TW202320861A - 以抗體-藥物結合物治療耐化療的癌症之方法 - Google Patents
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Abstract
本揭示係關於使用ADC治療癌症的治療方法領域。本揭示亦關於包含用於治療癌症之ADC的醫藥產品領域。更具體而言,該ADC係由經由連接子而與抗癌劑(諸如拓樸異構酶I抑制劑)連結的抗鈣黏蛋白6 (CDH6)抗體所構成,且該癌症可對化療具有耐性。
Description
相關申請案之交叉引用
本案主張美國臨時專利申請號63/244,458 (2021年9月15日申請)之優先權及利益。此申請案之內容藉由引用將其整體併入本文。
關於序列表的聲明
與本申請相關的序列表以文本格式代替紙本提供,並在此藉由引用併入本說明書中。含有序列表的文本檔案名稱為098065-0296_SL.txt(台灣申請案序列表的文本檔案名稱外文:PD1227528_ForeignSequence.xml;中文:PD1227528_Sequence.xml)。該文本檔案大小約為112 kb,創建於2021年9月9日,並經由EFS-Web以電子方式提交。
技術領域
本揭示係關於治療方法、抗體-藥物結合物(ADC)之用途、用於治療癌症之ADC醫藥產品等的領域。
鈣黏蛋白(cadherin)係存在於細胞膜表面之醣蛋白,透過彼等N端胞外域之鈣離子依賴性結合而作為細胞間黏著分子發揮功能,或作為負責細胞間相互作用的訊息分子而發揮功能。典型的鈣黏蛋白屬於鈣黏蛋白超家族,且係由5個胞外域(EC域)、1個跨膜區(transmembrane region)、及胞內域所構成的單次跨膜蛋白。典型的鈣黏蛋白根據其胺基酸序列的同源性,被分類為以E-鈣黏蛋白及N-鈣黏蛋白為代表的第I型家族、及第II型家族。
鈣黏蛋白6 (cadherin-6,CDH6)係一種由790個胺基酸所構成的單次跨膜蛋白,被分類為第II型鈣黏蛋白家族,且此蛋白具有N端胞外域及C端胞內域。人類CDH6基因於1995年首次被選殖(非專利文獻1),其序列能夠參照例如登錄號NM_004932及NP_004923 (NCBI)等。
CDH6於發育階段在腦或腎臟特異性地表現,並已被報告在中樞神經系統的迴路形成(非專利文獻2及3)及腎臟的腎元發育時(非專利文獻4及5)扮演重要角色。在成人的正常組織中,CDH6的表現被侷限於腎小管、膽管上皮細胞等。
另一方面,已知於成人癌症的幾種類型中,CDH6在腫瘤位置處會特異性地過度表現。已報告關於人類腎細胞癌,尤其是腎透明細胞癌(renal clear cell carcinoma),CDH6表現與預後不良之關連性及作為腫瘤標記之可利用性(非專利文獻6及7)。關於人類卵巢癌亦已報告CDH6的高度表現(非專利文獻8)。亦已報告CDH6涉及人類甲狀腺癌的上皮間質轉換(epithelial-mesenchymal transition)(非專利文獻9)。再者,已報告CDH6亦表現於人類膽管癌及人類小細胞肺癌(非專利文獻12及13)。
癌症在死亡原因中排名前幾位。雖然癌症病患的數量被預期隨著人口的高齡化而增加,但治療需求尚未被充分滿足。習知的化療劑的問題為:由於其選擇性低,此等化療劑不僅對腫瘤細胞具有毒性,對於正常細胞也具有毒性,從而有不良反應;及該化療劑無法以充分的量投予,因此無法充分發揮其效果。因此在近年,已開發更高選擇性的分子標靶藥物或抗體藥物,其靶向在癌細胞中呈現突變或高表現特徵的分子、或涉及細胞惡性轉化的特定分子。
此外,另一主要問題為,用習知化療劑的一般癌症療法(例如鉑系化療)通常會導致出現對一種或多種化療劑具有耐性的癌細胞。耐化療的癌細胞會造成癌症的再發或復發,此為癌症擴散的一個原因。
抗體於血液中穩定性高,且特異性地結合至其之目標抗原。基於這些理由,被期待降低不良反應,而已開發出許多針對在癌細胞表面高度表現之分子的抗體藥物。依賴抗體的抗原特異性結合能力的技術之一,係使用抗體-藥物結合物(antibody-drug conjugate,ADC)。ADC為一種於其中將抗體結合藥物之結合物,該抗體會與在癌細胞表面表現之抗原結合並可透過該結合將該抗原內化至細胞內,該藥物具有細胞毒殺活性(cytotoxic activity)。ADC可有效地將藥物遞送至癌細胞,從而可期待藉由將藥物蓄積在癌細胞內而殺死癌細胞(非專利文獻10以及專利文獻1及2)。關於ADC,例如,包含與單甲基奧瑞他汀E (monomethyl auristatin E)結合而成的抗CD30單株抗體之Adcetris(TM)(本妥昔單抗維多汀(brentuximab vedotin))已被核准作為何杰金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)及退行性大細胞淋巴瘤(anaplastic large cell lymphoma)的治療藥物。又,包含與美坦新(emtansine)結合而成的抗HER2單株抗體之Kadcyla(TM)(曲妥珠單抗-美坦新(trastuzumab emtansine))被使用於治療HER2陽性之進行性或復發性乳癌。
適合作為抗腫瘤藥物之ADC之目標抗原的特徵為:該抗原在癌細胞表面特異性地高度表現但在正常細胞內低表現或不表現;該抗原可內化至細胞內;該抗原不會從細胞表面被分泌等。抗體的內化能力取決於目標抗原及該抗體二者的性質。難以從目標的分子結構來預測適合內化的抗原結合位,或者從抗體的結合強度、物性等來預測具有高內化能力的抗體。因此,在開發具有高效力的ADC上重要的挑戰,係獲得對於目標抗原具有高內化能力之抗體(非專利文獻11)。
作為靶向CDH6的ADC,已知包含與抗CDH6抗體結合而成的DM4之ADC,其中該抗CDH6抗體會特異性地結合CDH6之EC域5 (EC5)(專利文獻3、非專利文獻14及15)。
引用文獻清單
專利文獻
專利文獻1:WO2014/057687
專利文獻2:US2016/0297890
專利文獻3:WO2016/024195
專利文獻4:WO2018/212136
非專利文獻
非專利文獻1:Shimoyama Y, et al., Cancer Research, 2206-2211, 55, May 15, 1995
非專利文獻2:Inoue T, et al., Developmental Biology, 183-194, 1997
非專利文獻3:Osterhout J A, et al., Neuron, 632-639, 71, Aug 25, 2011
非專利文獻4:Cho E A, et al., Development, 803-812, 125, 1998
非專利文獻5:Mah S P, et al., Developmental Biology, 38-53, 223, 2000
非專利文獻6:Paul R, et al., Cancer Research, 2741-2748, July 1, 57, 1997
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非專利文獻8:Koebel M, et al., PLoS Medicine, 1749-1760, 5(12), e232, Dec.2008
非專利文獻9:Gugnoni M, et al., Oncogene, 667-677, 36, 2017
非專利文獻10:Polakis P., Pharmacological Reviews, 3-19, 68, 2016
非專利文獻11:Peters C, et al., Bioscience Reports, 1-20, 35, 2015
非專利文獻12:Goeppert B, et al., Epigenetics, 780-790, 11(11), 2016
非專利文獻13:Yokoi S, et al., American Journal of Pathology, 207-216, 161, 1, 2002
非專利文獻14:Bialucha et al., Cancer Discovery, 1030-1045, 7, 9. 2017.
非專利文獻15:Schöffski et al., Oncology Research and Treatment, 547-556, 44, 10, 2021.
技術課題
本揭示之目的係提供一種使用ADC治療癌症的治療方法、用於治療癌症之包含ADC的醫藥產品等。更具體而言,該ADC係由經由連接子而與拓樸異構酶I抑制劑(諸如依喜替康(exatecan)的衍生物)連結的抗鈣黏蛋白6 (CDH6)抗體所構成,且癌症可對化療具有耐性。
課題之解決手段
本發明人等針對實現上述目的進行深入研究,且令人驚訝地發現,本揭示的ADC呈現優異的抗腫瘤效果及安全性。更具體而言,本發明人等發現,其抗體與胞外域3(在本說明中亦稱為EC3)特異性地結合的抗CDH6抗體-藥物結合物呈現優異的抗腫瘤效果及安全性。
本揭示包括下列發明態樣:
[1]一種用於治療癌症之治療方法,該方法包含對有需要之受試者投予抗體-藥物結合物(ADC)。
[2]如[1]之治療方法,其中抗體-藥物結合物(ADC)具有下式所表示之結構:
[式4]
其中AB表示抗體或抗體之功能性片段,n表示每個抗體的與該抗體結合之藥物-連接子結構單元的平均數量,且該抗體經由衍生自該抗體的硫氫基連結至該連接子。
[3]如[1]或[2]之治療方法,其中抗體-藥物結合物(ADC)為抗CDH6抗體-藥物結合物。
[4]如[1]至[3]中任一項之治療方法,其中該癌症選自下列所組成之群組:腎細胞癌、卵巢癌、間皮瘤、甲狀腺癌、子宮癌、膽管癌、胰臟癌、非小細胞肺癌、子宮頸癌、腦腫瘤、頭頸癌、肉瘤、骨肉瘤、小細胞肺癌、乳癌、膀胱癌、子宮內膜癌、及去勢抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer)。
[5]如[1]至[3]中任一項之治療方法,其中該癌症選自卵巢癌、非小細胞肺癌、乳癌、膀胱癌、子宮內膜癌、及去勢抗性前列腺癌所組成之群組。
[6]如[1]至[3]中任一項之治療方法,其中該癌症為卵巢癌。
[7]如[6]之治療方法,其中該卵巢癌選自上皮性卵巢癌、輸卵管癌、或原發性腹膜癌所組成之群組。
[8]如[6]或[7]之治療方法,其中該卵巢癌為轉移性的。
[9]如[1]至[8]中任一項之治療方法,其中該抗體為包含選自下述組合(1)至(4)所組成之群組中的任一組合的輕鏈及重鏈的抗體、或該抗體之功能性片段:
(1)由SEQ ID NO:61中位置21至233之胺基酸序列組成之輕鏈及由SEQ ID NO:69中位置20至471之胺基酸序列組成之重鏈;
(2)由SEQ ID NO:61中位置21至233之胺基酸序列組成之輕鏈及由SEQ ID NO:73中位置20至471之胺基酸序列組成之重鏈;
(3)由SEQ ID NO:65中位置21至233之胺基酸序列組成之輕鏈及由SEQ ID NO:73中位置20至471之胺基酸序列組成之重鏈;及
(4)由SEQ ID NO:61中位置21至233之胺基酸序列組成之輕鏈及由SEQ ID NO:77中位置20至471之胺基酸序列組成之重鏈。
[10]如[1]至[9]中任一項之治療方法,其中該抗體為包含由SEQ ID NO:61中位置21至233之胺基酸序列組成之輕鏈及由SEQ ID NO:69中位置20至471之胺基酸序列組成之重鏈的抗體、或該抗體之功能性片段。
[11]如[1]至[9]中任一項之治療方法,其中該抗體為包含由SEQ ID NO:61中位置21至233之胺基酸序列組成之輕鏈及由SEQ ID NO:77中位置20至471之胺基酸序列組成之重鏈的抗體、或該抗體之功能性片段。
[12]如[1]至[11]中任一項之治療方法,其中該重鏈或輕鏈經選自下列所組成之群組中的一種或多種修飾:N-連接型醣基化、O-連接型醣基化、N端加工、C端加工、去醯胺化、天冬胺酸異構化、甲硫胺酸氧化、在N端添加甲硫胺酸殘基、脯胺酸殘基醯胺化、N端麩醯胺酸或N端麩胺酸轉化為焦麩胺酸、及從羧基端刪除一個或兩個胺基酸。
[13]如[1]至[11]中任一項之治療方法,其中該重鏈或輕鏈經選自下列所組成之群組中的二種以上的修飾:N-連接型醣基化、O-連接型醣基化、N端加工、C端加工、去醯胺化、天冬胺酸異構化、甲硫胺酸氧化、在N端添加甲硫胺酸殘基、脯胺酸殘基醯胺化、N端麩醯胺酸或N端麩胺酸轉化為焦麩胺酸、及從羧基端刪除一個或兩個胺基酸。
[14]如[1]至[13]中任一項之治療方法,其中每個抗體結合的所選擇之藥物-連接子結構單元的平均數量在1至10個之範圍內。
[15]如[1]至[14]中任一項之治療方法,其中每個抗體結合的所選擇之藥物-連接子結構單元的平均數量在2至8個之範圍內。
[16]如[1]至[14]中任一項之治療方法,其中每個抗體結合的所選擇之藥物-連接子結構單元的平均數量在5至8個之範圍內。
[17]如[1]至[14]中任一項之治療方法,其中每個抗體結合的所選擇之藥物-連接子結構單元的平均數量在7至8個之範圍內。
[18]如[1]至[17]中任一項之治療方法,其中該癌症包含一種或多種表現CDH6的腫瘤。
[19]如[1]至[18]中任一項之治療方法,其中該受試者有以包含鉑類藥物的化療方案治療的病史。
[20]如[1]至[18]中任一項之治療方法,其中該受試者有以包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案治療的病史。
[21]如[1]至[20]中任一項之治療方法,其中該受試者先前已經以包含鉑類藥物之化療方案治療。
[22]如[1]至[20]中任一項之治療方法,其中該受試者先前已經以包含鉑類藥物及紫杉烷之化療方案治療。
[23]如[1]至[22]中任一項之治療方法,其中該抗體-藥物結合物(ADC)與一種或多種化療劑組合而同時或不同時投予。
[24]如[23]之治療方法,其中該抗體-藥物結合物(ADC)在該一種或多種化療劑之後投予。
[25]如[23]之治療方法,其中該抗體-藥物結合物(ADC)及該一種或多種化療劑分別作為活性成分包含在不同的調配物中,並同時或不同時投予。
[26]如[23]之治療方法,其中該抗體-藥物結合物(ADC)及該一種或多種化療劑作為活性成分一起包含在相同調配物中,並同時投予。
[27]如[23]至[26]中任一項之治療方法,其中該一種或多種化療劑為抗代謝物質、鉑類藥物、紫杉烷、或鉑類藥物及紫杉烷二者。
[28]如[1]至[27]中任一項之治療方法,其中該受試者在以包含鉑類藥物的化療方案治療時顯示完全反應(complete response,CR)、部分反應(partial response,PR)或疾病穩定(stable disease,SD)。
[29]如[1]至[27]中任一項之治療方法,其中該受試者在以包含鉑類藥物的化療方案治療時顯示完全反應(CR)或部分反應(PR)。
[30]如[1]至[27]中任一項之治療方法,其中該受試者在以包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案治療時顯示完全反應(CR)、部分反應(PR)、或疾病穩定(SD)。
[31]如[1]至[27]中任一項之治療方法,其中該受試者在以包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案治療時顯示完全反應(CR)或部分反應(PR)。
[32]如[1]至[31]中任一項之治療方法,其中該受試者患有對鉑類化療具有耐性的癌症。
[33]如[1]至[32]中任一項之治療方法,其中該受試者患有對包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案具有耐性的癌症。
[34]如[1]至[33]中任一項之治療方法,其中該受試者在投予ADC之前呈現癌症復發。
[35]如[34]之治療方法,其中該癌症復發發生在包含鉑類藥物的化療方案完成後不到六個月或約六個月內。
[36]如[34]之治療方法,其中該癌症復發發生在包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案完成後不到六個月或約六個月內。
[37]如[34]之治療方法,其中該癌症復發發生在包含鉑類藥物的化療方案完成後約六個月或之後。
[38]如[34]之治療方法,其中該癌症復發發生在包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案完成後約六個月或之後。
[39]如[1]至[38]中任一項之治療方法,其中該受試者被投予該ADC與第二藥物。
[40]如[39]之治療方法,其中該ADC在該第二藥物之前投予。
[41]如[39]之治療方法,其中該ADC在該第二藥物之後投予。
[42]如[39]之治療方法,其中該ADC與該第二藥物同時投予。
[43]一種用於治療癌症之治療方法,該方法包含對受試者投予醫藥組成物,該受試者患有對鉑類化療具有耐性之卵巢癌及/或在投予醫藥組成物之前呈現卵巢癌復發,其中該醫藥組成物包含具有下式表示之結構的抗體-藥物結合物(ADC):
[式4]
其中AB表示抗體或抗體之功能性片段,n表示每個抗體的與該抗體結合之藥物-連接子結構單元的平均數量,且該抗體經由衍生自該抗體的硫氫基連結至該連接子;且其中該ADC為其鹽或者該ADC或該鹽之水合物,其中每個抗體結合的藥物-連接子結構單元的平均數量為7至8個,其中該抗體包含:SEQ ID NO:87表示之重鏈胺基酸序列或於其中一個或二個胺基酸從其羧基端刪除之衍生自SEQ ID NO:87表示之胺基酸序列的胺基酸序列;及SEQ ID NO:88表示之輕鏈胺基酸序列。
[44]一種用於治療癌症之治療方法,該方法包含對受試者投予醫藥組成物,該受試者患有卵巢癌且先前已經以包含鉑類藥物、紫杉烷、或鉑類藥物及紫杉烷二者之化療方案治療,其中該醫藥組成物包含具有下式表示之結構的抗體-藥物結合物(ADC):
[式4]
其中AB表示抗體或抗體之功能性片段,n表示每個抗體的與該抗體結合之藥物-連接子結構單元的平均數量,且該抗體經由衍生自該抗體的硫氫基連結至該連接子;且其中該ADC為其鹽或者該ADC或該鹽之水合物,其中每個抗體結合的藥物-連接子結構單元的平均數量為7至8個,其中該抗體包含:SEQ ID NO:87表示之重鏈胺基酸序列或於其中一個或二個胺基酸從其羧基端刪除之衍生自SEQ ID NO:87表示之胺基酸序列的胺基酸序列;及SEQ ID NO:88表示之輕鏈胺基酸序列。
[45]如[1]至[44]中任一項之治療方法,該方法包含使用來自測試受試者之生物樣本以檢測該生物樣本中CDH6的存在與否、及對檢測到CDH6的測試受試者投予醫藥組成物。
[46]如[1]至[45]中任一項之治療方法,其中該癌症已對包含鉑類藥物的化療方案產生耐性。
[47]如[1]至[45]中任一項之治療方法,其中該癌症已對包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案產生耐性。
[48]如[1]至[47]中任一項之治療方法,其中該抗代謝物質為吉西他濱(gemcitabine)。
[49]如[1]至[47]中任一項之治療方法,其中該鉑類藥物為卡鉑(carboplatin)。
[50]如[1]至[47]中任一項之治療方法,其中該鉑類藥物為卡鉑且該紫杉烷為紫杉醇(paclitaxel)。
[51]一種用於癌症之治療劑,包含如本文揭示之抗體-藥物結合物(ADC)。
[52]如[51]之治療劑,其中該抗體-藥物結合物(ADC)具有下式所表示之結構:
[式4]
其中AB表示抗體或抗體之功能性片段,n表示每個抗體的與該抗體結合之藥物-連接子結構單元的平均數量,且該抗體經由衍生自該抗體的硫氫基連結至該連接子。
[53]如[51]或[52]之治療劑,其中該抗體-藥物結合物(ADC)為抗CDH6抗體-藥物結合物。
[54]如[51]至[53]中任一項之治療劑,其中該癌症選自下列所組成之群組:腎細胞癌、卵巢癌、間皮瘤、甲狀腺癌、子宮癌、膽管癌、胰臟癌、非小細胞肺癌、子宮頸癌、腦腫瘤、頭頸癌、肉瘤、骨肉瘤、小細胞肺癌、乳癌、膀胱癌、子宮內膜癌、及去勢抗性前列腺癌。
[55]如[51]至[53]中任一項之治療劑,其中該癌症選自卵巢癌、非小細胞肺癌、乳癌、膀胱癌、子宮內膜癌、及去勢抗性前列腺癌所組成之群組。
[56]如[51]至[53]中任一項之治療劑,其中該癌症為卵巢癌。
[57]如[56]之治療劑,其中該卵巢癌選自上皮性卵巢癌、輸卵管癌、或原發性腹膜癌所組成之群組。
[58]如[56]或[57]之治療劑,其中該卵巢癌為轉移性的。
[59]如[51]至[58]中任一項之治療劑,其中該抗體為包含選自下述組合(1)至(4)所組成之群組中的任一組合的輕鏈及重鏈的抗體、或該抗體之功能性片段:
(1)由SEQ ID NO:61中位置21至233之胺基酸序列組成之輕鏈及由SEQ ID NO:69中位置20至471之胺基酸序列組成之重鏈;
(2)由SEQ ID NO:61中位置21至233之胺基酸序列組成之輕鏈及由SEQ ID NO:73中位置20至471之胺基酸序列組成之重鏈;
(3)由SEQ ID NO:65中位置21至233之胺基酸序列組成之輕鏈及由SEQ ID NO:73中位置20至471之胺基酸序列組成之重鏈;及
(4)由SEQ ID NO:61中位置21至233之胺基酸序列組成之輕鏈及由SEQ ID NO:77中位置20至471之胺基酸序列組成之重鏈。
[60]如[51]至[59]中任一項之治療劑,其中該抗體為包含由SEQ ID NO:61中位置21至233之胺基酸序列組成之輕鏈及由SEQ ID NO:69中位置20至471之胺基酸序列組成之重鏈的抗體、或該抗體之功能性片段。
[61]如[51]至[59]中任一項之治療劑,其中該抗體為包含由SEQ ID NO:61中位置21至233之胺基酸序列組成之輕鏈及由SEQ ID NO:77中位置20至471之胺基酸序列組成之重鏈的抗體、或該抗體之功能性片段。
[62]如[51]至[61]中任一項之治療劑,其中該重鏈或輕鏈經選自下列所組成之群組中的一種或多種修飾:N-連接型醣基化、O-連接型醣基化、N端加工、C端加工、去醯胺化、天冬胺酸異構化、甲硫胺酸氧化、在N端添加甲硫胺酸殘基、脯胺酸殘基醯胺化、N端麩醯胺酸或N端麩胺酸轉化為焦麩胺酸、及從羧基端刪除一個或兩個胺基酸。
[63]如[51]至[61]中任一項之治療劑,其中該重鏈或輕鏈經選自下列所組成之群組中的二種以上的修飾:N-連接型醣基化、O-連接型醣基化、N端加工、C端加工、去醯胺化、天冬胺酸異構化、甲硫胺酸氧化、在N端添加甲硫胺酸殘基、脯胺酸殘基醯胺化、N端麩醯胺酸或N端麩胺酸轉化為焦麩胺酸、及從羧基端刪除一個或兩個胺基酸。
[64]如[51]至[63]中任一項之治療劑,其中每個抗體結合的所選擇之藥物-連接子結構單元的平均數量在1至10個之範圍內。
[65]如[51]至[64]中任一項之治療劑,其中每個抗體結合的所選擇之藥物-連接子結構單元的平均數量在2至8個之範圍內。
[66]如[51]至[64]中任一項之治療劑,其中每個抗體結合的所選擇之藥物-連接子結構單元的平均數量在5至8個之範圍內。
[67]如[51]至[64]中任一項之治療劑,其中每個抗體結合的所選擇之藥物-連接子結構單元的平均數量在7至8個之範圍內。
[68]如[51]至[67]中任一項之治療劑,其中該癌症包含一種或多種表現CDH6的腫瘤。
[69]如[51]至[68]中任一項之治療劑,其中該受試者有以包含鉑類藥物的化療方案治療的病史。
[70]如[51]至[68]中任一項之治療劑,其中該受試者有以包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案治療的病史。
[71]如[51]至[70]中任一項之治療劑,其中該受試者先前已經以包含鉑類藥物之化療方案治療。
[72]如[51]至[70]中任一項之治療劑,其中該受試者先前已經以包含鉑類藥物及紫杉烷之化療方案治療。
[73]如[51]至[72]中任一項之治療劑,其中該抗體-藥物結合物(ADC)與一種或多種化療劑組合而同時或不同時投予。
[74]如[73]之治療劑,其中該抗體-藥物結合物(ADC)在該一種或多種化療劑之後投予。
[75]如[73]之治療劑,其中該抗體-藥物結合物(ADC)及該一種或多種化療劑分別作為活性成分包含在不同的調配物中,並同時或不同時投予。
[76]如[73]之治療劑,其中該抗體-藥物結合物(ADC)及該一種或多種化療劑作為活性成分一起包含在相同調配物中,並同時投予。
[77]如[73]至[76]中任一項之治療劑,其中該一種或多種化療劑為抗代謝物質、鉑類藥物、紫杉烷、或鉑類藥物及紫杉烷二者。
[78]如[51]至[77]中任一項之治療劑,其中該受試者在以包含鉑類藥物的化療方案治療時顯示完全反應(CR)、部分反應(PR)或疾病穩定(SD)。
[79]如[51]至[77]中任一項之治療劑,其中該受試者在以包含鉑類藥物的化療方案治療時顯示完全反應(CR)或部分反應(PR)。
[80]如[51]至[77]中任一項之治療劑,其中該受試者在以包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案治療時顯示完全反應(CR)、部分反應(PR)、或疾病穩定(SD)。
[81]如[51]至[77]中任一項之治療劑,其中該受試者在以包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案治療時顯示完全反應(CR)或部分反應(PR)。
[82]如[51]至[81]中任一項之治療劑,其中該受試者患有對鉑類化療具有耐性的癌症。
[83]如[51]至[82]中任一項之治療劑,其中該受試者患有對包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案具有耐性的癌症。
[84]如[51]至[83]中任一項之治療劑,其中該受試者在投予ADC之前呈現癌症復發。
[85]如[84]之治療劑,其中該癌症復發發生在包含鉑類藥物的化療方案完成後不到六個月或約六個月內。
[86]如[84]之治療劑,其中該癌症復發發生在包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案完成後不到六個月或約六個月內。
[87]如[84]之治療劑,其中該癌症復發發生在包含鉑類藥物的化療方案完成後約六個月或之後。
[88]如[84]之治療劑,其中該癌症復發發生在包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案完成後約六個月或之後。
[89]如[51]至[88]中任一項之治療劑,其中該受試者被投予該ADC與第二藥物。
[90]如[89]之治療劑,其中該ADC在該第二藥物之前投予。
[91]如[89]之治療劑,其中該ADC在該第二藥物之後投予。
[92]如[89]之治療劑,其中該ADC與該第二藥物同時投予。
[93]一種用於癌症之治療劑,該藥劑包含用於投予至受試者之醫藥組成物,該受試者患有對鉑類化療具有耐性之卵巢癌及/或在投予醫藥組成物之前呈現卵巢癌復發,其中該醫藥組成物包含具有下式表示之結構的抗體-藥物結合物(ADC):
[式4]
其中AB表示抗體或抗體之功能性片段,n表示每個抗體的與該抗體結合之藥物-連接子結構單元的平均數量,且該抗體經由衍生自該抗體的硫氫基連結至該連接子;且其中該ADC為其鹽或者該ADC或該鹽之水合物,其中每個抗體結合的藥物-連接子結構單元的平均數量為7至8個,其中該抗體包含:SEQ ID NO:87表示之重鏈胺基酸序列或於其中一個或二個胺基酸從其羧基端刪除之衍生自SEQ ID NO:87表示之胺基酸序列的胺基酸序列;及SEQ ID NO:88表示之輕鏈胺基酸序列。
[94]一種用於治療癌症之治療劑,該藥劑包含用於投予至受試者之醫藥組成物,該受試者患有卵巢癌且先前已經以包含鉑類藥物、紫杉烷、或鉑類藥物及紫杉烷二者之化療方案治療,其中該醫藥組成物包含具有下式表示之結構的抗體-藥物結合物(ADC):
[式4]
其中AB表示抗體或抗體之功能性片段,n表示每個抗體的與該抗體結合之藥物-連接子結構單元的平均數量,且該抗體經由衍生自該抗體的硫氫基連結至該連接子;且其中該ADC為其鹽或者該ADC或該鹽之水合物,其中每個抗體結合的藥物-連接子結構單元的平均數量為7至8個,其中該抗體包含:SEQ ID NO:87表示之重鏈胺基酸序列或於其中一個或二個胺基酸從其羧基端刪除之衍生自SEQ ID NO:87表示之胺基酸序列的胺基酸序列;及SEQ ID NO:88表示之輕鏈胺基酸序列。
[95]如[51]至[94]中任一項之治療劑,其中先將來自測試受試者之生物樣本用於檢測該生物樣本中CDH6的存在與否,再對檢測到CDH6的測試受試者投予醫藥組成物。
[96]如[51]至[95]中任一項之治療劑,其中該癌症已對包含鉑類藥物的化療方案產生耐性。
[97]如[51]至[95]中任一項之治療劑,其中該癌症已對包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案產生耐性。
[98]如[51]至[97]中任一項之治療劑,其中該抗代謝物質為吉西他濱。
[99]如[51]至[97]中任一項之治療劑,其中該鉑類藥物為卡鉑。
[100]如[51]至[97]中任一項之治療劑,其中該鉑類藥物為卡鉑且該紫杉烷為紫杉醇。
[101]一種如本文所揭示之抗體-藥物結合物(ADC),其用於治療癌症。
[102]如[101]之抗體-藥物結合物(ADC),其中該抗體-藥物結合物(ADC)具有下式所表示之結構:
[式4]
其中AB表示抗體或抗體之功能性片段,n表示每個抗體的與該抗體結合之藥物-連接子結構單元的平均數量,且該抗體經由衍生自該抗體的硫氫基連結至該連接子。
[103]如[101]或[102]之抗體-藥物結合物(ADC),其中抗體-藥物結合物(ADC)為抗CDH6抗體-藥物結合物。
[104]如[101]至[103]中任一項之抗體-藥物結合物(ADC),其中該癌症選自下列所組成之群組:腎細胞癌、卵巢癌、間皮瘤、甲狀腺癌、子宮癌、膽管癌、胰臟癌、非小細胞肺癌、子宮頸癌、腦腫瘤、頭頸癌、肉瘤、骨肉瘤、小細胞肺癌、乳癌、膀胱癌、子宮內膜癌、及去勢抗性前列腺癌。
[105]如[101]至[103]中任一項之抗體-藥物結合物(ADC),其中該癌症選自卵巢癌、非小細胞肺癌、乳癌、膀胱癌、子宮內膜癌、及去勢抗性前列腺癌所組成之群組。
[106]如[101]至[103]中任一項之抗體-藥物結合物(ADC),其中該癌症為卵巢癌。
[107]如[106]之抗體-藥物結合物(ADC),其中該卵巢癌選自上皮性卵巢癌、輸卵管癌、或原發性腹膜癌所組成之群組。
[108]如[106]或[107]之抗體-藥物結合物(ADC),其中該卵巢癌為轉移性的。
[109]如[101]至[108]中任一項之抗體-藥物結合物(ADC),其中該抗體為包含選自下述組合(1)至(4)所組成之群組中的任一組合的輕鏈及重鏈的抗體、或該抗體之功能性片段:
(1)由SEQ ID NO:61中位置21至233之胺基酸序列組成之輕鏈及由SEQ ID NO:69中位置20至471之胺基酸序列組成之重鏈;
(2)由SEQ ID NO:61中位置21至233之胺基酸序列組成之輕鏈及由SEQ ID NO:73中位置20至471之胺基酸序列組成之重鏈;
(3)由SEQ ID NO:65中位置21至233之胺基酸序列組成之輕鏈及由SEQ ID NO:73中位置20至471之胺基酸序列組成之重鏈;及
(4)由SEQ ID NO:61中位置21至233之胺基酸序列組成之輕鏈及由SEQ ID NO:77中位置20至471之胺基酸序列組成之重鏈。
[110]如[101]至[109]中任一項之抗體-藥物結合物(ADC),其中該抗體為包含由SEQ ID NO:61中位置21至233之胺基酸序列組成之輕鏈及由SEQ ID NO:69中位置20至471之胺基酸序列組成之重鏈的抗體、或該抗體之功能性片段。
[111]如[101]至[109]中任一項之抗體-藥物結合物(ADC),其中該抗體為包含由SEQ ID NO:61中位置21至233之胺基酸序列組成之輕鏈及由SEQ ID NO:77中位置20至471之胺基酸序列組成之重鏈的抗體、或該抗體之功能性片段。
[112]如[101]至[111]中任一項之抗體-藥物結合物(ADC),其中該重鏈或輕鏈經選自下列所組成之群組中的一種或多種修飾:N-連接型醣基化、O-連接型醣基化、N端加工、C端加工、去醯胺化、天冬胺酸異構化、甲硫胺酸氧化、在N端添加甲硫胺酸殘基、脯胺酸殘基醯胺化、N端麩醯胺酸或N端麩胺酸轉化為焦麩胺酸、及從羧基端刪除一個或兩個胺基酸。
[113]如[101]至[111]中任一項之抗體-藥物結合物(ADC),其中該重鏈或輕鏈經選自下列所組成之群組中的二種以上的修飾:N-連接型醣基化、O-連接型醣基化、N端加工、C端加工、去醯胺化、天冬胺酸異構化、甲硫胺酸氧化、在N端添加甲硫胺酸殘基、脯胺酸殘基醯胺化、N端麩醯胺酸或N端麩胺酸轉化為焦麩胺酸、及從羧基端刪除一個或兩個胺基酸。
[114]如[101]至[113]中任一項之抗體-藥物結合物(ADC),其中每個抗體結合的所選擇之藥物-連接子結構單元的平均數量在1至10個之範圍內。
[115]如[101]至[114]中任一項之抗體-藥物結合物(ADC),其中每個抗體結合的所選擇之藥物-連接子結構單元的平均數量在2至8個之範圍內。
[116]如[101]至[114]中任一項之抗體-藥物結合物(ADC),其中每個抗體結合的所選擇之藥物-連接子結構單元的平均數量在5至8個之範圍內。
[117]如[101]至[114]中任一項之抗體-藥物結合物(ADC),其中每個抗體結合的所選擇之藥物-連接子結構單元的平均數量在7至8個之範圍內。
[118]如[101]至[117]中任一項之抗體-藥物結合物(ADC),其中該癌症包含一種或多種表現CDH6的腫瘤。
[119]如[101]至[118]中任一項之抗體-藥物結合物(ADC),其中該受試者有以包含鉑類藥物的化療方案治療的病史。
[120]如[101]至[118]中任一項之抗體-藥物結合物(ADC),其中該受試者有以包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案治療的病史。
[121]如[101]至[120]中任一項之抗體-藥物結合物(ADC),其中該受試者先前已經以包含鉑類藥物之化療方案治療。
[122]如[101]至[120]中任一項之抗體-藥物結合物(ADC),其中該受試者先前已經以包含鉑類藥物及紫杉烷之化療方案治療。
[123]如[101]至[122]中任一項之抗體-藥物結合物(ADC),其中該抗體-藥物結合物(ADC)與一種或多種化療劑組合而同時或不同時投予。
[124]如[123]之抗體-藥物結合物(ADC),其中該抗體-藥物結合物(ADC)在該一種或多種化療劑之後投予。
[125]如[123]之抗體-藥物結合物(ADC),其中該抗體-藥物結合物(ADC)及該一種或多種化療劑分別作為活性成分包含在不同的調配物中,並同時或不同時投予。
[126]如[123]之抗體-藥物結合物(ADC),其中該抗體-藥物結合物(ADC)及該一種或多種化療劑作為活性成分一起包含在相同調配物中,並同時投予。
[127]如[123]至[126]中任一項之抗體-藥物結合物(ADC),其中該一種或多種化療劑為抗代謝物質、鉑類藥物、紫杉烷、或鉑類藥物及紫杉烷二者。
[128]如[101]至[127]中任一項之抗體-藥物結合物(ADC),其中該受試者在以包含鉑類藥物的化療方案治療時顯示完全反應(CR)、部分反應(PR)或疾病穩定(SD)。
[129]如[101]至[127]中任一項之抗體-藥物結合物(ADC),其中該受試者在以包含鉑類藥物的化療方案治療時顯示完全反應(CR)或部分反應(PR)。
[130]如[101]至[127]中任一項之抗體-藥物結合物(ADC),其中該受試者在以包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案治療時顯示完全反應(CR)、部分反應(PR)、或疾病穩定(SD)。
[131]如[101]至[127]中任一項之抗體-藥物結合物(ADC),其中該受試者在以包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案治療時顯示完全反應(CR)或部分反應(PR)。
[132]如[101]至[131]中任一項之抗體-藥物結合物(ADC),其中該受試者患有對鉑類化療具有耐性的癌症。
[133]如[101]至[132]中任一項之抗體-藥物結合物(ADC),其中該受試者患有對包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案具有耐性的癌症。
[134]如[101]至[133]中任一項之抗體-藥物結合物(ADC),其中該受試者在投予ADC之前呈現癌症復發。
[135]如[134]之抗體-藥物結合物(ADC),其中該癌症復發發生在包含鉑類藥物的化療方案完成後不到六個月或約六個月內。
[136]如[134]之抗體-藥物結合物(ADC),其中該癌症復發發生在包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案完成後不到六個月或約六個月內。
[137]如[134]之抗體-藥物結合物(ADC),其中該癌症復發發生在包含鉑類藥物的化療方案完成後約六個月或之後。
[138]如[134]之抗體-藥物結合物(ADC),其中該癌症復發發生在包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案完成後約六個月或之後。
[139]如[101]至[138]中任一項之抗體-藥物結合物(ADC),其中該受試者被投予該ADC與第二藥物。
[140]如[139]之抗體-藥物結合物(ADC),其中該ADC在該第二藥物之前投予。
[141]如[139]之抗體-藥物結合物(ADC),其中該ADC在該第二藥物之後投予。
[142]如[139]之抗體-藥物結合物(ADC),其中該ADC與該第二藥物同時投予。
[143]一種用於在受試者中治療癌症之抗體-藥物結合物(ADC),該受試者患有對鉑類化療具有耐性之卵巢癌及/或在投予醫藥組成物之前呈現卵巢癌復發,該ADC具有下式表示之結構:
[式4]
其中AB表示抗體或抗體之功能性片段,n表示每個抗體的與該抗體結合之藥物-連接子結構單元的平均數量,且該抗體經由衍生自該抗體的硫氫基連結至該連接子;且其中該ADC為其鹽或者該ADC或該鹽之水合物,其中每個抗體結合的藥物-連接子結構單元的平均數量為7至8個,其中該抗體包含:SEQ ID NO:87表示之重鏈胺基酸序列或於其中一個或二個胺基酸從其羧基端刪除之衍生自SEQ ID NO:87表示之胺基酸序列的胺基酸序列;及SEQ ID NO:88表示之輕鏈胺基酸序列。
[144]一種用於在受試者中治療癌症之抗體-藥物結合物(ADC),該受試者患有卵巢癌且先前已經以包含鉑類藥物、紫杉烷、或鉑類藥物及紫杉烷二者之化療方案治療,該ADC具有下式表示之結構:
[式4]
其中AB表示抗體或抗體之功能性片段,n表示每個抗體的與該抗體結合之藥物-連接子結構單元的平均數量,且該抗體經由衍生自該抗體的硫氫基連結至該連接子;且其中該ADC為其鹽或者該ADC或該鹽之水合物,其中每個抗體結合的藥物-連接子結構單元的平均數量為7至8個,其中該抗體包含:SEQ ID NO:87表示之重鏈胺基酸序列或於其中一個或二個胺基酸從其羧基端刪除之衍生自SEQ ID NO:87表示之胺基酸序列的胺基酸序列;及SEQ ID NO:88表示之輕鏈胺基酸序列。
[145]如[101]至[144]中任一項之ADC,其中先將來自測試受試者之生物樣本用於檢測該生物樣本中CDH6的存在與否,再對檢測到CDH6的測試受試者投予ADC。
[146]如[101]至[145]中任一項之抗體-藥物結合物(ADC),其中該癌症已對包含鉑類藥物的化療方案產生耐性。
[147]如[101]至[145]中任一項之抗體-藥物結合物(ADC),其中該癌症已對包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案產生耐性。
[148]如[101]至[147]中任一項之抗體-藥物結合物(ADC),其中該抗代謝物質為吉西他濱。
[149]如[101]至[147]中任一項之抗體-藥物結合物(ADC),其中該鉑類藥物為卡鉑。
[150]如[101]至[147]中任一項之治療方法,其中該鉑類藥物為卡鉑且該紫杉烷為紫杉醇。
[151]一種用於治療癌症之醫藥組成物,包含作為活性成分之如本文所揭示的抗體-藥物結合物(ADC)或其鹽、及醫藥上可接受之調配物成分。
[152]如[151]之醫藥組成物,其中該抗體-藥物結合物(ADC)具有下式所表示之結構:
[式4]
其中AB表示抗體或抗體之功能性片段,n表示每個抗體的與該抗體結合之藥物-連接子結構單元的平均數量,且該抗體經由衍生自該抗體的硫氫基連結至該連接子。
[153]如[151]或[152]之醫藥組成物,其中該抗體-藥物結合物(ADC)為抗CDH6抗體-藥物結合物。
[154]如[151]至[153]中任一項之醫藥組成物,其中該癌症選自下列所組成之群組:腎細胞癌、卵巢癌、間皮瘤、甲狀腺癌、子宮癌、膽管癌、胰臟癌、非小細胞肺癌、子宮頸癌、腦腫瘤、頭頸癌、肉瘤、骨肉瘤、小細胞肺癌、乳癌、膀胱癌、子宮內膜癌、及去勢抗性前列腺癌。
