ES2227512T3 - Produccion de anticuerpos contra auto-antigenos a partir de repertorios de segmentos de anticuerpos fijados en un fago. - Google Patents

Abstract

SE HAN DESCUBIERTOS METODOS PARA LA PRODUCCION DE ANTI-AUTO ANTICUERPOS Y FRAGMENTOS DE ANTICUERPOS QUE SON ANTICUERPOS O FRAGMENTOS DE UNA ESPECIE PARTICULAR DE UN MAMIFERO QUE SE UNEN A LOS AUTOANTIGENOS PARA ESA ESPECIE. LOS METODOS COMPRENDEN EL SUMINISTRO DE UNA BIBLIOTECA DE PAQUETES DE REPRESENTACION GENETICA REPLICABLES (RGDPS), CADA UNO DE LOS CUALES MUESTRA EN SU SUPERFICIE UN MIEMBRO DE UN PAR DE UNION ESPECIFICA QUE ES UN ANTICUERPO O UN FRAGMENTO DE ANTICUERPO Y CADA UNO DE LOS RGDP CONTIENE UNA SECUENCIA DE ACIDO NUCLEICO DERIVADA DE UNA ESPECIE DE MAMIFERO. LA SECUENCIA DE ACIDO NUCLEICO EN CADA RGDP CODIFICA UNA CADENA DE POLIPEPTIDO QUE ES UNA PARTE COMPONENTE DEL MIEMBRO SBP MOSTRADO EN LA SUPERFICIE DE ESE RGDP. LOS FRAGMENTOS DE ANTI-AUTO ANTICUERPO SE SELECCIONAN MEDIANTE SU UNION CON UN AUTO ANTIGENO DE LA MENCIONADA ESPECIE DEL MAMIFERO. LOS FRAGMENTOS DE ANTICUERPOS MOSTRADOS PUEDEN SER SCFV, FD, FAB O CUALQUIER OTRO FRAGMENTO QUE TENGA LA CAPACIDAD DE UNIRSE AL ANTIGENO. LAS BIBLIOTECAS DE ACIDO NUCLEICO UTILIZADAS PUEDEN DERIVARSE DE SECUENCIAS DEL GEN V RECLASIFICADAS DE UN MAMIFERO INMUNIZADO. LAS BIBLIOTECAS SINTETICAS O ARTIFICIALES SON DESCRITAS Y MOSTRADAS PARA QUE SEAN UTILES.

Description

Producción de anticuerpos contra auto-antígenos a partir de repertorios de segmentos de anticuerpos fijados en un fago.

La presente invención hace referencia al aislamiento de moléculas de anticuerpo dirigidas contra auto-antígenos, en particular anticuerpos humanos dirigidos contra auto-antígenos humanos. La tecnología de la expresión en fagos para la selección de moléculas de anticuerpo se encuentra descrita en la patente internacional WO92/01047 y las patentes inglesas PCT/GB92/01755 y GB9206372.6. Los aquí solicitantes, comprendieron que los anticuerpos dirigidos contra auto-antígenos pueden aislarse mediante la tecnología del expresión en fagos.

Los anticuerpos anti-auto-antígenos humanos son de especial interés para el diagnóstico y la terapia in vivo, ya que pueden evitar problemas derivados de la antigenicidad provocada por anticuerpos foráneos, p.ej., los anticuerpos de ratón. Los anticuerpos humanos que resultan más adecuados en la terapia son aquellos dirigidos contra moléculas de la superficie celular, como son receptores, adhesinas e integrinas, y aquellos dirigidos contra moléculas circulantes de efecto biológico, como hormonas, factores de crecimiento y citocinas. La obtención de anticuerpos humanos contra auto-antígenos es extremadamente dificultosa. La presente invención proporciona procedimiento potente para la obtención de tales anticuerpos.

Por ello, se necesitan procedimientos para aislar los fragmentos de anticuerpo con especificidad auto-antigénica. Los animales, normalmente, no producen anticuerpos contra auto-antígenos, un fenómeno denominado tolerancia (G.J. Nossal Science 245 147-153, 1989). Las enfermedades autoinmunes son el resultado del fallo de dicha tolerancia. En general, la vacunación con un auto-antígeno no resulta en la producción de anticuerpos circulantes. Por tanto, es difícil obtener anticuerpos a partir de auto-antígenos, particularmente en humanos. Es posible producir anticuerpos que reconozcan antígenos humanos en un animal como el ratón, especialmente si el antígeno humano no está estrechamente relacionado con algún equivalente en el animal. Si se requiere un anticuerpo humano es necesario "humanizar" el anticuerpo p.ej., mediante injerto de una CDR (patente GB2 188638B).

La tecnología de anticuerpos de fagos, tal como se describe en la patente internacional WO92/01047 ofrece la capacidad de aislar anticuerpos humanos de manera directa. En esta solicitud, nosotros demostramos por primera vez que es posible aislar anticuerpos contra auto-antígenos a partir de librerías de fago derivadas, por ejemplo, de fuentes no-inmunizadas y de librerías preparadas por recombinación sintética de secuencias del gen V, preferentemente por recombinación de las secuencias de VH con, DH, y JH, y VL con JL. Estos anticuerpos son específicos para su antígeno. Esta solicitud muestra que librerías únicas derivadas de esta manera pueden actuar tanto como fuente de antígenos foráneos o como auto-antígenos y abre la posibilidad de utilizar una librería universal extensa para aislar anticuerpos de cualquier posible antígeno.

En la solicitud de la patente internacional WO92/01047 se describía que los fragmentos de anticuerpo pueden expresarse en la superficie de un bacteriófago y de este modo unirse a un antígeno. Los fragmentos de anticuerpo pueden seleccionarse directamente mediante dicha característica. La capacidad de aislar fragmentos de anticuerpos (Fab, Fv, scFv y VH) mediante su expresión en la superficie de bacteriófagos filamentosos ha abierto de nuevo la posibilidad de aislar anticuerpos específicos (es decir, anticuerpos dirigidos contra un antígeno particular), algo que hasta ahora era difícil o imposible. En la patente internacional WO92/01047 se demostró que podían aislarse anticuerpos específicos de un humano que no había sido inmunizado específicamente ("no-inmunizado"), incluso especificidades para antígenos como la 2-fenil-5-oxazolona, a los cuales, los humanos no estamos normalmente expuestos.

En realizaciones de la presente invención, repertorios de anticuerpos naturales o sintéticos derivados de secuencias humanas se expresan en la superficie de bacteriófagos filamentosos, referidos aquí como un paquete de expresión genética replicable (rgdp, del inglés replicable genetic display package) y su especificidad de unión se selecciona mediante la unión al auto-antígeno. En este proceso, los repertorios del gen V se derivan de genes V reordenados in vitro o in vivo y/o mediante mutación de (un) gene(s) V reordenado(s). Una característica clave de los repertorios del gen V es que son extremadamente diversos en su secuencia, generalmente excediendo los 10^{6} miembros diferentes. Por tanto, es posible que una librería suficientemente grande, proporcione una fuente de especificidades dirigidas contra cualquier auto-antígeno. Los repertorios del gen V están clonados en un fago filamentoso (rgdp) por lo que los repertorios de anticuerpos se expresan en la superficie del rgdp. Los rgdps codifican especificidades de anticuerpos raros que se unen a un anti-auto-antígeno, pueden seleccionarse en virtud de su unión a un auto- antígeno. Los repertorios de anticuerpos pueden clonarse en un formato de replicón único o en un replicón dual tal como se describe en la patente internacional WO92/01047 y la patente PCT/GB92/00883.

Los genes V pueden clonarse en el material genético del rgdp y expresarse como dominios simples, por ejemplo dominios simples variables de cadena pesada, también denominados dominios ligando simples o "dAbs" (véase la patente internacional WO90/01544) o dominios variables de cadena pesada y ligera de anticuerpos asociados.

Los dos dominios pueden expresarse como cadenas polipeptídicas separadas (unidas como en los fragmentos Fab a través de asociaciones no-covalentes de los dominios y/o enlaces disulfuro), o como parte de la misma cadena (fragmentos Fv de cadena simple donde los dos dominios están contenidos en la misma cadena polipeptídica).

En la patente internacional WO92/01047 y en los ejemplos 1 al 8 de esta solicitud hemos utilizado fusiones de fragmentos de anticuerpos a la proteína del gen 3 del bacteriófago filamentosos para expresar y seleccionar los fragmentos de anticuerpos. Un enfoque alternativo podría ser unir fragmentos del anticuerpo con de la proteína del gen 8 u otras moléculas de superficie del bacteriófago filamentoso.

Son necesarios procedimientos para aislar anticuerpos humanos dirigidos contra antígenos humanos. Existe un número limitado de antígenos humanos para quienes existan anticuerpos humanos circulantes naturales que se les unan. Normalmente, los anticuerpos no están dirigidos contra los propios antígenos de origen humano. Aunque, gracias a la tecnología ha sido posible aislar anticuerpos dirigidos contra el grupo sanguíneo humano B a partir de una librería de fagos (librería de expresión en fagos) preparada a partir de individuos del grupo sanguíneo O (J.D. Marks y col., J. Mol. Biol. 222 581-597, 1991), que reconoce el grupo sanguíneo B como un antígeno extraño.

La presente invención se refiere a un procedimiento general de aislamiento de anticuerpos dirigidos contra auto-antígenos que son específicos para el antígeno en cuestión. Muchos pacientes muestran concentraciones significativas de auto-anticuerpos circulantes. En individuos normales sanos, se estima que entre el 10 y el 30 % de los linfocitos B están ocupados en producir auto-anticuerpos (I.R. Cohen y A. Cooke Inmunol. Today 7 363-364, 1986). Sin embargo los "auto-anticuerpos naturales" producidos no tienen por sí mismos un uso terapéutico pues son frecuentemente IgM, con baja afinidad y polireactivos (P. Casali y A.L. Notkins Ann. Rev. Inmunol. 7 515-531, 1989; S. Avrameas Inmunol. Today 12 154-159). Puede producirse una respuesta inmune contra el propio organismo en una enfermedad autoinmune o tras una infección. Así, por ejemplo, se han aislado unos pocos anticuerpos monoclonales dirigidos contra auto-antígenos de pacientes con enfermedades autoinmunes (K. James & G.T.J.Immunol. Methods 100 5-40, 1987). Estos auto-anticuerpos son específicos frecuentemente, con lo que a veces sólo pueden unirse a un grupo limitado de epitopos en el antígeno (M. Bouanani et al Arthritis Rheum. 34 1585-1593, 1991).

La preparación de librerías del gen V de mRNA de células plasmáticas que secretan anticuerpos IgG (o IgM) puede conducir al aislamiento de fragmentos de anticuerpos derivados de auto-anticuerpos. Los anticuerpos anti-auto-antígenos pueden aislarse de pacientes con enfermedades autoinmunes, por ejemplo en el caso de los anticuerpos anti-receptor de la acetilcolina se aislarían de repertorios de anticuerpos generados a partir de mRNA de IgG de pacientes con myasthenia gravis. Un fragmento específico de un anticuerpo para la peroxidasa tiroidea humana se ha sido aislado de una librería del bacteriófago lambda obtenida de un paciente con enfermedad auto-inmune tiroidea (S. Portolano et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 179 372-377, 1991). Ello precisó un rastreo extenso de unas 200.000 calvas para obtener un clon. Además, esta librería se derivaba de tejido tiroideo mediante un procedimiento de difícil aplicación en muchos casos.

En cambio, el poder de selección disponible mediante el sistema de expresión en fagos, demostrado en la patente internacional WO92/01047, permite el aislamiento fácil de auto-anticuerpos a partir del mRNA de IgM de linfocitos de sangre periférica de un donante sin enfermedad. Nosotros mostramos en el ejemplo 2 que la unión de auto-anticuerpos a la tiroglobulina humana (que puede encontrarse en el suero de personas con o sin enfermedad auto-inmune sintomática), puede aislarse de repertorios de fagos preparados a partir de humanos no inmunizados. Ello no significa que seamos capaces de obtener anticuerpos para la tiroglobulina humana mediante inmunización de humanos con tiroglobulina humana, a pesar de que se han detectado auto-anticuerpos contra la tiroglobulina en mucha gente. Se ha descrito que los auto-anticuerpos contra la tiroglobulina humana presentan a menudo un alto grado de reactividad en el suero (S.Avrameas, 1991 supra). En cambio, aquellos que se han aislado mediante un procedimiento de acuerdo con la presente invención, implicando la tecnología de la expresión en fagos, véase por ejemplo el ejemplo 2, son específicos para la tiroglobulina.

En la presente solicitud, nosotros también demostramos que incluso pueden aislarse anticuerpos contra el factor de necrosis tumoral humana-\alpha, tal como se describe en el ejemplo 1, de la misma librería que los anticuerpos dirigidos contra la tiroglobulina. Muchos auto-antígenos no tienen auto-anticuerpos circulantes asociados detectables. En el ejemplo 3, se muestra el aislamiento de anticuerpos contra auto-antígenos como la mucina, el antígeno carcinoembrionario (CEA) y el CD4, anticuerpos que no se habían descrito en el suero normal. Además, estos anticuerpos son específicos, aunque en los autoanticuerpos naturales existe frecuentemente un alto grado de polireactividad que puede ser a veces detectable. La amplia mayoría de los auto-antígenos no tienen auto-anticuerpos circulantes asociados detectables. Por tanto, el aislamiento de los anticuerpos anti-auto-antígenos, tal como se describe en esta invención, abre la posibilidad de aislar directamente anticuerpos humanos unidos a antígenos humanos para diversos propósitos, tales como anticuerpos que se unan a hormonas circulantes para bloquear, modificar o potenciar su acción, o anticuerpos que se unan a antígenos de superficie celular para marcar o eliminar, por ejemplo, células cancerosas.

El origen de los genes V que contribuyen al aislamiento de anticuerpos anti-auto-antígenos aislados de las librerías de expresión en fagos no es todavía evidente. La tolerancia a los propios antígenos del sistema inmune (evitando la generación de anticuerpos dirigidos contra auto-antígenos) está potenciada por la deleción clonal o por la inactivación funcional (anergia) de los linfocitos B autoreactivos (D.A. Nemazee & K. Burki Nature 337 562-566, 1989; C.C. Goodnow et al Nature 334 676-682, 1988; S.B. Hartley et al Nature 353 765-769, 1991; D.M. Russel et al Nature 354 308-311, 1991). En ambos casos, se detecta un escaso número de anticuerpos anti-auto-antígenos circulantes para la mayoría de los antígenos. Sin embargo, en el caso de la anergia, persisten células auto-reactivas del linage B y funcionalmente inactivadas en los órganos linfoides periféricos, de donde estas células B se introducen en la circulación. Estas células que son linfocitos raros con una especificidad anti-auto pueden proporcionar las parejas de cadena pesada o ligera (o ambas) para la los anticuerpos de fagos con especificidades anti-auto. De forma alternativa, estas especificidades anti-auto pueden producirse mediante combinación en la librería de un dominio VH con un dominio VL para dar una especificidad que normalmente se deleciona si ocurre en la naturaleza. Por esta razón, las librerías combinatorias y las librerías "de barajamiento de cadenas" como las descritas en la solicitud de patente internacional WO92/01047 pueden ser una fuente particularmente rica de anticuerpos anti-auto-antígenos. Un procedimiento de selección potente, como la expresión de anticuerpos en fagos, es necesario para la obtención de estos anticuerpos anti-auto-antígenos raros.

En esta solicitud, el grado de mutación somática observado en los fragmentos de anticuerpos-anti-auto-antígenos aislados por la tecnología de la expresión en fagos, indica que algunos tienen secuencias de línea germinal y provienen en consecuencia de células B vírgenes. Otros anticuerpos aislados mediante la tecnología de expresión en fagos, presentaban hipermutación somática, indicando que los genes V habían sido estimulados por el antígeno bien mediante reacción cruzada con un antígeno reactivo extraño o por otros antígenos extraños. En ambos casos, los fragmentos de anticuerpo aislados mediante la tecnología de fagos serán generalmente una combinación de dominios VH y VL, no originalmente presentes en los linfocitos B. Por lo que, tal como se describe en esta solicitud, se necesita la tecnología potente y robusta de la expresión en fagos para poder proceder a su aislamiento.

Según la presente invención, se proporciona un procedimiento de obtención de un miembro de una pareja de unión específica (miembro sbp), en donde el miembro sbp es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo y tiene un sitio de unión al antígeno especificidad de unión para un antígeno, el cual es un auto-antígeno humano para el que no existen anticuerpos específicos en el suero de humanos no-inmunizados con el antígeno. Dicho procedimiento comprende:

(a)

proporcionar una librería de fagos filamentosos, en donde cada bacteriófago filamentoso exprese un miembro sbp en su superficie, y cada bacteriófago filamentoso contenga una secuencia de ácidos nucleicos con la secuencia derivada de un humano no-inmunizado con un auto-antígeno determinado, no existiendo enfermedad auto-inmune contra el determinado auto-antígeno y no habiendo anticuerpos específicos para el determinado auto-antígeno hallado en el suero; y en donde la mencionada secuencia de ácidos nucleicos codifica una cadena polipeptídica que es un componente del miembro sbp expresado en la superficie del mencionado bacteriófago filamentoso;

(b)

seleccionar, por unión a un auto-antígeno determinado, uno o más miembros sbp con especificidad de unión por el auto-antígeno determinado.

El componente polipeptídico codificado por el ácido nucleico en cada bacteriófago filamentoso (rgdp) puede ser un dominio VH o VL de anticuerpo, o cualquier fragmento de anticuerpo que, solo o en combinación con uno o más componentes diferentes, forme un fragmento de anticuerpo capaz de unirse al antígeno. Como ejemplos de cadenas de polipéptidos que pueden utilizarse como componentes de un miembro sbp se incluyen las que se describen más arriba, V_{L}C_{L}, V_{H}C_{H}I, fragmentos scFv, fragmentos Fab y similares, además de los dominios VH y VL,.

Cada miembro sbp, expresado en la superficie de un rgdp, puede ser un fragmento de anticuerpo que comprenda un dominio V_{H} y un dominio V_{L}.

Cada fragmentos de anticuerpo puede ser un fragmento scFv, un fragmentos Fab, un fragmentos Fv consistente en un dominio V_{L} y uno V_{H} de un brazo simple de anticuerpo, un dominio simple de unión al ligando consistente esencialmente en el dominio variable de una cadena pesada (Fd), o cualquier otro fragmento que se tenga la capacidad de unión al epitopo o al antígeno.

La etapa de proporcionar una librería de rgdps puede comprender:

combinar (i)un primer componente de cadena polipeptídica de un miembro sbp fusionado a un componente de un rgdp, que por ello expresa dicho primer componente de cadena polipeptídica o población de lo mismo en la superficie de rgdps de expresión en un organismo huésped recombinante, o una población de dicho primer componente de cadena polipeptídica unido a un componente determinado de un rgdp con (ii) un segundo componente de cadena polipeptídica de un miembro sbp o una población del mencionado segundo componente de cadena polipeptídica para formar una librería de miembros sbp expresados en la superficie de los rgdps;

al menos uno de dichos componentes de cadena polipeptídica, el primero o el segundo o poblaciones de lo mismo, están codificados por ácidos nucleicos capaces de ser empaquetados por el componente mencionado de un rgdp.

