KR101950898B1 - 항-robo4 항체 - Google Patents

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Abstract

본 개시내용은 항-혈관신생 활성을 갖는 항체에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시내용은 ROBO4에 대한 항체 및 이 항체를 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 개시내용의 목적은 항-혈관신생 효과를 갖는 항-ROBO4 항체, 이 항체를 포함하는 약학 조성물 등, 이 항체를 사용하여 혈관신생을 억제하는 방법 등을 제공하는 것이다. 본 개시내용의 또 다른 목적은 상기 항체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다. 본 개시내용의 항체는 ROBO4의 다운스트림 신호를 활성화시키고 VEGF 또는 bFGF에 의해 유도된 세포 이동에 대한 억제 활성을 갖는다. 본 개시내용의 항체는 생체내 모델에서도 항-혈관신생 효과를 나타낸다. 따라서, 종래기술의 문제점이 해결되었다.

Description

항-ROBO4 항체{ANTI-ROBO4-ANTIBODY}
본 발명은 항-혈관신생 활성을 갖는 항체에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 ROBO4에 대한 항체, 및 이 항체를 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다.
분자량이 110 kDa인 단백질인 라운드어바웃 상동체(Roundabout homolog) 4(ROBO4)는 단회-통과 경막 구조를 갖고(비특허문헌 1), 공지된 혈관신생 억제제 슬릿(Slit) 상동체 2(Slit2)와의 결합을 통해 혈관신생을 억제하는 것으로 공지되어 있다(특허문헌 1 및 비특허문헌 2). Slit2는 혈관 내피 성장인자(VEGF)에 의해 촉진된 HUVEC의 이동을 억제한다고 보고되어 있고, 또한 ROBO4 유전자로 형질감염된 혈관 내피 세포(이하, 혈관 내피 세포는 "EC"로서도 지칭됨)의 경우 빈 벡터로 형질감염된 EC에 비해 VEGF 또는 bFGF에 의한 세포 이동의 촉진을 억제한다고 보고되어 있다(특허문헌 1 및 비특허문헌 2 내지 4).
뿐만 아니라, 세포 이동의 촉진, 내강(lumen) 형성의 촉진 또는 VEGF에 의한 투과성의 증가에 대한 Slit2의 억제 효과는 야생형 마우스로부터 유래된 EC 또는 조절 siRNA로 형질감염된 EC에서 관찰되지만, ROBO4 유전자-넉아웃 마우스로부터 유래된 EC 또는 ROBO4 유전자를 넉다운시키는 siRNA로 형질감염된 EC에서는 관찰되지 않는다고 보고되어 있다(특허문헌 2 및 비특허문헌 4 내지 6). 나아가, Slit2는 삼출성 연령 관련 황반 변성 또는 당뇨망막병증을 갖는 동물 질환 모델인, 레이저-유도된 맥락막 혈관신생 또는 산소-유도된 망막병증을 갖는 마우스 모델에서 ROBO4를 통해 혈관신생 또는 혈관 투과성의 증가를 억제한다고 보고되어 있다(특허문헌 2 및 비특허문헌 4).
이들 발견들에도 불구하고, ROBO4가 Slit2에 결합하지 않는다는 것을 보이는 보고도 있다(비특허문헌 9 및 특허문헌 5). ROBO4 유전자-넉아웃 EC의 이동 또는 내강 형성이 억제되기 때문에 ROBO4가 혈관신생의 억제보다는 오히려 혈관신생의 촉진에 참여한다는 그의 기능에 대한 보고도 있다(비특허문헌 10 및 11).
임상 실시에서, ROBO4는 결장암, 신경절신경아교종, 방광암, 유방암, 전이성 흑색종, 신장암, 폐암, 간암 또는 결장암으로부터의 간 전이에서 종양내 혈관에서 고도로 발현된다고 보고되어 있다(특허문헌 3 및 비특허문헌 1, 3 및 7). 더욱이, ROBO4는 증식성 당뇨망막병증 환자의 섬유혈관 막 내의 혈관에서도 발현된다고 보고되어 있다(비특허문헌 8). 따라서, ROBO4는 혈관 내피 세포, 특히 병리학적 상태에서 새로 형성된 혈관 내의 내피 세포에서 발현된다. 이것은 ROBO4의 고도 발현으로부터 비롯된 병리학적 혈관신생을 암시할 수 있지만, 병리학적 혈관신생을 억제하기 위한 ROBO4의 보충 발현도 암시할 수 있다.
전술된 바와 같이, ROBO4는 항-혈관신생 효과에 관여한다. 따라서, ROBO4에 대한 항체 및 그의 기능성 단편은 혈관신생을 수반하는 질환의 치료에 유용할 것이다. 그러나, ROBO4에 대한 작용제 또는 길항제 항체가 혈관신생을 억제하는지 아니면 촉진하는지는 불확실하다.
유럽 특허 제1,565,491호(특허문헌 4) 및 국제 특허출원 공보 제WO2008/100805호(특허문헌 5)에 기재된 항체들도 ROBO4에 대한 항체로서 공지되어 있다(이하, "항-ROBO4 항체"로서 지칭됨). 이들 항체들 중 어느 것도 생체내에서 혈관신생에 대한 억제 또는 저해 효과를 보이지 않는다.
[특허문헌 1] 국제 특허출원 공보 제WO2004/003163호 [특허문헌 2] 국제 특허출원 공보 제WO2008/073441호 [특허문헌 3] 국제 특허출원 공보 제WO2002/036771호 [특허문헌 4] 유럽 특허 제1,565,491호 [특허문헌 5] 국제 특허출원 공보 제WO2008/100805호
[비특허문헌 1] Genomics, 2002, vol. 79, p. 547-552 [비특허문헌 2] Developmental Biology, 2003, vol. 261, p. 251-267 [비특허문헌 3] Biochemical and Biophysical Research Communications, 2005, vol. 332, p. 533-541 [비특허문헌 4] Nature Medicine, 2008, No. 14, p. 448-453 [비특허문헌 5] Science Translational Medicine, 2010, vol. 2, p. 23ra19 [비특허문헌 6] Proceedings of the National Academy of Sciences, 2010, vol. 107, p. 10520-10525 [비특허문헌 7] Oncology Reports, 2006, vol. 15, p.1437-1443 [비특허문헌 8] Molecular Vision, 2009, vol. 15, p. 1057-1069 [비특허문헌 9] The FASEB Journal, 2005, vol. 19, p. 121-123 [비특허문헌 10] BMC Cell Biology, 2008, vol. 9, p. 61-72 [비특허문헌 11] The FASEB Journal, 2009, vol. 23, p. 513-522
본 발명의 목적은 ROBO4에 대한 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 추가 목적은 항-혈관신생 효과 등을 갖는 항-ROBO4 항체를 함유하는 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가 목적은 상기 항체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가 목적은 상기 항체 등을 사용하여 혈관신생을 억제하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 상기 목적들을 달성하기 위해 꾸준한 연구를 수행하였고 결과적으로 ROBO4의 다운스트림 신호의 활성화를 검출하는 스크리닝 시스템을 성공적으로 구축하였다. 더욱이, 본 발명자들은 상기 스크리닝 시스템을 이용하여 ROBO4의 다운스트림 신호를 활성화시키고 ROBO4 발현 EC에서 다양한 혈관신생 인자들, 예컨대, VEGF, bFGF, HGF, PDGF-BB 및 SDF-1에 의해 유도된 세포 이동에 대한 억제 활성을 갖고 심지어 생체내 모델에서도 항-혈관신생 효과를 나타내는 신규 항-ROBO4 단일클론 항체를 성공적으로 수득하였다. 이 방식으로, 본 발명이 완성되었다.
구체적으로, 본 발명은 하기 (1) 내지 (34)에 관한 것이다:
(1) 하기 (I) 내지 (III)에 기재된 성질을 갖는 항체 또는 그의 기능성 단편:
(I) 바람직하게는 1 x 10-8 이하, 특히 바람직하게는 5 x 10-9 이하의 KD 값으로 ROBO4 단백질에 결합하는 성질,
(II) 시험관내에서 교차-연결(cross-linking) 항체의 부재 하에서 혈관 내피 세포 이동을 억제하거나 저해하는 성질, 및
(III) 생체내에서 혈관신생을 억제하거나 저해하는 성질;
(2) (1)에 있어서, ROBO4 단백질이 인간 ROBO4 단백질인 항체 또는 그의 기능성 단편;
(3) (1)에 있어서, ROBO4 단백질이 서열번호 2의 아미노산 번호 1 내지 1007의 아미노산 서열로 구성된 단백질인 항체 또는 그의 기능성 단편;
(4) (1)에 있어서, ROBO4 단백질이 서열번호 2의 아미노산 번호 46 내지 1007의 아미노산 서열로 구성된 단백질인 항체 또는 그의 기능성 단편;
(5) (3) 또는 (4)에 있어서, 서열번호 2의 아미노산 번호 132 내지 209의 아미노산 서열로 구성된 부위에 결합하는 항체 또는 그의 기능성 단편;
(6) (1)에 있어서, 단일클론 항체 또는 그의 기능성 단편인 항체 또는 그의 기능성 단편;
(7) (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 44(도 25)로 표시된 아미노산 서열로 구성된 CDRH1, 서열번호 46(도 26)으로 표시된 아미노산 서열 또는 1개의 아미노산의 치환에 의해 서열번호 46의 아미노산 서열로부터 유도된 아미노산 서열로 구성된 CDRH2 및 서열번호 48(도 27)로 표시된 아미노산 서열로 구성된 CDRH3을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 50(도 28)으로 표시된 아미노산 서열 또는 1개 내지 3개의 아미노산(들)의 치환에 의해 서열번호 50의 아미노산 서열로부터 유도된 아미노산 서열로 구성된 CDRL1, 서열번호 52(도 29)로 표시된 아미노산 서열로 구성된 CDRL2 및 서열번호 54(도 30)로 표시된 아미노산 서열로 구성된 CDRL3을 포함하는 경쇄로 구성된 항체 또는 그의 기능성 단편;
(8) (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 44(도 25)로 표시된 아미노산 서열로 구성된 CDRH1, 서열번호 46(도 26)으로 표시된 아미노산 서열 또는 서열번호 68(도 44)로 표시된 아미노산 서열로 구성된 CDRH2 및 서열번호 48(도 27)로 표시된 아미노산 서열로 구성된 CDRH3을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 50(도 28)으로 표시된 아미노산 서열 또는 서열번호 70(도 46)으로 표시된 아미노산 서열로 구성된 CDRL1, 서열번호 52(도 29)로 표시된 아미노산 서열로 구성된 CDRL2 및 서열번호 54(도 30)로 표시된 아미노산 서열로 구성된 CDRL3을 포함하는 경쇄로 구성된 항체 또는 그의 기능성 단편;
(9) (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 31(도 16)로 표시된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 33(도 18)으로 표시된 아미노산 서열로 구성된 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 그의 기능성 단편;
(10) (1) 내지 (8) 중 어느 하나에 있어서, 하기 a) 내지 d)로부터 선택된 어느 한 중쇄 가변 영역 및 하기 e) 및 f)로부터 선택된 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 그의 기능성 단편:
a) 서열번호 56(도 32)의 아미노산 번호 20 내지 137로 표시된 아미노산 서열로 구성된 중쇄(hMAb1-H1형) 가변 영역,
b) 서열번호 58(도 34)의 아미노산 번호 20 내지 137로 표시된 아미노산 서열로 구성된 중쇄(hMAb1-H2형) 가변 영역,
c) 서열번호 60(도 36)의 아미노산 번호 20 내지 137로 표시된 아미노산 서열로 구성된 중쇄(hMAb1-H3형) 가변 영역, 및
d) 서열번호 62(도 38)의 아미노산 번호 20 내지 137로 표시된 아미노산 서열로 구성된 중쇄(hMAb1-H4형) 가변 영역; 및
e) 서열번호 64(도 40)의 아미노산 번호 21 내지 134로 표시된 아미노산 서열로 구성된 경쇄(hMAb1-L1형) 가변 영역, 및
f) 서열번호 66(도 42)의 아미노산 번호 21 내지 134로 표시된 아미노산 서열로 구성된 경쇄(hMAb1-L2형) 가변 영역;
(11) (1) 내지 (8) 중 어느 하나에 있어서, 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역의 하기 조합 1) 내지 6) 중 어느 한 조합을 포함하는 항체 또는 그의 기능성 단편:
1) 서열번호 58(도 34)의 아미노산 번호 20 내지 137로 표시된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 가변 영역 및 서열번호 64(도 40)의 아미노산 번호 21 내지 134로 표시된 아미노산 서열로 구성된 경쇄 가변 영역,
2) 서열번호 58(도 34)의 아미노산 번호 20 내지 137로 표시된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 가변 영역 및 서열번호 66(도 42)의 아미노산 번호 21 내지 134로 표시된 아미노산 서열로 구성된 경쇄 가변 영역,
3) 서열번호 62(도 38)의 아미노산 번호 20 내지 137로 표시된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 가변 영역 및 서열번호 66(도 42)의 아미노산 번호 21 내지 134로 표시된 아미노산 서열로 구성된 경쇄 가변 영역,
4) 서열번호 62(도 38)의 아미노산 번호 20 내지 137로 표시된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 가변 영역 및 서열번호 64(도 40)의 아미노산 번호 21 내지 134로 표시된 아미노산 서열로 구성된 경쇄 가변 영역,
5) 서열번호 56(도 32)의 아미노산 번호 20 내지 137로 표시된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 가변 영역 및 서열번호 64(도 40)의 아미노산 번호 21 내지 134로 표시된 아미노산 서열로 구성된 경쇄 가변 영역, 및
6) 서열번호 60(도 36)의 아미노산 번호 20 내지 137로 표시된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 가변 영역 및 서열번호 64(도 40)의 아미노산 번호 21 내지 134로 표시된 아미노산 서열로 구성된 경쇄 가변 영역;
(12) (1) 내지 (11) 중 어느 하나에 있어서, 키메라 항체 또는 그의 기능성 단편인 항체 또는 그의 기능성 단편;
(13) (1) 내지 (11) 중 어느 하나에 있어서, 인간화된 항체 또는 그의 기능성 단편인 항체 또는 그의 기능성 단편;
(14) (1) 내지 (13) 중 어느 하나에 있어서, 인간 IgG1 또는 인간 IgG2 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체 또는 그의 기능성 단편;
(15) (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 있어서, (7) 내지 (14) 중 어느 하나에 따른 항체에 의해 인식되는 항원 상의 부위에 결합하는 항체 또는 그의 기능성 단편;
(16) (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 있어서, ROBO4 단백질과의 결합에 대해 (7) 내지 (14) 중 어느 하나에 따른 항체와 경쟁하는 항체 또는 그의 기능성 단편;
(17) (1) 내지 (8) 중 어느 하나에 있어서, 중쇄와 경쇄의 하기 조합 1) 내지 6) 중 어느 한 조합을 포함하는 항체 또는 그의 기능성 단편:
1) 서열번호 58(도 34)의 아미노산 번호 20 내지 463으로 표시된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 및 서열번호 64(도 40)의 아미노산 번호 21 내지 239로 표시된 아미노산 서열로 구성된 경쇄(H-1140),
2) 서열번호 58(도 34)의 아미노산 번호 20 내지 463으로 표시된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 및 서열번호 66(도 42)의 아미노산 번호 21 내지 239로 표시된 아미노산 서열로 구성된 경쇄(H-1143),
3) 서열번호 62(도 38)의 아미노산 번호 20 내지 463으로 표시된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 및 서열번호 66(도 42)의 아미노산 번호 21 내지 239로 표시된 아미노산 서열로 구성된 경쇄(H-2143),
4) 서열번호 62(도 38)의 아미노산 번호 20 내지 463으로 표시된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 및 서열번호 64(도 40)의 아미노산 번호 21 내지 239로 표시된 아미노산 서열로 구성된 경쇄(H-2140),
5) 서열번호 56(도 32)의 아미노산 번호 20 내지 463으로 표시된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 및 서열번호 64(도 40)의 아미노산 번호 21 내지 239로 표시된 아미노산 서열로 구성된 경쇄(H-1040), 및
6) 서열번호 60(도 36)의 아미노산 번호 20 내지 463으로 표시된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 및 서열번호 64(도 40)의 아미노산 번호 21 내지 239로 표시된 아미노산 서열로 구성된 경쇄(H-2040);
(18) (17)에 따른 항체의 중쇄의 변경된 형태를 포함하는 항체로서, 이때 상기 변경된 형태가 상기 중쇄의 1개 내지 수개의 카복실-말단 아미노산(들), 바람직하게는 상기 중쇄의 1개 내지 8개의 카복실-말단 아미노산(들), 보다 바람직하게는 상기 중쇄의 1개 또는 2개의 카복실-말단 아미노산(들)을 결여하는 것인 항체;
(19) (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 있어서, 아미노산 서열 면에서 (17)에 따른 항체와 95% 이상 동일하고, 인간 ROBO4에 대한 1 x 10-8 이하의 KD 값을 갖고, 시험관내에서 교차-연결 항체의 부재 하에서 혈관 내피 세포 이동을 억제하거나 저해하고, 생체내에서 혈관신생을 억제하거나 저해하는 항체;
(20) (15)에 있어서, 인간 항체 또는 그의 기능성 단편인 항체 또는 그의 기능성 단편;
(21) 하기 (I) 내지 (III)으로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열:
(I) (1) 내지 (20) 중 어느 하나에 따른 항체의 중쇄 또는 경쇄의 부분 또는 전체 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열,
(II) (1) 내지 (20) 중 어느 하나에 따른 항체의 중쇄 또는 경쇄의 부분 또는 전체 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 구성된 뉴클레오티드 서열, 및
(III) (1) 내지 (20) 중 어느 하나에 따른 항체의 중쇄 또는 경쇄의 부분 또는 전체 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 구성된 뉴클레오티드 서열;
(22) (21)에 따른 뉴클레오티드 서열의 삽입체(insert)를 함유하는 재조합 벡터;
(23) 그의 내부에 도입된 (21)에 따른 뉴클레오티드 서열 또는 (22)에 따른 재조합 벡터를 함유하는 재조합 세포;
(24) (1) 내지 (20) 중 어느 하나에 따른 항체를 생성하는 세포로서, 바람직하게는 포유동물 세포, 보다 바람직하게는 CHO 세포, 훨씬 더 바람직하게는 CHOK1SV인 세포;
(25) (1) 내지 (20) 중 어느 하나에 따른 항체 또는 그의 기능성 단편의 제조 방법으로서, 하기 단계 (I) 및 (II)를 포함하는 제조 방법:
(I) (23) 또는 (24)에 따른 세포를 배양하는 단계, 및
(II) 단계 (I)에서 수득된 배양물로부터 (1) 내지 (20) 중 어느 하나에 따른 항체 또는 그의 기능성 단편을 수집하는 단계;
(26) (25)에 따른 제조 방법에 의해 제조된 항체 또는 그의 기능성 단편;
(27) (1) 내지 (20) 및 (26) 중 어느 하나에 따른 항체 또는 그의 기능성 단편의 변경된 형태;
(28) (1) 내지 (20) 및 (26) 중 어느 하나에 따른 항체 또는 그의 기능성 단편, 또는 (27)에 따른 변경된 형태를 활성 성분으로서 포함하는 약학 조성물;
(29) (28)에 있어서, 혈관신생 질환의 치료 또는 예방을 위한 물질인 약학 조성물;
(30) (28)에 있어서, 혈관신생 질환이 삼출성 연령 관련 황반 변성, 당뇨망막병증, 황반 부종, 양성 또는 악성 종양, 아테롬성동맥경화증, 수정체뒤섬유증식, 혈관종, 만성 염증, 안구 혈관신생 질환, 증식성 망막병증, 혈관신생 녹내장, 각막 조직 이식 또는 다른 조직 이식의 면역 거부, 류마티스 관절염, 건선, 급성 염증, 패혈증 또는 비만인 약학 조성물;
(31) (28)에 있어서, 혈관신생 질환이 삼출성 연령 관련 황반 변성, 당뇨망막병증, 황반 부종, 수정체뒤섬유증식, 안구 혈관신생 질환, 증식성 망막병증, 혈관신생 녹내장 또는 각막 조직 이식의 면역 거부인 약학 조성물;
(32) (1) 내지 (20) 및 (26) 중 어느 하나에 따른 항체 또는 그의 기능성 단편 또는 (27)에 따른 변경된 형태를 활성 성분으로서 포함하는 혈관신생 억제제;
(33) (1) 내지 (20) 및 (26) 중 어느 하나에 따른 항체 또는 그의 기능성 단편 또는 (27)에 따른 변경된 형태, 또는 (28) 내지 (31) 중 어느 하나에 따른 조성물을 혈관신생 질환의 치료 또는 예방이 필요한 대상체에게 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 혈관신생 질환을 치료하거나 예방하는 방법으로서, 이때 상기 혈관신생 질환이 바람직하게는 발현된 ROBO4 단백질을 갖는 개체의 혈관신생 질환인 방법; 및
(34) (28) 내지 (31) 중 어느 하나에 있어서, 추가 치료제 또는 예방제와 병용되는 약학 조성물로서, 이때 상기 치료제 또는 예방제가 바람직하게는 항-혈관신생 약물, 소염 약물 및/또는 항암 약물인 약학 조성물.
본 발명에 따라, ROBO4에 결합하고 항-혈관신생 효과를 갖는 항체를 함유하는, 혈관신생 질환용 치료제 등이 수득될 수 있다.
도 1은 HEK293 세포에서 인간 ROBO4의 일시적인 발현에 있어서 반응 요소로서 NF-κB, GAS, ISRE, IL-8 프로모터 또는 TCF에 대한 리포터 활성의 변화의 존재 또는 부재를 보여주는 도면이다. 이 도면에서 오차 막대는 표준 편차를 표시한다(n = 3).
도 2는 HEK293 세포에서 전장 인간 ROBO4 또는 인간 ROBO4의 세포내 영역 결실 변이체의 일시적인 발현에 있어서 IL-8 프로모터 활성의 변화의 존재 또는 부재를 보여주는 도면이다. 이 도면에서 오차 막대는 표준 편차를 표시한다(n = 5 또는 10).
도 3은 항-ROBO4 항체 MAb1에 의해 야기된, 인간 ROBO4-형질감염된 HEK293 세포에서의 IL-8 프로모터 활성의 변화를 보여주는 도면이다. 이 도면에서 오차 막대는 표준 편차를 표시한다(n = 3).
도 4는 항-ROBO4 항체 MAb2, MAb3 또는 MAb4에 의해 야기된, 인간 ROBO4-형질감염된 HEK293 세포에서의 IL-8 프로모터 활성의 변화를 보여주는 도면이다. 이 도면에서 오차 막대는 표준 편차를 표시한다(n = 3).
도 5는 항-ROBO4 항체 MAb1에 의해 야기된, VEGF 또는 bFGF의 존재 하에서 HUVEC의 이동 성능의 변화를 보여주는 도면이다. 이 도면에서 오차 막대는 표준 편차를 표시한다(n = 3 또는 4).
도 6은 항-ROBO4 항체 MAb2, MAb3 또는 MAb4에 의해 야기된, bFGF의 존재 하에서 HUVEC의 이동 성능의 변화를 보여주는 도면이다. 이 도면에서 오차 막대는 표준 편차를 표시한다(n = 4).
도 7은 인간 ROBO4, 마우스 ROBO4, 래트 ROBO4 또는 사이노몰구스 원숭이 ROBO4에 대한 항-ROBO4 항체 MAb1의 결합 활성의 존재 또는 부재를 보여주는 도면이다.
도 8은 인간 ROBO1, 인간 ROBO2 또는 인간 ROBO3에 대한 항-ROBO4 항체 MAb1의 결합 활성의 존재 또는 부재를 보여주는 도면이다. 상부 상자는 MAb1에 대한 결과를 보여주고, 하부 상자는 세포 표면 상에서의 이들 단백질들의 발현을 확인시켜준 양성 대조군 항체에 대한 결과를 보여준다.
