KR20230146521A - 항체-피롤로벤조디아제핀 유도체 접합체 - Google Patents

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KR20230146521A
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antibody
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dll3
amino acid
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KR1020237026191A
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존 티. 포이리에
찰스 루딘
제이슨 루이스
압둘 칸
데이비드 앤드류
씬레이 첸
이보 로렌즈
히로노리 마츠나가
Original Assignee
메모리얼 슬로안 케터링 캔서 센터
트라이-인스티튜셔널 테라퓨틱스 디스커버리 인스티튜트 인코포레이티드
다이이찌 산쿄 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 신규 항-DLL3 항체-피롤로디아제핀 유도체 및 이를 이용한 신규 항-DLL3 항체-피롤로디아제핀 유도체 접합체를 제공한다.

Description

항체-피롤로벤조디아제핀 유도체 접합체
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2021년 1월 13일에 출원된 미국 가출원 번호 63/136,928에 대해 우선권을 주장하고, 이의 개시내용은 그 전체가 참조로 본 명세서에 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 함유하고, 그 전체가 참조로 본 명세서에 포함된다. 2022년 1월 12일에 생성된 상기 ASCII 사본의 이름은 098065-0303_SL.txt이고 크기는 153,716 바이트이다.
기술분야
본 발명은 항종양 약물로서 유용한 항체-약물 접합체에 관한 것이고, 항체-약물 접합체는 링커 구조 모이어티를 통해 서로 접합된, 종양 세포를 표적화할 수 있는 항체와 피롤로벤조디아제핀 유도체를 갖는다.
본 기술의 배경에 대한 다음의 설명은 단순히 본 기술의 이해를 돕기 위한 것이고, 본 기술에 대한 선행기술을 설명하거나 구성하려는 것이 아니다.
항체-약물 접합체 (ADC)는 암세포의 표면 상에 발현되는 항원에 결합하는 항체에 접합되는 세포독성 활성을 갖는 약물을 갖고, 결합을 통해 항원의 세포 내재화가 가능하다. ADC는 약물을 암세포에 효과적으로 전달할 수 있어 암세포 내에 약물을 축적시켜 암세포를 사멸시킬 것으로 기대된다.
예를 들어, 항-CD30 단일클론 항체에 접합된 모노메틸 아우리스타틴 E를 갖는 ADC 애드세트리스(TM) (브렌툭시맙 베도틴)는 호지킨 림프종 및 역형성 대세포 림프종에 대한 치료 약물로 승인되었다. 항-HER2 단일클론 항체에 접합된 엠탄신을 갖는 캐싸일라(TM) (트라스투주맙 엠탄신)는 HER2-양성 진행성 및 재발성 유방암의 치료에 사용됩니다.
ADC에서 접합되는 약물의 유용한 예는 피롤로벤조디아제핀(PBD)이다. PBD는, 예를 들어, DNA 좁은 홈의 PuGPu 서열에 결합하여 세포독성을 나타낸다. 자연 발생 PBD인 안트라마이신은　1965년에 처음 발견되었고, 이 발견 이후 다양한 자연 발생 PBD 및 이의 유사체 PBD가 발견되었다 (Mantaj, et al., Angewandte Chemie, Internationl Edition 2016, 55, 2-29; Antonow.et al., Chemical Reviews, 2010, 111, 2815-2864; In Antibiotics III. Springer Verlag, New York, pp.3-11; 및 Accounts of Chemical Research, 1986, 19, 230 참조).
PBD의 일반 구조식은 다음의 화학식으로 표시된다:
[화학식 1]
A 및 C 고리 부분에서 치환기의 수, 유형 및 부위가 다른 PBD와 B 및 C 고리 부분에서 불포화도가 다른 PBD가 공지되어 있다.
PBD는 이량체 구조의 형성을 통해 극적으로 향상된 세포독성을 갖는 것으로 공지되어 있고 (Journal of the American Chemical Society, 1992,114, 4939; Journal of Organic Chemistry, 1996, 61, 8141 참조), 이량체 PBD를 갖는 다양한 ADC가 보고되었다 (WO 2013/173496, WO 2014/130879, WO 2017/004330, WO 2017/004025, WO 2017/020972, WO 2016/036804, WO 2015/095124, WO 2015/052322, WO 2015/052534, WO 2016/115191, WO 2015/052321, WO 2015/031693, WO 2011/130613 및 WO2019/065964 참조).
이량체 구조 PBD는 일부 공지된 ADC에서 사용된다. 예를 들어, 이량체 구조 PBD가 DLL3을 표적으로 하는 항체에 접합된 ADC가 보고되었다 (WO2013/126746 및 Saunders et al., Sci Translational Medicine 7(302): 302ra136 (2015) 참조).
DLL3 (즉, 델타-유사 리간드 3 또는 델타-유사 단백질 3)은 단일-통과 유형 I 막관통 단백질이고, 노치 리간드 중 하나이다 (Owen et al. J Hematol Oncol 12, 61 (2019) 참조). DLL3는 SCLC 및 LCNEC를 포함하는 고등급 폐 신경내분비 종양에서 선택적으로 발현된다. DLL3의 증가된 발현은 SCLC 및 LCNEC 환자-유래 이종이식 종양에서 관찰되었고, 원발성 종양에서도 확인되었다. Saunders et al., Sci Translational Medicine 7(302):302ra136 (2015) 참조. DLL3의 증가된 발현은 전립선 신경내분비 암종을 포함하는 폐외 신경내분비 암에서도 관찰되었다 (Puca et al., Sci Transl Med 11(484): pii: eaav0891 (2019)). DLL3는 이러한 종양 세포의 표면 상에서 발현되는 반면, 성인의 정상 조직에서의 발현은 제한적이다.
항-DLL3 항체를 유효성분으로서 함유하는 다양한 약학적 조성물이 공지되어 있다. Giffin et al., Clin Cancer Res 2021;27:1526-37, WO2011/093097 및 WO2013/126746 참조. 그러나 지금까지, DLL3를 표적으로 하는 약물은 약학적 제제로 사용하도록 승인되지 않았다.
당업계에는 다양한 유형의 암을 치료하기 위한 ADC와 같은 효율적이고 효과적인 표적 치료제에 대한 필요성이 존재한다. 본 출원은 그 필요성을 충족시키고, PBD를 활용하는 ADC를 포함한다.
요약
본 발명이 해결하고자 하는 과제: 본 발명은 신규 항-DLL-3 항체-피롤로벤조디아제핀(PBD) 유도체 접합체를 제공한다. 또한, 본 발명은 항-DLL-3 항체-PBD 유도체 접합체를 함유하는 약학적 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 항-DLL3 항체-PBD 유도체 접합체를 이용하여 암을 치료하는 방법을 제공한다.
과제를 해결하는 수단: 본 발명자들은 신규 항-DLL-3 항체-피롤로벤조디아제핀(PBD) 유도체 접합체가 예상 외로 강력한 항종양 활성을 가진다는 것을 발견하기 위해 열심히 연구하여 본 발명을 완성하였다. 본 발명은 다음의 본 발명의 양태 및 실시예를 포함한다:
[1] 일 양태에서, 본 개시내용은 다음의 식으로 표시되는 항체-약물 접합체를 제공한다:
상기 식에서,
m1은 1 내지 2의 정수를 나타내고;
D는 다음의 화학식 중 어느 하나로 표시되는 약물을 나타내고:
상기 식에서,
별표는 L에 대한 결합을 나타내고;
L은 Ab의 N297 글리칸과 D를 연결하는 링커이고;
N297 글리칸은 임의로 변형되고;
Ab는 DLL-3에 특이적으로 결합하는 항-DLL3 항체를 나타낸다.
[2] [1]에 따른 일부 실시양태에서, 항-DLL3 항체는 중쇄 면역글로불린 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 면역글로불린 가변 도메인 (VL)을 포함하고,
(a) VH는 (i) 각각 서열번호: 3, 서열번호: 4 및 서열번호: 5;
(ii) 각각 서열번호: 13, 서열번호: 14 및 서열번호: 15;
(iii) 각각 서열번호: 23, 서열번호: 24 및 서열번호: 25; 및
(iv) 각각 서열번호: 33, 서열번호: 34 및 서열번호: 35로 이루어진 군으로부터 선택된 VH-CDR1 서열, VH-CDR2 서열 및 VH-CDR3 서열을 포함하고/하거나;
(b) VL은 (i) 각각 서열번호: 8, 서열번호: 9 및 서열번호: 10;
(ii) 각각 서열번호: 18, 서열번호: 19 및 서열번호: 20;
(iii) 각각 서열번호: 28, 서열번호: 29 및 서열번호: 30; 및
(iv) 각각 서열번호: 38, 서열번호: 39 및 서열번호: 40으로 이루어진 군으로부터 선택된 VL-CDR1 서열, VL-CDR2 서열 및 VL-CDR3 서열을 포함한다.
[3] [1] 또는 [2]에 따른 일부 실시양태에서, 항-DLL3 항체는 중쇄 면역글로불린 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 면역글로불린 가변 도메인 (VL)을 포함하고, (a) VH-CDR1 서열, VH-CDR2 서열 및 VH-CDR3 서열을 포함하는 VH 및 (b) VL-CDR1 서열, VL-CDR2 서열 및 VL-CDR3 서열을 포함하는 VL의 조합은
(i) (a) 각각 서열번호: 3, 서열번호: 4 및 서열번호: 5, 및 (b) 서열번호: 8, 서열번호: 9 및 서열번호: 10;
(ii) 각각 (a) 서열번호: 13, 서열번호: 14 및 서열번호: 15, 및 (b) 서열번호: 18, 서열번호: 19 및 서열번호: 20;
(iii) 각각 (a) 서열번호: 23, 서열번호: 24 및 서열번호: 25, 및 (b) 서열번호: 28, 서열번호: 29 및 서열번호: 30; 및
(iv) 각각 (a) 서열번호: 33, 서열번호: 34 및 서열번호: 35, 및 (b) 서열번호: 38, 서열번호: 39 및 서열번호: 40으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
[4] [1] 또는 [2]에 따른 일부 실시양태에서, 항-DLL3 항체는 다음의 특성 중 하나 이상을 포함한다:
(a) 서열번호: 7, 17, 27, 37, 62, 66 또는 70 중 어느 하나로 존재하는 경쇄 면역글로불린 가변 도메인 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 경쇄 면역글로불린 가변 도메인 서열; 및/또는
(b) 서열번호: 2, 12, 22, 32, 59, 60, 61, 63, 64, 65, 67, 68 또는 69 중 어느 하나로 존재하는 중쇄 면역글로불린 가변 도메인 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 중쇄 면역글로불린 가변 도메인 서열.
[5] [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 항-DLL3 항체는 다음의 특성 중 하나 이상을 포함한다:
(a) 서열번호: 17, 27 또는 37 중 어느 하나로 존재하는 경쇄 면역글로불린 가변 도메인 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 경쇄 면역글로불린 가변 도메인 서열; 및/또는
(b) 서열번호: 12, 22 또는 32 중 어느 하나로 존재하는 중쇄 면역글로불린 가변 도메인 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 중쇄 면역글로불린 가변 도메인 서열.
[6] [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 항-DLL3 항체는 중쇄 면역글로불린 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 면역글로불린 가변 도메인 (VL)을 포함하고,
(a) VH는 서열번호: 2, 서열번호: 12, 서열번호: 22 및 서열번호: 32로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고/하거나;
(b) VL은 서열번호: 7, 서열번호: 17, 서열번호: 27 및 서열번호: 37로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
[7] [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 항-DLL3 항체는 중쇄 면역글로불린 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 면역글로불린 가변 도메인 (VL)을 포함하고,
(a) VH는 서열번호: 12, 서열번호: 22 또는 서열번호: 32로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고,
(b) VL은 서열번호: 17, 서열번호: 27 또는 서열번호: 37로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
[8] [6]에 따른 일부 실시양태에서, VH 아미노산 서열 및 VL 아미노산 서열은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
각각 서열번호: 2 및 서열번호: 7 (7-I1-B);
각각 서열번호: 12 및 서열번호: 17 (2-C8-A);
각각 서열번호: 22 및 서열번호: 27 (10-O18-A); 및
각각 서열번호: 32 및 서열번호: 37 (6-G23-F).
[9] [1] 내지 [8] 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 항체-약물 접합체는 항-DLL3 항체가 세포 표면 (예를 들어, 종양 세포 표면) 상에 발현된 DLL3 폴리펩타이드에 결합할 때 세포내 내재화를 겪는다.
[10] [1] 내지 [9] 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 항-DLL3는 IgG1 또는 이의 변이체, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM, IgD 및 IgE로 이루어진 군으로부터 선택되는 이소형의 Fc 도메인을 포함한다.
[11] [1] 내지 [10] 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 항-DLL3는 서열번호: 42, 57 또는 58의 중쇄 불변 영역을 포함한다.
[12] [1] 내지 [11] 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 항-DLL3 항체는 단일클론 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체 또는 이중특이적 항체이다.
[13] [1] 내지 [12] 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 항체는 다음을 포함한다:
(a) 서열번호: 59 내지 61 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호: 62 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(b) 서열번호: 63 내지 65 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호: 66 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및/또는
(c) 서열번호: 67 내지 69 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호: 70 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
[14] [1] 내지 [13] 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 항체는 다음을 포함한다:
(a) 서열번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호: 62의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(b) 서열번호: 65의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호: 66의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 또는
(c) 서열번호: 69의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호: 70의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
[15] [1]에 따른 일부 실시양태에서, 항-DLL-3 항체는 DLL-3에 결합하기 위해 제9항 또는 제V항에 따른 항체와 경쟁한다.
[16] [1] 내지 [15] 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 항-DLL3 항체는 DLL 상의 입체 에피토프 또는 비-입체 에피토프에 결합한다.
[17] [1] 내지 [16] 중 어느 하나에 따른 실시양태에서, 항-DLL3 항체는 서열번호: 50 또는 서열번호: 51의 아미노산 잔기 27-492를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 포유류 DLL3 폴리펩타이드에 결합한다.
[18] [1] 내지 [17] 중 어느 하나에 따른 실시양태에서, 항체의 중쇄 또는 경쇄는 N-결합 글리코실화, O-결합 글리코실화, N-말단 가공, C-말단 가공, 탈아미드화, 아스파르트산의 이성질체화, 메티오닌의 산화, N-말단에의 메티오닌 잔기의 추가, 프롤린 잔기의 아미드화, 중쇄의 위치 234 및 235 (EU 넘버링)에서의 2개의 류신(L) 잔기의 알라닌(A)으로의 치환 (LALA), 중쇄의 위치 356의 아미노산 잔기 Glu(E) 및 위치 358 (EU 넘버링)의 아미노산 잔기 Met(M)의 집합, 중쇄의 위치 356의 Asp(D) 및 위치 358 (EU 넘버링)의 류신(L)의 집합 또는 이들의 임의의 조합, N-말단 글루타민 또는 N-말단 글루탐산의 피로글루탐산으로의 전환, 및 카복실 말단에서의 1개 또는 2개의 아미노산의 제거로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 또는 2개 이상의 변형 또는 아미노산 잔기의 집합을 갖는다.
[19] [18]에 따른 일부 실시양태에서, 중쇄의 카복실 말단에서 1개 또는 2개의 아미노산이 제거된다.
[20] [19]에 따른 일부 실시양태에서, 양쪽 중쇄의 카복실 말단 각각에서 1개의 아미노산이 제거된다.
[21] [18] 내지 [20] 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 중쇄의 카복실 말단에 있는 프롤린 잔기는 추가로 아미드화된다.
[22] [1] 내지 [21] 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 항-DLL3 항체는 항체 의존성 세포독성 활성을 향상시키기 위해 조절되는 당쇄 변형을 포함한다.
[23] [1] 내지 [22] 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, D는 다음과 같다:
[24] [1] 내지 [22] 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, D는 다음과 같다:
[25] [1] 내지 [22] 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, D는 다음과 같다:
[26] [1] 내지 [22] 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, D는 다음과 같다:
[27] [23] 내지 [26] 중 어느 하나에 따른 실시양태에서, -OH는 위치 11'에 있다.
[28] [1] 내지 [27] 중 어느 하나에 따른 실시양태에서,
L은 -Lb-La-Lp-NH-B-CH2-O(C=O)-*로 표시되고, 별표는 D에 대한 결합을 나타내고;
B는 페닐기 또는 헤테로아릴기를 나타내고;
Lp는 표적 세포에서 절단 가능한 아미노산 서열로 구성된 링커를 나타내고;
La는 다음의 군으로부터 선택된 어느 하나를 나타내고:
-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-,
-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-NH-(CH2CH2)n3-C(=O)-,
-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)n3-CH2-C(=O)-,
-C(=O)-(CH2CH2)n2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)n3-CH2CH2-C(=O)- 및
-(CH2)n4-O-C(=O)-;
n2는 1 내지 3의 정수를 나타내고, n3는 1 내지 5의 정수를 나타내고, n4는 0 내지 2의 정수를 나타내고;
Lb는 La와 Ab의 글리칸 또는 변형된 글리칸을 결합하는 스페이서를 나타낸다.
[29] [28]에 따른 일부 실시양태에서, B는 1,4-페닐기, 2,5-피리딜기, 3,6-피리딜기, 2,5-피리미딜기 및 2,5-티에닐기로부터 선택된 어느 하나이다.
[30] [29]에 따른 일부 실시양태에서, B는 1,4-페닐기이다.
[31] [28] 내지 [30] 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, Lp는 2 내지 7개의 아미노산으로 구성된 아미노산 잔기이다.
[32] [28] 내지 [31] 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, Lp는 글라이신, 발린, 알라닌, 페닐알라닌, 글루탐산, 이소류신, 프롤린, 시트룰린, 류신, 세린, 라이신 및 아스파르트산으로부터 선택된 아미노산으로 구성된 아미노산 잔기이다.
[33] [28] 내지 [32] 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, Lp는 다음의 군으로부터 선택된다:
-GGVA- (서열번호: 85), -GG-(D-)VA-, -VA-, -GGFG- (서열번호: 86), -GGPI- (서열번호: 87), -GGVCit- (서열번호: 88), -GGVK- (서열번호: 89), -GG(D-)PI- 및 -GGPL- (서열번호: 90).
[34] [28] 내지 [33] 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, La는 다음의 군으로부터 선택된다:
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-, -C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-,
-CH2-OC(=O)- 및 -OC(=O)-.
[35] [28] 내지 [34] 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, Lb는 다음의 구조식으로 표시된다:
,
, 또는
위에 나타낸 Lb에 대한 각각의 구조식에서,
각각의 별표는 La에 대한 결합을 나타내고, 각각의 물결선은 Ab의 글리칸 또는 변형된 글리칸에 대한 결합을 나타낸다.
[36] [28] 내지 [35] 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서,
L은 -Lb-La-Lp-NH-B-CH2-O(C=O)-*로 표시되고,
B는 1,4-페닐기이고;
Lp는 다음의 군으로부터 선택된 어느 하나를 나타내고:
-GGVA- (서열번호: 85), -GG-(D-)VA-, -VA-, -GGFG- (서열번호: 86), -GGPI- (서열번호: 87), -GGVCit- (서열번호: 88), -GGVK- (서열번호: 89) 및 -GGPL- (서열번호: 90);
La는 다음의 군으로부터 선택된 어느 하나를 나타내고:
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-, -C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-,
-CH2-OC(=O)- 및 -OC(=O)-;
Lb는 다음의 구조식으로 표시되고:
,
, 또는
위에 나타낸 Lb에 대한 각각의 구조식에서,
각각의 별표는 La에 대한 결합을 나타내고, 각각의 물결선은 Ab의 글리칸 또는 변형된 글리칸에 대한 결합을 나타낸다.
[37] [28] 내지 [36] 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서,
L은 다음의 군으로부터 선택된다:
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)- ("GGVA"는 서열번호: 85로 개시됨),
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GG-(D-)VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPI-NH-B-CH2-OC(=O)- ("GGPI"는 서열번호: 87로 개시됨),
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-B-CH2-OC(=O)- ("GGFG"는 서열번호: 86으로 개시됨),
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(=O)- ("GGVCit"는 서열번호: 88로 개시됨),
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVK-NH-B-CH2-OC(=O)- ("GGVK"는 서열번호: 89로 개시됨),
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPL-NH-B-CH2-OC(=O)- ("GGPL"은 서열번호: 90으로 개시됨),
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z2-OC(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)- ("GGVA"는 서열번호: 85로 개시됨) 및
-Z3-CH2-OC(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)- ("GGVA"는 서열번호: 85로 개시됨),
상기 식에서,
Z1은 다음의 구조식을 나타내고:
Z2는 다음의 구조식을 나타내고:
Z3는 다음의 구조식을 나타내고:
Z1, Z2 및 Z3에 대한 각각의 구조식에서,
각각의 별표는 La에 대한 결합을 나타내고, 각각의 물결선은 Ab의 글리칸 또는 변형된 글리칸에 대한 결합을 나타내고;
B는 1,4-페닐기를 나타낸다.
[38] [37]에 따른 일부 실시양태에서,
L은 다음의 군으로부터 선택된다:
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)- ("GGVA"는 서열번호: 85로 개시됨),
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)- ("GGVCit"는 서열번호: 88로 개시됨),
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)- 및
-Z1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
상기 식에서,
B는 1,4-페닐기이고, Z1은 다음의 구조식을 나타내고:
Z1에 대한 구조식에서,
각각의 별표는 Z1에 인접한 C(=O)에 대한 결합을 나타내고, 각각의 물결선은 Ab의 글리칸 또는 변형된 글리칸에 대한 결합을 나타낸다.
[39] [1] 내지 [38] 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서,
L은 -Lb-La-Lp-NH-B-CH2-O(C=O)-*로 표시되고,
물결선은 D에 대한 결합을 나타내고;
B는 1,4-페닐기를 나타내고;
Lp는 -GGVA- (서열번호: 85) 또는 -VA를 나타내고;
La는 -(CH2)n9-C(=O)- 또는 -(CH2CH2)n10-C(=O)-NH-(CH2CH2O)n11-CH2CH2-C(=O)-를 나타내고, n9는 2 내지 7의 정수를 나타내고, n10은 1 내지 3의 정수를 나타내고, n11은 6 내지 10의 정수를 나타내고;
Lb는 -(숙신이미드-3-일-N)-이다.
[40] [39]에 따른 일부 실시양태에서,
L은 다음의 군으로부터 선택된 어느 하나를 나타낸다:
-(숙신이미드-3-일-N)-(CH2)5-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-(숙신이미드-3-일-N)-(CH2)5-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-)- ("GGVA" 는 서열번호: 85로 개시됨) 및
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)8-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
여기서 B는 1,4-페닐기이다.
[41] [1] 내지 [40] 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 항체는 IgG이다.
[42] [41]에 따른 일부 실시양태에서, 항체는 IgG1 또는 이의 변이체, IgG2, 또는 IgG4이다.
[43] [1] 내지 [42] 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 항체는 종양 세포에 결합하고, 종양 세포에 혼입되어 내재화한다.
[44] [43]에 따른 일부 실시양태에서, 항체는 추가로 항종양 효과를 갖는다.
[45] [1] 내지 [44] 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, N297 글리칸은 변형된 글리칸이다.
[46] [45]에 따른 일부 실시양태에서, N297 글리칸은 N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2, 또는 이들의 혼합물, 또는 N297-(Fuc)SG이고, N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 및 N297-(Fuc)SG는 다음의 식으로 표시되는 구조를 갖는다:
상기 식에서,
물결선은 항체의 Asn297에 대한 결합을 나타내고;
L(PEG)는 -(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH-를 나타내고, 여기서 우측 말단의 아미노기는 아미드 결합을 통해 N297 글리칸에 있는 β-Man의 1-3 분지쇄에 있는 비환원성 말단의 시알산의 2-위치에서 카복실산에 결합하고;
별표는 링커 L에 대한 결합을 나타내고;
n5는 2 내지 10의 정수를 나타내고,
상기 식에서,
물결선은 항체의 Asn297에 대한 결합을 나타내고;
L(PEG)는 -(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH-를 나타내고, 여기서 우측 말단의 아미노기는 아미드 결합을 통해 N297 글리칸에 있는 β-Man의 1-6 분지쇄에 있는 비환원성 말단의 시알산의 2-위치에서 카복실산에 결합하고;
별표는 링커 L에 대한 결합을 나타내고;
n5는 2 내지 10의 정수를 나타내고,
상기 식에서,
물결선은 항체의 Asn297에 대한 결합을 나타내고;
L(PEG)는 -(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH-를 나타내고, 여기서 우측 말단의 아미노기는 아미드 결합을 통해 N297 글리칸에 있는 β-Man의 1-3 및 1-6 분지쇄 각각에 있는 비환원성 말단의 시알산의 2-위치에서 카복실산에 결합하고;
별표는 링커 L에 대한 결합을 나타내고;
n5는 2 내지 10의 정수를 나타낸다.
[47] [46]에 따른 일부 실시양태에서, n5는 2 내지 5의 정수이다.
[48] [1] 내지 [47] 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서,
m2는 1 또는 2의 정수를 나타내고;
L은 다음의 군으로부터 선택되고:
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)- ("GGVA"는 서열번호: 85로 개시됨),
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(=O)- ("GGVCit"는 서열번호: 88로 개시됨),
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)- 및
-Z1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
여기서 B는 1,4-페닐기이고, Z1은 다음의 구조식을 나타내고:
Z1에 대한 구조식에서,
각각의 별표는 Z1에 인접한 C(=O)에 대한 결합을 나타내고, 각각의 물결선은 Ab의 N297 글리칸에 대한 결합을 나타내고;
Ab는 IgG 항체를 나타내고;
Ab의 N297 글리칸은 N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2, 및 이들의 혼합물, 및 N297-(Fuc)SG 중 어느 하나를 나타내고, N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 및 N297-(Fuc)SG는 다음의 식으로 표시되는 구조를 갖고:
,
또는
상기 식에서,
각각의 물결선은 항체의 Asn297에 대한 결합을 나타내고,
N297 글리칸에 있는 L(PEG)는 -NH-CH2CH2-(O-CH2CH2)n5-*를 나타내고, 여기서 n5는 2 내지 5의 정수를 나타내고, 좌측의 아미노기는 아미드 결합을 통해 N297 글리칸에 있는 β-Man의 1-3 및 1-6 분지쇄 중 하나 또는 각각에 있는 비환원성 말단의 시알산의 2-위치에서 카복실산에 결합하고, 각각의 별표는 링커 L에 있는 Z1의 트리아졸 고리의 1- 또는 3-위치에서의 질소 원자에 대한 결합을 나타낸다.
[49] 다른 양태에서, 본 개시내용은 다음의 군으로부터 선택되는 항체-약물 접합체를 제공한다:
;
;
; 또는
위에 나타낸 각각의 구조식에서,
m2는 1 또는 2의 정수를 나타내고;
Ab는 항-DLL3 IgG 항체 또는 항체의 기능적 단편을 나타내고;
Ab의 N297 글리칸은 N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2, 및 이들의 혼합물, 및 N297-(Fuc)SG 중 어느 하나를 나타내고, N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 및 N297-(Fuc)SG는 다음의 식으로 표시되는 구조를 갖고:
,
또는
상기 식에서,
각각의 물결선은 항체의 Asn297에 대한 결합을 나타내고,
N297 글리칸에 있는 L(PEG)는 -NH-CH2CH2-(O-CH2CH2)3-*를 나타내고, 여기서 좌측 말단의 아미노기는 아미드 결합을 통해 N297 글리칸에 있는 β-Man의 1-3 및 1-6 분지쇄 중 하나 또는 각각에 있는 비환원성 말단의 시알산의 2-위치에서 카복실산에 결합하고, 각각의 별표는 상응하는 구조식에 있는 트리아졸 고리의 1- 또는 3-위치에서의 질소 원자에 대한 결합을 나타낸다.
[50] [49]에 따른 일부 실시양태에서, 항체는 인간 IgG1 또는 이의 변이체, 인간 IgG2, 또는 인간 IgG4의 중쇄 불변 영역을 포함한다.
[51] [49]에 따른 일부 실시양태에서, 항체는 서열번호: 42, 57 또는 58의 중쇄 불변 영역을 포함한다.
[52] [48] 내지 [51] 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 항-DLL3 항체는 중쇄 면역글로불린 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 면역글로불린 가변 도메인 (VL)을 포함하고,
(a) VH는 (i) 각각 서열번호: 3, 서열번호: 4 및 서열번호: 5;
(ii) 각각 서열번호: 13, 서열번호: 14 및 서열번호: 15;
(iii) 각각 서열번호: 23, 서열번호: 24 및 서열번호: 25; 및
(iv) 각각 서열번호: 33, 서열번호: 34 및 서열번호: 35로 이루어진 군으로부터 선택된 VH-CDR1 서열, VH-CDR2 서열 및 VH-CDR3 서열을 포함하고/하거나
(b) VL은 (i) 각각 서열번호: 8, 서열번호: 9 및 서열번호: 10;
(ii) 각각 서열번호: 18, 서열번호: 19 및 서열번호: 20;
(iii) 각각 서열번호: 28, 서열번호: 29 및 서열번호: 30; 및
(iv) 각각 서열번호: 38, 서열번호: 39 및 서열번호: 40으로 이루어진 군으로부터 선택된 VL-CDR1 서열, VL-CDR2 서열 및 VL-CDR3 서열을 포함한다.
[53] [52]에 따른 일부 실시양태에서, 항-DLL3 항체는 중쇄 면역글로불린 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 면역글로불린 가변 도메인 (VL)을 포함하고, (a) VH-CDR1 서열, VH-CDR2 서열 및 VH-CDR3 서열을 포함하는 VH 및 (b) VL-CDR1 서열, VL-CDR2 서열 및 VL-CDR3 서열을 포함하는 VL의 조합은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(i) (a) 각각 서열번호: 3, 서열번호: 4 및 서열번호: 5, 및 (b) 서열번호: 8, 서열번호: 9 및 서열번호: 10;
(ii) (a) 각각 서열번호: 13, 서열번호: 14 및 서열번호: 15, 및 (b) 서열번호: 18, 서열번호: 19 및 서열번호: 20;
(iii) (a) 각각 서열번호: 23, 서열번호: 24 및 서열번호: 25, 및 (b) 서열번호: 28, 서열번호: 29 및 서열번호: 30; 및
(iv) (a) 각각 서열번호: 33, 서열번호: 34 및 서열번호: 35, 및 (b) 서열번호: 38, 서열번호: 39 및 서열번호: 40.
[54] [49] 내지 [53] 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 항체는 다음의 조합 (1) 내지 (4)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 조합으로 경쇄 및 중쇄를 포함하는 항체, 또는 항체의 기능적 단편이다:
(1) 서열번호: 7의 가변 도메인 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호: 2의 가변 도메인 서열을 포함하는 중쇄,
(2) 서열번호: 17의 가변 도메인 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호: 12의 가변 도메인 서열을 포함하는 중쇄,
(3) 서열번호: 27의 가변 도메인 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호: 22의 가변 도메인 서열을 포함하는 중쇄, 및
서열번호: 37의 가변 도메인 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호: 32의 가변 도메인 서열을 포함하는 중쇄.
[55] [54]에 따른 일부 실시양태에서, 항체는 서열번호: 17의 가변 도메인 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호: 12의 가변 도메인 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체이다.
[56] [54]에 따른 일부 실시양태에서, 항체는 서열번호: 27의 가변 도메인 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호: 22의 가변 도메인 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체이다.
[57] [54]에 따른 일부 실시양태에서, 항체는 서열번호: 37의 가변 도메인 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호: 32의 가변 도메인 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체이다.
[58] [54]에 따른 일부 실시양태에서, 항체는 서열번호: 7의 가변 도메인 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호: 2의 가변 도메인 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체이다.
[59] [49] 내지 [58] 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 항체는 다음을 포함한다:
(a) 서열번호: 59 내지 61 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호: 62의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(b) 서열번호: 63 내지 65 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호: 66의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 또는
(c) 서열번호: 67 내지 69 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호: 70의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
[60] [49] 내지 [59] 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 항체는 다음을 포함한다:
(a) 서열번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호: 62의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
(b) 서열번호: 65의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호: 66의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 또는
(c) 서열번호: 69의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호: 70의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
[61] [49] 내지 [60] 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 중쇄 또는 경쇄는 N-결합 글리코실화, O-결합 글리코실화, N-말단 가공, C-말단 가공, 탈아미드화, 아스파르트산의 이성질체화, 메티오닌의 산화, N-말단에의 메티오닌 잔기의 추가, 프롤린 잔기의 아미드화, 중쇄의 위치 234 및 235 (EU 넘버링)에서의 2개의 류신(L) 잔기의 알라닌(A)으로의 치환 (LALA), 중쇄의 위치 356의 아미노산 잔기 Glu(E) 및 위치 358 (EU 인덱스에 따름)의 아미노산 잔기 Met(M)의 집합, 중쇄의 위치 356의 Asp(D) 및 위치 358 (EU 인덱스에 따름)의 류신(L)의 집합 또는 이들의 임의의 조합, N-말단 글루타민 또는 N-말단 글루탐산의 피로글루탐산으로의 전환, 및 카복실 말단에서의 1개 또는 2개의 아미노산의 제거로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 또는 2개 이상의 변형 또는 아미노산 잔기의 집합을 갖는다.
[62] 다른 양태에서, 본 개시내용은 다음의 식으로 표시되는 항체-약물 접합체를 제공한다:
상기 식에서,
m2는 1 또는 2의 정수를 나타내고;
Ab는 서열번호: 61의 아미노산 서열의 중쇄 및 서열번호: 62의 아미노산 서열의 경쇄를 포함하는 항-DLL3 IgG 항체를 나타내고;
Ab의 N297 글리칸은 N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2, 및 이들의 혼합물, 및 N297-(Fuc)SG 중 어느 하나를 나타내고, N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 및 N297-(Fuc)SG는 다음의 식으로 표시되는 구조를 갖고:
,
또는
상기 식에서,
각각의 물결선은 항체의 Asn297에 대한 결합을 나타내고,
N297 글리칸에 있는 L(PEG)는 -NH-CH2CH2-(O-CH2CH2)3-*를 나타내고, 여기서 좌측 말단의 아미노기는 아미드 결합을 통해 N297 글리칸에 있는 β-Man의 1-3 및 1-6 분지쇄 중 하나 또는 각각에 있는 비환원성 말단의 시알산의 2-위치에서 카복실산에 결합하고, 각각의 별표는 상응하는 구조식에 있는 트리아졸 고리의 1- 또는 3-위치에서의 질소 원자에 대한 결합을 나타낸다.
[63] 다른 양태에서, 본 개시내용은 다음의 식으로 표시되는 항체-약물 접합체를 제공한다:
상기 식에서,
m2는 1 또는 2의 정수를 나타내고;
Ab는 서열번호: 65의 아미노산 서열의 중쇄 및 서열번호: 66의 아미노산 서열의 경쇄를 포함하는 항-DLL3 IgG 항체를 나타내고;
Ab의 N297 글리칸은 N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2, 및 이들의 혼합물, 및 N297-(Fuc)SG 중 어느 하나를 나타내고, N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 및 N297-(Fuc)SG는 다음의 식으로 표시되는 구조를 갖고:
,
또는
상기 식에서,
각각의 물결선은 항체의 Asn297에 대한 결합을 나타내고,
N297 글리칸에 있는 L(PEG)는 -NH-CH2CH2-(O-CH2CH2)3-*를 나타내고, 여기서 좌측 말단의 아미노기는 아미드 결합을 통해 N297 글리칸에 있는 β-Man의 1-3 및 1-6 분지쇄 중 하나 또는 각각에 있는 비환원성 말단의 시알산의 2-위치에서 카복실산에 결합하고, 각각의 별표는 상응하는 구조식에 있는 트리아졸 고리의 1- 또는 3-위치에서의 질소 원자에 대한 결합을 나타낸다.
[64] 다른 양태에서, 본 개시내용은 다음의 식으로 표시되는 항체-약물 접합체를 제공한다:
상기 식에서,
m2는 1 또는 2의 정수를 나타내고;
Ab는 서열번호: 69의 아미노산 서열의 중쇄 및 서열번호: 70의 아미노산 서열의 경쇄를 포함하는 항-DLL3 IgG 항체를 나타내고;
Ab의 N297 글리칸은 N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2, 및 이들의 혼합물, 및 N297-(Fuc)SG 중 어느 하나를 나타내고, N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 및 N297-(Fuc)SG는 다음의 식으로 표시되는 구조를 갖고:
,
또는
상기 식에서,
각각의 물결선은 항체의 Asn297에 대한 결합을 나타내고,
N297 글리칸에 있는 L(PEG)는 -NH-CH2CH2-(O-CH2CH2)3-*를 나타내고, 여기서 좌측 말단의 아미노기는 아미드 결합을 통해 N297 글리칸에 있는 β-Man의 1-3 및 1-6 분지쇄 중 하나 또는 각각에 있는 비환원성 말단의 시알산의 2-위치에서 카복실산에 결합하고, 각각의 별표는 상응하는 구조식에 있는 트리아졸 고리의 1- 또는 3-위치에서의 질소 원자에 대한 결합을 나타낸다.
[65] 다른 양태에서, 본 개시내용은 [1] 내지 [64] 중 어느 하나에 따른 항체-약물 접합체, 이의 염, 또는 접합체 또는 염의 수화물을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
[66] [65]에 따른 일부 실시양태에서, 약학적 조성물은 항종양 약물이다.
[67] [65] 또는 [66]에 따른 일부 실시양태에서, 약학적 조성물은 DLL3을 발현하는 종양을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다.
[68] [66] 또는 [67]에 따른 일부 실시양태에서, 종양은 소세포 폐암 (SCLC), 대세포 신경내분비암종 (LCNEC), 신장, 비뇨생식관 (방광, 전립선, 난소, 자궁경부 및 자궁내막), 위장관 (위, 결장), 갑상선 (갑상선 수질암), 췌장 및 폐를 포함한 다양한 조직의 신경내분비종양, 신경아교종 또는 유사 신경내분비종양 (pNET)이다.
[69] 다른 양태에서 본 개시내용은 다음의 단계를 포함하는 글리칸-변형 항체를 제조하는 방법을 제공한다:
i) 항-DLL3 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하고 얻어진 배양물로부터 표적 항체를 수집하는 단계;
ii) 단계 i)에서 얻은 항체를 가수분해효소로 처리하여 (Fucα1,6)GlcNAc-항체를 제조하는 단계; 및
iii)-1 글리칸 공여 분자와 (Fucα1,6)GlcNAc-항체를 트랜스글리코시다제의 존재 하에 반응시키는 단계로서, 글리칸 공여 분자는 아자이드기를 갖는 PEG 링커를 MSG(9) 또는 SG(10)에 있는 시알산의 2-위치에 있는 카복실산의 카보닐기에 도입하고 환원 말단을 옥사졸린화하여 얻은 것인, 단계 또는
iii)-2 (Fucα1,6)GlcNAc-항체와 글리칸 공여 분자를 트랜스글리코시다제의 존재 하에 반응시키는 단계로서, 글리칸 공여 분자는 아자이드기를 갖는 PEG 링커를 α-아미노기가 임의로 보호된 (MSG-)Asn 또는 (SG-)Asn에 있는 시알산의 2-위치에 있는 카복실산의 카보닐기 및 Asn에 있는 카복실산의 카보닐기에 도입하여 가수분해효소의 작용을 유발한 후, 환원 말단을 옥사졸린화하여 얻은 것인, 단계.
[70] [69]에 따른 일부 실시양태에서, 방법은 단계 ii)의 반응 용액을 하이드록시아파타이트 컬럼으로 정제하여 (Fucα1,6)GlcNAc-항체를 정제하는 단계를 추가로 포함한다.
[71] 다른 양태에서 본 개시내용은 다음의 단계를 포함하는 [1] 내지 [64] 중 어느 하나에 따른 항체-약물 접합체 형태를 제조하는 방법을 제공한다:
i) [69] 또는 [70]에 따른 방법을 사용하여 글리칸-변형 항체를 제조하는 단계; 및
ii) DBCO를 갖는 약물-링커와 단계 i)에서 제조된 글리칸-변형 항체의 글리칸에 있는 아자이드기를 반응시키는 단계.
[72] 다른 양태에서 본 개시내용은 [69] 또는 [70]에 따른 방법을 사용하여 얻은 글리칸-변형 항체를 제공한다.
[73] 다른 양태에서 본 개시내용은 [71]에 따른 방법을 사용하여 얻은 항체-약물 접합체를 제공한다.
[74] 다른 양태에서 본 개시내용은 [1] 내지 [64] 중 어느 하나에 따른 항체-약물 접합체, 항체-약물 접합체의 염, 또는 항체-약물 접합체 또는 염의 수화물을 종양을 가진 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 종양을 치료하는 방법을 제공한다.
[75] 다른 양태에서 본 개시내용은 [1] 내지 [64] 중 어느 하나에 따른 항체-약물 접합체, 이의 염, 및 접합체 또는 염의 수화물로부터 선택되는 적어도 하나의 성분을 포함하는 약학적 조성물, 및 적어도 하나의 항종양 약물을 동시에, 개별적으로, 또는 연속적으로 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 종양을 치료하는 방법을 제공한다.
[76] [74] 또는 [75]에 따른 일부 실시양태에서, 종양은 DLL3을 발현하는 종양이다.
[77] [74] 내지 [76] 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 종양은 소세포 폐암 (SCLC), 대세포 신경내분비암종 (LCNEC), 신장, 비뇨생식관 (방광, 전립선, 난소, 자궁경부 및 자궁내막), 위장관 (위, 결장), 갑상선 (갑상선 수질암), 췌장 및 폐를 포함한 다양한 조직의 신경내분비종양, 신경아교종 또는 유사 신경내분비종양 (pNET)이다.
발명의 유리한 효과: 본 발명에 의해 제공되는 신규 항-DLL-3 항체-피롤로벤조다이아제핀(PBD) 유도체 접합체는 항종양 활성 및 안전성이 우수하므로, 항종양 제제로서 유용하다.
도 1은 본 발명의 약물-접합체 형태 ((I)의 분자)의 모식도이다. (a)는 약물 D를 나타내고, (b)는 링커 L을 나타내고, (c)는 N3-L(PEG)-를 나타내고, (d)는 N297 글리칸 (열린 타원: NeuAc(Sia), 열린 육각형: Man, 채워진 육각형: GlcNAc, 열린 다이아몬드: Gal, 열린 역삼각형: Fuc)을 나타낸다. (b)와 (c)는 함께 결합되어 (c)의 아자이드기 (채워진 눈물방울 모양)와 (b)의 스페이서 (열린 반원) 사이의 반응에 의해 트리아졸 고리를 형성한다. Y자형 도형은 항체 Ab를 나타낸다. 편의상, 이 모식도에서, N297 글리칸은 N297-(Fuc)MSG로 표시되고, 도표는 각각의 N297 글리칸의 2개의 분지 중 어느 하나가 아자이드기를 갖는 PEG 링커 (N3-L(PEG)-)가 결합하는 시알산을 갖는 반면 다른 분지는 비환원성 말단에 시알산을 갖지 않는 실시양태 (즉, N297-(Fuc)MSG)를 나타내지만; N297 글리칸의 2개의 분지 각각이 비환원성 말단에서 아자이드기를 갖는 PEG 링커가 결합하는 시알산을 갖는 다른 실시양태 (즉, N297-(Fuc)SG)도 허용될 수 있다. 달리 언급되지 않는 한, 이러한 예시 방식은 본 명세서 전반에 걸쳐 적용된다.
도 2는 본 발명의 약물-접합체 형태의 제조 중간체인 (Fucα1,6)GlcNAc-항체 (도 2의 (II)에서 A 분자) 및 MSG형 글리칸-변형 항체 (도 2의 B에서 (III) 분자)의 구조를 나타낸 모식도이다. 각 도표에서, Y자형 도형은 도 1과 같이 항체 Ab를 나타낸다. 도 2의 A에서, (e)는 글리코사이드 결합을 통해 Fuc의 1-위치에 연결된 6-위치에 GlcNAc만으로 구성된 N297 글리칸을 나타낸다. 도 2의 B에서, (d)는 도 1과 동일한 N297 글리칸을 나타내고, (f)는 아자이드기, 구체적으로는 말단에서 링커 L에 결합될 아자이드기를 갖는 PEG 링커 부분의 구조를 나타낸다. 아자이드기를 갖는 PEG 링커의 결합 방식은 도 1에 기술된 바와 같다.
도 3은 동물세포에서 제조된 항체로부터 MSG형 글리칸-변형 항체를 제조하는 단계에 대한 모식도이다. 도 2와 같이, 본 도면의 분자 (II) 및 (III)은 각각 (Fucα1,6)GlcNAc-항체 및 MSG형 글리칸-변형 항체를 나타낸다. 분자 (IV)는 동물 세포에서 제조된 항체이고, 이종 N297 글리칸 모이어티를 갖는 분자의 혼합물이다. 도 3a는 (IV)의 이종 N297 글리칸 모이어티를 EndoS와 같은 가수분해효소로 처리하여 동종 (Fucα1,6)GlcNAc-항체 (II)를 제조하는 단계를 도시한다. 도 3b는 항체 (II)의 N297 글리칸의 GlcNAc를 EndoS D233Q/Q303L 변이체와 같은 트랜스글리코시다제로 처리하여 MSG형 글리칸 공여 분자의 글리칸을 트랜스글리코실화함으로써 (III)의 MSG형 글리칸-변형 항체를 제조하는 단계를 도시한다. 여기서 사용되는 MSG형 글리칸 공여 분자는 아자이드기를 갖는 PEG 링커로 변형된 MSG의 비환원성 말단에 시알산을 갖는다. 따라서, 생성된 MSG형 N297 글리칸-변형 항체는 또한 도 2b에 기술된 것과 동일한 방식으로 변형된 비환원성 말단에 시알산을 갖는다. 편의상, 도 3b는 MSG를 공여 분자로 나타낸다. 그러나, 아자이드기를 갖는 링커 분자가 N297 글리칸의 각각의 비환원성 말단에 결합하는 글리칸-변형 항체는 또한 SG(10)을 글리칸 공여체로서 사용하여 (III)의 변형 항체와 같이 합성될 수 있다.
도 4: 도 4a는 각각 서열번호: 55 및 서열번호: 50으로 표시되는 호모 사피엔스 델타 유사 정규 노치 리간드 3 (DLL3) 이소형 1의 뉴클레오타이드 서열 및 아미노산 서열을 나타낸다. 도 4b는 각각 서열번호: 56 및 서열번호: 51로 표시되는 호모 사피엔스 델타 유사 정규 노치 리간드 3 (DLL3) 이소형 2의 뉴클레오타이드 서열 및 아미노산 서열을 나타낸다.
도 5: 도 5a는 각각 서열번호: 1 및 서열번호: 2로 표시되는 항체 7-I1-B의 VH 도메인의 뉴클레오타이드 서열 및 아미노산 서열을 나타낸다. VH CDR1 (서열번호: 3)은 굵은 글꼴로 나타냈고, VH CDR2 (서열번호: 4)는 밑줄로 나타냈고, VH CDR3 (서열번호: 5)는 밑줄 그어진 이탤릭체로 나타냈다. 도 5b는 각각 서열번호: 6 및 서열번호: 7로 표시되는 항체 7-I1-B의 VL 도메인의 뉴클레오타이드 서열 및 아미노산 서열을 나타낸다. VL CDR1 (서열번호: 8)은 굵은 글꼴로 나타냈고, VL CDR2 (서열번호: 9)는 밑줄로 나타냈고, VL CDR3 (서열번호: 10)은 밑줄 그어진 이탤릭체로 나타냈다.
도 6: 도 6a는 각각 서열번호: 11 및 서열번호: 12로 표시되는 항체 2-C8-A의 VH 도메인의 뉴클레오타이드 서열 및 아미노산 서열을 나타낸다. VH CDR1 (서열번호: 13)은 굵은 글꼴로 나타냈고, VH CDR2 (서열번호: 14)는 밑줄로 나타냈고, VH CDR3 (서열번호: 15)는 밑줄 그어진 이탤릭체로 나타냈다. 도 6b는 각각 서열번호: 16 및 서열번호: 17로 표시되는 항체 2-C8-A의 VL 도메인의 뉴클레오타이드 서열 및 아미노산 서열을 나타낸다. VL CDR1 (서열번호: 18)은 굵은 글꼴로 나타냈고, VL CDR2 (서열번호: 19)는 밑줄로 나타냈고, VL CDR3 (서열번호: 20)는 밑줄 그어진 이탤릭체로 나타냈다.
도 7: 도 7a는 각각 서열번호: 21 및 서열번호: 22로 표시되는 항체 10-O18-A의 VH 도메인의 뉴클레오타이드 서열 및 아미노산 서열을 나타낸다. VH CDR1 (서열번호: 23)은 굵은 글꼴로 나타냈고, VH CDR2 (서열번호: 24)는 밑줄로 나타냈고, VH CDR3 (서열번호: 25)는 밑줄 그어진 이탤릭체로 나타냈다. 도 7b는 각각 서열번호: 26 및 서열번호: 27로 표시되는 항체 10-O18-A의 VL 도메인의 뉴클레오타이드 서열 및 아미노산 서열을 나타낸다. VL CDR1 (서열번호: 28)은 굵은 글꼴로 나타냈고, VL CDR2 (서열번호: 29)는 밑줄로 나타냈고, VL CDR3 (서열번호: 30)는 밑줄 그어진 이탤릭체로 나타냈다.
도 8: 도 8a는 각각 서열번호: 31 및 서열번호: 32로 표시되는 항체 6-G23-F의 VH 도메인의 뉴클레오타이드 서열 및 아미노산 서열을 나타낸다. VH CDR1 (서열번호: 33)은 굵은 글꼴로 나타냈고, VH CDR2 (서열번호: 34)는 밑줄로 나타냈고, VH CDR3 (서열번호: 35)는 밑줄 그어진 이탤릭체로 나타냈다. 도 8b는 각각 서열번호: 36 및 서열번호: 37로 표시되는 항체 6-G23-F의 VL 도메인의 뉴클레오타이드 서열 및 아미노산 서열을 나타낸다. VL CDR1 (서열번호: 38)은 굵은 글꼴로 나타냈고, VL CDR2 (서열번호: 39)는 밑줄로 나타냈고, VL CDR3 (서열번호: 40)는 밑줄 그어진 이탤릭체로 나타냈다.
도 9는 표시된 항체에 의한 DLL3의 내재화를 검정하기 위해 수행된 세포독성-기반 내재화 검정인 Fab ZAP 검정의 결과를 나타낸다. 기준 DLL3 단일클론 항체 SC16을 양성 대조군으로 사용하였다. WO2015127407 참조. 모든 시험된 항-DLL3 항체는 기준 단일클론 항체와 대등한 사멸 활성을 나타냈다. 유리 항-DLL3이 Fab ZAP에 대해 세포 결합 항-DLL3과 경쟁함에 따라, 더 높은 농도의 항-DLL3 항체에서 후크 효과(hook effect)가 관찰되었다.
도 10: 도 10a-10d는 결합 완충액으로서 PBS 0.1% BSA 0.02% Tween 20을 사용하고 재생 완충액으로서 10 mM 글라이신 PH 1.7을 사용하여 25℃에서 Octet HTX를 통해 측정된 항체 7-I1-B (도 10a), 6-G23-F (도 10b), 10-O18-A (도 10c) 및 2-C8-A (도 10d)에 대한 결합 곡선을 나타낸다. 단일클론 항체 (각각 5 μg/mL)를 항-마우스(mouse) Fc 센서 상에 로딩하고, 로딩된 센서를 200 nM 출발 농도에서 표시된 재조합 인간 DLL3 단백질 (아미노산 Ala27-Ala479, Cat #9749-DL, R&D 시스템)의 희석액 내에 침지하였고, 7회 연속 1:3 희석하였다. 각각의 DLL3 희석에 대하여, 실제 측정 및 곡선 적합도를 나타내었다. 도 10e는 본 명세서에 기재된 4개의 단일클론 항체 (6-G23-F, 2-C8-A, 7-I1-B 및 10-O18-A)에 대한 해리 상수 (KD) 값을 도시하고, 이는 도 10a-10d에 도시된 결합 곡선을 사용하고 1가 (1:1) 결합 모델을 적용하여 계산되었다.
도 11은 6-G23-F, 10-O18-A 및 2-C8-A 단일클론 항체 (mAb)가 DLL1 또는 DLL4가 아닌 DLL3에 선택적으로 결합한다는 것을 보여준다. 7-I1-B mAb는 DLL3과 DLL4 모두와 결합하지만, DLL1과는 결합하지 않는다.
도 12는 하기 VI(E) 절에 기술된 "반응식 R: 항체의 제조"에 대한 반응식을 나타낸다.
도 13은 H2-C8-A에 대한 글리칸 변형 도식을 나타낸다.
도 14는 H6-G23-F에 대한 글리칸 변형 도식을 나타낸다.
도 15는 H10-O18-A에 대한 글리칸 변형 도식을 나타낸다.
도 16은 H2-C8-A ADC를 제조하기 위한 합성 단계를 나타낸다.
도 17은 H6-G23-F ADC를 제조하기 위한 합성 단계를 나타낸다.
도 18은 H10-O18-A ADC를 제조하기 위한 합성 단계를 나타낸다.
도 19는 3개의 인간 항-DLL3-약물 항체-약물 접합체 (H2-C8-A-접합체, H6-G23-F-접합체, H10-O18-A-접합체) 또는 항-LPS 항체-접합체의 생체내 항종양 효과를 나타낸다. 평가는 DLL3-양성 인간 소세포 폐암 세포주 NCI-H209를 면역결핍 마우스에 접종한 동물 모델을 이용하여 수행하였다. 가로축은 접종 후 일수를 나타내고, 세로축은 추정 종양 부피를 나타낸다. 오차 범위는 표준 오차 (SE) 값을 나타낸다. 화살표는 투여 날짜를 나타낸다.
도 20은 3개의 인간 항-DLL3 항체-약물 접합체 (H2-C8-A-접합체, H6-G23-F-접합체, H10-O18-A-접합체) 또는 항-LPS 항체-접합체의 생체내 항종양 효과를 나타낸다. 평가는 DLL3-양성 인간 소세포 폐암 세포주 NCI-H524를 면역결핍 마우스에 접종한 동물 모델을 이용하여 수행하였다. 가로축은 접종 후 일수를 나타내고, 세로축은 추정 종양 부피를 나타낸다. 오차 범위는 표준 오차 (SE) 값을 나타낸다. 화살표는 투여 날짜를 나타낸다.
도 21은 3개의 인간 항-DLL3 항체-약물 접합체 (H2-C8-A-접합체, H6-G23-F-접합체, H10-O18-A-접합체), 또는 항-DLL3 항체-약물 접합체 (SC16LD6.5)의 생체내 항종양 효과를 나타낸다. 평가는 DLL3-양성 인간 소세포 폐암 세포주 NCI-H510A를 면역결핍 마우스에 접종한 동물 모델을 이용하여 수행하였다. 가로축은 접종 후 일수를 나타내고, 세로축은 추정 종양 부피를 나타낸다. 오차 범위는 표준 오차 (SE) 값을 나타낸다. 화살표는 투여 날짜를 나타낸다.
도 22는 H2-C8-A-3에 대한 글리칸 변형 도식을 나타낸다.
도 23은 H10-O18-A-3에 대한 글리칸 변형 도식을 나타낸다.
도 24는 H2-C8-A-3 ADC를 제조하기 위한 합성 단계를 나타낸다.
도 25는 H10-O18-A-3 ADC를 제조하기 위한 합성 단계를 나타낸다.
도 26은 2개의 인간 항-DLL3 항체-약물 접합체 (H2-C8-A-3-접합체, H10-O18-A-3-접합체), 항-DLL3 항체-약물 접합체 (SC16LD6.5) 또는 항-LPS 항체-접합체의 생체내 항종양 효과를 나타낸다. 평가는 DLL3-양성 인간 소세포 폐암 세포주 NCI-H510A를 면역결핍 마우스에 접종한 동물 모델을 이용하여 수행하였다. 가로축은 투여 후 일수를 나타내고, 세로축은 추정 종양 부피를 나타낸다. 오차 범위는 표준 오차 (SE) 값을 나타낸다.
도 27은 2개의 인간 항-DLL3 항체-약물 접합체 (H2-C8-A-3-접합체, H10-O18-A-3-접합체)의 생체내 항종양 효과를 나타낸다. 평가는 DLL3-양성 인간 소세포 폐암 세포주 NCI-H209를 면역결핍 마우스에 접종한 동물 모델을 이용하여 수행하였다. 가로축은 투여 후 일수를 나타내고, 세로축은 추정 종양 부피를 나타낸다. 오차 범위는 표준 오차 (SE) 값을 나타낸다.
도 28은 2개의 인간 항-DLL3 항체-약물 접합체 (H2-C8-A-3-접합체, H10-O18-A-3-접합체), 항-DLL3 항체-약물 접합체 (SC16LD6.5) 또는 항-LPS 항체-접합체의 생체내 항종양 효과를 나타낸다. 평가는 DLL3-양성 인간 소세포 폐암 세포주 NCI-H82를 면역결핍 마우스에 접종한 동물 모델을 이용하여 수행하였다. 가로축은 투여 후 일수를 나타내고, 세로축은 추정 종양 부피를 나타낸다. 오차 범위는 표준 오차 (SE) 값을 나타낸다.
상세한 설명
본 발명의 항체-약물 접합체는 종양세포를 인식하거나 이에 결합할 수 있는 항체에 링커 구조 모이어티를 통해 접합된 항종양 화합물을 갖는 항종양 약물이다.
본 기술의 특정 양태, 방식, 실시양태, 변형 및 특징은 본 기술의 실질적인 이해를 제공하기 위해 다양한 수준의 세부사항으로 아래에 기술된다는 것이 인식되어야 한다.
