ES2651952T3

ES2651952T3 - Células que producen unas composiciones de anticuerpo

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Publication number: ES2651952T3
Application number: ES10180013.4T
Authority: ES
Inventors: Yutaka Kanda; Mitsuo Satoh; Kazuyasu Nakamura; Kazuhisa Uchida; Toyohide Shinkawa; Naoko Yamane; Emi Hosaka; Kazuya Yamano; Motoo Yamasaki; Nobuo Hanai
Original assignee: Kyowa Hakko Kirin Co Ltd
Current assignee: Kyowa Kirin Co Ltd
Priority date: 2000-10-06
Filing date: 2001-10-05
Publication date: 2018-01-30
Anticipated expiration: 2021-10-05
Also published as: JP2015131807A; EA200300443A1; KR100877676B1; ES2620359T3; EP2314685A1; CA2424602C; CN102311986B; EP3263702A1; EP2314686B2; JP6010147B2; CN103333860B; JP2012075441A; JP5301525B2; EP1331266A4; EP2314686B1; JP2009142288A; JP6270930B2; EA013563B1; JP2012087131A; CA2953239A1

Abstract

Procedimiento para producir una composición de anticuerpo que comprende unas moléculas de anticuerpo que presentan unas cadenas de azúcar unidas a N-glucósido complejas unidas a la región Fc, en el que de entre las cadenas de azúcar unidas a N-glucósido complejas unidas a la región Fc en la composición, la proporción para una cadena de azúcar en la que la fucosa no está unida a la N-acetilglucosamina en el extremo reductor en la cadena de azúcar es 50% o más, comprendiendo dicho procedimiento seleccionar una célula de CHO resistente a la lectina cultivando la célula utilizando un medio que comprende la lectina a una concentración de 1 μg/ml a 1 mg/ml, cultivar la célula de CHO resistente a la lectina, y expresar los anticuerpos utilizando la célula de CHO resistente a la lectina, en el que la lectina es una lectina que reconoce una estructura de cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa está unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar unida a N-glucósido.

Description

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en el que la α1,6-fucosiltransferasa es una proteína seleccionada de entre el grupo que consiste en los (a), 5 (b), (c), (d), (e) y (f) siguientes:

(a): una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID: 23;

(b): una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID: 24;

(c): una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que 1 a 20 aminoácidos son suprimidos, sustituidos, insertados en y/o añadidos a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 23 y presenta una actividad de α1,6-fucosiltransferasa;

15 (d) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que 1 a 20 aminoácidos son suprimidos, sustituidos, insertados en y/o añadidos a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 24 y presenta una actividad de α1,6-fucosiltransferasa;

(e): una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una homología de por lo menos 80% con la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 23 y presenta una actividad de α1,6-fucosiltransferasa;

(f): una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una homología de por lo

menos 80% con la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 24 y presenta una actividad de 25 α1,6-fucosiltransferasa.

14. Procedimiento según cualquiera de [1] a [13], en el que las moléculas de anticuerpo son seleccionadas de entre el grupo que consiste en (a), (b) y (c),

(a): anticuerpos humanos

(b): anticuerpos humanizados

(c) fragmentos de anticuerpo. 35

15. Procedimiento según cualquiera de [1] a [13], en el que las moléculas de anticuerpo pertenecen a una clase de IgG.

En la presente memoria se da a conocer además los (1) a (61) siguientes:

(1) una célula CHO obtenida de tejido de ovario de hámster chino en la que se ha introducido un gen codificante de una molécula de anticuerpo, que comprende una composición de anticuerpo que comprende una molécula de anticuerpo que presenta cadenas de azúcar complejas unidas mediante Nglucósido unidas a la región Fc, en la que entre el total de cadenas de azúcar complejas unidas

45 mediante N-glucósido unidas a la región Fc en la composición, la proporción de cadenas de azúcar en las que la fucosa no se encuentra unida a la N-acetilglucosamina en el extremo reductor de la cadena de azúcar es de 20% o superior.

(2): La célula CHO según (1), en la que la cadena de azúcar a la que no se encuentra unida la fucosa es una cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido en la que la posición 1 de fucosa no se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α.

(3): La célula CHO según (1) o (2), en la que la molécula de anticuerpo pertenece a una clase de IgG.

55 (4) La célula CHO según cualquiera de entre (1) y (3), en la que la actividad de un enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa y/o la actividad de un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido se encuentra reducida o anulada.

(5) La célula CHO según (4), en la que el enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, es un enzima seleccionado de entre el grupo que consiste en (a), (b) y (c), a continuación:

65 (a) GMD (GDP-manosa 4,6-deshidratasa),

(b) Fx (GDP-ceto-6-desoximanosa 3,5-epimerasa, 4-reductasa),

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ID nº 51, bajo condiciones restrictivas y codifica una proteína que presenta actividad de GFPP.

(30): La célula según (24), en la que GFPP es una proteína seleccionada de entre el grupo que consiste en (a), (b) y (c), a continuación:

(a): una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 73,

(b): una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que por lo menos un aminoácido ha sido delecionado, sustituido, insertado y/o añadido a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 73 y que presenta actividad de GFPP,

(c): una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una homología de por lo menos 80% respecto a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 73 y presenta actividad de GFPP.

(31): La célula según (23), en la que el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido es una α-1,6-fucosiltransferasa.

(32): La célula según (31), en la que la α-1,6-fucosiltransferasa es una proteína codificada por un ADN seleccionado de entre el grupo que consiste en (a), (b), (c) y (d), a continuación:

(a): un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID nº 1,

(b): un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID nº 2,

(c): un ADN que se hibrida con el ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID nº 1, bajo condiciones restrictivas y codifica una proteína que presenta actividad de α1,6fucosiltransferasa,

(d): un ADN que se hibrida con el ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID nº 2, bajo condiciones restrictivas y que codifica una proteína que presenta actividad de α1,6fucosiltransferasa.

(33): La célula según (31), en la que la α-1,6-fucosiltransferasa es una proteína seleccionada de entre el grupo que consiste en (a), (b), (c), (d), (e) y (f):

(a): una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 23,

(b): una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 24,

(c): una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que por lo menos un aminoácido ha sido delecionado, sustituido, insertado y/o añadido a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 23 y que presenta actividad de α-1,6-fucosiltransferasa,

(d): una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que por lo menos un aminoácido ha sido delecionado, sustituido, insertado y/o añadido a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 24 y que presenta actividad de α-1,6-fucosiltransferasa,

(e): una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una homología de por lo menos 80% respecto a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 23 y que presenta actividad de α-1,6-fucosiltransferasa,

(f): una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una homología de por lo menos 80% respecto a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 24 y que presenta actividad de α-1,6-fucosiltransferasa.

(34): La célula según cualquiera de entre (23) y (33), en la que la técnica de ingeniería genética es una técnica seleccionada de entre el grupo que consiste en (a), (b), (c) y (d), a continuación:

(a): una técnica de disrupción génica con diana en un gen codificante del enzima,

(b): una técnica para introducir un mutante negativo dominante de un gen codificante del enzima,

(c): una técnica para introducir una mutación en el enzima,

(d): una técnica para inhibir la transcripción o la traducción de un gen codificante del enzima.

(35): La célula según cualquiera de entre (23) y (34), que es resistente a por lo menos una lectina que

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(b) un ADN que se hibrida con el ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID nº 48, bajo condiciones restrictivas y codifica una proteína que presenta actividad de Fx.

(47): El animal no humano o planta transgénico o la progenie del mismo según (44), en el que GFPP es una proteína codificada por un ADN de (a) o (b), a continuación:

(a): un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID nº 51,

(b): un ADN que se hibrida con el ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID nº 51, bajo condiciones restrictivas y codifica una proteína que presenta actividad de GFPP.

(48): El animal no humano o planta transgénico o la progenie del mismo según (42) o (43), en el que el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido es una α-1-6-fucosiltransferasa.

(49): El animal no humano o planta transgénico o la progenie del mismo según (48), en el que la α-1,6fucosiltransferasa es una proteína codificada por un ADN seleccionado de entre el grupo que consiste en (a), (b), (c) y (d), a continuación:

(50): El animal o vegetal no humano transgénico o la progenie del mismo según cualquiera de entre (42) y (49), en el que el animal no humano transgénico es un animal seleccionado de entre el grupo que consiste en vaca, oveja, cabra, cerdo, caballo, ratón, rata, ave, mono y conejo.

(51): Un procedimiento para producir una composición de anticuerpo, que comprende introducir un gen codificante de una molécula de anticuerpo en el animal no humano o planta transgénico o progenie del mismo según cualquiera de entre (42) y (50), criar el animal o planta, aislar el tejido o líquido corporal que comprende el anticuerpo introducido a partir del animal o planta criado, y recuperar la composición de anticuerpo a partir del tejido o líquido corporal aislado.

(52): El procedimiento según (51), en el que la molécula de anticuerpo pertenece a una clase de IgG.

(53): El procedimiento según (51) o (52), que produce una composición de anticuerpo que presenta una actividad citotóxica mediada por células dependiente de anticuerpos más elevada que una composición de anticuerpo obtenida de un animal no humano o planta o la progenie del mismo el genoma del cual no ha sido modificado.

(54): Una composición de anticuerpo que se produce utilizando el procedimiento según (51) a (53).

(55): Un medicamento que comprende la composición de anticuerpo según (21), (22), (41) y (54) como ingrediente activo.

(56): El medicamento según (55), en el que el medicamento es un fármaco diagnóstico, un fármaco preventivo o un fármaco terapéutico para enfermedades acompañadas de tumores, enfermedades acompañadas de alergias, enfermedades acompañadas de inflamaciones, enfermedades autoinmunológicas, enfermedades de órganos circulatorios, enfermedades acompañadas de infecciones víricas o enfermedades acompañadas de infecciones bacterianas.

(57): Una proteína seleccionada de entre el grupo que consiste en (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i) y (j), a continuación:

(a): una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 71,

(b): una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que por lo menos un aminoácido ha

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sido delecionado, sustituido, insertado y/o añadido a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 71 y que presenta actividad de GMD,

(c): una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 72,

(d): una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que por lo menos un aminoácido ha sido delecionado, sustituido, insertado y/o añadido a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 72 y que presenta actividad de Fx,

(e): una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 73,

(f): una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que por lo menos un aminoácido ha sido delecionado, sustituido, insertado y/o añadido a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 73 y que presenta actividad de GFPP,

(g): una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 23,

(h): una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que por lo menos un aminoácido ha sido delecionado, sustituido, insertado y/o añadido a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 23 y que presenta actividad de α-1,6-fucosiltransferasa,

(i): una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 24,

(j): una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que por lo menos un aminoácido ha sido delecionado, sustituido, insertado y/o añadido a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 24 y que presenta actividad de α-1,6-fucosiltransferasa,

(58): Un ADN que codifica la proteína según (57).

(59): Un ADN seleccionado de entre el grupo que consiste en (a), (b), (c), (d) y (e), a continuación:

(c): un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID nº 65,

(d): un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID nº 48,

(e): un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID nº 51.

(60): Un ADN genómico seleccionado de entre el grupo que consiste en (a), (b) y (c), a continuación:

(a): un ADN genómico que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID nº 3,

(b): un ADN genómico que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID nº 67,

(c): un ADN genómico que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID nº 70.

(61): Un vector diana para la recombinación homóloga, que comprende una longitud completa del ADN según cualquiera de entre (58) y (60), o una parte del mismo.

La célula CHO obtenida de tejido de ovario de hámster chino en la que se ha introducido un gen codificante de una molécula de anticuerpo introducida según la presente invención puede ser cualquier célula CHO con la condición de que sea una célula CHO obtenida de tejido de ovario de hámster chino en la que se ha introducido un gen codificante de una molécula de anticuerpo, que produce una composición de anticuerpo que comprende cadenas de azúcar complejas unidas mediante N-glucósido unidas a la región Fc de una molécula de anticuerpo, en la que el total de cadenas de azúcar complejas unidas mediante N-glucósido unidas a la región Fc en la composición, la proporción, la proporción de cadenas de azúcar en las que la fucosa no se encuentra unida a la N-acetilglucosamina en el extremo reductor de la cadena de azúcar es de 20% o superior.

En la presente invención, la molécula de anticuerpo incluye cualquier molécula con la condición de que comprende la región Fc de un anticuerpo. Entre los ejemplos se incluyen un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una proteína de fusión que comprende una región Fc y similares.

El anticuerpo es una proteína que es producida en el cuerpo vivo mediante reacción inmunológica como resultado de la estimulación por antígenos exógenos y que presenta una actividad de unión específica al antígeno. Entre los ejemplos del anticuerpo se incluyen un anticuerpo secretado por una célula de hibridoma preparada a partir de una célula de bazo de un animal inmunizado con un antígeno, un anticuerpo preparado mediante una técnica de recombinación genética, es decir un anticuerpo obtenido mediante la introducción de un vector de expresión de anticuerpo en el que se ha insertado un gen de anticuerpo en una célula hospedadora, y similares. Entre los ejemplos específicos se incluyen un anticuerpo producido por un hibridoma, un anticuerpo

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Un animal transgénico no humano productor de anticuerpos humanos es un animal en el que se ha introducido un gen de anticuerpo humano en las células. Específicamente, un animal transgénico productor de anticuerpos humanos puede prepararse mediante la introducción de un gen de anticuerpo humano en una célula ES de un ratón, trasplantando la célula ES en un embrión de estadio temprano de otro ratón y seguidamente desarrollándolo. Mediante la introducción de un gen humano de anticuerpo híbrido en un huevo fertilizado y desarrollándolo, también puede prepararse el animal transgénico. Con respecto al método de preparación de un anticuerpo humano a partir del animal transgénico productor de anticuerpos humanos, puede producirse el anticuerpo humano y acumularse en un cultivo mediante la obtención de un hibridoma productor de anticuerpos humanos mediante un método de preparación de hibridomas habitualmente llevado a cabo en mamíferos diferentes del ser humano y después cultivándolo.

Entre los ejemplos del animal no humano transgénico se incluyen vaca, oveja, cabra, cerdo, caballo, ratón, rata, ave, mono, conejo y similares.

Además, en la presente invención, resulta preferente que el anticuerpo sea un anticuerpo que reconozca un antígeno de tipo tumoral, un anticuerpo que reconoce un antígeno relacionado con alergia o inflamación, un anticuerpo que reconoce un antígeno relacionado con una enfermedad de órgano circulatorio, un anticuerpo que reconoce un antígeno relacionado con enfermedad autoinmunológica o un anticuerpo que reconoce un antígeno relacionado con infección vírica o bacteriana, y resulta preferente un anticuerpo humano que pertenece a la clase IgG.

Un fragmento de anticuerpo es un fragmento que comprende la región Fc de un anticuerpo. Entre los ejemplos del fragmento de anticuerpo se incluyen un monómero de cadena H, un dímero de cadenas H y similares.

Una proteína de fusión que comprende una región Fc es una composición en la que un anticuerpo que comprende la región Fc de un anticuerpo o el fragmento de anticuerpo se fusiona con una proteína, tal como un enzima, una citoquina o similar.

En la presente invención, entre los ejemplos de la cadena de azúcar que se une a la región Fc de una molécula de anticuerpo se incluyen una cadena de azúcar unida mediante N-glucósido. Entre los ejemplos de la cadena de azúcar unida mediante N-glucósido se incluyen un tipo complejo en el que el lado de extremo no reductor de la estructura nuclear presenta una o una pluralidad de ramas paralelas de galactosa-N-acetilglucosamina (en adelante denominadas "Gal-GlcNAc") y el lado de extremo no reductor de Gal-GlcNAc presenta una estructura, tal como ácido siálico, N-acetilglucosamina bisectante o similar.

En un anticuerpo, la región Fc presenta posiciones a las que se une una cadena de azúcar unida mediante Nglucósido que se describirá a continuación. De acuerdo con lo anteriormente expuesto, se unen dos cadenas de azúcar por cada molécula de anticuerpo. Debido a que la cadena de azúcar unida mediante N-glucósido que se une a un anticuerpo incluye cualquier cadena de azúcar que presenta la estructura nuclear representada por la fórmula estructural (I), pueden resultar posibles varias combinaciones de cadenas de azúcar para las dos cadenas de azúcar unidas mediante N-glucósido que se unen al anticuerpo. De acuerdo con lo anterior, puede considerarse la identidad de las sustancias desde el punto de vista de la estructura sacárida unida a la región Fc.

En la presente invención, la composición que comprende una molécula de anticuerpo que presenta cadenas de azúcar complejas unidas mediante N-glucósido en la región Fc puede comprender un anticuerpo que presenta la misma estructura de cadena de azúcar o un anticuerpo que presenta diferentes estructuras de cadena de azúcar, con la condición de que se obtenga el efecto de la presente invención a partir de la composición.

En la presente invención, la proporción de una cadena de azúcar en la que la fucosa no se encuentra unida a la N-acetilglucosamina en el extremo reductor de la cadena de azúcar de entre el total de cadenas de azúcar complejas unidas mediante N-glucósido a la región Fc contenida en la composición de anticuerpo es la proporción del número de cadenas de azúcar en las que la fucosa no se encuentra unida a la Nacetilglucosamina en el extremo reductor en la cadena de azúcar respecto al número total de cadenas de azúcar complejas unidas mediante N-glucósido unidas a la región Fc contenida en la composición.

En la presente invención, la cadena de azúcar en la que la fucosa no se encuentra unida a la Nacetilglucosamina en el extremo reductor en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido es una cadena de azúcar en la que la fucosa no se encuentra unida a la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido. Entre los ejemplos se incluyen una cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido en la que la posición 1 de la fucosa no se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina mediante un enlace α.

La composición de anticuerpo mostraba una elevada actividad de ADCC en el caso de que la proporción de cadena de azúcar en la que la fucosa no se encuentra unida a la N-acetilglucosamina en el extremo reductor en la cadena de azúcar de entre el total de cadenas de azúcar complejas unidas mediante N-glucósido de unión a la

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mediante N-glucósido se refiere a un enzima relacionado con la reacción de unión de la posición 1 de la fucosa a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido.

Entre los ejemplos del enzima relacionado con la reacción de unión de la posición 1 de la fucosa a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido se incluyen la α-1,6-fucosiltransferasa, la α-L-fucosidasa y similares.

Además, entre los ejemplos se incluye un enzima que influye sobre la actividad del enzima relacionado con la reacción de unión de la posición 1 de la fucosa a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido y un enzima que influye sobre la estructura de sustancias como sustrato del enzima.

En la presente invención, entre los ejemplos de la α-1,6-fucosiltransferasa se incluyen:

una proteína codificada por un ADN de (a), (b), (c) o (d) a continuación:

(d): un ADN que se hibrida con el ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID nº 2, bajo condiciones restrictivas y que codifica una proteína que presenta actividad de α1,6fucosiltransferasa,

(e): una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 23,

(f): una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 24,

(g): una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que por lo menos un aminoácido ha sido delecionado, sustituido, insertado y/o añadido a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 23 y que presenta actividad de α-1,6-fucosiltransferasa,

(h): una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que por lo menos un aminoácido ha sido delecionado, sustituido, insertado y/o añadido a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 24 y que presenta actividad de α-1,6-fucosiltransferasa,

(i): una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una homología de por lo menos 80% respecto a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 23 y que presenta actividad de α-1,6-fucosiltransferasa,

(j): una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una homología de por lo menos 80% respecto a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 24 y que presenta actividad de α-1,6-fucosiltransferasa, y similares.

Además, entre los ejemplos del ADN codificante de la secuencia de aminoácidos de la α-1,6-fucosiltransferasa se incluyen un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID nº 1 o nº 2 y un ADN que se hibrida con el ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID nº 1 o nº 2 bajo condiciones restrictivas y codifica una secuencia de aminoácidos que presenta actividad de α-1,6fucosiltransferasa.

En la presente invención, un ADN que se hibrida bajo condiciones restrictivas es un ADN obtenido mediante, por ejemplo, un método tal como la hibridación de colonias, la hibridación de placas o la hibridación de transferencia southern utilizando un ADN tal como el ADN que presenta la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID nº 1, nº 2, nº 48, nº 51 o nº 65 o un fragmento parcial de la misma a modo de sonda, y específicamente incluye un ADN que puede identificarse llevando a cabo la hibridación a 65ºC en presencia de cloruro sódico 0,7 a 1,0 M utilizando un filtro en el que se inmovilizan fragmentos de ADN derivados de una colonia o placa, seguido del lavado del filtro a 65ºC con solución 0,1 a 2 x SSC (composición de la solución 1 x SSC que comprende cloruro sódico 150 mM y citrato sódico 15 mM). La hibridación puede llevarse a cabo siguiendo los métodos descritos en, por ejemplo, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) (en adelante denominado "Molecular Cloning, Second Edition"), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1987-1997 (en adelante denominado "Current Protocols in Molecular Biology"); DNA Cloning

1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University, 1995, y similares. Entre los ejemplos del ADN hibridable se incluye un ADN que presenta una homología de por lo menos 60% o superior,

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preferentemente de 70% o superior, más preferentemente de 80% o superior, todavía más preferentemente de 90% o superior, todavía más preferentemente de 95% o superior, respecto a la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID nº 1, nº 2, nº 48, nº 51 o nº 65.

En la presente divulgación, puede obtenerse la proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que por lo menos un aminoácido ha sido delecionado, sustituido, insertado y/o añadido a la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID nº 23, nº 24, nº 71, nº 72 o nº 73 y que presenta actividad de α-1,6fucosiltransferasa, actividad de GMD, actividad de Fx o actividad de GFPP, por ejemplo mediante la introducción de mutación dirigida a sitio en un ADN codificante de una proteína que presenta la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID nº 1, nº 2, nº 65, nº 48 o nº 51, respectivamente, utilizando la mutagénesis dirigida a sitio descrita en, por ejemplo, Molecular Cloning, segunda edición; Current Protocols in Molecular Biology; Nucleic Acids Research 10:6487, 1982; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6409, 1982; Gene 34:315, 1985; Nucleic Acids Research 13:4431, 1985; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488, 1985, y similares. El número de aminoácidos que debe delecionarse, sustituirse, insertarse y/o añadirse es uno o más, y el número no se encuentra particularmente limitado, aunque es un número que puede delecionarse, sustituirse o añadirse mediante una técnica conocida, tal como la mutagénesis dirigida a sitio, por ejemplo es de 1 a varias decenas, preferentemente de entre 1 y 20, más preferentemente de entre 1 y 10, y todavía más preferentemente de entre 1 y 5.

Además, con el fin de mantener la actividad de α-1,6-fucosiltransferasa, la actividad de GMD, la actividad de Fx o la actividad de GFPP de la proteína que debe utilizarse en la presente invención, presenta una homología de por lo menos 80% o superior, preferentemente de 85% o superior, más preferentemente de 90% o superior, todavía más preferentemente de 95% o superior, todavía más preferentemente de 97% o superior, y todavía más preferentemente de 99% o superior, respecto a la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID nº 23, nº 24, nº 71, nº 72 o nº 73, calculada utilizando software de análisis, tal como BLAST [J. Mol. Biol. 215:403, 1990], FASTA [Methods in Enzymology 183:63, 1990] o similares.

Entre los ejemplos de la célula CHO utilizada según la presente invención se incluyen una célula en la que la actividad enzimática se encuentra reducida o delecionada.

Entre las células en las que la actividad de un enzima se encuentra reducida o delecionada se incluyen las células en las que la actividad de un enzima relacionado con la modificación de un azúcar-nucleótido intracelular, la GDP-fucosa o la actividad de un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar, en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido se encuentra reducida o delecionada. Como método para obtener dichas células, puede utilizarse cualquier técnica, con la condición de que pueda reducir o delecionar la actividad enzimática de interés. Entre los ejemplos de la técnica para reducir o delecionar la actividad enzimática se incluyen:

(c): una técnica para introducir una mutación en el enzima,

(d): una técnica para inhibir la transcripción y/o la traducción de un gen codificante del enzima.

(e): una técnica para seleccionar una estirpe celular resistente a una lectina que reconoce una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante Nglucósido, y similares.

En la presente memoria, puede obtenerse la estirpe celular resistente a lectina mediante el cultivo de una estirpe celular en un medio que comprende una concentración predeterminada de lectina y después mediante la selección de una estirpe celular que adquiere dicha propiedad de manera que su tasa de supervivencia se incrementa en por lo menos 2 veces, preferentemente en 3 veces, y más preferentemente en 5 veces o más, que la estirpe celular parental con significancia estadística. Además, también puede obtenerse mediante el cultivo de una estirpe celular en un medio que comprende lectina, seguido de la selección de una estirpe celular que puede cultivarse a una determinada tasa de supervivencia, por ejemplo una tasa de supervivencia de 80%, a una concentración de lectina de por lo menos 2 veces, preferentemente de 5 veces, más preferentemente de 10 veces, y todavía más preferentemente de 20 veces o más, que la estirpe celular parental.

Como lectina que reconoce una estructura de cadena de azúcar en la que la posición 1 la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar unida mediante N-glucósido, puede utilizarse cualquier lectina puede reconocer la estructura de cadena de azúcar. Entre los ejemplos se incluyen una lectina de Lens culinaris LCA (aglutinina de lenteja obtenida de Lens culinaris), una lectina de guisante PSA (lectina de guisante obtenida de Pisum sativum), una lectina de

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de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido se incluyen la α-1,6-fucosiltransferasa, la α-L-fucosidasa y similares.

El gen tal como se utiliza en la presente memoria incluye ADN y ARN.

El método de disrupción génica puede ser cualquier método, con la condición de que se incluya la posibilidad de interrumpir el gen del enzima diana. Entre los ejemplos se incluyen un método antisentido, un método de ribozima, un método de recombinación homóloga, un método RDO, un método de ARNi, un método en que se utilizan retrovirus, un método en que se utilizan trasposones y similares. Los métodos se describen específicamente a continuación.

(a) Preparación de la célula hospedadora de la presente invención mediante el método antisentido o el método de ribozima.

La célula hospedadora de la presente invención puede prepararse mediante el método de ribozima descrito en Cell Technology 12:239, 1993; Bio/Technology 17:1097, 1999; Hum. Mol. Genet. 5:1083, 1995; Cell Technology 13:255, 1994; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:1886, 1999, o similar, por ejemplo de la manera siguiente, utilizando como diana un enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido.

Se prepara un ADNc o un ADN genómico codificante de un enzima relacionado con la síntesis de un azúcarnucleótido intracelular, GDP-fucosa, o un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido.

Se determina la secuencia de nucleótidos del ADNc o ADN genómico preparado.

Basándose en la secuencia de ADN determinada, se diseña una longitud apropiada de un gen antisentido o constructo de ribozima que comprende una fracción de ADN que codifica el enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido una parte de su región no traducida o un intrón.

Con el fin de expresar el gen antisentido o ribozima en una célula, se prepara un vector recombinante mediante la inserción de un fragmento o la longitud total del ADN preparado cadena abajo del promotor de un vector de expresión apropiado.

Se obtiene un transformante mediante la introducción del vector recombinante en una célula hospedadora adecuada para el vector de expresión.

La célula hospedadora de la presente invención puede obtenerse mediante la selección de un transformante basada en la actividad del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa o enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido. La célula hospedadora de la presente invención también puede obtenerse mediante la selección de un transformante basándose en la estructura de cadena de azúcar de una glucoproteína sobre la membrana celular o la estructura de cadena de azúcar de la molécula de anticuerpo producida.

Como célula hospedadora utilizada para la producción de la célula hospedadora de la presente invención, puede utilizarse cualquier célula, tal como de levadura, célula animal, célula de insecto o célula vegetal, con la condición de que presente un gen codificante del enzima diana relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa o enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido. Entre los ejemplos se incluyen células hospedadoras que se describirán a continuación, en el ítem 3.

Como vector de expresión, se utiliza un vector que es de replicación autónoma en la célula hospedadora o que puede integrarse en el cromosoma y comprende un promotor en una posición que permite que el gen antisentido

o ribozima diseñado pueda transferirse. Entre los ejemplos se incluyen vectores de expresión que se describirán a continuación, en el ítem 3.

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Con respecto al método para introducir un gen en diversas células hospedadoras, pueden utilizarse los métodos para introducir vectores recombinantes adecuados para diversas células hospedadoras, que se describirán a continuación, en el ítem 3.

El método a continuación puede ejemplificarse como el método de selección de un transformante basado en la actividad del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa o la actividad de un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido.

Método para la selección de un transformante:

Entre los ejemplos del método para seleccionar una célula en la que se encuentra reducida la actividad de un enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa o la actividad de un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido se incluyen métodos bioquímicos o técnicas de ingeniería genética descritos en New Biochemical Experimentation Series 3 -Saccharides I, Glycoprotein (Tokyo Kagaku Dojin), editado por la Japanese Biochemical Society, 1988; Cell Engineering, suplemento, Experimental Protocol Series, Glycobiology Experimental Protocol, Glycoprotein, Glycolipid and Proteoglycan (Shujun-sha), editado por Naoyuki Taniguchi, Akemi Suzuki, Kiyoshi Furukawa y Kazuyuki Sugawara, 1996; Molecular Cloning, segunda edición; Current Protocols in Molecular Biology; y similares. Entre los ejemplos del método bioquímico se incluyen un método en el que se evalúa la actividad enzimática utilizando un sustrato específico de enzima y similares. Entre los ejemplos de la técnica de ingeniería genética se incluye el análisis northern, la RT-PCR y similares que miden la cantidad de ARNm de un gen codificante del enzima.

Entre los ejemplos del método para seleccionar un transformante basándose en la estructura de la cadena de azúcar de una glucoproteína sobre la membrana celular se incluyen los métodos que se describen a continuación, en el ítem 1(5). Entre los ejemplos del método para seleccionar un transformante basándose en la estructura de la cadena de azúcar de una molécula de anticuerpo producida se incluyen los métodos que se describen a continuación, en los ítems 5 y 6.

Como método para preparar un ADNc codificante de un enzima relacionado con la síntesis de un azúcarnucleótido intracelular, GDP-fucosa, o un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido, se proporciona a modo de ejemplo el método siguiente.

Preparación de ADN:

Se preparó un ARN total o ARNm a partir de un tejido o célula humano o animal no humano.

Se preparó una biblioteca de ADNc a partir del ARN total o ARNm preparado.

Se producen cebadores degenerados basándose en la secuencia de aminoácidos de un enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la Nacetilglucosamina en el extremo reductor mediante enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante Nglucósido, y se obtiene un fragmento génico codificante del enzima relacionado con la síntesis de un azúcarnucleótido intracelular, GDP-fucosa, o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido, mediante PCR utilizando la biblioteca de ADNc preparada como molde.

Se prepara un ADN codificante del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDPfucosa o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido puede obtenerse mediante cribado de la biblioteca de ADNc utilizando el fragmento génico obtenido a modo de sonda.

Con respecto al ARNm de un tejido o célula humano o no humano, puede utilizarse un producto disponible comercialmente (por ejemplo fabricado por Clontech) o puede prepararse a partir de un tejido o célula humano o no humano de la manera siguiente. Entre los ejemplos del método para preparar un ARN total a partir de un tejido o célula humano o animal no humano se incluye el método de tiocianato de guanidina-trifluoroacetato de cesio [Methods in Enzymology 154:3, 1987], el método de tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo ácido (AGPC) [Analytical Biochemistry 162:156, 1987; Experimental Medicine 9:1937, 1991] y similares.

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se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido.

Como célula hospedadora puede utilizarse cualquier célula, tal como de levadura, célula animal, célula de insecto o célula vegetal, con la condición de que presente un gen codificante del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o del enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la Nacetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido. Entre los ejemplos se incluyen células hospedadoras que se describirán a continuación, en el ítem

3.

Entre los ejemplos del método para introducir RDO en diversas células hospedadoras se incluyen métodos para introducir vectores recombinantes adecuadas para diversas células hospedadoras, que se describirán a continuación, en el ítem 3.

Entre los ejemplos del método de preparación de ADNc codificante del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido, se incluyen los métodos descritos en la preparación de ADN en el ítem 1(1)(a) y similares.

Entre los ejemplos del método de preparación de un ADN genómico codificante del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la Nacetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido, se incluyen los métodos en la preparación de ADN genómico en el ítem 1(1)(a) y similares.

La secuencia de nucleótidos del ADN puede determinarse digiriéndola con enzimas de restricción apropiados, clonando los fragmentos en un plásmido, tal como pBluescript SK(-) (fabricado por Stratagene) o similares, sometiendo los clones a la reacción utilizada generalmente como método de análisis de una secuencia de nucleótidos, tal como el método de dideoxi [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463, 1977] de Sanger et al. o similares, y analizando seguidamente los clones utilizando un analizador automático de secuencias de nucleótidos, tal como el secuenciador de ADN A.L.F. (fabricado por Pharmacia) o similares.

El RDO puede prepararse mediante el método habitual o utilizando un sintetizador de ADN.

Entre los ejemplos del método de selección de una célula en la que se ha producido una mutación, mediante la introducción de la ROD en la célula hospedadora, en el gen codificante del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido, se incluyen los métodos para detectar directamente mutaciones en los genes cromosómicos descritos en Molecular Cloning, segunda edición, Current Protocols in Molecular Biology, y similares, los métodos descritos en el ítem 1(1)(a) para la selección de un transformante mediante la evaluación de la actividad del enzima introducido relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar, en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido, el método para la selección de un transformante utilizando la estructura sacárida de una glicoproteína sobre la membrana celular que se describirá a continuación, en el ítem 1(5), y el método para la selección de un transformante basándose en la estructura sacárida de la molécula de anticuerpo producida que se describirá a continuación en el ítem 5 o 6, y similares.

El constructo de la ROD puede diseñarse de acuerdo con los métodos descritos en Science 273:1386, 1996; Nature Medicine 4:285, 1998; Hepatology 25:1462, 1997; Gene Therapy 5:1960, 1999; J. Mol. Med. 75:829, 1997; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:8774, 1999; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:8768, 1999; Nuc. Acids. Res. 27:1323, 1999; Invest. Dematol. 111:1172, 1998; Nature Biotech. 16:1343, 1998; Nature Biotech. 18:43, 2000; Nature Biotech. 18:555, 2000, y similares.

(d) Preparación de la célula hospedadora de la presente invención mediante el método de ARNi

La célula hospedadora de la presente invención puede prepararse mediante el método de ARNi (interferencia de ARN) dirigiendo un gen de un enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDPfucosa, o de un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido, por ejemplo de la manera siguiente.

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similares.

Los enzimas catalizan reacciones específicas que presentan especificidad de sustrato y pueden prepararse mutantes negativos dominantes de los enzimas mediante disrupción del centro activo de los enzimas que catalizan la actividad catalítica que presenta especificidad de sustrato. El método para preparar un mutante negativo dominante se describe específicamente de la manera siguiente en referencia a GMD de entre los enzimas diana.