도 9는 인간 ROBO4의 세포외 영역/도메인 결실 변이체에 대한 항-ROBO4 항체 MAb1의 결합 활성의 존재 또는 부재를 보여주는 도면이다. 상부 상자는 MAb1에 대한 결과를 보여주고, 하부 상자는 세포 표면 상에서의 이들 단백질들의 발현을 확인시켜준 항-FLAG 항체에 대한 결과를 보여준다.
도 10은 항-ROBO4 항체 MAb1에 의해 야기된, 레이저-유도된 맥락막 혈관신생 모델에서의 혈관신생의 변화를 보여주는 도면이다. 이 도면에서 오차 막대는 표준 편차를 표시하고(n = 4개의 눈), ■ 또는 □는 각각의 눈의 결과를 보여준다.
도 11은 항-ROBO4 키메라 항체 cMAb1-1 또는 cMAb1-2에 의해 야기된, 인간 ROBO4-형질감염된 HEK293 세포에서의 IL-8 프로모터 활성의 변화를 보여주는 도면이다. 이 도면에서 오차 막대는 표준 편차를 표시한다(n = 3).
도 12는 항-ROBO4 키메라 항체 cMAb1-1 또는 cMAb1-2에 의해 야기된, bFGF의 존재 하에서 HUVEC의 이동 성능의 변화를 보여주는 도면이다. 이 도면에서 오차 막대는 표준 편차를 표시한다(n = 4).
도 13은 전장 인간 ROBO4를 코딩하는 cDNA(서열번호 1)를 보여준다.
도 14는 인간 ROBO4의 전장 아미노산 서열(서열번호 2)을 보여준다.
도 15는 MAb1의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열(서열번호 30)을 보여준다.
도 16은 MAb1 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열(서열번호 31)을 보여준다.
도 17은 MAb1의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열(서열번호 32)을 보여준다.
도 18은 MAb1 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열(서열번호 33)을 보여준다.
도 19는 cMAb1의 경쇄를 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열(서열번호 37)을 보여준다.
도 20은 cMAb1 경쇄의 아미노산 서열(서열번호 38)을 보여준다.
도 21은 cMAb1-1의 중쇄를 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열(서열번호 39)을 보여준다.
도 22는 cMAb1-1 중쇄의 아미노산 서열(서열번호 40)을 보여준다.
도 23은 cMAb1-2의 중쇄를 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열(서열번호 41)을 보여준다.
도 24는 cMAb1-2 중쇄의 아미노산 서열(서열번호 42)을 보여준다.
도 25는 MAb1의 중쇄 CDRH1의 아미노산 서열(서열번호 44)을 보여준다.
도 26은 MAb1의 중쇄 CDRH2의 아미노산 서열(서열번호 46)을 보여준다.
도 27은 MAb1의 중쇄 CDRH3의 아미노산 서열(서열번호 48)을 보여준다.
도 28은 MAb1의 경쇄 CDRL1의 아미노산 서열(서열번호 50)을 보여준다.
도 29는 MAb1의 경쇄 CDRL2의 아미노산 서열(서열번호 52)을 보여준다.
도 30은 MAb1의 경쇄 CDRL3의 아미노산 서열(서열번호 54)을 보여준다.
도 31은 hMAb1-H1형 중쇄를 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열(서열번호 55)을 보여준다.
도 32는 hMAb1-H1형 중쇄의 아미노산 서열(서열번호 56)을 보여준다.
도 33은 hMAb1-H2형 중쇄를 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열(서열번호 57)을 보여준다.
도 34는 hMAb1-H2형 중쇄의 아미노산 서열(서열번호 58)을 보여준다.
도 35는 hMAb1-H3형 중쇄를 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열(서열번호 59)을 보여준다.
도 36은 hMAb1-H3형 중쇄의 아미노산 서열(서열번호 60)을 보여준다.
도 37은 hMAb1-H4형 중쇄를 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열(서열번호 61)을 보여준다.
도 38은 hMAb1-H4형 중쇄의 아미노산 서열(서열번호 62)을 보여준다.
도 39는 hMAb1-L1형 경쇄를 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열(서열번호 63)을 보여준다.
도 40은 hMAb1-L1형 경쇄의 아미노산 서열(서열번호 64)을 보여준다.
도 41은 hMAb1-L2형 경쇄를 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열(서열번호 65)을 보여준다.
도 42는 hMAb1-L2형 경쇄의 아미노산 서열(서열번호 66)을 보여준다.
도 43은 hMAb1-H2형 또는 hMAb1-H4형 중쇄의 CDRH1의 아미노산 서열(서열번호 67)을 보여준다.
도 44는 hMAb1-H2형 또는 hMAb1-H4형 중쇄의 CDRH2의 아미노산 서열(서열번호 68)을 보여준다.
도 45는 hMAb1-H2형 또는 hMAb1-H4형 중쇄의 CDRH3의 아미노산 서열(서열번호 69)을 보여준다.
도 46은 hMAb1-L2형 경쇄의 CDRL1의 아미노산 서열(서열번호 70)을 보여준다.
도 47은 hMAb1-L2형 경쇄의 CDRL2의 아미노산 서열(서열번호 71)을 보여준다.
도 48은 hMAb1-L2형 경쇄의 CDRL3의 아미노산 서열(서열번호 72)을 보여준다.
도 49는 H-1040, H-1143, H-1140, H-2040, H-2143 또는 H-2140에 의해 야기된, 인간 ROBO4-형질감염된 HEK293 세포에서의 IL-8 프로모터 활성의 변화를 보여주는 도면이다.
도 50은 H-1143, H-2140 또는 H-2143에 의해 야기된, bFGF의 존재 하에서 HUVEC의 이동 성능의 변화를 보여주는 도면이다. 이 도면에서 오차 막대는 표준 편차를 표시한다(n = 4).
도 51은 H-1143의 교차-종 반응성을 보여주는 도면이다.
도 52는 H-2140의 교차-종 반응성을 보여주는 도면이다.
도 53은 H-2143의 교차-종 반응성을 보여주는 도면이다.
도 54는 H-1143, H-2140 또는 H-2143의 결합 특이성을 보여주는 도면이다.
도 55는 H-2143에 의해 야기된, 레이저-유도된 맥락막 혈관신생 모델에서의 혈관신생의 변화를 보여주는 도면이다. 이 도면에서 오차 막대는 표준 편차를 표시한다(n = 3개 또는 4개의 눈).
1. 정의
본 발명에서, "유전자"는 단백질의 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드(들) 또는 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 상보적인 가닥을 의미한다. "유전자"는 예를 들면, 단백질의 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 상보적인 가닥으로서 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, DNA, mRNA, cDNA 및 cRNA를 포함하기 위한 것이다. 이러한 유전자는 단일 가닥, 이중 가닥 또는 삼중 이상의 가닥을 갖는 뉴클레오티드 서열이고, "유전자"는 DNA 가닥과 RNA 가닥의 회합체, 1개 뉴클레오티드 가닥 상의 리보뉴클레오티드들(RNA들)과 데옥시리보뉴클레오티드들(DNA들)의 혼합물, 및 이러한 뉴클레오티드 가닥을 포함하는 이중 가닥 또는 삼중 이상의 가닥을 갖는 뉴클레오티드 서열도 포함하기 위한 것이다. 본 발명의 "ROBO4 유전자"의 예로는 ROBO4 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA, mRNA, cDNA 및 cRNA를 들 수 있다.
본 발명에서, 용어 "뉴클레오티드(들)" 또는 "뉴클레오티드 서열"은 "핵산"과 동일한 의미를 갖고, 예를 들면, DNA, RNA, 프로브, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 및 프라이머도 포함하기 위한 것이다. 이러한 뉴클레오티드 서열은 단일 가닥, 이중 가닥 또는 삼중 이상의 가닥을 갖는 뉴클레오티드이고, "뉴클레오티드" 서열은 DNA 가닥과 RNA 가닥의 회합체, 1개 뉴클레오티드 가닥 상의 리보뉴클레오티드들(RNA들)과 데옥시리보뉴클레오티드들(DNA들)의 혼합물, 및 이러한 뉴클레오티드 가닥을 포함하는 2개의 가닥 또는 3개 이상의 가닥의 회합체도 포함하기 위한 것이다.
본 발명에서, 용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 동일한 의미를 갖는다.
본 발명에서, "항원"은 "면역원"의 의미로서도 사용된다.
본 발명에서, "세포"는 동물 개체, 하위배양된 세포, 1차 배양된 세포, 세포주, 재조합 세포 등으로부터 유래된 다양한 세포도 포함한다.
본 발명에서, ROBO4 단백질을 인식하는 항체는 "항-ROBO4 항체"로서도 지칭된다. "항-ROBO4 항체"는 항-ROBO4 키메라 항체, 항-ROBO4 인간화된 항체, 항-ROBO4 인간 항체 등을 포함한다.
본 발명에서, "항체의 기능성 단편"은 원래의 항체의 기능들 중 하나 이상의 기능, 예를 들면, 결합 친화성(KD 값)을 발휘하는 항체 단편을 의미한다. "항체의 기능성 단편"의 예로는 Fab, F(ab')2, scFv, Fab', 단일 쇄 면역글로불린 등을 들 수 있으나 이들로 한정되지 않는다. 이러한 항체의 기능성 단편은 항체 단백질의 전장 분자를 효소, 예컨대, 파파인 또는 펩신으로 처리함으로써 수득될 수 있거나, 재조합 유전자를 사용하여 적절한 숙주 세포에서 생성한 재조합 단백질일 수 있다. 바람직한 "기능성 단편"은 원래의 항체의 생물학적 활성들 중 하나 이상의 생물학적 활성도 갖는다.
추가로, 본 발명과 관련하여 중쇄 또는 경쇄의 "부분 아미노산 서열"을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 본원에서 상기 정의된 "항체의 기능성 단편"을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이거나 이러한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명에서, 항체가 결합하는 "부위", 즉 항체에 의해 인식되는 "부위"는 항체에 의해 결합되거나 인식되는 항원 상의 부분 펩티드 또는 부분 입체구조를 의미한다. 본 발명에서, 이러한 부위는 에피토프 또는 항체 결합 부위로서도 지칭된다. 본 발명의 항-ROBO4 항체에 의해 결합되거나 인식되는 ROBO4 단백질 상의 부위의 예로는 ROBO4 단백질 상의 부분 펩티드 또는 부분 입체구조를 들 수 있다.
항체 분자의 중쇄 및 경쇄는 3개의 상보성 결정 영역들(CDR들)을 각각 갖는 것으로 공지되어 있다. 상보성 결정 영역은 초가변 도메인으로서도 지칭된다. 이들은 항체 중쇄 및 경쇄의 가변 영역에 위치한다. 이들 부위들은 특히 고도 가변성 1차 구조를 갖고 통상적으로 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 가닥의 각각의 1차 구조 상의 3개 위치에서 분리되어 있다. 본 발명에서, 항체의 상보성 결정 영역은 중쇄의 상보성 결정 영역의 경우 중쇄 아미노산 서열의 아미노 말단부터 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3으로서 지칭되고 경쇄의 상보성 결정 영역의 경우 경쇄 아미노산 서열의 아미노 말단부터 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3으로서 지칭된다. 이들 부위들은 3차원 구조 상에서 서로 인접하고 결합될 항원에 대한 특이성을 결정한다.
본 발명에서, "항체 돌연변이체"는 아미노산(들)의 치환, 결실, 추가 및/또는 삽입(이하, "돌연변이"로서 총칭됨)에 의해 원래의 항체의 아미노산 서열로부터 유도된 아미노산 서열을 갖고 본 발명의 ROBO4 단백질에 결합하는 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 항체 돌연변이체에서 돌연변이된 아미노산의 수는 1개 또는 2개, 1개 내지 3개, 1개 내지 4개, 1개 내지 5개, 1개 내지 6개, 1개 내지 7개, 1개 내지 8개, 1개 내지 9개, 1개 내지 10개, 1개 내지 12개, 1개 내지 15개, 1개 내지 20개, 1개 내지 25개, 1개 내지 30개, 1개 내지 40개 또는 1개 내지 50개이다. 이러한 항체 돌연변이체도 본 발명의 "항체"에 의해 포괄된다.
본 발명에서, "1개 내지 수개"에서 용어 "수개"는 2개 내지 10개, 바람직하게는 2개 내지 8개, 보다 바람직하게는 2개를 지칭한다.
본 발명의 항체에 의해 발휘되는 활성 또는 성질의 예로는 생물학적 활성 또는 물리화학적 성질을 들 수 있고, 구체적으로 다양한 생물학적 활성, 항원 또는 에피토프에 대한 결합 활성, 제조 또는 저장 동안의 안정성, 및 열안정성을 들 수 있다.
본 발명에서, 어구 "엄격한 조건 하에서 혼성화하는"은 5 x SSC를 함유하는 65℃ 용액에서의 혼성화에 이어서, 2 x SSC-0.1% SDS를 함유하는 65℃ 수용액에서의 20분 동안의 세척, 0.5 x SSC-0.1% SDS를 함유하는 65℃ 수용액에서의 20분 동안의 세척 및 0.2 x SSC-0.1% SDS를 함유하는 65℃ 수용액에서의 20분 동안의 세척을 포함하는 조건 하에서의 혼성화, 또는 이와 동등한 조건 하에서의 혼성화를 의미한다. SSC는 150 mM NaCl-15 mM 구연산나트륨의 수용액을 의미하고, n x SSC는 n배 농도를 갖는 SSC를 의미한다.
2. ROBO4 단백질
본 명세서에서, 용어 "ROBO4" 및 "ROBO4 단백질"은 동일한 의미로서 사용된다.
(2-1) 성질
본 발명의 ROBO4 단백질은 하기 성질을 갖는다:
(i) ROBO4는 대략 110 kDa의 분자량 및 단회-통과 경막 구조를 갖고, 혈관신생에 관여하는 SLIT2 단백질의 수용체 단백질이다. 본 발명의 임의의 ROBO4 단백질은 막, 예컨대, 세포막으로부터 유리된 형태로 발견될 수 있고, 막, 예컨대, 세포막에 결합된 형태로 존재할 수도 있다. 이와 관련하여, 분자량은 SDS-PAGE의 비환원 조건 하에서의 겉보기 분자량을 의미한다. ROBO4의 N-말단 세포외 영역은 2개의 면역글로불린 유사 도메인들(이하, "Ig 유사 도메인들"로서 지칭됨) 및 2개의 피브로넥틴 III형 도메인을 함유하는 반면, 그의 C-말단 세포내 영역은 단백질 풍부 영역을 함유한다. 본 명세서에서, 이들 2개의 면역글로불린 유사 도메인들은 아미노 말단부터 각각 Ig 유사 도메인 1 및 Ig 유사 도메인 2로서 지칭된다. 인간 ROBO4 단백질은 서열번호 2의 아미노산 번호 28 내지 1007의 아미노산 서열로 구성된다. 서열번호 2의 아미노산 번호 1 내지 27은 분비 신호를 나타내고; 그의 아미노산 번호 28 내지 467은 세포외 영역을 나타내고; 그의 아미노산 번호 46 내지 131은 Ig 유사 도메인 1을 나타내고; 그의 아미노산 번호 137 내지 224는 Ig 유사 도메인 2를 나타내고; 그의 아미노산 번호 252 내지 340은 피브로넥틴 III형 도메인 1을 나타내고; 그의 아미노산 번호 347 내지 438은 피브로넥틴 III형 도메인 2를 나타내고; 그의 아미노산 번호 468 내지 490은 세포막 내의 영역을 나타내고; 그의 아미노산 번호 491 내지 1007은 세포내 영역을 나타낸다.
(ii) ROBO4는 항-혈관신생 효과를 갖는다. 본 발명에서, 용어 "항-혈관신생"은 분자가 혼자서, 또 다른 인자와 협력하여, 또는 또 다른 인자와의 회합체로서 혈관신생을 직접적으로 또는 간접적으로 억제하고/하거나 저해한다는 것을 의미한다. 항-혈관신생 효과는 예를 들면, VEGF에 의한 혈관 투과성, 세포 이동 촉진 활성 또는 내강 형성 활성의 증가에 대한 억제 효과를 지표로서 사용함으로써 평가될 수 있다.
(iii) ROBO4는 하기 (a) 내지 (e) 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열(이하, "ROBO4 아미노산 서열"로서 지칭됨)을 포함하거나, ROBO4 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열로 구성되거나, ROBO4 아미노산 서열로 구성된다:
(a) 서열번호 2(도 14)로 표시된 아미노산 서열;
(b) 서열번호 2(도 14)로 표시된 아미노산 서열에 대한 80% 이상, 82% 이상, 84% 이상, 86% 이상, 88% 이상, 90% 이상, 92% 이상, 94% 이상, 96% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 서열 동일성을 나타내고 항-혈관신생 효과를 나타내는 폴리펩티드의 아미노산 서열;
(c) 1개 내지 50개, 1개 내지 45개, 1개 내지 40개, 1개 내지 35개, 1개 내지 30개, 1개 내지 25개, 1개 내지 20개, 1개 내지 15개, 1개 내지 10개, 1개 내지 8개, 1개 내지 6개, 1개 내지 5개, 1개 내지 4개, 1개 내지 3개, 1개 또는 2개, 또는 1개의 아미노산(들)의 치환, 결실, 추가 또는 삽입을 갖는 서열번호 2(도 14)로 표시된 아미노산 서열을 포함하고 혈관신생을 억제하는 폴리펩티드의 아미노산 서열;
(d) 아미노산 1 내지 45 또는 1 내지 131의 결실을 갖는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하고 혈관신생을 억제하는 폴리펩티드의 아미노산 서열; 및
(e) 서열번호 2(도 14)로 표시된 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 뉴클레오티드와 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되고 혈관신생을 억제하는 폴리펩티드의 아미노산 서열.
ROBO4 단백질은 2개 이상의 서브유닛으로 구성된 동종 또는 이종 올리고 회합체의 전체 또는 부분으로서 존재할 수 있다.
ROBO4 단백질의 아미노산 서열 및/또는 다른 성질은 개체, 조직, 체액, 세포, ROBO4 단백질 함유 분획, 정제된 또는 부분적으로 정제된 ROBO4 단백질 제제 등에서, 또는 복수의 개체, 조직, 세포, ROBO4 단백질 함유 분획 또는 ROBO4 단백질 제제들 사이에 동일하지 않을 수 있고 균질하지도 않을 수 있다. 한 개체, 조직, 체액, 세포, ROBO4 단백질 함유 분획, 정제된 또는 부분적으로 정제된 ROBO4 단백질 제제 등은 아미노산 서열 및/또는 성질 면에서 상이한 복수의 종류의 ROBO4 단백질들을 함유할 수 있다. 대안적으로, 복수의 개체, 조직, 세포, ROBO4 단백질 함유 제제 또는 ROBO4 단백질 제제는 ROBO4 단백질의 아미노산 서열 및/또는 다른 성질 면에서 상이할 수 있다. 아미노산 서열 및/또는 성질 면에서 서로 상이한 이러한 단백질들조차도, 이들이 상기 (i) 내지 (iii)에 기재된 성질을 보유하는 한, 본 발명의 "ROBO4 단백질"에 의해 모두 포괄된다.
(iv) 본 발명의 ROBO4 단백질은 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 설치류, 예컨대, 마우스 또는 래트, 또는 인간의 조직, 훨씬 더 바람직하게는 인간 또는 마우스의 조직, 이러한 조직으로부터 유래된 세포, 이러한 세포의 배양물 등으로부터 수득될 수 있다. 이러한 조직 및 세포는, 이들이 ROBO4 단백질을 함유하는 한, 특별히 한정되지 않는다. 그의 예로는 관절 조직, 혈액, 림프, 흉선, 비장, 및 이들 중 어느 하나로부터 유래된 세포를 들 수 있다. 바람직한 조직 및 세포는 혈관신생을 갖는 동물 또는 환자로부터 유래된 조직 및 세포이다. 그러나, 본 발명의 ROBO4 단백질의 기원은 전술된 기원들로 한정되지 않고, 본 발명의 ROBO4 단백질은 다른 동물 종, 다른 조직, 다른 세포 등으로부터 유래된 ROBO4 단백질들이 상기 (i) 내지 (iii)에 기재된 성질을 보유하는 한, 이들 단백질들 조차도 포함하기 위한 것이다.
본 발명의 ROBO4 단백질은 천연 단백질 및 재조합 단백질 중 임의의 단백질일 수 있다. ROBO4 단백질은 또 다른 펩티드 또는 단백질, 예컨대, 담체 또는 태그를 갖는 융합 생성물도 포함하기 위한 것이다. ROBO4 단백질은 중합체, 예컨대, PEG의 추가를 포함하는 화학적 변경, 및/또는 당쇄 변경을 포함하는 생물학적 변경을 구비한 형태도 포함하기 위한 것이다. 나아가, 본 발명의 ROBO4 단백질은 ROBO4 단백질 단편을 포함하기 위한 것이다. 상기 (ii)에 기재된 성질을 보유하는 ROBO4 단백질 단편은 ROBO4 단백질의 기능성 단편으로서 지칭된다.
(2-2) ROBO4 유전자
본 발명의 ROBO4 유전자는 하기 (a) 내지 (c) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열(이하, "ROBO4 유전자 서열"로서 지칭됨)을 포함하거나, ROBO4 유전자 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 구성되거나, ROBO4 유전자 서열로 구성된다:
(a) 서열번호 1(도 13)로 표시된 뉴클레오티드 서열;
(b) 서열번호 1로 표시된 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 구성된 뉴클레오티드와 엄격한 조건 하에서 혼성화하고 혈관신생을 억제하는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 및
(c) 1개 내지 150개, 1개 내지 140개, 1개 내지 130개, 1개 내지 120개, 1개 내지 110개, 1개 내지 100개, 1개 내지 90개, 1개 내지 80개, 1개 내지 70개, 1개 내지 60개, 1개 내지 50개, 1개 내지 45개, 1개 내지 40개, 1개 내지 30개, 1개 내지 25개, 1개 내지 20개, 1개 내지 15개, 1개 내지 10개, 1개 내지 8개, 1개 내지 6개, 1개 내지 5개, 1개 내지 4개, 1개 내지 3개, 1개 또는 2개, 또는 1개의 염기(들)의 치환, 결실, 추가 또는 삽입을 갖는 서열번호 1(도 13)로 표시된 뉴클레오티드 서열을 포함하고 혈관신생을 억제하는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
ROBO4 유전자는 혈관신생을 동반하는 질환, 예를 들면, 증식성 당뇨망막병증을 갖는 환자의 섬유혈관막 내의 혈관 또는 종양내 혈관에서 과다발현된다. 추가로, ROBO4 유전자는 혈관신생을 수반하는 것으로 간주되는 질환, 예컨대, 삼출성 연령 관련 황반 변성, 황반 부종, 아테롬성동맥경화증, 수정체뒤섬유증식, 혈관종, 만성 염증, 안구 혈관신생 질환, 증식성 망막병증, 혈관신생 녹내장, 각막 조직 이식 또는 다른 조직 이식의 면역 거부, 류마티스 관절염, 건선, 급성 염증, 패혈증 또는 비만으로 고통받는 환자, 또는 이들 질환들의 모델 동물로부터 유래된 조직 또는 혈액 분획에서 과다발현되어 있는 것으로 보인다.
ROBO4 유전자의 발현 및 발현 수준은 ROBO4 유전자 전사 생성물 및 ROBO4 단백질 중 임의의 물질을 지표로서 사용함으로써 분석될 수 있고, 전자 지표의 경우 RT-PCR, 노던 블롯 혼성화 등에 의해 측정될 수 있고 후자 지표의 경우 면역분석(예를 들면, 효소-연결된 면역흡착 분석; 이하, "ELISA"로서 지칭됨) 등에 의해 측정될 수 있다.
(2-3) 단백질의 제조
본 발명의 ROBO4 단백질은 동물 조직(체액을 포함함), 상기 조직으로부터 유래된 세포, 또는 상기 세포의 배양물로부터 정제될 수 있거나 단리될 수 있고, 유전자 재조합, 시험관내 번역, 화학 합성 등에 의해 제조될 수 있다.