본 기술을 실시함에 있어서, 분자 생물학, 단백질 생화학, 세포 생물학, 면역학, 미생물학 및 재조합 DNA에 관한 많은 종래 기술들이 사용된다. 예를 들어, Sambrook 및 Russell eds. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition; the series Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology; the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); MacPherson et al. (1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press); MacPherson et al. (1995) PCR 2: A Practical Approach; Harlow 및 Lane eds. (1999) Antibodies, A Laboratory Manual; Freshney (2005) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 5th edition; Gait ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; 미국 특허 등록번호 4,683,195; Hames 및 Higgins eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization; Hames 및 Higgins eds. (1984) Transcription and Translation; Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press (1986)); Perbal (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning; Miller 및 Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory); Makrides ed. (2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells; Mayer 및 Walker eds. (1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); 및 Herzenberg et al. eds (1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology. 참조. 폴리펩타이드 유전자 발현 산물의 수준 (즉, 유전자 번역 수준)을 검출 및 측정하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 항체 검출 및 정량화 기술과 같은 폴리펩타이드 검출 방법의 사용을 포함한다. (또한, Strachan & Read, Human Molecular Genetics, Second Edition. (John Wiley and Sons, Inc., NY, 1999) 참조).
이하, 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시양태를 설명한다. 아래에 기술되는 실시양태는 단지 본 발명의 대표적인 실시양태를 예시할 뿐이고, 이러한 실시예로 인해 본 발명의 범위가 좁게 해석되어서는 안된다는 점에 유의해야 한다.
I. 정의
본 명세서에서, '암'이라는 용어는 '종양'이라는 용어와 동일한 의미로 사용된다.
본 명세서에서, "유전자"라는 용어는 DNA뿐만 아니라 이의 mRNA 및 cDNA, 및 이들의 cRNA를 포함하는 의미로 사용된다.
본 명세서에서, "폴리뉴클레오타이드" 또는 "뉴클레오타이드"라는 용어는 핵산과 동일한 의미로 사용되고, DNA, RNA, 프로브(probe), 올리고뉴클레오타이드 및 프라이머 또한 포함한다. 본 명세서에서, "폴리뉴클레오타이드" 및 "뉴클레오타이드"라는 용어는 달리 명시되지 않는 한 서로 혼용되어 사용될 수 있다.
본 명세서에서, "폴리펩타이드" 및 "단백질"이라는 용어는 서로 혼용되어 사용될 수 있다.
본 명세서에서, "세포"라는 용어는 개별 동물 내의 세포 및 배양된 세포를 포함한다.
본 명세서에서, "DLL3"라는 용어는 DLL3 단백질과 동일한 의미로 사용될 수 있다. 본 명세서에서, 인간 DLL3을 "hDLL3"라고도 한다.
본 명세서에서, "세포독성 활성"이라는 용어는 임의의 주어진 방식으로 세포에 병리학적 변화를 일으키는 것을 의미하도록 사용된다. 본 용어는 직접적인 외상을 의미할 뿐만 아니라, DNA 절단, 염기 이량체의 형성, 염색체 절단, 세포 유사분열 장치(cell mitotic apparatus)의 손상 및 다양한 종류의 효소의 활성 감소와 같은 세포에 발생하는 모든 종류의 구조적 또는 기능적 손상 또한 의미한다.
본 명세서에서, "세포에서 독성을 나타내는"이라는 문구는 어떠한 주어진 방식으로든 세포에 독성이 나타난다는 것을 의미하도록 사용된다. 본 용어는 직접적인 외상을 의미할 뿐만 아니라, DNA 절단, 염기 이량체의 형성, 염색체 절단, 세포 유사분열 장치의 손상, 다양한 종류의 효소의 활성 감소 및 세포 성장 인자의 효과 억제와 같이 세포에 발생하는 모든 종류의 구조적, 기능적 또는 대사적 영향을 의미한다.
본 명세서에서, "항체의 항원 결합 단편"이라고도 불리는 "항체의 기능적 단편"이라는 용어는 항원에 대한 결합 활성을 갖는 항체의 일부 단편을 의미하도록 사용되고, 항체 단편으로부터 형성된 Fab, F(ab')2, scFv, 디아바디(diabody), 선형 항체 및 다중특이적 항체 등을 포함한다. F(ab')2를 환원 조건에서 처리하여 얻은 항체 가변 영역의 1가 단편인 fab' 또한 항체의 항원 결합 단편에 포함된다. 그러나, 항체의 항원 결합 단편은 그것이 항원 결합 능력을 갖는 한, 이러한 분자에 제한되지 않는다. 이러한 항원 결합 단편은 항체 단백질의 전장(full-length) 분자에 적절한 효소를 처리하여 얻은 것뿐만 아니라, 유전적으로 조작된 항체 유전자를 사용하여 적절한 숙주 세포에서 생산된 단백질 또한 포함한다.
본 명세서에서, "에피토프"라는 용어는 특정 항-DLL3 항체가 결합하는 DLL3의 부분 펩타이드 또는 부분 3차원 구조를 의미하도록 사용된다. 이러한 에피토프는 상기 DLL3의 부분 펩타이드로서, 면역분석법과 같이 당업자에게 잘 알려진 방법에 의해 결정될 수 있다. 먼저, 항원의 다양한 부분 구조가 제조된다. 이러한 부분 구조의 제조에 대해서는 공지된 올리고펩타이드 합성 기술이 적용될 수 있다. 예를 들어, DLL3이 이의 C-말단 또는 N-말단으로부터 적절한 길이로 연속적으로 절단된 일련의 폴리펩타이드는 당업자에게 잘 알려진 유전자 재조합 기술에 의해 제조된다. 그 후, 이러한 폴리펩타이드에 대한 항체의 반응성을 연구하고, 인식 부위를 대략적으로 결정한다. 그 후, 더 짧은 펩타이드를 합성하고, 이들 펩타이드에 대한 반응성을 연구하여 에피토프를 결정할 수 있다. 다수의 세포외 도메인을 갖는 막 단백질에 결합하는 항체가 에피토프로서 복수의 도메인으로 구성된 3차원 구조로 향하는 경우, 항체가 결합하는 도메인은 특정 세포외 도메인의 아미노산 서열을 변형시켜 3차원 구조를 변형시킴으로써　결정될 수 있다. 특정 항체에 결합하는 항원의 부분 3차원 구조인 에피토프는 X-선 구조 분석에 의해 항체에 인접한 항원의 아미노산 잔기를 특정함으로써 결정될 수도 있다.
본 명세서에서, "인간화 항체"는 인간 항체 사슬로부터의 가변 영역 프레임워크 잔기를 포함하는 적어도 하나의 사슬 및 비-인간 항체 (예를 들어, 마우스)로부터의 적어도 하나의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 항체를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 "인간 항체"라는 용어는 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하도록 의도된다. 그러나, 본 명세서에서 사용되는 "인간 항체"라는 용어는 마우스와 같은 다른 포유류 종으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 이식된 항체를 포함하도록 의도되지 않는다.
본 명세서에서, "동일한 에피토프에 결합하는 항체"라는 문구는 공통 에피토프에 결합하는 항체를 의미하도록 사용된다. 제1 항체가 결합하는 부분 펩타이드 또는 부분 3차원 구조에 제2 항체가 결합하는 경우, 제1 항체와 제2 항체가 동일한 에피토프에 결합하는 것으로 판단할 수 있다. 대안적으로, 항원에 대한 제1 항체의 결합에 대해 제2 항체가 제1 항체와 경쟁하는 것 (즉, 제2 항체가 항원에 대한 제1 항체의 결합을 방해하는 것)을 확인함으로써, 에피토프의 구체적인 서열 또는 구조가 판단되지 않았다고 하더라도, 제1 항체 및 제2 항체가 동일한 에피토프에 결합하는 것으로 판단할 수 있다. 본 명세서에서, "동일한 에피토프에 결합하는"이라는 문구는 이들 판단 방법 중 어느 하나 또는 모두에 의해 제1 항체 및 제2 항체가 공통 에피토프에 결합하는 것으로 판단된 경우를 의미한다. 제1 항체와 제2 항체가 동일한 에피토프에 결합하고, 나아가 제1 항체가 항종양 활성 또는 내재화 활성 등의 특수한 효과를 갖는 경우, 제2 항체도 제1 항체와 동일한 활성을 갖는 것으로 기대할 수 있다.
본 명세서에서, "CDR"이라는 용어는 상보성 결정 영역을 의미하도록 사용된다. 항체 분자의 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR을 갖는 것으로 알려져 있다. 이러한 CDR은 초가변 영역이라고도 하고, 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역에 위치한다. 이들 영역은 특히 고도로 가변적인 1차 구조를 가지고, 각각의 중쇄 및 경쇄에서 폴리펩타이드 사슬의 1차 구조 상의 3개의 부위로 분리된다. 본 명세서에서, 항체의 CDR과 관련하여, 중쇄의 CDR은 중쇄의 아미노산 서열의 아미노-말단 측으로부터 각각 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3으로 지칭되고, 경쇄의 CDR은 경쇄의 아미노산 서열의 아미노-말단 측으로부터 각각 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3으로 지칭된다. 이들 부위는 3차원 구조 상에서 서로 근접하게 위치하고, 항체가 결합하는 항원에 대한 항체의 특이성을 결정한다.
본 명세서에서 사용되는 "CDR-이식된 항체"라는 용어는 바람직한 항원 특이성을 갖는 "공여체" 항체로부터 "수용체" 항체의 적어도 하나의 CDR이 CDR "이식편"으로 대체된 항체를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 "개체," "환자" 또는 "대상체"라는 용어는 개별 유기체, 척추동물, 포유류 또는 인간일 수 있다. 일부 실시양태에서, 개체, 환자 또는 대상체는 인간이다.
본 명세서에서 사용되는 "약학적으로 허용가능한 담체"라는 용어는 약학적 투여와 양립할 수 있는 임의의 및 모든 용매, 분산 매체, 코팅, 항균 및 항진균 화합물, 등장성 및 흡수 지연 화합물 등을 포함하도록 의도된다. 약학적으로 허용가능한 담체 및 이의 제제는 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences (20th　edition, ed. A. Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA.)에 기재되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 "치료하는" 또는 "치료"는 인간과 같은 대상체에서 본 명세서에 기재된 질환 또는 장애의 치료를 포함하고, 다음을 포함한다: (i) 질환 또는 장애의 억제, 즉 이의 발달 억제; (ii) 질환 또는 장애의 경감, 즉 장애의 퇴행 유발; (iii) 장애의 진행을 늦추는 것; 및/또는 (iv) 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상의 진행을 억제하거나, 경감하거나, 늦추는 것. 일부 실시양태에서, 치료는 질환과 관련된 증상이, 예를 들어 완화되거나, 감소되거나, 치료되거나, 완화 상태에 놓이는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 "특이적으로 결합"은 다른 분자 (예를 들어, 항원)를 인식하고 결합하지만 또 다른 분자를 실질적으로 인식하고 결합하지 않는 분자 (예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편)를 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 "특이적 결합," "특이적으로 결합" 또는 특정 분자 (예를 들어, 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 상의 에피토프)에 "특이적인"이라는 용어는, 예를 들어 결합하는 분자에 대해 약 10-4 M, 10-5 M, 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M 또는 10-12 M의 KD를 갖는 분자에 의해 나타낼 수 있다. "특이적으로 결합"이라는 용어는 또한 분자 (예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편)가 임의의 다른 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 에피토프에 실질적으로 결합하지 않고 특정 폴리펩타이드 (예를 들어, DLL3 폴리펩타이드) 또는 특정 폴리펩타이드 상의 에피토프에 결합하는 결합을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 "1 내지 몇몇"은 1 내지 10, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 또는 1 또는 2를 의미하도록 사용된다.
본 발명에서, "할로젠 원자"의 예는 플루오린 원자, 클로린 원자, 브로민 원자 및 아이오딘 원자를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, "C1 내지 C6 알킬기"는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬기를 의미한다. "C1 내지 C6 알킬기"의 예는 메틸기, 에틸기, n-프로필기, i-프로필기, n-부틸기, i-부틸기, s-부틸기, t-부틸, n-펜틸기 및 n-헥실을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, "C1 내지 C6 알콕시기"는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬기를 갖는 알콕시기를 의미한다. "C1 내지 C6 알콕시기"의 예는 메톡시기, 에톡시기, n-프로폭시기, i-프로폭시기, n-부톡시기, i-부톡시, s-부톡시기, n-펜틸옥시기 및 n-헥실옥시를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, "C1 내지 C6 알킬티오기"는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬기를 갖는 알킬티오기를 의미한다. "C1 내지 C6 알킬티오기"의 예는 메틸티오기, 에틸티오기, n-프로필티오기, i-프로필티오기, n-부틸티오기, i-부틸티오기, s-부틸티오기, t-부틸티오기, n-펜틸티오기 및 n-헥실티오기를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, "3원 내지 5원 포화 탄화수소 고리"는 3 내지 5개의 탄소 원자를 갖는 포화 고리형 탄화수소기를 의미한다. "3원 내지 5원 포화 탄화수소 고리"의 예는 사이클로프로필기, 사이클로부틸기 및 사이클로펜틸기를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, "C3 내지 C5 사이클로알콕시기"는 3 내지 5개의 탄소 원자를 갖는 포화 고리형 탄화수소기를 갖는 사이클로알콕시기를 의미한다. "C3 내지 C5 사이클로알콕시기"의 예는 사이클로프로폭시기, 사이클로부톡시기 및 사이클로펜틸옥시기를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, "3원 내지 5원 포화 헤테로고리"의 예는 1,3-프로필렌 옥사이드, 아자사이클로부탄, 트리메틸렌 설파이드, 테트라하이드로퓨란 및 피롤리딘을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, "아릴기"의 예는 페닐기, 벤질기, 인데닐기, 나프틸기, 플루오레닐기, 안트라닐기 및 페난트레닐기를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, "헤테로아릴기"의 예는 티에닐기, 피롤릴기, 피라졸릴기, 트리아졸릴기, 옥사졸릴기, 옥사디아졸릴기, 티아졸릴기, 피리딜기, 피리미딜기, 피리다질기, 피라지닐기, 퀴놀릴기, 퀴녹살릴기, 벤조티오페닐기, 벤즈이미다졸릴기, 벤조트리아졸릴기 및 벤조퓨라닐기를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, "6원 헤테로고리"의 예는 피리딘 고리, 피리미딘 고리 및 피리다진 고리를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서, "스피로(spiro)-결합된"은, 실시예에 예시된 바와 같이, A와 A가 결합하는 피롤리딘 고리, 또는 E와 E가 결합하는 피롤리딘 고리가 스피로 고리를 형성하는 상황을 의미한다.
II. 델타-유사 리간드 3 (DLL3)
DLL3 (즉, 델타-유사 리간드 3 또는 델타-유사 단백질 3)은 SCLC 및 LCNEC를 포함하는 고등급 폐 신경내분비 종양에서 선택적으로 발현된다. DLL3의 증가된 발현은 SCLC 및 LCNEC 환자-유래 이종이식 종양에서 관찰되었고, 원발성 종양에서도 확인되었다. Saunders et al., Sci Translational Medicine 7(302): 302ra136 (2015) 참조. DLL3의 증가된 발현은 또한 전립선 신경내분비 암종을 포함하는 폐외 신경내분비 암에서 관찰되었다 (Puca et al., Sci Transl Med 11(484): pii: eaav0891 (2019)). DLL3은 이러한 종양 세포의 표면에서 발현되는 반면, 정상 조직에서는 발현되지 않는다. 본 개시내용은 종양 세포 상의 DLL3에 결합 시 내재화하는 면역글로불린-관련 조성물 (예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편)을 제공하고, 따라서 이들 종양 세포에 독성 페이로드(payload)를 전달하는 데 유용하다. 본 기술의 면역글로불린-관련 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에서 DLL3-관련 암을 검출하거나 치료하는 방법에 유용하다. 따라서, 본 방법의 다양한 양태는 항-DLL3 항체의 제조, 특성화 및 조작에 관한 것이다. 본 기술의 면역글로불린-관련 조성물은 암 치료를 위해 단독으로 또는 추가 치료제와 조합되어 유용하다. 일부 실시양태에서, 면역글로불린-관련 조성물은 인간화 항체, 키메라 항체, 또는 이중특이적 항체이다.
초파리의 경우, 노치(Notch) 신호 전달은 주로 노치 수용체에 의해 매개된다. 델타는 인접 세포에서 신호 전달을 활성화하는 노치의 초파리 리간드 중 하나이다. 인간은 4개의 공지된 노치 수용체 (NOTCH1 내지 NOTCH4) 및 델타-유사 리간드로 불리는 델타의 3개의 상동체를 갖는다: DLL1, DLL3 및 DLL4. DLL1 및 DLL4와 달리, DLL3는 노치 신호 전달을 활성화하기 보다는 억제한다는 것이 보고되었다.
DLL3 (델타-유사 3 또는 SCDO1으로도 알려짐)은 노치 DSL 리간드의 델타-유사 패밀리의 구성원이다. 대표적인 DLL3 단백질 이종상동(ortholog)은 다음을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다:
인간 (수탁번호 NP_058637:
MVSPRMSGLLSQTVILALIFLPQTRPAGVFELQIHSFGPGPGPGAPRSPCSARLPCRLFFRVCLKPGLSEEAAESPCALGAALSARGPVYTEQPGAPAPDLPLPDGLLQVPFRDAWPGTFSFIIETWREELGDQIGGPAWSLLARVAGRRRLAAGGPWARDIQRAGAWELRFSYRARCEPPAVGTACTRLCRPRSAPSRCGPGLRPCAPLEDECEAPLVCRAGCSPEHGFCEQPGECRCLEGWTGPLCTVPVSTSSCLSPRGPSSATTGCLVPGPGPCDGNPCANGGSCSETPRSFECTCPRGFYGLRCEVSGVTCADGPCFNGGLCVGGADPDSAYICHCPPGFQGSNCEKRVDRCSLQPCRNGGLCLDLGHALRCRCRAGFAGPRCEHDLDDCAGRACANGGTCVEGGGAHRCSCALGFGGRDCRERADPCAARPCAHGGRCYAHFSGLVCACAPGYMGARCEFPVHPDGASALPAAPPGLRPGDPQRYLLPPALGLLVAAGVAGAALLLVHVRRRGHSQDAGSRLLAGTPEPSVHALPDALNNLRTQEGSGDGPSSSVDWNRPEDVDPQGIYVISAPSIYAREVATPLFPPLHTGRAGQRQHLLFPYPSSILSVK (서열번호: 50)
및 NP_982353:
MVSPRMSGLLSQTVILALIFLPQTRPAGVFELQIHSFGPGPGPGAPRSPCSARLPCRLFFRVCLKPGLSEEAAESPCALGAALSARGPVYTEQPGAPAPDLPLPDGLLQVPFRDAWPGTFSFIIETWREELGDQIGGPAWSLLARVAGRRRLAAGGPWARDIQRAGAWELRFSYRARCEPPAVGTACTRLCRPRSAPSRCGPGLRPCAPLEDECEAPLVCRAGCSPEHGFCEQPGECRCLEGWTGPLCTVPVSTSSCLSPRGPSSATTGCLVPGPGPCDGNPCANGGSCSETPRSFECTCPRGFYGLRCEVSGVTCADGPCFNGGLCVGGADPDSAYICHCPPGFQGSNCEKRVDRCSLQPCRNGGLCLDLGHALRCRCRAGFAGPRCEHDLDDCAGRACANGGTCVEGGGAHRCSCALGFGGRDCRERADPCAARPCAHGGRCYAHFSGLVCACAPGYMGARCEFPVHPDGASALPAAPPGLRPGDPQRYLLPPALGLLVAAGVAGAALLLVHVRRRGHSQDAGSRLLAGTPEPSVHALPDALNNLRTQEGSGDGPSSSVDWNRPEDVDPQGIYVISAPSIYAREA (서열번호: 51));
침팬지 (수탁번호 XP_003316395:
MVSPRMSRLLSQTVILALIFLPQTRPAGVFELQIHSFGPGPGPGAPRSPCSARVPCRLFFRVCLKPGLSEEAAESPCALGAALSARGPVYTEQPGAPAPDLPLPDGLLQVPFRDAWPGTFSFIIETWREELGDQIGGPAWSLLARVAGRRRLAAGGTWARDIQRAGAWELRFSYRARCEPPAVGTACTRLCRPRSAPSRCGPGLRPCAPLEDECEAPPVCRAGCSPEHGFCEQPGECRCLEGWTGPLCTVPVSTSSCLSPRGPSSATTGCLVPGPGPCDGNPCANGGSCSETPGSFECACPRGFYGLRCEVSGVTCADGPCFNGGLCVGGADPDSAYICHCPPGFQGSNCEKRVDRCSLQPCRNGGLCLDLGHALRCRCRAGFAGPRCEHDLDDCAGRACANGGTCVEGGGAHRCSCALGFGGRDCRERADPCAARPCAHGGRCYAHFSGLVCACAPGYMGARCEFPVHPDGASALPAAPPGLRPGDPQRYLLPPALGLLVAAGVAGAALLLVHVRRRGHAQDAGARLLAGTPEPSVHALPDALNNLRTQEGAGDGPSSSVDWNRPEDVDPRGIYVISAPSIYAREA (서열번호: 52));
마우스 (수탁번호 NP_031892:
MVSLQVSPLSQTLILAFLLPQALPAGVFELQIHSFGPGPGLGTPRSPCNARGPCRLFFRVCLKPGVSQEATESLCALGAALSTSVPVYTEHPGESAAALPLPDGLVRVPFRDAWPGTFSLVIETWREQLGEHAGGPAWNLLARVVGRRRLAAGGPWARDVQRTGTWELHFSYRARCEPPAVGAACARLCRSRSAPSRCGPGLRPCTPFPDECEAPSVCRPGCSPEHGYCEEPDECRCLEGWTGPLCTVPVSTSSCLNSRVPGPASTGCLLPGPGPCDGNPCANGGSCSETSGSFECACPRGFYGLRCEVSGVTCADGPCFNGGLCVGGEDPDSAYVCHCPPGFQGSNCEKRVDRCSLQPCQNGGLCLDLGHALRCRCRAGFAGPRCEHDLDDCAGRACANGGTCVEGGGSRRCSCALGFGGRDCRERADPCASRPCAHGGRCYAHFSGLVCACAPGYMGVRCEFAVRPDGADAVPAAPRGLRQADPQRFLLPPALGLLVAAGLAGAALLVIHVRRRGPGQDTGTRLLSGTREPSVHTLPDALNNLRLQDGAGDGPSSSADWNHPEDGDSRSIYVIPAPSIYAREA (서열번호: 53)),
및 래트(rat) (수탁번호 NP_446118:
MVSLQVSSLPQTLILAFLLPQALPAGVFELQIHSFGPGPGPGTPRSPCNARGPCRLFFRVCLKPGVSQEAAESLCALGAALSTSGPVYTEQPGVPAAALSLPDGLVRVPFLDAWPGTFSLIIETWREQLGERAAGPAWNLLARVAGRRRLAAGAPWARDVQRTGAWELHFSYRARCEPPAVGAACARLCRSRSAPSRCGPGLRPCTPFPDECEAPRESLTVCRAGCSPEHGYCEEPDECHCLEGWTGPLCTVPVSTSSCLNSRVSGPAGTGCLLPGPGPCDGNPCANGGSCSETPGSFECACPRGFYGPRCEVSGVTCADGPCFNGGLCVGGEDPDSAYVCHCPPAFQGSNCERRVDRCSLQPCQNGGLCLDLGHALRCRCRAGFAGPRCEHDLDDCAGRACANGGTCVEGGGARRCSCALGFGGRDCRERADPCASRPCAHGGRCYAHFSGLVCACAPGYMGVRCEFAVRPDGADAVPAAPRGLRQADSQRFLLPPALGLLAAAALAGAALLLIHVRRRGPGRDTGTRLLSGTREPSVHTLPDALNNLRLQDGAGDGPTSSADWNHPEDGDSRSIYVIPAPSIYAREA (서열번호: 54)).
인간에서, DLL3 유전자는 염색체 19q13에 위치한 9.5 kBp에 걸친 8개의 엑손으로 구성된다. 마지막 엑손 내의 대체 스플라이싱은 2389 bp의 전사물 (수탁번호 NM_016941 (서열번호: 55)) 및 2052 bp의 전사물 (수탁번호 NM_203486 (서열번호: 56))을 발생시킨다. 전자 전사체는 길이가 618 아미노산인 단백질을 암호화하고(수탁번호 NP_058637 (서열번호: 50)), 후자 전사체는 길이가 587 아미노산인 단백질을 암호화한다 (수탁번호 NP_982353 (서열번호: 51)). 도 4a-4b 참조. DLL3의 이들 2개의 단백질 이소형은 이들의 세포외 도메인 및 이들의 막통과 도메인에 걸쳐 전체적으로 100%의 동일성을 공유하고, 더 긴 이소형이 단백질의 카복시 말단에 32개의 추가 잔기를 함유하는 연장된 세포질 꼬리를 함유한다는 점에서만 다르다.
두 이소형 모두 종양 세포에서 검출될 수 있다. 사실, 비정상 DLL3 발현 (유전자형 및/또는 표현형)은 암 줄기세포 및 종양 개시 세포와 같은 다양한 종양원성 세포 하위 모집단과 관련이 있다. 따라서, 본 개시내용은 이러한 세포 (예를 들어, 암 줄기세포, 종양 개시 세포, 및 암, 예를 들어 소세포 폐암, 대세포 신경내분비 암종, 폐 신경내분비암, 폐외 신경내분비암 및 흑색종)를 표적화하는 데 특히 유용할 수 있는 DLL3 항체를 제공함으로써, 신생물 장애의 치료, 관리 또는 예방을 촉진한다.
본 발명에서 사용되는 DLL3 단백질은 인간 또는 비-인간 포유류 (예를 들어, 래트, 마우스 또는 원숭이)의 DLL3-발현 세포로부터 직접 정제되어 사용될 수 있거나, 전술한 세포의 세포막 분획을 제조하여 DLL3 단백질로 사용할 수 있다. 대안적으로, DLL3은 또한 이를 시험관 내에서 합성하거나, 숙주 세포가 유전자 조작에 의해 DLL3을 생산하도록 함으로써 얻을 수 있다. 이러한 유전자 조작에 따라, 구체적으로 DLL3 cDNA를 발현할 수 있는 벡터에 DLL3 cDNA를 혼입시킨 후, 전사 및 번역에 필요한 효소, 기질 및 에너지 물질을 함유하는 용액에서 DLL3를 합성하거나, DLL3를 발현하도록 다른 원핵생물 또는 진핵생물의 숙주 세포를 형질전환시킴으로써 DLL3 단백질을 얻을 수 있다. 또한, 상기 유전자 조작에 기반한 DLL3-발현 세포 또는 DLL3을 발현하는 세포주를 이용하여 DLL3 단백질을 제공할 수 있다. 대안적으로, DLL3 cDNA가 혼입된 발현 벡터는 면역화될 동물에 직접 투여될 수 있고, DLL3은 동물의 체내에서 발현될 수 있고 따라서 면역화될 수 있다.
또한, 상기 DLL3의 아미노산 서열에서 하나 또는 여러 개의 아미노산의 치환, 결실 및/또는 부가를 포함하는 아미노산 서열로 구성되고, DLL3 단백질과 동등한 생물학적 활성을 갖는 단백질 또한 "DLL3"이라는 용어에 포함된다.
III. 항-DLL3 항체
본 기술은 항-DLL3 면역글로불린-관련 조성물 (예를 들어, 항-DLL3 항체 또는 이의 항원 결합 단편)의 제조 및 사용을 위한 방법 및 조성물을 기술한다. 본 개시내용의 항-DLL3 면역글로불린-관련 조성물은 DLL3 관련 암 (예를 들어, 소세포 폐암, 대세포 신경내분비암종, 폐 신경내분비암, 폐외 신경내분비암 및 흑색종)의 진단 또는 치료에 유용할 수 있다. 본 기술의 범위 내의 항-DLL3 면역글로불린-관련 조성물은, 예를 들어 표적 폴리펩타이드, 상동체, 유도체 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 단일클론, 키메라, 인간화, 인간, 이중특이적 항체 및 디아바디를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 개시내용은 또한 본 명세서에 개시된 임의의 항-DLL3 항체의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 항원 결합 단편은 Fab, F(ab)'2, Fab', scFv 및 Fv로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 기술은 DLL3-항체 복합체의 내재화를 촉진시킬 수 있어 종양 세포에 독성 페이로드를 전달하는 데 유용한 항-DLL3 항체를 개시한다.
도 5-8은 본 명세서에 개시된 항체에 대한 CDR 서열뿐 아니라 VH 및 VL에 대한 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을　제공한다 (서열번호: 1-40). 아래의 표는 또한 본 명세서에 개시된 항체에 대한 CDR 서열뿐 아니라 VH 및 VL에 대한 아미노산 서열을 제공한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 중쇄 면역글로불린 가변 도메인(VH) 및 경쇄 면역글로불린 가변 도메인(VL)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 (a) VH는 (i) 각각 서열번호: 3, 서열번호: 4 및 서열번호: 5; (ii) 각각 서열번호: 13, 서열번호: 14 및 서열번호: 15; (iii) 각각 서열번호: 23, 서열번호: 24 및 서열번호: 25; 및 (iv) 각각 서열번호: 33, 서열번호: 34 및 서열번호: 35로 이루어진 군으로부터 선택된 VH-CDR1 서열, VH-CDR2 서열 및 VH-CDR3 서열을 포함하고/하거나; (b) VL은 (i) 각각 서열번호: 8, 서열번호: 9 및 서열번호: 10; (ii) 각각 서열번호: 18, 서열번호: 19 및 서열번호: 20; (iii) 각각 서열번호: 28, 서열번호: 29 및 서열번호: 30; 및 (iv) 각각 서열번호: 38, 서열번호: 39 및 서열번호: 40으로 이루어진 군으로부터 선택된 VL-CDR1 서열, VL-CDR2 서열 및 VL-CDR3 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 중쇄 면역글로불린 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 면역글로불린 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 (a) VH-CDR1 서열, VH-CDR2 서열, 및 VH-CDR3 서열을 포함하는 VH 및 (b) VL-CDR1 서열, VL-CDR2 서열, 및 VL-CDR3 서열을 포함하는 VL의 조합은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: (i) 각각 (a) 서열번호: 3, 서열번호: 4 및 서열번호: 5, 및 (b) 서열번호: 8, 서열번호: 9 및 서열번호: 10; (ii) 각각 (a) 서열번호: 13, 서열번호: 14 및 서열번호: 15, 및 (b) 서열번호: 18, 서열번호: 19 및 서열번호: 20; (iii) 각각 (a) 서열번호: 23, 서열번호: 24 및 서열번호: 25, 및 (b) 서열번호: 28, 서열번호: 29 및 서열번호: 30; 및 (iv) 각각 (a) 서열번호: 33, 서열번호: 34 및 서열번호: 35, 및 (b) 서열번호: 38, 서열번호: 39 및 서열번호: 40. 일부 실시양태에서, 항체는 임의의 이소형의 Fc 도메인, 예를 들어 IgG (IgG1 및 변이체 (서열번호: 42, 57 및 58), IgG2, IgG3 및 IgG4 포함), IgA (IgA1 및 IgA2 포함), IgD, IgE 또는 IgM, 및 IgY를 추가로 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열번호: 42, 57 또는 58, 바람직하게는 서열번호: 57 또는 58, 더 바람직하게는 서열번호: 58의 중쇄 불변 영역을 포함하고, 불변 영역 서열의 비제한적인 예는 다음을 포함한다:
인간 IgD 불변 영역, 유니프롯(Uniprot): P01880 (서열번호: 41)
APTKAPDVFPIISGCRHPKDNSPVVLACLITGYHPTSVTVTWYMGTQSQPQRTFPEIQRRDSYYMTSSQLSTPLQQWRQGEYKCVVQHTASKSKKEIFRWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDHGPMK
인간 IgG1 불변 영역, 유니프롯: P01857 (서열번호: 42)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
인간 IgG1 변이체 불변 영역 (서열번호: 57)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
인간 IgG1 변이체 불변 영역 (서열번호: 58)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
인간 IgG2 불변 영역, 유니프롯: P01859 (서열번호: 43)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
인간 IgG3 불변 영역, 유니프롯: P01860 (서열번호: 44)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVNHKPSNTKVDKRVELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK
인간 IgM 불변 영역, 유니프롯: P01871 (서열번호: 45)
GSASAPTLFPLVSCENSPSDTSSVAVGCLAQDFLPDSITLSWKYKNNSDISSTRGFPSVLRGGKYAATSQVLLPSKDVMQGTDEHVVCKVQHPNGNKEKNVPLPVIAELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLGQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVMSDTAGTCY
인간 IgG4 불변 영역, 유니프롯: P01861 (서열번호: 46)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
인간 IgA1 불변 영역, 유니프롯: P01876 (서열번호: 47)
ASPTSPKVFPLSLCSTQPDGNVVIACLVQGFFPQEPLSVTWSESGQGVTARNFPPSQDASGDLYTTSSQLTLPATQCLAGKSVTCHVKHYTNPSQDVTVPCPVPSTPPTPSPSTPPTPSPSCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGVTFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAEPWNHGKTFTCTAAYPESKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY
인간 IgA2 불변 영역, 유니프롯: P01877 (서열번호: 48)
ASPTSPKVFPLSLDSTPQDGNVVVACLVQGFFPQEPLSVTWSESGQNVTARNFPPSQDASGDLYTTSSQLTLPATQCPDGKSVTCHVKHYTNPSQDVTVPCPVPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTANITKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRMAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY
인간 Ig 카파(kappa) 불변 영역, 유니프롯: P01834 (서열번호: 49)
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
일부 실시양태에서, 본 기술의 면역글로불린-관련 조성물은 서열번호: 41-48, 57, 58과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 중쇄 불변 영역을 포함한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 본 기술의 면역글로불린-관련 조성물은 서열번호: 49와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 경쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 기술의 면역글로불린-관련 조성물은 DLL3의 세포외 도메인에 결합한다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 입체 에피토프다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 서열번호: 2, 서열번호: 12, 서열번호: 22, 또는 서열번호: 32, 또는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 면역글로불린 가변 도메인 (VH) 아미노산 서열, 또는 서열번호: 59, 서열번호: 60, 서열번호: 61, 서열번호: 63, 서열번호: 64, 서열번호: 65, 서열번호: 67, 서열번호: 68, 또는 서열번호: 69, 또는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 변이체를　포함하는 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 분리된 면역글로불린-관련 조성물 (예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편)을 제공한다.
추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 본 기술의 면역글로불린-관련 조성물은 서열번호: 7, 서열번호: 17, 서열번호: 27, 또는 서열번호: 37, 또는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 변이체를　포함하는 경쇄 면역글로불린 가변 도메인 (VL) 아미노산 서열, 또는 서열번호: 62, 서열번호: 66, 또는 서열번호: 70, 또는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하는 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 기술의 면역글로불린-관련 조성물은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 면역글로불린 가변 도메인 (VH) 또는 중쇄 아미노산 서열, 및 경쇄 면역글로불린 가변 도메인 (VL) 또는 경쇄 아미노산 서열을 포함한다:　각각 서열번호: 2 및 서열번호: 7 (7-I1-B); 각각 서열번호: 12 및 서열번호: 17 (2-C8-A); 각각 서열번호: 59 및 서열번호: 62 (H2-C8-A); 각각 서열번호: 60 및 서열번호: 62 (H2-C8-A-2); 각각 서열번호: 61 및 서열번호: 62 (H2-C8-A-3); 각각 서열번호: 22 및 서열번호: 27 (10-O18-A); 각각 서열번호: 67 및 서열번호: 70 (H10-O18-A); 각각 서열번호: 68 및 서열번호: 70 (H10-O18-A-2); 각각 서열번호: 69 및 서열번호: 70 (H10-O18-A-3); 각각 서열번호: 32 및 서열번호: 37 (6-G23-F).
면역글로불린-관련 조성물의 상기 실시양태 중 어느 하나에서, HC 및 LC 면역글로불린 가변 도메인 서열은 DLL3의 세포외 도메인에 결합하는 항원 결합 부위를 형성한다. 면역글로불린-관련 조성물의 상기 실시양태 중 어느 하나에서, HC 및 LC 면역글로불린 가변 도메인 서열은 DLL3에 결합하는 항원 결합 부위를 형성하고　면역글로불린-관련 조성물의 내재화를 촉진한다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 입체 에피토프다.
일부 실시양태에서, HC 및 LC 면역글로불린 가변 도메인 서열은 동일한 폴리펩타이드 사슬의 구성요소이다. 다른 실시양태에서, HC 및 LC 면역글로불린 가변 도메인 서열은 상이한 폴리펩타이드 사슬의 구성요소이다. 특정 실시양태에서, 항체는 전장 항체이다.
일부 실시양태에서, 본 기술의 면역글로불린-관련 조성물은 하나 이상의 DLL3 폴리펩타이드에 결합하고 이때 해리상수(KD)는　약 10-3 M, 10-4 M, 10-5 M, 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M 또는 10-12 M이다. 특정 실시양태에서, 면역글로불린-관련 조성물은 단일클론 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체 또는 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 항체 프레임워크 영역을 포함한다.
특정 실시양태에서, 면역글로불린-관련 조성물은 다음의 특성 중 하나 이상을 포함한다: (a) 서열번호: 7, 17, 27, 37, 62, 66 또는 70 중 어느 하나로 존재하는 경쇄 면역글로불린 가변 도메인 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 경쇄 면역글로불린 가변 도메인 서열; 및/또는 (b) 서열번호: 2, 12, 22, 32, 59, 60, 61, 63, 64, 65, 67, 68 또는 69　중 어느 하나로 존재하는 중쇄 면역글로불린 가변 도메인 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 중쇄 면역글로불린 가변 도메인 서열. 다른 양태에서, 본 명세서에서 제공되는 면역글로불린-관련 조성물 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 다른 아미노산으로 치환된다. 치환은 본 명세서에서 정의된 바와 같은 "보존적 치환"일 수 있다.
특정 실시양태에서, 면역글로불린-관련 조성물은 N297A 및 K322A, 중쇄의 위치 234 및 235 (EU 인덱스에 따름)에서의 2개의 류신(L) 잔기의 알라닌(A)으로의 2개의 아미노산 치환 (LALA), 중쇄의 위치 356의 Glu(E) 및 위치 358 (EU 인덱스에 따름)의 Met(M)의 아미노산 잔기의 집합, 또는 중쇄의 위치 356의 Asp(D) 및 위치 358 (EU 인덱스에 따름)의 류신(L)의 집합, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환 또는 아미노산 잔기의 집합을　포함하는 IgG1 불변 영역을 함유한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 면역글로불린-관련 조성물은 S228P 돌연변이를 포함하는 IgG4 불변 영역을 함유한다. 상기 LALA 치환을 포함하는 조작된 항체는 독성, PK 프로파일 및 Fc-매개 이펙터 면역 기능에 의해 유발되는 손상된 안정성 중 임의의 바람직하지 않은 효과 없이 항종양 효과를 나타낸다 (Pharmacol Ther. 2019; 200: 110-125).
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 항-DLL3 면역글로불린-관련 조성물은 신속한 결합 및 세포 흡수 및/또는 느린 방출을 용이하게 하기 위해 구조적 변형을 함유한다. 일부 양태에서, 본 기술의 항-DLL3 면역글로불린-관련 조성물 (예를 들어, 항체)은 신속한 결합 및 세포 흡수 및/또는 느린 방출을 용이하게 하기 위해 CH2 불변 중쇄 영역에 결실을 함유할 수 있다. 일부 양태에서, Fab 단편은 신속한 결합 및 세포 흡수 및/또는 느린 방출을 용이하게 하기 위해 사용된다. 일부 양태에서, F(ab)'2 단편은 신속한 결합 및 세포 흡수 및/또는 느린 방출을 용이하게 하기 위해 사용된다.
본 명세서에 기재된 항-DLL3 항체의 아미노산 서열 변형(들)이 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 항-DLL3 항체의 아미노산 서열 변이체는 적절한 뉴클레오타이드 변화를 항체 핵산에 도입하거나 펩타이드 합성에 의해 제조된다. 이러한 변형은, 예를 들어 항체의 아미노산 서열 내의 잔기로부터의 결실 및/또는 잔기로의 삽입 및/또는 잔기의 치환을 포함한다. 얻어진 항체가 원하는 특성을 갖는 한, 관심 항체를 얻기 위해 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 이루어진다. 변형은 또한 단백질의 글리코실화 패턴의 변화를 포함한다. 치환 돌연변이 유발을 위한 가장 중요한 부위는 초가변 영역을 포함하지만, FR 변경도 고려된다. "보존적 치환"은 아래 표에 나타나 있다.
한 유형의 치환 변이체는 모 항체의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 포함한다. 이러한 치환 변이체를 생성하는 편리한 방법은 파지 디스플레이를 이용한 친화도 성숙을 포함한다. 구체적으로, 몇몇 초가변 영역 부위 (예를 들어, 6-7 부위)가 돌연변이되어 각각의 부위에서 모든 가능한 아미노산 치환을 생성한다. 이렇게 제조된 항체 변이체는 각각의 입자 내에 패키징된 M13의 유전자 III 생성물에 대한 융합으로서 사상 파지 입자로부터 1가 방식으로 표시된다. 이어서, 파지-표시된 변이체는 본 명세서에 개시된 바와 같이 그의 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝된다. 변형을 위한 후보 초가변 영역 부위를 확인하기 위해, 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발을 수행하여 항원 결합에 유의미하게 기여하는 초가변 영역 잔기를 확인할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 항체와 항원 사이의 접촉점을 확인하기 위해 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하는 것이 유익할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 인접 잔기는 본 명세서에 설명된 기술에 따른 치환을 위한 후보이다. 일단 이러한 변이체가 생성되면, 변이체의 패널(panel)은 본 명세서에 기재된 바와 같이 스크리닝을 거치고, 하나 이상의 관련 검정에서 유사하거나 우수한 특성을 갖는 항체가 추가 개발을 위해 선택될 수 있다.
일 양태에서, 본 기술은 본 명세서에 기재된 임의의 면역글로불린-관련 조성물을 암호화하는 핵산 서열을 제공한다. 또한 본 명세서에 기재된 임의의 항체를 암호화하는 재조합 핵산 서열이 본 명세서에 개시된다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 서열번호: 1, 6, 11, 16, 21, 26, 31 및 36으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 양태에서, 본 기술은 본 명세서에 기재된 임의의 면역글로불린-관련 조성물을 암호화하는 임의의 핵산 서열을 발현하는 숙주 세포 또는 발현 벡터를 제공한다.
본 기술의 면역글로불린-관련 조성물 (예를 들어, 항-DLL3 항체)은 단일특이적, 이중특이적, 삼중특이적 또는 보다 더 다중특이적일 수 있다. 다중특이적 항체는 하나 이상의 DLL3 폴리펩타이드의 상이한 에피토프에 대해 특이적일 수 있거나 DLL3 폴리펩타이드(들) 뿐만 아니라 이종 폴리펩타이드 또는 고체 지지 물질과 같은 이종 조성물 모두에 대해 특이적일 수 있다. 예를들어, WO　93/17715; WO　92/08802; WO　91/00360; WO　92/05793; Tutt et al., J. Immunol. 147: 60-69 (1991); 미국 특허 등록번호 5,573,920, 4,474,893, 5,601,819, 4,714,681, 4,925,648; 6,106,835; Kostelny et al., J. Immunol. 148: 1547-1553 (1992) 참조. 일부 실시양태에서, 면역글로불린-관련 조성물은 키메라이다. 특정 실시양태에서, 면역글로불린-관련 조성물은 인간화된다.
본 기술의 면역글로불린-관련 조성물은 N 또는 C 말단에서 이종 폴리펩타이드에 재조합적으로 융합되거나 폴리펩타이드 또는 다른 조성물에 화학적으로 접합(공유 및 비공유 접합 포함)될 수 있다. 예를 들어, 본 기술의 면역글로불린-관련 조성물은 검출 검정에서 표지로서 유용한 분자 및 이종 폴리펩타이드, 약물 또는 독소와 같은 이펙터 분자에 재조합적으로 융합되거나 접합될 수 있다. 예를들어, WO　92/08495; WO　91/14438; WO　89/12624; 미국 특허 등록번호 5,314,995; 및 EP　0 396 387 참조.
본 기술의 면역글로불린-관련 조성물의 상기 실시양태 중 임의의 것에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 동위원소, 염료, 크로마겐(chromagen), 조영제, 약물, 독소, 사이토카인, 효소, 효소 억제제, 호르몬, 호르몬 길항제, 성장 인자, 방사성 핵종, 금속, 리포좀, 나노입자, RNA, DNA 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 제제에 임의로 접합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 기술의 항체 또는 항원 결합 단편은 약학적으로 허용 가능한 담체와 조합될 수 있다. 화학적 결합 또는 물리적 결합을 위해, 면역글로불린-관련 조성물 상의 작용기는 일반적으로 제제 상의 작용기와 회합(associate)한다. 대안적으로, 제제 상의 작용기는 면역글로불린-관련 조성물 상의 작용기와 회합한다.
제제 및 면역글로불린-관련 조성물 상의 작용기는 직접적으로 회합할 수 있다. 예를 들어, 제제 상의 작용기(예를 들어, 설프하이드릴기)는 디설파이드를 형성하기 위해 면역글로불린-관련 조성물 상의 작용기(예를 들어, 설프하이드릴기)와 회합할 수 있다. 대안적으로, 작용기는 가교결합제 (즉, 링커)를 통해 회합할 수 있다. 가교결합제의 일부 예가 아래에 기재되어 있다. 가교결합제는 제제 또는 면역글로불린-관련 조성물에 부착될 수 있다. 접합체 내의 제제 또는 면역글로불린-관련 조성물의 수는 또한 다른 것에 존재하는 작용기의 수에 의해 제한된다. 예를 들어, 접합체와 회합된 제제의 최대 수는 면역글로불린-관련 조성물 상에 존재하는 작용기의 수에 따라 달라진다. 대안적으로, 제제와 회합된 면역글로불린-관련 조성물의 최대 수는 제제 상에 존재하는 작용기의 수에 따라 달라진다.
또 다른 실시양태에서, 접합체는 하나의 제제와 회합된 하나의 면역글로불린-관련 조성물을 포함한다. 일 실시양태에서, 접합체는 적어도 하나의 면역글로불린-관련 조성물에 화학적으로 결합된 (예를 들어, 접합된) 적어도 하나의 제제를 포함한다. 제제는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 면역글로불린-관련 조성물에 화학적으로 결합될 수 있다. 예를 들어, 제제 상의 작용기는 면역글로불린-관련 조성물 상의 작용기에 직접 부착될 수 있다. 적합한 작용기의 일부 예는, 예를 들어 아미노, 카복실, 설프하이드릴, 말레이미드, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트 및 하이드록실을 포함한다.
제제는 또한 디알데하이드, 카보디이미드, 디말레이미드 등과 같은 가교결합제에 의해 면역글로불린-관련 조성물에 화학적으로 결합될 수 있다. 가교결합제는, 예를 들어 Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, Ill로부터 얻을 수 있다. Pierce Biotechnology, Inc. 웹사이트에서 도움을 제공할 수 있다. 추가적인 가교결합제는 Kreatech Biotechnology, B.V., Amsterdam, The Netherlands의 미국 특허 등록번호 5,580,990; 5,985,566; 및 6,133,038에 기술된 백금 가교결합제를 포함한다.
대안적으로, 제제 및 면역글로불린-관련 조성물 상의 작용기가 동일할 수 있다. 동종이작용성(Homobifunctional) 가교결합제는 일반적으로 동일한 작용기를 가교결합하는 데 사용된다. 동종이작용성 가교결합제의 예는 EGS (즉, 에틸렌 글리콜 비스[숙신이미딜숙시네이트]), DSS (즉, 디숙신이미딜 수베레이트), DMA (즉, 디메틸 아디피미데이트.2HCl), DTSSP (즉, 3,3'-디티오비스[설포숙신이미딜프로피오네이트])), DPDPB (즉, 1,4-디-[3'-(2'-피리딜디티오)-프로피온아미도]부탄) 및 BMH (즉, 비스-말레이미도헥산)를 포함한다. 이러한 동종이작용성 가교결합제는 또한 Pierce Biotechnology, Inc.로부터 입수가능하다.
다른 경우에, 면역글로불린-관련 조성물로부터 제제를 절단하는 것이 유익할 수 있다. 상기 Pierce Biotechnology, Inc.의 웹 사이트는, 또한, 예를 들어 세포 내의 효소에 의해 절단될 수 있는 적합한 가교결합제를 선택하는 데 있어서 당업자에게 도움을 제공할 수 있다. 따라서, 제제는 면역글로불린-관련 조성물로부터 분리될 수 있다. 절단가능한 링커의 예는 SMPT (즉, 4-숙신이미딜옥시카보닐-메틸-a-[2-피리딜디티오]톨루엔), 설포-LC-SPDP (즉, 설포숙신이미딜 6-(3-[2-피리딜디티오]-프로피온아미도)헥사노에이트), LC-SPDP (즉, 숙신이미딜 6-(3-[2-피리딜디티오]-프로피온아미도)헥사노에이트), 설포-LC-SPDP (즉, 설포숙신이미딜 6-(3-[2-피리딜디티오]-프로피온아미도)헥사노에이트), SPDP (즉, N-숙신이미딜 3-[2-피리딜디티오]-프로피온아미도헥사노에이트) 및 AEDP (즉, 3-[(2-아미노에틸)디티오]프로피온산 HCl)를 포함한다.
다른 실시양태에서, 접합체는 적어도 하나의 면역글로불린-관련 조성물과 물리적으로 결합된 적어도 하나의 제제를 포함한다. 제제를 면역글로불린-관련 조성물과 물리적으로 결합시키기 위해 당업자에게 공지된 임의의 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린-관련 조성물 및 제제는 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 함께 혼합될 수 있다. 혼합 순서는 중요하지 않다. 예를 들어, 면역글로불린-관련 조성물 및 제제를 용기에 넣고, 면역글로불린-관련 조성물 및 작용제를 혼합하기 위해, 예를 들어 용기를 흔들어 교반할 수 있다.
면역글로불린-관련 조성물은 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 변형될 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린-관련 조성물은 상술한 바와 같이 가교결합제 또는 작용기에 의해 변형될 수 있다.
본 발명의 항체는 또한 항체의 변형을 포함한다. 변형은 화학적 또는 생물학적으로 변형된 본 발명의 항체를 의미하는 데 사용된다. 이러한 화학적 변형의 예는 아미노산 골격에 대한 화학적 모이어티의 결합, 및 N-결합 또는 O-결합 탄수화물 사슬의 화학적 변형을 포함한다. 이러한 생물학적 변형의 예는 번역 후 변형 (예를 들어, N-결합 또는 O-결합 글리코실화, N-말단 또는 C-말단 가공, 탈아미드화, 아스파르트산의 이성질체화, 메티오닌의 산화, 및 N-말단 글루타민 또는 N-말단 글루탐산의 피로글루탐산으로의 전환)을 거친 항체, 및 원핵생물 숙주 세포를 사용하여 발현되도록 한 결과 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가된 항체를 포함한다. 또한, 이러한 변형은 본 발명의 항체 또는 항원을 검출 또는 분리할 수 있도록 표지된 항체, 예를 들어 효소로 표지된 항체, 형광으로 표지된 항체 및 친화도-표지된 항체를 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 항체의 이러한 변형은 항체의 혈중 안정성 및 유지력의 개선; 항원성의 감소; 항체 또는 항원의 검출 또는 분리; 등에 유용하다.
또한, 본 발명의 항체에 결합하는 당쇄 변형 (글리코실화, 탈푸코실화 등)을 조절함으로써, 항체 의존성 세포 독성 활성을 향상시킬 수 있다. 항체의 당쇄 변형을 조절하는 기술로서, 국제 공개공보 번호 WO1999/54342, WO2000/61739 및 WO2002/31140, WO2007/133855 등이 알려져 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 항체는 또한 전술한 당쇄 변형이 조절된 항체를 포함한다.
항체 유전자가 분리되면, 숙주와 발현 벡터의 적절한 조합을 이용하여 유전자를 적절한 숙주에 도입함으로써 항체를 제조할 수 있다. 항체 유전자의 구체적인 예는 본 명세서에 기재된 항체의 중쇄 서열을 암호화하는 유전자 및 본 명세서에 기재된 항체의 경쇄 서열을 암호화하는 유전자의 조합일 수 있다. 숙주 세포의 형질전환 시, 이러한 중쇄 서열 유전자 및 경쇄 서열 유전자는 단일 발현 벡터에 삽입될 수 있거나, 이들 유전자는 각각 상이한 발현 벡터에 삽입될 수 있다.
진핵세포가 숙주로 사용되는 경우에는, 동물 세포, 식물 세포 또는 진핵 미생물이 사용될 수 있다. 특히, 동물 세포의 예는 원숭이 세포인 COS 세포 (Gluzman, Y., Cell (1981) 23, p. 175-182, ATCC CRL-1650), 마우스 섬유아세포 NIH3T3 (ATCC 번호 CRL-1658), 중국 햄스터 난소 세포의 디하이드로폴레이트 환원효소-결핍 세포주 (CHO 세포, ATCC CCL-61)(Urlaub, G. 및 Chasin, L. A. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1980) 77, p. 4126-4220) 및 FreeStyle 293F 세포 (Invitrogen Corp.)와 같은 포유류 세포를 포함할 수 있다.
원핵세포가 숙주로 사용되는 경우에는, 예를 들어 대장균(Escherichia coli) 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)가 사용될 수 있다.
형질전환을 위해 관심 항체 유전자가 이들 세포에 도입되고, 그 후 항체를 얻기 위해 형질전환된 세포가 시험관 내에서 배양된다. 전술한 배양에서, 항체의 서열에 따라 수율이 다른 경우가 있으므로, 수율을 지표로 하여 동등한 결합 활성을 갖는 항체 중에서 약제로 생산되기 쉬운 항체를 선택할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체는 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계 및 전술한 단계에서 얻은 배양물로부터 관심 항체 또는 항체의 기능적 단편을 수집하는 단계를 포함하는, 상기 항체 제조 방법에 의해 얻은 항체도 포함한다.
배양된 포유류 세포에서 제조된 항체의 중쇄의 카복실 말단의 라이신 잔기가 결실된 것으로 알려져 있고(Journal of Chromatography A, 705: 129-134 (1995)), 중쇄 카복실 말단의 2개의 아미노산 잔기인 글라이신과 라이신이 결실되고, 카복실 말단에 새로 위치한 프롤린 잔기가 아미드화된 것으로 알려져 있다 (Analytical Biochemistry, 360: 75-83 (2007)). 그러나, 이들 중쇄 서열의 이러한 결실 및 변형은 항체의 항원-결합 활성 및 이펙터 기능 (보체의 활성화, 항체 의존성 세포 독성 등)에 영향을 미치지 않는다. 따라서, 본 발명에 따른 항체는 전술한 변형을 거친 항체 및 항체의 기능적 단편도 포함하고, 이러한 항체의 구체적인 예는 중쇄 카복실 말단에서 1개 또는 2개의 아미노산 결실을 포함하는 결실 돌연변이체, 및 전술한 결실 돌연변이체를 아미드화하여 형성된 결실 돌연변이체 (예를 들어, 카복실 말단 부위의 프롤린 잔기가 아미드화된 중쇄)를 포함한다. 그러나, 본 발명에 따른 항체의 중쇄의 카복실 말단에서의 결실을 포함하는 결실 돌연변이체는 항원 결합 활성 및 이펙터 기능을 보유하는 한, 상기 결실 돌연변이체에 한정되지 않는다. 본 발명에 따른 항체를 구성하는 2개의 중쇄는 전장 항체 및 상기 결실 돌연변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄의 어느 한 유형일 수도 있거나, 전술한 군에서 선택된 임의의 2가지 유형의 조합일 수도 있다. 각각의 결실 돌연변이의 비율은 본 발명에 따른 항체를 생산하는 배양된 포유류 세포의 유형 및 배양 조건에 의해 영향을 받을 수 있다. 본 발명에 따른 항체의 주성분의 예는 2개의 중쇄의 카복실 말단 각각에서 1개의 아미노산 잔기가 결실된 항체를 포함할 수 있다.
항체의 생물학적 활성의 예는 일반적으로 항원 결합 활성, 항원에 결합하여 항원을 발현하는 세포 내로 내재화되는 활성, 항원의 활성을 중화시키는 활성, 항원의 활성을 증진시키는 활성, 항체 의존성 세포독성 (ADCC) 활성, 보체 의존성 세포독성 (CDC) 활성 및 항체 의존성 세포 식균작용 (ADCP)을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 항체의 기능은 DLL3에 대한 결합 활성이고, 바람직하게는 DLL3에 결합하여 DLL3-발현 세포 내로 내재화되는 활성이다. 또한, 본 발명의 항체는 세포 내재화 활성뿐 아니라 ADCC 활성, CDC 활성 및/또는 ADCP 활성을 가질 수 있다.
IV. 항-DLL3 항체의 제조
본 발명의 항-DLL3 항체는 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 종의 바람직한 예는 인간, 원숭이, 래트, 마우스 및 토끼를 포함할 수 있다. 본 발명의 항-DLL3 항체가 인간 이외의 종으로부터 유래된 경우, 항-DLL3 항체를 잘 알려진 기술로 키메라화 또는 인간화하는 것이 바람직하다. 본 발명의 항체는 다중클론 항체 또는 단일클론 항체일 수 있고, 단일클론 항체가 바람직하다.
본 발명의 항-DLL3 항체는 종양 세포를 표적으로 할 수 있는 항체이다. 구체적으로, 본 발명의 항-DLL3 항체는 종양 세포를 인식할 수 있는 특성, 종양 세포에 결합할 수 있는 특성 및/또는 세포 흡수에 의해 종양 세포 내로 내재화되는 특성 등을 갖는다. 따라서, 본 발명의 항-DLL3 항체는 항체-약물 접합체를 제조하기 위해 링커를 통해 항종양 활성을 갖는 화합물에 접합될 수 있다.
종양 세포에 대한 항체의 결합 활성은 유세포 분석으로 확인할 수 있다. 종양 세포로의 항체의 흡수는 (1) 항체에 결합하는 2차 항체(형광 표지됨)를 사용하여 형광 현미경 하에서 세포로 흡수된 항체를 가시화하는 검정 (Cell Death and Differentiation, 2008, 15, 751-761), (2) 항체에 결합하는 2차 항체(형광 표지됨)를 사용하여 세포로 흡수된 형광의 양을 측정하는 검정 (Molecular Biology of the Cell Vol. 15, 5268-5282, December 2004) 또는 (3) 항체에 결합하는 면역독소로서, 세포 성장을 억제하기 위해 세포 흡수 시 방출되는 독소를 사용하는 Mab-ZAP 검정에 의해 확인될 수 있다(Bio Techniques 28: 162-165, January 2000). 단백질 G 및 디프테리아 독소의 촉매 영역의 재조합 접합 단백질이 면역독소로 사용될 수 있다.
본 명세서에서, "높은 내재화 능력"이라는 용어는 전술한 항체 및 사포린-표지된 항-래트 IgG 항체가 투여된 DLL3-발현 세포의 생존율 (100%로 정의된 항체 첨가 없는 세포 생존율에 대한 비율로 표시됨)은 바람직하게는 70% 이하이고, 더 바람직하게는 60% 이하이다.
본 발명의 항종양 항체-약물 접합체는 항종양 효과를 나타내는 접합된 화합물을 포함한다. 따라서, 항체 그 자체가 항종양 효과를 갖는 것이 바람직하나 필수적인 것은 아니다. 종양 세포에서 항종양 화합물의 세포독성을 특이적으로 및/또는 선택적으로 나타내기 위해, 항체가 내재화되어 종양 세포 내로 전달되는 특성을 갖는 것이 중요하고 바람직하다.
항-DLL3 항체는 이 분야에서 통상적으로　수행되는 방법에 의해 항원으로 사용되는 폴리펩타이드로 동물을 면역화한 후, 그 생체 내에서 생산된 항체를 회수하여 정제함으로써 얻을 수 있다. 3차원 구조를 유지하는 DLL3를 항원으로 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 방법의 예는 DNA 면역화 방법을 포함할 수 있다.