[155]如[151]至[153]中任一項之醫藥組成物,其中該癌症選自卵巢癌、非小細胞肺癌、乳癌、膀胱癌、子宮內膜癌、及去勢抗性前列腺癌所組成之群組。
[156]如[151]至[153]中任一項之醫藥組成物,其中該癌症為卵巢癌。
[157]如[156]之醫藥組成物,其中該卵巢癌選自上皮性卵巢癌、輸卵管癌、或原發性腹膜癌所組成之群組。
[158]如[156]或[157]之醫藥組成物,其中該卵巢癌為轉移性的。
[159]如[151]至[158]中任一項之醫藥組成物,其中該抗體為包含選自下述組合(1)至(4)所組成之群組中的任一組合的輕鏈及重鏈的抗體、或該抗體之功能性片段:
(1)由SEQ ID NO:61中位置21至233之胺基酸序列組成之輕鏈及由SEQ ID NO:69中位置20至471之胺基酸序列組成之重鏈;
(2)由SEQ ID NO:61中位置21至233之胺基酸序列組成之輕鏈及由SEQ ID NO:73中位置20至471之胺基酸序列組成之重鏈;
(3)由SEQ ID NO:65中位置21至233之胺基酸序列組成之輕鏈及由SEQ ID NO:73中位置20至471之胺基酸序列組成之重鏈;及
(4)由SEQ ID NO:61中位置21至233之胺基酸序列組成之輕鏈及由SEQ ID NO:77中位置20至471之胺基酸序列組成之重鏈。
[160]如[151]至[159]中任一項之醫藥組成物,其中該抗體為包含由SEQ ID NO:61中位置21至233之胺基酸序列組成之輕鏈及由SEQ ID NO:69中位置20至471之胺基酸序列組成之重鏈的抗體、或該抗體之功能性片段。
[161]如[151]至[159]中任一項之醫藥組成物,其中該抗體為包含由SEQ ID NO:61中位置21至233之胺基酸序列組成之輕鏈及由SEQ ID NO:77中位置20至471之胺基酸序列組成之重鏈的抗體、或該抗體之功能性片段。
[162]如[151]至[161]中任一項之醫藥組成物,其中該重鏈或輕鏈經選自下列所組成之群組中的一種或多種修飾:N-連接型醣基化、O-連接型醣基化、N端加工、C端加工、去醯胺化、天冬胺酸異構化、甲硫胺酸氧化、在N端添加甲硫胺酸殘基、脯胺酸殘基醯胺化、N端麩醯胺酸或N端麩胺酸轉化為焦麩胺酸、及從羧基端刪除一個或兩個胺基酸。
[163]如[151]至[161]中任一項之醫藥組成物,其中該重鏈或輕鏈經選自下列所組成之群組中的二種以上的修飾:N-連接型醣基化、O-連接型醣基化、N端加工、C端加工、去醯胺化、天冬胺酸異構化、甲硫胺酸氧化、在N端添加甲硫胺酸殘基、脯胺酸殘基醯胺化、N端麩醯胺酸或N端麩胺酸轉化為焦麩胺酸、及從羧基端刪除一個或兩個胺基酸。
[164]如[151]至[163]中任一項之醫藥組成物,其中每個抗體結合的所選擇之藥物-連接子結構單元的平均數量在1至10個之範圍內。
[165]如[151]至[164]中任一項之醫藥組成物,其中每個抗體結合的所選擇之藥物-連接子結構單元的平均數量在2至8個之範圍內。
[166]如[151]至[164]中任一項之醫藥組成物,其中每個抗體結合的所選擇之藥物-連接子結構單元的平均數量在5至8個之範圍內。
[167]如[151]至[164]中任一項之醫藥組成物,其中每個抗體結合的所選擇之藥物-連接子結構單元的平均數量在7至8個之範圍內。
[168]如[151]至[167]中任一項之醫藥組成物,其中該癌症包含一種或多種表現CDH6的腫瘤。
[169]如[151]至[168]中任一項之醫藥組成物,其中該受試者有以包含鉑類藥物的化療方案治療的病史。
[170]如[151]至[168]中任一項之醫藥組成物,其中該受試者有以包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案治療的病史。
[171]如[151]至[170]中任一項之醫藥組成物,其中該受試者先前已經以包含鉑類藥物之化療方案治療。
[172]如[151]至[170]中任一項之醫藥組成物,其中該受試者先前已經以包含鉑類藥物及紫杉烷之化療方案治療。
[173]如[151]至[172]中任一項之醫藥組成物,其中該抗體-藥物結合物(ADC)與一種或多種化療劑組合而同時或不同時投予。
[174]如[173]之醫藥組成物,其中該抗體-藥物結合物(ADC)在該一種或多種化療劑之後投予。
[175]如[173]之醫藥組成物,其中該抗體-藥物結合物(ADC)及該一種或多種化療劑分別作為活性成分包含在不同的調配物中,並同時或不同時投予。
[176]如[173]之醫藥組成物,其中該抗體-藥物結合物(ADC)及該一種或多種化療劑作為活性成分一起包含在相同調配物中,並同時投予。
[177]如[173]至[176]中任一項之醫藥組成物,其中該一種或多種化療劑為抗代謝物質、鉑類藥物、紫杉烷、或鉑類藥物及紫杉烷二者。
[178]如[151]至[177]中任一項之醫藥組成物,其中該受試者在以包含鉑類藥物的化療方案治療時顯示完全反應(CR)、部分反應(PR)或疾病穩定(SD)。
[179]如[151]至[177]中任一項之醫藥組成物,其中該受試者在以包含鉑類藥物的化療方案治療時顯示完全反應(CR)或部分反應(PR)。
[180]如[151]至[177]中任一項之醫藥組成物,其中該受試者在以包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案治療時顯示完全反應(CR)、部分反應(PR)、或疾病穩定(SD)。
[181]如[151]至[177]中任一項之醫藥組成物,其中該受試者在以包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案治療時顯示完全反應(CR)或部分反應(PR)。
[182]如[151]至[181]中任一項之醫藥組成物,其中該受試者患有對鉑類化療具有耐性的癌症。
[183]如[151]至[182]中任一項之醫藥組成物,其中該受試者患有對包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案具有耐性的癌症。
[184]如[151]至[183]中任一項之醫藥組成物,其中該受試者在投予ADC之前呈現癌症復發。
[185]如[184]之醫藥組成物,其中該癌症復發發生在包含鉑類藥物的化療方案完成後不到六個月或約六個月內。
[186]如[184]之醫藥組成物,其中該癌症復發發生在包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案完成後不到六個月或約六個月內。
[187]如[184]之醫藥組成物,其中該癌症復發發生在包含鉑類藥物的化療方案完成後約六個月或之後。
[188]如[184]之醫藥組成物,其中該癌症復發發生在包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案完成後約六個月或之後。
[189]如[151]至[188]中任一項之醫藥組成物,其中該受試者被投予該ADC與第二藥物。
[190]如[189]之醫藥組成物,其中該ADC在該第二藥物之前投予。
[191]如[189]之醫藥組成物,其中該ADC在該第二藥物之後投予。
[192]如[189]之醫藥組成物,其中該ADC與該第二藥物同時投予。
[193]一種用於在受試者中治療癌症之醫藥組成物,該受試者患有對鉑類化療具有耐性之卵巢癌及/或在投予醫藥組成物之前呈現卵巢癌復發,其中該醫藥組成物包含具有下式表示之結構的抗體-藥物結合物(ADC):
[式4]
其中AB表示抗體或抗體之功能性片段,n表示每個抗體的與該抗體結合之藥物-連接子結構單元的平均數量,且該抗體經由衍生自該抗體的硫氫基連結至該連接子;且其中該ADC為其鹽或者該ADC或該鹽之水合物,其中每個抗體結合的藥物-連接子結構單元的平均數量為7至8個,其中該抗體包含:SEQ ID NO:87表示之重鏈胺基酸序列或於其中一個或二個胺基酸從其羧基端刪除之衍生自SEQ ID NO:87表示之胺基酸序列的胺基酸序列;及SEQ ID NO:88表示之輕鏈胺基酸序列。
[194]一種用於在受試者中治療卵巢癌之醫藥組成物,該受試者患有卵巢癌且先前已經以包含鉑類藥物、紫杉烷、或鉑類藥物及紫杉烷二者之化療方案治療,其中該醫藥組成物包含具有下式表示之結構的抗體-藥物結合物(ADC):
[式4]
其中AB表示抗體或抗體之功能性片段,n表示每個抗體的與該抗體結合之藥物-連接子結構單元的平均數量,且該抗體經由衍生自該抗體的硫氫基連結至該連接子;且其中該ADC為其鹽或者該ADC或該鹽之水合物,其中每個抗體結合的藥物-連接子結構單元的平均數量為7至8個,其中該抗體包含:SEQ ID NO:87表示之重鏈胺基酸序列或於其中一個或二個胺基酸從其羧基端刪除之衍生自SEQ ID NO:87表示之胺基酸序列的胺基酸序列;及SEQ ID NO:88表示之輕鏈胺基酸序列。
[195]如[151]至[194]中任一項之醫藥組成物,其中先將來自測試受試者之生物樣本用於檢測該生物樣本中CDH6的存在與否,再對檢測到CDH6的測試受試者投予醫藥組成物。
[196]如[151]至[195]中任一項之醫藥組成物,其中該癌症已對包含鉑類藥物的化療方案產生耐性。
[197]如[151]至[195]中任一項之醫藥組成物,其中該癌症已對包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案產生耐性。
[198]如[151]至[197]中任一項之醫藥組成物,其中該抗代謝物質為吉西他濱。
[199]如[151]至[197]中任一項之醫藥組成物,其中該鉑類藥物為卡鉑。
[200]如[151]至[197]中任一項之醫藥組成物,其中該鉑類藥物為卡鉑且該紫杉烷為紫杉醇。
[201]一種如本文所揭示之抗體-藥物結合物(ADC)於製造治療癌症的藥物之用途。
[202]如[201]之用途,其中抗體-藥物結合物(ADC)具有下式所表示之結構:
[式4]
其中AB表示抗體或抗體之功能性片段,n表示每個抗體的與該抗體結合之藥物-連接子結構單元的平均數量,且該抗體經由衍生自該抗體的硫氫基連結至該連接子。
[203]如[201]或[202]之用途,其中抗體-藥物結合物(ADC)為抗CDH6抗體-藥物結合物。
[204]如[201]至[203]中任一項之用途,其中該癌症選自下列所組成之群組:腎細胞癌、卵巢癌、間皮瘤、甲狀腺癌、子宮癌、膽管癌、胰臟癌、非小細胞肺癌、子宮頸癌、腦腫瘤、頭頸癌、肉瘤、骨肉瘤、小細胞肺癌、乳癌、膀胱癌、子宮內膜癌、及去勢抗性前列腺癌。
[205]如[201]至[203]中任一項之用途,其中該癌症選自卵巢癌、非小細胞肺癌、乳癌、膀胱癌、子宮內膜癌、及去勢抗性前列腺癌所組成之群組。
[206]如[201]至[203]中任一項之用途,其中該癌症為卵巢癌。
[207]如[206]之用途,其中該卵巢癌選自上皮性卵巢癌、輸卵管癌、或原發性腹膜癌所組成之群組。
[208]如[206]或[207]之用途,其中該卵巢癌為轉移性的。
[209]如[201]至[208]中任一項之用途,其中該抗體為包含選自下述組合(1)至(4)所組成之群組中的任一組合的輕鏈及重鏈的抗體、或該抗體之功能性片段:
(1)由SEQ ID NO:61中位置21至233之胺基酸序列組成之輕鏈及由SEQ ID NO:69中位置20至471之胺基酸序列組成之重鏈;
(2)由SEQ ID NO:61中位置21至233之胺基酸序列組成之輕鏈及由SEQ ID NO:73中位置20至471之胺基酸序列組成之重鏈;
(3)由SEQ ID NO:65中位置21至233之胺基酸序列組成之輕鏈及由SEQ ID NO:73中位置20至471之胺基酸序列組成之重鏈;及
(4)由SEQ ID NO:61中位置21至233之胺基酸序列組成之輕鏈及由SEQ ID NO:77中位置20至471之胺基酸序列組成之重鏈。
[210]如[201]至[209]中任一項之用途,其中該抗體為包含由SEQ ID NO:61中位置21至233之胺基酸序列組成之輕鏈及由SEQ ID NO:69中位置20至471之胺基酸序列組成之重鏈的抗體、或該抗體之功能性片段。
[211]如[201]至[209]中任一項之用途,其中該抗體為包含由SEQ ID NO:61中位置21至233之胺基酸序列組成之輕鏈及由SEQ ID NO:77中位置20至471之胺基酸序列組成之重鏈的抗體、或該抗體之功能性片段。
[212]如[201]至[211]中任一項之用途,其中該重鏈或輕鏈經選自下列所組成之群組中的一種或多種修飾:N-連接型醣基化、O-連接型醣基化、N端加工、C端加工、去醯胺化、天冬胺酸異構化、甲硫胺酸氧化、在N端添加甲硫胺酸殘基、脯胺酸殘基醯胺化、N端麩醯胺酸或N端麩胺酸轉化為焦麩胺酸、及從羧基端刪除一個或兩個胺基酸。
[213]如[201]至[211]中任一項之用途,其中該重鏈或輕鏈經選自下列所組成之群組中的二種以上的修飾:N-連接型醣基化、O-連接型醣基化、N端加工、C端加工、去醯胺化、天冬胺酸異構化、甲硫胺酸氧化、在N端添加甲硫胺酸殘基、脯胺酸殘基醯胺化、N端麩醯胺酸或N端麩胺酸轉化為焦麩胺酸、及從羧基端刪除一個或兩個胺基酸。
[214]如[201]至[213]中任一項之用途,其中每個抗體結合的所選擇之藥物-連接子結構單元的平均數量在1至10個之範圍內。
[215]如[201]至[214]中任一項之用途,其中每個抗體結合的所選擇之藥物-連接子結構單元的平均數量在2至8個之範圍內。
[216]如[201]至[214]中任一項之用途,其中每個抗體結合的所選擇之藥物-連接子結構單元的平均數量在5至8個之範圍內。
[217]如[201]至[214]中任一項之用途,其中每個抗體結合的所選擇之藥物-連接子結構單元的平均數量在7至8個之範圍內。
[218]如[201]至[217]中任一項之用途,其中該癌症包含一種或多種表現CDH6的腫瘤。
[219]如[201]至[218]中任一項之用途,其中該受試者有以包含鉑類藥物的化療方案治療的病史。
[220]如[201]至[218]中任一項之用途,其中該受試者有以包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案治療的病史。
[221]如[201]至[220]中任一項之用途,其中該受試者先前已經以包含鉑類藥物之化療方案治療。
[222]如[201]至[220]中任一項之用途,其中該受試者先前已經以包含鉑類藥物及紫杉烷之化療方案治療。
[223]如[201]至[222]中任一項之用途,其中該抗體-藥物結合物(ADC)與一種或多種化療劑組合而同時或不同時投予。
[224]如[223]之用途,其中該抗體-藥物結合物(ADC)在該一種或多種化療劑之後投予。
[225]如[223]之用途,其中該抗體-藥物結合物(ADC)及該一種或多種化療劑分別作為活性成分包含在不同的調配物中,並同時或不同時投予。
[226]如[223]之用途,其中該抗體-藥物結合物(ADC)及該一種或多種化療劑作為活性成分一起包含在相同調配物中,並同時投予。
[227]如[223]至[226]中任一項之用途,其中該一種或多種化療劑為抗代謝物質、鉑類藥物、紫杉烷、或鉑類藥物及紫杉烷二者。
[228]如[201]至[227]中任一項之用途,其中該受試者在以包含鉑類藥物的化療方案治療時顯示完全反應(CR)、部分反應(PR)或疾病穩定(SD)。
[229]如[201]至[227]中任一項之用途,其中該受試者在以包含鉑類藥物的化療方案治療時顯示完全反應(CR)或部分反應(PR)。
[230]如[201]至[227]中任一項之用途,其中該受試者在以包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案治療時顯示完全反應(CR)、部分反應(PR)、或疾病穩定(SD)。
[231]如[201]至[227]中任一項之用途,其中該受試者在以包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案治療時顯示完全反應(CR)或部分反應(PR)。
[232]如[201]至[231]中任一項之用途,其中該受試者患有對鉑類化療具有耐性的癌症。
[233]如[201]至[232]中任一項之用途,其中該受試者患有對包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案具有耐性的癌症。
[234]如[201]至[233]中任一項之用途,其中該受試者在投予ADC之前呈現癌症復發。
[235]如[234]之用途,其中該癌症復發發生在包含鉑類藥物的化療方案完成後不到六個月或約六個月內。
[236]如[234]之用途,其中該癌症復發發生在包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案完成後不到六個月或約六個月內。
[237]如[234]之用途,其中該癌症復發發生在包含鉑類藥物的化療方案完成後約六個月或之後。
[238]如[234]之用途,其中該癌症復發發生在包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案完成後約六個月或之後。
[239]如[201]至[238]中任一項之用途,其中該受試者被投予該ADC與第二藥物。
[240]如[239]之用途,其中該ADC在該第二藥物之前投予。
[241]如[239]之用途,其中該ADC在該第二藥物之後投予。
[242]如[239]之用途,其中該ADC與該第二藥物同時投予。
[243]一種醫藥組成物用於治療癌症之用途,該用途包含對受試者投予醫藥組成物,該受試者患有對鉑類化療具有耐性之卵巢癌及/或在投予醫藥組成物之前呈現卵巢癌復發,其中該醫藥組成物包含具有下式表示之結構的抗體-藥物結合物(ADC):
[式4]
其中AB表示抗體或抗體之功能性片段,n表示每個抗體的與該抗體結合之藥物-連接子結構單元的平均數量,且該抗體經由衍生自該抗體的硫氫基連結至該連接子;且其中該ADC為其鹽或者該ADC或該鹽之水合物,其中每個抗體結合的藥物-連接子結構單元的平均數量為7至8個,其中該抗體包含:SEQ ID NO:87表示之重鏈胺基酸序列或於其中一個或二個胺基酸從其羧基端刪除之衍生自SEQ ID NO:87表示之胺基酸序列的胺基酸序列;及SEQ ID NO:88表示之輕鏈胺基酸序列。
[244]一種醫藥組成物用於治療癌症之用途,該用途包含對受試者投予醫藥組成物,該受試者患有卵巢癌且先前已經以包含鉑類藥物、紫杉烷、或鉑類藥物及紫杉烷二者之化療方案治療,其中該醫藥組成物包含具有下式表示之結構的抗體-藥物結合物(ADC):
[式4]
其中AB表示抗體或抗體之功能性片段,n表示每個抗體的與該抗體結合之藥物-連接子結構單元的平均數量,且該抗體經由衍生自該抗體的硫氫基連結至該連接子;且其中該ADC為其鹽或者該ADC或該鹽之水合物,其中每個抗體結合的藥物-連接子結構單元的平均數量為7至8個,其中該抗體包含:SEQ ID NO:87表示之重鏈胺基酸序列或於其中一個或二個胺基酸從其羧基端刪除之衍生自SEQ ID NO:87表示之胺基酸序列的胺基酸序列;及SEQ ID NO:88表示之輕鏈胺基酸序列。
[245]如[201]至[244]中任一項之用途,該方法包含使用來自測試受試者之生物樣本以檢測該生物樣本中CDH6的存在與否、及對檢測到CDH6的測試受試者投予醫藥組成物。
[246]如[201]至[245]中任一項之用途,其中該癌症已對包含鉑類藥物的化療方案產生耐性。
[247]如[201]至[245]中任一項之用途,其中該癌症已對包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案產生耐性。
[248]如[201]至[247]中任一項之用途,其中該抗代謝物質為吉西他濱。
[249]如[201]至[247]中任一項之用途,其中該鉑類藥物為卡鉑。
[250]如[201]至[247]中任一項之用途,其中該鉑類藥物為卡鉑且該紫杉烷為紫杉醇。
在一些態樣中,所揭示之治療廣泛地述及用於治療癌症之治療用途或方法,該用途或方法包含對有需要之受試者投予抗體-藥物結合物(ADC)。
在一些態樣中,抗體-藥物結合物(ADC)具有下式所表示之結構:
[式4]
其中AB表示抗體或抗體之功能性片段,n表示每個抗體的與該抗體結合之藥物-連接子結構單元的平均數量,且該抗體經由衍生自該抗體的硫氫基連結至該連接子。
在一些態樣中,抗體-藥物結合物(ADC)為抗CDH6抗體-藥物結合物。
在一些態樣中,抗體-藥物結合物(ADC)為抗CDH6抗體-藥物結合物,其中該抗體特異性地結合胞外域3。
在一些態樣中,癌症選自下列所組成之群組:腎細胞癌、卵巢癌、間皮瘤、甲狀腺癌、子宮癌、膽管癌、胰臟癌、非小細胞肺癌、子宮頸癌、腦腫瘤、頭頸癌、肉瘤、骨肉瘤、小細胞肺癌、乳癌、膀胱癌、子宮內膜癌、及去勢抗性前列腺癌。在一些態樣中,癌症選自卵巢癌、非小細胞肺癌、乳癌、膀胱癌、子宮內膜癌、及去勢抗性前列腺癌所組成之群組。在一些態樣中,癌症為卵巢癌。在一些態樣中,卵巢癌選自上皮性卵巢癌、輸卵管癌、或原發性腹膜癌所組成之群組。在一些態樣中,卵巢癌為轉移性的。
在一些態樣中,該抗體為包含選自下述組合(1)至(4)所組成之群組中的任一組合的輕鏈及重鏈的抗體、或該抗體之功能性片段:(1)由SEQ ID NO:61中位置21至233之胺基酸序列組成之輕鏈及由SEQ ID NO:69中位置20至471之胺基酸序列組成之重鏈;(2)由SEQ ID NO:61中位置21至233之胺基酸序列組成之輕鏈及由SEQ ID NO:73中位置20至471之胺基酸序列組成之重鏈;(3)由SEQ ID NO:65中位置21至233之胺基酸序列組成之輕鏈及由SEQ ID NO:73中位置20至471之胺基酸序列組成之重鏈;及(4)由SEQ ID NO:61中位置21至233之胺基酸序列組成之輕鏈及由SEQ ID NO:77中位置20至471之胺基酸序列組成之重鏈。
在一些態樣中,抗體為包含由SEQ ID NO:61中位置21至233之胺基酸序列組成之輕鏈及由SEQ ID NO:69中位置20至471之胺基酸序列組成之重鏈的抗體、或該抗體之功能性片段。在一些態樣中,抗體為包含由SEQ ID NO:61中位置21至233之胺基酸序列組成之輕鏈及由SEQ ID NO:77中位置20至471之胺基酸序列組成之重鏈的抗體、或該抗體之功能性片段。
在一些態樣中,重鏈或輕鏈經選自下列所組成之群組中的一種或多種修飾:N-連接型醣基化、O-連接型醣基化、N端加工、C端加工、去醯胺化、天冬胺酸異構化、甲硫胺酸氧化、在N端添加甲硫胺酸殘基、脯胺酸殘基醯胺化、N端麩醯胺酸或N端麩胺酸轉化為焦麩胺酸、及從羧基端刪除一個或兩個胺基酸。
在一些態樣中,重鏈或輕鏈經選自下列所組成之群組中的二種以上的修飾:N-連接型醣基化、O-連接型醣基化、N端加工、C端加工、去醯胺化、天冬胺酸異構化、甲硫胺酸氧化、在N端添加甲硫胺酸殘基、脯胺酸殘基醯胺化、N端麩醯胺酸或N端麩胺酸轉化為焦麩胺酸、及從羧基端刪除一個或兩個胺基酸。
在一些態樣中,每個抗體結合的所選擇之藥物-連接子結構單元的平均數量在1至10個之範圍內。在一些態樣中,每個抗體結合的所選擇之藥物-連接子結構單元的平均數量在2至8個之範圍內。在一些態樣中,每個抗體結合的所選擇之藥物-連接子結構單元的平均數量在5至8個之範圍內。在一些態樣中,每個抗體結合的所選擇之藥物-連接子結構單元的平均數量在7至8個之範圍內。
在一些態樣中,癌症包含表現CDH6之一種或多種腫瘤。
在一些態樣中,受試者有以包含鉑類藥物之化療方案治療的病史。在一些態樣中,受試者有以包含鉑類藥物及紫杉烷之化療方案治療的病史。
在一些態樣中,受試者先前已經以包含鉑類藥物之化療方案治療。在一些態樣中,受試者先前已經以包含鉑類藥物及紫杉烷之化療方案治療。
在一些態樣中,抗體-藥物結合物(ADC)與一種或多種化療劑組合而同時或不同時投予。
在一些態樣中,抗體-藥物結合物(ADC)在一種或多種化療劑之後投予。
在一些態樣中,抗體-藥物結合物(ADC)在抗體-藥物結合物(ADC)與一種或多種化療劑組合投予之後投予。
在一些態樣中,抗體-藥物結合物(ADC)及一種或多種化療劑分別作為活性成分包含在不同的調配物中,並同時或不同時投予。
在一些態樣中,抗體-藥物結合物(ADC)及一種或多種化療劑作為活性成分一起包含在相同調配物中,並同時投予。
在一些態樣中,一種或多種化療劑為抗代謝物質、鉑類藥物、紫杉烷、或鉑類藥物及紫杉烷二者。在一些態樣中,一種或多種化療劑為抗代謝物質。在一些態樣中,一種或多種化療劑為鉑類藥物。在一些態樣中,一種或多種化療劑為鉑類藥物及紫杉烷二者。
在一些態樣中,受試者在以包含鉑類藥物的化療方案治療時顯示完全反應(CR)、部分反應(PR)或疾病穩定(SD)。
在一些態樣中,受試者在以包含鉑類藥物的化療方案治療時顯示完全反應(CR)或部分反應(PR)。
在一些態樣中,受試者在以包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案治療時顯示完全反應(CR)、部分反應(PR)、或疾病穩定(SD)。
在一些態樣中,受試者在以包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案治療時顯示完全反應(CR)或部分反應(PR)。
在一些態樣中,受試者患有對鉑類化療具有耐性的癌症。在一些態樣中,受試者患有對包含鉑類藥物及紫杉烷之化療方案具有耐性的癌症。在一些態樣中,受試者在投予ADC之前呈現癌症復發。在一些態樣中,受試者患有對包含鉑類藥物及紫杉烷之化療方案具有耐性的癌症。
在一些態樣中,癌症復發發生在包含鉑類藥物的化療方案完成後不到六個月或約六個月內。在一些態樣中,癌症復發發生在包含鉑類藥物的化療方案完成後不到約六個月。在一些態樣中,癌症復發發生在包含鉑類藥物的化療方案完成後約六個月內。
在一些態樣中,癌症復發發生在包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案完成後不到六個月或六個月內。在一些態樣中,癌症復發發生在包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案完成後不到六個月。在一些態樣中,癌症復發發生在包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案完成後六個月內。
在一些態樣中,癌症復發發生在包含鉑類藥物的化療方案完成後約六個月或之後。在一些態樣中,癌症復發發生在包含鉑類藥物的化療方案完成後約六個月。在一些態樣中,癌症復發發生在包含鉑類藥物的化療方案完成後約六個月之後。
在一些態樣中,癌症復發發生在包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案完成後不到六個月或約六個月內。在一些態樣中,癌症復發發生在包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案完成後不到約六個月。在一些態樣中,癌症復發發生在包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案完成後約六個月內。
在一些態樣中,癌症復發發生在包含鉑類藥物的化療方案完成後不到六個月或六個月內。在一些態樣中,癌症復發發生在包含鉑類藥物的化療方案完成後不到六個月。在一些態樣中,癌症復發發生在包含鉑類藥物的化療方案完成後六個月內。
在一些態樣中,癌症復發發生在包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案完成後約六個月或之後。在一些態樣中,癌症復發發生在包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案完成後約六個月。在一些態樣中,癌症復發發生在包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案完成後約六個月之後。
在一些態樣中,癌症復發發生在包含鉑類藥物的化療方案完成後六個月或之後。在一些態樣中,癌症復發發生在包含鉑類藥物的化療方案完成後六個月。在一些態樣中,癌症復發發生在包含鉑類藥物的化療方案完成後六個月之後。
在一些態樣中,癌症復發發生在包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案完成後六個月或之後。在一些態樣中,癌症復發發生在包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案完成後六個月。在一些態樣中,癌症復發發生在包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案完成後六個月之後。
在一些態樣中,受試者被投予ADC與第二藥物。在一些態樣中,在投予第二藥物之前投予ADC。在一些態樣中,在投予第二藥物之後投予ADC。在一些態樣中,ADC與第二藥物同時投予。
在一些態樣中,本揭示通常述及一種用於治療癌症之治療方法,該方法包含對受試者投予醫藥組成物,該受試者患有對鉑類化療具有耐性之卵巢癌及/或在投予醫藥組成物之前呈現卵巢癌復發,其中該醫藥組成物包含具有下式表示之結構的抗體-藥物結合物(ADC):
[式4]
其中AB表示抗體或抗體之功能性片段,n表示每個抗體的與該抗體結合之藥物-連接子結構單元的平均數量,且該抗體經由衍生自該抗體的硫氫基連結至該連接子;且其中該ADC為其鹽或者該ADC或該鹽之水合物,其中每個抗體結合的藥物-連接子結構單元的平均數量為7至8個,其中該抗體包含:SEQ ID NO:87表示之重鏈胺基酸序列或於其中一個或二個胺基酸從其羧基端刪除之衍生自SEQ ID NO:87表示之胺基酸序列的胺基酸序列;及SEQ ID NO:88表示之輕鏈胺基酸序列。
在一些態樣中,本揭示通常述及一種用於治療癌症之治療方法,該方法包含對受試者投予醫藥組成物,該受試者患有卵巢癌且先前已經以包含鉑類藥物、紫杉烷、或鉑類藥物及紫杉烷二者之化療方案治療,其中該醫藥組成物包含具有下式表示之結構的抗體-藥物結合物(ADC):
[式4]
其中AB表示抗體或抗體之功能性片段,n表示每個抗體的與該抗體結合之藥物-連接子結構單元的平均數量,且該抗體經由衍生自該抗體的硫氫基連結至該連接子;且其中該ADC為其鹽或者該ADC或該鹽之水合物,其中每個抗體結合的藥物-連接子結構單元的平均數量為7至8個,其中該抗體包含:SEQ ID NO:87表示之重鏈胺基酸序列或於其中一個或二個胺基酸從其羧基端刪除之衍生自SEQ ID NO:87表示之胺基酸序列的胺基酸序列;及SEQ ID NO:88表示之輕鏈胺基酸序列。
在一些態樣中,本揭示通常述及一種用於治療癌症之治療方法,該方法包含使用來自測試受試者之生物樣本以檢測該生物樣本中CDH6的存在與否、及對檢測到CDH6的測試受試者投予醫藥組成物。
在一些態樣中,癌症已對包含鉑類藥物的化療方案產生耐性。在一些態樣中,癌症已對包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案產生耐性。
在一些態樣中,抗代謝物質為吉西他濱。在一些態樣中,鉑類藥物為卡鉑。在一些態樣中,鉑類藥物為卡鉑且紫杉烷為紫杉醇。
本發明包括下述本發明的態樣:
[1A]一種用於治療癌症之治療方法,該方法包含對有需要之受試者投予具有下式表示結構之抗體-藥物結合物(ADC):
[式4]
其中AB表示抗體或抗體之功能性片段,n表示每個抗體的與該抗體結合之藥物-連接子結構單元的平均數量,且該抗體經由衍生自該抗體的硫氫基連結至該連接子。
[2A]如[1A]之治療方法,其中該癌症選自卵巢癌、非小細胞肺癌、乳癌、膀胱癌、子宮內膜癌、及去勢抗性前列腺癌所組成之群組。
[3A]如[2A]之治療方法,其中該癌症為卵巢癌。
[4A]如[3A]之治療方法,其中該卵巢癌選自上皮性卵巢癌、輸卵管癌、或原發性腹膜癌所組成之群組。
[5A]如[3A]之治療方法,其中該卵巢癌為轉移性的。
[6A]如[1A]之治療方法,其中該抗體為包含選自下述組合(1)至(4)所組成之群組中的任一組合的輕鏈及重鏈的抗體、或該抗體之功能性片段:
(1)由SEQ ID NO:61中位置21至233之胺基酸序列組成之輕鏈及由SEQ ID NO:69中位置20至471之胺基酸序列組成之重鏈;
(2)由SEQ ID NO:61中位置21至233之胺基酸序列組成之輕鏈及由SEQ ID NO:73中位置20至471之胺基酸序列組成之重鏈;
(3)由SEQ ID NO:65中位置21至233之胺基酸序列組成之輕鏈及由SEQ ID NO:73中位置20至471之胺基酸序列組成之重鏈;及
(4)由SEQ ID NO:61中位置21至233之胺基酸序列組成之輕鏈及由SEQ ID NO:77中位置20至471之胺基酸序列組成之重鏈。
[7A]如[1A]之治療方法,其中該抗體為包含由SEQ ID NO:61中位置21至233之胺基酸序列組成之輕鏈及由SEQ ID NO:69中位置20至471之胺基酸序列組成之重鏈的抗體、或該抗體之功能性片段。
[8A]如[1A]之治療方法,其中該抗體為包含由SEQ ID NO:61中位置21至233之胺基酸序列組成之輕鏈及由SEQ ID NO:77中位置20至471之胺基酸序列組成之重鏈的抗體、或該抗體之功能性片段。
[9A]如[1A]之治療方法,其中該重鏈或輕鏈經選自下列所組成之群組中的一種或多種修飾:N-連接型醣基化、O-連接型醣基化、N端加工、C端加工、去醯胺化、天冬胺酸異構化、甲硫胺酸氧化、在N端添加甲硫胺酸殘基、脯胺酸殘基醯胺化、N端麩醯胺酸或N端麩胺酸轉化為焦麩胺酸、及從羧基端刪除一個或兩個胺基酸。
[10A]如[1A]之治療方法,其中該重鏈或輕鏈經選自下列所組成之群組中的二種以上的修飾:N-連接型醣基化、O-連接型醣基化、N端加工、C端加工、去醯胺化、天冬胺酸異構化、甲硫胺酸氧化、在N端添加甲硫胺酸殘基、脯胺酸殘基醯胺化、N端麩醯胺酸或N端麩胺酸轉化為焦麩胺酸、及從羧基端刪除一個或兩個胺基酸。
[11A]如[1A]之治療方法,其中每個抗體結合的所選擇之藥物-連接子結構單元的平均數量在1至10個之範圍內。
[12A]如[11A]之治療方法,其中每個抗體結合的所選擇之藥物-連接子結構單元的平均數量在2至8個之範圍內。
[13A]如[11A]之治療方法,其中每個抗體結合的所選擇之藥物-連接子結構單元的平均數量在5至8個之範圍內。
[14A]如[11A]之治療方法,其中每個抗體結合的所選擇之藥物-連接子結構單元的平均數量在7至8個之範圍內。
[15A]如[1A]之治療方法,其中該癌症包含一種或多種表現CDH6的腫瘤。
[16A]如[1A]之治療方法,其中該受試者患有對鉑類化療具有耐性的癌症。
[17A]如[1A]之治療方法,其中該受試者在投予ADC之前呈現癌症復發。
[18A]如[1A]之治療方法,其中該受試者患有對包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案具有耐性的癌症。
[19A]如[17A]之治療方法,其中該癌症復發發生在包含鉑類藥物的化療方案完成後約六個月內。
[20A]如[17A]之治療方法,其中該癌症復發發生在包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案完成後約六個月內。
[21A]如[1A]之治療方法,其中該受試者被投予該ADC與第二藥物。
[22A]如[21A]之治療方法,其中該ADC在該第二藥物之前投予。
[23A]如[21A]之治療方法,其中該ADC在該第二藥物之後投予。
[24]如[21A]之治療方法,其中該ADC與該第二藥物同時投予。
[25A]一種用於治療癌症之治療方法,該方法包含對受試者投予醫藥組成物,該受試者患有對鉑類化療具有耐性之卵巢癌及/或在投予醫藥組成物之前呈現卵巢癌復發,其中該醫藥組成物包含具有下式表示之結構的抗體-藥物結合物(ADC):
[式4]
其中AB表示抗體或抗體之功能性片段,n表示每個抗體的與該抗體結合之藥物-連接子結構單元的平均數量,且該抗體經由衍生自該抗體的硫氫基連結至該連接子;且其中該ADC為其鹽或者該ADC或該鹽之水合物,其中每個抗體結合的藥物-連接子結構單元的平均數量為7至8個,其中該抗體包含:SEQ ID NO:87表示之重鏈胺基酸序列或於其中一個或二個胺基酸從其羧基端刪除之衍生自SEQ ID NO:87表示之胺基酸序列的胺基酸序列;及SEQ ID NO:88表示之輕鏈胺基酸序列或於其中一個或二個胺基酸從其羧基端刪除之衍生自SEQ ID NO:88表示之胺基酸序列的胺基酸序列。
發明之有利效果
本揭示提供一種使用ADC治療癌症的治療方法、及用於治療癌症之包含ADC的醫藥產品等。本揭示亦提供一種使用其抗體與EC3特異性地結合的抗CDH6抗體-藥物結合物的治療方法,以發揮並維持腫瘤消退作用及安全性之優異的抗腫瘤作用來用於治療耐化療的癌症。本揭示亦提供一種包含抗CDH6抗體-藥物結合物之醫藥組成物。
在下文中,將參照圖式說明用於進行本發明的較佳具體實施例。應注意,以下所述的具體實施例僅說明本發明的代表性具體實施例,本發明的範疇不應因這些實例而被狹義解釋。
在本說明中,術語「癌症」係與術語「腫瘤」以相同的意義使用。
在本說明中,術語「基因」不僅用以包括DNA,亦包括其mRNA及cDNA、以及此等之cRNA。
在本說明中,術語「多核苷酸」或「核苷酸」係與核酸以相同的意義使用,且亦包括DNA、RNA、探針、寡核苷酸及引子。在本說明中,除非另有指明,否則術語「多核苷酸」及「核苷酸」可彼此互換使用。
在本說明中,術語「多肽」及「蛋白質」可彼此互換使用。
在本說明中,術語「細胞」包括個體動物中的細胞及培養的細胞。
在本說明中,術語「CDH6」可與CDH6蛋白以相同的意義使用。在本說明中,人類CDH6亦稱為「hCDH6」。
在本說明中,術語「細胞毒殺活性」用以意指以任何給定方法對細胞造成的病理性的變化。該術語不僅意指直接的外傷,亦意指對細胞造成之所有類型的結構或機能的損傷,諸如DNA斷裂、鹼基二聚體的形成、染色體斷裂、對細胞有絲分裂器的損傷、及各種類型的酵素活性的降低。
在本說明中,詞組「在細胞中產生毒性」用以意指以任何給定方式在細胞中呈現毒性。該術語不僅意指直接的外傷,亦意指對細胞造成之所有類型的結構、機能、代謝的影響,諸如DNA斷裂、鹼基二聚體的形成、染色體斷裂、對細胞有絲分裂器的損傷、各種類型的酵素活性的降低、及壓制細胞生長因子的作用。
在本說明中,術語「抗體之功能性片段」,亦稱為「抗體之抗原結合片段」,用以意指具有對於抗原之結合活性的抗體之部分片段,且包括Fab、F(ab')2、scFv、雙功能抗體(diabody)、線性抗體及由抗體片段所形成的多特異性抗體等。Fab'係藉由在還原條件下處理F(ab')2所獲得之抗體可變區的單價片段,其亦包括在抗體之抗原結合片段中。然而,只要抗原結合片段具有抗原結合能力,則抗體之抗原結合片段不受限於此等分子。此等抗原結合片段不僅包括藉由將抗體蛋白質之全長分子以適當的酵素進行處理所獲得者,亦包括使用經基因工程之抗體基因而於適當的宿主細胞中所產生的蛋白質。
在本說明中,術語「表位」用以意指特定抗CDH6抗體結合之CDH6的部分肽或部分三維結構。此類表位,即上述CDH6的部分肽,可藉由本技術領域中具有通常知識者所熟知的方法來確定,例如免疫測定法。首先,產生抗原的各種部分結構。關於此類部分結構的產生,可應用已知的寡肽合成技術。例如,藉由本技術領域中具有通常知識者所熟知的基因重組技術,產生CDH6已從其C端或N端以適當長度連續截短之一系列多肽。之後,研究抗體對此類多肽的反應性,並粗略確定辨識位。之後,進一步合成較短的肽,然後可研究其對這些肽的反應性,以確定表位。當與具有多個胞外域之膜蛋白結合的抗體指向由多個域構成的三維結構作為表位時,抗體結合的域可藉由修飾特定胞外域之胺基酸序列且因此修飾三維結構來確定。表位係與特定抗體結合的抗原的部分三維結構,亦可藉由以X射線結構分析特定出與抗體相鄰的抗原的胺基酸殘基來確定該表位。
在本說明中,詞組「與相同表位結合的抗體」用以意指與共通表位結合的抗體。若第二抗體係與第一抗體所結合的部分肽或部分三維結構結合,則可確定第一抗體及第二抗體結合相同的表位。或者,藉由確認對於第一抗體與抗原的結合,第二抗體係與第一抗體競爭(即第二抗體干擾第一抗體與抗原的結合),可確定第一抗體及第二抗體結合相同的表位,即使該表位的特定序列或結構尚未確定。在本說明中,詞組「與相同表位結合」係指藉由這些確定方法中的任一種或兩種而確定第一抗體及第二抗體與共通表位結合的情況。當第一抗體及第二抗體結合相同的表位,且第一抗體具有特殊效果(例如抗腫瘤活性或內化活性)時,可預期第二抗體具有與第一抗體相同的活性。
在本說明中,術語「CDR」用以意指互補決定區。已知抗體分子之重鏈及輕鏈各具有3個CDR。此類CDR亦稱為高度變異區,且位於抗體重鏈及輕鏈的可變區。這些區域具有特定高度可變的一級結構,並在各個重鏈及輕鏈中的多肽鏈一級結構上被分成三個部位。在本說明中,對於抗體的CDR,重鏈的CDR從重鏈胺基酸序列的胺基端側起分別稱為CDRH1、CDRH2及CDRH3,反之,輕鏈的CDR從輕鏈胺基酸序列的胺基端側起分別稱為CDRL1、CDRL2及CDRL3。這些部位在三維結構上彼此靠近,並決定抗體對於該抗體所結合之抗原的特異性。
在本發明中,詞組「於嚴苛條件下雜交」用以意指在市售之雜交溶液ExpressHyb雜交溶液(Clontech Laboratories, Inc.製)中於68℃進行雜交、或者在下述條件或與其同等的條件下進行雜交:使用固定有DNA之濾器而在0.7至1.0 M NaCl存在下於68℃進行雜交,然後使用0.1至2倍濃度的SSC溶液(其中1倍濃度SSC由150 mM NaCl及15 mM檸檬酸鈉組成)於68℃洗滌產物用於鑑定。
