JPH09506508A

JPH09506508A - 組換え結合タンパク質およびペプチド

Info

Publication number: JPH09506508A
Application number: JP7515505A
Authority: JP
Inventors: デビッドグリフィス，アンドリュー; ホリガー，カスパー−フィリップ; ニッシム，アウバ; フィシュ，イゴア; ポールウィンター，グレゴリー
Original assignee: Medical Research Council
Current assignee: Medical Research Council
Priority date: 1993-12-03
Filing date: 1994-12-05
Publication date: 1997-06-30
Also published as: AU1117095A; WO1995015388A1; EP0731842A1; AU690171B2; CA2177367A1

Abstract

(57)【要約】ＤＮＡ構成物であって、第一のペプチドまたはポリペプチドをコードするヌクレオチドの第一のエキソン配列、第二のペプチドまたはポリペプチドをコードするヌクレオチドの第二のエキソン配列、およびＲＮＡスプライス部位の間の異種イントロン〔例えばテトラヒメナ・テルモフィラ（Tetrahymena thermophila）核のプレｒＲＮＡのイントロン〕と該イントロン中の部位特異的組換え配列（例えばloxP）をコードする第一の配列と第二の配列の間のヌクレオチドの第三の配列を含んで成り、前記エキソンは一緒になって１つのペプチドまたはポリペプチド生成物をコードする、ＤＮＡ構成物が提供される。そのような構成物はペプチドまたはポリペプチドの製造方法において用いられ、転写が一本鎖ペプチドまたはポリペプチド生成物の翻訳を可能にするイントロンのスプライシングをもたらす。ペプチドまたはポリペプチドの発現用の構成物の作製に使われる、イントロン中に部位特異的組換え配列を有する自己スプライシングイントロンをコードするヌクレオチドの配列から本質的に成る単離された核酸構成物も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】組換え結合タンパク質およびペプチド本発明は２以上のポリペプチドまたはペプチド成分を含んで成るポリペプチド、それらの製造方法およびこの製造に使われるＤＮＡ構成物に関する。特に、本発明はそのようなポリペプチドおよびそれをコードする核酸のレパートリーの提供に関する。本出願では、好ましくは部位特異的組換え系、例えばlox P(Hoess他，Proc．N atl．Acad．Sci．USA 79 3398-3402，1982；Sternberg 他，J．Mol．Biol．150 467-486，1981)と共に、ＲＮＡスプライス部位を有するイントロン、例えば自己スプライスイントロン、を含有する核酸を使った結合タンパク質およびペプチドの作製が記載される。部位特異的組換えを使って、２つの核酸配列をライブラリーとして別々にクローニングした後で組換え現象により一緒にすることができる（Waterhouse他，Nucleic Acids Res．21:2265-2266，1993；A.D．Griffiths他，EMBO J．印刷中；WO 92/20791；WO 93/19172）。第一の配列のライブラリーを第一のレプリコン中にクローニングし、第二の配列のライブラリーを第二のレプリコン中にクローニングする。両部位間での組換えが両配列のライブラリーを同一レプリコン上に一緒にする。この組換えは、例えばＰ１感染によりもしくはＥ．コリ中のプラスミドによってコードされるレコンビナーゼを使うことにより生体内で行うことができ、または可溶性レコンビナーゼを使って試験管内で行うことができる。lox Pの場合、レコンビナーゼがCreである。これは大規模ライブラリーを作製することを可能にし、そこでの限界はクローニング効率ではなくてむしろ増殖させることができる細胞の数である。よってこの方法は、表示タンパク質の大規模ライブラリーからの所望の結合特性を有するタンパク質の選択を可能にするファージ表示技術(WO 92/01047；WO 92/2079 1；WO 93/06213；WO 93/11236；WO 93/19172；PCT/GB93/02492)と組み合わせると特に有力である。ライブラリーのサイズは、適切な親和力と特異性を有する抗体や他の結合タンパク質を選択できることにとって重要である。 WO 93/19172は、主に異なる核酸配列によりコードされる二本の鎖が会合すると機能的な結合部位を形成するヘテロ二量体タンパク質をコードするように核酸の２つのライブラリーを部位特異的（例えばlox Ｐ）系を使って組み換えることを記載している。２つのポリペプチドを連続した転写解読枠に一緒にすることも記載している。しかしながら、この方法は該配列の２部分の間の接合部において部位特異的組換え配列中にコードされるアミノ酸配列、例えば一本鎖Ｆｖ分子中のリンカーの使用を強いる。これに伴う問題は、lox P配列中に唯一つの転写解読枠があり、これによりコードされるアミノ酸が多くのタンパク質の機能的形態での発現と適合しない場合があることである。野性型に代わる別のlox P部位を使えば（例えば図４を参照のこと）、更に異なるアミノ酸配列が生成し得るが、可能性はまだ制限されている。例えば、loxP組換え部位により部分的にコードされる15アミノ酸リンカーを使って機能的な一本鎖Ｆｖ分子を作製することができる。しかしながらloxP部位の長さ（34bp）は、最終発現生成物中に最低11個の異種（「外来」）アミノ酸が組み込まれなければならないことを意味する。これは、連続した読み枠中へのloxP 部位の組み込みをダイアボディレパートリーの作製に不適当にし、且つ発現を増強させるためのscFvリンカーの変更の範囲を狭くする。本発明はＲＮＡスプライシング、特に自己スプライシングイントロンの使用を含む。これにより、スプライスされるヌクレオチドによりコードされるアミノ酸が最終発現タンパク質中に取り込まれないように組換え部位をイントロン内部に挿入できるようになる。そのような状況では、組み込む必要がある「外来」アミノ酸だけが自己スプライシングイントロンのいずれかの末端の配列から誘導されたものである。（注意：生成物のアミノ酸組成と配列は正確に操作することができ、選択に応じてそして当業界で既知の技術を使って、アミノ酸を挿入、置換または削除することができる。）自己スプライシングイントロンを使う時、組み込まれるアミノ酸は５′スプライス部位（５′ＳＳ）がＰ１配列そして３′スプライス部位（３′ＳＳ）がＰ10 配列に由来する。ヘアピンループ（図１）を作るイントロンの内部ガイド配列とスプライシング部位を有するそれらのペアは指摘のとおり存在する。自己スプライシングイントロンの使用は、lox Pによる組換えの使用を、該イントロンにより隔てられた鎖の２部分が異なる連続ポリペプチド鎖の大規模ライブラリーの作製へと広げる。 PCT/GB93/02492により優先権主張される出願EP 93303614.7には、二価または二特異性「ダイアボディ」を使って自己スプライシングイントロン中に挿入されるloxP部位の使用の例が与えられている。「ダイアボディ」は、ポリペプチドの多価または多特異性多量体（例えば二価または二特異性二量体）であり、ここで多量体中の各ポリペプチドは、与えられたポリペプチドのドメインが互いに会合して抗原結合部位を形成することができないように、免疫グロブリン軽鎖可変領域の結合性部分を含む第二のドメインに連結された免疫グロブリン重鎖可変領域の結合性部分を含む第一のドメインを含んで成る。抗原結合部位は１つの抗原結合部位から形成される。抗原結合部位は該ポリペプチドの多量化（例えば二量化）により形成される。自己スプライシングイントロンを含むＤＮＡからの二価ダイアボディの発現は図１と２に示される。出願明細書EP 93303914.7は鎖の入替え（chain-shuffling ）へのこの系の利用も開示している。（図３も参照のこと。）PCT/GB93/02492は、二特異性ダイアボディに自己スプライシングイントロンを使ったlopP部位のスプライシング切除を記載している（この出願の実施例１）。それらの２つの先行出願では、自己スプライシングイントロンはダイアボディの２つのドメインの間だけをスプライシングするために使われた。しかしながら、ポリペプチド鎖の２部分を一緒にするために自己スプライシングイントロンを使用することは一般的適用性があり、一本鎖Ｆｖ断片、ペプチドライブラリーまたは実に任意のポリペプチド配列にも同様に適用することができる。組換えを促進するlox Pのような系の使用により、１つのポリペプチド配列を、もとは別のレプリコン上にコードされていた同様なまたは異なる機能を有する別のポリペプチド配列により置換することができる。これは、機能に貢献する２以上のドメインを有する一本鎖Ｆｖのようなポリペプチド鎖の場合に特に有用である。本発明は、２つのレパートリーの間のスプライス部位およびコードされるタンパク質またはペプチドを選択しながら、２つの核酸レパートリーの使用を可能にする。鎖の入替え（chain-shuffling）と称する一態様では、１つの核酸配列を一定に維持し、そして別の鎖のライブラリーをイントロン中のlox P部位のところで組み換える。 β−ガラクトシダーゼのα−ペプチドをコードする遺伝子中にテトラヒメナ（Tetrahymena ）介在配列（グループＩ自己スプライシングイントロン）が挿入された系を使って、自己スプライシングイントロンがＥ．コリ中で機能的であることが証明されている（J.V. Price & T.R．Cech，Science 228: 719-722，1985；R.B．Waring他，Cell 40: 3 71-380，1985；M.D．Been & T.R．Cech，Cell 47:207-216，1986）。α−ペプチドがβ−ガラクトシダーゼ酵素受容体を補完したので、青いコロニーの存在により自己スプライシングがＥ．コリ中で機能的であることが示された。この系は自己スプライシングと適合できるイントロン配列の診断にも使われている。自己スプライシングイントロンは上記のように機能性タンパク質中に挿入されたことがあるが、スプライシングイントロンはプロテインエンジニアリング法または２つの核酸レパートリーの組換えを含む方法には使われたことがない。本発明は、第一のペプチドまたはポリペプチドをコードする第一のヌクレオチド配列、第二のペプチドまたはポリペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列、およびＲＮＡスプライス部位の間の異種イントロンと該イントロン中の部位特異的組換え配列をコードする第一配列と第二配列の間の第三のヌクレオチド配列を含んで成るＤＮＡ構成物を提供する。ＲＮＡスプライス部位の存在および位置は、該イントロンがＤＮＡ構成物からＲＮＡへの転写時に第一配列と第二配列の間からヌクレオチドをスプライシングにより除去できるようにし、その結果第一配列と第二配列の一緒のスプライシングをもたらすことができる。使用するイントロンに応じて、スプライシング後に転写されたＲＮＡ中に第一配列と第二配列の間に１または複数のヌクレオチドが残ってもよく、該ＲＮＡの翻訳生成物中の第一と第二のペプチドまたはポリペプチドの間に１または複数のアミノ酸が存在してもよい。しかしながら、当業者は、第一および第二の配列を「エキソン」配列と称することもできると認識するだろう。用語「異種」（または「外来」）は、該イントロンが転写時に第一配列と第二配列の間からのヌクレオチドの除去の実施可能な位置において第一配列と第二配列の間に生来見られないものであることを意味する。本発明のＤＮＡ構成物は、それらが生来、即ち組換えＤＮＡ技術による人間の介入なしに、存在しないという意味で「人工的」である。第一および第二のペプチドまたはポリペプチドは任意のアミノ酸配列であることができる。好ましくは、第一および第二のポリペプチドが一緒になって特異的結合ペア（ｓｂｐ）のメンバー、例えば免疫グロブリン（抗体または抗体断片）の抗原結合部位を形成する。よって、第一および第二のポリペプチドの組合せは、ｓｂｐメンバーのＶＨドメインとＶＬドメインを互いに会合せしめて抗原結合部位を作ることのできるペプチドリンカーによりＶＬドメインに連結されたＶＨドメインから成るscFv抗体断片であるポリペプチドｓｂｐメンバーを形成することができる（Bird他，Science，242，423-426，1988；Huston他，PNAS USA，85 ，5879-5883，1988）。そのような場合、該ＤＮＡ構成物は、ＶＨまたはＶＬドメインをコードする第一のヌクレオチド配列、片割れのＶＬまたはＶＨドメインをコードする第二のヌクレオチド配列、および第一配列と第二配列の間の異種イントロンを含む第三のヌクレオチド配列を含んで成る。ＤＮＡ構成物がＲＮＡに転写されそして第三配列のヌクレオチドがスプライシングにより除去される時、ＲＮＡ中に残っている第三配列のヌクレオチドはscFv抗体断片のペプチドリンカーをコードしそしてそれに翻訳され得る。第三配列のヌクレオチドが第一と第二のペプチドまたはポリペプチド鎖を連結するリンカーのアミノ酸をコードしそれに翻訳され得るというこの理論は、いずれのペプチドまたはポリペプチドにも使うことができ、例えばペプチドライブラリーの作製に使うことができる。本発明の好ましい態様では、第一および第二の配列が天然に存在する任意のポリペプチドにおいて連結されないペプチドまたはポリペプチドをコードする。該ペプチドまたはポリペプチドは、同一の天然に存在する分子から誘導してもよいが、ペプチド結合により直接連結されていない、即ちそれらは１または複数の介在アミノ酸により生来分離されたポリペプチドの２部分であることができる。第一および第二のペプチドまたはポリペプチドの一方もしくは両方が抗体断片、例えばＶＨ，ＶＬ，ＣＨ，ＣＬ，ＶＨ−ＣＨまたはＶＬ−ＣＬであってもよい。該ペプチドまたはポリペプチドは完全なドメインである必要はない。第一および第二のペプチドまたはポリペプチドの一方または両方が合成ヌクレオチド配列、例えばランダムに作製したものによりコードされてもよい。よって、例えば、第一および第二のエキソン配列がランダムに作製したヌクレオチド配列を含んで成る本開示のＤＮＡ構成物のレパートリーまたは集団からの発現により、ランダム配列ペプチドまたはポリペプチドライブラリーを作製することができる。ＤＮＡ構成物は、スプライシング後に「ダイアボディ」ポリペプチド、即ち免疫グロブリン重鎖可変領域の結合領域を含む第一のドメインと免疫グロブリン軽鎖可変領域の結合領域を含む第二のドメインとを含んで成るポリペプチドであって、両ドメインが互いに連結されている（例えばペプチド結合またはペプチドリンカーにより）が互いに会合して抗原結合部位を形成することはできないポリペプチド、をコードするＲＮＡに転写可能であってもよい。両ドメインがペプチドリンカーにより連結される場合、該リンカーは、例えば、長さ10アミノ酸以下であることができる。Holliger他，PNAS USA，90: 6444-6448(1933)およびPCT/US9 3/02492を参照のこと。この種のポリペプチドは、互いに会合して多価または多特異性結合タンパク質を形成することができる。しかしながら、スプライシング後にそのような「ダイアボディ」ポリペプチドをコードするＲＮＡに転写することができるＤＮＡ構成物は、本発明から除外され得る。第一および第二のペプチドまたはポリペプチドの他の例としては、免疫グロブリン重鎖および軽鎖可変領域の結合領域；Ｔ細胞レセプターのＶα／Ｖβ領域；Ｔ細胞レセプター／抗体（断片）融合体；例えば抗体のエピトープマッピングのためのペプチド、レセプター結合ペプチド、酵素、例えばプロテアーゼ、阻害剤；任意の多領域タンパク質、例えばヌクレオチド結合領域と基質結合領域を有するヌクレオチドデヒドロゲナーゼ、付着分子、例えばICAM-1、レセプター、例えばリガンド結合領域とキナーゼ領域を有するPDGFレセプター、ＤＮＡ結合領域とリガンド−例えば糖質コルチコイドレセプター−と相互作用する第二領域を有する転写因子、の突然変異誘発ライブラリーが挙げられる。多領域タンパク質の概説については、BrandenおよびTooze，“Introduction to Protein Structure” ，Garland 1991を参照のこと。イントロンは自己スプライシンググループＩイントロン、例えばテトラヒメナからのICE10であることができる（T.R．Cech，Ann．Rev．Biochem．59，543-568 ，1990）。イントロンのスプライシング除去はＲＮＡレベルで起こり、５′および３′スプライス部位のところに配列を後に残す。この配列はポリペプチド生成物の２つのペプチドまたはポリペプチド成分の間の３アミノ酸をコードするだろう。