항원의 기원은 인간에 한정되지 않고, 따라서, 동물은 마우스 또는 래트와 같은 비-인간 동물로부터 유래된 항원으로도 면역화될 수 있다. 이 경우에, 이종항원에 결합하는 얻어진 항체의 인간 항원과의 교차 반응성을 조사함으로써 인간의 질병에 적용할 수 있는 항체가 선택될 수 있다.
또한, 항원에 대한 항체를 생산하는 항체-생산 세포는 단일클론 항체를 얻기 위해, 공지된 방법 (예를 들어, Kohler and Milstein, Nature (1975) 256, 495-497; 및 Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, 365-367, Plenum Press, N. Y. (1980))에 따라 골수종 세포와 융합되어 하이브리도마를 확립할 수 있다.
이하, DLL3에 대한 항체를 얻는 방법이 구체적으로 설명된다.
일반 개요. 처음에, 본 기술의 항체가 생성될 수 있는 표적 폴리펩타이드를 선택한다. 예를 들어, 항체는 전장 DLL3 단백질에 대해, 또는 DLL3 단백질의 세포외 도메인의 일부에 대해 생성될 수 있다. 이러한 표적 폴리펩타이드에 대한 항체를 생성하는 기술은 당업자에게 잘 알려져 있다. 이러한 기술의 예는, 예를 들어 디스플레이 라이브러리, 제노(xeno) 또는 인간 마우스, 하이브리도마 등을 포함하는 것들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 기술의 범위 내의 표적 폴리펩타이드는 면역 반응을 유도할 수 있는 세포외 도메인을 함유하는 DLL3 단백질로부터 유래된 임의의 폴리펩타이드를 포함한다.
DLL3 단백질 및 이의 단편에 대한 재조합적으로 조작된 항체 및 항체 단편, 예를 들어 항체-관련 폴리펩타이드가 본 개시내용에 따라 사용하기에 적합하다는 것을 이해해야 한다.
본 명세서에 제시된 기술에 적용될 수 있는 항-DLL3 항체는 단일클론 및 다중클론 항체, 및 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, scFv, 디아바디, 항체 경쇄, 항체 중쇄 및/또는 항체 단편과 같은 항체 단편을 포함한다. 항체 Fv-함유 폴리펩타이드, 예를 들어 Fab' 및 F(ab')2 항체 단편의 고수율 생산에 유용한 방법이 기술되어 왔다. 미국 특허 등록번호 5,648,237 참조.
일반적으로, 항체는 기원 종으로부터 얻어진다. 더 구체적으로, 표적 폴리펩타이드 항원에 대한 특이성을 갖는 기원 종 항체의 경쇄, 중쇄 또는 둘 모두의 가변 부분의 핵산 또는 아미노산 서열이 얻어진다. 기원 종은 본 기술의 항체 또는 항체의 라이브러리를 생성하는 데 유용한 임의의 종, 예를 들어 래트, 마우스, 토끼, 닭, 원숭이, 인간 등이다.
파지 또는 파지미드 디스플레이 기술 (phagemid display technology)은 본 기술의 항체를 이끌어내는 데 유용한 기술이다. 단일클론 항체를 생성 및 클로닝하는 기술은 당업자에게 잘 알려져 있다. 본 기술의 항체를 암호화하는 서열의 발현은 대장균에서 수행될 수 있다.
핵산 암호화 서열의 축퇴성으로 인해, 자연 발생 단백질의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 다른 서열이 본 기술의 실시에 사용될 수 있다. 이들은 서열 내에서 기능적으로 동등한 아미노산 잔기를 암호화하는 상이한 코돈의 치환에 의해 변경되어, 침묵 변경을 만들어내는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 핵산 서열을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 기술에 따른 면역글로불린의 뉴클레오타이드 서열은, 변이체가 DLL3 단백질을 인식하는 효능이 있는 항체를 형성하는 한, 표준 방법 ("Current Methods in Sequence Comparison and Analysis," Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp. 127-149, 1998, Alan R. Liss, Inc.)에 의해 계산되는 최대 25%의 서열 상동성 변이를 허용한다는 것이 이해된다. 예를 들어, 폴리펩타이드 서열 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 기능적 등가물로서 작용하는 유사한 극성의 다른 아미노산으로 치환되어, 침묵 변경을 초래할 수 있다. 서열 내의 아미노산에 대한 치환체는, 그 아미노산이 속하는 부류의 다른 구성원으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 비극성(소수성) 아미노산은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함한다. 극성 중성 아미노산은 글라이신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라진 및 글루타민을 포함한다. 양전하 (염기성) 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함한다. 음전하 (산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 또한 본 기술의 범위 내에, 예를 들어 글리코실화, 단백질 가수분해적 절단(proteolytic cleavage), 항체 분자 또는 다른 세포 리간드에의 연결 등에 의해, 번역 동안 또는 번역 후에 차등적으로 변형되는 단백질 또는 이의 단편 또는 유도체가 포함된다. 추가로, 면역글로불린 암호화 핵산 서열은 번역, 개시 및/또는 종결 서열을 생성하고/하거나 파괴하거나 암호화 영역에 변이를 생성하고/하거나 새로운 제한 엔도뉴클레아제 부위를 형성하거나 기존의 것들을 파괴하여 추가 시험관 내 변형을 촉진하기 위해, 시험관 내 또는 생체 내에서 돌연변이될 수 있다. 당업계에 공지된 임의의 돌연변이 유발 기술이 사용될 수 있고, 여기에는 시험관 내 부위 지정 돌연변이 유발, J. Biol. Chem. 253:6551, 탭 링커(Tab linker)(Pharmacia)의 사용 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
다중클론 항혈청 및 면역원의 제조. 본 기술의 항체 또는 항체 단편을 생성하는 방법은 일반적으로 대상체(일반적으로 마우스 또는 토끼와 같은 비-인간 대상체)를 정제된 DLL3 단백질 또는 이의 단편 또는 DLL3 단백질 또는 이의 단편을 발현하는 세포로 면역화시키는 것을 포함한다. 적절한 면역원성 제제는, 예를 들어 재조합적으로 발현된 DLL3 단백질 또는 화학적으로 합성된 DLL3 펩타이드를 함유할 수 있다. DLL3 단백질, 또는 이의 일부 또는 단편의 세포외 도메인은 다중클론 및 단일클론 항체 제조를 위한 표준 기술을 사용하여 DLL3 단백질, 또는 이의 일부 또는 단편에 결합하는 항-DLL3 항체를 생성하기 위한 면역원으로 사용될 수 있다.
전장 DLL3 단백질 또는 이의 단편은 면역원으로서 단편으로서 유용하다. 일부 실시양태에서, DLL3 단편은 펩타이드에 대해 생성된 항체가 DLL3 단백질과 특이적 면역 복합체를 형성하도록 DLL3의 세포외 도메인을 포함한다.
DLL3의 세포외 도메인의 길이는 466개의 아미노산 길이만큼 되고,　전장 DLL3 단백질의 아미노산 27-492에 걸쳐 있다. 일부 실시양태에서, 항원성 DLL3 펩타이드는 적어도 5, 8, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 또는 450개의 아미노산 잔기를 포함한다. 용도 및 당업자에게 잘 알려진 방법에 따라, 더 긴 항원성 펩타이드는 때때로 더 짧은 항원성 펩타이드보다 바람직하다. 주어진 에피토프의 다량체는 때때로 단량체보다 더 효과적이다.
필요한 경우, DLL3 단백질(또는 이의 단편)의 면역원성은 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH) 또는 난알부민 (OVA)과 같은 담체 단백질에 대한 융합 또는 접합에 의해 증가될 수 있다. 많은 이러한 담체 단백질이 당업계에 공지되어 있다. 또한, 폴리펩타이드에 대한 대상체의 면역 반응을 증가시키기 위해 DLL3 단백질을 프로인드의 완전 또는 불완전 보조제 (Freund's complete or incomplete adjuvant)와 같은 종래의 보조제와 조합할 수 있다. 면역학적 반응을 증가시키기 위해 사용되는 다양한 보조제는 프로인드의 것 (완전 및 불완전), 미네랄 젤 (예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 표면 활성 물질 (예를 들어, 라이소레시틴, 플루로닉 폴리올, 폴리음이온, 펩타이드, 오일 에멀젼, 디니트로페놀 등), 바실리 칼메트-게린 (Bacille Calmette-Guerin) 및 코리네박테리움 파르붐 (Corynebacterium parvum)과 같은 인간 보조제, 또는 유사한 면역자극성 화합물을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 이들 기술은 이 분야에서 표준이다.
본 기술을 기술함에 있어서, 면역 반응은 "1차" 또는 "2차" 면역 반응으로 기술될 수 있다. "보호" 면역 반응으로도 기술되는 1차 면역 반응은 특정 항원, 예를 들어 DLL3 단백질에 대한 일부 초기 노출 (예를 들어, 초기 "면역화")의 결과로 개체에서 생성되는 면역 반응을 의미한다. 일부 실시양태에서, 면역화는 개체를 항원을 함유하는 백신으로 백신접종한 결과 발생할 수 있다. 예를 들어, 백신은 하나 이상의 DLL3 단백질-유래 항원을 포함하는 DLL3 백신일 수 있다. 1차 면역 반응은 시간이 지남에 따라 약화되거나 약해질 수 있고 심지어 사라지거나 적어도 검출할 수 없을 정도로 약해질 수 있다. 따라서, 본 기술은 또한 여기에서 "기억 면역 반응"으로 기술되는　"2차" 면역 반응에 관한 것이다. 2차 면역 반응이라는 용어는 1차 면역 반응이 이미 생성된 후 개체에서 유도된 면역 반응을 의미한다.
따라서, 예를 들어 약화되거나 약해진 기존의 면역 반응을 증진시키거나, 사라졌거나 더 이상 검출될 수 없는 이전의 면역 반응을 재생성하기 위해, 2차 면역 반응이 유도될 수 있다. 2차 또는 기억 면역 반응은 체액성 (항체) 반응 또는 세포성 반응일 수 있다. 2차 또는 기억 체액성 반응은 항원의 첫 번째 제시에서 생성된 기억 B 세포의 자극 시 발생한다. 지연형 과민(DTH) 반응은 CD4+ T 세포에 의해 매개되는 일종의 세포성 2차 또는 기억 면역 반응이다. 항원에 대한 첫 번째 노출은 면역 체계를 준비시키고 추가 노출(들)은 DTH를 초래한다.
적절한 면역화 후에, 항-DLL3 항체는 대상체의 혈청으로부터 제조될 수 있다. 원하는 경우, DLL3 단백질에 대한 항체 분자는 포유류로부터 (예를 들어, 혈액으로부터) 분리될 수 있고, IgG 분획을 얻기 위해 폴리펩타이드 A 크로마토그래피와 같은 잘 알려진 기술에 의해 추가로 정제될 수 있다.
단일클론 항체. 본 기술의 일 실시양태에서, 항체는 항-DLL3 단일클론 항체이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 항-DLL3 단일클론 항체는 인간 또는 마우스 항-DLL3 단일클론 항체일 수 있다. DLL3 단백질, 또는 이의 유도체, 단편, 유사체 또는 상동체에 대한 단일클론 항체의 제조를 위해, 연속 세포주 배양에 의해 항체 분자의 생산을 제공하는 임의의 기술이 이용될 수 있다. 이러한 기술은 인간 단일클론 항체를 생산하기 위해 하이브리도마 기술 (예를 들어, Kohler & Milstein, 1975. Nature 256: 495-497 참조); 트리오마(trioma) 기술; 인간 B 세포 하이브리도마 기술 (예를 들어, Kozbor, et al., 1983. Immunol. Today 4: 72 참조) 및 EBV 하이브리도마 기술를 포함하나, 이에 제한되지 않는다 (예를 들어, Cole, et al., 1985. In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 참조). 인간 단일클론 항체는 본 기술의 실시에 이용될 수 있고, 인간 하이브리도마를 사용하거나 (예를 들어, Cote, et al., 1983. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030 참조), 시험관 내에서 엡스타인 바 바이러스로 인간 B 세포를 형질전환시킴으로써 (예를 들어, Cole, et al., 1985. In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 참조) 생산될 수 있다. 예를 들어, 항체의 영역을 암호화하는 핵산의 집단이 분리될 수 있다. 항체의 보존된 영역을 암호화하는 서열로부터 유래된 프라이머를 이용하는 PCR은 집단으로부터 항체의 일부를 암호화하는 서열을 증폭시키는 데 사용되고, 그 후 항체 또는 이의 단편, 예컨대 가변 도메인을 암호화하는 DNA가 증폭된 서열로부터 재구성된다. 이러한 증폭된 서열은 또한 파지 또는 박테리아 상에서 융합 폴리펩타이드의 발현 및 디스플레이를 위해 다른 단백질 - 예를 들어, 박테리오파지 코트 또는 박테리아 세포 표면 단백질 - 을 암호화하는 DNA에 융합될 수 있다. 이어서, 증폭된 서열은 발현되고, 예를 들어 DLL3 단백질 상에 존재하는 항원 또는 에피토프에 대해 발현된 항체 또는 이의 단편의 친화도에 기초하여 추가로 선택되거나 분리될 수 있다. 대안적으로, 항-DLL3 단일클론 항체를 발현하는 하이브리도마는 대상체를 면역화시키고 이어서 일상적인 방법을 사용하여 대상체의 비장으로부터 하이브리도마를 분리함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, Milstein et al., (Galfre 및 Milstein, Methods Enzymol (1981) 73: 3-46) 참조. 표준 방법을 사용하여 하이브리도마를 스크리닝하면 다양한 특이성 (즉, 상이한 에피토프에 대해) 및 친화도의 단일클론 항체가 생성될 것이다. 원하는 특성, 예를 들어 DLL3 결합을 갖는 선택된 단일클론 항체는 하이브리도마에 의해 발현되는 바와 같이 사용될 수 있고, 이는 그의 특성을 변경하기 위해 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 분자에 결합될 수 있거나, 이를 암호화하는 cDNA는 다양한 방식으로 분리되고, 시퀀싱되고, 조작될 수 있다. 합성 덴드로메릭 트리(Synthetic dendromeric tree)는 DLL3 단백질의 면역원성 특성을 향상시키기 위해 반응성 아미노산 측쇄, 예를 들어 라이신에 부가될 수 있다. 또한, CPG-디뉴클레오타이드 기술은 DLL3 단백질의 면역원성 특성을 향상시키는 데 사용될 수 있다. 다른 조작은 보관 중 또는 대상체에게 투여한 후 항체의 불안정성에 기여하는 특정 아미노 아실 잔기를 치환하거나 결실시키는 것, 및 DLL3 단백질의 항체의 친화도를 향상시키기 위한 친화도 성숙 기술을 포함한다.
하이브리도마 기술. 일부 실시양태에서, 본 기술의 항체는 불멸화 세포에 융합된 인간 중쇄 전이유전자 및 경쇄 전이유전자를 포함하는 게놈을 갖는 형질전환 비-인간 동물, 예를 들어 형질전환 마우스로부터 얻은 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생성된 항-DLL3 단일클론 항체이다. 하이브리도마 기술은 당업계에 공지되어 있고 Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 349 (1988); Hammerling et al., Monoclonal Antibodies And T-Cell Hybridomas, 563-681 (1981)에 교시되어 있는 것들을 포함한다. 하이브리도마 및 단일클론 항체를 제조하기 위한 다른 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
파지 디스플레이 기술. 상기 언급된 바와 같이, 본 기술의 항체는 재조합 DNA 및 파지 디스플레이 기술의 적용을 통해 제조될 수 있다. 예를 들어, 항-DLL3 항체는 당업계에 공지된 다양한 파지 디스플레이 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 파지 디스플레이 방법에서, 기능적 항체 도메인은 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 운반하는 파지 입자의 표면에 디스플레이된다. 목적하는 결합 특성을 갖는 파지는 항원, 일반적으로 고체 표면 또는 비드에 결합되거나 포획된 항원으로 직접 선택함으로써 레퍼토리 또는 조합 항체 라이브러리 (예를 들어, 인간 또는 뮤린)로부터 선택된다. 이들 방법에서 사용되는 파지는 일반적으로 파지 유전자 III 또는 유전자 VIII 단백질에 재조합적으로 융합된 Fab, Fv 또는 디설파이드 안정화된 Fv 항체 도메인을 갖는 fd 및 M13을 포함하는 사상 파지이다. 또한, 방법은 DLL3 폴리펩타이드, 예를 들어 폴리펩타이드 또는 이의 유도체, 단편, 유사체 또는 상동체에 대해 목적하는 특이성을 갖는 단일클론 Fab 단편의 신속하고 효과적인 식별을 가능하게 하기 위해 Fab 발현 라이브러리 (예를 들어,　Huse, et al., Science 246: 1275-1281, 1989 참조)의 제작에 적용될 수 있다. 본 기술의 항체를 제조하는 데 사용될 수 있는 파지 디스플레이 방법의 다른 예는 Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 85: 5879-5883, 1988; Chaudhary et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 87: 1066-1070, 1990; Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182: 41-50, 1995; Ames et al., J. Immunol. Methods 184: 177-186, 1995; Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24: 952-958, 1994; Persic et al., Gene 187: 9-18, 1997; Burton et al., Advances in Immunology 57: 191-280, 1994; PCT/GB91/01134; WO　90/02809; WO　91/10737; WO　92/01047; WO　92/18619; WO　93/11236; WO　95/15982; WO　95/20401; WO　96/06213; WO　92/01047 (Medical Research Council et al.); WO　97/08320 (Morphosys); WO　92/01047 (CAT/MRC); WO　91/17271 (Affymax); 및 미국 특허 등록번호 5,698,426, 5,223,409, 5,403,484, 5,580,717, 5,427,908, 5,750,753, 5,821,047, 5,571,698, 5,427,908, 5,516,637, 5,780,225, 5,658,727 및 5,733,743에 개시된 것들을 포함한다. 디설파이드 결합을 통해 폴리펩타이드를 부착시킴으로써 박테리오파지 입자의 표면 상에 폴리펩타이드를 디스플레이하는 데 유용한 방법은 Lohning, 미국 특허 등록번호 6,753,136에 의해 기술되었다. 위의 참조에 기술된 바와 같이, 파지 선택 후, 파지로부터의 항체 암호화 영역은 분리되어 인간 항체 또는 임의의 다른 목적하는 항원 결합 단편을 포함하는 전체 항체를 생성하는 데 사용될 수 있고, 포유류 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 및 박테리아를 포함하는 임의의 목적하는 숙주에서 발현될 수 있다. 예를 들어, Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편을 재조합적으로 제조하는 기술은 또한 WO　92/22324; Mullinax et al., BioTechniques 12: 864-869, 1992; and Sawai et al., AJRI 34: 26-34, 1995; 및 Better et al., Science 240: 1041-1043, 1988에 개시된 것들과 같이 당업계에 공지된 방법을 사용하여 활용될 수 있다.
일반적으로, 항체 또는 항체 단편이 파지 또는 파지미드 입자의 표면 상에 존재할 것이기 때문에, 좋은 결합 활성을 유지하는 변이체를 식별하기 위해 디스플레이 벡터 내로 클로닝된 하이브리드 항체 또는 하이브리드 항체 단편은 적절한 항원에 대해 선택될 수 있다. 예를 들어, Barbas III et al., Phage Display, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001) 참조. 그러나, 선택 및/또는 스크리닝을 위해 항체 단편 라이브러리를 용해성 파지 벡터 (변형된 T7 또는 람다 Zap 시스템)내로 클로닝하는 것과 같은 다른 벡터 포맷이 이 공정에 사용될 수 있다.
재조합 항-DLL3 항체의 발현. 상기 언급된 바와 같이, 본 기술의 항체는 재조합 DNA 기술의 적용을 통해 제조될 수 있다. 본 기술의 항-DLL3 항체를 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오타이드 구조체는 일반적으로 천연-회합 또는 이종 프로모터 영역을 포함하는 항-DLL3 항체 사슬의 암호화 서열에 작동가능하게 연결된 발현 조절 서열을 포함한다. 이와 같이, 본 기술의 다른 양태는 본 기술의 항-DLL3 항체를 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 함유하는 벡터를 포함한다. 본 기술의 하나 이상의 폴리펩타이드의 재조합 발현을 위해, 항-DLL3 항체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부를 함유하는 핵산은 당업계에 잘 알려져 있고 아래에 상세히 설명되는 재조합 DNA 기술에 의해 적절한 클로닝 벡터 또는 발현 벡터 (즉, 삽입된 폴리펩타이드 암호화 서열의 전사 및 번역에 필요한 요소를 함유하는 벡터)에 삽입된다. 다양한 벡터 집단을 생산하는 방법은 Lerner et al., 미국 특허 등록번호 6,291,160 및 6,680,192에 의해 기술되었다.
일반적으로, 재조합 DNA 기술에 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태이다. 본 개시내용에서, 플라스미드가 가장 일반적으로 사용되는 벡터의 형태이므로, "플라스미드"와 "벡터"는 혼용하여 사용될 수 있다. 그러나, 본 기술은 기술적으로 플라스미드가 아닌 다른 형태의 발현 벡터, 예컨대 동등한 기능을 갖는 바이러스 벡터 (예를 들어, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)를 포함하도록 의도된다. 이러한 바이러스 벡터는 대상체의 감염 및 해당 대상체에서의 구조체의 발현을 가능하게 한다. 일부 실시양태에서, 발현 조절 서열은 진핵 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시킬 수 있는 벡터 내의 진핵 프로모터 시스템이다. 일단 벡터가 적절한 숙주에 혼입되면, 숙주는 항-DLL3 항체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 고수준 발현, 및 항-DLL3 항체, 예를 들어 교차-반응 항-DLL3 항체의 수집 및 정제에 적합한 조건 하에 유지된다. 일반적으로, U.S. 2002/0199213 참조. 이들 발현 벡터는 일반적으로 에피좀으로서 또는 숙주 염색체 DNA의 필수적인 부분으로서 숙주 유기체 내에서 복제가능하다. 통상적으로, 발현 벡터는 목적하는 DNA 서열로 형질전환된 세포의 검출을 가능하게 하기 위해 선택 마커, 예를 들어 암피실린-내성 또는 하이그로마이신-내성을 함유한다. 벡터는 또한 세포외 항체 단편의 분비를 지시하는 데 유용한 신호 펩타이드, 예를 들어 펙테이트 분해효소를 암호화할 수 있다. 미국 특허 등록번호 5,576,195 참조.
본 기술의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서의 핵산의 발현에 적합한 형태로 DLL3 결합 특성을 갖는 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하고, 이는 재조합 발현 벡터가 발현될 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 발현에 사용될 숙주 세포에 기초하여 선택된 하나 이상의 조절 서열을 포함한다는 것을 의미한다. 재조합 발현 벡터 내에서, "작동가능하게 연결된"은 (예를 들어, 시험관 내 전사/번역 시스템 또는 벡터가 숙주 세포 내로 도입되는 경우 숙주 세포에서) 뉴클레오타이드 서열의 발현을 허용하는 방식으로 관심 뉴클레오타이드 서열이 조절 서열(들)에 연결된 것을 의미하도록 의도된다. "조절 서열"이라는 용어는 프로모터, 인핸서 및 기타 발현 조절 요소 (예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함하도록 의도된다. 이러한 조절 서열은 예를 들어, Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)에 기술되어 있다. 조절 서열은 여러 유형의 숙주 세포에서 뉴클레오타이드 서열의 구성적 발현을 지시하는 것들 및 특정 숙주 세포에서만 뉴클레오타이드 서열의 발현을 지시하는 것들 (예를 들어, 조직-특이적 조절 서열)을 포함한다. 발현 벡터의 설계는 형질전환될 숙주 세포의 선택, 목적하는 폴리펩타이드의 발현 수준 등과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 재조합 폴리펩타이드 발현 (예를 들어, 항-DLL3 항체)의 프로모터로서 유용한 전형적인 조절 서열은 예를 들어, 3-포스포글리세레이트 키나아제 및 다른 당분해 효소의 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 유도성 효모 프로모터는 무엇보다도 알코올 탈수소효소, 이소사이토크롬 C, 및 말토스 및 갈락토스 이용을 담당하는 효소로부터의 프로모터를 포함한다. 일 실시양태에서, 본 기술의 항-DLL3 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 ara B 프로모터에 작동가능하게 연결되고 숙주 세포에서 발현가능하다. 미국 특허 등록번호 5,028,530 참조. 본 기술의 발현 벡터는 숙주 세포에 도입되어 본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산에 의해 암호화되는 융합 폴리펩타이드 (예를 들어, 항-DLL3 항체 등)를 포함하는 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 생산할 수 있다.
본 기술의 다른 양태는 하나 이상의 항-DLL3 항체를 암호화하는 핵산을 함유하는 항-DLL3 항체-발현 숙주 세포에 관한 것이다. 본 기술의 재조합 발현 벡터는 원핵 또는 진핵 세포에서의 항-DLL3 항체의 발현을 위해 설계될 수 있다. 예를 들어, 항-DLL3 항체는 대장균과 같은 박테리아 세포, 곤충 세포 (바큘로바이러스 발현 벡터 사용), 진균 세포, 예를 들어 효모, 효모 세포 또는 포유류 세포에서 발현될 수 있다. 적합한 숙주 세포는 Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)에 더 기술되어 있다. 대안적으로, 재조합 발현 벡터는, 예를 들어 T7 프로모터 조절 서열 및 T7 폴리머라제를 사용하여 시험관 내에서 전사되고 번역될 수 있다. 확률적으로 생성된 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현을 통한 미리 결정된 특성을 갖는 폴리펩타이드, 예를 들어 항-DLL3 항체의 제조 및 스크리닝에 유용한 방법은 이전에 기술되었다. 미국 특허 등록 번호 5,763,192; 5,723,323; 5,814,476; 5,817,483; 5,824,514; 5,976,862; 6,492,107; 6,569,641 참조.
원핵생물에서의 폴리펩타이드의 발현은 융합 또는 비-융합 폴리펩타이드의 발현을 지시하는 구성적 또는 유도성 프로모터를 함유하는 벡터를 갖는 대장균에서 가장 흔히 수행된다. 융합 벡터는 그 안에 암호화된 폴리펩타이드에 다수의 아미노산을 부가하는데, 보통 재조합 폴리펩타이드의 아미노 말단에 부가한다. 이러한 융합 벡터는 일반적으로 3가지 목적을 수행한다: (i) 재조합 폴리펩타이드의 발현 증가; (ii) 재조합 폴리펩타이드의 용해도 증가; 및 (iii) 친화도 정제에서 리간드로 작용하여 재조합 폴리펩타이드의 정제 촉진. 종종, 융합 발현 벡터에서, 단백질 가수분해적 절단 부위는 융합 폴리펩타이드의 정제 후에 융합 모이어티로부터 재조합 폴리펩타이드의 분리를 가능하게 하기 위해 융합 모이어티와 재조합 폴리펩타이드의 접합부에 도입된다. 이러한 효소, 및 이들의 동족 인식 서열은 인자 Xa, 트롬빈 및 엔테로키나아제를 포함한다. 일반적인 융합 발현 벡터는 글루타치온 S-트랜스퍼라제 (GST), 말토스 E 결합 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 A를 각각 표적 재조합 폴리펩타이드에 융합시키는 pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith and Johnson, 1988. Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.) 및 pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, N.J.)를 포함한다.
적합한 유도성 비-융합 대장균 발현 벡터의 예는 pTrc (Amrann et al., (1988) Gene 69: 301-315) 및 pET 11d (Studier et al., GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89)를 포함한다. 폴리펩타이드 융합을 통해 다기능 폴리펩타이드를 산출하기 위한 별개의 활성 펩타이드 또는 단백질 도메인의 표적화된 조립 방법은 Pack et al., 미국 특허 등록번호 6,294,353; 6,692,935에 의해 기술되었다. 대장균에서 재조합 폴리펩타이드, 예를 들어 항-DLL3 항체　발현를 최대화하기 위한 하나의 전략은 재조합 폴리펩타이드를 단백질 가수분해적으로 절단하는 능력이 손상된 숙주 박테리아 내에서 폴리펩타이드를 발현시키는 것이다. 예를 들어, Gottesman, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 119-128 참조. 또 다른 전략은 각각의 아미노산에 대한 개별적인 코돈이 발현 숙주, 예를 들어 대장균에서 우선적으로 이용되는 것이 되도록 발현 벡터 내로 삽입될 핵산의 핵산 서열을 변경하는 것이다(예를 들어, Wada, et al., 1992. Nucl. Acids Res. 20: 2111-2118 참조). 본 기술의 핵산 서열의 이러한 변경은 표준 DNA 합성 기술에 의해 수행될 수 있다.
다른 실시양태에서, 항-DLL3 항체 발현 벡터는 효모 발현 벡터이다. 효모 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae)에서의 발현을 위한 벡터의 예는 pYepSec1 (Baldari, et al., 1987. EMBO J. 6: 229-234), pMFa (Kurjan 및 Herskowitz, Cell 30: 933-943, 1982), pJRY88 (Schultz et al., Gene 54: 113-123, 1987), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.), 및 picZ (Invitrogen Corp, San Diego, Calif.)를 포함한다. 대안적으로, 항-DLL3 항체는 배큘로바이러스 발현 벡터를 사용하여 곤충 세포에서 발현될 수 있다. 배양된 곤충 세포 (예를 들어, SF9 세포)에서의 폴리펩타이드, 예를 들어 항-DLL3 항체의 발현에 이용할 수 있는 배큘로바이러스 벡터는 pAc 종 (Smith, et al., Mol. Cell. Biol. 3: 2156-2165, 1983) 및 pVL 종 (Lucklow 및 Summers, 1989. Virology 170: 31-39)을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 기술의 항-DLL3 항체를 암호화하는 핵산은 포유류 발현 벡터를 사용하여 포유류 세포에서 발현된다. 포유류 발현 벡터의 예는, 예를 들어, pCDM8 (Seed, Nature 329: 840, 1987) 및 pMT2PC (Kaufman, et al., EMBO J. 6: 187-195, 1987)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 포유류 세포에서 사용되는 경우, 발현 벡터의 조절 기능은 종종 바이러스 조절 요소에 의해 제공된다. 예를 들어, 통상적으로 사용되는 프로모터는 폴리오마 (polyoma), 아데노바이러스 2, 사이토메갈로바이러스 (cytomegalovirus) 및 시미안 바이러스 40 (simian virus 40)으로부터 유래된다. 본 기술의 항-DLL3 항체의 발현에 유용한 원핵 및 진핵 세포 모두에 대한 다른 적합한 발현 시스템은, 예를 들어　Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989의 챕터 16 및 17을 참조한다.
다른 실시양태에서, 재조합 포유류 발현 벡터는 특정 세포 유형 (예를 들어, 조직-특이적 조절 요소)에서 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 조직-특이적 조절 요소는 당업계에 공지되어 있다. 적합한 조직-특이적 프로모터의 비제한적인 예는 알부민 프로모터 (간-특이적; Pinkert, et al., Genes Dev. 1: 268-277, 1987), 림프-특이적 프로모터 (Calame 및 Eaton, Adv. Immunol. 43: 235-275, 1988), T 세포 수용체(Winoto 및 Baltimore, EMBO J. 8: 729-733, 1989) 및 면역글로불린(Banerji, et al., 1983. Cell 33: 729-740; Queen 및 Baltimore, Cell 33: 741-748, 1983.)의 프로모터, 뉴런-특이적 프로모터 (예를 들어, 뉴로필라멘트 프로모터; Byrne 및 Ruddle, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473-5477, 1989), 췌장-특이적 프로모터 (Edlund, et al., 1985. Science 230: 912-916) 및 유선-특이적 프로모터 (예를 들어, 우유 유청 프로모터; 미국 특허 등록번호 4,873,316 및 유럽 출원 공개번호 264,166)를 포함한다. 발달-조절 프로모터, 예를 들어 뮤린 hox 프로모터 (Kessel 및 Gruss, Science 249: 374-379, 1990) 및 α-태아단백질 프로모터 (Campes 및 Tilghman, Genes Dev. 3: 537-546, 1989)가 또한 포함된다.
본 방법의 다른 양태는 본 기술의 재조합 발현 벡터가 도입된 숙주 세포에 관한 것이다. "숙주 세포" 및 "재조합 숙주 세포"라는 용어는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 이러한 용어는 특정 대상 세포뿐만 아니라 그러한 세포의 자손 또는 잠재적 자손을 지칭하는 것으로 이해된다. 특정 변형이 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 후속 세대에서 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 사실상 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 여전히 본 명세서에 사용되는 용어의 범위 내에 포함된다.
숙주 세포는 임의의 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 예를 들어, 항-DLL3 항체는 대장균, 곤충 세포, 효모 또는 포유류 세포와 같은 박테리아 세포에서 발현될 수 있다. 포유류 세포는 면역글로불린 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 분절을 발현하기에 적합한 숙주이다. Winnacker, From Genes To Clones, (VCH Publishers, NY, 1987) 참조. 온전한 이종 단백질을 분비할 수 있는 다수의 적합한 숙주 세포주가 당업계에서 개발되었고, 이는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포주, 다양한 COS 세포주, HeLa 세포, L 세포 및 골수종 세포주를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 비-인간이다. 이들 세포에 대한 발현 벡터는 발현 조절 서열, 예컨대 복제 기점, 프로모터, 인핸서, 및 필요한 처리 정보 부위, 예컨대 리보좀 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위 및 전사 종결자 서열을 포함할 수 있다. Queen et al., Immunol. Rev. 89: 49, 1986. 예시적인 발현 조절 서열은 내인성 유전자, 사이토메갈로바이러스, SV40, 아데노바이러스, 소 유두종 바이러스 등으로부터 유래된 프로모터이다. Co et al., J Immunol. 148: 1149, 1992. 다른 적합한 숙주 세포는 당업자에게 공지되어 있다.
벡터 DNA는 통상적인 형질전환 또는 형질감염 기술을 통해 원핵 또는 진핵 세포 내로 도입될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는, "형질전환" 및 "형질감염"이라는 용어는 칼슘 포스페이트 또는 칼슘 클로라이드 공침법, DEAE-덱스트란-매개 형질감염, 리포펙션(lipofection), 전기천공법, 유전자 총 (biolistic) 또는 바이러스-기반 형질감염을 포함하는, 외래 핵산 (예를 들어, DNA)을 숙주 세포 내로 도입하기 위한 당업계에서 인정받은 다양한 기술을 의미하도록 의도된다. 포유류 세포를 형질전환시키는 데 사용되는 다른 방법은 폴리브렌(polybrene), 프로토플라스트 융합(protoplast fusion), 리포좀, 전기천공 및 미세주사의 사용을 포함한다 (일반적으로, Sambrook et al., Molecular Cloning 참조). 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시키는 적합한 방법은 Sambrook, et al. (MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) 및 기타 실험 매뉴얼에서 찾을 수 있다. 관심 DNA 분절을 함유하는 벡터는 세포 숙주의 유형에 따라, 잘 알려진 방법에 의해 숙주 세포 내로 전달될 수 있다.
포유류 세포의 안정적인 형질감염을 위해, 사용된 발현 벡터 및 형질감염 기술에 따라 세포의 작은 부분만이 외래 DNA를 그들의 게놈에 통합할 수 있다는 것이 알려져 있다. 이들 통합체를 식별하고 선택하기 위해, 선택가능한 마커 (예를 들어, 항생제에 대한 내성)를 암호화하는 유전자가 일반적으로 관심 유전자와 함께 숙주 세포 내로 도입된다. 다양한 선택가능한 마커는 G418, 하이그로마이신 및 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 내성을 부여하는 마커를 포함한다. 선택가능한 마커를 암호화하는 핵산은 항-DLL3 항체를 암호화하는 것과 동일한 벡터 상에서 숙주 세포 내로 도입되거나, 별도의 벡터 상에서 도입될 수 있다. 도입된 핵산으로 안정적으로 형질감염된 세포는 약물 선택에 의해 식별될 수 있다 (예를 들어, 선택가능한 마커 유전자를 혼입한 세포는 생존하는 반면, 다른 세포는 죽는다).
본 기술의 항-DLL3 항체를 포함하는 숙주 세포, 예컨대 배양물 중의 원핵 또는 진핵 숙주 세포는 재조합 항-DLL3 항체를 생산 (즉, 발현)하는 데 사용될 수 있다. 일 실시양태에서, 방법은 항-DLL3 항체가 생산되도록 숙주 세포 (항-DLL3 항체를 암호화하는 재조합 발현 벡터가 도입됨)를 적합한 배지에서 배양하는 단계를 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 방법은 배지 또는 숙주 세포로부터 항-DLL3 항체를 분리하는 단계를 추가로 포함한다. 일단 발현되면, 항-DLL3 항체, 예를 들어 항-DLL3 항체 또는 항-DLL3 항체-관련 폴리펩타이드의 집합체가 배양 배지 및 숙주 세포로부터 정제된다. 항-DLL3 항체는 HPLC 정제, 컬럼 크로마토그래피, 겔 전기영동 등을 포함하는 당업계의 표준 절차에 따라 정제될 수 있다. 일 실시양태에서, 항-DLL3 항체는 Boss et al., 미국 특허 등록번호 4,816,397의 방법에 의해 숙주 생물체에서 생산된다. 일반적으로, 항-DLL3 항체 사슬은 신호 서열로 발현되어 배양 배지로 방출된다. 그러나, 항-DLL3 항체 사슬이 숙주 세포에 의해 자연적으로 분비되지 않는 경우, 항-DLL3 항체 사슬은 순한 세제로 처리하여 방출될 수 있다. 재조합 폴리펩타이드의 정제는 당업계에 잘 알려져 있고, 암모늄 설페이트 침전, 친화도 크로마토그래피 정제 기술, 컬럼 크로마토그래피, 이온 교환 정제 기술, 겔 전기영동 등을 포함한다 (일반적으로 Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., 1982) 참조).
항-DLL3 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 항-DLL3 항체 암호화 서열은 형질전환 동물의 게놈 내로의 도입 및 형질전환 동물의 우유에서의 후속적인 발현을 위해 트랜스유전자에 혼입될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 등록번호 5,741,957, 5,304,489 및 5,849,992 참조. 적합한 트랜스유전자는 카제인 또는 β-락토글로불린과 같은 유선 특이적 유전자로부터의 인핸서 및 프로모터와 작동가능하게 연결된 경쇄 및/또는 중쇄에 대한 암호화 서열을 포함한다. 형질전환 동물의 생산을 위해, 트랜스유전자는 수정된 난모세포 내로 미세주입되거나, 배아 줄기 세포의 게놈 내로 혼입될 수 있고, 이러한 세포의 핵은 제핵 난모세포 내로 전달된다.
단일-사슬 항체. 일 실시양태에서, 본 기술의 항-DLL3 항체는 단일-사슬 항-DLL3 항체이다. 본 기술에 따르면, 기술은 DLL3 단백질에 특이적인 단일-사슬 항체의 생산을 위해 적용될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 등록번호　4,946,778 참조). 본 기술의 항체 및 단일-사슬 Fv를 생산하는 데 사용될 수 있는 기술의 예는 미국 특허 등록번호 4,946,778 및 5,258,498; Huston et al., Methods in Enzymology, 203: 46-88, 1991; Shu, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7995-7999, 1993; 및 Skerra et al., Science 240: 1038-1040, 1988에 기술된 것들을 포함한다.
키메라 및 인간화 항체. 일 실시양태에서, 본 기술의 항-DLL3 항체는 키메라 항-DLL3 항체이다. 일 실시양태에서, 본 기술의 항-DLL3 항체는 인간화 항-DLL3 항체이다. 본 기술의 일 실시양태에서, 공여체 및 수용체 항체는 상이한 종으로부터의 단일클론 항체이다. 예를 들어, 수용체 항체는 (인간에서 항원성을 최소화하기 위해) 인간 항체이고, 이 경우 생산되는 CDR-이식 항체는 "인간화된" 항체로 명명된다.
인간 및 비-인간 부분을 모두 포함하는, 키메라 및 인간화 단일클론 항체와 같은　재조합 항-DLL3 항체는 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조될 수 있고, 본 기술의 범위 내에 있다. 인간에서의 본 기술의 항-DLL3 항체의 생체 내 사용 및 시험관 내 검출 분석에서의 이들 제제의 사용을 포함하는 일부 용도의 경우, 키메라 또는 인간화 항-DLL3 항체를 사용하는 것이 가능하다. 이러한 키메라 및 인간화 단일클론 항체는 당업계에 공지된 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있다. 이러한 유용한 방법은 예를 들어, 국제 출원번호 PCT/US86/02269; 미국 특허 등록번호 5,225,539; 유럽 특허 공개번호 184187; 유럽 특허 공개번호 171496; 유럽 특허 공개번호 173494; PCT 국제공개번호 WO　86/01533; 미국 특허 등록번호 4,816,567; 5,225,539; 유럽 특허 공개번호 125023; Better, et al., 1988. Science 240: 1041-1043; Liu, et al., 1987. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443; Liu, et al., 1987. J. Immunol. 139: 3521-3526; Sun, et al., 1987. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214-218; Nishimura, et al., 1987. Cancer Res. 47: 999-1005; Wood, et al., 1985. Nature 314: 446-449; Shaw, et al., 1988. J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553-1559; Morrison (1985) Science 229: 1202-1207; Oi, et al. (1986) BioTechniques 4: 214; Jones, et al., 1986. Nature 321: 552-525; Verhoeyan, et al., 1988. Science 239: 1534; Morrison, Science 229: 1202, 1985; Oi et al., BioTechniques 4: 214, 1986; Gillies et al., J. Immunol. Methods, 125: 191-202, 1989; 미국 특허 등록번호 5,807,715; 및 Beidler, et al., 1988. J. Immunol. 141: 4053-4060에 기술된 방법을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 항체는 CDR-이식 (EP　0 239 400; WO　91/09967; 미국 특허 등록번호 5,530,101; 5,585,089; 5,859,205; 6,248,516; EP460167), 축성(veneering)또는 재표면화 (EP　0 592 106; EP　0 519 596; Padlan E. A., Molecular Immunology, 28: 489-498, 1991; Studnicka et al., Protein Engineering 7: 805-814, 1994; Roguska et al., PNAS 91: 969-973, 1994) 및 사슬 뒤섞기 (미국 특허 등록번호 5,565,332)를 포함하는 다양한 기술을 사용하여 인간화될 수 있다. 일 실시양태에서, 뮤린 항-DLL3 단일클론 항체를 암호화하는 cDNA는 Fc 불변 영역을 암호화하는 서열을 제거하기 위해 특이적으로 선택된 제한 효소로 분해되고, 인간 Fc 불변 영역을 암호화하는 cDNA의 등가 부분이 치환된다 (Robinson et al., PCT/US86/02269; Akira et al., 유럽 특허 출원 공개번호 184,187; Taniguchi, 유럽 특허 출원 공개번호 171,496; Morrison et al., 유럽 특허 출원 공개번호 173,494; Neuberger et al., WO　86/01533; Cabilly et al. 미국 특허 등록번호 4,816,567; Cabilly et al., 유럽 특허 출원 공개번호 125,023; Better et al. (1988) Science 240: 1041-1043; Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443; Liu et al. (1987) J Immunol 139: 3521-3526; Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214-218; Nishimura et al. (1987) Cancer Res 47: 999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314: 446-449; and Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553-1559; 미국 특허 등록번호 6,180,370; 미국 특허 등록번호 6,300,064; 6,696,248; 6,706,484; 6,828,422 참조).
일 실시양태에서, 본 기술은 여전히 효과적인 항체 이펙터 기능을 가지면서 인간 항-마우스 항체 (이하 "HAMA"라고 지칭함) 반응을 유도할 가능성이 거의 없는 인간화 항-DLL3 항체의 구성을 제공한다. 본 명세서에서 사용되는 "인간" 및 "인간화"라는 용어는, 항체와 관련하여, 인간 대상체에서 치료상 허용되는 약한 면역원성 반응을 유도할 것으로 예상되는 임의의 항체에 관한 것이다. 일 실시양태에서, 본 기술은 인간화 항-DLL3 항체, 중쇄 및 경쇄 면역글로불린을 제공한다.
CDR-이식 항체. 일부 실시양태에서, 본 기술의 항-DLL3 항체는 항-DLL3 CDR-이식 항체이다. 일반적으로 항-DLL3 CDR 항체를 생성하는 데 사용되는 공여체 및 수용체 항체는 상이한 종으로부터의 단일클론 항체이고; 일반적으로 수용체 항체는 (인간에서 항원성을 최소화하기 위해) 인간 항체이고, 이 경우 생성되는 CDR-이식 항체는 "인간화" 항체로 명명된다. 구체적으로, "인간화 항체"는 인간 항체 사슬로부터의 가변 영역 프레임워크 잔기를 포함하는 적어도 하나의 사슬 및 비-인간 항체 (예를 들어, 마우스)로부터의 적어도 하나의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 항체를 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 "인간 항체"라는 용어는 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하도록 의도된다. 그러나, 본 명세서에서 사용되는 "인간 항체"라는 용어는 마우스와 같은 다른 포유류 종으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상에 이식된 항체를 포함하도록 의도되지 않는다. 이식편은 수용체 항체의 단일 VH 또는 VL 내의 단일 CDR (또는 심지어 단일 CDR의 일부), 또는 VH 및 VL 중 하나 또는 둘 모두 내의 다수의 CDR (또는 이의 일부)일 수 있다. 자주, 수용체 항체의 모든 가변 도메인 내의 모든 3개의 CDR은 상응하는 공여체 CDR로 교체될 것이지만, DLL3 단백질에 대한 생성된 CDR-이식 항체의 적절한 결합을 허용하기 위해 필요한 만큼만 교체되면 된다. CDR-이식 및 인간화 항체를 생성하는 방법은 Queen et al. 미국 특허 등록번호 5,585,089; 미국 특허 등록번호 5,693,761; 미국 특허 등록번호 5,693,762; 및 Winter U.S. 5,225,539; 및 EP　0682040에 의해 교시된다. VH 및 VL 폴리펩타이드를 제조하는 데 유용한 방법은 Winter et al., 미국 특허 등록번호 4,816,397; 6,291,158; 6,291,159; 6,291,161; 6,545,142; EP　0368684; EP0451216; 및 EP0120694에 의해 교시된다.
동일한 패밀리 및/또는 동일한 패밀리 구성원으로부터 적합한 프레임워크 영역 후보를 선택한 다음, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 중 어느 하나 또는 둘 모두는 기원 종으로부터의 CDR을 하이브리드 프레임워크 영역 내로 이식시킴으로써 생성된다. 상기 양태들 중 어느 하나와 관련하여 하이브리드 가변 사슬 영역을 갖는 하이브리드 항체 또는 하이브리드 항체 단편의 조립은 당업자에게 공지된 통상적인 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 하이브리드 가변 도메인 (즉, 표적 종을 기반으로 하는 프레임워크 및 기원 종으로부터의 CDR)을 암호화하는 DNA 서열은 올리고뉴클레오타이드 합성 및/또는 PCR에 의해 생성될 수 있다. CDR 영역을 암호화하는 핵산은 또한 적절한 제한 효소를 사용하여 기원 종 항체로부터 분리될 수 있고, 적합한 연결 효소로 연결하여 표적 종 프레임워크 내에 연결될 수 있다. 대안적으로, 기원 종 항체의 가변 사슬의 프레임워크 영역은 부위-지정 돌연변이유발에 의해 변경될 수 있다.
혼성체는 각각의 프레임워크 영역에 상응하는 다수의 후보 중에서 선택하여 구성되기 때문에, 본 명세서에 기술된 원리에 따라 구성할 수 있는 많은 서열 조합이 존재한다. 따라서, 혼성체의 라이브러리는 개별 프레임워크 영역의 상이한 조합을 갖는 구성원들로 구성될 수 있다. 이러한 라이브러리는 서열의 전자 데이터베이스 집합 또는 혼성체의 물리적 집합일 수 있다.
이 과정은 일반적으로 이식된 CDR의 측면에 있는 수용체 항체의 FR을 변경시키지 않는다. 그러나, 당업자는 FR을 공여체 항체의 상응하는 FR과 더욱 유사하게 만들기 위해 때때로 주어진 FR의 특정 잔기를 교체함으로써 생성된 항-DLL3 CDR-이식 항체의 항원 결합 친화도를 개선시킬 수 있다. 치환의 적합한 위치는 CDR에 인접하거나 CDR과 상호작용할 수 있는 아미노산 잔기를 포함한다 (예를 들어,　US 5,585,089, 특히 칼럼 12-16 참조). 또는 당업자는 공여체 FR로 시작하여 수용체 FR 또는 인간 컨센서스 FR (human consensus FR)과 더 유사하도록 변형시킬 수 있다. 이들 변형을 만들기 위한 기술은 당업계에 공지되어 있다. 특히, 생성된 FR이 해당 위치에 대한 인간 컨센서스 FR에 적합하거나, 이러한 컨센서스 FR과 적어도 90% 이상 동일한 경우, 그렇게 하는 것은 전체 인간 FR을 갖는 동일한 항체와 비교하여 생성된 변형된 항-DLL3 CDR-이식 항체의 항원성을 유의미하게 증가시키지 않을 수 있다.
이중특이적 항체 (BsAb). 이중특이적 항체는 별도의 구조를 갖는 2개의 표적, 예를 들어 동일한 표적 항원 상의 2개의 상이한 표적 항원, 2개의 상이한 에피토프에 동시에 결합할 수 있는 항체이다. BsAb는, 예를 들어 동일하거나 상이한 항원의 상이한 에피토프를 인지하는 중쇄 및/또는 경쇄를 조합함으로써 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 분자 기능에 의해, 이중특이적 결합제는 그의 2개의 결합 팔 (하나의 VH/VL 쌍) 중 하나에서 하나의 항원 (또는 에피토프)에 결합하고, 그의 두 번째 팔 (상이한 VH/VL 쌍)에서 상이한 항원 (또는 에피토프)에 결합한다. 이 정의에 따르면, 이중특이적 결합제는 (특이성 및 CDR 서열 모두에서)　2개의 별개의 항원 결합 팔을 갖고, 이것이 결합하는 각각의 항원에 대해 1가이다.
본 기술의 이중특이적 항체 (BsAb) 및 이중특이적 항체 단편 (BsFab)은, 예를 들어 DLL3에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 팔 및 두 번째 표적 항원에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 다른 팔을 갖는다. 특정 실시양태에서, BsAb는 세포 표면 상에 DLL3 항원을 발현하는 종양 세포에 결합할 수 있다.
다양한 이중특이적 융합 단백질은 분자 공학을 이용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 전체 면역글로불린 프레임워크 (예를 들어, IgG), 단일 사슬 가변 단편 (scFv) 또는 이들의 조합을 이용하는 BsAb가 구성되어 왔다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 융합 단백질은 2가이고, 예를 들어 하나의 항원에 대한 단일 결합 부위를 갖는 scFv 및 두 번째 항원에 대한 단일 결합 부위를 갖는 Fab 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 융합 단백질은 2가이고, 예를 들어 하나의 항원에 대한 단일 결합 부위를 갖는 scFv 및 두 번째 항원에 대한 단일 결합 부위를 갖는 다른 scFv 단편을 포함한다. 다른 실시양태에서, 이중특이적 융합 단백질은 4가이고, 예를 들어 하나의 항원에 대한 2개의 결합 부위를 갖는 면역글로불린 (예를 들어, IgG)　및 두 번째 항원에 대한 2개의 동일한 scFv를 포함한다. 2개의 scFv 단위가 직렬로 구성된 BsAb는 임상적으로 성공적인 이중특이적 항체 형태인 것으로 나타나 왔다. 일부 실시양태에서, 직렬로 2개의 단일 사슬 가변 단편 (scFv)을 포함하는　BsAb는 종양 항원 (예를 들어, DLL3)에 결합하는 scFv가 상이한 표적 항원에 결합하는 scFv와 연결되도록 설계되었다.
BsAb를 생산하는 최근의 방법은 더 일반적인 면역글로불린 이소형보다 더 강하게 가교결합되도록 추가 시스테인 잔기를 갖는 조작된 재조합 단일클론 항체를 포함한다. 예를 들어, FitzGerald et al., Protein Eng. 10(10):1221-1225 (1997) 참조. 또 다른 접근법은 필요한 이중 특이성을 가진 2개 이상의 상이한 단일-사슬 항체 또는 항체 단편 분절을 연결시키는 재조합 융합 단백질을 설계하는 것이다. 예를 들어, Coloma et al., Nature Biotech. 15:159-163 (1997) 참조. 다양한 이중특이적 융합 단백질은 분자 공학을 이용하여 생산될 수 있다.
두 개 이상의 상이한 단일-사슬 항체 또는 항체 단편을 연결시키는 이중특이적 융합 단백질은 유사한 방식으로 제조된다. 재조합 방법은 다양한 융합 단백질을 제조하는 데 사용될 수 있다. 일부 특정 실시양태에서, 본 기술에 따른 BsAb는 중쇄 및 경쇄, 및 scFv를 포함하는 면역글로불린을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, scFv는 본 명세서에 개시된 임의의 DLL3 면역글로불린의 중쇄의 C-말단에 연결된다. 일부 특정 실시양태에서, scFv는 본 명세서에 개시된 임의의 DLL3 면역글로불린의 경쇄의 C-말단에 연결된다. 다양한 실시양태에서, scFv는 링커 서열을 통해 중쇄 또는 경쇄에 연결된다. scFv에 대한 중쇄 Fd의 인-프레임 연결에 필요한 적절한 링커 서열은 PCR 반응을 통해 VL 및 V카파 도메인에 도입된다. 이어서, scFv를 암호화하는 DNA 단편은 CH1 도메인을 암호화하는 DNA 서열을 함유하는 스테이징 벡터(staging vector) 내에 연결된다. 생성된 scFv-CH1 구조체는 절단되고, DLL3 항체의 VH 영역을 암호화하는 DNA 서열을 함유하는 벡터 내에 연결된다. 생성된 벡터는 이중특이적 융합 단백질의 발현을 위해 포유류 세포와 같은 적절한 숙주 세포를 형질감염시키는 데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 링커의 길이는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100개의 아미노산 길이만큼 된다. 일부 실시양태에서, 링커는 단단한 3차원 구조를 채택하는 대신, 폴리펩타이드에 유연성을 제공하는 경향 (예를 들어, 제1 및/또는 제2 항원 결합 부위)을 갖는 것을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 링커는, 예를 들어 안정성의 증가와 같은 BsAb에 부여되는 특정 특성에 기반하여 본 명세서에 기재된 BsAb에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본 기술의 BsAb는 G4S 링커(서열번호: 82)를 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 본 기술의 BsAb는 (G4S)n 링커를 포함하고, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 그 이상이다 (서열번호: 83).
Fc 변형. 일부 실시양태에서, 본 기술의 항-DLL3 항체는 변이체 Fc 영역을 포함하고, 여기서 상기 변이체 Fc 영역은 야생형 Fc 영역 (또는 모 Fc 영역)에 비해 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하여, 상기 분자가 Fc 수용체 (예를 들어, FcγR)에 대해 변경된 친화도를 갖도록 하지만, 단 상기 변이체 Fc 영역은 Sondermann et al., Nature, 406:267-273 (2000)에 의해 개시된 것과 같은 Fc-Fc 수용체 상호작용의 결정학적 및 구조적 분석에 기초하여 Fc 수용체와 직접 접촉하는 위치에서 치환을 갖지 않는다. FcγR과 같은 Fc 수용체와 직접 접촉하는 Fc 영역 내의 위치의 예는 아미노산 234-239 (힌지 영역), 아미노산 265-269 (B/C 루프), 아미노산 297-299 (C7E 루프) 및 아미노산 327-332 (F/G) 루프를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 기술의 항-DLL3 항체는 하나 이상의 아미노산 변형을 갖는 변이체 Fc 영역을 갖는 활성화 및/또는 억제 수용체에 대해 변경된 친화도를 갖고, 여기서 상기 하나 이상의 아미노산 변형은 알라닌으로의 N297 치환 또는 알라닌으로의 K322 치환이다.
글리코실화 변형. 일부 실시양태에서, 본 기술의 항-DLL3 항체는 모 Fc 영역과 비교하여 변이체 글리코실화를 갖는 Fc 영역을 갖는다. 일부 실시양태에서, 변이체 글리코실화는 푸코스의 부재를 포함하고; 일부 실시양태에서, 변이체 글리코실화는 GnT1-결핍 CHO 세포에서의 발현으로부터 발생한다.
일부 실시양태에서, 본 기술의 항체는 항체의 기능성, 예를 들어 항원에 대한 결합 활성을 변경하지 않으면서, 관심 항원 (예를 들어, DLL3)에 결합하는 적절한 참조 항체에 비해 변형된 글리코실화 부위를 가질 수 있다. 본 명세서에서 사용되는, "글리코실화 부위"는 올리고당 (즉, 함께 연결된 2개 이상의 단당류를 함유하는 탄수화물)이 특이적으로 공유결합으로 부착될 항체 내의 임의의 특정 아미노산 서열을 포함한다.
올리고당 측쇄는 일반적으로 N- 또는 O-결합을 통해 항체의 백본(backbone)에 연결된다. N-결합 글리코실화는 올리고당 모이어티가 아스파라진 잔기의 측쇄에 부착되는 것을 의미한다. O-결합 글리코실화는 올리고당 모이어티가 하이드록시아미노산, 예를 들어 세린, 트레오닌에 부착하는 것을 의미한다. 예를 들어, 푸코스 및 말단 N-아세틸글루코사민을 포함하는 특정 올리고당이 결여된 Fc-글리코폼 (Fc-glycoform)(hDLL3-IgGln)은 특수 CHO 세포에서 생산될 수 있고, 향상된 ADCC 이펙터 기능을 나타낼 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 면역글로불린-관련 조성물의 탄수화물 함량은 글리코실화 부위를 추가하거나 결실시킴으로써 변경된다. 항체의 탄수화물 함량을 변경하기 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 본 기술 내에 포함되는데, 예를 들어, 미국 특허 등록번호 6,218,149; EP 0359096B1; 미국 특허출원 공개번호 US 2002/0028486; 국제특허출원 공개번호 WO 03/035835; 미국 특허출원 공개번호 2003/0115614; 미국 특허 등록번호 6,218,149; 미국 특허 등록번호 참조; 이들 모두는 그 전체 내용이 본 명세서에 참조로 포함된다. 일부 실시양태에서, 항체 (또는 이의 관련 부분 또는 구성)의 탄수화물 함량은 항체의 하나 이상의 내인성 탄수화물 모이어티를 결실시킴으로써 변경된다. 일부 특정 실시양태에서, 본 기술은 위치 297을 아스파라진에서 알라닌으로 변형시킴으로써 항체의 Fc 영역의 글리코실화 부위를 결실시키는 것을 포함한다.