Como resultado del análisis de la estructura tridimensional de la GMD derivada de E. coli, se ha encontrado que 4 aminoácidos (la treonina en la posición 133, el ácido glutámico en la posición 135, la tirosina en la posición 157 y la lisina en la posición 161) presentan una función importante en la actividad del enzima (Structure 8:2, 2000). Es decir, al preparar mutantes mediante la sustitución de los 4 aminoácidos por otros aminoácido diferentes basándose en la información de la estructura tridimensional, se reduce significativamente la actividad enzimática de la totalidad de los mutantes. Por otra parte, prácticamente no se observaron en los mutantes cambios en la capacidad de la GMD de unirse al coenzima NADP de GMD y su sustrato GDP-manosa. De acuerdo con lo anterior, puede prepararse un mutante negativo dominante mediante la sustitución de los 4 aminoácidos que controlan la actividad enzimática de GMD. Por ejemplo, en GMD (SEC ID nº 65) derivada de células CHO, puede prepararse un mutante negativo dominante mediante sustitución de la treonina en la posición 155, el ácido glutámico en la posición 157, la tirosina en la posición 179 y la lisina en la posición 183 por otros aminoácidos, mediante comparación de la homología y la predicción de la estructura tridimensional utilizando la información de secuencia de aminoácidos basándose en los resultados de la GMD derivada de E. coli. Dicho gen en el que se introduce la sustitución de aminoácido puede prepararse mediante mutagénesis dirigida a sitio, descrita en Molecular Cloning, segunda edición, Current Protocols in Molecular Biology o similares.

La célula hospedadora de la presente invención puede prepararse de acuerdo con el método descrito en Molecular Cloning, segunda edición, Current Protocols in Molecular Biology o similares, utilizando el gen mutante negativo dominante preparado del enzima diana, por ejemplo, tal como se indica a continuación.

Se preparó un gen codificante de un mutante negativo dominante (en adelante denominado "gen mutante negativo dominante") del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido.

Basándose en el ADN de longitud completa preparado del gen mutante negativo dominante, se preparó, en caso necesario, un fragmento de ADN de longitud apropiada que contenía una fracción codificante de la proteína.

Se produjo un vector recombinante mediante la inserción del fragmento de ADN o el ADN de longitud completa cadena abajo del promotor de un vector de expresión apropiado.

Se obtuvo un transformante mediante la introducción del vector recombinante en una célula hospedadora adecuada para el vector de expresión.

La célula hospedadora de la presente invención puede prepararse mediante la selección de un transformante basándose en la actividad del enzima relacionada con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDPfucosa, o en la actividad del enzima relacionada con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido, o la estructura de cadena de azúcar de una glucoproteína de una molécula de anticuerpo producida o sobre la membrana celular.

Como célula hospedadora puede utilizarse cualquier célula, tal como de levadura, célula animal, célula de insecto o célula vegetal, con la condición de que presente un gen codificante del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o del enzima diana relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la Nacetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido. Entre los ejemplos se incluyen células hospedadoras que se describirán a continuación, en el ítem

3.

Como vector de expresión, se utiliza un vector que es de replicación autónoma en la célula hospedadora o que puede integrarse en el cromosoma y que comprende un promotor en una posición que permite llevar a cabo la transcripción del ADN codificante del mutante negativo dominante de interés. Entre los ejemplos se incluyen vectores de expresión que se describirán a continuación, en el ítem 3.

Para introducir el gen en diversas células hospedadoras, puede utilizarse el método para introducir vectores recombinantes adecuados para diversas células hospedadoras, que se describirá a continuación, en el ítem 3.

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Entre los ejemplos del método de selección de un transformante basándose en la actividad del enzima relacionada con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido, se incluyen los métodos descritos en el ítem 1(1)(a).

Entre los ejemplos del método para seleccionar un transformante basándose en la estructura de la cadena de azúcar de una glucoproteína sobre la membrana celular se incluyen los métodos que se describen a continuación, en el ítem 1(5). Entre los ejemplos del método para seleccionar un transformante basándose en la estructura de la cadena de azúcar de una molécula de anticuerpo producida se incluyen los métodos que se describen a continuación, en el ítem 5 o 6.

(3) Método para introducir una mutación en el enzima

La célula hospedadora de la presente invención puede prepararse mediante la introducción de una mutación en un gen codificante de un enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido, seguido de la selección de una estirpe celular de interés en la que se ha producido la mutación en el enzima.

Entre los ejemplos del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, se incluyen GMD, Fx, GFPP, fucoquinasa y similares. Entre los ejemplos del enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la Nacetilglucosamina en el extremo reductor mediante enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante Nglucósido se incluyen la α-1,6-fucosiltransferasa, la α-L-fucosidasa y similares.

Entre los ejemplos del método se incluyen: 1) un método en el que se selecciona una estirpe celular deseada a partir de mutantes obtenidos mediante un tratamiento inductor de mutación de una estirpe celular parental con un mutágeno o mutantes generados espontáneamente, basándose en la actividad de un enzima relacionada con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o la actividad de un enzima relacionada con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido, 2) un método en el que la estirpe celular deseada se selecciona de entre mutantes obtenidos mediante un tratamiento inductor de mutación de una estirpe celular parental con un mutágeno o mutantes generados espontáneamente, basándose en la estructura de cadena de azúcar de una molécula de anticuerpo producida, y 3) un método en el que la estirpe celular deseada se selecciona de entre mutantes obtenidos mediante un tratamiento inductor de mutación de una estirpe celular parental con un mutágeno o mutantes generados espontáneamente, basándose en la estructura de cadena de azúcar de una glucoproteína sobre la membrana celular.

Como tratamiento inductor de mutación puede utilizarse cualquier tratamiento, con la condición de que pueda inducir una mutación puntual o una deleción o mutación por desplazamiento de marco en el ADN de las células de la estirpe celular parental.

Entre los ejemplos se incluyen el tratamiento con etilnitrosourea, nitrosoguanidina, benzopireno o un pigmento de acridina y el tratamiento con radiación. Además, pueden utilizarse como mutágenos diversos agentes alquilantes y carcinógenos. Entre los ejemplos del método que permite que actúe un mutágeno sobre las células se incluyen los métodos descritos en Tissue Culture Techniques, tercera edición (Asakura Shoten), editado por Japanese Tissue Culture Association (1996), Nature Genet. 24:314, 2000, y similares.

Entre los ejemplos del mutante generado espontáneamente se incluyen mutantes que se forman espontáneamente al continuar el subcultivo bajo condiciones generales de cultivo celular, sin aplicar un tratamiento especial inductor de mutaciones.

Entre los ejemplos del método para medir la actividad del enzima relacionada con la síntesis de un azúcarnucleótido intracelular, GDP-fucosa, o la actividad del enzima relacionada con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido, se incluyen los métodos descritos en el ítem 1(1)(a). Entre los ejemplos del método para discriminar la estructura de cadena de azúcar de una molécula de anticuerpo preparada se incluyen los métodos que se describirán a continuación, en el ítem 5 o 6. Entre los ejemplos del método para discriminar la estructura de cadena de azúcar de una glucoproteína sobre la membrana celular se incluyen los métodos que se describirán a continuación, en el ítem 1(5).

(4) Método para inhibir la transcripción y/o la traducción de un gen codificante del enzima

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La célula hospedadora de la presente invención puede prepararse mediante la inhibición de la transcripción y/o traducción de un gen diana mediante un método tal como la técnica de ARN/ADN antisentido [Bioscience and Industry 50:322, 1992; Chemistry 46:681, 1991; Biotechnology 9:358, 1992; Trends in Biotechnology 10:87, 1992; Trends in Biotechnology 10:152, 1992; Cell Engineering 16:1463, 1997], la técnica de triple hélice [Trends in Biotechnology 10:132, 1992] o similares, utilizando un gen codificante de un enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, y/o un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido, como la diana.

(5) Método de selección de una estirpe celular resistente a una lectina que reconoce una estructura de cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar unida mediante N-glucósido

La célula hospedadora de la presente invención puede prepararse mediante la utilización de un método de selección de una estirpe celular resistente a una lectina que reconoce una estructura de cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar unida mediante N-glucósido

Entre los ejemplos del método de selección de una estirpe celular resistente a una lectina que reconoce una estructura de cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la Nacetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar unida mediante Nglucósido se incluyen los métodos que utilizan lectina descritos en Somatic Cell Mol. Genet. 12:51, 1986, y similares. Como la lectina, puede utilizarse cualquier lectina, con la condición de que sea una lectina que reconozca una estructura de cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar unida mediante N-glucósido Entre los ejemplos se incluyen una lectina de Lens culinaris LCA (aglutinina de lenteja obtenida de Lens culinaris), una lectina de guisante PSA (lectina de guisante obtenida de Pisum sativum), una lectina de haba VFA (aglutinina obtenida de Vicia faba), una lectina de Aleuria aurantia AAL (lectina obtenida de Aleuria aurantia) y similares.

Específicamente, la estirpe celular de la presente invención resistente a una lectina que reconoce una estructura de cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la Nacetilglucosamina en el extremo reductor mediante enlace α en la cadena de azúcar unida mediante N-glucósido puede seleccionarse mediante el cultivo de células durante un tiempo de entre 1 día y 2 semanas, preferentemente de entre 1 día y 1 semana, utilizando un medio que comprende la lectina a una concentración de entre 1 μg/ml y 1 mg/ml, subcultivando las células supervivientes o recolectando una colonia y transfiriéndola a un recipiente de cultivo y a continuación continuando el cultivo utilizando el medio que contiene lectina. Entre los ejemplos de la estirpe celular obtenidos mediante el método se incluyen CHO/CCR4-LCA Nega-13 (FERM nº BP-7756) obtenidos en el Ejemplo 14(2) que se describen a continuación.

2. Preparación de un animal no humano o planta transgénico o la progenie del mismo de la presente divulgación

El animal no humano o planta transgénico o progenie del mismo de la presente divulgación es un animal no humano o planta transgénico o progenie del mismo en el que se modifica un gen genómico de manera que pueda controlarse la actividad de un enzima relacionada con la modificación de una cadena de azúcar de una molécula de anticuerpo, y puede prepararse según un método similar al del ítem 1, utilizando un gen codificante de un enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido, como la diana.

En un animal no humano transgénico, puede prepararse una célula madre embrionaria de la presente divulgación en la que se encuentra controlada la actividad del enzima relacionada con la síntesis de un azúcarnucleótido intracelular, GDP-fucosa, o la actividad del enzima relacionada con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido, aplicando un método similar al del ítem 1 a una célula madre embrionaria del animal no humano deseado, tal como vaca, oveja, cabra, cerdo, caballo, ratón, rata, ave, mono, conejo o similar.

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Específicamente, se preparó un clon mutante en el que un gen codificante del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar compleja se inactiva o se sustituye con cualquier secuencia, mediante una técnica de recombinación homóloga [por ejemplo Nature 326(6110):295, 1987; Cell 51(3):503, 1987, o similares]. Utilizando el clon mutante preparado, puede prepararse un individuo híbrido que comprende un clon de células madre embrionarias y una célula normal, mediante un método de inyección quimérica en un blastocito de huevo fertilizado de un animal o mediante un método de agregación quimérica. El individuo híbrido se cruza con un individuo normal, de manera que puede obtenerse un animal no humano transgénico en el que la actividad del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa o la actividad de un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido se encuentra reducida o anulada en las células corporales completas.

Además, una célula de huevo fertilizado de la presente divulgación en la que se ha reducido o eliminado la actividad de un enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o la actividad del enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido, puede prepararse aplicando un método similar al del ítem 1 a un huevo fertilizado de un animal no humano de interés, tal como vaca, oveja, cabra, cerdo, caballo, ratón, rata, ave, mono, conejo o similar.

Un animal no humano transgénico en el que se ha eliminado la actividad de un enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o la actividad de un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar compleja unida puede prepararse mediante el trasplante de la célula de huevo fertilizado preparada en el oviducto o útero de una hembra pseudogestante utilizando el método de trasplante embrionario descrito en Manipulation Mouse Embryo, segunda edición, o similar, seguido del nacimiento del animal.

En una planta transgénica, el callo de la presente divulgación en el que la actividad de un enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa o la actividad de un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido ha sido reducida o eliminada puede prepararse mediante la aplicación de un método similar al del ítem 1 a un callo o célula de la planta de interés.

Una planta transgénica en la que se encuentra reducida la actividad de un enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa o la actividad de un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la Nacetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido puede prepararse mediante el cultivo del callo preparado utilizando un medio que comprende auxina y citoquinina para rediferenciarlo de acuerdo con un método conocido [Tissue Culture 20, 1994; Tissue Culture 21, 1995; Trends in Biotechnology 15:45, 1997].

3. Procedimiento para producir una composición de anticuerpo

La composición de anticuerpo puede obtenerse expresándola en una célula hospedadora utilizando los métodos descritos en Molecular Cloning, segunda edición; Current Protocols in Molecular Biology; Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 (en adelante denominado "Antibodies"); Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, tercera edición, Acad. Press, 1993 (en adelante también denominada "Monoclonal Antibodies"), y Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (en adelante también denominada "Antibody Engineering"), por ejemplo, tal como se indica a continuación.

Se preparó un ADNc de longitud completa codificante de una molécula de anticuerpo y se preparó una longitud apropiada de un fragmento de ADN que comprendía una fracción codificante de la molécula de anticuerpo.

Se preparó un vector recombinante mediante la inserción del fragmento de ADN o el ADN de longitud completa cadena abajo del promotor de un vector de expresión apropiado.

Puede obtenerse un transformante que produce la molécula de anticuerpo mediante la introducción del vector recombinante en una célula hospedadora adecuada para el vector de expresión.

Como célula hospedadora, puede utilizarse cualquiera de entre una célula de levadura, una célula animal, una

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célula vegetal o similar, con la condición de que pueda expresar el gen de interés.

Como célula hospedadora también puede utilizarse una célula tal como una célula de levadura, una célula animal, una célula de insecto, una célula vegetal o similar en la que se ha introducido mediante una técnica de ingeniería genética un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar unida mediante Nglucósido que se une a la región Fc de la molécula de anticuerpo.

Como vector de expresión, se utiliza un vector que es de replicación autónoma en la célula hospedadora o que puede integrarse en el cromosoma y que comprende un promotor en una posición que permite que el ADN codificante de la molécula de anticuerpo pueda transferirse.

El ADNc puede prepararse a partir de un tejido o célula humano o no humano utilizando, por ejemplo, un cebador sonda específico para la molécula de anticuerpo de interés, de acuerdo con los métodos descritos en la preparación de ADN en el ítem 1(1)(a).

En el caso de que se utilice una levadura como célula hospedadora, entre los ejemplos de vector de expresión se incluyen YEP13 (ATCC 37115), YEp24 (ATCC 37051), YCp50 (ATCC 37419) y similares.

Puede utilizarse cualquier promotor, con la condición de que pueda funcionar en las levaduras. Entre los ejemplos se incluyen un promotor de un gen de la ruta glucolítica, tal como un gen de hexosa quinasa, etc., el promotor PH05, el promotor PGK, el promotor GAP, el promotor ADH, el promotor gal 1, el promotor gal 10, el promotor de la proteína de choque térmico, el promotor MF α1, el promotor CUP 1 y similares.

Entre los ejemplos de célula hospedadora se incluyen los microorganismos pertenecientes al género Saccharomyces, al género Schizosaccharomyces, al género Kluyveromyces, al género Trichosporon, al género Schwanniomyces y similares, tales como Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Trichosporon pullulans and Schwanniomyces alluvius, etc.

Como método para introducir el vector recombinante, puede utilizarse cualquier método, con la condición de que pueda introducir ADN en levaduras. Entre los ejemplos se incluyen la electroporación [Methods in Enzymology 194:182, 1990], el método de esferoplastos [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:1929, 1978], el método de acetato de litio [J. Bacteriol. 153:163, 1983], un método descrito en Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929, 1978, y similares.

En el caso de que se utilice una célula animal como huésped, entre los ejemplos del vector de expresión se incluyen pcDNAI, pcDM8 (disponible de Funakoshi), pAGE107 [solicitud publicada de patente japonesa examinada nº 22979/91; Cytotechnology 3:133, 1990], pAS3-3 (solicitud publicada de patente japonesa examinada nº 227075/90), pCDM8 [Nature 329:840, 1987], pcDNAI/Amp (fabricado por Invitrogen), pREP4 (fabricado por Invitrogen), pAGE103 [J. Biochemistry 101:1307, 1987], pAGE210 y similares.

Puede utilizarse cualquier promotor, con la condición de que pueda funcionar en una célula animal. Entre los ejemplos se incluye un promotor de gen TI (temprano inmediato) del citomegalovirus (CMV), un promotor temprano del SV40, un promotor de retrovirus, un promotor de metalotioneína, un promotor de choque térmico, un promotor SRα y similares. Además, puede utilizarse un intensificador del gen TI del CMV humano conjuntamente con el promotor.

Entre los ejemplos de la célula hospedadora se incluyen una célula humana tal como una célula Namalwa, una célula de mono tal como una célula COS, una célula de hámster chino, tal como una célula CHO o HBT5637 (solicitud publicada de patente japonesa examinada nº 299/88), una célula de mieloma de rata, una célula de mieloma de ratón, una célula derivada de riñón de hámster sirio, una célula madre embrionaria, una célula de huevo fertilizado y similares.

Como método para introducir el vector recombinante, puede utilizarse cualquier método, con la condición de que pueda introducir ADN en células animales. Entre los ejemplos se incluyen la electroporación [Cytotechnology 3:133, 1990], el método del fosfato de calcio (solicitud publicada de patente japonesa examinada nº 227075/90), el método de lipofección [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413, 1987], el método de inyección [Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual], un método que utiliza una pistola de partícula (pistola génica) (patente japonesa nº 2606856, patente japonesa nº 2517813), el método de DEAE-dextrano [Biomanual Series 4-Gene Transfer and Expression Analysis (Yodo-sha), editado por Takashi Yokota y Kenichi Arai, 1994], el método del vector vírico (Manipulating Mouse Embryo, segunda edición) y similares.

En el caso de que se utilice una célula de insecto como huésped, la proteína puede expresarse mediante el método descrito en Current Protocols in Molecular Biology, Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W.H. Freeman and Company, New York (1992), Bio/Technology 6:47, 1988, o similares.

Es decir, la proteína puede expresarse mediante la introducción simultánea de un vector de introducción de un gen recombinante y un baculovirus en una célula de insecto con el fin de obtener un virus recombinante en un

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sobrenadante de cultivo de células de insecto y después infectar las células de insecto con el virus recombinante.

Entre los ejemplos del vector de introducción de genes utilizado en el método se incluyen pVL1392, pVL1393, pBlueBacIII (todos fabricados por Invitrogen) y similares.

Entre los ejemplos de baculovirus se incluyen el virus de la polihedrosis nuclear Autographa californica, que infecta un insecto de la familia Barathra.

Entre los ejemplos de células de insecto se incluyen los oocitos de Spodoptera frugiperda Sf9 y Sf21 [Current Protocols in Molecular Biology, Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W.H. Freeman and Company, New York, 1992], un oocito de Trichoplusia ni High 5 (fabricado por Invitrogen) y similares.

Entre los ejemplos del método para la introducción simultánea del vector de introducción de genes recombinantes y el baculovirus para la preparación de virus recombinante se incluyen el método de fosfato de calcio (solicitud publicada de patente japonesa examinada nº 227075/90), el método de lipofección [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413, 1987] y similares.

En el caso de que se utilice una célula vegetal como célula hospedadora, entre los ejemplos de vector de expresión se incluyen el plásmido Ti, el virus del mosaico del tabaco y similares.

Como promotor puede utilizarse cualquier promotor, con la condición de que pueda funcionar en una célula vegetal. Entre los ejemplos se incluye el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), el promotor actina 1 del arroz y similares.

Entre los ejemplos de célula hospedadora se incluyen células vegetales de la planta del tabaco, de la patata, del tomate, de la zanahoria, de la soja, de la colza, de la alfalfa, del arroz, del trigo, de la cebada, y similares.

Como método para introducir el vector recombinante, puede utilizarse cualquier método, con la condición de que pueda introducir ADN en una célula vegetal. Entre los ejemplos se incluye un método que utiliza Agrobacterium (solicitud publicada de patente japonesa examinada nº 140885/84, solicitud publicada de patente japonesa examinada nº 70080/85, documento nº 94/00977), la electroporación (solicitud publicada de patente japonesa examinada nº 251887/85), un método que utiliza una pistola de partícula (pistola génica) (patente japonesa nº 2606856, patente japonesa nº 2517813), y similares.

Como método para expresar un gen, puede llevarse a cabo la producción mediante secreción, la expresión de una proteína de fusión de la región Fc con otra proteína y similares, de acuerdo con el método descrito en Molecular Cloning, segunda edición, o similar, además de la expresión directa.

En el caso de que se exprese un gen en una bacteria, levadura, célula animal, célula de insecto o célula vegetal en la que se ha introducido un gen relacionado con la síntesis de una cadena de azúcar, puede obtenerse una molécula de anticuerpo a la que un gen introducido añade un azúcar o cadena de azúcar.

Puede obtenerse una composición de anticuerpo mediante el cultivo del transformante obtenido en un medio para producir y acumular la molécula de anticuerpo en el cultivo y después recuperarla a partir del cultivo resultante. El método para el cultivo del transformante utilizando un medio puede aplicarse de acuerdo con un método general que se utiliza para el cultivo de células hospedadoras.

Como medio para el cultivo de un transformante obtenido utilizando un procariota tal como Escherichia coli, etc., o un eucariota tal como una levadura, etc., como la célula hospedadora, el medio puede ser un medio natural o un medio sintético, con la condición de que comprenda materiales tales como una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, una sal inorgánica y similares que puedan resultar asimilados por el organismo y pueda llevarse a cabo eficientemente el cultivo del transformante.

Como fuente de carbono, pueden utilizarse aquellas que puedan ser asimiladas por el organismo. Entre los ejemplos se incluyen carbohidratos tales como glucosa, fructosa, sacarosa, melazas que los contienen, almidón, hidrolizado de almidón, etc.; ácidos orgánicos, tales como ácido acético, ácido propiónico, etc.; alcoholes, tales como etanol, propanol, etc., y similares.

Entre los ejemplos de la fuente de nitrógeno se incluye amonio, sales amónicas de ácido inorgánico u orgánico, tales como cloruro amónico, sulfato amónico, acetato amónico, fosfato amónico, etc.; otros compuestos que contienen nitrógeno, peptona, extracto de carne, extracto de levadura, licor de maceración del maíz, hidrolizado de caseína, harina de soja, hidrolizado de harina de soja, diversas células fermentadas e hidrolizados de las mismas, y similares.

Entre los ejemplos del material inorgánico se incluyen dihidrogenofosfato de potasio, hidrogenofosfato de dipotasio, fosfato de magnesio, sulfato de magnesio, cloruro sódico, sulfato ferroso, sulfato de manganeso,

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1989], el método de Lowe et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8227, 1989; Genes Develop. 4:1288, 1990], los métodos descritos en la solicitud publicada de patente japonesa examinada nº 336963/93 y solicitud publicada de patente japonesa examinada nº 823021/94 y similares.

Es decir, una molécula de anticuerpo de interés puede secretarse positivamente al exterior de la célula a partir de una célula hospedadora mediante la inserción de un ADN codificante de la molécula de anticuerpo y un ADN codificante de un péptido de señal adecuado para la expresión de la molécula de anticuerpo en un vector de expresión utilizando una técnica de recombinación génica, introduciendo el vector de expresión en la célula hospedadora y expresando después la molécula de anticuerpo.

Además, puede incrementarse su cantidad de producción de acuerdo con el método descrito en la solicitud publicada de patente japonesa examinada nº 227075/90 utilizando un sistema de amplificación génica utilizando un gen de dihidrofolato reductasa.

Además, la composición de anticuerpo también puede producirse utilizando un animal individual en el que se ha introducido un gene (animal no humano transgénico) o una planta individual (planta transgénica) que se construye mediante la diferenciación de una célula animal o vegetal en la que se ha introducido el gen.

En el caso de que el transformante sea un animal individual o una planta individual, puede producirse una composición de anticuerpo de acuerdo con el método general mediante cría o cultivo, produciendo y acumulando de esta manera la composición de anticuerpo, recuperando después la composición de anticuerpo a partir del animal o planta individual.

Entre los ejemplos del procedimiento para producir una composición de anticuerpo utilizando un animal individual se incluyen un método en el que la composición de anticuerpo de interés se produce en un animal construido mediante la introducción de un gen de acuerdo con un método conocido [American Journal of Clinical Nutrition 63:627S, 1996; Bio/Technology 9:830, 1991].

En el caso de un animal individual, puede producirse una composición de anticuerpo mediante la cría de un animal no humano transgénico en el que se ha introducido un ADN codificante de una molécula de anticuerpo, produciendo y acumulando de esta manera la composición de anticuerpo en el animal, y recuperando después la composición de anticuerpo a partir del animal. Entre los ejemplos de los sitios del animal en que se produce y se acumula la composición se incluyen la leche (solicitud publicada de patente japonesa examinada nº 309192/88) y huevos del animal. Como promotor utilizado en dicho caso, puede utilizarse cualquier promotor, con la condición de que pueda funcionar en un animal. Entre los ejemplos preferentes se incluyen promotores específicos de células de glándula mamaria, tales como el promotor caseína α, el promotor caseína β, el promotor lactoglobulina β, promotor de proteína ácida de suero y similares.

Un ejemplo del procedimiento para producir una composición de anticuerpo utilizando una planta individual incluye un método en el que se produce una composición de anticuerpo mediante el cultivo de una planta transgénica en la que se introduce un ADN codificante de una molécula de anticuerpo mediante un método conocido [Tissue Culture 20, 1994; Tissue Culture 21, 1995; Trends in Biotechnology 15:45, 1997] para producir y acumular la composición de anticuerpo en la planta y después recuperar la composición de anticuerpo a partir de la planta.

Con respecto a la purificación de una composición de anticuerpo producida por un transformante en el que se ha introducido un gen codificante de una molécula de anticuerpo, por ejemplo en el caso de que la composición de anticuerpo se exprese intracelularmente en estado disuelto, las células se recuperan tras el cultivo mediante centrifugación, se suspenden en un tampón acuoso y después se fragmentan utilizando un oscilador ultrasónico, prensa francesa, homogeneizador Manton Gaulin, molino Dynomill o similar, con el fin de obtener un extracto libre de células. Puede obtenerse un producto purificado de la composición de anticuerpo a partir de un sobrenadante obtenido mediante centrifugación del extracto libre de células, mediante la utilización de una técnica general de purificación para el aislamiento de enzimas, tal como la extracción con solvente, la precipitación a altas concentraciones salinas ("salting out"), la desalación con sulfato amónico, etc.; la precipitación con un solvente orgánico, la cromatografía de intercambio aniónico utilizando una resina, tal como dietilaminoetil (DEAE)-sefarosa, DIAION HPA-75 (fabricada por Mitsubishi Chemical), etc.; la cromatografía de intercambio catiónico utilizando una resina, tal como S-Sepharose FF (fabricada por Pharmacia), etc.; cromatografía hidrofóbica utilizando una resina, tal como butil-sefarosa, fenil-sefarosa, etc.; la filtración en gel utilizando un tamiz molecular; la cromatografía de afinidad; el cromatoenfoque; la electroforesis, tal como el enfoque isoeléctrico, etc.; y similares, que pueden utilizarse solos o en combinación.

Además, en el caso de que la composición de anticuerpo se exprese intracelularmente mediante la formación de un cuerpo insoluble, las células se recuperan, se fragmentan y se centrifugan de la misma manera, y el cuerpo insoluble de la composición de anticuerpo se recupera como una fracción precipitada. El cuerpo insoluble recuperado de la composición de anticuerpo se solubiliza utilizando un agente desnaturalizante de proteínas. La composición de anticuerpo se convierte en una estructura tridimensional normal mediante dilución o dialización

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Como animal diferente del ser humano, puede utilizarse cualquier animal, tal como el ratón, la rata, el hámster, el conejo o similar, con la condición de que pueda prepararse una célula de hibridoma a partir del mismo.

Entre los ejemplos de método para preparar ARN total a partir de una célula de hibridoma se incluyen el método de tiocianato de guanidina-trifluoroacetato de cesio [Methods in Enzymology 154:3, 1987] y similares, y como ejemplo del método de preparación de ARN a partir del ARN total, el método de columna de celulosa con oligo(dT) inmovilizado (Molecular Cloning, segunda edición), y similares. Además, entre los ejemplos de un kit para preparar ARNm a partir de una célula de hibridoma se incluyen el kit de aislamiento de ARNm Fast Track (fabricado por Invitrogen), el kit de purificación de ARNm Quick Prep (fabricado por Pharmacia) y similares.

Entre los ejemplos del método para sintetizar ADNc y la preparación de una biblioteca de ADNc se incluyen los métodos habituales (Molecular Cloning, segunda edición, Current Protocols in Molecular Biology, suplemento 134) y métodos utilizando un kit disponible comercialmente, tal como SuperScriptTM, el sistema de plásmidos para la síntesis de ADNc y la clonación de plásmidos (fabricado por Gibco Brl)) o el kit de síntesis de ADNc-ZAP (fabricado por Stratagene) y similares.

Durante la preparación de la biblioteca de ADNc, el vector en el que se inserta un ADNc sintetizado utilizando el ARNm extraído de una célula de hibridoma como molde puede ser cualquier vector con la condición de que pueda insertarse el ADNc. Entre los ejemplos se incluyen ZAP Express [Strategies 5:58, 1992], pBluescript II SK(+) [Nucleic Acids Research 17:9494, 1989], λzapII (fabricado por Stratagene), λgt10 y λgt11 [DNA Cloning, A Practical Approach I:49, 1985], Lambda BlueMid (fabricado por Clontech), λExCell, pT7T3 18U (fabricado por Pharmacia), pcD2 [Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983], pUC18 [Gene 33:103, 1985] y similares.

Como Escherichia coli en la que se introduce la biblioteca de ADNc construida a partir de un vector fago o plásmido, puede utilizarse cualquier Escherichia coli, con la condición de que pueda introducirse, expresarse y mantenerse la biblioteca de ADNc. Entre los ejemplos se incluyen XL1-Blue MRF' [Strategies 5:81, 1992], C600 [Genetics 39, 440, 1954], Y1088 y Y1090 [Science 222:778, 1983], NM522 [J. Mol. Biol. 166, 1, 1983], K802 [J. Mol. Biol. 16, 118, 1966], JM105 [Gene, 38, 275, 1985] y similares.

Como método para seleccionar un clon de ADNc codificante de las regiones V de las cadenas H y L de un anticuerpo obtenido de un animal diferente del ser humano a partir de la biblioteca de ADNc, puede utilizarse una hibridación de colonias o una hibridación de placas utilizando una sonda marcada con isótopos o con fluorescencia (Molecular Cloning, segunda edición). El ADNc codificante de las regiones V de las cadenas H y L también puede prepararse mediante la preparación de cebadores y llevando a cabo la reacción en cadena de la polimerasa (en adelante denominada "PCR"; Molecular Cloning, segunda edición; Current Protocols in Molecular Biology, suplemento 1-34) utilizando un ADNc sintetizado a partir de ARNm o de una biblioteca de ADNc a modo de molde.

La secuencia de nucleótidos de los ADNc puede determinarse mediante la digestión de los ADNc seleccionados con enzimas de restricción apropiados, clonando los fragmentos en un plásmido, tal como pBluescript SK(-) (fabricado por Stratagene) o similares, llevando a cabo la reacción de un método generalmente utilizado de análisis de la secuencia de nucleótidos, tal como el método de dideoxi [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463, 1977] de Sanger et al. o similar, y analizando seguidamente los clones utilizando un analizador automático de secuencias de nucleótidos, tal como el secuenciador de ADN A.L.F. (fabricado por Pharmacia) o similares. Puede confirmarse si los ADNc obtenidos codifican las secuencias de aminoácidos completas de las regiones V de las cadenas H y L del anticuerpo que contiene una secuencia de señal secretoria mediante la deducción de las secuencias de aminoácidos completas de las regiones V de las cadenas H y L a partir de la secuencia de nucleótidos determinada y comparándolas con las secuencias de aminoácidos completas de las regiones V de las cadenas H y L de anticuerpos conocidos [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dep. Health and Human Services, 1991].

(3): Análisis de una secuencia de aminoácidos de la región V de anticuerpos obtenidos de animales diferentes del ser humano

Con respecto a las secuencias de aminoácidos completas de las regiones V de las cadenas H y L del anticuerpo que contiene una secuencia de señal secretoria, puede deducirse la longitud de la secuencia de señal secretoria y las secuencias de aminoácidos N-terminales y también pueden encontrarse subgrupos a los que pertenecen, mediante la comparación de los mismos con las secuencias de aminoácidos completas de las regiones V de las cadenas H y L de anticuerpos conocidos [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dep. Health and Human Services, 1991]. Además, las secuencias de aminoácidos de las regiones V de las cadenas H y L de cada RDC también pueden encontrarse mediante la comparación de las mismas con las secuencias de aminoácidos de las regiones V de las cadenas H y L de anticuerpos conocidos [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dep. Health and Human Services, 1991].

(4): Construcción de vector de expresión de anticuerpo híbrido humano

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Puede construirse un vector de expresión de anticuerpo híbrido humano mediante la clonación de ADNc codificantes de las regiones V de cadenas H y L de un anticuerpo obtenido de un animal diferente del ser humano cadena arriba de genes codificantes de las regiones C de las cadenas H y L de un anticuerpo humano en el vector para la expresión de anticuerpos humanizados construidos en el ítem 3(1). Por ejemplo, puede construirse un vector de expresión de anticuerpo híbrido humano mediante la unión de cada uno de los ADNc codificantes de las regiones V de las cadenas H y L de un anticuerpo obtenido de un animal diferente del ser humano a un ADN sintético que comprende secuencias de nucleótidos en los extremos 3'-terminales de las regiones V de las cadenas H y L de un anticuerpo obtenido de un animal diferente del ser humano y secuencias de nucleótidos en los extremos 5'-terminales de las regiones C de las cadenas H y L de un anticuerpo humano y que también presentan una secuencia de reconocimiento de un enzima de restricción apropiado en ambos extremos, y mediante la clonación de los mismos cadena arriba de los genes codificantes de las regiones C de las cadenas H y L de un anticuerpo humano contenido en el vector para la expresión de anticuerpos humanizados construidos que se describen en el ítem 3(1).

(5) Construcción de ADNc codificante de la región V de anticuerpo injertado con RDC humano

Los ADNc codificantes de las regiones V de las cadenas h y L de un anticuerpo injertado con RDC humano puede obtenerse de la manera siguiente. En primer lugar, se seleccionan las secuencias de aminoácidos de los marcos (en adelante denominados "RM") de las regiones V de las cadenas H y L de un anticuerpo humano para la injertación de las RDC de las regiones V de las cadenas H y L de un anticuerpo obtenido de un animal diferente del ser humano. Como secuencias de aminoácidos de las RM de las regiones V de las cadenas H y L de un anticuerpo humano, pueden utilizarse cualesquiera secuencias de aminoácidos con la condición de que se obtengan de un anticuerpo humano. Entre los ejemplos se incluyen secuencias de aminoácidos de las RM de las regiones V de las cadenas H y L de anticuerpos humanos registrados en bases de datos tales como la Protein Data Bank, etc., secuencias de aminoácidos comunes en cada subgrupo de las RM de las regiones V de las cadenas H y L de los anticuerpos conocidos [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dep. Health and Human Services, 1991] y similares. Sin embargo, con el fin de producir un anticuerpo con injertación de RDC humano que presenta una actividad potente, resulta preferible seleccionar una secuencia de aminoácidos que presente una homología tan elevada como resulte posible (de por lo menos 60% o superior) con secuencias de aminoácidos de las regiones V de las cadenas H y L de un anticuerpo de interés obtenido de un animal diferente del ser humano.