残存するアミノ酸の数が異なるように自己スプライシングをデザインしてもよい。他のグループＩイントロンまたはグループII自己スプライシングイントロンを使ってもよい。少なくとも149の自己スプライシンググループＩイントロンが知られており、それらとしては、テトラヒメナ・テルモフィラ（Tetrahymena thermophila）のrRNAイントロン、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）のチトクロームｂ遺伝子イントロン１、ニューロスポラ・クラッサのミトコンドリアrRNA、ニューロスポラ・クラッサのチトクロームオキシダーゼサブユニット１遺伝子oxi3イントロン、ファージＴ４のチミジレートシンターゼイントロン、クラミドモナス・レインハーティ（Clamydomonas r einhardtii ）の23S rRNA Cr.LSUイントロン、ファージＴ４のnrdBイントロン、アナベナ（Anabaena）のプレtRNA(Leu)イントロンが挙げられる。グループII自己スプライシングイントロンとしては、酵母ミトコンドリアoxi3遺伝子イントロン５γおよびポドスポラ・アンセリナ（Podospora anserina）のチトクロームｃオキシダーゼＩ遺伝子が挙げられる。自己スプライシングイントロンは、分子の作製において、例えばlox P部位での組換えと併用することができる。例えば、lox P部位をポリペプチド鎖の２つのドメイン（例えばＶＨとＶＬ）の間の自己スプライシングイントロン中に含めることができる。これは、例えばlox P部位を通して別の可変ドメイン遺伝子と自己スプライシングイントロンの適当な領域を有する別のレプリコン上にＤＮＡレベルで組み換えることができる。転写後のＲＮＡレベルでの自己スプライシングは、第一と第二のポリペプチドの新たな組合せを有する生成ポリペプチド鎖をもたらすだろう。本発明の一観点では、ＤＮＡ構成物中の第三のヌクレオチド配列であるイントロンが、部位特異的組換えのための配列を含んで成る。該配列は、生体内および／または試験管内での部位特異的組換えに適当である。それは組換えがCreタンパク質により触媒される34bp部位のlox P部位であることができる（Hoess他，PN AS USA，79: 3398-3402，1982,およびSternberg他，J．Mol．Biol., 150: 467-486，1981）。 lox P部位の34bpは、８bpの非対称コアにより隔てられた２つの13bp逆方向反復配列から成る（図４参照）。結果として組換えベクターをもたらす二配列の間での更に制御された組換えを提供するために、各ベクターは各々が互いに異なる２つの部位特異的組換え配列を含むことができる。これらの配列は、組換えが別のベクター上の同様の配列との間で起こるが同一ベクター上の異なる配列との間では起こらないようなものでなければならない。部位特異的組換えの使用により、もとは異なる（第一と第二の）ベクター／レプリコン上にある第一と第二の核酸配列を単一の組換えベクター／レプリコン上に一緒にすることが可能である。第一のベクターの各々と第二のベクターの各々は、第一の部位特異的組換え配列と、第一のものとは異なる第二の部位特異的組換え配列を含むことができ、部位特異的組換えは異なるベクター上の第一の部位特異的組換え配列との間および異なるベクター上の第二の部位特異的組換え配列との間で起こり、同一ベクター上の第一の部位特異的組換え配列と第二の部位特異的組換え配列の間では起こらない。第一の部位特異的組換え配列がコリファージＰ１から得られるIox Pでありそして第二の部位特異的組換え配列が変異型lox P配列であることができ、逆も可能である。可能性として、第一の配列が互いとは組み換わらず且つ第二の配列が互いとは組み換わらない限り、第一および第二の部位特異的組換え配列の両方が変異型であってもよい。適当な変異型lox P配列はlox P 511である。図４を参照のこと。第一のベクターがファージまたはファジミドで第二のベクターがプラスミドであってもよく、あるいは第一のベクターがプラスミドで第二のベクターがファージまたはファジミドであってもよい。この系（即ち部位特異的組換えを使うがイントロンスプライシングを使わない）は、ファージ上に表示された抗体の調製に利用されている（P．Waterhouse他，Nuc．Acid Research 21:2265-2266，1993 ;およびWO93/19172）。一態様では、組換えは細胞内であり、そして第一のベクターと第二のベクターより優先的に組換えベクターを複製する細菌宿主中で行われる。これは好結果の組換え現象の選択を豊富にするために使うことができる。細胞内組換えは、ファージもしくはファジミドより優先的にプラスミドを複製するかまたはプラスミドより優先的にファージもしくはファジミドを複製する細菌宿主中で行うことができる。例えば、細菌宿主はＥ．コリのまたは別のグラム陰性菌のPolA株であることができる。PolA細胞はプラスミドの複製を維持するのには不適当であるが、繊維状ファージやファジミド（繊維状ファージの遺伝子間領域を含有するプラスミド）の複製を維持することができる。そのため、例えば、もし第一のベクターが第一のマーカー遺伝子を含むプラスミドであり、そして第二のベクターが第二のマーカー遺伝子を含むファージまたはファジミドであるなら、両マーカーについての選択は好結果の組換え現象の生成物である組換えベクターを与えるだろう。何故なら、第一のマーカーが複製または発現されるためにはプラスミドから該マーカーを転移する組換えが起こらなければならないからである。最初は２つの別々のレプリコン上に存在していたポリペプチド生成物の２つの成分またはサブユニットの核酸を一緒にすることにより、例えばファージ表示を使った広範囲に渡る再クローニングに頼ることなく、サブユニット遺伝子の好ましい組合せを直接単離することができる。この単離は、それらを一度同じ細胞中に導入してしまえばレプリコン間での組換えにより達成することができる。好ましい配置では、一方の成分の遺伝子が他方の成分の遺伝子を含む受容体レプリコン上に組み換えられるように組換えが行われる。好ましくは、受容体レプリコンはバクテリオファージ粒子中にパッケージングすることができる。最も好ましくは、機能的な多量体をrgdpの表面上に表示できるようにするために、サブユニットのうちの１つまたは複数をコードする遺伝子がカプシド遺伝子、例えばｇIIIに融合される。様々な組換え系が既知であり、それらの多くはレプリコン間の組換えを果たせるようなやり方で利用することができる。最も良く理解されている部位特異的組換え系の１つは、バクテリオファージλ の組込みと切除に使われるものである（“Escherichiacoli and Salmonella typ himurium．Cellular and Molecular Bio-logy.”（1987）pp 1054-1060，Neidha rt，F.C.主筆 American Soc-iety for Microbiology）。このバクテリオファージは一度細胞の内部に入ったら２つの発生経路、即ち溶菌または溶原化をとることができる。溶原化経路は感染した細菌の染色体中へのλゲノムの組込みを伴う。組込みは、att Ｐと呼ばれるバクテリオファージ中の約240bp配列とatt Ｂと呼ばれる細菌染色体中の25bp部位の間での部位特異的組換えの結果である。この組込み現象は、宿主によりコードされるIHFと称する因子と、２つのatt部位に共通する15bp領域を認識する、ファージによりコードされるIntレコンビナーゼと称する酵素により触媒される。組み込まれたＤＮＡはatt Bとatt Pに由来する配列により隣接され、それらはatt Lおよびatt Rと呼ばれる。組込み現象は可逆的であり、Int、IHFおよびバクテリオファージによりコードされる第二の酵素Xis により触媒される。この系はＥ．コリ中でのレプリコン間の配列転移に利用できると想像される。例えば、IntとXisタンパク質が宿主細胞中に提供されると、att L部位とatt R部位の間の組換えが、供与体遺伝子と再生されたatt B部位とを含有する環状ＤＮＡセグメントを形成するように、供与体遺伝子をatt L部位とatt R部位により隣接せしめることができる。この環状セグメントは次いで受容体プラスミド中に工作されたatt P部位と組み換わることができる。本明細書中に記載の研究のために、利用可能な可能性のうちloxP／Cre系を選択した。何故なら、組換えが高度に配列特異的であり、非常に効率的であり、且つ容易にクローニングベクター中に組み込まれる短い標的部位のところで起こるからである。しかしながら、別の部位特異的組換え系、例えばflpレコンビナーゼ（A．Landy，Curr．Opinion Genetics Devel．3，699-707，1993）を使ってもよい。生産的組換え現象を豊富にする方法は変異型部位を使用することである。lox P配列の数種の変異体が知られており、それらは互いとおよび野性型lox P配列と組み換わる能力が弱められる〔Hoess，R.H.，Wierzbicki，A.およびAbremski，K ．（1986）Nucl．AcidsRes．14，2287-2300〕。例えば、lox P 511は中央の８bp セグメント中にＧ→Ａ点変異を有し、その結果、それは他のlox P 511部位とだけ組み換わり、野性型lox P配列とは組み換わらないだろう〔Hoess，R.H.，Wier zbicki，A．およびAbremski，K．（1986）前掲〕。野性型lox P配列と変異型lox P配列の組合せの配置は、どの組換え現象が可能かを指示することができる。部位loxP1，loxP2，loxP3およびloxP4（図４）はloxP511と同様に使うことができる。それらの部位はloxP511と顕著には組み換わらない。loxPWT部位とそれから誘導された変異型部位との間に或る程度の組換えが起こる場合がある。例えば、ある実験で、loxP3部位とloxPWT部位の間で５％の組換えが観察された。それらの新規loxP部位はいずれも同じ部位、即ち類似部位と効率的に組み換わり、例えば或るloxP4部位は別のloxP4部位と組み換わり、異なる部位との組換えよりもこの組換えが強い優先性を有することを示す。更に異なる変異型loxP部位の提供は、より複雑で、制御可能で且つ効率的な組換え方法をもたらす、組換え現象の発生に対する更に大きな制御を可能にする。それらのloxP部位の利用可能性のため、実施例６に示したような３つのloxP部位を含むベクター系の作製が可能になった。この３loxP系は、２つのloxP部位を含む系に比べて、次のような２つの追加の特色を表す： (a) それは抗体断片の親和性成熟のための軽鎖および重鎖遺伝子の鎖の入替え（chain-shuffling）を容易にするだろう〔Marks他(1992)，Bio/Technology 10 ，779-783参照〕。何故なら、１つの可変ドメインを一定に維持し、そして適当な供与体ベクターを使ってＶＨおよびＶＬ遺伝子のライブラリーをそれと組み換えることができるからである。例えば、scFv断片のＶＨドメイン遺伝子が３つのloxP部位を含むベクター（例えばfd3lox）のloxP511とloxPwtの間に置かれている、或る抗原に特異的なクローンを単離する。次いでＶＨドメイン遺伝子を一定に維持しながら、３loxP部位ベクター中の該クローンをpUC19のようなドナーベクター上のloxP4部位とloxP51 1部位の間に置かれたＶＬ遺伝子のライブラリーと組み換えることにより、ＶＬドメインのライブラリーを入れ替える。今や３lox部位ベクター中にコードされるようになったＶＬドメイン遺伝子およびscFv断片のライブラリー（例えば改善された親和力を有する）を、ファージ上に表示されたscFv断片レパートリーから選択することができる。鎖の入替えは２loxP系でも実施することができるが、この３loxP 系は、特にレプリコン、ファージまたはプラスミドの性質に対してより一層柔軟性を与える。この場合両レパートリーともloxP部位により隣接されているので、再度入替えられたレパートリーが発現される。実施例６と図13は、ＶＨとＶＬ遺伝子がloxP部位を含む自己スプライシングイントロンにより隔てられているダイアボディまたは一本鎖Fvレパートリーの作製のためのモデル実験におけるloxP系の使用を示す。この系のデザインは上記のような鎖の入替えを容易にするだろう。 (b) それは、例えば可溶性scFv断片の発現用の可溶性発現ベクター中に、抗原への結合について繊維状バクテリオファージの表面上で選択されている軽鎖および重鎖遺伝子対を転移させることを容易にする。この転移は現在のところ制限酵素を使ったクローニングにより行わなければならない。組換えによる転移は、新たな変異型loxP部位例えばloxP4とWT部位とを含有する発現ベクターを作製し、そしてそれらの２つの部位とfd2loxベクター上の対応部位との間で組換えを行うことにより、達成することができる。これのモデル実験は実施例６と図13に記載される。３つの異なるloxP部位の使用は、例えば、３つの配列の順番の組換えも可能にする。組み換える予定の第一の配列をloxPとloxP511により隣接させ、第二の配列をloxP511とloxP3により隣接させる。次いでそれらの配列を第三のＤＮＡ配列と３つのloxP部位を含む第三のレプリコン中に組み換える。異なる自己スプライシングイントロン中の２つのloxP部位の位置づけは、図７と８に示されるように３つの配列を連続して発現できるようにする。生産的配置の選択は、細菌、好ましくは大腸菌（Ｅ．コリ）または他のグラム陰性菌のpolA株の使用によって容易にすることができる。それらの細胞はＤＮＡポリメラーゼＩが欠損しており、従ってプラスミドの複製を維持することができない（Johnston，S.およびR，D.S．1984，前掲）。しかしながら、それらは繊維状ファージや繊維状ファージ遺伝子間領域を含むプラスミドの複製を維持することができる。Creにより触媒される組換えをpolA細菌中で実施すれば、同一polA細胞中の両選択マーカーの存在について選択することにより、好結果の組換え現象が富化される。何故なら、第二のマーカー遺伝子が複製されそして発現されるためには組換えが起こらなければならないからである。得られた細胞は完全なレパートリーを含み、細胞として増殖させることができ、そしてヘルパーファージを使って感染させ、両鎖の遺伝子を含有し且つそれらの遺伝子を細胞の表面上に発現するファジミドを生産させることができる。本発明は、開示されるようなＤＮＡ構成物を含んで成るベクターも提供する。一般に、該ベクターは発現に必要な核酸を含んで成る。該ベクターは発現時のポリペプチド生成物の分泌のための核酸を含んで成ってもよい。本発明は、第一のペプチドまたはポリペプチド成分と第二のペプチドまたはポリペプチド成分との組合せを含んで成るポリペプチド生成物の製造方法も提供する。該方法は、第一のペプチドまたはポリペプチドをコードする第一のヌクレオチド配列、第二のペプチドまたはポリペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列、および第一配列と第二配列の間の、イントロン内に部位特異的組換え配列を有する異種イントロンをコードする第三のヌクレオチド配列を含んで成るＤＮＡ構成物を提供し；前記構成物のＤＮＡをＲＮＡに転写し；第三配列のヌクレオチドのスプライシングを誘発しまたは許容し、前記ポリペプチド生成物をコードするＲＮＡ分子を生成せしめ；前記ＲＮＡ分子をポリペプチド生成物に翻訳することを含んで成る。転写、スプライシングおよび翻訳段階は試験管内または生体内系で行うことができる。便利にはそして特にレパートリーの作製に好ましくは、それらの段階が生体内、例えばＥ．コリ内で実施される。スプライシングは、あまり好ましくないが、自己スプライシング性でないイントロンを使って、スプライシングを促進する真核細胞のスプライシング装置の成分を例えばＥ．コリ中に導入することにより、成し遂げてもよい（J.A．Wise，Science 262:1978-1979，1993;A.J．Lamo nd，BioEssays 15: 595-603，1993）。ＤＮＡ構成物は上記に記載したようないずれのものであってもよい。適当な調節配列、例えばプロモーター断片、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および当業界で既知であるような他の配列を含有する適当な発現（転写）用ベクターを選択しまたは作製することができる。更なる詳細については、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第２版，Sambrook他，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照のこと。