(2-3-1) 천연 ROBO4의 정제 또는 단리
천연 ROBO4 단백질은 예를 들면, 혈관신생 질환, 예컨대, 삼출성 연령 관련 황반 변성, 당뇨망막병증, 황반 부종, 양성 또는 악성 종양, 아테롬성동맥경화증, 수정체뒤섬유증식, 혈관종, 만성 염증, 안구 혈관신생 질환, 증식성 망막병증, 혈관신생 녹내장, 각막 조직 이식 또는 다른 조직 이식의 면역 거부, 류마티스 관절염, 건선, 급성 염증, 패혈증 또는 비만으로 고통받는 환자 또는 비인간 동물로부터 유래된 조직(체액, 세포 등을 포함함), 상기 조직으로부터 유래된 세포, 또는 상기 세포의 배양물로부터 정제될 수 있거나 단리될 수 있다. 이러한 비인간 동물은 이들 질환들의 모델 동물도 포함한다. 모델 제조에 사용되는 동물들은, 이들이 척추동물인 한, 특별히 한정되지 않는다. 상기 동물들은 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 설치류, 예컨대, 마우스 또는 래트, 훨씬 더 바람직하게는 마우스 또는 래트이다. 이러한 환자 또는 모델 동물의 조직 및 세포는, 이들이 ROBO4 단백질을 함유하는 한, 특별히 한정되지 않는다. 그의 예로는 관절 조직, 혈액, 림프, 흉선, 비장, 및 이들 중 임의의 조직으로부터 유래된 세포를 들 수 있다. 바람직한 조직 및 세포는 혈관신생을 갖거나 유사한 증상을 나타내는 환자 또는 모델 동물로부터 유래된다. 그러나, 본 발명의 ROBO4 단백질의 기원은 전술된 기원들로 한정되지 않고, 본 발명의 ROBO4 단백질은 다른 동물 종, 다른 조직, 다른 세포 등으로부터 유래될 수 있다.
이러한 조직, 세포, 세포 배양물 등으로부터의 정제 또는 단리는 당업자에게 잘 공지된 방법들, 예컨대, 분별과 크로마토그래피의 병용에 의해 수행될 수 있다. 이러한 방법들은 염석, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 순상 또는 역상 크로마토그래피 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 항-ROBO4 단일클론 항체와 교차-연결된 친화성 겔을 제조하여 컬럼에 적재함으로써 친화성 크로마토그래피용 컬럼을 제조할 수 있다. ROBO4 단백질을 함유하는 미정제 또는 부분적으로 정제된 분획을 이러한 컬럼에 첨가한다. 그 후, 멸균된 인산염 완충 식염수(PBS)를 사용하여 비특이적으로 흡착된 물질을 제거한 후, 용출용 완충제 용액을 첨가하여 ROBO4 단백질을 선택적으로 수집한다. ROBO4 단백질을 함유하는 용액을 겔 여과하거나, 또는 완충제를 교체하고/하거나 농축기, 예컨대, 센트리프렙(Centriprep)을 이용하여 농축할 수 있다.
(2-3-2) 재조합 ROBO4 단백질의 제조
본 발명의 ROBO4 단백질은 재조합체 형태로 제조될 수도 있다. 구체적으로, ROBO4 단백질 또는 ROBO4 단백질 단편의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 사용하여 숙주 세포를 형질감염시키고 ROBO4 단백질을 세포 배양물로부터 수집할 수 있다. 예를 들면, ROBO4 유전자 또는 그의 단편을 발현 벡터 내로 삽입한다. 그 후, 발생된 재조합 벡터를 사용하여 원핵 또는 진핵 숙주 세포를 형질감염시키고, 수득된 재조합 세포를 항온처리하여 ROBO4 단백질을 발현시킬 수 있다. 당분야에서 공지된 발현 패턴, 예컨대, 분비 발현, 가용성 형태의 세포내 발현 또는 봉입체(inclusion body) 방법이 이용될 수 있다. 또한, ROBO4 단백질은 천연 ROBO4 단백질과 동일한 아미노 말단(N-말단) 및/또는 카복시 말단(C-말단)을 갖는 분자로서 발현될 수 있을 뿐만 아니라, 분비 신호, 세포내 국소화 신호, 친화성 정제용 태그 또는 파트너 펩티드를 갖는 융합 단백질로서도 발현될 수 있다. 방법들, 예컨대, 상기 (2-3-1)의 천연 ROBO4 단백질의 정제 또는 단리에 기재된 분별과 크로마토그래피의 적절한 병용으로 이러한 재조합 세포 배양물로부터 ROBO4 단백질을 정제할 수 있거나 단리할 수 있다.
ROBO4 유전자 또는 그의 단편을 당업자에게 잘 공지된 방법으로 제조할 수 있다.
그의 예로는 ROBO4 cDNA 발현 라이브러리를 주형으로서 사용하고 서열을 특이적으로 증폭할 수 있는 한 세트의 프라이머를 사용하는 중합효소 연쇄 반응(이하, "PCR"로서 지칭됨; Saiki, R.K., et al., Science (1988) 239, p. 487-489); ROBO4 발현용 mRNA 분획을 주형으로서 사용하고 서열을 역전사할 수 있는 프라이머 및 서열을 특이적으로 증폭할 수 있는 한 세트의 프라이머를 사용하는 역전사 PCR(이하, "RT-PCR"로서 지칭됨); 면역분석을 이용한 발현 클로닝; 및 정제된 ROBO4 단백질의 부분 아미노산 서열을 사용한 cDNA 클로닝을 들 수 있다.
(2-3-3) 시험관내 번역
본 발명의 ROBO4 단백질은 시험관내 번역에 의해 제조될 수도 있다. 이러한 번역 방법은, 이 방법이 전사 및 번역에 필요한 효소, 기질 및 에너지 물질을 포함하는 세포 무함유 번역 시스템을 사용하는 방법인 한, 특별히 한정되지 않는다. 그의 예로는 로슈 디아그노스틱스(Roche Diagnostics)에 의해 제조된 신속 번역 시스템(RTS)을 이용하는 방법을 들 수 있다.
(2-3-4) 화학적 합성
본 발명의 ROBO4 단백질은 화학적 합성에 의해 제조될 수도 있다. 화학적 합성 방법의 예로는 고체상 펩티드 합성 방법, 예컨대, Fmoc 합성 및 Boc 합성 방법을 들 수 있다.
3. 항-ROBO4 항체
(3-1) 항-ROBO4 항체의 종류
본 발명의 항체는 단일클론 항체 및 다중클론 항체 중 임의의 항체일 수 있다. 본 발명의 단일클론 항체의 예로는 비인간 동물 유래의 항체(비인간 동물 항체), 인간 유래의 항체(인간 항체), 키메라 항체 및 인간화된 항체, 바람직하게는 키메라 항체, 인간화된 항체 및 인간 유래의 항체(인간 항체), 보다 바람직하게는 인간화된 항체 및 인간 유래의 항체(인간 항체)를 들 수 있다.
비인간 동물 항체의 예로는 척추동물, 예컨대, 포유동물 및 조류로부터 유래된 항체를 들 수 있다. 포유동물 유래의 항체의 예로는 설치류 유래의 항체, 예컨대, 마우스 항체 및 래트 항체를 들 수 있다. 조류 유래의 항체의 예로는 닭 항체를 들 수 있다.
키메라 항체의 예로는 인간 항체(인간 면역글로불린) 불변 영역과 결합된 비인간 동물 항체 유래의 가변 영역을 포함하는 항체를 들 수 있으나 이것으로 한정되지 않는다. 비인간 동물 항체 유래의 가변 영역의 예로는 후술된 MAb1로부터 유래된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 들 수 있다.
인간화된 항체의 예로는 비인간 동물 항체의 가변 영역 내의 CDR들을 이식받은 인간 항체(인간 면역글로불린 가변 영역), 상기 CDR들뿐만 아니라 비인간 동물 항체의 골격 영역의 부분 서열도 이식받은 인간 항체, 및 이들 인간화된 항체들 중 임의의 인간화된 항체에서 1개 또는 2개 이상의 비인간 동물 항체 유래의 아미노산(들)을 치환시킨 인간 항체 아미노산(들)을 갖는 항체를 들 수 있다. 비인간 동물 항체의 가변 영역 내의 CDR들의 예로는 후술된 MAb1로부터 유래된 중쇄 가변 영역 내의 CDRH1 내지 CDRH3, 및 후술된 MAb1로부터 유래된 경쇄 가변 영역 내의 CDRL1 내지 CDRL3을 들 수 있다.
인간 항체는, 이것이 본 발명의 항원을 인식하는 항체인 한, 특별히 한정되지 않는다. 그의 예로는 본 발명의 항체 CDR들을 갖는 항체에 의해 결합된 부위와 동일한 부위에 결합하는 인간 항체, 및 전술된 MAb1에 의해 결합된 부위와 동일한 ROBO4 상의 부위에 결합하는 인간 항체를 들 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 복수의 상이한 항체들로부터 유래된 부위들로 구성된 항체일 수 있다. 그의 예로는 복수의 상이한 항체들 사이에서 교환된 중쇄 및/또는 경쇄를 포함하는 항체, 그들 사이에서 교환된 전장 중쇄 및/또는 경쇄를 포함하는 항체, 그들 사이에서 교환된 가변 또는 불변 영역을 포함하는 항체, 및 그들 사이에서 교환된 모든 또는 일부 CDR들을 포함하는 항체를 들 수 있다. 키메라 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 본 발명의 상이한 항체들로부터 유래될 수 있다. 인간화된 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 내의 CDRH1 내지 CDRH3 및 CDRL1 내지 CDRL3은 본 발명의 2개 이상의 상이한 항체들로부터 유래될 수 있다. 인간 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 내의 CDRH1 내지 CDRH3 및 CDRL1 내지 CDRL3은 본 발명의 2개 이상의 상이한 항체들에 의해 보유된 CDR들의 조합일 수 있다.
본 발명의 단일클론 항체의 동종형(isotype)은 특별히 한정되지 않고, 그의 예로는 IgG, 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4, IgM, IgA, 예컨대, IgA1 및 IgA2, IgD 및 IgE를 들 수 있고, 바람직하게는 IgG 및 IgM, 보다 바람직하게는 IgG2를 들 수 있다. 단일클론 항체의 동종형 및 서브클래스는 예를 들면, 오우크털로니(Ouchterlony) 시험, ELISA 또는 방사면역분석(이하, "RIA"로서 지칭됨)에 의해 결정될 수 있다. 확인을 위한 상업적으로 입수가능한 키트(바이오-라드 라보라토리스 인코포레이티드(Bio-Rad Laboratories, Inc.)에 의해 제조된 마우스 타이퍼(Typer) 키트, 에이비디 세로텍(AbD Serotec)에 의해 제조된 래트 단일클론 항체 동종형분류 시험 키트(RAT MONOCLONAL ANTIBODY ISOTYPING TEST KIT) 등)가 사용될 수 있다.
(3-2) 항-ROBO4 항체의 결합 특이성
본 발명의 항체는 ROBO4 단백질을 인식한다. 다시 말해, 본 발명의 항체는 ROBO4 단백질에 결합한다. 이러한 항체는 "항-ROBO4 항체"로서 지칭된다. 나아가, 본 발명의 바람직한 항체는 ROBO4 단백질을 특이적으로 인식한다. 다시 말해, 본 발명의 바람직한 항체는 ROBO4 단백질에 특이적으로 결합한다. 나아가, 본 발명의 보다 바람직한 항체는 ROBO4 단백질에 의해 보유된 Ig 유사 도메인에 특이적으로 결합한다. 이러한 Ig 유사 도메인의 예로는 Ig 유사 도메인 1 및 Ig 유사 도메인 2를 들 수 있다. 본 발명의 보다 바람직한 항체는 서열번호 2의 아미노산 번호 132 내지 209의 아미노산 서열로 구성된 영역을 인식한다. 본 발명의 항체는 인간 ROBO4 단백질, 원숭이, 바람직하게는 사이노몰구스 원숭이 ROBO4 단백질 및 토끼 ROBO4 단백질에 결합하지만, 마우스 ROBO4 단백질 및 래트 ROBO4 단백질에는 결합하지 않는다(실시예 4)-3 및 실시예 11)-4에서의 교차-종 반응성).
본 발명에서, "특이적 인식", 즉 "특이적 결합"은 비특이적 흡착이 아닌 결합을 의미한다. 결합이 특이적인지 아닌지를 결정하기 위한 기준의 예로는 해리 상수(이하, "KD"로서 지칭됨)를 들 수 있다. 본 발명의 바람직한 항체는 ROBO4 단백질에 대한 1 x 10-5 이하, 5 x 10-6 이하, 2 x 10-6 이하 또는 1 x 10-6 이하, 보다 바람직하게는 5 x 10-7 이하, 2 x 10-7 이하 또는 1 x 10-7 이하, 훨씬 더 바람직하게는 5 x 10-8 이하, 2 x 10-8 이하 또는 1 x 10-8 이하, 더욱 더 바람직하게는 5 x 10-9 이하, 2 x 10-9 이하 또는 1 x 10-9 이하, 가장 바람직하게는 5 x 10-10 이하, 2 x 10-10 이하 또는 1x10-10 이하의 KD 값을 갖는다. 보다 구체적으로, 본 발명의 바람직한 항체는 ROBO4 단백질에 대한 2 x 10-8 이하, 보다 바람직하게는 1 x 10-8 이하, 훨씬 더 바람직하게는 5 x 10-9 이하의 KD 값을 갖는다.
본 발명에서, 항체와 항원의 결합은 ELISA, RIA, 표면 플라스몬 공명(이하, "SPR"로서 지칭됨) 분석 등에 의해 분석될 수 있거나 측정될 수 있다. SPR 분석에서 이용된 장치의 예로는 (지이 헬쓰케어 바이오-사이언시스 코포레이션(GE Healthcare Bio-Sciences Corp.)에 의해 제조된) 비아코어(BIAcore)(TM), (바이오-라드 라보라토리스 인코포레이티드(Bio-Rad Laboratories, Inc.)에 의해 제조된) 프로테온(ProteOn)(TM), (바이오나비스 오이 리미티드(BioNavis Oy Ltd.)에 의해 제조된) SPR-나비(SPR-Navi)(TM), (텍사스 인스트루먼츠 인코포레이티드(Texas Instruments Inc.)에 의해 제조된) 스프레에타(Spreeta)(TM), (호리바 리미티드(Horiba, Ltd.)에 의해 제조된) SPRi-플렉스(Plex)II(TM) 및 (메트롬(Metrohm)에 의해 제조된) 오토랩(Autolab) SPR(TM)을 들 수 있다. 항체와 세포 표면 상에서 발현된 항원의 결합은 유동 세포측정(flow cytometry) 등에 의해 분석될 수 있다.
(3-3) 항-ROBO4 항체의 시험관내 항-혈관신생 활성
본 발명의 항체는 시험관내에서 교차-연결 항체의 부재 하에서 항-혈관신생 활성을 갖는다. 일부 항체들이 시험관내에서 교차-연결 항체의 부재 하에서 약리학적 활성을 나타내지 않지만 생체내에서는 교차-연결 항체의 부재 하에서 약리학적 활성을 나타낸다는 것이 공지되어 있다(Cancer Cell (2011), 19, p. 101-113). 이것은 아마도 백혈구가 생체내에서 교차-연결 항체의 기능과 동일한 기능을 갖는 Fcγ 수용체를 발현한다는 것이 발견되었기 때문일 것이므로(Nature (2008), 8, p. 34-47), 상기 항체들은 교차-연결 항체 없이도 백혈구의 존재 하에서 교차-연결을 통해 약리학적 활성을 나타낸다. 그러나, 실제 유기체에서 병변 내의 백혈구의 수는 개체들 사이에 상이하고(Cancer Res (2011), 71, 5670-5677), 아마도 이로 인해 백혈구에 의해 유도된 교차-연결에 의존하는 약리학적 활성을 나타내는 항체들의 효과가 개체들 사이에 상이하다. 본 발명의 항체는 시험관내에서 교차-연결 항체의 부재 하에서조차도 뛰어난 항-혈관신생 활성을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 항체는 생체내에서 백혈구의 수와 무관한 항-혈관신생 효과도 가질 수 있으므로 약학적으로 적합하다.
항-혈관신생 활성은 혈관 내피 세포 성장, 이동, 내강 형성 등을 억제하는 활성을 의미한다. 시험관내 항-혈관신생 활성은 혈관 투과성, 혈관 내피 세포 이동 또는 내강 형성 시험에 의해 평가될 수 있다.
예를 들면, 이러한 평가를 위한 혈관 투과성 시험은 1 ㎛의 공극 크기를 갖는 보이덴(Boyden) 챔버의 상층에 정상 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)를 접종하여 단일 층을 형성한 후, 상기 세포 층을 투과하는 FITC-표지부착된 덱스트란 등의 양을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 세포 층을 투과하는 FITC-표지부착된 덱스트란의 양은 예를 들면, 시험관내 혈관 투과성 분석(카탈로그 번호 ECM640, 밀리포어 코포레이션(Millipore Corp.)에 의해 제조됨)을 이용함으로써 측정될 수 있다. 5 ㎍/㎖ 이하의 농도로 첨가된 항체가 세포 층을 투과하는 FITC-표지부착된 덱스트란의 양을 억제하는 효과를 나타내는 경우, 이 항체는 혈관 투과성에 대한 억제 효과를 갖고 항-혈관신생 활성을 갖는 항체로서 평가될 수 있다. 본 발명의 항체는 전술된 측정 조건 하에서 바람직하게는 5 ㎍/㎖ 이하, 보다 바람직하게는 1 ㎍/㎖ 이하, 특히 바람직하게는 0.5 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 혈관 투과성에 대한 억제 활성을 나타낸다.
이러한 평가를 위한 세포 이동 시험은 3 내지 8 ㎛의 공극 크기를 갖는 보이덴 챔버의 상층에 HUVEC를 접종하는 단계, 내피 세포 이동 향상제, 예컨대, VEGF를 함유하는 배지를 하층에 첨가하는 단계, 및 하층으로 이동하는 세포의 수를 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 항체가 이동하는 HUVEC 세포의 수를 감소시키는 효과를 나타내는 경우, 이 항체는 혈관 내피 세포 이동에 대한 억제 효과를 갖고 항-혈관신생 활성을 갖는 항체로서 평가될 수 있다. 이동하는 세포의 수는 예를 들면, 혈관 내피 세포 이동 분석 시스템(카탈로그 번호 354143, 비디 바이오사이언시스(BD Biosciences)에 의해 제조됨)을 이용함으로써 측정될 수 있다. 본 발명의 항체는 바람직하게는 전술된 측정 조건 하에서 바람직하게는 5 ㎍/㎖ 이하, 보다 바람직하게는 1 ㎍/㎖ 이하, 특히 바람직하게는 0.5 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 세포 이동에 대한 억제 활성을 나타낸다.
이러한 평가를 위한 내강 형성 시험은 매트리겔(Matrigel)로 코팅된 세포 배양 용기에 HUVEC를 접종하는 단계 및 매트리겔 상에서 HUVEC에 의해 형성된 내강 구조의 분지점 수, 관 길이 등을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 항체가 내강 구조의 분지점 수 또는 관 길이를 감소시키는 효과를 나타내는 경우, 이 항체는 내강 형성에 대한 억제 효과를 갖고 항-혈관신생 활성을 갖는 항체로서 평가될 수 있다. 내강 구조의 분지점 수 또는 관 길이는 예를 들면, 혈관 내피 세포 관 형성 분석 시스템(카탈로그 번호 354149, 비디 바이오사이언시스에 의해 제조됨)을 이용함으로써 측정될 수 있다. 본 발명의 항체는 전술된 측정 조건 하에서 바람직하게는 5 ㎍/㎖ 이하, 보다 바람직하게는 1 ㎍/㎖ 이하, 특히 바람직하게는 0.5 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 내강 형성에 대한 억제 활성을 나타낸다.
그러나, 이러한 분석 시스템은, 이것이 ROBO4 단백질에 의해 유도된 혈관신생 및 그의 억제를 분석할 수 있는 한, 이들 시험들로 한정되지 않는다.
교차-연결 항체는 본 발명의 항체의 Fc 영역에 결합하고 2개 이상의 본 발명의 항체 분자들을 교차-연결하는 작용을 하는 항체를 의미한다. 예를 들면, 본 발명의 항체의 Fc 영역이 마우스로부터 유래된 경우, 교차-연결 항체는 마우스 Fc 영역에 결합하고 교차-연결 항체의 2개의 결합 부위들에서 이들 2개의 본 발명의 항체 분자들에 각각 결합함으로써 2개 이상의 본 발명의 항체 분자들을 회합시키는 항체를 지칭한다.
어구 "교차-연결 항체의 부재 하에서 항-혈관신생 활성을 갖는"은 항체가 심지어 교차-연결 항체와 공존하지 않는 상태에서도 혈관신생 억제에 대한 평가 시스템, 예를 들면, 전술된 평가 시스템에서 항-혈관신생 효과를 나타낸다는 것을 의미한다.
어구 "교차-연결 항체의 존재 하에서 항-혈관신생 활성을 갖는"은 항체가 혈관신생에 대한 평가 시스템, 예를 들면, 전술된 항-혈관신생 활성 평가 시스템에서 교차-연결 항체의 부재 하에서 항-혈관신생 활성을 나타내지 않지만, 1개의 본 발명의 항체 분자 당 하나 이상의 교차-연결 항체 분자(들), 바람직하게는 2개 이상의 교차-연결 항체 분자들과 공존할 때 항-혈관신생 활성을 나타낸다는 것을 의미한다.
(3-4) 혈관신생에 대한 항-ROBO4 항체의 생체내 억제 또는 저해 활성
본 발명의 항체는 생체내에서 혈관신생을 억제하거나 저해한다. 혈관신생에 대한 생체내 억제 또는 저해 활성은 표준 방법에 따라 동물 질환 모델을 사용함으로써 평가될 수 있다. 예를 들면, 하기 실시예 4)-6에 기재된 레이저-유도된 맥락막 혈관신생 모델이 혈관신생의 질환 모델로서 널리 사용되고, 새로 형성된 혈관의 양을 점수로서 평가하는 데에 사용될 수 있다. 또한, 환자의 경우, 예를 들면, 본 발명의 항체의 투여 전 및 후에 생검으로 종양 환자로부터 종양 샘플을 채취하고, 그의 종양내 혈관의 혈관 밀도를 면역조직화학적 분석(IHC)으로 측정하여 새로 형성된 혈관의 양을 점수화할 수 있다.
(3-5) 항-ROBO4 항체에 의한 다운스트림 신호의 활성화
ROBO4 단백질에 대한 일부 유도된 반응을 나타내는 세포주 또는 1차 배양된 세포를 사용하는 평가 시스템으로 본 발명의 항-ROBO4 항체를 평가할 수 있다. 이러한 세포주의 예로는 마우스 혈관 내피 세포주(ATCC 번호 CRL-2779)를 들 수 있다. 이러한 1차 배양된 세포의 예로는 마우스 혈관 내피 세포 및 인간 혈관 내피 세포를 들 수 있다.
본 발명의 항체는 ROBO4에 대한 작용제 항체이다. 구체적으로, 본 발명의 항체는 ROBO4에 결합하고 ROBO4의 다운스트림 신호를 활성화시킨다. 따라서, 본 발명의 항체의 항-혈관신생 효과는 ROBO4 다운스트림 신호의 활성화를 지표로서 사용함으로써 평가될 수 있다. ROBO4 다운스트림 신호의 예로는 IL-8 프로모터 활성을 들 수 있다. IL-8 프로모터 활성은 인간 ROBO4를 발현하지 않는 세포에 비해 전장 인간 ROBO4를 발현하는 세포에서 급격히 증가되었고, 세포내 도메인-결실된 인간 ROBO4를 발현하는 세포에서는 거의 관찰되지 않았다. 따라서, IL-8 프로모터 활성의 증가는 ROBO4 신호의 활성화가 검출되었다는 것을 입증하였다(실시예 3). IL-8 프로모터 활성은 예를 들면, IL-8 프로모터 서열 삽입체를 갖는 리포터 벡터 및 인간 ROBO4 발현 플라스미드로 형질감염된 세포에 항-ROBO4 항체를 첨가하거나 항-ROBO4 항체 및 교차-연결 항체를 함께 첨가한 후 리포터 활성을 측정함으로써 평가될 수 있다.