A continuación, las secuencias de aminoácidos de las RDC de las regiones V de las cadenas H y L del anticuerpo de interés obtenidas de un animal diferente de un ser humano se injertan en las secuencias de aminoácidos seleccionadas de las RM de las regiones V de las cadenas H y L de un anticuerpo humano para diseñar secuencias de aminoácidos de las regiones V de las cadenas H y L del anticuerpo injertado con RDC humana. Las secuencias de aminoácidos diseñadas se convierten en secuencias de ADN mediante la consideración de la frecuencia de uso de los codones en las secuencias de nucleótidos de los genes de anticuerpo [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dep. Health and Human Services (1991)] y se diseñan las secuencias de ADN codificantes de las secuencias de aminoácidos de las regiones V de las cadenas H y L del anticuerpo injertado con RDC humana. Basándose en las secuencias de ADN diseñadas, se sintetizan varios fragmentos de ADN sintéticos con una longitud de aproximadamente 100 bases y se lleva a cabo la PCR utilizándolos. En este caso, resulta preferible en cada una de las cadenas H y L que se diseñen 6 ADN sintéticos en vista de la eficiencia de reacción de la PCR y las longitudes de los ADN que pueden sintetizarse.

Además, pueden clonarse fácilmente en el vector para la expresión de anticuerpos humanizados construido en el ítem 3(1), mediante la introducción de secuencias de reconocimiento de un enzima de restricción apropiado en los extremos 5'-terminales del ADN sintético presente en ambos extremos. Después de la PCR, el producto amplificado se clona en un plásmido, tal como pBluescript SK(-) (fabricado por Stratagene) o similar y se determinan las secuencias de nucleótidos mediante el método en el ítem 3(2), obteniendo de esta manera un plásmido que presenta secuencias de ADN codificantes de las secuencias de aminoácidos de las regiones V de las cadenas H y L del anticuerpo injertado con RDC humana deseado.

(6) Construcción de vector de expresión de anticuerpo injertado con RDC humana

Puede construirse un vector de expresión de anticuerpo injertado con RDC humana mediante la clonación de ADNc codificantes de las regiones V de cadenas H y L de un anticuerpo injertado con RDC humana construido en el ítem 3(5), cadena arriba del gen codificante de las regiones C de las cadenas H y L de un anticuerpo humano en el vector para la expresión de anticuerpos humanizados construido en el ítem 3(1). Por ejemplo, el vector de expresión de anticuerpo con injertación de RDC humana puede construirse mediante la introducción de secuencias de reconocimiento de un enzima de restricción apropiado en los extremos 5'-terminales de ambos extremos de un fragmento sintético de ADN, de entre los fragmentos sintéticos de ADN que se utilizan al llevar a cabo una PCR en el ítem 3(5) para la construcción de las regiones V de las cadenas H y L del anticuerpo con injertación de RDC humana, de manera que se clonan cadena arriba de los genes codificantes de las regiones C de las cadenas H y L de un anticuerpo humano en el vector para la expresión de anticuerpos humanizados

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indicado en el ítem 3(1) de manera que puedan expresarse en una forma adecuada.

(7) Producción estable de anticuerpos humanizados

Puede obtenerse un transformante capaz de producir establemente un anticuerpo híbrido humano y un anticuerpo injertado con RDC humano (ambos denominados en adelante en la presente memoria "anticuerpo humanizado") mediante la introducción de los vectores de expresión de anticuerpo humanizado indicados en los ítems 3(4) y (6) en una célula animal apropiada.

Entre los ejemplos del método para introducir un vector de expresión de anticuerpos humanizados en una célula animal se incluyen la electroporación [solicitud publicada de patente japonesa examinada nº 257891/90; Cytotechnology 3:133, 1990] y similares.

Como célula animal en la que se introduce un vector de expresión de anticuerpo humanizado, puede utilizarse cualquier célula con la condición de que sea una célula animal que pueda producir el anticuerpo humanizado.

Entre los ejemplos se incluyen células de mieloma de ratón, tales como las células NS' y las células SP2/0, células de ovario de hámster chino, tales como las células CHO/dhfr-y las células CHO/DG44, mieloma de rata tal como las células YB2/0 y las células IR983F, células BHK obtenidas de riñón de hámster chino, células de mieloma humano tales como las células Namalwa y similares, y resultan preferentes las células CHO/DG44 de ovario de hámster chino, las células YB2/0 de mieloma de rata y las células hospedadoras de la presente invención indicadas en el ítem 5.

Tras la introducción del vector de expresión de anticuerpos humanizados, puede seleccionarse un transformante capaz de producir establemente el anticuerpo humanizado utilizando un medio de cultivo de células animales que comprende un agente tal como el sulfato de G418 (en adelante denominado "G418", fabricado por Sigma) y similares de acuerdo con el método dado a conocer en la solicitud publicada de patente japonesa examinada nº 257891/90. Entre los ejemplos de medio para el cultivo de células animales se incluye el medio RPMI 1640 (fabricado por Nissui Pharmaceutical), el medio GIT (fabricado por Nihon Pharmaceutical), el medio Ex-Cell 302 (fabricado por JRH), el medio IMDM (fabricado por Gibco BRL), el medio hibridoma-SFM (fabricado por Gibco BRL), medios obtenidos mediante la adición de diversos aditivos, tales como el suero de feto bovino (en adelante denominado "FBS") a dichos medios, y similares. El anticuerpo humanizado puede producirse y acumularse en el sobrenadante de cultivo mediante el cultivo del transformante obtenido en un medio. El nivel de expresión y la actividad de unión a antígeno del anticuerpo humanizado en el sobrenadante de cultivo pueden medirse mediante un método tal como el ensayo de inmunosorción ligada a enzima [en adelante denominado "ELISA"; Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, capítulo 14, 1998, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited, 1996] o similares. Además, puede incrementarse el nivel de expresión de anticuerpo humanizado del transformante utilizando un sistema de amplificación de gen DHFR de acuerdo con el método dado a conocer en la solicitud publicada de patente japonesa examinada nº 257891/90.

El anticuerpo humanizado puede purificarse a partir de un sobrenadante de cultivo del transformante utilizando una columna de proteína A [Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, capítulo 8, 1988, Monoclonal Antibodies, Principles and Practice, Academic Press Limited, 1996]. Además, también pueden utilizarse métodos de purificación utilizados generalmente para la purificación de proteínas. Por ejemplo, la purificación puede llevarse a cabo mediante la combinación de una filtración en gel, una cromatografía de intercambio iónico y una ultrafiltración. El peso molecular de la cadena H, la cadena L o la molécula de anticuerpo completa del anticuerpo humanizado purificado pueden medirse mediante, por ejemplo, electroforesis en gel de poliacrilamida [en adelante denominada "SDS-PAGE"; Nature 227:680, 1970], Western blotting [Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, capítulo 12, 1988; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited, 1996] o similares.

De esta manera, se han descrito métodos para producir una composición de anticuerpo utilizando una célula animal como huésped, aunque, tal como se ha indicado anteriormente, la composición de anticuerpo también puede ser producida por una levadura, una célula de insecto, una célula vegetal, un animal individual o una planta individual mediante los mismos métodos que en la célula animal.

En el caso de que una célula hospedadora presente la capacidad de expresar una molécula de anticuerpo de manera innata, puede producirse la composición de anticuerpo de la presente exposición mediante la preparación de una célula que expresa la molécula de anticuerpo utilizando el método indicado en el ítem 1, cultivando la célula y después purificando la composición de anticuerpo de interés a partir del cultivo resultante.

4. Evaluación de actividad de la composición de anticuerpo

Como método para medir la cantidad de composición purificada de anticuerpo, la actividad de unión a un anticuerpo y la función efectora de la composición purificada de anticuerpo, puede utilizarse el método conocido

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que se describe en Monoclonal Antibodies, Antibody Engineering, y similares.

A título de ejemplos, en el caso de que la composición de anticuerpo sea de un anticuerpo humanizado, la actividad de unión a un antígeno y la actividad de unión a una estirpe celular en cultivo positiva para antígeno pueden medirse mediante métodos tales como ELISA, un método de inmunofluorescencia [Cancer Immunol. Immunother. 36:373, 1993] y similares. La actividad citotóxica contra una estirpe celular en cultivo positiva para antígeno puede evaluarse mediante la medición de la actividad de CDC, la actividad de ADCC [Cancer Immunol. Immunother. 36:373, 1993] y similares.

Además, puede evaluarse la seguridad y el efecto terapéutico de la composición de anticuerpo en el ser humano utilizando un modelo apropiado de especie animal relativamente próxima al ser humano, tal como Macaca fascicularis o similar.

5. Análisis de las cadenas de azúcar de unión a moléculas de anticuerpo expresadas en diversas células

La estructura de cadena de azúcar de unión a una molécula de anticuerpo expresada en diversas células puede analizarse de acuerdo con el análisis general de la estructura de cadena de azúcar de una glucoproteína. Por ejemplo, la cadena de azúcar que se une a una molécula de IgG comprende un azúcar neutro, tal como galactosa, manosa, fucosa o similar, un aminoazúcar tal como N-acetilglucosamina o similar, y un azúcar ácido, tal como ácido siálico o similar, y puede analizarse mediante un método tal como un análisis de la estructura de las cadenas de azúcar o similar utilizando el análisis de la composición de azúcares, el mapeado bidimensional de las cadenas de azúcar o similares.

(1) Análisis de las composiciones de azúcares neutros y aminoazúcares

La composición de cadenas de azúcar de unión a una molécula de anticuerpo puede analizarse llevando a cabo la hidrólisis ácida de las cadenas de azúcar con un ácido, tal como el ácido trifluoroacético o similar, para liberar un azúcar neutro o un aminoazúcar y medir las proporciones composicionales.

Entre los ejemplos se incluye un método de utilización de un analizador de la composición de azúcares (BioLC) fabricado por Dionex. El BioLC es un aparato que analizar la composición de azúcares mediante HPAEC-PAD (cromatografía de intercambio aniónico de alto rendimiento-detección amperométrica pulsada) [J. Liq. Chromatogr. 6:1577, 1983].

Las proporciones composicionales también pueden analizarse mediante un método de marcaje de fluorescencia utilizando 2-aminopiridina. Específicamente, las proporciones composicionales pueden calcularse de acuerdo con un método conocido [Agric. Biol. Chem. 55(1):283-284, 1991] mediante marcaje de una muestra hidrolizada con ácido con fluorescencia de 2-aminopiridilación y analizando después la composición mediante HPLC.

(2) Análisis de la estructura de las cadenas de azúcar

La estructura de las cadenas de azúcar de unión a una molécula de anticuerpo puede analizarse mediante el método de mapeado bidimensional de las cadenas de azúcar [Anal. Biochem. 171:73, 1988; Biochemical Experimentation Methods 23 -Methods for Studying Glycoprotein Sugar Chains (Japan Scientific Societies Press) editado por Reiko Takahashi, 1989]. El método de mapeado bidimensional de cadenas de azúcar es un método para deducir la estructura de las cadenas de azúcar por ejemplo representando gráficamente el tiempo de retención o la posición de elución de una cadena de azúcar mediante cromatografía de fase inversa en el eje X y el tiempo de retención o posición de elución de la cadena de azúcar mediante cromatografía de fase normal en el eje Y, respectivamente, y comparándolas con dichos resultados de las cadenas de azúcar conocidas.

Específicamente, las cadenas de azúcar se liberan del anticuerpo sometiendo al mismo a hidrazinolisis y la cadena de azúcar liberada se somete a marcaje de fluorescencia con 2-aminopiridina (en adelante denominado "PA") [J. Biochem. 95:197, 1984] y después las cadenas de azúcar se separan de un exceso de reactivo de tratamiento de PA mediante filtración en gel y se someten a cromatografía de fase inversa. A continuación, cada pico de las cadenas de azúcar separadas se somete a cromatografía de fase normal. La estructura de cadena de azúcar puede deducirse representando gráficamente los resultados en un mapa bidimensional de las cadenas de azúcar y comparándolos con los puntos de un estándar de cadena de azúcar (fabricado por Takara Shuzo) o la literatura [Anal. Biochem. 171:73, 1988].

La estructura deducida mediante el método de mapeado bidimensional de las cadenas de azúcar puede confirmarse llevando a cabo adicionalmente una espectrometría de masas, tal como EM-MALDI-TOF de cada cadena de azúcar o similares.

6. Método de determinación inmunológica para discriminar la estructura de cadena de azúcar de la molécula de anticuerpo

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Una composición de anticuerpo comprende una molécula de anticuerpo en la que las cadenas de azúcar de unión a la región Fc del anticuerpo presentan estructuras diferentes. La composición de anticuerpo en la que la proporción de cadena de azúcar en la que la fucosa no se encuentra unida a N-acetilglucosamina en el extremo reductor de la cadena de azúcar es 20% o más del total de cadenas de azúcar complejas unidas mediante Nglucósido que se unen a la región Fc de la composición de anticuerpo presenta una actividad de ADCC potente en el extremo reductor. La composición de anticuerpo puede identificarse mediante la utilización del método de análisis de la estructura de cadena de azúcar de una molécula de anticuerpo descrita en el ítem 6. Además, también puede identificarse mediante un método de determinación inmunológica utilizando una lectina.

La estructura de cadena de azúcar de una molécula de anticuerpo puede identificarse mediante el método de determinación inmunológica utilizando una lectina de acuerdo con un método de determinación inmunológica conocido, tal como tinción western, RIA (radioinmunoensayo), VIA (viroinmunoensayo), EIA (enzimoinmunoensayo), FIA (fluoro-inmunoensayo), MIA (metalo-inmunoensayo) y similares, descritos en Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Wiley-Liss, Inc. (1995); Immunoassay, 3a ed., Igakushoin (1987); Enzyme Antibody Method, edición revisada, Gakusai Kikaku (1985), y similares.

Una lectina que reconoce la estructura de cadena de azúcar de una molécula de anticuerpo comprendida en una composición de anticuerpo se marca y la lectina marcada se deja reaccionar con una composición de anticuerpo, que es la muestra. A continuación, se mide la cantidad de complejo de lectina marcada que se forma con la molécula de anticuerpo.

Entre los ejemplos de la lectina utilizada para identificar la estructura de la cadena de azúcar de una molécula de anticuerpo se incluye WGA (aglutinina de germen de trigo obtenido de T. vulgaris), ConA (cocanavalina A obtenida de C. ensiformis), RIC (una toxina obtenida de R. communis), L-PHA (leucoaglutinina obtenida de P. vulgaris), LCA (aglutinina de lenteja obtenida de L. culinaris), PSA (lectina de guisante obtenida de P. sativum), AAL (lectina de Aleuria aurantia), ACL (lectina de Amaranthus caudatus), BPL (lectina de Bauhinia purpurea), DSL (lectina de Datura stramonium), DBA (aglutinina de Dolichos biflorus), EBL (lectina de corteza de saúco), ECL (lectina de Erythrina cristagalli), EEL (lectina de Euonymus eoropaeus), GNL (lectina de Galanthus nivalis), GSL (lectina de Griffonia simplicifolia), HPA (aglutinina de Helix pomatia), HHL (lectina de híbrido de Hippeastrum), Jacalina, LTL (lectina de Lotus tetragonolobus), LEL (lectina de Lycopersicon esculentum), MAL (lectina de Maackia amurensis), MPL (lectina de Maclura pomifera), NPL (lectina de Narcissus pseudonarcissus), PNA (aglutinina de cacahuete), E-PHA (eritroaglutinina de Phaseolus vulgaris), PTL (lectina de Psophocarpus tetragonolobus), RCA (aglutinina de Ricinus communis), STL (lectina de Solanum tuberosum), SJA (aglutinina de Sophora japonica), SBA (aglutinina de soja), UEA (aglutinina de Ulex europaeus), VVL (lectina de Vicia villosa) y WFA (aglutinina de Wisteria floribunda).Resulta preferente utilizar una lectina que reconozca específicamente una estructura de cadena de azúcar en la que la fucosa se une a la N-acetilglucosamina en el extremo reductor en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido. Entre los ejemplos se incluyen lectina de Lens culinaris LCA (aglutinina de lenteja obtenida de Lens culinaris), lectina de guisante PSA (lectina de guisante obtenida de Pisum sativum), lectina de haba VFA (aglutinina obtenida de Vicia faba) y lectina de Aleuria aurantia AAL (lectina obtenida de Aleuria aurantia).

7. Aplicación de una molécula de anticuerpo producida de acuerdo con la presente invención

La composición de anticuerpo de la presente divulgación presenta una potente actividad citotóxica mediada por células dependiente de anticuerpos. Un anticuerpo que presente una potente actividad citotóxica mediada por células dependiente de anticuerpos resulta útil para prevenir y tratar diversas enfermedades, incluyendo cánceres, enfermedades inflamatorias, enfermedades inmunológicas tales como enfermedades autoinmunológicas, alergias y similares, enfermedades de órganos circulatorios e infecciones víricas o bacterianas.

En el caso de los cánceres, concretamente los tumores malignos, las células de cáncer crecen. Los agentes antitumorales generales inhiben el crecimiento de las células de cáncer. En contraste, un anticuerpo que presente una potente actividad citotóxica mediada por células dependiente de anticuerpos puede tratar cánceres al dañar las células de cáncer mediante su efecto de eliminación celular y, por lo tanto, resulta más eficaz como agente terapéutico que los agentes antitumorales generales. Actualmente, en el agente terapéutico para cánceres, un efecto antitumoral de un medicamento de anticuerpo por sí solo resulta insuficiente, de manera que se ha llevado a cabo una terapia de combinación con quimioterapia [Science 280:1197, 1998]. En el caso de que se encontrase un efecto antitumoral más potente con la composición de anticuerpo de la presente divulgación por sí sola, se reduciría la dependencia de la quimioterapia y se reducirían los efectos secundarios.

En enfermedades inmunológicas tales como las enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunológicas, alergias y similares, se inducen reacciones in vivo de las enfermedades debido a la liberación de una molécula mediadora por los inmunocitos, de manera que puede inhibirse la reacción alérgica mediante la eliminación de los inmunocitos utilizando un anticuerpo que presente una potente actividad citotóxica mediada por células dependiente de anticuerpos.

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Entre los ejemplos de enfermedades de órganos circulatorios se incluyen la arterioesclerosis y similares. Actualmente, la arterioesclerosis se trata utilizando catéteres con balón, aunque las enfermedades de órganos circulatorios pueden prevenirse y tratarse mediante la inhibición del crecimiento de las células arteriales en restricción tras el tratamiento con un anticuerpo con potente actividad citotóxica mediada por células dependiente de anticuerpos.

Pueden prevenirse y tratarse diversas enfermedades, incluyendo infecciones víricas y bacterianas, mediante la inhibición de la proliferación de las células infectadas por un virus o bacteria utilizando un anticuerpo con potente actividad citotóxica mediada por células dependiente de anticuerpos.

Posteriormente se describen ejemplos de un anticuerpo que reconozca un antígeno de tipo tumoral, un anticuerpo que reconoce un antígeno relacionado con alergia o inflamación, un anticuerpo que reconozca antígenos relacionados con enfermedades de los órganos circulatorios y un anticuerpo que reconozca antígenos relacionados con infecciones víricas o bacterianas.

Entre los ejemplos del anticuerpo que reconoce un antígeno de tipo tumoral se incluyen el anticuerpo anti-GD2 (Ohta et al., Anticancer Res. 13:331-336, 1993), el anticuerpo anti-GD3 (Ohta et al., Cancer Immunol. Immunother. 36:260-266, 1993), el anticuerpo anti-GM2 (Nakamura et al., Cancer Res. 54:1511-1516, 1994), el anticuerpo anti-HER2 (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-4289, 1992), el anticuerpo anti-CD52 (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-4289, 1992), el anticuerpo anti-MAGE (Jungbluth et al., British

J. Cancer 83:493-497, 2000), el anticuerpo anti-HM1.24 (Ono et al., Molecular Immunol. 36:387-395, 1999), el anticuerpo anti-proteína relacionada con la hormona paratiroidea (PTHrP) antibody (Ogata et al., Cancer 88:2909-2911, 2000), el anticuerpo anti-factor básico de crecimiento fibroblástico y el anticuerpo anti-FGF8 (Matsuzaki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9911-9915, 1989), el anticuerpo anti-receptor del factor básico de crecimiento fibroblástico y el anticuerpo anti-receptor de FGF8 (Kuo et al., J. Biol. Chem. 265:16455-16463, 1990), el anticuerpo anti-factor de crecimiento similar a la insulina (Yao et al., J. Neurosci. Res. 40:647-659, 1995), el anticuerpo anti-PMSA (Murphy et al., J. Urology, 160, 2396-2401, 1998), el anticuerpo anti-factor de crecimiento endotelial vascular (Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599, 1997), el anticuerpo anti-receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (Kanno et al., Oncogene 19:2138-2146, 2000) y similares.

Entre los ejemplos del anticuerpo que reconoce un antígeno relacionado con alergia o inflamación se incluyen el anticuerpo anti-interleuquina 6 (Abrams et al., Immunol. Rev. 127:5-24, 1992), el anticuerpo anti-receptor de interleuquina 6 (Sato et al., Molecular Immunol. 31:371-381, 1994), el anticuerpo anti-interleuquina 5 (Abrams et al., Immunol. Rev. 127:5-24, 1992), el anticuerpo anti-receptor de interleuquina 5 y el anticuerpo antiinterleuquina 4 (Biord et al., Cytokine 3:562-567, 1991), el anticuerpo anti-factor de necrosis tumoral (Tempest et al., Hybridoma 13:183-190, 1994), el anticuerpo anti-receptor del factor de necrosis tumoral (Amrani et al., Molecular Pharmacol. 58:237-245, 2000), el anticuerpo anti-CCR4 (Campbell et al., Nature 400:776-780, 1999), el anticuerpo anti-quimioquina (Peri et al., J. Immuno. Meth. 174:249-257, 1994), el anticuerpo anti-receptor de quimioquina (Wu et al., J. Exp. Med. 186:1373-1381, 1997) y similares. Entre los ejemplos del anticuerpo que reconoce un antígeno relacionado con una enfermedad de órgano circulatorio se incluye el anticuerpo antiGpIIb/IIIa (Co et al., J. Immunol. 152:2968-2976, 1994), el anticuerpo anti-factor de crecimiento derivado de plaquetas (Ferns et al., Science 253:1129-1132, 1991), el anticuerpo anti-receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas (Shulman et al., J. Biol. Chem. 272:17400-17404, 1997) y el anticuerpo anti-factor de coagulación sanguínea (Peter et al., Circulation 101:1158-1164, 2000) y similares.

Entre los ejemplos del anticuerpo que reconoce un antígeno relacionado con infección vírica o bacteriana se incluye el anticuerpo anti-gp120 (Tugarinov et al., Structure 8:385-395, 2000), el anticuerpo anti-CD4 (Schulze-Koops et al., J. Rheumatology 25:2065-2076, 1998), el anticuerpo anti-CCR4 y el anticuerpo anti-toxina Vero (Karnali et al., J. Clin. Microbiol. 37:396-399, 1999) y similares.

Dichos anticuerpos pueden obtenerse de organizaciones públicas tales como la ATCC (The American Type Culture Collection), el RIKEN Gene Bank at The Institute of Physical and Chemical Research, National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology (nombre actual: International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) y similares, o compañías privadas proveedoras de reactivos, tales como Dainippon Pharmaceutical, R & D SYSTEMS, PharMingen, Cosmo Bio, Funakoshi y similares.

El medicamento que comprende la composición de anticuerpo de la presente divulgación puede administrarse como agente terapéutico solo, aunque generalmente resulta preferente proporcionarlo como formulación farmacéutica producida mediante un método apropiado bien conocido en el campo técnico de la fabricación farmacéutica, mediante la mezcla del mismo con por lo menos un portador farmacéuticamente aceptable.

Resulta deseable seleccionar una vía de administración que resulte más eficaz en el tratamiento. Entre los ejemplos se incluyen la administración oral y la administración parenteral, tal como la administración bucal, traqueal, rectal, subcutánea, intramuscular, intravenosa o similar. En una preparación de anticuerpo, resulta preferente la administración intravenosa.

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La forma de administración incluye sprays, cápsulas, tabletas, gránulos, jarabes, emulsiones, supositorios, inyecciones, pomadas, cintas y similares.

Entre los ejemplos de la preparación farmacéutica adecuados para la administración oral se incluyen emulsiones, sprays, cápsulas, tabletas, polvos, gránulos y similares.

Pueden producirse preparaciones líquidas, tales como emulsiones y jarabes, utilizando, a modo de aditivos, agua, sacáridos tales como sacarosa, sorbitol, fructosa, etc.; glicoles, tales como polietilenglicol, propilenglicol, etc.; aceites, tales como aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de soja, etc.; antisépticos, tales como ésteres de ácido p-hidroxibenzoico, etc.; saborizantes, tales como saborizante de fresa, hierbabuena, etc., y similares.

Pueden producirse cápsulas, comprimidos, polvos, gránulos y similares utilizando, a modo de aditivo, rellenos, tales como lactosa, glucosa, sacarosa, manitol, etc.; agentes desintegrantes, tales como almidón, alginato sódico, etc.; lubricantes, tales como estearato de magnesio, talco, etc.; ligantes, tales como alcohol polivinílico, hidroxipropilcelulosa, gelatina, etc.; surfactantes, tales como éster de ácido graso, etc.; plastificadores, tales como glicerina, etc., y similares.

Entre los ejemplos de la preparación farmacéutica adecuados para la administración parenteral se incluyen inyecciones, supositorios, sprays y similares.

Las inyecciones pueden prepararse utilizando un portador, tal como una solución salina, una solución de glucosa, una mezcla de ambas, o similares. Además, pueden prepararse inyecciones de polvos mediante liofilización de la composición de anticuerpo de la manera habitual y añadiendo cloruro sódico a la misma.

Pueden prepararse supositorios utilizando un portador, tal como manteca de cacao, grasa hidrogenada, ácido carboxílico o similares.

Además, pueden prepararse sprays utilizando la composición de anticuerpo por sí sola o utilizando un portador que no estimula la membrana mucosa bucal o de las vías respiratorias del paciente y puede facilitar la absorción de la composición de anticuerpo dispersándola en forma de partículas finas.

Entre los ejemplos del portador se incluyen lactosa, glicerol y similares. Dependiendo de las propiedades de la composición de anticuerpo y el portador, resulta posible producir preparaciones farmacéuticas, tales como aerosoles, polvos secos y similares. Además, los componentes ejemplificados como aditivos para preparaciones orales también pueden añadirse a las preparaciones parenterales.

Aunque la dosis clínica o la frecuencia de administración varía dependiendo del efecto terapéutico objetivo, del método de administración, del periodo de tratamiento, de la edad, del peso corporal y similares, habitualmente es de entre 10 µg/kg y 20 mg/kg al día por adulto.

Además, como método de examen del efecto antitumoral de la composición de anticuerpo contra diversas células tumorales, entre los ensayos in vitro se incluyen el método de medición de la actividad CDC, el método de medición de la actividad ADCC y similares, y entre los ensayos in vivo se incluyen experimentos antitumorales utilizando un sistema antitumoral en un animal experimental, tal como un ratón, etc., y similares.

Las mediciones de la actividad CDC y de la actividad ADCC y los experimentos antitumorales pueden llevarse a cabo de acuerdo con los métodos descritos en Cancer Immunology Immunotherapy 36:373, 1993; Cancer Research 54:1511, 1994, y similares.

La presente divulgación se describe a continuación en detalle basándose en los ejemplos.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra patrones de electroforesis de SDS-PAGE de cinco anticuerpos híbridos anti-GD3 purificados (utilizando un gradiente de gel de 4% a 15%). Las figuras 1A y 1B muestran los resultados de la electroforesis bajo condiciones no reductoras y bajo condiciones reductoras, respectivamente. Los carriles 1 a 7 muestran los patrones de electroforesis de marcadores de peso molecular alto. Anticuerpo híbrido YB2/0-GD3, anticuerpo híbrido CHO/DG44-GD3, anticuerpo híbrido SP2/0-GD3, anticuerpo híbrido NS0-GD3 (302), anticuerpo híbrido NS0-GD3 (GIT) y marcadores de peso molecular bajo, respectivamente.

La figura 2 muestra las actividades de cinco anticuerpos híbridos anti-GD3 purificados de unión a GD3, medidos mediante modificación de la concentración de anticuerpo. La ordenada y las abscisas muestran la actividad de unión a GD3 y la concentración de anticuerpo, respectivamente. "○", "●", "□", "■" y "Δ" muestran las actividades del anticuerpo híbrido YB2/0-GD3, del anticuerpo híbrido CHO/DG44-GD3, del anticuerpo híbrido SP2/0-GD3, del anticuerpo híbrido NS0-GD3 (302) y del anticuerpo híbrido NS0-GD3 (GIT), respectivamente.

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La figura 3 muestra las actividades de ADCC de cinco anticuerpos híbridos anti-GD3 purificados para la estirpe celular de melanoma humano G-361. La ordenada y las abscisas muestran la actividad citotóxica y la concentración de anticuerpo, respectivamente. "○", "●", "□", "■" y "Δ" muestran las actividades del anticuerpo híbrido YB2/0-GD3, del anticuerpo híbrido CHO/DG44-GD3, del anticuerpo híbrido SP2/0-GD3, del anticuerpo híbrido NS0-GD3 (302) y del anticuerpo híbrido NS0-GD3 (GIT), respectivamente.

La figura 4 muestra los patrones de electroforesis de SDS-PAGE de tres anticuerpos anti-IL_h-5Rα con injertación de RDC (utilizando un gradiente de gel de 4% a 15%). Las figuras 4A y 4B muestran los resultados de la electroforesis llevada a cabo bajo condiciones no reductoras y bajo condiciones reductoras, respectivamente. Los carriles 1 a 5 muestran los patrones de electroforesis de los marcadores de peso molecular alto, anticuerpo de YB2/0-IL_h RDC, anticuerpo de CHO/d-IL-5R_h RDC, anticuerpo de NS0-IL-5R_h RDC y de los marcadores de peso molecular bajo, respectivamente.

La figura 5 muestra las actividades de tres anticuerpos anti-hIL-5Rα con injertación de RDC purificados de unión a IL-5Rα_h, medidos mediante modificación de la concentración de anticuerpo. La ordenada y las abscisas muestran la actividad de unión con IL-5Rα_h y la concentración de anticuerpo, respectivamente. "○", "●" and "□" muestran las actividades del anticuerpo de YB2/0-IL-5R_h RDC, del anticuerpo de CHO/d-IL-5R_h RDC y del anticuerpo de NS0-IL-5R_h RDC, respectivamente.

La figura 6 muestra las actividades de ADCC de tres anticuerpos anti-IL-5Rα_h con injertación de RDC purificados para una línea de células T de ratón expresante de IL-5R_h llamada CTLL-2(h5R). La ordenada y las abscisas muestran la actividad citotóxica y la concentración de anticuerpo, respectivamente. "○", "●" and "□" muestran las actividades del anticuerpo de YB2/0-IL-5R_h RDC, del anticuerpo de CHO/d-IL-5R_h RDC y del anticuerpo de NS0-IL-5R_h RDC, respectivamente.

La figura 7 muestra las actividades de inhibición de tres anticuerpos anti-IL-5Rα_h con injertación de RDC purificados en un modelo de incremento de eosinófilos inducido por IL-5_h de Macaca fascicularis. La ordenada y las abscisas muestran el número de eosinófilos en sangre periférica y el número de días (el día de inicio de la administración de anticuerpo y de IL-5_h se definió como día 0). "101 y 102", "301, 302 y 303", "401, 402 yd 403" y "501, 502 y 503" muestran los resultados en el grupo de no administración de anticuerpo, en el grupo de administración de anticuerpo de YB2/0-IL-5R_h RDC, en el grupo de administración de CHO/d-IL-5R_h RDC y del grupo de administración de NS0-IL-5R_h RDC, respectivamente.

La figura 8 muestra los patrones de elución de la elución de HPLC de fase inversa de una cadena de azúcar tratada con PA (lado izquierdo) y de un patrón de elución obtenido mediante el tratamiento de la cadena de azúcar tratada con PA con α-L-fucosidasa y después analizados mediante HPLC de fase inversa (lado derecho) del anticuerpo anti-IL-5Rα con injertación de RDC purificado producido por YB2/0 (figura 8A) y del anticuerpo anti-IL-5Rα_h con injertación de RDC purificado producido por NS0 (figura 8B). La ordenada y las abscisas muestran la intensidad relativa de fluorescencia y el tiempo de elución, respectivamente.

La figura 9 muestra un patrón de elución obtenido mediante la preparación de una cadena de azúcar tratada con PA a partir del anticuerpo anti-IL-5Rα_h con injertación de RDC purificado producido por las células CHO/d y el análisis del mismo mediante HPLC de fase inversa. La ordenada y las abscisas muestran la intensidad relativa de fluorescencia y el tiempo de elución, respectivamente.

En la figura 10, la figura 10A muestra las actividades de unión a GD3 de una fracción no adsorbida y una parte de una fracción adsorbida, medidas mediante la modificación de la concentración de anticuerpo. La ordenada y las abscisas muestran la actividad de unión a GD3 y la concentración de anticuerpo, respectivamente. "●" y "○" muestran la fracción no adsorbida y una parte de la fracción adsorbida, respectivamente. La figura 10B muestra las actividades de ADCC de la fracción no adsorbida y una parte de la fracción adsorbida para La línea de melanoma humano G-361. La ordenada y las abscisas muestran la actividad citotóxica y la concentración de anticuerpo, respectivamente. "●" y "○" muestran la fracción no adsorbida y una parte de la fracción adsorbida, respectivamente.

La figura 11 muestra los patrones de elución obtenidos mediante en análisis de cadenas de azúcar tratadas con PA preparadas a partir de una fracción no adsorbida y una parte de una fracción adsorbida mediante una HPLC de fase inversa. Las figuras 11A y 11B muestran un patrón de elución de la fracción no adsorbida y un patrón de elución de una parte de la fracción adsorbida, respectivamente. La ordenada y las abscisas muestran la intensidad relativa de fluorescencia y el tiempo de elución, respectivamente.

La figura 12 muestra los patrones de elución de cadenas de azúcar tratadas con PA preparadas a partir de 6 anticuerpos híbridos anti-GD3 (figs. 12A a 12F) obtenidos mediante el análisis de los mismos mediante HPLC de fase inversa. La ordenada y las abscisas muestran la intensidad relativa de fluorescencia y el tiempo de elución, respectivamente.

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La figura 25 muestra la construcción de un plásmido mfFUT8-pCR2.1.

La figura 26 muestra la construcción de un plásmido pBSmfFUT8.

La figura 27 muestra la construcción de un plásmido pAGEmfFUT8.

La figura 28 muestra los resultados del análisis de los niveles de expresión del gen FUT8 por una estirpe celular de expresión en exceso del gen utilizando una RT-PCR competitiva. La ordenada muestra los valores relativos de cantidades de transcripción de FUT8 respecto a las cantidades de transcripción de β-actina.

La figura 29 muestra las actividades de ADCC de un anticuerpo híbrido anti-GD3 purificado a partir de una estirpe celular que expresa en exceso gen FUT8 contra una estirpe celular de melanoma humano G-361. La ordenada y las abscisas muestran la actividad citotóxica y la concentración de anticuerpo, respectivamente.