形質転換方法は使用する宿主に依存するが公知である。好ましくはファージまたはファジミドベクターが使われ、ＤＮＡ構成物を有する該ベクターがバクテリオファージ粒子中にパッケージングされる。有利には、ポリペプチド生成物は生物体、例えばバクテリオファージ、例えば繊維状バクテリオファージ、例えばfdまたはM13の表面成分であるドメインを含んで成る。好ましくは該表面成分はバクテリオファージfdのＧIIIまたは別の繊維状ファージからの同等物である。適当な技術はWO92/01047，WO92/20791，WO93/06213，WO93 /11236，WO93/19172およびPCT/GB93/02492中に記載されている。このように、提供されたＤＮＡ構成物は、スプライシング段階を伴って、該構成物から発現されたポリペプチド生成物を表面上に表示する粒子中にパッケージングされる。こうして、標的に対する結合親和力または酵素（例えば触媒）親和力を有するポリペプチド生成物を培地から抽出することができ、または例えばクロマトグラフィー技術を使った標的との接触により、そのような結合親和力または酵素活性を持たない他のポリペプチド生成物の混合物から選択することができる。ポリペプチド生成物がsbpメンバーである場合、選択は相補的sbpメンバーに対する結合親和力に基づいて行うことができる。例えば、免疫グロブリン結合ドメイン（例えばscFv断片）は抗原に対する結合親和力に基づいて選択することができる。ＤＮＡ構成物の準備の段階は、異なる核酸配列を有する複数の構成物、例えば構成物のレパートリーの用意を実際に含むだろう。用語「レパートリー」は、遺伝的多様性、即ちヌクレオチド配列の多様性を指摘するために使われ、一般におそらく数百万のオーダー（例えば10⁷〜10⁹から10¹²〜10¹⁴）の多数の異なる配列を包含する。部位特異的組換え用の配列（例えばlox P野性型または変異型）が転写時のスプライシングと適合できる部位においてＤＮＡ構成物中の第三配列内に含まれる時、高多様性レパートリーを作製することができる。１つのライブラリーと別のライブラリーとの間の組換えにより作製されるライブラリーのサイズは、トランスフェクション効率によってのみ限定される。理論上、各ライブラリーが10⁷のクローンを含むとすれば、１回の組換えが10⁷の多様性レベルを更に導入することができ、よって10⁷の異なるＶＨドメインをコードする第一のレパートリーと10⁷の異なるＶＬドメインをコードする第二のレパートリーとの組換えは、10¹⁴の異なるポリペプチド生成物をコードする組換えレパートリーを与える。同様に、10³個のクローンの２つのライブラリーを組み換えると10⁶個のクローンのライブラリーを与えることができる。例えば、第一のペプチドまたはポリペプチド成分のレパートリーをコードする核酸を含んで成るレプリコンの第一レパートリーが自己スプライシングイントロンの一部を含むことができ、一方で第二のペプチドまたはポリペプチド成分のレパートリーをコードする核酸を含んで成るレプリコンの第二レパートリーが自己スプライシングイントロンの相補的部分を含むことができる。レプリコンの第一および第二のレパートリーの中の各レプリコンは、レプリコンの第一レパートリーからのレプリコンとレプリコンの第二レパートリーからのレプリコンとの組換えが結果として生じる組換えレプリコン中で自己スプライシングイントロンの形成をもたらすように適当に配置された、部位特異的組換え用の配列を含んで成る。あるいは、第一および第二レパートリーの一方または両方のレプリコンが完全な自己スプライシングイントロンを含んでもよい。レプリコンの第一および第二レパートリーを、例えば部位特異的組換え配列のところで組み換えて（「交差させて」）、各レプリコン上に第一および第二のペプチドまたはポリペプチド成分をコードする核酸の間に自己スプライシングイントロンを有する、第一および第二のペプチドまたはポリペプチド成分の複数の異なる組合せをコードする核酸を含む（組換え）レプリコンの第三レパートリーを作製することができる。この組換えは、レプリコンの第一レパートリーによるトランスフェクションに続くレプリコンの第二レパートリーによるトランスフェクションの後、細菌宿主細胞中で生体内で起こることができる。部位特異的組換え配列がlox Pであるなら、組換えはCreレコンビナーゼにより触媒され得る。レプリコンの第三レパートリー中の核酸のＲＮＡへの転写に続いて、部位特異的組換え配列を含むイントロンがスプライシングにより除去され、ポリペプチド生成物をコードするmRNAになり、それがポリペプチド生成物に翻訳され得る。第一および第二のペプチドまたはポリペプチド成分の異なる組合せを含んで成るポリペプチド生成物のレパートリーの作製の後、着目の生成物、例えば特定の結合特異性または酵素活性を有する生成物の選択段階を行うことができる。レプリコンの第三レパートリーの中の各レプリコンがバクテリオファージ粒子中へのレプリコンのパッケージングを可能にする配列を含んで成り、そしてポリペプチド生成物が上述したようなバクテリオファージの表面成分を含んで成ってもよい。次いで着目の結合特異性または酵素活性を有するポリペプチド生成物の表示により、ファージ粒子のレパートリーから粒子を選択することができる。各選択された粒子はそのポリペプチド生成物をコードするＤＮＡを含有する。図５は、scFvレパートリーの作製に使われる理論を表す。そこではポリペプチド生成物の「第一のポリペプチド成分」がＶＨドメインであり、そしてポリペプチド生成物の「第二のポリペプチド成分」がＶＬドメインである。lox P部位がクラスＩ自己スプライシングイントロン中に含められる。生成物レパートリー中の各scFv断片のペプチドリンカーは、少なくとも一部は、転写時のＶＨドメインとＶＬドメインの間のイントロンのスプライシング後に残ったスプライス部位の残存物により形成される。発現用の組換えレパートリーの作製において２つのレパートリーを使う代わりに、単一の第一または第二のペプチドもしくはポリペプチド成分を第一または第二のペプチドもしくはポリペプチド成分のレパートリーに対して「鎖の入替え」を行うこともできる。こうして、着目の抗原に結合することのできるscFv断片の選択に使われるscFv断片のレパートリーの作製の際に、該抗原に結合することができる（相補的なＶＬまたはＶＨドメインを有する）とわかっているＶＨまたはＶＬドメインのいずれかを相補的なＶＬまたはＶＨドメインと組み合わせて発現用のレパートリーを作製し、次いで結合することができる組合せについて抗原に基づいて選択することができる。本発明の更なる観点は、イントロン中に部位特異的組換え配列、例えばloxP部位またはそれの変異体もしくは誘導体を有する自己スプライシングイントロンをコードするヌクレオチドの配列を含んで成る核酸を提供する。そのような核酸は、好ましくは、イントロン中に部位特異的組換え配列を有する自己スプライシングイントロンをコードするヌクレオチドの配列から本質的に成る。そのような核酸は単離することができ、そして本明細書中に開示されるような方法で使われる構成物の作製の際の使用に適当である。好ましくは、該核酸は、コードする核酸またはペプチドの連結のための、イントロンに隣接する制限部位を含んで成る。核酸は、発現用のプロモーターと作用可能に連結されて、即ちプロモーターの調節下に置かれてベクター中に組み込まれてもよい。他の好ましい特徴は、方法およびＤＮＡ構成物に関して本明細書中に開示される通りである。特に、イントロン内の部位特異的組換え配列は、記載されるように、好ましくは異種である。ダイアボディまたは一本鎖Fv断片を形成するための自己スプライシングポリペプチド鎖の２つの抗体ドメイン間の自己スプライシングイントロン中に組換え部位（例えばlox P）を含めることができる。これは、例えば、別の可変ドメイン遺伝子と自己スプライシングイントロンの適当な領域を有する別のレプリコン上のlox P部位を通してＤＮＡレベルで組み換えることができる。転写後のＲＮＡレベルでの自己スプライシングは、コードされるリンカー領域の長さに依存して、可変ドメインの新たな組合せを有するダイアボディポリペプチド鎖または一本鎖Fvポリペプチドをもたらすだろう。PCT/GB93/02492中には、ダイアボディポリペプチドをコードするＲＮＡからのイントロンのスプライシングが記載されている。これは、適当な長さのリンカーをコードするＲＮＡスプライス部位の片側に余分なアミノ酸をコードする配列を導入することにより、容易に一本鎖Fv断片に拡張することができる。図３および５に記載の系を使って二価もしくは二特異性ダイアボディにまたは一本鎖Fv断片に対して鎖の入替えを実施することができる。上述したように、図 13に示されるような３つのloxP部位を有する系の使用により、更なる制御レベルを確立することができる。自己スプライシングイントロン中にloxP部位を含むクローンからのダイアボディまたは一本鎖Fv分子の発現は、実施例１，２および４で証明される。実施例３は、２つのエキソンをより長い連続配列中に組み換える大規模ライブラリーを作製できることを証明する。レパートリーを作製するためのこの方法論は、ペプチド配列に代わってＶＨおよびＶＬ遺伝子が使われる一本鎖Fv分子およびダイアボディのような他の分子にも応用することができる。実施例６は、ダイアボディまたは一本鎖Fvレパートリーの作製に合わせて配置された loxP部位の間で組換えを実施することができることを証明するモデル実験を記載する。この方法論は、実施例３およびGriffiths他（1994，前掲）に記載のライブラリーに適し、そして10¹²以上の独立したscFvまたはダイアボディクローンのライブラリーが作製可能であると結論づけられる。本明細書中に更に記載されるように、スプライス部位を有するイントロン、例えば内部lox P部位を含む自己スプライシングイントロンは、２つの機能的ドメインが一緒になる別のいずれの系、例えばＴ細胞レセプターまたは２ドメインタンパク質にも適用することができる。抗体のような天然変異体を有するタンパク質に加えて、任意の２ドメインタンパク質について、２ドメインの突然変異誘発ライブラリーを作製し次いでlox P系を使ってその２ドメインを一緒にすることができる。ドメイン、例えばＶＨおよびＶＬドメインのライブラリーを一緒にスプライシングすることに加えて、例えば自己スプライシングイントロンを使ってドメインの部分を一緒にスプライシングすることができる。例えば、Ｖドメインのフレームワーク３中にlox Pのような組換え部位を含む自己スプライシングイントロンの使用により、例えばCDR３入替えにおいて、CDR１およびCDR２を含む断片とCDR ３を含む断片との組換えが可能になる。ペプチドライブラリーの作製におけるスプライシングイントロン／組換えペプチドをコードする２つの配列が組換え部位（例えばlox P部位）を含む自己スプライシングイントロンにより隔てられてコードされるタイブラリーを作製することができる。例えば、10アミノ酸ペプチドの２つの別々のライブラリーをクローニングし、次いで図６に示されるようにlox P 511とlox P部位を介して組み換えることができる。５′および３′スプライス部位の領域によりコードされるアミノ酸は、このペプチドライブラリーを、中心に５個の一定アミノ酸を有する計25個のアミノ酸のペプチドに変える。次いでペプチドライブラリーを様々な目的に、例えば抗体結合部位のエピトープマッピングに、またはレセプター結合タンパク質、プロテアーゼ阻害剤もしくは基質などの新規分子を誘導するために、使うことができる。実施例３は、自己スプライシングイントロン中に含まれるloxP部位間での組換えを使って約５×10¹⁰の組換え25アミノ酸ペプチドの大規模ファージ表示ライブラリーを作製することができ、そして抗ｐ53抗体により認識されるエピトープを含むペプチドを選択することができることを示す。ジスルフィド結合が形成されそしてシステイン間でペプチドがループを形成するように、10アミノ酸ペプチドの各々の中にシステイン残基を含めることにより、強制的なペプチドライブラリーを作製することができる。５′および３′スプライス部位並びに読み枠を変えることにより、５アミノ酸リンカーの長さとアミノ酸配列を変えることができる。ランダムアミノ酸の数も変えることができ、リンカーの各側で同じである必要はない。この実施例は長い連続配列中に２つのエクソンを組み換える大規模ライブラリーを作製できることを証明する。組換え抗体の作製における２以上のイントロンの使用ポリペプチドをコードする３つ以上の核酸配列を一緒に連結させるのに２つ以上のスプライシングイントロンを使うことができる。これは、Ｖ−Ｄ−Ｊ組換え（抗体重鎖について）がＥ．コリ中で起こるようなライブラリーを作製する場合に特に有利であるかもしれない。イントロン中に部位特異的組換え配列（例えば lox P）を使うことにより（例えば図７のスキームを使って）、ＶＨドメインのこのＶ−Ｄ−Ｊ組換えがＥ．コリ中でレコンビナーゼ（lox Pの場合にはCre）の存在下で起こるようになる。ＶＨ，ＤＨおよびＪＨ領域は天然のＶ，ＤおよびＪゲノムセグメントであるか、または多分異なる長さの合成オリゴヌクレオチドから誘導することができ、特にＤ領域については、組換えにより生成するCDR3長さの範囲が生来のCDR3長さの同一（または変形）分布とＮ塩基付加の存在または不在を反映するように合成オリゴヌクレオチドから誘導することができる。図７は一本鎖Fv分子を得るためにＶ−Ｄ−Ｊ組換えを達成するためのlox Pの使用を示し、図８はこの分子の発現を示す。イントロン並びにスプライス供与部位および受容部位は、スプライシングが２つのイントロンの間に置かれたエキソンを切断しないことを保証するようにデザインする必要がある。異なる組換え部位を含む第四のイントロンの導入が、Ｊ領域への異なるＣＨ１ドメインの連結を可能にするだろう。Ｔ細胞レセプターにも同様な系を利用することができ、軽鎖のＶおよびＪ領域の再入替えにも同様な系を利用することができる。５′および３′スプライス部位のための配列の選択イントロンが自己スプライシング過程により削除される時、５′および３′スプライス部位によってイントロンの残存物がポリペプチドのコード領域中に後に残る。実施例１は、このイントロンの残存物によってダイアボディ中に取り込まれて発現の変動が起こる２つの異なるアミノ酸配列を示す。Ｐ１およびＰ10配列の性質に依存して多数のタンパク質の発現に差がありそうである。従って、ある場合にはイントロンの好結果のスプライシングおよびタンパク質の発現と適合できるアミノ酸を同定する必要があるかもしれない。５′および３′スプライス部位の塩基のため取り込まれる適当なアミノ酸の同定は、該イントロンのＰ１ヘアピンループを形成する相補的塩基と共に内部ガイド配列の領域中の塩基を変異させる（例えば無作為に）ことにより行うことができる。効率的にスプライシングされたポリペプチド生成物が生産され、ファージ上に表示されそして標的への結合により選択されるように、イントロンが第一および第二のペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸の間、例えば抗体断片のＶＨドメインとＶＬドメインの間に挿入されれば、効率的なスプライシングと適合できるそれらの配列を選択することができる。同様に、内部ガイド配列のものと一緒に３′スプライス部位を変更することができ、そしてポリペプチド配列の発現により効率的にスプライシングされるものを選択することができる。変更しようとする内部ガイド配列の塩基がＰ１およびＰ10ヘアピンループのうちの１つにのみ参加する時、上記方法を適用する。内部ガイド配列の中央の塩基はＰ１およびＰ10ヘアピンループの両方に参加することが図１からわかる。よって、それらの塩基は、相補性と自己スプライシングを維持するために、５′および３′スプライス部位の両方の塩基並びに内部ガイド配列の塩基を変異せしめることが必要である。図４は、３′スプライス部位と自己スプライシングイントロンの内部ガイド配列のところに変異を作り、ＲＮＡの自己スプライシング後に、ダイアボディと一本鎖Fv抗体断片のより高レベルの発現と適合できるアミノ酸のコードづけを可能にすることができることを示す。この部位特異的変異方法は自己スプライシングイントロンの別の部位にも適用可能である。レパートリーを作製しようとする時、実施例１で使用したGLSSG配列を、イントロンのスプライシング後に２つのポリペプチドを連結する配列のための最初の試験配列として使用することができる。例えば実施例４に記載の変異方法を使って同定された他の配列を代替物として使ってもよい。自己スプライシングと適合できるプレ−mRNAのスプライシング後に成熟タンパク質中に保持されるエキソンの５′末端のスプライス部位の配列を選択するために、既知の自己スプライシングイントロンの配列を調査することができる（F．M ichelおよびE．Westhof， J．Mol．Biol．216:581-606，1990；F．Lisacek他，J．Mol．Biol．235: 1206-1 217，1994）。