliginda seçilmistir.
Insan DLL1 proteinini ekspres eden hücreler, insan DLL1/BaF3 hücrelerini kurmak için ticari olarak temin edilebilen antikorlar (R&D Systems, Inc., MAB1818) kullanilarak seçilmistir. kanseri hücre dizisi DU4475 cDNA kütüphanesinden PCR ile büyütülmüs ve memeliler için pMCN ekspresyon vektbrlerine klonlanmistir. Bir hücre dizisi DG44, insan Notch1 ekspresyon vektbrü ile dönüstürülmüstür. Ilaç dirençli hücreler, Geneticin varliginda seçilmistir. Insan Notch1 proteinini ekspres eden hücreler, insan Notch1/DG44 hücrelerini kurmak için ticari olarak temin edilebilen antikorlar (GeneTeX Inc., GTX23294) kullanilarak seçilmistir. Çözünür bir DLL3 proteinini ya da bunun N-terminal silme varyant proteinini üreten hücre dizileri, anti-DLL3 antikoru elde edilmesi ve elde edilen antikorlar için epitoplarin belirlenmesi için imünojenlerin elde edilmesi amaciyla hazirlanmistir.
Insan DLL3 hücre disi dizisi bir Notch reseptör baglayici motifli DSL alanindan Bir insan DLL3 hücre disi bölgesinden (DIZI ID NO: 1iin amino asit dizisinde 27-492) ve fare IgG2a antikor sabit bölge dizilerinden olusan, cDNA kodlayan bir kimerik molekül insan DLL3-FC (DIZI lD NO: 5) hazirlanmis ve memeliler için pMCN ekspresyon vektörlerine klonlanmistir. DG44 hücre dizisi, insan DLL3-FC ekspresyon vektörü ile dönüstürülmüstür. Ilaç dirençli hücreler, Geneticin varliginda seçilmistir.
Insan DLL3-FC proteinini yüksek oranda ekspres eden klonlar, insan DLL3-FC üreten DG44 hücrelerini olusturmak için anti-fare antikorlari kullanilarak ELISA ile seçilmistir.
Insan DLL3 hücre disi bölgesinin (DIZI ID NO: 1'in amino asit dizisinde 176-492) kismi bir dizisinden ve fare IgGZa antikor sabit bölge dizilerinden olusan, cDNA kodlayan bir kimerik molekül insan DLL3delta1-Fc (DIZI ID NO: 6) hazirlanmis ve memeliler için pMCN ekspresyon vektörlerine klonlanmistir. DG44 hücre dizisi, insan DLL3-FC ekspresyon vektörü ile dönüstürülmüstür. Ilaç dirençli hücreler, Geneticin varliginda seçilmistir. Insan DLL3deltaldelta1-Fc proteinini yüksek oranda ekspres eden klonlar, insan DLL3delta1-Fc üreten DG44 hücrelerini olusturmak için anti-fare antikorlari kullanilarak ELlSA ile seçilmistir.
Insan DLL3 hücre disi bölgesinin (DIZI ID NO: 1'in amino asit dizisinde 216-492) kismi bir dizisinden ve fare IgG2a antikor sabit bölge dizilerinden olusan, cDNA kodlayan bir kimerik molekül insan DLL3delta2-Fc (DIZI ID NO: 7) hazirlanmis ve memeliler için pMCN ekspresyon vektörlerine klonlanmistir. DG44 hücre dizisi, insan DLL3delta2-Fc ekspresyon vektörü ile dönüstürülmüstür. Ilaç dirençli hücreler, Geneticin varliginda seçilmistir. Insan DLL3deltaZ-Fc proteinini yüksek oranda ekspres eden klonlar, insan DLL3delta2-Fc üreten DG44 hücrelerini olusturmak için anti-fare antikorlari kullanilarak ELlSA ile seçilmistir.
Bir fare DLL3 hücre disi bölgesinden (DIZI ID NO: 2'nin amino asit dizisinde 33-490) ve fare IgG2a antikor sabit bölge dizilerinden olusan, cDNA kodlayan bir kimerik molekül fare DLL3-FC (DIZI ID NO: 8) hazirlanmis ve memeliler için pMCN ekspresyon vektörlerine klonlanmistir. DG44 hücre dizisi, fare DLL3-FC ekspresyon vektörü ile dönüstürülmüstür. Ilaç dirençli hücreler, Geneticin varliginda seçilmistir.
Fare DLL3-Fc proteinini yüksek oranda ekspres eden klonlar, fare DLL3-Fc-üreten DG44 hücrelerini olusturmak için anti-fare antikorlari kullanilarak ELISA ile seçilmistir.
Ilgili her protein, Protein G afinite kolon kromatografisi ve jel filtrasyon kromatografisi ile Fc füzyon proteini üreten hücre dizisinin kültür üst fazindan saflastirilmistir.
Saflastirilmis proteinin konsantrasyonu, standart olarak konsantrasyonu bilinen lgG ile DC protein analizi (Bio-Rad Laboratories, lnc.) kullanilarak tespit edilmistir. internalizasyonunun analizi Alti ila 7 haftalik BaIb/c (Charles River Laboratories Japan, Inc.) ve MRL/MpJJmsSIc- Freudtun bir tam adjuvani (Becton, Dickinson and Company) kullanilarak bir emülsiyon içinde hazirlanmasi ile antijenik proteinler, 0,1 mg insan DLL3-Fc/kafa dozunda subkütan olarak uygulanmistir. Iki hafta sonra, Freud'un tamamlanmamis bir adjuvani kullanilarak hazirlanan bir antijen emülsiyonu, günde bir kez olmak üzere toplam 3 ila 6 kez, 0,05 mg/kafa dozunda subkütan olarak uygulanmistir.
Antijenik proteinlerin 0,05 mgii, serumunda antikor titresinde bir artisa sahip oldugu teyit edilen her bir fareye ayri ayri intravenöz olarak uygulanmistir. Uç gün sonra, dalak hücreleri ekstrakte edilmis ve yaklasik 3:1 hücre sayim oraninda fare miyelom hücreleri P3-X yöntemi ile kaynastirilmistir. Santrifüjleme ile PEG'in uzaklastirilmasindan sonra hücreler, hücre konsantrasyonunu ayarlamak için 1 x HAT ortam takviyesi (Sigma Aldrich Corp.), 0.5 x BM-Condimed H1 Hybridoma klonlama takviyesi (Roche Diagnostics GmbH) ve % 10 fetal sigir serumu içeren bir RPMI1640 ortaminda süspanse edilmistir. Daha sonra, hücreler 96 kuyucuklu bir plakanin her bir kuyucuguna ekilmistir. Hibridom koloni formasyonu onaylanmis ve daha sonra kültür üst fazinda bulunan anti-DLL3 antikorlarinin varligi ya da yoklugu, insan DLL3-Fc ile kaplanmis bir plaka kullanilarak ELISA ile analiz edilmistir. Pozitif kuyucuklarda bulunan hibridom hücreleri, anti-DLL3 antikorlari üreten hibridom dizilerinin olusturulmasi için sinirlayici seyreltme yöntemi ile klonlanmistir. Monoklonal antikorlar, lsoStrip (Roche Diagnostics GmbH) kullanilarak izotiplenmistir.
Her bir IgG monoklonal antikor, Protein G afinite kolon kromatografisi ve tuzdan arindirma islemi ile olusturulan hibridomlarin kültür üst fazlarindan saflastirilmistir.
Saflastirilmis antikorun konsantrasyonu DC protein testi ile tespit edilmistir.
Insan DLL3-Fc, fare DLL3-Fc, insan DLL3-delta1- Fc ve insan DLL3delta2-Fc, bir Nunc immünoplaka üzerinde ayri ayri hareketsizlestirilmistir (439454). Yikandiktan sonra, uygun bir konsantrasyona ayarlanan her bir seyreltilmis antikor çözeltisi buna ilave edilmis ve oda sicakliginda 1 saat inkübe edilmistir. Yikandiktan sonra, uygun bir konsantrasyona ayarlanan her bir seyreltilmis antikor çözeltisi buna ilave edilmis ve oda sicakliginda 1 saat inkübe edilmistir. Reaksiyon çözeltisi plakadan çikarilmistir. Tween 20 içeren TBS ile yikandiktan sonra, alkalin fosfataz isaretli anti- fare IgK antikorlari plakaya ilave edilmis ve 1 saat süreyle inkübe edilmistir. Plaka yikandiktan sonra, bir alkali fosfataz substrat Sigma 104 buna ilave edilmis ve oda sicakliginda inkübe edilmistir. Inkübasyondan sonra absorbans, 405 nm'lik bir dalga boyunda ve 655 nm'lik bir referans dalga boyunda ölçülmüstür. Sonuçlar Sekil 2yde gösterilmektedir. Tüm saflastirilmis antikorlar, doza bagli bir sekilde insan DLL3- olarak temin edilebilen MAB4315 antikoru, fare DLL3-Fc'ye baglanmistir. Ticari olarak temin edilebilen antikor MAB4315, insan DLL3deltal-Fciye baglanmistir. ancak insan DLL3delta2-F0'ye baglanmamistir, epitopunun DSL alaninda bulundugunu ne de insan DLL3deIta2-FC'ye baglanmamistir. Bu nedenle, bu antikorlar için tahmin edilen epitoplar, DIZI ID NO: 1,in amino asit dizisinde 27 ve 175 kalintilari arasinda DLL3deIta1-Fc hem de insan DLL3-delta2- FC'ye baglanmistir, bu antikorlar için epitoplarin DIZI ID NO: 1'in amino asit dizisinde 216-492 kalintilarinda bulundugunu göstermektedir. Tam uzunlukta DLL3 proteininin ve çözünebilir DLL3-Fc füzyon proteininin sematik yapisi ve her bir anti-DLL3 antikoru tarafindan taninan bir alan Sekil 9ida gösterilmektedir.