조작된 글리코폼은 이펙터 기능을 향상시키거나 감소시키는 것을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 목적에 유용할 수 있다. 조작된 글리코폼은 당업자에게 공지된 임의의 방법, 예를 들어 조작된 또는 변이체 발현 균주를 사용함으로써, 하나 이상의 효소, 예를 들어 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III(GnTIII)와의 공동-발현에 의해, 다양한 유기체 또는 다양한 유기체로부터의 세포주에서 Fc 영역을 포함하는 분자를 발현시킴으로써, 또는 Fc 영역을 포함하는 분자가 발현된 후에 탄수화물(들)을 변형시킴으로써 생성될 수 있다. 조작된 글리코폼을 생성하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, Umana et al., 1999, Nat. Biotechnol. 17: 176-180; Davies et al., 2001, Biotechnol. Bioeng. 74:288-294; Shields et al., 2002, J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J. Biol. Chem. 278:3466-3473; 미국 특허 등록번호 6,602,684; 미국 특허 출원번호 10/277,370; 미국 특허 출원번호 10/113,929; 국제특허출원 공개 번호 WO 00/61739A1 ; WO 01/292246A1; WO 02/311140A1; WO 02/30954A1; POTILLEGENTTM 기술 (Biowa, Inc. Princeton, N.J.); GLYCOMABTM 글리코실화 공학 기술 (GLYCART biotechnology AG, Zurich, Switzerland)에 기술된 것들을 포함하나 이에 제한되지 않고; 이들 모두는 그 전체 내용이 본 명세서에 참조로 포함된다. 예를 들어, 국제특허출원 공개 번호 WO 00/061739; 미국 특허출원 공개번호 2003/0115614; Okazaki et al., 2004, JMB, 336: 1239-49 참조.
융합 단백질. 일 실시양태에서, 본 기술의 항-DLL3 항체는 융합 단백질이다. 본 기술의 항-DLL3 항체는, 제2 단백질에 융합되는 경우, 항원성 태그로 사용될 수 있다. 폴리펩타이드에 융합될 수 있는 도메인의 예는 이종 신호 서열뿐만 아니라 다른 이종 기능 영역을 포함한다. 융합은 반드시 직접적일 필요는 없지만, 링커 서열을 통해 발생할 수 있다. 또한, 본 기술의 융합 단백질도 항-DLL3 항체의 특성을 개선하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포로부터의 정제 또는 이후의 취급 및 보관 동안 안정성 및 지속성을 개선하기 위해 추가 아미노산, 특히 하전된 아미노산의 영역이 항-DLL3 항체의 N 말단에 첨가될 수 있다. 또한, 펩타이드 모이어티는 정제를 용이하게 하기 위해 항-DLL3 항체에 첨가될 수 있다. 이러한 영역은 항-DLL3 항체의 최종 제조 이전에 제거될 수 있다. 폴리펩타이드의 취급을 용이하게 하기 위한 펩타이드 모이어티의 첨가는 당업계에 익숙하고 일상적인 기술이다. 본 기술의 항-DLL3 항체는 융합된 폴리펩타이드의 정제를 용이하게 하는 펩타이드와 같은 마커 서열에 융합될 수 있다. 선택 실시양태에서, 마커 아미노산 서열은 pQE 벡터 (QIAGEN, Inc., Chatsworth, Calif)에 제공된 태그와 같은 헥사-히스티딘 펩타이드 (서열번호: 84)이고, 이들 중 다수는 상업적으로 입수가능하다. Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821-824, 1989에 기술된 바와 같이, 예를 들어 헥사-히스티딘 (서열번호: 84)은 융합 단백질의 편리한 정제를 제공한다. 정제에 유용한 또 다른 펩타이드 태그인 "HA" 태그는 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유래된 에피토프에 해당한다. Wilson et al., Cell 37: 767, 1984.
따라서, 이들 상기 융합 단백질 중 임의의 것은 본 기술의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 사용하여 조작될 수 있다. 또한, 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 융합 단백질은 증가된 생체 내 반감기를 나타낸다.
(IgG로 인해) 디설파이드-결합 이량체 구조를 갖는 융합 단백질은 단량체 분비 단백질 또는 단백질 단편 단독에 비해 다른 분자를 결합하고 중화하는 데 더 효율적일 수 있다. Fountoulakis et al., J. Biochem. 270: 3958-3964, 1995.
유사하게, EP-A-O 464 533 (대응 캐나다 2045869)은 또 다른 인간 단백질 또는 이의 단편과 함께 면역글로불린 분자의 불변 영역의 다양한 부분을 포함하는 융합 단백질을 개시한다. 많은 경우에, 융합 단백질의 Fc 부분은 치료 및 진단에 유익하고, 따라서, 예를 들어 개선된 약동학적 특성을 가질 수 있다. EP-A 0232 262 참조. 대안적으로, 융합 단백질이 발현되고, 검출되고, 정제된 후에 Fc 부분을 결실시키거나 변형하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, Fc 부분은 융합 단백질이 면역화를 위한 항원으로 사용되는 경우 치료 및 진단을 방해할 수 있다. 약물 발견에서, 예를 들어 hIL5와 같은 인간 단백질은 hIL5의 길항제를 확인하기 위해 고-처리량 스크리닝 분석을 목적으로 Fc 부분과 융합되어 왔다. Bennett et al., J. Molecular Recognition 8: 52-58, 1995; Johanson et al., J. Biol. Chem., 270: 9459-9471, 1995.
항원의 제조: DLL3 항원은 숙주 세포가 유전자 조작에 따라 항원 단백질을 암호화하는 유전자를 생산하도록 함으로써 얻을 수 있다. 구체적으로, 항원 유전자를 발현시킬 수 있는 벡터를 제작한 후, 벡터를 숙주 세포 내로 도입하여 유전자를 발현시킨 후, 발현된 항원을 정제할 수 있다. 항체는 상기 유전자 조작에 기반한 항원-발현 세포 또는 항원을 발현하는 세포주로 동물을 면역화하는 방법에 의해서 얻을 수도 있다.
대안적으로, 항원 단백질을 사용하지 않고, 항원 단백질의 cDNA를 발현벡터 내에 혼입한 후, 발현벡터를 면역화될 동물에 투여하고, 이로 인해 면역화된 동물의 체내에서 항원 단백질을 발현시켜 항원 단백질에 대한 항체를 생산함으로써, 항체를 얻을 수도 있다.
본 발명에 사용되는 항-DLL3 항체는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 출원의 서열 목록에 기재된 아미노산 서열로 특정되는 항체가 적합하게 사용될 수 있다. 본 발명에 사용되는 항-DLL3 항체는 바람직하게는 다음의 특성을 갖는 항체이다:
(1) 다음과 같은 특성을 갖는 항체:
(a) DLL3에 특이적으로 결합하고,
(b) DLL3에 결합하여 DLL3-발현 세포 내로 내재화되는 활성을 갖거나;
(2) DLL3이 인간 DLL3인, 상기 (1)에 따른 항체.
본 발명의 DLL3에 대한 항체를 얻는 방법은 항-DLL3 항체를 얻을 수 있는 한, 특별히 제한되지 않는다. 항원으로서 형태를 유지하는 DLL3을 사용하는 것이 바람직하다.
항체를 얻기 위한 방법의 일 예는 DNA 면역화 방법을 포함할 수 있다. DNA 면역화 방법은 항원 발현 플라스미드로 동물(예를 들어, 마우스 또는 래트) 개체를 형질감염시킨 후, 개체 내에서 항원을 발현시켜 항원에 대한 면역을 유도하는 접근법이다. 형질감염 접근법은 플라스미드를 근육에 직접 주입하는 방법, 리포좀 또는 폴리에틸렌이민과 같은 형질감염 시약을 정맥에 주입하는 방법, 바이러스 벡터를 사용하는 접근법, 유전자 총 (gene gun)을 사용하여 플라스미드가 부착된 금 입자를 주입하는 접근법, 플라스미드 용액을 대량으로 정맥에 빠르게 주입하는 유체역학적 방법 등을 포함한다. 발현 플라스미드를 근육에 주입하는 형질감염 방법에 있어서, 플라스미드의 근육 내 주입 부위에 전기천공법을 적용하는 것을 포함하는 생체 내 전기천공법이라 불리는 기술은 발현 수준을 개선시키기 위한 접근법으로 알려져 있다 (Aihara H, Miyazaki J. Nat Biotechnol. 1998 Sep; 16 (9): 867-70 or Mir LM, Bureau MF, Gehl J, Rangara R, Rouy D, Caillaud JM, Delaere P, Branellec D, Schwartz B, Scherman D. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 Apr 13; 96 (8): 4262-7). 이 접근법은 플라스미드의 근육 내 주입 전에 근육을 히알루로니다제(hyaluronidase)로 처리함으로써 발현 수준을 더욱 개선시킨다 (McMahon JM1, Signori E, Wells KE, Fazio VM, Wells DJ., Gene Ther. 2001 Aug; 8 (16): 1264-70). 또한, 하이브리도마의 제조는 공지된 방법에 의해 수행될 수 있고, 예를 들어 하이브리뮨 하이브리도마 제조 시스템 (Hybrimune Hybridoma Production System)(Cyto Pulse Sciences, Inc.)을 사용하여 수행될 수도 있다.
단일클론 항체를 얻는 구체적인 예는 다음 절차를 포함할 수 있다:
(a) 면역 반응은 DLL3 cDNA를 발현 벡터 (예를 들어, pcDNA3.1; Thermo Fisher Scientific Inc.) 내로 혼입하고, 동물의 몸에서 DLL3을 발현시키도록 전기천공법 또는 유전자 총과 같은 방법에 의해 면역화될 동물 (예를 들어, 래트 또는 마우스)에 벡터를 직접 투여함으로써 유도될 수 있다. 전기천공법 등에 의한 벡터의 투여는 항체 역가를 향상시키기 위해 필요에 따라 1회 이상, 바람직하게는 복수회 수행될 수 있다;
(b) 면역 반응이 유도된 전술한 동물로부터 항체-생산 세포를 함유하는 조직 (예를 들어, 림프절)의 수집;
(c) 골수종 세포 (이하 "골수종"이라 함)(예: 마우스 골수종 SP2/0-ag14 세포)의 제조;
(d) 항체-생산 세포와 골수종 사이의 세포 융합;
(e) 관심 항체를 생산하는 하이브리도마 군의 선택;
(f) 단일 세포 클론으로의 분할 (클로닝);
(g) 임의로, 단일클론 항체의 대량 생산, 또는 하이브리도마가 접종된 동물의 번식을 위한 하이브리도마의 배양; 및/또는
(h) 이로 인해 생산된 단일클론 항체의 생리 활성 (내재화 활성) 및 결합 특이성에 관한 연구, 또는 표지 시약으로서의 항체의 특성 조사.
본 명세서에 사용된 항체 역가를 측정하기 위한 방법의 예는 유세포 분석 및 세포-ELISA를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 항체는 또한 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체와 같은 인간에게 이종유전적 항원성 (heterogenetic antigenicity)을 감소시키기 위한 목적으로 인위적으로 변형된 유전자 재조합 항체, 및 상기 DLL3에 대한 단일클론 항체를 포함한다. 이들 항체는 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다.
키메라 항체의 예는, 마우스- 또는 래트-유래 항체의 가변 영역을 인간-유래 불변 영역에 접합하여 형성된 키메라 항체와 같이, 가변 영역과 불변 영역이 서로 이종인 항체를 포함할 수 있다 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, 6851-6855, (1984) 참조).
인간화 항체의 예는 상보성 결정 영역 (CDR)만을 인간-유래 항체 내로 혼입하여 형성된 항체 (Nature (1986) 321, p. 522-525 참조), CDR 이식 방법에 따라 CDR 서열뿐만 아니라 일부 프레임워크로부터의 아미노산 잔기를 인간 항체 내로 혼입하여 형성된 항체 (국제공개공보 번호 WO90/07861), 및 항원-결합 능력을 유지하면서 일부 CDR의 아미노산 서열을 변형시켜 형성된 항체를 포함할 수 있다.
본 발명의 항체의 추가 예는 DLL3에 결합하는 인간 항체를 포함할 수 있다. 항-DLL3 인간 항체는 인간 염색체로부터 유래된 항체의 유전자 서열만을 갖는 인간 항체를 의미한다. 항-DLL3 인간 항체는 인간 항체의 중쇄 및 경쇄 유전자를 포함하는 인간 염색체 단편을 갖는 인간 항체-생성 마우스를 사용하는 방법에 의해 얻을 수 있다 (Tomizuka, K. et al., Nature Genetics (1997) 16, p. 133-143; Kuroiwa, Y. et al., Nucl. Acids Res. (1998) 26, p. 3447-3448; Yoshida, H. et al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects vol. 10, p. 69-73 (Kitagawa, Y., Matsuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999; Tomizuka, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, p. 722-727; 등 참조).
이러한 인간 항체-생산 마우스는, 내인성 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 유전자좌가 파괴되고 대신 인간 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 유전자좌가 효모 인공 염색체 (YAC) 벡터 등을 사용하여 도입된 유전적으로 변형된 동물을 이용하여, 이러한 유전적으로 변형된 동물로부터 녹아웃(knock-out) 동물 및 형질전환 동물을 생산한 후, 이러한 동물을 서로 번식시킴으로써 특이적으로 생산될 수 있다.
그렇지 않으면, 항-DLL3 인간 항체는 또한 유전자 재조합 기술에 따라 진핵 세포를 이러한 인간 항체의 중쇄 및 경쇄 각각을 암호화하는 cDNA, 또는 바람직하게는 cDNA를 포함하는 벡터로 형질전환시킨 후, 항체가 배양물 상등액으로부터 얻어질 수 있도록 유전적으로 변형된 인간 단일클론 항체를 생산하는 형질전환된 세포를 배양함으로써 얻어질 수 있다.
이 맥락에서, 예를 들어 진핵 세포 및 바람직하게는 CHO 세포, 림프구 또는 골수종과 같은 포유류 세포가 숙주로 사용될 수 있다.
또한, 인간 항체 라이브러리로부터 선택된 파지 디스플레이-유래 인간 항체를 얻는 방법 (Wormstone, I. M. et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002) 43 (7), p. 2301-2308; Carmen, S. et al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), p. 189-203; Siriwardena, D. et al., Ophthalmology (2002) 109 (3), p. 427-431; 등 참조)이 또한 공지되어 있다.
예를 들어, 인간 항체의 가변영역을 파지의 표면에 단일 사슬 항체 (scFv)로 발현하도록 하는 단계, 및 그 후 항원에 결합하는 파지를 선택하는 단계를 포함하는 파지 디스플레이 방법이 적용될 수 있다 (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), p. 1105-1116).
항원에 대한 결합 능력 때문에 선택된 파지 유전자를 분석함으로써 항원에 결합하는 인간 항체의 가변 영역을 암호화하는 DNA 서열을 결정할 수 있다.
일단 항원에 결합하는 scFv의 DNA 서열이 결정되면, 전술한 서열을 갖는 발현 벡터를 생산한 후, 생산된 벡터를 적절한 숙주에 도입하고 그 안에서 발현하도록 하여 인간 항체를 얻을 수 있다 (국제공개공보 번호 WO92/01047, WO92/20791, WO93/06213, WO93/11236, WO93/19172, WO95/01438 및 WO95/15388, Annu. Rev. Immunol (1994) 12, p. 433-455, Nature Biotechnology (2005) 23 (9), p. 1105-1116).
본 명세서에서 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환이다. 보존적 아미노산 치환은 특정 아미노산 측쇄와 관련된 아미노산 그룹 내에서 발생하는 치환이다. 바람직한 아미노산 그룹은 다음과 같다: 산성 그룹 = 아스파르트산 및 글루탐산; 염기성 그룹 = 라이신, 아르기닌 및 히스티딘; 비-극성 그룹 = 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌 및 트립토판; 및 비하전된 극성 패밀리 = 글라이신, 아스파라진, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌 및 티로신. 다른 바람직한 아미노산 그룹은 다음과 같다: 지방족 하이드록시 그룹 = 세린 및 트레오닌; 아미드-함유 그룹 = 아스파라진 및 글루타민; 지방족 그룹 = 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신; 및 방향족 그룹 = 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신. 이러한 아미노산 치환은 바람직하게는 원래의 아미노산 서열을 갖는 물질의 특성을 손상시키지 않고 수행된다.
V. 항-DLL3 항체의 식별 및 특성화
본 기술의 항-DLL3 항체를 식별하고/하거나 스크리닝하는 방법. DLL3 단백질에 대해 원하는 특이성을 갖는 것들 (예를 들어, DLL3의 세포외 도메인에 결합하는 것들)에 대해 DLL3 폴리펩타이드에 대한 항체를 식별하고 스크리닝하는 데 유용한 방법은 당업계에 공지된 임의의 면역학적-매개 기술을 포함한다. 면역 반응의 성분은 당업자에게 잘 알려진 다양한 방법에 의해 시험관 내에서 검출될 수 있다. 예를 들어, (1) 세포독성 T 림프구는 방사성 표지된 표적 세포와 함께 배양될 수 있고 이들 표적 세포의 용해는 방사능의 방출에 의해 검출될 수 있고; (2) 도움 T 림프구는 항원 및 항원 제시 세포와 함께 배양될 수 있고　사이토카인의 합성 및 분비는 표준 방법에 의해 측정될 수 있고 (Windhagen A et al., Immunity, 2: 373-80, 1995); (3) 항원 제시 세포는 전체 단백질 항원과 함께 배양될 수 있고 MHC 상에의 해당 항원의 제시는　T 림프구 활성화 분석 또는 생물물리학적 방법에 의해 검출될 수 있고 (Harding et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 86: 4230-4, 1989);　(4) 비만 세포는 그의 Fc-엡실론 수용체를 가교결합하는 시약과 함께 배양될 수 있고 히스타민 방출은 효소 면역분석에 의해 측정될 수 있고 (Siraganian et al., TIPS, 4: 432-437, 1983); (5) 효소-결합 면역흡착 분석 (ELISA)이 있다.
유사하게, 모델 유기체 (예를 들어, 마우스) 또는 인간 대상체에서의 면역 반응의 산물은 당업자에게 잘 알려진 다양한 방법에 의해 검출될 수도 있다. 예를 들어, (1) 백신접종에 대한 반응으로의 항체의 생성은 임상 실험실에서 현재 사용되는 표준 방법, 예를 들어 ELISA에 의해 쉽게 검출될 수 있고; (2) 면역 세포의 염증 부위로의 이동은 피부 표면을 긁어내고, 이동 세포를 긁은 부위에서 포획하기 위해 멸균 용기를 위치시켜 검출될 수 있고 (Peters et al., Blood, 72: 1310-5, 1988); (3) 미토겐(mitogen) 또는 혼합 림프구 반응에 대한 반응으로의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 증식은 3H-티미딘을 사용하여 측정될 수 있고; (4) PBMC의 과립구, 대식세포 및 다른 식세포의 식세포 능력은 PBMC를 표지된 입자와 함께 웰(well)에 위치시켜 측정될 수 있고 (Peters et al., Blood, 72: 1310-5, 1988); (5) 면역계 세포의 분화는 PBMC를 CD4 및 CD8과 같은 CD 분자에 대한 항체로 표지하고 이들 마커를 발현하는 PBMC의 분획을 측정함으로써 측정될 수 있다.
일 실시양태에서, 본 기술의 항-DLL3 항체는 복제가능한 유전자 패키지의 표면 상에서 DLL3 펩타이드의 디스플레이를 사용하여 선택된다. 예를 들어, 미국 특허 등록번호 5,514,548; 5,837,500; 5,871,907; 5,885,793; 5,969,108; 6,225,447; 6,291,650; 6,492,160; EP　585 287; EP　605522; EP　616640; EP　1024191; EP　589 877; EP　774 511; EP　844 306 참조. 목적하는 특이성을 갖는 결합 분자를 암호화하는 파지미드 게놈을 함유하는 사상 박테리오파지 입자를 생산/선택하는 데 유용한 방법이 기술되어 왔다. 예를 들어, EP　774 511; US 5871907; US 5969108; US 6225447; US 6291650; US 6492160 참조.
일부 실시양태에서, 본 기술의 항-DLL3 항체는 효모 숙주 세포의 표면 상에서 DLL3 펩타이드의 디스플레이를 사용하여 선택된다. 효모 표면 디스플레이에 의한 scFv 폴리펩타이드의 분리에 유용한 방법은 Kieke et al., Protein Eng. 1997 Nov; 10(11): 1303-10에 의해 기술되었다.
일부 실시양태에서, 본 기술의 항-DLL3 항체는 리보좀 디스플레이를 사용하여 선택된다. 리보좀 디스플레이를 사용하여 펩타이드 라이브러리에서 리간드를 식별하는 데 유용한 방법은 Mattheakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9022-26, 1994; 및 Hanes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4937-42, 1997에 의해 기술되었다.
특정 실시양태에서, 본 기술의 항-DLL3 항체는 DLL3 펩타이드의 tRNA 디스플레이를 사용하여 선택된다. tRNA 디스플레이를 사용하는 리간드의 시험관 내 선택에 유용한 방법은 Merryman et al., Chem. Biol., 9: 741-46, 2002에 의해 기술되었다.
일 실시양태에서, 본 기술의 항-DLL3 항체는 RNA 디스플레이를 사용하여 선택된다. RNA 디스플레이 라이브러리를 사용하여 펩타이드 및 단백질을 선택하는 데 유용한 방법은 Roberts et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 12297-302, 1997; 및 Nemoto et al., FEBS Lett., 414: 405-8, 1997에 의해 기술되었다. 비천연 RNA 디스플레이 라이브러리를 사용하여 펩타이드 및 단백질을 선택하는 데 유용한 방법은 Frankel et al., Curr. Opin. Struct. Biol., 13: 506-12, 2003에 의해 기술되었다.
일부 실시양태에서, 본 기술의 항-DLL3 항체는 그람 음성 박테리아의 주변 세포질 (periplasm)에서 발현되고 표지된 DLL3 단백질과 혼합된다. WO　02/34886 참조. Harvey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 22: 9193-98 2004 및 미국 특허출원 공개번호 2004/0058403에 기재된 바와 같이, DLL3 단백질에 대한 친화도를 갖는 재조합 폴리펩타이드를 발현하는 클론에서, 항-DLL3 항체에 결합된 표지된 DLL3 단백질의 농도가 증가하고 세포가 나머지 라이브러리로부터 분리될 수 있게 한다.
목적하는 항-DLL3 항체의 선택 후, 상기 항체는 당업자에게 공지된 임의의 기술, 예를 들어 원핵 또는 진핵 세포 발현 등에 의해 대량으로 생산될 수 있는 것으로 고려된다. 예를 들어, 비제한적으로, 항-DLL3 하이브리드 항체 또는 단편인 항-DLL3 항체는 CDR 및 필요한 경우, 원래의 종 항체 결합 특이성을 보유하기 위해 요구되는 가변 영역 프레임워크의 최소 부분 (본 명세서에 기재된 기술에 따라 조작된 바와 같음)이 원래의 종 항체로부터 유래하고 나머지 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같이 조작될 수 있는 표적 종 면역글로불린으로부터 유래하여 하이브리드 항체 중쇄의 발현을 위한 벡터를 생산하는 항체 중쇄를 암호화하는 발현 벡터를 제작하기 위해 통상적인 기술을 사용하여 생산될 수 있다.
DLL3 결합의 측정. 일부 실시양태에서, DLL3 결합 검정은 DLL3 단백질 및 항-DLL3 항체가 DLL3 단백질과 항-DLL3 항체 사이의 결합 및 DLL3 단백질과 항-DLL3 항체 사이의 결합량 평가에 적합한 조건 하에 혼합되는 검정 형식을 의미한다. 결합량은 DLL3 단백질의 부재 하에서의 결합량, 비-특이적 면역글로불린 조성물의 존재 하에서의 결합량, 또는 둘 다일 수 있는 적합한 대조군과 비교된다. 결합량은 임의의 적합한 방법에 의해 평가될 수 있다. 결합 검정 방법은, 예를 들어 ELISA, 방사면역검정, 섬광 근접 검정, 형광 에너지 전달 검정, 액체 크로마토그래피, 막 여과 검정 등을 포함한다. 항-DLL3 항체에 결합하는 DLL3 단백질의 직접 측정을 위한 생물물리학적 검정은, 예를 들어 핵 자기 공명, 형광, 형광 편광, 표면 플라스몬 공명(BIACORE 칩), 생물층 간섭계 (biolayer interferometry) 등이다. 특이적 결합은 당업계에 공지된 표준 검정, 예를 들어, 방사성리간드 결합 검정, ELISA, FRET, 면역침전, SPR, NMR (2D-NMR), 질량 분광법 등에 의해 결정된다. 후보 항-DLL3 항체의 특이적 결합이 후보 항-DLL3 항체의 부재 하에서 관찰된 결합보다 적어도 1% 더 큰 경우, 후보 항-DLL3 항체는 본 기술의 항-DLL3 항체로서 유용하다.
상기 중쇄 아미노산 서열 및 경쇄 아미노산 서열에 대해 높은 동일성을 나타내는 서열을 함께 조합함으로써, 상기 각 항체와 동등한 생물학적 활성을 갖는 항체를 선택할 수 있다. 이러한 동일성은 일반적으로 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 동일성이다. 또한, 중쇄 또는 경쇄의 아미노산 서열에 대하여, 이의 하나 또는 여러 아미노산 잔기의 치환, 결실 또는 첨가를 포함하는 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열을 조합함으로써, 상기 각 항체와 동등한 생물학적 활성을 갖는 항체를 선택할 수 있다.
2가지 유형의 아미노산 서열 사이의 동일성은 Clustal W 버전 2 (Larkin MA, Blackshields G, Brown NP, Chenna R, McGettigan PA, McWilliam H, Valentin F, Wallace IM, Wilm A, Lopez R, Thompson JD, Gibson TJ 및 Higgins DG (2007),"Clustal W and Clustal X version 2.0", Bioinformatics. 23 (21): 2947-2948)의 기본 파라미터를 사용하여 서열을 정렬함으로써 판단할 수 있다.
새롭게 생성된 인간 항체가 본 명세서에 기재된 임의의 하나의 래트 항-인간 DLL3 항체, 키메라 항-인간 DLL3 항체 또는 인간화 항-인간 DLL3 항체가 결합하는 부분 펩타이드 또는 부분 3차원 구조에 결합하는 경우, 인간 항체가 래트 항-인간 DLL3 항체, 키메라 항-인간 DLL3 항체 또는 인간화 항-인간 DLL3 항체가 결합하는 것과 동일한 에피토프에 결합하는 것으로 판단될 수 있다. 대안적으로, 인간 항체가 DLL3에 대한 항체의 결합에 있어서 본 명세서에 기재된 래트 항-인간 DLL3 항체, 키메라 항-인간 DLL3 항체 또는 인간화 항-인간 DLL3 항체와 경쟁한다는 것을 확인함으로써, 에피토프의 특정 서열 또는 구조가 결정되지 않았다고 하더라도, 인간 항체가 본 명세서에 기재된 래트 항-인간 DLL3 항체, 키메라 항-인간 DLL3 항체 또는 인간화 항-인간 DLL3 항체가 결합하는 것과 동일한 에피토프에 결합하는 것으로 판단될 수 있다. 본 명세서에서, 이들 판단 방법 중 적어도 하나에 의해 인간 항체가 "동일한 에피토프에 결합한다"고 판단되는 경우, 새로 제조된 인간 항체는 본 명세서에 기재된 래트 항-인간 DLL3 항체, 키메라 항-인간 DLL3 항체 또는 인간화 항-인간 DLL3 항체와 "동일한 에피토프에 결합한다"고 결론지어진다. 인간 항체가 동일한 에피토프에 결합한다는 것이 확인되는 경우, 인간 항체는 래트 항-인간 DLL3 항체, 키메라 항-인간 DLL3 항체 또는 인간화 항-인간 DLL3 항체와 동등한 생물학적 활성을 갖는 것으로 예상된다.
상기 방법으로 얻어진 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체는 공지된 방법 등에 따라 항원에 대한 결합 활성을 평가하여 바람직한 항체를 선택할 수 있다.
항체의 특성의 비교를 위한 또 다른 지표의 일 예시는 항체의 안정성을 포함할 수 있다. 시차 주사 열량계 (DSC)는 단백질의 상대적인 구조적 안정성을 나타내는 좋은 지표인 열변성 중간점 (Tm)을 신속하고 정확하게 측정할 수 있는 장치이다. DSC를 사용하여 Tm 값을 측정하고 얻은 값을 비교함으로써, 열 안정성의 차이를 비교할 수 있다. 항체의 보존 안정성은 항체의 열 안정성과 일정한 상관 관계가 있는 것으로 알려져 있으므로(Lori Burton, et al., Pharmaceutical Development and Technology (2007) 12, p. 265-273), 열 안정성을 지표로 사용하여 바람직한 항체를 선택할 수 있다. 항체의 선택을 위한 지표의 다른 예는 적합한 숙주 세포에서의 높은 수율 및 수용액에서의 낮은 응집을 포함할 수 있다. 예를 들어, 수율이 가장 높은 항체가 항상 가장 높은 열 안정성을 나타내는 것은 아니므로, 앞서 언급한 지표들을 바탕으로 종합적으로 판단하여 인간에게 투여하기에 가장 적합한 항체를 선택할 필요가 있다.
얻어진 항체는 균일한 상태로 정제될 수 있다. 항체의 분리 및 정제를 위하여, 통상의 단백질에 사용되는 분리 및 정제 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 컬럼 크로마토그래피, 여과, 한외여과, 염석, 투석, 분취용 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 및 등전 포커싱을 적절하게 선택하고 서로 조합하여, 항체를 분리 및 정제할 수 있으나 (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); 및 Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow 및 David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), 분리 및 정제 방법의 예는 이에 제한되지 않는다.
크로마토그래피의 예는 친화도 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피 및 흡수 크로마토그래피 등을 포함할 수 있다.
이들 크로마토그래피 기술은 HPLC 또는 FPLC와 같은 액체 크로마토그래피를 사용하여 수행될 수 있다.
친화도 크로마토그래피에 사용되는 컬럼의 예는 단백질 A 컬럼 및 단백질 G 컬럼을 포함할 수 있다. 단백질 A를 사용하는 컬럼의 예는 Hyper D, POROS 및 Sepharose F. F. (Pharmacia)를 포함할 수 있다.
또한, 항원-고정화 담체를 사용하여, 항원에 대한 항체의 결합 활성을 이용함으로써 항체를 정제할 수 있다.
VI. 항-DLL3 항체-약물 접합체 (ADC)
A. 약물
본 명세서에 기재된 항-DLL3 항체 (예를 들어, 2-C8-A, 6-G23-F 및 10-O18-A, 또는 인간 항체: H2-C8-A, H2-C8-A-2, H2-C8-A-3, H6-G23-F, H6-G23-F-2, H6-G23-F-3, H10-O18-A, H10-O18-A-2 및 H10-O18-A-3)는 항-DLL3 항체-약물 접합체 (ADC)를 제조하기 위해 링커 구조 모이어티를 통해 약물에 접합될 수 있다. 약물은 링커 구조에 연결될 수 있는 치환기 또는 부분 구조를 갖는 한 특별히 제한되지 않는다. 항-DLL3 항체-약물 접합체 (ADC)는 접합된 약물에 따라 다양한 용도로 사용될 수 있다. 이러한 약물의 예는 항종양 활성을 갖는 물질, 혈액 질환에 효과적인 물질, 자가면역 질환에 효과적인 물질, 항염증 물질, 항균 물질, 항진균 물질, 항기생충 물질, 항바이러스 물질 및 항마취 물질을 포함할 수 있다.
본 발명의 항체-약물 접합체는 다음의 화학식으로 표시된다:
[화학식 36]
m1은 항체-약물 접합체 내의 항체 분자 당 접합된 약물 분자의 수를 나타내고, Ab는 항체 또는 항체의 기능적 단편을 나타내고, L은 Ab와 D를 연결하는 링커를 나타내고, D는 약물을 나타낸다.
A. 약물
본 발명의 항체-약물 접합체에 접합된 약물 D가 본 명세서에 기재되어 있다. 본 발명의 약물 D는 바람직하게는 항종양 화합물이다. 항종양 화합물은 종양 세포에서 링커의 일부 또는 전부가 절단되고 항종양 화합물 모이어티가 방출되면 항종양 효과를 나타낸다. 링커와 약물이 결합 부분에서 절단되면, 원래 구조의 항종양 화합물이 방출되고 원래의 항종양 효과가 발휘된다.
본 발명의 항체-약물 접합체 내의 항종양 화합물은 하기 일반식 (V)로 표시되는 피롤로벤조다이아제핀 유도체 (PBD 유도체)이다:
[화학식 37]
상기 화학식의 변수 그룹은 아래에서 보다 상세히 기술된다.
별표는 링커 L에 대한 결합을 나타낸다.
n1은 2 내지 8의 정수를 나타내고, 바람직하게는 2 내지 6, 더 바람직하게는 3 내지 5이다.
첨자 n1이 2 내지 8의 정수, 바람직하게는 2 내지 6의 정수, 더 바람직하게는 3 내지 5의 정수인 알킬 사슬은 이중 결합을 포함할 수 있다.
A는 스피로-결합된 3원 내지 5원 포화 탄화수소 고리 또는 3원 내지 5원 포화 헤테로고리를 나타내고, 바람직하게는 3원 내지 5원 포화 탄화수소 고리 (사이클로프로판, 사이클로부탄 또는 사이클로펜탄), 더 바람직하게는 사이클로프로판 또는 사이클로부탄, 가장 바람직하게는 사이클로프로판이다.
스피로-결합된 3원 내지 5원 포화 탄화수소 고리는 1 내지 4개의 할로젠 원자로 치환될 수 있고, 바람직하게는 1 또는 2개의 플루오린 원자로 치환될 수 있다 (예를 들어, 2,2-디플루오로사이클로프로판).
R1 및 R2는 각각 독립적으로 C1 내지 C6 알콕시기, C1 내지 C6 알킬기, 수소 원자, 하이드록시기, 티올기, C1 내지 C6 알킬티오기, 할로젠 원자 또는 -NR'R"을 나타내고, 각각 바람직하게는 C1 내지 C6 알콕시기, C1 내지 C6 알킬기 또는 하이드록시기, 더 바람직하게는 C1 내지 C3 알콕시기, 가장 바람직하게는 메톡시기이다.
R3, R4 및 R5는 하기 (i) 내지 (iii) 중 어느 하나에 기재된 바와 같다.
i. 화합물 실시양태 1
R3 및 R4가 R3 및 R4가 결합된 탄소 원자와 함께 결합하여 다음에 나타낸 바와 같이 이중 결합을 형성하는 경우:
[화학식 38]
상기 식에서, R5는 그룹 1로부터 선택된 하나 이상의 치환기를 임의로 갖는 아릴기 또는 헤테로아릴기 또는 그룹 2로부터 선택된 하나 이상의 치환기를 임의로 갖는 C1 내지 C6 알킬기를 나타내고, 바람직하게는 그룹 1로부터 선택된 하나 이상의 치환기를 임의로 갖는 아릴기이다.
R5에 대한 "그룹 1로부터 선택된 하나 이상의 치환기를 임의로 갖는 아릴기 또는 헤테로아릴기"에서의 "아릴기"는 바람직하게는 페닐기 또는 나프틸기이고, 더 바람직하게는 페닐기이다.
R5에 대한 "그룹 1로부터 선택된 하나 이상의 치환기를 임의로 갖는 아릴기 또는 헤테로아릴기"에서의 "헤테로아릴기"는 바람직하게는 티에닐기, 피리딜기, 피리미딜기, 퀴놀릴기, 퀴녹살릴기 또는 벤조티오페닐기, 더 바람직하게는 2-티에닐기, 3-티에닐기, 2-피리딜기, 3-피리딜기 또는 4-피리딜기, 보다 더 바람직하게는 3-피리딜기 또는 3-티에닐기이다.
R5에 대한 아릴기 또는 헤테로아릴기의 치환기의 예는 다음의 a) 내지 j)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:
a) 1 내지 3개의 할로젠 원자로 임의로 치환된 C1 내지 C6 알콕시기
b) 1 내지 3개의 할로젠 원자, 하이드록시기, -OCOR', -NR'R'', -C(=NR')-NR''R''' 및 -NHC(=NR')-NR''R'''로부터 선택된 어느 하나로 임의로 치환된 C1 내지 C6 알킬기
c) 할로젠 원자,
d) C3 내지 C5 사이클로알콕시기,
e) C1 내지 C6 알킬티오기,
f) -NR'R'',
g) -C(=NR')-NR''R''',
h) -NHC(=NR')-NR''R''',
i) -NHCOR' 및
j) 하이드록시기.
여기서, b) 및 f) 내지 i)의 R', R'' 및 R'''는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 C1 내지 C6 알킬기를 나타내고, 바람직하게는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 C1 내지 C3 알킬기이다.
a) 내지 j)는 바람직하게는 다음과 같다:
a) 1 내지 3개의 할로젠 원자로 임의로 치환된 C1 내지 C3 알콕시기, 더 바람직하게는 메톡시기, 에톡시기, n-프로폭시기, i-프로폭시기 또는 트리플루오로메톡시, 보다 더 바람직하게는 메톡시기, 에톡시기 또는 트리플루오로메톡시기, 가장 바람직하게는 메톡시기;
b) 1 내지 3개의 할로젠 원자로 임의로 치환된 C1 내지 C3 알킬기, 하이드록시기, -OCOR', -C(=NR')-NR''R''' 또는 -NHC(=NR')-NR''R''', 여기서 R', R'' 및 R'''은 각각 독립적으로 수소 원자 또는 C1 내지 C3 알킬기, 더 바람직하게는 1 내지 3개의 할로젠 원자로 임의로 치환된 C1 내지 C3 알킬기, 하이드록시기, -OCOR', -C(=NR')-NR''R''' 및 -NHC(=NR')-NR''R''', 여기서 R', R'' 및 R'''은 각각 독립적으로 수소 원자 또는 메틸기, 보다 더 바람직하게는 메틸기, 에틸기, n-프로필기, i-프로필기, 플루오로메틸기, 디플루오로메틸기, 트리플루오로메틸기, 하이드록시메틸기,　-CH2OCOMe, -CH2-NHC(=NH)-NH2 또는 -CH2-NHC(=NMe)-NH2;
c) 할로젠 원자, 바람직하게는 플루오린 원자 또는 클로린 원자;
d) C3 내지 C5 사이클로알콕시기, 더 바람직하게는 사이클로프로폭시기;
e) C1 내지 C3 알킬티오기, 더 바람직하게는 메틸티오기 또는 에틸티오기;
f) -NR'R'', 여기서 R' 및 R''은 각각 독립적으로 수소 원자 또는 C1 내지 C3 알킬기, 더 바람직하게는 -NH2, -NHMe, -NMe2, -NHEt, 또는 -NEt2;
g) -C(=NR')-NR''R''', 여기서 R', R'' 및 R'''은 각각 독립적으로 수소 원자 또는 C1 내지 C3 알킬기, 더 바람직하게는 -C(=NH)-NH2 또는 -C(=NMe)-NH2;
h) -NHC(=NR')-NR''R''', 여기서 R', R'' 및 R'''은 각각 독립적으로 수소 원자 또는 C1 내지 C3 알킬기, 더 바람직하게는 -NHC(=NH)-NH2 또는 -NHC(=NMe)-NH2;
i) -NHCOR', 여기서 R'은 수소 원자 또는 C1 내지 C3 알킬기, 더 바람직하게는 -NHCOMe 또는 -NHCOEt; 및
j) 하이드록시기.
R5에 대한 아릴기(바람직하게는 페닐기) 또는 헤테로아릴기 (바람직하게는 피리딜기)는 임의의 위치에 적어도 하나의 치환기를 가질 수 있다. 복수 개의 치환기가 존재하는 경우, 그 치환기는 동일하거나 상이할 수 있다.
R5가 아릴기인 경우, 각각의 치환기는 바람직하게는 a), b), d), g), h) 또는 j), 더 바람직하게는 a), b), d), 또는 j)이다.
R5가 페닐기인 경우, R5는 임의의 위치에 치환기를 가질 수 있고 복수의 치환기를 가질 수 있고, 바람직하게는 1개 또는 2개의 치환기가 3-위치 및/또는 4-위치에 존재하고, 더 바람직하게는 1개의 치환기가 4-위치에 존재한다. R5가 나프틸기인 경우, R5는 임의의 위치에 치환기를 가질 수 있고, 복수의 치환기를 가질 수 있고, 바람직하게는 1개의 치환기가 6-위치에 존재한다.
R5가 페닐기인 경우, R5는 더 바람직하게는 페닐기, 4-메톡시페닐기, 3-메톡시페닐기, 4-에톡시페닐기, 4-(n-프로폭시)-페닐기, 4-(i-프로폭시)-페닐기, 4-사이클로프로폭시-페닐기, 4-트리플루오로메틸페닐기, 4-하이드록시메틸-페닐기, 4-아세톡시메틸-페닐기 또는 4-카바미미드아미도메틸-페닐기(4-carbamimidamidomethyl-phenyl group), 보다 더 바람직하게는 페닐기, 4-메톡시페닐기, 3-메톡시페닐기, 4-사이클로프로폭시-페닐기, 4-하이드록시메틸-페닐기, 4-아세톡시메틸-페닐기, 4-카바미미드아미도메틸-페닐기 또는 4-트리플루오로메틸페닐기이다.
R5가 나프틸기인 경우, R5는 더 바람직하게는 나프틸기 또는 6-메톡시-2-나프틸기이다.
가장 바람직한 것은 4-메톡시페닐기이다.
R5가 헤테로아릴기인 경우, 각각의 치환기는 바람직하게는 a), b), d), g), h) 또는 j), 더 바람직하게는 a) 또는 b)이다.
R5가 헤테로아릴기인 경우, R5는 임의의 위치에 적어도 하나의 치환기를 가질 수 있다. R5가 3-피리딜기인 경우, 이의 치환기(들)는 바람직하게는 6-위치 및/또는 5-위치에 존재한다. R5가 2-피리딜인 경우, 이의 치환기(들)는 바람직하게는 5-위치 및/또는 4-위치, 또는 5-위치 및/또는 6-위치에 존재한다. R5가 4-피리딜인 경우, 이의 치환기(들)는 바람직하게는 2-위치 및/또는 6-위치에 존재한다.
R5가 헤테로아릴기인 경우, R5는 복수의 치환기를 가질 수 있고, 바람직하게는 1개 또는 2개의 치환기를 갖고, 바람직하게는 1개의 치환기를 갖는다.
R5가 피리딜기인 경우, R5는 바람직하게는 6-메톡시-3-피리딜기 또는 6-메틸-3-피리딜기이다.
R5가 3-티에닐기 또는 6-퀴녹살릴기인 경우, R5는 바람직하게는 치환되지 않는다.
R5에 대한 "그룹 2로부터 선택된 하나 이상의 치환기를 임의로 갖는 C1 내지 C6 알킬기"에서 "C1 내지 C6 알킬기"는 바람직하게는 C1 내지 C3 알킬기, 더 바람직하게는 메틸기 또는 에틸기이다.
R5에 대한 "그룹 2로부터 선택된 하나 이상의 치환기를 임의로 갖는 C1 내지 C6 알킬기"에서 치환기는 각각 할로젠 원자, 하이드록시기 또는 C1 내지 C6 알콕시기 (바람직하게는, C1 내지 C3 알콕시기), 바람직하게는 하이드록시기, 메톡시기 또는 에톡시기, 더 바람직하게는 하이드록시기이다.
ii. 화합물 실시양태 2
R3가 수소 원자를 나타내는 경우, R4 및 R5는 R4 및 R5가 결합된 탄소 원자와 함께 결합하여, 하기에 나타낸 바와 같이 3원 내지 5원 포화 탄화수소 고리 또는 3원 내지 5원 포화 헤테로고리 또는 CH2=를 형성한다:
[화학식 39]
또는
[화학식 49]
3원 내지 5원 포화 탄화수소 고리는 1 내지 4개의 할로젠 원자로 치환될 수 있고, 바람직하게는 1 또는 2개의 플루오린 원자로 치환될 수 있다.
R4 및 R5는 바람직하게는 결합하여 3원 내지 5원 포화 탄화수소 고리 또는 CH2=, 더 바람직하게는 사이클로프로판, 사이클로부탄 또는 CH2= (엑소메틸렌기), 보다 더 바람직하게는 사이클로프로판을 형성한다.
R4 및 R5가 결합하여 3원 내지 5원 포화 탄화수소 고리 또는 3원 내지 5원 포화 헤테로고리를 형성하는 경우, 3원 내지 5원 포화 탄화수소 고리 또는 3원 내지 5원 포화 헤테로고리는 바람직하게는 A와 동일하다. 더 바람직하게는, A는 3원 내지 5원 포화 탄화수소 고리이고, R4 및 R5는 결합하여 3원 내지 5원 포화 탄화수소 고리를 형성하고, 보다 더 바람직하게는 A는 사이클로프로판 고리이고, R4 및 R5는 결합하여 사이클로프로판 고리를 형성한다.
iii. 화합물 실시양태 3
R3, R4, 및 R5는 R3가 결합된 탄소 원자 및 R4 및 R5가 결합된 탄소 원자와 함께 결합하여, 그룹 3으로부터 선택된 하나 이상의 치환기를 임의로 갖는 벤젠 고리 또는 6원 헤테로고리를 형성한다.
다음의 화학식은 R3 및 R4가 서로 결합하여 하나 이상의 치환기를 임의로 갖는 벤젠 고리를 형성하는 경우를 나타낸다.
[화학식 41]
벤젠 고리 또는 헤테로고리는 임의의 위치에 적어도 1개의 치환기를 가질 수 있다. 복수 개의 치환기가 존재하는 경우, 그 치환기는 동일하거나 상이할 수 있다.
벤젠 고리 또는 헤테로고리의 각 치환기는 할로젠 원자, 1 내지 3개의 할로젠 원자로 임의로 치환된 C1 내지 C6 알킬기 또는 C1 내지 C6 알콕시기, 바람직하게는 할로젠 원자, 1 내지 3개의 할로젠 원자로 임의로 치환된 C1 내지 C3 알킬기 또는 C1 내지 C3 알콕시기, 더 바람직하게는 할로젠 원자, 메틸기 또는 메톡시기이다.
"하나 이상의 치환기를 임의로 갖는 벤젠 고리 또는 6원 헤테로고리"는 바람직하게는 치한되지 않은 벤젠 고리이다.
R3, R4 및 R5는 가장 바람직하게는 하위절 (i)의 "화합물 실시양태 1"에서 상기를 충족한다.
R6 및 R7은 각각 수소 원자를 나타내거나, R6 및 R7은 결합하여 이민 결합 (C=N)을 나타낸다.
R8은 하이드록시기 또는 C1 내지 C3 알콕시기, 바람직하게는 하이드록시기 또는 메톡시기, 더 바람직하게는 하이드록시기이다. R8은 하이드로젠설파이트 부가물 (OSO3M, 여기서 M은 금속 양이온임)일 수 있다.
R8이 비대칭 탄소 원자에 결합하므로, 하기의 부분 구조 (Va) 또는 (Vb)로 표시되는 입체 배치가 제공된다. 각각의 물결선은 일반식 (V)에서 Y에 대한 결합을 나타내고, 각각의 별표는 L에 대한 결합을 나타낸다.
[화학식 42]
X 및 Y는 각각 독립적으로 산소 원자, 질소 원자 또는 황 원자, 바람직하게는 산소 원자이다.
본 발명의 약물 D는 바람직하게는 다음의 군으로부터 선택되는 어느 하나의 화합물이다:
[화학식 43]
[화학식 44]
[화학식 45]
상기 식에서, 각각의 별표는 약물이 링커 구조 (L)에 결합하는 위치를 나타낸다.
일부 실시양태에서, -OH는 위치 11'에 있다.
B. 링커 구조
본 발명의 항체-약물 접합체에서 항종양 약물을 항체에 결합시키기 위한 링커 구조가 기술될 것이다.
링커 L은 다음의 화학식으로 표시된다:
-Lb-La-Lp-NH-B-CH2-O(C=O)-*
상기 식에서, 별표는 약물 D의 N10'-위치에서의 질소 원자에 대한 결합을 나타내고, Lb는 La를 Ab의 글리칸 또는 변형된 글리칸에 연결하는 스페이서를 나타낸다.
B는 페닐기 또는 헤테로아릴기를 나타내고, 바람직하게는 1,4-페닐기, 2,5-피리딜기, 3,6-피리딜기, 2,5-피리미딜기 또는 2,5-티에닐기, 더 바람직하게는 1,4-페닐기이다.
Lp는 생체 내 또는 표적 세포에서 절단 가능한 아미노산 서열로 구성된 링커를 나타낸다. Lp는, 예를 들면 에스터라제 및 펩티다제와 같은 효소의 작용에 의해 절단된다.
Lp는 2 내지 7개 (바람직하게는, 2 내지 4개)의 아미노산으로 구성된 펩타이드 잔기이다. 즉, Lp는 2 내지 7개의 아미노산이 펩타이드 결합으로 연결된 올리고펩타이드 잔기로 구성된다.
Lp는 N 말단에서 Lb-La- 중 La의 카보닐기에 결합하고, C 말단에서 링커의 -NH-B-CH2-O(C=O)- 부분의 아미노기(-NH-)와 아미드 결합을 형성한다. Lp의 C 말단과 -NH- 사이의 결합은 에스터라제와 같은 효소에 의해 절단된다.
Lp를 구성하는 아미노산은 특정 아미노산에 제한되지 않고, 예를 들어 L- 또는 D-아미노산, 바람직하게는 L-아미노산이다. 아미노산은 α-아미노산 뿐만 아니라, 예를 들어 β-알라닌, ε-아미노카프로산 또는 γ-아미노부티르산과 같은 구조를 갖는 아미노산을 포함할 수 있고, N-메틸화된 아미노산과 같은 비-천연 아미노산을 더 포함할 수 있다.
Lp의 아미노산 서열은 특정 아미노산 서열로 제한되지 않고, Lp를 구성하는 아미노산의 예는 글라이신(Gly; G), 발린(Val; V), 알라닌(Ala; A), 페닐알라닌(Phe; F), 글루탐산(Glu; E), 이소류신(Ile; I), 프롤린(Pro; P), 시트룰린(Cit), 류신(Leu; L), 세린(Ser; S), 라이신(Lys; K) 및 아스파르트산(Asp; D)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들 중에서 바람직한 것은 글라이신(Gly; G), 발린(Val; V), 알라닌(Ala; A) 및 시트룰린(Cit)이다.
이들 아미노산 중 임의의 것은 여러 번 나타날 수 있고, Lp는 임의로 선택된 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 약물 방출 패턴은 아미노산 유형을 통해 조절될 수 있다.
구체적인 링커 Lp는 -GGVA- (서열번호: 85), -GG-(D-)VA-, -VA-, -GGFG- (서열번호: 86), -GGPI- (서열번호: 87), -GGVCit- (서열번호: 88), -GGVK- (서열번호: 89), -GG(D-)PI-, -GGPL- (서열번호: 90), -EGGVA (서열번호: 91), -PI-, -GGF-, DGGF- (서열번호: 92), (D-)D-GGF-, -EGGF- (서열번호: 93), -SGGF- (서열번호: 94), -KGGF- (서열번호: 95), -DGGFG- (서열번호: 96), -GGFGG- (서열번호: 97), -DDGGFG- (서열번호: 98), -KDGGFG- (서열번호: 99) 및 -GGFGGGF- (서열번호: 100)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
여기서, "(D-)V"는 D-발린을 나타내고, "(D)-P"는 D-프롤린을 나타내고, "(D-)D"는 D-아스파르트산을 나타낸다.
링커 Lp는 바람직하게는 다음 중 어느 하나이다:
-GGVA- (서열번호: 85), -GG-(D-)VA-, -VA-, -GGFG- (서열번호: 86), -GGPI- (서열번호: 87), -GGVCit- (서열번호: 88), -GGVK- (서열번호: 89), -GG(D-)PI- 및 -GGPL- (서열번호: 90).
링커 Lp는 더 바람직하게는 다음 중 어느 하나이다:
-GGVA- (서열번호: 85), -GGVCit- (서열번호: 88) 및 -VA-.
Lb는 다음을 나타낸다: La를 Ab의 글리칸 또는 변형된 글리칸에 연결하는 스페이서. 일부 실시양태에서, Lb는 다음의 군으로부터 선택되는 어느 하나를 나타낸다:
-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-, -C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-NH-(CH2CH2)n3-C(=O)-,
-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)n3-CH2-C(=O)-,
-C(=O)-(CH2CH2)n2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)n3-CH2CH2-C(=O)-, -(CH2)n4-O-C(=O)-
상기 식에서, n2는 1 내지 3의 정수 (바람직하게는, 1 또는 2)를 나타내고, n3는 1 내지 5의 정수 (바람직하게는, 2 내지 4의 정수, 더 바람직하게는, 2 또는 4)를 나타내고, n4는 0 내지 2의 정수 (바람직하게는, 0 또는 1)를 나타낸다.
일부 실시양태에서, La는 바람직하게는 다음의 군으로부터 선택되는 어느 하나를 나타낸다:
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-, -C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-,
-CH2-OC(=O)- 및 -OC(=O)-, 및
La는 더 바람직하게는 -C(=O)-CH2CH2-C(=O)- 또는 -C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-이다.
스페이서 Lb는 특정 스페이서에 제한되지 않고, 이의 예는 다음의 화학식으로 표시되는 스페이서를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
[화학식 46]
[화학식 47]
[화학식 48]
.
위에 나타낸 Lb에 대한 구조식에서, 각각의 별표는 La의 좌측 말단에서의 -(C=O) 또는 -(CH2)n4에 대한 결합을 나타내고, 각각의 물결선은 Ab의 글리칸 또는 변형된 글리칸에 대한 결합을 나타낸다.
Lb (Lb-1, Lb-2 또는 Lb-3)에 대한 각각의 구조식에서, 아자이드기와 DBCO의 클릭 반응에 의해 형성된 트리아졸 고리 부위는 기하 이성질체의 구조를 제공하고, Lb의 분자는 2개의 구조 중 어느 하나 또는 2개의 구조 모두의 혼합물로 존재한다. 본 발명의 항체-약물 접합체의 분자 당 m1개의 "-L-D" 모이어티가 존재하고, m1개의 "-L-D" 모이어티의 각각의 L에서 Lb (Lb-1, Lb-2 또는 Lb-3)로서 2개의 구조 중 어느 하나가 존재하거나 2개의 구조 모두가 공존한다.
일부 실시양태에서, L은 바람직하게는 -Lb-La-Lp-NH-B-CH2-O(C=O)-*로 표시되고, 여기서:
B는 1,4-페닐기이고,
Lp는 다음의 군으로부터 선택되는 어느 하나를 나타내고:
-GGVA- (서열번호: 85), -GG-(D-)VA-, -VA-, -GGFG- (서열번호: 86), -GGPI- (서열번호: 87), -GGVCit- (서열번호: 88), -GGVK- (서열번호: 89), -GG(D-)PI- 및 -GGPL- (서열번호: 90),
La는 다음의 군으로부터 선택되는 어느 하나를 나타내고:
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-, -C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-, -CH2-OC(=O)-, -OC(=O)-,
Lb는 Lb에 대한 위의 구조식 중 어느 하나를 나타낸다.
일부 실시양태에서, L은 더 바람직하게는 다음의 군으로부터 선택되는 어느 하나이다:
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)- ("GGVA"는 서열번호: 85로 개시됨),
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GG-(D-)VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPI-NH-B-CH2-OC(=O)- ("GGPI"는 서열번호: 87로 개시됨),
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-B-CH2-OC(=O)- ("GGFG"는 서열번호: 86으로 개시됨),
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(=O)- ("GGVCit"는 서열번호: 88로 개시됨),
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVK-NH-B-CH2-OC(=O)- ("GGVK"는 서열번호: 89로 개시됨),
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPL-NH-B-CH2-OC(=O)- ("GGPL"은 서열번호: 90으로 개시됨),
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z2-OC(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)- ("GGVA"는 서열번호: 85로 개시됨),
-Z3-CH2-OC(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)- ("GGVA"는 서열번호: 85로 개시됨);
상기 식에서 Z1은 Lb에 대해 기재된 바와 같은 다음의 구조식을 나타내고:
[화학식 49]
Z2는 Lb에 대해 기재된 바와 같은 다음의 구조식을 나타내고:
[화학식 50]
Z3는 Lb에 대해 기재된 바와 같은 다음의 구조식을 나타내고:
[화학식 51]
B는 1,4-페닐기이다.
L은 가장 바람직하게는 다음 중 어느 하나이다:
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)- ("GGVA"는 서열번호: 85로 개시됨),
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(=O)- ("GGVCit"는 서열번호: 88로 개시됨),
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)- 및 -Z1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
상기 식에서 B는 1,4-페닐기이고, Z1은 Lb에 대해 기재된 바와 같은 다음의 구조식을 나타낸다:
[화학식 52]
본 발명의 항체-약물 접합체는, 항체-약물 접합체의 대부분의 분자가 종양 세포 내로 이동한 후, 효소 등에 의해 링커 부분 (예를 들어, Lp)이 절단되어, 항체-약물 접합체를 활성화시켜 약물 D의 일부 (이하, 유리 약물로 지칭함 (후술))를 방출하는 과정을 통해 항종양 활성을 나타내는 것으로 추론된다.
따라서, 본 발명의 항체-약물 접합체는 종양 세포 외부에서 안정한 것이 바람직하다.
C. 항체
개시된 항체-약물 접합체(ADC)에 사용되는 항체는 항-DLL3 항체 (예를 들어, 2-C8-A, 6-G23-F 및 10-O18-A, 또는 인간 항체 H2-C8-A, H6-G23-F, H10-O18-A, H2-C8-A-3 및 H10-O18-A-3)이다. 개시된 ADC에 혼입될 수 있는 개시된 항체는 상기 III 절 "항-DLL3 항체"에 상세히 설명되어 있다.
간략하게, 일부 실시양태에서, ADC의 항-DLL3 항체는 중쇄 면역글로불린 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 면역글로불린 가변 도메인 (VL)을 포함할 수 있고, (a) VH는 (i) 각각 서열번호: 3, 서열번호: 4 및 서열번호: 5; (ii) 각각 서열번호: 13, 서열번호: 14 및 서열번호: 15; (iii) 각각 서열번호: 23, 서열번호: 24 및 서열번호: 25; 및 (iv) 각각 서열번호: 33, 서열번호: 34 및 서열번호: 35로 이루어진 군으로부터 선택된 VH-CDR1 서열, VH-CDR2 서열 및 VH-CDR3 서열을 포함하고/하거나; (b) VL은 (i) 각각 서열번호: 8, 서열번호: 9 및 서열번호: 10; (ii) 각각 서열번호: 18, 서열번호: 19 및 서열번호: 20; (iii) 각각 서열번호: 28, 서열번호: 29 및 서열번호: 30; 및 (iv) 각각 서열번호: 38, 서열번호: 39 및 서열번호: 40으로 이루어진 군으로부터 선택된 VL-CDR1 서열, VL-CDR2 서열 및 VL-CDR3 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, ADC의 항-DLL3 항체는 다음의 특성 중 하나 이상을 포함할 수 있다: (a) 서열번호: 7, 17, 27, 37, 62, 66 또는 70 중 어느 하나로 존재하는 경쇄 면역글로불린 가변 도메인 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 경쇄 면역글로불린 가변 도메인 서열; 및/또는 (b) 서열번호: 2, 12, 22, 32, 59, 60, 61, 63, 64, 65, 67, 68 또는 69 중 어느 하나로 존재하는 중쇄 면역글로불린 가변 도메인 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 중쇄 면역글로불린 가변 도메인 서열.
일부 실시양태에서, ADC의 항-DLL3 항체는 중쇄 면역글로불린 가변 도메인 (VH) 또는 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 가변 도메인 (VL) 또는 경쇄를 포함할 수 있고, (a) VH 또는 중쇄는 서열번호: 2, 서열번호: 12, 서열번호: 22, 서열번호: 32, 서열번호: 59, 서열번호: 60, 서열번호: 61, 서열번호: 63, 서열번호: 64, 서열번호: 65, 서열번호: 67, 서열번호: 68 및 서열번호: 69로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고/하거나, (b) VL 또는 경쇄는 서열번호: 7, 서열번호: 17, 서열번호: 27, 서열번호: 37, 서열번호 62, 서열번호: 66 및 서열번호: 70으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, VH 또는 중쇄 아미노산 서열 및 VL 또는 경쇄 아미노산 서열은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 각각 서열번호: 2 및 서열번호: 7 (7-I1-B); 각각 서열번호: 12 및 서열번호: 17 (2-C8-A); 각각 서열번호: 59 및 서열번호: 62 (H2-C8-A); 각각 서열번호: 60 및 서열번호: 62 (H2-C8-A-2); 각각 서열번호: 61 및 서열번호: 62 (H2-C8-A-3); 각각 서열번호: 22 및 서열번호: 27 (10-O18-A); 각각 서열번호: 67 및 서열번호: 70 (H10-O18-A); 각각 서열번호: 68 및 서열번호: 70 (H10-O18-A-2); 각각 서열번호: 69 및 서열번호: 70 (H10-O18-A-3); 각각 서열번호: 32 및 서열번호: 37 (6-G23-F); 각각 서열번호: 63 및 서열번호: 66 (H6-G23-F); 각각 서열번호: 64 및 서열번호: 66 (H6-G23-F-2); 및 각각 서열번호: 65 및 서열번호: 66 (H6-G23-F-3).
일부 실시양태에서, ADC의 항-DLL3 항체는 아래에 더 상세히 논의되는 바와 같이 글리칸 변형되거나 글리칸 개조될 수 있다.
본 발명의 기능적 단편은, 항원에 대한 결합 활성을 유지하면서, IgG 중쇄 Fc 영역 및 Asn297 주위의 아미노산에서 N-결합 글리칸으로 변형되는 잘 보존된 아스파라진(Asn297)을 갖는 기능적 단편을 포함한다.
i. 개시된 항-DLL3 항체의 글리칸 변형:
최근에 효소 반응 등에 의해 항체의 이종 당단백질을 변형하여 작용기를 갖는 글리칸을 균질하게 도입하는 방법이 보고되고 있다 (ACS Chemical Biology 2012, 7, 110, ACS Medicinal Chemistry Letters 2016, 7, 1005). 이 글리칸 변형 기술을 사용하여 균질한 ADC를 합성하기 위한 약물을 부위-특이적으로 도입하려는 시도가 있었다 (Bioconjugate Chemistry 2015, 26, 2233, Angew. Chem. Int. Ed. 2016, 55, 2361-2367, US 2016361436).
본 발명의 글리칸 변형은 가수분해효소를 이용하여 단백질 (예를 들어, 항체)에 첨가된 이종 글리칸을 절단하여 각 말단에 GlcNAc만을 남김으로써 GlcNAc를 갖는 동종 단백질 모이어티 (이하, "수용체"로 지칭함)를 생성한다. 이후, 별도로 제조된 임의의 글리칸 (이하, "공여체"라 함)을 제공하고, 트랜스글리코시다제를 이용하여 수용체와 공여체를 연결시킨다. 따라서, 임의의 글리칸 구조를 갖는 균질한 당단백질을 합성할 수 있다.
본 발명에서, "글리칸"은 글리코사이드 결합을 통해 서로 결합된 둘 이상의 단당류의 구조 단위를 의미한다. 특정 단당류 및 글리칸은 때때로 예를 들어, "GlcNAc-," "MSG-" 등으로 약칭된다. 구조식에서 이들 약어 중 어느 하나를 사용하는 경우, 특별히 정의되지 않는 한, 약어는 환원 말단에서 또 다른 구조 단위로의 글리코사이드 결합에 관여하는 산소 원자 또는 질소 원자가 글리칸을 나타내는 약어에 포함되지 않도록 의도된다.
본 발명에서, 편의를 위해 글리칸의 기본 단위인 단당류를 표시하되, 달리 명시되지 않는 한, 고리 구조에서, 고리를 구성하는 산소 원자에 결합하고 하이드록시기 (또는 글리코사이드 결합에 관여하는 산소 원자)와 직접 결합하는 탄소 원자의 위치를 1-위치 (시알산의 경우에만 2-위치)로 정의한다. 실시예에서 화합물의 명칭은 각각 전체로서의 화학 구조를 고려하여 제공되고, 그 규칙이 반드시 적용되는 것은 아니다.
본 발명에서 글리칸이 기호 (예를 들어, GLY, SG, MSG, GlcNAc)로 표시되는 경우, 기호는 달리 정의되지 않는 한, 환원 말단에 이르는 탄소 원자를 포함하고 N- 또는 O-글리코사이드 결합에 관여하는 N 또는 O를 포함하지 않도록 의도된다.
본 발명에서, 명시되지 않는 한, 글리칸이 아미노산의 측쇄에 연결될 때의 부분 구조를 괄호 안에 측쇄 부분을 나타내는 방식, 예를 들어 "(SG-)Asn"으로 나타낸다.
D. 항체-약물 접합체 (ADC)
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-DLL3 항체-약물 접합체는 다음의 화학식으로 표시된다:
[화학식 53]
상기 식에서, 항체 Ab 또는 항체의 기능적 단편은 그의 아미노산 잔기 (예를 들어, 시스테인, 라이신)의 측쇄로부터 L에 직접 결합하거나, Ab의 글리칸 또는 변형된 글리칸을 통해 L에 결합할 수 있고, 바람직하게는 Ab의 글리칸 또는 변형된 글리칸을 통해 L에 결합하고, 더 바람직하게는 Ab의 변형된 글리칸을 통해 L에 결합한다.
본 발명의 Ab의 글리칸은 N-결합 글리칸 또는 O-결합 글리칸, 바람직하게는 N-결합 글리칸이다. N-결합 글리칸 및 O-결합 글리칸은 각각 N-글리코사이드 결합 및 O-글리코사이드 결합을 통해 항체의 아미노산 측쇄에 결합한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 (Ab)는 IgG, 바람직하게는 IgG1, IgG2 또는 IgG4이다. 일부 실시양태에서, 항체 (Ab)는 2-C8-A, 6-G23-F, 10-O18-A, H2-C8-A, H2-C8-A-2, H2-C8-A-3, H6-G23-F, H6-G23-F-2, H6-G23-F-3, H10-O18-A, H10-O18-A-2 또는 H10-O18-A-3이다.
IgG는 중쇄의 Fc 영역의 297-위치의 아스파라진 잔기 (이하, "Asn297 또는 N297"로 지칭함)에 잘 보존된 N-결합 글리칸을 갖고, N-결합 글리칸은 항체 분자의 활성 및 동역학에 기여하는 것으로 공지되어 있다 (Biotechnol. Prog., 2012, 28, 608-622, Sanglier-Cianferani, S., Anal. Chem., 2013, 85, 715-736).