Etapa de obtención de la librería de rgdp que comprende:

expresar en un organismo huésped recombinante un primer componente de cadena polipeptídica de un miembro sbp o de una población de dicho primer componente de cadena polipeptídica, fusionado a un componente de un rgdp que por ello expresa dicho primer componente de cadena polipeptídica en la superficie de los rgdps;

combinar dicho primer componente de cadena polipeptídica o de una población de lo mismo con un segundo componente de cadena polipeptídica de un miembro sbp o una población de dicho segundo componente de cadena polipeptídica para formar una libraría de rgdps, en donde cada uno exprese un miembro sbp en su superficie; y al menos uno de dichos componentes polipeptídicos se exprese a partir de ácidos nucleicos capaces de ser empaquetados por el componente de un rgdp.

Si el miembro sbp es un fragmento Fab, el primer y segundo componente de cadena polipeptídica puede ser un polipéptido que comprenda un dominio V_{L} y un C_{L} y el segundo componente de cadena polipeptídica, un polipéptido que consista en un dominio V_{H} y un C_{H}l.

La combinación del primer y segundo componente de cadena polipeptídica o de poblaciones de lo mismo puede realizarse a nivel de ácido nucleico con vectores de expresión, teniendo cada uno introducido una secuencia codificante de un primer componente y una secuencia codificante de un segundo componente. Por otro lado, la combinación puede ser a nivel de polipéptido, si los primeros componentes no se expresan en los mismos vectores que los segundos componentes. En efecto, uno u otro, primer o segundo, deben proporcionarse como una librería soluble. Los detalles de varios formatos que pueden emplearse se describen en las patentes WO92/01047 y PCT/GB92/00883.

La etapa para proporcionar la librería comprende:

combinar (i) el ácido nucleico que codifica el primer componente de cadena polipeptídica a un miembro sbp fusionado con un componente de un rgdp o una población de dicho primer componente de cadena polipeptídica fusionado con un componente de rgdp, con (ii) el ácido nucleico codificante del segundo componente de cadena polipeptídica de un miembro sbp o una población de lo mismo, para formar una librería de ácidos nucleicos; en donde dicho ácido nucleico sea capaz de ser empaquetado por el componente de un rgdp;

expresar en un organismo huésped recombinante el primer componente de cadena polipeptídica fusionado con un componente de un rgdp o una población de lo mismo y un segundo componente de cadena polipeptídica de un miembro sbp o de una población de lo mismo para producir una librería de rgdps en donde cada uno exprese en su superficie un miembro sbp y contenga el ácido nucleico codificante de un primero y un segundo componente de cadena polipeptídica del miembro sbp expresado en su superficie.

Se recomienda a los lectores consultar la patente internacional WO92/01047, en particular, si se desea obtener más detalles de cualquier procedimiento que se describe aquí.

En otra realización de la presente invención, los dos, el primero y el segundo componente de cadena polipeptídica o poblaciones de lo mismo se expresan a partir de un ácido nucleico capaz de ser empaquetado por el componente de un rgdp. Ello puede ocurrir cuando los componentes juntos forman un fragmento Fab o, más frecuentemente, cuando cada miembro sbp exprese un fragmento scFv de anticuerpo.

En otra realización, cada segundo componente de cadena polipeptídica o la población de lo mismo puede expresarse a partir de un ácido nucleico separado del ácido nucleico del cual se expresa el primer polipéptido de cadena polipeptídica o población de lo mismo. El ácido nucleico codificante del primer componente de cadena polipeptídica puede hallarse en el mismo vector de expresión que el ácido nucleico codificante del segundo componente de cadena polipeptídica, pero separado de éste modo, por ejemplo, se producen los fragmentos Fab. De manera alternativa, el ácido nucleico codificante del primer componente de cadena polipeptídica puede estar en un vector de expresión distinto al ácido nucleico que codifica el segundo componente de cadena polipeptídica. Si un primer o segundo componente de cadena polipeptídica está codificado en el mismo vector de expresión, entonces se expresarán como fragmentos scFv, en donde un dominio VH estará unido a un dominio VL por un puente polipeptídico, de manera que el scFv será una sola cadena polipeptídica.

Cada miembro sbp expresado en la superficie de un rgdp en un fragmento Fab de anticuerpo.

El ácido nucleico puede proceder de p.ej. genes V reordenados de un humano no-immunizado. Es difícil obtener anticuerpos que reconozcan (es decir se unan unión específicamente) los auto-antígenos humanos.

El ácido nucleico puede proceder de una librería preparada por recombinación sintética o artificial de segmentos del gen V, que pueden ser secuencias del gen V de línea germinal. La librería, también, puede ser totalmente sintética.

Los miembros sbp seleccionados en (b) expresados en la superficie de rgdps pueden ser seleccionados o cribados para proporcionar un miembro sbp individual o una población mezclada de dichos miembros sbp asociados en sus respectivos rgdps con ácidos nucleicos codificantes de dichos miembros sbp o una cadena polipeptídica de lo mismo. Los fagos rgdp que expresan los miembros sbp seleccionados en (b) se pueden crecer para incrementar su número antes de la subsiguiente selección o cribado. El ácido nucleico que codifica un miembro sbp seleccionado o cribado y que se deriva de un rgdp que expresa en su superficie un miembro sbp seleccionado o cribado, puede utilizarse para expresar un miembro sbp o un fragmento derivado de lo mismo en un organismo huésped recombinante.

La presente invención abarca cualquier procedimiento de obtención de un ácido nucleico de uno o más rgdps seleccionados de una librería mediante unión con un auto-antígeno, en donde dicho DNA codificante se utiliza en otro procedimiento (de acuerdo o no con cualquier procedimiento de la presente invención) para obtener un miembro sbp individual o una población mezclada de miembros sbp, o un ácido nucleico codificante de lo mismo.

El producto final de expresión, un miembro sbp seleccionado, puede modificarse para producir un derivado de lo mismo.

La expresión del producto final o derivado de lo mismo puede utilizarse para preparar un medicamento terapéutico o profiláctico o un producto de diagnóstico.

La presente invención también comprende fragmentos de anticuerpos, derivados de los mismos, incluyendo anticuerpos completos y fusiones con enzimas, obtenidos mediante cualquier procedimiento descrito de acuerdo con la presente invención.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona la utilización en cualquier procedimiento según cualquier aplicación de la presente invención, de un equipo que comprende una librería de vectores que contienen un ácido nucleico con la capacidad de ser empaquetado en rgdps y que codifica un componente de cadena polipeptídica de un anticuerpo para su expresión en la superficie de los rgdps.

En la presente invención, también se proporciona la utilización, en cualquier procedimiento de cualquier aplicación de la invención aquí descrita, de un equipo que comprende una librería de rgdps, en donde cada uno contiene el ácido nucleico codificante de al menos uno de los componentes de cadena polipeptídica de un anticuerpo.

La presente invención proporcional generalmente un procedimiento para producir un paquete de expresión genética replicable (rgdps) o poblaciones de dichos rgdps, que comprende las etapas de:

(a) inserción de secuencias de nucleótidos codificantes de una molécula de unión que es un miembro de un para de unión específica y de un anticuerpo anti-auto-antígeno dentro de un genoma viral;

(b) cultivo del virus que contiene las mencionadas secuencias nucleotídicas conocidas para que las mencionadas moléculas de unión se expresen y presenten en la superficie del virus.

La presente invención también proporciona un procedimiento para seleccionar un rgdp específico para un epitopo auto-antigénico que comprende: la producción de una población de rgdps y la etapa adicional de selección de las moléculas por su capacidad de unión, es decir contactando la población de anticuerpos anti-auto-antígenos expresado en los rgdps con el epitopo determinado, de modo que el rgdp individual con la especificidad de unión deseada pueda unirse al epitopo determinado. El procedimiento puede comprender una o más etapas adicionales de: (i) separación de cualquier rgdps unido del epitopo; (ii) recuperación de rgdps separados e (iii) utilización de las secuencias nucleotídicas insertadas de cualquiera de los rgdps separados en un sistema recombinante para producir la molécula de unión separada del virus. En la etapa de selección se puede aislar la secuencia nucleotídica codificante de la molécula de unión de especificidad deseada, gracias a que dicha molécula de unión se expresa asociada a la superficie del virus en el que está contenido el ácido nucleico codificante.

La presente invención también proporciona un procedimiento de producción de un miembro multimérico de una pareja de unión específica (sbp), el cual es un anticuerpo anti-auto-antígeno, que comprende:

la expresión en un organismo huésped recombinante de una primera cadena polipeptídica de un miembro sbp o población genéticamente diversa de un miembro sbp fusionado con un componente de un paquete de expresión genética replicable (rgdp), por lo que dicho polipéptido se expresa en la superficie del rgdp; y la expresión en un organismo huésped recombinante de una segunda cadena polipeptídica de dicho multímero, causando o permitiendo que las cadenas polipeptídicas se unan para formar el multímero como parte del mencionado rgdp, y en donde al menos una de las cadenas polipeptídicas se expresa a partir de ácidos nucleicos capaces de ser empaquetados por el componente determinado, por lo que el material genético de cada rgdp codificará una cadena polipeptídica determinada.

Las dos cadenas mencionadas, primera y segunda, pueden expresarse en el mismo organismo huésped.

La primera y la segunda cadena de un multímero pueden expresarse como cadenas separadas a partir de un vector simple que contenga sus respectivos ácidos nucleicos.

Al menos una de las cadenas polipeptídicas (o componentes de cadenas polipeptídicas) pueden expresarse a partir de un vector fago.

Al menos una de las cadenas polipeptídicas puede ser expresada a partir de un vector fagémido, el procedimiento incluye la utilización de fagos auxiliares, o un plásmido que exprese los genes complementarios del fago, para ayudar al empaquetamiento de un genoma de fagémido y por tanto el componente del rgdp es la proteína de la cápside. Dicha proteína de la cápside, en el fago auxiliar, puede estar ausente, ser defectuosa o defectuosa condicional.

El procedimiento comprende la introducción de un vector capaz de expresar la primera cadena polipeptídica en el organismo huésped que exprese la segunda cadena polipeptídica en su forma libre, o la introducción de un vector capaz de expresar la segunda cadena polipeptídica en la forma libre en un organismo huésped que exprese la primera cadena polipeptídica.

Cada una cadenas polipeptídicas pueden expresarse a partir de los ácidos nucleicos capaces de ser empaquetados como un rgdp utilizando dicho componente de producto de fusión, por lo que se empaqueta el ácido nucleico codificante de ambas cadenas polipeptídicas en sus respectivos rgdps.

Las fusiones pueden expresarse en ausencia del componente presentador de rgdp, quizás la cápside, expresado en su forma salvaje.

La proteína de la cápside, en el fago auxiliar, puede estar ausente, ser defectuosa o defectuosa condicional.

La célula huésped puede ser una cepa mutante que introduce la diversidad genética en el ácido nucleico del miembro sbp.

El rgdp es un bacteriófago filamentosos, el huésped puede ser una bacteria, y el mencionado componente del rgdp una proteína de la cápside del bacteriófago. El fago puede seleccionarse a partir de los fagos de la clase I: fd, M13, f1, If1, Ike, ZJ/Z, Ff; y de los fagos de la clase II: Xf, Pf1 y Pf3. El fago puede ser fd o un derivado de fd. El derivado puede ser resistente a la tetraciclina. El miembro sbp o cadena polipeptídica puede expresarse como una fusión con la proteína de la cápside del gen III del fago fd o su equivalente en otro fago filamentoso. El miembro sbp o la cadena polipeptídica se inserta en una región N-terminal de la proteína de la cápside madura, cadena abajo de una secuencia señal de secreción para los péptidos. La secuencia se inserta después del aminoácido +1 de la proteína madura. El lugar de inserción puede estar flanqueado por secuencias cortas correspondientes a las secuencias flanqueantes en donde se ha de insertar cada uno de los ácidos nucleicos.

El huésped puede ser E.coli.

El ácido nucleico codificantes de un polipéptido de un miembro sbp pueden unirse cadena debajo de la secuencia de una proteína de la cápside viral mediante un codón de parada de traducción suprimible, por lo que en dichas condiciones, si el codón de parada se suprime, se producen proteínas de fusión que contienen el polipéptido miembro sbp y la proteína de la cápside viral, mientras que en condiciones no-supresoras, se producen las formas libres de los polipéptidos de miembros sbp.

Los sistemas de selección y los formatos de ensayo se discuten en otro lugar en este texto. En estos sistemas y formatos, la secuencia del gen codificante de la molécula de unión (p.ej. el anticuerpo) de la deseada especificidad se separa de una población general de rgdps con un rango de especificidades, por el hecho de su unión a una diana específica (p.ej., el antígeno o el epitopo). Por tanto los rgdps formados por la mencionada expresión pueden ser seleccionados o cribados para proporcionar un miembro individual sbp o una población mezclada, seleccionada de dichos miembros sbp asociados en sus respectivos rgdps con el ácido nucleico codificante del miembro sbp o una cadena polipeptídica de lo mismo. Los rgdps pueden seleccionarse por afinidad con un miembro complementario al miembro sbp determinado.

Cualquier rgdp unido a un segundo miembro puede recuperarse mediante lavados con un eluyente. Las condiciones de lavado pueden variar para obtener rgdps con diferentes afinidades de unión para un epitopo determinado. De manera alternativa, para obtener p.ej., rgdps de gran afinidad, el miembro complementario (p.ej., un epitopo) puede presentarse en la población de rgdps (p.e. pAbs) ya unido a un miembro de unión, en ese caso los pAbs con una gran afinidad por el epitopo desplazarán el miembro de unión ya unido. Por tanto, el eluyente puede contener una molécula que compite con dicho rgdp por la unión con el miembro sbp complementario. El rgdp puede aplicarse a un miembro sbp complementario en presencia de una molécula que compita con el paquete para unirse a un miembro sbp complementario. El ácido nucleico derivado de rgdp seleccionado o cribado puede usarse para expresar un miembro sbp determinado o un fragmento o derivado de lo mismo en un organismo huésped recombinante. El ácido nucleico de uno o más rgdps puede obtenerse y utilizarse para proporcionar el ácido nucleico codificante en un procedimiento adicional para obtener un miembro sbp individual, o una población mezclada de miembros sbp, o un ácido nucleico codificante de lo mismo. La expresión del producto final puede modificarse para producir un derivado de éste.

Una fuente preferente para la generación de librerías de humanos no-inmunizados es el mRNA de IgM. En el ejemplo 43 de la patente internacional WO9201047, se halló que los fragmentos de anticuerpos dirigidos contra la lisozima de huevo de pavo y la 2-fenil-5-oxazolona se aislaban más fácilmente a partir de una librería de fagos derivada de mRNA de IgM de donantes humanos no-inmunizados, que de una preparada a partir de mRNA de IgG. Además, no se pudieron aislar fragmentos de unión de anticuerpos contra la 2-fenil-5-oxazolona de una librería de 2.000.000 clones de anticuerpos de fagos preparados del mRNA de IgG de ratones no-inmunizados (T. Clackson et al, Nature 352 624-628. 1991). Los ejemplos 1 y 3 de esta solicitud muestran el aislamiento de anticuerpos específicos para auto-antígenos de una librería de IgM. Aunque, en estos ejemplos, se han seleccionado las especificidades anti-auto como fragmentos de cadena simple Fv en un formato de replicón simple, las especificidades de anticuerpos podrían seleccionarse como fragmentos Fab en un formato de replicón simple o un formato de replicón dual combinatorial (Hoogenboom y col., 1991 supra) por ejemplo mediante recombinación con el sistema loxP (PCT/GB92/00883).

Las librerías de fagos pueden prepararse enriquecidas en anticuerpos dirigidos contra auto-antígenos. Antes de la estimulación con el antígeno, los linfocitos B expresan IgM de superficie e IgD de superficie, pero poca IgM o IgD solubles. Estas células no estimuladas contienen probablemente genes de anticuerpos con especificidades anti-auto. Por el contrario, las células plasmáticas diferenciadas terminalmente, secretan anticuerpos solubles y expresan pocas inmunoglobulinas de superficie. La preparación del cDNA para preparaciones de librerías de fagos mediante cebadores específicos de IgM de superficie o IgD de superficie producirán un repertorio enriquecido en de genes de anticuerpos nativos no-seleccionados codificantes de los dominios V. En los linfocitos B, silenciados funcionalmente mediante exposición al auto-antígeno existe una gran reducción en los niveles de IgM de superficie, aunque los niveles de IgD de superficie permanecen invariables (C.C. Goodnow y col., supra). Así, un cebador específico para la IgD de superficie puede ser particularmente adecuado para el aislamiento de anticuerpos anti-auto-antígenos.

Sin embargo, tal como se demuestra en esta solicitud, el mRNA de IgM de linfocitos de sangre periférica no seleccionados es la fuente preferente de genes V para especificidades anti-auto. Otras fuentes de estos anticuerpos anti-auto-antígenos puede ser el mRNA fetal o mRNA de sangre de cordón (P.M. Lydyard y col., Scand J Inmunol 31 33-34, 1990).

Es posible generar repertorios fagos de expresión mediante la combinación original de los dominios de VH y VL mediante PCR y fusión de sus genes codificantes en las células que expresan estos dominios. El principio de la "PCR en la célula" en el que se mantiene el emparejamiento original VH/VL, se demuestra en la patente PCT/GB92/01483 y describe por Embleton y col., en Nucleic Acid Res., 20, 3831-3837, 1992. Esto puede ser particularmente útil si los linfocitos pueden seleccionarse en el estadio anterior a la deleción de los clones que expresan anticuerpos anti-auto-antígenos.

En una realización de la invención, pueden utilizarse las secuencias del gen V, o incluso librerías preparadas por recombinación sintética de los segmentos V, D y J. Estos actúan como fuente rica de anticuerpos anti-auto-antígenos. En los ejemplos 5 al 7, nosotros demostramos que pueden aislarse especificidades anti-auto contra el TNF, anticuerpo humano anti-rhesus D (OAK3) y la tiroglobulina humana de una librería de anticuerpos de fagos preparada mediante unión sintética de los segmentos V. D y J. El uso de los genes V de la línea germinal para este propósito, como se muestra en los ejemplos 5 al 7, debería ser válido para el aislamiento de anticuerpos anti-auto-antígenos ya que existen evidencias de que los linfocitos B dirigidos contra auto-antígenos solubles se silencian funcionalmente y se eliminan aquellos dirigidos contra auto-antígenos multivalentes unidos a la membrana (S.B. Hartley y col., supra; D.M. Russell y col., supra). Por tanto, el uso de librerías sintéticas generadas por recombinación in vitro de VH, DH, JH o VK, JK o VL, JL o su equivalente puede ser particularmente ventajoso para el aislamiento de anticuerpos dirigidos contra auto-antígenos multivalentes unidos a membrana.