Her bir monoklonal antikorun bir hücre membrani üzerinde ekspres edilen insan DLL37üne baglanmasi ve hücre membrani üzerindeki bir insan DLL3-monoklonal antikor kompleksinin davranisi akis sitometrisi ile analiz edilmistir. Insan DLL3/BaF3 hücreleri, FACS tamponu (% 1 fetal sigir serumu ve % içinde süspanse edilmistir. 1 x 106 hücre/mltlik hücre süspansiyonu, 4 cC'de 30 dakika boyunca monoklonal antikor (nihai konsantrasyon: 5 ug/ml) ile reaksiyona sokulmustur. Santifüj ve üst fazin uzaklastirilmasindan sonra, hücreler bir kez FACS tamponu ile yikanmistir. FlTC etiketli anti-fare IgG (H+L) antikorlari (Beckman Coulter, Inc.) buna ilave edilmis ve 4 C'de 30 dakika boyunca inkübe edilmistir.
Reaksiyona girmeyen FITC antikorlari santritüj yoluyla uzaklastirilmistir. Daha sonra, hücreler yeniden süspanse edilmis ve bir akis sitometresi FACSCaIibur (Becton, Dickinson and Company) kullanilarak analiz edilmistir. Hücre zarindan DLL3-antikor kompleksinin hareketinin ya da kaybolmasinin analiz edilmesi amaciyla, insan DLL3/BaF3 hücreleri, % 10 fetal sigir serumu (FBS) ve fare IL3 içeren bir RPMI164O kültür ortami içinde süspanse edilmistir. 1 x 106 hücre/ml'lik hücre süspansiyonu, monoklonal antikor (nihai konsantrasyon: 5 ug/ml) ile karistirilmis ve bir C02 inkübatöründe 37 C'de 1 saat ya da 4 saat boyunca reaksiyona sokulmustur.
Reaksiyondan sonra, hücre zarina baglanan antikorun miktari, yukarida tarif edilen ile ayni sekilde asik sitometrisi ile analiz edilmistir. Bir hücre histogram grafiginde floresans yogunlugu degerlerinin geometrik ortalamasi (X Geo Ortalama), FACSCaIibur'da bulunan CELLQuest Pro analitik yazilimi kullanilarak tespit edilmistir. Tüm izole edilmis anti-DLLS monoklonal antikorlari, hücrelerde DLL3'e baglanmistir (Sekil 3 (a)). Antikorun 4 C'deki hücrelerle reaksiyonu, hücre zarindan DLL3-antik0r kompleksinin hücresel alimi gibi membran akiskanligini inhibe etmektedir. Antikorun 37 C'deki hücrelere reaksiyonu, proteaz parçalanmasi ya da benzerinden kaynaklanan DLL3-antikor kompleksinin hücresel alimina ve gölgelemeye (hücre zarindan salim) neden olabilir. 37 C'de 1 saat ya da 4 saat süreyle inkübasyonun bir sonucu olarak hücre zarina baglanan her bir monoklonal antikorun miktari, Sekil 3(b)'de, 4 C'deki ile karsilastirildiginda bagil bir deger olarak gösterilmektedir. 37 C'de inkübasyonun bir sonucu olarak, hücre zarinin yüzeyi azalmistir. Bu sonuçlar, DLL3-antikor kompleksinin internalizasyonunu ya da gölgelendigini göstermektedir. Buna karsi, 37 C'de inkübasyonun bir sonucu olarak, miktari, tam tersine, pek degismemis ya da artmistir.
Nihai sonuç, bu antikorlarin kararli bir sekilde hücre membrani üzerinde bir DLL3 kompleksi seklinde olabildigini göstermektedir.
Hücre yüzeyindeki DLL3 proteininin sayisi, hücre yüzey antijeninin akis sitometrisi ile kantitatif belirlenmesi için bir QlFIKIT (DAKO, FO479) kullanilarak belirlenmistir.
Analiz, içerilen protokole göre bir birincil antikor olarak anti-DLLS antikoru DL303 (nihai konsantrasyon: 5 ug/ml) ile gerçeklestirilmistir. Insan DLL3/BaF3, NCI-H hücrelerinin yüzeylerindeki inhibisyonu ile ADCC aktivitesinin indüklenmesi Her bir anti-DLL3 antikoru, kalsein ile isaretlenmis DLL3-ekspres eden hücrelere karsi antikor bagli hücre aracili sitotoksisite (ADCC) -indükleyici aktivite açisindan incelenmistir. DLL3-ekspres eden insan DLL3/BaF3 ve küçük hücreli akciger kanseri varliginda 90 dakika kültürlenmis, daha sonra santrifüj edilmis ve kalsein isaretli hedef hücreleri hazirlamak için yikanmistir. Hedef hücreler 1 x 104 hücre/kuyucuk olacak sekilde 96 kuyucuklu plakaya ekilmistir (Coster 3799). Ardindan, uygun bir nihai konsantrasyona ayarlanan antikor buna ilave edilmis ve oda sicakliginda 15 dakika inkübe edilmistir. Efekt'or hücreler buna 5 x 104 hücre/kuyucuk olacak sekilde ilave edilmistir. Reaksiyon plakasi, bir 002 inkübat'or'unde 37 cC 'de inkübe edilmistir.
Kullanilan efektör hücreler, bir fare FcyR3- insan FcyR3 kimerik molekülünü ekspres santrifüj edilmis ve her bir oyuktan 100 ul kültür üst fazi toplanmistir. Floresan yogunlugu, ARVO SX (Wallac) kullanilarak ölçülmüstür.
ADCC indükleyici aktivite, asagidaki formüle göre hesaplanmistir: ADCC [%1 = (A - C) / (B - C) x 100, burada A her bir kuyucuktaki floresan yogunlugunu temsil etmektedir; B % 1 nihai konsantrasyonda Nonidet P-40 ile çözünmüs hücrelerin üst fazinda floresan yogunlugunun ortalamasini temsil etmektedir ve C sadece bir ortam takviye edilmis kuyucukta floresan yogunlugunun ortalamasini temsil etmektedir. Ortalama ve standart sapma, her bir deney kosulu altinda üç ölçümden hesaplanmistir. Sekil 4, DLL3/BaF3 hücrelerine karsi 2.5 ug/mlilik nihai konsantrasyonda ilave edilen antikorun ADCC-indükleyici aktivitesini göstermektedir.
ADCC aktivitesi kontrol antikorlari lgG1 ve IgG2ide dogrulamamistir, oysa ADCC indükleyici aktivite DL301, DL306 ve DL312'de dogrulanmistir. Ticari olarak temin edilebilen monoklonal antikor MAB4315'de hiçbir farkli ADCC indükleyici aktivite dogrulanmamistir.
NCI-H1184'e karsi ADCC'yi indükledigini göstermektedir.
Her bir anti-DLL3 monoklonal antikor, bir toksin isaretli anti-fare ikincil antikor Mab- ZAP (Gelismis Hedefleme Sistemi) kullanilarak hücresel alim için degerlendirilmistir.
DLL3/BaF3 hücreleri, 96 kuyucuklu bir plakaya 5 x 103 hücre/kuyucuk olacak sekilde ekilmistir. Ardindan, anti-DLL3 fare monoklonal antikoru ve Mab-ZAP (nihai konsantrasyon: 1 pg/ml) ilave edilmis ve bir 002 inkübatöründe 37 cC'de inkübe edilmistir. Dört gün sonra, buraya Hücre Sayimi Reaktif SF (Nacalai Tesque, Inc.) ilave edilmistir. Absorbans, hücre büyümesini belirlemek için bir mikroplaka okuyucusu kullanilarak 450 nm'de ve 620 nm'lik bir kontrol dalga boyunda ölçülmüstür (Sekil 6). Anti-DLL3 monoklonal antikorunun ve Mab-ZAP'nin hücrelere ilave edilmesi, hücre büyümesini inhibe etmistir. Bir ADCC indükleyici aktiviteye sahip oldugu teyit edilen DL301, DL306 ve DL312 antikorlari, hücrelerle karistirildiktan ve 37 C'de kültürlendikten sonra DLL3 ifade eden hücrelerde büyük miktarlarda kalmistir ve Mab-ZAP kompleksinin hücresel alimindan kaynaklanan düsük büyüme engelleyici etki sergilemistir. hazirlanmasi Bir Smart 5,-RACE cDNA kütüphanesi (Clontech Laboratories, Inc.), her bir anti-DLL3 antikorunu üreten toplam hibridom RNA'Iarindan hazirlanmistir. Toplam RNA preparasyonu RNeasy Mini kolonu (Qiagen) kullanilarak yapilmistir. CDNA kütüphane hazirliginda, üreticinin talimatini takip edilmistir. Antikor degisken bölgelerini (VH ve VL) kodlayan diziler, antikor sabit bölgelerini kodlayan dizilere tamamlayici primerler kullanilarak PCR ile saglamlastirilmistir. Böylece PCR ile amplifiye edilen parçalar pCR2.1TOPO'ya klonlanmis ve dizilenmistir. Elde edilen VH- ve VL-kodlayan dizileri ve insan lgG1 sabit bölge kodlama dizilerini içeren kimerik antikor ekspresyon vektörleri olusturulmustur. Hafif zincir ve agir zincir kodlayici sekanslarin her ikisi de memeli hücreleri için bir ekspresyon vektörüne dahil edilmis ve bir fare CMV promotörünün kontrolü altinda kopyalanmistir. Tablo 1, tanimlanan antikor degisken bölge dizilerinin DIZI ID Norlarini ve bunlarin CDR dizilerini, tam uzunluktaki fare antikor dizilerini ve kimerik antikor dizilerini göstermektedir.