La figura 30 muestra los patrones de elución de cadenas de azúcar tratadas con PA preparadas a partir de anticuerpos producidos por estirpes celulares en las que se ha introducido mfFUT8-6 y pAGE249, obtenidos mediante el análisis de los mismos mediante HPLC de fase inversa. Las figuras 30A y 30B muestran los patrones de elución de cadenas de azúcar tratadas con PA preparadas a partir de un anticuerpo producido por la estirpe celular en la que se ha introducido mfFUT8-6 y cadenas de azúcar tratadas con PA preparadas a partir de un anticuerpo producido por la estirpe celular en la que se ha introducido pAGE249, respectivamente. La ordenada y las abscisas muestran la intensidad relativa de fluorescencia y el tiempo de elución, respectivamente.

La figura 31 muestra un patrón de elución de cadenas de azúcar tratadas con PA preparadas con herceptina, obtenido mediante el análisis del mismo mediante HPLC de fase inversa. La ordenada y las abscisas muestran la intensidad relativa de fluorescencia y el tiempo de elución, respectivamente.

La figura 32 muestra la construcción del plásmido CHfFUT8-pCR2.1.

La figura 33 muestra la construcción del plásmido ploxPPuro.

La figura 34 muestra la construcción del plásmido pKOFUT8gE2-1.

La figura 35 muestra la construcción del plásmido pKOFUT8gE2-2.

La figura 36 muestra la construcción del plásmido pscFUT8gE2-3.

La figura 37 muestra la construcción del plásmido pKOFUT8gE2-3.

La figura 38 muestra la construcción del plásmido pKOFUT8gE2-4.

La figura 39 muestra la construcción del plásmido pKOFUT8gE2-5.

La figura 40 muestra la construcción de un plásmido pKOFUT8Puro.

La figura 41 muestra los resultados de análisis southern del genoma de las líneas de células CHO con disrupción del gen de α-1,6-fucosiltransferasa 1st.ΔFUT8 2-46-1 y 1st.ΔFUT8 2-46.

La figura 42 muestra las actividades de ADCC de un anticuerpo híbrido anti-CCR4 purificado a partir de una estirpe celular con disrupción génica de alelo de FUT8. La ordenada y las abscisas muestran la actividad citotóxica y la concentración de anticuerpo. "▲" y "■" muestran las actividades de un anticuerpo purificado derivado de una célula CHO 5-03 productora de anticuerpos híbridos anti-CCR4 y un anticuerpo purificado derivado de 1st.ΔFUT8 2-46-1, respectivamente.

La figura 43 muestra actividades de ADCC de anticuerpos híbridos anti-CCR4 humanos producidos por estirpes celulares resistentes a lectina. La ordenada y las abscisas muestran la actividad citotóxica y la concentración de anticuerpo. "□", "■", "◆" y "▲" muestran las actividades de los anticuerpos producidos por la cepa 5-03, CHO/CCR4-LCA, CHO/CCR4-AAL y CHO/CCR4-PHA, respectivamente.

La figura 44 muestra actividades de ADCC de anticuerpos híbridos anti-CCR4 humanos producidos por estirpes celulares resistentes a lectina. La ordenada y las abscisas muestran la actividad citotóxica y la concentración de anticuerpo, respectivamente. "□", "Δ" y "●" muestran las actividades de los anticuerpos producidos por YB2/0 (KM2760 # 58-35-16), 5-03 y CHO/CCR4-LCA, respectivamente.

La figura 45 muestra los patrones de elución de cadenas de azúcar tratadas con PA preparadas a partir de anticuerpos híbridos anti-CCR4 purificados, obtenidos mediante el análisis de los mismos mediante HPLC de

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fase inversa. La ordenada y las abscisas muestran la intensidad relativa de fluorescencia y el tiempo de elución, respectivamente. Las figuras 45A, 45B, 45C y 45D muestran los resultados de los análisis de un anticuerpo producido por la cepa 5-03, un anticuerpo producido por CHO/CCR4-LC1, un anticuerpo producido por CHO/CCR4-AAL y un anticuerpo producido por CHO/CCR4-PHA, respectivamente.

La figura 46 muestra la primera etapa de construcción de un vector de expresión de GMD derivada de células CHO (6 etapas en total).

La figura 47 muestra la segunda etapa de construcción de un vector de expresión de GMD derivada de células CHO (6 etapas en total).

La figura 48 muestra la tercera etapa de construcción de un vector de expresión de GMD derivada de células CHO (6 etapas en total).

La figura 49 muestra la cuarta etapa de construcción de un vector de expresión de GMD derivada de células CHO (6 etapas en total).

La figura 50 muestra la quinta etapa de construcción de un vector de expresión de GMD derivada de células CHO (6 etapas en total).

La figura 51 muestra la sexta etapa de construcción de un vector de expresión de GMD derivada de células CHO (6 etapas en total).

La figura 52 muestra la resistencia de CHO/CCR4-LCA que expresa GMD para la lectina LCA. La medición se llevó a cabo dos veces definiendo la tasa de supervivencia de un grupo de células cultivadas sin adición de lectina LCA como 100%. En el dibujo, "249" muestra la tasa de supervivencia de CHO/CCR4-LCA en el que se ha introducido el vector de expresión pAGE249 para la lectina LCA. GMD muestra la resistencia de CHO7CCR4-LCA en la que se ha introducido un vector de expresión de GMD pAGE249GMD para la lectina LCA.

La figura 53 muestra actividades de ADCC de anticuerpos híbridos anti-CCR4 humanos producidos por células de las estirpes celulares CHO/CCR4-LCA expresantes de GMD. La ordenada y las abscisas muestran la actividad citotóxica y la concentración de anticuerpo, respectivamente.

La figura 54 muestra una etapa de producción de un plásmido CHO-GMD en el que el extremo 5'-terminal de un clon 34-2 se introduce en el extremo 5'-terminal de un ADNc clon 22-8 de GMD derivado de célula CHO.

La figura 55 muestra un patrón de elución de cadenas de azúcar tratadas con PA preparadas a partir de un anticuerpo híbrido anti-CCR4 purificado a partir de CHO/CCR4-LCA expresante de gen de GMD, obtenidos mediante el análisis de los mismos mediante HPLC de fase inversa. La ordenada y las abscisas muestran la intensidad relativa de fluorescencia y el tiempo de elución, respectivamente.

Ejemplo 1

Producción de anticuerpo híbrido humano anti-gangliósido GD3:

1. Construcción de vector de expresión en tándem pChiLHGM4 para el anticuerpo híbrido humano antigangliósido GD3

Se construyó un plásmido pChi641LGM40 mediante la ligación de un fragmento de aproximadamente 4,03 kb que contiene un ADNc de cadena L, obtenido mediante la digestión de un vector de expresión de cadena L, pChi641LGM4 [J. Immunol. Methods 167:271, 1994] para el anticuerpo híbrido humano anti-gangliósido GD3 (en adelante denominado "anticuerpo híbrido anti-GD3") con los enzimas de restricción MluI (fabricado por Takara Shuzo) y SalI (fabricado por Takara Shuzo) con un fragmento de aproximadamente 3,40 kb que contenía un gen de resistencia a G418 y una señal de procesamiento, obtenido mediante la digestión de un vector de expresión pAGE107 [Cytotechnology 3:133, 1990] para células animales con enzimas de restricción MluI (fabricado por Takara Shuzo) y SalI (fabricado por Takara Shuzo) utilizando el kit de ligación de ADN (fabricado por Takara Shuzo) y transformando después E. coli HB101 (Molecular Cloning, segunda edición9 con el producto ligado.

A continuación, un fragmento de aproximadamente 5,68 kb que contiene un ADNc de cadena L, obtenido mediante la digestión del plásmido construido pChi641LGM40 con un enzima de restricción ClaI (fabricado por Takara Shuzo), creando extremos romos en el mismo utilizando el kit de creación de extremos romos de ADN (fabricado por Takara Shuzo) y digiriéndolo además con MluI (fabricado por Takara Shuzo), se ligó con un fragmento de aproximadamente 8,40 kb que contenía un ADNc de la cadena H, obtenido mediante digestión con un vector de expresión de la cadena H de anticuerpo híbrido anti-GD3, pChi641HGM4 [J. Immunol. Methods 167:271, 1994] con el enzima de restricción XhoI (fabricado por Takara Shuzo), creando extremos romos con el kit de creación de extremos romos de ADN (fabricado por Takara Shuzo) y digiriéndolo además con MluI

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por Gibco BRL)] que comprendía 0,5 mg/ml de G418 y MTX 10 nM, proporcionando una densidad de 1 a 2x105 células/ml y la suspensión se dispensaron 0,5 ml en los pocillos de una placa de 24 pocillos (fabricada por Iwaki Glass). Los transformantes que mostraban resistencia a MTX 10 nM se indujeron mediante cultivo a 37ºC durante 1 a 2 semanas en un incubador con 5% de CO2. Con respecto a los transformantes en los pocillos en los que se había observado crecimiento, se incrementó la concentración de MTX a 100 nM, y finalmente se obtuvieron transformantes capaces de crecer en el medio IMDM-dFBS(10) que comprendía 0,5 mg/ml de G418 y MTX 100 nM y de producir anticuerpo híbrido anti-GD3 en gran cantidad, mediante el mismo método que el indicado anteriormente. De entre los transformantes obtenidos, se seleccionaron las estirpes celulares adecuadas y se aislaron en células individuales (clonación) mediante dilución limitante dos veces. Además, utilizando el método para determinar el producto de transcripción de un gen de α-1,6-fucosiltransferasa mostrado en el Ejemplo 9, se seleccionó una estirpe celular productora de una cantidad relativamente reducida del producto de transcripción y se utilizó como estirpe celular adecuada.

(3) Preparación de células productoras de anticuerpos utilizando células NS0 de mieloma de ratón

Tras introducir 5 μg del vector de expresión pChi641LHGM4 del anticuerpo híbrido anti-GD3 en 4x106 células NS0 de mieloma de ratón mediante electroporación [Cytotechnology 3:133, 1990], las células se suspendieron en 40 ml de EX-CELL302-FBS(10) (medio EX-CELL302 que comprendía FBS al 10% y L-glutamina 2 mM [en adelante denominado "L-Gln", fabricado por Gibco BRL)] y se dispensaron 200 μl/pocillo en una placa de cultivo de 96 pocillos (fabricado por Sumitomo Bakelite). Tras cultivarlas a 37ºC durante 24 horas en un incubador con 5% de CO2, se añadió G418 hasta una concentración de 0,5 mg/ml, seguido del cultivo durante 1 a 2 semanas. Se recuperó de los pocillos el sobrenadante de cultivo, en el que se habían formado colonias de los transformantes que mostraban resistencia a G418 y se había observado el crecimiento de las colonias, y se midió la actividad de unión a antígenos del anticuerpo híbrido anti-GD3 en el sobrenadante mediante ELISA, mostrado en el ítem 3 del Ejemplo 1.

Con respecto a los transformantes en pocillos en los que se había observado producción del anticuerpo híbrido anti-GD3 en los sobrenadantes de cultivo, con el fin de incrementar la cantidad de anticuerpo producido utilizando un sistema de amplificación de gen DHFR, se suspendió cada uno de ellos en medio EX-CELL302-dFBS(10) (medio EX-CELL302 que comprendía dFBS al 10% y L-Gln 2 mM) que comprendía 0,5 mg/ml de G418 y MTX 50 nM, proporcionando una densidad de 1 a 2x105 células/ml y la suspensión se dispensaron 2 ml en los pocillos de una placa de 24 pocillos (fabricada por Greiner). Los transformantes que mostraban resistencia a MTX 50 nM se indujeron mediante cultivo a 37ºC durante 1 a 2 semanas en un incubador con 5% de CO2. Se midió la actividad de unión a antígenos del anticuerpo híbrido anti-GD3 en sobrenadantes de cultivo en pocillos en los que se había observado crecimiento de transformantes, mediante el ELISA mostrado en el ítem 3 del Ejemplo 1. Con respecto a los transformantes en pocillos en los que se había observado producción del anticuerpo híbrido anti-GD3 en sobrenadantes de cultivo, se incrementó la concentración de MTX a 100 nM y después a 200 nM, y los transformantes capaces de crecer en el medio EX-CELL302-dFBS(10) que comprendía 0,5 mg/ml de G418 y MTX 200 nM y de producir el anticuerpo híbrido anti-GD3 en una gran cantidad se obtuvieron finalmente mediante el mismo método que se ha indicado anteriormente. De entre los transformantes obtenidos, se seleccionaron las estirpes celulares y se aislaron en forma de células individuales (clonación) mediante dilución limitante dos veces. Además, utilizando el método para determinar el producto de transcripción de un gen de α-1,6-fucosiltransferasa mostrado en el Ejemplo 9, se seleccionó una estirpe celular productora de una cantidad relativamente reducida del producto de transcripción y se utilizó como estirpe celular adecuada.

3. Medición de la actividad de unión del anticuerpo a GD3 (ELISA)

Se midió la actividad de unión a GD3 del anticuerpo tal como se indica a continuación.

En 2 ml de solución de etanol que contenía 10 µg de dipalmitoilfosfatidilcolina (fabricada por Sigma) y 5 µg de colesterol (fabricado por Sigma), se disolvieron 4 nmoles de GD3. En cada pocillo de una placa de 96 pocillos para ELISA (fabricada por Greiner), se dispensaron 20 µl de la solución (40 pmoles/pocillo de concentración final), seguido de secado al aire, se dispensó PBS que contenía albúmina de suero bovino al 1% (en adelante denominada "BSA", fabricada por Sigma) (en adelante denominado "PBS-BSA al 1%") a razón de 100 µl/pocillo y después se llevó a cabo la reacción a temperatura ambiente durante 1 hora para el bloqueo de los grupos activos restantes. Tras descartar el PBS-BSA al 1%, se dispensó un sobrenadante de cultivo de un transformante o una solución diluida de un anticuerpo híbrido humano en 50 µl/pocillo para llevar a cabo la reacción a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras la reacción, se lavó cada pocillo con PBS que contenía Tween-20 al 0,05% (fabricado por Wako Pure Chemical Industries) (en adelante denominado "PBS-Tween"), una solución de anticuerpo de cabra anti-IgG humana marcado con peroxidasa (H y L) (fabricada por American Qualex) diluida

3.000 veces con PBS-BSA al 1% y se dispensó a razón de 50 µl/pocillo como solución de anticuerpo secundario y después se llevó a cabo la reacción a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras la reacción y posterior lavado con PBS-Tween, se dispensó solución de sustrato ABTS [solución preparada mediante disolución de 0,55 g de sal amónica de ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolín-6-sulfónico) en 1 litro de tampón citrato 0,1 M (pH 4,2) y adición de 1 µl/ml de peróxido de hidrógeno a la solución inmediatamente antes del uso (en adelante se utiliza la misma solución)] en 50 µl/pocillo para el revelado de color y después se midió la absorbancia a 415 nm (en

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anticuerpo (cadena H: aproximadamente 49 Kd; cadena L: aproximadamente 23 Kd; molécula completa: aproximadamente 144 kD) y también coincidieron con los informes que indican que el anticuerpo IgG presentaba un peso molecular de aproximadamente 150 kD bajo condiciones no reductoras y resultaba degradado en cadenas H con un peso molecular de aproximadamente 50 kD y cadenas L que presentaban un peso molecular de aproximadamente 25 kD bajo condiciones reductoras debido al corte del enlace disulfuro (en adelante denominado "enlace S-S") en la molécula [Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, capítulo 14, 1998; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited, 1996], de manera que se confirmó que cada anticuerpo híbrido anti-GDE3 se había expresado y purificado en forma de molécula de anticuerpo con la estructura real.

Ejemplo 2

Evaluación de la actividad del anticuerpo híbrido anti-GD3:

1.: Medición de la actividad de unión del anticuerpo híbrido anti-GD3 a GD3 (ELISA)

Se midió la actividad de los cinco tipos de anticuerpo híbrido anti-GD3 purificado obtenidos en el ítem 4 del Ejemplo 1 de unión a GD3 (fabricados por Snow Brand Milk Products) mediante el ELISA mostrado en el ítem 3 del Ejemplo 1. La figura 2 muestra el resultado del examen de la actividad de unión medida mediante la modificación de la concentración del anticuerpo híbrido anti-GD3 que debía añadirse. Tal como se muestra en la figura 2, los cinco tipos de anticuerpo híbrido anti-GD3 mostraron prácticamente la misma actividad de unión a GD3. El resultado demuestra que las actividades de unión a antígeno de dichos anticuerpos son constantes independientemente de las células animales productoras de anticuerpos y los métodos de cultivo de las mismas. Además, la comparación entre el anticuerpo híbrido de NS0-GD3 (302) y el anticuerpo híbrido de NS0-GD3 (GIT) sugiere que las actividades de unión a antígeno son constantes independientemente de los medios utilizados en el cultivo.

2.: Actividad citotóxica (actividad ADCC) in vitro del anticuerpo híbrido anti-GD3

Con el fin de evaluar la actividad citotóxica in vitro de los cinco tipos de anticuerpo híbrido anti-GD3 purificado obtenidos en el ítem 4 del Ejemplo 1, se midió la actividad ADCC de acuerdo con el método siguiente.

(1): Preparación de solución de células diana

Se cultivó la estirpe celular de melanoma humano G-361 (ATCC nº CRL 1424) utilizando el medio RPMI1640FBS(10) para preparar 1x10 6 células, y las células se marcaron radioisotópicamente haciéndolas reaccionar con 3,7 MBq equivalentes de la sustancia radioactiva Na251CrO4 a 37ºC durante 1 hora. Tras la reacción, las células se lavaron tres veces en la suspensión de medio RPMI1640-FBS(10) y la centrifugación, se resuspendieron en el medio y después se incubaron a 4ºC durante 30 minutos en hielo para la disolución espontánea de la sustancia radioactiva. Tras la centrifugación, se ajustó el precipitado a 2x105 células/ml mediante la adición de 5 ml del medio RPMI1640-FBS(10) y se utilizó como solución de las células madre.

(2): Preparación de solución de células efectoras

De una persona sana se recolectaron 50 ml de sangre venosa y se mezclaron suavemente con 0,5 ml de heparina sodio (fabricado por Takeda Pharmaceutical). La mezcla se centrifugó para aislar una capa de células mononucleares utilizando Lymphoprep (fabricado por Nycomed Pharma AS) siguiendo las instrucciones del fabricante. Tras lavar con el medio RPMI1640-FBS(10) mediante centrifugación tres veces, el precipitado resultante se resuspendió, proporcionando una densidad de 2x106 células/ml con el medio y se utilizó como la solución de células efectoras.

(3): Medición de la actividad ADCC

En cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo en U (fabricada por Falcon), se dispensaron 50 μl de la solución de células diana preparada en (1) anteriormente (1x104 células/pocillo). A continuación, se añadieron a lo anterior 100 µl de la solución de células efectoras preparadas en (2), anteriormente (2x105 células/pocillo, la proporción de células efectoras a células diana alcanzó 20:1). A continuación, se añadió cada uno de los anticuerpos híbridos anti-GD3, proporcionando una concentración final de entre 0,0025 y 2,5 µg/ml, seguido de la reacción a 37ºC durante 4 horas. Tras la reacción, se centrifugó la placa y se midió la cantidad de 51Cr en el sobrenadante utilizando un contador γ. Se calculó la cantidad de 51Cr liberado espontáneamente mediante la misma operación, utilizando únicamente el medio en lugar de la solución de células efectoras y la solución de anticuerpo y midiendo la cantidad de 51Cr en el sobrenadante. Se calculó la cantidad total de 51Cr liberado mediante la misma operación, utilizando únicamente el medio en lugar de la solución de anticuerpos y añadiendo ácido clorhídrico 1 N en lugar de la solución de células efectoras y midiendo la cantidad de 51Cr en el sobrenadante. Se calculó la actividad de ADCC a partir de la ecuación (II) a continuación:

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Los resultados se muestran en la figura 3. Tal como se muestra en la figura 3, entre los cinco tipos de anticuerpo híbrido anti-GD3, el anticuerpo híbrido de YB2/0-GD3 mostró la actividad ADCC más potente, seguido del anticuerpo híbrido de SP2/0-GD3, el anticuerpo híbrido de NS0-GD3 y el anticuerpo híbrido de CHO-GD3, en ese orden. No se observó diferencia de actividad ADCC entre el anticuerpo híbrido de NS0-GD3 (302) y el anticuerpo híbrido de NS0-GD3 (GIT) preparado utilizando diferentes medios durante el cultivo. Los resultados anteriores demuestran que la actividad ADCC de los anticuerpos varía en gran medida dependiendo del tipo de células animales que deben utilizarse en la producción de los mismos. Respecto a su mecanismo, debido a que las actividades de unión a antígeno eran idénticas, se consideró que la unión estaba causada por una diferencia en la unión de la estructura a la región Fc de anticuerpo.

Ejemplo 3

Preparación de anticuerpo con injertación de RDC humana anti-cadena α de receptor de interleuquina 5 humana:

1. Preparación de células productoras estables de anticuerpo con injertación de RDC humana anti-cadena α de receptor de interleuquina 5 humana:

(1) Preparación de célula productora de anticuerpos utilizando la célula YB2/0 de mieloma de rata

Mediante la utilización del vector de expresión del anticuerpo con injertación de RDC humana anti-cadena α de receptor de interleuquina 5 humana (en adelante denominado "anticuerpo con injertación de RDC anti-IL5Rα_h"), pKANTEX1259HV3LV0, descrita en el documento nº WO 97/10354, se prepararon células capaces de producir establemente anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Rα_h tal como se indica a continuación.

Tras introducir 5 μg del vector de expresión de anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Rα_h pKANTEX1259HV3LV0 en 4x106 células de YB2/0 de mieloma de rata mediante electroporación [Cytotechnology 3:133, 1990], las células se suspendieron en 40 ml de RPMI1640-FBS(10) y se dispensaron 200 μl/pocillo en una placa de cultivo de 96 pocillos (fabricado por Sumitomo Bakelite). Tras cultivarlas a 37ºC durante 24 horas en un incubador con 5% de CO2, se añadió G418 hasta una concentración de 0,5 mg/ml, seguido del cultivo durante 1 a 2 semanas. Se recuperó de los pocillos el sobrenadante de cultivo, en el que se habían formado colonias de los transformantes que mostraban resistencia a G418 y se había observado el crecimiento de las colonias, y se midió la actividad de unión a antígenos del anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Rα_h en el sobrenadante mediante ELISA, mostrado en el ítem 2 del Ejemplo 3.

Con respecto a los transformantes en pocillos en los que se había observado producción del anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Rα_h en los sobrenadantes de cultivo, con el fin de incrementar la cantidad de anticuerpo producido utilizando un sistema de amplificación de gen DHFR, se suspendió cada uno de ellos en el medio RPMI1640-FBS(10) que comprendía 0,5 mg/ml de G418 y MTX 50 nM, proporcionando una densidad de 1 a 2x105 células/ml y la suspensión se dispensaron 2 ml en los pocillos de una placa de 24 pocillos (fabricada por Greiner). Los transformantes que mostraban resistencia a MTX 50 nM se indujeron mediante cultivo a 37ºC durante 1 a 2 semanas en un incubador con 5% de CO2. Se midió la actividad de unión a antígenos del anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Rα_h en sobrenadantes de cultivo en pocillos en la que se observó crecimiento de los transformantes mediante el ELISA mostrado en el ítem 2 del Ejemplo 3. Con respecto a los transformantes en pocillos en los que se había observado producción del anticuerpo con injertación de RDC antiIL-5Rα_h en sobrenadantes de cultivo, se incrementó la concentración de MTX a 100 nM y después a 200 nM, y los transformantes capaces de crecer en el medio RPMI1640-FBS(10) que comprendía 0,5 mg/ml de G418 y MTX 200 nM y de producir el anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Rα_h en una gran cantidad se obtuvieron finalmente de la manera indicada anteriormente. De entre los transformantes obtenidos, se seleccionaron las estirpes celulares y se aislaron en forma de células individuales (clonación) mediante dilución limitante dos veces. Además, utilizando el método para determinar el producto de transcripción de un gen de α1,6-fucosiltransferasa mostrado en el Ejemplo 9, se seleccionó una estirpe celular productora de una cantidad relativamente reducida del producto de transcripción y se utilizó como estirpe celular adecuada. El clon de células transformadas nº 3 productoras de anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Rα_h obtenido se depositó el 5 de abril de 1999 como FERM nº BP-6690 en el National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology (Higashi 1-1-3, Tsukuba, Ibaraki, Japón) (nombre actual: International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japón)).

(2) Preparación de células productoras de anticuerpos utilizando células CHO/dhfr-

Tras introducir 4 μg del vector de expresión de anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Rα_h

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3. Purificación de anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Rα_h

(1): Cultivo de célula productora de anticuerpos derivada de célula YB2/0 y purificación de anticuerpos

El clon de células transformadas productoras de anticuerpos con injertación de RD anti-IL-5Rα_h obtenido en el ítem 1(1) del Ejemplo 1 se suspendió en el medio GIT que comprendía 0,5 mg/ml de G418 y MTX 200 nM, proporcionando una densidad de 3x105 células/ml y la suspensión se dispensó a razón de 200 ml en matraces de 175 mm2 (fabricados por Greiner). Tras cultivarlas a 37ºC durante 8 días en un incubador con 5% de CO2, se recuperó el sobrenadante de cultivo. El anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Rα_h se purificó a partir del sobrenadante de cultivo utilizando cromatografía de intercambio iónico y un método de filtración en gel. El anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Rα_h purificado se denominó anticuerpo de YB2/0-IL-5R_h RDC.

(2): Cultivo de células productoras de anticuerpos derivada de células CHO/dhfr-y purificación de anticuerpos

El clon de células transformadas productoras de anticuerpos injertados con RDC anti-IL-5Rα_h obtenido en el ítem 1(2) del Ejemplo 3 se suspendió en el medio EX-CELL302 que comprendía L-Gln 3 mM, CDLC al 0,5% y PF68 al 0,3%, proporcionando una densidad de 3x105 células/ml y se cultivó utilizando una botella centrifugadora de 4,0 litros de capacidad (fabricada por Iwaki Glass) bajo agitación a una velocidad de 100 rpm. Tras cultivarlas a 37ºC durante 10 días en una sala de temperatura controlada, se recuperó el sobrenadante de cultivo. El anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Rα_h se purificó a partir del sobrenadante de cultivo utilizando cromatografía de intercambio iónico y un método de filtración en gel. El anticuerpo con injertación de RDC antiIL-5Rα_h purificado se denominó anticuerpo de CHO/d-IL-5R_h RDC.

(3): Cultivo de células productoras de anticuerpos derivadas de células NS0 y purificación de anticuerpos

El clon de células transformadas productoras de anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Rα_h obtenido en el ítem 1(3) del Ejemplo 3 se cultivó de acuerdo con el método de Yarranton et al. [Bio/Technology 10:169, 1992] y después se recuperó un sobrenadante de cultivo. El anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Rα_h se purificó a partir del sobrenadante de cultivo utilizando cromatografía de intercambio iónico y el método de filtración en gel. El anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Rα_h purificado se denominó anticuerpo de NS0/IL-5R_h RDC.

4. Análisis de anticuerpos con injertación de RDC anti-IL-5Rα_h purificados

De acuerdo con un método conocido [Nature 227:680, 1970], 4 μg de cada uno de los tres tipos de anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Rα_h producido y purificado a partir de las células animales respectivas, obtenidos en el ítem 3 del Ejemplo 3, se sometieron a SDS-PAGE para analizar el peso molecular y el grado de purificación. Se muestran los resultados en la figura 4. Tal como se muestra en la figura 4, se observó una única banda en aproximadamente 150 kilodaltons de peso molecular bajo condiciones no reductoras, y dos bandas de aproximadamente 50 kD y aproximadamente 25 kD bajo condiciones reductoras, en cada uno de los anticuerpos con injertación de RDC anti-IL-5Rα purificados. Los pesos moleculares prácticamente coincidieron con los pesos moleculares deducidos de las secuencias de nucleótidos de ADNc de las cadenas H y L del anticuerpo (cadena

H: aproximadamente 49 Kd; cadena L: aproximadamente 23 Kd; molécula completa: aproximadamente 144 kD) y también coincidieron con los informes que indican que el anticuerpo IgG presentaba un peso molecular de aproximadamente 150 kD bajo condiciones no reductoras y resultaba degradado en cadenas H con un peso molecular de aproximadamente 50 kD y cadenas L que presentaban un peso molecular de aproximadamente 25 kD bajo condiciones reductoras debido al corte del enlace S-S en la molécula [Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, capítulo 14, 1998; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited, 1996], de manera que se confirmó que cada anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Rα se había expresado y purificado en forma de molécula de anticuerpo con la estructura real.

Ejemplo 4

Evaluación de actividad de anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Rα_h

1. Actividad de unión de anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Rα_h (ELISA)

Se midió la actividad de los tres tipos de anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Rα_h purificado obtenidos en el ítem 3 del Ejemplo 3 de unión a IL-5Rα_h mediante el ELISA mostrado en el ítem 2 del Ejemplo 3. La figura 5 muestra el resultado del examen de la actividad de unión medida mediante la modificación de la concentración del anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Rα_h que debía añadirse. Tal como se muestra en la figura 5, los tres tipos de anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Rα_h mostraron prácticamente la misma actividad de unión a IL-5Rα_h. El resultado demuestra que las actividades de unión a antígeno de dichos anticuerpos son constantes independientemente de las células animales productoras de anticuerpos y los métodos de cultivo de las mismas, de manera similar al resultado del ítem 1 del Ejemplo 2.

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2. Actividad citotóxica (actividad ADCC) in vitro del anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Rα_h

Con el fin de evaluar la actividad citotóxica in vitro de los tres tipos de anticuerpo con injertación de RDC anti-IL5Rα_h purificado obtenidos en el ítem 3 del Ejemplo 3, se midió la actividad ADCC de acuerdo con el método siguiente.

(1): Preparación de solución de células diana

Se cultivó la línea de células T de ratón CTLL-2(h5R) que expresaba las cadenas α y β de IL-5R_h descritos en el documento nº WO 97/10354 utilizando el medio RPMI1640-FBS(10), proporcionando una densidad de 1x106 células/0,5 ml, y las células se marcaron radioisotópicamente haciéndolas reaccionar con 3,7 MBq equivalentes de la sustancia radioactiva Na251CrO4 a 37ºC durante 1,5 horas. Tras la reacción, las células se lavaron tres veces en la suspensión de medio RPMI1640-FBS(10) y se centrifugaron, se resuspendieron en el medio y después se incubaron a 4ºC durante 30 minutos en hielo para la disolución espontánea de la sustancia radioactiva. Tras la centrifugación, se ajustó el precipitado a una densidad de 2x105 células/ml mediante la adición de 5 ml del medio RPMI1640-FBS(10) y se utilizó como solución de las células madre.

(2): Preparación de solución de células efectoras

De una persona sana se recolectaron 50 ml de sangre venosa y se mezclaron suavemente con 0,5 ml de heparina sodio (fabricado por Takeda Pharmaceutical). La mezcla se centrifugó para aislar una capa de células mononucleares utilizando Polymorphprep (fabricado por Nycomed Pharma AS) siguiendo las instrucciones del fabricante. Tras lavar con el medio RPMI1640-FBS(10) mediante centrifugación tres veces, las células resultantes se resuspendieron, proporcionando una densidad de 9x106 células/ml con el medio y se utilizaron como solución de células efectoras.

(3): Medición de la actividad ADCC

En cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo en U (fabricada por Falcon), se dispensaron 50 μl de la solución de células diana preparada en (1) anteriormente (1x104 células/pocillo). A continuación, se añadieron a lo anterior 100 µl de la solución de células efectoras preparadas en (2), anteriormente (9x105 células/pocillo, la proporción de células efectoras a células diana alcanzó 90:1). A continuación, se añadió cada uno de los anticuerpos con injertación de RDC anti-IL-5Rα_h, proporcionando una concentración final de entre 0,001 y 0,1 µg/ml, seguido de la reacción a 37ºC durante 4 horas. Tras la reacción, se centrifugó la placa y se midió la cantidad de 51Cr en el sobrenadante utilizando un contador γ. Se calculó la cantidad de 51Cr liberado espontáneamente mediante la misma operación, utilizando únicamente el medio en lugar de la solución de células efectoras y la solución de anticuerpo y midiendo la cantidad de 51Cr en el sobrenadante. Se calculó la cantidad total de 51Cr liberado mediante la misma operación, utilizando únicamente el medio en lugar de la solución de anticuerpos y añadiendo ácido clorhídrico 1 N en lugar de la solución de células efectoras y midiendo la cantidad de 51Cr en el sobrenadante.

Se calculó la actividad de ADCC a partir de la ecuación (II), anteriormente proporcionada.

Los resultados se muestran en la figura 6. Tal como se muestra en la figura 6, entre los tres tipos de anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Rα_h, el anticuerpo YB2/0-IL-5R_h RDC mostró la actividad ADCC más potente, seguido del anticuerpo CHO/d-IL-5R_h RDC y el anticuerpo NS0-IL-5R_h RDC, en este orden. De manera similar al resultado del ítem 2 del Ejemplo 2, los resultados anteriores demuestran que la actividad ADCC de los anticuerpos varía en gran medida dependiendo de las células animales que deben utilizarse en la producción de los mismos. Además, debido a que los anticuerpos producidos por las células YB2/0 mostraban la actividad ADCC más potente en ambos tipos de anticuerpo humanizado, se reveló que podía producirse un anticuerpo con actividad ADCC potente mediante la utilización de células YB2/0.

3. Evaluación de la actividad in vivo del anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Rα_h

Con el fin de evaluar la actividad in vivo de los tres tipos de anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Rα_h purificado obtenidos en el ítem 3 del Ejemplo 3, se examinó la actividad de inhibición en un modelo de eosinofilia creciente inducida por IL-5_h de Macaca fascicularis de acuerdo con el método siguiente.

Se administró la IL-5_h (método de preparación descrito en el documento nº WO 97/10354) en Macaca fascicularis bajo la piel dorsal a una dosis de 1 μg/kg, desde el primer día y una vez al día durante un total de 14 veces. Cada anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Rα_h se administró por vía intravenosa a una dosis de 0,3 mg/kg una hora antes de la administración de IL-5_h el día cero. A modo de control se utilizó un grupo sin adición de anticuerpo. En los grupos en los que se había administrado anticuerpo se utilizaron tres animales de Macaca fascicularis en cada grupo (nº 301, nº 302, nº 303, nº 401, nº 402, nº 403, nº 501, nº 502 y nº 503) y se utilizaron dos animales (nº 101 y nº 102) en el grupo sin adición de anticuerpo. Desde los 7 días antes del inicio de la administración y hasta 42 días después de la administración, se recolectó periódicamente

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aproximadamente 1 ml de sangre de una vena safena o una vena femoral y se midió el número de eosinófilos en 1 μl de sangre periférica. Se muestran los resultados en la figura 7. Tal como se muestra en la figura 7, el incremento de los eosinófilos en sangre resultó completamente inhibido en el grupo en el que se había administrado anticuerpo YB2/0-IL-5R_h RDC. Por otra parte, se observó una actividad de inhibición completa en un animal en el grupo en el que se había administrado el anticuerpo de CHO/d-IL-5R_h RDC, mientras que la actividad de inhibición no era suficiente en dos animales. En el grupo en el que se había administrado el anticuerpo de NS0-IL-5R_h RDC, no se observó actividad de inhibición completa y su efecto no resultó suficiente.