En los ejemplos 5 al 7 hemos utilizado segmentos sintéticos de VH CDR3 que incorporan secuencias de bases al azar en la región de unión V-D-J y las unen con segmentos del gen VH de línea germinal. Se pueden utilizar otras estrategias como generar cada uno de los bucles de CDR de secuencia aleatoria o de estructuras canónicas (C. Chothia et al, Nature 342 877-893, 1989) e incorporar elementos de secuencia aleatoria. La naturaleza de la línea germinal de los segmentos V y J podría alterarse por incorporación de alteraciones específicas o aleatorias en la secuencia, o utilizando regiones del gen V mutadas somáticamente. La estrategia utilizada en los ejemplos 5 a 7 tiene la ventaja de que las estructuras en bucle de los segmentos del gen V forman únicamente un número limitado de plegamientos y combinaciones de plegamientos distintos (C. Chothia et al J. Mol. Biol. 227 779-8117, 1992), que se han presuntamente para una mayor estabilidad y para crear una distribución y un conjunto de sitios de unión bien ajustado para acoplarse con la estructura de los antígenos. Además, las regiones de entramado y los primeros bucles hipervariables de las cadenas pesada y ligera de anticuerpos humanos sintéticos son probablemente idénticos en muchos individuos distintos. Tales anticuerpos humanos sintéticos podrían ser menos inmunogénicos que las estructuras enteramente artificiales.

Una alternativa adicional aunque menos preferida que la anterior sobre la expresión en librerías de fagos naturales y sintéticos podría ser la generación de librerías de expresión en fagos generados mediante mutagénesis aleatoria, de una o unas pocas moléculas de anticuerpos humanos y la selección de sus especificidades anti-auto-antigénicas.

Selección

Los rgdps individuales que expresan la especificidad deseada para un antígeno, pueden ser aislados de una librería utilizando técnicas convencionales de cribado (p.ej., las descritas en Harlow, E. y Lane, D., 1988, supra Gherardi, E y col., 1990 J. Immunol. Meth. 126 p61-68).

Los solicitantes han ideado incluso técnicas de selección parcticables gracias a las propiedades únicas de los rgdps. El esbozo general de algunos procedimientos de cribaje se ilustra en la Figura 5 empleando pAbs como un ejemplo típico de rgdp.

La población/librería de los pABs a cribar podría crearse in vitro por mutagénesis de los anticuerpos pre-existentes de fagos (mediante técnicas bien conocidas en la materia, tal como mutagénesis dirigida con oligonucleótidos (Sambrook J., y col., 1989 Molecular Cloning a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press)), la recombinación artificial de segmentos V humanos, tal como se describe en otra parte. Esta población puede ser cribada en uno o más formatos descritos más adelante con referencia a la Figura 5, para derivar aquellos pAbs individuales cuyas propiedades de unión a los antígenos sean diferentes a las de la muestra c.

Elución de la unión

La Figura 5 (i) muestra el antígeno (ag) unido a una superficie sólida (s). La superficie sólida (s), puede ser una placa de Petri, bolas de cromatografía, bolas magnéticas y similares. La población/librería de pAbs se hace pasar a continuación por los ags, y aquellos individuos p que se unen, se recogen después del lavado, y opcionalmente se detectan con un sistema de detección. Se puede utilizar un sistema de detección basado en un antisuero anti-fd (véase p.ej., el Ejemplo 4 de la patente internacional WO92/01047). Si las muestras de la población unida, p, se recogen en condiciones de astringencia creciente, se incrementará la afinidad de unión representada en cada una de las muestras. Las condiciones de astringencia en aumento pueden obtenerse, por ejemplo, incrementando el tiempo de agitación o cambiando el pH de la solución en la que se sumerge, etc.

Competición

Con referencia a la figura 5(ii) el antígeno ag puede estar unido a un soporte sólido s y unirse hasta la saturación por la molécula de unión original c. Si una población de un mutante pAb (o un grupo de pAbs relacionados) se expone al complejo, solamente se unirán aquellos que tengan una mayor afinidad por el antígeno ag que c. En la mayoría de los ejemplos, sólo una minoría de la población c será desplazada por los individuos de la población p. Si c es una molécula tradicional de anticuerpo, todo el material unido se recogerá y se recuperará el p unido infectando en la bacteria adecuada y/o mediante el uso de técnicas estándares de PCR.

Una aplicación ventajosa se desprende si se utiliza el ag como receptor y el c como el ligando correspondiente. A continuación, la población recogida p, se relaciona estructuralmente con el lugar de unión del receptor y o ligando. A este tipo de especificidad se le asigna una gran utilidad en la industria farmacéutica.

Otra ventajosa aplicación se deriva si ag es un anticuerpo y c su antígeno. La población p unida recuperada es entonces un anticuerpo anti-idiotipo que tiene numerosas utilizaciones tanto en la investigación como en el diagnóstico para la industria farmacéutica.

Actualmente es difícil seleccionar directamente anticuerpos anti-idiotipo. Los pAbs podrían tener la capacidad de hacerlo directamente uniendo las librerías de pAb (p.ej., una librería nativa) a células B (que expresan anticuerpos en su superficie) y aislando aquellos fagos que se han unido correctamente.

En algunas ocasiones puede ser ventajoso preseleccionar la población p. Por ejemplo, en el caso del anti-idiotipo anterior, p puede estar absorbida por un anticuerpo relacionado que no se une al antígeno.

Sin embargo, si c es un pAb, c o p o los dos, pueden marcarse de manera que sean diferenciables y seleccionarse por el p unido sobre el c. Este marcaje puedo ser físico, por ejemplo, marcando p con una biotina; o mejor, genético. Por ejemplo, c puede marcarse con una diana de restricción EcoB, mientras que p puede marcarse con una diana de restricción EcoK (véase Carter, P y col., 1985, Nucl. Acids. Res. 13, 4431-4443). Cuando el p+c unido se eluye del antígeno y se utiliza para la infección de bacterias adecuadas, se produce una restricción (y por tanto no hay crecimiento) de la población c (es decir, las bacterias de restricción EcoB en este ejemplo). Cualquier fago que se cultive, podría ser enriquecido en aquellos individuos de p las mayores afinidades de unión. De manera alternativa, puede lograrse un marcaje genético marcando p con secuencias nuevas que pueden utilizarse de forma específica para amplificar p en una mezcla, utilizando la PCR.

Puesto que los pAbs unidos pueden amplificarse mediante, por ejemplo, PCR o infección bacteriana, también es posible rescatar la especificidad deseada incluso cuando se una un número insuficiente de individuos para permitir la detección mediante técnicas convencionales.

El procedimiento de selección preferido para la expresión en fagos de una molécula de proteína con una especificidad o afinidad deseada será la elución de una matriz de afinidad con un ligando. Por tanto, pueden utilizarse auto-antígenos o fragmentos de éstos para eluir los anticuerpos de fagos específicos de los auto-antígenos unidos a una matriz. Alternativamente, puede unirse a una matriz el antígeno homólogo de una especie diferente y en consecuencia, podrá eluirse la librería de anticuerpos de fagos unida y los anticuerpos de fagos específicos para dicho auto-antígeno. Por ejemplo, puede unirse a la matriz un antígeno bovino y utilizarse para la elución de la librería de fagos de anticuerpos humanos unida a los antígenos bovinos, un antígeno humano. Los anticuerpos anti-auto-antígenos aislados serán específicos para los epitopos compartidos por los antígenos bovinos y humanos. Una alternativa menos preferida puede ser unir el fago de manera no específica a la columna y eluir con un auto-antígeno. Por ejemplo, si una librería de fagos se une a una columna de afinidad anti-Fab, puede lavarse a un pH que no eluya los fagos no-específicos y a continuación lavarse con una solución idéntica pero que contenga el auto-antígeno, eluyéndose así en función de la alta afinidad de la fase móvil de fagos que expresan anticuerpos contra el auto-antígeno.

Para cada uno de estos formatos de elución con concentraciones crecientes de ligando, deben eluirse los fagos que expresan las moléculas de unión de afinidad creciente. Sin embargo, cuando p.ej., un pAb se une a su antígeno con alta afinidad o avidez (u otra proteína a su pareja de unión), puede no ser siempre posible eluir el pAb de la matriz de afinidad con moléculas relacionadas con el antígeno. Alternativamente, puede ser adecuado eluir una específicamente molécula que pueda prepararse a una concentración suficientemente elevada. En estos casos, es necesario utilizar un procedimiento de elución que no sea específico para, por ejemplo, el complejo antígeno-anticuerpo. Algunos de los procedimientos de elución no-específicos usados generalmente reducen la viabilidad del fago, por ejemplo la viabilidad del fago se reduce con el tiempo a pH 12 (Rossomando, E.F. y Zinder N. D. J. Mol.Biol. 36 387-399 1968). Pueden existir interacciones entre los anticuerpos y las matrices de afinidad, que no pueden romperse completamente sin eliminar la infectividad del fago. En estos casos, se necesita un procedimiento para eluir los fagos que no dependen p.ej., de la rotura de la interacción anticuerpo-antígeno. Se concebió un procedimiento que permite la elución de los pABs unidos en condiciones suaves (reducción de un grupo ditiol con ditiotreitol) que no rompe la estructura del fago (Ejemplo 47 de la patente internacional WO92/01047).

El procedimiento de elución suave utiliza la unión de la población de anticuerpos de fagos con el antígeno biotinilado y la unión con las perlas magnéticas de estreptavidina. Después del lavado para eliminar los fagos no unidos, el anticuerpo de fagos se eluye y se utiliza para infectar células para proporcionar una población de anticuerpos de fagos. Un enlace disulfuro entre la biotina y la molécula de antígeno permite la elución suave con ditiotreitol. Una forma particularmente ventajosa de realizar esta selección es la utilización de antígeno biotinilado en exceso pero a una concentración igual o inferior equivalente a la constante de disociación deseada para la unión antígeno-anticuerpo. Este procedimiento es ventajoso para la selección de anticuerpos con alta afinidad (R.E. Hawkins, S. J. Russell y G. Winter J. Mol. Biol., 226:889-896, 1992). Los anticuerpos pueden seleccionarse para disminuir las tasas de selección por el antígeno tal como se describe en R.E. Hawkins y col., (1992), supra. La concentración de antígeno biotinilado puede reducirse gradualmente para seleccionar anticuerpos de fagos de afinidad superior. Como alternativa, los anticuerpos de fagos pueden estar en exceso respecto al antígeno biotinilado con el fin de competir con los anticuerpos de fagos por la unión, de forma análoga a la competición de péptidos de fagos con el anticuerpo biotinilado descrito por JK Scott & G.P. Smith (Science 249:386-390, 1990).

Este proceso de elución sólo es un ejemplo de un procedimiento de elución en condiciones suaves. Un procedimiento en particular ventajoso sería introducir una secuencia nucleotídica codificante de aminoácidos que constituyen un sitio de reconocimiento para el corte por una proteasa altamente específica entre el gen foráneo insertado, en este caso un gen para un fragmento de anticuerpo y la secuencia del resto del gen III. Ejemplos de dichas proteasas altamente específicas son el Factor X y la trombina. Después de la unión del fago con una matriz de afinidad y elución para eliminar los fagos de unión inespecífica y débil, se recogen los fagos de unión fuerte mediante lavado en una columna con la proteasa en condiciones adecuadas para la digestión por el sitio de corte. Esto cortaría el fragmento de anticuerpo de la partícula de fagos eluyendo los fagos. Se esperaría que dichos fagos fueran infecciosos, ya que únicamente el sitio de corte de la proteasa debería ser el único introducido específicamente. Los fagos de unión fuerte podrían recuperarse a continuación mediante infección, p.ej., de las células E. coli TG1.

Un procedimiento alternativo al anterior es coger la matriz de afinidad que ha retenido el pAb unido fuertemente y extraer el DNA, por ejemplo mediante ebullición en solución con SDS. El DNA extraído se puede utilizar entonces directamente para transformar células huésped de E. coli o alternativamente se pueden amplificar las secuencias codificantes del anticuerpo, por ejemplo utilizando la PCR con cebadores adecuados como los descritos aquí y luego insertarse en un vector para la expresión como un anticuerpo soluble para el estudio posterior o un pAB para otras tandas de selección.

Otro procedimiento preferido para la selección de acuerdo con la afinidad debería ser la unión con una matriz de afinidad que contenga cantidades pequeñas de ligando.

Si se desea seleccionar a partir de una población de fagos que expresan una proteína con una afinidad elevada por su ligando, una estrategia preferida es unir una población de fagos a una matriz de afinidad que contenga una cantidad pequeña de ligando. Existe competición entre fagos, que expresen proteínas con afinidad alta y otras con baja, por la unión al ligando sobre la matriz. Los fagos que expresan proteínas de alta afinidad se unen preferentemente y los que expresan proteínas de baja afinidad se eliminan mediante lavados. La proteína de alta afinidad se recupera a continuación con el ligando o mediante otros procedimientos que eluyen los fagos de la matriz de afinidad (Ejemplo 35 de la patente internacional WO92/01047 demuestra este procedimiento).

En resumen, para la recuperación del DNA empaquetado de la etapa de afinidad, el paquete puede eluirse sencillamente, puede eluirse en presencia de un miembro sbp homólogo que compite con dicho paquete por la unión con un miembro sbp complementario; podría eliminarse mediante ebullición, mediante corte proteolítico de la proteína; y otros procedimientos que serán evidentes a los expertos en la materia, p.ej., la unión entre el sustrato y el miembro sbp complementario para liberar el DNA empaquetado y el miembro sbp. En cualquier caso, el objetivo es obtener el DNA del empaquetamiento para que pueda utilizarse directa o indirectamente, para expresar el miembro sbp codificado de ese modo.

La especificidad de este procedimiento de selección para los pAbs y la capacidad para crear una librería extensa indica que las técnicas de inmunización desarrolladas para incrementar la selección de células productoras de anticuerpos de interés, no será un requerimiento absoluto. La técnica permite el aislamiento rápido de especificidades de unión, p.ej., especificidades de unión al antígeno, incluyendo aquellas que presentan dificultades o incluso no pueden obtenerse por técnicas convencionales, por ejemplos, los anticuerpos catalíticos o anti-idiotípicos. La obtención del animal completo es posible hoy en día ya que se ha construido una librería completa del repertorio inmune.

Aplicaciones de anticuerpos para autoantígenos

Anticuerpos humanos contra componentes de la superficie celular. El aislamiento de dichas especificidades de anticuerpos podría ser especialmente útil para preparar agentes que medien la muerte celular como en células cancerosas, mediante la función efectora natural de los anticuerpos. Los anti-auto-anticuerpos pueden ser válidos en la preparación de reactivos de para el diagnóstico por la imagen in vivo, como por ejemplo la utilización de radio-isótopos.

Los anticuerpos dirigidos contra los componentes de la superficie celular de subgrupos específicos de células T podrían utilizarse terapéuticamente (D. Wraith et al Cell 57: 709-715, 1989; L. Steinman y R. Mategazza FASEB J. 4: 2726-2731, 1990), por ejemplo, para evitar la acción de células T en la artritis reumatoide.

Anticuerpos humanos modificadores de la función de auto-moléculas

Es posible el aislamiento de moléculas que modifiquen la acción de auto-moléculas (moléculas del propio organismo) a través de su unión a epitopos específicos de moléculas como hormonas, factores de crecimiento y receptores. Las proteínas multifuncionales pueden presentar características deseables o indeseables, especialmente si tienen un uso terapéutico. Por ejemplo, la linfocina TNF (factor tumoral necrosante) se une al menos a dos clases diferentes de receptores celulares, uno que se encuentra generalmente en las células endoteliales vasculares y el otro en las células tumorales. Se ha obtenido un anticuerpo de ratón para el TNF que evita su unión a los receptores de células endoteliales mientras que permite su unión a las células tumorales, permitiendo por tanto el ataque a los tumores pero sin efectos tóxicos colaterales mediados a través de las células endoteliales (Solicitud de patente PCT/AU90/00337). Para el uso terapéutico de anticuerpos modificadores de hormonas o de moléculas de factores de crecimiento, sería preferible un anticuerpo humano específico aislado por selección a partir de una librería de fagos.

Anti-idiotipos humanos

Los anticuerpos anti-idiotipos (anticuerpos dirigidos contra un antígeno que combina sitios formados por dominios variables de anticuerpos humanos) se obtienen de manera convencional por aislamiento de un anticuerpo contra un antígeno y posteriormente, este anticuerpo aislado se utiliza como inmunógeno para obtener los anticuerpos dirigidos contra él mismo. Si el anticuerpo original se dirige contra una hormona o factor de crecimiento, por la relación entre el antígeno y algunos lugares combinados en el anticuerpo, el anti-idiotipo puede mimetizar en algunos aspectos a la hormona o al factor de crecimiento y unirse al receptor de estas moléculas. Sin embargo la fracción de anticuerpos anti-idiotipo capaces de mimetizar la unión de la hormona al receptor es de esperar que sea pequeña. Mediante la vía convencional de anti-idiotipos, es difícil aislar anti-idiotipos de anticuerpos humanos que mimeticen moléculas que se unan a receptores humanos. En esta solicitud, se muestra que los anticuerpos dirigidos contra el antígeno, que combinan sitios formados por dominios variables de anticuerpos humanos pueden aislarse directamente de librerías de anticuerpos expresados en fago, como se muestra en los ejemplos del 1 al 4, y debería ser posible identificar anticuerpos anti-idiotipos que mimeticen la unión de las hormonas de una manera directa, por simple selección de su unión al receptor.

Los anti-idiotipos pueden se útiles así mismo para el tratamiento de enfermedades auto-inmunes. Pueden utilizarse para unir los anticuerpos circulantes. Sin embargo, es preferible enganchar directamente las células que producen esos anticuerpos, por ejemplo, mediante un anticuerpo biespecífico dirigido contra un marcador de superficie celular con especificidad anti-idiotipo. De manera alternativa, se puede utilizar la plasmaforésis para extraer directamente los anticuerpos circulantes y las células tratadas.

Anticuerpos humanos contra receptores

Los anticuerpos humanos que se unen a los receptores, pueden seleccionarse por el bloqueo o antagonismo de la función de los ligandos directamente de una librería de fagos que expresa los anticuerpos derivados de un donante no inmunizado.

Anticuerpos humanos que previenen el rechazo de los transplantes

Los anticuerpos dirigidos contra las proteínas del complejo mayor de histocompatibilidad pueden utilizarse para el tratamiento de pacientes seguidamente a la realización del transplante, o del tratamiento de los órganos antes de un transplante para prevenir el rechazo. Los anticuerpos dirigidos contra algunos marcadores de superficie celular de linfocitos han sido utilizados en la prevención del rechazo en los transplantes, p.ej., CD45, CD3, CD4, CD8 y el receptor de la interleucina 2. El ejemplo 3 muestra que los anticuerpos humanos contra el CD4 pueden aislarse directamente de las librerías de expresión en fagos.

Anticuerpos humanos contra las citocinas

Los anticuerpos humanos contra las citocinas pueden ser valiosos para el tratamiento de las enfermedades humanas, por ejemplo, en el choque séptico, los anticuerpos anti-TNF y anti-interleucina 1. En los ejemplos del 1 al 6 se muestran anticuerpos humanos contra el TNF que pueden aislarse directamente de librerías de anticuerpos en fagos derivadas de humanos no inmunizados o de recombinación de síntesis de fragmentos V, D y J. En muchos casos, estas moléculas de citocinas, están altamente conservadas entre especies, por ejemplo, esto ocurre con el factor de crecimiento transformante-\beta (TGF-\beta) y se ha demostrado por ello, la dificultad de aislar anticuerpos dirigidos contra la molécula humana, incluso en el ratón. El aislamiento de anti-auto-anticuerpos humanos tal como se ha descrito en esta invención, proporciona un método de obtención de anticuerpos humanos con dicha especificidad.