次いで好ましいアミノ酸の組み込みをもたらす自己スプライシングと適合できる配列を選択することができる。ストレプトマイシンを使った自己スプライシングの制御ストレプトマイシンは自己スプライシングを抑制する。よってStr-R大腸菌中でのストレプトマイシンの使用は、転写されたＲＮＡ中で起こるスプライシングを防止するだろう。ストレプトマイシンの除去によりスプライシングされたＲＮＡ生成物の生成が可能になり、翻訳されると、スプライシングによってのみ生成されるタンパク質生成物をもたらすだろう。よって、増殖培地中ストレプトマイシンの存在下では活性タンパク質を発現しないが、それの不在下では活性タンパク質を発現する、クローン化遺伝子を有することができる。これは大腸菌中で増殖を減少させるかまたは毒性であるタンパク質、例えば大腸菌タンパク質に対して向けられた抗体または大腸菌酵素の阻害剤、を発現させるのに有用である。この場合、必要とされるまで毒性タンパク質の発現をスイッチオフにすることができる。本発明を実施例によって更に説明することにする。本発明の範囲内での修正および変更は当業者に明白であろう。本明細書中に言及される全ての刊行物は参考として本明細書中に組み込まれる。図１は、Ｐ１およびＰ10ヘリックス並びに内部ガイド配列を含む、自己スプライシングイントロンの略図を示す。スプライス部位が矢印により示される。図２は、自己スプライシングイントロンを含むＤＮＡからの一本鎖Fvまたはダイアボディポリペプチドの発現を図解する。自己スプライシングイントロンを隣接する配列がペプチドリンカーの長さを決定するだろう。リボソーム結合部位が○により示され、Lg3はファージfd遺伝子IIIのリーダー配列である。図３はダイアボディ（または一本鎖Fv）分子の鎖入替えを図解する。それは受容体ファージベクター fdDOG-2dialoxsplice(a)と供与体プラスミドベクター pU C19-2dialoxsplice(b)との間のCre媒介組換えにより作製されるレプリコンを示す。(a)はfd-tet-DOG1に基づいており、遺伝子IIIプロモーターの調節下の１つのシストロン中に鎖ＶＨＡ−ＶＬＢを有する。ＶＨＡとＶＬＢとの間に、自己スプライシング活性と適合できる部位に挿入されたlox P 511組換え部位を含有するテトラヒメナからの自己スプライシングイントロンが挿入される。(b)はpUC19 に基づいており、lox P 511、テトラヒメナからの自己スプライシングイントロンの遠位部分、ＶＬＡ、およびlox P野性型配列を(a)と同じ配置で含有する。Ｅ．コリ内では、lox-Cre系での組換えの可逆性のために６つのレプリコン間で平衡が発生する。可変領域の間のリンカーペプチドの長さに依存して、一本鎖Fvとダイアボディ分子の両方に同じスキームが適用されるだろう。生成物(e)は、使用するリンカーの長さに依存して一本鎖Fvまたはダイアボディを表示しているfd ファージを発現するだろう。 (a)と(b)は変異型または野性型lox P部位のいずれかの間の組換えによって合体して、それぞれキメラプラスミド(c)と(d)を生成することができる。次いで２つの野性型lox P部位または２つの変異型lox P部位の間で更なる組換えが起こり、元のベクター（(a)および(b)）または２つの新規ベクター（(e)および(f)）を生成することができる。従って(a)と(b)の軽鎖が交換され、生成物(e)は、使用するリンカー長さに依存して一本鎖Fvまたはダイアボディを表示するfdファージを新たにコードする。生成物(f)は元来(a)にあったＶＬを含む。Ｅ．コリ内では、lox-Cre系での組換えの可逆性のために６つのレプリコン間で平衡が発生する。図４は、野性型および変異型lox P部位の配列を示す。図５は、ＶＨドメインとＶＬドメインのレパートリー間の組換えによる一本鎖 Fvレパートリーの作製を図解する。図６は、２つのレプリコン、(a)pUC19-PEPと(b)fdDOG-PEPの間の組換えによるペプチドライブラリーの作製を図解する。rbsはリボソーム結合部位を表し；Lpe lBはリーダーペプチド配列であり；ｇIIIはfdファージ遺伝子IIIであり；10aaは 10個のアミノ酸残基をコードするランダムオリゴヌクレオチド(NNK)₁₀であり（ＫはＧとＴの等モル混合物である）；^*はオーカー終止コドンである。発現される配列は、aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-aa6-aa7-aa8-aa9-aa10-A-L-L-R-Y-aa11-aa12-a a13-aa14-aa15-aa16-aa17-aa18-aa19-aa20である。図７は、自己スプライシングイントロン中のlox P部位間の組換えを使ったＶ，ＤおよびＪ領域の組換えを図解する。ＶＨ，ＤＨおよびＪＨ領域は生来のＶＨ，ＤＨおよびＪＨ領域であってもよく、または特にＤ領域については、組換えにより生成するCDR3長さの範囲が生来のCDR3長さの同一（または変更）分布を反映するように、多分異なる長さの合成オリゴヌクレオチド配列から誘導してもよい。スキームは遺伝子IIIタンパク質に融合されたＶＬ領域を有する一本鎖Fv分子について示されている。lx1，lx2およびlx3は３つの異なるlox P部位、例えば野性型lox P，lox P511およびlox P3である。in2およびin3は、lx2とlx3部位を含む２つのイントロン、例えばテトラヒメナrRNAおよびT4 sunYイントロンである。(a)受容体ベクター；(b)供与体ベクター１；(c)供与体ベクター２；(d)組換え fdファージ。図８は、図７に記載のように作製された、遺伝子IIIタンパク質に融合された組換えＶ，ＤおよびＪ領域を含有する一本鎖Fv分子の転写、スプライシングおよび発現を示す。最終生成物のアミノ酸をコードする核酸領域は、発現されたscFv−遺伝子III融合体として示される。(a)ＤＮＡ；(b)一次転写物；(c) スプライシングされた転写物；(d)発現されたscFv−遺伝子III融合体。図９は、生体内でのＶＨ，ＤＨおよびＪＨ組換えを模倣した新規ＶＨドメインを生成する組換えからの別の最終生成物を示す。０〜15アミノ酸をコードするランダムヌクレオチド配列の２つの別々のライブラリー（ｘとｙ）を作製し、そしてlox／Cre系を使って組み換える。lx1とlx2は２つの異なるlox部位、例えばlox P511とlox P（野性型）である。このスキームは、ただ１つの自己スプライシングイントロンと２つの異なるlox P配列を必要とする。図10は、ベクターfdDOG-PEPの作製を示す。(a)pUC19 NQ10 K；(b)fdDOG-FCK； (c)INTRON-LoxP(wt)；(d)fdDOG-PEP；r.b.s＝リボソーム結合部位；LpelB＝リーダーペプチド配列；ｇIII＝fdファージ遺伝子III（ｇIII）；10aa＝ランダムオリゴヌクレオチド；^*＝オーカー終止コドン。図11は、ベクターpUC19-PEPの作製を示す。(a)pUC19 NQ10 K；(b)fdDOG-BLX； (c)INTRON-LoxP(wt)；(d)fdDOG-PEP；r.b.s＝リボソーム結合部位；LpelB＝リーダーペプチド配列；ｇIII＝fdファージ遺伝子III（ｇIII）；10aa＝ランダムオリゴヌクレオチド；^*＝オーカー終止コドン。図12は、構成物fdDWT/3および実施例４に記載の構成物からの発現によって形成される３つの異なるリンカーを示す。配列Ａは未変異の自己スプライシングイントロンから誘導される。配列Ｂは３′スプライス部位のところと内部ガイド配列中で変異させた自己スプライシングイントロンから誘導される。配列Ｃは一本鎖Fv断片から誘導された配列を示す。Ｐ１およびＰ10ヘアピンループに寄与する塩基に下線が引かれている。制限部位の塩基が強調されている。対角の斜線は、その間で自己スプライシングイントロンがスプライシングされる塩基を示す。Ｔ７はT7 RNAポリメラーゼのためのプロモーターである。Ｆｘは第Ｘ因子プロテアーゼのための部位である。パートＤは変異される塩基（Ｐ10ヘアピンループ中ではＧ→Ｃ、そして内部ガイド配列中ではそれの相補的塩基）を強調した自己スプライシングイントロンの概略図である。図13Ａは、３つのlox P部位を含有するfdファージ受容体ベクターfdDWT/4を示す。それは抗NIPクローンG6（Griffiths他，1994,前掲）のＶＨおよびＶＬ遺伝子を含有する。部位loxP511とloxPWTがＶＨ遺伝子を隣接し、そして部位loxPWT とloxP4がＶＬ遺伝子を隣接する。loxPWT部位は自己スプライシングイントロン中にあり、そしてloxP4部位はＶＬ遺伝子と遺伝子IIIの間にある。コードされるダイアボディまたは一本鎖Fvポリペプチド鎖は、遺伝子IIIタンパク質との融合体として発現される。選択手順の間にファージのタンパク質溶解による抗原からの溶出の可能性を見込んで、第Ｘ因子プロテアーゼのための部位がＶＬ遺伝子と遺伝子IIIの間に含められる。loxP4部位がそれぞれloxP3とloxP1により置換されている別のfdDWT/4の変形も作製した。供与体ベクターPDN8は、loxP511部位とlo xPWT部位により隣接されたＶＨ−Ｄ10遺伝子を含有する。供与体ベクターpRWT/4 はloxPWT部位とloxP4部位により隣接されたＶＬ−Ｄ10遺伝子を含有する。供与体ベクターpRWT/3またはpWT/1中では、pRWT/4のloxP4部位がそれぞれloxP3部位またはloxP1部位により置換されている。発現ベクターpEX511/4は、loxP511部位とloxP4部位により隣接された、細菌にストレプトマイシン感受性を付与するＳ1 2遺伝子を含有する。図13Ｂは、実施例６中に記載された実験で得られる組換え効率を要約する。左側のloxP部位はloxP511であり、中央のloxP部位は自己スプライシングイントロン中のloxP部位であり、そして右側のloxP部位はＶＬ遺伝子と遺伝子IIIの間のl oxP部位である。実施例１：ダイアボディ分子の作製における自己スプライシングイントロンの使用この実施例に記載の実験では、それぞれ２−フェニルオキサゾール−５−オンおよび鶏卵リゾチームに対して向けられた、ダイアボディ形式でクローニングされた２つの抗体NQ11およびD1.3のＶＨドメイン遺伝子とＶＬドメイン遺伝子の間に自己スプライシングイントロンを導入した。この自己スプライシングイントロンは、機能的二価ダイアボディの発現により測定すると、発現後にスプライシングにより除去されることが示された。二価ダイアボディのＶＨドメインとＶＬドメインの間に５アミノ酸リンカーを残すように切除される自己スプライシングイントロンを含有するNQ11およびD1.3クローンの作製テトラヒメナからの自己スプライシングイントロン（T.R．Cech,Ann．Rev．Bi ochem.59:543-568，1990）は、Ｅ．コリの細胞質中でスプライシングできることがわかっている。クローンICE10(IanEperon，University of Leicester)からのそのような自己スプライシングイントロンを、スプライシングするとリンカーＶＨ−GLSSG−ＶＬを有するダイアボディをコードする転写解読枠を生成するようにして、抗体D1.3およびNQ11のＶＨとＶＬドメインをコードする遺伝子の間に挿入した。スプライシングなしでは、自己スプライシングイントロンが３つの読み枠で数個の終止コドンを含むため、機能的なダイアボディを全く生産することができない。プライマーT1baBstEIIの５′末端にBstEII制限部位を含め、そしてプライマー T1foSac中にSacＩ制限部位を導入した。これにより、自己スプライシングイントロン断片を２元連結反応において、各々BstEIIとSacＩで切断された発現ベクターpUC119D1.3（D1.3抗リゾチーム抗体のＶドメインをコードする）またはpUC19N Q11（抗phOx抗体NQ11のＶドメインをコードする）中にクローニングすることが可能になった。 T1baBstEIIは自己スプライシングイントロンの５′末端のところにプライムし、スプライシング活性に必要とされる内部ガイド配列（ＩＧＳ）を保存し且つＶＨドメインの３′末端のところに余分なグリシン残基を挿入する。T1foSacは自己スプライシングイントロンの３′末端にプライムし、イントロンの一部でないがテトラヒメナＤＮＡ中に存在するスプライシングイントロンのすぐ３′側のチミジン塩基を保存する。T1foSacはＶＬの５′末端のところに５アミノ酸リンカーを形成する余分なGly残基とSer残基を挿入する。標準条件（例えばPCT/GB93/02492の実施例14を参照のこと）を使ってプライマーT1baBstEIIとT1foSacIを用いて自己スプライシングイントロンを増幅させた。ＰＣＲ反応の生成物を制限酵素SacＩとBstEIIで消化し、そしてBstEII／SacＩで消化されたpUC119D1.3またはpUC19NQ11中にモル比４：１（ＳＳＩ：pUC119D1.3 またはpUC19NQ11）で連結し、得られた連結混合物を使ってＥ．コリTG1細胞を形質転換せしめた。自己スプライシングイントロンに特異的なプライマーT1foSac とT1baBstEIIを使って、正しいサイズの挿入断片について組換え体をスクリーニングした。 37℃での増殖により可溶性ダイアボディを発現させた。２mlの２×ＹＴ／0.1 ％グルコース／100μg/mlアンピシリン中の対数増殖期の細胞を、最終濃度1mM I PTGへのIPTGの添加こより誘導し、そして22℃で３時間増殖させた。細胞を遠心し（1000g，10分）、細胞ペレットを100 μｌの氷冷ＰＢＳ／１mM EDTA中に再懸濁し、そして氷上に60分間置いておいた。細胞懸濁液を遠心し（1000g，10分）、ダイアボディを含む上清をリゾチームとphOxに関するELISAに使用した（PCT/GB93/02492の実施例１に記載）。スプライシングされた５アミノ酸リンカーD1.3ダイアボディのELISAシグナル（405nmでの吸光度）は、５アミノ酸リンカーD1.3ダイアボディ（PCT/GB93/0249 2の実施例１で作製）を使って得られたものと同等であった（10分後、1.0より大きい）。しかしながら、スプライシングされた５アミノ酸リンカーNQ11ダイアボディの場合は、PCT/GB93/02492の実施例１で作製された５アミノ酸リンカーダイアボディに比べてシグナルがかなり低かった（20分後、2.0に比較して0.2）。これについて３つの説明が考えられる： −NQ11ダイアボディはGLSSGリンカー配列では機能的でない−これはありそうにないと思われる； −イントロンの３′側（ＶＬドメインの５′側）のＤＮＡ配列が自己スプライシングに適さないため、ダイアボディNQ11の場合に自己スプライシングが正しく機能しない。ＶＬドメイン遺伝子の５′末端のD1.3配列は自己スプライシングを許容するのに有能であるが、この領域中のNQ11配列は不十分である； −この構成物中に陰性スプライス部位が存在する。二価ダイアボディのＶＨドメインとＶＬドメインの間に６アミノ酸リンカーを残すように切除される、loxP部位を有する自己スプライシングイントロンを含有するNQ11およびD1.3クローンの作製プライマーT1ba2BstEIIおよびT1fo2SacIは、ＲＮＡレベルで効率的な自己スプライシングを可能にするであろう自己スプライシングイントロンの３′側の配列をNQ11構成物中に導入するようにデザインした。 T1ba2BstEIIおよびT1fo2SacIを使ってＰＣＲにより自己スプライシングイントロンを増幅させた。このイントロンを抗体NQ11のＶＨドメイン遺伝子とＶＬドメイン遺伝子の間に挿入し、スプライシングされるとリンカーＶＨ−GSLKVG−ＶＬを有するダイアボディをコードする転写解読枠を作製した。スプライシングなしでは、自己スプライシングイントロンが３つの読み枠で幾つかの終止コドンを含むため、全く機能的なダイアボディを生産することができない。プライマーT1ba2BstEIIの５′末端にBstEII制限部位を含め、そしてプライマーT1fo2Sac中にSacＩ制限部位を導入した。これにより、自己スプライシングイントロン断片を２元連結反応において、BstEIIとSacＩで切断された発現ベクターpUC19NQ11中にクローニングすることが可能になった。T1ba2BstEIIは自己スプライシングイントロンの５′末端のところにプライムし、スプライシング活性に必要とされる内部ガイド配列（ＩＧＳ）と対合する５′スプライス部位のところの塩基を保存し且つＶＨドメインの３′末端のところに余分なグリシン残基を挿入する。T1fo2Sacは自己スプライシングイントロンの３′末端にプライムし、イントロンの一部でないがテトラヒメナＤＮＡ中に存在するスプライシングイントロンのすぐ３′側のチミジン塩基を保存し、且つＶＬドメインのＮ末端のところに余分なGly残基とSer残基を挿入する。