在本說明中,術語「1至數個」用以意指1至10個、1至9個、1至8個、1至7個、1至6個、1至5個、1至4個、1至3個、或者1或2個。
在本說明中,術語「具有耐性的」用以意指對於以抗癌劑治療沒有反應。該術語亦可表示為「頑抗性的」、「無反應的(non-responsive或unresponsive)」。此外,由於該無反應的特性而無法防止腫瘤生長,因此該術語亦可表示為「不耐受的(intolerant)」。
在本說明中,術語「具有耐性的」可為「具有因以抗癌劑治療而由癌症獲得的耐性」或可為「具有與以抗癌劑治療無關的癌症固有的耐性」。
在本說明中,術語「對化療具有耐性的」用以意指對於以化療治療沒有反應。
在本說明中,術語「對化療方案具有耐性的」用以意指對於根據化療方案進行的化療沒有反應。
在本說明中,術語「對鉑類化療具有耐性的」用以意指對於以鉑類化療治療沒有反應。
在本說明中,術語「化療」用以意指使用一種或多種用於治療癌症之化療劑的療法。
在本說明中,術語「化療劑」用以意指用於治療癌症之化療藥劑。化療劑包括但不限於:烷化劑(例如,甲基二(氯乙基)胺(mechlorethamine)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、依弗醯胺(ifosfamide)、黴法蘭(melphalan)、氮芥苯丁酸(chlorambucil)、六甲基三聚氰胺(hexamethylmelamine)、噻替哌(thiotepa)、白消安(busulfan)、卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、司莫司汀(semustine)、鏈佐星(streptozocin)、達卡巴嗪(dacarbazine))、抗代謝物質(例如,吉西他濱、胺甲喋呤(methotrexate)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、卡培他濱(capecitabine)、氟尿苷(floxuridine)、阿糖胞苷(cytarabine)、巰基嘌呤(mercaptopurine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)、噴司他丁(pentostatin))、長春花屬生物鹼(例如,長春花鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine))、表鬼臼毒素(epipodophyllotoxins) (例如,依託泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide))、抗生素(例如,放線菌素D(dactinomycin)、道諾黴素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、博萊黴素(bleomycin)、普卡黴素(plicamycin)、絲裂黴素(mitomycin))、鉑複合物(例如,順鉑(cisplatin)、卡鉑、奧沙利鉑(oxaliplatin))、紫杉烷(例如,紫杉醇(paclitaxel)、多西紫杉醇(docetaxel))、蒽二酮類(例如,米托蒽醌(mitoxantrone))、經取代之尿素(例如,羥基尿素)、甲肼(例如,鹽酸丙卡巴肼(procarbazine hydrochloride))、維生素A代謝物(例如,視網酸(tretinoin))。
在本說明中,術語「鉑類化療」用以意指在有/沒有其他一種或多種化療劑下使用一種或多種鉑類藥物之癌症療法。
在本說明中,術語「鉑類藥物」用以意指用於治療癌症之鉑複合物。鉑類藥物包括但不限於:順鉑、卡鉑及奧沙利鉑。
在本說明中,術語「癌症復發」用以意指在經過一段無檢測到癌症的期間後,癌症又回到與原發性腫瘤相同的位置或身體的另一個位置。該術語係以下述參考文獻中的「復發」為基礎來定義的。
NCI Dictionaries, “recurrence”, NCI Dictionary of Cancer Terms [線上]。美國國家癌症研究院(National Cancer Institute)[檢索於2022-09-06]。檢索自<cancer.gov/publications/dictionaries/cancer-terms/def/recurrence>。
在本說明中,術語「化療方案」用以意指定義藥物、劑量、頻率等的化療之治療計畫。
在本說明中,術語「完全反應(CR)」用以意指所有癌症的徵象都對治療有反應而消失。「完全反應(CR)」並不總意指癌症已經治癒。該術語亦可表示為「完全緩解」。該術語係以下述參考文獻中的「完全反應」為基礎來定義的。
NCI Dictionaries, “complete response”, NCI Dictionary of Cancer Terms [線上]。美國國家癌症研究院[檢索於2022-09-06]。檢索自<cancer.gov/publications/dictionaries/cancer-terms/def/complete-response>。
在本說明中,術語「部分反應(PR)」用以意指體內之腫瘤的大小或癌症的程度對治療有反應而減少。該術語亦可表示為「部分緩解」。該術語係以下述參考文獻中的「部分反應」為基礎來定義的。
NCI Dictionaries, “partial response”, NCI Dictionary of Cancer Terms [線上]。美國國家癌症研究院[檢索於2022-09-06]。檢索自<cancer.gov/publications/dictionaries/cancer-terms/def/partial-response>。
在本說明中,術語「疾病穩定(SD)」用以意指癌症在程度或嚴重度上既沒有減少也沒有增加。該術語係以下述參考文獻中的「部分反應」為基礎來定義的。
NCI Dictionaries, “stable disease”, NCI Dictionary of Cancer Terms [線上]。美國國家癌症研究院[檢索於2022-09-06]。檢索自<cancer.gov/publications/dictionaries/cancer-terms/def/stable-disease>。
1.CDH6
鈣黏蛋白係存在於細胞膜表面之醣蛋白,透過彼等N端的胞外域之鈣離子依賴性結合而作為細胞間黏著分子發揮功能,或作為負責細胞間相互作用的訊息分子而發揮功能。典型的鈣黏蛋白屬於鈣黏蛋白超家族,且係由5個胞外域(EC域)、1個跨膜區、及胞內域所構成的單次跨膜蛋白。
CDH6 (鈣黏蛋白6)係一種由790個胺基酸所構成的單次跨膜蛋白,被分類為第II型鈣黏蛋白家族,且此蛋白具有N端胞外域及C端胞內域。人類CDH6基因於1995年首次被選殖(非專利文獻1),其序列能夠參照例如登錄號NM_004932及NP_004923(NCBI)等。
本發明中使用的CDH6蛋白可直接從人類或非人類哺乳動物(例如,大鼠、小鼠或猴)的CDH6表現細胞中純化,然後可使用;或可製備上述細胞的細胞膜區分(cell membrane fraction)並可用作CDH6蛋白。或者,CDH6亦可藉由活體外合成或藉由以基因操作使宿主細胞產生CDH6而獲得。根據此類基因操作,可獲得CDH6蛋白,特別是藉由將CDH6 cDNA插入能夠表現CDH6 cDNA的載體中,然後在含有轉錄及轉譯所必需的酵素、受質及能量材料的溶液中合成CDH6;或藉由將其他原核生物或真核生物的宿主細胞轉形,以使其表現CDH6。再者,基於上述基因操作的CDH6表現細胞、或表現CDH6之細胞株可用於呈現CDH6蛋白。或者,可將已併入CDH6 cDNA之表現載體直接投予至待免疫動物,因而可在所免疫的動物體內表現CDH6。
再者,由在上述CDH6之胺基酸序列中包含1個或數個胺基酸的取代、刪除及/或添加的胺基酸序列所組成,且具有與CDH6蛋白同等的生物活性之蛋白質,亦包括在該術語「CDH6」中。
人類CDH6蛋白具有SEQ ID NO:1所示之胺基酸序列。人類CDH6蛋白的細胞外區域由具有SEQ ID NO:1所示胺基酸序列中位置54至159之胺基酸序列的胞外域1 (在本說明中,亦稱為EC1)、具有SEQ ID NO:1所示胺基酸序列中位置160至268之胺基酸序列的胞外域2 (在本說明中,亦稱為EC2)、具有SEQ ID NO:1所示胺基酸序列中位置269至383之胺基酸序列的胞外域3 (在本說明中,亦稱為EC3)、具有SEQ ID NO:1所示胺基酸序列中位置384至486之胺基酸序列的胞外域4 (在本說明中,亦稱為EC4)、及具有SEQ ID NO:1所示胺基酸序列中位置487至608之胺基酸序列的胞外域5 (在本說明中,亦稱為EC5)所構成。EC1至EC5之胺基酸序列分別顯示於SEQ ID NO:2至6 (表1)。
2.抗CDH6抗體的生產
本發明抗CDH6抗體的一個實例可包括辨識包含SEQ ID NO:4所示胺基酸序列的胺基酸序列並具有內化活性之抗CDH6抗體。本發明抗CDH6抗體的一個實例可包括特異性辨識包含SEQ ID NO:4所示胺基酸序列的胺基酸序列並具有內化活性之抗CDH6抗體。本發明抗CDH6抗體的一個實例可包括辨識由SEQ ID NO:4所示胺基酸序列組成的胺基酸序列並具有內化活性之抗CDH6抗體。本發明抗CDH6抗體的一個實例可包括特異性辨識由SEQ ID NO:4所示胺基酸序列組成的胺基酸序列並具有內化活性之抗CDH6抗體。詞組「特異性辨識包含SEQ ID NO:4所示胺基酸序列的胺基酸序列」或「特異性辨識EC3域」當應用於抗體時,用以意指與CDH6 的其他胞外域相比,該抗體強烈辨識或強烈結合CDH6的EC3域。
本發明之抗CDH6抗體可源自於任何物種。該物種的較佳實例可包括人類、猴、大鼠、小鼠及兔。當本發明之抗CDH6抗體源自於人類以外的物種時,較佳為藉由熟知的技術來將該抗CDH6抗體嵌合或人源化。本發明之抗體可為多株抗體,亦可為單株抗體,較佳為單株抗體。
本發明之抗CDH6抗體為可靶向腫瘤細胞的抗體。具體而言,本發明之抗CDH6抗體具有能夠辨識腫瘤細胞的特性、能夠與腫瘤細胞結合的特性、及/或藉由細胞攝取被內化到腫瘤細胞中的特性等。因此,本發明的抗CDH6抗體可經由連接子與具有抗腫瘤活性的化合物結合以製備抗體-藥物結合物。
抗體對腫瘤細胞的結合活性可藉由流式細胞測量術(flow cytometry)確認。抗體攝取至腫瘤細胞中可藉由下列來確認:(1)使用與抗體結合的二級抗體(經螢光標識)在螢光顯微鏡下使細胞攝取的抗體可視化的測定(Cell Death and Differentiation, 2008, 15, 751-761);(2)使用與抗體結合的二級抗體(經螢光標識)測量細胞攝取的螢光量的測定(Molecular Biology of the Cell Vol. 15, 5268-5282, December 2004);或(3) 使用與抗體結合的免疫毒素的Mab-ZAP測定,其中該毒素在細胞攝取時釋放以壓制細胞生長(Bio Techniques 28: 162-165, January 2000)。白喉毒素之催化區的重組結合蛋白及蛋白G (protein G)可用作免疫毒素。
在本說明中,術語「高內化能力」用以意指已投予上述抗體及經皂草素標識的抗大鼠IgG抗體之CDH6表現細胞的存活率(其藉由相對於定義為100%之未添加抗體的細胞存活率的比率表示)較佳為70%或更低,更佳為60%或更少。
本發明之抗腫瘤抗體-藥物結合物包含發揮抗腫瘤作用的結合化合物。因此,較佳但非必須的是,抗體本身應具有抗腫瘤作用。為了在腫瘤細胞中特異性及/或選擇性地發揮抗腫瘤化合物的細胞毒性,重要且較佳為該抗體應具有被內化並轉移至腫瘤細胞中的特性。
抗CDH6抗體可藉由以本技術領域常用的方法用多肽作為抗原對動物進行免疫,然後收集並純化在其活體中產生的抗體來獲得。較佳為使用保留三維結構的CDH6作為抗原。此類方法之實例可包括DNA免疫法。
抗原的來源並不限於人類,因此亦可用源自非人類動物(諸如小鼠或大鼠)的抗原對動物進行免疫。在此情況下,可藉由檢驗所獲得的會結合異源抗原的抗體與人類抗原的交叉反應性來選擇適用於人類疾病的抗體。
此外,產生針對該抗原之抗體的抗體產生細胞可根據已知的方法與骨髓瘤細胞融合(例如,Kohler and Milstein, Nature (1975) 256, 495-497;及Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, 365-367, Plenum Press, N. Y. (1980))來建立融合瘤,以獲得單株抗體。
在下文中,將具體說明獲得針對CDH6的抗體的方法。
(1)抗原的製備
抗原可根據基因操作藉由使宿主細胞產生編碼抗原蛋白的基因來獲得。具體而言,產生能夠表現抗原基因的載體,然後將該載體導入宿主細胞,使該基因在其中表現,之後可純化所表現的抗原。亦可藉由用基於上述基因操作的抗原表現細胞或表現抗原的細胞株對動物進行免疫的方法來獲得抗體。
或者,不使用抗原蛋白,抗體的獲得亦可藉由將抗原蛋白的cDNA併入表現載體中,然後將表現載體投予至待免疫動物,並在因此所免疫的動物體內表現抗原蛋白,從而在其中產生針對抗原蛋白的抗體。
(2)抗CDH6單株抗體的生產
在本發明中使用的抗CDH6抗體沒有特別限制。例如,可適合地使用藉由本案序列表中所示的胺基酸序列所特定的抗體。本發明中使用的抗CDH6抗體期望為具有下述特性的抗體:
(1)一種具有下述特性的抗體:
(a)特異性地結合CDH6、及
(b)具有藉由與CDH6結合而被內化到CDH6表現細胞中的活性;或
(2)如上述(1)的抗體,其中該CDH6為人類CDH6;或
(3)如上述(1)或(2)的抗體,其中該抗體特異性辨識人類CDH6的EC3且具有內化活性。
獲得本發明之針對CDH6的抗體的方法並沒有特別限制,只要可獲得抗CDH6抗體即可。較佳為使用保留其構形的CDH6作為抗原。
獲得抗體的方法的一個較佳實例可包括DNA免疫法。DNA免疫法係一種涉及以抗原表現質體轉染動物(例如小鼠或大鼠)個體,然後在該個體中表現抗原以誘導針對抗原的免疫的方法。轉染方法包括將質體直接注射至肌肉的方法、將轉染試劑(諸如微脂體或聚乙烯亞胺)注射至靜脈的方法、使用病毒載體的方法、使用基因槍注射附著有質體之金顆粒的方法、將大量質體溶液快速注射至靜脈的流體動力學的方法等。關於將表現質體注射至肌肉的轉染方法,一種稱為活體內電穿孔的技術已知係一種改善表現程度的方法,該技術涉及將電穿孔應用於質體的肌內注射部位(Aihara H, Miyazaki J. Nat Biotechnol. 1998 Sep; 16 (9): 867-70或Mir LM, Bureau MF, Gehl J, Rangara R, Rouy D, Caillaud JM, Delaere P, Branellec D, Schwartz B, Scherman D. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 Apr 13; 96 (8): 4262-7)。此方法藉由在質體的肌內注射之前以玻尿酸酶處理肌肉來進一步改善表現程度(McMahon JM1, Signori E, Wells KE, Fazio VM, Wells DJ., Gene Ther. 2001 Aug; 8 (16): 1264-70)。另外,融合瘤生產可藉由已知的方法進行,亦可使用例如Hybrimune融合瘤生產系統(Cyto Pulse Sciences, Inc.)進行。
獲得單株抗體的具體實例可包括下述程序:
(a)可藉由將CDH6 cDNA併入表現載體中來誘導免疫反應(例如,pcDNA3.1;Thermo Fisher Scientific Inc.),並藉由如電穿孔或基因槍等方法將載體直接投予至待免疫動物(例如大鼠或小鼠),以便在該動物體內表現CDH6。如果需要增強抗體力價,藉由電穿孔等之載體的投予可進行一次或多次,較佳為多次;
(b)從免疫反應已被誘導之上述動物中收集含有抗體產生細胞的組織(例如淋巴結);
(c)製備骨髓瘤細胞(以下稱為「骨髓瘤」)(例如小鼠骨髓瘤SP2/0-ag14細胞);
(d)抗體產生細胞及骨髓瘤之間的細胞融合;
(e)選擇產生感興趣之抗體的融合瘤群;
(f)分裂成單細胞殖株(選殖);
(g)可選擇地,培養用於大量生產單株抗體之融合瘤、或繁殖已接種融合瘤的動物;及/或
(h)研究因此產生之單株抗體的生理活性(內化活性)及結合特異性、或檢驗抗體作為標識試劑的特性。
本文使用的用於測量抗體力價的方法的實例可包括但不限於流式細胞測量術及Cell-ELISA。
如此建立的融合瘤株的實例可包括產生抗CDH6抗體的融合瘤rG019、rG055、rG056及rG061。需要注意的是,在本說明中,由產生抗CDH6抗體的融合瘤rG019所產生的抗體被稱為「rG019抗體」或簡單的稱為「rG019」,由融合瘤rG055所產生的抗體被稱為「rG055抗體」或簡單的稱為「rG055」,由融合瘤rG056所產生的抗體被稱為「rG056抗體」或簡單的稱為「rG056」,且由融合瘤rG061所產生的抗體被稱為「rG061抗體」或簡單的稱為「rG061」。
rG019抗體之輕鏈可變區由SEQ ID NO:10所示之胺基酸序列組成。rG019抗體之輕鏈可變區胺基酸序列藉由SEQ ID NO:11所示之核苷酸序列編碼。rG019抗體之輕鏈可變區具有SEQ ID NO:12所示之胺基酸序列所組成之CDRL1、SEQ ID NO:13所示之胺基酸序列所組成之CDRL2、及SEQ ID NO:14所示之胺基酸序列所組成之CDRL3。rG019抗體之重鏈可變區由SEQ ID NO:15所示之胺基酸序列組成。rG019抗體之重鏈可變區胺基酸序列藉由SEQ ID NO:16所示之核苷酸序列編碼。rG019抗體之重鏈可變區具有SEQ ID NO:17所示之胺基酸序列所組成之CDRH1、SEQ ID NO:18所示之胺基酸序列所組成之CDRH2、及SEQ ID NO:19所示之胺基酸序列所組成之CDRH3。rG019抗體之序列顯示於表1。
rG055抗體之輕鏈可變區由SEQ ID NO:20所示之胺基酸序列組成。rG055抗體之輕鏈可變區胺基酸序列藉由SEQ ID NO:21所示之核苷酸序列編碼。rG055抗體之輕鏈可變區具有SEQ ID NO:22所示之胺基酸序列所組成之CDRL1、SEQ ID NO:23所示之胺基酸序列所組成之CDRL2、及SEQ ID NO:24所示之胺基酸序列所組成之CDRL3。rG055抗體之重鏈可變區由SEQ ID NO:25所示之胺基酸序列組成。rG055抗體之重鏈可變區胺基酸序列藉由SEQ ID NO:26所示之核苷酸序列編碼。rG055抗體之重鏈可變區具有SEQ ID NO:27所示之胺基酸序列所組成之CDRH1、SEQ ID NO:28所示之胺基酸序列所組成之CDRH2、及SEQ ID NO:29所示之胺基酸序列所組成之CDRH3。rG055抗體之序列顯示於表1。
rG056抗體之輕鏈可變區由SEQ ID NO:30所示之胺基酸序列組成。rG056抗體之輕鏈可變區胺基酸序列藉由SEQ ID NO:31所示之核苷酸序列編碼。rG056抗體之輕鏈可變區具有SEQ ID NO:32所示之胺基酸序列所組成之CDRL1、SEQ ID NO:33所示之胺基酸序列所組成之CDRL2、及SEQ ID NO:34所示之胺基酸序列所組成之CDRL3。rG056抗體之重鏈可變區由SEQ ID NO:35所示之胺基酸序列組成。rG056抗體之重鏈可變區胺基酸序列藉由SEQ ID NO:36所示之核苷酸序列編碼。rG056抗體之重鏈可變區具有SEQ ID NO:37所示之胺基酸序列所組成之CDRH1、SEQ ID NO:38所示之胺基酸序列所組成之CDRH2、及SEQ ID NO:39所示之胺基酸序列所組成之CDRH3。rG056抗體之序列顯示於表1。
rG061抗體之輕鏈可變區由SEQ ID NO:40所示之胺基酸序列組成。rG061抗體之輕鏈可變區胺基酸序列藉由SEQ ID NO:41所示之核苷酸序列編碼。rG061抗體之輕鏈可變區具有SEQ ID NO:42所示之胺基酸序列所組成之CDRL1、SEQ ID NO:43所示之胺基酸序列所組成之CDRL2、及SEQ ID NO:44所示之胺基酸序列所組成之CDRL3。rG061抗體之重鏈可變區由SEQ ID NO:45所示之胺基酸序列組成。rG061抗體之重鏈可變區胺基酸序列藉由SEQ ID NO:46所示之核苷酸序列編碼。rG061抗體之重鏈可變區具有SEQ ID NO:47所示之胺基酸序列所組成之CDRH1、SEQ ID NO:48所示之胺基酸序列所組成之CDRH2、及SEQ ID NO:49所示之胺基酸序列所組成之CDRH3。rG061抗體之序列顯示於表1。
此外,於再次進行上述「2. 抗CDH6抗體的生產」中的步驟(a)至(h)以獨立分別獲得單株抗體的情況下、以及於藉由其他方法分別獲得單株抗體的情況下,亦可獲得具有與rG019抗體、rG055抗體、rG056抗體或rG061抗體同等的內化活性的抗體。此類抗體的一個實例可包括結合至rG019抗體、rG055抗體、rG056抗體或rG061抗體所結合之相同表位的抗體。若新製備的單株抗體結合至rG019抗體、rG055抗體、rG056抗體或rG061抗體所結合的部分肽或部分三維結構,則可確定該單株抗體結合至rG019抗體、rG055抗體、rG056抗體或rG061抗體所結合的相同表位。此外,藉由確認在抗體與CDH6的結合上,該單株抗體係與rG019抗體、rG055抗體、rG056抗體或rG061抗體競爭(即,該單株抗體干擾rG019抗體、rG055抗體、rG056抗體或rG061抗體與CDH6的結合),可確定該單株抗體結合至抗CDH6抗體所結合的相同表位,即使尚未確定表位的特定序列或結構。當確認該單株抗體結合至rG019抗體、rG055抗體、rG056抗體或rG061抗體所結合的相同表位時,可強烈預期該單株抗體應具有與rG019抗體、rG055抗體、rG056抗體或rG061抗體同等的抗原結合能力、生物活性及/或內化活性。
(3)其他抗體
本發明之抗體亦包括為了降低對人類的異源抗原性而進行人工修飾的基因重組抗體,諸如嵌合抗體、人源化抗體及人類抗體,以及上述針對CDH6的單株抗體。這些抗體可藉由已知方法生產。
嵌合抗體的實例可包括可變區及恆定區彼此異源的抗體,諸如藉由將源自小鼠或大鼠的抗體的可變區與源自人類的恆定區結合而形成的嵌合抗體(參見Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, 6851-6855, (1984))。
衍生自大鼠抗人類CDH6抗體的嵌合抗體的實例包括下述輕鏈及重鏈所組成之抗體:包含本說明所述之各大鼠抗人類CDH6抗體(即,rG019抗體、rG055抗體、rG056抗體或rG061抗體)之輕鏈可變區及源自人類之恆定區的輕鏈;及包含其之重鏈可變區及源自人類之恆定區的重鏈。
衍生自大鼠抗人類CDH6抗體的嵌合抗體的其它實例包括下述輕鏈及重鏈所組成之抗體:包含在本說明所述之各大鼠抗人類CDH6抗體(即,rG019抗體、rG055抗體、rG056抗體或rG061抗體)之輕鏈可變區中具有一至數個胺基酸殘基、1至3個胺基酸殘基、1或2個胺基酸殘基、較佳為1個胺基酸殘基以其他胺基酸殘基取代的輕鏈可變區的輕鏈;及包含在其重鏈可變區中具有一至數個胺基酸殘基、1至3個胺基酸殘基、1或2個胺基酸殘基、較佳為1個胺基酸殘基以其他胺基酸殘基取代的重鏈可變區的重鏈。此抗體可具有任何給定的源自人類之恆定區。
衍生自大鼠抗人類CDH6抗體的嵌合抗體的其它實例包括下述輕鏈及重鏈所組成之抗體:包含在本說明所述之各大鼠抗人類CDH6抗體(即,rG019抗體、rG055抗體、rG056抗體或rG061抗體)之輕鏈可變區的任何1至3個CDR中具有1或2個胺基酸殘基、較佳為1個胺基酸殘基以其他胺基酸殘基取代的輕鏈可變區的輕鏈;及包含在其重鏈可變區的任何1至3個CDR中具有1或2個胺基酸殘基、較佳為1個胺基酸殘基以其他胺基酸殘基取代的重鏈可變區的重鏈。此抗體可具有任何給定的源自人類之恆定區。
衍生自rG019抗體之嵌合抗體的實例包括下述輕鏈及重鏈所組成之抗體:包含由SEQ ID NO:10所示胺基酸序列組成之輕鏈可變區的輕鏈、及包含由SEQ ID NO:15所示胺基酸序列組成之重鏈可變區的重鏈。此抗體可具有任何給定的源自人類之恆定區。
衍生自rG019抗體的嵌合抗體的其它實例包括下述輕鏈及重鏈所組成之抗體:包含在由SEQ ID NO:10所示胺基酸序列組成之輕鏈可變區中具有一至數個胺基酸殘基、1至3個胺基酸殘基、1或2個胺基酸殘基、較佳為1個胺基酸殘基以其他胺基酸殘基取代的輕鏈可變區的輕鏈;及包含在由SEQ ID NO:15所示胺基酸序列組成之重鏈可變區中具有一至數個胺基酸殘基、1至3個胺基酸殘基、1或2個胺基酸殘基、較佳為1個胺基酸殘基以其他胺基酸殘基取代的重鏈可變區的重鏈。此抗體可具有任何給定的源自人類之恆定區。
衍生自rG019抗體的嵌合抗體的其它實例包括下述輕鏈及重鏈所組成之抗體:包含在由SEQ ID NO:10所示胺基酸序列組成之輕鏈可變區的任何1至3個CDR中具有1或2個胺基酸殘基(較佳為1個胺基酸殘基)以其他胺基酸殘基取代的輕鏈可變區的輕鏈;及包含在由SEQ ID NO:15所示胺基酸序列組成之重鏈可變區的任何1至3個CDR中具有1或2個胺基酸殘基(較佳為1個胺基酸殘基)以其他胺基酸殘基取代的重鏈可變區的重鏈。此抗體可具有任何給定的源自人類之恆定區。
衍生自rG019抗體之嵌合抗體的其他實例包括下述輕鏈及重鏈所組成之抗體:包含由SEQ ID NO:10所示胺基酸序列組成之輕鏈可變區的輕鏈、及包含由SEQ ID NO:58所示胺基酸序列組成之重鏈可變區的重鏈。此抗體可具有任何給定的源自人類之恆定區。SEQ ID NO:58所示之胺基酸序列係SEQ ID NO:15所示之胺基酸序列中CDRH2中的半胱胺酸殘基被脯胺酸殘基取代的序列。
衍生自rG019抗體之嵌合抗體的特定實例包括下述輕鏈及重鏈所組成之抗體:由SEQ ID NO:53所示輕鏈全長胺基酸序列組成之輕鏈、及由SEQ ID NO:56所示重鏈全長胺基酸序列組成之重鏈。在本說明中,此嵌合抗人類CDH6抗體被稱為「嵌合G019抗體」、「chG019抗體」或「chG019」。chG019抗體之輕鏈全長胺基酸序列由SEQ ID NO:54所示核苷酸序列編碼,且chG019抗體之重鏈全長胺基酸序列由SEQ ID NO:57所示核苷酸序列編碼。
chG019抗體之輕鏈可變區的胺基酸序列與rG019抗體之輕鏈可變區的胺基酸序列相同,並由SEQ ID NO:10所示胺基酸序列組成。chG019抗體之輕鏈具有由SEQ ID NO:12所示胺基酸序列組成之CDRL1、由SEQ ID NO:13所示胺基酸序列組成之CDRL2及由SEQ ID NO:14所示胺基酸序列組成之CDRL3,其等分別與rG019之輕鏈CDRL1、CDRL2及CDRL3相同。chG019抗體之輕鏈可變區的胺基酸序列由SEQ ID NO:55所示核苷酸序列編碼。
chG019抗體之重鏈可變區的胺基酸序列由SEQ ID NO:58所示之胺基酸序列組成。chG019抗體之重鏈具有SEQ ID NO:17所示之胺基酸序列所組成之CDRH1、SEQ ID NO:60所示之胺基酸序列所組成之CDRH2、及SEQ ID NO:19所示之胺基酸序列所組成之CDRH3。SEQ ID NO:58所示之胺基酸序列係SEQ ID NO:15所示之胺基酸序列中CDRH2中的半胱胺酸殘基被脯胺酸殘基取代的序列。由SEQ ID NO:60所示之胺基酸序列組成的CDRH2為在SEQ ID NO:18所示之rG019 CDRH2中的半胱胺酸殘基被脯胺酸殘基取代的序列。chG019抗體之重鏈可變區胺基酸序列由SEQ ID NO:59所示之核苷酸序列編碼。
chG019抗體之序列顯示於表1。
衍生自大鼠抗人類CDH6抗體rG055抗體之嵌合抗體的實例包括下述輕鏈及重鏈所組成的嵌合抗體:包含由SEQ ID NO:20所示胺基酸序列組成之輕鏈可變區的輕鏈、及包含由SEQ ID NO:25所示胺基酸序列組成之重鏈可變區的重鏈。此抗體可具有任何給定的源自人類之恆定區。
衍生自大鼠抗人類CDH6抗體rG056抗體之嵌合抗體的實例包括下述輕鏈及重鏈所組成的嵌合抗體:包含由SEQ ID NO:30所示胺基酸序列組成之輕鏈可變區的輕鏈、及包含由SEQ ID NO:35所示胺基酸序列組成之重鏈可變區的重鏈。此抗體可具有任何給定的源自人類之恆定區。
衍生自大鼠抗人類CDH6抗體rG061抗體之嵌合抗體的實例包括下述輕鏈及重鏈所組成的嵌合抗體:包含由SEQ ID NO:40所示胺基酸序列組成之輕鏈可變區的輕鏈、及包含由SEQ ID NO:45所示胺基酸序列組成之重鏈可變區的重鏈。此抗體可具有任何給定的源自人類之恆定區。
人源化抗體之實例可包括:藉由僅將互補決定區(CDR)併入源自人類的抗體中而形成的抗體(參見Nature (1986) 321, p. 522-525)、根據CDR移植法(CDR grafting method)藉由將來自一些框架(framework)的胺基酸殘基以及CDR序列併入人類抗體中所形成的抗體(國際公開號WO90/07861)、及藉由修飾一些CDR的胺基酸序列同時保持抗原結合能力而形成的抗體。
在本說明中,衍生自rG019抗體、rG055抗體、rG056抗體、rG061抗體或chG019抗體之人源化抗體並不限於特定人源化抗體,只要該人源化抗體保留rG019抗體、rG055抗體、rG056抗體、rG061抗體或chG019抗體特有的全部6個CDR序列並且具有內化活性即可。此人源化抗體的一些CDR的胺基酸序列可進一步修飾,只要其具有內化活性即可。
chG019抗體之人源化抗體的具體實例可包括下述輕鏈及重鏈之任何給定的組合:包含由選自下述群組之任一胺基酸序列組成之輕鏈可變區的輕鏈,該群組由(1)SEQ ID NO:63或67所示之胺基酸序列、(2)與上述胺基酸序列(1)具有至少95%或更高之同一性的胺基酸序列(較佳為與除了各CDR序列以外的框架區的序列具有至少95%或更高的序列同一性的胺基酸序列)、及(3)在上述胺基酸序列(1)中包含一個或數個胺基酸的刪除、取代或添加的胺基酸序列所組成;及包含由選自下述群組之任一胺基酸序列組成之重鏈可變區的重鏈,該群組由(4)SEQ ID NO:71、75或79所示之胺基酸序列、(5)與上述胺基酸序列(4)具有至少95%或更高之同一性的胺基酸序列(較佳為與除了各CDR序列以外的框架區的序列具有至少95%或更高之序列同一性的胺基酸序列)、及(6)在上述胺基酸序列(4)中包含一個或數個胺基酸的刪除、取代或添加的胺基酸序列所組成。
或者,亦可使用具有人源化重鏈或輕鏈及其他衍生自大鼠抗體或嵌合抗體的鏈的抗體。此類抗體之實例可包括下述輕鏈及重鏈之任何給定的組合:包含由選自下述群組之任一胺基酸序列組成之輕鏈可變區的輕鏈,該群組由(1)SEQ ID NO:63或67所示之胺基酸序列、(2)與上述胺基酸序列(1)具有至少95%或更高之同一性的胺基酸序列(較佳為與除了各CDR序列以外的框架區的序列具有至少95%或更高的序列同一性的胺基酸序列)、及(3)在上述胺基酸序列(1)中包含一個或數個胺基酸的刪除、取代或添加的胺基酸序列所組成;及包含由選自下述群組之任一胺基酸序列組成之重鏈可變區的重鏈,該群組由(4)SEQ ID NO:15、25、35、45或58所示之胺基酸序列、(5)與上述胺基酸序列(4)具有至少95%或更高之同一性的胺基酸序列(較佳為與除了各CDR序列以外的框架區的序列具有至少95%或更高之序列同一性的胺基酸序列)、及(6)在上述胺基酸序列(4)中包含一個或數個胺基酸的刪除、取代或添加的胺基酸序列所組成。此類抗體之其他實例可包括下述輕鏈及重鏈之任何給定的組合:包含由選自下述群組之任一胺基酸序列組成之輕鏈可變區的輕鏈,該群組由(1)SEQ ID NO:10、20、30或40所示之胺基酸序列、(2)與上述胺基酸序列(1)具有至少95%或更高之同一性的胺基酸序列(較佳為與除了各CDR序列以外的框架區的序列具有至少95%或更高的序列同一性的胺基酸序列)、及(3)在上述胺基酸序列(1)中包含一個或數個胺基酸的刪除、取代或添加的胺基酸序列所組成;及包含由選自下述群組之任一胺基酸序列組成之重鏈可變區的重鏈,該群組由(4)SEQ ID NO:71、75或79所示之胺基酸序列、(5)與上述胺基酸序列(4)具有至少95%或更高之同一性的胺基酸序列(較佳為與除了各CDR序列以外的框架區的序列具有至少95%或更高之序列同一性的胺基酸序列)、及(6)在上述胺基酸序列(4)中包含一個或數個胺基酸的刪除、取代或添加的胺基酸序列所組成。
本說明中的胺基酸取代較佳為保留式胺基酸取代。保留式胺基酸取代係發生在與某些胺基酸側鏈相關的胺基酸群組內的取代。較佳的胺基酸群組如下:酸性群組=天冬胺酸及麩胺酸;鹼性群組=離胺酸、精胺酸及組胺酸;非極性群組=丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、及色胺酸;及不帶電的極性家族=甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸及酪胺酸。其他較佳胺基酸群組如下:脂族羥基群組=絲胺酸及蘇胺酸;含醯胺的群組=天冬醯胺酸及麩醯胺酸;脂族群組=丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸;及芳族群組=苯丙胺酸、色胺酸及酪胺酸。此類胺基酸取代較佳在不損害具有原始胺基酸序列的物質之性質的情況下進行。
具有上述輕鏈及重鏈之較佳組合的抗體實例包括下述輕鏈及重鏈所組成之抗體:具有SEQ ID NO:63所示之輕鏈可變區胺基酸序列的輕鏈(在本說明中,亦稱為hL02輕鏈可變區胺基酸序列)或具有SEQ ID NO:67所示之輕鏈可變區胺基酸序列的輕鏈(在本說明中,亦稱為hL03輕鏈可變區胺基酸序列);及具有SEQ ID NO:71所示之重鏈可變區胺基酸序列的重鏈(在本說明中,亦稱為hH01重鏈可變區胺基酸序列)、具有SEQ ID NO:75所示之重鏈可變區胺基酸序列的重鏈(在本說明中,亦稱為hH02重鏈可變區胺基酸序列)或具有SEQ ID NO:79所示之重鏈可變區胺基酸序列的重鏈(在本說明中,亦稱為hH04重鏈可變區胺基酸序列)。其較佳實例包括:具有SEQ ID NO:63所示之輕鏈可變區胺基酸序列的輕鏈及具有SEQ ID NO:71所示之重鏈可變區胺基酸序列的重鏈所組成的抗體;具有SEQ ID NO:63所示之輕鏈可變區胺基酸序列的輕鏈及具有SEQ ID NO:75所示之重鏈可變區胺基酸序列的重鏈所組成的抗體;具有SEQ ID NO:63所示之輕鏈可變區胺基酸序列的輕鏈及具有SEQ ID NO:79所示之重鏈可變區胺基酸序列的重鏈所組成的抗體;具有SEQ ID NO:67所示之輕鏈可變區胺基酸序列的輕鏈及具有SEQ ID NO:71所示之重鏈可變區胺基酸序列的重鏈所組成的抗體;具有SEQ ID NO:67所示之輕鏈可變區胺基酸序列的輕鏈及具有SEQ ID NO:75所示之重鏈可變區胺基酸序列的重鏈所組成的抗體;以及具有SEQ ID NO:67所示之輕鏈可變區胺基酸序列的輕鏈及具有SEQ ID NO:79所示之重鏈可變區胺基酸序列的重鏈所組成的抗體。其更佳實例包括:具有SEQ ID NO:63所示之輕鏈可變區胺基酸序列的輕鏈及具有SEQ ID NO:71所示之重鏈可變區胺基酸序列的重鏈所組成的抗體;具有SEQ ID NO:63所示之輕鏈可變區胺基酸序列的輕鏈及具有SEQ ID NO:75所示之重鏈可變區胺基酸序列的重鏈所組成的抗體;具有SEQ ID NO:63所示之輕鏈可變區胺基酸序列的輕鏈及具有SEQ ID NO:79所示之重鏈可變區胺基酸序列的重鏈所組成的抗體;以及具有SEQ ID NO:67所示之輕鏈可變區胺基酸序列的輕鏈及具有SEQ ID NO:75所示之重鏈可變區胺基酸序列的重鏈所組成的抗體。
具有上述輕鏈及重鏈的較佳組合之抗體的其他實例包括下述輕鏈及重鏈所組成之抗體:由SEQ ID NO:61所示輕鏈全長胺基酸序列中位置21至233之胺基酸序列組成的輕鏈(在本說明中,亦稱為hL02輕鏈全長胺基酸序列)或由SEQ ID NO:65所示輕鏈全長胺基酸序列中位置21至233之胺基酸序列組成的輕鏈(在本說明中,亦稱為hL03輕鏈全長胺基酸序列);及由SEQ ID NO:69所示重鏈全長胺基酸序列中位置20至471之胺基酸序列組成的重鏈(在本說明中,亦稱為hH01重鏈全長胺基酸序列)、由SEQ ID NO:73所示重鏈全長胺基酸序列中位置20至471之胺基酸序列組成的重鏈(在本說明中,亦稱為hH02重鏈全長胺基酸序列)或由SEQ ID NO:77所示重鏈全長胺基酸序列中位置20至471之胺基酸序列組成的重鏈(在本說明中,亦稱為hH04重鏈全長胺基酸序列)。其較佳實例包括:由SEQ ID NO:61所示輕鏈全長胺基酸序列中位置21至233之胺基酸序列組成的輕鏈及由SEQ ID NO:69所示重鏈全長胺基酸序列中位置20至471之胺基酸序列組成的重鏈所組成的抗體;由SEQ ID NO:61所示輕鏈全長胺基酸序列中位置21至233之胺基酸序列組成的輕鏈及由SEQ ID NO:73所示重鏈全長胺基酸序列中位置20至471之胺基酸序列組成的重鏈所組成的抗體;由SEQ ID NO:61所示輕鏈全長胺基酸序列中位置21至233之胺基酸序列組成的輕鏈及由SEQ ID NO:77所示重鏈全長胺基酸序列中位置20至471之胺基酸序列組成的重鏈所組成的抗體;由SEQ ID NO:65所示輕鏈全長胺基酸序列中位置21至233之胺基酸序列組成的輕鏈及由SEQ ID NO:69所示重鏈全長胺基酸序列中位置20至471之胺基酸序列組成的重鏈所組成的抗體;由SEQ ID NO:65所示輕鏈全長胺基酸序列中位置21至233之胺基酸序列組成的輕鏈及由SEQ ID NO:73所示重鏈全長胺基酸序列中位置20至471之胺基酸序列組成的重鏈所組成的抗體;以及由SEQ ID NO:65所示輕鏈全長胺基酸序列中位置21至233之胺基酸序列組成的輕鏈及由SEQ ID NO:77所示重鏈全長胺基酸序列中位置20至471之胺基酸序列組成的重鏈所組成的抗體。其更佳實例包括:由SEQ ID NO:61所示輕鏈全長胺基酸序列中位置21至233之胺基酸序列組成的輕鏈及由SEQ ID NO:69所示重鏈全長胺基酸序列中位置20至471之胺基酸序列組成的重鏈所組成的抗體(在本說明中,亦稱為「H01L02抗體」或「H01L02」);由SEQ ID NO:61所示輕鏈全長胺基酸序列中位置21至233之胺基酸序列組成的輕鏈及由SEQ ID NO:73所示重鏈全長胺基酸序列中位置20至471之胺基酸序列組成的重鏈所組成的抗體(在本說明中,亦稱為「H02L02抗體」或「H02L02」);由SEQ ID NO:61所示輕鏈全長胺基酸序列中位置21至233之胺基酸序列組成的輕鏈及由SEQ ID NO:77所示重鏈全長胺基酸序列中位置20至471之胺基酸序列組成的重鏈所組成的抗體(在本說明中,亦稱為「H04L02抗體」或「H04L02」);以及由SEQ ID NO:65所示輕鏈全長胺基酸序列中位置21至233之胺基酸序列組成的輕鏈及由SEQ ID NO:73所示重鏈全長胺基酸序列中位置20至471之胺基酸序列組成的重鏈所組成的抗體(在本說明中,亦稱為「H02L03抗體」或「H02L03」)。H01L02抗體、H02L02抗體、H02L03抗體或H04L02抗體之序列顯示於表1。
藉由組合與上述重鏈胺基酸序列及輕鏈胺基酸序列顯示高同一性的序列,可選擇具有與上述各抗體同等的生物活性的抗體。此類同一性通常為80%以上、較佳為90%以上、更佳為95%以上、最佳為99%以上的同一性。此外,藉由組合相對於該重鏈及輕鏈的胺基酸序列包含其一個或數個胺基酸殘基的取代、刪除或添加之重鏈及輕鏈的胺基酸序列,亦可選擇具有與上述各抗體同等的生物活性的抗體。
可藉由使用Clustal W第2版的系統內定參數比對序列來確定兩種類型的胺基酸序列之間的同一性(Larkin MA, Blackshields G, Brown NP, Chenna R, McGettigan PA, McWilliam H, Valentin F, Wallace IM, Wilm A, Lopez R, Thompson JD, Gibson TJ and Higgins DG (2007),"Clustal W and Clustal X version 2.0", Bioinformatics. 23 (21): 2947-2948)。
需要注意的是,在SEQ ID NO:61所示之hL02輕鏈全長胺基酸序列中,由位置1至20的胺基酸殘基組成之胺基酸序列為訊息序列,由位置21至128的胺基酸殘基組成之胺基酸序列為可變區,且由位置129至233的胺基酸殘基組成之胺基酸序列為恆定區。在SEQ ID NO:62所示之hL02輕鏈全長核苷酸序列中,由位置1至60的核苷酸組成之核苷酸序列編碼訊息序列,由位置61至384的核苷酸組成之核苷酸序列編碼可變區,且由位置385至699的核苷酸組成之核苷酸序列編碼恆定區。