Los resultados anteriores demuestran que la actividad in vivo de los anticuerpos varía en gran medida dependiendo del tipo de células animales que deben utilizarse en la producción de los mismos. Además, debido a que se observó una correlación positiva entre el grado de actividad in vivo del anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Rα_h y el grado de su actividad ADCC descrito en el ítem 2 del Ejemplo 4, se señaló que el grado de actividad de ADCC resulta notablemente importante para la expresión de la actividad del mismo.

Basándose en los resultados anteriormente proporcionados, se espera que un anticuerpo con potente actividad de ADCC también resulte útil en el campo clínico para diversas enfermedades en el ser humano.

Ejemplo 5

Análisis de las cadenas de azúcar que potencian la actividad de ADCC:

1.: Preparación de cadena de azúcar marcada con 2-aminopiridina (cadena sacárida tratada con PA)

El anticuerpo humanizado de la presente invención se hidrolizó con ácido clorhídrico para eliminar el ácido siálico. Tras eliminar por completo el ácido clorhídrico, la cadena de azúcar se cortó de la proteína mediante hidrazinolisis [Method of Enzymology 83:263, 1982]. Se eliminó la hidrazina y se llevó a cabo la N-acetilación mediante la adición de una solución acuosa de acetato amónico y anhídrido acético. Tras la liofilización, se llevó a cabo el marcaje fluorescente con 2-aminopiridina [J. Biochem. 95:197, 1984]. La cadena de azúcar marcada fluorescentemente (cadena sacárida tratada con PA) se separó de las impurezas utilizando una columna Superdex Peptide HR 10/30 (fabricada por Pharmacia). La fracción de cadena de azúcar se secó utilizando un concentrador centrífugo y se utilizó como cadena de azúcar tratada con PA purificada.

2.: Análisis de HPLC de fase inversa de cadena de azúcar tratada con PA de anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Rα_h

Según el método en el ítem 1 del Ejemplo 5, los diversos anticuerpos con injertación de RDC anti-IL-5Rα_h producidos en el Ejemplo 3 se sometieron a tratamiento de las cadenas de azúcar tratadas con PA y se llevó a cabo análisis de HPLC de fase inversa con una columna CLC-ODS (fabricada por Shimadzu). Se añadió una cantidad en exceso de α-L-fucosidasa (obtenida de riñón bovino, fabricado por Sigma) a la cadena de azúcar tratada con PA para la digestión (37ºC, 15 horas) y después se analizaron los productos mediante HPLC de fase inversa (figura 8). Se confirmó que la cadena de azúcar unida a asparagina se eluye durante 30 a 80 minutos utilizando los estándares de cadena de azúcar tratados con PA fabricados por Takara Shuzo. Se calculó la proporción de cadenas de azúcar en las que las posiciones de elución en la HPLC de fase inversa se encontraban desplazadas (cadenas sacáridas eluidas entre 48 y 78 minutos) en la digestión con α-L-fucosidasa. Se muestran los resultados en la Tabla 1.

Tabla 1

Célula productora de anticuerpos: Cadena sacárida con enlace α-1,6-fucosa (%)

YB2/0: 47

NS0: 73

Aproximadamente 47% del anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Rα_h producido por las células YB2/0 y aproximadamente 73% del anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Rα_h producido por las células NS0 eran cadenas de azúcar en las que la posición 1 de la fucosa se encontraba unida a la posición 6 de la Nacetilglucosamina en el extremo reductor mediante enlace α en la cadena de azúcar unida mediante N-glucósido (en adelante denominado "cadena sacárida que presenta α-1,6-fucosa"). De esta manera, la proporción de cadenas de azúcar en las que la posición 1 de la fucosa no se encuentra unida a la posición 6 de la Nacetilglucosamina en el extremo reductor mediante enlace α en la cadena de azúcar unida mediante N-glucósido (en adelante denominada "cadena sacárida libre de α-1,6-fucosa") es superior en el anticuerpo producido por la célula YB2/0 que en el anticuerpo producido por la célula NS0.

3. Análisis de la composición de monosacáridos de anticuerpos con injertación de RDC anti-IL-5Rα_h purificados

Las cadenas de azúcar de anticuerpos con injertación de RDC anti-IL-5Rα_h producidos por células YB2/0,

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(II).

Las figuras 14 y 15 muestran el resultado de la medición de la actividad de ADCC de los seis tipos de anticuerpo híbrido anti-GD3 que presentaban una proporción diferente de cadenas de azúcar libres de α-1,6-fucosa a diversas concentraciones (0,0005 a 5 μg/ml) utilizando células efectoras de dos donantes sanos (A y B), respectivamente. Tal como se muestra en las figuras 14 y 15, la actividad de ADCC de los anticuerpos híbridos anti-GD3 mostraban una tendencia a incrementarse proporcionalmente a la proporción de cadenas de azúcar libres de α-1,6-fucosa a cada concentración de anticuerpo. La actividad de ADCC se redujo en el caso de que la concentración de anticuerpo fuese baja. A una concentración de anticuerpo de 0,05 µg/ml, el anticuerpo en el que la proporción de cadenas de azúcar libres de α-1,6-fucosa es de 24%, 29%, 45% o 50% mostraron una actividad de ADCC prácticamente igual de potente pero la actividad de ADCC fue baja en el anticuerpo (13%) o (7%) en el que la proporción de cadenas de azúcar libres de α-1,6-fucosa es inferior a 20%. Estos resultados fueron iguales en el caso de modificación del donante de células efectoras.

Ejemplo 8

Evaluación de la actividad de anticuerpo híbrido anti-CCR4 con diferentes proporciones de cadena de azúcar libre de α-1,6-fucosa:

1. Producción de células que producen establemente anticuerpo híbrido anti-CCR4

Las células que son capaces de producir establemente un anticuerpo híbrido anti-CCR4 se prepararon de la manera siguiente, utilizando el vector de expresión de tipo tándem pKANTEX2160 para un anticuerpo híbrido anti-CCR4 descrito en el documento nº WO 01/64754.

Tras introducir 10 μg del vector de expresión de anticuerpo híbrido anti-CCR4 pKANTEX2160 en 4x106 células de YB2/0 de mieloma de rata mediante electroporación [Cytotechnology 3:133, 1990], las células se suspendieron en 40 ml de hibridoma-SFM-FBS(5) [medio de hibridoma-SFM (fabricado por Invitrogen) que comprendía FBS al 5% (fabricado por PAA Laboratories)] y se dispensaron en 200 μl/pocillo en una placa de cultivo de 96 pocillos (fabricado por Sumitomo Bakelite). Tras cultivarlas a 37ºC durante 24 horas en un incubador con 5% de CO2, se añadió G418 hasta una concentración de 1 mg/ml, seguido del cultivo durante 1 a 2 semanas. Se recuperó el sobrenadante de cultivo a partir de los pocillos en el que se observó crecimiento de transformantes que mostraban resistencia a G418 a partir de la formación de colonias, y se midió la actividad de unión a antígenos del anticuerpo híbrido anti-CCR4 en el sobrenadante mediante ELISA, mostrado en el ítem 2 del Ejemplo 8.

Con respecto a los transformantes en pocillos en los que se había observado producción del anticuerpo híbrido anti-CCR4 en los sobrenadantes de cultivo, con el fin de incrementar la cantidad de anticuerpo producido utilizando un sistema de amplificación de gen DHFR, se suspendió cada uno de ellos en el medio hibridoma-SFM-FBS(5) que comprendía 1 mg/ml de G418 y el inhibidor de DHFR MTX 50 nM (fabricado por Sigma), proporcionando una densidad de 1 a 2x105 células/ml y la suspensión se dispensó en porciones de 1 ml en los pocillos de una placa de 24 pocillos (fabricada por Greiner). Tras cultivarlas a 37ºC durante 1 a 2 semanas en un incubador con 5% de CO2, se indujeron los transformantes que mostraban resistencia a MTX 50 nM. Se observó actividad de unión a antígeno del anticuerpo híbrido anti-CCR4 en sobrenadantes de cultivo en pocillos en los que se observó crecimiento de los transformantes mediante el ELISA descrito en el ítem 2 del Ejemplo 8.

Con respecto a los transformantes en pocillos en los que se observó producción del anticuerpo híbrido anti-CCR4 en sobrenadantes de cultivo, se incrementó la concentración de MTX mediante el mismo método y finalmente se obtuvo un transformante capaz de crecer en medio de hibridoma-SFM-FBS(5) que comprendía MTX 200 nM y capaz de producir el anticuerpo híbrido anti-CCR4 en una gran cantidad. El transformante obtenido se convirtió en células individuales (clonación) mediante dilución limitante dos veces y la estirpe celular clonada obtenida se denominó KM2760 nº 58-35-16. En este caso, utilizando el método para determinar el producto de transcripción de un gen α-1,6-fucosiltransferasa mostrado en el Ejemplo 9, se seleccionó una estirpe celular productora de una cantidad relativamente pequeña del producto de transcripción y se utilizó como estirpe celular adecuada.

(2) Preparación de células productoras de anticuerpos utilizando células CHO/DG44

Tras introducir 4 μg del vector de expresión del anticuerpo híbrido anti-CCR4 pKANTEX2160 en 1,6x106 células CHO/DG44 mediante electroporación [Cytotechnology 3:133, 1990], las células se suspendieron en 10 ml de IMDM-dFBS(10)-HT(1) [medio IMDM (fabricado por Invitrogen) que comprendía FBS al 10% (fabricado por Invitrogen) y 1x concentración de suplemento HT (fabricado por Invitrogen)] y se dispensaron 100 μl/pocillo en una placa de cultivo de 96 pocillos (fabricado por Iwaki Glass). Tras cultivarlas a 37ºC durante 24 horas en un incubador con 5% de CO2, se cambió el medio a IMDM-dFBS(10) (medio IMDM que comprendía 10% de FBS dializado), seguido del cultivo durante 1 a 2 semanas. Se recuperó el sobrenadante de cultivo a partir de los pocillos en el que se observó crecimiento debido a la formación de un transformante que mostraba crecimiento independiente de HT y un nivel de expresión del anticuerpo híbrido anti-CCR4 en el sobrenadante mediante ELISA descrito en el ítem 2 del Ejemplo 8.

Con respecto a los transformantes en pocillos en los que se había observado producción del anticuerpo híbrido anti-CCR4 en los sobrenadantes de cultivo, con el fin de incrementar la cantidad de anticuerpo producido utilizando un sistema de amplificación de gen DHFR, se suspendió cada uno de ellos en el medio IMDM-dFBS(10) que comprendía MTX 50 nM, proporcionando una densidad de 1 a 2x105 células/ml, y la suspensión se dispensó a razón de 0,5 ml en los pocillos de una placa de 24 pocillos (fabricada por Iwaki Glass). Tras cultivarlas a 37ºC durante 1 a 2 semanas en un incubador con 5% de CO2, se indujeron los transformantes que mostraban resistencia a MTX 50 nM. Con respecto a los transformantes en los pocillos en los que se había observado crecimiento, se incrementó la concentración de MTX a 200 nM mediante el mismo método, y finalmente se obtuvo un transformante capaz de crecer en el medio IMDM-dFBS(10) que comprendía MTX 200 nM y de producir anticuerpo híbrido anti-CCR4 en gran cantidad en una gran cantidad. El transformante obtenido se denominó 5-03. En este caso, utilizando el método para determinar el producto de transcripción de un gen de α-1,6-fucosiltransferasa mostrado en el Ejemplo 9, se seleccionó una estirpe celular productora de una cantidad relativamente reducida del producto de transcripción y se utilizó como estirpe celular adecuada.

2. Actividad de unión de anticuerpo al péptido parcial de CCR4 (ELISA)

Se seleccionó el compuesto 1 (SEC ID nº 25) como péptido de la región extracelular de CCR4 humano capaz de reaccionar con el anticuerpo híbrido anti-CCR4. Con el fin de utilizarlo en la medición de actividad mediante ELISA, se preparó un conjugado con BSA (albúmina de suero bovino) (fabricado por Nacalai Tesque) mediante el método siguiente y se utilizó a modo de antígeno. Es decir, se añadieron gota a gota 100 ml de una solución en DMSO que comprendía 25 mg/ml de SMCC [éster de N-hidroxisuccinimida de ácido 4-(N-maleimidometil)ciclohexnao-1-carboxílico] (fabricado por Sigma) a 900 ml de una solución en PBS que contenía 10 mg de BSA bajo agitación con vórtex, seguido de agitación suave durante 30 minutos. Se aplicó una porción de 1 ml de la solución de reacción a una columna de filtración en gel, tal como una columna NAP-10 o similar equilibrada con 25 ml de PBS y después se eluyó con 1,5 ml de PBS y el eluido resultante se eluyó como solución de BSA-SMCC (la concentración de BSA se calculó basándose en la medición de A280). A continuación, se añadieron 250 ml de PBS a 0,5 mg de compuesto 1 y después se disolvieron completamente mediante la adición de 250 ml de DMF, y la solución de BSA-SMCC se añadió a lo anterior bajo agitación con vórtex, seguido de agitación suave durante 3 horas. La solución de reacción se dializó frente a PBS a 4ºC durante la noche, se añadió a lo anterior azida sódica, proporcionando una concentración final de 0,05% y la mezcla se filtró a través de un filtro de 0,22 μm para utilizarse como solución de BSA-compuesto 1.

Se dispensó el conjugado preparado a una concentración de 0,05 µg/ml y a razón de 50 µl/pocillo en una placa EIA de 96 pocillos (fabricado por Greiner) y se incubó para la adhesión a 4ºC durante la noche. Tras lavar cada pocillo con PBS, se añadió a lo anterior BSA al 1%-PBS a razón de 100 µl/pocillo y se dejó reaccionar a temperatura ambiente para bloquear los grupos activos restantes. Tras lavar cada pocillo con PBS que contenía Tween-20 al 0,05% (en adelante denominado "Tween-PBS"), se añadió un sobrenadante de cultivo de un transformante a razón de 50 µl/pocillo y se dejó reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras la reacción, se lavó cada pocillo con Tween-PBS y después una solución de anticuerpo de cabra anti-IgG(γ) humana marcado con peroxidasa (fabricada por American Qualex) diluida 6000 veces con PBS-BSA al 1% se añadió a razón de 50 µl/pocillo como anticuerpo secundario y se dejó reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras la reacción y posterior lavado con Tween-PBS, la solución de sustrato ABTS se dispensó a razón de 50 μl/pocillo para el revelado del color y 20 minutos después se detuvo la reacción mediante la adición de una solución de SDS al 5% a razón de 50 µl/pocillo. A continuación se midió la absorbancia DO415. El anticuerpo híbrido anti-CCR4 obtenido en el ítem 1 del Ejemplo 8 mostró la actividad de unión a CCR4.

3. Purificación de anticuerpo híbrido anti-CCR4

El clon KM2760 nº 58-35-16 de células transformantes expresantes de anticuerpo híbrido anti-CCR4 obtenido en el ítem 1(1) del Ejemplo 8 se suspendió en medio de hibridoma-SFM (fabricado por Invitrogen) que comprendía MTX 200 nM y 5% de GF21 de Daigo (fabricado por Wako Pure Chemical Industries), proporcionando una densidad de 2x105 células/ml y se sometió a cultivo bajo agitación por lotes alimentados utilizando una botella centrifugadora (fabricada por Iwaki Glass) en una cámara termostatizada a 37ºC. Tras cultivarlo durante 8 a 10 días, se purificó el anticuerpo híbrido anti-CCR4 a partir del sobrenadante de cultivo recuperado utilizando una columna de Prosep-A (fabricada por Millipore) y la filtración en gel. El anticuerpo híbrido anti-CCR4 purificado se denominó KM2760-1.

(2): Cultivo de células productoras de anticuerpos derivadas de células CHO-DG44 y purificación de anticuerpos

La línea 5-03 de células transformantes productoras de anticuerpo híbrido anti-CCR4 obtenida en el ítem 1(2) del Ejemplo 8 se cultivó a 37ºC en un incubador con 5% de CO2 utilizando medio IMDM-dFBS(10) en un matraz de 182 cm2 (fabricado por Greiner). Tras alcanzar la densidad celular la confluencia tras varios días, se descartó el sobrenadante del cultivo y las células se lavaron con 25 ml de tampón PBS y después se mezclaron con 25 ml de medio EXCELL 301 (fabricado por JRH). Tras cultivarlas a 37ºC durante 7 días en un incubador con 5% de CO2, se recuperó el sobrenadante de cultivo. Se purificó el anticuerpo híbrido anti-CCR4 a partir del sobrenadante de cultivo utilizando una columna Prosep-A (fabricada por Millipore) siguiendo las instrucciones del fabricante. El anticuerpo híbrido anti-CCR4 purificado se denominó KM3060.

Al medir la actividad de unión a CCR4 de KM2760-1 y KM3060 mediante ELISA, mostraron una actividad de unión equivalente.

4.: Análisis de los anticuerpos híbridos anti-CCR4 purificados

Cada 4 μg de los dos tipos de anticuerpo híbrido anti-CCR4 producidos y purificados a partir de las células animales respectivas, obtenidos en el ítem 1 del presente ejemplo, se sometió a SDS-PAGE de acuerdo con el método conocido [Nature 227:680, 1970] y se analizó el peso molecular y el grado de purificación. En cada uno de los anticuerpos híbridos anti-CCR4 purificados, se encontró una única banda correspondiente a un peso molecular de aproximadamente 150 kD bajo condiciones no reductoras y se encontraron dos bandas en aproximadamente 50 kD y aproximadamente 25 kD bajo condiciones reductoras. Los pesos moleculares prácticamente coincidieron con los pesos moleculares deducidos de las secuencias de nucleótidos de ADNc de las cadenas H y L del anticuerpo (cadena H: aproximadamente 49 Kd; cadena L: aproximadamente 23 Kd; molécula completa: aproximadamente 144 kD) y también coincidieron con los informes que indican que el anticuerpo de tipo IgG presenta un peso molecular de aproximadamente 150 kD bajo condiciones no reductoras y resulta degradado en cadenas H con un peso molecular de aproximadamente 50 kD y cadenas L que presentaban un peso molecular de aproximadamente 25 kD bajo condiciones reductoras debido al corte del enlace S-S en la molécula [Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, capítulo 14, 1988, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited, 1996], confirmando de esta manera que cada anticuerpo híbrido anti-CCR4 se había expresado y purificado en forma de molécula de anticuerpo con la estructura correcta.

5.: Preparación de anticuerpo híbrido anti-CCR4 con diferentes proporciones de cadena de azúcar libre de α-1,6fucosa

Se analizaron las cadenas de azúcar que se unían al anticuerpo híbrido anti-CCR4 KM2760-1 obtenido de células YB2/0 preparadas en el ítem 3(1) del Ejemplo 8 y al anticuerpo híbrido anti-CCR4 KM3060 obtenido de células CHO/DG44 preparadas en el ítem 3(2) del Ejemplo 2 de acuerdo con el método del Ejemplo 10(6). La proporción de cadenas de azúcar libres de α-1,6-fucosa era de 87% y 8% en KM2760 y KM3060, respectivamente. En la presente memoria las muestras se denominan anticuerpo híbrido anti-CCR4 (87%) y anticuerpo híbrido anti-CCR4 (8%).

Se mezcló anticuerpo híbrido anti-CCR4 (87%) y anticuerpo híbrido anti-CCR4 (8%) en una proporción de anticuerpo híbrido ant-CCR4 (87%): anticuerpo híbrido anti-CCR4 (8%) = 1: 39, 16 : 67, 22 : 57, 32 : 47 ó 42: 37. Se analizaron las cadenas de azúcar de dichas muestras de acuerdo con el método del Ejemplo 10(6). La proporción de cadenas de azúcar libres de α-1,6-fucosa era de 9%, 18%, 27%, 39% y 46%, respectivamente. En la presente memoria dichas muestras se denominan anticuerpo híbrido anti-CCR4 (9%), anticuerpo híbrido anti-CCR4 (18%), anticuerpo híbrido anti-CCR4 (27%), anticuerpo híbrido anti-CCR4 (39%) y anticuerpo híbrido anti-CCR4 (46%).

Los resultados del análisis de cadenas de azúcar de cada una de las muestras se muestran en la figura 16. La proporción de cadenas de azúcar libres de α-1,6-fucosa se muestra como valor medio del resultado de dos análisis de cadenas sacárida.

6. Evaluación de la actividad de unión al péptido parcial de CCR4 (ELISA)

La actividad de unión de los seis tipos diferentes de anticuerpo híbrido anti-CCR4 que presentaban una cadena de azúcar libre de α-1,6-fucosa diferente preparada en el ítem 5 del Ejemplo 8 a péptido parcial de CCR4 se midió de acuerdo con el método descrito en el ítem 2 del Ejemplo 8.

Como resultado, tal como se muestra en la figura 17, los seis tipos de anticuerpo híbrido anti-CCR4 mostraron prácticamente la misma actividad de unión a CCR4 y se encontró que la proporción de cadenas de azúcar libres de α-1,6-fucosa no presentaba ninguna influencia sobre la actividad de unión a antígeno del anticuerpo.

7. Evaluación de la actividad ADCC sobre la estirpe celular humana de nivel elevado de expresión de CCR4

La actividad de ADCC de los anticuerpos híbridos anti-CCR4 contra una célula humana CCR4/EL-4 de alto nivel de expresión de CCR4 (documento nº WO 01/64754) se midió de la manera siguiente.

(1): Preparación de suspensión de células diana

Se prepararon células (1,5x106) de una célula expresante de CCR4 humanas, células CCR4/EL-4, descritas en el documento nº WO 01/64754, y se añadió a las mismas 5,55 MBq equivalentes de una sustancia radioactiva Na251CrO4, seguido de la reacción a 37ºC durante 1,5 horas, para marcar de esta manera las células con un isótopo radioactivo. Tras la reacción, las células se lavaron tres veces mediante suspensión en medio y la posterior centrifugación, se resuspendieron en el medio y después se incubaron a 4ºC durante 30 minutos en hielo para llevar a cabo la disolución espontánea de la sustancia radioactiva. Tras la centrifugación, se ajustaron las células a 2x105 células/ml mediante la adición de 7,5 ml del medio y se utilizaron como suspensión de células diana.

(2): Preparación de suspensión de células efectoras humanas

De una persona sana se extrajeron 60 ml de sangre periférica y se añadieron 0,6 ml de heparina sodio (fabricada por Shimizu Pharmaceutical), seguido de la mezcla suave. La mezcla se centrifugó (800 g, 20 minutos) para aislar una capa de células mononucleares utilizando Lymphoprep (fabricado por Axis Shield) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células se lavaron mediante centrifugación (1.400 rpm, 5 minutos) tres veces utilizando un medio y después se resuspendieron en el medio, proporcionando una densidad de 5x106 células/ml y se utilizaron como suspensión de células efectoras humanas.

(3): Medición de la actividad ADCC

La suspensión de células diana preparada en (1) se dispensó a razón de 50 µl (1x104 células/pocillo) en cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo en U (fabricada por Falcon). A continuación, se añadieron a lo anterior 100 µl de la suspensión de células efectoras humanas preparada en (2) (2x105 células/pocillo, la proporción de células efectoras humanas a células diana alcanzó 50:1). 1). Además, se añadió a lo anterior cada uno de los anticuerpos híbridos anti-CCR4, proporcionando una concentración final de entre 0,0001 y 10 µg/ml, seguido de la reacción a 37ºC durante 4 horas. Tras la reacción, se centrifugó la placa y se midió la cantidad de 51Cr en el sobrenadante utilizando un contador γ. Se calculó la cantidad de 51Cr liberado espontáneamente llevando a cabo el mismo procedimiento, utilizando únicamente el medio en lugar de la solución de células efectoras humanas y la solución de anticuerpo y midiendo la cantidad de 51Cr en el sobrenadante. Se calculó la cantidad de 51Cr disociado total llevando a cabo el mismo procedimiento, utilizando 1 mol/l de solución de ácido clorhídrico en lugar de la solución de anticuerpo y la suspensión de células efectoras humanas y midiendo la cantidad de 51Cr en el sobrenadante. Se calculó la actividad ADCC (%) utilizando la ecuación (II).

Las figuras 18 y 19 muestran el resultado de la medición de la actividad de ADCC de los anticuerpos híbrido anti-CCR4 que presentaban una proporción diferente de cadenas de azúcar libres de α-1,6-fucosa a diversas concentraciones (0,001 a 10 μg/ml) utilizando células efectoras de dos donantes sanos (A y B), respectivamente. Tal como se muestra en las figuras 18 y 19, la actividad de ADCC de los anticuerpos híbridos anti-CCR4 mostraban una tendencia a incrementarse proporcionalmente a la proporción de cadenas de azúcar libres de α1,6-fucosa a cada concentración de anticuerpo. La actividad de ADCC se redujo en el caso de que la concentración de anticuerpo fuese baja. A una concentración de anticuerpo de 0,01 µg/ml, el anticuerpo en el que la proporción de cadenas de azúcar libres de α-1,6-fucosa es de 27%, 39% o 46% mostraron una actividad de ADCC prácticamente igual de potente pero la actividad de ADCC fue baja en el anticuerpo en el que la proporción de cadenas de azúcar libres de α-1,6-fucosa era inferior a 20%. Estos resultados fueron iguales en el caso de que se cambiase el donante de las células efectoras.

Ejemplo 9

Determinación del producto de transcripción del gen α-1,6-fucosiltransferasa en la estirpe celular huésped:

(1) Preparación de ADNc de cadena sencilla a partir de diversas estirpes celulares

Se prepararon muestras de ADNc de cadena sencilla a partir de células CHO/DG44 con deleción del gen dihidrofolato reductasa (dhfr) obtenidas de células de ovario de hámster chino y YB2/0 de mieloma de rata mediante el procedimiento a continuación.

Las células CHO/DG44 se suspendieron en medio IMDM (fabricado por Life Technologies) complementado con suero de feto bovino al 10% (fabricado por Life Technologies) y 1x concentración de complemento HT (fabricado por Life Technologies) y se inocularon 15 ml de la suspensión en matraz T75 para la utilización en cultivo celular adherente (fabricado por Greiner) a una densidad de 2x105 células/ml. Además, las células YB2/0 se suspendieron en medio RPMI1640 (fabricado por Life Technologies) complementado con suero de feto bovino al 10% (fabricado por Life Technologies) y L-GLN 4 mmoles/l (fabricado por Life Technologies) y se inocularon 15 ml de la suspensión en matraz T75 para el cultivo celular de suspensión (fabricado por Greiner) a una densidad de 2x105 células/ml. Se cultivaron a 37ºC en un incubador con 5% de CO2 y se recuperaron 1x107 de las células hospedadoras respectivas en el primer, 2º, 3º, 4º y 5º días del cultivo para extraer el ARN total utilizando RNAeasy (fabricado por Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.

El ARN total se disolvió en 45 μl de agua estéril, se añadió a lo anterior 1 μl de ADNasa libre de ARNasa RQ1 (fabricado por Promega), 5 μl de 10x tampón de ADNasa adjunto y 0,5 μl de inhibidor de ribonucleasa RNasin (fabricado por Promega), seguido de la reacción a 37ºC durante 30 minutos para degradar el ADN genómico contaminante en la muestra. Tras la reacción, se purificó nuevamente el ARN total utilizando RNAeasy (fabricado por Qiagen) y se disolvió en 50 μl de agua estéril.

En 20 μl de la mezcla de reacción utilizando oligo(dT) como cebador, se sintetizó ADNc de cadena sencilla a partir de 3 μg de cada una de las muestras de ARN total obtenidas mediante reacción de transcripción inversa utilizando el sistema de preamplificación SuperscriptTM para la síntesis del ADNc de primera cadena (fabricado por Life Technologies) y siguiendo las instrucciones del fabricante. Se utilizó una solución de 1x concentración de la solución de reacción para la clonación de α-1,6-fucosiltransferasa (en adelante denominada en ocasiones "FUT8") y β-actina derivada de las células hospedadoras respectivas y solución acuosa diluida 50 veces de la solución de reacción para la determinación de cada nivel de transcripción génica mediante PCR competitiva y las soluciones se almacenaron a -80ºC hasta la utilización de las mismas.

(2) Preparación de fragmentos parciales de ADNc de FUT8 de hámster chino y FUT8 de rata

Se preparó cada fragmento parcial de ADNc de FUT8 de hámster chino y FUT8 de rata mediante el procedimiento siguiente (figura 20).

En primer lugar, se diseñaron cebadores (mostrados en la SEC ID nº 4 y nº 5) específicos para las secuencias de nucleótidos comunes al ADNc de FUT8 humano [J. Biochem. 121:626, 1997] y ADNc de FUT8 porcino [J. Biol. Chem. 271:27810, 1995].

A continuación, 25 μl de una solución de reacción [tampón ExTaq (fabricado por Takara Shuzo), 0,2 mmoles/l de dNTP y 0,5 μmmoles/l de cebadores específicos de gen (SEC ID nº 4 y nº 5)] que contenían 1 μl de cada uno de los ADNc preparados a partir de células CHO y ADNc preparado a partir de células YB2/0, ambos obtenidos en el ítem (1) 2 días después del cultivo, y se llevó a cabo una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando una ADN polimerasa ExTaq (fabricado por Takara Shuzo). La PCR se llevó a cabo mediante el calentamiento a 94ºC durante 1 minuto, seguido de 30 ciclos de calentamiento a 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 2 minutos en un ciclo, y calentamiento final a 72ºC durante 10 minutos.

Tras la PCR, la solución de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8% y un fragmento amplificado específico de 979 pb se purificó utilizando el kit Geneclean Spin (fabricado por Bio 101) y se eluyó con 10 μl de agua estéril (en adelante el método se utiliza para la purificación de fragmentos de ADN a partir de un gel de agarosa). En un plásmido pCR2.1, se utilizaron 4 μl del fragmento amplificado para la inserción siguiendo las instrucciones del fabricante del kit de clonación TOPO TA (fabricado por Invitrogen) y se transformó

E. coli XL1-blue con la solución de reacción mediante el método de Cohen et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2110, 1972] (en adelante el método se utiliza para la transformación de E. coli). Se aislaron muestras de ADN plasmídico siguiendo un método conocido [Nucleic Acids Research 7:1513, 1979] (en adelante se utilizó el método para el aislamiento de plásmido) a partir de 6 clones con ADNc insertado de entre las colonias resistente a canamicina obtenidas.

La secuencia de nucleótidos de cada ADNc insertado en el plásmido se determinó utilizando el secuenciador de ADN 377 (fabricado por Perkin Elmer) y el kit BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction (fabricado por Perkin Elmer) siguiendo el método en las instrucciones del fabricante. Se confirmó que la totalidad de los ADNc insertados de los que se determinaron la secuencia mediante el método codificaban las secuencias parciales del marco de lectura abierta (ORF, según sus siglas en inglés) de FUT8 de hámster chino o FUT8 de rata (mostrados en SEC ID nº 6 y nº 7). Entre ellos, se seleccionaron muestras de ADN plasmídico que no contenía ningún error en absoluto mediante PCR en las secuencias. En la presente memoria dichos plásmidos se denominan CHFUT8-pCR2.1 y YBFUT8-pCR2.1.

(3) Preparación de ADNc de β-actina de hámster chino y de β-actina de rata

Se preparó ADNc de β-actina de hámster chino y de β-actina de rata mediante el procedimiento a continuación (figura 21).

En primer lugar, se diseñó un cebador directo específico para una secuencia común que contiene un codón de inicio de la traducción (mostrado en SEC ID nº 8) y cebadores inversos específicos para las secuencias respectivas que contienen un codón de terminación de la traducción (mostrado en las SEC ID nº 9 y nº 10) a partir de secuencias genómicas de β-actina de hámster chino (GenBank, nº U20114) y de β-actina de rata [Nucleic Acids Research 11:1759, 1983].

A continuación, 25 μl de una solución de reacción [tampón KOD nº 1 (fabricado por Toyobo), 0,2 mmoles/l de dNTP y MgCl2 1 mmol/l, 0,4 μmoles/l de cebadores específicos de gen (SEC ID nº 8 y nº 9 o SEC ID nº 8 y nº 10) y DMSO al 5%] que contenían 1 μl de cada uno de los ADNc preparados a partir de células CHO y ADNc preparado a partir de células YB2/0, ambos obtenidos en el ítem (1) 2 días después del cultivo, y se llevó a cabo una PCR utilizando una ADN polimerasa KOD (fabricado por Toyobo). La PCR se llevó a cabo mediante el calentamiento a 94ºC durante 1 minuto y posteriores 25 ciclos de calentamiento a 98ºC durante 15 segundos, 65ºC durante 2 segundos y 74ºC durante 30 segundos en un ciclo.

Tras la PCR, la solución de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8% y se purificó un fragmento amplificado específico de 1.128 pb. El fragmento de ADN se sometió a fosforilación 5'-terminal del ADN utilizando Megalabel (fabricado por Takara Shuzo) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se recuperó el fragmento de ADN a partir de la solución de reacción utilizando el método de precipitación con etanol y se disolvió en 10 μl de agua estéril.

Separadamente se disolvieron 3 μg de plásmido pBluescript II KS(+) (fabricado por Stratagene) en 35 μl de NEBuffer 2 (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron 16 unidades del enzima de restricción EcoRV (fabricado por Takara Shuzo) para la reacción de digestión a 37ºC durante 3 horas. A la solución de reacción se añadieron 35 μl de tampón Tris-HCl 1 mol/l (pH 8,0) y 3,5 μl de fosfatasa alcalina derivada de E. coli C15 (fabricada por Takara Shuzo), seguido de la reacción a 65ºC durante 30 minutos para desfosforilar de esta manera el extremo del ADN. La solución de reacción se extrajo con fenol/cloroformo, seguido de la precipitación con etanol y el fragmento de ADN recuperado se disolvió en 100 μl de agua estéril.

Cada 4 μl de fragmento amplificado preparado a partir de ADNc de hámster chino o de fragmento amplificado

(1.192 pb) preparado a partir de ADNc de rata se mezclaron con 1 μl del fragmento EcoRV-EcoRV (aproximadamente 3,0 kb) preparado a partir del plásmido pBluescript II KS(+) y 5 μl de Ligation High (fabricado por Toyobo) para la reacción de ligación a 16ºC durante 30 minutos. Utilizando la solución de reacción se transformó E. coli XL1-Blue y se aislaron las muestras de ADN plasmídico respectivas de acuerdo con un método conocido a partir de los clones resistentes a ampicilina obtenidos.

La secuencia de nucleótidos de cada ADNc insertado en el plásmido se determinó utilizando el secuenciador de ADN 377 (fabricado por Perkin Elmer) y el kit BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction (fabricado por Perkin Elmer) siguiendo el método en las instrucciones del fabricante. Se confirmó que la totalidad de los ADNc insertados de los que se habían determinado las secuencias mediante el método codificaban las secuencias completas de ORF de la β-actina de hámster chino o de β-actina de rata. Entre ellos, se seleccionaron muestras de ADN plasmídico que no contenía ningún error en absoluto mediante PCR en las secuencias. En la presente memoria, los plásmidos se denominan CHAc-pBS e YBAc-pBS.