CDR1 CDR2 CDR3 Degisken bölge zincir (DIZI ID NO: 12) (DIZl lD NO: 13) (DlZl lD NO: 14) Hafif KASQDINSYLI RTNRLVD LQYDEFPFT (DIZI ID NO: 15) zincir (DIZI lD NO: 18) (DIZI lD NO: 19) (DIZI lD NO:20) zincir (DIZI ID NO: 24) (DIZI lD NO: 25) (DIZI lD NO: 26) Hafif RASKSVSTSGYSYMH LASNLES QHSRHLPWT (DIZI ID NO: 27) zincir (DIZI lD NO:33) (DIZI lD NO: 31) (DIZI lD NO: 32) Zincir (DIZI ID NO: 36) (DIZI lD NO: 37) (DIZI lD NO: 38) Hafif KASQNVGTNVA SASYRYS QQYNNYPLT (DIZI lD NO: 39) zincir (DIZI ID NO: 42) (DIZI lD NO: 43) (DIZI lD NO: 44) zincir (DIZI lD NO:48) (DIZI lD NO:49) (DIZI lD NO: 50) Hafif RASQEISDYLS AASTLDS LQYASYPYT (DIZI ID NO: 51) zincir (DIZI ID NO: 54) (DIZI ID NO: 55) (DIZI ID NO: 56) Fare antikor dizisi Kimerik antikor dizisi DL301 Agir zincir (Dizi lD NO: 13) (Dizi lD NO: 11) Hafif Zincir (DIZI lD NO: 15) (DIZl ID NO: 17) DL306 Agir zincir (DiZi ID NO: 22) (DiZi lD NO: 23) Hafif zincir (DIZI lD NO: 28) (DIZl ID NO: 29) DL309 Agir zincir (DiZi ID NO: 34) (DiZi ID NO: 35) Hafif zincir (DIZI lD NO: 40) (DIZl lD NO: 41) DL312 Agir zincir (DiZi ID NO: 46) (DiZi ID NO: 47) Hafif zincir (DIZI lD NO: 52) (DIZl ID NO: 53) CCS-7 hücreleri, her bir kimerik antikor ekspresyon vektörü ile transfekte edilmis ve kimerik antikoru geçici olarak ekspres etmesine izin verilmistir. COS-Tnin kültür üst fazindaki kimerik antikorun, insan DLL3 proteinine baglandigi akis sitometrisi ve ELISA ile teyit edilmistir. konsantrasyonu, sandviç ELISA ile hesaplanmistir.
COS-7'nin kültür süpernatanindaki kimerik antikor Bu konsantrasyonda hesaplamasinda, konsantrasyonu için bilinen bir insan kimerik antikoru standart olarak kullanilmistir. Kimerik antikor (nihai konsantrasyon: 1 tig/ml), bir FACS tamponu (% 1 fetal sigir serumu içeren PBS) içinde süspanse edilen insan DLL3/BaF3 hücrelerine ilave edilmistir. 4 “C'de 30 dakika boyunca inkübasyondan ve yikandiktan sonra, hücreler FITC isaretli anti-insan antikorlari (Beckman Coulter, Inc.) ile reaksiyona sokulmus ve kimerik antikorun baglanmasi bir akis sitometresi FACSCalibur kullanilarak analiz insan DLL3/BaF3'e baglanmistir. Kimerik antikorlarin hiçbiri, zorla ifade edilen hücrelerin bir ana dizisi olan Ba/F3 hücrelerine baglanmamistir. Insan DLL3-Fc, bir Nunc imm'unoplaka 'üzerinde immobilize edilmis ve her kimerik antikorun immobilize proteine baglanmasi analiz edilmistir. Antijen-bagli kimerik antikorlarin tespit edilmesi için, buraya kimerik antikor ilave edilmis ve alkalin fosfataz isaretli anti-insan antikorlari (Biosource, AHI0305) ve bir alkalin fosfataz substrati Sigma 104, bu siraya ilave edilmistir.
Fc'ye doza bagli bir sekilde baglanmistir (Sekil 8(a)).
Bir kimerik antikorun ve antijen molekülüne baglanma için bir fare antikorunun rekabeti, ELISA ile analiz edilmistir (Sekil 8 (b)). 10 ng/kuyucuk insan DLL3-Fc, bir Nunc imm'unoplakasina ilave edilmis ve bunun 'üzerinde hareketsizlestirilmistir.
Kimerik antikorun ve uygun seyreltmede fare antikorunun bir karisimi (nihai konsantrasyon: 50 ng/ml), DLL3-Fc protein immobilize edilmis plakaya ilave edilmistir. Plaka oda sicakliginda 1 saat boyunca ink'übe edilmis ve ardindan yikanmistir. Alkalin fosfataz isaretli anti-insan antikorlari buna ilave edilmis ve ink'übe edilmistir. Ink'übasyondan sonra, Sigma 104 buna ilave edilmis ve absorbans ölçülmüstür. Kimerik antikorun antijen molekülüne baglanmasi, orijinal fare monoklonal antikorununki ile rekabet etmistir. DL301 fare antikoru disindaki antikorlar, DL301 kimerik antikorunun antijene baglanmasini inhibe etmemistir.
DL312 fare antikoru disindaki antikorlar, DL312 kimerik antikorunun antijene baglanmasini inhibe etmemistir. Bu sonuçlar, DL301 ve DL312'nin ilgili benzersiz epitoplarina baglandigini göstermistir. DL305, DL308 ve DL309 fare antikorlari, DL309 kimerik antikorunun antijene neredeyse ayni seviyede baglanmasini inhibe ederek, bu 3 antikor arasinda bir epitopun ayni oldugunu düsündürmektedir. Bir ADCC indükleyici aktiviteye sahip olan DL306 fare antikorunun, DL301, DL309 ya da DL312 kimerik antikorunun antijene baglanmasini inhibe etmedigi dogrulanmistir. Bu göstermistir. olusturulmasi ve rekombinant antikorun saflastirilmasi CCS-7 hücreleri, DL306 kimerik antikor ekspresyon vektörü ile transfekte edilmis ve kimerik antikoru geçici olarak ekspres etmesine izin verilmistir. COS-7tnin k'ült'ur 'üst fazindaki kimetik antikorun, akis sitometrisi ile insan DLL3 proteinine baglandigi dogrulanmistir. COS-7'nin kültür süpernatanindaki kimerik antikor konsantrasyonu, sandviç ELISA ile hesaplanmistir. Bu konsantrasyonda hesaplamasinda, konsantrasyonu için bilinen bir insan kimerik antikoru standart olarak kullanilmistir.
Kimerik antikor (nihai konsantrasyon: 1 pg/ml), bir FACS tamponu (% 1 fetal sigir serumu içeren PBS) içinde süspanse edilen insan DLL3/BaF3 hücrelerine ilave edilmistir. 4 cC*de 30 dakika boyunca inkübasyondan ve yikandiktan sonra, hücreler FlTC isaretli anti-insan anitkorlari (Beckman Coulter, Inc.) ile reaksiyona sokulmus ve kimerik antikorun baglanmasi bir akis sitometresi FACSCaIibur kullanilarak analiz edilmistir.
Sekil 10*da gösterildigi gibi, kimerik antikor DL306, insan DLL3/BaF3,e baglanmis ve bir parental dizisi olan Ba/F3 hücrelerine baglanmamistir. da DL312 ile transforme edilmistir. ilaca dirençli hücreler, Geneticin varliginda seçilmistir. Insan kimerik antikorunu yüksek oranda ekspres eden klonlar, insan kimerik antikor üreten DG44 hücrelerini olusturmak Için anti-insan antikorlari kullanilarak ELISA ile seçilmistir.
Ilgili her protein, rProtein A afinite kolon kromatografisi ve jel filtrasyon kromatografisi ile insan kimerik antikoru üreten hücre dizisinin kültür üst fazindan saflastirilmistir.
Saflastirilmis proteinin konsantrasyonu, standart olarak konsantrasyonu bilinen IgG ile DC protein analizi (Bio-Rad Laboratories, lnc.) kullanilarak tespit edilmistir. bölge-kodlama dizilerini içeren fare lgG2a antikor ekspresyon vektörü olusturulmustur. Hafif zincir ve agir zincir kodlayici sekanslarin her ikisi de memeli hücreleri için bir ekspresyon vektörüne dahil edilmis ve bir fare CMV promotörünün kontrolü altinda kopyalanmistir. Fukoz tasiyicisinda eksik bir CHO hücre çizgisi Ilaca dirençli hücreler, Geneticin varliginda seçilmistir. Fare IgGZa antikorunu yüksek oranda ekspres eden klonlar, fare düsük fukoz lgG2a antikoru üreten CHO hücreleri olusturmak için anti-fare IgG2a antikorlari kullanilarak ELISA ile seçilmistir. Ilgili her protein, Protein G afinite kolon kromatografisi ve jel filtrasyon kromatografisi ile fare düsük fruktoz IgGZa antikoru üreten hücre dizisinin kültür üst fazindan saflastirilmistir. Saflastirilmis proteinin konsantrasyonu, standart olarak konsantrasyonu için bilinen IgG ile DC protein testi ile belirlenmistir.