在SEQ ID NO:65所示之hL03輕鏈全長胺基酸序列中,由位置1至20的胺基酸殘基組成之胺基酸序列為訊息序列,由位置21至128的胺基酸殘基組成之胺基酸序列為可變區,且由位置129至233的胺基酸殘基組成之胺基酸序列為恆定區。在SEQ ID NO:66所示之hL03輕鏈全長核苷酸序列中,由位置1至60的核苷酸組成之核苷酸序列編碼訊息序列,由位置61至384的核苷酸組成之核苷酸序列編碼可變區,且由位置385至699的核苷酸組成之核苷酸序列編碼恆定區。
在SEQ ID NO:69所示之hH01重鏈全長胺基酸序列中,由位置1至19的胺基酸殘基組成之胺基酸序列為訊息序列,由位置20至141的胺基酸殘基組成之胺基酸序列為可變區,且由位置142至471的胺基酸殘基組成之胺基酸序列為恆定區。在SEQ ID NO:70所示之hL01重鏈全長核苷酸序列中,由位置1至57的核苷酸組成之核苷酸序列編碼訊息序列,由位置58至423的核苷酸組成之核苷酸序列編碼可變區,且由位置424至1413的核苷酸組成之核苷酸序列編碼恆定區。
在SEQ ID NO:73所示之hH02重鏈全長胺基酸序列中,由位置1至19的胺基酸殘基組成之胺基酸序列為訊息序列,由位置20至141的胺基酸殘基組成之胺基酸序列為可變區,且由位置142至471的胺基酸殘基組成之胺基酸序列為恆定區。在SEQ ID NO:74所示之hL02重鏈全長核苷酸序列中,由位置1至57的核苷酸組成之核苷酸序列編碼訊息序列,由位置58至423的核苷酸組成之核苷酸序列編碼可變區,且由位置424至1413的核苷酸組成之核苷酸序列編碼恆定區。
在SEQ ID NO:77所示之hH04重鏈全長胺基酸序列中,由位置1至19的胺基酸殘基組成之胺基酸序列為訊息序列,由位置20至141的胺基酸殘基組成之胺基酸序列為可變區,且由位置142至471的胺基酸殘基組成之胺基酸序列為恆定區。在SEQ ID NO:78所示之hH04重鏈全長核苷酸序列中,由位置1至57的核苷酸組成之核苷酸序列編碼訊息序列,由位置58至423的核苷酸組成之核苷酸序列編碼可變區,且由位置424至1413的核苷酸組成之核苷酸序列編碼恆定區。
在本說明中,表1-1至1-16亦統稱為表1。
本發明之抗體的進一步實例可包括結合至CDH6的人類抗體。抗CDH6人類抗體意指僅具有來自人類染色體之抗體的基因序列的人類抗體。抗CDH6人類抗體可藉由使用產生人類抗體之小鼠的方法獲得,該小鼠具有包含人類抗體的重鏈及輕鏈基因之人類染色體片段(參見Tomizuka, K. et al., Nature Genetics (1997) 16, p. 133-143;Kuroiwa, Y. et al., Nucl. Acids Res. (1998) 26, p. 3447-3448;Yoshida, H. et al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects vol. 10, p. 69-73 (Kitagawa, Y., Matsuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999;Tomizuka, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, p. 722-727等)。
此類產生人類抗體的小鼠可藉由使用基改動物而特異性地產生,其中內源性免疫球蛋白重鏈及輕鏈的基因座被破壞,然後作為代替而使用酵母人工染色體(YAC)載體等導入人類免疫球蛋白重鏈及輕鏈的基因座,然後從此類基改動物中產生出基因剔除動物及轉基因動物,然後將這些動物相互繁殖。
另外,抗CDH6人類抗體亦可藉由下述而獲得:以編碼此類人類抗體的各重鏈及輕鏈的cDNA、或者較佳為以包含該cDNA的載體,根據基因重組技術將真核細胞轉形,然後培養產生基改人類單株抗體的經轉形的細胞,從而從培養上清液中獲得抗體。
在此情況下,真核細胞、較佳為哺乳動物細胞(例如CHO細胞、淋巴細胞或骨髓瘤)可例如被用作宿主。
此外,亦已知一種獲得衍生自噬菌體顯示的人類抗體的方法,該抗體選自人類抗體庫(參見Wormstone, I. M. et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002) 43 (7), p. 2301-2308;Carmen, S. et al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), p. 189-203;Siriwardena, D. et al., Ophthalmology (2002) 109 (3), p. 427-431等)。
例如,可應用噬菌體顯示法,該方法包含使人類抗體的可變區作為單鏈抗體(scFv)在噬菌體表面上表現,然後選擇與抗原結合的噬菌體(Nature Biotechnology (2005), 23, (9), p. 1105-1116)。
藉由分析因其與抗原的結合能力而選擇的噬菌體基因,可確定編碼與抗原結合的人類抗體可變區的DNA序列。
一旦確定與抗原結合的scFv的DNA序列,就生產具有上述序列的表現載體,然後將生產的表現載體導入適當的宿主並使其在其中表現,從而獲得人類抗體(國際公開號WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438及WO95/15388、Annu. Rev. Immunol (1994) 12, p. 433-455、Nature Biotechnology (2005) 23 (9), p. 1105-1116)。
若新產生的人類抗體係與本說明所述的任一種大鼠抗人類CDH6抗體、嵌合抗人類CDH6抗體或人源化抗人類CDH6抗體(例如,rG019抗體、rG055抗體、rG056抗體、rG061抗體、chG019抗體、H01L02抗體、H02L02抗體、H02L03抗體或H04L02抗體)所結合的部分肽或部分三維結構結合,則可確定該人類抗體係與大鼠抗人類CDH6抗體、嵌合抗人類CDH6抗體或人源化抗人類CDH6抗體所結合的相同表位結合。或者,藉由確認在抗體與CDH6的結合中,該人類抗體係與本說明所述之大鼠抗人類CDH6抗體、嵌合抗人類CDH6抗體或人源化抗人類CDH6抗體(例如,rG019抗體、rG055抗體、rG056抗體、rG061抗體、chG019抗體、H01L02抗體、H02L02抗體、H02L03抗體或H04L02抗體)競爭(例如,該人類抗體干擾rG019抗體、rG055抗體、rG056抗體、rG061抗體、chG019抗體、H01L02抗體、H02L02抗體、H02L03抗體或H04L02抗體與CDH6的結合,較佳為與CDH6之EC3的結合),可確定該人類抗體結合至本說明所述大鼠抗人類CDH6抗體、嵌合抗人類CDH6抗體或人源化抗人類CDH6抗體所結合之相同表位,即使尚未確定該表位的特定序列或結構。在本說明中,當藉由這些確定方法中的至少一種而確定該人類抗體「結合相同的表位」時,得出的結論為:該新製備的人類抗體與本說明所述的大鼠抗人類CDH6抗體、嵌合抗人類CDH6抗體或人源化抗人類CDH6抗體「結合相同的表位」。當確認該人類抗體結合至相同表位時,則預期該人類抗體應具有與大鼠抗人類CDH6抗體、嵌合抗人類CDH6抗體或人源化抗人類CDH6抗體(例如,rG019抗體、rG055抗體、rG056抗體、rG061抗體、chG019抗體、H01L02抗體、H02L02抗體、H02L03抗體或H04L02抗體)同等的生物活性。
藉由上述方法所獲得之嵌合抗體、人源化抗體或人類抗體係根據已知的方法等而評估彼等對於抗原的結合活性,以便可選擇較佳的抗體。
用於比較抗體特性的另一指標的一個實例可包括抗體的穩定性。示差掃描熱析儀(DSC)係一種能夠迅速準確地測量熱變性中點(Tm)的儀器,該熱變性中點(Tm)係作為蛋白質相對結構穩定性的良好指標。藉由使用DSC測量Tm值並對獲得的值進行比較,可比較熱穩定性的差異。已知抗體的保存穩定性與抗體的熱穩定性有一定的相關性(Lori Burton, et al., Pharmaceutical Development and Technology (2007) 12, p. 265-273),因此,可使用熱穩定性作為指標來選擇較佳的抗體。用於選擇抗體的指標的其他實例可包括在適合的宿主細胞中的高產量及在水溶液中的低凝集性。例如,因為產量最高的抗體並不總顯示最高的熱穩定性,而需要藉由基於上述指標進行綜合判斷,來選擇最適合投予至人體的抗體。
本發明的抗體亦包括抗體的修飾。修飾用以意指經化學或生物修飾之本發明的抗體。此類化學修飾之實例包括化學部分與胺基酸骨架的結合、及N-連接型或O-連接型碳水化合物鏈的化學修飾。此類生物修飾之實例包括經轉譯後修飾(例如,N-連接型或O-連接型醣基化、N端或C端加工、去醯胺化、天冬胺酸異構化、甲硫胺酸氧化、及N端麩醯胺酸或N端麩胺酸轉化為焦麩胺酸)的抗體、及其N端添加甲硫胺酸殘基而造成允許使用原核宿主細胞表現的抗體。此外,此類修飾亦意指包括為了能夠檢測或單離本發明之抗體或抗原的經標識的抗體,例如經酵素標識的抗體、經螢光標識的抗體及經親和力標識的抗體。本發明之抗體的此類修飾對於抗體在血液中的穩定性及滯留的改善;抗原性降低;抗體或抗原之檢測或單離等是有用的。
此外,藉由調節與本發明之抗體結合的糖鏈修飾(醣基化、去岩藻醣基化(de-fucosylation)等),可增強抗體依賴性細胞毒殺活性。作為調節抗體糖鏈修飾的技術,已知於國際公開號WO1999/54342、WO2000/61739、及WO2002/31140等中所述的技術,但該技術不限於此。本發明的抗體亦包括上述糖鏈修飾經調節的抗體。
一旦單離出抗體基因,可使用宿主及表現載體的適當組合,將該基因導入適當的宿主以產生抗體。抗體基因的具體實例可為編碼本說明所述之抗體的重鏈序列的基因及編碼其中所述之抗體的輕鏈序列的基因的組合。在宿主細胞的轉形時,可將此類重鏈序列基因及輕鏈序列基因插入至單個表現載體中,或者這些基因可代替地各插入至不同表現載體中。
當使用真核細胞作為宿主時,可使用動物細胞、植物細胞或真核微生物。特別是,動物細胞的實例可包括哺乳動物細胞,諸如猴細胞的COS細胞(Gluzman, Y., Cell (1981) 23, p. 175-182, ATCC CRL-1650)、小鼠纖維母細胞NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658)、中國倉鼠卵巢細胞的二氫葉酸還原酶缺陷細胞株(CHO細胞,ATCC CCL-61) (Urlaub, G. and Chasin, L. A. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1980) 77, p. 4126-4220)及FreeStyle 293F細胞(Invitrogen Corp.)。
當使用原核細胞作為宿主時,可例如使用大腸桿菌(
Escherichia coli)或枯草桿菌(
Bacillus subtilis)。
將感興趣的抗體基因導入這些細胞進行轉形,然後將所轉形的細胞進行活體外培養以獲得抗體。在上述培養中,取決於抗體的序列而有產量不同的情況,因此,可使用產量為指標,從具有同等結合活性的抗體中選擇容易作為藥物生產的抗體。因此,本發明的抗體亦包括藉由上述生產抗體的方法獲得的抗體,該方法包含培養經轉形之宿主細胞的步驟及從上述步驟中獲得的培養物中收集感興趣的抗體或該抗體之功能性片段的步驟。
已知在培養的哺乳動物細胞中產生的抗體重鏈羧基端的離胺酸殘基被刪除(Journal of Chromatography A, 705: 129-134 (1995)),而且,亦已知重鏈羧基端的兩個胺基酸殘基甘胺酸及離胺酸被刪除,而新位在羧基端的脯胺酸殘基被醯胺化(Analytical Biochemistry, 360: 75-83 (2007))。然而,這些重鏈序列的此類刪除及修飾不會影響抗體的抗原結合活性及效應功能(補體的活化、抗體依賴性細胞毒性等)。因此,根據本發明之抗體亦包括經上述修飾的抗體及該抗體的功能性片段,此類抗體的具體實例包括在重鏈羧基端處包含1或2個胺基酸刪除的刪除突變體、及藉由將上述刪除突變體醯胺化而形成的刪除突變體(例如,其中在羧基端部位的脯胺酸殘基被醯胺化的重鏈)。然而,涉及根據本發明之抗體在重鏈羧基端的刪除的刪除突變體不限於上述刪除突變體,只要彼等保留抗原結合活性及效應功能即可。構成根據本發明之抗體的兩條重鏈可為選自全長抗體及上述刪除突變體所組成之群組中的任一種類型的重鏈,或可為選自上述群組中的任兩種類型的組合。個別刪除突變體的比率可被產生根據本發明之抗體的培養的哺乳動物細胞之類型及培養條件所影響。根據本發明之抗體的主要成分的實例可包括在兩條重鏈的各羧基端處刪除一個胺基酸殘基的抗體。
本發明抗體之同型的實例可包括IgG (IgG1、IgG2、IgG3及IgG4)。其中以IgG1及IgG4為較佳。
抗體的生物活性的實例通常可包括抗原結合活性、藉由與抗原結合而被內化到表現抗原的細胞中的活性、中和抗原活性的活性、增強抗原活性的活性、抗體依賴性細胞毒殺(ADCC)活性、補體依賴性細胞毒殺(CDC)活性及抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)。根據本發明之抗體的功能係針對CDH6的結合活性,且較佳為藉由與CDH6結合而被內化至CDH6表現細胞中的活性。此外,本發明之抗體可具有ADCC活性、CDC活性及/或ADCP活性、以及細胞的內化活性。
獲得的抗體可純化為均質狀態。對於抗體的分離及純化,可使用用於普通蛋白質的分離及純化方法。例如,適當選擇管柱層析、過濾、超濾、鹽析、透析、製備型聚丙烯醯胺凝膠電泳及等電點聚焦並相互組合,從而可分離及純化抗體(Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996);及Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)),然而分離及純化方法的實例不限於此。
層析的實例可包括親和力層析、離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾層析、逆相層析及吸收層析。
這些層析技術可使用液相層析進行,諸如HPLC或FPLC。
親和力層析中使用的管柱實例可包括蛋白A (Protein A)管柱及蛋白G (Protein G)管柱。涉及使用蛋白A之管柱的實例可包括 Hyper D、POROS及Sepharose F. F. (Pharmacia)。
另外,使用固定有抗原的擔體(carrier),可藉由利用抗體與抗原的結合活性來純化抗體。
3.抗CDH6抗體-藥物結合物
(1)藥物
上述「2.抗CDH6抗體的生產」中所獲得之抗CDH6抗體可經由連接子結構部分與藥物結合以製備抗CDH6抗體-藥物結合物。藥物並無特別限制,只要其具有可與連接子結構連結的取代基或部分結構即可。抗CDH6抗體-藥物結合物可根據結合的藥物而用於各種目的。此類藥物的實例可包括具有抗腫瘤活性的物質、對血液疾病有效的物質、對自體免疫疾病有效的物質、抗發炎物質、抗菌物質、抗真菌物質、抗寄生蟲物質、抗病毒物質及抗麻醉物質。
(1)-1抗腫瘤化合物
使用抗腫瘤化合物作為在本發明之抗CDH6抗體-藥物結合物中所結合之化合物的實例將於以下進行說明。抗腫瘤化合物並無特別限制,只要該化合物具有抗腫瘤作用且具有可與連接子結構連結的取代基或部分結構即可。當在腫瘤細胞中連接子的部分或全部斷裂時,抗腫瘤化合物部分被釋放,從而該抗腫瘤化合物展現抗腫瘤作用。由於連接子在與藥物的連結位置處斷裂,抗腫瘤化合物以其原始結構被釋放,發揮其原有的抗腫瘤作用。
上述「2.抗CDH6抗體的生產」中所獲得之抗CDH6抗體可經由連接子結構部分與抗腫瘤化合物結合以製備抗CDH6抗體-藥物結合物。
作為用於本發明的抗腫瘤化合物的一個實例,可較佳地使用依喜替康,其為一種喜樹鹼(camptothecin)衍生物(由下式表示之(1S,9S)-1-胺基-9-乙基-5-氟-2,3-二氫-9-羥基-4-甲基-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3',4':6,7]吲并[1,2-b]喹啉-10,13(9H,15H)-二酮)。
該化合物可藉由例如美國專利公開號US2016/0297890中所述的方法或其他已知方法容易地獲得,且在1-位的胺基可較佳地用作與連接子結構的連結位置。又,依喜替康可部分連接子仍附著於其上而在腫瘤細胞中被釋放。然而,即使在這樣的狀態下,該化合物也發揮優異的抗腫瘤作用。
由於依喜替康具有喜樹鹼結構,因此已知平衡在酸性水性介質(例如,pH 3左右)中移至具有形成的內酯環(閉環)的結構,而平衡在鹼性水性介質(例如,pH 10左右)中移至具有已開環的內酯環(開環)的結構。亦預期導入有對應於此類閉環結構及開環結構的依喜替康殘基的藥物結合物具有同等的抗腫瘤作用,更不用說任何這樣的藥物結合物皆包括在本發明的範疇內。
抗腫瘤化合物的其他實例可包括文獻中所述的抗腫瘤化合物(Pharmacological Reviews, 68, p. 3-19, 2016)。其具體實例可包括多柔比星、卡奇黴素(calicheamicin)、尾海兔素10 (dolastatin 10)、奧瑞他汀類(諸如單甲基奧瑞他汀E (MMAE)及單甲基奧瑞他汀F (MMAF))、美登素類(maytansinoids)(諸如DM1及DM4)、吡咯并苯二氮呯(pyrrolobenzodiazepine)二聚物SG2000 (SJG-136)、喜樹鹼衍生物SN-38、雙卡黴素類(duocarmycins)(諸如CC-1065)、瓢菌素(amanitin)、道諾黴素、絲裂黴素C、博萊黴素、環胞苷(cyclocytidine)、長春新鹼、長春花鹼、胺甲喋呤、鉑類抗腫瘤劑(順鉑及其衍生物)、以及紫杉醇及其衍生物。
在抗體-藥物結合物中,每個抗體分子結合的藥物分子數量係影響其效力及安全性的關鍵因素。抗體-藥物結合物的生產係藉由特定反應條件進行,諸如用於反應的起始材料及試劑的量,以達成恆定數量的結合的藥物分子。與低分子量化合物的化學反應不同,通常會得到含有不同數量的結合的藥物分子的混合物。每個抗體分子之結合的藥物分子數量被定義並表示為平均值,即結合的藥物分子的平均數量。除非另有指明,即,除了表示被包括在具有不同數量的結合的藥物分子的抗體-藥物結合物混合物中之具有特定數量的結合的藥物分子的抗體-藥物結合物的情況,該根據本發明之結合的藥物分子的數量通常亦意指平均值。與抗體分子結合的依喜替康分子的數量係可控制的,且作為每個抗體結合的藥物分子的平均數量,約可結合1至10個依喜替康分子。依喜替康分子數量較佳為2至8個、3至8個、4至8個、5至8個、6至8個、或7至8個,更佳為5至8個,進一步更佳為7至8個,進一步更佳為8個。需要注意的是,本技術領域中具有通常知識者可基於本案實施例的說明來設計將所需數量的藥物分子結合至抗體分子上的反應,且可獲得具有控制數量的結合的依喜替康分子的抗體-藥物結合物。
(2)連接子結構
將說明在本發明之抗CDH6抗體-藥物結合物中連接藥物至抗CDH6抗體的連接子結構。
在本案之抗體-藥物結合物中,連接抗CDH6抗體至藥物的連接子結構沒有特別限制,只要所產生的抗體-藥物結合物可使用即可。可根據使用目的適當選擇並使用連接子結構。連接子結構的一個實例可包括已知文獻中所述之連接子(Pharmacol Rev 68: 3-19, January 2016, Protein Cell DOI 10.1007/s13238-016-0323-0, etc.)。其進一步具體實例可包括VC(纈胺酸-瓜胺酸)、MC (馬來醯亞胺基己醯基)、SMCC(4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸琥珀醯亞胺基酯)、SPP(4-(2-吡啶基二硫基)戊酸N-琥珀醯亞胺基酯、SS(雙硫鍵)、SPDB (4-(2-吡啶基二硫基)丁酸N-琥珀醯亞胺基酯、SS/腙、腙及碳酸酯。
另一實例可包括美國專利公開號US2016/0297890所述之連接子結構(作為一實例,於其段落[0260]至[0289]中所述者)。可較佳地使用以下給定的任何連接子結構。需要注意的是,該結構的左端係與抗體的連結位置,其右端係與藥物的連結位置。再者,在以下給定之連接子結構中GGFG表示由通過肽鍵連接之甘胺酸-甘胺酸-苯丙胺酸-甘胺酸(GGFG)組成的胺基酸序列。
-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH
2CH
2-C(=O)-GGFG-NH-CH
2CH
2CH
2-C(=O)-、
-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH
2CH
2CH
2CH
2CH
2-C(=O)-GGFG-NH-CH
2CH
2CH
2-C(=O)-、
-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH
2CH
2CH
2CH
2CH
2-C(=O)-GGFG-NH-CH
2-O-CH
2-C(=O)-、
-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH
2CH
2CH
2CH
2CH
2-C(=O)-GGFG-NH-CH
2CH
2-O-CH
2-C(=O)-、
-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH
2CH
2-C(=O)-NH-CH
2CH
2O-CH
2CH
2O-CH
2CH
2-C(=O)-GGFG-NH-CH
2CH
2CH
2-C(=O)-、及
-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH
2CH
2-C(=O)-NH-CH
2CH
2O-CH
2CH
2O-CH
2CH
2O-CH
2CH
2O-CH
2CH
2-C(=O)-GGFG-NH-CH
2CH
2CH
2-C(=O)-。
更佳為下列:
-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH
2CH
2CH
2CH
2CH
2-C(=O)-GGFG-NH-CH
2-O-CH
2-C(=O)-、
-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH
2CH
2CH
2CH
2CH
2-C(=O)-GGFG-NH-CH
2CH
2-O-CH
2-C(=O)-、及
-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH
2CH
2-C(=O)-NH-CH
2CH
2O-CH
2CH
2O-CH
2CH
2-C(=O)-GGFG-NH-CH
2CH
2CH
2-C(=O)-。
更佳為下列:
-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH
2CH
2CH
2CH
2CH
2-C(=O)-GGFG-NH-CH
2-O-CH
2-C(=O)-、及
-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH
2CH
2-C(=O)-NH-CH
2CH
2O-CH
2CH
2O-CH
2CH
2-C(=O)-GGFG-NH-CH
2CH
2CH
2-C(=O)-。
抗體被連結至-(琥珀醯亞胺-3-基-N)端(例如,「-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH
2CH
2CH
2CH
2CH
2-C(=O)-GGFG-NH-CH
2-O-CH
2-C(=O)-」中與-CH
2CH
2CH
2CH
2CH
2-所連結的那端相反的一端(左端)),且抗腫瘤化合物被連結至與抗體所連結的-(琥珀醯亞胺-3-基-N)那端相反的一端(在上述實例中,在右端之CH
2-O-CH
2-C(=O)-的羰基)。「-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-」具有下式表示之結構:
此部分結構的3-位係與抗CDH6抗體的連結位置。此在3-位與抗體的連結的特徵在於形成硫醚鍵。此結構部分之1-位的氮原子係與包括該結構之連接子內的亞甲基的碳原子連結。
在具有依喜替康作為藥物之本發明的抗體-藥物結合物中,對於與抗體結合,較佳為具有以下給定之任何結構的藥物-連接子結構部分。對於這些藥物-連接子結構部分,每個抗體結合的平均數量可為1至10個,較佳為2至8個,更佳為5至8個,進一步更佳為7至8個,進一步更佳為8個。
-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH
2CH
2-C(=O)-GGFG-NH-CH
2CH
2CH
2-C(=O)-(NH-DX)、
-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH
2CH
2CH
2CH
2CH
2-C(=O)-GGFG-NH-CH
2CH
2CH
2-C(=O)-(NH-DX)、
-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH
2CH
2CH
2CH
2CH
2-C(=O)-GGFG-NH-CH
2-O-CH
2-C(=O)-(NH-DX)、
-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH
2CH
2CH
2CH
2CH
2-C(=O)-GGFG-NH-CH
2CH
2-O-CH
2-C(=O)-(NH-DX)、
-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH
2CH
2-C(=O)-NH-CH
2CH
2O-CH
2CH
2O-CH
2CH
2-C(=O)-GGFG-NH-CH
2CH
2CH
2-C(=O)-(NH-DX)、及
-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH
2CH
2-C(=O)-NH-CH
2CH
2O-CH
2CH
2O-CH
2CH
2O-CH
2CH
2O-CH
2CH
2-C(=O)-GGFG-NH-CH
2CH
2CH
2-C(=O)-(NH-DX)。
更佳為下列:
-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH
2CH
2CH
2CH
2CH
2-C(=O)-GGFG-NH-CH
2-O-CH
2-C(=O)-(NH-DX)、
-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH
2CH
2CH
2CH
2CH
2-C(=O)-GGFG-NH-CH
2CH
2-O-CH
2-C(=O)-(NH-DX)、及
-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH
2CH
2-C(=O)-NH-CH
2CH
2O-CH
2CH
2O-CH
2CH
2-C(=O)-GGFG-NH-CH
2CH
2CH
2-C(=O)-(NH-DX)。
更佳為下列:
-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH
2CH
2CH
2CH
2CH
2-C(=O)-GGFG-NH-CH
2-O-CH
2-C(=O)-(NH-DX)、及
-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH
2CH
2-C(=O)-NH-CH
2CH
2O-CH
2CH
2O-CH
2CH
2-C(=O)-GGFG-NH-CH
2CH
2CH
2-C(=O)-(NH-DX)。
-(NH-DX)具有下式表示的結構:
且其表示一個藉由從依喜替康之1-位的胺基上去除一個氫原子所衍生的基團。
(3)產生抗體-藥物結合物的方法
可用於本發明之抗體-藥物結合物的抗體並未特別限制,只要其為具有內化活性的抗CDH6抗體或該抗體的功能性片段即可,如上述章節「2.抗CDH6抗體的生產」及實施例所述。
接下來,將說明生產本發明的抗體-藥物結合物的典型方法。需要注意的是,在以下的說明中,使用各反應流程圖中所示的「化合物編號」來表示化合物。具體而言,將各化合物稱為「式(1)化合物」、「化合物(1)」等。對於其他化合物編號亦為如此。
(3)-1生產方法1
以下給定之式(1)表示之其中抗CDH6抗體經由硫醚連結至連接子結構的抗體-藥物結合物可藉由使具有藉由抗CDH6抗體之還原而從雙硫鍵轉化的硫氫基的抗體與化合物(2)反應來生產,化合物(2)可藉由已知方法獲得(例如,可藉由在專利公開文獻US2016/297890中所述之方法獲得(例如,在段落[0336]至[0374]所述之方法))。例如,此抗體-藥物結合物可藉由下述方法生產。
其中AB表示具有硫氫基之抗體,其中
L
1具有-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-表示之結構,且
L
1'表示下式表示之馬來醯亞胺基。
-L
1-L
X具有下述任一式表示之結構:
-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH
2CH
2-C(=O)-GGFG-NH-CH
2CH
2CH
2-C(=O)-、
-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH
2CH
2CH
2CH
2CH
2-C(=O)-GGFG-NH-CH
2CH
2CH
2-C(=O)-、
-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH
2CH
2CH
2CH
2CH
2-C(=O)-GGFG-NH-CH
2-O-CH
2-C(=O)-、
-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH
2CH
2CH
2CH
2CH
2-C(=O)-GGFG-NH-CH
2CH
2-O-CH
2-C(=O)-、
-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH
2CH
2-C(=O)-NH-CH
2CH
2O-CH
2CH
2O-CH
2CH
2-C(=O)-GGFG-NH-CH
2CH
2CH
2-C(=O)-、及
-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH
2CH
2-C(=O)-NH-CH
2CH
2O-CH
2CH
2O-CH
2CH
2O-CH
2CH
2O-CH
2CH
2-C(=O)-GGFG-NH-CH
2CH
2CH
2-C(=O)-。
其中,更佳為下列:
-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH
2CH
2CH
2CH
2CH
2-C(=O)-GGFG-NH-CH
2-O-CH
2-C(=O)-、
-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH
2CH
2CH
2CH
2CH
2-C(=O)-GGFG-NH-CH
2CH
2-O-CH
2-C(=O)-、及
-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH
2CH
2-C(=O)-NH-CH
2CH
2O-CH
2CH
2O-CH
2CH
2-C(=O)-GGFG-NH-CH
2CH
2CH
2-C(=O)-。
更佳為下列:
-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH
2CH
2CH
2CH
2CH
2-C(=O)-GGFG-NH-CH
2-O-CH
2-C(=O)-、及
-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH
2CH
2-C(=O)-NH-CH
2CH
2O-CH
2CH
2O-CH
2CH
2-C(=O)-GGFG-NH-CH
2CH
2CH
2-C(=O)-。
在上述反應流程圖中,抗體-藥物結合物(1)可被理解為具有一結構,其中從藥物至連接子端的一個結構部分與一個抗體連結。然而,此說明係為了方便起見,實際上有許多多個上述結構部分連結至一個抗體分子的情況。對於下述生產方法的說明亦為如此。
具體而言,抗體-藥物結合物(1)可藉由下述而生產:使可藉由已知方法獲得之化合物(2)(例如,可藉由專利公開文獻US2016/297890中所述之方法獲得(例如,可藉由段落[0336]至[0374]中所述之方法獲得))與具有硫氫基的抗體(3a)反應。
具有硫氫基之抗體(3a)可藉由本技術領域中具有通常知識者熟知方法獲得(Hermanson, G.T, Bioconjugate Techniques, pp. 56-136, pp. 456-493, Academic Press (1996))。該方法的實例可包括但不限於:特勞特試劑(Traut's reagent)與抗體的胺基反應;S-乙醯硫代鏈烷酸N-琥珀醯亞胺基酯與抗體的胺基反應,之後與羥胺反應;3-(吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀醯亞胺基酯與抗體反應,之後與還原劑反應;抗體與諸如二硫蘇糖醇、2-巰乙醇或參(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)之還原劑反應以還原抗體中的鏈間雙硫鍵,以形成硫氫基。
具體而言,藉由抗體中每個鏈間雙硫鍵使用0.3至3莫耳當量之TCEP作為還原劑,並於含有螯合劑的緩衝溶液中將還原劑與抗體反應,可獲得鏈間雙硫鍵被部分或完全還原的抗體。螯合劑之實例可包括乙二胺四乙酸(EDTA)及二伸乙三胺五乙酸(DTPA)。螯合劑能以1 mM至20 mM的濃度使用。磷酸鈉、硼酸鈉、乙酸鈉等的溶液可用作緩衝溶液。作為一具體實例,具有部分或完全還原之硫氫基的抗體(3a)可藉由使抗體與TCEP在4℃至37℃反應1至4小時來獲得。
應注意的是,藉由實施硫氫基與藥物-連接子部分的加成反應,而藥物-連接子部分可藉由硫醚鍵結合。
然後,每個具有硫氫基之抗體(3a)使用2至20莫耳當量的化合物(2),可產生每個抗體結合2至8個藥物分子的抗體-藥物結合物(1)。具體而言,可將含有溶解的化合物(2)的溶液添加至含有具有硫氫基之抗體(3a)的緩衝溶液中進行反應。在此情況下,乙酸鈉、磷酸鈉、硼酸鈉等的溶液可用作緩衝溶液。反應的pH為5至9,更佳地,反應可在接近pH 7進行。作為用於溶解化合物(2)的溶劑,可使用二甲亞碸(DMSO)、二甲基甲醯胺(DMF)、二甲基乙醯胺(DMA)、N-甲基-2-吡咯啶酮(NMP)等有機溶劑。反應可藉由將含有以1至20% v/v溶於有機溶劑之化合物(2)的溶液添加至含有具硫氫基之抗體(3a)的緩衝溶液中來進行。反應溫度為0至37℃,更佳為10至25℃,反應時間為0.5至2小時。可藉由以含硫醇的試劑使未反應的化合物(2)的反應性失活來終止反應。含硫醇的試劑例如為半胱胺酸或N-乙醯基-L-半胱胺酸(NAC)。更具體而言,可藉由添加1至2莫耳當量之NAC至所使用的化合物(2)中,並將獲得之混合物在室溫下培育10至30分鐘來終止反應。
(4)抗體-藥物結合物的鑑定
產生的抗體-藥物結合物(1)可根據下述共通程序進行濃縮、緩衝液交換、純化、以及抗體濃度及每個抗體分子結合的藥物分子的平均數量的測量,以鑑定抗體-藥物結合物(1)。
(4)-1共通程序A:抗體或抗體-藥物結合物水溶液的濃縮
於Amicon Ultra (50,000 MWCO,Millipore Corporation)容器中,添加抗體或抗體-藥物結合物之溶液,並使用離心機(Allegra X-15R,Beckman Coulter, Inc.),藉由離心而濃縮抗體或抗體-藥物結合物之溶液(於2000 G至3800 G離心5至20分鐘)。
(4)-2共通程序B:抗體濃度的測量
使用UV檢測器(Nanodrop 1000,Thermo Fisher Scientific Inc.),根據製造商規定的方法進行抗體濃度的測量。在此方面,使用抗體之間不同的280 nm吸收係數(1.3 mLmg
-1cm
-1至1.8 mLmg
-1cm
-1)。
(4)-3共通程序C:抗體的緩衝液交換
根據製造商規定的方法,將使用Sephadex G-25擔體的NAP-25管柱(Cat. No. 17-0852-02,GE Healthcare Japan Corporation)以含有氯化鈉(50 mM)及EDTA (2 mM)之磷酸鹽緩衝液(50 mM,pH 6.0)(本說明中稱為PBS6.0/EDTA)平衡。以每NAP-25管柱為2.5 mL之量施用抗體水溶液,然後收集以3.5 mL的PBS6.0/EDTA洗提之流分(fraction) (3.5 mL)。此流分藉由共通程序A濃縮。在使用共通程序B測量抗體濃度後,使用PBS6.0/EDTA將抗體濃度調整至20 mg/mL。
(4)-4共通程序D:抗體-藥物結合物之純化
NAP-25管柱以任何市售緩衝溶液平衡,諸如以含有山梨糖醇(5%)(10 mM,pH 5.5;在本說明中稱為ABS)的乙酸鹽緩衝液平衡。將抗體-藥物結合物的反應水溶液(約2.5 mL)施用於NAP-25管柱,然後以製造商規定量的緩衝溶液進行洗提,以收集抗體流分。將收集的流分再次施用於NAP-25管柱並以緩衝溶液進行洗提的凝膠過濾純化過程總共重複2或3次,以獲得排除未結合的藥物連接子及低分子量化合物(參(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)、N-乙醯基-L-半胱胺酸(NAC)及二甲亞碸)之抗體-藥物結合物。
(4)-5共通程序E:抗體-藥物結合物中抗體濃度及每個抗體分子結合的藥物分子的平均數量之測量
抗體-藥物結合物中的結合藥物濃度可藉由測量抗體-藥物結合物之水溶液於280 nm及370 nm兩個波長的UV吸光度,然後進行以下所示之計算式來計算。
在任何給定波長的總吸光度等於系統中存在的所有吸光化學物種的吸光度之和[吸光度的可加性]。因此,基於抗體及藥物的莫耳吸光係數在抗體與藥物結合前後不變的假設,抗體-藥物結合物中的抗體濃度及藥物濃度由下述方程式表示。
A
280=A
D,280+A
A,280=ε
D,280C
D+ε
A,280C
A方程式(1)
A
370=A
D,370+A
A,370=ε
D,370C
D+ε
A,370C
A方程式(2)
在此情況下,A
280表示抗體-藥物結合物之水溶液於280 nm的吸光度,A
370表示抗體-藥物結合物之水溶液於370 nm的吸光度,A
A,280表示抗體於280 nm的吸光度,A
A,370表示抗體於370 nm的吸光度,A
D,280表示結合物前驅物於280 nm的吸光度,A
D,370表示結合物前驅物於370 nm的吸光度,ε
A,280表示抗體於280 nm的莫耳吸收係數,ε
A,370表示抗體於370 nm的莫耳吸收係數,ε
D,280表示結合物前驅物於280 nm的莫耳吸收係數,ε
D,370表示結合物前驅物於370 nm的莫耳吸收係數,C
A表示在抗體-藥物結合物中的抗體濃度,且C
D表示在抗體-藥物結合物中的藥物濃度。
在此情況下,關於ε
A,280、ε
A,370、ε
D,280及ε
D,370,使用預先準備的值(基於計算的估計值或藉由化合物的UV測量獲得的測量值)。例如,ε
A,280可藉由已知的計算方法由抗體的胺基酸序列估計(Protein Science, 1995, vol. 4, 2411-2423)。ε
A,370通常為零。可藉由測量所使用之結合物前驅物以一定莫耳濃度溶解於溶液之吸光度,根據朗伯-比爾定律(Lambert-Beer's law)(吸光度=莫耳濃度×莫耳吸光係數×光析管(cell)光徑長)而獲得ε
D,280及ε
D,370。藉由測量抗體-藥物結合物之水溶液之A
280及A
370,然後藉由將此等值代入而解出聯立方程式(1)及(2),可確定C
A及C
D。又,藉由將C
D除以C
A,可確定每個抗體結合的藥物分子之平均數量。
(4)-6共通程序F:抗體-藥物結合物中每個抗體分子結合的藥物分子之平均數量之測量-(2)
除了上述「(4)-5共通程序E」外,抗體-藥物結合物中每個抗體分子結合的藥物分子的平均數量亦可使用下述方法藉由高效液相層析(HPLC)分析來確定。在下文中,將說明當抗體藉由雙硫鍵與藥物連接子結合時,藉由HPLC測量結合的藥物分子之平均數量的方法。本技術領域中具有通常知識者可參照此方法,取決於抗體及藥物連接子之間的連結方式,藉由HPLC適當測量結合的藥物分子之平均數量。
F-1.製備用於HPLC分析的樣品(抗體-藥物結合物的還原)
將抗體-藥物結合物溶液(約1 mg/mL,60 μL)與二硫蘇糖醇(DTT)水溶液(100 mM,15 μL)混合。藉由將混合物在37℃培育30分鐘,使抗體-藥物結合物的輕鏈及重鏈之間的雙硫鍵斷裂。所產生之樣品用於HPLC分析。
F-2. HPLC分析
於下列測量條件下進行HPLC分析。
HPLC系統:Agilent 1290 HPLC系統(Agilent Technologies, Inc.)