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Anticuerpos humanos para el diagnóstico y el tratamiento de trastornos cardíacos

Los anticuerpos humanos pueden seleccionarse contra componentes del coágulo, p.ej., la fibrina, sería útil para el diagnóstico por la imagen de coágulos si se marcaran con radioactividad o para disolver dichos coágulos, si por ejemplo se estuviera unido a una enzima para digerir el coágulo, como la uroquinasa.

Anticuerpos desencadenantes de la función del receptor

Los anticuerpos se pueden seleccionar según su unión a un receptor celular y desencadenar una determinada respuesta biológica en la célula. Este aspecto se ha descrito con más detalle más adelante y en el Ejemplo 8 se describe el aislamiento de estos anticuerpos.

Los rgdps unidos a los receptores celulares se aíslan mediante ciclos de crecimiento y selección. Algunos de estos rgdps codifican para especificidades de unión con potencialidad para activar receptores (solos o en combinación con otras especificidades de unión). Estas especificidades de unión se han examinado de manera aislada o en combinación para la activación de receptores celulares.

Existe una variedad de receptores celulares en los que la unión de un ligando, por ejemplo hormonas, factores de crecimiento o péptidos, desencadenan un evento biológico, por ejemplo la activación de actividad tirosín quinasa, o la apertura de un canal iónico. Los rdgps pueden seleccionarse por la unión a un receptor celular (o un receptor relacionado con porciones conservadas en la superficie, o procedente de otras especies), por ejemplo mediante células expresando un receptor celular, o un receptor soluble inmovilizado en una fase sólida, o dominios o epitopos peptídicos del receptor. Idealmente el receptor se proporciona en forma unida (tal como se requiere para su activación).

En la activación de los receptores de superficie celular, frecuentemente, parece que está implicado un movimiento relativo de proteínas o subunidades de éstas. Por ejemplo, en receptores portales para neurotrasmisores, las cinco subunidades que se ordenan simétricamente en el lugar de la membrana, delimitan un canal iónico central. La unión del neurotransmisor implica una alteración en el tamaño del canal iónico central por pequeños reordenamientos entre las subunidades, es una transición alostérica. Para los receptores tirosín quinasa, el ligando parece dirigir la oligomerización del recepetor. Por tanto, los anticuerpos con especificidades de unión dirigidas contra el receptor tienen la potencialidad de promover un cambio alostérico o promover la oligomerización. Por ello, la oligomerizació de los receptores, puede promoverse por el uso de anticuerpos bivalentes o biespecíficos.

Los anticuerpos solubles o fragmentos de anticuerpos pueden ser fragmentos monovalentes, por ejemplo fragmentos de cadena simple Fv o fragmentos Fab, o fragmentos bivalentes, por ejemplo, Fab_{2} o fragmentos de anticuerpo completo. La bivalencia puede promoverse también de otras maneras, (1) codificando una etiqueta, péptido o proteína (por ejemplo la subunidad de una proteína dimérica) que se auto-asocia por el extremo N- o C-terminal del fragmento monomérico, (2) utilizando un anticuerpo bivalente que se una al fragmento monovalente, por ejemplo, a una etiqueta común C-terminal o a un dominio constante de anticuerpo, (3) mediante unión química.

Los anticuerpos biespecíficos o fragmentos biespecíficos pueden generarse de forma similar como los fragmentos bivalentes. (Para la expresión de anticuerpos biespecíficos o sus fragmentos en la misma célula, es necesario que se introduzcan juntos los genes que codifican las dos especificidades). Los distintos "brazos" de los anticuerpos pueden dirigirse contra el mismo receptor, contra diferentes epitopos, o contra dos receptores diferentes (para activar dos receptores híbridos).

El aislamiento directo de anti-auto-anticuerpos de librerías de fagos, tal como se describe en la presente invención, es importante para permitir examinar gran número de anticuerpos desencadenantes de la actividad de receptores.

Resulta apropiado, distinguir entre la elaboración de anticuerpos para activar receptores, tal como se describe en un aspecto de la presente invención, de "la ruta anti-idiotipo" en la que anticuerpos específicos producidos en un animal, incluyendo el hombre, por vacunación de un animal determinado con un antígeno específico son utilizados posteriormente para vacunar a otro animal, produciéndose nuevos anticuerpos denominados anticuerpos anti-idiotipos (Anti-Ids), capaces de reconocer y unir al primer grupo de anticuerpos. Algunas especies de estos Anti-Ids son capaces de mimetizar las propiedades biológicas específicas del antígeno original. Si por ejemplo, el antígeno fuera una hormona peptídica o un receptor celular, el Anti-Id para el antígeno hormonal o receptor celular, será capaz de producir una respuesta por parte de dicha célula (Véase Gaulton, G.Ny Greane, My., 1986. Idiotypic mimicri of biological receptors. Ann. Revymmunol. 4, 253-280; Sege, Ky peterson, P.A., 1978. Use of anti-idiotipic antibodies as cell surface receptor probes. Proc. Natl. Acad. Sci. Usa. 75, 2443-2447).

La esencia de la actual enseñanza de los Anti-Ids como miméticos de los antígeno se debe a que se producen como resultado de la construcción de anticuerpos contra anticuerpos del antígeno original. Existe, sin embargo, alguna controversia sobre si los anti-idiotipos mimetizan correctamente al antígeno original. (S.J. Dvis et al Nature 358 76-79, 1992).

Hay por tanto una distinción clara entre anticuerpos preparados por una ruta anti-idiotipo que mimetizan antígenos como los factores de crecimiento o las hormonas, y los anticuerpos que se generan directamente contra receptores que activan receptores. Los anticuerpos derivados por una ruta anti-idiotipo requieren el antígeno (hormona, factor de crecimiento) y se unirán al mismo epitopo en el receptor como si fueran la hormona, mientras que los anticuerpos derivados por su unión a los receptores requieren que la unión no ocurra en el mismo epitopo que activa al receptor. De hecho, algunos anticuerpos no necesitan mimetizar una hormona o factor de crecimiento determinado por su especificidad, o por su unión al receptor (caracterizado como epitopo en la tasa normal o no mediante aclaramiento de la sangre) para diferenciarse. El proceso para producir los anticuerpos es también bastante diferente. Para los anticuerpos anti-idiotipos se hace de manera clásica por inmunización de los animales, aunque pueden aislarse directamente de una librería de expresión en fagos, tal como se ha descrito más arriba. Los anticuerpos dirigidos contra auto-receptores se obtienen por selección de librerías del gene V (tal como se ha descrito más arriba).

Los anticuerpos derivados directamente de la unión con el receptor pueden tener ventajas sobre la hormona natural o el factor de crecimiento, al igual que las ventajas derivadas de la ruta anti-idiotipo. Así, los receptores que son defectivos en su unión con la hormona natural o el factor de crecimiento (por ejemplo en enfermedades genéticas) pueden ser activados mediante la unión de un anticuerpo con un epitopo diferente.

Como agentes terapéuticos, los diversos isotipos de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que llevan regiones variables responsables para la especificidad de la moléculas tienen un número de propiedades ventajosas sobre la molécula bioreactiva que mimetizan. Por ejemplo, puede modificarse la vida media en circulación de las hormonas naturales. En un paciente, la vida media en circulación puede ir de minutos a algunas semanas, dependiendo del isotipo del anticuerpo o del fragmento escogido. Si se requiere una larga vida o un aclarado a corto plazo, se escoge el isotipo del anticuerpo apropiado sin necesidad de utilizar mecanismos implantados de liberación lenta, o infusiones continuas intravenosas, etc.

Además, muchas hormonas o factores de crecimiento de tejidos o antígenos, en general, son complejos funcionales con diferentes epitopos y funciones distintas y específicas. Los clones de anticuerpos miméticos monofuncionales pueden utilizarse para producir un efecto biológico específico de una hormona sin que exista un segundo efecto que pudiera tener alguna desventaja para el paciente. Así, la linfocina TNF (factor de necrosis tumoral) se une a dos clases de receptores celulares diferentes - uno, común en las células endoteliales vasculares, el otro común en las células tumorales. Si el TNF se modifica para que no pueda unirse a los receptores de células endoteliales, pero conservando su posibilidad de unión a los receptores de las células tumorales, se ataca a los tumores sin que al mismo tiempo se induzcan efectos colaterales demasiado tóxicos, mediados a través de los receptores vasculares. (Este tema se ha descrito en la solicitud de patente australiana PCT/AU90/00337). Un anticuerpo mimético es capaz de reconocer al receptor de la célula tumoral y es de esperar que puesto que es específico, elimine las células tumorales sin inducir efectos tóxicos mediados a través del endotelio vascular, al no existir semejanzas con el epitopo del TNF que se une a los receptores en este segundo caso.

Terminología

La mayor parte de la terminología que se trata en esta sección ha sido mencionada en el texto en diferentes lugares según su adecuación.

Auto

Un auto-antígeno es un antígeno o un epitopo que es capaz de unirse a un lugar de unión al antígeno formado por un dominio(s) variable(s) del anticuerpo y que se conserva entre miembros de la especie de un animal y nativa para el organismo.

El sistema inmune intenta evitar la producción de anticuerpos contra auto-antígenos. Se ha sugerido que (i) las secuencias de la línea germinal de segmentos del gen V han evolucionado bajo presión de dirigirse contra elementos foráneos, p.ej. patógenos, antígenos y epitopos, y más adelante para proporcionar anticuerpos que se unan a auto-antígenos, y (ii) además, la tolerancia inmune provoca que aquellas combinaciones de segmentos de gen codificantes de anti-auto-anticuerpos no progresen, por deleción o inactivados. En consecuencia, no existen anticuerpos circulantes contra esos antígenos en condiciones normales, pero sí en estados de enfermedad p.ej., en las enfermedades auto-inmunes. Un auto-antígeno puede existir como una variación alélica normal en la población. Sin embargo, no espera que la inmunización de un individuo de la especie con un auto-antígeno ocasione la generación o la detección de anticuerpos contra el antígeno, quizás exceptuando cuando la tolerancia se rompe deliberadamente. Los anticuerpos para un auto-antígeno sólo están presentes en un individuo que sufra una enfermedad auto-inmune. Por otro lado, existen algunos auto-antígenos cuyos anticuerpos circulantes pueden encontrarse como una subpoblación en los individuos normales de su especie.

Un auto-antígeno es un antígeno reconocido por los anticuerpos de superficie de células B, pero no por los anticuerpos que se encuentren en la circulación. La detección u obtención de anticuerpos circulantes para un auto-antígeno no es posible, con excepción quizás de los individuos que sufren de una enfermedad o un síndrome autoinmune.

Un anti-auto-anticuerpo o fragmento de éste es un anticuerpo o fragmento del mismo que tienen una especificidad de unión por un auto-antígeno. Puede reconocer un epitopo que se encuentra únicamente en un auto-antígeno, o puede tener una reacción cruzada con un antígeno reconocido como foráneo por individuos de la especie. La presente invención, es particularmente adecuada para la producción y el aislamiento de fragmentos de anticuerpos que se unen de forma única a un auto-antígeno.

Par de unión específica

El par de unión específica describe una pareja de moléculas (cada una miembro de una pareja de unión específica) generados de forma natural o producidas por síntesis. Una molécula del par, tiene un área o cavidad en su superficie, que específicamente se une a, y se define como complementaria con una organización espacial y polar particular de la otra molécula, por lo que los componentes del par tienen la propiedad de unirse específicamente el uno con el otro. Ejemplos tipo de pares de unión específica son los pares antígeno-anticuerpo, biotina-avidina, hormona-receptor de la hormona, receptor-ligando, enzima-substrato, IgG-proteína A.

Miembro multimérico

Miembro multimérico describe un primer polipéptido que se asocia con al menos un segundo polipéptido; los polipéptidos se expresan en una forma libre y/o en la superficie de un substrato. El substrato lo proporciona un bacteriófago. Si hay dos polipéptidos asociados, el complejo polipeptídico asociado se denomina dímero, pero puede ser un trímero, etc. El dímero, trímero, multímero, etc. o el miembro multimérico comprenden un miembro de un par de unión específica.

Ejemplos de miembros multiméricos son los dominios de las cadenas pesadas de una molécula de inmunoglobulina, los dominios ligeros de una molécula de inmunoglobulina y las subunidades del receptor de células T.

Paquete de expresión genética replicable (Rgpd)

El término hace referencia a una partícula biológica que tiene la información genética que puede dar a la partícula la capacidad para replicarse. La partícula puede mostrar en su superficie al menos parte de un polipéptido. El polipéptido puede estar codificado por la información genética nativa de la partícula y/o colocado de manera artificial en la partícula o un ancestro de ésta. El polipéptido expresado puede ser cualquier miembro del par de unión específica, p.ej., los dominios pesados o ligeros de la cadena basados en una molécula de inmunoglobulina, una enzima o un receptor, etc.

En el contexto de la presente invención, la partícula es un bacteriófago filamentoso como fd o M13.

Paquete

El término hacer referencia a un paquete genético replicable en el que la partícula muestra un miembro de un par específico en su superficie. El paquete puede ser un bacteriófago que expresa un dominio de unión al antígeno en su superficie. Este tipo de paquete ha sido denominado un anticuerpo de fago (pAb).

Anticuerpo

El término describe una inmunoglobulina natural o producida parcial o totalmente por síntesis. El término, así mismo, comprende cualquier proteína que tenga un dominio de unión que es, o es análogo a, un dominio de unión de inmunoglobulina. Estas proteínas pueden derivar de fuentes naturales o ser producidas parcial o totalmente por síntesis.

Ejemplos de anticuerpos son los isotipos de inmunoglobulinas y los fragmentos Fd, Fab, F(ab^{1})_{2}, scFv, dAb.

Superfamilia de las Inmunoglobulinas

El término hace referencia a una familia de polipéptidos, los miembros de la cual tienen al menos un dominio con una estructura relacionada con uno de los dominios variable o constante de moléculas de inmunoglobulinas. El dominio contiene dos hojas \beta y normalmente uniones disulfuro conservadas (ver A.F. Williams y A.N. Barclai 1988 Ann. Rev. Immunol. 6, 381-504).

Ejemplos de miembros de la superfamilia de las inmunoglobulinas son el CD4, el receptor del factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDG-FR) y la molécula de adhesión intercelular (ICAM). Salvo que en el texto se indique lo contrario, en esta solicitud la referencia a las inmunoglobulinas y sus homólogos incluye los miembros de la superfamilia de las inmunoglobulinas y homólogos de éstas.

Homólogos

Este término se refiere a los polipéptidos que tienen residuos idénticos o conservados en la posición correspondiente de su estructura primaria, secundaria o terciaria. El término así mismo, incluye a dos o más secuencias de nucleótidos que codifican para polipéptidos homólogos.

Ejemplos de péptidos homólogos son los isotipos de las inmunoglobulinas y las enzimas con estructura de barrilito TIM.

Funcional

El término se usa en relación al miembro sbp expresado en la superficie de un rgdp y significa que el miembro sbp está en una forma plegada en la que su dominio de unión específico para miembro complementario sbp es el mismo o estrechamente análogo con su configuración nativa, por lo que exhibe una especificidad similar respecto al miembro complementario sbp.

Población genéticamente diversa

El término se utiliza en relación con los miembros sbp de un polipéptido o los componentes de éste, se refiere no sólo a la diversidad que pueda existir en la población natural de células u organismos, sino también a la diversidad que pueda crearse por mutación artificial in vitro o in vivo.

La mutación in vitro por ejemplo, está relacionada con la utilización de mutagénesis al azar con oligonucleótidos que tienen mutaciones aleatorias de la secuencia que se desea variar. La mutagénesis in vivo usa cepas mutadoras o microorganismos huéspedes para albergar el DNA (véase el ejemplo 38 de la patente internacional WO 92/01047). La expresión "población única" se puede utilizar para denotar una pluralidad de p.ej., cadenas polipeptídicas que no genéticamente diversas. Una población restringida es aquella que es diversa pero menos que el repertorio completo de un animal o librería, de síntesis o no. La diversidad puede haberse reducido por selección previa p.ej., utilizando la especificidad de unión al antígeno.

Dominio

Un dominio es una parte de la proteína que está plegado sobre sí mismo, independientemente de otras partes de la misma proteína y de un miembro de unión complementario. Una unidad de plegamiento es una combinación específica de estructuras en hélice \alpha y/o hojas \beta. Los dominios y las unidades plegadas contienen estructuras que acercan aminoácidos que no son adyacentes en la estructura primaria.

Forma libre

El término forma libre hace referencia al estado de un polipéptido que no está dispuesto en un paquete genético replicable.

Defectuoso condicional

El término hace referencia a un gen que expresa un polipéptido defectuoso bajo un conjunto de condiciones, pero bajo otro conjunto de condiciones, expresa un polipéptido diferente pero relacionado y no-defectuoso. Un ejemplo, es un gen que contiene una mutación ámbar expresada en huéspedes no supresores o no supresores.

Un gen puede expresar una proteína que sea defectuosa en unas condiciones pero no en otras. Como por ejemplo, un gen con una mutación sensible a la temperatura.

Codones suprimibles de finalización de la traducción

El término hace referencia a un codón que permite la traducción de secuencias nucleotídicas cadena debajo de dicho codón en ciertas condiciones, pero en otras condiciones la traducción finaliza en dicho codón. Ejemplo de codones terminadores son el ámbar, el ocre y el ópalo.

Cepa mutadora

Es una célula huésped que tiene un defecto genético, que causa que la aparición de una mutación en la replicación del DNA respecto a su DNA progenitor. Ejemplo de cepas mutadoras son la NR9046mutD5 y la NR9046mut T1 (véase ejemplo 38 de la patente internacional WO92/01047).

Fago auxiliar

El fago auxiliar es un fago que se utiliza para infectar células que contienen un fago con un genoma defectuoso, de modo que el fago auxiliar funciona complementando ese defecto. El fago con un genoma defectuoso puede ser un fagémido o un fago al que se le han eliminado algunas secuencias génicas codificantes de determinadas funciones. Ejemplos de fagos auxiliares son el M14K07, M13K07 gen III número 3; y el fago que expresa o codifica una molécula de unión fusionada a una proteína de la cápside.

Vector

El vector es una molécula de DNA capaz de replicarse en un organismo huésped, en dicho vector se puede insertar un gen para constituir lo que se denomina molécula de DNA recombinante.

Vector Fago

Es un vector derivado por modificación del genoma de un fago, que contiene un origen de replicación para un bacteriófago, pero no para un plásmido.

Fagémido Vector

Es un vector derivado por modificación del genoma de un plásmido que contiene un origen de replicación de un bacteriófago al mismo tiempo que el origen de replicación de un plásmido.

Secretado

El término describe un rgdp o molécula que se asocia con el miembro sbp expresado en un sbdp en el que el miembro y/o la molécula se han plegado y empaquetado juntas y se localizan externamente al citosol celular.