Agir zincir (DIZI ID NO: 69) DL301 Hafif zincir (DIZI ID NO: 16) Agir zincir (DIZI ID NO: 70) Hafif zincir (DIZI ID NO: 28) Agir zincir (DIZI ID NO: 71) DL312 Hafif ZInCIr (DIZI ID NO: 52) Insan kimerik ve fare lgG2a rekombinant anti-DLL3 antikorlari, kalsein ile etiketlenmis DLL3-ifade eden hücrelere karsi antikor bagimli hücre aracili sitotoksisite (ADCC) - indükleyici aktiviteleri açisindan incelenmistir. DLL3-ekspres eden insan DLL3/BaF3 ve küçük hücreli akciger kanseri NCI-H hücre dizileri ayri ayri 20 ug/ml santrifüj edilmis ve kalsein isaretli hedef hücreleri hazirlamak için yikanmistir. Hedef hücreler 1 x 104 hücre/kuyucuk olacak sekilde 96 kuyucuklu plakaya ekilmistir (Coster 3799). Ardindan, uygun bir nihai konsantrasyona ayarlanan antikor buna ilave edilmis ve oda sicakliginda 15 dakika inkübe edilmistir. Efektör hücreler buna 5 x 104 hücre/kuyucuk olacak sekilde ilave edilmistir. Reaksiyon plakasi, bir COZ inkübatöründe 37 `C'de inkübe edilmistir. Rekombinant fare düsük fukoz lgG2a antikoru için kullanilan efektör hücreler, bir fare FcyR4-insan FcyRS kimerik molekülü antikor için kullanilan efekt'or hücreler, bir insan FcvR3 molekülünü ekspres eden NK92 hücreleridir. 4 saatlik inkübasyondan sonra, plaka santrifüj edilmis ve her bir oyuktan 100 ul kültür üst fazi toplanmistir. Floresan yogunlugu ARVO SX kullanilarak ölçülm'üst'ur. ADCC ind'ukleyici aktivite, Ornek 4'te açiklanan yöntem ile hesaplanmistir. doza bagli bir sekilde DLL3/BaF3 ve NCl-H1184'e karsi ADCCiyi indükledigini göstermektedir. doza bagli bir sekilde DLL3/BaF3 ve NCI-H1184'e karsi ADCCryi ind'ükledigini göstermektedir.
DIZI LISTESI <110> Forerunner Pharma Research Co., Ltd.; The University of Tokyo <130> PCG-9033WO <160> 71 <170> Patentln version 3.1 <210> 1 <211> 618 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1 12314& HisSer 3.31 5 535151. *v3 @Ege :&sz . 555%& 3313? E155& 1 (425 $33.32 9213* T3515: 1.6133 . 1:!" 1. 's' 3 8;::: Ala Aan Gly Giy Thr Cys Vai Glu Gly Gly Giy Ala His Atg Cys Ser 405 410 415 Cys Ala Leu Gly Phe Gly Gly Arq Asp Cys Axg Glu Arq Ala Asp Pro 420 425 430 Cys Ala &la Arg Pro Cys Ala His Gly Giy Arg Cys Ty: ala His ?ne 435 440 445 Ser Gly Leu Vai Cys Ala Cys Ala Pro Gly Tyr net Giy Ala Arg Cyß 450 455 460 Glu Phe Pro Val His Pro Asp Giy Ala Ser Ala Leu Pro hizi !da Pro 4335': 93%& <210> 2 <211> 585 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Valben 4 IF'EFSEA ?3 5232 9432 *7* 333:& <210> 3 <211> 723 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 3 Met Giy Sex &:9 Cys Ala Leu Ala Leu Ala Val Leu Set Ala Lan Lou Ser Ser Gly Val Phe Glu Leu Lys Leu Gln Glu Phe Gly Leu Lan Giy Ann Aug &en Cya Cya Arg Gly Gly?ne Arg Vai Cya Lan 11451 7 Ekim.. 2 m5& 5,7' = 15133 ,. (%11: 3 ag? ~ rsâwî &mr nßigâg ?kü <210> 4 <211> 2555 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 4 Giy GiyGiy Ala 40;; am Wîjêsßi ArgLya SerAna 55:19?' .'Z'm Proüye (313: v 1555)& .I (511.: r 7:31: .11`i 3 1323:? »332% 1.111% 631.11 11.11% A321. 111115› , 1.45.21.! Asp Ty: Giu Set Ph& Ser Cys Vai Cys Pro Tht Gly Trp Gln Giy Gin 850 855 860 Thr Cys Glu Vai Asp Ile Asn Glu Cys Va1 Lau Sar Pro Cys Arq Kis Gly Ala Se: Cys Gln Asn Thr His Giy Gly Ty: Arq Cys His Cya Gln 885 890 895 900 905 910 Pro Asu Pro Cys His Aan Gly Gly Set Cya ?hr Asp Giy Ile han ?hr 915 920 325 555 55% %5& %: "”5 555 Iüiaâgw.âüg Qgs gü: &yâ @ßi âsg- @@g'îlû.ßßüxgüý ük& @Bi'âgü Egß g :1.2355 ::::55 .55::: 55555› 1%?? 155% 1135 1115 1155 11%& llâö 115% igîü Ser His Prc Cys Gln han Gly Giy Thr Cys neu Asp Leu Pro Asu Thr Tyr Lys Cys Sar Oya Pro Arq Giy Thr Gin Gly Val His Cys Glu Ile han Val Asp Asp Cys Asu Pro Pro Val &sp Pro Val Ser kis Ser Pro Lys Cys Phe Asu Asu Gly rh: Cys Val Asp Giu Val Gly Gly Ty: Sar Cys Thr Cys Pro Pro Gly Phe Vai Gly Glu Arg Oya Glu Giy Rep Va: Asn Glu Cys Leu Sar âsn Pro Cys Asp &15 Arg Giy ?hr Gin Asn Cys Val Gin Axg Val Ann Asp Phe His Cys Glu Cys Arq Ala Giy Bis Thr Giy Arg Arq Cys Glu Ser Vai :le Asn Giy Cys Lys Gly Lys Pro Cys Lyß han Gly Gly Thr Cya Ala Vai Ala Ser &sn Thr Aia avg Giy ?ne Ile Cya Lys Cy8 Pro Ala Giy ?he Giu Gly Ala Thr Cya Glu &sn Asp kia &rg Ses Lev Arç Cys Lev Asn Giy Gly !hr Cys Ile Ser Sex Pro Thr Cys Lan Cyn Lan Gly Pro ?he Thr Giy Gln ?he Pro Ala Ser Ser Pro Cys Leu Giy Giy Asu Asu Gln Gly Thr Cys Glu Pro Thr Sar Giu Ser Pro 1400 iâos 1410 Cys Leu Cys Pro ala Lys Phe han Sly Leu Leu Cya ißgâ iýßg îââê iâüâ legg ;%35 iâêû Lâââ lgüê mga.3ag Üý%›glüig#ü.âgüiügü @ag &km &yâ &gm EH& Eâîg iâßâ igââ üßâg iâââ &âiß ßy& &ün &@@3âgg,$%ü.&$ü ag& @gg âßü~%%g*gßm &gp 135& 15%& iggg ßi& %ßi( ßwg $HH$$E$ mâm,%îß` Elm ?lg !bm &Em &si Zûsg,ßgm yy& ?gm üm@.@iû &gü; &Ey @ag âßâ âßßlâüß 133% 15%& îg'f iîgß ” Eâgß 1735 l?4ü 175ü 1?55 üln His air Gi& Law frp &ha ?:0 1365 :77& Lîâû iîâs E334) 3132“ 11395 :65:53' 3%# E7% ?gr Gün &ssuâsmißßg Mg› :mei: ;5.5355 &is; .%ig ßßü;îü%gîk$% Egg igw'ggl &mm 339 Leu Ser Has 19313 33%; :-1-: 55". <210> <211> <212> 254:) <213> Artificial Sequence (Yapay Dizi) <220> <223> human-mouse chimeric sequence (insan-fare kimerik dizisi) <400> Met Vhl Sor Pro Arq Mat Sar Giy Lau Lou Ser Gln Thr Val Ile Lau 25 30 Gln Ile His Se: ?he Gly `.Pro Cys Ser Ala im; Leu v . 41)“. A_ agiza; &gl '- * %353* 1 . &gm 32:33,& 12'::: Gly› Gly Prag Tr:: hcg ::the 955::- Iyi' Cys Tî'u; &m; !atsin 3.› Gly- ;Ekim ,ârg :Prcii 55' 5' 13%? ;il-311 mâ& fis; 51).& m %15& . 252%; 531%?? ' Is??? ?Sims :::3% &32535; » w& &Kas; gta-»m -s :v : -îjggm.g&gi=M L 61:.: <210> 6 <211> 575 <212> PRT <213> Artificial Sequence (Yapay Dizi) <220> 1.95 90: <223> human-mouse chimeric sequenoe (insan-fare kimerik dizisi) <400> 6 3339:› 14.93%& 1.811 1.8.5923 345% `g` $11.25 3:15& »8150 36: Lgn 343%.? <210> 7 <211> 535 <212> PRT <213> Artificial Sequence (Yapay Dizi) <220> <223> human-mouse chimeric sequence (insan-fare kimerik dizisi) <400> 7 **35331 5351`; di 9-9 Met Vai Lan Ala Ser: Ser Thr Thr Sa:: Ile His TI:: biat. ben ::eu Lev: 1 5 1.0 15 Lan Lan Mat Lan Ala Gln Pro Ala Met Ala Ala Pro Lan Val Cys hrg 25 30 hi& Gly aya Set ?:0 Glu His Giy Phe Cys Glu Gin ?to Gly Glu Ey&Cys 'nur Vai ?ro vai Se:: ..'7 »%&Itîî <210> 8 <211> 718 <212> PRT <213> Artificial Sequence (Yapay Dizi) <220> 611). <223> human-mouse chimeric sequence (insan-fare kimerik dizisi) <400> 8 3.1.3- .3.1.& .11:25: ProGly .5533: 531:::: 3.1..? 41'.` l '5' S- 1.62 ILI .1 _r- 3.1.53 1511:( 1131.917' 1.3,- 8 333%? 81114 4 E KL???- (31;: 345.12" 1331& .7`i ,ws, 5.. 51'i) 3152? 351332 11239” T1214' <210> 9 <211> 121 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9 <210> 10 <211> 464 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10 Met Glu Trp Ser Giy Vai Phe :le Phe Leu Lev Ser Vai ?hr Ala Giy 1 5 10 15 Vai His Ser Gin Vai Gln Lan Gin Gin Ser Giy Ala Asp Leu Vai Arg 25 30 Pro Giy Thr Ser Vai Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ty: Ala ?be 40 45 Thr Asu Tyr Leu Ile Glu Trp :le Lg: Gin Arq Pro Gly Gin Giy Leu 50 5 60 Glu Trv Il& Glg Val Met Aan Pro 613 Ser Glg Glg Thr His Tgr Ser 20513 112% 1 ., »vu-v. 1.111' *1 «1.1.12 i 14- '1. "1. “3.1.