(4) Preparación de estándar de FUT8 y control interno

Con el fin de medir el nivel de transcripción de ARNm del gen de FUT8 en cada célula, como plásmidos, CHFT8-pCR2.1 o YBFT8-pCR2.1, en los que los fragmentos parciales de ADNc preparados en el ítem (2) de FUT8 de hámster chino o FUT8 de rata, respectivamente, se digirieron con el enzima de restricción EcoRI, y los ADN lineales obtenidos se utilizaron como estándares para la preparación de una curva de calibración. CHFT8d-pCR2.1 e YBFT8d-pCR2.1, obtenidos de CHFT8-pCR2.1 e YBFT8-pCR2.1, mediante la deleción de 203 pb entre ScaI e HindIII, una secuencia de nucleótidos interna de FUT8 de hámster chino y FUT8 de rata, respectivamente, se digirieron con el enzima de restricción EcoRI y los ADN lineales obtenidos se utilizaron como estándares internos para la determinación de la cantidad de FUT8. Los detalles de los mismos se proporcionan a continuación.

Se prepararon los estándares de FUT8 de hámster chino y de FUT8 de rata de la manera siguiente. En 40 μl de NEBuffer 2 (fabricado por New England Biolabs), se disolvieron 2 μg del plásmido CHFT8-pCR2.1 y se añadieron 24 unidades del enzima de restricción EcoRV (fabricado por Takara Shuzo), seguido de la reacción de digestión a 37ºC durante 3 horas. Separadamente, se disolvieron 2 μg de plásmido YBFT8-pCR2.1 en 40 μl de NEBuffer 2 (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron 24 unidades del enzima de restricción EcoRI (fabricado por Takara Shuzo), seguido de la reacción de digestión a 37ºC durante 3 horas. Sometiendo una porción de cada una de las soluciones de reacción a electroforesis en gel de agarosa al 0,8% se confirmó que un fragmento EcoRI-EcoRI (aproximadamente 1 kb) que contenía cada uno de los fragmentos parciales de ADNc de FUT8 de hámster chino y FUT8 de rata se había separado de los plásmidos CHFT8-pCR2.1 e YBFT8-pCR2.1 mediante las reacciones de digestión con enzima de restricción. Se diluyó cada una de las soluciones de reacción con 1 μg/ml de ARNt de levadura de panadería (fabricada por Sigma), proporcionando concentraciones de 0,02 fg/µl, 0,2 fg/µl, 1 fg/µl, 2 fg/µl, 10 fg/µl, 20 fg/µl y 100 fg/µl y se utilizó como estándares de FUT8 de hámster chino y de FUT8 de rata.

Se prepararon los estándares internos de FUT8 de hámster chino y de FUT8 de rata de la manera siguiente (figura 22). Se preparó una solución de reacción [tampón KOD nº 1 (fabricado por Toyobo), 0,2 mmoles/l de dNTP, MgCl2 1 mmol/l, cebadores específicos génicos 0,4 µmoles/l (SEC ID nº 11 y nº 12) y DMSO al 5%] que contenía 5 ng de CHFT8-pCR2.1 o YBFT8-pCR2.1 y se llevó a cabo una PCR utilizando una ADN polimerasa KOD (fabricado por Toyobo). La PCR se llevó a cabo mediante el calentamiento a 94ºC durante 4 minutos y los posteriores 25 ciclos de calentamiento a 98ºC durante 15 segundos, 65ºC durante 2 segundos y 74ºC durante 30 segundos en un ciclo. Tras la PCR, la solución de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8% y se purificó un fragmento amplificado específico de aproximadamente 4,7 kb. El extremo 5'-terminal de ADN se fosforiló utilizando Megalabel (fabricado por Takara Shuzo) siguiendo las instrucciones del fabricante y después se recuperó el fragmento de ADN a partir de la solución de reacción mediante precipitación con etanol y se disolvió en 50 µl de agua estéril. Se mezcló el fragmento de ADN obtenido (5 µl, aproximadamente 4,7 kb) y 5 µl de Ligation High (fabricado por Toyobo), seguido de una reacción de autociclización a 16ºC durante 30 minutos.

Utilizando la solución de reacción se transformó E. coli DH5α y se aislaron las muestras de ADN plasmídico de acuerdo con un método conocido a partir de los clones resistentes a ampicilina obtenidos. La secuencia de nucleótidos de cada ADN plasmídico se determinó utilizando un aparato DNA Sequencer 377 (fabricado por Perkin Elmer) y el kit BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction (fabricado por Perkin Elmer) y se confirmó que se había delecionado una secuencia de nucleótidos interna de 203 pb entre ScaL e HindIII de FUT8 de hámster chino o FUT8 de rata. Los plásmidos obtenidos se denominaron CHFT8d-pCR2.1 o YBFT8d-pCR2.1, respectivamente.

A continuación, se disolvieron 2 μg de plásmido CHFT8d-pCR2.1 en 40 μl de NEBuffer 2 (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron 24 unidades del enzima de restricción EcoRI (fabricado por Takara Shuzo), seguido de la reacción de digestión a 37ºC durante 3 horas. Separadamente, se disolvieron 2 μg de plásmido YBFT8d-pCR2.1 en 40 μl de NEBuffer 2 (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron 24 unidades del enzima de restricción EcoRI (fabricado por Takara Shuzo), seguido de la reacción de digestión a 37ºC durante 3 horas. Una parte de cada una de las soluciones de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8% se confirmó que un fragmento EcoRI-EcoRI (aproximadamente 800 pb) que contenía un fragmento del que se habían delecionado 203 pb de las secuencias de nucleótidos internas de los fragmentos parciales de FUT8 de hámster chino o FUT8 de rata, se separó de los plásmidos CHFT8d-pCR2.1 o YBFT8d-pCR2.1 mediante reacciones de digestión con enzima de restricción. Se prepararon diluciones de 2 fg/µl a partir de las soluciones de reacción utilizando 1 µg/ml de ARNt de levadura de panadería (fabricada por Sigma) y se utilizó como controles internos de FUT8 de hámster chino o FUT8 de rata.

(5) Preparación de estándar de β-actina y control interno

Con el fin de medir el nivel de transcripción del ARNm del gen β-actina en diversas células hospedadoras, los plásmidos CHAc-pBS e YBAc-pBS, en los que la longitud completa del ORF de cada ADNc de β-actina de hámster chino y β-actina de rata preparado en el ítem (3) se habían insertado en pBluescript II KS(+), respectivamente, se digirieron con los enzimas de restricción HindIII y PstI y los enzimas de restricción HindIII y KpnI, respectivamente, y los ADN lineales digeridos se utilizaron como estándares para la preparación de una curva de calibración. CHAcd-pBS e YBAcd-pBS, obtenidos de CHAc-pBS e YBAc-pBS, mediante la deleción de 180 pb entre DraIII y DraIII de una secuencia de nucleótidos interna de β-actina de hámster chino y de β-actina de rata se digirieron con los enzimas de restricción HindIII y PstI y los enzimas de restricción HindIII y KpnI, respectivamente, y los ADN lineales digeridos se utilizaron como estándares internos para la determinación de la cantidad de β-actina. Los detalles de los mismos se proporcionan a continuación.

Se prepararon los estándares de β-actina de hámster chino y de β-actina de rata de la manera siguiente. En 40 μl de NEBuffer 2 (fabricado por New England Biolabs), se disolvieron 2 μg del plásmido CHAc-pBS y se añadieron 25 unidades del enzima de restricción HindIII (fabricado por Takara Shuzo) y 20 unidades de PstI (fabricado por Takara Shuzo), seguido de la reacción de digestión a 37ºC durante 3 horas. Separadamente se disolvieron 2 µg del plásmido YBAc-pBS en 40 μl de NEBuffer 2 (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron a lo anterior 25 unidades del enzima de restricción HindIII (fabricado por Takara Shuzo) y 25 unidades de KpnI (fabricado por Takara Shuzo), seguido de la reacción de digestión a 37ºC durante 3 horas. Una parte de cada una de las soluciones de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8% y se confirmó que se separaba un fragmento HindIII-PstI y un fragmento HindIII-KpnI (de aproximadamente 1,2 kb) que contenía el ORF de longitud completa de cada ADNc de la β-actina de hámster chino y de la β-actina de rata, a partir de los plásmidos CHAc-pBS e YBAc-pBS mediante las reacciones de digestión con los enzimas de restricción. Se diluyó cada una de las soluciones de reacción con 1 μg/ml de ARNt de levadura de panadería (fabricada por Sigma), proporcionando concentraciones de 2 pg/µl, 1 pg/µl, 200 fg/µl, 100 fg/µl y 20 fg/µl y se utilizaron como estándares de β-actina de hámster chino y/o de β-actina.

Se prepararon los estándares internos de β-actina de hámster chino y de β-actina de rata de la manera siguiente (figura 23). En 100 μl de NEBuffer 3 (fabricado por New England Biolabs), que contenía 100 ng/µl, 1 pg/µl, 200 fg/µl, 100 fg/µl and 20 fg/µl l de BSA (fabricado por New England Biolabs), se disolvieron 2 μg del plásmido CHAc-pBS y se añadieron 10 unidades del enzima de restricción DraIII (fabricado por New England Biolabs), seguido de la reacción de digestión a 37ºC durante 3 horas. Se recuperaron fragmentos de ADN de la solución de reacción mediante precipitación con etanol y se convirtieron los extremos de ADN en extremos romos utilizando el kit de generación de extremos romos de ADN (fabricado por Takara Shuzo) siguiendo las instrucciones del fabricante y después se dividió la solución de reacción en dos partes iguales. En primer lugar, a una parte de la solución de reacción se añadieron 35 μl de tampón Tris-HCl 1 mol/l (pH 8,0) y 3,5 μl de fosfatasa alcalina derivada de E. coli C15 (fabricada por Takara Shuzo), seguido de la reacción a 65ºC durante 30 minutos para desfosforilar los extremos del ADN. El fragmento de ADN se recuperó llevando a cabo el tratamiento de desfosforilación, el tratamiento de extracción con fenol/cloroformo y el tratamiento de precipitación con etanol y después se disolvió en 10 μl de agua estéril. La parte restante de la solución de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, purificando un fragmento de ADN de aproximadamente 1,1 kb que contenía el fragmento parcial de ORF de la β-actina de hámster chino.

Se mezcló el fragmento DraIII-DraIII desfosforilado (4,5 µl), 4,5 µl del fragmento DraIII-DraIII de aproximadamente 1,1 kb y 5 µl de Ligation High (fabricado por Toyobo), seguido de una reacción de ligación a 16ºC durante 30 minutos. Utilizando la solución de reacción se transformó E. coli DH5α y se aislaron los ADN plasmídicos de acuerdo con un método conocido a partir de los clones resistentes a ampicilina obtenidos. La secuencia de nucleótidos de cada ADN plasmídico se determinó utilizando un aparato DNA Sequencer 377 (fabricado por Perkin Elmer) y el kit BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction (fabricado por Perkin Elmer) y se confirmó que se había delecionado una secuencia DraIII-DraIII de la β-actina de hámster chino de 180 pb insertada en el plásmido. El plásmido se denominó CHAcd-pBS.

Además, se preparó un plásmido en el que se había delecionado un fragmento DraIII-DraIII de 180 pb de la βactina de rata mediante las mismas etapas de CHAcd-pBS. El plásmido se denominó YBAcd-pBS.

A continuación, se disolvieron 2 µg del plásmido CHAcd-pBS en 40 μl de NEBuffer 2 (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron a lo anterior 25 unidades del enzima de restricción HindIII (fabricado por Takara Shuzo) y 20 unidades de PstI (fabricado por Takara Shuzo), seguido de la reacción de digestión a 37ºC durante 3 horas. Separadamente se disolvieron 2 µg del plásmido YBAcd-pBS en 40 μl de NEBuffer 2 (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron a lo anterior 25 unidades del enzima de restricción HindIII (fabricado por Takara Shuzo) y 24 unidades de KpnI (fabricado por Takara Shuzo), seguido de la reacción de digestión a 37ºC durante 3 horas. Una parte de cada una de las soluciones de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8% y se confirmó que había separado un fragmento HindIII-PstI y un fragmento HindIII-KpnI (de aproximadamente 1,0 kb) que contenía un fragmento en el que se había delecionado la secuencia de nucleótidos interna de 180 pb del ORF de longitud completa de cada ADNc de β-actina de hámster chino y de β-actina de rata, de los plásmidos CHAcd-pBS e YBAcd-pBS mediante las reacciones de digestión con los enzimas de restricción. Se prepararon diluciones de 200 fg/µl a partir de las soluciones de reacción utilizando 1 µg/ml de ARNt de levadura de panadería (fabricada por Sigma) y se utilizaron como controles internos de β-actina de hámster chino y de βactina de rata.

(6) Determinación del nivel de transcripción mediante PCR competitiva

Se llevó a cabo una PCR competitiva utilizando el ADN de control interno de FUT8 preparado en el ítem (4) y el ADNc derivado de la célula hospedadora obtenido en el ítem (1) como moldes, el valor determinado del producto de transcripción FUT8 en la línea de células hospedadoras se calculó a partir del valor relativo de la cantidad de producto amplificado obtenido de cada molde. Por otra parte, debido a que se considera que el gen β-actina se transcribe continuamente en cada célula y su nivel de transcripción es aproximadamente el mismo en las células, se determinó el nivel de transcripción del gen β-actina como medida de la eficiencia de la reacción de síntesis del ADNc en cada línea de células hospedadoras. Es decir, se llevó a cabo una PCR utilizando el ADN de control interno de β-actina preparado en el ítem (5) y el ADNc derivado de la célula hospedadora obtenido en el ítem (1) como moldes, el valor determinado del producto de transcripción de β-actina en la línea de células hospedadoras se calculó a partir del valor relativo de la cantidad de producto amplificado obtenido de cada molde. Los detalles de los mismos se proporcionan a continuación.

Se determinó el producto de transcripción de FUT8 mediante el procedimiento siguiente. En primer lugar, se diseñó un grupo de cebadores específicos de secuencia (mostrado en las SEC ID nº 13 y nº 14) comunes a las secuencias internas de las secuencias parciales de ORF de FUT8 de hámster chino y de FUT8 de rata obtenidos en el ítem (2).

A continuación, se llevó a cabo la PCR utilizando una ADN polimerasa ExTaq (fabricada por Takara Shuzo) en 20 µl de volumen total de una solución de reacción [tampón ExTaq (fabricada por Takara Shuzo), 0,2 mmoles/l de dNTP, 0,5 µmoles/l de cebadores específicos de gen (SEC ID nº 13 y nº 14) y DMSO al 5%] que contenía 5 µl de solución de ADNc diluida 50 veces, preparada a partir de cada una de las líneas de células hospedadoras respectivas en el ítem (1) y 5 µl (10 fg) del plásmido como control interno. La PCR se llevó a cabo mediante el calentamiento a 94ºC durante 3 minutos y los posteriores 32 ciclos de calentamiento a 94ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 1 minuto en un ciclo.

Además, se llevó a cabo una PCR en una serie de reacción en la que se añadieron 5 µl (0,1 fg, 1 fg, 5 fg, 10 fg, 50 fg, 100 fg, 500 fg o 1 pg) del plásmido de estándar de FUT8 obtenido en el ítem (4) en lugar de cada ADNc

imagen29

FUT8 en la línea de células YB2/0 era de aproximadamente 0,1% el de la β-actina, mientras que era de 0,5% a 2% en la línea de células CHO.

Los resultados muestran que la cantidad de producto de transcripción de FUT8 en la línea de células YB2/0 era significativamente inferior que la observada en la línea de células CHO.

Tabla 4

Días de cultivo

Línea celular: 1º 2º 3º 4º 5º

CHO: 1,95 0,90 0,57 0,52 0,54

YB2/0: 0,12 0,11 0,14 0,08 0,07

Ejemplo 10

Determinación del producto de transcripción del gen α-1,6-fucosiltransferasa (FUT8) en la estirpe celular productora de anticuerpos híbridos anti-gangliósido GD3:

(1) Preparación de ADNc de cadena sencilla a partir de diversas estirpes celulares productoras de anticuerpos

15 Se preparó ADNc de cadena sencilla a partir de las estirpes celulares DCHI01-20 y 61-33 productoras de anticuerpo híbrido anti-gangliósido GD3 de la manera siguiente. La DCHI01-20 es un clon transformante derivado de las células CHO/DG44 descritas en el ítem 2(2) del Ejemplo 1. Además, 61-33 es un clon obtenido llevando a cabo la adaptación sin suero de las células transformantes 7-9-51 derivadas de YB2/0 (FERM nº BP-6691, depósito internacional de organismos de patente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566 Japón) y llevando a cabo después el aislamiento de células individuales mediante dos diluciones limitantes.

Las células DCHI01-20 se suspendieron en medio EXCELL 302 (fabricado por Jrh Biosciences) complementado

25 con 3 mmoles/l de L-GLN (fabricado por Life Technologies) y Pluronic F-68 al 0,3% (fabricado por Life Technologies) y concentrado de ácidos grasos al 0,5% (fabricado por Life Technologies) y se inocularon 15 ml de la suspensión en un matraz T75 para el cultivo celular de suspensión (fabricado por Greiner) a una densidad de 2x105 células/ml. Además, las células 61-33 se suspendieron en medio de hibridoma-SFM (fabricado por Life Technologies) complementado con fracción V de suero de feto bovino al 0,2% (fabricado por Life Technologies) (en adelante denominado "BSA") y se inocularon 15 ml de la suspensión en matraz T75 para el cultivo celular en suspensión (fabricado por Greiner) a una densidad de 2x105 células/ml. Se cultivaron a 37ºC en un incubador con 5% de CO2 y se recuperaron 1x107 de las células hospedadoras respectivas en el día 1, 2, 3, 4 y 5 después del cultivo para extraer el ARN total utilizando RNAeasy (fabricado por Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.

35 El ARN total se disolvió en 45 μl de agua estéril y se añadió a lo anterior 1 μl de ADNasa libre de ARNasa RQ1 (fabricado por Promega), 5 μl del tampón 10x de ADNasa adjunto y 0,5 μl de inhibidor de ribonucleasa RNasin (fabricado por Promega), seguido de la reacción a 37ºC durante 30 minutos para degradar el ADN genómico contaminante en la muestra. Tras la reacción, se purificó nuevamente el ARN total utilizando RNAeasy (fabricado por Qiagen) y se disolvió en 50 μl de agua estéril.

En 20 μl de la mezcla de reacción utilizando oligo(dT) como cebador, se sintetizó ADNc de cadena sencilla a partir de 3 μg de cada una de las muestras de ARN total obtenidas mediante reacción de transcripción inversa utilizando el sistema de preamplificación SuperscriptTM para la síntesis del ADNc de primera cadena (fabricado

45 por Life Technologies) siguiendo las instrucciones del fabricante. La solución de reacción se diluyó 50 veces con agua y se almacenó a -80ºC hasta la utilización.

(2) Determinación del nivel de transcripción de cada gen mediante PCR competitiva

Se determinó el nivel de transcripción de los genes en el ADNc derivado de la estirpe celular productora de anticuerpos obtenida en el ítem (1) mediante PCR competitiva de acuerdo con el Ejemplo 9(6).

Se determinó el nivel de transcripción de ARNm derivado de gen de FUT8 en cada una de las estirpes celulares productoras de anticuerpos mediante el procedimiento a continuación.

55 CHFT8-pCR2.1 e YBFT8-pCR2.1, como plásmidos en los que los fragmentos parciales de ADNc preparados en el Ejemplo 9(2) de FUT8 de hámster chino o FUT8 de rata, respectivamente, insertados en pCR2.1 fueron digeridos con el enzima de restricción EcoRI, y los ADN lineales obtenidos se utilizaron como estándares para la preparación de una curva de calibración para determinar el nivel de transcripción de FUT8.

CHFT8d-pCR2.1 e YBFT8d-pCR2.1, obtenidos mediante la deleción de 203 pb entre ScaI e HindIII de una

imagen30

FUT8 en la línea de células YB2/0 productora de anticuerpos 61-33 era de aproximadamente 0,3% o menos del de la β-actina, mientras que era de 0,7% a 1,5% en la línea de células CHO productora de anticuerpos.

Los resultados muestran que la cantidad de producto de transcripción de FUT8 en la línea de células YB2/0 productora de anticuerpos era significativamente inferior que la observada en la línea de células productora de anticuerpos derivada de células CHO.

Tabla 5

Días de cultivo

Línea celular: 1º 2º 3º 4º 5º

DCHI01-20: 0,75 0,73 0,99 1,31 1,36

61-33: 0,16 0,19 0,24 0,30 <0,10

Ejemplo 11 (ejemplo ilustrativo)

Preparación de estirpe celular sobreexpresante de gen de α-1,6-fucosiltransferasa (FUT8) de ratón

15 (1) Construcción de plásmido de expresión de α-1,6-fucosiltransferasa (FUT8) de ratón

Se extrajo el ARN total de 1x107 células de una célula NS0 de mieloma de ratón (RCB0213, Cell Bank at The Institute of Physical and Chemical Research) subcultivada utilizando medio IMDM (fabricado por Life Technologies) que contenía suero de feto bovino al 10% (fabricado por Life Technologies) utilizando RNAeasy (fabricado por Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARN total se disolvió en 45 μl de agua estéril y se añadió a lo anterior 1 μl de ADNasa libre de ARNasa RQ1 (fabricada por Promega), 5 μl del tampón 10x de ADNasa adjunto y 0,5 μl de inhibidor de ribonucleasa RNasin (fabricado por Promega), seguido de la reacción a 37ºC durante 30 minutos para degradar el ADN genómico contaminante en la muestra. Tras la reacción, se purificó nuevamente el ARN total utilizando RNAeasy (fabricado por Qiagen) y se disolvió en 50 μl de agua

25 estéril. En 20 μl de la mezcla de reacción utilizando oligo(dT) como cebador, se sintetizó ADNc de cadena sencilla a partir de 3 μg de cada una de las muestras de ARN total obtenidas mediante reacción de transcripción inversa utilizando el sistema de preamplificación SuperscriptTM para la síntesis del ADNc de primera cadena (fabricado por Life Technologies) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Se preparó ADNc de FUT8 de ratón mediante el procedimiento siguiente (figura 25).

En primer lugar se diseñó un cebador directo específico para una secuencia que contenía un codón de inicio de traducción (mostrado en SEC ID nº 19) y un cebador inverso específico para una secuencia que contenía el codón de terminación de traducción (mostrado en SEC ID nº 20) a partir de una secuencia de ADNc de FUT8 de

35 ratón (GenBank, AB025198).

A continuación, se prepararon 25 μl de una solución de reacción [tampón ExTaq (fabricado por Takara Shuzo), 0,2 mmoles/l de los dNTP, DMSO al 4% y 0,5 μmoles/l de cebadores específicos (SEC ID nº 19 y SEC ID nº 20)] que contenía 1 μl del ADNc derivado de células NS0 y se llevó a cabo una PCR utilizando una ADN polimerasa ExTaq (fabricada por Takara Shuzo). La PCR se llevó a cabo mediante el calentamiento a 94ºC durante 1 minuto, seguido de 30 ciclos de calentamiento a 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 2 minutos en un ciclo, y calentamiento final a 72ºC durante 10 minutos.

Tras la PCR, la solución de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8% y se purificó un

45 fragmento amplificado específico de 1.728 pb. En un plásmido pCR2.1, se utilizaron 4 μl del fragmento de ADN para la inserción siguiendo las instrucciones del fabricante del kit de clonación TOPO TA (fabricado por Invitrogen) y se transformó E. coli DH5α con la solución de reacción. Se aislaron los ADN plasmídicos de acuerdo con un método conocido a partir de 6 clones con inserción de ADNc de entre las colonias resistentes a canamicina obtenidas.

La secuencia de nucleótidos de cada ADNc insertado en el plásmido se determinó utilizando el secuenciador de ADN 377 (fabricado por Perkin Elmer) y el kit BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction (fabricado por Perkin Elmer) siguiendo el método en las instrucciones del fabricante. Se confirmó que la totalidad de los ADNc insertados las secuencias de los cuales habían sido determinadas codificaba la secuencia total del

55 ORF de la FUT8 de ratón. De entre ellas se seleccionó un ADN plasmídico que no contenía ningún error de lectura de bases en absoluto mediante PCR (se muestran la secuencia de ADN y la secuencia de aminoácidos en SEC ID nº 2 y nº 24, respectivamente). Además, se observó una inconsistencia de 3 bases debido a la sustitución de aminoácidos en la secuencia en comparación con la secuencia de FUT8 de ratón registrada en GenBank. En la presente memoria el plásmido se denomina mfFUT8-pCR2.1.

A continuación, se construyó el plásmido pBSmfFUT8 que contiene el ORF de secuencia completa de FUT8 de ratón de la manera siguiente (figura 26). En primer lugar se disolvió 1 μg de plásmido pBluescript II KS(+) (fabricado por Stratagene) en 35 μl de NEBuffer 2 (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron 20 unidades del enzima de restricción EcoRI (fabricado por Takara Shuzo), seguido de la reacción de digestión a 37ºC durante 2 horas. A la solución de reacción se añadieron 35 μl de tampón Tris-HCl 1 mol/l (pH 8,0) y 3,5 μl de fosfatasa alcalina derivada de E. coli C15 (fabricada por Takara Shuzo), seguido de la reacción a 65ºC durante 30 minutos para desfosforilar de esta manera los extremos del ADN. La solución de reacción se extrajo con fenol/cloroformo, seguido de la precipitación con etanol y el fragmento de ADN recuperado se disolvió en 10 μl de agua estéril.

Separadamente, se disolvió 1 μg de plásmido mfFUT8-pCR2.1 en 35 μl de NEBuffer 2 (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron 20 unidades del enzima de restricción EcoRI (fabricado por Takara Shuzo), seguido de la reacción de digestión a 37ºC durante 2 horas. La solución de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, purificando un fragmento de ADN de aproximadamente 1,7 kb que contenía el ORF de secuencia completa del ADNc de FUT8 de ratón.

Se mezcló el fragmento EcoRI-EcoRI derivado del plásmido pBluescript II KS(+) obtenido (1 µl, 2,9 kb), 4 µl del fragmento EcoRI-EcoRI (1,7 kb) preparado a partir del plásmido mfFUT8-pCR2.1 y 5 µl de Ligation High (fabricado por Toyobo), seguido de una reacción de ligación a 16ºC durante 30 minutos. Utilizando la solución de reacción se transformó E. coli DH5α y se aislaron los ADN plasmídicos de acuerdo con un método conocido a partir de los clones resistentes a ampicilina obtenidos. En la presente memoria el plásmido se denomina pBSmfFUT8.

Utilizando pBSmfFUT8 y pAGE249, se construyó el vector de expresión pAGEmfFUT8 de FUT8 de ratón mediante el procedimiento a continuación (figura 27). El plásmido pAGE249 es un derivado de pAGE248 [J. Biol. Chem. 269:14730, 1994], que es un vector del que se ha eliminado un fragmento SphI-SphI (2,7 kb) que contenía el gen dihidrofolato reductasa (dhfr) en pAGE248.

En 50 µl de tampón universal H (fabricado por Takara Shuzo), se disolvió 1 μg de plásmido pAGE249 y se añadieron 20 unidades del enzima de restricción SalI (fabricado por New England Biolabs), seguido de la reacción de digestión a 37ºC durante 2 horas. Se recuperó un fragmento de ADN de la solución de reacción mediante precipitación con etanol y se disolvió en 35 µl de tampón NEBuffer 2 (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron 20 unidades del enzima de restricción BamHI (fabricado por New England Biolabs), seguido de la reacción de digestión a 37ºC durante 2 horas. Tras la reacción de digestión, a la solución de reacción se añadieron 35 μl de tampón Tris-HCl 1 mol/l (pH 8,0) y 3,5 μl de fosfatasa alcalina derivada de E. coli C15 (fabricada por Takara Shuzo), seguido de la reacción a 65ºC durante 30 minutos para desfosforilar los extremos del ADN. La solución de reacción se extrajo con fenol/cloroformo, seguido de la precipitación con etanol y el fragmento de ADN recuperado se disolvió en 10 μl de agua estéril.

Separadamente, en 50 µl de tampón universal H (fabricado por Takara Shuzo), se disolvió 1 μg de plásmido pBSmfFUT8 y se añadieron 20 unidades del enzima de restricción SalI (fabricado por New England Biolabs), seguido de la reacción de digestión a 37ºC durante 2 horas. Se recuperó un fragmento de ADN de la solución de reacción mediante precipitación con etanol y se disolvió en 35 µl de tampón NEBuffer 2 (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron 20 unidades del enzima de restricción BamHI (fabricado por New England Biolabs), seguido de la reacción de digestión a 37ºC durante 2 horas. La reacción de digestión, la solución se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, purificando un fragmento de ADN de aproximadamente 1,7 kb que contenía el ORF de secuencia completa del ADNc de FUT8 de ratón.

Se mezcló el fragmento BamHI-SalI (1 µl, 6,5 kb) derivado del plásmido pAGE249, 4 µl del fragmento BamHI-SalI (1,7 kb) preparado a partir del plásmido pBSmfFUT8 y 5 µl de Ligation High (fabricado por Toyobo), seguido de una reacción de ligación a 16ºC durante 30 minutos. Utilizando la solución de reacción se transformó E. coli DH5α y se aisló un ADN plasmídico de acuerdo con un método conocido a partir de los clones resistentes a ampicilina obtenidos. En la presente memoria el plásmido se denomina pAGEmfFUT8.

(2) Preparación de estirpe celular sobreexpresante de gen de α-1,6-fucosiltransferasa (FUT8) de ratón

Se obtuvo una estirpe celular expresante de gen de FUT8 estable mediante la introducción del vector de expresión de FUT8 de ratón pAGEmfFUT8 construido en el ítem (1) en 61-33. El clon 61-33 es un clon obtenido mediante la adaptación sin suero de la célula transformante 7-9-51 (FERM nº BP-6691, depósito internacional de organismos de patente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) derivado de una célula YB2/0 de alta producción de un anticuerpo híbrido anti-gangliósido GD3 y realizando después el aislamiento de células individuales mediante dos diluciones limitantes.

El plásmido pAGEmfFUT8 se transfirió al interior de 61-33 mediante el procedimiento siguiente, mediante electroporación [Cytotechnology 3:133, 1990]. En primer lugar, se disolvieron 30 μg de plásmido pAGEmfFUT8 en 600 μl de NEBuffer 4 (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron 100 unidades del enzima de restricción FspI (fabricado por New England Biolabs), seguido de la reacción de digestión a 37ºC durante 2 horas, obteniendo un fragmento lineal. La solución de reacción se sometió a precipitación con etanol y el plásmido lineal recuperado se preparó en forma de una solución acuosa 1 µg/µl. A continuación, se suspendió 61-33 en un tampón K-PBS (KCl 137 moles/l, NaCl 2,7 moles/l, Na2HPO4 8,1 moles/l, KH2PO4 1,5 moles/l, MgCl2 4,0 moles/l), proporcionando una densidad de 2x107 células/ml y se mezclaron 200 µl de la suspensión celular (4x106 células) con 10 µl (10 µg) del plásmido lineal. La mezcla de células-ADN se transfirió a una cubeta de Gene Pulser (distancia entre electrodos: 2 mm) (fabricado por Bio-Rad) y después se llevó a cabo la electroporación utilizando un aparato de fusión celular Gene Pulser (fabricado por Bio-Rad) a un voltaje de pulso de 0,2 kV y 250 µF de capacidad eléctrica. La suspensión celular se mezcló con 10 ml de medio de hibridoma-SFM (fabricado por Life Technologies) complementado con suero de feto bovino al 5% dializado (fabricado por Life Technologies) y BSA al 0,2% (fabricado por Life Technologies) y se dispensó en porciones de 100 µl en una placa de 96 pocillos para la utilización de las células en suspensión (fabricado por Greiner). Tras el cultivo de las mismas a 37ºC durante 24 horas en 5% de CO2, se extrajeron 50 µl del sobrenadante de cultivo y se dispensaron 100 µl de medio de hibridoma-SFM (fabricado por Life Technologies) complementado con 0,5 mg/ml de higromicina B (fabricado por Wako Pure Chemical Industries), suero de feto bovino al 5% dializado (fabricado por Life Technologies) y BSA al 0,2% (fabricado por Life Tecnologies). Se cultivaron durante 3 semanas, repitiendo la etapa de intercambio de medio a intervalos de 3 a 4 días y se obtuvieron 14 estirpes celulares que mostraban resistencia a la higromicina.

Por otra parte, se preparó una estirpe celular de control negativo mediante la introducción del plásmido pAGE249 como vector parental de pAGEmfFUT8 en 61-33. Siguiendo el procedimiento anteriormente indicado, se convirtieron 10 µg del plásmido pAGE249 en la forma lineal con el enzima de restricción FspI y se introdujeron en 4x106 células de 61-33 mediante electroporación. Se mezclaron las células con 15 ml de medio de hibridoma-SFM (fabricado por Life Technologies) complementado con suero de feto bovino al 5% dializado (fabricado por Life Technologies) y BSA al 0,2% (fabricado por Life Technologies), se transfirieron a un matraz T75 para el cultivo celular en suspensión (fabricado por Greiner) y después se cultivaron a 37ºC durante 24 horas en 5% de CO2. Tras el cultivo de las mismas, una mitad del sobrenadante de cultivo (7,5 ml) se extrajo mediante centrifugación a 800 rpm durante 4 minutos y las células se suspendieron en 7,5 ml de medio de hibridoma-SFM (fabricado por Life Technologies) complementado con 0,5 mg/ml de higromicina B (fabricado por Wako Pure Chemical Industries), suero de feto bovino al 5% dializado (fabricado por Life Technologies) y BSA al 0,2% (fabricado por Life Technologies) y se transfirió a un matraz T75 para el cultivo celular en suspensión (fabricado por Greiner). Se cultivaron durante 3 semanas, repitiendo la etapa de intercambio de medio a intervalos de 3 a 4 días y se obtuvo una estirpe celular resistente a higromicina.

(3) Análisis del nivel de expresión del gen de α-1,6-fucosiltransferasa (FUT8) de estirpes celulares sobreexpresantes del gen

Utilizando 6 estirpes celulares seleccionadas opcionalmente de entre 14 estirpes celulares sobreexpresantes de FUT8 de ratón de 61-33 en el ítem (2) y la estirpe celular de control negativo, se compararon los niveles de expresión de FUT8 mediante RT-PCR competitiva.

Se suspendió en medio de hibridoma-SFM (fabricado por Life Technologies) cada una de dichas estirpes celulares sobreexpresantes, complementado con 0,5 mg/ml de higromicina B (fabricado por Wako Pure Chemical Industries), suero de feto bovino al 5% dializado (fabricado por Life Technologies) y BSA al 0,2% (fabricado por Life Technologies), proporcionando una densidad de 3x105 células/ml y después se transfirió a un matraz T75 para el cultivo celular en suspensión (fabricado por Greiner). Tras el cultivo de las mismas a 37ºC durante 24 horas en 5% de CO2, se recuperaron 1x107 células intactas para la extracción del ARN total utilizando RNAeasy (fabricado por Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARN total se disolvió en 45 μl de agua estéril y se añadió a lo anterior 0,5 μl de ADNasa libre de ARNasa RQ1 (fabricada por Promega), 5 μl del tampón 10x de ADNasa adjunto y 0,5 μl de inhibidor de ribonucleasa RNasin (fabricado por Promega), seguido de la reacción a 37ºC durante 30 minutos para degradar el ADN genómico contaminante en la muestra. Tras la reacción, se purificó nuevamente el ARN total utilizando RNAeasy (fabricado por Qiagen) y se disolvió en 50 μl de agua estéril.