この場合に使用した自己スプライシングイントロンは、bp236と237の間に挿入されたlox P部位を含有した。標準条件を使ってプライマーT1ba2BstEIIとT1fo2S acIを用いて該イントロンを増幅させた。ＰＣＲ反応の生成物を制限酵素SacＩと BstEIIで消化し、そしてBstEII／SacＩで消化されたpUC19NQ11中にモル比４：１（ＳＳＩ：pUC19NQ11）で連結し、得られた連結混合物を使ってＥ．コリTG1細胞を形質転換せしめた。自己スプライシングイントロンに特異的なプライマーT1fo2SacとT1ba2BstEII を使って、正しいサイズの挿入断片について組換え体をスクリーニングした。上述と同様に可溶性ダイアボディを発現させ、ELISAによりアッセイした。この場合、自己スプライシングにより形成された６アミノ酸リンカーNQ11ダイアボディを使った時、PCT/GB93/02492の実施例１で作製された５アミノ酸リンカーNQ 11ダイアボディについて得られたのと同等なシグナルが得られた（10分後、1.0 より大きい）。よって、この方法はNQ11構成物中のより効率的な自己スプライシングを可能にする。実施例２：一本鎖Fvクローンの作製における自己スプライシングイントロンの使用この実施例に記載の実験では、鶏卵リゾチームに対して向けられた、一本鎖Fv 形式でクローニングされた抗体D1.3のＶＨドメイン遺伝子とＶＬドメイン遺伝子の間に自己スプライシングイントロンを導入する。この自己スプライシングイントロンは、15アミノ酸リンカーを有する機能的一本鎖Fv分子の発現により決定すると、転写後にスプライシングにより除去されることが示される。一本鎖Fv分子のＶＨドメインとＶＬドメインの間に15アミノ酸リンカーを残すように切除される自己スプライシングイントロンを含有するD1.3クローンの作製テトラヒメナからの自己スプライシングイントロン（T.R．Cech,Ann．Rev．Bi ochem.59:543-568，1990）は、Ｅ．コリ細胞質中でスプライシングできることがわかっている。それを、スプライシングするとリンカーＶＨ−GGGGSGGGGSGLSSG −ＶＬを有するscFvをコードする転写解読枠を生成するようにして、抗体D1.3のＶＨドメインおよびＶＬドメインをコードする遺伝子の間に挿入する。スプライシングなしでは、自己スプライシングイントロンが３つの読み枠で数個の終止コドンを含むため、機能的な scFvを全く生産することができない。プライマーT1bascFvBstEIIの５′末端にBstEII制限部位を含め、そしてプライマーT1foSac中にSacＩ制限部位を導入した。これにより、自己スプライシングイントロン断片を２元連結反応において、BstEIIとSacＩで切断された発現ベクターpUC119D1.3〔D1.3抗リゾチーム抗体のＶドメインをコードする；Holliger他（ 1993）前掲〕中にクローニングすることが可能になる。 T1bascFvBstEIIプライマーは自己スプライシングイントロンの５′末端のところにプライムし、スプライシング活性に必要とされる内部ガイド配列（ＩＧＳ）を保存し、且つＶＨの３′末端のところに余分な10個のアミノ酸残基を挿入する。T1foSacは、イントロンの一部でないがテトラヒメナＤＮＡ中に存在する自己スプライシングイントロンの３′末端のところにプライムし、且つＶＬドメインのＮ末端端のところに余分なセリン残基とグリシン残基を挿入する。この場合に使用した自己スプライシングイントロンは、bp236と237の間に挿入されたlox P部位を含有した。標準条件を使ってプライマーT1bascFvBstEIIとT1f oSacIを用いて該イントロンを増幅させた。ＰＣＲ反応の生成物を制限酵素SacＩとBstEIIで消化し、そしてBstEII／SacＩで消化されたpUC119D1.3中にモル比４：１（ＳＳＩ：pUC19NQ11）で連結し、得られた連結混合物を使ってＥ．コリTG1 細胞を形質転換せしめた。自己スプライシングイントロンに特異的なプライマー T1foSacとT1bascFvBstEIIを使って、正しいサイズの挿入断片について組換え体をスクリーニングした。実施例１と同様に可溶性一本鎖Fvを発現させ、ELISAによりリゾチームを結合する能力についてアッセイする。10分後に1.0より大きなシグナルが得られる。よって、自己スプライシングイントロンは一本鎖Fv分子をコードする核酸において使うことができる。実施例３：自己スプライシングイントロン中のlox P組換え部位を使ってファージ上に表示された25アミノ酸ペプチド（20の可変残基を含む）の多様性レパートリーの作製この実施例に記載の実験では、バクテリオファージ上に表示された25アミノ酸ペプチド（５つの不変アミノ酸により隔てられた２つの可変10アミノ酸ペプチド配列から成る）の多様性レパートリーを、別々のレプリコン中にクローニングした10アミノ酸ペプチドの２つの別々のレパートリーの組換えによって調製した。 Creレコンビナーゼの制御下でのlox P部位間の組換えにより、それらの配列が連結される。こうして調製された最終レパートリーは２つのペプチドライブラリーの多様性を兼ね備える（図６）。ベクターfdDOG-PEPの作製抗体NQ10/12.5のVHCH断片を、pelBリーダー配列の上流にloxP511部位とApaLI 制限部位を導入するオリゴ3249（表１と図10参照）とオリゴLMB2を使って、ベクターpUC19 NQ10kから増幅させた。次いで得られた断片をApaLIとNotIで切断されたfdDOG1（T．Clackson他，前掲）中にクローニングした。野性型lox P部位（ヌクレオチド236と237の間）を含むテトラヒメナからのグループＩ自己スプライシングイントロン（T.R．Cech他，Structural Biology 1:273-280，1994）を、オリゴ3189（EcoRI制限部位を導入する）とオリゴ3193（ランダムオリゴヌクレオチド(NNK)₁₀とNotI制限部位を含む）を使って増幅させた。得られた断片をSfiI とNotIで切断された fdDOG-BLX中にクローニングし、ベクターfdDOG-PEPを作製した。ベクターpUC19-PEPの作製野性型lox P部位（ヌクレオチド236と237の間）を含むテトラヒメナからのグループＩ自己スプライシングイントロンを、オリゴ3194（EcoRI制限部位を導入しそしてランダムオリゴヌクレオチド(NNK)₁₀を含む）（表１，図11）とオリゴ3 198（SfiI制限部位を導入する）を使って増幅させた。得られた断片を次いでSfi IとEcoRIで切断されたpUC19-2lox（P．Waterhouse他，1993，前掲）中にクローニングし、ベクターpUC19-PEP（図11）を作製した。組合せ感染と生体内組換え fdファージ上で25アミノ酸ペプチド（20の可変表示アミノ酸を含む）の大規模組合せレパートリーを作製するために、組合せ感染と生体内組換えの方策を使った（P．Waterhouse他，Nucleic AcidsRes.，21，2265-2266，1993）。この方法は、２つの10アミノ酸レパートリーを自己スプライシングイントロンにより隔てられた形で同一レプリコン上に一緒にするのにlox−Cre部位特異的組換え系を使う。 fdDOGPEP中の10アミノ酸ペプチドのライブラリーを含有する10⁹のＥ．コリTG1 細胞を使って、12.5μg/mlのテトラサイクリンを含む２×ＴＹ（２×ＴＹ−ＴＥＴ）１ｌに接種し、培養物を２ｌのバッフルアーレンマイヤーフラスコ中で２つの500mlアリコートにおいて30℃で30時間振盪培養した。ポリエチレングリコールを使った沈澱により上清からファージを精製し（J．McCafferty他，Nature348 : 552-554，1990）、ＰＢＳ（リン酸塩緩衝化塩類溶液：25mMNaH₂PO₄，125mM Na Cl，pH7.0）中に再懸濁した。指数のファージをＥ．コリTG1細胞に感染させ（30 分、37℃）そしてＴＹＥ−ＴＥＴ上で平板培養することによりファージを滴定した。収量は典型的には培養物１ｌあたり６×10¹³t.u．である。プラスミドpACYCara/Cre（実施例４）とpUC19 PEP中にクローニングされた10 アミノ酸ペプチドのライブラリーを含有する2.4×10⁸のＥ．コリを使って、100 μg/mlのカルベニシリン、25μg/mlのクロラムフェニコール、２g/ｌのグリセロールおよび１％グルコースを含有する２×ＴＹ（2xTYCaChglyglc）200mlに接種し、そして振盪しながら37℃で一晩増殖させた。一晩培養物の10mlアリコートを使って２ｌのアーレンマイヤーバッフルフラスコ中の2xTYCaChglyglcの10×１ｌ培養物に接種し、培養物を0.4のＡ₆₀₀まで37℃で振盪培養した。 1.4×10¹²t.u．のfdDOG-PEPライブラリーを各アーレンマイヤーバッフルフラスコに加え、振盪せずに37℃で10分間インキュベートした。次いで感染細胞を含む2xTYCaChglyglcを、0.45μmの接線流フィルター（PELLICONカセット，MILLIPO RE）を通して濾過し、２ｌのアーレンマイヤーバッフルフラスコ中、100μg/ml のカルベニシリン、25μg/mlのクロラムフェニコール、15μg/mlのテトラサイクリン、２g/ｌのグリセロールおよび0.5g/ｌのＬ（＋）−アラビノースを含有する２×ＴＹ（2xTYCaChTetglyara）10×１ｌ中に再懸濁し、そして培養物を振盪させながら30℃で36時間増殖させた。増殖前に試料を取り、カルベニシリン、クロラムフェニコールおよびテトラサイクリンを含む２ｘＴＹ寒天板上に塗布することによりライブラリーサイズを決定した。4.7×10¹⁰の独立クローンが存在した。次いで上記の通り培養物を濾過した。濾液中の組換えファージをPEG／NaClを使って沈澱させ、26mlＰＢＳの最終容量になるように再懸濁した。指数のファージをＥ．コリに感染させ（30分、37℃）、そしてＴＹＥ−ｔｅｔ上に塗抹することによりファージを滴定した。得られた収量は合計6.0×10¹³t.u．であった（fdDOG-RECライブラリーグリセロール原液）。組換えの頻度を決定するために、オリゴ4226とpelBBACK（表１）を使って個々のコロニーからＤＮＡを増殖させることによりＰＣＲスクリーニングを実施した。スクリーニングした50個のうち13個のクローンは、６％ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動により、移動度が314塩基対のサイズ（組換え型ファージから期待されるサイズ）に相当するバンドを与え、その他のクローンは移動度が284塩基対のサイズ（未組換え型ファージから期待されるサイズ）に相当するバンドを与えた。従って組換え頻度は26％であった。組換えを促進するためにCreレコンビナーゼが誘導される時、各細菌細胞中にはプラスミドとファージレプリコンの多重コピーが存在し、一晩の増殖後に細菌あたり少なくとも60のファージが生産されるので、各細菌は供与体ベクターからのペプチドを含む少なくとも１つのファージを与えるはずであり、ライブラリーの全体サイズは4.7×10¹ ⁰ クローンであると考えられる。組換えライブラリーからのファージの増殖組換えfdDOG-RECライブラリーグリセロール原液の35mlアリコート（2.4×10¹¹ c.f.u．）を10ｌの２×ＴＹ−ＴＥＴに接種した。培養物をバッフル付フラスコ（フラスコあたり培地１ｌ）中で振盪させながら30 ℃で一晩増殖させた。培養物を４℃にて5000gで15分間遠心し、ポリエチレングリコールを使って上清からfdファージを沈澱させ、そして各レパートリーを最終容量10mlのＰＢＳ中に再懸濁した。総ファージ収量（10ｌから）は典型的には10¹⁴ t.u．あたりである。組換え型ファージ中のイントロンの試験管内スプライシング組換え型ファージ中のイントロンのスプライシングについて試験するために、 31個の陽性組換えクローンのうち５個のクローンをオリゴ−3520とfdSEQ1を使って増幅させた。ＰＣＲ後の生成物のサイズは619塩基対（組換え型ファージに期待されるサイズ）と589塩基対（未組換え型ファージに期待されるサイズ）であった。製造業者の教示に従って試験管内転写キット（ Promega，Riboprobe II Core System T7 RNA Polymerase,カタログ番号 P2590）を使って、５個のクローンに対して試験管内転写を実施した（１個が未組換え型で４個が組換え型）。試料を煮沸し、６％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。４つの組換え型クローンの全てがスプライシングされたエキソン（198bp）に相当するバンドを示し、未組換え型クローンは移動度が168bp（スプライシングされたエキソン）に相当するバンドを与えた。これらの結果は、スプライシング反応が未組換え型ファージにも組換え型ファージにも起こることを示す。ライブラリーからのクローンの選択ファージ上に表示されたペプチドライブラリーを、アミノ酸配列RHSVを有する細胞表面上の直鎖状エピトープを認識する抗p53抗体(Pab240)（C.W．Stephen & D.P．Lane，J．Mol．Biol．1992，225，577-583）を結合する能力について選択した。選択は、以前に記載された方法論（J.D．Marks他，J．Mol．Biol.,222，581-5 97，1991；A.D.Grifflths他（1993）EMBO J.,12,725-734）を使って、10μg/ml で抗p53抗体がコーティングされたImmunotube（Nunc; Maxisorp）上で実施した。A.D．Griffiths他（1994）EMBO J.,13，3245-3260により記載された方法論を使って、Immunotube上の抗p53抗体へのファージ上に表示されたペプチドの結合について４回の増殖と選択を実施した。単離された単一クローンからのファージが抗p53抗体に結合する能力は、抗体p53がコーティングされたプレート上でのEL ISAにより評価した。ファージは McCafferty他（前掲）により記載されたように調製し、ELISAはGriffiths他（19 93，前掲）により記載されたように実施した。ただし、使用した二次抗体はアルカリホスファターゼに結合した抗ヤギ抗体であった。陽性のELISAシグナルを与えた31個のクローンを、オリゴ3870とfd SEQ1（表１）を使ったＰＣＲにより増幅させた。アリコートを１％アガロースゲル上での電気泳動により分析した。残りの生成物をMagic PCR Preps（Promega）を使って精製し、そして製造業者の教示に従って蛍光性ジデオキシチェーンターミネーター（Applied Biosystem）およびオリゴ4445と3358を使ったＰＣＲサイクル配列分析反応において使った。配列は表２に示される。選択されたクローンが特定されたことを確認するために、単離された単一クローンからの同一ファージを、Pab240と同じイソタイプ（IgG1）並びにλおよびκ 軽鎖（Fog-1およびFog-2）のいずれかを有する抗体への結合についてELISAによりアッセイした。ELISAは選択されたクローンのいずれもそれらの抗体と交差反応しないことを示した。従って、Steven & Lane（1992，前掲）により記載されたようなファージペプチドライブラリーから選択された共通配列と同じエピトープRHSVが選択されると結論づけられた。ファージ上に表示された31個の選択されたペプチドのうち、８つが配列RHSVを含み、４つがKHSVを含み、５つが(RまたはK)HS(LまたはI)を含み、そして３つが(RまたはK)HSXを含んだ。よって、自己スプライシングイントロン中に含まれるlox P部位間の組換えを使って、約５×10¹⁰の組換え25アミノ酸ペプチドの大規模ファージ表示ライブラリーを作製することができる。この方法は、例えば、レセプターへの結合に関与するペプチドを選択するのに特に有効であろう。組換えようとする10アミノ酸ペプチドの各々の中に、ジスルフィド結合が形成されそしてシステイン間でペプチドがループを形成するようにシステイン残基を含めることにより、強制的なペプチドライブラリーを作製することができる。５′および３′スプライス部位並びに読み枠を変えることにより、アミノ酸リンカーの長さとアミノ酸を変えることができる。この実施例は、２つのエキソンを１つの長い連続配列中に組み換える大規模ライブラリーを作製できることを証明する。レパートリーを作製するためのこの方法論は、例えば一本鎖Fv断片やダイアボディといった他の分子にも応用することができる。実施例４：高レベル発現と適合できる新規ダイアボディリンカーをコードするような、loxP部位を含む自己スプライシングイントロンの３′スプライス部位と内部ガイド配列の変異抗体レパートリーの作製においてloxPによる組換えを利用するために、リンカーとしてそれらのloxP配列によりコードされるアミノ酸配列を使って、連続した転写解読枠において一本鎖Fv断片の２つの抗体ドメインＶＨとＶＬの間にloxP部位を含めることができる。