Thr Val Pro Ser Ser Thr Ttp Pro Ser Giu Thr Val Thr Cys &sn Val 210 215 220 Ala His Pro Ala Sa: Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile vai Pro Arg Asp Üye Gly Cya Lys ?ro Cya Il& Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser 245 250 255 val ?ne Ile ?he Pro Pro Lys Pro Lys A5p'Vai Lev Thr Ile Thr Leu 260 265 270 rh: ?rc Lya Vai rhr Cys Val Vai Vai Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro 275 280 285 .ßiu 95;.SLQ.Bh3 gag &:3 Rh& &- @ßy #gg ya& 5;& ya; %2& &h; A2& 2%& &2%Zîâü 3%& El& EE& EE& âüâ,âü$ im& L&&.&&212$$ Es& @üw.âââ 3%& %20 Kââ 3%& 3%. &32 ..2.22 2...& <210> 11 <211> 470 <212> PRT <213> Artificial Sequence (Yapay Dizi) <220> <223> chimeric antibody heavy chain (kimerik antikor agir zinciri) <400> 11 .7% @5; i; .' !is-;î @Karsi 1153'& 3%& îgâ <210> 12 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12 Rss:: Ty:: Lan :na sivi <210> 13 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus 3331& .5535; $31.33 32233 »3.233 33,33 <400> 13 Vai Met kan PID Gly Ser Giy Gly Th: His Ty: Ser Glu Lys ?he Arg <210> 14 <211>12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 14 <210> 15 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 15 SM 4313;' sam* 152%:: ?EMG (5,139 <210> 16 <211> 236 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 16 723::: Sar Asp Ty: Asp Ty: Vai Thr Tyr Ala Met Asp Ty: 3G::: &her Lan GlySar Tyr Gln AspSet ?:0Pro Ser <210> 17 <211> 236 <212> PRT <213> Artificial Sequence (Yapay Dizi) <220> <223> chimeric antibody light chain (kimerik antikor hafif zinciri) <400> 17 Met Asp Met Arc Thr Pro Ala Gln Phe Leu Giy Ile Leu Leu Leu Phe Pro Gly Ile Lys Cys Asp Ile Lys Met ?hr Gin Ser Pro Ser Met Ty: Ala Ser Leu Gly Glu Arq Vai Thr Ile Thr Cys Lys Ala Gin Asp Ile &ön Ser Tyt Lan Il& Trp Phe Gin Ser Pro Lyn Thr Leu Ile Tyr Arg Thr Asu &:9 65 70 75 Pro Ser hcg Phe Ser Gly Ser Giy Sar Gly Gla 119 Se; Ser Leu Giu Ty: Giy Asp Met Giy lie 160 105 Tyr Asp Glu Pha Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly 115 120 Lys Axq Thr Val Ala Ala Pro Sar Val ?he Ila 130 135 Glu Gin Leu Lys Ser Giy Thr Ala Ser Vai Val 145 150 155 Phe Ty: Pro Arg Giu ala Lys Val Gln Trp Lys 165 170 Gln Ser Giy &sn Ser Gln Giu Ser val Thr Giu 180 185 Ser ?hr Ty: Ser Lev Ser Ser Thr Lan Thr Lou 195 ZCO Giu Lys His Lys Val Tyr Ala :ya Glu Vai Thr 210 215 Set Pro Val Thr Lys Ser Phe han Arg Gly Glu 225 230 235 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 18 Lys Aia Ser Sin kap Ile Asn Ser Ty: neu Ile <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 19 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 20 Lan (Sin 'ryr Asp Giu ?ha ?:0 ?ha 'Hiz- <210> 21 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 21 <210> 22 <211> 461 <212> PRT 4 35.511; <213> Mus musculus <400> 22 36:.' (`31 ri 11".) GlyAsp 3.1 _a Kat Gly Trp Ser Trp Ile ?ne Leu ?he Leu Leu Ser Gly ?hr Gly Gly Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Sar Gly ?to Slm Leu Val Lys 25 30 Pro Gly Ala Ser Vai Lya Met Ser Cys Arg Ala Ser Giy ryr Thr ?he 40 45 Thr Asp Tyr Tyr Mat Lya Trp Val Lys Gln Sar His Gly Lys Ser Leu 56 55 60 Giu Trp Ile Gly Asp Ila.Asn Pro Asu Asn Gly Asp Tht ?ne Tyr kan 65 7 `5 83 Çin Lys Phe Lys uly Lys Ala Thr Leu Thr Ile Asp Lys Ser Ser Ser 1.15 ;HIÇ 1.3.5: .'&Äi .tlf a. ., **35'i :33:: .335.3 3.353 ::::3 33.3 :3333. .- i @lu IQQ_gQg n› .::: <210> 23 <211> 467 <212> PRT <213> Artificial Sequence (Yapay Dizi) <220> <223> chimeric antibody heavy chain (kimerik antikor agir zinciri) <400> 23 *Iyi* Tystî 1.214% ÄlaTyr 95“ gßßgâß GluSer E173? 4 i' GlyVai 420 425 430 435 440 445 His Giu Alu Lan His un Sie Ty: Thr Gin by& Ser Iieu Sar Lev. Ser 450 &55 460 <210> 24 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 24 Mp Ty: iy: mt; &ya; <210> 25 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 25 Asp Ile kan Pro han Ran Gly Asp Thr Fhe Ty: Asn Gin Lys Ph& Lys l 5 10 15 <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 26 Rap (513› :msn Ty:: ALL& ?ya Ph& Asp Tyr <210> 27 <211> 111 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 27 Siy Ty: Sa::ya ben !ßu&gg Ph& sacPrs ?al ßiu <210> 28 <211> 238 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 28 . 1,3:: <210> 29 <211> 238 <212> PRT îLagEi: GlyAsp 1%» ISI& :w *w 'emu **w <213> Artificial Sequence (Yapay Dizi) <220> <223> chimeric antibody light chain (kimerik antikor hafif zinciri) <400> 29 <210> 30 <211>15 331:' 6.1.21 <212> PRT (513; 9x1:: 1.5.5 578.1 <213> Mus musculus <400> 30 <210> 31 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 31 305:: .7:i5 (31); Ty:: Se:: Ty:: &et His 3513: . 81.11 24219 3.320 (515' <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 32 Sin ya& Sax.âag His Lan Era xx; &hr <210> 33 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 33 Gin Vai Gin Leu Gln Gln Ser Giy Giy Asp Ser Vai Lys :10 Bar Cya Lys Ala Ala Giy Tyr Ile Giu frp Vai Lys Gin Arg Pro Giy Gly Giu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Lya Gly Lys Ala Sar Phe ?hr Ala Asp Thr Met Gin Lou Ser Ser Lan ?hr Sar Glu Asp Ala hrg Trp Giy Ala Arg Glu Pro Gly ?he 100 105 <210> 34 <211> 462 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 34 GlyAsn s :1 f., ` LanSer GlnCys by: 5811" .:9@i Thr AlaLeu MetTyr Thr <210> 35 <211> 468 <212> PRT <213> Artificial Sequence (Yapay Dizi) <220> <223> chimeric antibody heavy chain (kimerik antikor agir zinciri) <400> 35 LouTyr ( J: `gb-nire' I <210> 36 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 36 <210> 37 <211> 17 Cys Pro` <212> PRT <213> Mus musculus <400> 37 Giu Ile Lan Pro Gly Ser Giy Ser ?hr ?hr ryr Asu Giu Lys Ph& Lys 1 5 10 15 <210> 38 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 38 Tr; Giy ki& Arg Giu Era Giy Ph& ?to Ty: <210> 39 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 39 Asp Iie Val Met Tnr Gin Ser Gin Lys Phe Mat Sor Thr Ser Val Giy 1 5 10 15 Asp Arg Vai Ser Vai ?hr Cya Ly: Ala Ser Gin Asn Val Gly Thr &an 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Ala Leu Ile 40 45 Ty: Ser Aia Ser Tyr Arg Tyr Ser Giy Val Pro Asp Arg ?he Thr Giy` 50 55 50 3%: Giy Sur @If tüm &sp ?ne Tur Lan ?hr Ile Su: &an val Gin 39: GLu âßp Lan Ala Glu ?yt Ph& Cys Gln Sin ?gr A3& &sn Ty: ?ra Lan 90 35 th: ph: Gly &la Gly ?hr Lys Leu &la Lev Lys 100 105 <210> 40 <211> 238 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 40 <210> 41 3911` <211> 238 <212> PRT 1-91!. 