(3-6) 항-ROBO4 마우스 단일클론 항체 및 키메라 항체
MAb1은 실시예 2에 기재된 방법에 의해 수득된 항-ROBO4 마우스 단일클론 항체이다.
MAb1의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 30(도 15)에 제시되어 있고, 그의 아미노산 서열은 서열번호 31(도 16)에 제시되어 있다. CDRH1의 아미노산 서열은 서열번호 44(도 25)에 제시되어 있고, CDRH2의 아미노산 서열은 서열번호 46(도 26)에 제시되어 있고, CDRH3의 아미노산 서열은 서열번호 48(도 27)에 제시되어 있다. MAb1의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 32(도 17)에 제시되어 있고, 그의 아미노산 서열은 서열번호 33(도 18)에 제시되어 있다. CDRL1의 아미노산 서열은 서열번호 50(도 28)에 제시되어 있고, CDRL2의 아미노산 서열은 서열번호 52(도 29)에 제시되어 있고, CDRL3의 아미노산 서열은 서열번호 54(도 30)에 제시되어 있다.
본 발명의 항체 돌연변이체는 바람직하게는 단백질 분해 또는 산화에 대한 감소된 민감성, 개선된 생물학적 활성, 항원에 결합하는 개선된 능력, 또는 그에 부여된 물리화학적 또는 기능적 성질 등을 나타낸다. 이러한 항체 돌연변이체의 예로는 보존적 아미노산 치환에 의해 원래의 항체의 아미노산 서열로부터 유도된 아미노산 서열을 갖는 항체를 들 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 측쇄와 관련된 아미노산 기에서 일어나는 치환이다.
바람직한 아미노산 기는 다음과 같다: 아스파르트산 및 글루탐산을 포함하는 산성 기; 라이신, 아르기닌 및 히스티딘을 포함하는 염기성 기; 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌 및 트립토판을 포함하는 비극성 기; 및 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 쓰레오닌 및 티로신을 포함하는 비하전된 극성 패밀리. 다른 바람직한 아미노산 기는 다음과 같다: 세린 및 쓰레오닌을 포함하는 지방족 하이드록시 기; 아스파라긴 및 글루타민을 포함하는 아미드 함유 기; 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신을 포함하는 지방족 기; 및 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신을 포함하는 방향족 기. 항체 돌연변이체에서 이러한 아미노산 치환은 바람직하게는 원래의 항체의 항원 결합 활성을 감소시키지 않으면서 수행된다.
보존적 아미노산 치환에 의해 본 발명의 MAb1의 아미노산 서열로부터 유도된 아미노산 서열을 갖는 항체 돌연변이체뿐만 아니라, 보존적 아미노산 돌연변이에 의해 MAb1 유래의 CDRH1 내지 CDRH3 및 CDRL1 내지 CDRL3 중 임의의 CDR의 아미노산 서열로부터 유도된 CDR 아미노산 서열을 포함하는 마우스 항체, 래트 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체, 인간 항체 등도 본 발명에 의해 포괄된다.
본 발명의 항체의 불변 영역은 특별히 한정되지 않는다. 바람직하게는, 인간 항체로부터 유래된 불변 영역은 인간에서 질환을 치료하거나 예방하기 위한 본 발명의 항체에서 사용된다. 인간 항체의 중쇄 불변 영역의 예로는 Cγ1, Cγ2, Cγ3, Cγ4, Cμ, Cδ, Cα1, Cα2 및 Cε을 들 수 있다. 인간 항체의 경쇄 불변 영역의 예로는 Cκ 및 Cλ를 들 수 있다.
본 발명의 마우스-인간 IgG1형 키메라 항체로서 예시된 cMAb1-1의 분비 신호 함유 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 그의 아미노산 서열뿐만 아니라, 그의 중쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 그의 아미노산 서열도 각각 서열번호 37, 38, 39 및 40(도 19, 20, 21 및 22)에 제시되어 있다. 마찬가지로, 본 발명의 마우스-인간 IgG2형 키메라 항체로서 예시된 cMAb1-2의 분비 신호 함유 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 그의 아미노산 서열뿐만 아니라, 그의 중쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 그의 아미노산 서열도 각각 서열번호 37, 38, 41 및 42(도 19, 20, 23 및 24)에 제시되어 있다.
(3-7) 항-ROBO4 항체의 기능성 단편
한 양태에 따라, 본 발명은 본 발명의 항-ROBO4 항체의 기능성 단편을 제공한다. 상기 항체의 기능성 단편은 상기 항체의 기능의 적어도 일부를 유지하는 단편, 또는 하기 (3-10)에 기재된 그의 변경된 형태를 의미한다. 항체의 이러한 기능의 예로는 일반적으로 항원 결합 활성, 항원 활성 조절 활성, 항체 의존적 세포독성 활성 및 보체 의존적 세포독성 활성을 들 수 있다. 본 발명의 항-ROBO4 항체의 기능의 예로는 ROBO4 단백질 결합 활성, 항-혈관신생 활성 및 ROBO4 다운스트림 신호 활성화 효과를 들 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 ROBO4에 대한 항체에 의해 나타나는 전술된 활성 (3-3) 내지 (3-5)의 전부 또는 일부를 갖는 임의의 기능성 단편이 본 발명의 항체의 기능성 단편에 포함된다.
항체의 기능성 단편은, 이것이 항체의 활성의 적어도 일부를 유지하는 항체의 단편 또는 그의 변경된 형태인 한, 특별히 한정되지 않는다. 그의 예로는 Fab, F(ab')2, Fv, 적절한 연결제를 통해 연결된 중쇄 및 경쇄 Fv들을 포함하는 단일 쇄 Fv(scFv), 디아바디(diabodies), 선형 항체, 항체 단편들로부터 형성된 다중특이적 항체, 및 환원 조건 하에서 F(ab')2의 처리에 의해 수득된 항체 가변 영역의 1가 단편인 Fab'를 들 수 있으나 이들로 한정되지 않는다. 연결제 모이어티(moiety)를 보유하는 scFv와 같이 본 발명의 항체의 단편 이외의 모이어티를 함유하는 분자도 본 발명의 항체의 기능성 단편의 의미에 포함된다.
그의 아미노 말단 및/또는 카복시 말단에서 1개 내지 수개 이상의 아미노산(들)의 결실에 의해 항체 단백질로부터 유도되고 항체의 기능의 적어도 일부를 유지하는 분자도 본 발명의 항체의 기능성 단편의 의미에 포함된다.
본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편은 2종 이상의 상이한 항원들에 대한 특이성을 갖는 다중특이적 항체일 수 있다. 다중특이적 항체는 2종의 상이한 항원들에 결합하는 이중특이적 항체로 한정되지 않고, 3종 이상의 상이한 항원들에 대한 특이성을 갖는 항체도 본 발명의 "다중특이적 항체"의 의미에 포함된다.
본 발명의 다중특이적 항체는 전장 항체 또는 그의 기능성 단편(예를 들면, 이중특이적 F(ab')2 항체)일 수 있다. 이중특이적 항체는 2종의 항체들의 중쇄와 경쇄(HL 쌍)를 결합시킴으로써 제조될 수도 있다. 이중특이적 항체는 2종 이상의 단일클론 항체 생성 하이브리도마들을 융합시켜 이중특이적 항체 생성 융합 세포를 제조함으로써 수득될 수도 있다(Millstein et al., Nature (1983) 305, p. 537-539). 다중특이적 항체도 전술된 방식과 동일한 방식으로 제조될 수 있다.
한 양태에 따라, 본 발명의 항체는 단일 쇄 항체(단일 쇄 Fv; 이하, "scFv"로서 지칭됨)이다. scFv는 폴리펩티드 연결제를 통해 항체의 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역을 연결함으로써 수득된다(Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 113, ed Rosenburg and Moore, Springer Verlag, New York, p.269-315 (1994), Nature Biotechnology (2005), 23, p.1126-1136). 나아가, 폴리펩티드 연결제를 통해 연결된 2개의 scFv들을 포함하는 2가 scFv가 이중특이적 항체로서 사용될 수 있다. 더욱이, 3개 이상의 scFv들을 포함하는 다가 scFv도 다중특이적 항체로서 사용될 수 있다.
본 발명은 적절한 연결제를 통해 연결된 항체의 전장 중쇄 서열 및 경쇄 서열을 포함하는 단일 쇄 면역글로불린을 포함한다(Lee, H-S, et. al., Molecular Immunology (1999) 36, p.61-71; Shirrmann, T. et. al., mAbs (2010), 2, (1) p.1-4). 이러한 단일 쇄 면역글로불린은 이량체화됨으로써, 원래 사량체인 항체의 구조 및 활성과 유사한 구조 및 활성을 유지할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 단일 중쇄 가변 영역을 갖고 경쇄 서열을 갖지 않는 항체일 수 있다. 이러한 항체는 단일 도메인 항체(sdAb) 또는 나노바디(nanobody)로서 지칭되고 항원에 결합하는 능력을 유지한다고 보고되어 있다(Muyldemans S. et. al., Protein Eng. (1994) 7 (9), 1129-35, Hamers-Casterman C. et. al., Nature (1993) 363 (6428) 446-8). 이들 항체들도 본 발명에 따른 항체의 기능성 단편의 의미에 포함된다.
(3-8) 항-인간 ROBO4 인간화된 항체(이하, "항-ROBO4 인간화된 항체")
한 양태에 따라, 본 발명은 인간화된 항체 또는 그의 기능성 단편을 제공한다. 본 발명의 항-ROBO4 인간화된 항체 또는 그의 기능성 단편은 항-혈관신생 활성을 갖고 바람직하게는 생체내에서 항-혈관신생 활성을 갖는다. 바람직하게는, 상기 인간화된 항체 또는 그의 기능성 단편은 ROBO4 단백질에 특이적으로 결합한다. 나아가, 상기 인간화된 항체 또는 그의 기능성 단편은 ROBO4에 대한 작용제 항체이고 그의 다운스트림 신호를 활성화시킨다. 나아가, 상기 인간화된 항체 또는 그의 기능성 단편은 시험관내에서 교차-연결 항체의 부재 하에서 혈관 내피 세포 이동을 억제하거나 저해한다.
본 발명의 인간화된 항체의 예로는 비인간 동물 항체의 상보성 결정 영역들(CDR들)로 치환된 MAb1 CDR들을 갖는 인간 유래의 항체(문헌(Nature (1986) 321, p. 522-525) 참조), 및 CDR 이식 방법(국제 특허출원 공보 제WO90/07861호)에 의해 CDR 서열 및 골격 영역의 일부 아미노산 잔기들을 이식받은 인간 항체를 들 수 있다. 나아가, 각각의 CDR 내의 1개 내지 3개 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환됨으로써 인간화된 항체로부터 유도된 변이체도, 이 변이체가 활성 (3-3) 내지 (3-5)의 전부 또는 일부를 갖는 한, 본 발명의 항체에 포함된다.
본 발명의 항-ROBO4 인간화된 항체 또는 그의 기능성 단편의 바람직한 예로는 서열번호 44(도 25)로 표시된 아미노산 서열로 구성된 CDRH1, 서열번호 46(도 26)으로 표시된 아미노산 서열 또는 1개의 아미노산의 치환에 의해 서열번호 46의 아미노산 서열로부터 유도된 아미노산 서열로 구성된 CDRH2 및 서열번호 48(도 27)로 표시된 아미노산 서열로 구성된 CDRH3을 포함하는 가변 영역을 갖는 중쇄, 및 서열번호 50(도 28)으로 표시된 아미노산 서열 또는 1개 내지 3개의 아미노산(들)의 치환에 의해 서열번호 50의 아미노산 서열로부터 유도된 아미노산 서열로 구성된 CDRL1, 서열번호 52(도 29)로 표시된 아미노산 서열로 구성된 CDRL2 및 서열번호 54(도 30)로 표시된 아미노산 서열로 구성된 CDRL3을 포함하는 가변 영역을 갖는 경쇄로 구성되고 본 발명의 ROBO4 단백질을 인식하는 항체; 및 이 항체의 ROBO4 단백질 결합 활성을 유지하는 항체의 분획을 들 수 있다.
CDRH2에서의 아미노산 치환의 예로는 CDRH2에서 서열번호 46의 아미노산 4로 표시된 아미노산의 치환을 들 수 있다. 구체적으로, 서열번호 46의 아미노산 4인 아스파라긴은 글루타민으로 치환될 수 있다. 발생된 항체가 본 발명의 ROBO4에 대한 항체에 의해 나타나는 활성 (3-3) 내지 (3-5)의 전부 또는 일부를 갖는 한, 치환될 아미노산은 한정되지 않는다.
CDRL1에서의 아미노산 치환의 예로는 CDRL1에서 서열번호 50의 아미노산 9, 11 및 13으로 표시된 아미노산들 중 임의의 1개 내지 3개, 바람직하게는 3개 아미노산의 치환을 들 수 있다. 구체적으로, 서열번호 50의 세린(아미노산 9), 글리신(아미노산 11) 및 쓰레오닌(아미노산 13)은 글루탐산, 라이신 및 류신으로부터 선택된 아미노산, 바람직하게는 각각 글루탐산, 라이신 및 류신으로 치환될 수 있다. 발생된 항체가 본 발명의 ROBO4에 대한 항체에 의해 나타나는 활성 (3-3) 내지 (3-5)의 전부 또는 일부를 갖는 한, 치환될 아미노산(들)은 한정되지 않는다.
펩티드 또는 단백질 내의 아스파라긴 잔기는 일부 조건에서 탈아미드화를 용이하게 겪는다고 보고되어 있으므로(Gerger et al: The Journal of Biological Chemistry Vol.262 No.2, 785-794, 1987), 전술된 CDR들에서의 아미노산 치환은 본 발명의 인간화된 항체의 안정성을 증가시킬 수 있다.
이들 CDRH들을 갖는 보다 바람직한 인간화된 항체의 중쇄 가변 영역의 예로는 서열번호 56(도 32)의 아미노산 번호 20 내지 137로 표시된 아미노산 서열(이때, CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열번호 56(도 32)의 아미노산 번호 50 내지 54, 69 내지 85 및 118 내지 126으로 표시됨), 서열번호 58(도 34)의 아미노산 번호 20 내지 137로 표시된 아미노산 서열(이때, CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열번호 58(도 34)의 아미노산 번호 50 내지 54, 69 내지 85 및 118 내지 126으로 표시됨), 서열번호 60(도 36)의 아미노산 번호 20 내지 137로 표시된 아미노산 서열(이때, CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열번호 60(도 36)의 아미노산 번호 50 내지 54, 69 내지 85 및 118 내지 126으로 표시됨), 및 서열번호 62(도 38)의 아미노산 번호 20 내지 137로 표시된 아미노산 서열(이때, CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열번호 62(도 38)의 아미노산 번호 50 내지 54, 69 내지 85 및 118 내지 126으로 표시됨)을 들 수 있다. 이들 CDRL들을 갖는 보다 바람직한 인간화된 항체의 경쇄 가변 영역의 예로는 서열번호 64(도 40)의 아미노산 번호 21 내지 134로 표시된 아미노산 서열(이때, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3은 각각 서열번호 64(도 40)의 아미노산 번호 44 내지 59, 75 내지 81 및 114 내지 122로 표시됨), 및 서열번호 66(도 42)의 아미노산 번호 21 내지 134로 표시된 아미노산 서열(이때, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3은 각각 서열번호 66(도 42)의 아미노산 번호 44 내지 59, 75 내지 81 및 114 내지 122로 표시됨)을 들 수 있다.
보다 바람직한 인간화된 항체의 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역의 보다 바람직한 조합의 예로는 하기 조합들을 들 수 있다: 서열번호 58(도 34)의 아미노산 번호 20 내지 137로 표시된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 64(도 40)의 아미노산 번호 21 내지 134로 표시된 아미노산 서열로 구성된 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간화된 항체; 서열번호 58(도 34)의 아미노산 번호 20 내지 137로 표시된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 가변 영역 및 서열번호 66(도 42)의 아미노산 번호 21 내지 134로 표시된 아미노산 서열로 구성된 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간화된 항체; 서열번호 62(도 38)의 아미노산 잔기 20 내지 137로 표시된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 가변 영역 및 서열번호 66(도 42)의 아미노산 번호 21 내지 134로 표시된 아미노산 서열로 구성된 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간화된 항체; 서열번호 62(도 38)의 아미노산 번호 20 내지 137로 표시된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 가변 영역 및 서열번호 64(도 40)의 아미노산 번호 21 내지 134로 표시된 아미노산 서열로 구성된 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간화된 항체; 서열번호 56(도 32)의 아미노산 번호 20 내지 137로 표시된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 가변 영역 및 서열번호 64(도 40)의 아미노산 번호 21 내지 134로 표시된 아미노산 서열로 구성된 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간화된 항체; 및 서열번호 60(도 36)의 아미노산 번호 20 내지 137로 표시된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 가변 영역 및 서열번호 64(도 40)의 아미노산 번호 21 내지 134로 표시된 아미노산 서열로 구성된 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간화된 항체.
중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역의 보다 바람직한 조합을 포함하는 전장 인간화된 항체의 훨씬 더 바람직한 예로는 하기 인간화된 항체들을 들 수 있다: 서열번호 58(도 34)의 아미노산 번호 20 내지 463으로 표시된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 및 서열번호 64(도 40)의 아미노산 번호 21 내지 239로 표시된 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 포함하는 인간화된 항체(H-1140); 서열번호 58(도 34)의 아미노산 번호 20 내지 463으로 표시된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 및 서열번호 66(도 42)의 아미노산 번호 21 내지 239로 표시된 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 포함하는 인간화된 항체(H-1143); 서열번호 62(도 38)의 아미노산 번호 20 내지 463으로 표시된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 및 서열번호 66(도 42)의 아미노산 번호 21 내지 239로 표시된 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 포함하는 인간화된 항체(H-2143); 서열번호 62(도 38)의 아미노산 번호 20 내지 463으로 표시된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 및 서열번호 64(도 40)의 아미노산 번호 21 내지 239로 표시된 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 포함하는 인간화된 항체(H-2140); 서열번호 56(도 32)의 아미노산 번호 20 내지 463으로 표시된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 및 서열번호 64(도 40)의 아미노산 번호 21 내지 239로 표시된 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 포함하는 인간화된 항체(H-1040); 및 서열번호 60(도 36)의 아미노산 번호 20 내지 463으로 표시된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 및 서열번호 64(도 40)의 아미노산 번호 21 내지 239로 표시된 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 포함하는 인간화된 항체(H-2040).
본 발명의 가장 바람직한 항체는 H-1140, H-1143, H-2140 및 H-2143이다.
H-1140은 1) 인간 ROBO4에 특이적으로 결합하고 ROBO1, ROBO2 및 ROBO3에는 결합하지 않는 성질, 2) 인간 ROBO4에 대한 3.9 nM의 KD 값을 갖는 성질, 3) 4주 동안 40℃ 하에서 인간 ROBO4에 대한 친화성을 유지하는 성질, 4) VEGF, bFGF, HGF, PDGF-BB 및 SDF-1로부터 선택된 하나 이상의 혈관신생 인자, 특히 VEGF 또는 bFGF에 의해 유도된 HUVEC 이동을 억제하는 성질, 5) 생체내에서 혈관신생을 억제하는 성질, 및 6) ISPRI 웹에 기초한 면역원성 스크리닝(에피백스 인코포레이티드(EpiVax, Inc.))에서 낮은 면역원성을 나타내는 성질을 갖는다.
H-1143은 1) 인간 ROBO4에 특이적으로 결합하고 ROBO1, ROBO2 및 ROBO3에는 결합하지 않는 성질, 2) 인간 ROBO4에 대한 3.5 nM의 KD 값을 갖는 성질, 3) 4주 동안 40℃ 하에서 인간 ROBO4에 대한 친화성을 유지하는 성질, 4) VEGF, bFGF, HGF, PDGF-BB 및 SDF-1, 특히 VEGF 및 bFGF로부터 선택된 하나 이상의 혈관신생 인자에 의해 유도된 HUVEC 이동을 억제하는 성질, 5) 생체내에서 혈관신생을 억제하는 성질, 및 6) 에피스크린(EpiScreen)TM 면역원성 시험(안티토프 리미티드(Antitope Ltd.))에서 낮은 면역원성을 나타내는 성질을 갖는다.
H-2140은 1) 인간 ROBO4에 특이적으로 결합하고 ROBO1, ROBO2 및 ROBO3에는 결합하지 않는 성질, 2) 인간 ROBO4에 대한 1.8 nM의 KD 값을 갖는 성질, 3) 4주 동안 40℃ 하에서 인간 ROBO4에 대한 친화성을 유지하는 성질, 4) 다양한 혈관신생 인자들, 예컨대, VEGF, bFGF, HGF, PDGF-BB 및 SDF-1, 특히 VEGF 및 bFGF에 의해 유도된 HUVEC 이동을 억제하는 성질, 5) 생체내에서 혈관신생을 억제하는 성질, 및 6) 에피스크린TM 면역원성 시험(안티토프 리미티드)에서 낮은 면역원성을 나타내는 성질을 갖는다.
H-2143은 1) 인간 ROBO4에 특이적으로 결합하고 ROBO1, ROBO2 및 ROBO3에는 결합하지 않는 성질, 2) 인간 ROBO4에 대한 1.7 nM의 KD 값을 갖는 성질, 3) 4주 동안 40℃ 하에서 인간 ROBO4에 대한 친화성을 유지하는 성질, 4) 다양한 혈관신생 인자들, 예컨대, VEGF, bFGF, HGF, PDGF-BB 및 SDF-1, 특히 VEGF 및 bFGF에 의해 유도된 HUVEC 이동을 억제하는 성질, 5) 생체내에서 혈관신생을 억제하는 성질, 6) 에피스크린TM 면역원성 시험(안티토프 리미티드)에서 낮은 면역원성을 나타내는 성질, 및 7) 사이노몰구스 원숭이에게의 단회 유리체내 주사(2.75 mg/눈) 후 임상 징후, 체중, 음식물 소비, 혈액학, 혈액 화학, 병리학 또는 망막전도기록에서 심각한 변화를 보이지 않는 성질을 갖는다.
항체, 예컨대, H-1140, H-1143, H-2143, H-2140, H-1040 및 H-2040의 아미노산 서열에 대한 95% 이상, 바람직하게는 97% 이상, 보다 바람직하게는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항체도, 이 항체가 활성 (3-3) 내지 (3-5)의 전부 또는 일부를 갖는 한, 본 발명의 항체에 포함된다. 더욱이, 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역의 조합을 포함하는 상기 항체 또는 중쇄와 경쇄의 조합을 포함하는 상기 항체의 CDR들과 아미노산 서열 면에서 동일한 CDR들을 갖고, 그에 대한 95% 이상, 바람직하게는 97% 이상, 보다 바람직하게는 99% 이상의 동일성을 갖는 CDR 아미노산 서열 이외의 아미노산 서열을 갖는 항체도, 이 항체가 활성 (3-3) 내지 (3-5)의 전부 또는 일부를 갖는 한, 본 발명의 항체에 포함된다.