檢測器:紫外線吸收光譜儀(測量波長:280 nm)
管柱:ACQUITY UPLC BEH苯基(2.1×50 mm,1.7 μm,130埃;Waters Corp.,P/N 186002884)
管柱溫度:80℃
移動相A:含有0.10%三氟乙酸(TFA)及15% 2-丙醇之水溶液
移動相B:含有0.075% TFA及15% 2-丙醇之乙腈溶液
梯度程式:14%-36% (0分鐘-15分鐘)、36%-80% (15分鐘-17分鐘)、80%-14% (17分鐘-17.01分鐘)及14% (17.01分鐘-25分鐘)
樣品注射:10 μL
F-3.資料分析
F-3-1.相較於未結合的抗體輕鏈(L0)及重鏈(H0),與藥物分子結合的輕鏈(與i個藥物分子結合的輕鏈:L
i)及與藥物分子結合的重鏈(與i個藥物分子結合的重鏈:H
i)係與結合的藥物分子的數量成比率地呈現更高的疏水性,因此具有更長的滯留時間。因此這些鏈係以例如L0及L1或H0、H1、H2及H3的順序被洗提。可藉由與L0及H0比較滯留時間,而將檢測峰歸至L0、L1、H0、H1、H2及H3中的任一個。結合的藥物分子的數量可由本技術領域中具有通常知識者定義,但較佳為L0、L1、H0、H1、H2及H3。
F-3-2.由於藥物連接子具有UV吸收,使用輕鏈或重鏈及藥物連接子的莫耳吸收係數而根據下述表示式將峰面積值因應結合的藥物連接子分子的數量進行校正。
在此情況下,藉由已知的計算方法從各抗體的輕鏈或重鏈胺基酸序列估計的值(Protein Science, 1995, vol. 4, 2411-2423)可用作抗體輕鏈或重鏈的莫耳吸光係數(280 nm)。在H01L02的情況下,根據抗體的胺基酸序列,將31710的莫耳吸光係數及79990的莫耳吸光係數分別用作輕鏈及重鏈的估計值。將藉由各藥物連接子與巰乙醇或N-乙醯基半胱胺酸的反應而使馬來醯亞胺基轉化為琥珀醯亞胺硫醚的化合物之實際測量的莫耳吸光係數(280 nm)用作該藥物連接子的莫耳吸光係數(280 nm)。吸光度測量的波長可由本技術領域中具有通常知識者適當設定,較佳為能夠測量抗體的峰的波長,更佳為280 nm。
F-3-3.對於峰面積的校正值的總和,根據下述表示式計算各鏈的峰面積比率(%)。
F-3-4.根據下述表示式計算抗體-藥物結合物中每個抗體分子結合的藥物分子之平均數量。
結合的藥物分子之平均數量=(L
0峰面積比率x0+L
1峰面積比率x1+H
0峰面積比率x0+H
1峰面積比率x1+H
2峰面積比率x2+H
3峰面積比率x3)/100x2
需注意的是,為了確保抗體-藥物結合物的量,可將在相似條件下所生產之具有幾乎相同的結合的藥物分子之平均數量(例如,±1的層級)的多個抗體-藥物結合物混合以製備新的批次。在此情況下,新批次的藥物分子的平均數量介於混合前的藥物分子的平均數量之間。
本發明之抗體-藥物結合物的一個具體實例可包括具有下式表示之結構的抗體-藥物結合物:
或下式:
在此情況下,AB表示本說明所揭示之抗CDH6抗體,且該抗體經由源自該抗體的硫氫基與藥物連接子結合。在此情況下,n與所謂的DAR (藥物對抗體的比率(drug-to-antibody Ratio))具有相同含義,且表示每個抗體的藥物對抗體的比率。具體而言,n表示每個抗體分子結合的藥物分子數量,為被定義並表示為平均值的數值,即結合的藥物分子的平均數量。在本發明以[式9]或[式10]表示之抗體-藥物結合物的情況,藉由共通程序F進行測量,n可為2至8,較佳為5至8,更佳為7至8,更佳為8。
本發明之抗體-藥物結合物的一個實例可包括具有由上述式[式9]或[式10]表示之結構的抗體-藥物結合物、或該抗體-藥物結合物的醫藥上可接受的鹽,其中由AB表示之抗體包括選自下述抗體(a)至(g)所組成之群組中的任一種抗體、或該抗體的功能性片段:
(a)由SEQ ID NO:61所示輕鏈全長胺基酸序列中位置21至233之胺基酸序列組成的輕鏈及由SEQ ID NO:69所示重鏈全長胺基酸序列中位置20至471之胺基酸序列組成的重鏈所組成的抗體;
(b)由SEQ ID NO:61所示輕鏈全長胺基酸序列中位置21至233之胺基酸序列組成的輕鏈及由SEQ ID NO:73所示重鏈全長胺基酸序列中位置20至471之胺基酸序列組成的重鏈所組成的抗體;
(c)由SEQ ID NO:61所示輕鏈全長胺基酸序列中位置21至233之胺基酸序列組成的輕鏈及由SEQ ID NO:77所示重鏈全長胺基酸序列中位置20至471之胺基酸序列組成的重鏈所組成的抗體;
(d)由SEQ ID NO:65所示輕鏈全長胺基酸序列中位置21至233之胺基酸序列組成的輕鏈及由SEQ ID NO:69所示重鏈全長胺基酸序列中位置20至471之胺基酸序列組成的重鏈所組成的抗體;
(e)由SEQ ID NO:65所示輕鏈全長胺基酸序列中位置21至233之胺基酸序列組成的輕鏈及由SEQ ID NO:73所示重鏈全長胺基酸序列中位置20至471之胺基酸序列組成的重鏈所組成的抗體;
(f)由SEQ ID NO:65所示輕鏈全長胺基酸序列中位置21至233之胺基酸序列組成的輕鏈及由SEQ ID NO:77所示重鏈全長胺基酸序列中位置20至471之胺基酸序列組成的重鏈所組成的抗體;以及
(g)選自抗體(a)至(f)所組成之群組中的任一種抗體,其中該重鏈或輕鏈包含一種或兩種以上的修飾,該修飾選自以下列為代表的轉譯後修飾所組成之群組:N-連接型醣基化、O-連接型醣基化、N端加工、C端加工、去醯胺化、天冬胺酸異構化、甲硫胺酸氧化、在N端添加甲硫胺酸殘基、脯胺酸殘基醯胺化、及N端麩醯胺酸或N端麩胺酸轉化為焦麩胺酸、及羧基端的一個或兩個胺基酸的刪除。
4.藥物
由於上述章節「2.抗CDH6抗體的生產」及實施例中所述的本發明之抗CDH6抗體或該抗體之功能性片段與腫瘤細胞表面的CDH6結合並具有內化活性,其可用作藥物,特別是單獨或與額外藥物組合而用作腎細胞腫瘤或卵巢腫瘤等癌症的治療劑,例如腎細胞癌、腎透明細胞癌、乳突腎細胞癌、卵巢癌、卵巢漿液性腺癌、甲狀腺癌、膽管癌、肺癌(例如,小細胞肺癌或非小細胞肺癌)、神經膠質母細胞瘤、間皮瘤、子宮癌、胰臟癌、威爾姆氏瘤(Wilms' tumor)或神經母細胞瘤。
此外,本發明之抗CDH6抗體或該抗體之功能性片段可用於檢測表現CDH6的細胞。
再者,由於本發明之抗CDH6抗體或該抗體之功能性片段具有內化活性,其可用作抗體-藥物結合物中的抗體。
當使用具有抗腫瘤活性(諸如細胞毒殺活性)之藥物作為藥物時,上述章節「3.抗CDH6抗體-藥物結合物」及實施例中所述的本發明之抗CDH6抗體-藥物結合物為具有內化活性的抗CDH6抗體及/或該抗體的功能性片段與具有抗腫瘤活性(諸如細胞毒殺活性)的藥物的結合物。由於此抗CDH6抗體-藥物結合物對表現CDH6之癌細胞呈現抗腫瘤活性,其可用作藥物,特別是用作癌症的治療劑及/或預防劑。
本發明之抗CDH6抗體-藥物結合物可吸收水分或具有吸附水,例如,當其放置在空氣中或進行再結晶或純化程序時變成水合物。此類含水的化合物或醫藥上可接受的鹽亦包括於本發明中。
當本發明的抗CDH6抗體-藥物結合物具有鹼性基團(諸如胺基)時,若期望,其可形成醫藥上可接受的酸加成鹽。此類酸加成鹽的實例可包括:氫鹵化物,諸如氫氟酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽及氫碘酸鹽;無機酸鹽,諸如硝酸鹽、過氯酸鹽、硫酸鹽及磷酸鹽;低級烷磺酸鹽,諸如甲磺酸鹽、三氟甲磺酸鹽及乙磺酸鹽;芳基磺酸鹽,諸如苯磺酸鹽及對甲苯磺酸鹽;有機酸鹽,諸如甲酸鹽、乙酸鹽、三氟乙酸鹽、蘋果酸鹽、富馬酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、草酸鹽及馬來酸鹽;以及胺基酸鹽,諸如鳥胺酸鹽、麩胺酸鹽及天冬胺酸鹽。
當本發明的抗CDH6抗體-藥物結合物具有酸性基團(諸如羧基)時,若期望,其可形成醫藥上可接受的鹼加成鹽。此類鹼加成鹽的實例可包括:鹼金屬鹽,諸如鈉鹽、鉀鹽及鋰鹽;鹼土金屬鹽,諸如鈣鹽及鎂鹽;無機鹽,諸如銨鹽;以及有機胺鹽,諸如二芐胺鹽、啉鹽、苯基甘胺酸烷基酯鹽、乙二胺鹽、N-甲基還原葡糖胺鹽、二乙胺鹽、三乙胺鹽、環己胺鹽、二環己胺鹽、N,N'-二芐基乙二胺鹽、二乙醇胺鹽、N-芐基-N-(2-苯基乙氧基)胺鹽、哌鹽、四甲基銨鹽及參(羥甲基)胺基甲烷鹽。
本發明亦可包括其中構成抗體-藥物結合物的一個或多個原子被原子的同位素置換的抗CDH6抗體-藥物結合物。存在兩類型的同位素:放射性同位素及穩定同位素。同位素之實例可包括氫的同位素(2H及3H)、碳的同位素(11C、13C及14C)、氮的同位素(13N及15N)、氧的同位素(15O、17O及18O)及氟的同位素(18F)。包含經此類同位素標識的抗體-藥物結合物的組成物可用作例如治療劑、預防劑、研究試劑、測定試劑、診斷劑及活體內診斷成像劑。本發明包括經同位素標識的各種及每種抗體-藥物結合物、以及任何給定比率之經同位素標識的抗體-藥物結合物的混合物。可根據本技術領域已知的方法生產經同位素標識的抗體-藥物結合物,例如藉由使用經同位素標識的起始原料來代替後述的本發明生產方法的起始原料。
例如,可基於壓制細胞增殖反應的活性來測量活體外細胞毒性。例如,培養過度表現CDH6的癌細胞株,並在培養系統中加入不同濃度的抗CDH6抗體-藥物結合物。之後,可測量其對灶(focus)形成、群落(colony)形成及球狀體(spheroid)生長的壓制活性。在此情況下,例如,藉由使用衍生自腎細胞腫瘤或卵巢腫瘤之癌細胞株,可檢驗對腎細胞腫瘤或卵巢腫瘤的細胞生長抑制活性。
可測量在實驗動物活體內對癌症的治療效果,例如,藉由將抗CDH6抗體-藥物結合物投予至已接種高度表現CDH6之腫瘤細胞株的裸鼠,然後測量癌細胞的變化。在此情況下,例如,藉由使用衍生自免疫缺陷小鼠的動物模式,並藉由接種衍生自腎細胞癌、腎透明細胞癌、乳突腎細胞癌、卵巢癌、卵巢漿液性腺癌或甲狀腺癌之細胞,可測量對腎細胞癌、腎透明細胞癌、乳突腎細胞癌、卵巢癌、卵巢漿液性腺癌或甲狀腺癌的治療效果。
應用本發明的抗CDH6抗體-藥物結合物的癌症的類型沒有特別限制,只要該癌症在待治療的癌細胞中表現CDH6即可。其實例可包括腎細胞癌(例如,腎透明細胞癌或乳突腎細胞癌)、卵巢癌、卵巢漿液性腺癌、甲狀腺癌、膽管癌、肺癌(例如,小細胞肺癌或非小細胞肺癌)、神經膠質母細胞瘤、間皮瘤、子宮癌、胰臟癌、威爾姆氏瘤及神經母細胞瘤,然而癌症不限於此,只要該癌症表現CDH6即可。其實例亦可包括腎細胞癌、卵巢癌、間皮瘤、甲狀腺癌、子宮癌、膽管癌、胰臟癌、非小細胞肺癌、子宮頸癌、腦腫瘤、頭頸癌、肉瘤、骨肉瘤、小細胞肺癌、乳癌、膀胱癌、子宮內膜癌、及去勢抗性前列腺癌。癌症之更佳實例可包括腎細胞癌(例如,腎透明細胞癌及乳突腎細胞癌)及卵巢癌。癌症之更佳實例可包括卵巢癌(例如,上皮性卵巢癌、輸卵管癌及原發性腹膜癌)。
本發明之抗CDH6抗體-藥物結合物較佳可投予至哺乳動物,且更佳為投予至人類。
包含本發明之抗CDH6抗體-藥物結合物的醫藥組成物中使用的物質可從本技術領域通常使用的醫藥添加劑等中按照施用劑量或施用濃度適當選擇,然後使用。
本發明抗CDH6抗體-藥物結合物能以包含一種或多種醫藥相容成分之醫藥組成物投予。例如,醫藥組成物通常包含一種或多種藥物擔體(例如,無菌液體(例如水及油(包括石油及動物來源、植物來源或合成來源的油(例如花生油、大豆油、礦物油及芝麻油))))。當靜脈內投予醫藥組成物時,水為更典型的擔體。食鹽水溶液、葡萄糖水溶液及甘油水溶液亦可用作液體擔體,特別是用於注射溶液。適合的醫藥擔體為本技術領域已知的。若期望,組成物亦可其包含痕量的保濕劑、乳化劑或pH緩衝劑。適合的醫藥擔體之實例揭示於E. W. Martin的「Remington's Pharmaceutical Sciences」中。處方對應於投予模式。
在一些態樣中,抗體-藥物結合物(ADC)包含式4。在一些態樣中,將包含式4之ADC投予至對鉑類癌症治療呈現耐性之病患。在一些態樣中,將包含式4之ADC投予至在鉑類癌症治療完成後2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個月內癌症復發的耐鉑的癌症病患。在一些態樣中,將包含式4之ADC投予至在鉑類癌症治療完成後至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個月內疾病復發的耐鉑的癌症病患。在一些態樣中,將包含式4之ADC投予至在卡鉑及/或紫杉醇方案完成後至少2、3、4、5、6、8、8、9、10、11或12個月內疾病復發的耐鉑的癌症病患。
在一些態樣中,在以諸如卡鉑/紫杉醇、卡鉑/多西紫杉醇、順鉑/紫杉醇、及卡鉑/紫杉醇/貝伐珠單抗(bevacizumab)方案等鉑/紫杉烷化療治療後,投予包含式4之ADC。
在一些態樣中,在以一種或多種下述鉑類化療治療後投予包含式4之ADC,諸如卡鉑/紫杉醇、卡鉑/微脂體多柔比星、卡鉑/吉西他濱、順鉑/吉西他濱、卡鉑/依弗醯胺、順鉑/依弗醯胺、奧沙利鉑/5-FU/甲醯四氫葉酸(luecovorin)、及奧沙利鉑/卡培他濱方案。
在一些態樣中,將包含式4之ADC投予至有需要的病患以治療耐鉑性,較佳地,該病患具有下列疾病之復發:卵巢癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、乳癌、膀胱癌、子宮內膜癌、去勢抗性前列腺癌(castrate-resistant prostate cancer,CRPC)、及其他表現CDH6之癌症。在一些態樣中,卵巢癌包括上皮性卵巢癌、輸卵管癌、及原發性腹膜癌。
在一些態樣中,包含式4之ADC適用於治療患有在鉑類化療後疾病進展或復發的卵巢癌的病患。在一些態樣中,包含式4之ADC適用於治療一線鉑類化療方案失敗之女性的晚期卵巢癌。在一些態樣中,包含式4之ADC適用於治療化療後疾病進展後的卵巢癌。
在一些態樣中,包含式4之ADC作為單一藥劑適用於治療患有在初始或後續化療期間或之後疾病進展後的轉移性卵巢癌的病患。在一些態樣中,包含式4之ADC適用於治療患有一線或後續療法失敗後的轉移性卵巢癌的病患。
各種遞送系統係已知的且彼等可用於投予本發明之抗CDH6抗體-藥物結合物。投予途徑的實例可包括但不限於皮內、肌內、腹膜內、靜脈內及皮下途徑。例如,可藉由注射或彈丸注射(bolus injection)進行投予。根據特佳具體實施例,上述抗體-藥物結合物的投予係藉由注射進行。腸胃外投予係較佳的投予途徑。
根據代表性之具體實施例,醫藥組成物根據習知程序被規定為適合對人類靜脈內投予的醫藥組成物。用於靜脈內投予的組成物通常為在無菌及等張水性緩衝溶液中的溶液。如有必要,藥物亦可含有助溶劑及局部麻醉劑,以緩和注射區域的疼痛(例如,利多卡因(lignocaine))。一般而言,上述成分係分別或一起在單位劑型的混合物中,作為包含在容器中的冷凍乾燥粉末或無水濃縮物而提供,其係藉由密封在例如標明活性劑的量的安瓿或囊袋中而獲得。當藥物藉由注射投予時,可使用例如含有無菌醫藥級的水或食鹽水的注射瓶來投予。當藥物藉由注射投予時,可提供注射用無菌水或食鹽水的安瓿,使得上述成分在投予前相互混合。
本發明之醫藥組成物可為僅包含本案抗CDH6抗體-藥物結合物的醫藥組成物,或可為包含抗CDH6抗體-藥物結合物及至少一種其他癌症治療劑的醫藥組成物。本發明之抗CDH6抗體-藥物結合物亦可與另外的癌症治療劑一起投予,從而可增強抗癌效果。用於此目的之另外的抗癌劑可與抗體-藥物結合物一起同時、分別或連續地投予至個體。此外,另外的抗癌劑及抗CDH6抗體-藥物結合物可各以不同的投予間隔投予至受試者。在本發明中,詞組「第二藥物」意指本發明抗CDH6抗體-藥物結合物以外的治療劑。另外的抗癌劑可為「第二藥物」。然而,在本發明中,「第二藥物」並不一定是用於所謂「二線療法」的藥物。此類用於癌症之治療劑或第二藥物、或另外的抗癌劑的實例可包括:包括伊馬替尼(imatinib)、舒尼替尼(sunitinib)及瑞格非尼(regorafenib)之酪胺酸激酶抑制劑;包括帕博西尼(palbociclib)之CDK4/6抑制劑;包括TAS-116之HSP90抑制劑;包括MEK162之MEK抑制劑;以及包括納武利尤單抗(nivolumab)、派姆單抗(pembrolizumab)及易普利單抗(ipilimumab)之免疫檢查點抑制劑等;然而用於癌症之治療劑不限於此,只要為具有抗腫瘤活性的藥物。
此類醫藥組成物可製備成冷凍乾燥調配物或液體調配物形式的具有選定組成及必要純度的調配物。製備成冷凍乾燥調配物的醫藥組成物可為含有本技術領域使用的適當醫藥添加劑的調配物。同樣地,可製備液體調配物以使液體調配物含有本技術領域中使用的各種醫藥添加劑。
醫藥組成物的組成及濃度亦取決於投予方法而變化。關於包含於本發明之醫藥組成物中的抗CDH6抗體-藥物結合物對抗原的親和力,即,抗CDH6抗體-藥物結合物與抗原的解離常數(Kd值),隨著親和力的增加(即Kd值低),醫藥組成物即使其施用劑量減少亦可發揮藥效。因此,抗體-藥物結合物的施用劑量亦可藉由基於抗體-藥物結合物對抗原的親和力狀態設定施用劑量來確定。當本發明之抗體-藥物結合物投予至人類時,其能以例如約0.001至100 mg/kg之劑量而一次投予或以1至180天的間隔多次投予。其可較佳地以0.1至50 mg/kg之劑量(且更佳為1至50 mg/kg、1至30 mg/kg、1至20 mg/kg、1至15 mg/kg、2至50 mg/kg、2至30 mg/kg、2至20 mg/kg或2至15 mg/kg之劑量),以1至4週之間隔(較佳為2至3週之間隔)而多次投予。
當用於本揭示之鉑類藥物或化療劑為順鉑時,投予方法之實例包括但不限於下列劑量及投予。
例如,每天投予15至20 mg/m
2(體表面積)之順鉑一次,連續5天,之後至少休息2週。此被視為一個療程,並重複投予。
作為另一種劑量及投予,例如,每天投予50至70 mg/m
2(體表面積)之順鉑一次,之後至少休息3週。此被視為一個療程,並重複投予。
作為另一種劑量及投予,例如,每天投予25至35 mg/m
2(體表面積)之順鉑一次,之後至少休息1週。此被視為一個療程,並重複投予。
作為另一種劑量及投予,例如,每天投予10至20 mg/m
2(體表面積)之順鉑一次,連續5天,之後至少休息2週。此被視為一個療程,並重複投予。
作為另一種劑量及投予,例如,每天投予70至90 mg/m
2(體表面積)之順鉑一次,之後至少休息3週。此被視為一個療程,並重複投予。
作為另一種劑量及投予,例如,每天投予20 mg/m
2(體表面積)之順鉑一次,連續5天,之後至少休息2週。此被視為一個療程,並重複投予。
作為另一種劑量及投予,例如,每天投予100 mg/m
2(體表面積)之順鉑一次,之後至少休息3週。此被視為一個療程,並重複投予。
作為另一種劑量及投予,例如,每天投予75 mg/m
2(體表面積)之順鉑一次,之後至少休息20天。此被視為一個療程,並重複投予。
作為另一種劑量及投予,例如,在60分鐘期間以靜脈滴注投予25 mg/m
2(體表面積)之順鉑,且持續每週投予連續2週,之後第三週休息。此被視為一個療程,並重複投予。
作為另一種劑量及投予,例如,與多柔比星鹽酸鹽組合,每天投予100 mg/m
2(體表面積)之順鉑一次,之後至少休息3週。此被視為一個療程,並重複投予。
作為另一種劑量及投予,例如,與多柔比星鹽酸鹽組合,每天投予50 mg/m
2(體表面積)之順鉑一次,之後至少休息3週。此被視為一個療程,並重複投予。
作為另一種劑量及投予,例如,與一種或多種其他抗癌劑組合,以連續靜脈輸注投予每天100 mg/m
2(體表面積)之順鉑1天,之後至少休息20天。此被視為一個療程,並重複投予。
作為另一種劑量及投予,例如,與一種或多種其他抗癌劑組合,以連續靜脈輸注投予每天25 mg/m
2(體表面積)之順鉑連續4天,之後至少休息17天。此被視為一個療程,並重複投予。
作為另一種劑量及投予,例如,與一種或多種其他抗癌劑組合,每天投予60至100 mg/m
2(體表面積)之順鉑一次,之後至少休息3週。此被視為一個療程,並重複投予。
作為另一種劑量及投予,例如,與一種或多種其他抗癌劑組合,每天投予20 mg/m
2(體表面積)之順鉑一次,連續5天,之後至少休息2週。此被視為一個療程,並重複投予。
作為另一種劑量及投予,例如,與胺甲喋呤、硫酸長春花鹼及多柔比星鹽酸鹽組合,以單次靜脈輸注通常地投予70 mg/m
2(體表面積)之順鉑。
作為標準劑量及投予方法,第1天投予30 mg/m
2之胺甲喋呤,之後在第2天靜脈輸注3 mg/m
2之硫酸長春花鹼、30 mg/m
2之多柔比星鹽酸鹽(滴定量)及70 mg/m
2之順鉑。在第15及22天靜脈內投予30 mg/m
2之胺甲喋呤及3 mg/m
2之硫酸長春花鹼。此被視為一個療程,該療程每4週重複一次。
作為另一種劑量及投予,注射用順鉑每天以20 mg/m
2靜脈內投予,每週期5天。
作為另一種劑量及投予,注射用順鉑在每週期每3至4週的第1天以75至100 mg/m
2靜脈內投予一次。
作為另一種劑量及投予,注射用順鉑每週期每3至4週以50至70 mg/m
2靜脈內投予一次。對於經大量預處理的病患,可使用每週期50 mg/m
2之起始劑量,每4週重複一次。
當用於本揭示之鉑類藥物或化療劑為卡鉑時,投予方法之實例包括但不限於下列劑量及投予。
例如,每天投予300至400 mg/m
2(體表面積)之卡鉑一次,之後至少休息4週。此被視為一個療程,並重複投予。
作為另一種劑量及投予,例如,與曲妥珠單抗(基因重組)及紫杉烷組合,每天投予300至400 mg/m
2(體表面積)之卡鉑一次,之後至少休息3週。此被視為一個療程,並重複投予。
作為另一種劑量及投予,例如,與派姆單抗(基因重組)及吉西他濱鹽酸鹽組合,每天以相當於AUC為2 [(mg/mL)•min]之劑量投予卡鉑一次。持續每週投予連續2週,之後第三週休息。此被視為一個療程,並重複投予。
作為另一種劑量及投予,例如,與依弗醯胺及依託泊苷組合,以靜脈滴注投予635 mg/m
2(體表面積)之卡鉑1天,或以靜脈滴注投予400 mg/m
2(體表面積)之卡鉑2天,之後至少休息3至4週。此被視為一個療程,並重複投予。
作為另一種劑量及投予,例如,與硫酸長春新鹼及依託泊苷組合,以靜脈滴注投予560 mg/m
2(體表面積)之卡鉑1天,並停藥至少3至4週。此被視為一個療程,並重複投予。
作為另一種劑量及投予,例如,在每4週的第1天靜脈內投予360 mg/m
2之卡鉑。
作為另一種劑量及投予,例如,在每4週的第1天靜脈內投予300 mg/m
2之卡鉑,進行6個週期。
作為另一種劑量及投予,例如,在0.1至48小時期間以靜脈輸注投予卡鉑AUC 1.0至10 [(mg/mL)•min],之後在0.1至48小時期間靜脈內投予1至100 mg/m
2之聚乙二醇化微脂體多柔比星,且每2至4週重複治療,進行1至10個週期。
作為另一種劑量及投予,例如,在30分鐘期間以靜脈輸注投予卡鉑AUC 5 [(mg/mL)•min],之後在60分鐘期間靜脈內投予30 mg/m
2之聚乙二醇化微脂體多柔比星,且每3至4週重複治療,進行3至6個週期。
作為另一種劑量及投予,例如,在30分鐘期間以靜脈輸注投予卡鉑AUC 5 [(mg/mL)•min],之後在60分鐘期間靜脈內投予30 mg/m
2之聚乙二醇化微脂體多柔比星,且每3週重複治療,進行3個週期。
作為另一種劑量及投予,例如,在30分鐘期間以靜脈輸注投予卡鉑AUC 5 [(mg/mL)•min],之後在60分鐘期間靜脈內投予30 mg/m
2之聚乙二醇化微脂體多柔比星,且每3週重複治療,進行6個週期。
作為另一種劑量及投予,例如,在30分鐘期間以靜脈輸注投予卡鉑AUC 5 [(mg/mL)•min],之後在60分鐘期間靜脈內投予30 mg/m
2之聚乙二醇化微脂體多柔比星,且每4週重複治療,進行3個週期。
作為另一種劑量及投予,例如,在30分鐘期間以靜脈輸注投予卡鉑AUC 5 [(mg/mL)•min],之後在60分鐘期間靜脈內投予30 mg/m
2之聚乙二醇化微脂體多柔比星,且每4週重複治療,進行6個週期。
當用於本揭示之紫杉烷或化療劑為紫杉醇時,投予方法之實例包括但不限於下列劑量及投予。
例如,每天在3小時期間以靜脈滴注投予210 mg/m
2(體表面積)之紫杉醇一次,之後至少休息3週。此被視為一個療程,並重複投予。
作為另一種劑量及投予,例如,每天在1小時期間以靜脈滴注投予100 mg/m
2(體表面積)之紫杉醇一次,且持續每週投予連續6週,之後至少休息2週。此被視為一個療程,並重複投予。
作為另一種劑量及投予,例如,每天在1小時期間以靜脈滴注投予80 mg/m
2(體表面積)之紫杉醇一次,且持續每週投予連續3週。此被視為一個療程,並重複投予。
作為另一種劑量及投予,例如,每天在24小時期間以靜脈滴注投予135 mg/m
2(體表面積)之紫杉醇一次,之後至少休息3週。此被視為一個療程,並重複投予。
作為另一種劑量及投予,例如,每天在1小時期間以靜脈滴注投予80 mg/m
2(體表面積)之紫杉醇一次,持續每週投予連續3週,之後至少休息2週。此被視為一個療程,並重複投予。
作為另一種劑量及投予,例如,每天在30分鐘期間以靜脈滴注投予260 mg/m
2(體表面積)之紫杉醇一次,之後至少休息20天。此被視為一個療程,並重複投予。
作為另一種劑量及投予,例如,每天在30分鐘期間以靜脈滴注投予100 mg/m
2(體表面積)之紫杉醇一次,之後至少休息6天。持續每週投予連續3週。此被視為一個療程,並重複投予。
作為另一種劑量及投予,例如,與吉西他濱組合,每天在30分鐘期間以靜脈滴注投予125 mg/m
2(體表面積)之紫杉醇一次,之後至少休息6天。持續每週投予連續3週。此被視為一個療程,並重複投予。
作為另一種劑量及投予,例如,每天在30分鐘期間以靜脈滴注投予100 mg/m
2(體表面積)之紫杉醇一次,之後至少休息6天。持續每週投予連續3週並在第四週停藥。此被視為一個療程,並重複投予。
作為另一種劑量及投予,例如,與一種或多種其他抗癌劑組合,每天在30分鐘期間以靜脈滴注投予100 mg/m
2(體表面積)之紫杉醇一次,之後至少休息6天。持續每週投予連續3週,之後第四週休息。此被視為一個療程,並重複投予。
作為另一種劑量及投予,例如,每2或3週在3或24小時期間靜脈內投予50、90、100、135或175 mg/m
2之紫杉醇。
當用於本揭示之紫杉烷或化療劑為多西紫杉醇時,投予方法之實例包括但不限於下列劑量及投予。
例如,每天在1小時期間以靜脈滴注投予60 mg/m
2(體表面積)之多西紫杉醇一次,每3至4週一次。
作為另一種劑量及投予,例如,每天在1小時期間以靜脈滴注投予70 mg/m
2(體表面積)之多西紫杉醇一次,每3至4週一次。
作為另一種劑量及投予,例如,每天在1小時期間以靜脈滴注投予75 mg/m
2(體表面積)之多西紫杉醇一次,每3週一次。
作為另一種劑量及投予,例如,每3週在1小時期間靜脈內投予60至100 mg/m
2之多西紫杉醇。
作為另一種劑量及投予,例如,每3週在投予50 mg/m
2之多柔比星及500 mg/m
2之環磷醯胺1小時後,靜脈內投予75 mg/m
2之多西紫杉醇,進行6個療程。
作為另一種劑量及投予,例如,每3週在1小時期間靜脈內投予75 mg/m
2之多西紫杉醇。
作為另一種劑量及投予,例如,每3週在1小時期間靜脈內投予75 mg/m
2之多西紫杉醇,之後立即在30至60分鐘期間投予75 mg/m
2之順鉑。
作為另一種劑量及投予,例如,每3週以1小時靜脈輸注投予75 mg/m
2之多西紫杉醇。可持續每天口服投予5 mg之強體松(prednisone)兩次。
作為另一種劑量及投予,例如,以1小時靜脈輸注投予75 mg/m
2之多西紫杉醇,之後以1至3小時靜脈輸注投予順鉑75 mg/m
2(二者僅在第1天),從順鉑輸注結束時開始,之後以24小時連續靜脈輸注給予氟尿嘧啶每天750 mg/m
2,進行5天。每3週重複一次治療。
作為另一種劑量及投予,例如,於第1天,以1小時靜脈輸注投予75 mg/m
2之多西紫杉醇,之後在1小時期間靜脈內投予順鉑75 mg/m
2,之後以連續靜脈輸注投予每天750 mg/m
2之氟尿嘧啶5天。每3週投予此方案,進行4個週期。
作為另一種劑量及投予,例如,於第1天,以1小時靜脈輸注投予75 mg/m
2之多西紫杉醇,之後以30分鐘至3小時輸注投予順鉑100 mg/m
2,之後從第1天至第4天以連續輸注投予氟尿嘧啶1000 mg/m
2/天。每3週投予此方案,進行3個週期。
當用於本揭示之鉑類藥物及紫杉烷為順鉑及紫杉醇時,投予方法之實例包括但不限於下列劑量及投予。
例如,在第1天,在0.1至48小時期間以連續靜脈輸注投予10至300 mg/m
2之紫杉醇,之後在第1天或第2天,腹膜內投予1至200 mg/m
2之順鉑,且在第8天,腹膜內投予10至30 mg/m
2之紫杉醇,並且每2至5週重覆該治療,進行1至10個週期。
作為另一種劑量及投予,例如,在第1天,在3或24小時期間以連續靜脈輸注投予135或175 mg/m
2之紫杉醇,之後在第1天或第2天,腹膜內投予75至100 mg/m
2之順鉑,且在第8天,腹膜內投予60 mg/m
2之紫杉醇,並且每3週重覆該治療,進行3至6個週期。
作為另一種劑量及投予,例如,在第1天,在24小時期間以連續靜脈輸注投予135 mg/m
2之紫杉醇,之後在第2天,腹膜內投予75 mg/m
2之順鉑,且在第8天,腹膜內投予60 mg/m
2之紫杉醇,並且每3週重覆該治療,進行6個週期。
作為另一種劑量及投予,例如,在第1天,在24小時期間以連續靜脈輸注投予135 mg/m
2之紫杉醇,之後在第2天,腹膜內投予100 mg/m
2之順鉑,且在第8天,腹膜內投予60 mg/m
2之紫杉醇,並且每3週重覆該治療,進行6個週期。
作為另一種劑量及投予,例如,以175 mg/m
2之劑量在3小時期間靜脈內投予紫杉醇,之後以75 mg/m
2之劑量投予順鉑,且該方案可每3週給予一次。
作為另一種劑量及投予,例如,以135 mg/m
2之劑量在24小時期間靜脈內投予紫杉醇,之後以75 mg/m
2之劑量投予順鉑,且該方案可每3週給予一次。
當用於本揭示之鉑類藥物及紫杉烷為卡鉑及紫杉醇時,投予方法之實例包括但不限於下列劑量及投予。
例如,在第1天,在0.1至48小時期間以靜脈輸注投予10至300 mg/m
2之紫杉醇,之後以AUC為1.0至10 [(mg/mL)•min]之靜脈輸注投予卡鉑,並且每21天重覆該治療,進行1至10個週期。
作為另一種劑量及投予,例如,在第1天,在3小時期間以靜脈輸注投予175 mg/m
2或180 mg/m
2之紫杉醇,之後在1小時期間以AUC為5至6 [(mg/mL)•min]之靜脈輸注投予卡鉑,並且每21天重覆該治療,進行3至6個週期。
作為另一種劑量及投予,例如,在第1天,在3小時期間以靜脈輸注投予175 mg/m
2之紫杉醇,之後在1小時期間以AUC為5 [(mg/mL)•min]之靜脈輸注投予卡鉑,並且每21天重覆該治療,進行3個週期。
作為另一種劑量及投予,例如,在第1天,在3小時期間以靜脈輸注投予175 mg/m
2之紫杉醇,之後在1小時期間以AUC為5 [(mg/mL)•min]之靜脈輸注投予卡鉑,並且每21天重覆該治療,進行4個週期。
作為另一種劑量及投予,例如,在第1天,在3小時期間以靜脈輸注投予175 mg/m
2之紫杉醇,之後在1小時期間以AUC為5 [(mg/mL)•min] min之靜脈輸注投予卡鉑,並且每21天重覆該治療,進行5個週期。
作為另一種劑量及投予,例如,在第1天,在3小時期間以靜脈輸注投予175 mg/m
2之紫杉醇,之後在1小時期間以AUC為5 [(mg/mL)•min]之靜脈輸注投予卡鉑,並且每21天重覆該治療,進行6個週期。
作為另一種劑量及投予,例如,在第1天,在3小時期間以靜脈輸注投予175 mg/m
2之紫杉醇,之後在1小時期間以AUC [(mg/mL)•min]之靜脈輸注投予卡鉑,並且每21天重覆該治療,進行3個週期。
作為另一種劑量及投予,例如,在第1天,在3小時期間以靜脈輸注投予175 mg/m
2之紫杉醇,之後在1小時期間以AUC [(mg/mL)•min]之靜脈輸注投予卡鉑,並且每21天重覆該治療,進行4個週期。
作為另一種劑量及投予,例如,在第1天,在3小時期間以靜脈輸注投予175 mg/m
2之紫杉醇,之後在1小時期間以AUC為5.5 [(mg/mL)•min]之靜脈輸注投予卡鉑,並且每21天重覆該治療,進行5個週期。
作為另一種劑量及投予,例如,在第1天,在3小時期間以靜脈輸注投予175 mg/m
2之紫杉醇,之後在1小時期間以AUC為5.5 [(mg/mL)•min]之靜脈輸注投予卡鉑,並且每21天重覆該治療,進行6個週期。
作為另一種劑量及投予,例如,在第1天,在3小時期間以靜脈輸注投予175 mg/m
2之紫杉醇,之後在1小時期間以AUC為6 [(mg/mL)•min]之靜脈輸注投予卡鉑,並且每21天重覆該治療,進行3個週期。
作為另一種劑量及投予,例如,在第1天,在3小時期間以靜脈輸注投予175 mg/m
2之紫杉醇,之後在1小時期間以AUC為6 [(mg/mL)•min]之靜脈輸注投予卡鉑,並且每21天重覆該治療,進行4個週期。
作為另一種劑量及投予,例如,在第1天,在3小時期間以靜脈輸注投予175 mg/m
2之紫杉醇,之後在1小時期間以AUC為6 [(mg/mL)•min]之靜脈輸注投予卡鉑,並且每21天重覆該治療,進行5個週期。
作為另一種劑量及投予,例如,在第1天,在3小時期間以靜脈輸注投予175 mg/m
2之紫杉醇,之後在1小時期間以AUC為6 [(mg/mL)•min]之靜脈輸注投予卡鉑,並且每21天重覆該治療,進行6個週期。
作為另一種劑量及投予,例如,在第1天,在3小時期間以靜脈輸注投予180 mg/m
2之紫杉醇,之後在1小時期間以AUC為5 [(mg/mL)•min]之靜脈輸注投予卡鉑,並且每21天重覆該治療,進行6個週期。
作為另一種劑量及投予,例如,在第1天,在3小時期間以靜脈輸注投予180 mg/m
2之紫杉醇,之後在1小時期間以AUC為5.5 [(mg/mL)•min]之靜脈輸注投予卡鉑,並且每21天重覆該治療,進行6個週期。
作為另一種劑量及投予,例如,在第1天,在3小時期間以靜脈輸注投予180 mg/m
2之紫杉醇,之後在1小時期間以AUC為6 [(mg/mL)•min]之靜脈輸注投予卡鉑,並且每21天重覆該治療,進行6個週期。
作為另一種劑量及投予,例如,在第1、8及15天,在1小時期間以靜脈輸注投予80 mg/m
2之劑量密集的紫杉醇,在第1天隨後在1小時期間以AUC為5至6 [(mg/mL)•min]之靜脈輸注投予卡鉑,並且每21天重覆該治療,進行6個週期。
作為另一種劑量及投予,例如,在第1、8及15天,在1小時期間以靜脈輸注投予80 mg/m
2之劑量密集的紫杉醇,在第1天隨後在1小時期間以AUC為5 [(mg/mL)•min]之靜脈輸注投予卡鉑,並且每21天重覆該治療,進行6個週期。
作為另一種劑量及投予,例如,在第1、8及15天,在1小時期間以靜脈輸注投予80 mg/m
2之劑量密集的紫杉醇,在第1天隨後在1小時期間以AUC為5.5 [(mg/mL)•min]之靜脈輸注投予卡鉑,並且每21天重覆該治療,進行6個週期。
作為另一種劑量及投予,例如,在第1、8及15天,在1小時期間以靜脈輸注投予80 mg/m
2之劑量密集的紫杉醇,在第1天隨後在1小時期間以AUC為6 [(mg/mL)•min]之靜脈輸注投予卡鉑,並且每21天重覆該治療,進行6個週期。
作為另一種劑量及投予,例如,在第1、8及15天,在1小時期間以靜脈輸注投予60 mg/m
2之紫杉醇,之後在30分鐘期間以AUC為2 [(mg/mL)•min]之靜脈輸注投予卡鉑,並且每21天重覆該週期,進行6個週期(18週)。
作為另一種劑量及投予,例如,每週在1小時期間以靜脈輸注投予80 mg/m
2之劑量密集的紫杉醇,之後每3週以AUC為6 [(mg/mL)•min]之靜脈輸注投予卡鉑。
作為另一種劑量及投予,例如,每週在1小時期間靜脈內投予80 mg/m
2之劑量密集的紫杉醇,且每3週投予AUC 6 [(mg/mL)•min]之卡鉑。
當用於本揭示之鉑類藥物及紫杉烷為卡鉑及多西紫杉醇時,投予方法之實例包括但不限於下列劑量及投予。
例如,在第1天,在0.1至48小時期間以靜脈輸注投予10至300 mg/m
2之多西紫杉醇,之後在0.1至48小時期間以AUC為1.0至10 [(mg/mL)•min]之靜脈輸注投予卡鉑,並且每21天重覆該治療,進行1至10個週期。
作為另一種劑量及投予,例如,在第1天,在1小時期間以靜脈輸注投予60-75 mg/m
2之多西紫杉醇,之後在1小時期間以AUC為5至6 [(mg/mL)•min]之靜脈輸注投予卡鉑,並且每3週重覆該治療,進行6個週期。
作為另一種劑量及投予,例如,在第1天,在1小時期間以靜脈輸注投予60 mg/m
2之多西紫杉醇,之後在1小時期間以AUC為5 [(mg/mL)•min]之靜脈輸注投予卡鉑,並且每3週重覆該治療,進行6個週期。
作為另一種劑量及投予,例如,在第1天,在1小時期間以靜脈輸注投予65 mg/m
2之多西紫杉醇,之後在1小時期間以AUC為5 [(mg/mL)•min]之靜脈輸注投予卡鉑,並且每3週重覆該治療,進行6個週期。
作為另一種劑量及投予,例如,在第1天,在1小時期間以靜脈輸注投予70 mg/m
2之多西紫杉醇,之後在1小時期間以AUC為5 [(mg/mL)•min]之靜脈輸注投予卡鉑,並且每3週重覆該治療,進行6個週期。
作為另一種劑量及投予,例如,在第1天,在1小時期間以靜脈輸注投予75 mg/m
2之多西紫杉醇,之後在1小時期間以AUC為5 [(mg/mL)•min]之靜脈輸注投予卡鉑,並且每3週重覆該治療,進行6個週期。
作為另一種劑量及投予,例如,在第1天,在1小時期間以靜脈輸注投予60-75 mg/m
2之多西紫杉醇,之後在1小時期間以AUC為6 [(mg/mL)•min]之靜脈輸注投予卡鉑,並且每3週重覆該治療,進行6個週期。
作為另一種劑量及投予,例如,在第1天,在1小時期間以靜脈輸注投予60 mg/m