Repertorio de genes reordenados de inmunoglobulina

El término hace referencia a una colección de nucleótidos naturales, p.ej., secuencias de DNA que codifican genes de inmunoglobulinas expresadas en un animal. Las secuencias se generan por reordenamientos in vivo de p.ej., segmentos V, F y J para las cadenas H y p.ej., los segmentos V y J de las cadenas L. De forma alternativa, las secuencias pueden generarse a partir de una línea celular inmunizada in vitro, en la que los reordenamientos en respuesta a la inmunización ocurren intracelularmente.

Librería

El término librería hace referencia a una colección de nucleótidos p.ej., clones de secuencias de DNA; o una colección de polipéptidos genéticamente diversa, o miembros del par de unión específica, o polipéptidos o miembros sbp que están expresados en rgdps y pueden seleccionarse para obtener un polipéptido individual o un miembro sbp de una población mezclada de polipéptidos o de miembros sbp.

Repertorio de Genes de inmunoglobulinas reordenados artificialmente

Colección de nucleótidos, p.ej., secuencias de DNA derivadas total o parcialmente de una fuente diferente a las secuencias de inmunoglobulinas reordenadas de un animal, pudiendo incluir, por ejemplo, secuencias de DNA codificantes de dominios VH mediante combinación de segmentos V desordenados con segmentos D y J y secuencias de DNA codificantes de dominios VL mediante combinación de segmentos V y J.

Parte o todo el conjunto de las secuencias de DNA puede derivarse de la síntesis de oligonucleótidos.

Péptido señal de secreción

Esta secuencia de aminoácidos unida al extremo N-terminal del polipéptido dirige el desplazamiento del polipéptido fuera del citosol.

Eluyente

Es una solución utilizada para la rotura de las uniones entre dos moléculas. Las uniones pueden ser mediante enlaces no-covalentes o covalentes. Las dos moléculas, pueden ser miembros de un sbp.

Derivado

Es un polipéptido que deriva de otro polipéptido que está codificado por el DNA de un rdgp seleccionado. El polipéptido derivado puede diferir del otro polipéptido codificado por adición, deleción, substitución o inserción de aminoácidos, o por el enlace de otras moléculas. Estos cambios pueden realizarse a nivel de nucleótido o de proteína. Por ejemplo, el polipéptido codificado puede ser el fragmento Fab que es después enlazado a una cola Fc de otro origen. De manera alternativa pueden unirse marcadores como enzimas, fluoresceínas, etc. a fragmentos Fab, scFv.

Descripción resumida de las figuras

Figura 1. Se muestra el análisis por ELISA de las especificidades de las cadenas simples solubles Fvs (scFvs) aisladas de una librería no estimulada por selección con tiroglobulina bovina (panel superior), TNF\alpha humano (panel central), o mAb Fog-1 (gamma-1, kappa). La unión se determinó por ELISA frente a un panel de proteínas, tal como siguen: 1 - plástico; 2 -inhibidor de la tripsina de huevo de gallina; 3 - quimiotripsinógeno A; 4 - ovoalbúmina de huevo de gallina; 5 - hemocianina de lapa; 6 - tiroglobulina bovina; 7 - TNF\alpha humano; 8 - lisozima de clara de huevo de pavo; 9 - citocromo C de corazón de caballo; 10 - albúmina sérica bovina; 11 - mAb Fog-1.

Figura 2. Se muestra un análisis por ELISA de las especificidades del scFvs soluble aisladas de una librería no inmunizada por selección con el antígeno carcino-embrionario humano (CEA) (panel superior), el péptido MUC1 (Price et al., 1990, supra) (panel central), o el CD4 humano (panel inferior). La unión se determinó por ELISA frente a un panel de proteínas, tal como sigue: 1 - inhibidor de la tripsina de huevo de gallina; 2 - quimiotripsinógeno A; 3-ovoalbúmina de huevo de gallina; 4 - hemocianina de la lapa 5 - CEA; 6 - extracto de orina conteniendo mucina polimórfica epitelial humana (PEM); 7 - tiroglobulina bovina; 8 - lisozima de clara de huevo de gallina; 9 - albúmina sérica bovina; 10 - gamma globulina de pollo unida con ácido 4-hidroxi-3-nitrofenil acético; 11- CD4 soluble recombinante humano.

Figura 3. Se muestra un ELISA para analizar la unión de tres scFvs, aislados por selección con un anticuerpo humano monoclonal Fog-1 (IgG1, kappa), frente a un panel de anticuerpos humanos de isotipos variables, tal como sigue: 1 - Fog-1; 2 - el fragmento Fv de Hulys11; 3 - anticuerpo de Hulys 11 (IgG1, kappa); 4 - RegA (IgG1, kappa); FogC (IgG3, kappa); 6 - Pagl (IgG1, lambda); 7 - IgG2, anticuerpo lambda purificado de plasma de mielomas (Sigma) ; 8 - Oak3 (IgG3, lambda); 9 - IgG4, lambda purificada de plasma de mielomas; 10 Foml (IgM, lambda); 11 - FomA (IgM, lambda).

Figura 4. Se ilustra el ensamblado de genes V_{H} en la creación de una librería de síntesis.

Figura 5. Se ilustra de manera esquemática la técnica de selección para pAbs: 2(i) muestra un sistema de unión/elu-
ción; 2(ii) muestra un sistema de competición (p = pAb; ag = antígeno con unión necesaria al pAb; c = población competidora p.ej., anticuerpo, pAb, ligando; s = substrato (p.ej., bolas de plástico, etc.); d = sistema de detección).

La presente invención se ilustra en los ejemplos siguientes. Los oligonucleotidos cebadores y las sondas mencionadas en el texto se incluyen en una lista en la Tabla IV. Las tablas I a IV se encuentran después del Ejemplo 8.

El ejemplo 1 muestra el aislamiento de anticuerpos dirigidos contra el factor de necrosis tumoral humano \alpha y un anticuerpo humano monoclonal de una librería de fago de fragmentos Fv de cadena simple derivados de un humano no inmunizado.

El ejemplo 2 muestra el aislamiento de anticuerpos que se unen a la tiroglobulina humana de una librería de fagos de fragmentos Fv de cadena simple derivados de un humano no inmunizado.

El ejemplo 3 muestra el aislamiento de fragmentos de anticuerpo dirigidos contra auto-antígenos para la mucina MUC1, antígeno carcinoembrionario (CEA) i CD4 soluble recombinante (rsCD4) de una librería de expresión en fagos de fragmentos de cadena sencilla Fv, derivada de un humano no inmunizado.

El ejemplo 4 muestra la caracterización de fragmentos de anti-auto-anticuerpos seleccionados por secuenciación de DNA y determinaciones de afinidad.

El ejemplo 5 muestra la creación de librerías humanas sintética de segmentos VH de línea germinal.

El ejemplo 6 muestra el aislamiento de fragmentos de anticuerpos que se unen al factor de necrosis tumoral \alpha de una librería humana sintética de línea germinal.

El ejemplo 7 muestra la creación de una librería humana sintética de segmentos VH de línea germinal que contienen secuencias VH CDR3 de diferentes tamaños y el aislamiento de cadenas de fragmentos Fv de cadena simple que se unen a la tiroglobulina humana y a un anticuerpo monoclonal humano.

El ejemplo 8 muestra el aislamiento de anticuerpos humanos dirigidos contra las moléculas del receptor de la interleucina-1 humana que desencadenan la función del receptor.

Ejemplo 1 Aislamiento de fragmentos de anticuerpos dirigidos contra auto-antígenos de una librería de scFvs generada a partir de donantes de sangre no inmunizados

Los genes V de origen natural, aislados de los PLBs humanos pueden disponerse en una librería extensa de fragmentos de anticuerpos que contengan reactividades contra antígenos, a los cuales el donante nunca ha sido expuesto (patente internacional WO92/01047, ejemplo 42). Los autores de la presente invención se dieron cuenta que estas librerías pueden contener además reactividades contra auto-antígenos que provienen de la auto-reactividad de células B que no han sido delecionadas o de fragmentos no naturales resultantes de la recombinación de cadenas VH y VL. Para su comprobación, seleccionaron una gran librería scFv dispuesta en la superficie de un fagémido contra el TNF-\alpha humano y la inmunoglobulina IgG/\kappa humana.

Métodos Rescate de la librería

La librería scFvs se construyó a partir del RNA de PBLs humanos, tal como ha sido descrito previamente (patente internacional WO92/01047 ejemplo 42). Para rescatar los fragmentos de anticuerpos expresados en fagos, se utilizaron aproximadamente 10^{9} E.coli conteniendo el fagémido para inocular 50 ml de TI 2X con glucosa al 1% y ampicilina a 100 mg/ml (TI 2X-AMP-GLU) y se crecieron hasta una O.D de 0,8 en agitación. Cinco ml de ese cultivo se utilizaron para inocular 50 ml de TI 2X-AMP-GLU, se añadieron 2 X 10^{8}U.T. del auxiliar delta gen 3 (M13 D gen III, véase WO92/01047) y el cultivo se incubó a 37ºC durante 45 minutos sin agitación y después a 37ºC durante 45 minutos con agitación. El cultivo se centrifugó a 4000 r.p.m. durante 10 minutos y el precipitado se resuspendió en 2 litros de TI 2X que contenía 100 mg/ml de ampicilina y 50 mg/ml de kanamicina y se dejó crecer durante toda la noche. El fago se preparó como se ha descrito previamente (WO92/01047 ejemplo 42). EL M13 D gen III se preparó como sigue.

El fago auxiliar M13 D gen III, no codifica para la proteína del gen III; el fagémido, que expresa fragmentos de anticuerpo, tiene una gran avidez por unirse al antígeno. Las partículas infecciosas de M13 D gen III se producen creciendo el fago auxiliar en las células que contienen un derivado del PUC19 que proporciona el tipo salvaje de la proteína gIII, durante la morfogénesis del fago. El cultivo se incubó durante 1 hora a 37ºC sin agitación y a continuación una hora adicional a 37ºC con agitación. Las células se centrifugaron (IEC-Centra 8, 4000 rpm/min durante 10 min), se resuspendieron en 300 ml de caldo de cultivo TI 2 X que contenía 100 mg de ampicilina/ml y 25 mg de kanamicina/ml (TI-AMP-KAN 2X) y se crecieron toda la noche en agitación a 37ºC. Las partículas de fago se purificaron y concentraron del medio de cultivo con dos precipitaciones con PEG (Sambrook et al., 1990), resuspendiéndose en 2 ml de PBS y se pasaron a través de un filtro de 0,45 mm (Minisart NML; Sartorius) para obtener una concentración final de aproximadamente 10^{13} unidades de transducción/ml (clones resistentes a la ampicilina).

Cribado de la librería

Se recubrieron inmunotubos (Nunc) durante toda la noche con 4 ml de 100 mg/ml o 10 mg/ml de TNF-\alpha recombinante en PBS, o 4 ml de 10 mg/ml de Fog-1, una inmunoglobulina IgG/\kappa humana que reconoce el antígeno Rh (D) de las células rojas de sangre humana. Los tubos se bloquearon con Leche descremada Marvel-PBS al 2% durante 2 horas a 37ºC y a continuación se lavaron 3 veces con PBS. Aproximadamente, unas 10^{13} UT de fago se añadieron al tubo y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente, se mezcló dando vueltas en una mesa giratoria y después se dejó reposar durante 1,5 horas. Los tubos se lavaron 10 veces con PBS con 0,1% Tween-20 y 10 minutos con PBS. El fago se eluyó añadiendo 1 ml de trietilamina 100 mM y se dejó en rotación durante 15 minutos en una mesa giratoria, después la solución se neutralizó inmediatamente con 0,5 ml de Tris-HCl 1,0 M pH 7,4. El fago se usó para infectar 10 ml de un cultivo de E.coli TG1 en fase logarítimica mediante incubación del fago eluyente con bacterias durante 30 minutos a 37ºC. Las E.coli se sembraron en placas TIE que contenían glucosa al 1% y ampicilina 100 mg/ml. La librería de bacterias resultante, se rescató después con el fago auxiliar delta gen 3 descrito arriba y la preparación de los fagos en una subsiguiente ronda de selección. Este proceso se realizó por un total de 4 veces por purificación de afinidad con lavados en el tubo, aumento hasta 20 veces con PBS 0,1% Tween-20 y 20 veces con PBS durante 3 o 4 rondas más.

Caracterización de los retenidos

Los fagos eluidos de las rondas de selección 3ª y 4ª se utilizaron para la infección de E. coli HB 2151 y se produjeron scFv soluble (Marks y col., 1991) de las colonias simples para el ensayo. En el caso del TNF, el fago se rescató de colonias simples. Los ELISAs se realizaron como se ha descrito previamente con placas cubiertas con 10 \mug/ml de TNF-\alpha humano en bicarbonato 50 mM pH 9,6 o 10 \mug/ml Fog-1 en PBS. Los clones positivos según el ELISA se caracterizaron además por fingerprinting por PCR (WO92/01047, ejemplo 20) y después se secuenciaron.

Resultados

TNF: El scFv soluble de 1536 colonias y fagos procedentes de 1152 colonias se cribó mediante ELISA. Los resultados se muestran en la figura 1, cuya descripción se proporciona en el apartado anterior de descripción resumida de las figuras. Además, los clones positivos para la unión al TNF-\alpha se caracterizaron por fingerprinting por PCR y se secuenciación. De esta manera se identificaron 15 ligandos. Cuatro de ellos han sido secuenciados.

Fog-1: El scFv soluble de 96 clones se cribó mediante ELISA y los clones positivos se caracterizaron por fingerprinting por PCR y se secuenciaron. De esta manera, cuatro ligandos diferentes se identificaron y secuenciaron.

Ejemplo 2 Aislamiento de especificidades de fragmentos de anticuerpos dirigidos contra la tiroglobulina humana de una librería de fragmentos scFv mediante expresión en el bacteriófago fd

El ejemplo 44 de la patente internacional WO92/1047 describe la selección de fragmentos de anticuerpo scFv dirigidos contra la tiroglobulina bovina, a partir de una librería de fragmentos de scFv. Éstos se derivaron de humanos no inmunizados y se expresaron en la superficie del fago fd, aislado por cribado contra la tiroglobulina bovina. Los resultados demostraron que es posible aislar de una librería derivada de un individuo no inmunizado fragmentos de anticuerpos que se unan a un antígeno al que un individuo no ha sido nunca expuesto.

Se analizaron dieciséis clones, encontrados por cribado según su especificidad para la tiroglobulina bovina, por unión a la tiroglobulina humana en un ensayo de ELISA (tal como se describe en el ejemplo 44 de la patente WO92/01047). Nueve de esos clones se unieron fuertemente a la tiroglobulina humana con unas señales de absorbancia entre 1,0 y 1,6, 12 minutos después de la adición del substrato. No se encontró reactividad cruzada (señales menores que 0.05 después de 90 min) con un panel de antígenos no relacionados, lisozima de huevo blanco de gallina, BSA, ovoalbúmina, tripsinógeno, citocromo c, hemocianina de lapa, insulina, cardiolipina y DNA.

Por tanto, pueden aislarse anticuerpos con especificidad para epitopos en el auto-antígeno humano tiroglobulina de librerías preparadas de humanos no inmunizados.

Se secuenciaron dos clones que se unían a dos tiroglobulinas bovina y humana, \alpha-Thy y \alpha-Thy29 y dos clones que se unen únicamente a la tiroglobulina bovina, \alpha-Thy32 i \alpha-Thy33.

Ejemplo 3 Aislamiento de fragmentos de anticuerpo dirigidos contra los auto-antígenos humanos MUC1 de la mucina, el antígeno carcinoembrionario (CEA) y el CD4 recombinante soluble (rsCD4) de una librería de expresión en fagos de fragmentos humanos Fv de cadena simple

La librería de expresión en fagos de fragmentos Fv de cadena simple derivados de donantes humanos no inmunizados usada en el ejemplo 1, se utilizó en la selección y el aislamiento de fragmentos de anticuerpo dirigidos contra auto-antígenos MUC1 para la mucina, el antígeno carcioembrionario (CEA) y el CD4 recombinante soluble (rsCD4).

Rescate de la librería

La librería se rescató de manera similar al ejemplo 1 con la excepción que el fago auxiliar M13K07 (5X10^{10}pfu) se utilizó para el rescate en vez del fago auxiliar delta gen 3 (M13 D gen III).

Selección de fagos específicos para mucina MUC1 y antígeno carcinoembrionario (CEA)

El fago se cribó por su unión utilizando inmunotubos (Nunc; Maxisorp) cubiertos básicamente con un antígeno (Marks y col., 1991), o se seleccionó en una columna de antígeno (J.McCafferti y col., Nature 348 552-554, 1990). Se emplearon los antígenos siguientes: CD4 humano recombinante soluble (rsCD4) (expresado en baculovirus por American Biotechnologies Incy suministrado por el MRC AIDS Reagent Project [ADP608]; el antígeno carcinoembrionario humano (CEA); y un péptido de 20 aminoácidos (M.R. Price y col., Molecymmunol. 27 795-802, 1990), que corresponde a un motivo repetitivo en la mucina humana MUC1 (mucina epitelial polimórfica asociada a los tumores PEM) (S. Gendler y col., J. Biol. Chem. 263 12820-12823, 1988; J.R. Gum y col., Biochem, Biophis. Res. Commun. 171 407-415, 1990).

Se recubrieron los inmunotubos con CEA (20 mg/ml) y rsCD4 (10 mg/ml) en tampón fosfato salino durante toda la noche a temperatura ambiente. En las primeras dos rondas de selección, los tubos se lavaron 10 veces con PBS, Tween 20 al 0,1% (v/v) y 10 veces con PBS. Los fagos se eluyeron con trietilamina 100 mM como en la siguiente referencia (Marks y col., 1991). El fago eluido (normalmente entre 10^{6} y 10^{7} unidades de transducción) se utilizó en la infección de células E. coli TGI. Aproximadamente 10^{9} bacterias infectadas se utilizaron como inóculo para el siguiente rescate. La librería se sometió de 3 a 5 rondas de rescate y selección para cada tipo de antígeno.

Para la selección del fago que se une al péptido MUC1, el péptido se combinó químicamente con Sepharose 4B proporcionada por M.R. Price). Se preparó una columna de 1 ml y el fago se seleccionó tal como describió McCafferti y col., 1990 (supra). En resumen, la columna de Sepharose-MCU1 se lavó con PBS que contenía leche descremada en polvo (MPBS) al 2% y el fago se cargó en 1 ml del mismo tampón. Después de lavar la columna sucesivamente con volúmenes de 10 ml de MPBS, PBS pH 7,2 Tris-HCl 50 mM/ NaCl 500 mM pH 8,0 y Tris-HCl/500mM NaCl pH9,0, el fago se eluyó con 5 ml de trietilamina 100 mM y se neutralizó con tampón de fosfato sódico 0,5M pH6,8. Se llevaron a cabo cinco rondas de selección.