(3-9) 동일한 부위에 결합하는 항체
본 발명에 의해 제공된 항체에 의해 결합되는 부위와 "동일한 부위에 결합하는 항체"도 본 발명의 항체에 포함된다. 특정 항체에 의해 결합되는 부위와 "동일한 부위에 결합하는 항체"는 이 항체에 의해 인식되는 항원 분자 상의 부위에 결합하는 또 다른 항체를 의미한다. 제2 항체가 제1 항체에 의해 결합되는 항원 분자 상의 부분 펩티드 또는 부분 3차원 구조에 결합하는 경우, 제1 항체 및 제2 항체는 동일한 부위에 결합한다는 결론을 내릴 수 있다. 나아가, 심지어 특이적 결합 부위의 펩티드 서열 또는 3차원 구조가 결정되지 않은 경우에도 제2 항체가 항원과의 결합에 대해 제1 항체와 경쟁한다는 것, 즉 제2 항체가 제1 항체와 항원의 결합을 방해한다는 것을 확인함으로써 제1 항체 및 제2 항체가 동일한 부위에 결합한다는 결론을 내릴 수 있다. 나아가, 제1 항체 및 제2 항체가 동일한 부위에 결합하고 제1 항체가 본 발명의 항체의 한 양태의 특징적인 효과, 예컨대, 항-혈관신생 활성을 갖는 경우, 제2 항체도 그와 동일한 활성을 가질 확률이 극도로 높다. 따라서, 제2 항-ROBO4 항체가 제1 항-ROBO4 항체에 의해 결합되는 부위에 결합하는 경우, 제1 항체 및 제2 항체는 ROBO4 단백질 상의 동일한 부위에 결합한다는 결론을 내릴 수 있다. 나아가, 제2 항-ROBO4 항체가 ROBO4 단백질과의 결합에 대해 제1 항-ROBO4 항체와 경쟁한다는 것을 확인함으로써 제1 항체 및 제2 항체가 ROBO4 단백질 상의 동일한 부위에 결합하는 항체라는 결론을 내릴 수 있다.
본 발명의 MAb1에 의해 인식되는 ROBO4 단백질 상의 부위에 결합하는 항체도 본 발명에 포함된다.
항체 결합 부위는 당업자에게 잘 공지된 방법, 예컨대, 면역분석에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 일련의 펩티드들을 항원의 아미노산 서열의 적절한 C-말단 또는 N-말단 절두로 제조하고, 그에 대한 항체의 반응성을 연구하여 인식 부위를 대략적으로 결정한다. 그 다음, 보다 짧은 펩티드들을 합성하고 이들 펩티드들에 대한 항체의 반응성을 연구하여 결합 부위를 결정할 수 있다. 유전자 재조합 또는 펩티드 합성과 같은 기법을 이용하여 항원 단편 펩티드를 제조할 수 있다.
항체가 항원의 부분 입체구조에 결합하거나 이러한 부분 입체구조를 인식하는 경우, X-선 구조 분석을 이용하여 상기 항체에 인접한 항원 상의 아미노산 잔기를 확인함으로써 상기 항체에 대한 결합 부위를 결정할 수 있다.
(3-10) 항-ROBO4 항체의 변경된 형태 또는 그의 기능성 단편
본 발명은 항체 또는 그의 기능성 단편의 변경된 형태를 제공한다. 본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편의 변경된 형태는 화학적 또는 생물학적 변경을 구비한 본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편을 의미한다. 화학적으로 변경된 형태는 화학적 모이어티와 접합된 아미노산 골격을 갖는 형태, 화학적으로 변경된 N-연결된 또는 O-연결된 탄수화물 쇄를 갖는 형태 등을 포함한다. 상기 화학적 모이어티 또는 형태는 독성 또는 세포독성을 나타낼 수 있다. 생물학적으로 변경된 형태는 번역 후 변경(예를 들면, N-연결된 또는 O-연결된 글리코실화, N-말단 또는 C-말단 프로세싱, 탈아미드화, 아스파르트산의 이성질체화 또는 메티오닌의 산화)을 겪은 형태, 원핵 숙주 세포를 사용한 발현에 의해 N-말단에 추가된 메티오닌 잔기를 함유하는 형태 등을 포함한다. 이러한 변경된 형태는 본 발명의 항체 또는 항원의 검출 또는 단리를 허용하도록 표지부착된 형태, 예를 들면, 효소-표지부착된 형태, 형광-표지부착된 형태 또는 친화성-표지부착된 형태도 포함하기 위한 것이다. 본 발명의 항체의 이러한 변경된 형태 또는 그의 기능성 단편은 본 발명의 원래의 항체 또는 그의 기능성 단편의 안정성 또는 혈액 체류의 개선, 항원성의 감소, 항체 또는 항원의 검출 또는 단리 등에 유용하다.
화학적으로 변경된 형태에 함유된 화학적 모이어티의 예로는 수용성 중합체, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜 공중합체, 카복시메틸셀룰로스, 덱스트란 및 폴리비닐 알코올을 들 수 있다.
생물학적으로 변경된 형태의 예로는 효소 처리, 세포 처리 등에 의해 변경된 형태, 유전자 재조합에 의해 추가된 또 다른 펩티드, 예컨대, 태그와 융합된 형태, 및 내재성 또는 외재성 당쇄 변경 효소를 발현하는 숙주 세포로부터 제조된 형태를 들 수 있다.
이러한 변경은 항체 또는 그의 기능성 단편 내의 임의 위치 또는 원하는 위치에서 만들어질 수 있다. 대안적으로, 동일한 또는 2개 이상의 상이한 변경들이 항체 또는 그의 기능성 단편 내의 1개 또는 2개 이상의 위치에서 만들어질 수 있다.
본 발명에서, "항체 단편의 변경된 형태"는 심지어 "항체의 변경된 형태의 단편"도 포함하기 위한 것이다.
예를 들면, 종종, 배양된 포유동물 세포에 의해 생성된 항체는 그의 중쇄에서 카복실-말단 라이신 잔기를 결여한다는 것이 공지되어 있다(Journal of Chromatography A, 705: 129-134 (1995)). 종종 중쇄의 2개 카복실-말단 아미노산 잔기들(즉, 글리신 및 라이신)이 결여되고 카복실-말단에 새로 위치하는 프롤린 잔기가 아미드화된다는 것도 공지되어 있다(Analytical Biochemistry, 360: 75-83 (2007)). 그러나, 이들 중쇄 서열들에서의 이러한 결여 또는 변경은 항체가 그의 항원에 결합하는 능력에 영향을 미치지 않고 항체의 이펙터 기능(보체 활성화, 항체 의존적 세포독성 등)에도 영향을 미치지 않는다. 따라서, 변경을 갖는 항체 및 이 항체의 기능성 단편도 본 발명의 항체에 포함된다. 이러한 항체의 예로는 중쇄의 카복실-말단에서 1개 또는 2개의 아미노산(들)이 결실되거나 결여됨으로써 본 발명의 항체로부터 유도된 결실 돌연변이체, 및 아미드화된 잔기(예를 들면, 중쇄의 카복실-말단 부위에서 아미드화된 프롤린 잔기)를 갖는 결실 돌연변이체를 들 수 있다. 그러나, 본 발명에 따른 항체의 결실 돌연변이체는, 이 결실 돌연변이체가 항원에 결합하는 능력 및 활성 (3-3) 내지 (3-5)의 전부 또는 일부를 유지하는 한, 전술된 종류들로 한정되지 않는다. 본 발명에 따른 항체를 구성하는 2개의 중쇄들은 전장 중쇄 및 결실 돌연변이체의 중쇄로 구성된 군으로부터 선택된 임의의 1종의 중쇄로 구성될 수 있거나, 이들로부터 선택된 임의의 2종의 중쇄들의 조합으로 구성될 수 있다. 결실 변이체 중쇄(들)의 정량적 비는 예를 들면, 본 발명에 따른 항체를 생성하는 배양된 포유동물 세포의 종류, 및 세포의 배양 조건에 민감하다. 본 발명에 따른 항체의 주성분으로서 이러한 결실 변이체 중쇄의 예로는 둘다가 1개의 카복실-말단 아미노산 잔기를 결여하는 2개의 중쇄들을 들 수 있다. 이들 결실 변이체들의 전부가 본 발명에 따른 항체 변이체, 항체의 기능성 단편 또는 그의 변경된 형태에 포함된다.
4. 항체의 제조 방법
(4-1) 하이브리도마를 사용하는 방법
본 발명의 항-ROBO4 항체를 제조하기 위해, 문헌(Kohler and Milstein, Nature (1975) 256, p.495-497, Kennet, R. ed., Monoclonal Antibody, p.365-367, Prenum Press, N. Y. (1980))의 방법에 따라 ROBO4 단백질로 면역화된 동물의 비장으로부터 항-ROBO4 항체 생성 세포를 단리한다. 상기 세포를 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마를 확립하고, 이들 하이브리도마의 배양물로부터 단일클론 항체를 수득할 수 있다.
(4-1-1) 항원의 제조
항-ROBO4 항체의 제조를 위한 항원은 예를 들면, 본 명세서의 다른 단락들에 기재된 천연 또는 재조합 ROBO4 단백질 제조 방법에 따라 수득될 수 있다. 이로써 제조될 수 있는 항원의 예로는 ROBO4 단백질, 또는 그의 6개 이상의 연속 아미노산을 갖는 부분 서열을 포함하는 ROBO4 단백질 단편, 및 그에 추가된 임의 아미노산 서열 또는 담체를 추가로 포함하는 그들의 유도체를 들 수 있다(이하, "ROBO4 항원"으로서 총칭됨).
재조합 ROBO4 항원은 ROBO4 항원의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자로 숙주 세포를 형질감염시키고 상기 세포의 배양물로부터 상기 항원을 수집함으로써 제조될 수 있다. 천연 ROBO4 항원은 예를 들면, 혈관신생을 갖는 인간 또는 설치류 조직, 이 조직으로부터 유래된 세포 또는 이 세포의 배양물로부터 정제될 수 있거나 단리될 수 있다. 세포 무함유 시험관내 번역 시스템에서 ROBO4 항원의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자로부터 수득된 ROBO4 항원도 본 발명의 "ROBO4 항원"에 포함된다.
(4-1-2) 항-ROBO4 단일클론 항체의 제조
상기 단일클론 항체는 전형적으로 하기 단계들에 의해 제조된다:
(a) 항원을 제조하는 단계,
(b) 항체 생성 세포를 제조하는 단계,
(c) 골수종 세포(이하, "골수종"으로서 지칭됨)를 제조하는 단계,
(d) 상기 항체 생성 세포를 골수종과 융합시키는 단계,
(e) 관심있는 항체를 생성하는 하이브리도마 군에 대해 스크리닝하는 단계, 및
(f) 단일 세포 클론을 수득하는 단계(클로닝).
이 제조 방법은 필요한 경우 (g) 하이브리도마를 배양하는 단계, 하이브리도마가 이식된 동물을 발생시키는 단계 등, (h) 단일클론 항체의 생물학적 활성을 분석하거나 측정하는 단계 등을 추가로 포함한다.
이하, 단일클론 항체의 제조 방법은 이들 단계들과 관련하여 상세히 기재될 것이다. 그러나, 상기 항체의 제조 방법은 이들로 한정되지 않고, 예를 들면, 비장 세포 및 골수종 이외의 항체 생성 세포가 사용될 수 있다.
(a) 항원을 제조하는 단계
상기 (2-3)에 기재된 ROBO4 단백질 제조 방법에 따라 항원을 제조할 수 있다.
(b) 항체 생성 세포를 제조하는 단계
단계 (a)에서 수득된 항원을 항원보강제, 예컨대, 프로인트 완전 또는 불완전 항원보강제 또는 황산알루미늄칼륨과 혼합하고, 실험 동물을 발생된 면역원으로 면역화시킨다. 당분야에서 공지된 하이브리도마 제조 방법에서 사용된 임의의 실험 동물이 제한 없이 사용될 수 있다. 구체적으로, 예를 들면, 마우스, 래트, 염소, 양, 소 또는 말이 사용될 수 있다. 단리된 항체 생성 세포 등과 융합될 용이하게 입수가능한 골수종 세포의 관점에 비추어 볼 때 면역화될 동물은 바람직하게는 마우스 또는 래트이다.
실제로 사용되는 마우스 및 래트 품종은 특별히 한정되지 않는다. 마우스의 경우, 예를 들면, A, AKR, BALB/c, BALB/cAnNCrj, BDP, BA, CE, C3H, 57BL, C57BL, C57L, DBA, FL, HTH, HT1, LP, NZB, NZW, RF, R III, SJL, SWR, WB 또는 129가 사용될 수 있다. 래트의 경우, 예를 들면, 위스타(Wistar), 로우(Low), 르위스(Lewis), 스프라그-다울리(Sprague-Dawley), ACI, BN 또는 피셔(Fischer)가 사용될 수 있다.
이들 마우스 및 래트는 실험 동물 사육소/분양소, 예를 들면, 클레아 재팬 인코포레이티드(CLEA Japan, Inc.) 또는 찰스 리버 라보라토리스 재팬 인코포레이티드(Charles River Laboratories Japan Inc.)로부터 입수될 수 있다.
이들 중 BALB/c 마우스 품종 또는 위스타 및 로우 래트 품종이 후술된 골수종 세포와의 융합 적합성을 고려할 때 면역화될 동물로서 특히 바람직하다.
또한, 인간 항원과 마우스 항원 사이의 상동성을 고려할 때, 자가항체를 제거하는 생물학적 기작이 감소되어 있는 마우스, 즉 자가면역 질환 마우스도 바람직하게 사용된다.
이와 관련하여, 이들 마우스 또는 래트는 면역화 시점에서 바람직하게는 5주령 내지 12주령, 보다 바람직하게는 6주령 내지 8주령이다.
예를 들면, 문헌(Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987); Kabat, E. A. and Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Spigfield, Illinois (1964))의 방법을 이용하여 ROBO4 단백질로 동물을 면역화시킬 수 있다.
항체 역가 측정 방법의 예로는 면역분석, 예컨대, RIA 및 ELISA를 들 수 있으나 이들로 한정되지 않는다.
면역화된 동물로부터 분리된 비장 세포 또는 림프구로부터 유래된 항체 생성 세포를 당분야에서 공지된 방법, 예를 들면, 문헌(Kohler et al., Nature (1975) 256, p.495; Kohler et al., Eur. J. Immnol. (1977) 6, p.511; Milstein et al., Nature (1977), 266, p.550; Walsh, Nature, (1977) 266, p.495)의 방법에 따라 제조할 수 있다.
비장 세포의 경우, 비장을 잘게 자르는 단계, 스테인레스 메쉬를 통해 세포를 여과하는 단계 및 이어서 발생된 세포를 이글(Eagle's) 최소 필수 배지(MEM) 등에 부유시켜 항체 생성 세포를 분리하는 단계를 포함하는 일반적인 방법이 채택될 수 있다.
(c) 골수종을 제조하는 단계
세포 융합에서 사용되는 골수종 세포는 특별히 한정되지 않고 당분야에서 공지된 세포주로부터 사용하기에 적절하게 선택될 수 있다. 스크리닝 절차가 이미 확립된 HGPRT(하이포잔틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제) 결핍 세포주, 즉 마우스 유래의 X63-Ag8(X63), NS1-ANS/1(NS1), P3X63-Ag8.U1(P3Ul), X63-Ag8.653(X63.653), SP2/0-Ag14(SP2/0), MPC11-45.6TG1.7(45.6TG), FO, S149/5XXO, BU.1 등, 래트 유래의 210.RSY3.Ag.1.2.3(Y3) 등, 또는 인간 유래의 U266AR(SKO-007), GM1500-GTG-A12(GM1500), UC729-6, LICR-LOW-HMy2(HMy2), 8226AR/NIP4-1(NP41) 등이 융합 세포로부터 하이브리도마를 선택하는 데에 있어서의 편의를 고려할 때 바람직하게 사용된다. 이들 HGPRT 결핍 세포주들은 예를 들면, 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)으로부터 입수될 수 있다.
이들 세포주들은 적절한 배지, 예를 들면, 8-아자구아닌 배지[글루타민, 2-머캡토에탄올, 젠타미신 및 태아 소혈청(이하, "FCS"로서 지칭됨)으로 보충되고 8-아자구아닌으로 더 보충된 RPMI-1640 배지], 이스코브 변경 둘베코 배지(이하, "IMDM"으로서 지칭됨) 또는 둘베코 변경 이글 배지(이하, "DMEM"으로서 지칭됨)에서 하위배양되고, 세포 융합 당일 2 x 107개 세포 이상의 세포수를 확보하기 위해 세포 융합 3일 내지 4일 전에 일반 배지[예를 들면, 10% FCS를 함유하는 ASF104 배지(아지노모토 컴파니 인코포레이티드(Ajinomoto Co., Inc.)에 의해 제조됨)에서 하위배양된다.
(d) 항체 생성 세포를 골수종 세포와 융합시키는 단계
당분야에서 공지된 방법(문헌(Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987)), 문헌(Kabat, E. A. and Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Spigfield, Illinois (1964)) 등)에 따라 세포 생존율이 극도로 감소되는 것을 방지하는 조건 하에서 항체 생성 세포를 골수종 세포와 융합시킬 수 있다. 예를 들면, 중합체, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜의 고농도 용액에서 항체 생성 세포를 골수종 세포와 혼합하는 단계를 포함하는 화학적 방법, 또는 전기 자극을 이용하는 물리적 방법이 이용될 수 있다.
(e) 관심있는 항체를 생성하는 하이브리도마 군에 대해 스크리닝하는 단계
세포 융합에 의해 수득된 하이브리도마에 대한 선택 방법은 특별히 한정되지 않고, HAT(하이포잔틴-아미노프테린-타이미딘) 선택 방법(Kohler et al., Nature (1975) 256, p.495; Milstein et al., Nature (1977) 266, p.550)이 전형적으로 이용된다. 이 방법은 아미노프테린의 존재 하에서 생존할 수 없는 HGPRT 결핍 골수종 세포주를 사용하여 하이브리도마를 수득하는 데에 효과적이다. 구체적으로, 비융합된 세포 및 하이브리도마를 HAT 배지에서 배양하여 아미노프테린에 대한 내성을 갖는 하이브리도마만이 선택적으로 남아 생장하게 할 수 있다.
(f) 단일 세포 클론을 수득하는 단계(클로닝)
당분야에서 공지된 방법, 예를 들면, 메틸셀룰로스, 연질 아가로스 또는 제한 희석 방법(예를 들면, 문헌(Barbara, B. M. and Stanley, M. S.: Selected Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman and Company, San Francisco (1980)) 참조)을 이용하여 하이브리도마를 클로닝할 수 있다. 제한 희석 방법이 바람직하다.
(g) 하이브리도마를 배양하는 단계 및 하이브리도마가 이식된 동물을 발생시키는 단계
선택된 하이브리도마를 배양하여 단일클론 항체를 생성할 수 있다. 바람직하게는, 원하는 하이브리도마를 클로닝한 후 항체를 생성할 수 있다.
이 하이브리도마에 의해 생성된 단일클론 항체를 하이브리도마의 배양물로부터 수집할 수 있다. 뿐만 아니라, 재조합 항체도 단일클론 항체 유전자로 형질감염된 세포의 배양물로부터 수집할 수 있다. 나아가, 하이브리도마를 동일한 품종의 마우스(예를 들면, 전술된 BALB/cAnNCrj) 또는 Nu/Nu 마우스에 복강내로 주사하여 생장시킬 수 있다. 그 다음, 그들의 복수로부터 단일클론 항체를 수집할 수도 있다.
(h) 단일클론 항체의 생물학적 활성을 분석하거나 측정하는 단계
다양한 생물학적 시험을 선택하여 목적에 따라 이 단계에 적용할 수 있다.
(4-2) 세포 면역화 방법
천연 ROBO4 단백질을 발현하는 세포, 재조합 ROBO4 단백질 또는 그의 단편을 발현하는 세포 등을 면역원으로서 사용하여 전술된 하이브리도마 방법으로 항-ROBO4 항체를 제조할 수 있다.
천연 ROBO4 단백질을 발현하는 세포의 예로는 혈관신생 질환, 예컨대, 증식성 당뇨망막병증 또는 종양으로 고통받는 환자로부터 유래된 세포, 및 이들 환자의 조직으로부터 유래된 세포를 들 수 있다. 이러한 세포는 바람직하게는 혈관 내피 세포이지만 이것으로 한정되지 않는다. 이들 ROBO4 단백질 발현 세포들은 1회 면역화에서 1 x 105개 내지 1 x 109개 세포, 바람직하게는 1 x 106개 내지 1 x 108개 세포, 보다 바람직하게는 0.5 x 107개 내지 2 x 107개 세포, 훨씬 더 바람직하게는 1 x 107개 세포의 양으로 사용된다. 면역화에 사용될 세포의 수는 ROBO4 단백질의 발현 수준에 따라 변화될 수 있다. 면역원은 일반적으로 복강내로 투여되고, 피내 경로 등을 통해 투여될 수 있다. (4-1-2)에 기재된 방법이 하이브리도마 제조 방식에 적용될 수 있다.
(4-3) 유전자 재조합 및 숙주 세포
본 발명의 항체를 제조하기 위해, 그의 중쇄의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드(중쇄 뉴클레오티드) 및 그의 경쇄의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드(경쇄 뉴클레오티드), 또는 중쇄 뉴클레오티드의 삽입체를 함유하는 벡터 및 경쇄 뉴클레오티드의 삽입체를 함유하는 벡터로 숙주 세포를 형질감염시킨 후 배양하고, 배양물로부터 항체를 수집할 수 있다. 중쇄 뉴클레오티드 및 경쇄 뉴클레오티드는 한 벡터 내에 삽입될 수 있다.
원핵 또는 진핵 세포가 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 진핵 세포가 숙주로서 사용되는 경우, 동물 세포, 식물 세포 또는 진핵 미생물이 사용될 수 있다.
동물 세포의 예로는 포유동물 유래의 세포, 즉 원숭이 유래의 COS 세포(Gluzman, Y. Cell (1981) 23, p. 175-182, ATCC 번호 CRL-1650), 마우스 섬유모세포 NIH3T3(ATCC 번호 CRL-1658), 마우스 NS0 세포주(ECACC), 중국 햄스터 난소 세포(CHO 세포, ATCC 번호 CCL-61), 그의 디하이드로폴레이트 환원효소 결핍 세포주(CHOdhfr-: Urlaub, G. and Chasin, L. A. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (1980) 77, p.4126-4220), 론자 바이올로직스(Lonza Biologics)에 의해 개발된 CHOK1SV, 조류, 예컨대, 닭으로부터 유래된 세포, 및 곤충으로부터 유래된 세포를 들 수 있다.
또한, 본 발명의 숙주 세포는 항체 단백질에 부착된 당쇄의 구조가 변경되어 있는 항체 단백질을 생성할 수 있는 세포를 포함하고, 이때 변경을 갖는 항체의 생물학적 활성은 바람직하게는 변경을 갖지 않은 항체에 비해 향상되어 있다. 본 발명의 이러한 숙주 세포의 예로는 항체의 Fc 영역에 결합된 복합 N-글리코사이드-연결된 당쇄를 갖는 항체 단백질을 생성할 수 있는 CHO 세포를 들 수 있고, 이때 항체의 Fc 영역에 결합된 총 복합 N-글리코사이드-연결된 당쇄들 중에서 푸코스가 당쇄의 환원 말단에서 N-아세틸글루코스아민에 결합되어 있지 않은 당쇄의 비는 20% 이상이다(국제 특허출원 공보 제WO2000/61739호 및 제WO2002/31140호).
진핵 미생물의 예로는 효모를 들 수 있다. 원핵 세포의 예로는 이. 콜라이(E. coli) 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 들 수 있다.
본 발명의 항-ROBO4 항체를 생성하기 위한 숙주 세포로서 바람직하게는 포유동물 유래의 세포가 사용되고, 보다 바람직하게는 CHO 세포가 사용되고, 훨씬 더 바람직하게는 CHOK1SV가 사용된다.
본 발명의 항체(다양한 동물 종들로부터 유래된 단일클론 항체, 래트 항체, 마우스 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체, 인간 항체 등)의 분비를 위한 신호 펩티드는 상기 항체와 동일한 종, 동일한 종류 및 동일한 하위종류의 항체의 분비 신호, 또는 항체 그 자체의 분비 신호로 한정되지 않는다. 그와 상이한 종류 또는 하위종류의 항체의 임의의 분비 신호, 또는 그와 상이한 진핵 종 또는 원핵 종으로부터 유래된 단백질의 임의의 분비 신호가 선택되고 사용될 수 있다.