En 20 μl de la mezcla de reacción utilizando oligo(dT) como cebador, se sintetizó ADNc de cadena sencilla a partir de 2,5 μg del ARN total obtenido mediante reacción de transcripción inversa utilizando el sistema de preamplificación SuperscriptTM para la síntesis del ADNc de primera cadena (fabricado por Life Technologies) siguiendo las instrucciones del fabricante. La solución de reacción se diluyó 50 veces con agua y se determinó el nivel de transcripción de cada gen mediante PCR competitiva según el Ejemplo 9(6).

Se determinó el nivel de transcripción de ARNm derivado de gen de FUT8 en cada una de las estirpes celulares mediante el procedimiento a continuación.

YBFT8-pCR2.1, como plásmido en el que se había insertado un fragmento parcial de ADNc preparado en el Ejemplo 9(2) de FUT8 de rata en pCR2.1, fue digerido con el enzima de restricción EcoRI, y el ADN lineal obtenido se utilizó como estándar para la preparación de una curva de calibración para determinar el nivel de transcripción de FUT8.

Entre los YBFT8d-pCR2.1 preparados en el Ejemplo 9(4), el YBFT8d-pCR2.1 obtenido mediante la deleción de 203 pb entre ScaI e HindIII de una secuencia de nucleótidos interna de FUT8 de rata se digirió con el enzima de restricción EcoRI y los ADN lineales obtenidos se utilizaron como estándar interno para la determinación de FUT8.

Se llevó a cabo una PCR utilizando una ADN polimerasa ExTaq (fabricada por Takara Shuzo) en 20 µl de volumen total de una solución de reacción [tampón ExTaq (fabricada por Takara Shuzo), 0,2 mmoles/l de dNTP, 0,5 µmoles/l de cebadores específicos de gen (SEC ID nº 13 y nº 14) y DMSO al 5%] que contenía 5 µl de solución de ADNc diluida 50 veces, preparada a partir de cada una de las líneas de células hospedadoras respectivas anteriormente y 5 µl (10 fg) del plásmido como control interno. La PCR se llevó a cabo mediante el calentamiento a 94ºC durante 3 minutos y los posteriores 32 ciclos de calentamiento a 94ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 1 minuto en un ciclo.

Además, se llevó a cabo una PCR en una serie de reacción en la que se añadieron 5 µl (0,1 fg, 1 fg, 5 fg, 10 fg, 50 fg, 100 fg, 500 fg o 1 pg) del plásmido estándar de FUT8 en lugar de cada ADNc derivado de línea de célula hospedadora y se utilizó en la preparación de una curva de calibración para el nivel de transcripción de FUT8. En este caso, se utilizó 1 μg/ml de un ARNt de levadura de panadería (fabricado por Sigma) para la dilución del plásmido estándar.

Por otra parte, debido a que se considera que el gen β-actina se transcribe de manera constante en cada célula y su nivel de transcripción es aproximadamente el mismo en todas las células, se determinó el nivel de transcripción del gen β-actina como índice de la eficiencia de la reacción de síntesis del ADNc en cada estirpe celular de expresión.

YBAc-pBS, plásmido en el que se había insertado el ORF de longitud completa del ADNc de la β-actina de rata en pBluescript II KS(+), preparado en el Ejemplo 9(3), fue digerido con los enzimas de restricción HindIII y KpnI, y el ADN lineal obtenido se utilizó como estándar en la preparación de una curva de calibración para determinar el nivel de transcripción del gen de la β-actina.

YBAcd-pBS, obtenido mediante la deleción de 180 pb entre DraI y DraI de una secuencia de nucleótidos interna de la β-actina de rata, fue digerida con los enzimas de restricción HindIII y KpnI, y el ADN lineal obtenido se utilizó como estándar interno para la determinación de la cantidad de β-actina.

Se llevó a cabo una PCR utilizando una ADN polimerasa ExTaq (fabricada por Takara Shuzo) en 20 µl de volumen total de una solución de reacción [tampón ExTaq (fabricado por Takara Shuzo), dNTP 0,2 mmoles/l, cebadores específicos de β-actina 0,5 µmoles/l (SEC ID nº 17 y nº 18) y DMSO al 5%] que contenía 5 µl de solución de ADNc diluida 50 veces preparada a partir de cada una de las estirpes celulares de expresión y 5 µl (1 pg) del plásmido como control interno. La PCR se llevó a cabo mediante el calentamiento a 94ºC durante 3 minutos y los posteriores 17 ciclos de calentamiento a 94ºC durante 30 segundos, 65ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 2 minutos en un ciclo.

Además, se llevó a cabo una PCR en una serie de reacción en la que se añadieron 10 pg, 5 pg, 1 pg, 500 fg o 100 fg) del plásmido de estándar de β-actina en lugar de cada ADNc derivado de estirpe celular de expresión y se utilizó en la preparación de una curva de calibración para el nivel de transcripción de β-actina. En este caso, se utilizó 1 μg/ml de un ARNt de levadura de panadería (fabricado por Sigma) para la dilución del plásmido estándar.

Mediante la realización de la PCR con el juego de cebadores indicado en la Tabla 3 pudo amplificarse un fragmento de ADN que presentaba el tamaño mostrado en la columna de dianas de la Tabla 3 a partir de cada producto de transcripción génica y cada estándar y puede amplificarse un fragmento de ADN que presenta un tamaño mostrado en la columna de competidores de la Tabla 3 a partir de cada control interno.

Cada una de las soluciones (7 µl) tras la PCR se sometió a una electroforesis en gel de agarosa al 1,75% y después se tiñó el gel sumergiéndolo durante 30 minutos a concentración 1x de tinción de gel de ácidos nucleicos SYBR Verde I (fabricada por Molecular Probes). La cantidad de fragmento de ADN amplificado se midió mediante el cálculo de la intensidad de luminiscencia de cada ADN amplificado utilizando un aparato Fluoro-imager (FluorImager SI, fabricado por Molecular Dynamics).

La cantidad de producto amplificado formado mediante PCR utilizando un plásmido estándar como molde se midió mediante el método, y se preparó una curva de calibración representando gráficamente los valores medidos frente a las cantidades de plásmido estándar. Utilizando la curva de calibración se calculó la cantidad de ADNc de un gen de interés en cada estirpe celular a partir de la cantidad de producto amplificado al utilizar como molde cada ADNc derivado de estirpe celular de expresión, y se definió la cantidad como el nivel de transcripción de ARNm en cada estirpe celular.

La figura 28 muestra los niveles de transcripción de FUT8 como valores relativos respecto a la cantidad de producto de transcripción de β-actina. Las tres estirpes celulares mfFUT8-1, mfFUT8-2 y mfFUT8-4 y la estirpe celular en la que se ha introducido pAGE249 eran estirpes celulares que mostraban un nivel de transcripción de FUT8 relativamente pequeño, que era equivalente a 0,3% a 10% del nivel de transcripción de β-actina. Por otra parte, las otras tres estirpes celulares mfFUT8-3, mfFUT8-6 y mfFUT8-7 eran estirpes celulares que mostraban un nivel de transcripción de FUT8 elevado, que era equivalente a 20% a 40% del nivel de transcripción de βactina.

(4) Purificación del anticuerpo producido por una estirpe celular sobreexpresante de gen de α-1,6fucosiltransferasa (FUT8)

Cada una de las seis estirpes celulares sobreexpresantes del gen de FUT8 y una estirpe celular de control negativo obtenidos en el ítem (2) se suspendió en medio de hibridoma-SFM (fabricado por Life Technologies) complementado con 200 nmoles/l de MTX, 0,5 mg/ml de higromicina B (fabricada por Wako Pure Chemical Industries) y BSA al 0,2% (fabricado por Life Technologies), proporcionando una densidad de 2x105 células/ml y después se inocularon 100 ml en total de la suspensión en tres matraces T225 para la utilización en el cultivo celular en suspensión (fabricados por Iwaki). Tras cultivarlas a 37ºC durante 7 a 9 días en un incubador con 5% de CO2, se contó el número de células intactas con el fin de confirmar que la viabilidad de las mismas era prácticamente igual (diferentes en 30% o menos) y después se recuperó cada suspensión celular. Se centrifugó cada una de las suspensiones celulares a 3.000 rpm a 4ºC durante 10 minutos y el sobrenadante recuperado se centrifugó a 10.000 rpm a 4ºC durante 1 hora y después se filtró utilizando una unidad de filtración PES (fabricada por Nalgene) que presentaba un diámetro de poro de 0,22 µm y una capacidad de 150 ml.

Se empaquetó un Prosep-A HighCapacity (fabricado por bioProcessing) en una columna de 0,8 cm de diámetro hasta un grosor de 2 cm y se lavó con 10 ml de tampón citrato 0,1 moles/l (pH 3,0) y 10 moles de tampón de glicina/NaOH 1 mol/l-NaCl 0,1 moles/l (pH 8,6) en ese orden para conseguir el equilibrado del portador. A continuación, se pasaron 100 ml de cada uno de los sobrenadantes de cultivo por la columna y se lavaron con 50 ml de tampón de glicina/NaOH 1 mol/l-NaCl 0,15 moles/l (pH 8,6). Tras lavarlas, el anticuerpo adsorbido en Prosep-A se eluyó utilizando 2,5 ml de tampón citrato 0,1 moles/l (pH 3,0), el eluido se fraccionó en porciones de 500 µl y cada fracción se neutralizó mediante la mezcla con 100 µl de Tris-HCl 2 moles/l (pH 8,5). Se seleccionaron dos fracciones que contenían el anticuerpo a concentración elevada (1,2 ml en total) mediante el método de BCA [Anal. Biochem. 150:76, 1985], se agruparon y después se dializaron frente a tampón citrato 10 moles/l (pH 6,0) a 4ºC durante un día y noche completos. Tras la diálisis, se recuperó la solución de anticuerpo y se sometió a esterilización mediante filtración utilizando un Millex GV de 0,22 µm de tamaño de poro (fabricado por Millipore).

(5) Actividad citotóxica in vitro (actividad ADCC) del anticuerpo producido por una estirpe celular sobreexpresante de gen de α-1,6-fucosiltransferasa (FUT8) de ratón

Con el fin de evaluar la actividad citotóxica in vitro de los anticuerpos anti-GD3 purificados en el ítem (4), se midió la actividad ADCC utilizando una célula positiva para GD3, la estirpe celular en cultivo de melanoma humano G361 (RCB0991, Cell Bank at The Institute of Physical and Chemical Research).

Las células G-361 subcultivadas en medio RPMI1640 (fabricado por Life Technologies) que contenía suero de feto bovino al 10% (fabricado por Life Technologies) (en adelante denominado "RPMI1640-FBS(10)") se suspendieron en 500 µl de RPMI1640-FBS(10) a una densidad de 1x106 células y se añadieron 3,7 MBq de Na251CrO4 al mismo, seguido del cultivo a 37ºC durante 30 minutos para el marcaje de las células con el isótopo radioactivo. Tras la centrifugación a 1.200 rpm durante 5 minutos, se descartó el sobrenadante y las células diana se suspendieron en 5 ml de RPMI1640-FBS(10). Se repitió la etapa de lavado tres veces y después la suspensión celular se incubó durante 30 minutos sobre hielo para la disociación espontánea de la sustancia radioactiva. Se repitió nuevamente dos veces la etapa de lavado y después las células se suspendieron en 5 ml de RPMI1640-FBS(10), preparando de esta manera 2x105 células/ml de una suspensión de células diana.

Por otra parte, se recolectaron 30 ml de sangre periférica de una persona sana y se mezclaron suavemente con 0,5 ml de heparina sodio (fabricada por Shimizu Pharmaceutical) y después se mezclaron con 30 ml de solución salina fisiológica (fabricada por Otsuka Pharmaceutical). Tras la mezcla, se aplicaron suavemente como capa superior 10 ml de la mezcla sobre 4 ml de Lymphoprep (fabricado por Nycomed Pharma AS) y se centrifugó a temperatura ambiente a 2.000 rpm durante 30 minutos. Las fracciones de células mononucleares separadas se recolectaron de los tubos de centrifugación, se agruparon y después se suspendieron en 30 ml de RPMI1640FBS(10). Tras la centrifugación a temperatura ambiente a 1.200 rpm durante 5 minutos, se descartó el sobrenadante y las células se suspendieron en 20 ml de RPMI1640-FBS(10). Se repitió dos veces la etapa de lavado y después se prepararon 2x106 células/ml de una suspensión de células efectoras utilizando RPMI1640FBS(10).

La suspensión de células diana se dispensó a razón de 50 µl (1x104 células/pocillo) en cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo en U (fabricada por Falcon). A continuación, se dispensó la suspensión de células

imagen31

imagen32

10 GlcNAc, Gal, Man, Fuc y PA indican N-acetilglucosamina, galactosa, manosa, fucosa y un grupo piridilamino, respectivamente. En las figuras 30 y 31, se calculó la proporción de grupos de cadena de azúcar libres de α-1,6fucosa a partir del área ocupada por los picos (i) a (iv) respecto a la ocupada por (i) a (ix), y la proporción de grupos de cadena de azúcar con unión de α-1,6-fucosa, a partir del área ocupada por los picos (v) a (ix) respecto

15 a la ocupada por (i) a (ix).

imagen33

por la célula.

1. Construcción del plásmido vector pKOFUT8Puro con diana en el exón 2 del gen de α-1,6-fucosiltransferasa (FUT8) de hámster chino

(1) Construcción del plásmido ploxPPuro

Se construyó el plásmido ploxPPuro mediante el procedimiento a continuación (figura 33).

En primer lugar se disolvió 1,0 μg de plásmido pKOSelectPuro (fabricado por Lexicon) en 35 μl de tampón NEBuffer 4 (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron 20 unidades del enzima de restricción AscI (fabricado por New England Biolabs), seguido de la reacción de digestión a 37ºC durante 2 horas. Tras la reacción de digestión, la solución se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, purificando un fragmento de ADN de aproximadamente 1,5 kb que contenía una unidad de expresión de gen de resistencia a la puromicina.

Por otra parte, se disolvió 1,0 μg de plásmido ploxP descrito en la solicitud publicada de patente japonesa examinada nº 314512/99 en 35 μl de tampón NEBuffer 4 (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron 20 unidades del enzima de restricción AscI (fabricado por New England Biolabs), seguido de la reacción de digestión a 37ºC durante 2 horas. Tras la reacción de digestión, la solución se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, purificando un fragmento de ADN de aproximadamente 2,0 kb.

El fragmento AscI-AscI obtenido (4,5 µl, aproximadamente 1,5 kb) obtenido del plásmido pKOSelectPuro, 0,5 µl de fragmento AscI-AscI (aproximadamente 2,0 kb) obtenido del plásmido ploxP y 5,0 µl de Ligation High (fabricado por Toyobo) se mezclaron y seguidamente se llevó a cabo la reacción de ligación a 16ºC durante 30 minutos. Se transformó E. coli DH5α utilizando la solución de reacción y se aisló un ADN plasmídico de acuerdo con un método conocido a partir de los clones resistentes a ampicilina obtenidos. En la presente memoria el plásmido se denomina ploxPPuro.

(2) Construcción del plásmido pKOFUT8gE2-1

Se construyó el plásmido pKOFUT8gE2-1 mediante el procedimiento a continuación (figura 34), utilizando el plásmido pFUT8fgE2-2 obtenido en el Ejemplo 12(2), que presentaba una región genómica que comprendía el exón 2 de FUT8 de hámster chino.

En 35 μl de tampón NEBuffer 1 (fabricado por New England Biolabs), que contenía 100 µg/ml de BSA (fabricado por New England Biolabs), se disolvieron 2,0 μg del plásmido pFUT8fgE2-2 y se añadieron 20 unidades del enzima de restricción SacI (fabricado por New England Biolabs), seguido de la reacción de digestión a 37ºC durante 2 horas. Se recuperó un fragmento de ADN de la solución de reacción mediante precipitación con etanol y se disolvió en 35 µl de tampón NEBuffer 2 (fabricado por New England Biolabs) que contenía 100 µg/ml de BSA (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron 20 unidades del enzima de restricción EcoRV (fabricado por New England Biolabs), seguido de la reacción de digestión a 37ºC durante 2 horas. Tras la reacción de digestión, la solución se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, purificando un fragmento de ADN de aproximadamente 1,5 kb.

Separadamente, en 35 μl de tampón NEBuffer 1 (fabricado por New England Biolabs), que contenía 100 µg/ml de BSA (fabricado por New England Biolabs), se disolvió 1,0 μg del plásmido LITMUS28 y se añadieron 20 unidades del enzima de restricción SacI (fabricado por New England Biolabs), seguido de la reacción de digestión a 37ºC durante 2 horas. Se recuperó un fragmento de ADN de la solución de reacción mediante precipitación con etanol y se disolvió en 35 µl de tampón NEBuffer 2 (fabricado por New England Biolabs) que contenía 100 µg/ml de BSA (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron 20 unidades del enzima de restricción EcoRV (fabricado por New England Biolabs), seguido de la reacción de digestión a 37ºC durante 2 horas. Tras la reacción de digestión, la solución se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, purificando un fragmento de ADN de aproximadamente 2,8 kb.

El fragmento EcoRV-SacI obtenido (4,5 µl, aproximadamente 1,5 kb) obtenido del plásmido pFUT8fgE2-2, 0,5 µl de fragmento EcoRV-SacI (aproximadamente 2,8 kb) obtenido del plásmido LITMUS28 y 5,0 µl de Ligation High (fabricado por Toyobo) se mezclaron y seguidamente se llevó a cabo la reacción de ligación a 16ºC durante 30 minutos. Se transformó E. coli DH5α utilizando la solución de reacción y se aisló un ADN plasmídico de acuerdo con un método conocido a partir de los clones resistentes a ampicilina obtenidos. En la presente memoria el plásmido se denomina pKOFUT8gE2-1.

(3) Construcción del plásmido pKOFUT8gE2-2

Se construyó el plásmido pKOFUT8gE2-2 mediante el procedimiento a continuación (figura 35), utilizando el plásmido pKOFUT8gE2-1 obtenido en el ítem (2).

En 30 μl de tampón NEBuffer 2 (fabricado por New England Biolabs), que contenía 100 µg/ml de BSA (fabricado por New England Biolabs), se disolvieron 2,0 μg del plásmido pKOFUT8gE2-1 y se añadieron 20 unidades del enzima de restricción EcoRV (fabricado por New England Biolabs), seguido de la reacción de digestión a 37ºC durante 2 horas. Se recuperó un fragmento de ADN de la solución de reacción mediante precipitación con etanol y se disolvió en 30 µl de tampón NEBuffer 1 (fabricado por New England Biolabs) que contenía 100 µg/ml de BSA (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron 20 unidades del enzima de restricción KpnI (fabricado por New England Biolabs), seguido de la reacción de digestión a 37ºC durante 2 horas. Tras la reacción de digestión, la solución se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, purificando un fragmento de ADN de aproximadamente 1,5 kb.

Separadamente, se disolvió 1,0 μg de plásmido ploxPPuro en 30 μl de tampón NEBuffer 4 (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron 20 unidades del enzima de restricción HpaI (fabricado por New England Biolabs), seguido de la reacción de digestión a 37ºC durante 2 horas. Se recuperó un fragmento de ADN de la solución de reacción mediante precipitación con etanol y se disolvió en 30 µl de tampón NEBuffer 1 (fabricado por New England Biolabs) que contenía 100 µg/ml de BSA (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron 20 unidades del enzima de restricción KpnI (fabricado por New England Biolabs), seguido de la reacción de digestión a 37ºC durante 2 horas. Tras la reacción de digestión, la solución se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, purificando un fragmento de ADN de aproximadamente 3,5 kb.

Una porción de 4,0 µl del fragmento EcoRV-KpnI obtenido (aproximadamente 1,5 kb) del plásmido pKOFUT8gE2-1, 1,0 µl de fragmento HpaI-KpnI (aproximadamente 3,5 kb) obtenido del plásmido ploxPPuro y 5,0 µl de Ligation High (fabricado por Toyobo) se mezclaron y seguidamente se llevó a cabo la reacción de ligación a 16ºC durante 30 minutos. Se transformó E. coli DH5α utilizando la solución de reacción y se aisló un ADN plasmídico de acuerdo con un método conocido a partir de los clones resistentes a ampicilina obtenidos. En la presente memoria el plásmido se denomina pKOFUT8gE2-2.

(4) Construcción del plásmido pscFUT8gE2-3

Se construyó el plásmido pscFUT8gE2-3 mediante el procedimiento a continuación (figura 36), utilizando el plásmido pFUT8fgE2-4 obtenido en el Ejemplo 12(2), que presentaba una región genómica que comprendía el exón 2 de FUT8 de hámster chino.

Se disolvieron 2,0 µg de plásmido pFUT8fgE2-3 en 35 μl de tampón NEBuffer 1 (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron 20 unidades del enzima de restricción HpaII (fabricado por New England Biolabs), seguido de la reacción de digestión a 37ºC durante 2 horas. Se recuperó un fragmento de ADN a partir de la solución de reacción mediante precipitación con etanol y después se convirtieron los extremos del ADN en romos utilizando Blunting High (fabricado por Toyobo) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se recuperó el fragmento de ADN mediante precipitación con fenol/cloroformo y precipitación con etanol y se disolvió en 35 µl de tampón NEBuffer 2 (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron 20 unidades del enzima de restricción HindIII (fabricado por New England Biolabs), seguido de la reacción de digestión a 37ºC durante 2 horas. Tras la reacción de digestión, la solución se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, purificando un fragmento de ADN de aproximadamente 3,5 kb.

Por otra parte, en 35 μl de tampón NEBuffer 2 (fabricado por New England Biolabs) se disolvió 1,0 μg del plásmido LITMUS39 (fabricado por New England Biolabs) y la solución se mezcló con 20 unidades del enzima de restricción EcoRV (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron 20 unidades del enzima de restricción HindIII (fabricado por New England Biolabs), seguido de la reacción de digestión a 37ºC durante 2 horas. Tras la reacción de digestión, la solución se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, purificando un fragmento de ADN de aproximadamente 2,8 kb.

El fragmento HpaII-HindIII obtenido (4,0 µl, aproximadamente 3,5 kb) del plásmido pFUT8fgE2-4, 1,0 µl de fragmento EcoRV-HindIII (aproximadamente 2,8 kb) obtenido del plásmido LITMUS39 y 5,0 µl de Ligation High (fabricado por Toyobo) se mezclaron y seguidamente se llevó a cabo la reacción de ligación a 16ºC durante 30 minutos. Se transformó E. coli DH5α utilizando la solución de reacción y se aisló un ADN plasmídico de acuerdo con un método conocido a partir de los clones resistentes a ampicilina obtenidos. En la presente memoria el plásmido se denomina pscFUT8gE2-3.

(5) Construcción del plásmido pKOFUT8gE2-3

Se construyó el plásmido pKOFUT8gE2-3 mediante el procedimiento a continuación (figura 37), utilizando el plásmido pFUT8fgE2-4 obtenido en el Ejemplo 12(2), que presentaba una región genómica que comprendía el exón 2 de FUT8 de hámster chino.

En 35 μl de tampón NEBuffer para EcoRI (fabricado por New England Biolabs) se disolvieron 2,0 μg del plásmido pFUT8fgE2-4 y se añadieron 20 unidades del enzima de restricción EcoRI (fabricado por New England Biolabs) y

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disolvió durante la noche en 150 µl de un tampón TE-ARNasa (pH 8,0) (Tris-HCl 10 mmoles/l, EDTA 1 mmol/l, 200 µg/ml de ARNasa A).

Se disolvieron 12 µg del ADN genómico obtenido en 120 μl de tampón NEBuffer 3 (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron 25 unidades del enzima de restricción PstI (fabricado por New England Biolabs), seguido de la reacción de digestión a 37ºC durante la noche. Se recuperó un fragmento de ADN a partir de la solución de reacción mediante precipitación con etanol, se disolvió en 20 µl de tampón TE (pH 8,0) (Tris-HCl 10 mmoles/l, EDTA 1 mmol/l) y después se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8% (p/v). Tras la electroforesis, se transfirió el ADN genómico a una membrana de nilón de acuerdo con un método conocido [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:3683, 1979]. Tras completar la transferencia, la membrana de nilón se calentó a 80ºC durante 2 horas.

Separadamente se preparó una sonda utilizada en la transferencia southern de la manera siguiente. En primer lugar, se diseñaron cebadores (SEC ID nº 28 y nº 29) que unen una secuencia fuera de la región homóloga del vector de reconocimiento con la región genómica de FUT8 obtenida en el Ejemplo 12. A continuación, utilizando la ADN polimerasa ExTaq (fabricada por Takara Shuzo), se prepararon 20 μl de una solución de reacción [tampón ExTaq (fabricado por Takara Shuzo), 0,2 mmoles/l de los dNTP y 0,5 μmoles/l de cebadores específicos (SEC ID nº 28 y SEC ID nº 29)] que contenía 4,0 ng del plásmido pFUT8fgE2-2 obtenido en el Ejemplo 12(2) y se llevó a cabo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La PCR se llevó a cabo mediante calentamiento a 94ºC durante 1 minuto y posteriores 25 ciclos de calentamiento a 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 74ºC durante 1 minuto en un ciclo. Tras la PCR, la solución de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1,75% (p/v), purificando un fragmento de ADN de sonda de aproximadamente 230 pb. La solución de ADN de sonda obtenida (5 µl) se marcó con un isótopo radioactivo utilizando 1,75 MBq de [α-32P]dCTP y el sistema de marcaje de ADN Megaprime, dCTP (fabricado por Amersham Pharmacia Biotech).

La hibridación se llevó a cabo de la manera siguiente. En primer lugar, la membrana de nilón se selló dentro de una botella centrifugadora y se llevó a cabo una prehibridación a 65ºC durante 3 horas mediante la adición de 15 ml de una solución de hibridación [SSPE 5x, 50 x solución de Denhardt, SDS al 0,5% (p/v), ADN de esperma de salmón 100 µg/ml]. A continuación, la sonda de ADN marcada con 32P se desnaturalizó por calor y se introdujo en la botella. A continuación, se calentó la membrana de nilón a 65ºC durante la noche.

Tras la hibridación, la membrana de nilón se sumergió en 50 ml de SSC 2x-SDS al 0,1% (p/v) y se calentó a 65ºC durante 15 minutos. Tras repetir la etapa de lavado dos veces, la membrana se sumergió en 50 ml de SSC 0,2-SDS al 0,1% (p/v) y se calentó a 65ºC durante 15 minutos. Tras el lavado, la membrana de nilón se expuso a una película para rayos X a -80ºC durante dos noches para el revelado.

Mediante tratamiento con el enzima de restricción PstI, se formó un fragmento de ADN de aproximadamente 4,4 kb a partir de un alelo de FUT8 de tipo salvaje. Por otra parte, se formó un fragmento de ADN de aproximadamente 6,0 kb a partir de un alelo en el que se había generado la recombinación homóloga con un vector de reconocimiento.

Mediante el método, dichos fragmentos específicos de aproximadamente 4,4 kb y aproximadamente 6,0 kb se encontraron a partir del ADN genómico del clon positivo en el ítem (3). Debido a que la proporción cuantitativa de ambos fragmentos era de 1: 1, se confirmó que el clon era un clon en el que se había interrumpido una copia del alelo de FUT8. En adelante en la presente memoria, el clon se denomina cepa 1st.ΔFUT8 2-46.

3. Deleción del gen de resistencia a fármaco de la célula CHO en la que se ha interrumpido 1 copia del gen de α1,6-fucosiltransferasa (FUT8)

(1) Introducción de vector de expresión de la recombinasa Cre

Se introdujo el vector pBS185 de expresión de la recombinasa Cre (fabricado por Life Technologies) en la cepa 1st.ΔFUT8 2-46 preparada en el ítem 2 del presente ejemplo.

Se introdujo un gen del plásmido pBS185 en la cepa 1st.ΔFUT8 2-46 tal como se indica a continuación de acuerdo con el método de electroporación [Cytotechnology 3:133, 1990]. En primer lugar, se suspendió la cepa 1st.ΔFUT8 2-46 en un tampón K-PBS (KCl 137 mmoles/l, NaCl 2,7 mmoles/l, Na2HPO4 8,1 mmoles/l, KH2PO4 1,5 mmoles, MgCl2 4,0 mmoles), proporcionando una densidad de 8x107 células/ml. Tras mezclar 200 µl de la suspensión celular (1,6x106 células) y 4 µg del plásmido pBS185, se transfirió un volumen entero de la mezcla de células-ADN a una cubeta de Gene Pulser (distancia entre electrodos: 2 mm) (fabricado por Bio-Rad) y después se llevó a cabo la electroporación utilizando un aparato de fusión celular Gene Pulser (fabricado por Bio-Rad) a un voltaje de pulso de 350 V y 250 µF de capacidad eléctrica. Tras la transferencia génica, se suspendió la suspensión celular en 10 ml de medio IMDM (fabricado por Life Technologies) complementado con suero de feto bovino al 10% (fabricado por Life Technologies) y complemento HT a concentración 1x (fabricado por Life Technologies) y se diluyó adicionalmente 20.000 veces utilizando el mismo medio. Las células se inocularon en 7 placas de cultivo celular adherente de 10 cm de diámetro (fabricadas por Falcon) y después se cultivaron a 37ºC durante 24 horas con 5% de CO2. Tras cultivarlas, se separó el sobrenadante de cultivo y se dispensaron 10 ml del medio IMDM (fabricado por Life Technologies) complementado con suero de feto bovino al 10% dializado (fabricado por Life Technologies). El cultivo se llevó a cabo durante 10 días, repitiendo el intercambio de medio a intervalos de 3 a 4 días.

(2) Preparación de estirpes celulares con vector de expresión de recombinasa Cre introducido

Se obtuvieron 400 colonias arbitrarias tal como se indica a continuación, a partir de la estirpe celular obtenida en el ítem (1).

En primer lugar, se separó el sobrenadante de cultivo de la placa de 10 cm y se añadieron 7 ml de tampón fosfato a la placa, que seguidamente se colocó bajo un estereomicroscopio. A continuación, se raspó cada colonia y se aspiró utilizando Pipetteman (fabricado por Gilson) y se transfirió a una placa de fondo redondo de 96 pocillos (fabricada por Falcon). Tras el tratamiento de tripsina, se inoculó cada clon en una placa de fondo redondo de 96 pocillos para la utilización en cultivo celular adherente (fabricado por Iwaki Glass) y se cultivó durante 1 semana utilizando medio IMDM (fabricado por Life Technologies) complementado con suero de feto bovino al 10% dializado (fabricado por Life Technologies).

Tras el cultivo de las mismas, cada clon en la placa se sometió a tratamiento de tripsina y después se mezcló con dos volúmenes de un medio liofilizante (DMSO al 20%, suero de feto bovino al 40% e IMDM al 40%). Se inoculó una mitad de la mezcla en una placa de fondo plano de 96 pocillos para el cultivo celular adherente (fabricada por Iwaki Glass) como placa réplica, mientras que la mitad restante de la mezcla se sometió a crioconservación como placa maestra.

A continuación, la placa réplica se cultivó durante 6 días utilizando medio IMDM (fabricado por Life Technologies) complementado con 15 µg/ml de puromicina (fabricado por Sigma) y suero de feto bovino al 10% dializado (fabricado por Life Technologies). Un clon positivo del que se había eliminado el gen de resistencia a puromicina interpuesto entre las secuencias de loxP mediante la expresión de la recombinasa Cre moría en presencia de puromicina. Mediante este método de selección se encontraron 91 clones positivos.

(3) Diagnóstico de la eliminación de genes de resistencia a fármaco mediante transferencia southern del genoma

El diagnóstico de la eliminación del gen de resistencia a fármaco mediante transferencia southern del genoma se llevó a cabo en 6 clones opcionales de entre los clones positivos encontrados en el ítem (2).

Entre las placas maestras crioconservadas en el ítem (2), se seleccionó una placa de 96 pocillos que contenía los 6 clones positivos y se incubó a 37ºC durante 10 minutos en 5% de CO2. Tras la incubación, se recolectaron las células de un pocillo correspondiente a cada clon positivo y se inocularon en una placa de fondo plano de 24 pocillos para células adherentes (fabricada por Greiner). Tras cultivarlas durante 1 semana utilizando medio IMDM (fabricado por Life Technologies) complementado con suero de feto bovino al 10% dializado (fabricado por Life Technologies), las células se inocularon en una placa de fondo plano de 6 pocillos para la adhesión celular (fabricada por Greiner). Se prepararon los ADN genómicos de cada clon en la placa de acuerdo con un método conocido [Nucleic Acids Research 3:2303, 1976] y se disolvieron durante la noche en 150 µl de un tampón TE-ARNasa (pH 8,0) (Tris-HCl 10 mmoles/l, EDTA 1 mmol/l, 200 µg/ml de ARNasa A).

Se disolvieron 12 µg del ADN genómico obtenido en 120 μl de tampón NEBuffer para BamHI (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron 20 unidades del enzima de restricción BamHI (fabricado por New England Biolabs), seguido de la reacción de digestión a 37ºC durante la noche. Se recuperó un fragmento de ADN a partir de la solución de reacción mediante precipitación con etanol, se disolvió en 20 µl de tampón TE (pH 8,0) (Tris-HCl 10 mmoles/l, EDTA 1 mmol/l) y después se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,4% (p/v). Tras la electroforesis, se transfirió el ADN genómico a una membrana de nilón de acuerdo con un método conocido [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:3683, 1979]. Tras completar la transferencia, la membrana de nilón se calentó a 80ºC durante 2 horas.

Por otra parte, se preparó una sonda utilizada en la transferencia southern de la manera siguiente. En primer lugar, se diseñaron cebadores (SEC ID nº 30 y nº 31) que se unen a una secuencia fuera de la región homóloga del vector de reconocimiento en la región genómica de FUT8 obtenida en el Ejemplo 12. A continuación, se llevó a cabo una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando una ADN polimerasa ExTaq (fabricada por Takara Shuzo) mediante la preparación de 20 μl de una solución de reacción [tampón ExTaq (fabricado por Takara Shuzo), 0,2 mmoles/l de los dNTP y 0,5 μmoles/l de cebadores específicos (SEC ID nº 30 y SEC ID nº 31)] que contenía 4,0 ng del plásmido pFUT8fgE2-2 obtenido en el Ejemplo 12(2). La PCR se llevó a cabo mediante calentamiento a 94ºC durante 1 minuto y posteriores 25 ciclos de calentamiento a 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 74ºC durante 1 minuto en un ciclo. Tras la PCR, la solución de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1,75% (p/v), purificando un fragmento de ADN de sonda de aproximadamente 230 pb. Una porción de 5 µl de la solución de ADN de sonda obtenida se marcó con un isótopo radioactivo utilizando 1,75 MBq de [α-32P]dCTP y el sistema de marcaje de ADN Megaprime, dCTP (fabricado por Amersham Pharmacia Biotech).