Cribado y secuenciación de los clones

Las colonias resistentes a la ampicilina procedentes de la infección de E.coli TGI con el fago eluido, se cribaron tanto por su unión al fago (Clackson y col., 1991) como a fragmentos solubles scFv (Marks y col., 1991). Puesto que el gen codificante de fragmentos de anticuerpos está unido al que codifica la proteína de la cubierta del fago por un codón ámbar, los fragmentos solubles puede secretarse por una cepa no supresora de bacterias infectadas por el fago (Hoogenboom y col., 1991). La unión al antígeno de scFvs solubles en sobrenadantes bacterianos se detectó con el mAb 9E10 (1 \mug/ml) de ratón, que reconoce el péptido etiqueta C-terminal (Munro y Pelham, Cell 46, 291-300, 1986), y un anticuerpo anti-ratón conjugado con peroxidasa (Sigma), tal como se ha descrito (Ward y col., 1989). Las placas se recubrieron con los antígenos FogI, TNF\alpha, tiroglobulina bovina y rsCD4, tal como se ha descrito para los inmunotubos más arriba, y con CEA a 5 mg/ml. Un extracto de orina humano que contiene mucina epitelial polimórfica (PEM) se utilizó a un a concentración proteica de aproximadamente 10 mg/ml.

La especificidad de los clones aislados se ensayó mediante ELISA con fragmentos scFv solubles y se placas se pretrataron con los utilizaron placas recubiertas con varias proteínas. Las antígenos Fog-1, TNF\alpha, tiroglobulina bovina, rsCD4, CEA y PEM tal como se ha descrito más arriba. Se recubrieron también con otras proteínas toda la noche a temperatura ambiente a una concentración de 1 mg/ml en PBS (citocromo c [Sigma]) o en NaHCO3 50 mM, pH 9,6 (albúmina sérica bovina, lisozima de clara de huevo de pavo, lisozima de clara de huevo de gallina, ovoalbúmina de gallina, hemocianina de la lapa [CalBiochem], quimotripsinógeno A, inhibidor de la tripsina de clara de huevo de pollo [Sigma], gamma globulina de pollo unida a ácido 4-hidroxi-3-nitrofenil acético. Los clones positivos en un ensayo ELISA se analizaron por fingerprinting por PCR y digestión con las enzimas de restricción BstNI como en la referencia (Marks y col., 1991, supra) para identificar diferentes clones. Se seleccionaron ejemplos de clones con diferentes modelos de restricción y se secuenciaron las cadenas pesadas y ligeras mediante el equipo Sequenasa (USB) o mediante un equipo de secuenciación Taq DyeDeoxi Terminator Cycle (Applied Biosistems) y Applied Biosistems 373A de secuenciación de DNA.

Los clones secuenciados se analizaron mediante el programa MacVector 3.5 (IBI Kodak, New Haven, CT). Los genes VH se compararon con 83 segmentos de genes de línea germinal presentes en el directorio de VH compilado por Tomlinson y col., (J. Mol. Biol. 227 776-798, 1992). Los genes VL se compararon con 34 segmentos de genes kappa de línea germinal publicados y 13 segmentos publicados de genes lambda. Las regiones codificadas de genes V no se incluyeron en el análisis.

Los fragmentos de anticuerpos humanos seleccionados muestran alta especificidad contra los auto-antígenos

Después de cinco rondas de selección, las células E.coli se infectaron con fago eluido y se estudió la unión de los fragmentos de anticuerpo producidos por clones individuales mediante ELISA. El fago seleccionado con los 20 aminoácidos del péptido MUC1 (Price y col., 1990, supra), que corresponde a un motivo repetido en la mucina humana MUC1 (mucina epitelial polimórfica asociada a tumor o PEM) (Gendler y col., 1988, supra; Gum y col., 1990, supra), se estudió según su unión a la PEM humana y la unión al péptido y a la proteína. Los genes V de los clones con actividad de unión se secuenciaron y se identificó un clon para cada antígeno de CEA, PEM y rsCD4 (Tabla 1). La aparición de un número bajo de clones que se unían a CEA, PE, y al CD4 humano recombinante soluble (rsCD4), después incluso de varias rondas de selección, son consecuencia de la utilización del VCS-M13 (Stratagene) como fago auxiliar (a pesar de que el M13DgIII auxiliar se utilizó para otros antígenos). Las poblaciones de partículas de fagémido producidos por recate con M13DgIII (que no produce pIII) tienen una media de avidez más alta que la producida por rescate con VCS-M13 (pIII de tipo salvaje cuando es codificada por ese fago auxiliar puede competir con fusiones scFv-pIII).

Los fragmentos scFv se investigaron según su unión a un panel de otras proteínas antigénicas, y se encontró que eran altamente específicas. Este aspecto se ilustra en la Fig. 2 con los clones sencillos con actividad de unión al CEA, MUC1 y rsCD4 humanos. Véase la breve descripción de la figura 2 (supra) para su comprensión.

Los fragmentos de anticuerpos dirigidos contra auto-antígenos CEA y MUC1 humanos, que son marcadores tumorales y rsCD4 pueden derivarse de la misma librería y todos ellos tienen una alta especificidad para el antígeno.

Ejemplo 4 Caracterización de fragmentos de anti-auto-anticuerpos mediante secuenciación de DNA y unión al antígeno

Los fragmentos de anti-auto-anticuerpos aislados en los ejemplos 1, 2 y 3 se caracterizaron mediante secuenciación del DNA y unión al antígeno.

Los fragmentos de anticuerpos se derivan de un grupo de genes V no mutados y mutados somáticamente

Las secuencias de varios clones con auto-especificidad se determinaron tal como se describió en el ejemplo 3 y contienen cadenas ligeras kappa y lambda (Tabla II). La comparación de las secuencias de los segmentos de genes V de línea germinal indica que se utilizan varias familias diferentes (VH1, 3, 4 y 5; V\kappa1 y 4, V11, 2 y 3). En unos pocos casos los genes V son completamente de línea germinal, por ejemplo genes como VH y VI de Thy-29. Sin embargo muchos de los genes V tienen algunas diferencias con respecto a los segmentos de los genes V de la línea germinal próxima, a nivel de nucleótido y de aminoácidos (Tabla II), sugiriendo que se derivan de mutaciones somáticas de células B. Algunas mutaciones pueden aumentar durante la amplificación por PCR y el proceso de ensamblaje, por ejemplo los genes VH de un FOG1-G8 y un MUC1 y el gen V\kappa de un Thy-33, probablemente surgidos de entrecruzamientos entre dos genes V durante la amplificación por PCR (Tabla II). Además, amplias diferencias (por ejemplo de V\kappa de FOG1-H6 que difiere en 36 nucleótidos) pueden deberse al uso de un segmento de gen V desconocido. Existe una notable homología en el CDR3 de la cadena pesada entre un TNF-A1 y un TNF-E1: los genes de línea germinal V son diferentes pero se emplea el mismo segmento JH y los residuos 11/16 del CDR3 son idénticos. Esto sugiere que los dos fragmentos scFv pueden unirse al mismo epítopo de TNF.

Los fragmentos de anticuerpo están dirigidos contra diferentes epítopos de la misma proteína

Los fragmentos scFv dirigidos contra la tiroglobulina bovina del ejemplo 2 se investigaron por su unión a la tiroglobulina humana, que difiere solo en 6 residuos de aminoácidos en el promotor (Malthieri, Y. Lissitzki, S (1987) Eur. J. Biochem., 165, 491-498). Para cuatro de los doce clones (incluyendo Thy-29) se encontró unión a la tiroglobulina humana, mientras no ocurrió así con el resto (incluyendo Thy-32 y Thy-33)(los datos no se presentan). De forma similar, los fragmentos que se unen al anticuerpo humano Fog-1 se investigaron por su unión a un grupo de otros anticuerpos que diferían en el isotipo de la cadena pesada y ligera (Fig. 3). Véase para la explicación, una breve descripción en la figura 3(supra). El fragmento de aFOF1-A4 estaba unido a todas las cadenas pesadas g1, 2 y 3 isotipos, pero no a g4 o m. En contraste, los fragmentos aFOG1-H6 y aFOG1-A3 no se unieron a ninguno de los otros anticuerpos, incluyendo aquellos del mismo isotipo, como Fog-1, lo que sugiere que están dirigidos al dominio variable de Fog-1.

Caracterización de fragmentos scFv seleccionados

Los clones siguientes se escogieron de una purificación en amplia escala y una caracterización adicional: aFOG1-H6, aFOG1-A3, aTNF-E7 y aThy-29. Se utilizaron las colonias de una cepa E.coli no supresora HB2151 portadoras del fagémido apropiado para inocular 2 litros de TI 2X con 100 \mug/ml ampicilina y glucosa al 0,1%. Los cultivos se crecieron y se indujeron (De Bellis, Dy Schwartz I. (1990) Nucleic Acid Res., 18, 1311) y los fragmentos scFv etiquetados se purificaron con mAb 9E10 como en la referencia(Clackson y col., 1991, supra y en la patente
WO92/01047).

La inhibición de 125I-Fog-1 que se une al antígeno Rh D por los fragmentos scFv FOG1-H6 y FOG1-A3 purificados por afinidad fue esencialmente como se realizó previamente (Gorick, B.D., Thompson, K.M., Melamed, M.Dy Hughes, J.N. (1988) Vox. Sang., 55, 165-170) con las siguientes modificaciones: Se pre-incubaron 0,0148 \mug de 125I-FOG1 con cantidades variables de los fragmentos aFOG1-H6 o aFOG1-A3 scFv purificados (0-16 \mug) a 37ºC durante 1.5 horas, antes de añadir 0,5 \mul de células R1R2 (o células rr como control). A continuación, la mezcla se incubó durante 1,5 horas a 37ºC con agitación constante y finalmente las células se separaron del sobrenadante. Como control, se realizó una valoración con un fragmento purificado scFv dirigido contra la lisozima de clara de huevo de pavo (aTEL9) (Marks y col., 1991, supra).

Las medidas cinéticas se realizaron con el uso de resonancia plasmón de superficie (BIAcore, Pharmacia Biosensor AB) (Jönsson, U., Fägerstam, L., Ivarsson, B., Lundh, K., Löfas, S, Persson, B., Roos, H., Rönnberg, I., Sjölier, S., Stenberg, E., Stählberg, R., Urbaniczcki, C., Östlin, H. y Malmquvist, M. (1991) Biotechniques, 11, 620-627, Jönsson, U. y Malmqvist, M. (1992) En Turner, A. (ed.), Real Time Biospecific Interaction. JAI Press Ltd., San Diego, Vol 2, pp. 291-336). Para separar especies monoméricas y multiméricas, los fragmentos de scFv purificados se concentraron por filtración y se fraccionaron después en una columna calibrada de Superdex 75 FLP (Pharmacia) en PBS, EDTA 0,2 mM. La filtración en gel se monitorizó por absorvancia a 280 nm y por on-line con BIAcore con un antígeno inmobilizado en un chip sensor (Johnsson y col., 1991).

Los experimentos de cinética se realizaron en dos configuraciones diferentes. Primero, para analizar la unión a scFv soluble, diferentes antígenos se inmovilizaron covalentemente en un chip sensor (en el caso de mAb Fog-1, el anticuerpo se inmovilizó también mediante un mAb anti-humano cadena ligera kappa de ratón con un chip sensor recubierto con una IgG1 de conejo anti-ratón). Segundo, para analizar la unión del mAb soluble, el aFOG1-H6 scFv se inmovilizó en la superficie del chip.

Los antígenos se acoplaron a un chip sensor a través de sus grupos amino mediante el equipo Amine Coupling (Pharmacia Biosensor AB) (Jhonsson, B., Löfas, S. y Lindqvist, G. (1991) Anal. Biochem., 198, 268-277). Los antígenos se diluyeron en tampón acetato 10 mM pH 5,0 hasta aproximadamente 25 \mug/ml, y 3805 unidades de resonancia (RU) de TNF, 6249RU de tiroglobulina humana, y 5279 RU de FOG1 se inmovilizaron. Para la presentación bioespecífica de Fog-1, se acopló una IgG1 de conejo anti-ratón purificada por afinidad (Pharmacia Biosensor AB) a la superficie, seguido por un mAb de ratón anti-kappa humana (2300 RU) y después Fog-1 (2050 RU). Como la unión del IgG1 de conejo anti-ratón al mAb de ratón es reversible por HCl 10 mM, el complejo se reconstruyó en cada ciclo de análisis. ScFv anti-Fog-1 se acopló con la superficie de CM5 a 1538 RU. Todas las determinaciones se realizaron a 25ºC en PBS, EDTA 0,2 mM, tensoactivo BIAcore P20 al 0,05% con un flujo constante de 10 \mul/min, y un volumen de muestra inyectada de 35 \mul. No fue necesario regenerar el antígeno ya que los fragmentos scFv se disociaron rápidamente, con la excepción de la presentación bioespecífica del antígeno por la IgG1 de conejo anti-ratón que se regeneró en HCl 10 mM durante 3 minutos.

Los análisis del monómero scFv se realizaron en el intervalo de concentración de 100-500 nM y los dímeros en el intervalo de 40-200 nM a excepción de Fog-1 presentado bioespecíficamente con concentraciones de scFv dimérico de 0,25-1,26 \muM. Fog-1 se analizó sobre la superficie de aFOG1-H6 scFv en el intervalo de concentración de 10-200 nM. Todas las concentraciones se calcularon a la absorción U.V. a 280 nm (asumiendo que 0,7 mg/ml scFv rinde una A280=1 [Mach, H., Middaugh, C.Ry Lewis, R.V. (1992) Anal. Biochem. 200, 74-80], y que Mr o un scFc monómero es 30 kD y de un dímero es 60 kD). No se ha realizado ninguna corrección para la fracción de proteína activa y por tanto los valores obtenidos están estimados por defecto. La evaluación cinética de los datos se realizó según (Karlsson, R., Michaelsson, A., y Mattsson, L. (1991) Jynmunol. Methods, 145. 229-240) y se evaluaron en el programa Origin 1.1 (Microcal Inc., Northampton, Mass., USA).

Dos de los fragmentos de anticuerpos están dirigidos contra idiotipos del mAb humano Fog-1

La unión del anticuerpo 125I-Fog-1 a las células rojas de la sangre humana que portan el antígeno Rh D pudo inhibirse con los fragmentos scFv aFOG1-H6 y aFOG1-A3. Así los dos, aFOG1-H6 y aFOG1-A3, son anticuerpos anti-idiotipos de sitio específico asociados en complejos con el antígeno de unión a de Fog-1. La inhibición abarca de la unión 125I-Fog1 al antígeno Rh D (R1R2 células rojas sanguíneas humanas) y se determinó mediante titulación de los fragmentos aFOG1-H6 y aFOG1-A3 scFv purificados por afinidad. (Como control, la no inhibición de la unión de 125IFog-1 se observó con un fragmento scFV (aTEL9) (Marks y col., 1991, supra) dirigido contra lisozima de clara de huevo de pavo). Con un máximo de 16 \mug scFv (exceso molar de 1000 veces para 125Ifog-1), la unión se inhibió un 14,2% (aFOG1-H6) y 20,9% (aFOG1-A3), sugiriendo que la afinidad de estos fragmentos para Fog-1 es más pequeña que la afinidad de Fog-1 para el antígeno Rh D (Ka = 2,2 X 10^{9} M^{-1}) que se une monovalentemente (Gorick y col., 1988, supra). Si el 100% de los fragmentos son activos, las afinidades de dos fragmentos por su unión a Fog-1 podría estimularse a una Ka = 3 X 10^{5} M^{-1} para aFOG1-H6 y 6 X 10^{5} M^{-1} por aFOG1-A3, y esto es consistente con otras medidas cinéticas (véase más abajo y la Tabla III).

Los fragmentos scFv pueden formar monómeros y dímeros en solución

Los fragmentos de anticuerpo solubles que se purificaron de sobrenadantes de bacterias por cromatografía de afinidad, por unión al péptido etiqueta C-terminal al mAb 9E10. Después de ultrafiltración, los fragmentos se purificaron en gel filtración FPLC (Pharmacia), y se detectaron en el mismo sitio ambos con absorción UV (280 nm) y por unión al antígeno inmovilizado en un chip sensor en un aparato BIAcore (Pharmacia Biosensor AB). Los fragmentos scFv emergieron en dos picos, correspondientes al tamaño de los monómeros y los dímeros. Los dímeros se unen más fuertemente al antígeno inmovilizado que los monómeros debido a su mayor avidez por la unión. Los dímeros scFv corren como monómeros en geles de SDS en condiciones no reductoras, y no están unidos por uniones bisulfuro. Como los dos picos se ven en gel filtración, parece que no exista una conversión rápida entre monómeros y dímeros. Se presume que los dímeros son fragmentos scFv retenidos a través del segmento flexible de cadenas pesadas y ligeras, o con la cadena pesada de una molécula scFv asociada con la cadena ligera de otra. Observamos que los fragmentos de anticuerpo Fab obtenidos en bacteria, pueden también multimerizar (datos sin publicar).

Los fragmentos scFv tienen actividades micromolares

La presencia de dos scFv monómeros y dímeros pudo llevar a sobreestimar la afinidad de unión mediante los métodos de fase sólida. Para determinar la afinidad y la cinética de la unión de fragmentos scFv al antígeno que recubre el chip mediante una resonancia plasmón de superficie, nosotros purificamos los fragmentos por gel filtración (Tabla III). Para los dímeros, las constantes off-rate se determinaron alrededor de 10^{-1}s^{-1} y las constantes on-rate para scFv dímeros fueron alrededor de 10^{5}-10^{8} M^{-1}s^{-1} (asumiendo que la muestra fuera completamente activa). En el caso de aFOG1-H6, el antígeno (el mAb Fog-1) se inmovilizó en el chip sensor de dos maneras, directamente o mediante anticuerpo anti-ratón IgG1 de conejo. Los resultados fueron casi idénticos por cualquiera de los dos métodos (véase Tabla III). Sin embargo, la fracción activa de los fragmentos scFv varía considerablemente y puede llevar a una estimación por defecto del on-rate (y de la afinidad de unión); por ejemplo, utilizó el apagado de la fluorescencia para la dosificación con varios fragmentos scFv dirigidos contra la feniloxazolona; detectándose sólo lugares funcionales de unión por molécula scFv entre 0,06 y 0,38 (datos sin publicar). En efecto las constantes de on-rate calculadas para la asociación de fragmento aFOG-1H6 y anticuerpo Fog-1 dependen de si el anticuerpo (K_{on} 2,2 X 10 ^{5} N ^{-1} s^{-1}) o el fragmentoscFv está inmovilizado en el chip sensor (Tabla III), indicio de que el fragmento aFOG1-H6 es menos activo que el anticuerpo Fog-1. Para los monómeros scFv, las señales de unión son menores y es difícil de seguir la cinética de unión a la superficie, excepto para la disociación del monómero Thy-29 (K_{off} = 2X10^{-2}s^{-1}). Sin embargo, la estabilización de los cuatro pliegues del fragmento dímero Thy-29 (véase más abajo), sugiere que las constantes de off-rate de otros monómeros son >10^{-2}s^{-1}, tal vez 10^{-1}s^{-1}.