(4-4) 인간화된 항체를 디자인하고 제조하는 방법
인간화된 항체의 예로는 비인간 동물 항체의 CDR들로 치환된 CDR들을 갖는 인간 유래의 항체(문헌(Nature (1986) 321, p. 522-525) 참조), CDR 이식 방법에 의해 CDR 서열 및 골격 영역의 일부 아미노산 잔기들을 이식받은 인간 항체(예를 들면, 국제 특허출원 공보 제WO90/07861호 및 미국 특허 제6972323호 참조), 및 이들 인간화된 항체들 중 임의의 인간화된 항체에서 1개 또는 2개 이상의 비인간 동물 항체 유래의 아미노산(들)을 치환시킨 인간 항체 아미노산(들)을 갖는 항체를 들 수 있다.
(4-5) 인간 항체를 제조하는 방법
본 발명의 항체의 추가 예로는 인간 항체를 들 수 있다. 항-ROBO4 인간 항체는 인간 유래의 항체의 아미노산 서열로 구성된 항-ROBO4 항체를 의미한다. 항-ROBO4 인간 항체는 인간 항체 중쇄 및 경쇄 코딩 유전자를 포함하는 인간 게놈 DNA 단편을 보유하는 인간 항체 생성 마우스를 사용하는 방법에 의해 수득될 수 있다(예를 들면, 문헌(Tomizuka, K. et al., Nature Genetics (1997) 16, p.133-143), 문헌(Kuroiwa, Y. et. al., Nuc. Acids Res. (1998) 26, p.3447-3448), 문헌(Yoshida, H. et. al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects vol. 10, p.69-73 (Kitagawa, Y., Matuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999), 문헌(Tomizuka, K. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, p.722-727) 등 참조).
구체적으로, 이러한 인간 항체 생성 동물은 비인간 포유동물의 내재성 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자 좌위를 파괴하고 대신에 효모 인공 염색체(YAC) 벡터 등을 통해 인간 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자 좌위를 그에 도입함으로써 제조될 수 있다. 대안적으로, 유전자 재조합 기법으로 이러한 인간 항체의 중쇄 및 경쇄 코딩 cDNA들, 바람직하게는 상기 cDNA들 각각을 포함하는 벡터를 사용하여 진핵 세포를 형질전환시키고, 재조합 인간 단일클론 항체를 생성하는 형질전환된 세포를 배양한다. 배양 상청액으로부터 이 항체를 수득할 수 있다.
이와 관련하여, 예를 들면, 진핵 세포, 바람직하게는 포유동물 세포, 예컨대, CHO 세포, 림프구 또는 골수종이 숙주로서 사용될 수 있다.
인간 항체 라이브러리로부터 선택된 파지 디스플레이 유래의 인간 항체를 수득하는 방법(문헌(Wormstone, I. M. et. al, Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002) 43 (7), p.2301-2308), 문헌(Carmen, S. et. al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), p.189-203), 문헌(Siriwardena, D. et. al., Opthalmology (2002) 109 (3), p.427-431) 등 참조)도 공지되어 있다.
예를 들면, 인간 항체의 가변 영역이 파지 표면 상에서 단일 쇄 항체(scFv)로서 발현되게 하는 단계 및 항원에 결합하는 파지를 선택하는 단계를 포함하는 파지 디스플레이 방법(Nature Biotechnology (2005), 23, (9), p. 1105-1116)이 이용될 수 있다.
파지와 항원의 결합을 기초로 선택된 파지의 유전자를 분석하여 항원에 결합하는 인간 항체의 가변 영역을 코딩하는 DNA 서열을 결정할 수 있다.
항원에 결합하는 scFv의 DNA 서열이 결정되면, 이 서열을 갖는 발현 벡터를 제조하고, 적절한 숙주를 상기 발현 벡터로 형질감염시키고 인간 항체를 발현하게 한다(국제 특허출원 공보 제WO92/01047호, 제WO92/20791호, 제WO93/06213호, 제WO93/11236호, 제WO93/19172호, 제WO95/01438호 및 제WO95/15388호, 문헌(Annu. Rev. Immunol (1994) 12, p.433-455) 및 문헌(Nature Biotechnology (2005) 23 (9), p.1105-1116)).
(4-6) 항체의 기능성 단편을 제조하는 방법
단일 쇄 항체를 제조하는 방법은 당분야에서 잘 공지되어 있다(예를 들면, 미국 특허 제4,946,778호, 제5,260,203호, 제5,091,513호 및 제5,455,030호 참조). 이 scFv에서, 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역은 이들이 접합체를 형성하는 것을 방지하는 연결제, 바람직하게는 폴리펩티드 연결제를 통해 연결된다(Huston, J.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988), 85, p. 5879-5883). scFv에서 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 동일한 항체로부터 유래될 수 있거나 상이한 항체로부터 유래될 수 있다.
예를 들면, 12개 내지 19개의 잔기들로 구성된 임의 단일 쇄 펩티드가 이들 가변 영역들을 연결하는 폴리펩티드 연결제로서 사용된다.
scFv 코딩 DNA를 수득하기 위해, 항체의 중쇄 또는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA 및 항체의 경쇄 또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA의 서열들 중 전체 또는 원하는 아미노산 서열을 코딩하는 각각의 DNA 부분을 주형으로서 사용하고 이 주형의 양 말단들을 플랭킹하는 프라이머 쌍을 사용하여 PCR로 증폭시킨다. 그 후, 폴리펩티드 연결제 모이어티를 코딩하는 DNA도 그의 양 말단들을 플랭킹하는 프라이머 쌍으로 함께 증폭하여 이들 말단들을 각각 중쇄 및 경쇄에 연결한다.
scFv 코딩 DNA를 상용적인 방법에 따라 사용하여 상기 DNA를 함유하는 발현 벡터를 제조할 수 있고 숙주 세포를 상기 발현 벡터로 형질전환시킬 수 있다. 추가로, 숙주 세포를 배양하고 scFv를 상용적인 방법에 따라 배양물로부터 수집할 수 있다.
또한, 항체의 다른 기능성 단편을 수득하기 위해, 각각의 기능성 단편을 코딩하는 유전자를 전술된 방법에 따라 수득하고, 세포를 상기 유전자로 형질감염시킨다. 관심있는 기능성 단편을 세포의 배양물로부터 수집할 수 있다.
본 발명의 항체를 다량체화하여 항원에 대한 그의 친화성을 향상시킬 수 있다. 다량체화되는 항체는 1종의 항체일 수 있거나 복수의 에피토프들 각각 또는 동일한 항원을 인식하는 복수의 항체들일 수 있다. 항체 다량체화 방법의 예로는 2개의 scFv들과 IgG CH3 도메인의 결합, 2개의 scFv들과 스트렙타비딘의 결합 및 나선-회전-나선 모티프의 도입을 들 수 있다.
본 발명의 항체는 아미노산 서열 면에서 상이한 복수의 종류의 항-ROBO4 항체들의 혼합물, 즉 다중클론 항체일 수 있다. 다중클론 항체의 예로는 CDR 세트의 부분 또는 전체에서 상이한 복수의 종류의 항체들의 혼합물을 들 수 있다. 이러한 다중클론 항체는 혼합 배양된 상이한 항체 생성 세포들의 배양물로부터 수집될 수 있다(국제 특허출원 공보 제WO2004/061104호). 뿐만 아니라, 별도로 제조된 항체들을 혼합할 수 있다. 나아가, 동물을 원하는 항원으로 면역화시키고 표준 방법에 따라 상기 동물로부터 혈청을 수집함으로써 다중클론 항체의 한 양태인 항혈청을 제조할 수 있다.
다양한 분자들, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 접합체 항체도 항체의 변경된 형태로서 사용될 수 있다.
본 발명의 항체는 이들 항체와 다른 약물에 의해 형성된 임의의 접합체(면역접합체)일 수도 있다. 이러한 항체의 예로는 방사성 물질 또는 약리학적 효과를 갖는 화합물과 접합된 항체를 들 수 있다(Nature Biotechnology (2005) 23, p. 1137-1146).
(4-7) 항체의 정제
수득된 항체를 균질한 수준으로 정제할 수 있다. 항체의 분리 및 정제를 위해 통상적인 단백질 분리 및 정제 방법을 이용할 수 있다.
적절하게 선택되거나 조합된 방법, 예를 들면, 크로마토그래피 컬럼, 필터, 한외여과, 염석, 투석, 분취 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및/또는 등전점 포커싱(isoelectric focusing)(그러나, 이들로 한정되지 않음)으로 항체를 분리하고 정제할 수 있다(Strategies for Protein Purification and Charcterization: A Laboratoy Course Manual, Daniel R. Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)).
크로마토그래피의 예로는 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과, 역상 크로마토그래피 및 흡착 크로마토그래피를 들 수 있다.
액체상 크로마토그래피, 예컨대, HPLC 또는 FPLC를 이용하여 이들 크로마토그래피 방법을 수행할 수 있다.
친화성 크로마토그래피에서 사용되는 컬럼의 예로는 단백질 A, 단백질 G 및 항원 컬럼을 들 수 있다.
단백질 A 컬럼의 예로는 (폴 코포레이션(Pall Corp.)에 의해 제조된) 하이퍼(Hyper) D, (어플라이드 바이오시스템스 인코포레이티드(Applied Biosystems, Inc.)에 의해 제조된) POROS 및 (지이 헬스케어 바이오-사이언시스 코포레이션에 의해 제조된) 세파로스 F.F.를 들 수 있다.
또한, 항원-고정된 담체를 사용하여 항원에 대한 항체의 결합 활성을 기초로 항체를 정제할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편, 또는 그의 변경된 형태를 코딩하는 유전자, 이 유전자의 삽입체를 함유하는 재조합 벡터, 상기 유전자 또는 벡터로 형질감염된 세포, 및 본 발명의 항체를 생성하는 세포도 제공한다.
방법 (4-1) 내지 (4-6) 중 임의의 방법에 의해 제조된 항체 또는 그의 기능성 단편이 본 발명에 포함될 수 있다.
5. 약학 조성물
본 발명은 항-ROBO4 항체 또는 그의 기능성 단편, 또는 그의 변경된 형태를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학 조성물은 발병, 진행 및/또는 악화의 과정 동안 병리학적 소견들 중 하나로서 혈관신생을 보이고 이 혈관신생 또는 혈관 투과성의 억제에 의해 개선될 수 있는 질환(이하, 이 질환은 편의상 "혈관신생 질환"으로서 지칭됨)의 치료 또는 예방에 유용하다. 혈관신생 질환의 예로는 삼출성 연령 관련 황반 변성, 당뇨망막병증, 황반 부종, 양성 또는 악성 종양, 아테롬성동맥경화증, 수정체뒤섬유증식, 혈관종, 만성 염증, 안구 혈관신생 질환, 증식성 망막병증, 혈관신생 녹내장, 각막 조직 이식 또는 다른 조직 이식의 면역 거부, 류마티스 관절염, 건선, 급성 염증, 패혈증 및 비만을 들 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 혈관신생 질환의 치료 또는 예방에 있어서 약제로서 유용하고, 특히 삼출성 연령 관련 황반 변성, 당뇨망막병증, 황반 부종, 양성 또는 악성 종양, 수정체뒤섬유증식, 안구 혈관신생 질환, 증식성 망막병증, 혈관신생 녹내장 및 각막 조직 이식의 면역 거부의 치료 또는 예방에 유용하고, 보다 바람직하게는 삼출성 연령 관련 황반 변성, 당뇨망막병증, 황반 부종, 양성 또는 악성 종양, 수정체뒤섬유증식, 안구 혈관신생 질환, 증식성 망막병증 및 혈관신생 녹내장의 치료 또는 예방에 유용하다.
본 발명에서, 질환의 치료 및/또는 예방은 질환, 바람직하게는 발현된 ROBO4 단백질을 갖는 개체에서의 질환의 발병의 예방, 그의 악화 또는 진행의 억제 또는 저해, 질환으로 고통받는 개체에 의해 나타나는 1개 또는 2개 이상의 증상의 경감, 그의 악화 또는 진행의 억제 또는 관해, 2차 질환의 치료 또는 예방 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
본 발명의 약학 조성물은 치료 또는 예방 유효량의 항-ROBO4 항체 또는 이 항체의 기능성 단편 및 약학적으로 허용가능한 희석제, 비히클, 가용화제, 유화제, 보존제 및/또는 첨가제를 함유할 수 있다.
"치료 또는 예방 유효량"은 특정 제형 및 투여 경로에 의해 특정 질환에 대한 치료 또는 예방 효과를 발휘하는 양을 의미한다.
본 발명의 약학 조성물은 이 조성물 또는 그에 함유된 항체의 pH, 삼투압, 점도, 투명도, 색채, 긴장성, 멸균성 또는 안정성, 가용성, 지속된 방출, 흡수성, 투과성, 제형, 강도, 성질, 형태 등을 변화시키거나, 유지하거나 보유하기 위한 물질(이하, "약학 물질"로서 지칭됨)을 함유할 수 있다. 약학 물질은, 이 물질이 약리학적으로 허용가능한 물질인 한, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 무독성 또는 낮은 독성이 바람직하게는 이들 약학 물질들에 의해 보유된 성질이다.
약학 물질의 예로는 하기 물질들을 들 수 있으나 이들로 한정되지 않는다: 아미노산, 예컨대, 글리신, 알라닌, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 및 라이신; 항균제; 항산화제, 예컨대, 아스코르브산, 황산나트륨 및 중아황산나트륨; 완충제, 예컨대, 인산염, 구연산염 또는 붕산염 완충제, 중탄산나트륨 및 트리스-HCl 용액; 충전제, 예컨대, 만니톨 및 글리신; 킬레이팅제, 예컨대, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA); 착물화제, 예컨대, 카페인, 폴리비닐피롤리딘, β-사이클로덱스트린 및 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린; 증량제, 예컨대, 글루코스, 만노스 및 덱스트린; 다른 탄수화물, 예컨대, 단당류, 이당류, 글루코스, 만노스 및 덱스트린; 착색제; 교취제; 희석제; 유화제; 친수성 중합체, 예컨대, 폴리비닐피롤리딘; 저분자량 폴리펩티드; 염 형성 반대이온; 방부제, 예컨대, 염화벤즈알코늄, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 펜에틸 알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르브산 및 과산화수소; 용매, 예컨대, 글리세린, 프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜; 당 알코올, 예컨대, 만니톨 및 소르비톨; 현탁제; 계면활성제, 예컨대, PEG, 소르비탄 에스테르, 폴리소르베이트, 예컨대, 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80, 트리톤, 트로메타민, 레시틴 및 콜레스테롤; 안정성 향상제, 예컨대, 수크로스 및 소르비톨; 탄성 향상제, 예컨대, 염화나트륨, 염화칼륨, 만니톨 및 소르비톨; 수송제; 희석제; 부형제; 및/또는 약학 첨가제.
첨가되는 이들 약학 물질들의 양은 항-ROBO4 항체 또는 그의 기능성 단편, 또는 그의 변경된 형태의 중량의 0.001배 내지 1000배, 바람직하게는 0.01배 내지 100배, 보다 바람직하게는 0.1배 내지 10배이다.
리포좀 내에 캡슐화된 항-ROBO4 항체 또는 그의 기능성 단편, 또는 그의 변경된 형태; 또는 리포좀과 접합된 항체를 포함하는 변경된 항체 형태를 포함하는 면역리포좀을 함유하는 약학 조성물(미국 특허 제6214388호 등)도 본 발명의 약학 조성물에 포함된다.
부형제 또는 비히클은, 이들이 주사가능한 물, 식염수, 인공 뇌척수액, 및 경구 또는 비경구 투여를 위한 다른 제제에서 통상적으로 사용되는 액체 또는 고체 물질인 한, 특별히 한정되지 않는다. 식염수의 예로는 중성 식염수 및 혈청 알부민 함유 식염수를 들 수 있다.
완충제의 예로는 약학 조성물의 최종 pH를 7.0 내지 8.5로 조절하는 트리스 완충제, 약학 조성물의 최종 pH를 4.0 내지 5.5로 조절하는 아세트산염 완충제, 약학 조성물의 최종 pH를 5.0 내지 8.0으로 조절하는 구연산염 완충제, 및 약학 조성물의 최종 pH를 5.0 내지 8.0으로 조절하는 히스티딘 완충제를 들 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 고체, 액체, 현탁액 등이다. 본 발명의 약학 조성물의 또 다른 예로는 동결건조된 제제를 들 수 있다. 부형제, 예컨대, 수크로스를 사용하여 동결건조된 제제를 형성할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여 경로는 장 투여, 국소 투여 및 비경구 투여 중 임의의 투여일 수 있고, 바람직하게는 표적화된 질환에 따라 선택될 수 있다. 그의 구체적인 예로는 정맥내 투여, 동맥내 투여, 근육내 투여, 피내 투여, 피하 투여, 복강내 투여, 경피 투여, 골내 투여 및 관절내 투여를 들 수 있다. 또한, 안내 투여는 바람직하게는 눈 혈관신생 질환, 예컨대, 삼출성 연령 관련 황반 변성, 당뇨망막병증, 황반 부종, 수정체뒤섬유증식, 안구 혈관신생 질환, 증식성 망막병증, 혈관신생 녹내장 또는 각막 조직 이식의 면역 거부의 경우 이용될 수 있다.
약학 조성물의 처방(recipe)은 투여 방법, ROBO4 단백질에 대한 항체의 결합 친화성 등에 따라 결정될 수 있다. ROBO4 단백질에 대한 보다 높은 친화성(보다 낮은 KD 값)을 갖는 본 발명의 항-ROBO4 항체 또는 그의 기능성 단편, 또는 그의 변경된 형태는 보다 낮은 용량에서 그의 약물 효능을 발휘할 수 있다.
본 발명의 항-ROBO4 항체의 복용량은 개체의 종, 질환의 종류, 증상, 성별, 연령, 기존 병태, ROBO4 단백질에 대한 항체의 결합 친화성 또는 그의 생물학적 활성, 및 다른 인자에 따라 적절하게 결정될 수 있다. 통상적으로 0.01 내지 1000 mg/kg, 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/kg의 복용량이 180일 동안 매일 1회, 또는 1일 2회 또는 3회 이상 투여될 수 있다.
약학 조성물의 제형의 예로는 주사제(동결건조된 제제 및 점적제를 포함함), 좌약제, 경비 흡수 제제, 경피 흡수 제제, 설하 제제, 캡슐제, 정제, 연고, 과립제, 에어로졸, 환제, 산제, 현탁액, 유제, 점안제 및 생물학적 이식물 제제를 들 수 있다.
활성 성분으로서 본 발명의 항-ROBO4 항체 또는 그의 기능성 단편, 또는 그의 변경된 형태를 포함하는 약학 조성물은 추가 치료제 또는 예방제와 병용될 수 있다. 상기 치료제 또는 예방제의 예로는 항-혈관신생 약물, 소염 약물 및/또는 항암 약물을 들 수 있다. 예를 들면, 항-혈관신생 약물, 소염 약물 및/또는 항암 약물을 대상체에게 투여한 후, 활성 성분으로서 항-ROBO4 항체 또는 이 항체의 기능성 단편을 포함하는 약학 조성물을 상기 대상체에게 투여한다. 대안적으로, 상기 약학 조성물을 대상체에게 투여한 후, 항-혈관신생 약물, 소염 약물 및/또는 항암 약물을 상기 대상체에게 투여한다. 대안적으로, 상기 약학 조성물을 항-혈관신생 약물, 소염 약물 및/또는 항암 약물과 동시에 대상체에게 투여할 수 있다. 항-혈관신생 약물의 예로는 라니비주맙을 들 수 있다.
본 발명은 혈관신생 질환, 예컨대, 삼출성 연령 관련 황반 변성, 당뇨망막병증, 황반 부종, 양성 또는 악성 종양, 아테롬성동맥경화증, 수정체뒤섬유증식, 혈관종, 만성 염증, 안구 혈관신생 질환, 증식성 망막병증, 혈관신생 녹내장, 각막 조직 이식 또는 다른 조직 이식의 면역 거부, 류마티스 관절염, 건선, 급성 염증, 패혈증 또는 비만을 치료하거나 예방하는 방법, 상기 혈관신생 질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물의 제조를 위한 본 발명의 항체의 용도, 및 상기 혈관신생 질환의 치료 또는 예방을 위한 본 발명의 항체의 용도도 제공한다. 본 발명의 항체를 포함하는 치료 또는 예방용 키트도 본 발명에 포함된다.
6. 진단용 조성물
본 발명은 본 발명의 항-ROBO4 항체 또는 그의 기능성 단편, 또는 그의 변경된 형태를 포함하는 검사 또는 진단용 조성물(이하, "진단용 조성물"로서 총칭됨)을 제공한다.
본 발명의 진단용 조성물은 혈관신생 질환, 예컨대, 삼출성 연령 관련 황반 변성, 당뇨망막병증, 황반 부종, 양성 또는 악성 종양, 아테롬성동맥경화증, 수정체뒤섬유증식, 혈관종, 만성 염증, 안구 혈관신생 질환, 증식성 망막병증, 혈관신생 녹내장, 각막 조직 이식 또는 다른 조직 이식의 면역 거부, 류마티스 관절염, 건선, 급성 염증, 패혈증 또는 비만의 검사 또는 진단에 유용하다. 본 발명의 진단용 조성물은 보편적인 진단 기준을 충족시키지 못하는 초기 혈관신생 또는 혈관신생 전 증상, 혈관신생으로 발전하는 비진단된 증상 등의 검사 또는 진단에도 유용하다. 본 발명에서, 상기 검사 또는 진단은 예를 들면, 질환을 획득할 위험의 확인 또는 시험, 질환의 존재 또는 부재의 확인, 진행 또는 악화 정도의 시험, 항-ROBO4 항체 등을 포함하는 약학 조성물을 사용한 약물 치료의 효과의 시험 또는 확인, 약물 치료 이외의 치료의 효과의 시험 또는 확인, 재발 위험의 시험, 및 재발의 존재 또는 부재의 확인을 포함한다. 그러나, 본 발명에 따른 검사 또는 진단은, 이것이 통상적인 검사 또는 진단인 한, 이들로 한정되지 않는다.
ROBO4 단백질이 건강한 개체로부터 유래된 샘플에 비해 시험 대상체로부터 유래된 샘플에서 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배 또는 20배 이상의 양, 바람직하게는 10배 이상의 양으로 검출되는 경우, 시험 대상체는 혈관신생 질환을 갖거나 이를 획득할 고위험에 있는 대상체로서 진단될 수 있다. 뿐만 아니라, ROBO4 단백질의 혈청 농도가 특정 기준 값을 초과하는 경우, 시험 대상체는 혈관신생 질환을 갖는 대상체로서 진단되거나 이를 획득할 고위험에 있는 대상체로서 진단될 수 있다. 상기 기준 값은 통상적으로 0.01 내지 10 ng/㎖, 바람직하게는 0.1 내지 1 ng/㎖, 보다 바람직하게는 0.1 내지 0.3 ng/㎖이다.
이러한 진단용 조성물은 pH 완충제, 삼투조절제, 염, 안정화제, 방부제, 색채 현상제, 증감제, 응집 억제제 등을 함유할 수 있다.
본 발명은 혈관신생 질환, 예컨대, 삼출성 연령 관련 황반 변성, 당뇨망막병증, 황반 부종, 양성 또는 악성 종양, 아테롬성동맥경화증, 수정체뒤섬유증식, 혈관종, 만성 염증, 안구 혈관신생 질환, 증식성 망막병증, 혈관신생 녹내장, 각막 조직 이식 또는 다른 조직 이식의 면역 거부, 류마티스 관절염, 건선, 급성 염증, 패혈증 또는 비만을 검사하거나 진단하는 방법, 상기 혈관신생 질환의 진단용 조성물의 제조를 위한 본 발명의 항체의 용도, 및 상기 혈관신생 질환의 검사 또는 진단을 위한 본 발명의 항체의 용도도 제공한다. 본 발명의 항체를 포함하는 검사 또는 진단용 키트도 본 발명에 포함된다.