この場合、リンカーの選択は使用するloxP部位の長さと配列により規定される。別の方策は、ＶＨとＶＬの間に挿入されたグループＩ自己スプライシングイントロンのＲＮＡスプライシングを用いることである。発現後、組換え部位によりコードされるアミノ酸配列がスプライシングによりＲＮＡから除去され、従って発現される最終タンパク質中に取り込まれないように、イントロン中にloxPのような組換え部位を挿入することができる。グループＩイントロンが自己スプライシング過程により削除される時は、５′ および３′スプライス部位（それぞれＰ１およびＰ10 ヘアピンループ中で内部ガイド配列と対合する）に由来するイントロンの残基がポリペプチドのコード領域中に残る。好結果のスプライシングは、内部ガイド配列（ＩＧＳ）を含むＰ１およびＰ10ヘアピンループ中での塩基の対合に依存する。この実施例は、スプライシング後にＲＮＡによりコードされるアミノ酸が変更されるように３′スプライス部位と内部ガイド配列を変異せしめることができることを証明する。それらのアミノ酸は高レベルの発現と適合できる７アミノ酸（ダイアボディ）リンカーに寄与する。変異された３′スプライス部位が15アミノ酸リンカーを含む一本鎖Fv分子の作製に利用できることも更に示される。この実施例では、ＶＨドメインとＶＬドメインを連結させるのにloxPWT部位を含む自己スプライシングイントロンを使って、ハプテンＮＩＰ（３−ヨード−４−ヒドロキシ−５−ニトロフェニルアセテート）に対して向けられたscFv断片またはダイアボディをコードするベクターを作製しそして発現させる。１．自己スプライシングイントロン中にloxPを含む発現ベクターからの抗ＮＩＰダイアボディの作製および発現、並びにＰ10ヘアピンループの変異自己スプライシングイントロン中にloxPを含むダイアボディ発現ベクターは図 12に示される。このベクターの作製の顕著な特徴を下記に与える。ベクターpUC1 9Tet-intron-loxP（テトラヒメナICE10イントロン配列のbp236-237の間に挿入されたloxPWT配列を含む）から、#3312：intron-lox-backと#3463：intron-for-2 オリゴ（表１）（これらはそれぞれ、５′末端のところにXhoIとNcoI部位により隣接されたＰ１ヘアピンループの内部ガイド配列と５′スプライス部位の配列；および３′末端のところにApaLI部位とNotI部位により隣接されたＰ10ヘアピンループの３′スプライス部位を含む）を使って該イントロンを増幅させた。増幅生成物をNcoI−EcoRI断片としてpUC19 -2lox（Waterhouse他，1993，前掲）中にクローニングした。該イントロンはXho I部位とApaLI部位により隣接されている。この実施例に記載の実験では、ＶＨ遺伝子とＶＬ遺伝子はFab断片クローンG6 （抗NIP；A.D．Griffiths他，EMBO J.，13: 3245-3250，1994）に由来する。ＶＨ遺伝子をNcoI−XhoI断片としてpUCベクター誘導体中にクローニングした。Hin dIII部位にT7 RNAポリメラーゼ用のプロモーター配列を導入し、SalI部位とHind III部位により隣接させた。pUCベクター誘導体から、ＶＨ−NIP、自己スプライシングイントロン、loxP部位およびＴ７ポリメラーゼプロモーターを含有するSa lI−NotI断片を、ApaLI部位がSalI部位に変更されているfd-DOG1（Clackson他， Nature，352: 624-628，1991）中にサブクローニングした。G6のＶＬ遺伝子をAp aLI−NotI断片としてクローニングした。次いでloxP3部位を有するＶＬ遺伝子の３′末端にAscI部位を導入しそしてこのAscI部位と遺伝子III（ｇIII）の５′末端のNotI部位との間に第Ｘ因子プロテアーゼ開裂部位を導入した。得られた構成物fdDWT/3は図12に示される。スプライシング後、fdDWT/3から転写されたＲＮＡは７アミノ酸リンカーSLKVS ALを有する抗NIPダイアボディのポリペプチド鎖をコードする（図12ａ）。この構成物をコードするfdDNAによりTG1細胞を形質転換せしめ、そしてA.D．Griffit hsら（1994，前掲）により記載された通りにファージを調製した。このダイアボディは貧弱に発現された。ファージ力価は10⁷TU／ml未満であった（通常期待されるより少なくとも100倍少ない）。Griffiths他（1994，前掲）により記載された通りに実施したNIP-BSAへの結合についてのファージELISAにおいて検出可能なシグナルは全く得られなかった。しかしながら、スプライシングされた転写物から調製したcDNAの配列決定により証明されるように、このイントロンは正しくスプライシングされることがわかった。イントロンのスプライシングについて試験するために、まずプライマーfd-PCR -BackとBamHI-forを使ったＰＣＲによりベクターを増幅させ、Ｔ７プロモーター配列を含むＤＮＡ鋳型を調製した（表１）。この鋳型から、試験管内転写キット（Promega，RiboprobeIICore System T7 RNA Polymerase,カタログ番号 P2590）を使ってＲＮＡを調製した。まずDNaseＩでの消化により元のＤＮＡ鋳型を除去し、次いでFirst-Strand cDNA Synthesis Kit(Amersham)を使ってcDNAを調製した。VH3BackSfiとJK-FORプライマー（J.D．Marks他，J．Mol．Biol.，222:581-5 97，1991）を使ったＰＣＲにより該cDNAを増幅させ、そして同プライマーを使って配列決定した。得られた配列は、ダイアボディ発現生成物中にSLKVSALリンカーを与える正しいスプライシングを証明した。発現を改善するために、ダイアボディの発現用のリンカーとしてより適合性のアミノ酸を同定し、スプライス部位の塩基を変更するのに使用することができる。このため、３′スプライシングシグナル（Ｐ10）中の最初のＧがＣに変異された第二の抗ＮＩＰダイアボディを作製した。ＩＧＳとの完全な対合を可能にするために、ＩＧＳ中の対応するＣをＧに変更した（図12ｄ）。ベクターpUC19Tet-i ntron-loxPのイントロンを、第二組のプライマー、即ちＰ１とＩＧＳ中のＣ→Ｇ変異をコードする#3877、およびＧ→Ｃ変異を有するＰ10をコードする#3878（表１）を使ったＰＣＲにより増幅させた。上記と同様に該イントロンをクローニングして同様なfdDWT/3構成物を与えた。ただしこの場合には、該イントロンのスプライシング後、生成するＲＮＡはリンカーＶＨ−SLNVSAL−ＶＬをコードする（図12ｂ）。上記と同様な発現されたＲＮＡのｃＤＮＡ配列分析により、変異型イントロンのスプライシングを試験した。ダイアボディリンカー中のＫからＮへの変異は、ファージfd上に表示されたダイアボディの発現を著しく改善し、５×10⁸〜10⁹TU／mlの範囲のファージ力価と、１吸光度単位の範囲のNIP-BSAへの結合のファージELISAシグナルをもたらした。ダイアボディは抗原結合部位を形成するのに２つのポリペプチド鎖を必要とし（P．Holliger他，1993，前掲）且つ存在するダイアボディポリペプチド鎖だけが遺伝子IIIタンパク質に融合するので、ELISAシグナルは、或るダイアボディポリペプチド鎖が融合体から開裂され、ファージ表面上に保持されたｇIII−ダイアボディポリペプチド融合体と結合してNIPに結合することができる機能的な二価ダイアボディを形成することを指摘する。J．McCafferty他（Protein Enginee ring 4: 955-961，1991）により記載されたような遺伝子IIIタンパク質に対して向けられた抗体を使った検出により、ファージタンパク質のウエスタンブロットを実施した。その結果、ｇIIIタンパク質−ダイアボディポリペプチド融合体と生来のｇIIIタンパク質の位置に移動する開裂融合体の相対比がそれぞれ40％と6 0％であった。２．自己スプライシングイントロン中にloxPを含む発現ベクターからの抗NIP sc Fvの発現、およびＰ10ヘアピンループの変異変異型Ｐ10ヘアピンループのスプライシングにより誘導されたSLNVSALリンカーはダイアボディの（高レベル）発現と適合できたので、自己スプライシングイントロンに同じ変異型Ｐ10ヘアピンループを使う15アミノ酸リンカーを使って一本鎖Fv構成物を作製した。loxP部位を含む自己スプライシングイントロンはスプライシングされるとアミノ酸配列GGGGSLNVGGGGSALを与える（図12ｃ）。この自己スプライシングイントロンをオリゴヌクレオチド4243と4244（表１）を使ってベクターpUC19Tet-intron-loxPからＰＣＲにより増幅させた。それらのオリゴヌクレオチドは、それぞれ５′および３′スプライス部位を隣接する４つの連続したグリシン残基をコードする塩基を含む。上述したようなＫ→Ｎ変異をもたらすように、オリゴヌクレオチド4243は内部ガイド配列の変異を含み、そしてオリゴヌクレオチド4244は３′スプライス部位の変異を含む。該イントロンは転写後にスプライシングされ、NIP-BSAに基づくファージELISAにより測定すると、1.0の吸光度でファージfd表面上に抗NIP scFv断片を機能的に表示する。更に、ファージ力価は５×10⁸〜１×10⁹TU／mlの範囲であり、それらのファージfdクローンが良好に増殖したことを示した。このように、自己スプライシングによる高レベルの発現と適合するアミノ酸のコードづけを可能にするように、自己スプライシングイントロンの３′スプライス部位と内部ガイド配列に変異を作ることができる。変更したいと思うアミノ酸によって、Ｐ１ヘアピンループとＰ10ヘアピンループの塩基またはＰ１ヘアピンループだけの塩基を変異せしめることが必要かもしれない。実施例５：アラビノースプロモーターの調節下でCreレコンビナーゼを発現するプラスミドpACYCareCreの作製この実施例に記載の実験では、Creレコンビナーゼがアラビノースにより誘導可能なプロモーターの調節下で発現されるプラスミドを作製する。使われる複製開始点p15Aは、それをColE1複製開始点を有するプラスミドとファージ複製開始点を有するファージまたはファジミドとの併用に適するようにする。プライマーlacfor2とlacback2を使ってpUC119〔Vieira，J.およびMessing，J．（1987）Methods in Enzymol.，153, 3-11〕からＰＣＲにより断片を増幅させた。この断片はlacI遺伝子断片（不活性）からpUC119のポリリンカーまでに及び、前記プライマーは該断片の両末端に一連の制限部位を導入する。このＰＣＲ断片をPvuIIとKasＩで切断し、そして同酵素で消化したpUC119中に再クローニングしてpUC119lacipolyを作製した。 pARA14〔Cagnon，C.，Valverde，V.およびMasson，J.-M．（1991）Protein En gineering 4, 843-847〕をSacＩとNcoＩで消化し、araC遺伝子とaraBのプロモーター−オペレーター領域を含有する断片を遊離させた。この断片を同酵素で切断したpUC119lacipoly中に連結せしめ、pUC119araを作製した。プライマーcreforとcrebackを使って、バクテリオファージP1Cmc1.00r^-m^-〔Ya rmolinsky，M.B.，Hansen，E.B.，Jafri，S.およびChattoraj，D.K．（1989）J ．Bacteriol.，171, 4785-4791〕からＰＣＲによりCreレコンビナーゼ遺伝子を増幅させた。BsaＩとKpnＩでの消化後、この断片をNcoＩとKpnＩで切断したpUC1 19ara中に連結せしめ、pUC119araCreを作製した。最後に、araBのプロモーター−オペレーター領域の調節下にaraC遺伝子とCre レコンビナーゼ遺伝子を含有するpUC119araCreのPvuII−HindIII断片を、BsaBＩとHindIIIで切断したpACYC184〔Chang，A.C.Y.およびCohen，S.N．（1978）J．B acteriol.，134, 1141-1156〕中にサブクローニングし、それによりpACYC184のテトラサイクリン遺伝子を置換した。こうして製造されたプラスミド（pACYCara Cre）は、p15A複製開始点を有するプラスミド上にアラビノース誘導性Cre遺伝子を含有する。このプラスミドは重鎖供与体ベクター（ColE1複製開始点を有する）と受容体ベクター（繊維状ファージ複製開始点を有する）の両者と共にＥ．コリ中で共存することができ、loxP方式における大規模ファージ表示ライブラリーの作製に有用である。実施例６：自己スプライシングイントロン中のloxP部位を使った、FD3LOX系を使ったダイアボディレパートリーの作製のモデル実験この実施例では、自己スプライシングイントロン中のloxP部位がＶＨおよびＶＬ遺伝子レパートリーの組換えによるダイアボディまたは一本鎖Fvレパートリーの作製に利用できることを証明するモデル実験を記載する。このために、抗NIP ダイアボディ分子をコードする３つのlox部位を含むfdファージ受容体ベクターを使って、ＶＨまたはＶＬドメインをコードする供与体ベクターとの組換えを実施するモデル実験を記載する。ダイアボディカセットと発現ベクターとの組換えも証明される。この実施例の方法は、実施例４に記載したような15アミノ酸リンカー、または他のポリペプチドを使った一本鎖Fvレパートリーの作製にも同様に適用可能である。３つのlox部位を含むfdファージ受容体ベクターfdDWT/4は図13に示される。それは抗NIPクローンG6（Griffiths他，1994，前掲）のＶＨ遺伝子とＶＬ遺伝子を含有する。loxP511部位とloxPWT部位がＶＨ遺伝子を隣接し、loxPWT部位とloxP4 部位がＶＬ遺伝子を隣接している。loxPWT部位は自己スプライシングイントロン中にあり、loxP4部位はＶＬ遺伝子と遺伝子IIIの間に存在する。コードされるダイアボディまたは一本鎖Fvポリペプチド鎖は遺伝子IIIタンパク質との融合体として発現される。選択操作の間に抗原からのファージのタンパク質溶解による溶出の可能性を見込んで、ＶＬ遺伝子と遺伝子IIIの間に第Ｘ因子プロテアーゼのための部位が含められる。loxP4部位がそれぞれloxP3とloxP1により置換されているfdDWT/4の別の変形も作製することができる（図13参照）。例えば、最初にＶＬ遺伝子レパートリーをApaLI−AscI断片としてfdDWT/4中にクローニングするならば、次いでloxP511部位とloxPWT部位により隣接されたＶＨ遺伝子レパートリーを含む供与体ベクターとの組換えによりＶＨ遺伝子レパートリーを導入することができる。 fdDWT/4を、loxP511部位とloxPWT部位により隣接されたＶＨ−D10遺伝子を含む供与体ベクターpDN8と組み換えた。これは、ＶＨ−D10を含むpDN8供与体ベクターを用いてＥ．コリTG1 pACYCaraCre（実施例５）を形質転換せしめ、次いで可変ドメインＶＨ−G6とＶＬ−G6をコードする遺伝子を含むfdDWT/4ファージを感染させることによって行った。組換えは300℃で一晩続行させた。細菌上清からの組換えファージを使ってTG1を感染させた。供与体と受容体のloxP511部位の間および供与体と受容体のloxPWT部位の間の組換えの結果として、組換えfdファージは元のＶＬ−G6を維持しながらＶＨ−D10を含有する。供与体ベクター中に存在するＶＬ−G6とＶＨ−D10 CDR3をコードする配列上に特異的にプライムするオリゴヌクレオチドを使った増幅による個々のfdファージコロニーのＰＣＲスクリーニングにより、好結果の組換えを分析した。この場合、組換えが起こった時にだけＰＣＲ生成物が観察される。組換え効率は75％であった。fdDWT/3またはfdDWT/1をpDN8と組み換える同様な実験でも同様な効率が得られた（図13）。あるいは、ＶＨ遺伝子レパートリーをfdDWT/4のNcoＩ部位とXhoＩ部位の間にクローニングし、そしてＶＬレパートリーをloxPWTとloxPWTとloxP4部位により隣接させることができる。 fdDWT/4を、loxPWT部位とloxP4部位により隣接されたＶＬ−D10遺伝子を含む供与体ベクターpRWT/4と組み換えた。これは、ＶＬ− D10を含むpRWT/4供与体ベクターを用いてＥ．コリTG1 pACYCaraCre（実施例５）を形質転換せしめ、次いで可変ドメインＶＨ−G6とＶＬ−G6をコードする遺伝子を含むfdDWT/4ファージを感染させることによって行った。組換えは30℃で一晩続行させた。細菌上清からの組換えファージを使ってTG-1を感染させた。