IgG의 불변 영역의 아미노산 서열은 잘 보존되어 있고, 각각의 아미노산은 Edelman et al.의 Eu 인덱스 넘버링에 의해 특정된다 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., Vol. 63, No. 1 (May 15, 1969), pp. 78-85). 예를 들어, Fc 영역에서 N-결합 글리칸이 첨가되는 Asn297은 Eu 인덱스 넘버링에서 297-위치에 해당하고, 분자의 단편화 또는 영역의 결실에 의해 아미노산의 실제 위치가 달라지더라도 각각의 아미노산은 Eu 인덱스 넘버링에 의해 고유하게 특정된다.
본 발명의 항체-약물 접합체의 일부 실시양태에서, 항체의 항체 또는 기능적 단편은 그의 Asn297의 측쇄에 결합하는 글리칸 (이하, "N297 글리칸"으로 지칭함)을 통해 L에 결합할 수 있고, 보다 더 바람직하게는 항체의 항체 또는 기능적 단편은 변형된 N297 글리칸을 통해 L에 결합한다.
다음의 화학식은 본 발명의 항체-약물 접합체 또는 항체의 기능적 단편이 N297 글리칸을 통해 L에 결합하는 상황을 나타낸다.
[화학식 54]
변형된 글리칸을 갖는 항체는 글리칸-변형 항체로 지칭된다.
시알릴 글리코펩타이드의 약자인 SGP는 대표적인 N-결합 복합체 글리칸이다. SGP는, 예를 들어 WO 2011/0278681에 기재된 방법을 사용하여 암탉의 계란 난황으로부터 분리/정제될 수 있다. SGP의 정제 산물은 상업적으로 이용 가능하고 (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., FUSHIMI Pharmaceutical Co., Ltd.), 구매가 가능하다. 예를 들어, SG의 글리칸 모이어티의 환원 말단에서 하나의 GlcNAc를 결실시켜 형성된 글리칸 (이하, "SG(10)"으로 지칭함)인 디시알로옥타사카라이드 (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.)가 상업적으로 이용 가능하다.
본 발명에서, SG(10)의 -Man의 분지쇄 중 어느 하나의 비환원성 말단에서만 시알산을 결실시켜 형성된 글리칸 구조를 MSG(9)라 하고, 1-3 분지쇄에만 시알산이 존재하는 구조를 MSG1, 1-6 분지쇄에만 시알산이 존재하는 구조를 MSG2라 한다.
본 발명의 변형된 글리칸은 N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2, 또는 N297-(Fuc)MSG1과 N297-(Fuc)MSG2의 혼합물, 또는 N297-(Fuc)SG이고, 바람직하게는 N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 또는 N297-(Fuc)SG이고, 더 바람직하게는 N297-(Fuc)MSG1 또는 N297-(Fuc)MSG2이다.
N297-(Fuc)MSG1은 다음의 구조식 또는 서열식으로 표시된다:
[화학식 55]
[화학식 56]
위의 식에서:
각각의 물결선은 항체의 Asn297에 대한 결합을 나타내고,
L(PEG)는 -(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH-를 나타내고, 여기서 우측 말단의 아미노기는 N297 글리칸에 있는 β-Man의 1-3 분지쇄에 있는 비환원성 말단의 시알산의 2-위치에서의 카복실산에 대한 아미드-결합을 나타내고,
각각의 별표는 링커 L, 특히 링커 L 중 Lb의 1,2,3-트리아졸 고리의 1- 또는 3-위치에서의 질소 원자에 대한 결합을 나타내고,
n5는 2 내지 10의 정수이고, 바람직하게는 2 내지 5의 정수이다.
N297-(Fuc)MSG2는 다음의 구조식 또는 서열식으로 표시된다:
[화학식 57]
[화학식 58]
위의 식에서:
각각의 물결선은 항체의 Asn297에 대한 결합을 나타내고,
L(PEG)는 -(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH-를 나타내고, 여기서 우측 말단의 아미노기는 N297 글리칸에 있는 β-Man의 1-6 분지쇄에 있는 비환원성 말단의 시알산의 2-위치에서의 카복실산에 대한 아미드-결합을 나타내고,
각각의 별표는 링커 L, 특히 링커 L 중 Lb의 1,2,3-트리아졸 고리의 1- 또는 3-위치에서의 질소 원자에 대한 결합을 나타내고,
n5는 2 내지 10의 정수이고, 바람직하게는 2 내지 5의 정수이다.
N297-(Fuc)SG는 다음의 구조식 또는 서열식으로 표시된다:
[화학식 59]
[화학식 60]
위의 식에서:
각각의 물결선은 항체의 Asn297에 대한 결합을 나타내고,
L(PEG)는 -(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH-를 나타내고, 여기서 우측 말단의 아미노기는 N297 글리칸에 있는 β-Man의 1-3 및 1-6 분지쇄 각각에 있는 비환원성 말단의 시알산의 2-위치에서의 카복실산에 대한 아미드-결합을 나타내고,
각각의 별표는 링커 L, 특히 링커 L 중 Lb의 1,2,3-트리아졸 고리의 1- 또는 3-위치에서의 질소 원자에 대한 결합을 나타내고,
n5는 2 내지 10의 정수이고, 바람직하게는 2 내지 5의 정수이다.
본 발명의 항체-약물 접합체에서 항체의 N297 글리칸이 N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 또는 이들의 혼합물인 경우, 항체-약물 접합체는 항체가 이량체이기 때문에 (도 1 참조) 링커 L 2개 분자와 약물 D 2개 분자가 접합된 분자이다 (m2 = 1).
본 발명의 항체-약물 접합체에서 항체의 N297 글리칸이 N297-(Fuc)SG인 경우, 항체-약물 접합체는 링커 L 4개 분자와 약물 D 4개 분자가 접합된 분자이다 (m2 = 2). N297 글리칸은 바람직하게는 N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 또는 N297-(Fuc)SG, 더 바람직하게는 N297-(Fuc)MSG1 또는 N297-(Fuc)MSG2이다.
본 발명의 항체-약물 접합체에서 항체의 N297 글리칸이 N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 또는 N297-(Fuc)SG인 경우, 균질한 ADC를 얻을 수 있다.
본 발명의 항체-약물 접합체는 가장 바람직하게는 다음의　군으로부터 선택되는 하나의 항체-약물 접합체이다:
[화학식 61]
[화학식 62]
[화학식 63]
[화학식 64]
[화학식 65]
[화학식 66]
[화학식 67]
[화학식 68]
[화학식 69]
[화학식 70]
[화학식 71]
[화학식 72]
상기 각 구조식에서,
m2는 1 또는 2를 나타내고 (바람직하게는, m2는 1이다),
항체 Ab는 항-DLL3 IgG 항체 (바람직하게는, IgG1, IgG2 또는 IgG4, 더 바람직하게는, IgG1) 또는 항체의 기능적 단편이고,
N297 글리칸은 N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2, 및 이들의 혼합물, 및 N297-(Fuc)SG 중 어느 하나 (바람직하게는, N297-(Fuc)MSG1)를 나타내고,
L(PEG)는 -NH-CH2CH2-(O-CH2CH2)3-*을 나타내고, 여기서 좌측 말단의 아미노기는 N297 글리칸에 있는 β-Man의 1-3 및 1-6 분지쇄 중 어느 하나 또는 각각 (바람직하게는, 1-3 분지쇄)의 비환원성 말단의 시알산의 2-위치에서의 카복실산에 대한 아미드-결합을 나타내고, 별표는 링커 L 중 Lb의 트리아졸 고리의 1- 또는 3-위치에서의 질소 원자에 대한 결합을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 항-DLL3 항체는, 예를 들어 2-C8-A, 6-G23-F, 10-O18-A, H2-C8-A, H2-C8-A-2, H2-C8-A-3, H6-G23-F, H6-G23-F-2, H6-G23-F-3, H10-O18-A, H10-O18-A-2 또는 H10-O18-A-3이다.
하나의 접합체 분자 ("(N297 글리칸)-(N1Lb)L-D")에서 L 중 Lb의 트리아졸 고리의 1-위치에서 질소 원자에 N297 글리칸이 각각 결합하는 "-(N297 글리칸)-L-D"의 2개 또는 4개의 단위 (m2 = 1 또는 2)를 갖는 구조 또는 하나의 접합체 분자 ("(N297 글리칸)-(N3Lb)L-D")에서 L 중 Lb의 트리아졸 고리의 3-위치에서 질소 원자에 N297 글리칸이 각각 결합하는 "-(N297 글리칸)-L-D"의 2개 또는 4개의 단위 (m2 = 1 또는 2)를 갖는 구조는 편의상 가장 바람직한 항체-약물 접합체로 예시되었음에도 불구하고, "(N297 글리칸)-(N1Lb)L-D" (m2 = 1인 경우, 1개의 단위, m2 = 2인 경우, 1개, 2개 또는 3개의 단위) 및 "(N297 글리칸)-(N3Lb)L-D" (m2 = 1인 경우, 1개의 단위, m2 = 2인 경우, 3개, 2개 또는 1개의 단위) 모두를 하나의 접합체 분자에 갖는 항체-약물 접합체 또한 포함한다. 즉, 하나의 접합체 분자에 "(N297 글리칸)-(N1Lb)L-D" 및 "(N297 글리칸)-(N3Lb)L-D"중 어느 하나가 존재하거나 둘 다 공존한다.
본 발명의 항체-약물 접합체 및 본 발명의 항-DLL3 항체-약물 접합체는 강한 종양 활성 (생체 내 항종양 활성, 시험관 내 항세포 활성), 만족스러운 생체 내 동역학 및 물리적 특성, 및 높은 안전성을 나타내므로 의약으로서 유용하다.
본 발명의 항체-약물 접합체에 대해 입체 이성질체, 비대칭 탄소 원자에 의한 광학 이성질체, 기하 이성질체, 호변 이성질체, 또는 d-형, l-형 및 회전장애 이성질체와 같은 광학 이성질체가 존재할 수 있고, 항체-약물 접합체의 유리 약물 또는 제조 중간체, 및 이들 이성질체, 광학 이성질체, 및 이들의 혼합물은 모두 본 발명에 포함된다. 본 발명의 PBD 유도체 (V) 또는 (VI)는 11'-위치에 비대칭 탄소를 가지므로 광학 이성질체가 존재한다. 여기서, 이들 이성질체 및 이들 이성질체의 혼합물은 모두 하나의 화학식, 즉 일반식 (V) 또는 (VI)으로 표시된다. 따라서, (V) 또는 (VI)은 모든 광학 이성질체 및 광학 이성질체의 혼합물을 임의의 비율로 포함한다. (V) 또는 (VI)의 11'-위치에서의 절대 입체 배열은 X-선 결정 구조 분석 또는 NMR, 예컨대 이의 결정질 생성물 또는 중간체, 또는 이들의 유도체에 대한 모셔법(Mosher method)을 통해 결정될 수 있다. 그런 다음, 절대 입체 배열은 입체 배열이 알려진 비대칭 중심을 갖는 시약으로 유도체화된 결정질 생성물 또는 중간체를 사용하여 결정할 수 있다. 필요에 따라, 본 발명에 따른 합성 화합물의 입체 이성질체를 통상적인 광학분할법 또는 분리법으로 분리하여 얻을 수 있다.
항체 분자 당 접합된 약물 분자의 수는 본 발명의 항체-약물 접합체의 효능 및 안전성에 영향을 미치는 중요한 인자이다. 항체-약물 접합체는 일정한 수의 접합된 약물 분자를 제공하도록 특정된 반응하고자 하는 원료 및 시약의 양과 같은　반응 조건으로 생성되지만, 저분자량 화합물의 화학반응과는 대조적으로, 접합된 약물 분자의 수가 다른 혼합물이 일반적으로 얻어진다. 항체 분자 당 접합된 약물 분자의 수는 평균값, 즉 접합된 약물 분자의 평균 수 (DAR: 약물 대 항체 비)로 특정된다. 항체 분자에 접합된 피롤로벤조디아제핀 유도체 분자의 수는 조절 가능하고, 항체 분자 당 접합된 약물 분자의 평균 수(DAR)로서 1 내지 10개의 피롤로벤조디아제핀 유도체 분자가 접합될 수 있지만, 그 수는 바람직하게는 1 내지 8개, 더 바람직하게는 1 내지 5개이다.
본 발명의 항체-약물 접합체에서 항체가 항체의 변형된 글리칸을 통해 L에 결합하는 경우, 항체-약물 접합체에서 항체 분자 당 접합된 약물 분자의 수 m2는 1 또는 2의 정수이다. 글리칸이 N297 글리칸이고 글리칸이 N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 또는 N297-(Fuc)MSG1과 N297-(Fuc)MSG2의 혼합물인 경우, m2는 1이고, DAR은 1 내지 3의 범위 (바람직하게는 1.0 내지 2.5의 범위, 더 바람직하게는 1.2 내지 2.2의 범위) 내이다. N297 글리칸이 N297-(Fuc)SG인 경우, m2는 2이고, DAR은 3 내지 5의 범위 (바람직하게는 3.2 내지 4.8의 범위, 더 바람직하게는 3.5 내지 4.2의 범위) 내이다.
전술한 실시양태 중 임의의 것에서, 항-DLL3 항체 (즉, "항체" 또는 "Ab")는 2-C8-A, 6-G23-F, 10-O18-A, H2-C8-A, H2-C8-A-2, H2-C8-A-3, H6-G23-F, H6-G23-F-2, H6-G23-F-3, H10-O18-A, H10-O18-A-2 또는 H10-O18-A-3으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, ADC의 항-DLL3 항체는 중쇄 면역글로불린 가변 도메인(VH) 및 경쇄 면역글로불린 가변 도메인(VL)을 포함할 수 있고, (a) VH는 (i) 각각 서열번호: 3, 서열번호: 4 및 서열번호: 5; (ii) 각각 서열번호: 13, 서열번호: 14 및 서열번호: 15; (iii) 각각 서열번호: 23, 서열번호: 24 및 서열번호: 25; 및 (iv) 각각 서열번호: 33, 서열번호: 34 및 서열번호: 35로 이루어진 군으로부터 선택된 VH-CDR1 서열, VH-CDR2 서열 및 VH-CDR3 서열을 포함하고/하거나; (b) VL은 (i) 각각 서열번호: 8, 서열번호: 9 및 서열번호: 10; (ii) 각각 서열번호: 18, 서열번호: 19 및 서열번호: 20; (iii) 각각 서열번호: 28, 서열번호: 29 및 서열번호: 30; 및 (iv) 각각 서열번호: 38, 서열번호: 39 및 서열번호: 40으로 이루어진 군으로부터 선택된 VL-CDR1 서열, VL-CDR2 서열 및 VL-CDR3 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, ADC의 항-DLL3 항체는 다음의 특성 중 하나 이상을 포함할 수 있다: (a) 서열번호: 7, 17, 27, 37, 62, 66 또는 70 중 어느 하나로 존재하는 경쇄 면역글로불린 가변 도메인 서열 또는 경쇄 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 경쇄 면역글로불린 가변 도메인 서열; 및/또는 (b) 서열번호: 2, 12, 22 중 어느 하나로 존재하는 중쇄 면역글로불린 가변 도메인 서열 또는 중쇄 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 중쇄 면역글로불린 가변 도메인 서열. 일부 실시양태에서, ADC의 항-DLL3 항체는 중쇄 면역글로불린 가변 도메인 (VH) 또는 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 가변 도메인 (VL) 또는 경쇄를 포함할 수 있고, (a) VH 또는 중쇄는 서열번호: 2, 서열번호: 12, 서열번호: 22, 서열번호: 32, 서열번호: 59, 서열번호: 60, 서열번호: 61, 서열번호: 63, 서열번호: 64, 서열번호: 65, 서열번호: 67, 서열번호: 68 및 서열번호: 69로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고/하거나, (b) VL은 서열번호: 7, 서열번호: 17, 서열번호: 27, 서열번호: 37, 서열번호 62, 서열번호: 66 및 서열번호: 70으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, VH 또는 중쇄 아미노산 서열 및 VL 또는 경쇄 아미노산 서열은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 각각 서열번호: 2 및 서열번호: 7 (7-I1-B); 각각 서열번호: 12 및 서열번호: 17 (2-C8-A); 각각 서열번호: 59 및 서열번호: 62 (H2-C8-A); 각각 서열번호: 60 및 서열번호: 62 (H2-C8-A-2); 각각 서열번호: 61 및 서열번호: 62 (H2-C8-A-3); 각각 서열번호: 22 및 서열번호: 27 (10-O18-A); 각각 서열번호: 67 및 서열번호: 70 (H10-O18-A); 각각 서열번호: 68 및 서열번호: 70 (H10-O18-A-2); 각각 서열번호: 69 및 서열번호: 70 (H10-O18-A-3); 각각 서열번호: 32 및 서열번호: 37 (6-G23-F); 각각 서열번호: 63 및 서열번호: 66 (H6-G23-F); 각각 서열번호: 64 및 서열번호: 66 (H6-G23-F-2); 및 각각 서열번호: 65 및 서열번호: 66 (H6-G23-F-3).
당업자는 본 명세서의 실시예에서의 설명을 기초로 필요한 수의 약물 분자를 각각의 항체 분자에 접합시키고, 조절된 수의 접합된 피롤로벤조디아제핀 유도체 분자를 갖는 항체를 얻기 위해 반응 방법을 조작할 수 있다.
본 발명의 항체-약물 접합체, 유리 약물 또는 제조 중간체는 대기 중에 방치되거나 재결정화될 때 수분을 흡수하거나, 흡수된 물의 흡착을 허용하거나, 수화물이 될 수 있고, 물을 함유하는 이러한 화합물 및 염도 본 발명에 포함된다.
본 발명의 항체-약물 접합체, 유리 약물 또는 제조 중간체는 아미노기와 같은 염기성 기를 갖는 경우, 필요에 따라 약학적으로 허용 가능한 염으로 전환될 수 있다. 이러한 염의 예는 하이드로클로라이드 및 하이드로아이오다이드와 같은 하이드로젠 할라이드 염; 니트레이트, 퍼클로레이트, 설페이트 및 포스페이트와 같은 무기산 염; 메탄설포네이트, 트리플루오로메탄설포네이트 및 에탄설포네이트와 같은 저급 알칸설포네이트; 벤젠설포네이트 및 p-톨루엔설포네이트와 같은 아릴설포네이트; 포르메이트, 아세테이트, 말레이트(malate), 푸마레이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 옥살레이트 및 말레이트(maleate)와 같은 유기산 염; 및 오르니틴 염, 글루타메이트 및 아스파테이트와 같은 아미노산 염을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 항체-약물 접합체, 유리 약물 또는 제조 중간체가 카복시기와 같은 산성 기를 갖는 경우, 일반적으로 염기 부가염이 형성될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염의 예는 소듐 염, 포타슘 염 및 리튬 염과 같은 알칼리 금속 염; 칼슘 염 및 마그네슘 염과 같은 알칼리 토금속 염; 암모늄 염과 같은 무기 염; 및 디벤질아민 염, 모르폴린 염, 페닐글라이신 알킬 에스테르 염, 에틸렌디아민 염, N-메틸글루카민 염, 디에틸아민 염, 트리에틸아민 염, 사이클로헥실아민 염, 디사이클로헥실아민 염, N,N'-디벤질에틸렌디아민 염, 디에탄올아민 염, N-벤질-N-(2-페닐에톡시)아민 염, 피페라진 염, 테트라메틸암모늄 염 및 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 염과 같은 유기 아민 염을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 항체-약물 접합체, 유리 약물 또는 제조 중간체는, 예를 들어 공기 중의 수분을 흡수하여 수화물로 존재할 수 있다. 본 발명의 용매화물은 특정 용매화물에 한정되지 않고, 임의의 약학적으로 허용 가능한 용매화물일 수 있고, 구체적으로 수화물, 에탄올 용매화물, 2-프로판올 용매화물 등이 바람직하다. 본 발명의 항체-약물 접합체, 유리 약물 또는 제조 중간체는 질소 원자가 존재하는 경우 N-옥사이드 형태일 수 있고, 이들 용매화물 및 N-옥사이드 형태는 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명은 다양한 방사성 또는 비방사성 동위원소로 표지된 화합물을 포함한다. 본 발명의 항체-약물 접합체, 유리 약물 또는 제조 중간체는 원자 동위원소의 비-천연 비를 갖는 구성 원자를 하나 이상 함유할 수 있다. 원자 동위원소의 예는 중수소(2H), 삼중수소(3H), 아이오딘-125(125I) 및 탄소-14(14C)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 화합물은 삼중수소(3H), 아이오딘-125(125I) 및 탄소-14(14C)와 같은 방사성 동위원소로 방사성 표지될 수 있다. 방사성 표지된 화합물은 치료제 또는 예방제, 분석 시약과 같은 연구용 시약, 및 생체 내 영상화를 위한 진단제와 같은 진단제로서 유용하다. 본 발명의 항체-약물 접합체의 동위원소 변이체는 방사성 여부와 상관없이 모두 본 발명의 범위에 포함된다.
E. 제조 방법
본 발명의 항체-약물 접합체를 제조하는 대표적인 방법이 여기에 기술되고 이의 유리 약물 또는 제조 중간체에 대해 기술될 것이다. 이하, 반응식에 표시된 화합물 번호는 화합물을 서로 식별하는 데 사용된다. 구체적으로, "화학식 (1)의 화합물," "화합물 (1)" 등의 형태로 언급할 것이다. 다른 숫자가 있는 화합물도 같은 방식으로 나타낼 것이다.
반응식 R: 항체의 제조
글리칸-변형 항체는, 예를 들어 WO 2013/120066에 기술된 방법에 따라, 도 3에 설명된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 합성의 단계 R1 및 R2에 대한 다음 설명은 도 12 및 아래의 반응식과 관련하여 이루어진다.
단계 R-1: 환원성 말단에서 키토비오스 구조의 GlcNAcβ1-4GlcNAc에서 글리코사이드 결합의 가수분해
본 단계는 공지된 효소 반응을 이용하여 표적 항체의 아미노산 서열의 297-위치 (N297-연결된 글리칸)에서 아스파라긴에 결합하는 N-결합 글리칸을 절단함으로써 글리칸-절단 항체를 제조하는 단계이다.
완충 용액 (예를 들어, 50 mM 포스페이트 완충 용액)에서 표적 항체 (20 mg/mL)는 0℃ 내지 40℃에서 효소 EndoS와 같은 가수분해효소를 사용하여 환원성 말단에서 키토비오스 구조 중 GlcNAcβ1과 4GlcNAc 사이의 글리코사이드 결합의 가수분해 반응을 겪는다. 반응 시간은 10분 내지 72시간이고, 바람직하게는 1시간 내지 6시간이다. 사용되는 야생형 효소 EndoS의 양은 항체 0.1 내지 10 mg, 바람직하게는 0.1 내지 3 mg, 내지 항체의 100 mg이다. 반응 종료 후, 각각 후술되는 친화도 크로마토그래피로 정제하고/하거나 하이드록시아파타이트 컬럼으로 정제하여 GlcNAcβ1과 4GlcNAc 사이에서 가수분해된 글리칸을 갖는 (Fucα1,6)GlcNAc 항체를 제조한다.
단계 R-2: 트랜스글리코실화 반응
본 단계는 효소 반응을 이용하여 (Fucα1,6)GlcNAc 항체를 아자이드기를 포함하는 PEG 링커를 갖는 MSG- (MSG1-, MSG2-) 또는 SG-형 글리칸 옥사졸린 형태 (이하, "아자이드 글리칸 옥사졸린 형태"로 지칭함)에 결합하여 글리칸-변형 항체를 제조하는 단계이다.
완충 용액 (예를 들어, 포스페이트 완충 용액)에서 글리칸-절단 항체는 0℃ 내지 40℃에서 효소 EndoS (D233Q/Q303L)와 같은 촉매량의 트랜스글리코시다제의 존재 하에 아자이드 글리칸 옥사졸린 형태와 반응하여 틀내스글리코실화 반응을 겪는다. 반응 시간은 10분 내지 72시간이고, 바람직하게는 1시간 내지 6시간이다. 사용되는 효소 EndoS (D233Q/Q303L)의 양은 1 내지 10 mg, 바람직하게는 1 내지 3 mg, 내지 항체의 100 mg이고, 사용되는 아자이드 글리칸 옥사졸린 형태의 양은 2 당량 내지 과당량, 바람직하게는 2 당량 내지 20 당량이다.
반응 종료 후, 친화도 크로마토그래피로 정제하고 하이드록시아파타이트 컬럼으로 정제하여 정제된 글리칸-변형 항체를 얻었다.
아자이드 글리칸 옥사졸린 (예를 들어, [N3-PEG (3)]-MSG1-Ox, WO19065964의 실시예 56) 형태는　WO19065964의 실시예 55 내지 57에 기술된 방법에 따라 제조될 수 있다. 합성 유기화학 분야에서 공지된 반응 (예를 들어, 축합 반응)을 이용하여, 아자이드기를 포함하는 PEG 링커 (N3-L(PEG))인 N3-(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH2를 MSG (MSG1, MSG2) 또는 디시알로옥타사카라이드 (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.)에 도입할 수 있다. 구체적으로, N3-(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH2의 우측 말단에 있는 아미노기와 시알산의 2-위치에 있는 카복실산은 축합 반응하여 아미드 결합을 형성한다.
축합 반응에 사용되는 축합제의 예는 N,N'-디사이클로헥실카보디이미드 (DCC), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 (EDCI), 카보닐디이미다졸 (CDI), 2-(2H-벤조트리아졸-2-일)-4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)페놀 (BOP), 1H-벤조트리아졸-1-일옥시트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (PyBOP) 및 O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 본 반응을 위한 용매의 예는 디클로로메탄, DMF, THF, 에틸 아세테이트 및 이들의 혼합 용매를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
반응 온도는 일반적으로 -20℃ 내지 100℃ 또는 용매의 끓는점이고, 바람직하게는 -5℃ 내지 50℃의 범위 내이다. 필요에 따라, 트리에틸아민, 디이소프로필에틸아민, N-메틸모르폴린 및 4-디메틸아미노피리딘과 같은 유기 염기 또는 포타슘 카보네이트, 소듐 카보네이트, 포타슘 하이드로젠 카보네이트 및 소듐 하이드로젠 카보네이트와 같은 무기 염기를 첨가할 수 있다. 또한, 예를 들어, 반응 촉진제로서 1-하이드록시벤조트리아졸 또는 N-하이드록시숙신이미드를 첨가할 수 있다.
MSG, MSG1 또는 MSG2는 (MSG-)Asn 또는 분리/정제된 (MSG1-)Asn 또는 (MSG2-)Asn을 EndoM과 같은 가수분해효소로 가수분해하여 얻을 수 있다.
공지된 문헌 (J. Org Chem., 2009, 74(5), 2210-2212. Helv. Chim. Acta, 2012, 95, 1928-1936)에 따라 MSG- (MSG1-, MSG2-) 또는 SG-형 글리칸의 환원성 말단에서 GlcNAc로부터 옥사졸린화를 준비할 수 있다.
단계 R-3: 트랜스글리코실화 반응
단계 R-2 대신, 다음의 단계를 적용하여 WO 2018/003983에 기술된 2개의 효소를 사용하는 방법과 함께 상기 글리칸-변형 항체를 제조할 수 있다. 단계 R-1에서 얻은 (Fucα1,6)GlcNAc 항체를 2개의 글리코실트랜스퍼라제 (효소 A 및 효소 B)의 존재 하에 시알산에 아자이드기가 도입된 (SG-)Asn, (MSG-)Asn 등의 글리칸 공여 분자와 반응시켜 시알산에 도입된 아자이드기를 갖는 SG형 글리칸-변형 Fc-함유 분자를 합성한다. 효소 A의 예는 EndoM, EndoOm 및 EndoCC, 및 감소된 가수분해 활성을 나타내는 EndoM 돌연변이체, EndoOm 돌연변이체 및 EndoCC 돌연변이체를 포함할 수 있다. 효소 A는 바람직하게는 EndoM N175Q, EndoCC N180H 또는 EndoOm N194Q이다. 효소 B의 예는 EndoS 및 EndoS2 (EndoS49), 및 감소된 가수분해 활성을 나타내는 EndoS 돌연변이체 및 EndoS2 (EndoS49) 돌연변이체를 포함할 수 있다. 효소 B는 바람직하게는 EndoS D233Q, EndoS D233Q/Q303L, EndoS D233Q/E350A, EndoS D233Q/E350Q, EndoS D233Q/E350D, EndoS D233Q/E350N, EndoS D233Q/D405A, EndoS2 D184M, EndoS2 T138Q 등이다. 글리칸-변형 항체를 제조함에 있어서, 항체 수용액의 농축, 농도 측정 및 완충액 교환은 하기 A 내지 C의 일반 작업에 따라 수행될 수 있다.
i. 일반 작업 A: 항체의 수용액 농축
Amicon Ultra (30,000 내지 50,000 MWCO, Millipore Corporation) 용기에 항체 또는 항체-약물 접합체의 용액을 첨가하고, 후술되는 항체 또는 항체-약물 접합체의 용액을 원심분리기 (Allegra X-15R, Beckman Coulter, Inc.)를 사용하여 원심분리 작업 (2000 G 내지 4000 G에서 5 내지 20분 동안 원심분리)을 통해 농축하였다.
ii. 일반 작업 B: 항체 농도 측정
UV 검출기 (Nanodrop 1000, Thermo Fisher Scientific Inc.)를 사용하여, 제조사가 구체화한 방법에 따라 항체 농도를 측정하였다. 그 후, 항체마다 다른 280 nm 흡광계수 (1.3 mLmg-1cm-1 내지 1.8 mLmg-1cm-1)를 이용하였다.
iii. 일반 작업 C: 항체에 대한 완충액 교환
완충 용액 (예를 들어, 포스페이트 완충 식염수 (pH 6.0), 포스페이트 완충액 (pH 6.0))을 일반 작업 A에 따라 농축된　항체의 수용액에 첨가하였다. 이 작업을 여러 번 수행한 후, 일반 작업 B를 이용하여 항체 농도를 측정하고, 완충 용액 (예를 들어, 포스페이트 완충 식염수 (pH 6.0), 포스페이트 완충액 (pH 6.0))으로 10 내지 20 mg/mL로 조절하였다.
반응식 S: 접합
본 제조 방법은 변형-촉진 알카인 아자이드 고리화 첨가 (SPAAC, strain-promoted alkyne azide cycloaddition: J. AM. CHEM. SOC. 2004, 126, 15046-15047) 반응을 통해 상기 글리칸-변형 항체를 제조 중간체 (2)에 접합하여 항체-약물 접합체를 제조하는 방법이다. 하기 식에서, Ab는 글리칸-변형 항체를 나타낸다.
[반응식 73]
SPAAC 반응은 항체 Ab의 완충 용액 (소듐 아세테이트 용액, 소듐 포스페이트, 소듐 보레이트 용액 등, 또는 이들의 혼합물)과 용액 용해 화합물 (2)를 적절한 용매(디메틸 설폭사이드 (DMSO), 디메틸포름알아미드 (DMF), 디메틸아세트아미드 (DMA), N-메틸-2-피리돈 (NMP), 프로필렌 글리콜 (PG) 등, 또는 이들의 혼합물)에서 혼합하여 진행한다.
사용되는 화합물 (2)의 몰량은 항체 1 몰 당 2 몰 내지 과량의 몰량, 바람직하게는 1 몰 내지 30 몰이고, 유기 용매의 비율은 바람직하게는 항체의 완충액에 대해 1 내지 200% v/v이다. 반응 온도는 0℃ 내지 37℃, 바람직하게는 10℃ 내지 25℃이고, 반응 시간은 1 내지 150시간, 바람직하게는 6시간 내지 100시간이다. 본 반응에서 pH는 바람직하게는 5 내지 9이다.
항체-약물 접합체 화합물 (ADC)은 상기 일반 작업 A 내지 C 및 후술되는 일반 작업 D 내지 F에 따른 완충액 교환, 정제, 및 항체 농도 및 항체 분자 당 접합된 약물 분자의 평균 수의 측정을 통해 서로 식별될 수 있다.
iv. 일반 작업 D: 항체-약물 접합체 정제
NAP-25 컬럼 (GE Healthcare)을 상업적으로 입수가능한 소르비톨 (5%)을 함유하는 아세트산 완충 용액 (10 mM, pH 5.5; 여기서, ABS로 지칭함)으로 평형화시켰다. 이 NAP-25 컬럼에 항체-약물 접합체의 반응 수용액 (약 1.5 내지 2.5 mL)을 가하고, 제조사에서 정한 양의 완충액으로 용출하여 항체 분획을 분리하고 수집하였다. 분리하고 수집한 항체 분획을 다시 NAP-25 컬럼에 가하고, 완충액으로 용출하는 겔 여과 정제 과정을 총 2 또는 3회 반복하여 비결합 약물-링커, 디메틸 설폭사이드 및 프로필렌 글리콜이 제거된 항체-약물 접합체를 얻었다.
v. 일반 작업 E: 항체-약물 접합체의 항체 농도 측정
항체-약물 접합체 내 접합된 약물의 농도는 아래에 나타낸 램버트-비어 법칙을 이용하여 계산할 수 있다. 램버트-비어 법칙을 이용하는 식 (I)은 다음과 같다.
[식 1]
여기서, A280은 280 nm에서의 항체-약물 접합체 수용액의 흡광도를 나타내고, ε280은 280 nm에서의 항체-약물 접합체의 몰 흡광 계수를 나타내고, C (molㆍL-1)은 항체-약물 접합체의 몰농도를 나타낸다. 식 (I)로부터, 하기의 식 (II)를 사용하여 항체-약물 접합체의 몰농도, C (molㆍL-1)를 결정할 수 있다.
[식 II]
또한, 양 변에 항체-약물 접합체의 몰질량을 곱하여 항체-약물 접합체의 질량 농도 C'을 결정한다 (식(III)).
[식 III]
식에 사용되고 실시예에 적용되는 값에 대해 설명한다.
사용한 흡광도 A280은 280nm에서 항체-약물 접합체 수용액의 UV 흡광도를 측정한 값이다. 몰질량 MW (gㆍmol-1)에 대해, 항체의 아미노산 서열로부터 항체의 분자량 추정값을 계산하여, 항체-약물 접합체의 몰질량의 근사값으로 사용하였다. 측정에 사용된 광학 경로 길이 I (cm)는 1 cm이었다.
항체-약물 접합체의 몰 흡광 계수, ε280은 하기의 식 (IV)를 사용하여 결정할 수 있다.
[식 IV]
여기서, εAb, 280은 280 nm에서의 항체의 몰 흡광 계수를 나타내고, εDL, 280은 280 nm에서의 약물의 몰 흡광 계수를 나타낸다.
공지된 계산 방법 (Protein Science, 1995, vol. 4, 2411-2423)을 사용하여, 항체의 아미노산 서열로부터 εAb, 280을 추정할 수 있다. 예를 들어, 사용한 DLL3 항체 (H2-C8-A)의 몰 흡광 계수는 εAb, 280 = 220378 (계산된 추정값)이었고, 사용한 DLL3 항체 (H6-G23-F)의 몰 흡광 계수는 εAb, 280 = 215353 (계산된 추정값)이었고, 사용한 DLL3 항체 (H10-O18-A)의 몰 흡광 계수는 εAb, 280 = 215424 (계산된 추정값)이었고, 사용한 LPS 항체의 몰 흡광 계수는 εAb, 280 = 230280 (계산된 추정값)이었고, 사용한 DLL3 항체 (H2-C8-A-3)의 몰 흡광 계수는 εAb, 280 = 220420 (계산된 추정값)이었고, 사용한 DLL3 항체 (H10-O18-A-3)의 몰 흡광 계수는 εAb, 280 = 215380 (계산된 추정값)이었다.
각각의 UV 측정에서 얻은 측정값으로부터 εDL, 280을 사용을 위해 계산하였다. 구체적으로, 특정 몰농도를 갖는 접합체 전구체 (약물)를 용해시키는 용액의 흡광도를 측정하고, 램버트-비어 법칙인 식 (I)을 적용하여 생성된 값을 사용하였다.
vi. 일반 작업 F: 항체-약물 접합체 내의 항체 분자 당 접합된 약물 분자의 평균 수 측정
항체-약물 접합체 내의 항체 분자 당 접합된 약물 분자의 평균 수는 다음의 방법으로 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 통해 결정할 수 있다.
[F-1. HPLC 분석을 위한 샘플 제조 (항체-약물 접합체의 환원)]
항체-약물 접합체의 용액 (약 1 mg/mL, 60 μL)을 디티오트레이톨(DTT) (100 mM, 15 μL)의 수용액과 혼합한다. 혼합물을 37℃에서 30분 동안 배양시켜 항체-약물 접합체의 L 사슬 및 H 사슬 사이의 디설파이드 결합이 분해된 샘플을 제조하고, 이 샘플을 HPLC 분석에 사용한다.
[F-2. HPLC 분석]
HPLC 분석은 다음의 측정 조건에서 수행된다.
HPLC 시스템: Agilent 1290 HPLC 시스템 (Agilent Technologies)
검출기: 자외선 흡수 분광기 (측정 파장: 280 nm, 329 nm)
컬럼: BEH 페닐 (2.1 x 50 mm, 1.7 μm, Waters Acquity)
컬럼 온도: 75℃
이동상 A: 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)-15% 이소프로필 알코올 수용액
이동상 B: 0.075% TFA-15% 이소프로필 알코올 아세토니트릴 용액
기울기 프로그램 1 (Gradient program 1): 14%-36% (0분 내지 15분), 36%-80% (15분 내지 17분), 80%-14% (17분 내지 17.1분), 14%-14% (17.1분 내지 23분)
기울기 프로그램 2: 14%-50% (0분 내지 15분), 50%-80% (15분 내지 17분), 80%-14% (17분 내지 17.1분), 14%-14% (17.1분 내지 23분)
샘플 주입 부피: 5 μL
[F-3. 데이터 분석]
[F-3-1] 접합된 약물 분자를 갖는 L 사슬 (접합된 약물을 1개 갖는 L 사슬: L1) 및 접ㅎ바된 약물 분자(들)를 갖는 H 사슬 (접합된 약물을 1개 갖는 H 사슬: H1, 접합된 약물을 2개 갖는 H 사슬: H2, 접합된 약물을 3개 갖는 H 사슬: H3)은 접합된 약물 분자의 수에 비례하여 증가된 소수성을 갖고, 어떠한 접합된 약물 분자도 갖지 않는 항체의 L 사슬 (L0) 및 H 사슬 (H0)에 비해 더 긴 체류시간을 갖고, 따라서 L0, L1, H0, H1, H2 및 H3가 제시된 순서대로 용출된다. L1 및 H0의 순서가 바뀌는 경우도 있지만, 접합된 약물 분자를 갖지 않는 H0는 약물에 특징적인 329 nm의 파장에서 흡수하지 않는다. L0과 H0 사이의 체류 시간을 비교하여, 검출된 각각의 피크를 L0, L1, H0, H1, H2 또는 H3에 할당할 수 있다.
[F-3-2] 각 약물-링커는 UV를 흡수하므로, 접합된 약물-링커 분자의 수에 따른 L 사슬, H 사슬 및 약물-링커의 몰 흡광 계수와 함께 다음의 식을 이용하여 피크 면적 값을 보정한다.
[식 V]
여기서, 각 항체의 L 사슬 및 H 사슬의 몰 흡광 계수 (280 nm)에 대해, 공지된 계산 방법 (Protein Science, 1995, vol. 4, 2411-2423)을 사용하여 항체의 L 사슬 및 H 사슬의 아미노산 서열로부터 추정된 값을 사용할 수 있다. DLL3 항체 (H2-C8-A)의 경우, 아미노산 서열로부터 추정된 L 사슬의 몰 흡광 계수로 26123을 사용하였고, 아미노산 서열로부터 추정된 H 사슬의 몰 흡광 계수로 84150을 사용하였다. DLL3 항체 (H6-G23-F)의 경우, 아미노산 서열로부터 추정된 L 사슬의 몰 흡광 계수로 30105를 사용하였고, 아미노산 서열로부터 추정된 H 사슬의 몰 흡광 계수로 77423을 사용하였다. DLL3 항체 (H10-O18-A)의 경우, 아미노산 서열로부터 추정된 L 사슬의 몰 흡광 계수로 26166을 사용하였고, 아미노산 서열로부터 추정된 H 사슬의 몰 흡광 계수로 81340을 사용하였다. DLL3 항체 (H2-C8-A-3)의 경우, 아미노산 서열로부터 추정된 L 사슬의 몰 흡광 계수로 26212를 사용하였고, 아미노산 서열로부터 추정된 H 사슬의 몰 흡광 계수로 83993을 사용하였다. DLL3 항체 (H10-O18-A-3)의 경우, 아미노산 서열로부터 추정된 L 사슬의 몰 흡광 계수로 26212를 사용하였고, 아미노산 서열로부터 추정된 H 사슬의 몰 흡광 계수로 81478을 사용하였다.
[F-3-3] 보정된 피크 영역 전체에 대한 각 사슬의 피크 면적 비율(%)은 다음 식을 이용하여 계산한다.
[식 VI]
[F-3-4] 항체-약물 접합체 내의 항체 분자 당 접합된 약물 분자의 평균 수는 다음 식을 이용하여 계산된다.
접합된 약물 분자의 평균 수 = (L0 피크 면적 비율 x 0 + L0 피크 면적 비율 x 1 + H0 피크 면적 비율 x 0 + H1 피크 면적 비율 x 1 + H2 피크 면적 비율 x 2 + H3 피크 면적 비율 x 3) / 100 x 2.
VII. 유리 약물 및 제조 중간체
본 발명의 항체-약물 접합체의 중간체 및 유리 약물은 다음의 화학식으로 표시된다:
[화학식 74]
이에 대해서는 다음에 설명될 것이다.
본 발명의 유리 약물은 항체-약물 접합체가 종양 세포 내로 이동하고 이어서 항체-약물 접합체 내의 링커 L의 일부가 절단되는 과정을 통해 생성된다.
본 발명의 항체-약물 접합체는 제조 중간체를 사용하여 제조된다.
본 발명의 항체-약물 접합체에 대한 유리 약물은 (a) R16과 R17이 결합하여 이민 결합 (N=C)을 형성하는 경우에 해당한다.
본 발명의 항체-약물 접합체에 대한 제조 중간체는 (b) R16이 J-La'-Lp'-NH-B'-CH2-O (C=O)-*로 표시되는 경우에 해당한다.
따라서, 화학식에서 l 및 n1, E 및 A, R9 및 R1, R10 및 R2, R11 및 R3, R12 및 R4, R13 및 R5, R14 및 R6, R15 및 R7, V 및 X, W 및 Y, 그룹 7 및 그룹 1, 그룹 8 및 그룹 2, 그룹 9 및 그룹 3, 그룹 10 및 그룹 4, 그룹 11 및 그룹 5, 및 그룹 12 및 그룹 6는 각각 동의어이다.
l은 2 내지 8의 정수, 바람직하게는 2 내지 6의 정수, 더 바람직하게는 3 내지 5의 정수를 나타낸다. l이 2 내지 8의 정수, 바람직하게는 2 내지 6의 정수, 더 바람직하게는 3 내지 5의 정수인 알킬 사슬은 이중 결합을 포함할 수 있다.
E는 스피로-결합된 3원 내지 5원 포화 탄화수소 고리 또는 3원 내지 5원 포화 헤테로고리를 나타내고, 바람직하게는 3원 내지 5원 포화 탄화수소 고리 (사이클로프로판, 사이클로부탄 또는 사이클로펜탄), 더 바람직하게는 사이클로프로판 또는 사이클로부탄, 가장 바람직하게는 사이클로프로판이다. 스피로-결합된 3원 내지 5원 포화 탄화수소 고리는 1 내지 4개의 할로젠 원자로 치환될 수 있고, 바람직하게는 1개 또는 2개의 플루오린 원자로 치환될 수 있다 (예를 들어, 2,2-디플루오로사이클로프로판).
R9 및 R10은 각각 독립적으로 C1 내지 C6 알콕시기, C1 내지 C6 알킬기, 수소 원자, 하이드록시기, 티올기, C1 내지 C6 알킬티오기, 할로젠 원자 또는 -NR'R''를 나타내고, 각각 바람직하게는 C1 내지 C6 알콕시기, C1 내지 C6 알킬기 또는 하이드록시기, 더 바람직하게는 C1 내지 C3 알콕시기, 가장 바람직하게는 메톡시기이다.
R11, R12 및 R13은 다음의 (i) 내지 (iii) 중 어느 하나에 기술된 바와 같다.
A. 화합물 실시양태 1
R11 및 R12가 R3 및 R4가 결합된 탄소와 함께 결합되어 이중 결합을 형성하는 경우, R13은 그룹 7로부터 선택된 하나 이상의 치환기를 임의로 갖는 아릴기 또는 헤테로아릴기, 또는 그룹 8로부터 선택된 하나 이상의 치환기를 임의로 갖는 C1 내지 C6 알킬기를 나타내고, 바람직하게는 그룹 7로부터 선택된 하나 이상의 치환기를 임의로 갖는 아릴기이다.
R13에 대한 "그룹 7로부터 선택된 하나 이상의 치환기를 임의로 갖는 아릴기 또는 헤테로아릴기"에서의 "아릴기"는 바람직하게는 페닐기 또는 나프틸기, 더 바람직하게는 페닐기이다.
R13에 대한 "그룹 7로부터 선택된 하나 이상의 치환기를 임의로 갖는 아릴기 또는 헤테로아릴기"에서의 "헤테로아릴기"는 바람직하게는 티에닐기, 피리딜기, 피리미딜기, 퀴놀릴기, 퀴녹살릴기 또는 벤조티오페닐기, 더 바람직하게는 2-티에닐기, 3-티에닐기, 2-피리딜기, 3-피리딜기 또는 4-피리딜기, 보다 더 바람직하게는 3-피리딜기 또는 3-티에닐기이다.
R13에 대한 아릴기 또는 헤테로아릴기의 치환기의 예는 다음의 a) 내지 j)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:
a) 1 내지 3개의 할로젠 원자로 임의로 치환된 C1 내지 C6 알콕시기,
b) 1 내지 3개의 할로젠 원자, 하이드록시기, -OCOR', -NR'R'', -C(=NR')-NR''R''' 및 -NHC(=NR')-NR''R'''으로부터 선택된 어느 하나로 임의로 치환된 C1 내지 C6 알킬기,
c) 할로젠 원자,
d) C3 내지 C5 사이클로알콕시기
e) C1 내지 C6 알킬티오기,
f) -NR'R'',
g) -C(=NR')-NR''R''',
h) -NHC(=NR')-NR''R''',
i) -NHCOR' 및
j) 하이드록시기.
여기서, b) 및 f) 내지 i)의 R', R'' 및 R'''은 각각 독립적으로 수소 원자 또는 C1 내지 C6 알킬기를 나타내고, 각각 독립적으로 바람직하게는 수소 원자 또는 C1 내지 C3 알킬기이다.
a) 내지 j)는 바람직하게는 다음과 같다:
a) 1 내지 3개의 할로젠 원자로 임의로 치환된 C1 내지 C3 알콕시기, 더 바람직하게는 메톡시기, 에톡시기, n-프로폭시기, i-프로폭시기 또는 트리플루오로메톡시기, 보다 더 바람직하게는 메톡시기, 에톡시기 또는 트리플루오로메톡시기, 가장 바람직하게는 메톡시기;
b) 1 내지 3개의 할로젠 원자로부터 선택된 임의의 것으로 임의로 치환된 C1 내지 C3 알킬기, 하이드록시기, -OCOR', -C(=NR')-NR''R''' 또는 -NHC(=NR')-NR''R''', 여기서 R', R'' 및 R'''은 각각 독립적으로 수소 원자 또는 C1 내지 C3 알킬기, 더 바람직하게는 1 내지 3개의 할로젠 원자로부터 선택된 임의의 것으로 임의로 치환된 C1 내지 C3 알킬기, 하이드록시기, -OCOR', -C(=NR')-NR''R''' 및 -NHC(=NR')-NR''R''', 여기서 R', R'' 및 R'''은 각각 독립적으로 수소 원자 또는 메틸기, 보다 더 바람직하게는 메틸기, 에틸기, n-프로필기, i-프로필기, 플루오로메틸기, 디플루오로메틸기, 트리플루오로메틸기, 하이드록시메틸기,　-CH2OCOMe, -CH2-NHC(=NH)-NH2 또는 -CH2-NHC(=NMe)-NH2;
c) 할로젠 원자, 바람직하게는 플루오린 원자 또는 클로린 원자;
d) C3 내지 C5 사이클로알콕시기, 더 바람직하게는 사이클로프로폭시기;
e) C1 내지 C3 알킬티오기, 더 바람직하게는 메틸티오기 또는 에틸티오기;
f) -NR'R'', 여기서 R' 및 R''은 각각 독립적으로 수소 원자 또는 C1 내지 C3 알킬기, 더 바람직하게는 -NH2, -NHMe, -NMe2, -NHEt 또는 -NEt2;
g) -C(=NR')-NR''R''', 여기서 R', R'' 및 R'''은 각각 독립적으로 수소 원자 또는 C1 내지 C3 알킬기, 더 바람직하게는 -C(=NH)-NH2 또는 -C(=NMe)-NH2;
h) -NHC(=NR')-NR''R''', 여기서 R', R'' 및 R'''은 각각 독립적으로 수소 원자 또는 C1 내지 C3 알킬기, 더 바람직하게는 -NHC(=NH)-NH2 또는 -NHC(=NMe)-NH2;
i) -NHCOR', 여기서 R'은 수소 원자 또는 C1 내지 C3 알킬기, 더 바람직하게는 -NHCOMe 또는 -NHCOEt; 및
j) 하이드록시기.
R13에 대한 아릴기 (바람직하게는, 페닐기) 또는 헤테로아릴기 (바람직하게는, 피리딜기)는 임의의 위치에 적어도 하나의 치환기를 가질 수 있다. 복수의 치환기가 존재하는 경우, 치환기는 동일하거나 상이할 수 있다.
R13이 아릴기인 경우, 각각의 치환기는 바람직하게는 a), b), d), g), h) 또는 j), 더 바람직하게는 a), b), d) 또는 j)이다.
R13이 페닐기인 경우, R13은 임의의 위치에 치환기를 가질 수 있고, 복수의 치환기를 가질 수 있고, 바람직하게는 3-위치 및/또는 4-위치에 1개 또는 2개의 치환기가 존재할 수 있고, 더 바람직하게는 4-위치에 1개의 치환기가 존재할 수 있다.
R5가 나프틸기인 경우, R5는 임의의 위치에 치환기를 가질 수 있고, 복수의 치환기를 가질 수 있고, 바람직하게는 6-위치에 1개의 치환기가 존재한다.
R13이 페닐기인 경우, R13은 더 바람직하게는 페닐기, 4-메톡시페닐기, 3-메톡시페닐기, 4-에톡시페닐기, 4-(n-프로폭시)-페닐기, 4-(i-프로폭시)-페닐기, 4-사이클로프로폭시-페닐기, 4-트리플루오로메틸페닐기, 4-하이드록시메틸-페닐기, 4-아세톡시메틸-페닐기 또는 4-카바미미드아미도메틸-페닐기, 보다 더 바람직하게는 페닐기, 4-메톡시페닐기, 3-메톡시페닐기, 4-사이클로프로폭시-페닐기, 4-하이드록시메틸-페닐기, 4-아세톡시메틸-페닐기, 4-카바미미드아미도메틸-페닐기 또는 4-트리플루오로메틸페닐기이다.
R13이 나프틸기인 경우, R13은 더 바람직하게는 나프틸기 또는 6-메톡시-2-나프틸기이다. 가장 바람직한 것은 4-메톡시페닐기이다.
R13이 헤테로아릴기인 경우, 각각의 치환기는 바람직하게는 a), b), d), g), h) 또는 j), 더 바람직하게는 a) 또는 b)이다.
R13이 헤테로아릴기인 경우, R13은 임의의 위치에 적어도 하나의 치환기를 가질 수 있다. R13이 3-피리딜기인 경우, 이의 치환기(들)는 바람직하게는 6-위치 및/또는 5-위치에 존재한다. R13이 2-피리딜인 경우, 이의 치환기(들)는 바람직하게는 5-위치 및/또는 4-위치 또는 5-위치 및/또는 6-위치에 존재한다. R13이 4-피리딜인 경우, 이의 치환기는 바람직하게는 2-위치 및/또는 6-위치에 존재한다.
R13이 헤테로아릴기인 경우, R13은 복수개의 치환기를 가질 수 있고, 바람직하게는 1개 또는 2개의 치환기를 갖고, 바람직하게는 1개의 치환기를 갖는다.
R13이 피리딜기인 경우, R13은 바람직하게는 6-메톡시-3-피리딜기 또는 6-메틸-3-피리딜기이다.
R13이 3-티에닐기 또는 6-퀴녹살릴기인 경우, R13은 바람직하게는 치환되지 않는다.
R13에 대한 "그룹 8로부터 선택된 하나 이상의 치환기를 임의로 갖는 C1 내지 C6 알킬기"에서의 "C1 내지 C6 알킬기"는 바람직하게는 C1 내지 C3 알킬기, 더 바람직하게는 메틸기 또는 에틸기이다.
R13에 대한 "그룹 8로부터 선택된 하나 이상의 치환기를 임의로 갖는 C1 내지 C6 알킬기"에서의 치환기는 각각 할로젠 원자, 하이드록시기 또는 C1 내지 C6 알콕시기 (바람직하게는, C1 내지 C3 알콕시기), 바람직하게는 하이드록시기, 메톡시기 또는 에톡시기, 더 바람직하게는 하이드록시기이다.
B. 화합물 실시양태 2
R11이 수소 원자를 나타내는 경우, R12 및 R13은 R12 및 R13이 결합된 탄소 원자와 함께 결합하여, 3원 내지 5원 포화 탄화수소 고리 또는 3원 내지 5원 포화 헤테로고리 또는 CH2=를 형성한다.
3원 내지 5원 포화 탄화수소 고리는 1 내지 4개의 할로젠 원자로 치환될 수 있고, 바람직하게는 1개 또는 2개의 플루오린 원자로 치환될 수 있다.
R12 및 R13은 결합하여 바람직하게는 3원 내지 5원 포화 탄화수소 고리 또는 CH2=를 형성하고, 더 바람직하게는 사이클로프로판, 사이클로부탄 또는 CH2= (엑소메틸렌기)를 형성하고, 보다 더 바람직하게는 사이클로프로판을 형성한다.
R12 및 R13이 결합하여 3원 내지 5원 포화 탄화수소 고리 또는 3원 내지 5원 포화 헤테로고리를 형성하는 경우, 3원 내지 5원 포화 탄화수소 고리 또는 3원 내지 5원 포화 헤테로고리는 바람직하게는 E와 동일하다. 더 바람직하게는, E는 3원 내지 5원 포화 탄화수소 고리이고 R12 및 R13은 결합하여 3원 내지 5원 포화 탄화수소 고리를 형성하고, 보다 더 바람직하게는 E는 사이클로프로판 고리이고 R12 및 R13은 결합하여 사이클로프로판 고리를 형성한다.
C. 화합물 실시양태 3
R11, R12, 및 R13은 R11이 결합된 탄소 원자 및 R12 및 R13이 결합된 탄소 원자와 함께 결합하여, 그룹 9로부터 선택된 하나 이상의 치환기를 임의로 갖는 벤젠 고리 또는 6원 헤테로고리를 형성한다.
벤젠 고리 또는 헤테로고리는 임의의 위치에서 적어도 하나의 치환기를 가질 수 있다. 복수의 치환기가 존재하는 경우, 치환기는 동일하거나 상이할 수 있다.
벤젠 고리 또는 헤테로고리의 각각의 치환기는 할로젠 원자, 1 내지 3개의 할로젠 원자로 임의로 치환된 C1 내지 C6 알킬기 또는 C1 내지 C6 알콕시기, 바람직하게는 할로젠 원자, 1 내지 3개의 할로젠 원자로 임의로 치환된 C1 내지 C3 알킬기 또는 C1 내지 C3 알콕시기, 더 바람직하게는 할로젠 원자, 메틸기 또는 메톡시기이다.
"하나 이상의 치환기를 임의로 갖는 벤젠 고리 또는 6원 헤테로고리"는 바람직하게는 치환되지 않은 벤젠 고리이다.
R11, R12, 및 R13은 가장 바람직하게는 상기 (i)을 만족한다.
D. 기타 변수 그룹 및 실시양태
R14 및 R15는 각각 수소 원자를 나타내거나, R14 및 R15는 결합하여 이민 결합 (C=N)을 나타낸다.
V 및 W는 각각 독립적으로 산소 원자, 질소 원자 또는 황 원자, 바람직하게는 산소 원자이다.
R16 및 R17은 다음과 같다:
(a) R16 및 R17은 결합하여 이민 결합 (N=C)을 형성하거나;
(b) R16은 J-La'-Lp'-NH-B'-CH2-O(C=O)-*를 나타내고 R17은 하이드록시기 또는 C1 내지 C3 알콕시기를 나타낸다.
(b) R16이 J-La'-Lp'-NH-B'-CH2-O(C=O)-*인 경우, 화학식에서 별표는 상기 화학식으로 표시되는 피롤로벤조디아제핀 고리의 N10'-위치에 대한 결합을 나타낸다.
B'은 페닐기 또는 헤테로아릴기를 나타내고, 바람직하게는 1,4-페닐기, 2,5-피리딜기, 3,6-피리딜기, 2,5-피리미딜기 또는 2,5-티에닐기, 더 바람직하게는 1,4-페닐기이다.
Lp'은 생체 내 또는 표적 세포에서 절단 가능한 아미노산 서열로 구성된 링커를 나타낸다. Lp는, 예를 들어 에스터라제 및 펩티다제와 같은 효소의 작용에 의해 절단된다.
링커 Lp'의 구체적인 예는 -GGVA- (서열번호: 85), -GG-(D-)VA-, -VA-, -GGFG- (서열번호: 86), -GGPI- (서열번호: 87), -GGVCit- (서열번호: 88), -GGVK- (서열번호: 89), -GG(D-)PI-, -GGPL- (서열번호: 90), -EGGVA (서열번호: 91), -PI-, -GGF-, DGGF- (서열번호: 92), (D-)D-GGF-, -EGGF- (서열번호: 93), -SGGF- (서열번호: 94), -KGGF- (서열번호: 95), -DGGFG- (서열번호: 96), -GGFGG- (서열번호: 97), -DDGGFG- (서열번호: 98), -KDGGFG- (서열번호: 99) 및 -GGFGGGF- (서열번호: 100)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
여기서, "(D-)V"는 D-발린을 나타내고, "(D)-P"는 D-프롤린을 나타내고, "(D-)D"는 D-아스파르트산을 나타낸다.
링커 Lp'은 바람직하게는 다음과 같다:
-GGVA- (서열번호: 85), -GG-(D-)VA-, -VA-, -GGFG- (서열번호: 86), -GGPI- (서열번호: 87), -GGVCit- (서열번호: 88), -GGVK- (서열번호: 89), -GG(D-)PI-, or -GGPL- (서열번호: 90).
더 바람직한 예는 -GGVA- (서열번호: 85), -GGVCit- (서열번호: 88) 및 -VA-이다.
La'은 다음의 군으로부터 선택된 어느 하나를 나타낸다:
-C(=O)-(CH2CH2)n6-C(=O)-, -C(=O)-(CH2CH2)n6-C(=O)-NH-(CH2CH2)n7-C(=O)-,
-C(=O)-(CH2CH2)n6-C(=O)-NH-(CH2CH2O)n7-CH2-C(=O)-,
-C(=O)-(CH2CH2)n6-NH-C(=O)-(CH2CH2O)n7-CH2CH2-C(=O)-, -(CH2)n8-O-C(=O)-,
-(CH2)n12-C(=O)- 및 -(CH2CH2)n13-C(=O)-NH-(CH2CH2O)n14-CH2CH2-C(=O)-.
상기 식에서, n6은 1 내지 3의 정수 (바람직하게는 1 또는 2)를 나타내고, n7은 1 내지 5의 정수 (바람직하게는 2 내지 4의 정수, 더 바람직하게는 2 또는 4)를 나타내고, n8은 1 내지 2의 정수 (바람직하게는 0 또는 1)를 나타내고, n12는 2 내지 7의 정수 (바람직하게는 2 내지 5의 정수, 더 바람직하게는 2 또는 5)를 나타내고, n13은 1 내지 3의 정수 (바람직하게는 1)를 나타내고, n14는 6 내지 10의 정수 (바람직하게는 8)를 나타낸다.
La'은 바람직하게는 다음의 군으로부터 선택된 어느 하나를 나타낸다:
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-, -C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-, -CH2-OC(=O)-, -OC(=O)-,
-(CH2)2-C(=O)-, -(CH2)5-C(=O)- 및 -CH2CH2-C(=O)-NH -(CH2CH2O)8-CH2CH2-C(=O)-.
La'은 더 바람직하게는 -C(=O)-CH2CH2-C(=O)-, -C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)- 또는 -(CH2)5-C(=O)-이다.
J는 특정 구조에 한정되지 않고, 아자이드기와 반응하여 1,2,3-트리아졸 고리를 형성하는 알카인 구조를 포함하는 임의의 고리형 구조일 수 있고, 이의 예는 다음의 화학식으로 표시되는 화합물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:
[화학식 75]
상기 나타낸 J에 대한 구조식에서, 각각의 별표는 La'의 좌측 말단에서의 -(C=O) 또는 -(CH2)n8에 대한 결합을 나타낸다.
대안적으로, J는 항체 Ab의 아미노산 잔기 (예를 들어, 시스테인 또는 라이신)의 측쇄 또는 할로젠 원자에 결합하는 화합물일 수 있고, J의 예는 다음의 화학식으로 표시되는 말레이미딜기를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:
[화학식 76]
상기 나타낸 말레이미딜기에서, 별표는 La'의 좌측 말단에서의 -(CH2)n12 또는 -(CH2CH2)n13에 대한 결합을 나타낸다.
R16은 바람직하게는 J-La'-Lp'-NH-B'-CH2-O(C=O)-*로 표시되고, 여기서
B'은 1,4-페닐기이고;
Lp'은 다음의 군으로부터 선택된 어느 하나를 나타내고:
-GGVA- (서열번호: 85), -GG-(D-)VA-, -VA-, -GGFG- (서열번호: 86), -GGPI- (서열번호: 87), -GGVCit- (서열번호: 88), -GGVK- (서열번호: 89), GG(D-)PI- 및 -GGPL- (서열번호: 90);
La'은 다음의 군으로부터 선택된 어느 하나를 나타내고:
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-, -C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-, -OC(=O)-, -CH2-OC(=O)-,
-(CH2)5-C(=O)- 및 -CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)8-CH2CH2-C(=O)-;
J는 다음의 구조식 중 어느 하나를 나타낸다:
[화학식 77]
상기 J에 대한 구조식에서,
각각의 별표는 La'에 대한 결합을 나타낸다.
R16은 더 바람직하게는 다음의 군으로부터 선택된 어느 하나이다:
J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B'-CH2-OC(=O)- ("GGVA"는 서열번호: 85로 개시됨),
J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GG-(D-)VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
J1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPI-NH-B'-CH2-OC(=O)- ("GGPI"는 서열번호: 87로 개시됨),
J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-B'-CH2-OC(=O)- ("GGFG"는 서열번호: 86으로 개시됨),
J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B'-CH2-OC(=O)- ("GGVCit"는 서열번호: 88로 개시됨),
J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVK-NH-B'-CH2-OC(=O)- ("GGVK"는 서열번호: 89로 개시됨),
J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPL-NH-B'-CH2-OC(=O)- ("GGPL"은 서열번호: 90으로 개시됨),
J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
J1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
J2-OC(=O)-GGVA-NH-B'-CH2-OC(=O)- ("GGVA"는 서열번호: 85로 개시됨),
J3-CH2-OC(=O)-GGVA-NH-B'-CH2-OC(=O)- ("GGVA"는 서열번호: 85로 개시됨),
J4-(CH2)5-C(=O)-GGVA-NH-B'-CH2-OC(=O)- ("GGVA"는 서열번호: 85로 개시됨),
J4-(CH2)5-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)- 및
J4-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)8-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
상기 식에서, J1, J2, J3 및 J4는 하기로 표시되는 구조식을 나타낸다:
[화학식 78]
상기 J1, J2, J3 및 J4에 대한 구조식에서,
각각의 별표는 J1, J2, J3 또는 J4에 인접한 기에 대한 결합을 나타내고,
B'은 1,4-페닐기이다.
R16은 가장 바람직하게는 하기 중 어느 하나이다.
J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B'-CH2-OC(=O)- ("GGVA"는 서열번호: 85로 개시됨),
J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
J1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B'-CH2-OC(=O)- ("GGVCit"는 서열번호: 88로 개시됨),
J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
J1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
J4-(CH2)5-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
상기 식에서,
B'은 1,4-페닐기이고,
J1 및 J4는 J에 대한 다음의 구조식으로 표시된다:
[화학식 79]
상기 J1 및 J4에 대한 구조식에서,
각각의 별표는 J1 또는 J4에 인접한 기에 대한 결합을 나타낸다.
R17은 하이드록시기 또는 C1 내지 C3 알콕시기, 바람직하게는 하이드록시기 또는 메톡시기이다. R17은 하이드로젠설파이트 부가물 (OSO3M, 여기서 M은 금속 양이온임)일 수 있다. R17이 비대칭 탄소 원자에 결합하므로, 하기의 부분 구조 (VIa) 또는 (VIb)로 표시되는 입체 배열이 제공된다. 각각의 물결선은 일반식 (VI)로 표시되는 유리 약물 및 중간체에서의 W에 대한 결합을 나타낸다.
[화학식 80]
유리 약물은 바람직하게는 다음의 군으로부터 선택된 하나의 화합물이다:
[화학식 81]
유리 약물은 일부 경우에 링커 L의 일부가 결합된 채로 종양 세포에서 방출되나, 이러한 상태에서도 우수한 항종양 효과를 발휘하는 우수한 약물이다. 유리 약물은, 종양 세포로 이동한 후, 일부 경우에 추가로 산화하여 R16 및 R17의 탈수소화를 야기하나, 이러한 상태에서도 우수한 항종양 효과를 발휘한다.
제조 중간체는 다음의 군으로부터 선택된 하나의 화합물일 수도 있다:
[화학식 82]
[화학식 83]
제조 중간체는 다음의 군으로부터 선택된 하나의 화합물일 수도 있다:
[화학식 84]
[화학식 85]
[화학식 86]
[화학식 87]
VIII. 약제
본 발명의 항체-약물 접합체는 암 세포에 세포독성 활성을 나타내고, 따라서 의약, 특히 암 치료제 및/또는 예방제로 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 암은 DLL3을 발현하거나 DLL3을 과발현한다.
본 발명의 항체-약물 접합체가 적용되는 암의 예는 소세포 폐암 (SCLC), 대세포 신경내분비암종 (LCNEC), 신장, 비뇨생식관 (방광, 전립선, 난소, 자궁경부 및 자궁내막), 위장관 (위, 결장), 갑상선 (갑상선 수질암), 췌장 및 폐를 포함한 다양한 조직의 신경내분비종양, 신경아교종 또는 유사 신경내분비종양 (pNET)을 포함할 수 있으나, 치료 표적으로서의 암 세포가 항체-약물 접합체 내의 항체가 인식할 수 있는 단백질을 발현하는 한 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 항체-약물 접합체는 바람직하게는 포유류에 투여될 수 있고, 더 바람직하게는 인간에게 투여된다.
본 발명의 항체-약물 접합체를 함유하는 약학적 조성물에 사용되는 물질은 투여 용량 또는 농도의 관점에서 해당 분야에서 일반적으로 사용되는 제제 첨가제 등에서 적합하게 선택하여 적용할 수 있다.
본 발명의 항체-약물 접합체는 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 성분을 함유하는 약학적 조성물로서 투여될 수 있다. 예를 들어, 약학적 조성물은 일반적으로 하나 이상의 약학적 담체 (예를 들어, 멸균된 액체 (물 및 오일(석유 오일 및 동물 기원, 식물 기원 또는 합성 기원의 오일(예를 들어, 땅콩 오일, 콩 오일, 미네랄 오일 및 참깨 오일)을 포함함)))를 함유한다. 약학적 조성물이 정맥 내로 투여되는 경우, 물이 보다 일반적인 담체이다. 식염수 수용액, 덱스트로스 수용액 및 글리세롤 수용액도 담체, 특히 주사액을 위한 담체로서 사용될 수 있다. 필요에 따라, 조성물은 또한 미량의 보습제, 유화제 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 적합한 약학적 담체의 예는 E. W. Martin에 의해 "Remington's Pharmaceutical Sciences"에 개시되어 있다. 제제는 투여 방식에 상응한다.