본 발명의 항체를 사용하는 검사 또는 진단 방법은 바람직하게는 샌드위치 ELISA이다. 항체를 사용하는 통상적인 검출 방법, 예컨대, ELISA, RIA, ELISPOT(효소-연결된 면역스폿) 분석, 도트 블롯팅, 오우크털로니 시험 또는 CIE(역면역전기영동)가 이용될 수 있다. 샌드위치 ELISA 분석 시스템에 적용되는 항체는 ROBO4를 인식하지만 서로 경쟁하지 않는 2종의 항체들의 임의의 조합물일 수 있다. 바이오틴 이외에 생화학적 분석에서 수행될 수 있는 표지부착 방법, 예컨대, HRP, 알칼리성 포스파타제 또는 FITC가 항체를 위한 표지부착 방법으로서 사용될 수 있다. 발색 기질, 예컨대, TMB(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘), BCIP(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트), ρ-NPP(ρ-니트로페닐 포스페이트), OPD(o-페닐렌디아민), ABTS(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산), 수퍼시그날(SuperSignal) ELISA 피코 화학발광 기질(써모 피셔 사이언티픽 인코포레이티드(Thermo Fisher Scientific Inc.)), 형광 기질, 예컨대, 콴타블루(QuantaBlu)(TM) 형광발생 퍼록시다제 기질(써모 피셔 사이언티픽 인코포레이티드) 및 화학발광 기질이 효소 표지부착을 이용하는 검출에서 사용될 수 있다. 인간 또는 비인간 동물로부터 유래된 샘플뿐만 아니라 인위적으로 처리된 샘플, 예컨대, 재조합 단백질도 이 분석에서 사용될 수 있다. 유기체 개체로부터 유래된 시험 샘플의 예로는 혈액, 활액, 복수, 림프, 뇌척수액 및 조직 균질화물 상청액을 들 수 있으나 이들로 한정되지 않는다.
본 발명의 항체를 포함하는 검사 또는 진단용 샌드위치 ELISA 키트는 ROBO4 단백질 표준물 용액, 착색 시약, 희석을 위한 완충제 용액, 고체상을 위한 항체, 검출을 위한 항체 및 세척 용액 등을 함유할 수 있다. 항원에 결합된 항체의 양은 바람직하게는 흡광도, 형광도, 발광도 또는 RI(방사성동위원소) 방법과 같은 방법을 이용함으로써 측정될 수 있다. 바람직하게는 흡광도 플레이트 판독기, 형광도 플레이트 판독기, 발광도 플레이트 판독기, RI 액체 신틸레이션 계수기 등이 이 측정에서 이용된다.
[실시예]
이하, 본 발명은 실시예와 관련하여 보다 상세히 기재될 것이다. 그러나, 본 발명은 이들로 한정되기 위한 것이 아니다.
달리 특정되어 있지 않은 한, 하기 실시예에서 각각의 유전공학적 공정은 문헌("Molecular Cloning" (Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989))에 기재된 방법 또는 당업자에 의해 이용되는 다른 실험 매뉴얼에 기재된 방법에 의해 수행되었거나, 사용된 상업적으로 입수가능한 시약 또는 키트의 설명서에 따라 수행되었다.
(실시예 1) 발현 벡터의 제조
1)-1 인간 ROBO4 발현 벡터의 제조
1)-1-1 전장 인간 ROBO4 발현 벡터의 제조
EcoRV 및 NotI을 사용하여 인간 ROBO4 cDNA(접수번호 BC039602)를 포함하는 플라스미드(오픈 바이오시스템스(Open Biosystems)에 의해 제조됨)로부터 인간 ROBO4 cDNA를 절단하고 pCI 벡터(프로메가 코포레이션(Promega Corp.)에 의해 제조됨)의 EcoRV와 NotI 사이에 도입하여 전장 인간 ROBO4 발현 벡터(이하, "pCI-hROBO4"로서 지칭됨)를 제조하였다. 이 벡터에 클로닝된 인간 ROBO4 유전자의 서열은 서열번호 1에 제시되어 있다. 또한, 인간 ROBO4의 아미노산 서열은 서열번호 2에 제시되어 있다.
1)-1-2 인간 ROBO4 세포외 영역 발현 벡터의 제조
하기 프라이머 세트를 사용하는 PCR 반응을 통해 인간 ROBO4 세포외 영역 폴리펩티드(서열번호 2의 아미노산 번호 1 내지 461로 표시된 아미노산 서열로 구성됨; 이하, "인간 ROBO4-ECD"로서 약칭됨)를 코딩하는 cDNA를 증폭하였다:
Figure 112014100448286-pct00001
수득된 PCR 생성물을 pEF6/V5-His-TOPO 벡터(라이프 테크놀로지스 코포레이션(Life Technologies Corp.)에 의해 제조됨) 내로 클로닝하였다(이하, 발생된 벡터는 "pEF6-ROBO4-ECD"로서 약칭되고; 이하, "pEF6-ROBO4-ECD"에 의해 발현된 재조합 단백질은 "rROBO4-ECD"로서 지칭됨).
1)-1-3 N-말단 FLAG-태그부착된 전장 인간 ROBO4 및 인간 ROBO4 세포외 영역/도메인 결실 변이체 발현 벡터의 제조
FLAG 태그가 부착된 N-말단을 갖는, 인간 ROBO4의 서열번호 2의 아미노산 번호 28 내지 1007로 표시된 아미노산 서열로 구성된 영역(이 도면에서, 이 영역은 "hROBO4-28"로서 지칭됨), 그의 아미노산 번호 46 내지 1007로 표시된 아미노산 서열로 구성된 영역(이 도면에서, 이 영역은 "hROBO4-46"으로서 지칭됨), 그의 아미노산 번호 132 내지 1007로 표시된 아미노산 서열로 구성된 영역(이 도면에서, 이 영역은 "hROBO4-132"로서 지칭됨), 그의 아미노산 번호 210 내지 1007로 표시된 아미노산 서열로 구성된 영역(이 도면에서, 이 영역은 "hROBO4-210"으로서 지칭됨), 그의 아미노산 번호 225 내지 1007로 표시된 아미노산 서열로 구성된 영역(이 도면에서, 이 영역은 "hROBO4-225"로서 지칭됨), 또는 그의 아미노산 번호 341 내지 1007로 표시된 아미노산 서열로 구성된 영역(이 도면에서, 이 영역은 "hROBO4-341"로서 지칭됨)을 포함하는 단백질의 발현을 위한 벡터를 구축하기 위해, pCI-hROBO4를 주형으로서 사용하고 하기 각각의 프라이머 세트를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다:
hROBO4-28 증폭을 위한 프라이머 세트:
Figure 112014100448286-pct00002
hROBO4-46 증폭을 위한 프라이머 세트:
Figure 112014100448286-pct00003
hROBO4-132 증폭을 위한 프라이머 세트:
Figure 112014100448286-pct00004
hROBO4-210 증폭을 위한 프라이머 세트:
Figure 112014100448286-pct00005
hROBO4-225 증폭을 위한 프라이머 세트:
Figure 112014100448286-pct00006
hROBO4-341 증폭을 위한 프라이머 세트:
Figure 112014100448286-pct00007
수득된 PCR 생성물을 pCR4Blunt-TOPO 벡터(라이프 테크놀로지스 코포레이션(Life Technologies Corp.)에 의해 제조됨) 내로 도입하여 클로닝 벡터를 제조하였다. KpnI 및 NheI을 사용하여 각각의 클로닝 벡터로부터 상응하는 cDNA를 절단하고 pCI 벡터의 KpnI과 NheI 사이에 도입하여 N-말단 FLAG-태그부착된 전장 인간 ROBO4 발현 벡터 및 4개의 인간 ROBO4 세포외 영역/도메인 결실 변이체 발현 벡터들을 제조하였다. N-말단 FLAG-태그부착된 전장 인간 ROBO4 발현 벡터는 N-말단부터 ROBO4의 신호 서열(서열번호 2의 아미노산 번호 1 내지 27의 아미노산들) + FLAG 서열(DYKDDDDK) + ROBO4(서열번호 2의 아미노산 번호 28 내지 1007의 아미노산들)을 코딩하는 뉴클레오티드로 구성된다. 이하, N-말단 FLAG-태그부착된 전장 인간 ROBO4의 발현을 위한 벡터는 "pCI-FLAG-hROBO4-28"로서 지칭된다. 인간 ROBO4 세포외 영역/도메인 결실 변이체 발현 벡터들 중, 예를 들면, 서열번호 2의 아미노산 번호 46 내지 1007로 구성된 ROBO4의 발현을 위한 벡터는 ROBO4의 신호 서열(서열번호 2의 아미노산 번호 1 내지 27의 아미노산들) + FLAG 서열(DYKDDDDK) + 세포외 영역-결실된 ROBO4(서열번호 2의 아미노산 번호 46 내지 1007의 아미노산들)로 구성된다. 이 벡터는 "pCI-hROBO4-46"으로서 지칭된다. 마찬가지로, ROBO4의 세포외 영역에서 부분 결실을 갖는 ROBO4를 코딩하는 벡터들은 각각 "pCI-hROBO4-132", "pCI-hROBO4-210", "pCI-hROBO4-225" 및 "pCI-hROBO4-341"로서 지칭된다.
상기 벡터에 클로닝된 FLAG-태그부착된 전장 인간 ROBO4 또는 인간 ROBO4의 세포외 영역/도메인 결실 변이체 각각의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 3, 5, 7, 9, 11 또는 13에 제시되어 있다. 또한, 상응하는 FLAG-태그부착된 전장 인간 ROBO4 또는 인간 ROBO4의 세포외 영역/도메인 결실 변이체의 아미노산 서열은 서열번호 4, 6, 8, 10, 12 또는 14에 제시되어 있다.
1)-1-4 인간 ROBO4 세포내 영역 결실 변이체 발현 벡터의 제조
인간 ROBO4의 서열번호 2의 아미노산 번호 1 내지 511로 표시된 아미노산 서열로 구성된 영역(이하, 이 영역은 "hROBO4-ΔC"로서 지칭됨)을 포함하는 단백질의 발현을 위한 벡터를 구축하기 위해, pCI-hROBO4를 주형으로서 사용하고 hROBO4-ΔC를 위한 하기 프라이머 세트 및 퀵체인지(QuikChange) XL 부위-지정된 돌연변이유발 키트(아질런트 테크놀로지스 인코포레이티드(Agilent Technologies, Inc.)에 의해 제조됨)를 사용하여 인간 ROBO4의 511번째 아미노산을 코딩하는 코돈 바로 다음에 정지 코돈을 삽입함으로써 hROBO4-ΔC 발현 벡터(이하, "pCI-hROBO4-ΔC"로서 지칭됨)를 제조하였다:
Figure 112014100448286-pct00008
1)-2 마우스 ROBO4 발현 벡터의 제조
마우스 심장 퀵-클론 cDNA(타카라 바이오 인코포레이티드(Takara Bio Inc.)에 의해 제조됨)를 주형으로서 사용하고 하기 프라이머 세트를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다:
Figure 112014100448286-pct00009
수득된 PCR 생성물을 pCR-Blunt II-TOPO 벡터(라이프 테크놀로지스 코포레이션에 의해 제조됨) 내로 도입하여 마우스 ROBO4 cDNA를 포함하는 클로닝 벡터를 제조하였다. KpnI 및 NotI을 사용하여 상기 클로닝 벡터로부터 마우스 ROBO4 cDNA를 절단하고 pCI 벡터의 KpnI과 NotI 사이에 도입하여 마우스 ROBO4 발현 벡터(이하, "pCI-mROBO4"로서 지칭됨)를 제조하였다. 이 벡터에 클로닝된 마우스 ROBO4 유전자 내의 ORF 부위의 서열은 서열번호 15의 뉴클레오티드 7 내지 3051에 제시되어 있다. 또한, 마우스 ROBO4의 아미노산 서열은 서열번호 16에 제시되어 있다.
1)-3 래트 ROBO4 발현 벡터의 제조
래트 비장 퀵-클론 cDNA(타카라 바이오 인코포레이티드에 의해 제조됨)를 주형으로서 사용하고 하기 프라이머 세트를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다:
Figure 112014100448286-pct00010
수득된 PCR 생성물을 pCR4Blunt-TOPO 벡터 내로 도입하여 래트 ROBO4 cDNA를 포함하는 클로닝 벡터를 제조하였다. KpnI 및 NotI을 사용하여 상기 클로닝 벡터로부터 래트 ROBO4 cDNA를 절단하고 pCI 벡터의 KpnI과 NotI 사이에 도입하여 래트 ROBO4 발현 벡터(이하, "pCI-raROBO4"로서 지칭됨)를 제조하였다. 래트 ROBO4 cDNA의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 17에 제시되어 있다. 이 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열은 서열번호 18에 제시되어 있다.
1)-4 N-말단 FLAG-태그부착된 사이노몰구스 원숭이 ROBO4 발현 벡터의 제조
사이노몰구스 원숭이 신장 총 RNA로부터 합성된 cDNA를 주형으로서 사용하고 하기 프라이머 세트를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다:
Figure 112014100448286-pct00011
수득된 PCR 생성물을 pCR4Blunt-TOPO 벡터 내로 도입하여 각각의 사이노몰구스 원숭이 ROBO4 cDNA(이하, cynoROBO4-1 또는 cynoROBO4-2로서 지칭됨)를 포함하는 2종의 클로닝 벡터(이하, 이들 벡터들은 각각 pCR-cynoROBO4-1 및 pCR-cynoROBO4-2로서 지칭됨)를 제조하였다.
그 다음, pCR-cynoROBO4-1 또는 pCR-cynoROBO4-2를 주형으로서 사용하고 하기 프라이머 세트를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다:
Figure 112014100448286-pct00012
수득된 PCR 생성물을 pCR4Blunt-TOPO 벡터 내로 도입하여 각각의 사이노몰구스 원숭이 ROBO4 cDNA를 포함하는 클로닝 벡터를 제조하였다. BamHI 및 NotI을 사용하여 상기 클로닝 벡터로부터 상응하는 사이노몰구스 원숭이 ROBO4 cDNA를 절단하고 pCI 벡터의 BamHI과 NotI 사이에 도입하여 2종의 사이노몰구스 원숭이 ROBO4 발현 벡터들(이하, 각각 pCI-cynoROBO4-1 및 pCI-cynoROBO4-2로서 지칭됨)을 제조하였다.
그 다음, pCR-cynoROBO4-1 또는 pCR-cynoROBO4-2를 주형으로서 사용하고 하기 프라이머 세트를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다:
Figure 112014100448286-pct00013
수득된 PCR 생성물을 pCR-TOPO 벡터(라이프 테크놀로지스 코포레이션에 의해 제조됨) 내로 도입하여 N-말단 FLAG-태그부착된 사이노몰구스 원숭이 ROBO4 cDNA를 포함하는 각각의 클로닝 벡터를 제조하였다. KpnI 및 NotI을 사용하여 상기 클로닝 벡터로부터 상응하는 사이노몰구스 원숭이 ROBO4 cDNA를 절단하고 pCI 벡터의 KpnI과 NotI 사이에 도입하여 N-말단 FLAG-태그부착된 사이노몰구스 원숭이 ROBO4 발현 벡터(이하, 각각 "pCI-FLAG-cynoROBO4-1" 및 "pCI-FLAG-cynoROBO4-2"로서 지칭됨)를 제조하였다. pCI-FLAG-cynoROBO4-1 및 pCI-FLAG-cynoROBO4-2 각각에 클로닝된 사이노몰구스 원숭이 ROBO4 cDNA의 뉴클레오티드 서열은 각각 서열번호 19 및 21에 제시되어 있다. 각각의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열은 각각 서열번호 20 및 22에 제시되어 있다.
1)-5 N-말단 FLAG-태그부착된 인간 ROBO1 발현 벡터의 제조
인간 심장 퀵-클론 cDNA(타카라 바이오 인코포레이티드에 의해 제조됨)를 주형으로서 사용하고 하기 프라이머 세트를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다:
Figure 112014100448286-pct00014
수득된 PCR 생성물 및 pDONR221 벡터(라이프 테크놀로지스 코포레이션에 의해 제조됨)에 대한 BP 반응을 수행하여 인간 ROBO1 cDNA를 포함하는 공여자 벡터를 제조하였다.
그 다음, 상기 공여자 벡터를 주형으로서 사용하고 하기 프라이머 세트를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다:
Figure 112014100448286-pct00015
수득된 PCR 생성물을 pCR4Blunt-TOPO 벡터 내로 도입하여 N-말단 FLAG-태그부착된 인간 ROBO1 cDNA를 포함하는 클로닝 벡터를 제조하였다. NheI 및 NotI을 사용하여 상기 클로닝 벡터로부터 N-말단 FLAG-태그부착된 인간 ROBO1 cDNA를 절단하고 pCI 벡터의 NheI과 NotI 사이에 도입하여 발현 벡터(이하, "pCI-FLAG-hROBO1"로서 지칭됨)를 제조하였다. N-말단 FLAG-태그부착된 인간 ROBO1 cDNA의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 23에 제시되어 있다. 이 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열은 서열번호 24에 제시되어 있다.
1)-6 인간 ROBO2 발현 벡터의 제조
인간 폐 퀵-클론 cDNA(타카라 바이오 인코포레이티드에 의해 제조됨)를 주형으로서 사용하고 하기 프라이머 세트를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다:
Figure 112014100448286-pct00016
수득된 PCR 생성물을 pCR4Blunt-TOPO 벡터 내로 도입하여 인간 ROBO2 cDNA를 포함하는 클로닝 벡터를 제조하였다. NotI 및 NheI을 사용하여 상기 클로닝 벡터로부터 인간 ROBO2 cDNA를 절단하고 pCI 벡터의 NotI과 NheI 사이에 도입하여 발현 벡터(이하, "pCI-hROBO2"로서 지칭됨)를 제조하였다. 인간 ROBO2 cDNA의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 25에 제시되어 있다. 이 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열은 서열번호 26에 제시되어 있다.
1)-7 인간 ROBO3 발현 벡터의 제조
인간 ROBO3/pENTR223.1(오픈 바이오시스템스(Open Biosystems)에 의해 제조됨)을 주형으로서 사용하고 하기 프라이머 세트를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다:
Figure 112014100448286-pct00017
수득된 PCR 생성물을 pCR4Blunt-TOPO 벡터 내로 도입하여 인간 ROBO3 cDNA를 포함하는 클로닝 벡터를 제조하였다. NotI 및 NheI을 사용하여 상기 클로닝 벡터로부터 인간 ROBO3 cDNA를 절단하고 pCI 벡터의 NotI과 NheI 사이에 도입하여 발현 벡터(이하, "pCI-hROBO3"으로서 지칭됨)를 제조하였다. 이 벡터에 클로닝된 인간 ROBO3 유전자 내의 ORF 부위의 서열은 서열번호 27의 뉴클레오티드 35 내지 4192에 제시되어 있다. 또한, 인간 ROBO3의 아미노산 서열은 서열번호 28에 제시되어 있다.
(실시예 2) 단일클론 항체의 제조
2)-1 항원성 단백질의 제조
rROBO4-ECD를 발현시키기 위해, 293펙틴(fectin)(라이프 테크놀로지스 코포레이션에 의해 제조됨)을 사용하여 프리스타일(FreeStyle) 293-F 세포(라이프 테크놀로지스 코포레이션에 의해 제조됨)를 pEF6-ROBO4-ECD로 형질감염시키고 8% CO2 조건 하에서 6일 동안 37℃에서 배양하였다. 배양의 완료 후, 배양 용액을 원심분리로 수집하고 rROBO4-ECD 정제 스톡(stock)으로서 사용하였다. 15000의 분자량 컷오프를 갖는 투석 튜브를 이용하여 수득된 배양 상청액을 20 mM 트리스-HCl(pH 7.5)에 대해 투석하고 필터(0.45 ㎛)를 통해 여과한 후, 20 mM 트리스-HCl(pH 7.5)로 평형화된 하이트랩(HiTrap) 16/10 Q XL(지이 헬쓰케어 바이오-사이언시스 코포레이션에 의해 제조됨)에 첨가하였다. NaCl 구배(20 mM 트리스-HCl, pH 7.5/0.2 M NaCl, 20 mM 트리스-HCl, pH 7.5/1 M NaCl)를 이용하여 용출을 수행하였다. 용출 분획의 부분을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(이하, "SDS-PAGE"로서 약칭됨)으로 분리하였다. 그 다음, 겔을 쿠마시 브릴리언트 블루 염색(이하, "CBB 염색"으로서 약칭됨)으로 염색하고 웨스턴 블롯팅으로 검출하여 rROBO4-ECD를 함유하는 분획을 확인하였다. 그 다음, rROBO4-ECD를 함유하는 분획을 수집하고 PBS로 평형화된 하이로드(HiLoad) 16/60 수퍼덱스 75 pg(지이 헬쓰케어 바이오-사이언시스 코포레이션에 의해 제조됨)에 첨가하였다. PBS로 용출한 후, 용출 분획의 부분을 SDS-PAGE로 분리하였다. 그 다음, 겔을 CBB 염색으로 염색하고 웨스턴 블롯팅으로 검출하여 rROBO4-ECD를 함유하는 분획을 확인하였다. rROBO4-ECD를 함유하는 분획을 수집하고 면역화를 위한 항원 및 결합 친화성 분석을 위한 항원으로서 사용하였다. BCA 단백질 분석 시약(피어스 바이오테크놀로지 인코포레이티드(Pierce Biotechnology, Inc.)에 의해 제조됨)을 사용하여 단백질 농도를 측정하였다.
2)-2 면역화
6주령의 암컷 BALB/c 마우스를 사용하였다. 0일째 날, rROBO4-ECD와 프로인트 완전 항원보강제의 혼합물 50 ㎍을 각각의 마우스에게 피하 또는 피내 투여하였다. 7일째 날, 14일째 날 및 21일째 날, rROBO4-ECD와 프로인트 불완전 항원보강제의 혼합물 50 ㎍을 상기 마우스에게 피하 또는 피내 투여하였다. 38일째 날, rROBO4-ECD 50 ㎍을 상기 마우스에게 복강내 투여하였다. 42일째 날, 마우스 림프절 또는 비장을 수집하여 하이브리도마 제조에 사용하였다.
2)-3 하이브리도마 제조
하이브리뮨(Hybrimune) 하이브리도마 제조 시스템(사이토 펄스 사이언시스 인코포레이티드(Cyto Pulse Sciences, Inc.)에 의해 제조됨)을 이용하여 림프절 세포 또는 비장 세포와 마우스 골수종 SP2/0-ag14 세포를 전기적으로 융합시키고 클로나셀(ClonaCell)-HY 선택 배지 D(스템셀 테크놀로지스 인코포레이티드(StemCell Technologies Inc.)에 의해 제조됨)로 희석하고 배양하였다. 보이는 하이브리도마 콜로니를 수집하여 단일클론 하이브리도마를 제조하였다. 수집된 각각의 하이브리도마 콜로니를 배양하고, 수득된 하이브리도마 배양 상청액을 항-ROBO4 항체 생성 하이브리도마에 대해 스크리닝하였다.
2)-4 항체 스크리닝
2)-4-1 세포-ELISA를 위한 항원 유전자 발현 세포의 제조
HEK293 세포를, 10% FBS를 함유하는 DMEM 배지 중의 7.5 x 105개 세포/㎖로 조절하였다. 리포펙타민 2000(라이프 테크놀로지스 코포레이션에 의해 제조됨)을 사용하여 세포를 pCI-hROBO4 또는 음성 대조군 pCI-모의물로 형질감염시키고, 96웰 절반 면적 플레이트(코닝 인코포레이티드(Corning Inc.)에 의해 제조됨)에 50 ㎕/웰의 농도로 분배하고, 5% CO2 조건 하에서 37℃에서 10% FBS를 함유하는 DMEM 배지에서 밤새 배양하였다. 수득된 형질감염된 세포들을 서로 부착시키면서 세포-ELISA에서 사용하였다.