La mayor estabilidad de los dímeros scFv en el chip sensor, comparado con los monómeros, indica que los dímeros son bivalentes. Los dímeros scFv son, por tanto, análogos a las dos cabezas de anticuerpo IgG (pero con diferente espaciamiento entre las cabezas), y su avidez por la unión se estimó alrededor de 10^{7}M^{-1} para K_{on}/K_{off} (Tabla III). Las afinidades de los monómeros deben ser menores en virtud de su disociación más rápida en la superficie. Para los monómeros de la Thy-29 y asumiendo que la constante on-rate es la misma que para el dímero (Mason, D. Wy Williams, A.F. (1986) Kinetics of Antibodi Reactions and the Analisis of Cell Surface Antigens. Blackwell Scientific, Oxford), podemos estimar una afinidad de alrededor de 3 X 10^{6}M^{-1}. Estas afinidades, calculadas a partir de la tasa de las constantes calculadas con resonancia plasmón de superficie de unión, resultaron ser similares a aquellas cuantificadas en solución por técnicas de apagado de la fluorescencia. Por ejemplo, la afinidad de unión del fragmento monómero scFv aTEL9 (Marks y col., 1991) que se une a la lisozima de pavo (y que derivaba de la misma librería) se estimó de 3,9 X 10^{7} M^{-1} mediante la resonancia plasmon de superficie (Tabla III), y 1,2 X10^{7} M^{-1} por apagado de la fluorescencia (Marks y col., 1991, supra).

Las afinidades de los anticuerpos aislados son típicas de anticuerpos de la respuesta inmune primaria de ratón (Foote, J. y Milstein, C. (1991) Nature, 352, 530-532). La cinética de asociación de fragmentos de anticuerpo a los auto-antígenos de la proteína (10^{5} a 10^{6} M^{-1} s^{-1}) es también típica de las interacciones Ab-proteínas previamente caracterizadas. Sin embargo las cinéticas de disociación (10-2s-1) son relativamente rápidas para las interacciones Ab-proteína (pero ambas tasas son lentas comparadas con varias interacciones Ab-hapteno). Resulta sorprendente que se pueda aislar fragmentos scFv con tales off-rates rápidas y no se esperaría que un fago "monomérico" quedase retenido en el soporte sólido durante el lavado. Sin embargo, los fragmentos se disponen de manera multivalente en el fago, especialmente cuando se utiliza el fago auxiliar M13DgIII, y algunos de los scFvs que tienden a formar dímeros en solución, pueden también formar dímeros en el fago. Las interacciones multivalentes con el antígeno ayudan a retener el fago, permitiendo el aislamiento del fago codificado scFv.

La combinación al azar de repertorios de genes V derivados del mRNA de animales inmunizados está enriquecido por las cadenas pesadas o ligeras de genes V codificando parte de los sitios de unión del antígeno y esto facilita el aislamiento de los fragmentos de unión al antígeno mediante la tecnología de fagos, a pesar de que las combinaciones de genes V de cada linfocito B parecen estar bastante destruidas. Los sitios de unión antigénica pueden generarse también de novo por la combinación al azar de las cadenas, tal como se ilustra en el aislamiento de fragmentos scFv contra antígenos foráneos de donantes humanos no inmunizados (Marks y col., 1991, supra).

Los "autoanticuerpos naturales", anticuerpos auto-reactivos aislados de donantes sanos, tienden a ser de baja afinidad y poliespecíficos y pueden ser producidos por un grupo discreto de células B (Holmberg, D. y Coutinho, A. (1985)Immunol. Today, 6, 356-357), en parte contribuyen a la actividad interna de grupo las células B CD5+ (Casali, P. y Notkins, A.L. (1989) Annu. Rev. Immunol., 7: 513-535). En contraste, los fragmentos anti-auto scFv que se fabricaron, eran altamente específicos en la unión al antígeno a pesar de presentar sólo afinidades micromolares. Este es un hallazgo sorprendente y valioso. Sus afinidades podrían presumiblemente aumentarse in vitro; por ejemplo, la afinidad de un framgneto scFv por el hapteno derivado de la feniloxazolona de la librería de fagos (y de manera similar a los anticuerpos anti-auto descritos aquí, con una relativa off-rate rápida), se aumentó de Ka = 3.1 X 10^{6}M^{-1}a 9.1 X 10^{8}M^{-1} por barajamiento de cadenas (WO92/01047; Marks y col., 1992b, Biotechnology 10, 779-783, 1992). Esto permitiría la creación de anticuerpos humanos altamente específicos, con alta afinidad contra los auto-antígenos, para uso en la terapia humana.

Ejemplo 5 Creación de una librería de síntesis

Mediante expresión de los repertorios de anticuerpos en la superficie de fagos filamentosos y la selección del fago con el antígeno^{1}, podemos mimetizar la selección inmune^{2,3} y fabricar anticuerpos humanos de genes V reordenados de donantes no inmunizados^{4}. Los anticuerpos humanos han sido fabricados por síntesis de elementos de genes V definidos. Un repertorio de 49 segmentos de genes V_{H} humanos de línea germinal se reordenaron in vitro por combinación de un "segmento D" sintético de cinco residuos aminoacídicos al azar y un segmento J, para crear una tercera región determinante de la complementariedad (CDR) de ocho residuos. Los genes V_{H} reordenados se clonaron en un Vlambda3 de cadena ligera humano como un fragmento de cadena simple Fv para la expresión en fagos. La librería de 10^{7} fagos, se cribó con un hapteno, 2-feniloxazol-5 (phOx) conjugado con la albúmina sérica bovina (BSA), y el fago aislado que codifica para fragmentos con actividad de unión específica para phOx-BSA, y con afinidades para phOx-gamma-ácido aminobutírico (phOx-GABA) en el intervalo micromolar. La comparación de veinte clones con secuencias únicas mostraron que la "respuesta inmune" in vitro al hapteno fue ampliamente restringida para el segmento V_{H}26 (familia V_{H}3)^{6} con un residuo variante aromático (Tyr, Phe, Trp) en el residuo 98 de CDR3. El uso de genes V reordenados in vitro quizás permita el diseño de librerías de anticuerpos decantadas hacia la unión de antígenos de estructura conocida, y la creación de anticuerpos humanos terapéuticos con inmunogenicidad reducida.

El dominio variable de un anticuerpo consiste en una hoja \beta con tres lazos de secuencia hipervariable o CDRs^{5}. Los lazos crean lugares de unión del antígeno de formas variadas, incluyéndose desde superficies planas^{7} a bolsillos^{8}. Para las cadenas pesadas humanas, la diversidad de la secuencia de los primeros dos CDRs, se codifica por un repertorio de alrededor de 50 segmentos VH de línea germinal (I.M. Tomlinson y col., supra). El tercer CDR se genera de la recombinación de esos segmentos con alrededor de treinta segmentos D y seis segmentos J.^{9}, y a pesar de que la secuencia es altamente variable, frecuentemente incluye un puente de la Asp 101 del lazo a la Arg94 de la pauta^{10}. Las estructuras y las longitudes de los dos primeros CDRs están restringidas^{10, 11}, pero en el CDR3 difieren ampliamente, con longitudes en el intervalo de los 4 a los 25 residuos^{5}.

Se creó una librería de genes V_{H} reordenados con una CDR3 de ocho residuos que incluía la Asp101, en combinación con un Vlambda3 de cadena ligera (ref. 12). Cuarenta y nueve segmentos V_{H} de línea germinal, incluídos la mayoría de los genes humanos del repertorio V_{H} (Tomlinson y col., supra) se amplificaron cada uno por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)^{13} y en los oligonucleótidos cebadores se introdujo un segmento sintético D (de 15 bases de secuencia al azar en el extremo 3' del segmento V_{H}) y un segmento J junto a un lazo CDR3 de ocho residuos (Fig. 4). Los segmentos reordenados se juntaron y se clonaron para su expresión en fagos con un Vlambda3 de cadena ligera humana, y crearon una librería sintética de 10^{7} clones de fagos. Como en el sistema inmune, la librería sintética de 10^{7} clones, puede interceptar sólo una fracción pequeña de la diversidad potencial. Por tanto, la diversidad es potencialmente de 49 X 32^{5} = 1,6 X 10^{9} secuencias nucleotídicas diferentes, o 49 X 20^{5} = 1,6 X 10^{8} secuencias aminoacídicas diferentes.

La librería se sometió a cuatro rondas de crecimiento y cribado en tubos recubiertos de albúmina sérica bovina (BSA) y se analizaron los clones como fragmentos solubles^{14} Fv de cadena simple^{15, 16} por su actividad de unión al phOX-BSA mediante ELISA^{4}. Después de la tercera y cuarta rondas, se identificaron 14/96 y 61/96 clones con actividades de unión al phOXBSA y de esos (29 analizados) ninguno unido a otras proteínas (véase la leyenda de la Tabla B). Además, su unión a las placas recubiertas de phOx-BSA puede competir con las del hapteno soluble (Tabla B).

La secuenciación reveló que muchos (21/29) de los unidos a phOx eran únicos, con un CDR3 de ocho residuos y utilizaron tanto un segmento de la familia V_{H}4, o uno de los tres segmentos de la familia V_{H}3 (Tabla B). Estos segmentos juntos, utilizan tres de los siete pliegues "canónicos" disponibles para los dos primeros lazos hipervariables de los segmentos humanos V_{H} (C. Chothia, y col., supra). La mayoría de los clones únicos (16/21) derivaron del segmento VH26^{6} y tiene secuencias relacionadas en el tercer lazo hipervariable: en ese grupo el primer residuo tiende a tener un lugar en la cadena de ramificación alifática (15/16), el segundo residuo tiende a ser lisina o arginina (11/16), mientras el cuarto residuo es siempre un residuo aromático (frecuentemente tirosina).

Las afinidades (Kd) de dos fuertes ligandos (Ox13 y Ox31, Tabla B) para pHOX-GABA fueron determinadas por valoración de la fluorescencia asociada^{17} como 3,1 \pm 0,2 \muM y 6,7 \pm 0,7 \muM, respectivamente. Aunque el anticuerpo de la librería de síntesis pierda los diversos tamaños de VH-CDR3 y de las cadenas ligeras distintas de anticuerpos generados in vivo, las afinidades para phOx-GABA se relacionan con 0,5 \muM para un anticuerpo (en fago) generado de donantes no inmunizados^{4}, o 1 \muM para algunos hibridomas procedentes de la respuesta inmune primaria en ratón (pero véase caveat, leyenda de la Tabla A). Para aumentar estas afinidades, uno puede sistemáticamente alterar (véase más abajo) los abundantes anticuerpos phOx seleccionados (Tabla A).

En principio, el uso de librerías de expresión en fago de genes V reordenados in vitro ofrece una alternativa atractiva para el reordenamiento in vivo^{4}. Las regiones de pauta de lectura y los dos lazos hipervariables de dos cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos sintéticos humanos creados de la librería son esencialmente de línea germinal. Esto contrasta con los anticuerpos de fago "primarios" manipulados procedentes de genes V humanos reordenados in vivo, en los que la extensión de las mutaciones somáticas varia ampliamente^{4}. Dejando a un lado el polimorfismo, los segmentos de genes VH son idénticos en diferentes individuos y los anticuerpos sintéticos presentan una menor inmunogenicidad potencial. Por alteración de los tamaños de las secuencias de los lazos CDR3 de las cadenas pesada y ligera o por localización de las mutaciones mínimas en los otros lazos CDR, o por mezcla con la "línea germinal" de cadenas ligeras sintéticas^{19,20}, puede ser posible aumentar sus afinidades siempre que se retenga su carácter de línea germinal.

TABLA A

1

Tabla A

Composición de la librería de síntesis

Se utilizaron cuarenta y nueve segmentos de V_{H} humanos (Tomlinson y col., supra), uno por cada uno de las familias génicas V_{H}2,V_{H}5,V_{H}6 y de los segmentos múltiples para las otras tres familias y se clonaron según la familia. Los clones de los segmentos V_{H} de cada familia se examinaron para la presencia de inserto (una media de 85%) y se precipitaron en una única librería extensa, como en la Tabla B, creando un sesgo (controlado) para ciertas familias génicas. Los segmentos de las familias V_{H}2,V_{H}5, V_{H}6 están sobre-representados con respecto a los segmentos de otras familias. La secuenciación de cincuenta cinco clones de la librería sin selección confirmaron que los segmentos V_{H} de cada familia estaban presenten y que los nucleótidos estaban presentes en las proporciones esperadas en el segmento D, pero parcial y débilmente para C. (Por primera vez una segunda posición en cada codón, A, 21.3%, G, 17.9%, C33 7% y T, 27.1%, en la tercera posición, G, 42.6% y T, 57.4%). Estos niveles de expresión de los fragmentos de anticuerpos se examinaron también y los segmentos V_{H} se identificaron en clones con niveles de expresión detectables, por ejemplo V_{H}1(DP-7), V_{H}2(DP-27), V_{H}3(DP-29, 35, 38, 44, 47, 51, 53), V_{H}4(DP-63, 69), V_{H}5(DP-3), V_{H}6(DP-74).

Métodos

Los clones se examinaron para la presencia de un inserto por "cribado con PCR"^{21} con oligonucleótidos LMB3 y PHWN-SEQ (ref. 4)y la secuencia de doble cadena de DNA por el método^{22} dideoxi- de terminación de la cadena con oliognucleótidos LINKSEQ (5'-CGA TCC GCC ACC GCC AGA G-3'). (Los números en las tablas se corrigieron para el inserto). Los fragmentos solubles de scFv expresados, fueron examinados a partir de 10 \mul del sobrenadante del cultivo E.coli HB2151 inducido toda la noche(ref. 14) distribuidos en un filtro de nitrocelulosa mediante un dispensador (Minifold II, Schleicher and Schuell), y se detectaron los fragmentos scFC unidos al péptido-etiqueta con el anticuerpo 9E10^{23} y los anticuerpos anti-ratón marcados con peroxidasa (Sigma).

TABLA B

2

Tabla B

POx-ligandos aislados de la librería de síntesis

Un oligonucleótido sintético SYNLIB1 (Véase Tabla IV) introdujo un segmento D con un residuo de cinco aminoácidos de secuencia al azar, un segmento J y una diana de restricción XhoI al extremo 3' de cada uno de los 49 segmentos VH de línea germinal (Tomlinson y col., supra). El cebador se utilizó en una reacción en cadena de la polimerasa^{13} con unos cebadores basados en un segmento de la familia V_{H} (VHBACK) que incorporaron un lugar NcoI^{4}, HuVH1BackSfi a HuVH6BackSfi. Cada clon del segmento V_{H} (en forma de molde de cadena simple en un vector M13) se amplificó separadamente a 94ºC durante 1 min, 50ºC durante 1,5 min, durante 25 ciclos en un termociclador PHC-3 (Techne). Cada amplificación se analizó mediante electroforesis en gel de agarosa y cantidades de DNA similares de segmentos V_{H} de la misma familia se precipitaron, digirieron con NcoI y XhoI y se clonaron en un vector pHEN1 (ref. 14) que lleva el dominio variable de un Vlambda3 de cadena ligera reordenado (IGLV3S1; ref. 12) tomado de un fragmento scFv que se une al BSA^{4}.

Si en lugar de un oligonucleótido al azar, se utiliza un oligonucleótido codificante para un CDR, p.ej., de un roedor, éste podría causar la huella de un CDR no-humano en el producto sintético de la librería.

Referencias mencionadas en el Ejemplo 5

1. McCafferty, J., Gruiffiths, A.D., Winter, G. & Chiswell D.J. (1990). Nature, 348, 552-554.

2. Milstein, C. (1990). Proc. R. Soc Lond Biol, 239, 1-16.

3. Winter,G & Milstein, C (1991). Nature, 349, 293-299.

4. Marks, J.D., y col., (1991). J. Mol. Biol., 222, 581-597.

5. Kabat, E.A., Wu, T.T., Reid-Miller, M., Perry, H.M. & Gottesman, K.S. Sequences of proteins of immunological interest (US Department of Health and Human Services, US Governement Printing Office, 1987).

6. Matthyssens, G. & Rabbits, T.H. (1980). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 6561-6565.

7. Amit, A.G., Mariuzza, R.A., Phillips, S.E. & Poljak, R.J. (1996). Science, 233, 747-753.

8. Alzari, P.M., y col., (1990). Embo J, 9, 3807-3814.

9. Ichihara, Y., Matsuoka, H. & Kurosawa, Y (1988). Embo J, 7, 4141-4150.

10. Clothia, C. & Lesk, A.M. (1987). J. Mol Biol, 196, 901-917.

11. Clothia, C., y col. (1989). Nature, 342, 877-883.

12. Fripiat, J.O., y col. (1990). Nucleic Acids Res, 18, 7134.

13. Saiki, R.K., y col., (1985). Science, 230, 1350-1354.

14. Hoogenboom, H.R., y col., (1991). Nucleic Acids Res, 19, 4133-4137.

15. Huston, J.S. y col., (1988). Proc Natl Acad Sci USA, 85, 5879-5883.

16. Bird, R.E. y col., (1988). Science, 242, 423-426.

17. Eisen, H.N. (1964). Meth. Med Research, 10, 115-121.

18. Foote, J & Milstein, C. (1991). Nature, 352, 530-532.

19. Clackson, T., Hoogenboom, H.R., Griffiths, A.D. & Winter, G (1991). Nature, 352, 624-628.

20. Roberts, A.J., y col (1992). Bio/Technology, en publicación.

21. Gussow, D. & Clakson, T. (1989). Nucleic Acids Res. 17, 4000.

22. Sanger, F., Nicklen, S. & Coulson, A.R. (1977). Proc. Natl. Acad Sci USA, 74, 5463-5467.

23. Munro, S. & Pelham, H,.R.B. (1986). Cell, 46, 291-300.

24. Chen, P.P., Liu, M.F., Sinha, S & Carson, D.A. (1988). Arthritis Rheum, 31, 1429-1431.

25. Berman, J.E., y col., (1988). Embo J, 7, 727-738.

26. Matsuda, F., y col (1990).Embo J, 9, 2501-2506.

27. Sanz, I., y col., (1989). Embo J, 8, 3741-3748.

28. Rath, S., Stanley, C.M. & Stewart, M.W. (1988). J. Immunol Methods, 106, 245-249.

Ejemplo 6 Aislamiento de fragmentos de anticuerpos específicos para el factor de necrosis tumoral-\alpha de una librería humana de síntesis procedente de línea germinal

Se aisló un clon que codifica para un fragmento de anticuerpo específico para el factor de necrosis tumoral- \alpha de una librería humana de síntesis procedente de línea germinal. Esta librería se preparó tal como se describió en el ejemplo 5, a excepción de que se utilizó el oligonucleótido SYNLIB2 en lugar de SYNLIB1, de manera que se generaron 5 aminoácidos V_{H} CDR3. La librería se cribó contra el factor de necrosis tumoral-\alpha, tal como se ha descrito en el ejemplo 1 para la librería derivada de humanos sin inmunizar. Después de cuatro rondas de cribado, un anticuerpo de fago (y su correspondiente fragmento soluble) se aislaron según su actividad de unión al TNF. La región del fragmento scFv (\alphaTNF-10) se derivó del segmento DP-45 V_{H} (Tomlinson y col., 1992, supra). Los clones unidos al hapteno \alphaNIP-6, \alphaNIP-12, \alphaOx-15 y \alphaOx-18 también derivaron del mismo segmento, aunque cada uno de esos fragmentos fueron específicos para la unión del hapteno o el TNF. Esto indica que pueden crearse sitios de unión al antígeno con especificidades enteramente diferentes en la misma pauta de lectura del anticuerpo por substitución de únicamente el CDR3. La unión a los antígenos no específicos se determinó por ELISA tal como se ha descrito en el
ejemplo 1.