2之多西紫杉醇,之後在1小時期間以AUC為6 [(mg/mL)•min]之靜脈輸注投予卡鉑,並且每3週重覆該治療,進行6個週期。
作為另一種劑量及投予,例如,在第1天,在1小時期間以靜脈輸注投予65 mg/m
2之多西紫杉醇,之後在1小時期間以AUC為6 [(mg/mL)•min]之靜脈輸注投予卡鉑,並且每3週重覆該治療,進行6個週期。
作為另一種劑量及投予,例如,在第1天,在1小時期間以靜脈輸注投予70 mg/m
2之多西紫杉醇,之後在1小時期間以AUC為6 [(mg/mL)•min]之靜脈輸注投予卡鉑,並且每3週重覆該治療,進行6個週期。
作為另一種劑量及投予,例如,在第1天,在1小時期間以靜脈輸注投予75 mg/m
2之多西紫杉醇,之後在1小時期間以AUC為6 [(mg/mL)•min]之靜脈輸注投予卡鉑,並且每3週重覆該治療,進行6個週期。
當用於本揭示之抗代謝物質或化療劑為吉西他濱時,投予方法之實例包括但不限於下列劑量及投予。
例如,在30分鐘期間以單次靜脈滴注投予1000 mg/m
2之吉西他濱,且持續每週投予連續3週,之後第四週休息。此被視為一個療程,並重複投予。
作為另一種劑量及投予,例如,在30分鐘期間以單次靜脈滴注投予1250 mg/m
2之吉西他濱,且持續每週投予連續2週,之後第三週休息。此被視為一個療程,並重複投予。
作為另一種劑量及投予,例如,與順鉑組合,在30分鐘期間以單次靜脈滴注投予1250 mg/m
2之吉西他濱,且持續每週投予連續2週,之後第三週休息。此被視為一個療程,並重複投予。
作為另一種劑量及投予,例如,在各個21天週期的第1及8天,在30分鐘期間靜脈內投予1000 mg/m
2之吉西他濱。
作為另一種劑量及投予,例如,在各個21天週期的第1及8天,在30分鐘期間靜脈內投予1000 mg/m
2之吉西他濱,在第1天投予吉西他濱後,組合靜脈內投予卡鉑AUC 4 [(mg/mL)•min]。
作為另一種劑量及投予,例如,在各個21天週期的第1及8天,在30分鐘期間靜脈內投予800 mg/m
2之吉西他濱,在第1天投予吉西他濱後,組合靜脈內投予卡鉑AUC 4 [(mg/mL)•min]。
作為另一種劑量及投予,例如,在各個21天週期的第1及8天,在30分鐘期間靜脈內投予800 mg/m
2之吉西他濱,在第1天投予吉西他濱後,組合靜脈內投予卡鉑AUC 4 [(mg/mL)•min]。
作為另一種劑量及投予,例如,在各個21天週期的第1天,在30分鐘期間靜脈內投予1000 mg/m
2之吉西他濱,並在第8天,在30分鐘期間靜脈內投予800 mg/m
2之吉西他濱,在第1天投予吉西他濱後,組合靜脈內投予卡鉑AUC 4 [(mg/mL)•min]。
作為另一種劑量及投予,例如,在各個21天週期的第1及8天,在30分鐘期間靜脈內投予1250 mg/m
2之吉西他濱。
作為另一種劑量及投予,例如,在各個21天週期的第1及8天,在30分鐘期間靜脈內投予1250 mg/m
2之吉西他濱,在第1天投予吉西他濱前,組合以3小時靜脈輸注投予紫杉醇175 mg/m
2。
作為另一種劑量及投予,例如,在各個28天週期的第1、8及15天,在30分鐘期間靜脈內投予1000 mg/m
2之吉西他濱。
作為另一種劑量及投予,例如,在各個28天週期的第1、8及15天,在30分鐘期間靜脈內投予1000 mg/m
2之吉西他濱,在第1天投予吉西他濱後,組合以3小時靜脈內投予順鉑100 mg/m
2。
作為另一種劑量及投予,例如,在各個21天週期的第1及8天,在30分鐘期間靜脈內投予1250 mg/m
2之吉西他濱。
作為另一種劑量及投予,例如,在各個21天週期的第1及8天,在30分鐘期間靜脈內投予1250 mg/m
2之吉西他濱,在第1天投予吉西他濱後,組合靜脈內投予順鉑 100 mg/m
2。
作為另一種劑量及投予,例如,在前7週,每週在30分鐘期間靜脈內投予1000 mg/m
2之吉西他濱一次,之後休息一週,並在各個28天週期的第1、8及15天每週投藥。
當用於本揭示之鉑類藥物及紫杉烷為卡鉑及紫杉醇且第二藥物為貝伐珠單抗時,投予方法之實例包括但不限於下列劑量及投予。
例如,在0.1至48小時期間靜脈內投予10至300 mg/m
2之紫杉醇,之後在0.1至48小時期間靜脈內投予AUC 1.0至10 [(mg/mL)•min]之卡鉑,並在0.1至48小時期間靜脈內投予1.0至50 mg/kg之貝伐珠單抗。每2至5週重複治療,進行1至10個週期。貝伐珠單抗最多可投予額外30個週期。
作為另一種劑量及投予,例如,在第1天,在3小時期間靜脈內投予175 mg/m
2之紫杉醇,之後在30至60分鐘期間靜脈內投予AUC 5或6 [(mg/mL)•min]之卡鉑,並在30-90分鐘期間靜脈內投予7.5 mg/kg之貝伐珠單抗。每3週重複治療,進行5或6個週期。貝伐珠單抗最多可投予額外12個週期。
作為另一種劑量及投予,例如,在第1天,在3小時期間靜脈內投予175 mg/m
2之紫杉醇,之後在30至60分鐘期間靜脈內投予AUC 6 [(mg/mL)•min]之卡鉑,並在30-90分鐘期間靜脈內投予7.5 mg/kg之貝伐珠單抗。每3週重複治療,進行6個週期。貝伐珠單抗最多可投予額外12個週期。
作為另一種劑量及投予,例如,在第1天,在3小時期間靜脈內投予175 mg/m
2之紫杉醇,之後在30至60分鐘期間靜脈內投予AUC 6 [(mg/mL)•min]之卡鉑,並在30-90分鐘期間靜脈內投予7.5 mg/kg之貝伐珠單抗。每3週重複治療,進行5個週期。貝伐珠單抗最多可投予額外12個週期。
作為另一種劑量及投予,例如,在第1天,在3小時期間靜脈內投予175 mg/m
2之紫杉醇,之後在30至60分鐘期間靜脈內投予AUC 5 [(mg/mL)•min]之卡鉑,並在30-90分鐘期間靜脈內投予7.5 mg/kg之貝伐珠單抗。每3週重複治療,進行6個週期。貝伐珠單抗最多可投予額外12個週期。
作為另一種劑量及投予,例如,在第1天,在3小時期間靜脈內投予175 mg/m
2之紫杉醇,之後在30至60分鐘期間靜脈內投予AUC 5 [(mg/mL)•min]之卡鉑,並在30-90分鐘期間靜脈內投予7.5 mg/kg之貝伐珠單抗。每3週重複治療,進行5個週期。貝伐珠單抗最多可投予額外12個週期。
作為另一種劑量及投予,例如,在第1天,在3小時期間靜脈內投予175 mg/m
2之紫杉醇,之後在30分鐘期間靜脈內投予AUC 6 [(mg/mL)•min]之卡鉑。在療程2開始時,第1天在30至90分鐘期間靜脈內投予15 mg/kg之貝伐珠單抗。每21天重複治療,進行6個療程。在療程7開始時,第1天在30-90分鐘期間單獨靜脈內投予貝伐珠單抗。每21天重複以貝伐珠單抗治療,進行最多22個療程。
作為另一種劑量及投予,例如,在第1天,在3小時期間靜脈內投予175 mg/m
2之紫杉醇,之後在1小時期間靜脈內投予AUC 6 [(mg/mL)•min]之卡鉑。在療程2開始時,第1天在30至90分鐘期間靜脈內投予15 mg/kg之貝伐珠單抗。每21天重複治療,進行6個療程。在療程7開始時,第1天在30-90分鐘期間單獨靜脈內投予貝伐珠單抗。每21天重複以貝伐珠單抗治療,進行最多22個療程。
實施例
以下,將於下列實施例中具體說明本發明。然而,這些實施例並未意圖限制本發明的範疇。此外,不應藉由任何手段以限制的方式解釋這些實施例。需要注意的是,下列實施例中,除非另有指明,有關基因操作的個別操作均根據「Molecular Cloning」中所述的方法(Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., published by Cold Spring Harbor Laboratory Press in 1989)、或本技術領域中具有通常知識者使用的實驗手冊中所述的其他方法進行,或者當使用市售試劑或套組時,實施例均根據包括在市售產品中的操作說明進行。在本說明中,除非另有指明,否則試劑、溶劑及起始材料均可從市售來源容易地取得。
[參考實施例1:獲得具有內化活性之大鼠抗人類CDH6抗體]
1)-1人類、小鼠、大鼠及食蟹獼猴(cynomolgus monkey) CDH6表現載體的構築
使用編碼人類CDH6蛋白(NP_004923)之cDNA表現載體(OriGene Technologies Inc.,RC217889),根據本技術領域中具有通常知識者已知的方法,將該cDNA併入用於哺乳動物表現之載體以產生人類CDH6表現載體pcDNA3.1-hCDH6。人類CDH6 ORF (開讀框)之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO:1。
使用編碼小鼠CDH6蛋白(NP_031692)之cDNA表現載體(OriGene Technologies Inc.,MC221619),根據本技術領域中具有通常知識者已知的方法,將該cDNA併入用於哺乳動物表現之載體以產生小鼠CDH6表現載體pcDNA3.1-mCDH6及p3xFLAG-CMV-9-mCDH6。小鼠CDH6 ORF之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO:7。
使用編碼大鼠CDH6蛋白(NP_037059)之cDNA表現載體(OriGene Technologies Inc.,RN211850)之各cDNA部分,根據本技術領域中具有通常知識者已知的方法,將該cDNA併入用於哺乳動物表現之載體以產生大鼠CDH6表現載體pcDNA3.1-rCDH6及p3xFLAG-CMV-9-rCDH6。大鼠CDH6 ORF之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO:8。
編碼食蟹獼猴CDH6蛋白之cDNA係以由食蟹獼猴腎臟之總RNA所合成的cDNA為模板,使用引子1 (5'-CACCATGAGAACTTACCGCTACTTCTTGCTGCTC-3') (SEQ ID NO:85)及引子2 (5'-TTAGGAGTCTTTGTCACTGTCCACTCCTCC-3') (SEQ ID NO:86)進行選殖。確認所得到之序列對應於食蟹獼猴CDH6 (NCBI,XP_005556691.1)的細胞外區域。亦確認該序列對應於登錄在EMBL之食蟹獼猴CDH6 (EHH54180.1)全長序列。根據本技術領域中具有通常知識者已知的方法,將該cDNA併入用於哺乳動物表現之載體以產生食蟹獼猴CDH6表現載體pcDNA3.1-cynoCDH6。食蟹獼猴CDH6 ORF之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO:9。
對於所產生之質體DNA的大量生產,使用EndoFree Plasmid Giga套組(Qiagen N.V.)。
1)-2免疫
對於免疫,使用WKY/Izm雌性大鼠(Japan SLC, Inc.)。首先,將各大鼠的下肢以玻尿酸酶(Sigma-Aldrich Co. LLC)預處理,之後,將參考實施例1)-1所產生之人類CDH6表現載體 pcDNA3.1-hCDH6肌內注射至相同部位。隨後,利用ECM830 (BTX),使用2針電極,於相同部位進行活體內電穿孔。約每二週一次,重覆相同之活體內電穿孔,之後,自大鼠收集淋巴結或脾臟,然後用於融合瘤之生產。
1)-3融合瘤之生產
根據電細胞融合,使用LF301細胞融合機(Cell Fusion Unit) (BEX Co., Ltd.),將淋巴結細胞或脾臟細胞與小鼠骨髓瘤SP2/0-ag14細胞(ATCC,No. CRL-1 581)融合,然後將細胞以ClonaCell-HY 選擇培養基D (StemCell Technologies Inc.)懸浮並稀釋,然後在37℃及5% CO
2之條件下培養。收集出現於培養基中的個別融合瘤群落作為單株融合瘤,然後懸浮於ClonaCell-HY 選擇培養基E (StemCell Technologies Inc.),然後在37℃及5% CO
2之條件下培養。在細胞適度增殖後,生產個別融合瘤細胞之冷凍原種(stock),同時將所獲得之融合瘤培養上清液用於篩選產生抗人類CDH6抗體之融合瘤。
1)-4根據Cell-ELISA方法之產生抗體之融合瘤篩選
1)-4-1用於Cell-ELISA之抗原基因表現細胞的製備
在補充10% FBS之DMEM培養基中,將293α細胞(衍生自表現整聯蛋白αv及整聯蛋白β3之HEK293細胞的穩定表現細胞株)製備為5 x 10
5細胞/mL。根據使用Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific Inc.)的轉導程序,將pcDNA3.1-hCDH6或pcDNA3.1-cynoCDH6、或作為陰性對照之pcDNA3.1的DNA導入293α細胞,並將細胞以100 μL/孔之量分配於96孔盤(Corning Inc.)。之後,在37℃及5% CO
2條件下,於補充10% FBS之DMEM培養基中將細胞培養24至27小時。將所獲得之轉染細胞以黏著狀態用於Cell-ELISA。
1)-4-2 Cell-ELISA
將以參考實施例1)-4-1中所製備之表現載體轉染之293α細胞的培養上清液移除,然後將來自各融合瘤之培養上清液添加至以pcDNA3.1-hCDH6或pcDNA3.1-cynoCDH6、或pcDNA3.1轉染的293α細胞。將細胞在4℃靜置1小時。以補充5% FBS之PBS (+)洗滌孔中的細胞1次,之後將於兔子中生產的抗大鼠IgG-過氧化酶抗體(Anti-Rat IgG-Peroxidase antibody) (Sigma-Aldrich Co. LLC)以補充5% FBS之PBS (+)稀釋500倍並添加至孔中。將細胞在4℃靜置1小時。以補充5% FBS之PBS (+)洗滌孔中的細胞3次,之後將OPD呈色溶液(其藉由將鄰苯二胺二鹽酸鹽(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)及H
2O
2溶於OPD溶液(0.05 M檸檬酸三鈉、0.1 M磷酸氫二鈉12水;pH 4.5)而製備,從而這些物質分別變成0.4 mg/ml及0.6% (v/v))以100 μL/孔的量添加至孔中。在偶爾攪拌的情況下進行呈色反應。之後,將1 M HCl添加至盤中(100 μL/孔)以終止呈色反應,之後使用盤讀取機(plate reader) (ENVISION: PerkinElmer, Inc.)測量於490 nm之吸光度。選擇產生比以對照pcDNA3.1轉染之293α細胞呈現更高吸光度之培養上清液的以pcDNA3.1-hCDH6或pcDNA3.1-cynoCDH6表現載體轉染之293α細胞的融合瘤作為生產與人類CDH6及食蟹獼猴CDH6結合之抗體的融合瘤。
1)-5根據流式細胞測量術對於結合食蟹獼猴CDH6之抗體的選擇性篩選
1)-5-1用於流式細胞測量術分析之抗原基因表現細胞的製備
於225-cm
2燒瓶(Sumitomo Bakelite Co., Ltd.)中以5×10
4細胞/cm
2接種293T細胞,然後將細胞在37℃及5% CO
2之條件下,於補充10% FBS之DMEM培養基中培養隔夜。使用Lipofectamine 2000將作為陰性對照之pcDNA3.1-cynoCDH6或pcDNA3.1導入293T細胞中,並將細胞進一步在37℃及5% CO
2之條件下培養隔夜。以各載體轉染之293T細胞以TrypLE Express (Thermo Fisher Scientific Corp.)處理,並將細胞以補充10% FBS之DMEM洗滌,然後懸浮於補充5% FBS之PBS中。將獲得之細胞懸浮液用於流式細胞測量術分析。
1)-5-2流式細胞測量術分析
在參考實施例1)-4中藉由Cell-ELISA所選擇之由產生人類CDH6結合抗體的融合瘤及產生食蟹獼猴CDH6結合抗體的融合瘤所產生的抗體對於食蟹獼猴CDH6的結合特異性係藉由流式細胞測量術進一步確認。將參考實施例1)-5-1中製備之暫時性表現的293T細胞的懸浮液離心,然後移除上清液。之後,藉由添加來自各融合瘤之培養上清液,將細胞懸浮。將細胞在4℃靜置1小時。以補充5% FBS之PBS洗滌細胞兩次,之後,藉由添加以補充5% FBS之PBS稀釋500倍的抗大鼠IgG FITC結合物(Anti-Rat IgG FITC conjugate) (Sigma-Aldrich Co. LLC),將細胞懸浮。將細胞在4℃靜置1小時。以補充5% FBS之PBS洗滌細胞兩次,然後再懸浮於補充5% FBS及2 μg/ml 7-胺基放線菌素D (Molecular Probes, Inc.)之PBS中,隨後使用流式細胞儀(FC500;Beckman Coulter, Inc.)檢測。使用FlowJo (Tree Star, Inc.)分析資料。藉由閘控7-胺基放線菌素D陽性細胞而從分析中排除死細胞後,生成活細胞之FITC螢光強度的直方圖。基於結果選擇產生與表現於細胞膜表面上之食蟹獼猴CDH6特異性地結合之抗體的融合瘤,其中相較於以對照pcDNA3.1轉染之293T細胞,以pcDNA3.1-cynoCDH6轉染之293T細胞中抗體的直方圖移至強螢光強度側。
1)-6大鼠單株抗體同型之確定
從參考實施例1)-5中所選擇的產生大鼠抗CDH6抗體的融合瘤之中選出被暗示可特異性地且強烈地與人類CDH6及猴CDH6結合的殖株rG019、rG055、rG056及rG061,並鑑定各抗體的同型。使用大鼠單株抗體同型分析測試套組(DS Pharma Biomedical Co., Ltd.)確定抗體的重鏈子類及輕鏈類型。結果,確認這4種殖株rG019、rG055、rG056及rG061皆具有IgG2b子類的重鏈及κ鏈型的輕鏈。
1)-7大鼠抗人類CDH6抗體之製備
1)-7-1培養上清液的生產
從融合瘤培養上清液純化大鼠抗人類CDH6單株抗體。首先,以ClonaCell-HY選擇培養基E (StemCell Technologies Inc.)充分增加各產生大鼠抗CDH6單株抗體之融合瘤的體積,之後,以添加有20% Ultra Low IgG FBS (Thermo Fisher Scientific Corp.)之融合瘤SFM (Hybridoma SFM) (Thermo Fisher Scientific Corp.)更換培養基。之後,將融合瘤培養4至5天。收取所產生之培養上清液,藉由通過0.8-μm濾器並通過0.2-μm濾器而從其中移除不溶物。
1)-7-2大鼠抗CDH6抗體之純化
根據蛋白G親和力層析,從參考實施例1)-7-1中製備的融合瘤培養上清液中純化抗體(大鼠抗CDH6抗體(rG019、rG055、rG056或rG061))。將抗體吸附於蛋白G管柱(GE Healthcare Biosciences Corp.)上,然後以PBS洗滌管柱,然後以0.1 M甘胺酸/HCl水溶液(pH 2.7)洗提抗體。將1 M Tris-HCl (pH 9.0)添加至洗提物中,而將pH調整至pH 7.0至7.5。之後,使用離心UF過濾裝置(Centrifugal UF Filter Device) VIVASPIN20 (截留分子量:UF30K,Sartorius Inc.),以HBSor (25 mM組胺酸/5%山梨糖醇,pH 6.0)置換緩衝液,同時濃縮抗體,而將抗體濃度調整為1 mg/mL。最後,通過Minisart-Plus濾器(Sartorius Inc.)過濾抗體以獲得純化樣品。
[參考實施例2:大鼠抗CDH6抗體之活體外評估]
2)-1藉由流式細胞測量術評估大鼠抗CDH6抗體之結合能力
藉由流式細胞測量術評估參考實施例1)-7中產生的大鼠抗CDH6抗體的人類CDH6結合活性。使用Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific Inc.),將參考實施例1)-1中產生的pcDNA3.1-hCDH6暫時性地導入293T細胞(ATCC)。在37℃及5% CO
2的條件下將細胞培養隔夜,之後,製備細胞懸浮液。將經轉染的293T細胞懸浮液離心,然後移除上清液。之後,藉由添加參考實施例1)-7中製備之4種大鼠抗CDH6單株抗體(殖株編號:rG019、rG055、rG056及rG061)的各種、或大鼠IgG對照(R&D Systems, Inc.)(最終濃度:10 ng/mL),將細胞懸浮。將細胞在4℃靜置1小時。將細胞以補充5% FBS之PBS洗滌兩次,然後藉由添加以補充5% FBS之PBS稀釋50倍之於兔中生產的抗大鼠IgG(全分子)-FITC抗體(Sigma-Aldrich Co. LLC)而懸浮。將細胞在4℃靜置1小時。將細胞以補充5% FBS之PBS洗滌兩次,之後使用流式細胞儀(FC500;Beckman Coulter, Inc.)檢測。使用FlowJo (Tree Star, Inc.)分析資料。結果顯示於圖1。在圖1之直方圖中,橫坐標描繪表明結合的抗體量的FITC螢光強度,且縱坐標描繪細胞計數。陰影直方圖顯示使用未以hCDH6轉染的陰性對照293T細胞,空心實線直方圖顯示使用hCDH6轉染的293T細胞。如所見,抗體與細胞表面上的hCDH6結合而增強螢光強度。大鼠IgG對照不與任何細胞結合。結果,確認4種產生的大鼠抗CDH6單株抗體與以pcDNA3.1-hCDH6轉染的293T細胞結合。
2)-2藉由流式細胞測量術分析大鼠抗CDH6抗體之CDH6結合位
2)-2-1人類CDH6各域刪除突變體之表現載體的構築
人類CDH6之全長細胞外區域具有五種胞外域,EC1 (SEQ ID NO:2)、EC2 (SEQ ID NO:3)、EC3 (SEQ ID NO:4)、EC4 (SEQ ID NO:5)、及EC5 (SEQ ID NO:6)。根據本技術領域中具有通常知識者已知的方法,藉由GeneArt合成待表現的基因,使得可從全長人類CDH6中刪除五種EC域中的各個,並將其併入用於哺乳動物表現之p3xFLAG-CMV-9載體(Sigma-Aldrich Co. LLC)中,以便產生欠缺EC1至EC5中任一者的各域刪除突變體的表現載體。
2)-2-2使用域刪除突變體藉由流式細胞測量術分析大鼠抗CDH6抗體的表位
使用以各EC域刪除載體轉染的293α細胞株,藉由流式細胞測量術分析來鑑定大鼠抗人類CDH6抗體所結合的表位。使用Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific Inc.),將參考實施例2)-2-1中產生的各域刪除突變體表現載體、或用於表現全長人類CDH6之pcDNA3.1-hCDH6暫時性地導入293α細胞株中,該細胞株為藉由以整聯蛋白αv及整聯蛋白β3表現載體穩定轉染而衍生自HEK293細胞的一種細胞株。在37℃及5% CO
2的條件下將細胞培養隔夜,之後,製備細胞懸浮液。將經轉染的293α細胞懸浮液離心,然後移除上清液。之後,藉由添加參考實施例1)-7中製備之4種大鼠抗CDH6單株抗體(殖株編號:rG019、rG055、rG056及rG061)的各種、或大鼠IgG對照(R&D Systems, Inc.)(最終濃度:20 nM),將細胞懸浮。將細胞在4℃靜置1小時。將細胞以補充5% FBS之PBS洗滌兩次,然後藉由添加以補充5% FBS之PBS稀釋50倍之於兔中生產的抗大鼠IgG(全分子)-FITC抗體(Sigma-Aldrich Co. LLC)而懸浮。將細胞在4℃靜置1小時。將細胞以補充5% FBS之PBS洗滌兩次,之後使用流式細胞儀(Canto II;BD Biosciences)檢測。使用FlowJo (Tree Star, Inc.)分析資料。結果示於圖2-1至圖2-6中。在圖2-1至圖2-6之直方圖中,橫坐標描繪表明結合的抗體量的FITC螢光強度,且縱坐標描繪細胞計數。陰影直方圖顯示使用陰性對照未轉染的293α細胞,空心實線直方圖顯示使用表現全長hCDH6或各EC域刪除突變體的293細胞。當抗體與細胞表面的全長hCDH6或各EC域刪除突變體結合時,螢光強度增強。大鼠IgG對照不與任何轉染細胞結合。4種產生的大鼠抗CDH6單株抗體與全長hCDH6、EC1刪除突變體、EC2刪除突變體、EC4刪除突變體及EC5刪除突變體結合,但不與EC3刪除突變體結合。由此結果,證實4種大鼠抗CDH6單株抗體係以EC3作為表位而與hCDH6特異性地結合。
2)-3大鼠抗CDH6抗體之內化活性
2)-3-1確認人類腫瘤細胞株中之CDH6表現
為了選擇CDH6陽性人類腫瘤細胞株用於評估獲得的抗體,從已知資料庫中檢索CDH6表現資訊,並藉由流式細胞測量術評估CDH6在細胞膜表面的表現。將各人類卵巢腫瘤細胞株NIH:OVCAR-3、PA-1及ES-2以及人類腎細胞腫瘤細胞株786-O (均自ATCC獲得)在37℃及5% CO
2條件下培養,之後,製備細胞懸液。將細胞離心,然後移除上清液。之後,藉由添加市售的抗人類CDH6抗體(MABU2715,R&D Systems,Inc.)或作為陰性對照之小鼠IgG1 (BD Pharmingen)(最終濃度:50 μg/mL),將細胞懸浮。將細胞在4℃靜置1小時。將細胞以補充5% FBS之PBS洗滌兩次,然後藉由添加以補充5% FBS之PBS稀釋50倍的結合有FITC的山羊抗小鼠免疫球蛋白之F(ab')2片段(Dako)而懸浮。將細胞在4℃靜置1小時。將細胞以補充5% FBS之PBS洗滌兩次,之後使用流式細胞儀(Canto II;BD Biosciences)檢測。使用FlowJo (Tree Star, Inc.)分析資料。結果顯示於圖3。在圖3之直方圖中,橫坐標描繪表明結合的抗體量的FITC螢光強度,且縱坐標描繪細胞計數。陰影直方圖顯示陰性對照mIgG1用於染色,且空心實線直方圖顯示抗人類CDH6抗體用於染色。如所見,抗體與細胞表面上的hCDH6結合而增強螢光強度。mIgG1對照不與任何細胞結合。結果,確認NIH:OVCAR-3、PA-1及786-O細胞株在細胞表面上內源性地表現CDH6。另一方面,證實ES-2細胞株並不表現CDH6。
2)-3-2評估大鼠抗CDH6抗體之內化活性
使用與抑制蛋白質合成的毒素(皂草素)結合之抗大鼠IgG試劑Rat-ZAP (Advanced Targeting Systems)評估大鼠抗CDH6抗體的內化活性。具體而言,將人類CDH6陽性卵巢腫瘤細胞株NIH:OVCAR-3 (ATCC)以4 x 10
3個細胞/孔接種於96孔盤上,然後在37℃及5% CO
2的條件下培養隔夜。將人類CDH6陽性腎細胞腫瘤細胞株786-O (ATCC)以1 x 10
3個細胞/孔接種於96孔盤上,然後培養隔夜。次日,將各大鼠抗CDH6抗體(最終濃度:1 nM)或作為陰性對照抗體的大鼠IgG2b抗體(R&D Systems,Inc.)添加至盤中。將Rat-ZAP (最終濃度:0.5 nM)或作為陰性對照的未與毒素結合的Fc (γ)片段特異性山羊抗大鼠IgG (Goat Anti-Rat IgG, Fc (γ) Fragment Specific) (Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.)(最終濃度:0.5 nM)進一步添加至盤中,將細胞在37℃及5% CO
2的條件下培養3天。使用CellTiter-Glo (TM)冷光細胞生存力測定(Promega Corp.),藉由定量ATP活性(RLU)來測量活細胞的數量。在此評估中,Rat-ZAP以依賴於大鼠抗CDH6抗體的內化活性的方式被攝取至細胞中,從而將抑制蛋白質合成的皂草素釋放至細胞中,以壓制細胞生長。當在補充陰性對照來代替Rat-ZAP的孔中的活細胞數量被定義為100%時,相對存活率表明藉由添加抗CDH6抗體帶來的細胞生長抑制效果。圖4顯示細胞存活率的圖表及表格。結果,證實大鼠抗CDH6抗體與CDH6結合並引起內化。
[參考實施例3:確定編碼大鼠抗CDH6抗體可變區之cDNA的核苷酸序列]
3)-1 rG019重鏈可變區及輕鏈可變區基因片段的擴增及定序
3)-1-1從G019製備總RNA
為了擴增編碼rG019的各可變區的cDNA,使用TRIzol試劑(Ambion, Inc.)從G019製備總RNA。
3)-1-2藉由5'-RACE PCR擴增編碼rG019重鏈可變區之cDNA並確定核苷酸序列
使用參考實施例3)-1-1中製備的約1 μg之總RNA及SMARTer RACE cDNA擴增套組(Clontech Laboratories, Inc.)擴增編碼重鏈可變區的cDNA。作為用於根據PCR擴增rG019重鏈基因可變區之cDNA的引子,使用UPM (通用引子A Mix:包括在SMARTer RACE cDNA擴增套組中)及從已知大鼠重鏈恆定區序列設計的引子。
將藉由5'-RACE PCR擴增之編碼重鏈可變區的cDNA選殖至質體中,然後對重鏈可變區之cDNA的核苷酸序列進行序列分析。
所確定的編碼rG019重鏈可變區之cDNA的核苷酸序列顯示於SEQ ID NO:16,其胺基酸序列顯示於SEQ ID NO:15。
3)-1-3藉由5'-RACE PCR擴增編碼rG019輕鏈可變區之cDNA並確定核苷酸序列
藉由與參考實施例3)-1-2中所施用之方法相同的方法進行擴增及定序。然而,作為用於根據PCR擴增rG019輕鏈基因可變區之cDNA的引子,使用UPM (通用引子A Mix:包括在SMARTer RACE cDNA擴增套組中)及從已知大鼠輕鏈恆定區序列設計的引子。
所確定的編碼rG019輕鏈可變區之cDNA的核苷酸序列顯示於SEQ ID NO:11,其胺基酸序列顯示於SEQ ID NO:10。
3)-2 rG055重鏈可變區及輕鏈可變區基因片段的擴增及定序
藉由與參考實施例3)-1中所施用之方法相同的方法確定序列。
所確定的編碼rG055重鏈可變區之cDNA的核苷酸序列顯示於SEQ ID NO:26,其胺基酸序列顯示於SEQ ID NO:25。編碼rG055輕鏈可變區之cDNA的核苷酸序列顯示於SEQ ID NO:21,其胺基酸序列顯示於SEQ ID NO:20。
3)-3 rG056重鏈可變區及輕鏈可變區基因片段的擴增及定序
藉由與參考實施例3)-1中所施用之方法相同的方法確定序列。
所確定的編碼rG056重鏈可變區之cDNA的核苷酸序列顯示於SEQ ID NO:36,其胺基酸序列顯示於SEQ ID NO:35。編碼rG056輕鏈可變區之cDNA的核苷酸序列顯示於SEQ ID NO:31,其胺基酸序列顯示於SEQ ID NO:30。
3)-4 rG061重鏈可變區及輕鏈可變區基因片段的擴增及定序
藉由與參考實施例3)-1中所施用之方法相同的方法確定序列。
所確定的編碼rG061重鏈可變區之cDNA的核苷酸序列顯示於SEQ ID NO:46,其胺基酸序列顯示於SEQ ID NO:45。編碼rG061輕鏈可變區之cDNA的核苷酸序列顯示於SEQ ID NO:41,其胺基酸序列顯示於SEQ ID NO:40。
[參考實施例4:人類嵌合抗CDH6抗體chG019之生產]
4)-1人類嵌合抗CDH6抗體chG019表現載體之構築
4)-1-1嵌合及人源化輕鏈表現載體pCMA-LK之構築
使用In-Fusion Advantage PCR選殖套組(Clontech Laboratories, Inc.),將藉由以限制酶XbaI及PmeI消化質體pcDNA3.3-TOPO/LacZ (Invitrogen Corp.)所獲得的約5.4-kb片段與包含編碼人類輕鏈訊息序列及人類κ鏈恆定區的DNA序列(SEQ ID NO:50)的DNA片段結合,以產生pcDNA3.3/LK。
從pcDNA3.3/LK中去除新黴素表現單元以構築pCMA-LK。
4)-1-2嵌合及人源化IgG1型重鏈表現載體pCMA-G1之構築
使用In-Fusion Advantage PCR選殖套組(Clontech Laboratories, Inc.),將藉由以XbaI及PmeI消化pCMA-LK以去除編碼輕鏈訊息序列及人類κ鏈恆定區的DNA序列所獲得的DNA片段與包含編碼人類重鏈訊息序列及人類IgG1恆定區之DNA序列(SEQ ID NO:51)的DNA片段結合,以構築pCMA-G1。
4)-1-3 chG019重鏈表現載體之構築
合成SEQ ID No:57所示之chG019重鏈的核苷酸序列中核苷酸位置36至440的DNA片段(GENEART)。使用In-Fusion HD PCR選殖套組(Clontech Laboratories, Inc.),將合成的DNA片段插入pCMA-G1已被限制酶BlpI切割的部位,以構築chG019重鏈表現載體。應注意的是,對於chG019重鏈,為了防止不可預期的雙硫鍵而使用以脯胺酸取代半胱胺酸之CDR序列。
4)-1-4 chG019輕鏈表現載體之構築
合成包含編碼chG019輕鏈之DNA序列(SEQ ID NO:52)的DNA片段(GENEART)。使用In-Fusion HD PCR選殖套組(Clontech Laboratories, Inc.),將合成的DNA片段與藉由以XbaI及PmeI消化pCMA-LK以去除編碼輕鏈訊息序列及人類κ鏈恆定區之DNA序列所獲得的DNA片段結合,以構築chG019輕鏈表現載體。
4)-2人類嵌合抗CDH6抗體chG019之生產及純化
4)-2-1 chG019之生產
根據手冊,將FreeStyle 293F細胞(Invitrogen Corp.)培養並繼代。將處於對數生長期的1.2×10
9FreeStyle 293F細胞(Invitrogen Corp.)接種於3-L Fernbach Erlenmeyer燒瓶(Corning Inc.),然後以FreeStyle 293表現培養基(Invitrogen Corp.)稀釋至2.0×10
6細胞/mL。在40 ml Opti-Pro SFM培養基(Invitrogen Corp.)中,添加0.24 mg重鏈表現載體、0.36 mg輕鏈表現載體及1.8 mg聚乙烯亞胺(Polyscience #24765),並輕輕攪拌所得之混合物。培育5分鐘後,將混合物添加至FreeStyle 293F細胞中。將細胞在8% CO
2培養箱中以90 rpm在37℃下振盪培養4小時,之後,將600 mL EX-CELL VPRO培養基(SAFC Biosciences Inc.)、18 mL GlutaMAX I (GIBCO)及30 mL Yeastolate超濾液(GIBCO)添加至培養物中。將細胞在8% CO
2培養箱中以90 rpm在37℃下進一步振盪培養7天。通過拋棄式膠囊型濾器(Advantec #CCS-045-E1H)過濾所獲得之培養上清液。
4)-2-2 chG019之純化
根據rProtein A親和力層析,藉由一步驟法從參考實施例4)-2-1中獲得的培養上清液中純化抗體。將培養上清液施用於裝填有以PBS平衡之MabSelectSuRe (GE Healthcare Biosciences Corp.)的管柱,之後,以管柱體積的兩倍或更多倍之量的PBS洗滌管柱。隨後,以2M精胺酸鹽酸鹽溶液(pH 4.0)洗提抗體,從而收集含有抗體之流分。對流分進行透析(Thermo Fisher Scientific Inc.,Slide-A-Lyzer透析匣),從而以HBSor (25 mM 組胺酸/5%山梨糖醇,pH 6.0)置換緩衝液。使用離心UF過濾裝置VIVASPIN20 (截留分子量:UF10K,Sartorius Inc.),濃縮抗體,將IgG濃度調整為5 mg/ml以上。最後,通過Minisart-Plus濾器(Sartorius Inc.)過濾抗體以獲得純化樣品。
4)-3評估人類嵌合抗CDH6抗體chG019之結合活性
藉由流式細胞測量術確認在4)-2中純化之人類嵌合抗CDH6抗體chG019的之CDH6結合活性。使用Lipofectamine 2000,將參考實施例1)-1產生之pcDNA3.1-hCDH6或pcDNA3.1-cynoCDH6、或pcDNA3.1暫時性地導入293α細胞中。在37℃及5% CO
2的條件下將細胞培養隔夜,之後,製備細胞懸浮液。將chG019添加至這些細胞中的各懸浮液。將細胞在4℃靜置1小時。之後,將細胞以補充5% FBS之PBS洗滌兩次,然後藉由添加以補充5% FBS之PBS稀釋500倍的經PE標識的F(ab')2片段抗人類IgG之Fcγ抗體(PE-labeled F(ab')2 Fragment anti-human IgG, Fcγ antibody) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)而懸浮。將細胞在4℃靜置1小時。將細胞以補充5% FBS之PBS洗滌兩次,然後再懸浮於補充5% FBS之PBS中,之後使用流式細胞儀(Canto II;BD Biosciences)檢測。使用FlowJo (Tree Star, Inc.)分析資料。如圖5所示,chG019並未結合作為陰性對照之以pcDNA3.1轉染的293α細胞,但以抗體濃度依賴性的方式與以pcDNA3.1-hCDH6或pcDNA3.1-cynoCDH6轉染的293α細胞結合。在圖5中,橫坐標描繪抗體濃度,縱坐標描繪基於平均螢光強度之結合的抗體量。從此結果可看出,chG019以幾乎同等的結合活性而特異性地結合人類CDH6及食蟹獼猴CDH6。
[參考實施例5:人源化抗CDH6抗體之生產]
5)-1抗CDH6抗體之人源化型式的設計
5)-1-1 chG019可變區的分子模擬
chG019可變區的分子模擬採用一種已知為同源模擬的方法(Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991))。使用市售蛋白質三維結構分析程式BioLuminate (Schrodinger, LLC製),使用登錄在Protein Data Bank (Nuc. Acid Res. 35, D301-D303 (2007))之結構(PDB ID:2I9L)作為模板,該結構與chG019之重鏈及輕鏈可變區具有高的序列同一性。