본 발명의 항-DLL3 항체-약물 접합체가 적용되는 암의 유형은 암이 치료하고자 하는 암세포에서 DLL3을 발현하는 한 특별히 제한되지 않는다. 이의 예는 소세포 폐암 (SCLC), 대세포 신경내분비암종 (LCNEC), 신장, 비뇨생식관 (방광, 전립선, 난소, 자궁경부 및 자궁내막), 위장관 (위, 결장), 갑상선 (갑상선 수질암), 췌장 및 폐를 포함한 다양한 조직의 신경내분비종양, 신경아교종 또는 유사 신경내분비종양 (pNET)을 포함할 수 있다. 그러나, 암이 DLL3을 발현하는 한 암은 이에 제한되지 않는다. 더 바람직한 암의 예는 소세포 폐암 (SCLC), 대세포 신경내분비암종 (LCNEC) 및 다양한 조직의 신경내분비종양을 포함할 수 있다.
본 발명의 항-DLL3 항체-약물 접합체는 바람직하게는 포유류, 더 바람직하게는 인간에게 투여될 수 있다.
다양한 전달 시스템이 공지되어 있고, 이들은 본 발명의 항체-약물 접합체를 투여하는 데 사용될 수 있다. 투여 경로의 예는 피내, 근육 내, 복강 내, 정맥 내 및 피하 경로를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 투여는 예를 들어 주사 또는 볼루스(bolus) 주사에 의해 이루어질 수 있다. 구체적인 바람직한 실시양태에 따르면, 상기 리간드-약물 접합체 형태의 투여는 주사에 의해 수행된다. 비경구 투여는 바람직한 투여 경로이다.
대표적인 실시양태에 따르면, 약학적 조성물은 통상적인 절차에 따라 인간에게 정맥 내 투여하기에 적합한 약학적 조성물로서 처방된다. 정맥 내 투여용 조성물은 일반적으로 멸균 및 등장성 수성 완충 용액에 담긴 용액이다. 필요한 경우, 의약은 주사 부위에서 통증을 완화시키기 위한 국소 마취제 (예컨대, 리그노카인) 및 가용화제를 함유할 수 있다. 일반적으로, 상기 성분은 활성제의 양을 나타내는 앰플 또는 사셰(sachet)에 밀봉하여 얻어지는 각각의 용기에 함유된 동결건조 분말 또는 무수 농축물로서 개별적으로 또는 단위 투여 형태로 혼합물로 제공된다. 약학적 조성물을 주사에 의해 투여하고자 하는 경우, 이는 멸균 약학 등급의 물 또는 식염수를 함유하는 주사용 병으로부터 투여될 수 있다. 의약이 주사에 의해 투여되는 경우, 전술한 성분이 투여 전에 서로 혼합되도록 주사용 식염수 또는 멸균수의 앰플이 제공될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 본 항체-약물 접합체만을 함유하는 약학적 조성물, 또는 항체-약물 접합체 및 항체-약물 접합체 이외의 적어도 하나의 암 치료제를 함유하는 약학적 조성물일 수 있다. 본 발명의 항체-약물 접합체는 다른 암 치료제와 병용하여 투여할 수 있어, 항암 효과를 증진시킬 수 있다. 이러한 목적으로 사용되는 다른 항암제는 항체-약물 접합체와 동시에, 별도로, 또는 후속적으로 개체에게 투여될 수 있고, 각각에 대해 투여 간격을 달리하여 투여될 수 있다. 이러한 암 치료제의 예는 아브락산, 카보플라틴, 시스플라틴, 젬시타빈, 이리노테칸(CPT-11), 파클리탁셀, 페메트렉시드, 소라페닙, 빈플라스틴, 국제 공개공보 번호 WO2003/038043에 기술된 제제, LH-RH 유사체 (예를 들어, 류프로렐린, 고세렐린), 에스트라무스틴 포스페이트, 에스트로겐 길항제 (예를 들어, 타목시펜, 랄록시펜) 및 아로마타제 억제제 (예를 들어, 아나스트로졸, 레트로졸, 엑스메스탄)를 포함할 수 있으나, 그것이 항종양 활성을 갖는 제제인 한, 이에 제한되지 않는다.
약학적 조성물은 선택된 조성물과 필요한 순도를 갖는 제제로서 동결건조 제제 또는 액상 제제로 제제화될 수 있다. 동결건조 제제로 제제화되는 경우, 이는 당업계에서 사용되는 적합한 제제 첨가제를 함유하는 제제일 수 있다. 또한 액상 제제의 경우, 당업계에서 사용되는 다양한 제제 첨가제를 함유하는 액상 제제로 제제화될 수 있다.
약학적 조성물의 조성 및 농도는 투여 방법에 따라 달라질 수 있다. 그러나, 항체-약물 접합체가 항원에 대해 높은 친화도, 즉 항원에 대한 해리 상수 (Kd 값)의 측면에서 더 높은 친화도 (더 낮은 Kd 값)를 갖는 경우, 본 발명의 약학적 조성물에 함유되는 항체-약물 접합체는 적은 투여량으로도 약학적 효과를 나타낼 수 있다. 따라서, 항체-약물 접합체의 투여량을 결정하기 위해, 투여량은 항원과 항체-약물 접합체의 친화도와 관련된 상황을 고려하여 설정될 수 있다. 본 발명의 항체-약물 접합체를 인간에게 투여하는 경우, 예를 들어 약 0.001 내지 100 mg/kg을 한 번에 투여하거나 1 내지 180일 간격으로 여러 번 투여할 수 있다.
요컨대, 개시된 면역글로불린-관련 조성물 (예를 들어, 2-C8-A, 6-G23-F, 10-O18-A, H2-C8-A, H6-G23-F 또는 H10-O18-A와 같은 항체 또는 이의 항원 결합 단편) 및 이의 항체-약물 접합체는 DLL3-관련 암의 치료에 유용하다. 이러한 치료는 병리학적으로 높은 수준의 DLL3를　갖는 것으로 확인된 환자 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 방법에 의해 진단된 환자) 또는 이러한 병리학적 수준과 관련된 것으로 알려진 질병으로 진단된 환자에서 사용될 수 있다. 일 양태에서, 본 개시내용은 본 기술의 항체 (또는 이의 항원 결합 단편)의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 DLL3-관련 암을 치료하는 방법을 제공한다. 본 기술의 항체에 의해 치료될 수 있는 암의 예는 다음을 포함하나, 이에 제한되지 않는다: 소세포 폐암 (SCLC), 대세포 신경내분비암종 (LCNEC), 신장, 비뇨생식관 (방광, 전립선, 난소, 자궁경부 및 자궁내막), 위장관 (위, 결장), 갑상선 (갑상선 수질암), 췌장 및 폐를 포함한 다양한 조직의 신경내분비종양, 신경아교종 또는 유사 신경내분비종양 (pNET). 본 기술의 조성물은 선택적으로 단일 볼루스로서 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 대안적으로, 투약 요법은 종양 출현 후 다양한 시간에 수행되는 다중 투여를 포함할 수 있다. 투여는 경구, 비강 내, 비경구 (정맥 내, 근육 내, 복강 내 또는 피하), 직장, 두개 내, 종양 내, 경막 내 또는 국소를 포함하는 임의의 적합한 경로에 의해 수행될 수 있다. 투여는 자가 투여 및 타인에 의한 투여를 포함한다. 기술된 바와 같은 의학적 상태의 다양한 치료 방식은 "실질적인"을 의미하도록 의도되고, 이는 전체 치료를 포함하지만 또한 전체 치료보다 더 작은 것도 포함하고, 여기서 일부 생물학적으로 또는 의학적으로 관련된 결과가 달성된다는 것이 또한 이해되어야 한다.
실시예
본 기술은 다음의 실시예에 의해 추가로 예시되고, 이는 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 다음의 실시예는 본 기술의 예시적인 항체-약물 접합체 (ADC) 및 항-DLL3 항체의 제조, 특성화 및 용도를 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명의 범위를 제한하도록 의도되지 않는다. 또한, 이들 실시예는 어떠한 수단으로도 제한된 방식으로 해석되어서는 안 된다. 다음의 실시예에서, 달리 명시되지 않는 한, 유전자 조작에 관한 개별 작업은 "Molecular Cloning" (Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., published by Cold Spring Harbor Laboratory Press in 1989) 에 기재된 방법 또는 당업자에 의해 사용되는 실험 매뉴얼에 기재된 다른 방법에 따라 수행되거나, 상업적으로 입수가능한 시약 또는 키트가 사용되는 경우, 실시예는 상업적으로 입수가능한 제품에 포함된 지침에 따라 수행되었음을 유의해야 한다. 본 명세서에서, 시약, 용매 및 출발 물질은 달리 명시되지 않는 한, 상업적으로 이용 가능한 공급원으로부터 용이하게 입수 가능하다.
실시예 1 - 단일클론 항체의 생성
전장 DLL3을 안정적으로 발현하는 HEK293T 세포에서 생산된, C-말단 6ХHis 태그 (서열번호: 84)를 갖는 아미노산 Ala27-Ala479에 상응하는 DLL3 (GenBank 수탁 번호 Q9NY J7-1)의 세포외 도메인 (ECD)을 면역원으로 사용하였다. 인간 면역글로불린 레퍼토리를 보유하고 있는 Ablexis AlivaMAb 카파 마우스 (Ablexis, San Diego, CA)를 3주 동안 표준 면역화 기술에 따라 가용성 DLL3-ECD 또는 안정한 세포로 면역화하였다. DLL3에 특이적인 높은 혈청 역가를 갖는 마우스로부터 비장세포 및 배액 림프절 세포를 수확하고, 마우스 골수종 세포와 융합시켜 전기융합을 이용하여 하이브리도마를 생성하였다. 이어서, 이들 하이브리도마를 스크린하여, ELISA에 의해 가용성 DLL3-ECD에 특이적으로 결합하는 항체의 존재를 확인하고 모 293 세포에 대한 유세포 분석에 의해 안정적으로 발현하는 293 세포 상의 전장 DLL3 단백질의 존재를 확인하였다. 하이브리도마를 하기와 같이 4℃/37℃ 염색과 함께 293 DLL3 형질감염체에 대한 염색 강도에 대한 유세포 분석에서 순위를 매겨 추가 조사를 위해 선택하였다.
실시예 2 - 단일클론 항체 6-G23-F, 2-C8-A, 7-I1-B 및 10-O18-A에 대한 4/37 내재화 분석
4℃에서의 염색과 37℃에서의 염색을 비교하여 4개의 단일클론 항체 (6-G23-F, 2-C8-A, 7-I1-B 및 10-O18-A)의 DLL3 내재화 능력을 비교하였다. DLL3를 통해 내재화하고 ADC 활성을 갖는 것으로 알려져 있고, 문헌에서 이전에 보고된 기준 단일클론 항체 SC16을 내재화에 대한 양성 대조군으로 사용하였다. 지수 성장 중의 NCI-H82 세포를 트립신/EDTA로 수확하고, 10% 태아 송아지 혈청 (FCS)을 함유하는 RPMI에서 한 번 세척하고, 10% FCS가 보충된 DMEM에 2Х107 세포/ml로 재현탁시켰다. 100 μL (2Х106개의 세포)를 U 바닥 96 웰 플레이트에 첨가하였다. 시험 단일클론 항체 (6-G23-F, 2-C8-A, 7-I1-B 또는 10-O18-A) 또는 기준 단일클론 항체를 별도의 웰에 첨가하여 복제 플레이트에서 10 μg/mL의 최종 농도를 제공하였다. 양 플레이트를 4℃에서 30분 동안 유지시킨 후, 양 플레이트를 10% FCS로 보충된 차가운 RPMI에서 2회 세척하고, 10% FCS로 보충된 RPMI에 재현탁시켰다. 한 플레이트는 4℃에서 유지되었고 (대조군 플레이트), 다른 플레이트는 37℃에서 CO2 배양기에서 배양되었다 (실험군 플레이트). 실험군 플레이트에 대해서는 CO2 배양기에서 37℃, 대조군 플레이트에 대해서는 4℃에서 4시간 배양한 후, 세포를 4℃에서 차가운 세척 완충액 (0.5% BSA를 함유하는 PBS)으로 3회 세척하였다. 이어서, 샘플을 세척 완충액에서 7 μg/mL의 최종 농도로 차가운 세척 완충액 + R-피코에리트린-어피니퓨어 F(ab')2 단편 염소 항-마우스 IgG (R-Phycoerythrin-AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG)(Jackson 115-116-071)에 재현탁시켰다. 4℃에서 30분 동안 배양한 후, 세포를 차가운 세척 완충액에서 3회 세척하고, PBS 0.5% 파라포름알데하이드에 고정시키고, 48시간 이내에 유세포 분석으로 분석하였다. 대조군 플레이트 (4℃에서 항체와 함께 배양됨)로부터 얻은 MFI를 실험군 플레이트 (37℃에서 항체와 함께 배양됨)로부터 얻은 상응하는 MFI로 나누어 계산한 평균 형광 강도 (MFI) 비를 내재화의 상대적 척도로 취하였다. 높은 값은 더 큰 내재화를 나타냈다. 아래의 표에 나타난 바와 같이, 모든 단일클론 항체 (6-G23-F, 2-C8-A, 7-I1-B 및 10-O18-A)는 DLL3에 결합 시 내재화할 수 있었지만, 기준 단일클론 항체의 정도까지는 내재화할 수 없었다.
이들 결과는 본 기술의 면역글로불린-관련 조성물이 DLL3에 대한 결합을 통해 내재화를 겪는다는 것을 입증한다. 따라서, 본 명세서에 개시된 면역글로불린-관련 조성물은 DLL3-양성 암 세포에 치료제를 전달하는 데 유용하다.
실시예 3 - 단일클론 항체 6-G23-F, 2-C8-A, 7-I1-B 및 10-O18-A에 대한 ??칭 내재화 검정
단일클론 항체를 내재화에 대해 순위화하기 위해, ??칭 내재화 검정 (Quenching Internalization Assay)을 사용하였다. 이 방법은 내면화 및 엔도좀/리소좀 경로로의 진입을 반영한다. 염소 항-마우스 IgG1 F(ab) (Jackson Immunoresearch 115-007-185)를 Dy light Dy650 NHS 에스테르 (Thermofisher 02206) 및 LICOR IRDye QC1 NHS 에스테르 (LICOR 929-7030)로 이중으로 표지하였다 (이중으로 표지된 항체는 본 명세서에서 "F(ab) Dy650-QC1"으로 지칭됨). 이 검정의 원리는 다음과 같다: F(ab) Dy650-QC1은 Dy light Dy650　형광이 IRDye QC1에 의해 ??칭되기 때문에 형광이 아니다. 그러나, 내재화 시, F(ab) Dy650-QC1은 엔도좀/리소좀 경로를 통해 분해되고, 결과적으로 IRDye QC1이 방출되어 Dy light Dy650의 형광을 관찰할 수 있게 한다. 따라서, Dy light Dy650　형광 신호를 리소좀을 통한 내재화의 척도로 취하였다. 간략하게, 지수 성장 중의 NCI-H82 세포를 트립신/EDTA로 수확하고, 10% FCS로 보충된 성장 배지 RPMI에서 1회 세척하고, 성장 배지에 재현탁시키고, 웰 당 1.25 x106개의 세포 (80 μL)를 첨가하였다. 200 μg/mL 농도의 단일클론 DLL3 항체를 200 μg/mL의 염소 항-마우스 IgG1 Dy650 QC1과 실온에서 20분 동안 혼합하고, 20 μL 의 혼합물을 세포에 첨가하였다. 4℃에서 30분 동안 배양한 후 세포를 성장 배지로 2회 세척하고, 성장 배지에 재현탁시키고 37℃ CO2 배양기로 옮겨　4시간 동안 내재화되도록 하였다. 이어서, 세포를 0.5% BSA를 함유하는 빙냉 PBS로 2회 세척하고 유세포 분석으로 분석하고, 평균 형광 강도를 결정하였다. 대조군 기준 단일클론의 평균 형광 강도를 100% 내재화로 설정하였다. 아래의 표에 나타난 바와 같이, 4개의 단일클론 항체 모두 내재화 및 엔도좀/리소좀 경로로의 진입을 나타냈다.
이들 결과는 본 기술의 면역글로불린-관련 조성물이 DLL3에 대한 결합을 통해 내재화되고, 세포의 파고좀/리소좀 구획에 진입한다는 것을 입증한다. 따라서, 본 명세서에 개시된 면역글로불린-관련 조성물은 DLL3-양성 암 세포에 치료제를 전달하는 데 유용하다.
실시예 4 - 항-DLL3 단일클론 항체에 대한 Fab ZAP 검정
Fab ZAP 검정을 내재화를 측정하기 위한 또 다른 방법으로 사용하였다. Fab ZAP 검정은 항-DLL3 단일클론 항체의 내재화를 통한 독소의 세포로의 전달을 측정한다. Fab ZAP 검정은 독소로 단일클론 항체를 태그하기 위해 사포린 독소 접합된 F(ab) 항-마우스 중쇄 및 경쇄를 사용한다. Advanced Targeting Systems의 키트를 사용하였고, Fab ZAP 검정 프로토콜에 따라 항-DLL3 단일클론 항체의 패널을 특성화하였다. 간략하게, 지수 성장 중의 NCI-H82 세포를 트립신/EDTA로 수확하고, 10% FCS로 보충된 RMPI에서 1회 세척하고, 10% FCS로 보충된 100 μL RPMI에서 96 웰 백색 고체 플레이트에 5000 세포/웰로 플레이팅하였다. 다음 날, 정제된 단일클론 항체 (G23-F, 2-C8-A, 7-I1-B 또는 10-O18-A) 또는 기준 단일클론 항체 25 μL를 10 μL/mL의 출발 농도로　첨가하고, 일련의 3배 희석을 수행하였다. 사포닌 접합된 F(ab) 항-마우스 Ig HL (Fab ZAP)을 25 μL에 첨가하여 4.4 nM의 최종 농도를 얻었다. 3-4일 후, 동일한 부피의 Cell Titre Glow (Promega G7571)를 플레이트에 첨가하고, 2분 동안 회전 진탕기에서 진탕하고, 추가로 10분 후 실온에서 플레이트 판독기를 사용하여 발광을 판독하였다. 프로존 효과를 무효화하기 위해, 모든 단일클론 항체를 완전 적정으로 시험하였다. 도 9 및 아래의 표에 나타난 바와 같이, 모든 단일클론 항체는 기준 단일클론 항체에 필적하는 세포독성 활성을 나타냈다. 이들 단일클론 항체를 이용한 다른 실험에서, 마우스 IgG1 대조군 단일클론 항체는 세포독성 활성을 나타내지 않았다. 따라서, 이들 결과는 세포독성 활성이 FcRs가 아닌 DLL3의 인식을 통해 매개된다는 것을 입증한다.
이들 결과는 본 기술의 면역글로불린-관련 조성물이 세포 표면 상에 DLL3을 발현하는 종양에 치료제를 전달할 수 있음을 입증한다. 따라서, 본 명세서에 개시된 면역글로불린-관련 조성물은 DLL3-양성 암 세포에 치료제를 전달하는 데 유용하다.
실시예 5 - 항-DLL3 항체의 에피토프 결합
기준 단일클론 항체 및 정제된 항-DLL3 단일클론 항체의　패널을 Carterra® 어레이 표면 플라스몬 공명 (SPR) 분석 플랫폼 (Carterra® Inc., Salt Lake City　UT) 상에서 짝 에피토프 비닝 (pairwise epitope binning)을 거쳤고, 여기서 각각의 단일클론 항체를 히스티딘-태그된 DLL3 항원 (DLL3-His)의 포획에 대해 시험하고, DLL3-His에 대한 결합에 대한 패널 내의 다른 모든 항체와의 경쟁에 대해 시험하였다. 항체를 프린트 어레이 방법에 의해 표준 아민 커플링 기술을 통해 HC200M 칩 (리간드) 상에 고정화하였다. 이어서 각 주기에서 전체 어레이에 걸쳐 항원을 주입한 다음, 단일 항체 (분석물)를 주입하였다. 각 주기의 끝에서 새로운 주기가 시작되기 전에 항원 및 분석물을 제거하기 위해 표면을 재생하였다. 아래의 표에 나타난 바와 같이, 6-G23-F가 빈(bin) 3에 있고 10-O18-A가 빈 1에 있고, 7-I1-B 및 2-C8-A가 빈 2에 맵핑되는 패널에서 3개의 상이한 빈이 식별되었다.
이들 결과는 본 기술의 면역글로불린-관련 조성물이 DLL3 단백질에 존재하는 3개의 별개의 에피토프에 결합한다는 것을 입증한다. 따라서, 본 명세서에 개시된 면역글로불린-관련 조성물은 DLL3을 발현하는 종양 세포에 다수의 치료제를 전달하기 위해 서로 조합하여 사용될 수 있다.
실시예 6 - 친화도 측정
PBS 0.1% BSA 0.02% Tween 20을 결합 완충액으로 사용하고, 10 mM 글라이신 pH 1.7을 재생 완충액으로 사용하여 25℃에서 Octet HTX 기기를 사용하여 생물층 간섭계 (BLI, biolayer interferometry)에 의해 4개의 단일클론 항체 (6-G23-F, 2-C8-A, 7-I1-B 및 10-O18-A)의 결합 친화도를 결정하였다. 4개의 정제된 단일클론 항체 (각각 5 μg/mL)를 항-마우스 Fc 센서 상에 로딩하였다. 로딩된 센서를 200 nM 출발 농도에서 재조합 인간 DLL3 단백질 (아미노산 Ala27-Ala479, cat #9749-DL, R&D 시스템)의 연속 희석액에 7회 연속 1:3 희석으로 담갔다. 도 10a-10d에 도시된 바와 같이. 결합은 농도 의존적이었다. 해리 상수 (KD)는 1가 (1:1) 결합 모델을 이용하여 계산하였다. 도 10e에 나타난 바와 같이, 모든 단일클론 항체는 하위-나노몰 범위의 친화도를 가졌다. 도 11은 6-G23-F, 10-O18-A 및 2-C8-A 단일클론 항체 (mAb)가 DLL3에 선택적으로 결합하지만, DLL1 또는 DLL4에는 결합하지 않는다는 것을 나타낸다. 7-I1-B mAb는 DLL3과 DLL4 모두에 결합하지만, DLL1에는 결합하지 않는다.
이들 결과는 본 기술의 면역글로불린-관련 조성물이 높은 친화도로 DLL3에 특이적으로 결합한다는 것을 입증한다. 따라서, 본 기술의 면역글로불린-관련 조성물은 생물학적 샘플에서 DLL3 단백질을 검출하는 방법에 유용하다.
실시예 7 - 형질감염된 세포 및 1차 세포에 대한 단일클론 항체의 결합.
4개의 단일클론 항체 (6-G23-F, 2-C8-A, 7-I1-B 및 10-O18-A)를 유세포 분석에 의해 내인성 인간 DLL3뿐만 아니라 마우스 및 사이노몰거스 DLL3에 결합하는 능력에 대해 시험하였다. 이 목적을 위해, HEK293 세포를 전장 인간, 마우스 또는 사이노몰거스 DLL3을 암호화하는 플라스미드 DNA로 형질감염시켜 실험에 사용하였다. 간략하게 106개의 형질감염된 HEK293 세포 또는 NCI-H82 1차 세포를 FACS 완충액 PBS 0.5% BSA에서 96 웰 U 바닥 플레이트의 웰에 첨가하고, 정제된 단일클론을 10 μg/mL로 첨가하였다. 4℃에서 30분 배양한 후, 세포를 FACS 완충액에서 3회 세척하고, PE 표지된 F(ab)2 항-마우스 IgG H 및 L 2번째 단계와 함께 배양하였다. 4℃에서 또 다른 30분 배양 후, 세포를 FACS 완충액에서 3회 세척하고, 유세포 분석기에서 분석하였다. 데이터는 2번째 단계와 함께 배경 염색에 의해 나뉜 단일클론에 대한 평균 형광 강도의 비율로 제시된다. 아래의 표에 나타난 바와 같이, 모든 단일클론 항체는 사이노몰거스 DLL3과 교차반응하였고, NCI H82 세포 상에서 내인성 DLL3을 검출하였지만, 오직 6-G23-F 및 7-I1-B만　마우스 DLL3에 결합하였다.
이들 결과는 본 기술의 면역글로불린-관련 조성물이 생물학적 샘플에서 DLL3 단백질을 검출하는 방법에 유용하다는 것을 입증한다.
실시예 8 - 시퀀싱
4개의 단일클론 항체의 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 RACE (cDNA 말단의 신속한 증폭)(Rapid amplification of cDNA ends)에 의해 7-I1-B, 6-G23-F, 2-C8-A 및 10-O18-A에 대한 상응하는 하이브리도마로부터 분리하였다. RNAEasy 키트 (Qiagen)를 사용하여 용해된 하이브리도마로부터 RNA를 분리하였다. cDNA 합성을 위해 mRNA를 분리하고, RACE 키트를 사용하여 PCR 산물을 생성하였다. 이어서, PCR 산물을 TOPO 벡터 내로 클로닝하고, PCR 증폭한 후, 시퀀싱을 위해 겔 분리하였다. 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 아래의 표 및 도 5a-5d (7-I1-B), 도 6a-6d (2-C8-A), 도 7a-7d (10-O18-A) 및 도 8a-8d (6-G23-F)에 나타난다.
실시예 8-1 재조합 항-DLL3 항체 H2-C8-A, H2-C8-A-2 및 H2-C8-A-3의 제조
중쇄 제작: 실시예 8에서 얻은 가변 영역 (서열번호: 12)을 IgG1의 인간 감마 사슬 불변 영역 (서열번호: 42)과 연결하여 항-DLL3 항체 H2-C8-A 의 중쇄 (서열번호: 59)를 제작하였다. 또한 실시예 8에서 얻은 가변 영역 (서열번호: 12)을 IgG1 변이체의 인간 감마 사슬 불변 영역 (서열번호: 57 및 58)과 연결하여 항-DLL3 항체 H2-C8-A-2 (서열번호: 60) 및 H2-C8-A-3 (서열번호: 61)의 중쇄를 제작하였다.
EVQLVESGGGLVQPGGSQRLSCAASGFTFSSYWMNWVRQAPGKGLEWVANIKEDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPGWAPFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호: 59)
EVQLVESGGGLVQPGGSQRLSCAASGFTFSSYWMNWVRQAPGKGLEWVANIKEDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPGWAPFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호: 60)
EVQLVESGGGLVQPGGSQRLSCAASGFTFSSYWMNWVRQAPGKGLEWVANIKEDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPGWAPFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호: 61)
경쇄 제작: 항-DLL3 항체 H2-C8-A의 경쇄를 제작하였고, 실시예 8에서 얻은 가변 영역을 IgG1의 인간 카파 사슬 불변 영역 (서열번호: 17 및 49)과 연결하여 항-DLL3 항체 H2-C8-A-2 및 H2-C8-A-3의 경쇄 (서열번호: 62)를 제작할 수 있다.
DIQMSQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWFQQKPGKAPKSLIYAASSLQSGVPSKFSGSGSGTDFTLAISSLQPEDFATYYCQQYNSFPYTFGQGTTLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호: 62)
발현 벡터 pCMA-G1 제작: 인간 중쇄 신호 서열 및 인간 감마 사슬 불변 영역을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터 pCMA-G1의 제작은 특허 출원 번호 WO2017/051888에 기술되어 있다.
발현 벡터 pCMA-LK 제작: 인간 경쇄 신호 서열 및 인간 카파 사슬 불변 영역을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터 pCMA-LK의 제작은 특허 출원 번호 WO2017/051888에 기술되어 있다.
발현 벡터 pCMA-G1-1 제작: DNA 단편 (서열번호: 75)을 합성하였다 (Eurofins Genomics, 인공 유전자 합성 서비스). DNA 단편을 제한 효소 XbaI 및 PmeI으로 절단하였다. 생성된 1.1 kb 단편을 아가로스 겔 전기영동에 의해 분리하고, Wizard SV 겔 및 PCR 클린업 시스템 (Promega)으로 정제하였다. pCMA-G1의 발현 벡터도 제한 효소 XbaI 및 PmeI으로 절단하여 아가로스 겔 전기영동으로 인간 중쇄 신호 서열 및 인간 감마 사슬 불변 영역을 암호화하는 DNA 서열을 제거하였다. 생성된 3.4 kb의 pCMA-G1의 XbaI/PmeI 단편을 또한 Wizard SV 겔 및 PCR 클린업 시스템으로 정제하였다. 정제된 1.1 kb 및 3.4 kb의 XbaI/PmeI 단편을 라이게이션 하이(Ligation High) (Toyobo)로 연결하여 발현 벡터 pCMA-G1-1을 제작하였다.
GGGTCTAGAGCCACCATGAAACACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCAGCTCCCAGATGGGTGCTGAGCCAGGTGCAATTGTGCAGGCGGTTAGCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCAAGCGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCCGTGACCGTGAGCTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCTGTCCTGCAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCCTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCCCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGCCAGCCCCGGGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCCGGCAAATGAGATATCGGGCCCGTTTAAACGGG (서열번호: 75)
항-DLL3 항체 H2-C8-A-2 중쇄의 발현 벡터 제작: 5'-부위(AGCTCCCAGATGGGTGCTGAGC; 서열번호: 76의 뉴클레오타이드 36-57) 및 3'-부위(AGCTCAGCCTCCACCAAGGGCCC; 서열번호: 76의 뉴클레오타이드 406-428) 모두에 인-퓨전(In-Fusion) 반응을 위한 플랭킹(flanking) 재조합 부위가 있는 뉴클레오타이드 위치 58 내지 405 (서열번호: 76에서)의 뉴클레오타이드로 구성된 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART, 인공 유전자 합성 서비스). 인-퓨전 HD PCR 클로닝 키트 (Takara Bio USA)를 사용하여, 합성된 DNA 단편을 제한효소 BIpI으로 절단되었던 pCMA-G1-1의 부위에 삽입하여 항-DLL3 항체 H2-C8-A-2 중쇄의 발현 벡터를 제작하였다.
ATGAAACACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCAGCTCCCAGATGGGTGCTGAGCGAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCAGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACTGGATGAACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAAGGCCTTGAATGGGTCGCCAACATCAAAGAGGACGGCAGCGAGAAGTACTACGTGGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGATCCTGGCTGGGCCCCTTTCGATTATTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACCGTTAGCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCAAGCGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCCGTGACCGTGAGCTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCTGTCCTGCAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCCTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCCCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGCCAGCCCCGGGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCCGGCAAA (서열번호: 76)
항-DLL3 항체 H2-C8-A-3 중쇄의 발현 벡터 제작: 서열번호: 77의 외부 5'-부위(CCAGCCTCCGGACTCTAGAGCCACC; 서열번호: 101) 및 서열번호: 77의 외부 3'-부위(TGAGTTTAAACGGGGGAGGCTAACT; 서열번호: 102) 모두에 인-퓨전 반응을 위한 플랭킹 재조합 부위가 있는 뉴클레오타이드 위치 1 내지 1401 (서열번호: 77에서)의 뉴클레오타이드로 구성된 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART, 인공 유전자 합성 서비스). 인-퓨전 HD PCR 클로닝 키트를 사용하여, 증폭된 DNA 단편을 제한효소 XbaI/PmeI으로 절단되었던 pCMA-LK의 부위에 삽입하여 항-DLL3 항체 H2-C8-A-3 중쇄의 발현 벡터를 제작하였다.
ATGAAGCACCTGTGGTTCTTTCTGCTGCTGGTGGCCGCTCCTAGATGGGTGCTGTCTGAAGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAACCTGGCGGCTCTCAGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACTGGATGAACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAAGGCCTTGAATGGGTCGCCAACATCAAAGAGGACGGCAGCGAGAAGTACTACGTGGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGCGCCGAAGATACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGATCCTGGCTGGGCCCCTTTCGATTATTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTGTCATCTGCCTCCACCAAGGGCCCAAGCGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCCGTGACCGTGAGCTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCTGTCCTGCAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAAGCCGCGGGGGGACCCTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCCCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGCCAGCCCCGGGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCCGGCAAA (서열번호: 77)
항-DLL3 항체 H2-C8-A-2 및 H2-C8-A-3 경쇄의 발현 벡터 제작: 5'-부위(CTGTGGATCTCCGGCGCGTACGGC; 서열번호: 80의 뉴클레오타이드 37-60) 및 3'-부위(CGTACGGTGGCCGCCCCCTCC; 서열번호: 80의 뉴클레오타이드 382-402) 모두에 인-퓨전 반응을 위한 플랭킹 재조합 부위가 있는 뉴클레오타이드 위치 61 내지 381 (서열번호: 80에서)의 뉴클레오타이드로 구성된 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART, 인공 유전자 합성 서비스). 인-퓨전 HD PCR 클로닝 키트 (Takara Bio USA)를 사용하여, 합성된 DNA 단편을 제한효소 BsiWI으로 절단되었던 pCMA-LK의 부위에 삽입하여 항-DLL3 항체 H2-C8-A-2 및 H2-C8-A-3 경쇄의 발현 벡터를 제작하였다.
ATGGTGCTGCAGACCCAGGTGTTCATCTCCCTGCTGCTGTGGATCTCCGGCGCGTACGGCGACATCCAGATGTCTCAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCAGCGTGGGAGACAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCAGCCAGGGCATCAGCAACTACCTGGCCTGGTTCCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCTAAGAGCCTGATCTATGCCGCTAGCTCTCTGCAGTCTGGCGTGCCCTCTAAGTTTAGCGGCTCTGGCAGCGGCACCGATTTCACACTGGCCATATCTAGCCTGCAGCCTGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTACAACAGCTTCCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACCACACTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCTCCGTGTTCATCTTCCCCCCCTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACCGCCTCCGTGGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTACCCCAGAGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGTCCGGGAACTCCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAAGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGAGCTCCCCCGTCACCAAGAGCTTCAACAGGGGGGAGTGT (서열번호: 80)
발현 및 정제: H2-C8-A의 중쇄 및 경쇄의 상응하는 DNA 서열을 암호화하는 발현 벡터를 제작하고 (형질감염-등급 플라스미드, Genscript), HEK293 세포 (HD 293F, Genscript)에 형질감염시켰다. 배양 및 수확 후에, 얻어진 상층액으로부터 단백질 A 친화도 크로마토그래피에 의해 항체를 정제하였다.
대안적으로, H2-C8-A-3에 대해서는, 매뉴얼에 따라, FreeStyle 293F 세포 (Thermo Fisher Scientific)를 배양하고 계대하였다. 지수 성장 중의 FreeStyle 293F 세포를 3-L 삼각 플라스크 (CORNING)에 시딩(seeding)하고, FreeStyle293 발현 배지 (Thermo Fisher Scientific)로 2.0-2.4Х106 세포/mL에서 총 부피 580 mL로 희석하였다. 한편, H2-C8-A-3의 중쇄 발현 벡터 300 μg, H2-C8-A-3의 경쇄 발현 벡터 300 μg 및 폴리에틸렌이민 (Polyscience) 1.8 mg을 20 mL의 Opti-Pro SFM 배지 (Thermo Fisher Scientific)에 첨가하고, 혼합물을 부드럽게 교반하였다. 5분 동안 배양한 후, 혼합물을 FreeStyle 293F 세포에 첨가하였다. 세포를 배양기 (37℃, 8% CO2)에서 95 rpm으로 4시간 동안 진탕하면서 배양한 후, 4 mM GlutaMAX 보충제 I (Thermo Fisher Scientific)을 포함하는 BalanCD(R) HEK293 (FUJIFILM Irvine Scientific) 480 mL, 및 4 mM GlutaMAX 보충제 I을 포함하는 BalanCD(R) HEK293 피드 (FUJIFILM Irvine Scientific) 120 mL를 배양물에 첨가하였다. 세포를 95 rpm에서 6일 동안 진탕하면서 배양기 (37℃, 8% CO2)에서 더 배양하였다. 배양물 상층액을 수확하고 500-mL 필터 시스템 (Thermo Fisher Scientific)으로 여과하였다.
한편, H2-C8-A-2에 대해서는, 매뉴얼에 따라, FreeStyle 293F 세포를 스피너 플라스크에서 중간 규모 생물반응기 BCP (Biott)로 37℃, 8% CO2에서 배양하고 계대하였다. WAVE BIOREACTOR (GE healthcare)로 FreeStyle 293F 세포를 형질감염시키고 배양하였다. 지수 성장 중의 2.0-2.4Х106 세포/mL의 FreeStyle 293F 세포 2.5 L를 WAVE CELLBAG10L (Cytiva)에 시딩하였다. 한편, H2-C8-A-2의 중쇄 발현 벡터 1.25 mg, H2-C8-A-2의 경쇄 발현 벡터 1.25 mg 및 폴리에틸렌이민 (Polyscience) 7.5 mg을 160 mL의 Opti-Pro SFM 배지 (Thermo Fisher Scientific)에 첨가하고, 혼합물을 부드럽게 교반하였다. 5분 동안 배양한 후, WAVE CELLBAG10L에서 혼합물을 FreeStyle 293F 세포에 첨가하였다. 세포를 WAVE CELLBAG10L (37℃, 8% CO2)에서 4시간 동안 흔들어주면서 배양한 후, 4 mM GlutaMAX 보충제 I을 포함하는 BalanCD(R) HEK293 1.92 L, 및 4 mM GlutaMAX 보충제 I을 포함하는 BalanCD(R) HEK293 피드 480 mL를 배양물에 첨가하였다. 세포를 WAVE CELLBAG10L (37℃, 8% CO2)에서 6일 동안 흔들어주면서 추가로 배양하였다. 배양물 상층액을 수확하고, 원심분리하고, CAPSULE CARTRIDGE FILTER (공극 크기: 0.45 μm, ADVANTEC)로 여과하였다.
항-DLL3 항체의 정제: 여과된 배양물 상층액을 r단백질 A 친화도 크로마토그래피 및 세라믹 하이드록시아파타이트의 2단계 과정에 의해 정제하였다. 정제 방법에 대한 상세한 내용은 특허 출원 번호 WO2020/013170에 기술되어 있다.
실시예 8-2 - 재조합 항-DLL3 항체 H6-G23-F, H6-G23-F-2 및 H6-G23-F-3의 MAB2-제조
중쇄 제작: 실시예 8에서 얻은 가변 영역 (서열번호: 32)을 IgG1의 인간 감마 사슬 불변 영역 (서열번호: 42)과 연결하여 항-DLL3 항체 H6-G23-F의 중쇄 (서열번호: 63)를 제작하였다. 또한 실시예 8에서 얻은 가변 영역 (서열번호: 32)과 IgG1 변이체의 인간 감마 사슬 불변 영역 (서열번호: 57 및 58)을 연결하여 항-DLL3 항체 H6-G23-F-2 및 H6-G23-F-3의 중쇄 (각각 서열번호: 64 및 65)를 제작하였다.
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWMGIIDPSDGSTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDREYNYYGLDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호: 63)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWMGIIDPSDGSTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDREYNYYGLDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호: 64)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWMGIIDPSDGSTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDREYNYYGLDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호: 65)
경쇄 제작: 항-DLL3 항체 H6-G23-F의 경쇄를 제작하였고, 실시예 8에서 얻은 가변 영역을 IgG1의 인간 카파 사슬 불변 영역 (서열번호: 37 및 49)과 연결하여 항-DLL3 항체 H6-G23-F-2 및 H6-G23-F-3의 경쇄 (서열번호: 66)를 제작할 수 있다.
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVYRDGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIYKVSNRDSGVPDRFRGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGTHWPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호: 66)
발현 및 정제: H6-G23-F의 중쇄 및 경쇄의 상응하는 DNA 서열을 암호화하는 발현 벡터를 제조하고 (형질감염-등급 플라스미드, Genscript), HEK293 세포 (HD 293F, Genscript)에 형질감염시켰다. 배양 및 수확 후에, 얻어진 상층액으로부터 단백질 A 친화도 크로마토그래피에 의해 항체를 정제하였다.
실시예 8-3 - 재조합 항-DLL3 항체 H10-O18-A, H10-O18-A-2 및 H10-O18-A-3의 MAB3-제조
중쇄 제작: 실시예 8에서 얻은 가변 영역 (서열번호: 22)을 IgG1의 인간 감마 사슬 불변 영역 (서열번호: 42)과 연결하여 항-DLL3 항체 H10-O18-A의 중쇄 (서열번호: 67)를 제작하였다. 실시예 8 (서열번호: 22)에서 얻은 가변 영역을 IgG1 변이체의 인간 감마 사슬 불변 영역 (서열번호: 57 및 58)과 연결하여 항-DLL3 항체 H10-O18-A-2 및 H10-O18-A-3의 중쇄 (각각 서열번호: 68 및 69)를 제작할 수 있다.
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSINSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIFYSGITNYNPSLKSRVTISLDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARIGVAGFYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호: 67)
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSINSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIFYSGITNYNPSLKSRVTISLDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARIGVAGFYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호: 68)
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSINSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIFYSGITNYNPSLKSRVTISLDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARIGVAGFYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호: 69)
경쇄 제작: 항-DLL3 항체 H10-O18-A의 경쇄를 제작하였고, 실시예 8에서 얻은 가변 영역을 IgG1의 인간 카파 사슬 불변 영역 (서열번호: 27 및 49)과 연결하여 항-DLL3 항체 H10-O18-A-2 및 H10-O18-A-3의 경쇄 (서열번호: 70)를 제작할 수 있다.
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGTSPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호: 70)
항-DLL3 항체 H10-O18-A-2 중쇄의 발현 벡터 제작: 5'-부위(AGCTCCCAGATGGGTGCTGAGC; 서열번호: 78의 뉴클레오타이드 36-57) 및 3'-부위(AGCTCAGCCTCCACCAAGGGCCC; 서열번호: 78의 뉴클레오타이드 406-428) 모두에 인-퓨전 반응을 위한 플랭킹 재조합 부위가 있는 뉴클레오타이드 위치 58 내지 405 (서열번호: 78에서)의 뉴클레오타이드로 구성된 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART, 인공 유전자 합성 서비스). 인-퓨전 HD PCR 클로닝 키트 (Takara Bio USA)를 사용하여, 합성된 DNA 단편을 제한효소 BIpI으로 절단되었던 pCMA-G1-1의 부위에 삽입하여 항-DLL3 항체 H10-O18-A-2 중쇄의 발현 벡터를 제작하였다.
ATGAAACACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCAGCTCCCAGATGGGTGCTGAGCCAGGTTCAGCTGCAAGAGTCTGGCCCTGGCCTGGTCAAGCCTAGCGAAACACTGAGCCTGACCTGTACCGTGTCTGGCGGCAGCATCAACAGCTACTACTGGTCCTGGATCCGGCAGCCTCCTGGCAAAGGACTGGAATGGATCGGCTACATCTTCTACAGCGGCATCACCAACTACAACCCCAGCCTGAAGTCCAGAGTGACCATCAGCCTGGACACCAGCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACAGCCGCCGATACAGCCGTGTACTACTGTGCCAGAATCGGCGTGGCCGGCTTCTACTTCGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACAGTTAGCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCAAGCGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCCGTGACCGTGAGCTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCTGTCCTGCAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCCTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCCCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGCCAGCCCCGGGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCCGGCAAA (서열번호: 78)
항-DLL3 항체 H10-O18-A-3 중쇄의 발현 벡터 제작: 서열번호: 79의 외부 5'-부위(CCAGCCTCCGGACTCTAGAGCCACC; 서열번호: 101) 및 서열번호: 79의 외부 3'-부위(TGAGTTTAAACGGGGGAGGCTAACT; 서열번호: 102) 모두에 인-퓨전 반응을 위한 플랭킹 재조합 부위가 있는 뉴클레오타이드 위치 1 내지 1401 (서열번호: 79에서)의 뉴클레오타이드로 구성된 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART, 인공 유전자 합성 서비스). 인-퓨전 HD PCR 클로닝 키트를 사용하여, 증폭된 DNA 단편을 제한효소 PmeI/XbaI으로 절단되었던 pCMA-LK 부위에 삽입하여 항-DLL3 항체 H10-O18-A-3 중쇄의 발현 벡터를 제작하였다.
ATGAAGCACCTGTGGTTCTTTCTGCTGCTGGTGGCCGCTCCTAGATGGGTGCTGTCTCAGGTTCAGCTGCAAGAGTCTGGCCCTGGCCTGGTCAAGCCTAGCGAAACACTGAGCCTGACCTGTACCGTGTCTGGCGGCAGCATCAACAGCTACTACTGGTCCTGGATCCGGCAGCCTCCTGGCAAAGGACTGGAATGGATCGGCTACATCTTCTACAGCGGCATCACCAACTACAACCCCAGCCTGAAGTCCAGAGTGACCATCAGCCTGGACACCAGCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACAGCCGCCGATACAGCCGTGTACTACTGTGCCAGAATCGGCGTGGCCGGCTTCTACTTCGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTTTCTTCTGCCTCCACCAAGGGCCCAAGCGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCCGTGACCGTGAGCTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCTGTCCTGCAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAAGCCGCGGGGGGACCCTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCCCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGCCAGCCCCGGGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCCGGCAAA (서열번호: 79)
항-DLL3 항체 H10-O18-A-2 및 H10-O18-A-3 경쇄의 발현 벡터 제작: 5'-부위(CTGTGGATCTCCGGCGCGTACGGC; 서열번호: 81의 뉴클레오타이드 37-60) 및 3'-부위(CGTACGGTGGCCGCCCCCTCC; 서열번호: 81의 뉴클레오타이드 385-405) 모두에 인-퓨전 반응을 위한 플랭킹 재조합 부위가 있는 뉴클레오타이드 위치 61 내지 384 (서열번호: 81에서)의 뉴클레오타이드로 구성된 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART, 인공 유전자 합성 서비스). 인-퓨전 HD PCR 클로닝 키트 (Takara Bio USA)를 사용하여, 합성된 DNA 단편을 제한효소 BsiWI으로 절단되었던 pCMA-LK 부위에 삽입하여 항-DLL3 항체 H10-O18-A-2 및 H10-O18-A-3 경쇄의 발현 벡터를 제작하였다.
ATGGTGCTGCAGACCCAGGTGTTCATCTCCCTGCTGCTGTGGATCTCCGGCGCGTACGGCGAGATCGTGCTGACACAGAGCCCTGGCACACTGTCACTGTCTCCAGGCGAAAGAGCCACACTGAGCTGTAGAGCCAGCCAGAGCGTGTCCAGCTCTTACCTGGCTTGGTATCAGCAGAAGCCCGGACAGGCTCCCAGACTGCTGATCTATGGCGCCTCTTCTAGAGCCACAGGCATCCCCGATAGATTCAGCGGCTCTGGCAGCGGCACCGATTTCACCCTGACAATCAGCAGACTGGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGTCAGCAGTACGGCACAAGCCCTCTGACCTTTGGCGGCGGAACAAAGGTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCTCCGTGTTCATCTTCCCCCCCTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACCGCCTCCGTGGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTACCCCAGAGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGTCCGGGAACTCCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAAGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGAGCTCCCCCGTCACCAAGAGCTTCAACAGGGGGGAGTGT (서열번호: 81)
발현 및 정제: H10-O18-A의 중쇄 및 경쇄의 상응하는 DNA 서열을 암호화하는 발현 벡터를 제작하고 (형질감염-등급 플라스미드, Genscript), HEK293 세포 (HD 293F, Genscript)에 형질감염시켰다. 배양 및 수확 후에, 얻어진 상층액으로부터 단백질 A 친화도 크로마토그래피에 의해 항체를 정제하였다.
대안적으로, H10-O18-A-3에 대해서는, 매뉴얼에 따라, FreeStyle 293F 세포 (Thermo Fisher Scientific)를 배양하고 계대하였다. 지수 성장 중의 FreeStyle 293F 세포를 3-L 삼각 플라스크 (CORNING)에 시딩하고, FreeStyle293 발현 배지 (Thermo Fisher Scientific)로 2.0-2.4Х106 세포/mL에서 총 부피 580 mL로 희석하였다. 한편, H10-O18-A-3의 중쇄 발현벡터 300 μg, H10-O18-A-3의 경쇄 발현벡터 300 μg 및 폴리에틸렌이민 (Polyscience) 1.8 mg을 20 mL의 Opti-Pro SFM 배지 (Thermo Fisher Scientific)에 첨가하고, 혼합물을 부드럽게 교반하였다. 5분 동안 배양한 후, 혼합물을 FreeStyle 293F 세포에 첨가하였다. 세포를 배양기 (37℃, 8% CO2)에서 95 rpm으로 4시간 동안 진탕하면서 배양한 후, 4 mM GlutaMAX 보충제 I (Thermo Fisher Scientific)을 포함하는 BalanCD(R) HEK293 (FUJIFILM Irvine Scientific) 480 mL, 및 4 mM GlutaMAX 보충제 I을 포함하는 BalanCD(R) HEK293 피드 (FUJIFILM Irvine Scientific) 120 mL를 배양물에 첨가하였다. 세포를 95 rpm에서 6일 동안 진탕하면서 배양기 (37℃, 8% CO2)에서 추가로 배양하였다. 배양물 상층액을 수확하고 500-mL 필터 시스템 (Thermo Fisher Scientific)으로 여과하였다.
한편, H10-O18-A-2에 대해서는, 매뉴얼에 따라, FreeStyle 293F 세포를 스피너 플라스크에서 중간 규모 생물반응기 BCP(Biott)로 37℃, 8% CO2에서 배양하고 계대하였다. WAVE BIOREACTOR (GE healthcare)로 FreeStyle 293F 세포를 형질감염시키고 배양하였다. 지수 성장 중의 2.0-2.4Х106 세포/mL의 FreeStyle 293F 세포 2.5 L를 WAVE CELLBAG10L (Cytiva)에 시딩하였다. 한편, H10-O18-A-2의 중쇄 발현 벡터 1.25 mg, H10-O18-A-2의 경쇄 발현 벡터 1.25 mg 및 폴리에틸렌이민 (Polyscience) 7.5 mg을 160 mL의 Opti-Pro SFM 배지 (Thermo Fisher Scientific)에 첨가하고, 혼합물을 부드럽게 교반하였다. 5분 동안 배양한 후, WAVE CELLBAG10L에서 혼합물을 FreeStyle 293F 세포에 첨가하였다. 세포를 WAVE CELLBAG10L (37℃, 8% CO2)에서 4시간 동안 흔들어주면서 배양한 후, 4 mM GlutaMAX 보충제 I을 포함하는 BalanCD(R) HEK293 1.92 L, 및 4 mM GlutaMAX 보충제 I을 포함하는 BalanCD(R) HEK293 피드 480 mL를 배양물에 첨가하였다. 세포를 WAVE CELLBAG10L (37℃, 8% CO2)에서 6일 동안 흔들어주면서 추가로 배양하였다. 배양물 상층액을 수확하고, 원심분리하고, CAPSULE CARTRIDGE FILTER (공극 크기: 0.45 μm, ADVANTEC)로 여과하였다.
항-DLL3 항체의 정제: 여과된 배양물 상층액을 r단백질 A 친화도 크로마토그래피 및 세라믹 하이드록시아파타이트의 2단계 과정에 의해 정제하였다. 정제 방법에 대한 상세한 내용은 특허 출원 번호 WO2020/013170에 기술되어 있다.
실시예 9 - 글리칸 변형 (H2-C8-A 항체-[MSG1-N 3 ］ 2 )
항-DLL3 항체 H2-C8-A의 글리칸 변형을 도 13의 도식에 나타낸 바와 같이 수행하였다. 이 도면은 MSG1-형 N297 글리칸의 비환원성 말단에서 아자이드기가 시알산에 도입된 링커 구조에 관한 도식을 나타낸다. 아자이드기를 N297 글리칸에 도입하여 형성된 중간체의 링커 구조는 모두 화학식으로 표시되는 구조와 동일하다.
단계 1: (Fucα1,6)GlcNAc-H2-C8-A 항체 제조
H2-C8-A 항체 용액 (PBS 중 8.02 mg/mL (pH 7.2), 12.0 mL)을 일반 작업 C에 따라 50 mM 포스페이트 완충액 (pH 6.0)으로 완충액 교환하였다. 생성된 H2-C8-A 항체 용액 (50 mM 포스페이트 완충액 (pH 6.0) 중 20.2 mg/mL, 2.50 mL)에 0.0335 mL의 야생형 EndoS 용액 (PBS 중 7.52 mg/mL)을 첨가하고, 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 반응의 진행은 마이크로칩 전기영동 시스템 (Bioanalyzer2100, Agilent)을 통해 확인하였다. 반응 종료 후, 하기의 절차에 따라 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하고 하이드록시아파타이트 컬럼으로 정제하였다.
(1) 정제 장치: AKTA pure150 (GE Healthcare 제조)
컬럼: HiTrap r단백질 A FF (5 mL) (GE Healthcare 제조)
유속: 5 mL/분 (충전 시 1.25 mL/분)
결합 완충액 (20 mM 포스페이트 완충액 (pH 6.0)) 3 CV를　1.25 mL/분으로 흘려주고 5 CV를 추가로 5 mL/분으로 흘려주었다. 중간 세척 시, 세척 완충액 (20 mM 포스페이트 완충액 (pH 7.0), 0.5 M 소듐클로라이드 용액) 15 CV를 흘려주었다. 용출 시, 용출 완충액 (ImmunoPure IgG 용출 완충액, Pierce 제조) 6 CV를 흘려주었다. 용출액을 즉시 1 M Tris 완충액 (pH 9.0)으로 중화시켰다. 목적하는 화합물을 함유하는 분획을 일반 작업 C를 이용하여 5 mM 포스페이트 완충액/50 mM 2-모르폴리노에탄설폰산 (MES) 용액 (pH 6.8)으로 완충액 교환하였다.
(2) 하이드록시아파타이트 크로마토그래피에 의한 정제
정제 장치: AKTA avant25 (GE Healthcare 제조)
컬럼: Bio-Scale 미니 CHT I형 카트리지 (5 mL) (Bio-Rad Laboratories, Inc. 제조)
유속: 5 mL/분 (충전 시 1.25 mL/분)
단계 1에서 얻은 용액을 컬럼의 상부에 가하고, 용액 (5 mM 포스페이트 완충액, 50 mM 2-모르폴리노에탄설폰산 (MES) 용액 (pH 6.8)) 3 CV를　1.25 mL/분으로 흘려주고 3 CV를 추가로 5 mL/분으로 흘려주었다. 그 후, A 용액과 B 용액(5 mM 포스페이트 완충액/50 mM 2-모르폴리노에탄설폰산 (MES) 용액 (pH 6.8), 2 M 소듐 클로라이드 용액)에 대해 용출하였다. 용출 조건은 용액 A: 용액 B = 100:0 내지 0:100 (15 CV)이었다. 또한, 세척 용액 (500 mM 포스페이트 완충액 (pH 6.5)) 5 CV를　흘려주었다. 목적하는 화합물을 함유하는 분획을 일반 작업 C를 이용하여 완충액 교환하여 (Fucα1,6)GlcNAc-H2-C8-A 항체 용액 (50 mM 포스페이트 완충액 (pH 6.0) 중 19.4 mg/mL, 2.10 mL)을 얻었다.
단계 2: H2-C8-A 항체-[MSG1-N3]2 제조
단계 1에서 얻은 (Fucα1,6)GlcNAc-H2-C8-A 항체 용액 (50 mM 포스페이트 완충액 (pH 6.0) 중 19.4 mg/mL, 2.10 mL)에 50 mM 포스페이트 완충액 (pH 6.0) 중 옥사졸린 (6.46 mg), [N3-PEG (3)]-MSG1-Ox (WO19065964 내 실시예 56)의 용액 (0.129 mL) 및 EndoS D233Q/Q303L 용액 (PBS 중 4.80mg/mL) 0.170 mL를　첨가하고 30℃에서 4.5시간 동안 배양하였다. 반응의 진행은 마이크로칩 전기영동 시스템 (Bioanalyzer2100, Agilent)을 통해 확인하였다. 반응 종료 후, 단계 1과 같이 친화도 크로마토그래피 및 하이드록시아파타이트 크로마토그래피에 의해 정제하고, 이어서 목적하는 화합물을 함유하는 분획을 일반 작업 C를 이용하여 10 mM 아세테이트 완충액, 5% 소르비톨 (pH 5.5)로 완충액 교환하여 H2-C8-A 항체-[MSG1-N3]2 용액 (10 mM 아세테이트 완충액, 5% 소르비톨 (pH 5.5)　중 11.1 mg/mL, 3.00mL)을 얻었다.
실시예 10 - 글리칸 변형 (H6-G23-F 항체-[MSG1-N 3 ］ 2 )
항-DLL3 항체 H6-G23-F의 글리칸 변형을 도 14의 도식에 나타낸 바와 같이 수행하였다. 이 도면은 MSG1-형 N297 글리칸의 비환원성 말단에서 아자이드기가 시알산에 도입된 링커 구조에 관한 도식을 나타낸다. 아자이드기를 N297 글리칸에 도입하여 형성된 중간체의 링커 구조는 모두 화학식으로 표시되는 구조와 동일하다.
단계 1: (Fucα1,6)GlcNAc-H6-G23-F 항체 제조
H6-G23-F 항체 용액 (PBS (pH 7.2) 중 6.22 mg/mL, 16.5 mL)을 일반 작업 C에 따라 50 mM 포스페이트 완충액 (pH 6.0)으로 완충액 교환하였다. 생성된 H6-G23-F 항체 용액 (50 mM 포스페이트 완충액 (pH 6.0) 중 19.9 mg/mL, 2.50 mL)을 사용하여, 실시예 9의 단계 1과 동일한 작업을 수행하여 (Fucα1,6)GlcNAc-H6-G23-F 항체 용액 (PB (pH 6.0) 중 19.9 mg/mL, 2.00 mL)을 얻었다.
단계 2: H6-G23-F 항체-[MSG1-N3]2 제조
상기 단계 1에서 얻은 (Fucα1,6)GlucNAc-H6-G23-F 항체 용액 (PB (pH 6.0) 중 19.9 mg/mL, 2.00 mL)을 사용하여 실시예 9의 단계 2와 동일한 작업을 수행하여 H6-G23-F 항체-[MSG1-N3]2 용액 (10 mM 아세테이트 완충액, 5% 소르비톨 (pH 5.5) 중 9.24 mg/mL, 3.50 mL)을 얻었다.
실시예 11 - 글리칸 변형 (H10-O18-A 항체-[MSG1-N 3 ］ 2 )
항-DLL3 항체 H10-O18-A의 글리칸 변형을 도 15의 도식에 나타낸 바와 같이 수행하였다. 이 도면은 MSG1-형 N297 글리칸의 비환원성 말단에서 아자이드기가 시알산에 도입된 링커 구조에 관한 도식을 나타낸다. 아자이드기를 N297 글리칸에 도입하여 형성된 중간체의 링커 구조는 모두 화학식으로 표시되는 구조와 동일하다.
단계 1: (Fucα1,6)GlcNAc-H10-O18-A 항체 제조
H10-O18-A 항체 용액 (PBS (pH 7.2) 중 6.87 mg/mL, 16.0 mL)을 일반 작업 C에 따라 50 mM 포스페이트 완충액 (pH 6.0)으로 완충액 교환하였다. 생성된 H10-O18-A 항체 용액 (50 mM 포스페이트 완충액 (pH 6.0) 중 20.1 mg/mL, 2.50 mL)을 사용하여, 실시예 9의 단계 1과 동일한 작업을 수행하여 (Fucα1,6)GlcNAc- H10-O18-A 항체 용액 (PB (pH 6.0) 중 21.0 mg/mL, 2.00 mL)을 얻었다.
단계 2: H10-O18-A 항체-[MSG1-N3]2 제조
단계 1에서 얻은 (Fucα1,6)GlucNAc-H10-O18-A 항체 용액 (PB (pH 6.0) 중 21.0 mg/mL, 2.00 mL)을 사용하여 실시예 9의 단계 2와 동일한 작업을 수행하여 H10-O18-A 항체-[MSG1-N3]2 용액 (10 mM 아세테이트 완충액, 5% 소르비톨 (pH 5.5) 중 10.7 mg/mL, 3.50 mL)을 얻었다.
실시예 12 - H2-C8-A-접합체 합성