Ejemplo 7 Aislamiento de fragmentos de cadena simple Fv por unión a la tiroglobulina humana y a un anticuerpo monoclonal humano de una librería humana de síntesis que contiene secuencias VH CDR3 de diferente tamaño, procedente de línea germinal

Una librería humana de síntesis de fragmentos de cadenas sencillas Fv de línea germinal se preparó de manera análoga a la librería del Ejemplo 5, para incluir los segmentos V_{H} de línea germinal y los sintéticos de las regiones DH y JH, que generaron regiones VH CDR3 de entre 4 y 12 aminoácidos. Se proporcionó una cadena ligera sencilla reordenada de línea germinal. Esta librería de fago ha sido utilizada como fuente de fragmentos de anticuerpo con especificidades anti-humanas.

Cincuenta segmentos de genes V_{H} de línea germinal (Tomlinson y col., 1991, supra, como en el Ejemplo 5) se amplificaron con oligonucleótidos para introducir un CDR3 completamente al azar, variando en tamaño de los 4 a los 12 residuos. En una primera reacción de PCR, cada gen se amplificó con su cebador VHBACK específico de familia (uno de VH1BACKfi a VH6BACKSfi; Marks y col., 1991, supra; según la patente WO92/01047) en el extremo 5' y con unión en el extremo 3' de cada uno de los oligonucleótidos de las series SYNLIB4 - SYNLIB12 (Tabla IV). La PCR contenía 2,5 pmol de cada uno de los componentes de un par de cebadores adecuado para una mezcla de reacción de 50 \mul que contenía 250 \muM dNTPS, 10 mM KCl, 10 mM (NH_{4})_{2}SO_{4}, 20 mM Tris HCl (pH 8,8), 2 mM MgCl2, 100 \mug/ml BSA y 1 \mul (1 unidad) de polimerasa Taq de DNA (Cetus). El molde consistió en 1 \mul de cultivo bacteriano de E.coli infectado con un clon de fago M13 codificante para una línea germinal apropiada del gen V. El ciclo de amplificación consistió en 94ºC durante 1 min, 55ºC durante 1 min y 72º durante 1,5 min. Después de 25 ciclos, se añadieron 30 pmol del mismo oligonucleótido VHBACK y 30 pmol de JHSAL (Tabla IV) y la PCR continuó durante 15 ciclos adicionales, que introdujeron un lugar de clonado SalI en el extremo 3' terminal del gen VH. Después de verificar que una banda del tamaño apropiado se veía en un gel de agarosa por electroforesis, los productos de PCR de todas las amplificaciones hechas con el mismo cebador SYNLIB se recogieron, cortaron con NcoI y SalI y clonaron en NcoI-XhoI-cortado pHEN1-V3 (pHEN1 que contenía clonado IGLV3S1) tal como en el Ejemplo 5. En este proceso, se realizaron 9 librerías (cada una con su tamaño particular de CDR3) cada una conteniendo entre 5 X 10^{6} y 5 X10^{7}clones.

Selección

Los fagos se prepararon de nueve librerías diferentes por rescate con VCS-M13 como se describe en el Ejemplo3. El fago de las nueve librerías individuales se mezcló hasta obtener una librería extensa y se sometió a cribado con cada uno de los 2 antígenos: Se recubrieron inmunotubos con OAK3 (anticuerpo humano D anti-Resus, IgG3, k) durante toda noche en tampón carbonado (0.1 M NaHCO_{3}, pH 9,6 a 100 \mug/ml) o tirobglobulina humana (recubierta con 100 \mug/ml en PBS). Las selecciones se realizaron como en el Ejemplo 3.

Cribado

El ELISA se realizó tal como se describe en Hoogenboom y col., 1999, supra. Las placas de ELISA se recubrieron toda la noche con 100 \mug/ml de OAK3 a temperatura ambiente o con 100 \mug/ml de tiroglobulina humana a temperatura ambiente.

Resultados

Después de cuatro rondas de selección con tubos OAK3-recubiertos, se emplearon fagos eluidos para infectar HB2151, y los fragmentos solubles scFV se analizaron por su unión en un ELISA. Se contaron 59/96 clones positivos en el ELISA de OAK3.

La librería sintética humana de línea germinal se sometió a 5 rondas de selección en tubos recubiertos con tiroglobulina humana, contándose 80/96 clones positivos en un ELISA de clones individuales rescatados con VSC-M13.

Dos de cada uno de los clones positivos, se analizaron en ELISA según unión a un grupo de antígenos (OAK3, tiroglobulina humana, phOx-BSA, NIP-BSA, BSA, ovoalbúmina, quimotripsinógeno-A, estreptavidina, citocromo c, KLH, lisozima de huevo blanco de pavo). Los dos clones que se unieron a OAK-3 (como fragmentos solubles scFv) dieron señales 3 veces más altas que el fondo en los ELISA con OAK3. Los dos clones que se unieron a tiroglobulina (como fragmentos scFv expresados en el fago) dieron señales aproximadamente 5 veces mayores que el fondo en el ELISA con tiroglobulina. Todos los clones resultaron altamente específicos para el antígeno para el que habían sido seleccionados. Los segmentos VH de cuatro clones se identificaron de la familia VH3 por su hibridación con los cebadores específicos de la familia (J.D. Marks y col., Eur. J. Immunol. 21 985-991, 1991). El tamaño de CRD3 de cada clon se analizó por amplificación del CDR3 con oligonucleótidos CDRFOR y CDRBACK (Tabla IV) y se analizó el producto en geles de poliacrilamida al 8%. Para los dos clones que se unían a OAK3, se encontraron tamaños de 4 a 7 residuos de aminoácidos, mientras los clones que se unieron a la tiroglobulina tienen un tamaño de CDR3 de 10 residuos.

Los fragmentos de anticuerpo scFv que se unen a un anticuerpo monoclonal humano y a un auto-antígeno humano han sido aislados de una librería humana de síntesis de línea germinal.

Ejemplo 8 Aislamiento de fragmentos de anticuerpos desencadenantes de la actividad del receptor de la interleucina 1

La librería de fragmentos Fv de cadena simple derivados de un humano sin inmunizar que se ha descrito en el Ejemplo 1, se utilizó para la selección de anticuerpos que desencadenarán la actividad del receptor de la interleucina 1. Los fragmentos de anticuerpos se aislaron primeramente porque se unen al dominio externo soluble del receptor de la interlecuina 1 (IL-1R) de las células T. Los clones de anticuerpo que se han identificado, se analizaron en ensayos de actividad biológica con interleucina tipo 1. El IL-1R de células T, murino o humano, es altamente homólogo a la glicoproteína de superficie celular de 80 KD que se une a la interleucina-1\alpha y interleucina-1\beta. Un clon de cDNA que codifica 316 aminoácidos N terminales del dominio externo del receptor murino ha sido expresado en células HeLa (S.K. Dower y col., J Immunol. 142 4314-4320 1989). Esa molécula soluble del receptor expresada y purificada muestra propiedades de unión indistinguibles de la molécula de IL-1R completa, un complejo que se forma entre la molécula única soluble IL1-R y el IL-1. Esta molécula de receptor soluble se une a la interlecuina-1 humana. El receptor de la interleucina de las células T humanas ha sido clonado y secuenciado por J.E. Sims et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 8946-8950, 1989). El dominio externo soluble del receptor humano de IL1, los aminoácidos 1 a 316, se expresó en células HeLa y se purificaron tal como se ha descrito para el receptor murino.

La librería humana sin inmunizar rescatada, se selecciona contra el receptor recombinante soluble de IL-1 que corresponde al dominio externo del receptor de IL-1. Los inmunotubos se recubrieron con el receptor soluble de IL-1 como se ha descrito en el Ejemplo 1 para un total de cuatro rondas de selección por afinidad.

Los clones que se unen al receptor soluble IL-1, se caracterizaron por ELISA mediante microplacas recubiertas con 10 \mug/ml del receptor soluble recombinante IL-1, como se ha descrito para el TNF-\alpha en el Ejemplo 3. Los fragmentos de anticuerpo que muestran señales significativas en el ELISA, con receptor soluble de IL-1 pero no con antígenos no específicos se escogieron para su estudio posterior.

Los clones de anticuerpo aislados de esta manera se expresan como fragmentos solubles en E.coli y se purificaron tal como se describe en el Ejemplo 4 por cromatografía de afinidad con mAb 9E10. La unión a los receptores humanos se realiza mediante fragmentos de anticuerpo marcado con ^{125}I contra una línea celular de fibroblastos humanos TIG-1 que expresan el receptor de la interleucina-1 básicamente como describió T.Taki y col. (Eur. J. Immunol. 22 1221-1227 1992) para la determinación de la afinidad de ^{125}I IL-1\alpha al receptor de esas células. Los fragmentos purificados de anticuerpo que presentan unión al receptor se utilizan para el cribado en un ensayo biológico con células humanas epiteliales para examinar la estimulación de la síntesis de prostaciclina (PG2) y factor activador de las plaquetas (PAF) tal como describió E. Dejana y col. (Blood 69 695-699, 1987). Estos estudios identificarán los fragmentos de anticuerpo que tienen anti-auto especificidad contra el receptor de IL-1 y desencadenan la actividad del receptor. La actividad puede cuantificarse en relación a la interleucina-1\alpha humana con un bioensayo estándar, por ejemplo, proliferación del D10S auxiliar línea celular T mediante incorporación de ^{3}H-timidina (S.F. Orencole y C.A. Dinarello Cytokine 1 14-22 1989) o un ensayo de conversión en proliferación como describió A.J. Gearing y col., (J. Immunol. Methods 99 7-11. 1987).

TABLA I

3

Las proporciones indican la frecuencia de unión de los clones después de cada tanda de selección. Los fagémidos se rescataron con el fago auxiliar M13DgIII, excepto para la selección de CEA, MUC1 y rsCD4, donde se utilizó el fago auxiliar VCS-M13.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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TABLA II

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4

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Las referencias para todas las cadenas pesadas de los genes de línea germinal puede encontrarse en Tomlinson y col., (1992). Las referencias para las cadenas ligeras son VL2.1 (Brockly y col, 1989); IGLV1S2 (Bernard y col., 1990); IGLV3S1 (Frippiat y col., 1990); L8 (Vd) y L5(Vb) (Pech y col., 1984); L12 (HK 102) (Bentley y Rabbits, 1980); B3 (VKIV) (Klobeck y col., 1985); 02 y 04 (Pargent y col., 1991); L11 (Scott y col., 1991); HumlvIL1 (Daley y col., 1992). Nombres alternativos se dan entre paréntesis.

a) Estos genes parecen haber sido creados por entrecruzamiento entre dos genes V durante la amplificación con PCR y por tanto las coincidencias han sido determinados utilizando los dos segmentos putativos de línea germinal: FR, región de entramado; CDR, región determinante de la complementariedad.

Bentley, D.L. y Rabbits, T.H. (1980) Nature, 288, 730-3.

Bernard, F., Chuchana, P., Fripiiat, J.P., Buluwela, L. y Lefranc, M.P. (1990) Nucleic Acids Res, 18, 7139.

Brockly, F., Alexandre, D., Chuchana, P., Huck, S., Lefranc, G. y Lefreanc, M.P. (1989) Nucleic Acids Res, 17, 3976.

Frippiat, J.P., Chuchana, P., Bernard, F., Buluwela, L., Lefranc,g. y Lefranc M.P. (1990) Nucleic Acids Res, 18, 7134.

Klobeck, H.G. Bornkamm, G.W., Combriato, G., Mocikat, R., Pohlenz, H.D. y Zachau, H.G. (1985) Nucleic Acids Res, 13, 6515-29.

Pargent, W., Meindl, A., Thiebe, R., Mitzel, S. y Zachau, H.G. (1991) Eur. J. Immunol, 21, 1821-7. Pech, M, Jaenichen, H.R., Pohlenz, H.D., Neumaier, P.S., Klobeck, H.G. y Zachau, (1984) J Mol Biol, 176, 189-204.

Scott, M.G. Crimmins, D.L., McCourt, D.W., Chung, G., Schable, K.F., Thiebe, R., Quenzel, E.M., Zachau, H.G. y Nahm, M.H. (1991) J Immunol, 47, 40007-13.

Tomlinson, IM. Walter, G., Marks, J.D., Llewelyn, M.B. y Winter, G. (1992) J. Mol. Biol., 227, en publicación.

TABLA III Afinidades y cinéticas de unión al antígeno por los fragmentos scFV monoméricos y diméricos

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6

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \begin{minipage}{150mm} A) M, fracción monomérica, D, fracción 
dimérica, b) números en paréntesis son las desviaciones estándares,
c) FQ, titulación por fluorescencia, d) calculado a partir de la
magnitud de inhibición de la unión de
I125-FOG-I con el antígeno Rh D; c)
no determinado porque las curvas de disociación estaban
torcidas.\end{minipage} \cr}

TABLA IV Oligonucleotidos usados

7

Cebadores VHBack humanos

8

Claims (19)

1. Procedimiento de producción de un miembro de un par de unión específica (miembro sbp), siendo dicho miembro sbp es un anticuerpo humano o un fragmento de anticuerpo humano que tiene un sitio de unión al antígeno con unión específica para una diana de auto-antígeno humano, comprendiendo el procedimiento:

a) proporcionar una librería que comprende bacteriófagos filamentosos que presentan cada uno un miembro sbp en su superficie; en donde cada bacteriófago filamentoso que presenta en su superficie un miembro sbp contiene una secuencia de ácido nucleico codificante del miembro sbp hibido en la superficie del bacteriófago filamentoso, o codificante de una cadena polipeptídica del miembro sbp hibido en la superficie de cada bacteriófago filamentoso; en donde la posición de la librería comprende la preparación de dicho ácido nucleico a partir de secuencias de anticuerpos humanos de un humano o de humanos no inmunizados con una diana auto-antigénica humana, y que no tienen una enfermedad inmune contra la diana auto-antigénica humana sin que se determine que los anticuerpos humanos con especificidad de unión por dicha diana auto-antigénica humana sean detectables en la circulación humana; y

b) seleccionar por unión con dicha diana auto-antigénica humana, uno o más miembros sbp con especificidad de unión por dicha diana humana auto-antigénica.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el proporcionar dicha librería de bacteriófagos filamentosos comprende:

combinar (i) un primer componente de cadena polipeptídica que forma parte de un miembro sbp fusionado a un componente de un bacteriófago filamentoso que de esta manera hibre dicho primer componente de cadena polipeptídica, o una población de éste, en la superficie de un bacteriófago filamentoso que se expresa en una célula huésped recombinante, o una población de dicho primer componente de cadena polipeptídica fusionado con dicho componente de un bacteriófago filamentoso, con (ii) un segundo componente de cadena polipeptídica de un miembro sbp o de una población del mismo, para formar una librería de miembros sbp expresados en la superficie de un bacteriófago filamentoso; al menos uno de dichos componentes, primero o segundo, de cadena polipeptídica o poblaciones de los mismos están codificados por un ácido nucleico que es capaz de ser empaquetado utilizando dicho componente de un bacteriófago filamentoso.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el proporcionar dicha librería de bacteriófagos filamentosos comprende:

Combinar (i) el ácido nucleico que codifica un primer componente de cadena polipeptídica de un miembro de sbp fusionado a un componente de un bacteriófago filamentoso, o una población de dicho primer componente de cadena polipeptídica fusionado a un componente de un bacteriófago filamentoso, con (ii) un ácido nucleico que codifica un segundo componente de cadena polipeptídica de un miembro sbp o de una población del mismo, para formar una librería de ácido nucleico capaz de ser empaquetado utilizando dicho componente de un bacteriófago filamentoso;

expresar en una célula huésped recombinante dicho primer componente de cadena polipeptídica fusionada a un componente de un bacteriófago filamentosos o población del mismo y dicho segundo componente de cadena polipeptídica forma parte de un miembro sbp o una población de lo mismo, para producir una librería de bacteriófagos filamentosos donde cada uno en su superficie un miembro sbp y contiene el ácido nucleico codificante de un primer y segundo componente de cadena polipeptídica de un miembro sbp expresado en su superficie.

4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, 2 o 3 en donde cada miembro sbp expresado en la superficie del bacteriófago filamentoso es un fragmento de anticuerpo que comprende un dominio V_{H} y un dominio V_{L}.

5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en donde dichas partes de los componentes de cadena polipeptídica, tanto primero como segundo, o poblaciones de los mismos, se expresan a partir de ácidos nucleicos capaces de ser empaquetados utilizando dicho componente de un bacteriófago filamentoso.

6. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho miembro de sbp expresado en la superficie de un bacteriófago filamentoso es un fragmento de anticuerpo scFv.

7. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2 o 3, en donde dicha parte del segundo componente de cadena polipeptídica o población del mismo está codificado por un ácido nucleico separado del ácido nucleico codificante de dicha parte del primer componente de cadena polipeptídica o de una población de lo mismo.

8. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 7, en donde dicho miembro sbp expresado en la superficie de un bacteriófago filamentoso es un fragmento de anticuerpo Fab.

9. Procedimiento de acuerdo cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el ácido nucleico se deriva de de los genes V reordenados.

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10. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el auto-antígeno es un antígeno carcino-embrionario.

11. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el auto-antígeno es el factor de necrosis tumoral alfa (TNF\alpha).

12. Procedimiento de acuerdo cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde los miembros sbp seleccionados en (b) expresados en la superficie del bacteriófago filamentoso se seleccionan o criban para proporcionar un bacteriófago filamentoso individual que exprese un miembro sbp o una población mezclada de dicho bacteriófago filamentoso, y en donde cada bacteriófago filamentoso contiene un ácido nucleico codificante del miembro sbp o cadena polipeptídica que se expresa en superficie.

13. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el ácido nucleico que codifica un miembro sbp seleccionado o cribado, y que deriva de un bacteriófago filamentoso que expresa en su superficie un miembro sbp cribado o seleccionado, se utiliza para expresar un miembro sbp o un fragmento o derivado de lo mismo en una célula huésped recombinante.

14. Procedimiento de acuerdo la reivindicación 13, en donde el ácido nucleico de uno o más bacteriófagos filamentosos se extrae y utiliza para proporcionar un ácido nucleico codificante para obtener en un método posterior un miembro sbp individual o una población mezclada de miembros sbp, o un ácido nucleico que codifica un miembro sbp individual o una población mezclada de dichos miembros sbp.

15. Procedimiento de acuerdo la reivindicación 13 o la reivindicación 14, en donde la expresión de los productos finales se modifica para producir un derivado de lo mismo.

16. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13, 14 y 15, en donde la expresión del producto final o derivado del mismo se utiliza para preparar un medicamento terapéutico o profiláctico o un producto de diagnóstico.

17. Utilización en un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, de un equipo que comprende una librería de secuencias de ácido nucleico capaces de ser empaquetadas en un bacteriófago filamentoso y que codifica un componente de cadena polipeptídica de un anticuerpo para su expresión en la superficie de un bacteriófago filamentoso.

18. Utilización en un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, de un equipo que comprende una librería de bacteriófagos filamentosos donde cada uno contiene un ácido nucleico que codifica al menos una parte del componente de cadena polipeptídica de un anticuerpo.

19. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en donde el auto-antígeno es un receptor y se selecciona un miembro sbp que se une y desencadena su activación.