613,! -!) <213> Artificial Sequence (Yapay Dizi) <220> (513* 81.21 <223> chimeric antibody light chain (kimerik antikor hafif zinciri) <400> 41 Met Giy Iie Lys Met. Glu Ser Gln 'mr (51:: Ya). Phe Vai Tyr ne:: Leu <210> 42 <211> 11 93.111 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 42 <210> 43 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 43 <210> 44 613! ?hr 311:& *351% am figg; &w; @%3 23%:: izle; San' Lys Ala Ser Gin Msn Val Giy Thr Asn Val Ala I Iyisi?? 'v r& .33.5 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 44 Gln &in Ty: aan &En ?yt Pr& Lan ?hr <210> 45 <211> 123 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 45 Ser Val Lya Giy hrg ?ha Thr Ile Set Lan Ty: Lan Gin net asa ala ieu &:9 <210> 46 <211> 466 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 46 Met Lys Leu Trp Leu Asn Trp Ile Phe Leu Val Thr Leu Lev Asu Giy 25 30 Pro Gly Gly Ser Lou Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly ?he Thr Phe 50 55 60 Glu Trp Leu Ala Leu Ile Arq Asn Lys Ala Asn Gly Tyr ?hr Thr Giu 65 70 75 BG Ty: Asn Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ärq Asp Rsn Set 90 95 Gin Asn Ile Leu Iyr Leu Gln Met Asn Ala Lau Arg Ala Glu Asp Ser 100 105 119 A:: Thr Ty: Ty: :ya Ala Ara Agp Ser Asp Gly ?ya Ty: Giu Tyr Ty: 115 lîü 125 130 135 149 22%?? "w 4_ Ngwzgti;as;üj'“r: <210> 47 <211> 472 <212> PRT <213> Artificial Sequence (Yapay Dizi) <220> <223> chimeric antibody heavy Chain (kimerik antikor agir zinciri) <400> 47 737, ›« C3::: .491,1 1:61.) 12312? 119.252› :ER: 93.55 1› mt› $51.35 51.25%& M3 .'""- 1' `i :31:33 8 Bye-i ; .4 'me ?(2393 ..9.5 .1.7, › GluSer <210> 48 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 48 <210> 49 <211> 19 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 49 Lau Ile Arg Ran Lys Ala Ann Gly Tyr That Thr Glu Ty:: Asn Ala 38: <210> 50 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 50 Asp Set &39 Giy Ty: Ty: Sin ?gr Tgr Ph& Asp Ty: <210> 51 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 51 <210> 52 <211> 236 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 52 Lau GlyAsp Tyr Mü& Aßý Müh &Kg Vüi PE& RL& ßi& vai Ph& @iy Ph& Lâm Law Lâm ftp 1131:). m5::: E311; ÇinVai 39: sar 11.?? basa? ;ILE <210> 53 <211> 236 <212> PRT <213> Artificial Sequence (Yapay Dizi) <220> <223> chimeric antibody light chain (kimerik antikor hafif zinciri) <400> 53 Thr AugSer Lan Ser Pro Van Thr Lys Se: ?he Asu Arq Giy Giu Cya <210> 54 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 54 *lwîî'ûêâ LeuSar irg &la Ser Gln Glu 118 Sen Asp Ty: Lan Sar <210> 55 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 55 <210> 56 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 56 Leu Gin Ty: &la Sar Ty: ?to Ty: Ek: <210> 57 <211> 1857 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 57 qegchctga çatgccqtzg 9@$??9Lgüß ngçsgmßtßa tmawaggats â":.câ @tasg ügîwââßiâü <210> 58 <211> 1758 <212> DNA ~ ggiswuk cacçgatqtc ccqangqnct ggawggcqtg 2. ”-35, ;tgssniâz Wii" gafân%ü%W% 3:35* vwwwa ggaçiqugâ ®1ü$$$ßýgh aüßanüîgmk <213> Mus musculus <400>58 -"mwrgnßg &m tggcçâcttm cttgaagütq caçqcgcctc 3.333%& gam& -smâ'aâw L wguüüühüçâ gû; 1 tcwciqactg cgcttqqcaç iüîggßüâgg . gagéßßgîîîéâ *Wâwßvgâgî 317 mm::. ..-ww-.vw sit... «vw-ina sana# 1%& .%3 gagwwswh Rqâßgtüwk'crêüsûçygâ vurma" una-.ttmmgi tCÇGCtgccq agtcaßcgtq agattggaqî üc ggüâümüigw f'ââßsââwâgg .çvg Güâßgv WWwnçqvnwt Eiâhgnmuüý Kttüßggüah asmüaeasaß taarqtwßg& CGCGCQGtQW argwta.aaq ggsaütgnma çastâagüas 1.g$? 3132'li? atgqtcnatc Ütcgggâügâ tgcçtgaagc ûtgügCâßgß ctgaütgißg Qtßqaâomig 9tßüûüâügü gqmtqcagcc cztggtcutq igtgccaatq ectqqtttnü ttcqccçgqa Ct9&995&95 <210> 59 <211> 2172 <212> DNA tscaggtgtn Crea tig ::et :3 m::: ccqgaQt» s gcctügtaug üctgqaçâga qüaaâtqggâ actgügugag uwgâgcacqg îüggcaqâtg gecttcsatç aagqctrztaa ngq&tccaca ctgaegatgq <213> homo sapiens <400> 59 tüügûtttqn cttagasgtâ qtsuâaügçc ccaqsagçcc gmagmtsçga tagacqsatg gttçcacttü Cfctgtzgcwgü ctastgßgaa tastqaaazg üqqhgnaqat ctçâgßqaag scacçaaütq acangacçgt c&3attüaüt cgaggecctt wgcgatgutt gâguatgctg göggwtggýg tcctaçüqcg gaqtçcqaag gâgcntgstg tzngçiûtm gqggtcaçqt gâagactgcq amgcstcccg kantar-;acttt ctîtcgqqae qcüqaststt agtcagêçgc ggmügsgmac gûûûgtÜGQG agcmtqcsa getqsctgna gütg'hms'C-Ct cçcccgqcta üttüaqqgtn ççscgcaqc& tgcmabgßcg gçcgvücqac cetçsaqqçc ancutçnttc ctqtgcxaac catqgqogtg GCtgqtngG ügûgtýtüûß gacnccgügt tggâcag&gc qqgqâatgca cuaggctqtc gçaçucacst <210>60 <211>7668 <212> DNA ggtgüqcgat aqtçsaçwgt tcmatgqcac ßgqatctmqa gtçatqccta tgqacgactç <213> homo sapiens <400>60 catmmganta güctggatqt gggctçgcaq gü&ü&gßtac gnquctcqg caacügccqt gatqagaâgc qçccqgtact gaqtgtgacm mtqagg::: gr:: aqgccqgnct ccmtumtqtg tcaactgguß uggtggqcga cmüaccsctt ctggctgçua gtqacgmqtg gcaßctqcca acagcecttq GûgtÇQQCtR aguaçaaccq tcaggqacçc tcasgtgtgq güîgütâQQÜ gacctîctte gçqcacctts dçîgtgtgvc igacaöaçca cttctamçqa ascqqtaçßc qgcgtqgcaç nacctggama îaûtscatwt mgßmamüwSg üiýgûggggg tswßüggâêg Engsgwwgâß aaqoaugch sanctqqatg acctgccgmc tgtgacaztq fu "sie ;mazur qagughggcc i tcctgqcgec awhatgeßtq ca atqactçant agtacmaqtg gûcaûtqacc ßößêgâggüß :# J ..iI- güggßügstü cacntqcgcc ..ÇuâigCttÇ mgaßgssüaa Mr âüwêüßiâgâ çtqnctgtga gütçcqtcua ywguýüâMkß îâgasâg.&i sgwyâsûgß. ” @asagßmwüf SWJFÂSQLÃ , ` in: x$s$%ümwa \ vwân eaqcc-ctgc Çccqgqctsc qiccaactgt atçsaaagac Mu?“îéßk 1i .3 ,:;T Vu üößâüßüß: isactqaatg gceqggaûât 62ûggétçgt aatçsccûea âmümâügmsw . w.±gsggagt ;H âdêâgâsgüg tgcmgaccuq ggcaCQEQgq cgggaeaqcß aaaßfgaaâg âügßgawâgâ egwügssüßa tgücüqeqct qcggqmugtq actgaügsc& GGLQQüâüöâ gut&cacqqg cctqmctgga tcagcqggta açsatqagtg âtfîwb 4 mwsxßâßwam tgaaçmgqca cttcçaggsc ugaqçtQQQÜ g&waüa@$st maasmamngg etgcqngatc caâtgçcttc saatgâgtçc cagqtgcgac aaectgcugg ›Sgâüüâßîgü êiWwüüFgüü sisârmqa 23a0. qatgtcaitg LLCLQtgagg agsçêanwas aßcqgqatct agtgncgqcc tqcgcggaçc ”7% ßaâ-x”v Wüâwgâßggß- îîýggwâwîsîâ *W Göwwsm 4. W *1 W %3*- GWCâaccaga *15 t ça t ç; :z .:::9 WC “Gta nc; c: iltqqçtg GÜÇ..
.Y . “Hagi” aga** ühswmfüßs aßßaßüxfükt egttcacatç gqtgcaccts acctqWnga Esmws &La fî @füügâdüwk Süîügâß aguccscat: qcutgcaqtq aqgâasscoa actgagaCÜa »üfûgwkwük cçgctgqicâ Lßwxwxüaü Wgßßüwîêâwm Wggâggüüm ectçqactâa gLaqaactgü ccaqtçeaac QLÇGLamccü Wâéwaâügü~ çsccqtggt cetgqatçcc tgasqccgac gqccgtnatc ggâüggß itü gçüýJG-qgiwmêgi , ›: Lgammüsmww .44.94# * , ctqcatgçcg SEâNQWWLQLSI üruggwßßgû aqcttcgggç . açgcaqtçtü tüagccgsct etqßacqicc agcgügqagt gctqacctqç gecttqcacc gggggßüaüââ $?gßüQWgßîg cçggcaqcta âüwghßâgßâ *HIWWGßWüü gaWîîgâfîîg gcaaccmctcs gtgûgaümqq ÇUGaCQGCG? tqcagügctq yâiîâméçw .. 4 «ML W** ' üßsââîêv ›" UQQWZQÖEÇâ gcutgtutga gectgqagac WüwûgýâwWw mg? ÃWKM ctgeqüggac »îlüGüC v9& AÜWSWQEESmü dîüügâgükâ üâgWWîWSWQ 4 &WWFW 2 ugsçwwrâas gechacatc gâaqßacttc gqaccanttc ÜÇIgCtgßîq L @Qaâmmwf gocaatgumc Lûhîg .Jâw ü &$.aßßSMSî WKGLELÄFÂPQ 6953.