실시예 9의 단계 2에서 얻은 항체와 WO 2019/065964에 따라 합성된 약물-링커를 접합하여 하기 반응식에 도시된 바와 같이 ADC를 합성하였다. 합성의 첫 단계는 도 16에 제시된다. 단계 1에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성질체를 갖고, 단계 1에서 얻은 화합물은 도 16에서 R로 나타낸 두 구조의 혼합물로서 링커를 갖는다.
단계 1: 항체 H2-C8-A-[MSG1-N3]2 및 약물-링커의 접합
10 mM 아세테이트 완충액에, 실시예 9의 단계 2에서 얻은 H2-C8-A 항체-(MSG1-N3)2의 5% 소르비톨 (pH 5.5) 용액 (11.1 mg/mL, 1.5 mL), 1,2-프로판디올 (1.43 mL) 및 WO 2019/065964 내 실시예 3의 절차에 따라 제조된 N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N-[4-({[(11'S,11'aS)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-[(5-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}펜틸)옥시]-5'-옥소-11',11'a-디하이드로-1'H,3'H-스피로[사이클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-카보닐]옥시}메틸)페닐]-L-알라닌아미드 ("GGVA"는 서열번호: 85로 개시됨)의 10 mM 디메틸 설폭사이드 용액 (0.0690 mL; 항체 분자 당 6 당량)을 실온에서 첨가하였고, 튜브 로테이터 (MTR-103, AS ONE Corporation)를 이용하여 실온에서 48시간 동안 반응시켰다.
정제 작업: 용액을 일반 작업 D를 이용하여 정제하여 목적하는 화합물의 용액 7.0 mL를 얻었다.
특성화: 일반 작업 E (εA, 280 = 220378, εA, 329 = 0, εD, 280 = 23155 및 εD, 329 = 19492 사용함) 및 F (기울기 프로그램 1)를 사용하여 다음과 같은 특성값을 얻었다.
항체 농도: 1.77 mg/mL, 항체 수율: 12.4 mg (74%), 항체 분자 당 접합된 약물 분자의 평균 수 (n): 1.8.
실시예 13 - H6-G23-F-접합체 합성
실시예 10의 단계 2에서 얻은 항체와 WO 2019/065964 내 실시예 3의 절차에 따라 제조된 N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N-[4-({[(11'S,11'aS)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-[(5-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}펜틸)옥시]-5'-옥소-11',11'a-디하이드로-1'H,3'H-스피로[사이클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-카보닐]옥시}메틸)페닐]-L-알라닌아미드 ("GGVA"는 서열번호: 85로 개시됨)를 접합하여, 하기 반응식에 도시된 바와 같이 ADC를 합성하였다. 합성의 첫 단계는 도 17에 제시된다. 단계 1에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성질체를 갖고, 단계 1에서 얻은 화합물은 도 17에서 R로 나타낸 두 구조의 혼합물로서 링커를 갖는다.
단계 1: 항체 H6-G23-F-[MSG1-N3]2 및 약물-링커의 접합
H6-G23-F-[MSG1-N3]2 용액 (10 mM 아세테이트 완충액, 5% 소르비톨 (pH 5.5) 중 9.24 mg/mL, 1.1 mL)을 사용하여 실시예 12와 동일한 작업을 수행하였다. 그 결과, H6-G23-F ADC 용액 (6.0 mL)을 얻었다.
특성화: 일반 작업 E (εA, 280 = 215353, εA, 329 = 0, εD, 280 = 23155 및 εD, 329 = 19492 사용함) 및 F (기울기 프로그램 1)를 사용하여 다음과 같은 특성값을 얻었다.
항체 농도: 1.38 mg/mL, 항체 수율: 8.30 mg (82%), 항체 분자 당 접합된 약물 분자의 평균 수 (n): 1.8.
실시예 14 - H10-O18-A-접합체 합성
실시예 11의 단계 2에서 얻은 항체와 WO 2019/065964 내 실시예 3의 절차에 따라 제조된 N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N-[4-({[(11'S,11'aS)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-[(5-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}펜틸)옥시]-5'-옥소-11',11'a-디하이드로-1'H,3'H-스피로[사이클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-카보닐]옥시}메틸)페닐]-L-알라닌아미드 ("GGVA"는 서열번호: 85로 개시됨)를 접합하여, 하기 반응식에 도시된 바와 같이 ADC를 합성하였다. 합성의 첫 단계는 도 18에 제시된다. 단계 1에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성질체를 갖고, 단계 1에서 얻은 화합물은 도 18에서 R로 나타낸 두 구조의 혼합물로서 링커를 갖는다.
단계 1: 항체 H10-O18-A-[MSG1-N3]2 및 약물-링커의 접합
H10-O18-A-[MSG1-N3]2 용액 (10 mM 아세테이트 완충액, 5% 소르비톨 (pH 5.5) 중 10.7 mg/mL, 1.0 mL)을 사용하여 실시예 12와 동일한 작업을 수행하였다. 그 결과, H10-O18-A ADC 용액 (5.0 mL)을 얻었다.
특성화: 일반 작업 E (εA, 280 = 215424, εA, 329 = 0, εD, 280 = 23155 및 εD, 329 = 19492 사용함) 및 F (기울기 프로그램 2)를 사용하여 다음과 같은 특성값을 얻었다.
항체 농도: 1.68 mg/mL, 항체 수율: 8.41 mg (79%), 항체 분자 당 접합된 약물 분자의 평균 수 (n): 1.8.
실시예 15 - 항-LPS ADC (항-LPS 항체-접합체) 합성
항-LPS 항체-접합체는 DLL3과 무관한 항원을 인식하는 인간 IgG로부터 제조된 항체-약물 접합체이고, 음성 대조군으로 사용하였다.
항-LPS 항체는 국제 공개공보 번호 WO 2015/046505에 기술된 h#1G5-H1L1의 하기 서열번호: 73 및 74 (국제 공개공보 번호 WO 2015/046505 내 서열번호: 57 및 67에 상응함)에 제시된 바와 같은 중쇄 전장 및 경쇄 전장 아미노산 서열을 참조하여 제조하였다. WO 2019/065964 내 실시예 21 및 36을 참조하여, 글리칸 변형 및 접합 반응을 수행하여 항-LPS ADC (항-LPS 항체-접합체)를 얻었다.
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWINWVRQAPGQGLEWMGNIYPGSSSINYNEKFKSRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARTIYNYGSSGYNYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (LPS_중쇄; 서열번호: 73)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASENVGNSVSWYQQKPGQPPKLLIYGASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCGQSYSYPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (LPS_경쇄; 서열번호: 74).
실시예 16 - 항-DLL3 ADC, SC16LD6.5 제조
항-DLL3 ADC, SC16LD6.5를 다음의 단계에 의해 제조하였고; 항-DLL3 항체, hSC16.56을 WO 2017/031458 A2를 참조하여 제조하였다. hSC16.56 (SC16)의 경쇄 및 중쇄의 아미노산 서열은 각각 하기 서열번호: 71 및 서열번호: 72 (국제 공개공보 번호 WO 2017/031458 내 서열번호: 7 및 8에 상응함)로 표시된다. 약물 링커, SG3249를 이전에 보고된 절차 (Med. Chem. Lett. 2016, 7, 983-987)에 따라 합성하였다. 보고된 절차, WO 2014/130879 A2 내 실시예 7 (a) 말레이미드 접합에 따라 hSC16.56 (SC16)을 SG3249와 접합하여 SC16LD6.5 (ADC1)를 얻었다.
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYADDFKGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARIGDSSPSDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호: 71)
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCKASQSVSNDVVWYQQKPGQAPRLLIYYASNRYTGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQDYTSPWTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACE VTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호: 72)
실시예 17 - 항체-약물 접합체의 생체 내 항종양 효과
DLL3-양성 인간 종양 세포주 세포의 접종에 의한 면역결핍 마우스로부터 유래된 동물 모델을 사용하여 항체-약물 접합체의 항종양 효과를 평가하였다. 4- 내지 5-주령의 BALB/c 누드 마우스 (CAnN. Cg-Foxnl [nu]/ CrlCrlj [Foxnlnu/Foxnlnu], Charles River Laboratories Japan Inc.)를 실험에 사용하기 전에 SPF 조건 하에 3일 이상 순응시켰다. 마우스에게 멸균 고체 식단 (FR-2, Funabashi Farms Co., Ltd)을 공급하고 멸균 수돗물 (수돗물에 5 내지 15 ppm의 소듐 하이포클로라이트 용액을 첨가하여 제조됨)을 제공하였다. 전자 디지털 캘리퍼스 (CD-15CX, Mitutoyo Corp.)를 사용하여 접종된 종양의 장직경 및 단직경을 주 2회 측정한 후, 다음의 식에 따라 종양의 부피를 계산하였다.
종양 부피 (mm3 = 1/2 x 장직경 (mm) x [단직경 (mm)]2.
각 항체-약물 접합체를 ABS 완충액 (10 mM 아세테이트 완충액, 5% 소르비톨, pH 5.5) (Nacalai Tesque, Inc.)으로 희석하였고, 희석액을 각 연구에서 나타낸 용량으로 각 마우스의 꼬리에 정맥 투여하였다. 상기와 동일한 방법으로 대조군 (비히클 군)에 ABS 완충액을 투여하였다. 한 그룹당 6마리의 마우스가 실험에 사용되었다. 추정 종양 부피가 3000 mm3 초과인 그룹은 당시에 안락사시켰다.
17) -1 항종양 효과 - (1)
DLL3-양성 인간 소세포 폐암 세포주 NCI-H209 (ATCC)를 마트리겔 (Corning Inc.)에 현탁시키고, 세포 현탁액을 4 x 106개 세포의 용량으로 각 암컷 누드 마우스의 우측 옆구리 부위에 피하 접종하였다 (0일). 11일째에, 마우스를 무작위로 그룹화하였다. 그룹화 당일, 3개의 항체-약물 접합체 (H2-C8-A-접합체, H6-G23-F-접합체, H10-O18-A-접합체) 각각 또는 항-LPS 항체-접합체를 각 마우스의 꼬리에 0.4 mg/kg의 용량으로 정맥 투여하였다. 그 결과를 도 19에 나타냈다. 가로축은 접종 후 일수를 나타내고, 세로축은 추정 종양 부피를 나타낸다. 오차 범위는 SE 값을 나타낸다. 화살표는 투여 날짜를 나타낸다.
항-LPS 항체-접합체는 이 종양 모델에서 의미 있는 항종양 효과를 나타내지 않았다. 3개의 항체-약물 접합체 (H2-C8-A-접합체, H6-G23-F-접합체, H10-O18-A-접합체)는 모두 투여 후 종양 부피를 감소시켰고, 상당한 종양 퇴화를 나타냈고, 투여 후 28일 동안 종양 퇴행 효과를 유지하였다 (도 19). 또한, 각 항체-약물 접합체로 처리된 마우스는 체중 감소 징후가 유의하지 않아, 3개의 항체-약물 접합체 (H2-C8-A-접합체, H6-G23-F-접합체, H10-O18-A-접합체)가 독성이 낮고 안전함을 시사하였다. 비히클 및 항-LPS 항체-접합체 그룹은 해당 그룹의 마우스 중 적어도 하나의 추정 종양 부피가 3000 mm3를 초과하는 경우 안락사되었다.
17)-2 항종양 효과 - (2)
DLL3-양성 인간 소세포 폐암 세포주 NCI-H524 (ATCC)를 마트리겔 (Corning Inc.)에 현탁시키고, 세포 현탁액을 2.5 x 106개 세포의 용량으로 각 암컷 누드 마우스의 우측 옆구리 부위에 피하 접종하였다 (0일). 13일째에, 마우스를 무작위로 그룹화하였다. 그룹화 당일, 3개의 항체-약물 접합체 (H2-C8-A-접합체, H6-G23-F-접합체, H10-O18-A-접합체) 각각 또는 항-LPS 항체-접합체를 마우스의 꼬리에 0.4 mg/kg의 용량으로 정맥 투여하였다. 그 결과를 도 20에 나타냈다. 가로축은 접종 후 일수를 나타내고 세로축은 추정 종양 부피를 나타낸다. 오차 범위는 SE 값을 나타낸다. 화살표는 투여 날짜를 나타낸다.
항-LPS 항체-접합체는 이 종양 모델에서 의미 있는 항종양 효과를 나타내지 않았다. 3개의 항체-약물 접합체 (H2-C8-A-접합체, H6-G23-F-접합체, H10-O18-A-접합체)는 모두 투여 후 종양 부피를 감소시켰고, 종양 퇴화를 나타냈고, H2-C8-A-접합체 및 H10-O18-A-접합체는 투여 후 29일 동안 종양 퇴행 효과를 유지하였다 (도 20). 또한, 각 항체-약물 접합체로 처리된 마우스는 체중 감소 징후가 유의하지 않아, 3개의 항체-약물 접합체 (H2-C8-A-접합체, H6-G23-F-접합체, H10-O18-A-접합체)가 독성이 낮고 안전함을 시사하였다. 비히클 및 항-LPS 항체-접합체 그룹은 해당 그룹의 마우스 중 적어도 하나의 추정 종양 부피가 3000 mm3를 초과하는 경우 안락사되었다.
17)-3 항종양 효과 - (3)
DLL3-양성 인간 소세포 폐암 세포주 NCI-H510A (ATCC)를 마트리겔 (Corning Inc.)에 현탁시키고, 세포 현탁액을 2.5 x 106개 세포의 용량으로 각 암컷 누드 마우스의 우측 옆구리 부위에 피하 접종하였다 (0일). 15일째에, 마우스를 무작위로 그룹화하였다. 그룹화 당일, 3개의 항체-약물 접합체 (H2-C8-A-접합체, H6-G23-F-접합체, H10-O18-A-접합체) 각각 또는 기준 항-DLL3 항체-접합체 (SC16LD6.5)를 각 마우스의 꼬리에 0.2 mg/kg의 용량으로 정맥 투여하였다. 그 결과를 도 21에 나타냈다. 가로축은 접종 후 일수를 나타내고 세로축은 추정 종양 부피를 나타낸다. 오차 범위는 SE 값을 나타낸다. 화살표는 투여 날짜를 나타낸다.
기준 항-DLL3-약물 접합체 (SC16LD6.5)는 이 종양 모델에서 종양 퇴행 효과 없이 약간의 종양 성장 억제를 나타냈다. 반면, H2-C8-A-접합체 및 H10-O18-A-접합체는 투여 후 종양 부피를 감소시켰고, 투여 후 27일 동안 종양 퇴행 효과를 유지하였다. H2-C8-A-접합체 및 H10-O18-A-접합체는 SC16LD6.5 보다 종양 부피를 더 감소시킨다. 따라서, 본 발명의 2개의 항체-약물 접합체 (H2-C8-A-접합체, H10-O18-A-접합체)는 SC16LD6.5에 비해 항종양 제제로 작용하는 항체-약물 접합체로서 우수하다 (도 21). 또한, 각 항체-약물 접합체로 처리된 마우스는 체중 감소 징후가 유의하지 않아, 3개의 항체-약물 접합체 (H2-C8-A-접합체, H6-G23-F-접합체, H10-O18-A-접합체)가 독성이 낮고 안전함을 시사하였다.
실시예 18 - 글리칸 변형 (H2-C8-A-3 항체-[MSG1-N 3 ］ 2 )
항-DLL3 항체 H2-C8-A-3의 글리칸 변형을 도 22의 도식에 나타낸 바와 같이 수행하였다. 이 도면은 MSG1-형 N297 글리칸의 비환원성 말단에서 아자이드기가 시알산에 도입된 링커 구조에 관한 도식을 나타낸다. 아자이드기를 N297 글리칸에 도입하여 형성된 중간체의 링커 구조는 모두 화학식으로 표시되는 구조와 동일하다.
단계 1: (Fucα1,6)GlcNAc-H2-C8-A-3 항체 제조
H2-C8-A-3 항체 용액 (HBSor(히스티딘 완충액 소르비톨) 중 30.0 mg/mL, 3.43 mL)을 일반 작업 C에 따라 50 mM 포스페이트 완충액 (pH 6.0)으로 완충액 교환하였다. 생성된 H2-C8-A-3 항체 용액 (50 mM 포스페이트 완충액 (pH 6.0) 중 20.0 mg/mL, 5.00 mL)을 사용하여, 실시예 9의 단계 1과 동일한 작업을 수행하여 (Fucα1,6)GlcNAc-H2-C8-A-3 항체 용액 (PB (pH 6.0) 중 19.8 mg/mL, 4.95 mL)을 얻었다.
단계 2: H2-C8-A-3 항체-[MSG1-N3]2 제조
상기 단계 1에서 얻은 (Fucα1,6)GlucNAc-H2-C8-A-3 항체 용액 (PB (pH 6.0) 중 19.8 mg/mL, 4.95 mL)을 사용하여 실시예 9의 단계 2와 동일한 작업을 수행하여 H2-C8-A-3 항체-[MSG1-N3]2 용액 (10 mM 아세테이트 완충액, 5% 소르비톨 (pH 5.5) 중 9.88 mg/mL, 9.30 mL)을 얻었다.
실시예 19 - 글리칸 변형 (H10-O18-A-3 항체-[MSG1-N 3 ］ 2 )
항-DLL3 항체 H10-O18-A-3의 글리칸 변형을 도 23의 도식에 나타낸 바와 같이 수행하였다. 이 도면은 MSG1-형 N297 글리칸의 비환원성 말단에서 아자이드기가 시알산에 도입된 링커 구조에 관한 도식을 나타낸다. 아자이드기를 N297 글리칸에 도입하여 형성된 중간체의 링커 구조는 모두 화학식으로 표시되는 구조와 동일하다.
단계 1: (Fucα1,6)GlcNAc-H10-O18-A-3 항체 제조
H10-O18-A-3 항체 용액 (HBSor 중 37.8 mg/mL, 2.20 mL)을 일반 작업 C에 따라 50 mM 포스페이트 완충액 (pH 6.0)으로 완충액 교환하였다. 생성된 H10-O18-A-3 항체 용액 (50 mM 포스페이트 완충액 (pH 6.0) 중 20.0 mg/mL, 3.86 mL)을 사용하여, 실시예 9의 단계 1과 동일한 작업을 수행하여 (Fucα1,6)GlcNAc-H10-O18-A-3 항체 용액 (PB (pH 6.0) 중 19.5 mg/mL, 3.77 mL)을 얻었다.
단계 2: H10-O18-A-3 항체-[MSG1-N3]2 제조
단계 1에서 얻은 (Fucα1,6)GlucNAc-H10-O18-A-3 항체 용액 (PB (pH 6.0) 중 19.5 mg/mL, 3.77 mL)을 사용하여 실시예 9의 단계 2와 동일한 작업을 수행하여 H10-O18-A-3 항체-[MSG1-N3]2 용액 (10 mM 아세테이트 완충액, 5% 소르비톨 (pH 5.5) 중 10.6 mg/mL, 6.50 mL)을 얻었다.
실시예 20 - H2-C8-A-3-접합체 합성
실시예 18의 단계 2에서 얻은 항체와 WO 2019/065964 내 실시예 3의 절차에 따라 제조된 N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N-[4-({[(11'S,11'aS)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-[(5-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}펜틸)옥시]-5'-옥소-11',11'a-디하이드로-1'H,3'H-스피로[사이클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-카보닐]옥시}메틸)페닐]-L-알라닌아미드 ("GGVA"는 서열번호: 85로 개시됨)를 접합하여, 하기 반응식에 도시된 바와 같이 ADC를 합성하였다. 합성의 첫 단계는 도 24에 제시된다. 단계 1에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성질체를 갖고, 단계 1에서 얻은 화합물은 도 24에서 R로 나타낸 두 구조의 혼합물로서 링커를 갖는다.
단계 1: 항체 H2-C8-A-3-[MSG1-N3]2 및 약물-링커의 접합
H2-C8-A-3-[MSG1-N3]2 용액 (10 mM 아세테이트 완충액, 5% 소르비톨 (pH 5.5) 중 9.88 mg/mL, 3.50 mL)을 사용하여 실시예 12와 동일한 작업을 수행하였다. 그 결과, H2-C8-A-3 ADC 용액 (17.5 mL)을 얻었고 시간이 지남에 따라 안정하였다.
특성화: 일반 작업 E (εA, 280 = 220420, εA, 329 = 0, εD, 280 = 23155 및 εD, 329 = 19492 사용함) 및 F (기울기 프로그램 1)를 사용하여 다음과 같은 특성값을 얻었다.
항체 농도: 1.65 mg/mL, 항체 수율: 29.0 mg (84%), 항체 분자 당 접합된 약물 분자의 평균 수 (n): 1.9.
실시예 21 - H10-O18-A-3-접합체 합성
실시예 19의 단계 2에서 얻은 항체와 WO 2019/065964 내 실시예 3의 절차에 따라 제조된 N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N-[4-({[(11'S,11'aS)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-[(5-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}펜틸)옥시]-5'-옥소-11',11'a-디하이드로-1'H,3'H-스피로[사이클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-카보닐]옥시}메틸)페닐]-L-알라닌아미드 ("GGVA"는 서열번호: 85로 개시됨)를 접합하여, 하기 반응식에 도시된 바와 같이 ADC를 합성하였다. 합성의 첫 단계는 도 25에 제시된다. 단계 1에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성질체를 갖고, 단계 1에서 얻은 화합물은 도 25에서 R로 나타낸 두 구조의 혼합물로서 링커를 갖는다.
단계 1: 항체 H10-O18-A-3-[MSG1-N3]2 및 약물-링커의 접합
H10-O18-A-3-[MSG1-N3]2 용액 (10 mM 아세테이트 완충액, 5% 소르비톨 (pH 5.5) 중 10.6 mg/mL, 3.50 mL)을 사용하여 실시예 12와 동일한 작업을 수행하였다. 그 결과, H10-O18-A-3 ADC 용액 (17.5 mL)을 얻었고 시간이 지남에 따라 안정하였다.
특성화: 일반 작업 E (εA, 280 = 215380, εA, 329 = 0, εD, 280 = 23155 및 εD, 329 = 19492 사용함) 및 F (기울기 프로그램 2)를 사용하여 다음과 같은 특성값을 얻었다.
항체 농도: 1.79 mg/mL, 항체 수율: 31.3 mg (84%), 항체 분자 당 접합된 약물 분자의 평균 수 (n): 1.9.
실시예 22 - 항체-약물 접합체의 생체내 항종양 효과
실시예 17과 실질적으로 동일한 프로토콜을 사용하였다.
22)-1 항종양 효과 - (1)
DLL3-양성 인간 소세포 폐암 세포주 NCI-H510A (ATCC)를 마트리겔 (Corning Inc.)에 현탁시키고, 세포 현탁액을 2.3 x 106개 세포의 용량으로 각 암컷 누드 마우스의 우측 옆구리 부위에 피하 접종하였다. 종양이 확립된 후, 마우스를 무작위로 그룹화하였다 (한 그룹 당 마우스 6마리). 그룹화 당일, 2개의 항체-약물 접합체 (H2-C8-A-3-접합체, H10-O18-A-3-접합체) 각각, 기준 항-DLL3 항체-접합체 (SC16LD6.5) 또는 항-LPS 항체-접합체를 각 마우스의 꼬리에 0.2 mg/kg의 용량으로 정맥 투여하였다. 그 결과를 도 26에 나타냈다. 가로축은 투여 후 일수를 나타내고, 세로축은 추정 종양 부피를 나타낸다. 오차 범위는 SE 값을 나타낸다.
항-LPS 항체-접합체는 이 종양 모델에서 의미 있는 항종양 효과를 나타내지 않았다. 기준 항-DLL3-약물 접합체 (SC16LD6.5)는 종양 퇴행 효과 없이 약간의 종양 성장 억제를 나타냈다. 반면, 2개의 항체-약물 접합체 (H2-C8-A-3-접합체, H10-O18-A-3-접합체)는 모두 종양 부피를 감소시켰고, 이들 그룹에서 투여 후 28일째에 모든 종양은 그 초기 부피보다 작았다. H2-C8-A-3-접합체 및 H10-O18-A-3-접합체는 SC16LD6.5보다 종양 부피를 더 감소시켰다. 따라서, 본 발명의 2개의 항체-약물 접합체 (H2-C8-A-3-접합체, H10-O18-A-3-접합체)는 SC16LD6.5 항체 약물 접합체에 비해 항종양 제제로 작용하는 항체-약물 접합체로서 우수하다. 또한, 각 항체-약물 접합체로 처리된 마우스는 체중 감소 징후가 없거나 유의하지 않아, 이들 항체-약물 접합체 (H2-C8-A-3-접합체, H10-O18-A-3-접합체)가 독성이 낮고 안전함을 시사하였다. 비히클 및 항-LPS 항체-접합체 그룹은 해당 그룹의 마우스 중 적어도 하나의 추정 종양 부피가 3000 mm3를 초과하거나 해당 그룹의 마우스 중 적어도 하나의 종양의 장직경이 20 mm를 초과하는 경우 안락사되었다.
22)-2 항종양 효과 - (2)
DLL3-양성 인간 소세포 폐암 세포주 NCI-H209 (ATCC)를 마트리겔 (Corning Inc.)에 현탁시키고, 세포 현탁액을 4 x 106개 세포의 용량으로 각 암컷 누드 마우스의 우측 옆구리 부위에 피하 접종하였다. 종양이 확립된 후, 마우스를 무작위로 그룹화하였다 (한 그룹 당 마우스 5 마리). 그룹화 당일, 2개의 항체-약물 접합체 (H2-C8-A-3-접합체, H10-O18-A-3-접합체) 각각을 마우스의 꼬리에 0.4 mg/kg의 용량으로 정맥 투여하였다. 그 결과를 도 27에 나타냈다. 가로축은 투여 후 일수를 나타내고 세로축은 추정 종양 부피를 나타낸다. 오차 범위는 SE 값을 나타낸다.
2개의 항체-약물 접합체 (H2-C8-A-3-접합체, H10-O18-A-3-접합체)는 모두 종양 부피를 감소시켰고, 이들 그룹에서 투여 후 28일째에 모든 종양은 그 초기 부피보다 작았다. 또한, 각 항체-약물 접합체로 처리된 마우스는 체중 감소 징후가 없거나 유의하지 않아, 2개의 항체-약물 접합체 (H2-C8-A-3-접합체, H10-O18-A-3-접합체)가 모두 독성이 낮고 안전함을 시사하였다.
22)-3 항종양 효과 - (3)
DLL3-양성 인간 소세포 폐암 세포주 NCI-H82 (ATCC)를 마트리겔 (Corning Inc.)에 현탁시키고, 세포 현탁액을 1 x 106개 세포의 용량으로 각 암컷 누드 마우스의 우측 옆구리 부위에 피하 접종하였다. 종양이 확립된 후, 마우스를 무작위로 그룹화하였다 (한 그룹 당 마우스 6 마리). 그룹화 당일, 2개의 항체-약물 접합체 (H2-C8-A-3-접합체, H10-O18-A-3-접합체) 각각, 기준 항-DLL3 항체-접합체 (SC16LD6.5) 또는 항-LPS 항체-접합체를 각 마우스의 꼬리에 0.4 mg/kg의 용량으로 정맥 투여하였다. 그 결과를 도 28에 나타냈다. 가로축은 투여 후 일수를 나타내고 세로축은 추정 종양 부피를 나타낸다. 오차 범위는 SE 값을 나타낸다.
항-LPS 항체-접합체는 이 종양 모델에서 의미있는 항종양 효과를 나타내지 않았다. 기준 항-DLL3-항체 접합체 (SC16LD6.5)는 이 종양 모델에서 종양 퇴행 효과 없이 약간의 종양 성장 억제를 나타냈다. 반면, 2개의 항체-약물 접합체 (H2-C8-A-3-접합체, H10-O18-A-3-접합체)는 모두 종양 부피를 감소시켰고, 이들 그룹에서 투여 후 28일째에 모든 종양은 그 초기 부피보다 작았다. 따라서, 본 발명의 2개의 항체-약물 접합체 (H2-C8-A-3-접합체, H10-O18-A-3-접합체)는 SC16LD6.5 항체 약물 접합체에 비해 항종양 제제로 작용하는 항체-약물 접합체로서 우수하다. 또한, 각 항체-약물 접합체로 처리된 마우스는 체중 감소 징후가 없거나 유의하지 않아, 2개의 항체-약물 접합체 (H2-C8-A-3-접합체, H10-O18-A-3-접합체)가 모두 독성이 낮고 안전함을 시사하였다. 항-LPS 항체-접합체 그룹은 해당 그룹의 마우스 중 적어도 하나의 추정 종양 부피가 3000 mm3을 초과하는 경우 안락사되었다.
실시예 23 - ICR 마우스에서의 항체-약물 접합체의 독성 또는 허용 용량
23)-1 ICR 마우스에서의 허용 용량 -(1)
5-주령의 Crl:CD1(ICR) 수컷 마우스 (Charles River Laboratories Japan, Inc.)를 무작위로 그룹화하였다 (한 그룹 당 마우스 5 마리). 그룹화 당일, 2개의 항체-약물 접합체 (H2-C8-A-3-접합체 또는 H10-O18-A-3-접합체) 각각을 3, 6 또는 10 mg/kg의 용량으로 각 마우스의 꼬리에 정맥 투여하였다. 마우스의 사망률을 1주일에 수회 관찰하였고, 투여 후 41일 동안 체중을 측정하였다.
H2-C8-A-3-접합체로 처리된 마우스는 이 실험 동안 모두 살아있었다. H2-C8-A-3-접합체로 처리된 마우스는 이 실험 동안 시험된 모든 용량 (3, 6, 10 mg/kg)에서 체중 감소 징후가 없거나 유의하지 않았다. H10-O18-A-3-접합체로 처리된 마우스는 이 실험 동안 모두 살아있었다. H10-O18-A-3-접합체로 처리된 마우스는 이 실험 동안 시험된 모든 용량 (3, 6, 10 mg/kg)에서 체중 감소 징후가 없거나 유의하지 않았다.
23)-2 ICR 마우스에서의 허용 용량 -(2)
5-주령의 Crl:CD1(ICR) 수컷 마우스 (Charles River Laboratories Japan, Inc.)를 무작위로 그룹화하였다 (한 그룹 당 마우스 5 마리). 그룹화 당일, 2개의 항체-약물 접합체 (H2-C8-A-3-접합체 또는 H10-O18-A-3-접합체) 각각을 3, 6 또는 10 mg/kg의 용량으로 각 마우스의 꼬리에 정맥 투여하였다. 마우스의 사망률을 1주일에 수회 관찰하였고, 투여 후 41일 동안 체중을 측정하였다.
H2-C8-A-3-접합체로 처리된 마우스는 이 실험 동안 모두 살아있었다. H2-C8-A-3-접합체로 처리된 마우스는 이 실험 동안 시험된 모든 용량 (3, 6, 10 mg/kg)에서 체중 감소 징후가 없거나 유의하지 않았다. H10-O18-A-3-접합체로 처리된 마우스는 이 실험 동안 모두 살아있었다. H10-O18-A-3-접합체로 처리된 마우스는 이 실험 동안 시험된 모든 용량 (3, 6, 10 mg/kg)에서 체중 감소 징후가 없거나 유의하지 않았다.
*****
산업적 이용 가능성: 본 발명은 내재화 활성을 갖는 항-DLL3 항체 및 이를 포함하는 항체-약물 접합체를 제공한다. 본 항체-약물 접합체는 암의 치료 약물 등으로 사용될 수 있다. 실제로, 전술한 실시예 및 개시내용은 본 기술의 ADC 조성물이 DLL3-관련 암 (예를 들어, 소세포 폐암 (SCLC), 대세포 신경내분비암종 (LCNEC), 신장, 비뇨생식관 (방광, 전립선, 난소, 자궁경부 및 자궁내막), 위장관 (위, 결장), 갑상선 (갑상선 수질암), 췌장 및 폐를 포함한 다양한 조직의 신경내분비종양, 신경아교종 또는 유사 신경내분비종양 (pNET))을 앓고 있는 대상체를 치료하기 위한 방법에 유용하다는 것을 입증한다.
SEQUENCE LISTING <110> MEMORIAL SLOAN KETTERING CANCER CENTER TRI-INSTITUTIONAL THERAPEUTICS DISCOVERY INSTITUTE <120> ANTIBODY-PYRROLOBENZODIAZEPINE DERIVATIVE CONJUGATE <130> 098065-0303 <140> <141> <150> 63/136,928 <151> 2021-01-13 <160> 102 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1 gaggtgcagc tggtggagtc tggggggggc ttggtaaagc ctggggggtc ccttagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt aacacctgga tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggttggccgt attaaaagca aatctgatgg tgggacaaca 180 gactacgctg cacccgtgaa aggcagattc accatctcaa gagatgattc aaaaaacacg 240 ctgtatctgc aaatgaacag cctgaaaacc gaggacacag ccgtgtatta ctgtacccag 300 tattattgga actcctttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357 <210> 2 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu 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180 gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatccg 300 ggctgggctc cctttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 354 <210> 12 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 12 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Gln Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asn Ile Lys Glu Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Pro Gly Trp Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 13 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 1 5 <210> 14 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 14 Lys Glu Asp Gly Ser Glu 1 5 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 15 Asp Pro Gly Trp Ala Pro Phe Asp Tyr 1 5 <210> 16 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 16 gacatccaga tgtcccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgtc gggcgagtca gggcattagc aattatttag cctggtttca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aagttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctcg ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt tcccgtacac ttttggccag 300 gggaccacgc tggagatcaa a 321 <210> 17 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 17 Asp Ile Gln Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ala Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Phe Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Thr Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 18 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 19 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 20 Gln Gln Tyr Asn 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Synthetic peptide <400> 28 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 29 Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 30 Gln Gln Tyr Gly Thr Ser Pro Leu Thr 1 5 <210> 31 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 31 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg catctggata caccttcacc agctactata tacactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaata atcgacccaa gtgatggtag cacaaactac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagatcgg 300 gaatataact actacggttt ggacgtctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 360 <210> 32 <211> 120 <212> PRT <213> 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 35 Asp Arg Glu Tyr Asn Tyr Tyr Gly Leu Asp Val 1 5 10 <210> 36 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 36 gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca gccggcctcc 60 atctcctgca ggtctagtca aagcctcgta taccgtgatg gaaacaccta cttgaattgg 120 tttcagcaga ggccaggcca atctccaagg cgcctaattt ataaggtttc taaccgggac 180 tctggggtcc cagacagatt ccgcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc 240 agccgggtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaaggtac acactggcct 300 ccgacgttcg gccaagggac caaggtggaa atcaaa 336 <210> 37 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 37 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Arg 20 25 30 Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe 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<212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 73 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Ser Ile Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Ile Tyr Asn Tyr Gly Ser Ser Gly Tyr Asn Tyr Ala Met 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 130 135 140 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 145 150 155 160 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 165 170 175 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 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385 390 395 400 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 405 410 415 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 420 425 430 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 435 440 445 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 74 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 74 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Asn Ser 20 25 30 Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 75 <211> 1117 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 75 gggtctagag ccaccatgaa acacctgtgg ttcttcctcc tgctggtggc agctcccaga 60 tgggtgctga gccaggtgca attgtgcagg cggttagctc agcctccacc aagggcccaa 120 gcgtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg cggcacagcc gccctgggct 180 gcctggtcaa ggactacttc cccgaacccg tgaccgtgag ctggaactca ggcgccctga 240 ccagcggcgt gcacaccttc cccgctgtcc tgcagtcctc aggactctac tccctcagca 300 gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc aacgtgaatc 360 acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aggttgagcc caaatcttgt gacaaaactc 420 acacatgccc accctgccca gcacctgaac tcctgggggg accctcagtc ttcctcttcc 480 ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg 540 tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg 600 tgcataatgc caagacaaag ccccgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgggtggtca 660 gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct 720 ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa ggccagcccc 780 gggaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag aaccaggtca 840 gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca 900 atggccagcc cgagaacaac tacaagacca cccctcccgt gctggactcc gacggctcct 960 tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggc aacgtcttct 1020 catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac ccagaagagc ctctccctgt 1080 ctcccggcaa atgagatatc gggcccgttt aaacggg 1117 <210> 76 <211> 1401 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 76 atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagcgag 60 gtgcagctgg ttgaatctgg cggaggactg gttcagcctg gcggatctca gagactgtct 120 tgtgccgcca gcggcttcac cttcagcagc tactggatga actgggtccg acaggcccct 180 ggcaaaggcc ttgaatgggt cgccaacatc aaagaggacg gcagcgagaa gtactacgtg 240 gacagcgtga agggcagatt caccatctcc agagacaacg ccaagaacag cctgtacctg 300 cagatgaact ccctgagagc cgaggacacc gccgtgtact actgtgccag agatcctggc 360 tgggcccctt tcgattattg gggccagggc acactggtca ccgttagctc agcctccacc 420 aagggcccaa gcgtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg cggcacagcc 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaacccg tgaccgtgag ctggaactca 540 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc cccgctgtcc tgcagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 660 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aggttgagcc caaatcttgt 720 gacaaaactc acacatgccc accctgccca gcacctgaac tcctgggggg accctcagtc 780 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 840 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 900 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccccgggagg agcagtacaa cagcacgtac 960 cgggtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1020 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1080 ggccagcccc gggaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1140 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1200 tgggagagca atggccagcc cgagaacaac tacaagacca cccctcccgt gctggactcc 1260 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggc 1320 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac ccagaagagc 1380 ctctccctgt ctcccggcaa a 1401 <210> 77 <211> 1401 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 77 atgaagcacc tgtggttctt tctgctgctg gtggccgctc ctagatgggt gctgtctgaa 60 gtgcagctgg tggaatctgg cggaggactg gttcaacctg gcggctctca gagactgtct 120 tgtgccgcca gcggcttcac cttcagcagc tactggatga actgggtccg acaggcccct 180 ggcaaaggcc ttgaatgggt cgccaacatc aaagaggacg gcagcgagaa gtactacgtg 240 gacagcgtga agggcagatt caccatctcc agagacaacg ccaagaacag cctgtacctg 300 cagatgaact ccctgcgcgc cgaagatacc gccgtgtact actgtgccag agatcctggc 360 tgggcccctt tcgattattg gggccaggga accctggtca ccgtgtcatc tgcctccacc 420 aagggcccaa gcgtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg cggcacagcc 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaacccg tgaccgtgag ctggaactca 540 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc cccgctgtcc tgcagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 660 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aggttgagcc caaatcttgt 720 gacaaaactc acacatgccc accctgccca gcacctgaag ccgcgggggg accctcagtc 780 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 840 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 900 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccccgggagg agcagtacaa cagcacgtac 960 cgggtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1020 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1080 ggccagcccc gggaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1140 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1200 tgggagagca atggccagcc cgagaacaac tacaagacca cccctcccgt gctggactcc 1260 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggc 1320 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac ccagaagagc 1380 ctctccctgt ctcccggcaa a 1401 <210> 78 <211> 1401 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 78 atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagccag 60 gttcagctgc aagagtctgg ccctggcctg gtcaagccta gcgaaacact gagcctgacc 120 tgtaccgtgt ctggcggcag catcaacagc tactactggt cctggatccg gcagcctcct 180 ggcaaaggac tggaatggat cggctacatc ttctacagcg gcatcaccaa ctacaacccc 240 agcctgaagt ccagagtgac catcagcctg gacaccagca agaaccagtt ctccctgaag 300 ctgagcagcg tgacagccgc cgatacagcc gtgtactact gtgccagaat cggcgtggcc 360 ggcttctact tcgattattg gggccagggc accctggtca cagttagctc agcctccacc 420 aagggcccaa gcgtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg cggcacagcc 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaacccg tgaccgtgag ctggaactca 540 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc cccgctgtcc tgcagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 660 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aggttgagcc caaatcttgt 720 gacaaaactc acacatgccc accctgccca gcacctgaac tcctgggggg accctcagtc 780 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 840 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 900 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccccgggagg agcagtacaa cagcacgtac 960 cgggtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1020 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1080 ggccagcccc gggaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1140 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1200 tgggagagca atggccagcc cgagaacaac tacaagacca cccctcccgt gctggactcc 1260 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggc 1320 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac ccagaagagc 1380 ctctccctgt ctcccggcaa a 1401 <210> 79 <211> 1401 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 79 atgaagcacc tgtggttctt tctgctgctg gtggccgctc ctagatgggt gctgtctcag 60 gttcagctgc aagagtctgg ccctggcctg gtcaagccta gcgaaacact gagcctgacc 120 tgtaccgtgt ctggcggcag catcaacagc tactactggt cctggatccg gcagcctcct 180 ggcaaaggac tggaatggat cggctacatc ttctacagcg gcatcaccaa ctacaacccc 240 agcctgaagt ccagagtgac catcagcctg gacaccagca agaaccagtt ctccctgaag 300 ctgagcagcg tgacagccgc cgatacagcc gtgtactact gtgccagaat cggcgtggcc 360 ggcttctact tcgattattg gggccagggc accctggtca ccgtttcttc tgcctccacc 420 aagggcccaa gcgtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg cggcacagcc 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaacccg tgaccgtgag ctggaactca 540 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc cccgctgtcc tgcagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 660 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aggttgagcc caaatcttgt 720 gacaaaactc acacatgccc accctgccca gcacctgaag ccgcgggggg accctcagtc 780 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 840 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 900 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccccgggagg agcagtacaa cagcacgtac 960 cgggtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1020 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1080 ggccagcccc gggaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1140 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1200 tgggagagca atggccagcc cgagaacaac tacaagacca cccctcccgt gctggactcc 1260 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggc 1320 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac ccagaagagc 1380 ctctccctgt ctcccggcaa a 1401 <210> 80 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 80 atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcgtacggc 60 gacatccaga tgtctcagag ccctagcagc ctgtctgcca gcgtgggaga cagagtgacc 120 atcacctgta gagccagcca gggcatcagc aactacctgg cctggttcca gcagaagcct 180 ggcaaggccc ctaagagcct gatctatgcc gctagctctc tgcagtctgg cgtgccctct 240 aagtttagcg gctctggcag cggcaccgat ttcacactgg ccatatctag cctgcagcct 300 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacaacagct tcccctacac cttcggccag 360 ggcaccacac tggaaatcaa gcgtacggtg gccgccccct ccgtgttcat cttccccccc 420 tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tccgtggtgt gcctgctgaa taacttctac 480 cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg gaactcccag 540 gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 600 ctgagcaaag ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 660 ctgagctccc ccgtcaccaa gagcttcaac aggggggagt gt 702 <210> 81 <211> 705 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 81 atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcgtacggc 60 gagatcgtgc tgacacagag ccctggcaca ctgtcactgt ctccaggcga aagagccaca 120 ctgagctgta gagccagcca gagcgtgtcc agctcttacc tggcttggta tcagcagaag 180 cccggacagg ctcccagact gctgatctat ggcgcctctt ctagagccac aggcatcccc 240 gatagattca gcggctctgg cagcggcacc gatttcaccc tgacaatcag cagactggaa 300 cccgaggact tcgccgtgta ctactgtcag cagtacggca caagccctct gacctttggc 360 ggcggaacaa aggtggaaat caagcgtacg gtggccgccc cctccgtgtt catcttcccc 420 ccctccgacg agcagctgaa gtccggcacc gcctccgtgg tgtgcctgct gaataacttc 480 taccccagag aggccaaggt gcagtggaag gtggacaacg ccctgcagtc cgggaactcc 540 caggagagcg tgaccgagca ggacagcaag gacagcacct acagcctgag cagcaccctg 600 accctgagca aagccgacta cgagaagcac aaggtgtacg cctgcgaggt gacccaccag 660 ggcctgagct cccccgtcac caagagcttc aacagggggg agtgt 705 <210> 82 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 82 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 83 <211> 75 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> SITE <222> (1)..(75) <223> This sequence may encompass 1-15 "Gly Gly Gly Gly Ser" repeating units <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 83 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 35 40 45 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 50 55 60 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 65 70 75 <210> 84 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag <400> 84 His His His His His His 1 5 <210> 85 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 85 Gly Gly Val Ala 1 <210> 86 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 86 Gly Gly Phe Gly 1 <210> 87 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 87 Gly Gly Pro Ile 1 <210> 88 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Citrulline <400> 88 Gly Gly Val Xaa 1 <210> 89 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 89 Gly Gly Val Lys 1 <210> 90 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 90 Gly Gly Pro Leu 1 <210> 91 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 91 Glu Gly Gly Val Ala 1 5 <210> 92 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 92 Asp Gly Gly Phe 1 <210> 93 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 93 Glu Gly Gly Phe 1 <210> 94 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 94 Ser Gly Gly Phe 1 <210> 95 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 95 Lys Gly Gly Phe 1 <210> 96 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 96 Asp Gly Gly Phe Gly 1 5 <210> 97 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 97 Gly Gly Phe Gly Gly 1 5 <210> 98 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 98 Asp Asp Gly Gly Phe Gly 1 5 <210> 99 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 99 Lys Asp Gly Gly Phe Gly 1 5 <210> 100 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 100 Gly Gly Phe Gly Gly Gly Phe 1 5 <210> 101 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 101 ccagcctccg gactctagag ccacc 25 <210> 102 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 102 tgagtttaaa cgggggaggc taact 25