5)-1-2人源化hG019之胺基酸序列的設計
藉由CDR移植將chG019人源化(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989))。KABAT等人所確定的人類γ鏈子群1及κ鏈子群1的共通序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))係與chG019的框架區具有高的同一性,並基於此而分別選擇彼等作為重鏈及輕鏈的接受體。參考例如Queen等人(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989))所給出的基準,藉由分析三維模型來選擇待移植至接受體上的給予體殘基。
5)-2 chG019重鏈之人源化
如此設計的三個重鏈被命名為hH01、hH02及hH04。hH01重鏈之全長胺基酸序列顯示於SEQ ID NO:69。編碼SEQ ID NO:69之胺基酸序列的核苷酸序列顯示於SEQ ID NO:70。重鏈hH02之全長胺基酸序列顯示於SEQ ID NO:73。編碼SEQ ID NO:73之胺基酸序列的核苷酸序列顯示於SEQ ID NO:74。重鏈hH04之全長胺基酸序列顯示於SEQ ID NO:77。編碼SEQ ID NO:77之胺基酸序列的核苷酸序列顯示於SEQ ID NO:78。
5)-3 chG019輕鏈之人源化
如此設計的二個輕鏈被命名為hL02及hL03。hL02輕鏈之全長胺基酸序列顯示於SEQ ID NO:61。編碼SEQ ID NO:61之胺基酸序列的核苷酸序列顯示於SEQ ID NO:62。輕鏈hL03之全長胺基酸序列顯示於SEQ ID NO:65。編碼SEQ ID NO:65之胺基酸序列的核苷酸序列顯示於SEQ ID NO:66。
5)-4藉由組合重鏈及輕鏈而設計人源化hG019
由hH01及hL02組成之抗體被命名為「H01L02抗體」或「H01L02」。由hH02及hL02組成之抗體被命名為「H02L02抗體」或「H02L02」。由hH02及hL03組成之抗體被命名為「H02L03抗體」或「H02L03」。由hH04及hL02組成之抗體被命名為「H04L02抗體」或「H04L02」。
5)-5人源化抗CDH6抗體之表現
5)-5-1人源化hG019重鏈表現載體之構築
5)-5-1-1人源化hG019-H01型重鏈表現載體之構築
合成SEQ ID NO:70所示之人源化hG019-H01型重鏈的核苷酸序列中核苷酸位置36至440的DNA片段(GENEART)。藉由與參考實施例4)-1-3中所施用之方法相同的方法構築人源化hG019-H01型重鏈表現載體。
5)-5-1-2人源化hG019-H02型重鏈表現載體之構築
合成SEQ ID NO:74所示之人源化hG019-H02型重鏈的核苷酸序列中核苷酸位置36至440的DNA片段(GENEART)。藉由與參考實施例4)-1-3中所施用之方法相同的方法構築人源化hG019-H02型重鏈表現載體。
5)-5-1-3人源化hG019-H04型重鏈表現載體之構築
合成SEQ ID NO:78所示之人源化hG019-H04型重鏈的核苷酸序列中核苷酸位置36至440的DNA片段(GENEART)。藉由與參考實施例4)-1-3中所施用之方法相同的方法構築人源化hG019-H04型重鏈表現載體。
5)-5-2人源化hG019輕鏈表現載體之構築
5)-5-2-1人源化hG019-L02型重鏈表現載體之構築
合成SEQ ID NO:62所示之人源化hG019-L02型輕鏈的核苷酸序列中核苷酸位置37至399的DNA片段(GENEART),該DNA片段包含編碼人源化hG019-L02型輕鏈可變區的DNA序列。使用In-Fusion HD PCR選殖套組(Clontech Laboratories, Inc.),將合成的DNA片段插入pCMA-LK已被限制酶BsiWI切割的部位,以構築人源化hG019-L02型輕鏈表現載體。
5)-5-2-2人源化hG019-L03型輕鏈表現載體之構築
合成SEQ ID NO:66所示之人源化hG019-L03型輕鏈的核苷酸序列中核苷酸位置37至399的DNA片段(GENEART),該DNA片段包含編碼人源化hG019-L03型輕鏈可變區的DNA序列。人源化hG019-L03型輕鏈表現載體藉由與參考實施例5)-5-2-1中所施用之方法相同的方法構築。
5)-5-3人源化hG019之製備
5)-5-3-1 H01L02、H02L02、H02L03及H04L02之生產
藉由與參考實施例4)-2-1中所施用之方法相同的方法生產抗體。藉由組合參考實施例5)-4中所示之重鏈及輕鏈而生產H01L02、H02L02、H02L03及H04L02。
5)-5-3-2 H01L02、H02L02、H02L03及H04L02之二步驟純化
藉由二步驟法,即藉由rProtein A親和力層析及陶瓷羥磷灰石,從參考實施例5)-5-3-1獲得之培養上清液純化抗體。將培養上清液施用於裝填有以PBS平衡之MabSelectSuRe (GE Healthcare Biosciences Corp.製)的管柱,之後,以管柱體積的兩倍或更多倍之量的PBS洗滌管柱。隨後,使用2 M精胺酸鹽酸鹽溶液(pH 4.0)洗提抗體。對含有抗體之流分進行透析(Thermo Fisher Scientific Inc.,Slide-A-Lyzer透析匣),從而以PBS置換緩衝液。以5 mM磷酸鈉/50 mM MES/pH 7.0之緩衝液將抗體溶液稀釋5倍,然後施用於陶瓷羥磷灰石管柱(Bio-Rad Laboratories, Inc., Bio-Scale CHT Type-1陶瓷羥磷灰石管柱),該管柱已用5 mM NaPi/50 mM MES/30 mM NaCl/pH 7.0的緩衝液平衡。以氯化鈉的線性濃度梯度進行洗提,從而收集含有抗體的流分。對此流分進行透析(Thermo Fisher Scientific Inc.,Slide-A-Lyzer透析匣),從而以HBSor (25 mM組胺酸/5%山梨糖醇,pH 6.0)置換緩衝液。以離心UF過濾裝置VIVASPIN20 (截留分子量:UF10K,Sartorius Inc.)濃縮抗體,從而將IgG濃度調整至20 mg/ml。最後,通過Minisart-Plus濾器(Sartorius Inc.)過濾抗體以獲得純化樣品。
[參考實施例A:抗CDH6抗體NOV0712之生產]
參考實施例中使用的抗CDH6抗體NOV0712係參照國際公開號WO 2016/024195中所述之NOV0712的輕鏈全長及重鏈全長胺基酸序列(分別為國際公開號WO 2016/024195中的SEQ ID NO:235及SEQ ID NO:234)而生產。
參考實施例A)-1抗CDH6抗體NOV0712
參考實施例A)-1-1抗CDH6抗體NOV0712重鏈表現載體之構築
合成SEQ ID NO:84所示之NOV0712重鏈核苷酸序列中核苷酸位置36至428的編碼NOV0712重鏈可變區的DNA片段(GENEART)。NOV0712重鏈表現載體藉由與參考實施例4)-1-3中所施用之方法相同的方法構築。由NOV0712重鏈表現載體所表現的NOV0712重鏈胺基酸序列顯示於SEQ ID NO:83。在SEQ ID NO:83所示之胺基酸序列中,由位置1至19的胺基酸殘基組成之胺基酸序列為訊息序列。
參考實施例A)-1-2抗CDH6抗體NOV0712輕鏈表現載體之構築
合成SEQ ID NO:82所示之NOV0712輕鏈的核苷酸序列中核苷酸位置37至405的DNA片段(GENEART),該DNA片段包含編碼NOV0712輕鏈可變區的DNA序列。藉由與參考實施例5)-5-2-1中所施用之方法相同的方法構築NOV0712輕鏈表現載體。由NOV0712輕鏈表現載體所表現的NOV0712輕鏈胺基酸序列顯示於SEQ ID NO:81。在SEQ ID NO:81所示之胺基酸序列中,由位置1至20的胺基酸殘基組成之胺基酸序列為訊息序列。
參考實施例A)-2抗CDH6抗體NOV0712之製備
參考實施例A)-2-1抗CDH6抗體NOV0712之生產
藉由與參考實施例4)-2-1中所施用之方法相同的方法生產NOV0712。
參考實施例A)-2-2抗CDH6抗體NOV0712之一步驟純化
藉由與參考實施例4)-2-2中所施用之方法相同的方法,從參考實施例A)-2-1中獲得之培養上清液中純化抗CDH6抗體NOV0712(抗體濃度:5mg/l HBSor)。
[參考實施例6:人源化hG019及NOV0712之活體外評估]
6)-1評估人源化hG019之結合活性
6)-1-1人源化hG019之人類CDH6抗原結合能力
藉由使用Biacore T200 (GE Healthcare Biosciences Corp.),根據捕獲法測量抗體及抗原(重組人類CDH6 Fc His嵌合體,R&D Systems, Inc.)之間的解離常數,該方法包含以經固定的抗His抗體來捕獲作為配體的抗原,然後使用抗體作為分析物而測量解離常數。藉由胺偶合法將約1000 RU的抗組胺酸抗體(His捕獲套組,GE Healthcare Biosciences Corp.)與感測器晶片CM5 (GE Healthcare Biosciences Corp.)共價結合。以與上述相同的方式亦將抗體固定於參考細胞上。使用補充1 mM CaCl
2之HBS-P+(10 mM HEPES pH 7.4、0.15 M NaCl、0.05%界面活性劑P20)作為電泳緩衝液。將抗原添加至固定有抗組胺酸抗體的晶片上60秒,然後以30 μl/min的流速添加抗體的連續稀釋溶液(0.391至100 nM) 300秒。隨後,監測解離階段600秒。作為再生溶液,以10 μl/min的流速添加兩次補充5 M MgCl2之甘胺酸溶液(pH 1.5) 30秒。將分析軟體(BIAevaluation軟體,4.1版)中的穩定狀態親和力(Steady State Affinity)模型用於資料分析,並計算解離常數(KD)。結果顯示於表2。
[表2]
抗體 | KD(M) | |
1 | H01L02 | 1.5E-09 |
2 | H02L02 | 1.1E-09 |
3 | H02L03 | 1.4E-09 |
4 | H04L02 | 1.1E-09 |
6)-1-2對於人類、猴、小鼠或大鼠CDH6之結合活性
使用Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific Inc.),將參考實施例1)-1中產生的pcDNA3.1-hCDH6、pcDNA3.1-cynoCDH6、p3xFLAG-CMV-9-mCDH6、或p3xFLAG-CMV-9-rCDH6暫時性地導入293α細胞。在37℃及5% CO
2的條件下將細胞培養隔夜,之後,製備細胞懸浮液。使用未轉染之293α細胞作為陰性對照。將如上述製造的293α細胞懸浮液離心,然後移除上清液。之後,藉由添加參考實施例5)-5-3中製備之4種人源化hG019抗體(殖株編號:H01L02、H02L02、H02L03及H04L02)的各種、或人類IgG1對照(Calbiochem),將細胞懸浮。將細胞在4℃靜置1小時。將細胞以補充5% FBS之PBS洗滌兩次,然後藉由添加以補充5% FBS之PBS稀釋500倍的抗人類IgG之Fc(γ) PE山羊F(ab') (anti-human IgG, Fc(γ) PE goat F(ab')) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)而懸浮。將細胞在4℃靜置1小時。將細胞以補充5% FBS之PBS洗滌兩次,之後使用流式細胞儀(Canto II;BD Biosciences)檢測。使用FlowJo (Tree Star, Inc.)分析資料。在圖6-1及6-2中,橫坐標描繪抗體濃度,縱坐標描繪基於平均螢光強度之結合的抗體量。如圖6-1及6-2所示,作為陰性對照的人類IgG1對照不與任何CDH6轉染的細胞結合。4種人源化hG019抗體(殖株編號:H01L02、H02L02、H02L03及H04L02)與人類CDH6及食蟹獼猴CDH6結合,但並不與小鼠及大鼠CDH6結合。沒有抗體與作為陰性對照之以空載體pcDNA3.1轉染的細胞結合。另一方面,國際公開號WO 2016/024195揭示NOV0712抗體呈現對人類CDH6、食蟹獼猴CDH6、小鼠CDH6及大鼠CDH6全部的結合活性。結果,證實本說明中獲得的4種人源化hG019抗體係呈現與NOV0712抗體不同的結合特性的抗CDH6抗體。
6)-2人源化hG019及NOV0712的CDH6結合位分析
6)-2-1使用域刪除突變體的表位分析
使用Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific Inc.),將參考實施例2)-2-1中產生的各域刪除突變體表現載體、或用於表現全長人類CDH6的pcDNA3.1-hCDH6暫時性地導入細胞中。在37℃及5% CO
2的條件下將細胞培養隔夜,之後,製備細胞懸浮液。將經轉染的293α細胞懸浮液離心,然後移除上清液。之後,藉由添加參考實施例5)-5-3中製備之4種人源化hG019抗體(殖株編號:H01L02、H02L02、H02L03及H04L02)的各種、或參考實施例A中製備的抗CDH6抗體NOV0712、或作為陰性對照的人類IgG1 (Calbiochem),將細胞懸浮。將細胞在4℃靜置1小時。將細胞以補充5% FBS之PBS洗滌兩次,然後藉由添加以補充5% FBS之PBS稀釋500倍的APC-抗人類IgG山羊F(ab')2 (APC-anti-human IgG goat F(ab')2) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)而懸浮。將細胞在4℃靜置1小時。將細胞以補充5% FBS之PBS洗滌兩次,之後使用流式細胞儀(Canto II;BD Biosciences)檢測。使用FlowJo (Tree Star, Inc.)分析資料。結果示於圖7-1至圖7-6中。在圖7-1至圖7-6之直方圖中,橫坐標描繪表明結合的抗體量的APC螢光強度,且縱坐標描繪細胞計數。陰影直方圖顯示使用陰性對照未轉染的293α細胞,空心實線直方圖顯示使用表現全長hCDH6或各EC域刪除突變體的293α細胞。當抗體與細胞表面的全長hCDH6或各EC域刪除突變體結合時,螢光強度增強。人類IgG1對照不與任何轉染細胞結合。4種人源化hG019抗體(殖株編號:H01L02、H02L02、H02L03及H04L02)與全長hCDH6、EC1刪除突變體、EC2刪除突變體、EC4刪除突變體及EC5刪除突變體結合,但不與EC3刪除突變體結合。具體而言,其證實4種人源化hG019抗體係以EC3作為表位而與hCDH6特異性地結合。另一方面,抗CDH6抗體NOV0712與全長hCDH6、EC1刪除突變體、EC2刪除突變體、EC3刪除突變體、及EC4刪除突變體結合,但不與EC5刪除突變體結合。具體而言,其證實抗CDH6抗體NOV0712係以EC5作為表位而與hCDH6特異性地結合。此與國際公開號WO 2016/024195中所述關於NOV0712的表位資訊一致。從此結果,證實本說明中獲得的4種人源化hG019抗體係呈現與NOV0712不同的特性的抗CDH6抗體。
6)-2-2抗體之結合競爭測定
6)-2-2-1 786-O/hCDH6穩定表現細胞株之生產
藉由以重組反轉錄病毒感染786-O細胞(ATCC)來產生786-O/hCDH6穩定表現細胞株,用於全長人類CDH6表現。根據本技術領域中具有通常知識者已知的方法,藉由使用編碼人類CDH6蛋白(NP_004923)的cDNA表現載體(OriGene Technologies Inc.,RC217889),並將該cDNA併入反轉錄病毒載體pQCXIN (Clontech Laboratories, Inc.)中來產生人類CDH6表現反轉錄病毒載體(pQCXIN-hCDH6)。使用FuGene HD (Promega Corp.),將pQCXIN-hCDH6暫時性地導入反轉錄病毒包裝細胞RetroPack PT67 (Clontech Laboratories, Inc.)。48小時後,回收含有重組反轉錄病毒的培養上清液,然後添加至786-O細胞培養系統中,將細胞感染。從感染後3天起,感染的細胞在37℃及5% CO
2的條件下,在補充G418 (Gibco) (最終濃度:50 mg/mL)的培養基中培養並以藥物篩選,以建立穩定表現人類CDH6的細胞株786-O/hCDH6。以與參考實施例2)-3-1中施用之相同的方式,藉由流式細胞測量術確認穩定表現株中人類CDH6的高表現(圖8)。使用以補充5% FBS的PBS稀釋500倍的山羊抗小鼠IgG1二級抗體Alexa Fluor 647 (Thermo Fisher Scientific Inc.)作為檢測抗體。結果顯示於圖8。在圖8之直方圖中,橫坐標描繪表明結合的抗體量的Alexa Fluor 647螢光強度,且縱坐標描繪細胞計數。陰影直方圖顯示陰性對照mIgG1用於染色,且空心實線直方圖顯示抗人類CDH6抗體用於染色。如所見,抗體與細胞表面上的hCDH6結合而增強螢光強度。mIgG1對照不與任何細胞結合。結果,證實786-O/hCDH6穩定表現細胞株比親代株786-O細胞更高度地表現人類CDH6。
6)-2-2-2使用經標識的H01L02及經標識的NOV0712之結合競爭測定
使用Alexa Fluor 488單株抗體標識套組(Thermo Fisher Scientific Inc.)生產經標識的H01L02及經標識的NOV0712。將6)-2-2-1中產生的786-O/hCDH6穩定表現細胞株的細胞懸浮液離心,然後移除上清液。之後,藉由添加經標識的NOV0712或經標識的 H01L02 (最終濃度:5 nM),及進一步添加參考實施例5)-5-3中製備之4種人源化hG019抗體(殖株編號:H01L02、H02L02、H02L03及H04L02)的各種、或參考實施例A中製備的抗CDH6抗體NOV0712、或作為陰性對照的人類IgG1 (Calbiochem) (最終濃度:如圖9橫坐標所示),將細胞懸浮。將細胞在4℃靜置1小時。之後,將細胞以補充5% FBS之PBS洗滌兩次,之後使用流式細胞儀(Canto II;BD Biosciences)檢測。使用FlowJo (Tree Star, Inc.)分析資料。結果顯示於圖9。橫坐標描繪添加的未標識的抗體的最終濃度,縱坐標描繪基於平均螢光強度之結合的抗體量。當未標識的NOV0712添加至以經標識的 NOV0712補充的細胞中時,藉由以添加濃度依賴性的方式置換為未標識的抗體,結合的經標識的抗體的量減少,因為彼等相互競爭結合相同的表位。另一方面,即使將4種人源化hG019抗體的各種或作為陰性對照的人類IgG1添加至以經標識的NOV0712補充的細胞中,結合的經標識的抗體的量並沒有變化,表明這些抗體的表位不同,因此不相互競爭結合。同樣地,當將4種未標識的人源化hG019抗體的各種添加至以經標識的H01L02補充的細胞中時,藉由以添加濃度依賴性的方式置換為未標識的抗體,結合的經標識的抗體的量減少,因為彼等相互競爭結合相同的表位。另一方面,即使將NOV0712或作為陰性對照的人類IgG1添加至以經標識的H01L02補充的細胞中,結合的經標識的抗體的量並沒有變化,表明這些抗體的表位不同,因此不相互競爭結合。
6)-3評估人源化hG019及NOV0712之內化活性
使用與抑制蛋白質合成的毒素(皂草素)結合之抗人類IgG試劑Hum-ZAP (Advanced Targeting Systems)評估人源化hG019及NOV0712之內化活性。具體而言,將人類CDH6陽性卵巢腫瘤細胞株NIH:OVCAR-3 (ATCC)以4 x 10
3個細胞/孔接種於96孔盤上,然後在37℃及5% CO
2的條件下培養隔夜。將人類CDH6陽性腎細胞腫瘤細胞株786-O (ATCC)以1 x 10
3個細胞/孔接種於96孔盤上,然後培養隔夜。將人類CDH6陽性卵巢腫瘤細胞株PA-1 (ATCC)以1 x 10
3個細胞/孔接種於96孔盤上,然後在37℃及5% CO
2的條件下培養隔夜。次日,將各抗CDH6抗體(最終濃度:1 nM)或作為陰性對照抗體的人類IgG1抗體(Calbiochem)添加至盤中。將Hum-ZAP (最終濃度:0.5 nM)或作為陰性對照的未與毒素結合的Fc (γ)片段特異性F(ab')2片段山羊抗人類IgG (F(ab')2 Fragment Goat Anti-human IgG, Fc (γ) Fragment Specific) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)(最終濃度:0.5 nM)進一步添加至盤中,將細胞在37℃及5% CO
2的條件下培養3天。使用CellTiter-Glo(TM)冷光細胞生存力測定,藉由定量ATP活性(RLU)來測量活細胞的數量。在此評估中,Hum-ZAP以依賴於人源化抗CDH6抗體的內化活性的方式被攝取至細胞中,從而將抑制蛋白質合成的皂草素釋放至細胞中,以壓制細胞生長。當在補充陰性對照來代替Hum-ZAP的孔中的活細胞數量被定義為100%時,相對存活率表明藉由添加抗CDH6抗體帶來的細胞生長抑制效果。圖10-1至10-3各顯示細胞存活率的圖表及表格。在本實驗中,具有強的內化活性的抗體被認為提供低的細胞存活率。結果,從對於3種細胞株全部的細胞存活率來預測,4種人源化hG019抗體的內化率約為50%至75%。因此,4種人源化hG019抗體呈現非常高的內化活性,且呈現比NOV0712高更多的內化活性。從ADC的藥效機制來看,內化活性較高的抗體被認為更適合作為ADC抗體。
[參考實施例7:人源化hG019-藥物結合物之生產]
7)-1抗體-藥物結合物H01L02-DXd之生產
步驟1:抗體-藥物結合物(1)
抗體之還原:藉由使用生產方法1所述之共通程序B (使用1.53 mLmg
-1cm
-1作為280 nm吸光係數)及C,將參考實施例5中生產之H01L02以PBS6.0/EDTA調整至9.85 mg/mL。在此溶液(5.7 mL)中,添加10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.)水溶液(0.231 mL;每抗體分子6.0當量)及1 M磷酸氫二鉀水溶液(Nacalai Tesque,Inc.;0.0855 mL)。在確認溶液的pH在7.0 ± 0.1之內後,藉由將溶液在37℃培育2小時來還原抗體中的鏈間雙硫鍵。
抗體及藥物連接子之間的結合:將上述溶液在15℃培育10分鐘。隨後,對其加入N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯丙胺醯基-N-(2-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3',4':6,7]吲并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-2-側氧基乙氧基)甲基]甘胺醯胺之在二甲亞碸中的10 mM溶液(0.386 mL;每抗體分子10當量),並將所獲得之混合物於15℃培育1小時以結合藥物連接子與抗體。隨後,對其加入100 mM NAC(Sigma-Aldrich Co. LLC)水溶液(0.0347 mL;每抗體分子9當量),並將所獲得之混合物在室溫下進一步攪拌20分鐘以終止藥物連接子之反應。
純化:藉由生產方法1所述之共通程序D純化上述溶液,獲得19mL含有標題抗體-藥物結合物「H01L02-ADC」之溶液。
特性分析:使用生產方法1所述之共通程序E(使用ε
D,280=5440及ε
D,370=21240),獲得下列特徵值。
抗體濃度:2.26 mg/mL,抗體產量:42.9 mg (76%),藉由共通程序E測量之每個抗體分子結合的藥物分子的平均數量(n):5.9,且藉由共通程序F測量之每個抗體分子結合的藥物分子的平均數量(n):7.7。
7)-2抗體-藥物結合物H02L02-DXd之生產
步驟1:抗體-藥物結合物(2)
抗體之還原:藉由使用生產方法1所述之共通程序B (使用1.51 mLmg
-1cm
-1作為280 nm吸光係數)及C,將參考實施例5中生產之H02L02以PBS6.0/EDTA調整至9.95 mg/mL。在此溶液(5.7 mL)中,添加10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.)水溶液(0.234 mL;每抗體分子6.0當量)及1 M磷酸氫二鉀水溶液(Nacalai Tesque,Inc.;0.0855 mL)。在確認溶液的pH在7.0 ± 0.1之內後,藉由將溶液在37℃培育2小時來還原抗體中的鏈間雙硫鍵。
抗體及藥物連接子之間的結合:將上述溶液在15℃培育10分鐘。隨後,對其加入N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯丙胺醯基-N-(2-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3',4':6,7]吲并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-2-側氧基乙氧基)甲基]甘胺醯胺之在二甲亞碸中的10 mM溶液(0.389 mL;每抗體分子10當量),並將所獲得之混合物於15℃培育1小時以結合藥物連接子與抗體。隨後,對其加入100 mM NAC(Sigma-Aldrich Co. LLC)水溶液(0.0350 mL;每抗體分子9當量),並將所獲得之混合物在室溫下進一步攪拌20分鐘以終止藥物連接子之反應。
純化:藉由生產方法1所述之共通程序D純化上述溶液,獲得19mL含有標題抗體-藥物結合物「H02L02-ADC」之溶液。
特性分析:使用生產方法1所述之共通程序E(使用ε
D,280=5440及ε
D,370=21240),獲得下列特徵值。
抗體濃度:2.61 mg/mL,抗體產量:49.6 mg (87%),藉由共通程序E測量之每個抗體分子結合的藥物分子的平均數量(n):5.9,且藉由共通程序F測量之每個抗體分子結合的藥物分子的平均數量(n):7.6。
7)-3抗體-藥物結合物H02L03-DXd之生產
步驟1:抗體-藥物結合物(3)
抗體之還原:藉由使用生產方法1所述之共通程序B (使用1.53 mLmg
-1cm
-1作為280 nm吸光係數)及C,將參考實施例5中生產之H02L03以PBS6.0/EDTA調整至9.86 mg/mL。在此溶液(5.7 mL)中,添加10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.)水溶液(0.270 mL;每抗體分子7.0當量)及1 M磷酸氫二鉀水溶液(Nacalai Tesque,Inc.;0.0855 mL)。在確認溶液的pH在7.0 ± 0.1之內後,藉由將溶液在37℃培育2小時來還原抗體中的鏈間雙硫鍵。
抗體及藥物連接子之間的結合:將上述溶液在15℃培育10分鐘。隨後,對其加入N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯丙胺醯基-N-(2-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3',4':6,7]吲并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-2-側氧基乙氧基)甲基]甘胺醯胺之在二甲亞碸中的10 mM溶液(0.386 mL;每抗體分子10當量),並將所獲得之混合物於15℃培育1小時以結合藥物連接子與抗體。隨後,對其加入100 mM NAC(Sigma-Aldrich Co. LLC)水溶液(0.0347 mL;每抗體分子9當量),並將所獲得之混合物在室溫下進一步攪拌20分鐘以終止藥物連接子之反應。
純化:藉由生產方法1所述之共通程序D純化上述溶液,獲得19mL含有標題抗體-藥物結合物「H01L02-ADC」之溶液。
特性分析:使用生產方法1所述之共通程序E((使用ε
D,280=5440及ε
D,370=21240),獲得下列特徵值。
抗體濃度:2.71 mg/mL,抗體產量:51.4 mg (91%),藉由共通程序E測量之每個抗體分子結合的藥物分子的平均數量(n):5.7,且藉由共通程序F測量之每個抗體分子結合的藥物分子的平均數量(n):7.6。
7)-4抗體-藥物結合物H04L02-DXd之生產
步驟1:抗體-藥物結合物(4)
抗體之還原:藉由使用生產方法1所述之共通程序B (使用1.53 mLmg
-1cm
-1作為280 nm吸光係數)及C,將參考實施例5中生產之H04L02以PBS6.0/EDTA調整至9.86 mg/mL。在此溶液(5.7 mL)中,添加10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.)水溶液(0.232 mL;每抗體分子6.0當量)及1 M磷酸氫二鉀水溶液(Nacalai Tesque,Inc.;0.0855 mL)。在確認溶液的pH在7.0 ± 0.1之內後,藉由將溶液在37℃培育2小時來還原抗體中的鏈間雙硫鍵。
抗體及藥物連接子之間的結合:將上述溶液在15℃培育10分鐘。隨後,對其加入N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯丙胺醯基-N-(2-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3',4':6,7]吲并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-2-側氧基乙氧基)甲基]甘胺醯胺之在二甲亞碸中的10 mM溶液(0.386 mL;每抗體分子10當量),並將所獲得之混合物於15℃培育1小時以結合藥物連接子與抗體。隨後,對其加入100 mM NAC(Sigma-Aldrich Co. LLC)水溶液(0.0347 mL;每抗體分子9當量),並將所獲得之混合物在室溫下進一步攪拌20分鐘以終止藥物連接子之反應。
純化:藉由生產方法1所述之共通程序D純化上述溶液,獲得19mL含有標題抗體-藥物結合物「H04L02-ADC」之溶液。
特性分析:使用生產方法1所述之共通程序E(使用ε
D,280=5440及ε
D,370=21240),獲得下列特徵值。
抗體濃度:2.56 mg/mL,抗體產量:48.7 mg (87%),藉由共通程序E測量之每個抗體分子結合的藥物分子的平均數量(n):5.8,且藉由共通程序F測量之每個抗體分子結合的藥物分子的平均數量(n):7.6。
[參考實施例B:NOV0712-藥物結合物之生產]
參考實施例B)-1抗體-藥物結合物NOV0712-DM4之生產
抗體-藥物結合物(5)
抗體及藥物連接子之間的結合:藉由生產方法1中所述之共通程序B (使用1.51 mLmg
-1cm
-1作為280 nm吸收係數)及C,將參考實施例A中生產的NOV0712以20 mM HEPES8.1 (HEPES,將Life Technologies Corp.製造的1 M緩衝溶液(20 mL)以1 M氫氧化鈉調整pH至8.1,然後以蒸餾水調至1 L)調整至9.7 mg/mL。將溶液在20℃培育10分鐘。隨後,對其加入WO2016/024195所述之1-(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基氧基)-1-側氧基-4-(吡啶-2-基二氫硫基)丁烷-2-磺酸之在DMA中的10 mM溶液(0.366 mL;每抗體分子5.2當量)、N2-去乙醯基-去乙醯基-N2-(4-甲基-4-巰基-1-側氧基戊基)-美登素(maytansine) (DM4)之在DMA中的10 mM溶液(0.366 mL;每抗體分子6.8當量)、及0.243 mL DMA,並將所獲得之混合物於20℃培育16小時以結合藥物連接子與抗體。隨後,對其加入1 M乙酸水溶液以將pH調整至5.0,並將所獲得之混合物在室溫下進一步攪拌20分鐘以終止藥物連接子之反應。
純化:藉由生產方法1所述之共通程序D純化上述溶液,獲得28mL含有標題抗體-藥物結合物「NOV0712-DM4」之溶液。
特性分析:使用生產方法1所述之共通程序E(使用ε
A,280=200500、ε
A,252=76295、ε
D,280=43170、及ε
D,252=23224),獲得下列特徵值。
抗體濃度:2.58 mg/mL,抗體產量:72.2 mg (93%),且藉由共通程序E測量之每個抗體分子結合的藥物分子的平均數量(n):3.0。
參考實施例B)-2抗體-藥物結合物NOV0712-DXd之生產
步驟1:抗體-藥物結合物(6)
抗體之還原:藉由使用生產方法1所述之共通程序B (使用1.5 mLmg
-1cm
-1作為280 nm吸光係數)及C,將參考實施例A中生產之NOV0712以PBS6.0/EDTA調整至9.26 mg/mL。在此溶液(6.6 mL)中,添加10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.)水溶液(0.254 mL;每抗體分子6.0當量)及1 M磷酸氫二鉀水溶液(Nacalai Tesque,Inc.;0.0990 mL)。在確認溶液的pH在7.0 ± 0.1之內後,藉由將溶液在37℃培育2小時來還原抗體中的鏈間雙硫鍵。
抗體及藥物連接子之間的結合:將上述溶液在15℃培育10分鐘。隨後,對其加入N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯丙胺醯基-N-(2-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3',4':6,7]吲并[1,2-b]喹啉-1-基]胺基}-2-側氧基乙氧基)甲基]甘胺醯胺之在二甲亞碸中的10 mM溶液(0.381 mL;每抗體分子9當量),並將所獲得之混合物於15℃培育1小時以結合藥物連接子與抗體。隨後,對其加入100 mM NAC(Sigma-Aldrich Co. LLC)水溶液(0.0381 mL;每抗體分子9當量),並將所獲得之混合物在室溫下進一步攪拌20分鐘以終止藥物連接子之反應。
純化:藉由生產方法1所述之共通程序D純化上述溶液,獲得23.5mL含有標題抗體-藥物結合物「NOV0712-ADC」之溶液。
特性分析:使用生產方法1所述之共通程序E(使用ε
D,280=5440及ε
D,370=21240),獲得下列特徵值。
抗體濃度:2.26 mg/mL,抗體產量:56.4 mg (92%),藉由共通程序E測量之每個抗體分子結合的藥物分子的平均數量(n):6.4,且藉由共通程序F測量之每個抗體分子結合的藥物分子的平均數量(n):7.8。
[參考實施例C:H01L02-DM4之生產]
參考實施例C)-1抗體-藥物結合物H01L02-DM4之生產
抗體-藥物結合物(7)
抗體及藥物連接子之間的結合:藉由生產方法1中所述之共通程序B (使用1.53 mLmg
-1cm
-1作為280 nm吸收係數)及C,將參考實施例5中生產的H01L02以20 mM HEPES8.1 (HEPES,將Life Technologies Corp.製造的1 M緩衝溶液(20 mL)以1 M氫氧化鈉調整pH至8.1,然後以蒸餾水調至1 L)調整至9.8 mg/mL。將溶液在20℃培育10分鐘。隨後,對其加入WO2016/024195所述之1-(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基氧基)-1-側氧基-4-(吡啶-2-基二氫硫基)丁烷-2-磺酸之在DMA中的10 mM溶液(0.062 mL;每抗體分子11.5當量)、及N2-去乙醯基-N2-(4-甲基-4-巰基-1-側氧基戊基)-美登素(DM4)之在DMA中的10 mM溶液(0.082 mL;每抗體分子15.1當量),並將所獲得之混合物於20℃培育18小時以結合藥物連接子與抗體。隨後,對其加入1 M乙酸水溶液以將pH調整至5.0,並將所獲得之混合物在室溫下進一步攪拌20分鐘以終止藥物連接子之反應。
純化:藉由生產方法1所述之共通程序D純化上述溶液,獲得3.5mL含有標題抗體-藥物結合物「H01L02-DM4」之溶液。
特性分析:使用生產方法1所述之共通程序E(使用εA,280=223400、εA,252=85646、εD,280=4317、及εD,252=23224),獲得下列特徵值。
抗體濃度:1.97 mg/mL,抗體產量:6.90 mg (88%),且藉由共通程序E測量之每個抗體分子結合的藥物分子的平均數量(n):3.6。
[參考實施例8:評估抗體-藥物結合物之活體外活性]
8)-1評估抗體-藥物結合物對CDH6陽性人類腫瘤細胞株的活體外細胞生長抑制活性
將CDH6陽性人類卵巢腫瘤細胞株PA-1以2 x 10
3個細胞/100 μL/孔接種於96孔盤的補充10% FBS之MEM培養基中,然後將細胞在37℃及5%CO
2之條件下培養隔夜。次日,將參考實施例7中生產的4種人源化hG019-藥物結合物(殖株名稱:H01L02-DXd、H02L02-DXd、H02L03-DXd及H04L02-DXd)的各種、或參考實施例B中生產的NOV0712-藥物結合物(NOV0712-DM4)添加至細胞中,使得最終濃度為0.0001 (nM)至100 (nM)。培養4天後,使用CellTiter-Glo(TM)冷光細胞生存力測定(Promega Corp.),藉由定量ATP來測量活細胞的數量。圖11顯示當將各抗體-藥物結合物添加至細胞中時的濃度依賴性細胞生長抑制活性。由此結果,證實4種人源化hG019-藥物結合物從添加低於NOV0712-藥物結合物之濃度起就呈現對腫瘤細胞的生長抑制活性,並且具有高的抗腫瘤活性。