GÜCQÇCGVQC <210> 61 <211> 4 <212> PRT <213> artificial (yapay) <220> <223> artificial Iinker (yapay baglayici) <400> 61 <210> 62 <211> 4 <212> PRT <213> artificial (yapay) <220> <223> artificial Iinker (yapay baglayici) <400> 62 <210> 63 <211> 5 qaütqqßcca ctczagcasc agqnccgctg ccctgaQûac tghqggcgçq catqgtgecq cqmcctgtCö <212> PRT <213> artificial (yapay) <220> <223> artificial Iinker (yapay baglayici) <400> 63 Giy Gly Gly Gly Sen: <210> 64 <211> 5 <212> PRT <213> artificial (yapay) <220> <223> artificial Iinker (yapay baglayici) <400> 64 <210> 65 <211> 6 <212> PRT <213> artificial (yapay) <220> <223> artificial Iinker (yapay baglayici) <400> 65 <210> 66 <211> 6 <212> PRT <213> artificial (yapay) <220> <223> artificial Iinker (yapay baglayici) <400> 66 <210> 67 <211> 7 <212> PRT <213> artificial (yapay) <220> <223> artificial Iinker (yapay baglayici) <400> 67 <210> 68 <211> 7 <212> PRT <213> artificial (yapay) <220> <223> artificial Iinker (yapay baglayici) <400> 68 <210>69 <211> 475 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 69

Claims (7)

ISTEMLER
1. Etken madde olarak DLL3 proteinine baglanan bir antikoru içeren bir farmasötik kompozisyon olup, özelligi; antikorun sitotoksik bir aktiviteye sahip olmasidir.
2. istem 17e göre farmasötik kompozisyon olup, özelligi; sitotoksik aktivitenin antikora bagimli hücre aracili bir sitotoksik aktivite (ADCC aktivitesi) olmasidir.
3. Istem 1 ila 2*den herhangi birine göre farmasötik kompozisyon olup, özelligi; antikorun bir internalizasyon aktivitesine sahip olmasidir.
4. Istem 1 ila 3'ten herhangi birine göre farmasötik kompozisyon olup, özelligi; antikorun bir sitotoksik madde ile konjuge edilmesidir.
5. istem 1 ila 4'ten herhangi birine göre farmasötik kompozisyon olup, özelligi; antikorun, DIZI ID NO: 1'de belirtilen amino asit dizisine sahip insan DLL3'i'inde 216 ila 492. amino asitlerin arasindaki bir bölgeyi tanimasidir.
6. Istem 1 ila 57ten herhangi birine göre farmasötik kompozisyon olup, özelligi; antikorun asagidakilerden herhangi birinde tarif edilen DLL3 proteinine baglanan antikorlardan seçilmesidir: (l) DIZI ID NO: 12*de belirtilen amino asit dizisine sahip agir zincir CDR1, DIZI ID NO: 13ite belirtilen amino asit dizisine sahip agir zincir CDR2 ve DIZI ID NO: 14*te belirtilen amino asit dizisine sahip agir zincir CDR3'ü içeren bir agir zincir degisken bölgesini ve DIZI ID NO: 18'de belirtilen amino asit dizisine sahip hafif zincir CDR1, DIZI ID NO: 19ida belirtilen amino asit dizisine sahip hafif zincir CDR2 ve DIZI ID NO: 20*de belirtilen amino asit dizisine sahip hafif zincir CDRSIÜ içeren bir hafif zincir degisken bölgesini içeren bir antikor; (2) DIZI ID NO: 24'te belirtilen amino asit dizisine sahip agir zincir CDR1, DIZI ID NO: 25tde belirtilen amino asit dizisine sahip agir zincir CDR2 ve DIZI ID NO: 26tda belirtilen amino asit dizisine sahip agir zincir CDRBIÜ içeren bir agir zincir degisken bölgesini ve DIZI ID NO: 30ida belirtilen amino asit dizisine sahip hafif zincir CDR1, DIZI ID NO: 31ide belirtilen amino asit dizisine sahip hafif zincir CDR2 ve DIZI ID NO: 32ide belirtilen amino asit dizisine sahip hafif zincir CDRS'ü içeren bir hafif zincir degisken bölgesini içeren bir antikor; (3) DIZI ID NO: 36*da belirtilen amino asit dizisine sahip agir zincir CDR1i DIZI ID NO: 37*de belirtilen amino asit dizisine sahip agir zincir CDR2 ve DIZI ID NO: 38tde belirtilen amino asit dizisine sahip agir zincir CDRS'ü içeren bir agir zincir degisken bölgesini ve DIZI ID NO: 42*de belirtilen amino asit dizisine sahip hafif zincir CDR1, DIZI ID NO: 43”de belirtilen amino asit dizisine sahip hafif zincir CDR2 ve DIZI ID NO: 44ite belirtilen amino asit dizisine sahip hafif zincir CDR3'ü içeren bir hafif zincir degisken bölgesini içeren bir antikor; (4) DIZI ID NO: 48*de belirtilen amino asit dizisine sahip agir zincir CDR1, DIZI ID NO: 49tda belirtilen amino asit dizisine sahip agir zincir CDR2 ve DIZI ID NO: 50,de belirtilen amino asit dizisine sahip agir zincir CDR3iü içeren bir agir zincir degisken bölgesini ve DIZI ID NO: 54'te belirtilen amino asit dizisine sahip hafif zincir CDR1, DIZI ID NO: 55'te belirtilen amino asit dizisine sahip hafif zincir CDR2 ve DIZI ID NO: 56*da belirtilen amino asit dizisine sahip hafif zincir CDRß'ü içeren bir hafif zincir degisken bölgesini içeren bir antikor; (5) (1) ila (4) antikorlarinin herhangi birinin baglandigi DLL3 proteinindeki ile ayni epitopa baglanan bir antikor.
7. Kanserin tedavisi için bir yöntemde kullanilmak üzere önceki istemlerden herhangi birine göre bir farmasötik kompozisyon olup, özelligi; anti-kanser ajanin akciger kanserini hedeflemesidir.
TR2018/06936T 2010-01-29 2011-01-28 Anti-dll3 antikoru. TR201806936T4 (tr)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2010019391 2010-01-29

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TR201806936T4 true TR201806936T4 (tr) 2018-06-21

Family

ID=44319091

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TR2018/06936T TR201806936T4 (tr) 2010-01-29 2011-01-28 Anti-dll3 antikoru.

Country Status (14)

Country Link
US (3) US9127071B2 (tr)
EP (3) EP2530091B1 (tr)
JP (1) JP5918540B2 (tr)
DK (2) DK3342786T3 (tr)
ES (2) ES2674420T3 (tr)
HR (2) HRP20211444T1 (tr)
HU (2) HUE056313T2 (tr)
LT (2) LT2530091T (tr)
PL (2) PL2530091T3 (tr)
PT (2) PT2530091T (tr)
RS (2) RS57412B1 (tr)
SI (2) SI2530091T1 (tr)
TR (1) TR201806936T4 (tr)
WO (1) WO2011093097A1 (tr)

Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HUE028589T2 (en) * 2008-07-10 2016-12-28 Toray Industries Pharmaceutical preparation for the treatment and prevention of cancer
DK3342786T3 (en) 2010-01-29 2021-09-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-dll3-antistof
DK2817338T3 (en) 2012-02-24 2017-10-23 Abbvie Stemcentrx Llc DLL3 modulators and methods of use
EP2832856A4 (en) * 2012-03-29 2016-01-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd ANTI-LAMP5 ANTIBODIES AND USE THEREOF
GB201302447D0 (en) * 2013-02-12 2013-03-27 Oxford Biotherapeutics Ltd Therapeutic and diagnostic target
MX2015010682A (es) * 2013-02-22 2016-05-31 Stemcentrx Inc Nuevos conjugados de anticuerpos y usos de los mismos.