Claims (75)

  1. 다음의 화학식으로 표시되는 항체-약물 접합체:

    상기 식에서,
    m1은 1 내지 2의 정수를 나타내고;
    D는 다음의 화학식 중 어느 하나로 표시되는 약물을 나타내고:

    상기 식에서,
    별표는 L에 대한 결합을 나타내고;
    L은 Ab의 N297 글리칸과 D를 연결하는 링커이고;
    N297 글리칸은 임의로 변형되고;
    Ab는 DLL-3에 특이적으로 결합하는 항-DLL3 항체 또는 항체의 기능적 단편을 나타낸다.
  2. 제1항에 있어서,
    항-DLL3 항체가 중쇄 면역글로불린 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 면역글로불린 가변 도메인 (VL)을 포함하고,
    (a) VH는 (i) 각각 서열번호: 3, 서열번호: 4 및 서열번호: 5;
    (ii) 각각 서열번호: 13, 서열번호: 14 및 서열번호: 15;
    (iii) 각각 서열번호: 23, 서열번호: 24 및 서열번호: 25; 및
    (iv) 각각 서열번호: 33, 서열번호: 34 및 서열번호: 35로 이루어진 군으로부터 선택된 VH-CDR1 서열, VH-CDR2 서열 및 VH-CDR3 서열을 포함하고/하거나;
    (b) VL은 (i) 각각 서열번호: 8, 서열번호: 9 및 서열번호: 10;
    (ii) 각각 서열번호: 18, 서열번호: 19 및 서열번호: 20;
    (iii) 각각 서열번호: 28, 서열번호: 29 및 서열번호: 30; 및
    (iv) 각각 서열번호: 38, 서열번호: 39 및 서열번호: 40으로 이루어진 군으로부터 선택된 VL-CDR1 서열, VL-CDR2 서열 및 VL-CDR3 서열을 포함하는, 항체-약물 접합체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    항-DLL3 항체가 중쇄 면역글로불린 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 면역글로불린 가변 도메인 (VL)을 포함하고, (a) VH-CDR1 서열, VH-CDR2 서열 및 VH-CDR3 서열을 포함하는 VH 및 (b) VL-CDR1 서열, VL-CDR2 서열 및 VL-CDR3 서열을 포함하는 VL의 조합은
    (i) (a) 각각 서열번호: 3, 서열번호: 4 및 서열번호: 5, 및 (b) 서열번호: 8, 서열번호: 9 및 서열번호: 10;
    (ii) 각각 (a) 서열번호: 13, 서열번호: 14 및 서열번호: 15, 및 (b) 서열번호: 18, 서열번호: 19 및 서열번호: 20;
    (iii) 각각 (a) 서열번호: 23, 서열번호: 24 및 서열번호: 25, 및 (b) 서열번호: 28, 서열번호: 29 및 서열번호: 30; 및
    (iv) 각각 (a) 서열번호: 33, 서열번호: 34 및 서열번호: 35, 및 (b) 서열번호: 38, 서열번호: 39 및 서열번호: 40으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체-약물 접합체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    항-DLL3 항체가 다음의 특성 중 하나 이상을 포함하는 항체-약물 접합체:
    (a) 서열번호: 7, 17, 27 또는 37 중 어느 하나로 존재하는 경쇄 면역글로불린 가변 도메인 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 경쇄 면역글로불린 가변 도메인 서열; 및/또는
    (b) 서열번호: 2, 12, 22 또는 32 중 어느 하나로 존재하는 중쇄 면역글로불린 가변 도메인 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 중쇄 면역글로불린 가변 도메인 서열.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    항-DLL3 항체가 다음의 특성 중 하나 이상을 포함하는 항체-약물 접합체:
    (a) 서열번호: 17, 27 또는 37 중 어느 하나로 존재하는 경쇄 면역글로불린 가변 도메인 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 경쇄 면역글로불린 가변 도메인 서열; 및
    (b) 서열번호: 12, 22 또는 32 중 어느 하나로 존재하는 중쇄 면역글로불린 가변 도메인 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 중쇄 면역글로불린 가변 도메인 서열.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    항-DLL3 항체가 중쇄 면역글로불린 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 면역글로불린 가변 도메인 (VL)을 포함하고, 여기서
    (a) VH는 서열번호: 2, 서열번호: 12, 서열번호: 22 및 서열번호: 32로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고/하거나;
    (b) VL은 서열번호: 7, 서열번호: 17, 서열번호: 27 및 서열번호: 37로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 항체-약물 접합체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    항-DLL3 항체가 중쇄 면역글로불린 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 면역글로불린 가변 도메인 (VL)을 포함하고,
    (a) VH는 서열번호: 12, 서열번호: 22 또는 서열번호: 32로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고,
    (b) VL은 서열번호: 17, 서열번호: 27 또는 서열번호: 37로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 항체-약물 접합체.
  8. 제6항에 있어서,
    VH 아미노산 서열 및 VL 아미노산 서열이 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체-약물 접합체:
    각각 서열번호: 2 및 서열번호: 7 (7-I1-B);
    각각 서열번호: 12 및 서열번호: 17 (2-C8-A);
    각각 서열번호: 22 및 서열번호: 27 (10-O18-A); 및
    각각 서열번호: 32 및 서열번호: 37 (6-G23-F).
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체-약물 접합체가 항-DLL3 항체가 세포 표면 (예를 들어, 종양 세포 표면) 상에 발현된 DLL3 폴리펩타이드에 결합할 때 세포내 내재화를 겪는 항체-약물 접합체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    항-DLL3이 IgG1 또는 이의 변이체, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM, IgD 및 IgE로 이루어진 군으로부터 선택되는 이소형의 Fc 도메인을 포함하는 항체-약물 접합체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    항-DLL3이 서열번호: 42, 57 또는 58의 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체-약물 접합체.
  12. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    항-DLL3 항체가 단일클론 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체 또는 이중특이적 항체인 항체-약물 접합체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 다음을 포함하는 항체-약물 접합체:
    (a) 서열번호: 59 내지 61 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호: 62의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
    (b) 서열번호: 63 내지 65 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호: 66의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 또는
    (c) 서열번호: 67 내지 69 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호: 70의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 다음을 포함하는 항체-약물 접합체:
    (a) 서열번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호: 62의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
    (b) 서열번호: 65의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호: 66의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 또는
    (c) 서열번호: 69의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호: 70의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
  15. 제1항에 있어서,
    항-DLL3 항체가 DLL-3에 결합하기 위해 제9항 또는 제V항에 따른 항체와 경쟁하는 항체-약물 접합체.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    항-DLL3 항체가, 입체 에피토프 또는 비-입체 에피토프인, DLL 상의 에피토프에 결합하는 항체-약물 접합체.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    항-DLL3 항체가 서열번호: 50 또는 서열번호: 51의 아미노산 잔기 27-492를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 포유류 DLL3 폴리펩타이드에 결합하는 항체-약물 접합체.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체의 중쇄 또는 경쇄가 N-결합 글리코실화, O-결합 글리코실화, N-말단 가공, C-말단 가공, 탈아미드화, 아스파르트산의 이성질체화, 메티오닌의 산화, N-말단에의 메티오닌 잔기의 추가, 프롤린 잔기의 아미드화, 중쇄의 위치 234 및 235 (EU 넘버링)에서의 2개의 류신(L) 잔기의 알라닌(A)으로의 치환 (LALA), 중쇄의 위치 356의 아미노산 잔기 Glu(E) 및 위치 358 (EU 넘버링)의 아미노산 잔기 Met(M)의 집합, 중쇄의 위치 356의 Asp(D) 및 위치 358 (EU 넘버링)의 류신(L)의 집합 또는 이들의 임의의 조합, N-말단 글루타민 또는 N-말단 글루탐산의 피로글루탐산으로의 전환, 및 카복실 말단에서의 1개 또는 2개의 아미노산의 제거로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 또는 2개 이상의 변형 또는 아미노산 잔기의 집합을 갖는 항체-약물 접합체.
  19. 제18항에 있어서,
    중쇄의 카복실 말단에서 1개 또는 2개의 아미노산이 제거된 항체-약물 접합체.
  20. 제19항에 있어서,
    양쪽 중쇄의 카복실 말단 각각에서 1개의 아미노산이 제거된 항체-약물 접합체.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    중쇄의 카복실 말단에 있는 프롤린 잔기가 추가로 아미드화된 항체-약물 접합체.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    항-DLL3 항체가 항체 의존성 세포독성 활성을 향상시키기 위해 조절되는 당쇄 변형을 포함하는 항체-약물 접합체.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    D가 다음과 같은 항체-약물 접합체:
    .
  24. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    D가 다음과 같은 항체-약물 접합체:
    .
  25. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    D가 다음과 같은 항체-약물 접합체:
    .
  26. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    D가 다음과 같은 항체-약물 접합체:
    .
  27. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    -OH가 위치 11'에 있는 항체-약물 접합체.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    L이 -Lb-La-Lp-NH-B-CH2-O(C=O)-*로 표시되고, 별표는 D에 대한 결합을 나타내고;
    B는 페닐기 또는 헤테로아릴기를 나타내고;
    Lp는 표적 세포에서 절단 가능한 아미노산 서열로 구성된 링커를 나타내고;
    La는 다음의 군으로부터 선택된 어느 하나를 나타내고:
    -C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-,
    -C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-NH-(CH2CH2)n3-C(=O)-,
    -C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)n3-CH2-C(=O)-,
    -C(=O)-(CH2CH2)n2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)n3-CH2CH2-C(=O)- 및
    -(CH2)n4-O-C(=O)-;
    n2는 1 내지 3의 정수를 나타내고, n3는 1 내지 5의 정수를 나타내고, n4는 0 내지 2의 정수를 나타내고;
    Lb는 La와 Ab의 글리칸 또는 변형된 글리칸을 결합하는 스페이서를 나타내는
    항체-약물 접합체.
  29. 제28항에 있어서,
    B가 1,4-페닐기, 2,5-피리딜기, 3,6-피리딜기, 2,5-피리미딜기 및 2,5-티에닐기로부터 선택된 어느 하나인 항체-약물 접합체.
  30. 제29항에 있어서,
    B가 1,4-페닐기인 항체-약물 접합체.
  31. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    Lp가 2 내지 7개의 아미노산으로 구성된 아미노산 잔기인 항체-약물 접합체.
  32. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    Lp가 글라이신, 발린, 알라닌, 페닐알라닌, 글루탐산, 이소류신, 프롤린, 시트룰린, 류신, 세린, 라이신 및 아스파르트산으로부터 선택된 아미노산으로 구성된 아미노산 잔기인 항체-약물 접합체.
  33. 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    Lp가 다음의 군으로부터 선택되는 항체-약물 접합체:
    -GGVA- (서열번호: 85), -GG-(D-)VA-, -VA-, -GGFG- (서열번호: 86), -GGPI- (서열번호: 87), -GGVCit- (서열번호: 88), -GGVK- (서열번호: 89), -GG(D-)PI- 및 -GGPL- (서열번호: 90).
  34. 제28항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    La가 다음의 군으로부터 선택되는 항체-약물 접합체:
    -C(=O)-CH2CH2-C(=O)-, -C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-,
    -C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-,
    -C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-,
    -C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-,
    -CH2-OC(=O)- 및 -OC(=O)-.
  35. 제28항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    Lb가 다음의 구조식으로 표시되는 항체-약물 접합체:
    ,
    , 또는

    위에 나타낸 Lb에 대한 각각의 구조식에서,
    각각의 별표는 La에 대한 결합을 나타내고, 각각의 물결선은 Ab의 글리칸 또는 변형된 글리칸에 대한 결합을 나타낸다.
  36. 제28항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    L이 -Lb-La-Lp-NH-B-CH2-O(C=O)-*로 표시되고,
    B는 1,4-페닐기이고;
    Lp는 다음의 군으로부터 선택된 어느 하나를 나타내고:
    -GGVA- (서열번호: 85), -GG-(D-)VA-, -VA-, -GGFG- (서열번호: 86), -GGPI- (서열번호: 87), -GGVCit- (서열번호: 88), -GGVK- (서열번호: 89) 및 -GGPL- (서열번호: 90);
    La는 다음의 군으로부터 선택된 어느 하나를 나타내고:
    -C(=O)-CH2CH2-C(=O)-, -C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-,
    -C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-,
    -C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-,
    -C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-,
    -CH2-OC(=O)- 및 -OC(=O)-;
    Lb는 다음의 구조식으로 표시되고:
    ,
    , 또는

    위에 나타낸 Lb에 대한 각각의 구조식에서,
    각각의 별표는 La에 대한 결합을 나타내고, 각각의 물결선은 Ab의 글리칸 또는 변형된 글리칸에 대한 결합을 나타내는
    항체-약물 접합체.
  37. 제28항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
    L이 다음의 군으로부터 선택되는 항체-약물 접합체:
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)- ("GGVA"는 서열번호: 85로 개시됨),
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GG-(D-)VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
    -Z1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPI-NH-B-CH2-OC(=O)- ("GGPI"는 서열번호: 87로 개시됨),
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-B-CH2-OC(=O)- ("GGFG"는 서열번호: 86으로 개시됨),
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(=O)- ("GGVCit" 서열번호: 88로 개시됨),
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVK-NH-B-CH2-OC(=O)- ("GGVK"는 서열번호: 89로 개시됨),
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPL-NH-B-CH2-OC(=O)- ("GGPL"은 서열번호: 90으로 개시됨),
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
    -Z2-OC(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)- ("GGVA"는 서열번호: 85로 개시됨) 및
    -Z3-CH2-OC(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)- ("GGVA"는 서열번호: 85로 개시됨),
    상기 식에서,
    Z1은 다음의 구조식을 나타내고:

    Z2는 다음의 구조식을 나타내고:

    Z3는 다음의 구조식을 나타내고:

    Z1, Z2 및 Z3에 대한 각각의 구조식에서,
    각각의 별표는 La에 대한 결합을 나타내고, 각각의 물결선은 Ab의 글리칸 또는 변형된 글리칸에 대한 결합을 나타내고;
    B는 1,4-페닐기를 나타낸다.
  38. 제37항에 있어서,
    L이 다음의 군으로부터 선택되는 항체-약물 접합체:
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)- ("GGVA"는 서열번호: 85로 개시됨),
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
    -Z1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(=O)- ("GGVCit"는 서열번호: 88로 개시됨),
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)- 및
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
    상기 식에서,
    B는 1,4-페닐기이고, Z1은 다음의 구조식을 나타내고:

    Z1에 대한 구조식에서,
    각각의 별표는 Z1에 인접한 C(=O)에 대한 결합을 나타내고, 각각의 물결선은 Ab의 글리칸 또는 변형된 글리칸에 대한 결합을 나타낸다.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 IgG인 항체-약물 접합체.
  40. 제39항에 있어서,
    항체가 IgG1 또는 이의 변이체, IgG2, 또는 IgG4인 항체-약물 접합체.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 종양 세포에 결합하고, 종양 세포에 혼입되어 내재화하는 항체-약물 접합체.
  42. 제41항에 있어서,
    항체가 추가로 항종양 효과를 갖는 항체-약물 접합체.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
    N297 글리칸이 변형된 글리칸인 항체-약물 접합체.
  44. 제43항에 있어서,
    N297 글리칸이 N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2, 또는 이들의 혼합물, 또는 N297-(Fuc)SG이고,
    N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 및 N297-(Fuc)SG는 다음의 식으로 표시되는 구조를 갖는 항체-약물 접합체:

    상기 식에서,
    물결선은 항체의 Asn297에 대한 결합을 나타내고;
    L(PEG)는 -(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH-를 나타내고, 여기서 우측 말단의 아미노기는 아미드 결합을 통해 N297 글리칸에 있는 β-Man의 1-3 분지쇄에 있는 비환원성 말단의 시알산의 2-위치에서 카복실산에 결합하고;
    별표는 링커 L에 대한 결합을 나타내고;
    n5는 2 내지 10의 정수를 나타내고,

    상기 식에서,
    물결선은 항체의 Asn297에 대한 결합을 나타내고;
    L(PEG)는 -(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH-를 나타내고, 여기서 우측 말단의 아미노기는 아미드 결합을 통해 N297 글리칸에 있는 β-Man의 1-6 분지쇄에 있는 비환원성 말단의 시알산의 2-위치에서 카복실산에 결합하고;
    별표는 링커 L에 대한 결합을 나타내고;
    n5는 2 내지 10의 정수를 나타내고,

    상기 식에서,
    물결선은 항체의 Asn297에 대한 결합을 나타내고;
    L(PEG)는 -(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH-를 나타내고, 여기서 우측 말단의 아미노기는 아미드 결합을 통해 N297 글리칸에 있는 β-Man의 1-3 및 1-6 분지쇄 각각에 있는 비환원성 말단의 시알산의 2-위치에서 카복실산에 결합하고;
    별표는 링커 L에 대한 결합을 나타내고;
    n5는 2 내지 10의 정수를 나타낸다.
  45. 제44항에 있어서,
    n5는 2 내지 5의 정수인 항체-약물 접합체.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,
    m2는 1 또는 2의 정수를 나타내고;
    L은 다음의 군으로부터 선택되고:
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)- ("GGVA"는 서열번호: 85로 개시됨),
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
    -Z1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(=O)- ("GGVCit"는 서열번호: 88로 개시됨),
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)- 및
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
    여기서 B는 1,4-페닐기이고, Z1은 다음의 구조식을 나타내고:

    Z1에 대한 구조식에서,
    각각의 별표는 Z1에 인접한 C(=O)에 대한 결합을 나타내고, 각각의 물결선은 Ab의 N297 글리칸에 대한 결합을 나타내고;
    Ab는 IgG 항체를 나타내고;
    Ab의 N297 글리칸은 N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2, 및 이들의 혼합물, 및 N297-(Fuc)SG 중 어느 하나를 나타내고, N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 및 N297-(Fuc)SG는 다음의 식으로 표시되는 구조를 갖고:
    ,
    또는

    상기 식에서,
    각각의 물결선은 항체의 Asn297에 대한 결합을 나타내고,
    N297 글리칸에 있는 L(PEG)는 -NH-CH2CH2-(O-CH2CH2)n5-*를 나타내고, 여기서 n5는 2 내지 5의 정수를 나타내고, 좌측의 아미노기는 아미드 결합을 통해 N297 글리칸에 있는 β-Man의 1-3 및 1-6 분지쇄 중 하나 또는 각각에 있는 비환원성 말단의 시알산의 2-위치에서 카복실산에 결합하고, 각각의 별표는 링커 L에 있는 Z1의 트리아졸 고리의 1- 또는 3-위치에서의 질소 원자에 대한 결합을 나타내는,
    항체-약물 접합체.
  47. 다음의 군으로부터 선택되는 항체-약물 접합체:
    ;
    ;
    ; 또는

    위에 나타낸 각각의 구조식에서,
    m2는 1 또는 2의 정수를 나타내고;
    Ab는 항-DLL3 IgG 항체 또는 항체의 기능적 단편을 나타내고;
    Ab의 N297 글리칸은 N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2, 및 이들의 혼합물, 및 N297-(Fuc)SG 중 어느 하나를 나타내고, N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 및 N297-(Fuc)SG는 다음의 식으로 표시되는 구조를 갖고:
    ,
    또는

    상기 식에서,
    각각의 물결선은 항체의 Asn297에 대한 결합을 나타내고,
    N297 글리칸에 있는 L(PEG)는 -NH-CH2CH2-(O-CH2CH2)3-*를 나타내고, 여기서 좌측 말단의 아미노기는 아미드 결합을 통해 N297 글리칸에 있는 β-Man의 1-3 및 1-6 분지쇄 중 하나 또는 각각에 있는 비환원성 말단의 시알산의 2-위치에서 카복실산에 결합하고, 각각의 별표는 상응하는 구조식에 있는 트리아졸 고리의 1- 또는 3-위치에서의 질소 원자에 대한 결합을 나타낸다.
  48. 제47항에 있어서,
    항체가 인간 IgG1 또는 이의 변이체, 인간 IgG2, 또는 인간 IgG4의 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체-약물 접합체.
  49. 제47항 또는 제48항에 있어서,
    항체가 서열번호: 42, 57 또는 58의 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체-약물 접합체.
  50. 제46항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서,
    항-DLL3 항체가 중쇄 면역글로불린 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 면역글로불린 가변 도메인 (VL)을 포함하고,
    (a) VH가 (i) 각각 서열번호: 3, 서열번호: 4 및 서열번호: 5;
    (ii) 각각 서열번호: 13, 서열번호: 14 및 서열번호: 15;
    (iii) 각각 서열번호: 23, 서열번호: 24 및 서열번호: 25; 및
    (iv) 각각 서열번호: 33, 서열번호: 34 및 서열번호: 35로 이루어진 군으로부터 선택된 VH-CDR1 서열, VH-CDR2 서열 및 VH-CDR3 서열을 포함하고/하거나
    (b) VL이 (i) 각각 서열번호: 8, 서열번호: 9 및 서열번호: 10;
    (ii) 각각 서열번호: 18, 서열번호: 19 및 서열번호: 20;
    (iii) 각각 서열번호: 28, 서열번호: 29 및 서열번호: 30; 및
    (iv) 각각 서열번호: 38, 서열번호: 39 및 서열번호: 40으로 이루어진 군으로부터 선택된 VL-CDR1 서열, VL-CDR2 서열 및 VL-CDR3 서열을 포함하는
    항체-약물 접합체.
  51. 제50항에 있어서,
    항-DLL3 항체가 중쇄 면역글로불린 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 면역글로불린 가변 도메인 (VL)을 포함하고, (a) VH-CDR1 서열, VH-CDR2 서열 및 VH-CDR3 서열을 포함하는 VH 및 (b) VL-CDR1 서열, VL-CDR2 서열 및 VL-CDR3 서열을 포함하는 VL의 조합은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체-약물 접합체:
    (i) (a) 각각 서열번호: 3, 서열번호: 4 및 서열번호: 5, 및 (b) 서열번호: 8, 서열번호: 9 및 서열번호: 10;
    (ii) (a) 각각 서열번호: 13, 서열번호: 14 및 서열번호: 15, 및 (b) 서열번호: 18, 서열번호: 19 및 서열번호: 20;
    (iii) (a) 각각 서열번호: 23, 서열번호: 24 및 서열번호: 25, 및 (b) 서열번호: 28, 서열번호: 29 및 서열번호: 30; 및
    (iv) (a) 각각 서열번호: 33, 서열번호: 34 및 서열번호: 35, 및 (b) 서열번호: 38, 서열번호: 39 및 서열번호: 40.
  52. 제47항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 다음의 조합 (1) 내지 (4)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 조합으로 경쇄 및 중쇄를 포함하는 항체, 또는 항체의 기능적 단편인 항체-약물 접합체:
    (1) 서열번호: 7의 가변 도메인 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호: 2의 가변 도메인 서열을 포함하는 중쇄,
    (2) 서열번호: 17의 가변 도메인 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호: 12의 가변 도메인 서열을 포함하는 중쇄,
    (3) 서열번호: 27의 가변 도메인 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호: 22의 가변 도메인 서열을 포함하는 중쇄, 및
    서열번호: 37의 가변 도메인 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호: 32의 가변 도메인 서열을 포함하는 중쇄.
  53. 제52항에 있어서,
    항체가 서열번호: 17의 가변 도메인 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호: 12의 가변 도메인 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체인 항체-약물 접합체.
  54. 제52항에 있어서,
    항체가 서열번호: 27의 가변 도메인 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호: 22의 가변 도메인 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체인 항체-약물 접합체.
  55. 제52항에 있어서,
    항체가 서열번호: 37의 가변 도메인 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호: 32의 가변 도메인 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체인 항체-약물 접합체.
  56. 52항에 있어서,
    항체가 서열번호: 7의 가변 도메인 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호: 2의 가변 도메인 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체인 항체-약물 접합체.
  57. 제47항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 다음을 포함하는 항체-약물 접합체:
    (a) 서열번호: 59 내지 61 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호: 62의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
    (b) 서열번호: 63 내지 65 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호: 66의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 또는
    (c) 서열번호: 67 내지 69 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호: 70의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
  58. 제47항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 다음을 포함하는 항체-약물 접합체:
    (a) 서열번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호: 62의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;
    (b) 서열번호: 65의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호: 66의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 또는
    (c) 서열번호: 69의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호: 70의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
  59. 제47항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서,
    중쇄 또는 경쇄가 N-결합 글리코실화, O-결합 글리코실화, N-말단 가공, C-말단 가공, 탈아미드화, 아스파르트산의 이성질체화, 메티오닌의 산화, N-말단에의 메티오닌 잔기의 추가, 프롤린 잔기의 아미드화, 중쇄의 위치 234 및 235 (EU 넘버링)에서의 2개의 류신(L) 잔기의 알라닌(A)으로의 치환 (LALA), 중쇄의 위치 356의 아미노산 잔기 Glu(E) 및 위치 358 (EU 인덱스에 따름)의 아미노산 잔기 Met(M)의 집합, 중쇄의 위치 356의 Asp(D) 및 위치 358 (EU 인덱스에 따름)의 류신(L)의 집합 또는 이들의 임의의 조합, N-말단 글루타민 또는 N-말단 글루탐산의 피로글루탐산으로의 전환, 및 카복실 말단에서의 1개 또는 2개의 아미노산의 제거로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 또는 2개 이상의 변형 또는 아미노산 잔기의 집합을 갖는 항체-약물 접합체.
  60. 다음의 식으로 표시되는 항체-약물 접합체:

    상기 식에서,
    m2는 1 또는 2의 정수를 나타내고;
    Ab는 서열번호: 61의 아미노산 서열의 중쇄 및 서열번호: 62의 아미노산 서열의 경쇄를 포함하는 항-DLL3 IgG 항체를 나타내고;
    Ab의 N297 글리칸은 N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2, 및 이들의 혼합물, 및 N297-(Fuc)SG 중 어느 하나를 나타내고, N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 및 N297-(Fuc)SG는 다음의 식으로 표시되는 구조를 갖고:
    ,
    또는

    상기 식에서,
    각각의 물결선은 항체의 Asn297에 대한 결합을 나타내고,
    N297 글리칸에 있는 L(PEG)는 -NH-CH2CH2-(O-CH2CH2)3-*를 나타내고, 여기서 좌측 말단의 아미노기는 아미드 결합을 통해 N297 글리칸에 있는 β-Man의 1-3 및 1-6 분지쇄 중 하나 또는 각각에 있는 비환원성 말단의 시알산의 2-위치에서 카복실산에 결합하고, 각각의 별표는 상응하는 구조식에 있는 트리아졸 고리의 1- 또는 3-위치에서의 질소 원자에 대한 결합을 나타낸다.
  61. 다음의 식으로 표시되는 항체-약물 접합체:

    상기 식에서,
    m2는 1 또는 2의 정수를 나타내고;
    Ab는 서열번호: 65의 아미노산 서열의 중쇄 및 서열번호: 66의 아미노산 서열의 경쇄를 포함하는 항-DLL3 IgG 항체를 나타내고;
    Ab의 N297 글리칸은 N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2, 및 이들의 혼합물, 및 N297-(Fuc)SG 중 어느 하나를 나타내고, N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 및 N297-(Fuc)SG는 다음의 식으로 표시되는 구조를 갖고:
    ,
    또는

    상기 식에서,
    각각의 물결선은 항체의 Asn297에 대한 결합을 나타내고,
    N297 글리칸에 있는 L(PEG)는 -NH-CH2CH2-(O-CH2CH2)3-*를 나타내고, 여기서 좌측 말단의 아미노기는 아미드 결합을 통해 N297 글리칸에 있는 β-Man의 1-3 및 1-6 분지쇄 중 하나 또는 각각에 있는 비환원성 말단의 시알산의 2-위치에서 카복실산에 결합하고, 각각의 별표는 상응하는 구조식에 있는 트리아졸 고리의 1- 또는 3-위치에서의 질소 원자에 대한 결합을 나타낸다.
  62. 다음의 식으로 표시되는 항체-약물 접합체:

    상기 식에서,
    m2는 1 또는 2의 정수를 나타내고;
    Ab는 서열번호: 69의 아미노산 서열의 중쇄 및 서열번호: 70의 아미노산 서열의 경쇄를 포함하는 항-DLL3 IgG 항체를 나타내고;
    Ab의 N297 글리칸은 N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2, 및 이들의 혼합물, 및 N297-(Fuc)SG 중 어느 하나를 나타내고, N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 및 N297-(Fuc)SG는 다음의 식으로 표시되는 구조를 갖고:
    ,
    또는

    상기 식에서,
    각각의 물결선은 항체의 Asn297에 대한 결합을 나타내고,
    N297 글리칸에 있는 L(PEG)는 -NH-CH2CH2-(O-CH2CH2)3-*를 나타내고, 여기서 좌측 말단의 아미노기는 아미드 결합을 통해 N297 글리칸에 있는 β-Man의 1-3 및 1-6 분지쇄 중 하나 또는 각각에 있는 비환원성 말단의 시알산의 2-위치에서 카복실산에 결합하고, 각각의 별표는 상응하는 구조식에 있는 트리아졸 고리의 1- 또는 3-위치에서의 질소 원자에 대한 결합을 나타낸다.
  63. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 따른 항체-약물 접합체, 이의 염, 또는 접합체 또는 염의 수화물을 포함하는 약학적 조성물.
  64. 제63항에 있어서,
    항종양 약물인 약학적 조성물.
  65. 제63항 또는 제64항에 있어서,
    DLL3을 발현하는 종양을 치료하는 데 사용하기 위한 약학적 조성물.
  66. 제64항 또는 제65항에 있어서,
    종양이 소세포 폐암 (SCLC), 대세포 신경내분비암종 (LCNEC), 신장, 비뇨생식관 (방광, 전립선, 난소, 자궁경부 및 자궁내막), 위장관 (위, 결장), 갑상선 (갑상선 수질암), 췌장 및 폐를 포함한 다양한 조직의 신경내분비종양, 신경아교종 또는 유사 신경내분비종양 (pNET)인 약학적 조성물.
  67. 글리칸-변형 항체를 제조하는 방법으로서,
    i) 항-DLL3 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하고 얻어진 배양물로부터 표적 항체를 수집하는 단계;
    ii) 단계 i)에서 얻은 항체를 가수분해효소로 처리하여 (Fucα1,6)GlcNAc-항체를 제조하는 단계; 및
    iii)-1 글리칸 공여 분자와 (Fucα1,6)GlcNAc-항체를 트랜스글리코시다제의 존재 하에 반응시키는 단계로서, 글리칸 공여 분자는 아자이드기를 갖는 PEG 링커를 MSG(9) 또는 SG(10)에 있는 시알산의 2-위치에 있는 카복실산의 카보닐기에 도입하고 환원 말단을 옥사졸린화하여 얻은 것인, 단계 또는
    iii)-2 (Fucα1,6)GlcNAc-항체와 글리칸 공여 분자를 트랜스글리코시다제의 존재 하에 반응시키는 단계로서, 글리칸 공여 분자는 아자이드기를 갖는 PEG 링커를 α-아미노기가 임의로 보호된 (MSG-)Asn 또는 (SG-)Asn에 있는 시알산의 2-위치에 있는 카복실산의 카보닐기 및 Asn에 있는 카복실산의 카보닐기에 도입하여 가수분해효소의 작용을 유발한 후, 환원 말단을 옥사졸린화하여 얻은 것인, 단계 또는
    iii)-3 (Fucα1,6)GlcNAc-항체와 글리칸 공여 분자를 2개의 글리코실트랜스퍼라제의 존재 하에 반응시키는 단계로서, 글리칸 공여 분자는 시알산에 도입된 아자이드기를 갖는 (SG-)Asn 또는 (MSG-)Asn인 것인, 단계
    를 포함하는 방법.
  68. 제67항에 있어서,
    단계 ii)의 반응 용액을 하이드록시아파타이트 컬럼으로 정제하여 (Fucα1,6)GlcNAc-항체를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  69. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 따른 항체-약물 접합체 형태를 제조하는 방법으로서,
    i) 제56항 또는 제57항에 따른 방법을 사용하여 글리칸-변형 항체를 제조하는 단계; 및
    ii) DBCO를 갖는 약물-링커와 단계 i)에서 제조된 글리칸-변형 항체의 글리칸에 있는 아자이드기를 반응시키는 단계
    를 포함하는 방법.
  70. 제67항 또는 제68항에 따른 방법을 사용하여 얻은 글리칸-변형 항체.
  71. 제69항에 따른 방법을 사용하여 얻은 항체-약물 접합체.
  72. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 따른 항체-약물 접합체, 항체-약물 접합체의 염, 또는 항체-약물 접합체 또는 염의 수화물을 종양을 가진 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 종양을 치료하는 방법.
  73. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 따른 항체-약물 접합체, 이의 염, 및 접합체 또는 염의 수화물로부터 선택되는 적어도 하나의 성분을 포함하는 약학적 조성물, 및 적어도 하나의 항종양 약물을 동시에, 개별적으로, 또는 연속적으로 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 종양을 치료하는 방법.
  74. 제72항 또는 제73항에 있어서,
    종양이 DLL3을 발현하는 종양인 방법.
  75. 제72항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서,
    종양이 소세포 폐암 (SCLC), 대세포 신경내분비암종 (LCNEC), 신장, 비뇨생식관 (방광, 전립선, 난소, 자궁경부 및 자궁내막), 위장관 (위, 결장), 갑상선 (갑상선 수질암), 췌장 및 폐를 포함한 다양한 조직의 신경내분비종양, 신경아교종 또는 유사 신경내분비종양 (pNET)인 것인, 방법.
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