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presentaba la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID nº 34 y un cebador de ADN sintético 23-mero que presentaba la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID nº 35, basándose en la secuencia de ADNc de GFPP obtenida de células CHO que se muestra en el Ejemplo 16-2.

A continuación, se prepararon 20 μl de una solución de reacción [tampón Ex Taq 1x (fabricado por Takara Shuzo), dNTP 0,2 mM, 0,5 unidades de polimerasa Ex Taq (fabricada por Takara Shuzo) y 0,5 μM de los cebadores de ADN sintéticos de SEC ID nº 34 y nº 35] que contenían 0,5 μl del ADNc de cadena sencilla preparada a partir de cada estirpe celular en el ítem (1) como molde, y se llevó a cabo la PCR utilizando el ciclador térmico de ADN 480 (fabricado por Perkin Elmer) mediante calentamiento a 94ºC durante 5 minutos y 24 ciclos posteriores de calentamiento a 94ºC durante 1 minuto y 68ºC durante 2 minutos en un ciclo. Tras someter 10 μl de la solución de reacción de PCR a electroforesis en agarosa, se tiñeron los fragmentos de ADN utilizando verde Cybrer (fabricado por BMA) y después se midió la cantidad del fragmento de ADN de aproximadamente 600 pb utilizando un Fluor Imager SI (fabricado por Molecular Dynamics).

(4) Análisis del nivel de expresión del gen FX mediante RT-PCR

Con el fin de amplificar el ADNc de FX mediante PCR, se preparó un cebador de ADN sintético 28-mero que presentaba la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID nº 36 y un cebador de ADN sintético 28-mero que presentaba la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID nº 37, basándose en la secuencia de ADNc de FX obtenida de células CHO que se muestra en el Ejemplo 16-1.

A continuación, se prepararon 20 μl de una solución de reacción [tampón Ex Taq 1x (fabricado por Takara Shuzo), dNTP 0,2 mM, 0,5 unidades de polimerasa Ex Taq (fabricada por Takara Shuzo) y 0,5 μM de los cebadores de ADN sintéticos de SEC ID nº 36 y nº 37] que contenían 0,5 μl del ADNc de cadena sencilla preparada a partir de cada estirpe celular en el ítem (1) como molde, y se llevó a cabo la PCR utilizando el ciclador térmico de ADN 480 (fabricado por Perkin Elmer) mediante calentamiento a 94ºC durante 5 minutos y 22 ciclos posteriores de calentamiento a 94ºC durante 1 minuto y 68ºC durante 2 minutos en un ciclo. Tras someter 10 μl de la solución de reacción de PCR a electroforesis en agarosa, se tiñeron los fragmentos de ADN utilizando verde Cybrer (fabricado por BMA) y después se midió la cantidad del fragmento de ADN de aproximadamente 300 pb utilizando un Fluor Imager SI (fabricado por Molecular Dynamics).

(5): Análisis del nivel de expresión del gen FUT8 mediante RT-PCR

Con el fin de amplificar el ADNc de FUT8 mediante PCR, se prepararon 20 μl de una solución de reacción [tampón Ex Taq 1x (fabricado por Takara Shuzo), dNTP 0,2 mM, 0,5 unidades de polimerasa Ex Taq (fabricada por Takara Shuzo) y 0,5 μM de los cebadores de ADN sintéticos de SEC ID nº 13 y nº 14] que contenían 0,5 μl del ADNc de cadena sencilla preparada a partir de cada estirpe celular en el ítem (1) como molde, y se llevó a cabo la PCR utilizando el ciclador térmico de ADN 480 (fabricado por Perkin Elmer) mediante calentamiento a 94ºC durante 5 minutos y 20 ciclos posteriores de calentamiento a 94ºC durante 1 minuto y 68ºC durante 2 minutos en un ciclo. Tras someter 10 μl de la solución de reacción de PCR a electroforesis en agarosa, se tiñeron los fragmentos de ADN utilizando verde Cybrer (fabricado por BMA) y después se midió la cantidad del fragmento de ADN de aproximadamente 600 pb utilizando un Fluor Imager SI (fabricado por Molecular Dynamics).

(6): Análisis del nivel de expresión del gen de β-actina mediante RT-PCR

Con el fin de amplificar el ADNc de β-actina mediante PCR, se prepararon 20 μl de una solución de reacción [tampón Ex Taq 1x (fabricado por Takara Shuzo), dNTP 0,2 mM, 0,5 unidades de polimerasa Ex Taq (fabricada por Takara Shuzo) y 0,5 μM de los cebadores de ADN sintéticos de SEC ID nº 15 y nº 16] que contenían 0,5 μl del ADNc de cadena sencilla preparada a partir de cada estirpe celular en el ítem (1) como molde, y se llevó a cabo la PCR utilizando el ciclador térmico de ADN 480 (fabricado por Perkin Elmer) mediante calentamiento a 94ºC durante 5 minutos y 14 ciclos posteriores de calentamiento a 94ºC durante 1 minuto y 68ºC durante 2 minutos en un ciclo. Tras someter 10 μl de la solución de reacción de PCR a electroforesis en agarosa, se tiñeron los fragmentos de ADN utilizando verde Cybrer (fabricado por BMA) y después se midió la cantidad del fragmento de ADN de aproximadamente 800 pb utilizando un Fluor Imager SI (fabricado por Molecular Dynamics).

(7): Niveles de expresión de los genes de GMD, GFPP, FX y FUT8 en cada estirpe celular

La cantidad de fragmento amplificado por PCR de cada gen en las cepas 5-03 y CHO/CCR4-LCA se calculó dividiendo los valores de las cantidades de los fragmentos amplificados por PCR obtenidos del ADNc de GMD, GFPP, FX y FUT en cada estirpe celular medidos en los ítems (2) a (6) por el valor de la cantidad del fragmento amplificado por PCR obtenido del ADNc de β-actina en cada estirpe celular, y definiendo la cantidad de los fragmentos amplificados por PCR en las células CHO/DG44 como 1. Se muestran los resultados en la Tabla 7.

Tabla 7

GMD: GEPP FX FUT8

Cepa CHO/DG44: 1 1 1 1

Cepa 5-03: 1,107 0,793 1,093 0,901

Células CHO/CCR4-LCA resistentes a LCA obtenidas de la cepa 5-03: 0,160 0,886 0,920 0,875

Tal como se muestra en la Tabla 7, el nivel de expresión del gen GDM en CHO/CCR4-LCA se redujo a aproximadamente 1/10 en comparación con las otras estirpes celulares. En este caso el ensayo se llevó a cabo independientemente dos veces y se utilizó el valor promedio.

2. Análisis utilizando CHO/CCR4-LCA productor de anticuerpos híbridos humanos anti-CCR4 en la que se ha forzado la expresión del gen GMD

(1) Construcción del vector de expresión pAGE249GMD del gen GMD obtenido de células CHO

Basándose en la secuencia de ADNc de GMD derivada de células CHO obtenida en el Ejemplo 17-1, se preparó un cebador 28-mero que presentaba la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID nº 38 y un cebador 29mero que presentaba la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID nº 39. A continuación, se prepararon 20 μl de una solución de reacción [tampón Ex Taq 1x (fabricado por Takara Shuzo), dNTP 0,2 mM, 0,5 unidades de polimerasa Ex Taq (fabricada por Takara Shuzo) y 0,5 μM de los cebadores de ADN sintéticos de SEC ID nº 38 y nº 39] que contenían 0,5 μl del ADNc de cadena sencilla de GMD preparado a partir de las células CHO en el ítem (1) como molde, y se llevó a cabo la PCR utilizando el ciclador térmico de ADN 480 (fabricado por Perkin Elmer) mediante calentamiento a 94ºC durante 5 minutos y 8 ciclos posteriores de calentamiento a 94ºC durante 1 minuto, 58ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 1 minuto en un ciclo, y después 22 ciclos de calentamiento a 94ºC durante 1 minuto y 68ºC en un ciclo. Tras completar la reacción, la solución de reacción de PCR se fraccionó mediante electroforesis en agarosa y después se recuperó un fragmento de ADN de aproximadamente 600 pb utilizando el kit Gene Clean II (fabricado por BIO 101) siguiendo las instrucciones del fabricante. El fragmento de ADN recuperado se conectó al vector pT7Blue(R) (fabricado por Novagen) utilizando el kit de ligación de ADN (fabricado por Takara Shuzo) y E. coli DH5α (fabricado por Toyobo) se transformó utilizando ele ADN plasmídico recombinante obtenido para obtener un plásmido mt-C (ver la figura 46).

A continuación, basándose en la secuencia de ADNc de GMD derivada de células CHO obtenida en el Ejemplo 17-1, se preparó un cebador 45-mero que presentaba la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID nº 40 y un cebador 31-mero que presentaba la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID nº 41. A continuación, se prepararon 20 μl de una solución de reacción [tampón Ex Taq 1x (fabricado por Takara Shuzo), dNTP 0,2 mM, 0,5 unidades de polimerasa Ex Taq (fabricada por Takara Shuzo) y 0,5 μM de los cebadores de ADN sintéticos de SEC ID nº 40 y nº 41] que contenían 0,5 μl del ADNc de cadena sencilla de GMD preparado a partir de las células CHO en el ítem (1) como molde, y se llevó a cabo la PCR utilizando el ciclador térmico de ADN 480 (fabricado por Perkin Elmer) mediante calentamiento a 94ºC durante 5 minutos y 8 ciclos posteriores de calentamiento a 94ºC durante 1 minuto, 57ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 1 minuto en un ciclo, y después 22 ciclos de calentamiento a 94ºC durante 1 minuto y 68ºC durante 2 minutos en un ciclo. Tras completar la reacción, la solución de reacción de PCR se fraccionó mediante electroforesis en agarosa y después se recuperó un fragmento de ADN de aproximadamente 150 pb utilizando el kit Gene Clean II (fabricado por BIO 101) siguiendo las instrucciones del fabricante. El fragmento de ADN recuperado se conectó al vector pT7Blue(R) (fabricado por Novagen) utilizando el kit de ligación de ADN (fabricado por Takara Shuzo) y E. coli DH5α (fabricado por Toyobo) se transformó utilizando ele ADN plasmídico recombinante obtenido para obtener el plásmido ATG (ver la figura 47).

A continuación, se dejó reaccionasen 3 μg del plásmido CHO-GMD preparado en el Ejemplo 17-1 con el enzima de restricción SacI (fabricado por Takara Shuzo) a 37ºC durante 16 horas, se recuperó un ADN llevando a cabo la extracción con fenol/cloroformo y la precipitación con etanol y se dejó que reaccionase con el enzima de restricción EcoRI (fabricado por Takara Shuzo) a 37ºC durante 16 horas, el ADN digerido se fraccionó mediante electroforesis en agarosa y después se recuperó un fragmento de ADN de aproximadamente 900 pb utilizando el kit Gene Clean II (fabricado por Bio 101) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se dejó que el plásmido mt-C (1,4 μg) reaccionase con el enzima de restricción SacI (fabricado por Takara Shuzo) a 37ºC durante 16 horas, se recuperó un ADN llevando a cabo la extracción con fenol/cloroformo y la precipitación con etanol y se dejó que reaccionase con el enzima de restricción EcoRI (fabricado por Takara Shuzo) a 37ºC durante 16 horas, el ADN digerido se fraccionó mediante electroforesis en agarosa y después se recuperó un fragmento de ADN de aproximadamente 3,1 kpb utilizando el kit Gene Clean II (fabricado por Bio 101) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los fragmentos de ADN recuperados se ligaron utilizando el kit de ligación de ADN (fabricado por Takara Shuzo) y E. coli DH5α se transformó utilizando el ADN plasmídico recombinante obtenido, obteniendo el plásmido WT-N(-) (ver la figura 48).

A continuación, se dejó que 2 μg del plásmido WT-N(-) reaccionasen con el enzima de restricción BamHI (fabricado por Takara Shuzo) a 37ºC durante 16 horas, se recuperó un ADN llevando a cabo la extracción con

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mediante el mismo método y después se recuperó el anticuerpo híbrido anti-CCR4 y se purificó a partir del sobrenadante de cultivo.

(4) Medición de la resistencia a lectinas en células transformadas

Las células transformantes expresantes de GMD obtenidas en el ítem (2) se suspendieron en medio IMDM-dFBS(10) que comprendía MTX 200 nM (fabricado por Sigma) y 0,5 mg/ml de higromicina, proporcionando una densidad de 6x104 células/ml, y la suspensión se dispensó en porciones de 50 μl/pocillo en una placa de cultivo de 96 pocillos (fabricada por Iwaki Glass). A continuación, un medio preparado mediante suspensión a concentraciones de 0 mg/ml, 0,4 mg/ml, 1,6 mg/ml o 4 mg/ml de LCA (aglutinina de Lens culinaris: fabricada por Vector Laboratories) en medio IMDM-dFBS(10) que contenía MTX 200 nM (fabricado por Sigma) y se añadieron 0,5 mg/ml de higromicina a la placa a razón de 50 μl/pocillo, seguido del cultivo de las mismas a 37ºC durante 96 horas en un incubador con 5% de CO2. Tras cultivarlas, se añadió WST-I (fabricado por Boehringer) a razón de 10 μl/pocillo y se incubaron a 37ºC durante 30 minutos en un incubador con 5% de CO2 para producir el revelado del color y después se midió la absorbancia a 450 nm y a 595 nm (en adelante denominada "DO450" y "DO595", respectivamente) utilizando un lector de microplacas (fabricado por Bio-Rad). De la misma manera, se midieron mediante el mismo método las células transformantes en las que se había introducido el vector pAGE249. El ensayo se llevó a cabo dos veces de manera independiente.

La figura 52 muestra el número de células supervivientes en cada pocillo en porcentaje al utilizar un valor calculado restando DO595 de DO450 medidas anteriormente, como el número de supervivientes de cada grupo celular y el número de células supervivientes en cada uno de los pocillos libres de LCA se define como 100%. Tal como se muestra en la figura 52, se observó una reducción de la resistencia a LCA en las células CHO/CCR4-LCA expresantes de GMD y la proporción de supervivencia era de aproximadamente 40% en presencia de 0,2 mg/ml de LCA y la proporción de supervivencia era de aproximadamente 20% en presencia de 0,8 mg/ml de LCA. Por otra parte, en las células CHO/CCR4-LCA en las que se había introducido el vector pAGE249, la proporción de supervivencia era de 100% en presencia de 0,2 mg/ml de LCA y la proporción de supervivencia era de aproximadamente 80% incluso en presencia de 0,8 mg/ml de LCA. Basándose en estos resultados, se sugiere que el nivel de expresión del gen GMD en las células CHO/CCR4-LCA se encuentra reducido y, como resultado, se obtuvo una resistencia a LCA.

(5) Actividad citotóxica (actividad de ADCC) in vitro de anticuerpo híbrido anti-CCR4 obtenido de CHO/CCR4-LCA expresantes de GMD

Con el fin de evaluar la actividad citotóxica in vitro del anticuerpo híbrido anti-CCR4 purificado obtenido en el ítem (3), se midió la actividad de ADCC de acuerdo con los métodos siguientes.

i) Preparación de una suspensión de células diana

Se añadieron 3,7 MBq equivalentes de una sustancia radioactiva Na251CrO4 a 1x10 6 células de CCR4-EL4 (ver el Ejemplo 8-7) cultivadas utilizando un medio preparado mediante la adición de 500 μg/ml de G418 sulfato (fabricado por Nacalai Tesque) al medio RPMI1640-FBS(10), seguido de la reacción a 37ºC durante 90 minutos, marcando de esta manera las células con un isótopo radioactivo. Tras la reacción, las células se lavaron tres veces en la suspensión de medio RPMI1640-FBS(10) y la posterior centrifugación, se resuspendieron en el medio y después se incubaron a 4ºC durante 30 minutos en hielo para la disociación espontánea de la sustancia radioactiva. Tras la centrifugación, se ajustaron las células a 2x105 células/ml mediante la adición de 5 ml de medio RPMI1640-FBS(10) y se utilizaron como suspensión de células diana.

ii) Preparación de una suspensión de células efectoras

De una persona sana se recolectaron 50 ml de sangre venosa y se mezclaron suavemente con 0,5 ml de heparina sodio (fabricado por Takeda Pharmaceutical). Utilizando Lymphoprep (fabricado por Nycomed Pharma AS), la mezcla se centrifugó siguiendo las instrucciones del fabricante para separar una capa de células mononucleares. Las células se lavaron tres veces mediante centrifugación utilizando medio RPMI1640-FBS(10) y después se resuspendieron en el medio, proporcionando una densidad de 2x106 células/ml y se utilizaron como suspensión de células efectoras.

iii) Medición de la actividad ADCC

La suspensión de células diana preparada en 1) se dispensó a razón de 50 µl (1x104 células/pocillo) en cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo en U (fabricada por Falcon). A continuación, se añadieron 100 µl de la suspensión de células efectoras humanas preparada en 2) a lo anterior (2x105 células/pocillo, la proporción de células efectoras humanas a células diana era de 25: 1). Se añadió a lo anterior cada uno de los diversos anticuerpos híbridos anti-CCR4 (el anticuerpo híbrido anti-CCR4 purificado en el ítem (3), y KM2760-1 y KM3060), proporcionando una concentración final de entre 0,0025 y 2,5 μg/ml, seguido de la reacción a 37ºC durante 4 horas. Tras la reacción, se centrifugó la placa y se midió la cantidad de 51Cr en el sobrenadante utilizando un contador γ. Se calculó la cantidad de 51Cr disociado espontáneamente llevando a cabo el mismo procedimiento, utilizando únicamente el medio en lugar de la suspensión de células efectoras humanas y la solución de anticuerpo y midiendo la cantidad de 51Cr en el sobrenadante. Se calculó la cantidad de 51Cr disociado total llevando a cabo el mismo procedimiento, utilizando únicamente el medio en lugar de la solución de anticuerpo y una solución 1 N de ácido clorhídrico en lugar de la suspensión de células efectoras humanas y midiendo la cantidad de 51Cr en el sobrenadante. Se calculó la actividad ADCC basándose en la fórmula (II).

Los resultados de las mediciones de actividad de ADCC se muestran en la figura 53. Tal como se muestra en la figura 53, la actividad de ADCC del anticuerpo híbrido anti-CCR4 purificado obtenido de las CHO7CCR4-LCA expresantes de GMD se redujo en medida similar a la de KM3060 obtenido en el Ejemplo 8. Por otra parte, la actividad de ADCC del anticuerpo híbrido anti-CCR4 purificado obtenido de las CHO7CCR4-LCA en las que se había introducido el vector pAGE249 mostró un grado de actividad de ADCC similar a la del anticuerpo híbrido anti-CCR4 purificado obtenido a partir de las CHO/CCR4-LCA. Basándose en estos resultados, se sugiere que el nivel de expresión del gen GMD en las células CHO/CCR4-LCA se encuentra reducido y, como resultado, puede producirse un anticuerpo con una potente actividad de ADCC.

(6) Análisis de cadenas de azúcar del anticuerpo híbrido anti-CCR4 obtenido de CHO/CCR4-LCA expresantes de GMD

Las cadenas de azúcar que se unían al anticuerpo híbrido anti-CCR4 purificado obtenido en el ítem (3) se analizaron de acuerdo con el método mostrado en el Ejemplo 14(4), mostrándose los resultados del análisis en la figura 55. En comparación con el anticuerpo híbrido anti-CCR4 purificado preparado a partir de CHO/CCR4-LCA en el Ejemplo 14, la proporción de cadenas de azúcar que no presentan α-1,6-fucosa en el anticuerpo híbrido anti-CCR4 purificado obtenido de las CHO/CCR4-LCA expresantes de GMD se redujo a 9% al calcular a partir del área del pico. De esta manera, se demostró que la proporción de cadenas de azúcar que no presentaban α1,6-fucosa en el anticuerpo producido por la célula se reducía a un nivel similar al del anticuerpo producido por la cepa 5-03, mediante la expresión del gen GMD en las CHO/CCR4-LCA.

Ejemplo 16

Preparación de diversos genes codificantes de enzimas relacionados con la síntesis de cadenas de azúcar en las células CHO:

1. Determinación de la secuencia de ADNc de FX obtenido de células CHO

(1): Extracción de ARN total de las células CHO/DG44

Las células CHO/DG44 se suspendieron en medio IMDM que contenía suero de feto bovino al 10% (fabricado por Life Technologies) y complemento HT a concentración 1x (fabricado por Life Technologies) y se inocularon 15 ml de la suspensión en un matraz T75 para la utilización en cultivo celular adherente (fabricado por Greiner), proporcionando una densidad de 2x105 células/ml. El segundo día después del cultivo de las mismas a 37ºC en un incubador con 5% de CO2, se recuperaron 1x107 células y se extrajo el ARN total de las mismas utilizando RNAeasy (fabricado por Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.

(2): Preparación de ADNc de cadena sencilla a partir de células CHO/DG44

El ARN total preparado en (1) se disolvió en 45 μl de agua estéril y se añadió a lo anterior 1 μl de ADNasa libre de ARNasa RQ1 (fabricada por Promega), 5 μl del tampón 10x de ADNasa adjunto y 0,5 μl de inhibidor de ribonucleasa RNasin (fabricado por Promega), seguido de la reacción a 37ºC durante 30 minutos para degradar el ADN genómico contaminante en la muestra. Tras la reacción, se purificó nuevamente el ARN total utilizando RNAeasy (fabricado por Qiagen) y se disolvió en 50 μl de agua estéril.

En 20 μl de la mezcla de reacción utilizando oligo(dT) como cebador, se sintetizó ADNc de cadena sencilla a partir de 3 μg de cada una de las muestras de ARN total obtenidas mediante reacción de transcripción inversa utilizando el sistema de preamplificación SuperscriptTM para la síntesis del ADNc de primera cadena (fabricado por Life Technologies) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se utilizó una solución acuosa diluida 50 veces de la solución de reacción en la clonación de GFPP y FX. Lo anterior se almacenó a -80ºC hasta que fue utilizado.

(3) Preparación de fragmento parcial de ADNc de FX obtenido de hámster chino

Mediante el procedimiento a continuación se preparó el fragmento parcial de ADNc de FX obtenido de hámster chino.

En primer lugar, se diseñaron cebadores (mostrados en SEC ID nº 42 y nº 43) específicos para secuencias de nucleótidos comunes registradas en una base de datos pública, es decir, un ADNc de FX humano (GeneBank nº

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3' RACE: Cebadores específicos de FX Cebadores comunes Tamaño del producto amplificado por PCR

Primera: FXGSP2-1 MCU (mezcla de cebadores universales)

Segunda: FXGSP2-2 CUA (cebador universal anidado) 1.100 pb

Tras la PCR, la solución de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1% y el fragmento amplificado específico de interés se purificó utilizando el kit de extracción en gel QiaexII (fabricado por Qiagen) y se eluyó con 20 µl de agua estéril. En un plásmido pCR2.1, se insertaron 4 μl del fragmento amplificado y se transformó E. coli DH5α utilizando la solución de reacción de acuerdo con las instrucciones adjuntas al kit de clonación TOPO TA (fabricado por Invitrogen).

Se aislaron los ADN plasmídicos a partir de las colonias resistentes a canamicina que aparecieron, con el fin de obtener 5 clones de ADNc que contenían la región 5' de FX de hámster chino. Se denominaron FX5' clon 25, FX5' clon 26, FX5' clon 27, FX5' clon 28, FX5' clon 31 y FX5' clon 32.

De la misma manera, se obtuvieron 5 clones de ADNc que contenían la región 3' de FX de hámster chino. Estos clones 3' de FX se denominaron FX3' clon 1, FX3' clon 3, FX3' clon 6, FX3' clon 8 y FX3' clon 9.

La secuencia de nucleótidos de la fracción de ADNc de cada uno de los clones obtenidos mediante RACE 5' y 3' se determinó utilizando el secuenciador de ADN 377 (fabricado por Perkin Elmer) según el método descrito en las instrucciones del fabricante. Mediante la comparación de las secuencias de nucleótidos del ADNc determinadas mediante el método, se excluyeron los errores de lectura de las bases nucleótidas debidos a la PCR y se determinó la secuencia de nucleótidos de longitud completa del ADNc de FX de hámster chino. La secuencia determinada se muestra en SEC ID nº 48.

2. Determinación de la secuencia de ADNc de GFPP obtenida de células CHO

(1) Preparación de fragmento parcial de ADNc de GFPP obtenido de hámster chino

Mediante el procedimiento a continuación se preparó el fragmento parcial de ADNc de GFPP obtenido de hámster chino.

En primer lugar, se compararon las secuencias de nucleótidos de un ADNc de GFPP (GenBank nº de acceso AF017445), las secuencias de EST de ratón con alta homología con la secuencia (GenBank nº de acceso AI467195, AA422658, BE304325 y AI466474) y secuencias de EST de rata (GenBank nº de acceso BF546372, AI058400 y AW144783), registradas en bases de datos públicas y se diseñaron los cebadores GFPP FW9 y GFPP RV9 (SEC ID nº 49 y nº 50) específicos para GFPP de rata en una región altamente conservada en estas tres especies.

A continuación, se llevó a cabo una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando una ADN polimerasa ExTaq (fabricada por Takara Shuzo) mediante la preparación de 25 μl de una solución de reacción [tampón ExTaq (fabricado por Takara Shuzo), 0,2 mM de los dNTP y 0,5 μmoles/l de cebadores específicos para GFPP FW9 y GFPP RV9 (SEC ID nº 49 y SEC ID nº 50)] que contenía 1 µg del ADNc de cadena sencilla obtenido de CHO/DG44 preparado en el ítem 1(2). La PCR se llevó a cabo mediante el calentamiento a 94ºC durante 5 minuto, seguido de 30 ciclos de calentamiento a 94ºC durante 1 minuto, 58ºC durante 2 minutos y 72ºC durante 3 minutos en un ciclo, y calentamiento final a 72ºC durante 10 minutos.

Tras la PCR, la solución de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 2% y el fragmento amplificado específico de 1,4 Kpb se purificó utilizando el kit de extracción en gel QiaexII (fabricado por Qiagen) y se eluyó con 20 µl de agua estéril. En un plásmido pCR2.1, se utilizaron 4 μl del fragmento amplificado para la inserción siguiendo las instrucciones del fabricante del kit de clonación TOPO TA (fabricado por Invitrogen) y se transformó E. coli DH5α con la solución de reacción.

Se aislaron los ADN plasmídicos a partir de las colonias resistentes a canamicina que aparecieron, con el fin de obtener 3 clones en los que se integraron respectivamente fragmentos parciales de ADNc de GFPP. Se denominan GFPP clon 8, GFPP clon 11 y GFPP clon 12.

La secuencia de nucleótidos del ADNc insertado en cada uno de los clones GFPP clon 8, GFPP clon 11 y GFPP clon 12 se determinó utilizando el secuenciador de ADN 377 (fabricado por Perkin Elmer) y el kit BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction (fabricado por Perkin Elmer) siguiendo el método en las instrucciones del fabricante. Se confirmó que el ADNc insertado la secuencia del cual se había determinado codificaba una secuencia parcial de marco de lectura abierta (ORF) de GFPP de hámster chino.

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(2): Determinación de la secuencia 5'-terminal de ADNc de GMD obtenida de células CHO

Se preparó un cebador 24-mero que presentaba la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID nº 61 a partir de las secuencias de nucleótidos de la región no codificante del lado 5'-terminal del ADNc de GMD humano y de ratón obtenido de células CHO, y un cebador 32-mero que presentaba la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID nº 62 a partir de la secuencia de ADNc de GMD obtenida de células CHO y se llevó a cabo la PCR mediante el método proporcionado a continuación para la amplificación del ADNc. A continuación, se prepararon 20 μl de una solución de reacción [tampón Ex Taq 1x (fabricado por Takara Shuzo), dNTP 0,2 mM, 0,5 unidades de polimerasa Ex Taq (fabricada por Takara Shuzo) y 0,5 μM de los cebadores de ADN sintéticos de SEC ID nº 61 y nº 62] que contenían 0,5 μl del ADNc de cadena sencilla de GMD preparado en el Ejemplo 151(1) como molde, y se llevó a cabo la reacción en el mismo utilizando el ciclador térmico de ADN 480 (fabricado por Perkin Elmer) mediante calentamiento a 94ºC durante 5 minutos y 20 ciclos posteriores de calentamiento a 94ºC durante 1 minuto, 55ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 2 minutos en un ciclo, seguido de 18 ciclos de calentamiento a 94ºC durante 1 minuto y 68ºC durante 2 minutos en un ciclo. Tras el fraccionamiento de la solución de reacción de PCR mediante electroforesis en agarosa, se recuperó un fragmento de ADN de aproximadamente 300 pb utilizando el kit Gene Clean II (fabricado por BIO 101) siguiendo las instrucciones del fabricante. El fragmento de ADN recuperado se ligó a un vector pT7Blue(R) (fabricado por Novagen) utilizando el kit de ligación de ADN (fabricado por Takara Shuzo) y E. coli DH5α (fabricado por Toyobo) se transformó utilizando el ADN plasmídico recombinante obtenido para obtener de esta manera 5'-GMD del plásmido. Utilizando un secuenciador de ADN 377 (fabricado por Perkin Elmer), se determinó la secuencia de nucleótidos de 28 bases situada cadena bajo de la metionina de inicio del ADNc de GMD obtenida de células CHO contenida en el plásmido.

(3): Determinación de la secuencia 3'-terminal del ADNc de GMD obtenido de células CHO

Con el fin de obtener la secuencia 3'-terminal del ADNc de GMD obtenida de células CHO, se llevó a cabo el método RACE mediante el método a continuación. Se preparó ADNc de cadena sencilla para 3'-RACE a partir del ARN obtenido de células CHO obtenido en el Ejemplo 15-1(1) utilizando el kit de amplificación de ADNc RACE SMARTTM (fabricado por Clontech) siguiendo las instrucciones del fabricante. En este caso como transcriptasa inversa se utilizó la transcriptasa inversa PowerScriptTM (fabricada por Clontech). Cada ADNc de cadena sencilla tras la preparación se diluyó 10 veces con el tampón de tricina-EDTA adjunto en el kit y se utilizó como molde para la PCR.

A continuación, se prepararon 20 μl de una solución de reacción [tampón Ex Taq 1x (fabricado por Takara Shuzo), dNTP 0,2 mM, 0,5 unidades de polimerasa Ex Taq (fabricada por Takara Shuzo) y 0,5 μM del cebador de ADN sintético 25-mero mostrado en SEC ID nº 63 generado basándose en la secuencia del ADNc de GMD obtenido de células CHO determinada en el ítem (1)] y una concentración 1x de mezcla de cebadores universales (adjunta al kit de amplificación de ADNc por RACE SMARTTM, fabricado por Clontech] que contenía 1 μl del ADNc para 3'-RACE como molde, y se llevó a cabo la PCR utilizando el ciclador térmico de ADN 480 (fabricado por Perkin Elmer) mediante calentamiento a 94ºC durante 5 minutos y 30 ciclos posteriores de calentamiento a 94ºC durante 1 minuto y 68ºC durante 2 minutos en un ciclo.

Tras completar la reacción, 1 µl de la solución de reacción de PCR se diluyó 20 veces con tampón de tricina-EDTA (fabricado por Clontech). A continuación, se prepararon 20 μl de una solución de reacción [tampón Ex Taq 1x (fabricado por Takara Shuzo), dNTP 0,2 mM, 0,5 unidades de polimerasa Ex Taq (fabricada por Takara Shuzo) y 0,5 μM del cebador de ADN sintético 25-mero mostrado en SEC ID nº 64 generado basándose en la secuencia del ADNc de GMD obtenido de células CHO determinada en el ítem (1)] y 0,5 µM de cebador universal anidado (adjunto al kit de amplificación de ADNc por RACE SMARTTM, fabricado por Clontech] que contenía 1 μl de la solución acuosa diluida 20 veces a modo de molde] y se llevó a cabo la PCR utilizando el ciclador térmico de ADN 480 (fabricado por Perkin Elmer) mediante calentamiento a 94ºC durante 5 minutos y 30 ciclos posteriores de calentamiento a 94ºC durante 1 minuto y 68ºC durante 2 minutos en un ciclo.

Tras completar la reacción, la solución de reacción de PCR se fraccionó mediante electroforesis en agarosa y después se recuperó un fragmento de ADN de aproximadamente 700 pb utilizando el kit Gene Clean II (fabricado por BIO 101) siguiendo las instrucciones del fabricante. El fragmento de ADN recuperado se ligó a un vector pT7Blue(R) (fabricado por Novagen) utilizando el kit de ligación de ADN (fabricado por Takara Shuzo) y E. coli DH5α (fabricado por Toyobo) se transformó utilizando el ADN plasmídico recombinante obtenido para obtener de esta manera 3'-GMD plasmídico. Utilizando un secuenciador de ADN 377 (fabricado por Perkin Elmer), se determinó la secuencia de nucleótidos de 27 bases situada cadena arriba del codón de terminación del ADNc de GMD obtenido de células CHO contenido en el plásmido.

La secuencia del ADNc de longitud completa del gen de GMD obtenido de células CHO determinada en los ítems (1), (2) y (3) y la secuencia de aminoácidos correspondiente se muestran en SEC ID nº 65 y nº 71, respectivamente.

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Aplicabilidad industrial

La presente divulgación proporciona una célula que puede producir una composición de anticuerpo, un procedimiento para producir una composición de anticuerpo utilizando la célula y la utilización de la misma.

Texto libre del listado de secuencias

SEC ID nº 4 -Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético SEC ID nº 5 -Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético SEC ID nº 8 -Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético SEC ID nº 9 -Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético SEC ID nº 10 -Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético SEC ID nº 11 -Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético SEC ID nº 12 -Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético SEC ID nº 13 -Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético SEC ID nº 14 -Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético SEC ID nº 15 -Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético SEC ID nº 16 -Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético SEC ID nº 17 -Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético SEC ID nº 18 -Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético SEC ID nº 19 -Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético SEC ID nº 20 -Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético SEC ID nº 21 -Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético SEC ID nº 22 -Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético SEC ID nº 26 -Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético SEC ID nº 27 -Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético SEC ID nº 28 -Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético SEC ID nº 29 -Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético SEC ID nº 30 -Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético SEC ID nº 31 -Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético SEC ID nº 32 -Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético SEC ID nº 33 -Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético SEC ID nº 34 -Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético SEC ID nº 35 -Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético SEC ID nº 36 -Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético SEC ID nº 37 -Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético SEC ID nº 38 -Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético SEC ID nº 39 -Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético SEC ID nº 40 -Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético SEC ID nº 41 -Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético SEC ID nº 42 -Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético SEC ID nº 43 -Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético SEC ID nº 44 -Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético SEC ID nº 45 -Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético SEC ID nº 46 -Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético SEC ID nº 47 -Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético SEC ID nº 49 -Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético SEC ID nº 50 -Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético SEC ID nº 52 -Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético SEC ID nº 53 -Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético SEC ID nº 54 -Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético SEC ID nº 55 -Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético SEC ID nº 56 -Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético SEC ID nº 57 -Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético SEC ID nº 58 -Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético SEC ID nº 59 -Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético SEC ID nº 60 -Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético SEC ID nº 61 -Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético SEC ID nº 62 -Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético SEC ID nº 63 -Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético SEC ID nº 64 -Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético SEC ID nº 66 -Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético SEC ID nº 68 -Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético SEC ID nº 69 -Explicación de la secuencia sintética: ADN sintético

Claims

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