WO2014159835A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Genentech, Inc. Anti-b7-h4 antibodies and immunoconjugates
US9562099B2 (en) * 2013-03-14 2017-02-07 Genentech, Inc. Anti-B7-H4 antibodies and immunoconjugates
SG11201509982UA (tr) 2013-06-06 2016-04-28 Igenica Biotherapeutics Inc
EP3892294A1 (en) * 2013-08-28 2021-10-13 AbbVie Stemcentrx LLC Site-specific antibody conjugation methods and compositions
EP3338793A1 (en) 2013-08-28 2018-06-27 AbbVie Stemcentrx LLC Novel sez6 modulators and methods of use
AU2014312210A1 (en) * 2013-08-28 2016-04-07 Abbvie Stemcentrx Llc Engineered anti-DLL3 conjugates and methods of use
NZ756749A (en) 2013-09-13 2022-05-27 Genentech Inc Methods and compositions comprising purified recombinant polypeptides
RU2016107435A (ru) * 2013-09-13 2017-10-18 Дженентек, Инк. Композиции и способы обнаружения и количественного определения белка клеток-хозяев в клеточных линиях и рекомбинантные полипептидные продукты
TWI652279B (zh) 2013-11-11 2019-03-01 中外製藥股份有限公司 含改變的抗體可變區之抗原結合分子
JP2017514143A (ja) * 2014-02-21 2017-06-01 アッヴィ・ステムセントルクス・エル・エル・シー メラノーマに使用するための抗ｄｌｌ３抗体および薬物コンジュゲート
CA2956072A1 (en) * 2014-07-21 2016-01-28 Bloodworks Antibodies that recognize red blood cell antigens
JP6749312B2 (ja) 2014-07-31 2020-09-02 アムゲン リサーチ （ミュンヘン） ゲーエムベーハーＡＭＧＥＮ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｍｕｎｉｃｈ）ＧｍｂＨ 最適化された種間特異的二重特異性単鎖抗体コンストラクト
EP3191518B1 (en) 2014-09-12 2020-01-15 Genentech, Inc. Anti-b7-h4 antibodies and immunoconjugates
TW202313697A (zh) 2014-11-11 2023-04-01 日商中外製藥股份有限公司 包含經改變之抗體可變區之抗原結合分子的資料庫
MA41613A (fr) * 2015-02-23 2018-01-02 Abbvie Stemcentrx Llc Récepteurs antigéniques chimériques anti-dll3 et procédés d'utilisation desdits récepteurs
TWI793062B (zh) 2015-07-31 2023-02-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｄｌｌ３及ｃｄ３抗體構築體
WO2018181425A1 (ja) 2017-03-29 2018-10-04 塩野義製薬株式会社 癌治療用医薬組成物
EP3679070A1 (en) * 2017-09-07 2020-07-15 Augusta University Research Institute, Inc. Antibodies to programmed cell death protein 1
US11952422B2 (en) 2017-12-05 2024-04-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule comprising altered antibody variable region binding CD3 and CD137
WO2019131988A1 (en) 2017-12-28 2019-07-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cytotoxicity-inducing therapeutic agent
WO2019217145A1 (en) * 2018-05-08 2019-11-14 Phanes Therapeutics, Inc. Anti-dll3 antibodies and uses thereof
TW202016151A (zh) 2018-06-09 2020-05-01 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 針對癌症治療之多特異性結合蛋白
JP7425049B2 (ja) * 2018-09-25 2024-01-30 ハープーン セラピューティクス，インク． Ｄｌｌ３結合タンパク質および使用方法
EP3952888A1 (en) * 2019-04-08 2022-02-16 Phanes Therapeutics, Inc. Humanized anti-dll3 chimeric antigen receptors and uses thereof
EP4023245A4 (en) 2019-08-28 2023-08-30 Azusapharma Sciences, Inc. BIFIDOBACTERIUM SPP. WITH EXPRESSION AND SECRETION OF DIABODY-TYPE BSAB
JP2023519776A (ja) 2020-03-31 2023-05-15 中外製薬株式会社 多重特異性抗原結合分子を製造するための方法
WO2021200898A1 (en) 2020-03-31 2021-10-07 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Dll3-targeting multispecific antigen-binding molecules and uses thereof
EP4217389A1 (en) * 2020-09-28 2023-08-02 Angitia Biomedicines Limited Anti-sclerostin constructs and uses thereof
US20240115721A1 (en) 2021-01-13 2024-04-11 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Anti-dll3 antibody-drug conjugate
KR20230146521A (ko) 2021-01-13 2023-10-19 메모리얼 슬로안 케터링 캔서 센터 항체-피롤로벤조디아제핀 유도체 접합체
WO2023041041A1 (en) * 2021-09-17 2023-03-23 Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. D3-binding molecules and uses thereof
WO2023053272A1 (en) 2021-09-29 2023-04-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Uses of dll3-targeting multispecific antigen-binding molecules
WO2023092082A1 (en) * 2021-11-18 2023-05-25 Bentley Cornelia Antibodies to receptor of advanced glycation end products (rage) and uses thereof
WO2024012524A1 (zh) * 2022-07-14 2024-01-18 苏州宜联生物医药有限公司 抗体药物偶联物及其制备方法和用途

Family Cites Families (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
JPS6459878A (en) 1987-08-31 1989-03-07 Matsushita Electric Ind Co Ltd Semiconductor laser protective circuit
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
WO1993012227A1 (en) 1991-12-17 1993-06-24 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
ES2246502T3 (es) 1990-08-29 2006-02-16 Genpharm International, Inc. Animales no humanos transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
JPH07501451A (ja) 1991-11-25 1995-02-16 エンゾン・インコーポレイテッド 多価抗原結合タンパク質
ATE381614T1 (de) 1992-07-24 2008-01-15 Amgen Fremont Inc Bildung von xenogenen antikörpern
US5648267A (en) 1992-11-13 1997-07-15 Idec Pharmaceuticals Corporation Impaired dominant selectable marker sequence and intronic insertion strategies for enhancement of expression of gene product and expression vector systems comprising same
CA2161351C (en) 1993-04-26 2010-12-21 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
AU701342B2 (en) 1994-07-13 1999-01-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Reconstituted human antibody against human interleukin-8
EP0972041B2 (en) 1997-04-04 2017-01-18 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Novel human delta3 compositions and therapeutic and diagnostic uses therefor
US20030180784A1 (en) 1997-04-04 2003-09-25 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Novel human Delta3 compositions and therapeutic and diagnostic uses therefor
US20060122373A1 (en) 1997-04-04 2006-06-08 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Delta3, FTHMA-070, Tango85, Tango77, SPOIL,NEOKINE, Tango129 and integrin alpha subunit protein and nucleic acid molecules and uses thereof
JP4139508B2 (ja) 1998-02-19 2008-08-27 旭化成株式会社 ヒトデルター３
JP4332581B2 (ja) 1998-02-19 2009-09-16 旭化成株式会社 ヒトデルタ−３
AU3657899A (en) 1998-04-20 1999-11-08 James E. Bailey Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
JP2002540763A (ja) 1999-02-10 2002-12-03 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド ３３個のヒト分泌タンパク質
EP2275540B1 (en) 1999-04-09 2016-03-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
WO2001012664A2 (en) 1999-08-19 2001-02-22 Chiron Corporation Notch receptor ligands and uses thereof
US6436703B1 (en) 2000-03-31 2002-08-20 Hyseq, Inc. Nucleic acids and polypeptides
WO2002014358A2 (en) 2000-08-11 2002-02-21 Eli Lilly And Company Novel secreted proteins and their uses
CA2424602C (en) 2000-10-06 2012-09-18 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Antibody composition-producing cell
US20030003097A1 (en) 2001-04-02 2003-01-02 Idec Pharmaceutical Corporation Recombinant antibodies coexpressed with GnTIII
AU2002330039A1 (en) 2001-09-17 2003-04-01 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosis of cancer compositions and methods of screening for modulators of cancer
US20050137130A1 (en) 2001-11-14 2005-06-23 Bodmer Mark W. Medical treatment
EP1514928B1 (en) 2002-06-05 2013-07-31 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing antibodies using baculoviruses
WO2004030615A2 (en) 2002-10-02 2004-04-15 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
US20040115204A1 (en) 2002-12-11 2004-06-17 Fanger Gary R. Antibodies to treat cancer
DE602004028249D1 (de) 2003-06-18 2010-09-02 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Fucosetransporter
US20050175619A1 (en) 2004-02-05 2005-08-11 Robert Duffy Methods of producing antibody conjugates
WO2007111733A2 (en) * 2005-12-16 2007-10-04 Genentech, Inc. Method for diagnosing, prognosing and treating glioma
EP2216339A1 (en) 2006-01-16 2010-08-11 Compugen Ltd. Novel nucleotide and amino acid sequences, and methods of use thereof for diagnosis
EP2078731A4 (en) 2006-10-20 2012-08-01 Forerunner Pharma Res Co Ltd PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING ANTI-HB-EGF ANTIBODY AS ACTIVE INGREDIENT
ATE504647T1 (de) 2007-01-30 2011-04-15 Forerunner Pharma Res Co Ltd Chimärer fc gamma rezeptor und verfahren zur bestimmung von adcc-aktivität unter verwendung des rezeptors
CN102056945A (zh) * 2008-04-07 2011-05-11 埃博灵克斯股份有限公司 针对Notch途径的单可变结构域
JP4787295B2 (ja) 2008-07-14 2011-10-05 株式会社トープラ 高強度セルフフォーミングねじによるねじ締結構造体
DK3342786T3 (en) 2010-01-29 2021-09-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-dll3-antistof
DK2817338T3 (en) 2012-02-24 2017-10-23 Abbvie Stemcentrx Llc DLL3 modulators and methods of use
JP2017514143A (ja) 2014-02-21 2017-06-01 アッヴィ・ステムセントルクス・エル・エル・シー メラノーマに使用するための抗ｄｌｌ３抗体および薬物コンジュゲート
TWI793062B (zh) 2015-07-31 2023-02-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｄｌｌ３及ｃｄ３抗體構築體

Also Published As

Publication number Publication date
HUE038962T2 (hu) 2018-12-28
DK3342786T3 (en) 2021-09-27
PT2530091T (pt) 2018-05-17
US20150368355A1 (en) 2015-12-24
JPWO2011093097A1 (ja) 2013-05-30
ES2889932T3 (es) 2022-01-14
HRP20211444T1 (hr) 2021-12-24
RS57412B1 (sr) 2018-09-28
EP2530091B1 (en) 2018-04-04
PL2530091T3 (pl) 2018-08-31
EP2530091A4 (en) 2013-07-10
EP3907242A1 (en) 2021-11-10
US9127071B2 (en) 2015-09-08
RS62387B1 (sr) 2021-10-29
US20160244530A2 (en) 2016-08-25
US20120328624A1 (en) 2012-12-27
DK2530091T3 (en) 2018-05-28
HUE056313T2 (hu) 2022-02-28
LT3342786T (lt) 2021-10-25
PL3342786T3 (pl) 2021-12-20
ES2674420T3 (es) 2018-06-29
HRP20180952T1 (hr) 2018-07-27
SI2530091T1 (en) 2018-06-29
US11111311B2 (en) 2021-09-07
PT3342786T (pt) 2021-09-24
EP2530091A1 (en) 2012-12-05
EP3342786A1 (en) 2018-07-04
LT2530091T (lt) 2018-06-11
SI3342786T1 (sl) 2022-01-31
WO2011093097A1 (ja) 2011-08-04
US20210380715A1 (en) 2021-12-09
JP5918540B2 (ja) 2016-05-18
EP3342786B1 (en) 2021-06-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210380715A1 (en) Anti-dll3 antibody
JP5986621B2 (ja) 抗ｇｐｒ４９抗体を用いる癌の診断および治療
EP2548576B1 (en) Diagnosis of cancer using anti-desmoglein-3 antibodies
US20180155438A1 (en) Diagnosis and treatment of cancer using anti-itm2a antibody
WO2011105573A1 (ja) 抗icam3抗体およびその用途
US9139647B2 (en) Diagnosis and treatment of cancer using anti-TM4SF20 antibody
JP5746018B2 (ja) 抗ｔｍｐｒｓｓ１１ｅ抗体を用いた癌の診断と治療
SG172427A1 (en) Diagnosis and treatment of cancer using anti-lgr7 antibody
AU2014201680A1 (en) Diagnosis and treatment of cancer using anti-GPR49 antibody