供与体と受容体のloxP4部位の間および供与体と受容体のloxPWT部位の間の組換えの結果として、組換えfdファージは元のＶＨ−G6を維持しながらＶＬ−D10を含有する。供与体ベクター中に存在するＶＨ−G6とＶＬ−D10 CDR3をコードする配列上に特異的にプライムするオリゴヌクレオチドを使った増幅による個々のfdファージクローンコロニーのＰＣＲスクリーニングにより、好結果の組換えを分析した。この場合、組換えが起こった時にだけＰＣＲ生成物が観察される。組換え効率は 10％未満であった。fdDWT/3またはfdDWT/1を供与体ベクターpRWT/3またはpWT/1 （pRWT/4のloxP4部位がそれぞれloxP3またはloxP1部位により置換される）と組み換える同様な実験で、ぞれぞれ０％および96％の効率が得られた。 fdDWT/4ではダイアボディポリペプチドは遺伝子IIIとの融合体としてのみ発現されるので、ファージ上に表示された二価ダイアボディは、遺伝子IIIタンパク質から開裂された遊離のダイアボディポリペプチドとダイアボディポリペプチド −遺伝子III融合体の会合から生じる。二価ダイアボディを可溶性分子として直接発現させることが望ましい。 loxP部位を使った組換えによる発現ベクター中への直接サブクローニングの実現性を試験するために、発現ベクターpEX511/4を作製した（図13）。これは、lo xP511部位とloxP4部位により隣接された、細菌にストレプトマイシン感受性を付与するＳ12遺伝子を含有する。pEX511/4を用いてＥ．コリTG1 pACYCaraCre（実施例５）を形質転換せしめ、次いで可変ドメインＶＨ−G6とＶＬ−G6をコードする遺伝子を含むfdDST/4 を使って感染させた。組換えを30℃で一晩続行させ、次いでストレプトマイシンを含むまたは含まない２×ＹＴ寒天上で細胞をレプリカ平板培養した。組換えが起こったならば、ダイアボディポリペプチドをコードする遺伝子がpEX511/5中のストレプトマイシン感受性遺伝子に取って替わっているだろう。これは細菌をストレプトマイシン耐性にするだろう。組換えが40〜70％の効率で起こったことがわかった。fdDWT/3またはfdWT/1をp EX511/3またはpEX511/1（pEX511/3のloxP4部位がそれぞれloxP3またはloxP1部位により置換された）と組み換えるという同様な実験を実施した。組換えは全く観察されなかった。このように、ダイアボディまたは一本鎖Fvレパートリーの作製に合わせて配置されたloxP部位の間で組換えを実施できることが証明される。レパートリーの作製のための好ましいアプローチは、まずＶＬ遺伝子をApaLI −AscI断片としてfdDWT/4中にクローニングし、次いでpDN8中のNcoI−XhoI断片としてＶＨレパートリーと組み換えることである。これはファージ表示に適するダイアボディレパートリー（またはわずかに変更されれば、一本鎖Fvレパートリー）を生成するだろう。ダイアボディの選択後、個々のまたはプールしたクローンを可溶性発現にむけてpEX511/4中にサブクローニングすることができる。実施例１，２および４におけるloxP部位を有する自己スプライシングイントロンを含むクローンからのペプチド表示鎖Fv発現からの結果と組み合わせると、この方法論は10¹⁰〜10¹²またはそれ以上のオーダーの独立クローンの大規模ダイアボディまたは一本鎖 Fvレパートリーの作製に適当であると結論づけられる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年６月１２日【補正内容】明細書系は、特にレプリコン、ファージまたはプラスミドの性質に対してより一層柔軟性を与える。この場合両レパートリーともloxP部位により隣接されているので、再度入替えられたレパートリーが発現される。実施例６と図12は、ＶＨとＶＬ遺伝子がloxP部位を含む自己スプライシングイントロンにより隔てられているダイアボディまたは一本鎖Fvレパートリーの作製のためのモデル実験におけるloxP系の使用を示す。この系のデザインは上記のような鎖の入替えを容易にするだろう。 (b) それは、例えば可溶性scFv断片の発現用の可溶性発現ベクター中に、抗原への結合について繊維状バクテリオファージの表面上で選択されている軽鎖および重鎖遺伝子対を転移させることを容易にする。この転移は現在のところ制限酵素を使ったクローニングにより行わなければならない。組換えによる転移は、新たな変異型loxP部位例えばloxP4とWT部位とを含有する発現ベクターを作製し、そしてそれらの２つの部位とfd2loxベクター上の対応部位との間で組換えを行うことにより、達成することができる。これのモデル実験は実施例６と図12に記載される。３つの異なるloxP部位の使用は、例えば、３つの配列の順番の組換えも可能にする。組み換える予定の第一の配列をloxPとloxP511により隣接させ、第二の配列をloxP511とloxP3により隣接させる。次いでそれらの配列を第三のＤＮＡ配列と３つのloxP部位を含む第三のレプリコン中に組み換える。異なる自己スプライシングイントロン中の２つのloxP部位の位置づけは、図７と８に示されるように３つの配列を連続して発現できるようにする。生産的配置の選択は、細菌、好ましくは大腸菌（Ｅ．コリ）または他のグラム陰性菌のpolA株の使用によって容易にすることができントロンの適当な領域を有する別のレプリコン上のlox P部位を通してＤＮＡレベルで組み換えることができる。転写後のＲＮＡレベルでの自己スプライシングは、コードされるリンカー領域の長さに依存して、可変ドメインの新たな組合せを有するダイアボディポリペプチド鎖または一本鎖Fvポリペプチドをもたらすだろう。PCT/GB93/02492中には、ダイアボディポリペプチドをコードするＲＮＡからのイントロンのスプライシングが記載されている。これは、適当な長さのリンカーをコードするＲＮＡスプライス部位の片側に余分なアミノ酸をコードする配列を導入することにより、容易に一本鎖Fv断片に拡張することができる。図３および５に記載の系を使って二価もしくは二特異性ダイアボディにまたは一本鎖Fv断片に対して鎖の入替えを実施することができる。上述したように、図 12に示されるような３つのloxP部位を有する系の使用により、更なる制御レベルを確立することができる。自己スプライシングイントロン中にloxP部位を含むクローンからのダイアボディまたは一本鎖Fv分子の発現は、実施例１，２および４で証明される。実施例３は、２つのエキソンをより長い連続配列中に組み換える大規模ライブラリーを作製できることを証明する。レパートリーを作製するためのこの方法論は、ペプチド配列に代わってＶＨおよびＶＬ遺伝子が使われる一本鎖Fv分子およびダイアボディのような他の分子にも応用することができる。実施例６は、ダイアボディまたは一本鎖Fvレパートリーの作製に合わせて配置された loxP部位の間で組換えを実施することができることを証明するモデル実験を記載する。この方法論は、実施例３およびGriffiths他（1994，前掲）に記載のライブラリーに適し、そして10¹²以上の独立したscFvまたはダイアボディクローンのライブラリーが作製可能であると結論づけられる。融合された組換えＶ，ＤおよびＪ領域を含有する一本鎖Fv分子の転写、スプライシングおよび発現を示す。最終生成物のアミノ酸をコードする核酸領域は、発現されたscFv−遺伝子III融合体として示される。(a)ＤＮＡ；(b)一次転写物；(c) スプライシングされた転写物；(d)発現されたscFv−遺伝子III融合体。図９は、生体内でのＶＨ，ＤＨおよびＪＨ組換えを模倣した新規ＶＨドメインを生成する組換えからの別の最終生成物を示す。０〜15アミノ酸をコードするランダムヌクレオチド配列の２つの別々のライブラリー（ｘとｙ）を作製し、そしてlox／Cre系を使って組み換える。lx1とlx2は２つの異なるlox部位、例えばlox P511とlox P（野性型）である。このスキームは、ただ１つの自己スプライシングイントロンと２つの異なるlox P配列を必要とする。図10は、ベクターpUC19-PEPの作製を示す。(a)pUC19 NQ10 K；(b)fdDOG-BLX； (c)INTRON-LoxP(wt)；(d)fdDOG-PEP；r.b.s＝リボソーム結合部位；LpelB＝リーダーペプチド配列；ｇIII＝fdファージ遺伝子III（ｇIII）；10aa＝ランダムオリゴヌクレオチド；^*＝オーカー終止コドン。図11は、構成物fdDWT/3および実施例４に記載の構成物からの発現によって形成される３つの異なるリンカーを示す。配列Ａは未変異の自己スプライシングイントロンから誘導される。配列Ｂは３′スプライス部位のところと内部ガイド配列中で変異させた自己スプライシングイントロンから誘導される。配列Ｃは一本鎖Fv断片から誘導された配列を示す。Ｐ１およびＰ10ヘアピンループに寄与する塩基に下線が引かれている。制限部位の塩基が強調されている。対角の斜線は、その間で自己スプライシングイントロンがスプライシングされる塩基を示す。Ｔ７はT7 RNAポリメラーゼのためのプロモーターである。Ｆｘは第Ｘ因子プロテアーゼのための部位である。パートＤは変異される塩基（Ｐ10ヘアピンループ中ではＧ→Ｃ、そして内部ガイド配列中ではそれの相補的塩基）を強調した自己スプライシングイントロンの概略図である。図12Ａは、３つのlox P部位を含有するfdファージ受容体ベクターfdDWT/4を示す。それは抗NIPクローンG6（Griffiths他，1994，前掲）のＶＨおよびＶＬ遺伝子を含有する。部位loxP511とloxPWTがＶＨ遺伝子を隣接し、そして部位loxPWT とloxP4がＶＬ遺伝子を隣接する。loxPWT部位は自己スプライシングイントロン中にあり、そしてloxP4部位はＶＬ遺伝子と遺伝子IIIの間にある。コードされるダイアボディまたは一本鎖Fvポリペプチド鎖は、遺伝子IIIタンパク質との融合体として発現される。選択手順の間にファージのタンパク質溶解による抗原からの溶出の可能性を見込んで、第Ｘ因子プロテアーゼのための部位がＶＬ遺伝子と遺伝子IIIの間に含められる。loxP4部位がそれぞれloxP3とloxP1により置換されている別のfdDWT/4の変形も作製した。供与体ベクターPDN8は、loxP511部位とlo xPWT部位により隣接されたＶＨ−Ｄ10遺伝子を含有する。供与体ベクターpRWT/4 はloxPWT部位とloxP4部位により隣接されたＶＬ−Ｄ10遺伝子を含有する。供与体ベクターpRWT/3またはpWT/1中では、pRWT/4のloxP4部位がそれぞれloxP3部位またはloxP1部位により置換されている。発現ベクターpEX511/4は、loxP511部位とloxP4部位により隣接された、細菌にストレプトマイシン感受性を付与するＳ1 2遺伝子を含有する。 fdDOG-BLX中にクローニングし、ベクターfdDOG-PEPを作製した。ベクターpUC19-PEPの作製野性型lox P部位（ヌクレオチド236と237の間）を含むテトラヒメナからのグループＩ自己スプライシングイントロンを、オリゴ3194（EcoRI制限部位を導入しそしてランダムオリゴヌクレオチド(NNK)₁₀を含む）とオリゴ3198（SfiI制限部位を導入する）を使って増幅させた。得られた断片を次いでSfiIとEcoRIで切断されたpUC19-2lox（P．Waterhouse他，1993，前掲）中にクローニングし、ベクターpUC19-PEPを作製した。組合せ感染と生体内組換え fdファージ上で25アミノ酸ペプチド（20の可変表示アミノ酸を含む）の大規模組合せレパートリーを作製するために、組合せ感染と生体内組換えの方策を使った（P．Waterhouse他，Nucleic Acids Res.，21，2265-2266，1993）。この方法は、２つの10アミノ酸レパートリーを自己スプライシングイントロンにより隔てられた形で同一レプリコン上に一緒にするのにlox−Cre部位特異的組換え系を使う。 fdDOGPEP中の10アミノ酸ペプチドのライブラリーを含有する10⁹のＥ．コリTG1 細胞を使って、12.5μg/mlのテトラサイクリンを含む２×ＴＹ（２×ＴＹ−ＴＥＴ）１ｌに接種し、培養物を２ｌのバッフルアーレンマイヤーフラスコ中で２つの500mlアリコートにおいて30℃で30時間振盪培養した。ポリエチレングリコールを使った沈澱により上清からファージを精製し（J．McCafferty他，Nature348 : 552-554，1990）、ＰＢＳ（リン酸塩緩衝化塩類溶液：25mMNaH₂PO₄，125mM Na Cl，pH7.0）中に再懸濁した。指数のファージをＥ．コリTG1細胞に感染させ（30 分、37℃）そしてＴＹＥ−ＴＥＴ上で平板培養することによりファージを滴定した。収量は典型的ヘアピンループ中で内部ガイド配列と対合する）に由来するイントロンの残基がポリペプチドのコード領域中に残る。好結果のスプライシングは、内部ガイド配列（ＩＧＳ）を含むＰ１およびＰ10ヘアピンループ中での塩基の対合に依存する。この実施例は、スプライシング後にＲＮＡによりコードされるアミノ酸が変更されるように３′スプライス部位と内部ガイド配列を変異せしめることができることを証明する。それらのアミノ酸は高レベルの発現と適合できる７アミノ酸（ダイアボディ）リンカーに寄与する。変異された３′スプライス部位が15アミノ酸リンカーを含む一本鎖Fv分子の作製に利用できることも更に示される。この実施例では、ＶＨドメインとＶＬドメインを連結させるのにloxPWT部位を含む自己スプライシングイントロンを使って、ハプテンＮＩＰ（３−ヨード−４−ヒドロキシ−５−ニトロフェニルアセテート）に対して向けられたscFv断片またはダイアボディをコードするベクターを作製しそして発現させる。１．自己スプライシングイントロン中にloxPを含む発現ベクターからの抗ＮＩＰダイアボディの作製および発現、並びにＰ10ヘアピンループの変異自己スプライシングイントロン中にloxPを含むダイアボディ発現ベクターは図 11に示される。このベクターの作製の顕著な特徴を下記に与える。ベクターpUC1 9Tet-intron-loxP（テトラヒメナICE10イントロン配列のbp236-237の間に挿入されたloxPWT配列を含む）から、#3312：intron-lox-backと#3463：intron-for-2 オリゴ（表１）（これらはそれぞれ、５′末端のところにXhoIとNcoI部位により隣接されたＰ１ヘアピンループの内部ガイド配列と５′スプライス部位の配列；および３′末端のところにApaLI部位とNotI部位により隣接されたＰ10ヘアピンループの３′スプライス部位を含む）を使って該イントロンを増幅させた。増幅生成物をNcoI−EcoRI断片としてpUC19 -2lox（Waterhouse他，1993，前掲）中にクローニングした。該イントロンはXho I部位とApaLI部位により隣接されている。この実施例に記載の実験では、ＶＨ遺伝子とＶＬ遺伝子はFab断片クローンG6 （抗NIP；A.D．Griffiths他，EMBO J.，13: 3245-3250，1994）に由来する。ＶＨ遺伝子をNcoI−XhoI断片としてpUCベクター誘導体中にクローニングした。Hin dIII部位にT7 RNAポリメラーゼ用のプロモーター配列を導入し、SalI部位とHind III部位により隣接させた。pUCベクター誘導体から、ＶＨ−NIP、自己スプライシングイントロン、loxP部位およびＴ７ポリメラーゼプロモーターを含有するSa lI−NotI断片を、ApaLI部位がSalI部位に変更されているfd-DOG1（Clackson他， Nature，352: 624-628，1991）中にサブクローニングした。G6のＶＬ遺伝子をAp aLI−NotI断片としてクローニングした。次いでloxP3部位を有するＶＬ遺伝子の３′末端にAscI部位を導入しそしてこのAscI部位と遺伝子III（ｇIII）の５′末端のNotI部位との間に第Ｘ因子プロテアーゼ開裂部位を導入した。得られた構成物fdDWT/3は図11に示される。スプライシング後、fdDWT/3から転写されたＲＮＡは７アミノ酸リンカーSLKVS ALを有する抗NIPダイアボディのポリペプチド鎖をコードする（図11ａ）。この構成物をコードするfdDNAによりTG1細胞を形質転換せしめ、そしてA.D．Griffit hsら（1994，前掲）により記載された通りにファージを調製した。このダイアボディは貧弱に発現された。ファージ力価は10⁷TU／ml未満であった（通常期待されるより少なくとも100倍少ない）。Griffiths他（1994，前掲）により記載された通りに実施したNIP-BSAへの結合についてのファージELISAにおいて検出可能なシグナルは全く得られなかった。しかしながら、スプライシングされた転写物から調製したcDNAの配列決定により証明されるように、このイントロンは正しくスプライシングされることがわかった。