[參考實施例9:抗體-藥物結合物之活體內抗腫瘤作用]
使用衍生自免疫缺陷小鼠的動物模式,藉由接種CDH6陽性人類腫瘤細胞株細胞來評估抗體-藥物結合物的抗腫瘤作用。將4至5週齡BALB/c裸鼠(CAnN.Cg-Foxnl[nu]/CrlCrlj[Foxnlnu/Foxnlnu],Charles River Laboratories Japan Inc.)及SCID小鼠(CB17/Icr-Prkdc[scid]/CrlCrlj,Charles River Laboratories Japan Inc.)在用於實驗之前在SPF條件下適應3天或更長。給小鼠餵食無菌固體飼料(FR-2,Funabashi Farms Co., Ltd),並給予無菌自來水(藉由在自來水中添加5至15 ppm次氯酸鈉溶液而製備)。每週使用電子數位卡尺(CD-15CX,Mitutoyo Corp.)測量接種的腫瘤的長徑及短徑兩次,然後根據下述表示式計算腫瘤的體積。
腫瘤體積(mm
3)=1/2×長徑(mm)×[短徑(mm)]
2以ABS緩衝液(10 mM乙酸鹽緩衝液,5%山梨糖醇,pH 5.5)(Nacalai Tesque,Inc.)稀釋各抗體-藥物結合物,並以各參考實施例中顯示的劑量將稀釋液靜脈內投予至各小鼠的尾部。以與上述相同的方式將ABS緩衝液投予至對照組(媒劑組)。實驗中每組使用六隻小鼠。
9)-1抗腫瘤作用-(1)
將參考實施例2)-3-1中確認CDH6表現的CDH6陽性人類腎細胞腫瘤細胞株786-O (ATCC)懸浮於Matrigel (Corning Inc.)中,並將細胞懸浮液以5×10
6個細胞的劑量皮下接種至各雄性SCID小鼠的右側腹區(第0天)。在第18天,將小鼠隨機分組。在分組當天,將參考實施例7生產之4種抗體-藥物結合物(殖株名稱:H01L02-DXd、H02L02-DXd、H02L03-DXd及H04L02-DXd)的各種或參考實施例B生產之NOV0712-DM4以3 mg/kg 的劑量靜脈內投予至各小鼠尾部。結果顯示於圖12。橫坐標描繪天數,縱坐標描繪腫瘤體積。誤差範圍描繪SE值。
NOV0712-DM4在此腫瘤模式中並未呈現顯著的抗腫瘤作用。在參考實施例7所生產的4種抗體-藥物結合物全部在投予後均減少腫瘤體積,發揮顯著的腫瘤消退,且腫瘤消退作用持續至投予後24天(圖12)。
9)-2抗腫瘤作用-(2)
將參考實施例2)-3-1中確認CDH6表現的CDH6陽性人類卵巢腫瘤細胞株PA-1(ATCC)懸浮於Matrigel (Corning Inc.)中,並將細胞懸浮液以8.5×10
6個細胞的劑量皮下接種至各雌性裸鼠的右側腹區(第0天)。在第11天,將小鼠隨機分組。在分組當天,將參考實施例7生產之抗體-藥物結合物H01L02-DXd、或參考實施例B生產之NOV0712-DM4或NOV0712-DXd以1或3 mg/kg的劑量靜脈內投予至各小鼠尾部。結果顯示於圖13。橫坐標描繪天數,縱坐標描繪腫瘤體積。誤差範圍描繪SE值。
在此腫瘤模式中,NOV0712-DM4在1及3 mg/kg的任何劑量下均未呈現抗腫瘤作用。另一方面,H01L02-DXd在以1及3 mg/kg的劑量投予後顯著減少腫瘤體積,並發揮腫瘤消退作用(圖13)。本說明中獲得之H01L02抗體及NOV0712抗體係與相同的藥物DXd結合,並比較所產生之樣本的藥效。結果,在1及3 mg/kg的劑量下,H01L02-DXd均發揮比NOV0712-DXd更強的抗腫瘤作用。具體而言,其證實對於作為抗腫瘤劑的抗體-藥物結合物,本發明之H01L02抗體係優於NOV0712抗體的抗體(圖13)。
9)-3抗腫瘤作用-(3)
將參考實施例2)-3-1中確認CDH6表現的CDH6陽性人類卵巢腫瘤細胞株NIH:OVCAR-3 (ATCC)懸浮於Matrigel (Corning Inc.)中,並將細胞懸浮液以1×10
7個細胞的劑量皮下接種至各雌性裸鼠的右側腹區(第0天)。在第22天,將小鼠隨機分組。在分組當天,將參考實施例7生產之抗體-藥物結合物H01L02-DXd、或參考實施例B生產之NOV0712-DM4以1或3 mg/kg的劑量靜脈內投予至各小鼠尾部。結果顯示於圖14。橫坐標描繪天數,縱坐標描繪腫瘤體積。誤差範圍描繪SE值。
NOV0712-DM4在1 mg/kg的劑量下並未呈現抗腫瘤作用,而在3 mg/kg的劑量下呈現抗腫瘤作用,然而從投予後2週起觀察到腫瘤再生。另一方面,H01L02-DXd以1及3 mg/kg的劑量投予後皆顯著壓制腫瘤體積的增加,且特別是在3 mg/kg的劑量下,腫瘤生長抑制效果在投予後持續長達31天(圖14)。
使用PA-1細胞以與上述相同方式評估參考實施例B中生產的NOV0712-DM4或參考實施例C中生產的H01L02-DM4的腫瘤生長抑制效果。H01L02-DM4比NOV0712-DM4進一步減少腫瘤體積。因此,作為用作抗腫瘤劑的抗體抗體-藥物結合物之抗體,本發明之H01L02抗體優於NOV0712抗體。
9)-4抗腫瘤作用-(4)
將參考實施例2)-3-1中確認CDH6表現的CDH6陽性人類腎細胞腫瘤細胞株786-O (ATCC)懸浮於Matrigel (Corning Inc.)中,並將細胞懸浮液以5×10
6個細胞的劑量皮下接種至各雄性SCID小鼠的右側腹區(第0天)。在第20天,將小鼠隨機分組。在分組當天,將參考實施例7生產之抗體-藥物結合物H01L02-DXd、或參考實施例B生產之NOV0712-DM4以1或3 mg/kg的劑量靜脈內投予至各小鼠尾部。結果顯示於圖15。橫坐標描繪天數,縱坐標描繪腫瘤體積。誤差範圍描繪SE值。
在此腫瘤模式中,NOV0712-DM4在1及3 mg/kg的任何劑量下均未呈現顯著的抗腫瘤作用。另一方面,H01L02-DXd以1及3 mg/kg的劑量投予後皆減少腫瘤體積,且特別是在3 mg/kg的劑量下發揮顯著的腫瘤消退,且腫瘤消退作用在投予後持續20天(圖15)。
9)-5抗腫瘤作用-(5)
將參考實施例2)-3-1中確認沒有CDH6表現的CDH6陰性人類卵巢腫瘤細胞株ES-2 (ATCC)懸浮於生理食鹽水中,並將細胞懸浮液以1×10
6個細胞的劑量皮下接種至各雌性裸鼠的右側腹區(第0天)。在第7天,將小鼠隨機分組。在分組當天,將參考實施例7生產之抗體-藥物結合物H01L02-DXd、或參考實施例B生產之NOV0712-DM4以1或3 mg/kg的劑量靜脈內投予至各小鼠尾部。結果顯示於圖16。橫坐標描繪天數,縱坐標描繪腫瘤體積。誤差範圍描繪SE值。
在此不表現CDH6的腫瘤模式中,H01L02-DXd及NOV0712-DM4在任何劑量下皆未呈現抗腫瘤作用。由此結果,在參考實施例9)-1、9)-2、9)-3及9)-4所證實的CDH6陽性腫瘤模式中抗體-藥物結合物之抗腫瘤作用係一種依賴於腫瘤細胞中CDH6表現的作用。因此,本發明之抗體-藥物結合物被認為係一種選擇性且安全的抗腫瘤藥物,其對CDH6陽性的腫瘤特異性地呈現抗腫瘤作用,而不會對CDH6陰性的正常組織造成細胞毒性(圖16)。
[實施例1:在卡鉑及紫杉醇的長期治療後,抗體-藥物結合物(1)之活體內抗腫瘤作用]
小鼠:對雌性5週齡BALB/c裸鼠(CHARLES RIVER LABORATORIES JAPAN, INC.)進行實驗。
測量及計算公式:在研究中,使用電子數位卡尺(CD15-CX,Mitutoyo Corp.)每週最多測量3次腫瘤的長軸及短軸,並計算腫瘤體積(mm
3)。計算公式如下所示。
腫瘤體積(mm
3)=1/2×長軸(mm)×[短軸(mm)]
2。
卡鉑以生理食鹽水稀釋,以10 mL/kg的流體體積靜脈內投予至尾部靜脈。紫杉醇以cremophor及乙醇(1:1)溶解,以生理食鹽水稀釋,然後以10 mL/kg的流體體積靜脈內投予至尾部靜脈。將抗體-藥物結合物(式4)以ABS緩衝液(10 mM乙酸緩衝液[pH 5.5],5%山梨糖醇)稀釋,並以10 mL/kg的流體體積靜脈內投予至尾部靜脈。
將人類卵巢癌細胞株NIH:OVCAR-3(購自ATCC (美國典型培養物保藏中心))懸浮於Matrigel基底膜基質中(Matrigel,Corning Inc.),以1.0 × 10
7個細胞皮下移植至雌性裸鼠的右側(第0天),並在移植後22天將小鼠隨機分組。卡鉑係在第22天、第66天、第88天、第109天、第128天、第149天、第169天、第192天及第212天以50 mg/kg的劑量靜脈內投予至尾部靜脈。紫杉醇係在第22天、第66天、第88天、第109天、第128天、第149天、第169天、第192天及第212天以30 mg/kg的劑量靜脈內投予至尾部靜脈。紫杉醇的溶劑係在第22天靜脈內投予至尾部靜脈。設置卡鉑及紫杉醇的組合投予組、以及作為對照組的溶劑投予組。在組合投予組中,選擇第232天腫瘤體積在150 mm
3至500 mm
3範圍內的小鼠,且抗體-藥物結合物(1)(式4)(DAR:7.8)包含分別由SEQ ID NO:87及88表示之重鏈胺基酸序列及輕鏈胺基酸序列,其基本上根據參考實施例7的7)-1製備,在第232天、第253天及第274天以10 mg/kg之劑量靜脈內投予至尾部靜脈。為明確起見,包含在所投予之抗體-藥物結合物(1)中的抗體在本發明中稱為「H01L02」。
在卡鉑及紫杉醇的長期治療後,抗體-藥物結合物(1)的腫瘤生長壓制效果的結果如圖17所示。當平均腫瘤體積達到約250mm
3時,12隻帶有NIH:OVCAR-3腫瘤的小鼠反覆以卡鉑及紫杉醇投藥。在第一次投藥時,所有病例中的腫瘤皆消退,然而,所有大多數的病例在6週內重新生長。在第9次投藥後,將5隻腫瘤體積在150 mm
3至500 mm
3範圍內的小鼠分組進行抗體-藥物結合物(1)治療。抗體-藥物結合物(1)在投予後顯示減少腫瘤體積,發揮顯著的腫瘤消退,並維持腫瘤消退作用。於此,在圖中,橫軸表示細胞移植後的天數,縱軸表示腫瘤體積。此外,沒有一組投予組呈現例如嚴重的體重減輕的任何特別值得注意的發現。
[實施例2:抗腫瘤研究(1)]
小鼠:對雌性5週齡BALB/c裸鼠(CHARLES RIVER LABORATORIES JAPAN, INC.)進行實驗。
測量及計算公式:在研究中,使用電子數位卡尺(CD15-CX,Mitutoyo Corp.)每週測量兩次腫瘤的長軸及短軸,並計算腫瘤體積(mm
3)。計算公式如下所示。
腫瘤體積(mm
3)=1/2×長軸(mm)×[短軸(mm)]
2。
將人類卵巢癌細胞株NIH:OVCAR-3 (購自ATCC)懸浮於Matrigel (Corning Inc.),以1.0 × 10
7個細胞皮下移植至雌性裸鼠的右側,並在移植後24天將小鼠隨機分組(第0天)。抗體-藥物結合物(1)(式4)(DAR:7.9)係在第0天以0.3 mg/kg的劑量靜脈內投予至尾部靜脈。卡鉑係在第0天以50 mg/kg的劑量靜脈內投予至尾部靜脈。設置各藥物之單獨投予組、組合投予組及作為對照組的溶劑投予組。
抗體-藥物結合物(1)及卡鉑之組合的結果如圖18所示。卡鉑的單獨投予在第21天顯示47%的腫瘤生長抑制(TGI)。抗體-藥物結合物(1)的單獨投予顯示65%之TGI。另一方面,抗體-藥物結合物(1)及卡鉑的組合投予呈現顯著優於卡鉑的單獨投予的腫瘤生長壓制效果(P<0.001),且亦呈現顯著優於抗體-藥物結合物(1)的單獨投予的腫瘤生長壓制效果(P<0.001);TGI為93%。此外,沒有一組單獨及組合投予組呈現例如體重減輕的任何特別值得注意的發現。
[實施例3:抗腫瘤研究(2)]
小鼠:對雌性5週齡BALB/c裸鼠(CHARLES RIVER LABORATORIES JAPAN, INC.)進行實驗。
測量及計算公式:在研究中,使用電子數位卡尺(CD15-CX,Mitutoyo Corp.)每週測量兩次腫瘤的長軸及短軸,並計算腫瘤體積(mm
3)。計算公式如下所示。
腫瘤體積(mm
3)=1/2×長軸(mm)×[短軸(mm)]
2。
將人類卵巢癌細胞株OV-90 (購自ATCC)懸浮於Matrigel (Corning Inc.),以2.5×10
6個細胞皮下移植至雌性裸鼠的右側,並在移植後14天將小鼠隨機分組(第0天)。抗體-藥物結合物(1)(式4)(DAR:7.9)係在第0天以1 mg/kg的劑量靜脈內投予至尾部靜脈。卡鉑係在第0天以50 mg/kg的劑量靜脈內投予至尾部靜脈。設置各藥物之單獨投予組、組合投予組及作為對照組的溶劑投予組。
抗體-藥物結合物(1)及卡鉑之組合的結果顯示於圖19。卡鉑的單獨投予在第21天顯示23%之TGI。抗體-藥物結合物(1)的單獨投予顯示67%之TGI。另一方面,抗體-藥物結合物(1)及卡鉑的組合投予呈現顯著優於卡鉑的單獨投予的腫瘤生長壓制效果(P<0.001),且亦呈現顯著優於抗體-藥物結合物(1)的單獨投予的腫瘤生長壓制效果(P<0.001);TGI為92%。此外,沒有一組單獨及組合投予組呈現例如體重減輕的任何特別值得注意的發現。
[實施例4:抗腫瘤研究(3)]
小鼠:對雌性5週齡BALB/c裸鼠(CHARLES RIVER LABORATORIES JAPAN, INC.)進行實驗。
測量及計算公式:在研究中,使用電子數位卡尺(CD15-CX,Mitutoyo Corp.)每週測量兩次腫瘤的長軸及短軸,並計算腫瘤體積(mm
3)。計算公式如下所示。
腫瘤體積(mm
3)=1/2×長軸(mm)×[短軸(mm)]
2。
將人類卵巢癌細胞株OV-90 (購自ATCC)懸浮於Matrigel (Corning Inc.),以2.5×10
6個細胞皮下移植至雌性裸鼠的右側,並在移植後15天將小鼠隨機分組(第0天)。抗體-藥物結合物(1)(式4)(DAR:7.8)係在第0天以10 mg/kg的劑量靜脈內投予至尾部靜脈。卡鉑係在第0天以50 mg/kg的劑量靜脈內投予至尾部靜脈。紫杉醇係在第1天以20 mg/kg的劑量靜脈內投予至尾部靜脈。設置抗體-藥物結合物(1)之單獨投予組、卡鉑及紫杉醇之組合投予組、抗體-藥物結合物(1)、卡鉑及紫杉醇之組合投予組、以及作為對照組之溶劑投予組。
抗體-藥物結合物(1)、卡鉑及紫杉醇之組合的結果顯示於圖20。卡鉑及紫杉醇之組合投予在第15天顯示65%之TGI;抗體-藥物結合物(1)之單獨投予在第15天顯示95%之TGI;且抗體-藥物結合物(1)、卡鉑及紫杉醇之組合投予在第15天顯示97%之TGI。此外,抗體-藥物結合物(1)、卡鉑及紫杉醇的組合投予在第19天呈現顯著優於卡鉑及紫杉醇的組合投予的腫瘤生長壓制效果(P<0.001),且在第19天亦呈現顯著優於抗體-藥物結合物(1)的單獨投予的腫瘤生長壓制效果(P<0.001)。此外,沒有一組單獨及組合投予組呈現例如體重減輕的任何特別值得注意的發現。
[實施例5:抗腫瘤研究(4)]
小鼠:對雌性5週齡BALB/c裸鼠(CHARLES RIVER LABORATORIES JAPAN, INC.)進行實驗。
測量及計算公式:在研究中,使用電子數位卡尺(CD15-CX,Mitutoyo Corp.)每週最多測量3次腫瘤的長軸及短軸,並計算腫瘤體積(mm
3)。計算公式如下所示。
腫瘤體積(mm
3)=1/2×長軸(mm)×[短軸(mm)]
2。
將人類卵巢癌細胞株OV-90 (購自ATCC)懸浮於Matrigel (Corning Inc.),以2.5×10
6個細胞皮下移植至雌性裸鼠的右側,並在移植後17天將小鼠隨機分組(第0天)。抗體-藥物結合物(1)(式4)(DAR:7.9)係在第0天以3 mg/kg的劑量靜脈內投予至尾部靜脈。吉西他濱係在第0天、第7天及第14天以15 mg/kg的劑量靜脈內投予至尾部靜脈。設置各藥物之單獨投予組、組合投予組及作為對照組的溶劑投予組。
抗體-藥物結合物(1)及吉西他濱之組合的結果顯示於圖21。吉西他濱的單獨投予在第21天顯示23%之TGI。抗體-藥物結合物(1)的單獨投予顯示79%之TGI。另一方面,抗體-藥物結合物(1)及吉西他濱的組合投予呈現顯著優於吉西他濱的單獨投予的腫瘤生長壓制效果(P<0.001),且亦呈現顯著優於抗體-藥物結合物(1)的單獨投予的腫瘤生長壓制效果(P<0.001);TGI為95%。此外,沒有一組單獨及組合投予組呈現例如體重減輕的任何特別值得注意的發現。
產業利用性
本發明提供具有內化活性的抗CDH6抗體及包含該抗體的抗體-藥物結合物。抗體-藥物結合物可用作癌症等的治療藥物。
無
[圖1]圖1顯示檢驗四種大鼠抗CDH6單株抗體(殖株編號rG019、rG055、rG056及rG061)或大鼠IgG對照與對照細胞或hCDH6轉染的293T細胞的結合的流式細胞測量術(flow cytometry)結果。橫坐標描繪表明結合的抗體量的FITC螢光強度,且縱坐標描繪細胞計數。
[圖2-1]圖2-1顯示四種大鼠抗CDH6單株抗體(rG019、rG055、rG056及rG061)或陰性對照抗體Rat IgG2b對於對照細胞或全長hCDH6轉染之293細胞的結合活性。橫坐標描繪表明結合的抗體量的FITC螢光強度,且縱坐標描繪細胞計數。
[圖2-2]圖2-2顯示四種大鼠抗CDH6單株抗體(rG019、rG055、rG056及rG061)或大鼠IgG對照對於對照細胞或刪除EC1的hCDH6轉染之293細胞的結合活性。橫坐標描繪表明結合的抗體量的FITC螢光強度,且縱坐標描繪細胞計數。
[圖2-3]圖2-3顯示四種大鼠抗CDH6單株抗體(rG019、rG055、rG056及rG061)或大鼠IgG對照對於對照細胞或刪除EC2的hCDH6轉染之293細胞的結合活性。橫坐標描繪表明結合的抗體量的FITC螢光強度,且縱坐標描繪細胞計數。
[圖2-4]圖2-4顯示四種大鼠抗CDH6單株抗體(rG019、rG055、rG056及rG061)或大鼠IgG對照對於對照細胞或刪除EC3的hCDH6轉染之293細胞的結合活性。橫坐標描繪表明結合的抗體量的FITC螢光強度,且縱坐標描繪細胞計數。
[圖2-5]圖2-5顯示四種大鼠抗CDH6單株抗體(rG019、rG055、rG056及rG061)或大鼠IgG對照對於對照細胞或刪除EC4的hCDH6轉染之293細胞的結合活性。橫坐標描繪表明結合的抗體量的FITC螢光強度,且縱坐標描繪細胞計數。
[圖2-6]圖2-6顯示四種大鼠抗CDH6單株抗體(rG019、rG055、rG056及rG061)或大鼠IgG對照對於對照細胞或刪除EC5的hCDH6轉染之293細胞的結合活性。橫坐標描繪表明結合的抗體量的FITC螢光強度,且縱坐標描繪細胞計數。
[圖3]圖3顯示評估CDH6在4種人類腫瘤細胞株(人類卵巢腫瘤細胞株NIH:OVCAR-3、PA-1及ES-2以及人類腎細胞腫瘤細胞株786-O)細胞膜表面的表現的流式細胞測量術結果。橫坐標描繪表明結合的抗體量的FITC螢光強度,且縱坐標描繪細胞計數。
[圖4]圖4顯示使用與抑制蛋白質合成的毒素(皂草素(saporin))結合的抗大鼠IgG試劑Rat-ZAP、或作為陰性對照的未與毒素結合的Fc (γ)片段特異性山羊抗大鼠IgG (Goat Anti-Rat IgG, Fc (γ) Fragment Specific),在NIH:OVCAR-3細胞及786-O細胞中評估4種大鼠抗CDH6抗體(rG019、rG055、rG056及rG061)或大鼠IgG對照的內化活性之圖表。圖表的縱坐標描繪ATP活性(RLU)。作為當在補充陰性對照來代替Rat-ZAP的孔中的活細胞數量被定義為100%時的相對存活率而計算的細胞存活率(%)顯示於每個圖表下方。
[圖5]圖5顯示人類嵌合抗CDH6抗體chG019與人類CDH6及猴CDH6的結合。橫坐標描繪抗體濃度,縱坐標描繪基於平均螢光強度之結合的抗體量。
[圖6-1]圖6-1及6-2各顯示四種人源化hG019抗體(H01L02、H02L02、H02L03及H04L02)或陰性對照抗體人類IgG1對於人類CDH6、猴CDH6、小鼠CDH6及大鼠CDH6的結合活性。橫坐標描繪抗體濃度,縱坐標描繪基於平均螢光強度之結合的抗體量。
[圖6-2]圖6-1及6-2各顯示四種人源化hG019抗體(H01L02、H02L02、H02L03及H04L02)或陰性對照抗體人類IgG1對於人類CDH6、猴CDH6、小鼠CDH6及大鼠CDH6的結合活性。橫坐標描繪抗體濃度,縱坐標描繪基於平均螢光強度之結合的抗體量。
[圖7-1]圖7-1顯示四種人源化hG019抗體(H01L02、H02L02、H02L03及H04L02)、抗CDH6抗體NOV0712或陰性對照抗體hIgG1對於對照細胞或全長hCDH6轉染之293α細胞的結合活性。橫坐標描繪表明結合的抗體量的APC螢光強度。縱坐標描繪細胞計數。
[圖7-2]圖7-2顯示四種人源化hG019抗體(H01L02、H02L02、H02L03及H04L02)、抗CDH6抗體NOV0712或陰性對照抗體hIgG1對於對照細胞或刪除EC1的hCDH6轉染之293α細胞的結合活性。橫坐標描繪表明結合的抗體量的APC螢光強度。縱坐標描繪細胞計數。
[圖7-3]圖7-3顯示四種人源化hG019抗體(H01L02、H02L02、H02L03及H04L02)、抗CDH6抗體NOV0712或陰性對照抗體hIgG1對於對照細胞或刪除EC2的hCDH6轉染之293α細胞的結合活性。橫坐標描繪表明結合的抗體量的APC螢光強度。縱坐標描繪細胞計數。
[圖7-4]圖7-4顯示四種人源化hG019抗體(H01L02、H02L02、H02L03及H04L02)、抗CDH6抗體NOV0712或陰性對照抗體hIgG1對於對照細胞或刪除EC3的hCDH6轉染之293α細胞的結合活性。橫坐標描繪表明結合的抗體量的APC螢光強度。縱坐標描繪細胞計數。
[圖7-5]圖7-5顯示四種人源化hG019抗體(H01L02、H02L02、H02L03及H04L02)、抗CDH6抗體NOV0712或陰性對照hIgG1對於對照細胞或刪除EC4的hCDH6轉染之293α細胞的結合活性。橫坐標描繪表明結合的抗體量的APC螢光強度。縱坐標描繪細胞計數。
[圖7-6]圖7-6顯示四種人源化hG019抗體(H01L02、H02L02、H02L03及H04L02)、抗CDH6抗體NOV0712或陰性對照hIgG1對於對照細胞或刪除EC5的hCDH6轉染之293α細胞的結合活性。橫坐標描繪表明結合的抗體量的APC螢光強度。縱坐標描繪細胞計數。
[圖8]圖8顯示檢驗人類CDH6在786-O/hCDH6穩定表現細胞株及其親代細胞株786-O之表現的流式細胞測量術結果。橫坐標描繪表明結合的抗體量的Alexa Fluor 647螢光強度,縱坐標描繪細胞計數。
[圖9]圖9顯示使用(a)經標識的NOV0712或(b)經標識的H01L02對四種未標識的人源化hG019抗體(H01L02、H02L02、H02L03及H04L02)、抗CDH6抗體NOV0712或陰性對照hIgG1的結合競爭測定。橫坐標描繪添加的未標識的抗體的最終濃度,縱坐標描繪基於平均螢光強度之結合的抗體量。
[圖10-1]圖10-1顯示使用與抑制蛋白質合成的毒素(皂草素)結合的抗人類IgG試劑Hum-ZAP、或作為陰性對照的未與毒素結合的Fc (γ)片段特異性F(ab')2片段山羊抗人類IgG (F(ab')2 Fragment Goat Anti-human IgG, Fc (γ) Fragment Specific),在NIH:OVCAR-3細胞中評估四種人源化hG019抗體(H01L02、H02L02、H02L03及H04L02)、抗CDH6抗體NOV0712及陰性對照抗體的內化活性的圖表。圖表的縱坐標描繪ATP活性(RLU)。作為當在補充陰性對照來代替Hum-ZAP的孔中的活細胞數量被定義為100%時的相對存活率而計算的細胞存活率(%)顯示於每個圖表下方。
[圖10-2]圖10-2顯示使用與抑制蛋白質合成的毒素(皂草素)結合的抗人類IgG試劑Hum-ZAP、或作為陰性對照的未與毒素結合的Fc (γ)片段特異性F(ab')2片段山羊抗人類IgG,在786-O細胞中評估四種人源化hG019抗體(H01L02、H02L02、H02L03及H04L02)、抗CDH6抗體NOV0712及陰性對照抗體的內化活性的圖表。圖表的縱坐標描繪ATP活性(RLU)。作為當在補充陰性對照來代替Hum-ZAP的孔中的活細胞數量被定義為100%時的相對存活率而計算的細胞存活率(%)顯示於每個圖表下方。
[圖10-3]圖10-3顯示使用與抑制蛋白質合成的毒素(皂草素)結合的抗人類IgG試劑Hum-ZAP、或作為陰性對照的未與毒素結合的Fc (γ)片段特異性F(ab')2片段山羊抗人類IgG,在PA-1細胞中評估四種人源化hG019抗體(H01L02、H02L02、H02L03及H04L02)、抗CDH6抗體NOV0712及陰性對照抗體的內化活性的圖表。圖表的縱坐標描繪ATP活性(RLU)。作為當在補充陰性對照來代替Hum-ZAP的孔中的活細胞數量被定義為100%時的相對存活率而計算的細胞存活率(%)顯示於每個圖表下方。
[圖11]圖11顯示評估四種人源化hG019-藥物結合物(H01L02-DXd、H02L02-DXd、H02L03-DXd及H04L02-DXd)或NOV0712-DM4對於PA-1細胞的活體外細胞生長抑制活性的結果。橫坐標描繪抗體-藥物結合物濃度,縱坐標描繪細胞存活率(%)。
[圖12]圖12顯示四種人源化hG019-藥物結合物(H01L02-DXd、H02L02-DXd、H02L03-DXd及H04L02-DXd)或NOV0712-DM4之活體內抗腫瘤作用。使用動物模式進行評估,其中將CDH6陽性人類腎細胞腫瘤細胞株786-O接種到免疫缺陷小鼠中。橫坐標描繪天數,縱坐標描繪腫瘤體積。誤差範圍描繪標準誤差(SE)值。
[圖13]圖13顯示人源化hG019-藥物結合物H01L02-DXd或NOV0712-DM4或NOV0712-DXd的活體內抗腫瘤作用。使用動物模式進行評估,其中將CDH6陽性人類卵巢腫瘤細胞株PA-1接種到免疫缺陷小鼠中。橫坐標描繪天數,縱坐標描繪腫瘤體積。誤差範圍描繪SE值。
[圖14]圖14顯示人源化hG019-藥物結合物H01L02-DXd或NOV0712-DM4的活體內抗腫瘤作用。使用動物模式進行評估,其中將CDH6陽性人類卵巢腫瘤細胞株NIH:OVCAR-3接種到免疫缺陷小鼠中。橫坐標描繪天數,縱坐標描繪腫瘤體積。誤差範圍描繪SE值。
[圖15]圖15顯示人源化hG019-藥物結合物H01L02-DXd或NOV0712-DM4的活體內抗腫瘤作用。使用動物模式進行評估,其中將CDH6陽性人類腎細胞腫瘤細胞株786-O接種到免疫缺陷小鼠中。橫坐標描繪天數,縱坐標描繪腫瘤體積。誤差範圍描繪SE值。
[圖16]圖16顯示人源化hG019-藥物結合物H01L02-DXd或NOV0712-DM4的活體內抗腫瘤作用。使用動物模式進行評估,其中將CDH6陰性人類卵巢腫瘤細胞株ES-2接種到免疫缺陷小鼠中。橫坐標描繪天數,縱坐標描繪腫瘤體積。誤差範圍描繪SE值。
[圖17]圖17顯示在卡鉑及紫杉醇的長期治療後,抗體-藥物結合物(1)的活體內抗腫瘤作用。使用動物模式進行評估,其中將CDH6陽性人類卵巢腫瘤細胞株NIH:OVCAR-3接種到免疫缺陷小鼠中。在投予卡鉑 50 mg/kg及紫杉醇 30 mg/kg (白色三角形) 9次後,選擇估計腫瘤體積在150 mm
3至500 mm
3範圍內的小鼠,並接受10 mg/kg的抗體-藥物結合物(1)的投予(黑色三角形)。橫坐標描繪天數,縱坐標描繪腫瘤體積。誤差範圍描繪SE值(媒劑組:N=6。治療組:N=5)。
[圖18]圖18係顯示在皮下移植NIH:OVCAR-3細胞的小鼠中,於抗體-藥物結合物(1)及卡鉑分別的單獨投予組、以及抗體-藥物結合物(1)及卡鉑的組合投予組的腫瘤生長壓制效果的線圖。
[圖19]圖19係顯示在皮下移植OV-90細胞的小鼠中,於抗體-藥物結合物(1)及卡鉑分別的單獨投予組、以及抗體-藥物結合物(1)及卡鉑的組合投予組的腫瘤生長壓制效果的線圖。
[圖20]圖20係顯示在皮下移植OV-90細胞的小鼠中,於抗體-藥物結合物(1)的單獨投予組、卡鉑及紫杉醇的組合投予組、以及抗體-藥物結合物(1)、卡鉑及紫杉醇的組合投予組的腫瘤生長壓制效果的線圖。
[圖21]圖21係顯示在皮下移植OV-90細胞的小鼠中,於抗體-藥物結合物(1)及吉西他濱分別的單獨投予組、以及抗體-藥物結合物(1)及吉西他濱的組合投予組的腫瘤生長壓制效果的線圖。
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無。
Claims (50)
- 一種用於治療癌症之治療方法,該方法包含對有需要之受試者投予抗體-藥物結合物(ADC)。
- 如請求項1或2之治療方法,其中該抗體-藥物結合物(ADC)為抗CDH6抗體-藥物結合物。
- 如請求項1至3中任一項之治療方法,其中該癌症選自下列所組成之群組:腎細胞癌、卵巢癌、間皮瘤、甲狀腺癌、子宮癌、膽管癌、胰臟癌、非小細胞肺癌、子宮頸癌、腦腫瘤、頭頸癌、肉瘤、骨肉瘤、小細胞肺癌、乳癌、膀胱癌、子宮內膜癌、及去勢抗性前列腺癌。
- 如請求項1至3中任一項之治療方法,其中該癌症選自卵巢癌、非小細胞肺癌、乳癌、膀胱癌、子宮內膜癌、及去勢抗性前列腺癌所組成之群組。
- 如請求項1至3中任一項之治療方法,其中該癌症為卵巢癌。
- 如請求項6之治療方法,其中該卵巢癌選自上皮性卵巢癌、輸卵管癌、或原發性腹膜癌所組成之群組。
- 如請求項6或7之治療方法,其中該卵巢癌為轉移性的。
- 如請求項1至8中任一項之治療方法,其中該抗體為包含選自下述組合(1)至(4)所組成之群組中的任一組合的輕鏈及重鏈的抗體、或該抗體之功能性片段: (1)由SEQ ID NO:61中位置21至233之胺基酸序列組成之輕鏈及由SEQ ID NO:69中位置20至471之胺基酸序列組成之重鏈; (2)由SEQ ID NO:61中位置21至233之胺基酸序列組成之輕鏈及由SEQ ID NO:73中位置20至471之胺基酸序列組成之重鏈; (3)由SEQ ID NO:65中位置21至233之胺基酸序列組成之輕鏈及由SEQ ID NO:73中位置20至471之胺基酸序列組成之重鏈;及 (4)由SEQ ID NO:61中位置21至233之胺基酸序列組成之輕鏈及由SEQ ID NO:77中位置20至471之胺基酸序列組成之重鏈。
- 如請求項1至9中任一項之治療方法,其中該抗體為包含由SEQ ID NO:61中位置21至233之胺基酸序列組成之輕鏈及由SEQ ID NO:69中位置20至471之胺基酸序列組成之重鏈的抗體、或該抗體之功能性片段。
- 如請求項1至9中任一項之治療方法,其中該抗體為包含由SEQ ID NO:61中位置21至233之胺基酸序列組成之輕鏈及由SEQ ID NO:77中位置20至471之胺基酸序列組成之重鏈的抗體、或該抗體之功能性片段。
- 如請求項1至11中任一項之治療方法,其中該重鏈或輕鏈經選自下列所組成之群組中的一種或多種修飾:N-連接型醣基化、O-連接型醣基化、N端加工、C端加工、去醯胺化、天冬胺酸異構化、甲硫胺酸氧化、在N端添加甲硫胺酸殘基、脯胺酸殘基醯胺化、N端麩醯胺酸或N端麩胺酸轉化為焦麩胺酸、及從羧基端刪除一個或兩個胺基酸。
- 如請求項1至11中任一項之治療方法,其中該重鏈或輕鏈經選自下列所組成之群組中的二種以上的修飾:N-連接型醣基化、O-連接型醣基化、N端加工、C端加工、去醯胺化、天冬胺酸異構化、甲硫胺酸氧化、在N端添加甲硫胺酸殘基、脯胺酸殘基醯胺化、N端麩醯胺酸或N端麩胺酸轉化為焦麩胺酸、及從羧基端刪除一個或兩個胺基酸。
- 如請求項1至13中任一項之治療方法,其中每個抗體結合的所選擇之藥物-連接子結構單元的平均數量在1至10個之範圍內。
- 如請求項1至14中任一項之治療方法,其中每個抗體結合的所選擇之藥物-連接子結構單元的平均數量在2至8個之範圍內。
- 如請求項1至14中任一項之治療方法,其中每個抗體結合的所選擇之藥物-連接子結構單元的平均數量在5至8個之範圍內。
- 如請求項1至14中任一項之治療方法,其中每個抗體結合的所選擇之藥物-連接子結構單元的平均數量在7至8個之範圍內。
- 如請求項1至17中任一項之治療方法,其中該癌症包含一種或多種表現CDH6的腫瘤。
- 如請求項1至18中任一項之治療方法,其中該受試者有以包含鉑類藥物的化療方案治療的病史。
- 如請求項1至18中任一項之治療方法,其中該受試者有以包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案治療的病史。
- 如請求項1至20中任一項之治療方法,其中該受試者先前已經以包含鉑類藥物之化療方案治療。
- 如請求項1至20中任一項之治療方法,其中該受試者先前已經以包含鉑類藥物及紫杉烷之化療方案治療。
- 如請求項1至22中任一項之治療方法,其中該抗體-藥物結合物(ADC)與一種或多種化療劑組合而同時或不同時投予。
- 如請求項23之治療方法,其中該抗體-藥物結合物(ADC)在該一種或多種化療劑之後投予。
- 如請求項23之治療方法,其中該抗體-藥物結合物(ADC)及該一種或多種化療劑分別作為活性成分包含在不同的調配物中,並同時或不同時投予。
- 如請求項23之治療方法,其中該抗體-藥物結合物(ADC)及該一種或多種化療劑作為活性成分一起包含在相同調配物中,並同時投予。
- 如請求項23至26中任一項之治療方法,其中該一種或多種化療劑為抗代謝物質、鉑類藥物、紫杉烷、或鉑類藥物及紫杉烷二者。
- 如請求項1至27中任一項之治療方法,其中該受試者在以包含鉑類藥物的化療方案治療時顯示完全反應(CR)、部分反應(PR)或疾病穩定(SD)。
- 如請求項1至27中任一項之治療方法,其中該受試者在以包含鉑類藥物的化療方案治療時顯示完全反應(CR)或部分反應(PR)。
- 如請求項1至27中任一項之治療方法,其中該受試者在以包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案治療時顯示完全反應(CR)、部分反應(PR)或疾病穩定(SD)。
- 如請求項1至27中任一項之治療方法,其中該受試者在以包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案治療時顯示完全反應(CR)或部分反應(PR)。
- 如請求項1至31中任一項之治療方法,其中該受試者患有對鉑類化療具有耐性的癌症。
- 如請求項1至32中任一項之治療方法,其中該受試者患有對包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案具有耐性的癌症。
- 如請求項1至33中任一項之治療方法,其中該受試者在投予ADC之前呈現癌症復發。
- 如請求項34之治療方法,其中該癌症復發發生在包含鉑類藥物的化療方案完成後不到六個月或約六個月內。
- 如請求項34之治療方法,其中該癌症復發發生在包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案完成後不到六個月或約六個月內。
- 如請求項34之治療方法,其中該癌症復發發生在包含鉑類藥物的化療方案完成後約六個月或之後。
- 如請求項34之治療方法,其中該癌症復發發生在包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案完成後約六個月或之後。
- 如請求項1至38中任一項之治療方法,其中該受試者被投予該ADC與第二藥物。
- 如請求項39之治療方法,其中該ADC在該第二藥物之前投予。
- 如請求項39之治療方法,其中該ADC在該第二藥物之後投予。
- 如請求項39之治療方法,其中該ADC與該第二藥物同時投予。
- 一種用於治療癌症之治療方法,該方法包含對受試者投予醫藥組成物,該受試者患有對鉑類化療具有耐性之卵巢癌及/或在投予醫藥組成物之前呈現卵巢癌復發,其中該醫藥組成物包含具有下式表示之結構的抗體-藥物結合物(ADC): [式4] 其中AB表示抗體或抗體之功能性片段,n表示每個抗體的與該抗體結合之藥物-連接子結構單元的平均數量,且該抗體經由衍生自該抗體的硫氫基連結至該連接子;且其中該ADC為其鹽或者該ADC或該鹽之水合物,其中每個抗體結合的藥物-連接子結構單元的平均數量為7至8個,其中該抗體包含:SEQ ID NO:87表示之重鏈胺基酸序列或於其中一個或二個胺基酸從其羧基端刪除之衍生自SEQ ID NO:87表示之胺基酸序列的胺基酸序列;及SEQ ID NO:88表示之輕鏈胺基酸序列。
- 一種用於治療癌症之治療方法,該方法包含對受試者投予醫藥組成物,該受試者患有卵巢癌且先前已經以包含鉑類藥物、紫杉烷、或鉑類藥物及紫杉烷二者之化療方案治療,其中該醫藥組成物包含具有下式表示之結構的抗體-藥物結合物(ADC): [式4] 其中AB表示抗體或抗體之功能性片段,n表示每個抗體的與該抗體結合之藥物-連接子結構單元的平均數量,且該抗體經由衍生自該抗體的硫氫基連結至該連接子;且其中該ADC為其鹽或者該ADC或者該鹽之水合物,其中每個抗體結合的藥物-連接子結構單元的平均數量為7至8個,其中該抗體包含:SEQ ID NO:87表示之重鏈胺基酸序列或於其中一個或二個胺基酸從其羧基端刪除之衍生自SEQ ID NO:87表示之胺基酸序列的胺基酸序列;及SEQ ID NO:88表示之輕鏈胺基酸序列。
- 如請求項1至44中任一項之治療方法,該方法包含使用來自測試受試者之生物樣本以檢測該生物樣本中CDH6的存在與否、及對檢測到CDH6的測試受試者投予醫藥組成物。
- 如請求項1至45中任一項之治療方法,其中該癌症已對包含鉑類藥物的化療方案產生耐性。
- 如請求項1至45中任一項之治療方法,其中該癌症已對包含鉑類藥物及紫杉烷的化療方案產生耐性。
- 如請求項1至47中任一項之治療方法,其中該抗代謝物質為吉西他濱(gemcitabine)。
- 如請求項1至47中任一項之治療方法,其中該鉑類藥物為卡鉑(carboplatin)。
- 如請求項1至47中任一項之治療方法,其中該鉑類藥物為卡鉑且該紫杉烷為紫杉醇(paclitaxel)。
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