イントロンのスプライシングについて試験するために、まずプライマーfd-PCR -BackとBamHI-forを使ったＰＣＲによりベクターを増幅させ、Ｔ７プロモーター配列を含むＤＮＡ鋳型を調製した（表１）。この鋳型から、試験管内転写キット（Promega，RiboprobeIICore System T7 RNA Polymerase,カタログ番号 P2590）を使ってＲＮＡを調製した。まずDNaseＩでの消化により元のＤＮＡ鋳型を除去し、次いでFirst-Strand cDNA Synthesis Kit(Amersham)を使ってcDNAを調製した。VH3BackSfiとJK-FORプライマー（J.D．Marks他，J．Mol．Biol.，222:581-5 97，1991）を使ったＰＣＲにより該cDNAを増幅させ、そして同プライマーを使って配列決定した。得られた配列は、ダイアボディ発現生成物中にSLKVSALリンカーを与える正しいスプライシングを証明した。発現を改善するために、ダイアボディの発現用のリンカーとしてより適合性のアミノ酸を同定し、スプライス部位の塩基を変更するのに使用することができる。このため、３′スプライシングシグナル（Ｐ10）中の最初のＧがＣに変異された第二の抗ＮＩＰダイアボディを作製した。ＩＧＳとの完全な対合を可能にするために、ＩＧＳ中の対応するＣをＧに変更した（図11ｄ）。ベクターpUC19Tet-i ntron-loxPのイントロンを、第二組のプライマー、即ちＰ１とＩＧＳ中のＣ→Ｇ変異をコードする#3877、およびＧ→Ｃ変異を有するＰ10をコードする#3878（表１）を使ったＰＣＲにより増幅させた。上記と同様に該イントロンをクローニングして同様なfdDWT/3構成物を与えた。ただしこの場合には、該イントロンのスプライシング後、生成するＲＮＡはリンカーＶＨ−SLNVSAL−ＶＬをコードする（図11ｂ）。上記と同様な発現されたＲＮＡのｃＤＮＡ配列分析により、変異型イントロンのスプライシングを試験した。ダイアボディリンカー中のＫからＮへの変異は、ファージfd上に表示されたダイアボディの発現を著しく改善し、５×10⁸〜10⁹TU／mlの範囲のファージ力価と、１吸光度単位の範囲のNIP-BSAへの結合のファージELISAシグナルをもたらした。ダイアボディは抗原結合部位を形成するのに２つのポリペプチド鎖を必要とし（P．Holliger他，1993，前掲）且つ存在するダイアボディポリペプチド鎖だけが遺伝子IIIタンパク質に融合するので、ELISAシグナルは、或るダイアボディポリペプチド鎖が融合体から開裂され、ファージ表面上に保持されたｇIII−ダイアボディポリペプチド融合体と結合してNIPに結合することができる機能的な二価ダイアボディを形成することを指摘する。J．McCafferty他（Protein Enginee ring 4: 955-961，1991）により記載されたような遺伝子IIIタンパク質に対して向けられた抗体を使った検出により、ファージタンパク質のウエスタンブロットを実施した。その結果、ｇIIIタンパク質−ダイアボディポリペプチド融合体と生来のｇIIIタンパク質の位置に移動する開裂融合体の相対比がそれぞれ40％と6 0％であった。２．自己スプライシングイントロン中にloxPを含む発現ベクターからの抗NIP sc Fvの発現、およびＰ10ヘアピンループの変異変異型Ｐ10ヘアピンループのスプライシングにより誘導されたSLNVSALリンカーはダイアボディの（高レベル）発現と適合できたので、自己スプライシングイントロンに同じ変異型Ｐ10ヘアピンループを使う15アミノ酸リンカーを使って一本鎖Fv構成物を作製した。loxP部位を含む自己スプライシングイントロンはスプライシングされるとアミノ酸配列GGGGSLNVGGGGSALを与える（図11ｃ）。き、loxP方式における大規模ファージ表示ライブラリーの作製に有用である。実施例６：自己スプライシングイントロン中のloxP部位を使った、FD3LOX系を使ったダイアボディレパートリーの作製のモデル実験この実施例では、自己スプライシングイントロン中のloxP部位がＶＨおよびＶＬ遺伝子レパートリーの組換えによるダイアボディまたは一本鎖Fvレパートリーの作製に利用できることを証明するモデル実験を記載する。このために、抗NIP ダイアボディ分子をコードする３つのlox部位を含むfdファージ受容体ベクターを使って、ＶＨまたはＶＬドメインをコードする供与体ベクターとの組換えを実施するモデル実験を記載する。ダイアボディカセットと発現ベクターとの組換えも証明される。この実施例の方法は、実施例４に記載したような15アミノ酸リンカー、または他のポリペプチドを使った一本鎖Fvレパートリーの作製にも同様に適用可能である。３つのlox部位を含むfdファージ受容体ベクターfdDWT/4は図13に示される。それは抗NIPクローンG6（Griffiths他，1994，前掲）のＶＨ遺伝子とＶＬ遺伝子を含有する。loxP511部位とloxPWT部位がＶＨ遺伝子を隣接し、loxPWT部位とloxP4 部位がＶＬ遺伝子を隣接している。loxPWT部位は自己スプライシングイントロン中にあり、loxP4部位はＶＬ遺伝子と遺伝子IIIの間に存在する。コードされるダイアボディまたは一本鎖Fvポリペプチド鎖は遺伝子IIIタンパク質との融合体として発現される。選択操作の間に抗原からのファージのタンパク質溶解による溶出の可能性を見込んで、ＶＬ遺伝子と遺伝子IIIの間に第Ｘ因子プロテアーゼのための部位が含められる。loxP4部位がそれぞれloxP3とloxP1により置換されているfdDWT/4の別の変形も作製することができる（図12参照）。例えば、最初にＶＬ遺伝子レパートリーをApaLI−AscI断片としてfdDWT/4中にクローニングするならば、次いでloxP511部位とloxPWT部位により隣接されたＶＨ遺伝子レパートリーを含む供与体ベクターとの組換えによりＶＨ遺伝子レパートリーを導入することができる。 fdDWT/4を、loxP511部位とloxPWT部位により隣接されたＶＨ−D10遺伝子を含む供与体ベクターpDN8と組み換えた。これは、ＶＨ−D10を含むpDN8供与体ベクターを用いてＥ．コリTG1 pACYCaraCre（実施例５）を形質転換せしめ、次いで可変ドメインＶＨ−G6とＶＬ−G6をコードする遺伝子を含むfdDWT/4ファージを感染させることによって行った。組換えは30℃で一晩続行させた。細菌上清からの組換えファージを使ってTG1を感染させた。供与体と受容体のloxP511部位の間および供与体と受容体のloxPWT部位の間の組換えの結果として、組換えfdファージは元のＶＬ−G6を維持しながらＶＨ−D10を含有する。供与体ベクター中に存在するＶＬ−G6とＶＨ−D10 CDR3をコードする配列上に特異的にプライムするオリゴヌクレオチドを使った増幅による個々のfdファージコロニーのＰＣＲスクリーニングにより、好結果の組換えを分析した。この場合、組換えが起こった時にだけＰＣＲ生成物が観察される。組換え効率は75％であった。fdDWT/3またはfdDWT/1をpDN8と組み換える同様な実験でも同様な効率が得られた（図12）。あるいは、ＶＨ遺伝子レパートリーをfdDWT/4のNcoＩ部位とXhoＩ部位の間にクローニングし、そしてＶＬレパートリーをloxPWTとloxPWTとloxP4部位により隣接させることができる。 fdDWT/4を、loxPWT部位とloxP4部位により隣接されたＶＬ−D10遺伝子を含む供与体ベクターpRWT/4と組み換えた。これは、ＶＬ− D10を含むpRWT/4供与体ベクターを用いてＥ．コリTG1 pACYCaraCre（実施例５）を形質転換せしめ、次いで可変ドメインＶＨ−G6とＶＬ−G6をコードする遺伝子を含むfdDWT/4ファージを感染させることによって行った。組換えは30℃で一晩続行させた。細菌上清からの組換えファージを使ってTG-1を感染させた。供与体と受容体のloxP4部位の間および供与体と受容体のloxPWT部位の間の組換えの結果として、組換えfdファージは元のＶＨ−G6を維持しながらＶＬ−D10を含有する。供与体ベクター中に存在するＶＨ−G6とＶＬ−D10 CDR3をコードする配列上に特異的にプライムするオリゴヌクレオチドを使った増幅による個々のfdファージクローンコロニーのＰＣＲスクリーニングにより、好結果の組換えを分析した。この場合、組換えが起こった時にだけＰＣＲ生成物が観察される。組換え効率は 10％未満であった。fdDWT/3またはfdDWT/1を供与体ベクターpRWT/3またはpWT/1 （pRWT/4のloxP4部位がそれぞれloxP3またはloxP1部位により置換される）と組み換える同様な実験で、ぞれぞれ０％および96％の効率が得られた。 fdDWT/4ではダイアボディポリペプチドは遺伝子IIIとの融合体としてのみ発現されるので、ファージ上に表示された二価ダイアボディは、遺伝子IIIタンパク質から開裂された遊離のダイアボディポリペプチドとダイアボディポリペプチド −遺伝子III融合体の会合から生じる。二価ダイアボディを可溶性分子として直接発現させることが望ましい。 loxP部位を使った組換えによる発現ベクター中への直接サブクローニングの実現性を試験するために、発現ベクターpEX511/4を作製した（図12）。これは、lo xP511部位とloxP4部位により隣接された、細菌にストレプトマイシン感受性を付与するＳ12遺伝子を含有【図１】【図４】【図２】【図３】【図５】【図６】【図７】【図８】【図９】【図１２】【図１０】【図１１】【図１１】【図１２】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｐ 21/08 9162−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ニッシム，アウバイギリス国，ケンブリッジシービー２２エーワイ，クイーンズウェイ 25 (72)発明者フィシュ，イゴアイギリス国，ケンブリッジシャージービー３７ピーエックス，コトン，ザフットパス 53 (72)発明者ウィンター，グレゴリーポールイギリス国，ケンブリッジシービー２１ティーキュー，トリニティーカレッジ（番地なし)

Claims

【特許請求の範囲】１．ＤＮＡ構成物であって、第一のペプチドまたはポリペプチドをコードするヌクレオチドの第一のエキソン配列、第二のペプチドまたはポリペプチドをコードするヌクレオチドの第二のエキソン配列、およびＲＮＡスプライス部位の間の異種イントロンと該イントロン中の部位特異的組換え配列をコードする第一の配列と第二の配列の間のヌクレオチドの第三の配列を含んで成り、前記エキソンは一緒になって１つのペプチドまたはポリペプチド生成物をコードする、ＤＮＡ構成物。２．前記ペプチドまたはポリペプチド生成物が特異的結合ペア（sbp）のメンバーを含んで成る、請求項１に記載のＤＮＡ構成物。３．前記sbpメンバーが相補的sbpメンバーを結合することができる結合ドメインを含んで成る、請求項１に記載のＤＮＡ構成物。４．前記結合ドメインが免疫グロブリンの抗原結合部位である、請求項３に記載のＤＮＡ構成物。５．前記ペプチドまたはポリペプチド生成物が、ＶＨドメインとＶＬドメインを会合させて抗原結合部位を形成するペプチドリンカーによってＶＬドメインに連結されたＶＨドメインを含んで成るscFv抗体断片である、請求項４に記載のＤＮＡ構成物。６．前記構成物の転写が、前記scFv抗体断片のペプチドリンカーのアミノ酸をコードしそして該アミノ酸に翻訳され得る前記ＲＮＡスプライス部位のヌクレオチドに相当するヌクレオチドを有するｍＲＮＡをもたらす、請求項５に記載のＤＮＡ構成物。７．前記ペプチドまたはポリペプチド生成物が、Ｔ細胞レセプターＶαドメインとＴ細胞レセプターＶβドメイン領域、またはＴ細胞レセプター／抗体融合体、またはＴ細胞レセプター／抗体断片融合体、またはレセプター結合ペプチド、または酵素、または多ドメインタンパク質、またはそれらのいずれかのアミノ酸配列変異体もしくは誘導体を含んで成る、請求項１に記載のＤＮＡ構成物。８．前記第一および第二のペプチドまたはポリペプチドが、天然に存在するいずれのポリペプチド中でも一緒に連結されない、請求項１に記載のＤＮＡ構成物。９．前記第一および第二のペプチドまたはポリペプチドのうちの一方が抗体断片を含んで成る、請求項８に記載のＤＮＡ構成物。 10．前記抗体断片がＶＨ，ＶＬ，ＣＨ，ＣＬ，ＶＨ−ＣＨおよびＶＬ−ＣＬから成る群より選択される、請求項９に記載のＤＮＡ構成物。 11．前記第一および／または第二のペプチドまたはポリペプチドが、合成ヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含んで成る、請求項８に記載のＤＮＡ構成物。 12．前記イントロンが自己スプライシンググループＩまたはグループIIイントロンである、上記請求項のいずれか一項に記載のＤＮＡ構成物。 13．前記自己スプライシングイントロンがテトラヒメナ・テルモフィラ（Tetr ahymena thermophila ）核のプレｒＲＮＡから得られる、請求項12に記載のＤＮＡ構成物。 14．前記部位特異的組換え配列が、コリファージP1から得られるloxP配列、またはそれの変異体もしくは誘導体である、上記請求項のいずれか一項に記載のＤＮＡ構成物。 15．前記ペプチドまたはポリペプチド生成物が生物体の表面成分を含んで成る、上記請求項のいずれか一項に記載のＤＮＡ構成物。 16．前記生物体がバクテリオファージである、請求項15に記載のＤＮＡ構成物。 17．前記バクテリオファージがfdまたはM13である、請求項16に記載のＤＮＡ構成物。 18．前記表面成分が遺伝子III生成物である、請求項17に記載のＤＮＡ構成物。 19．前記ペプチドまたはポリペプチド生成物が、免疫グロブリン重鎖可変領域の結合領域を含んで成るドメイン(a)、および免疫グロブリン軽鎖可変領域の結合領域を含んで成るドメイン(b)を含んで成り、前記ポリペプチドのドメイン(a) と(b)が連結されておりそして多量体として分子間会合して抗原結合部位を形成することができるが分子内会合して抗原結合部位を形成することができないというポリペプチドを含まない、上記請求項のいずれか一項に記載のＤＮＡ構成物。 20．前記ペプチドまたはポリペプチド生成物の発現のための核酸を更に含んで成るベクターである、上記請求項のいずれか一項に記載のＤＮＡ構成物。 21．前記ペプチドまたはポリペプチド生成物の分泌のための核酸を更に含んで成る、請求項20に記載のＤＮＡ構成物。 22．前記ベクターがプラスミド、ファージまたはファジミドベクターである、請求項20または請求項21に記載のＤＮＡ構成物。 23．上記請求項のいずれか一項に記載のＤＮＡ構成物を含んで成る宿主細胞。 24．集団としてレパートリー中の各ペプチドまたはポリペプチド生成物が異なるアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチド生成物のレパートリーをコードする、請求項１〜22のいずれか一項に記載の複数のＤＮＡ構成物。 25．請求項23に記載の複数のＤＮＡ構成物を含んで成る宿主細胞の集団。 26．第一のペプチドまたはポリペプチド成分と第二のペプチドまたはポリペプチド成分の組合せを含んで成るペプチドまたはポリペプチド生成物の製造方法であって、請求項20〜22のいずれか一項に記載のＤＮＡ構成物を用意し；前記構成物のＤＮＡをＲＮＡに転写し；第三の配列のヌクレオチドのスプライシングを誘導または許容して前記ペプチドまたはポリペプチド生成物をコードするＲＮＡ分子を生じさせ；前記ＲＮＡ分子を前記ペプチドまたはポリペプチド生成物に翻訳することを含んで成る方法。 27．転写、スプライシングおよび翻訳が試験管内で行われる、請求項26に記載の方法。 28．転写、スプライシングおよび翻訳が生体内で行われる、請求項27に記載の方法。 29．転写、スプライシングおよび翻訳がＥ．コリ細胞内で行われる、請求項28 に記載の方法。 30．転写、スプライシングおよび翻訳のために複数のＤＮＡ構成物が用意される、請求項26〜29のいずれか一項に記載の方法。 31．前記翻訳後、存在する他のペプチドまたはポリペプチドから着目のペプチドまたはポリペプチド生成物が選択または単離される、請求項26〜30のいずれか一項に記載の方法。 32．単離された核酸構成物であって、イントロン中に部位特異的組換え配列を有する自己スプライシングイントロンをコードするヌクレオチドの配列から本質的に成る核酸構成物。 33．前記部位特異的組換え配列がコリファージ１から得られるloxP配列、またはそれの変異体もしくは誘導体である、請求項32に記載の核酸構成物。 34．前記自己スプライシングイントロンがテトラヒメナ・テルモフィラ（Tetr ahymena thermophila ）核のプレｒＲＮＡから得られる、請求項32または請求項 33に記載の核酸構成物。