2)-4-2 유동 세포측정 분석을 위한 항원 유전자 발현 세포의 제조
HEK293T 세포를 225-cm2 플라스크(스미토모 베이켈라이트 컴파니 리미티드(Sumitomo Bakelite Co., Ltd.)에 의해 제조됨)에 1.125 x 107개 세포/플라스크의 농도로 접종하고, 5% CO2 조건 하에서 37℃에서 10% FBS를 함유하는 DMEM 배지에서 밤새 배양하였다. 다음 날, 리포펙타민 2000을 사용하여 HEK293T 세포를 pCI-ROBO4 또는 음성 대조군 pCI-모의물로 형질감염시키고, 5% CO2 조건 하에서 37℃에서 밤새 더 배양하였다. 다음 날, 발현 벡터로 형질감염된 HEK293T 세포를 TrypLE 익스프레스(Express)(라이프 테크놀로지스 코포레이션에 의해 제조됨)로 처리하고 10% FBS를 함유하는 DMEM 배지로 세척한 후 5% FBS를 함유하는 PBS에 현탁하였다. 수득된 세포 현탁액을 유동 세포측정 분석에서 사용하였다.
2)-5 세포-ELISA
발현 벡터로 형질감염된 HEK293 세포(상기 2)-4-1에서 제조됨)로부터 상청액을 제거한 후, 하이브리도마 배양 상청액을 pCI-hROBO4로 형질감염된 HEK293 세포 및 pCI-모의물로 형질감염된 HEK293 세포 각각에 첨가하고, 세포를 4℃에서 1시간 동안 방치하였다. 각각의 웰 내의 세포를, 5% FBS를 함유하는 PBS로 1회 세척하였다. 그 다음, 5% FBS를 함유하는 PBS로 500배 희석된, 염소에서 생성된 항-마우스 IgG-퍼록시다제 항체(시그마-알드리치 코포레이션(Sigma-Aldrich Corp.)에 의해 제조됨)를 상기 세포에 첨가하고, 세포를 4℃에서 1시간 동안 방치하였다. 각각의 웰 내의 세포를, 5% FBS를 함유하는 PBS로 5회 세척하였다. 그 다음, OPD 용해 용액(0.05 M 구연산삼나트륨, 0.1 M 인산수소이나트륨 12수화물, pH 4.5)에 각각 0.4 mg/㎖ 및 0.6%(부피/부피)의 농도로 용해된 OPD 착색 용액(o-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드(와코 퓨어 케미칼 인더스트리스 리미티드(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)에 의해 제조됨) 및 H2O2를 25 ㎕/웰의 농도로 상기 세포에 첨가하였다. 간헐적으로 교반하면서 착색 반응을 수행하고 1 M HCl을 25 ㎕/웰의 농도로 첨가하여 중지시켰다. 그 다음, 플레이트 판독기(엔비젼(ENVISION); 퍼킨 엘머 인코포레이티드(Perkin Elmer, Inc.)에 의해 제조됨)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포막 표면 상에서 발현된 ROBO4에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하는 하이브리도마를 선택하기 위해, 음성 대조군 pCI-모의물로 형질감염된 HEK293 세포에 비해 pCI-hROBO4로 형질감염된 HEK293 세포에서 보다 높은 흡광도를 나타내는 배양 상청액 중의 하이브리도마를 항-ROBO4 항체 생성 양성 하이브리도마로서 선택하였다.
2)-6 유동 세포측정 분석
2)-5 세포-ELISA에서 양성으로 확인된 각각의 하이브리도마에 의해 생성된 항체는 ROBO4에 결합한다는 것을 유동 세포측정으로 더 확인하였다. 2)-4-2에서 제조된 HEK293T 세포 현탁액을 원심분리하였다. 상청액의 제거 후, 하이브리도마 배양 상청액을 pCI-hROBO4로 형질감염된 세포 및 pCI-모의물로 형질감염된 세포 각각에 첨가하고, 발생된 현탁액을 1시간 동안 4℃에서 방치하였다. 세포를, 5% FBS를 함유하는 PBS로 2회 세척하였다. 그 다음, 5% FBS를 함유하는 PBS로 1000배 희석된 항-마우스 IgG FITC 접합체(시그마-알드리치 코포레이션에 의해 제조됨) 또는 5% FBS를 함유하는 PBS로 320배 희석된 항-래트 IgG FITC 접합체(시그마-알드리치 코포레이션에 의해 제조됨)를 상기 세포에 첨가하고, 발생된 현탁액을 1시간 동안 4℃에서 방치하였다. 세포를, 5% FBS를 함유하는 PBS로 3회 세척한 후, 5% FBS 및 2 ㎍/㎖ 7-아미노악티노마이신 D(몰레큘라 프로브스(Molecular Probes)에 의해 제조됨)를 함유하는 PBS에 재현탁하고, 유동 세포측정기(FC500; 벡크만 코울터 인코포레이티드(Beckman Coulter, Inc.)에 의해 제조됨)를 이용하여 검출하였다. 플로우조(Flowjo)(트리스타 인코포레이티드(TreeStar Inc.)에 의해 제조됨)를 이용하여 데이터를 분석하였다. 7-아미노악티노마이신 D 양성 사멸 세포를 게이팅(gating)으로 배제한 후, 생존 세포에 대한 FITC 형광 강도의 막대그래프를 작성하였다. pCI-ROBO4로 형질감염된 HEK293T 세포의 막대그래프가 음성 대조군 pCI-모의물로 형질감염된 293T 세포의 막대그래프에 비해 더 강한 형광 강도 영역으로 이동되어 있는 샘플을 생성하는 하이브리도마를 항-ROBO4 항체 생성 하이브리도마로서 수득하였다. 수득된 하이브리도마에 의해 생성된 항-ROBO4 항체들은 각각 MAb1, MAb2, MAb3 및 MAb4로서 명명되었다.
2)-7 단일클론 항체의 동종형분류
마우스 단일클론 동종형분류 키트 또는 래트 단일클론 동종형분류 키트(애이비디 세로텍에 의해 제조됨)를 사용하여 각각의 단일클론 항체의 동종형을 결정하였다. 결과는 IgG1(MAb1 및 MAb2) 및 IgG2b(MAb3 및 MAb4)이었다.
2)-8 단일클론 항체의 제조
하이브리도마 배양 상청액(이하, "항체 정제 스톡"으로서 지칭됨)으로부터 각각의 단일클론 항체를 정제하였다.
항체 정제 스톡을 다음과 같이 제조하였다: 8 내지 9 x 107개의 하이브리도마를 1272-cm2 플라스크(코닝 인코포레이티드에 의해 제조됨)에 접종하고 5% CO2 조건 하에서 37℃에서 20% 울트라-로우(Ultra-LoW) IgG 태아 소혈청을 함유하는 하이브리도마 SFM 배지(라이프 테크놀로지스 코포레이션에 의해 제조됨)에서 4일 동안 배양한 후, 상청액을 수집하였다.
하이트랩(Hitrap) 단백질 G HP 또는 하이트랩 맙셀렉트 슈어(MabSelect SuRe)(지이 헬쓰케어 바이오-사이언시스 코포레이션에 의해 제조됨)를 사용하여 항체를 정제하였다. 하이트랩 단백질 G HP의 경우, 항체 정제 스톡을 컬럼에 첨가하고 결합 완충제(0.02 M 인산나트륨, pH 7.0)로 세척한 후, 0.1 M 글리신(pH 2.7)으로 용출하였다. 대조적으로, 하이트랩 맙셀렉트 슈어의 경우, 항체 정제 스톡을 컬럼에 첨가하고 PBS로 세척한 후, 2 M 아르기닌-HCl(pH 4.0)로 용출하였다. 용출된 항체 용액을 중화한 후, 완충제를 PBS로 교체하였다. BCA 단백질 분석 시약을 사용하여 하이트랩 단백질 G HP로 정제된 항체의 농도를 측정하였다. 마우스 IgG2a(알앤드디 시스템스 인코포레이티드(R&D systems, Inc.)에 의해 제조됨)를 보정 곡선용 표준물로서 사용하였다. 대안적으로, POROS G 20 ㎛ 컬럼 PEEK(4.6 mm x 50 mm, 0.83 ㎖)(어플라이드 바이오시스템스 인코포레이티드에 의해 제조됨)에 결합된 항체의 용출물에서 흡광도(O.D. 280 nm)를 측정함으로써 하이트랩 맙셀렉트 슈어로 정제된 항체의 농도를 측정하였다. 구체적으로, PBS로 희석된 항체 샘플을 평형 완충제(30.6 mM 인산이수소나트륨 12수화물, 19.5 mM 인산일칼륨, 0.15 M NaCl, pH 7.0)로 평형화된 POROS G 20 ㎛에 첨가하였다. 컬럼을 평형 완충제로 세척한 후, 컬럼에 결합된 항체를 용출제(0.1%(부피/부피) HCl, 0.15 M NaCl)로 용출하였다. 용출물 중의 흡광도(O.D. 280 nm)의 피크 면적을 측정하고, 농도를 하기 방정식에 따라 계산하였다: 항체 샘플 농도(mg/㎖) = (항체 샘플의 피크 면적)/(표준물(인간 IgG1)의 피크 면적) x 표준물의 농도(mg/㎖) x 샘플의 희석비.
(실시예 3) ROBO4 다운스트림 신호의 활성화의 검출
3)-1 인터류킨-8(IL-8) 프로모터 영역을 반응 요소로서 포함하는 리포터 벡터의 제조
IL-8 프로모터 영역 DNA를 주형으로서 사용하고 하기 프라이머 세트를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다:
Figure 112014100448286-pct00018
수득된 PCR 생성물을 pCR4Blunt-TOPO 벡터에 도입하여 IL-8 프로모터 영역(-253 내지 -59) DNA를 포함하는 클로닝 벡터를 제조하였다. KpnI 및 SacI을 사용하여 상기 클로닝 벡터로부터 IL-8 프로모터 영역(-253 내지 -59) DNA를 절단하고 pGL4.15 벡터(프로메가 코포레이션에 의해 제조됨) 사이에 도입하여 IL-8 프로모터 영역을 반응 요소로서 포함하는 리포터 벡터를 제조하였다. IL-8 프로모터 영역(-253 내지 -59) DNA의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 29에 제시되어 있다.
3)-2 핵 인자-κB(NF-κB), 인터페론 감마 활성화 서열(GAS), 인터페론에 의해 자극되는 반응 요소(ISRE) 또는 형질감염 등급 T 세포 인자(TCF)를 반응 요소로서 포함하는 리포터 벡터
pGL4.32[luc2P/NF-κB-RE/Hygro] 벡터(프로메가 코포레이션에 의해 제조됨), pGAS-TA-Luc 벡터(타카라 바이오 인코포레이티드에 의해 제조됨), pISRE-TA-Luc 벡터(타카라 바이오 인코포레이티드에 의해 제조됨) 및 TOPflash(밀리포어 코포레이션(Millipore Corp.)에 의해 제조됨)를, 각각 NF-κB, GAS, ISRE 또는 TCF를 반응 요소로서 포함하는 리포터 벡터로서 사용하였다. 대안적으로, 반응 서열 무함유 pTA-Luc 벡터(타카라 바이오 인코포레이티드에 의해 제조됨)를 음성 대조군으로서 사용하였다. pRL-TK 벡터(타카라 바이오 인코포레이티드에 의해 제조됨)를 내부 대조군으로서 사용하였다.
3)-3 인간 ROBO4를 일시적으로 발현하는 세포에서 변화하는 신호의 분석
HEK293 세포를 96웰 플레이트(콜라겐 I으로 코팅됨; 아사히 글라스 컴파니 리미티드(Asahi Glass Co., Ltd.)에 의해 제조됨)에 2 x 104개 세포/웰의 농도로 접종하고, 5% CO2 조건 하에서 37℃에서 10% FBS를 함유하는 DMEM 배지에서 밤새 배양하였다. 다음 날, 퓨진(FuGene)6 형질감염 시약을 사용하여 HEK293 세포를 pCI-ROBO4, pCI-ROBO4-ΔC 또는 음성 대조군 pCI-모의물, 및 3)-1 및 3)-2에 기재된 각각의 리포터 벡터로 형질감염시키고, 5% CO2 조건 하에서 37℃에서 밤새 더 배양하였다. 다음 날, 듀얼-글로(Dual-Glo) 루시퍼라제 분석 시스템(프로메가 코포레이션에 의해 제조됨)을 이용하여 플레이트 판독기(미쓰라스(Mithras); 버쏠드 테크놀로지스 게엠베하 앤드 컴파니 카게(Berthold Technologies GmbH & Co, KG)에 의해 제조됨)에서 각각의 웰의 초파리 루시퍼라제 및 레닐라(Renilla) 루시퍼라제 활성을 발광 강도로서 측정하고, 각각의 웰의 리포터 활성을 하기 방정식에 따라 계산하였다: 리포터 활성 = 초파리 루시퍼라제 활성 유래의 발광 강도/레닐라 루시퍼라제 활성 유래의 발광 강도. 결과적으로, 음성 대조군 pCI-모의물로 형질감염된 세포에 비해 pCI-hROBO4로 형질감염된 세포에서 IL-8 프로모터 활성만이 증가되었다(도 1). 뿐만 아니라, pCI-hROBO4로 형질감염된 세포에서 검출된 IL-8 프로모터 활성의 증가는 pCI-hROBO4-ΔC(hROBO4의 세포내 영역 결실 돌연변이체)로 형질감염된 세포에서 급격히 약화되었는데, 이것은 pCI-hROBO4로 형질감염된 세포에서 검출된 IL-8 프로모터 활성의 증가가 ROBO4의 세포내 영역을 필요로 한다는 것을 입증한다(도 2). 따라서, pCI-hROBO4로 형질감염된 세포에서의 IL-8 프로모터 활성의 증가는 ROBO4 다운스트림 신호의 활성화가 검출된다는 것을 입증하였다.
(실시예 4) MAb1의 성질
4)-1 MAb1에 의한 ROBO4 다운스트림 신호의 활성화
pCI-hROBO4로 형질감염된 세포 또는 pCI-모의물로 형질감염된 세포(상기 3)-3에서 제조됨)를 밤새 배양하였다. 다음 날, 각각의 항-ROBO4 항체(MAb1, MAb2, MAb3 또는 MAb4) 또는 음성 대조군 마우스 IgG1(알앤드디 시스템스 인코포레이티드에 의해 제조됨)을 0, 0.3125, 1.25, 5 및 20 ㎍/㎖ 또는 0, 0.25, 1, 4 및 16 ㎍/㎖의 농도로 상기 세포에 첨가하고, 세포를 5% CO2 조건 하에서 37℃에서 5시간 동안 배양하였다. 그 다음, 듀얼-글로 루시퍼라제 분석 시스템(프로메가 코포레이션에 의해 제조됨)을 이용하여 플레이트 판독기(미쓰라스)에서 각각의 웰의 초파리 루시퍼라제 및 레닐라 루시퍼라제 활성을 발광 강도로서 측정하고, 각각의 웰의 리포터 활성을 하기 방정식에 따라 계산하였다: 리포터 활성 = 초파리 루시퍼라제 활성 유래의 발광 강도/레닐라 루시퍼라제 활성 유래의 발광 강도. 결과적으로, 음성 대조군 마우스 IgG는 인간 ROBO4를 일시적으로 발현하는 세포에서 IL-8 프로모터 활성에 영향을 미치지 않은 반면, MAb1은 IL-8 프로모터 활성을 증가시켰다(도 3). MAb1에서와 같이, MAb2도 IL-8 프로모터 활성을 증가시킨 반면, MAb3 또는 MAb4는 IL-8 프로모터 활성을 증가시키지 않았다(도 4). pCI-모의물 세포에서, MAb1 또는 MAb2는 IL-8 프로모터 활성을 증가시키지 않았다. 이들 결과는 MAb1이 ROBO4의 다운스트림 신호를 활성화시키고 ROBO4에 대한 모든 항체들이 ROBO4의 다운스트림 신호를 활성화시키지는 않는다는 것을 입증하였다.
ROBO4 다운스트림 신호의 활성을 증가시키지 않는 것으로 확인된 MAb3 및 MAb4를 교차-연결 항체(아피퓨어(AffiPure) 염소 항-마우스 IgG Fc 단편 특이적, 카탈로그 번호 115-005-071, 잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch))(1개의 MAb3 또는 MAb4 분자 당 2개의 교차-연결 항체 분자)의 존재 하에서 프로모터 활성에 대해 평가하였다. 결과적으로, 상기 두 항체들의 경우 프로모터 활성의 증가가 관찰되었다.
4)-2 HUVEC 이동 시험
HUVEC(쿠라보 인더스트리스 리미티드(KURABO INDUSTRIES LTD.)에 의해 제조됨)를 5% CO2 조건 하에서 37℃에서 0.1% BSA를 함유하는 휴메디아(HuMedia)-EB2(쿠라보 인더스트리스 리미티드에 의해 제조됨)에서 밤새 배양한 후, 0.1% BSA를 함유하는 휴메디아-EB2를 사용하여 4 x 105개 세포/㎖로 조절하였다. 4 x 105개 세포/㎖의 농도를 갖는 세포 현탁액 0.25 ㎖를, 젤라틴으로 코팅된 막을 갖는 비디 팔콘 플루오로블록(BD Falcon FluoroBlok) 24 멀티웰 삽입체 시스템(공극 크기: 8 ㎛) 내의 챔버 상층에 첨가하였다. 그 다음, 0.1% BSA 및 10 ng/㎖ 인간 VEGF165(펩프로텍 인코포레이티드(PeproTech Inc.)에 의해 제조됨) 또는 인간 bFGF(비디 바이오사이언시스) 및 2 ㎍/㎖ 마우스 IgG2a 또는 각각의 항-ROBO4 항체(MAb1, MAb2, MAb3 또는 MAb4)를 함유하는 휴메디아-EB2를 상기 챔버의 하층에 첨가하였다. 5% CO2 조건 하에서 37℃에서 2시간 내지 3시간 동안 항온처리한 후, 하층으로 이동한 HUVEC를, 4 ㎍/㎖ 칼세인-AM(라이프 테크놀로지스 코포레이션에 의해 제조됨)을 함유하는 휴메디아-EB2로 15분 동안 염색하였다. 그 다음, 플레이트 판독기(플렉스스테이션(FlexStation); 몰레큘라 디바이시스 엘엘씨(Molecular Devices, LLC.))를 이용하여 각각의 웰의 형광 강도(여기 파장/형광 파장: 485 nm/538 nm)를 측정하고, 각각의 웰에서 이동 세포의 양을 하기 방정식에 따라 계산하였다: 이동 세포의 양 = HUVEC로 보충된 웰의 형광 강도 - HUVEC로 보충되지 않은 웰의 형광 강도. 결과적으로, MAb1은 VEGF 또는 bFGF에 의해 유도된 HUVEC의 이동을 억제하였다(도 5). MAb1에서와 같이, MAb2도 bFGF에 의해 유도된 HUVEC의 이동을 억제한 반면, MAb3 또는 MAb4는 상기 세포 이동을 억제하지 않았다(도 6). 이들 결과는 항-ROBO4 항체에 의한 IL-8 프로모터 활성의 증가가 HUVEC 이동에 대한 억제 활성과 상관관계를 갖는다는 것을 입증하였다.
4)-3 교차-종 반응성
4)-3-1 항원 유전자 발현 세포의 제조
HEK293 세포를 60-mm 디쉬(코닝 인코포레이티드에 의해 제조됨)에 1.5 x 106개 세포/디쉬의 농도로 접종하고, 5% CO2 조건 하에서 37℃에서 10% FBS를 함유하는 DMEM 배지에서 밤새 배양하였다. 다음 날, 퓨진6 형질감염 시약을 사용하여 HEK293 세포를 pCI-hROBO4, pCI-mROBO4, pCI-raROBO4, pCI-FLAG-cynoROBO4-1, pCI-FLAG-cynoROBO4-2, pCI-hROBO1, pCI-hROBO2 또는 pCI-hROBO3으로 형질감염시키고 5% CO2 조건 하에서 37℃에서 밤새 더 배양하였다. 다음 날, 발현 벡터로 형질감염된 세포를 TrypLE 익스프레스(라이프 테크놀로지스 코포레이션에 의해 제조됨)로 처리하고, 5% FBS를 함유하는 PBS로 세척한 후, 5% FBS를 함유하는 PBS에 현탁하였다. 수득된 세포 현탁액을 유동 세포측정 분석에서 사용하였다.
4)-3-2 유동 세포측정 분석
4)-3-1에서 제조된 각각의 세포 현탁액을 원심분리하고, 상청액을 제거하였다. 그 다음, MAb1 또는 음성 대조군 마우스 IgG2a를 발현 벡터로 형질감염된 2 x 105개의 세포에 10 ㎍/㎖의 농도로 첨가하고, 발생된 현탁액을 4℃에서 1시간 동안 방치하였다. 상기 세포를, 5% FBS를 함유하는 PBS로 1회 세척하였다. 그 다음, 5% FBS를 함유하는 PBS로 1000배 희석된 항-마우스 IgG FITC 접합체를 상기 세포에 첨가하고, 발생된 현탁액을 4℃에서 1시간 동안 방치하였다. 상기 세포를, 5% FBS를 함유하는 PBS로 3회 세척한 후, 5% FBS를 함유하는 PBS에 재현탁하고, 유동 세포측정기(BD FACSCalibur)를 이용하여 검출하였다. 플로우조를 이용하여 데이터를 분석하였다. FITC 형광 강도의 막대그래프를 작성하였다. MAb1의 막대그래프가 음성 대조군 마우스 IgG2a의 막대그래프에 비해 보다 강한 형광 강도 영역으로 이동하였을 때 상기 항체가 교차-종 방식으로 결합한다는 결론을 내렸다. 교차-종 반응성 연구의 결과는 MAb1이 마우스 ROBO4 또는 래트 ROBO4에 결합하지 않지만 인간 ROBO4 및 사이노몰구스 원숭이 ROBO4에는 결합한다는 것을 입증하였다(도 7).
4)-4 결합 특이성
4)-4-1 항원 유전자 발현 세포의 제조
HEK293 세포를 60-mm 디쉬(코닝 인코포레이티드에 의해 제조됨)에 1.2 x 106개 세포/디쉬 또는 1.5 x 106개 세포/디쉬의 농도로 접종하고, 5% CO2 조건 하에서 37℃에서 10% FBS를 함유하는 DMEM 배지에서 밤새 배양하였다. 다음 날, 퓨진6 형질감염 시약을 사용하여 HEK293 세포를 pCI-hROBO4, pCI-FLAG-hROBO1, pCI-hROBO2 또는 pCI-hROBO3으로 형질감염시키고 5% CO2 조건 하에서 37℃에서 밤새 더 배양하였다. 다음 날, 발현 벡터로 형질감염된 세포를 TrypLE 익스프레스(라이프 테크놀로지스 코포레이션에 의해 제조됨)로 처리하고, 5% FBS를 함유하는 PBS로 세척한 후, 5% FBS를 함유하는 PBS에 현탁하였다. 수득된 세포 현탁액을 유동 세포측정 분석에서 사용하였다.
4)-4-2 유동 세포측정 분석
4)-4-1에서 제조된 각각의 세포 현탁액을 원심분리하고, 상청액을 제거하였다. 그 다음, MAb1, 양성 대조군 인간 ROBO4 항체(알앤드디 시스템스 인코포레이티드에 의해 제조됨), 마우스에서 생성된 단일클론 항-FLAG M2 항체(시그마-알드리치 코포레이션에 의해 제조됨), 인간 ROBO2 항체(알앤드디 시스템스 인코포레이티드에 의해 제조됨), 단일클론 항-인간 ROBO3 항체(알앤드디 시스템스 인코포레이티드에 의해 제조됨), 또는 음성 대조군 마우스 IgG1 또는 마우스 IgG2a를 발현 벡터로 형질감염된 2 x 105개의 세포에 10 ㎍/㎖의 농도로 첨가하고, 발생된 현탁액을 4℃에서 1시간 동안 방치하였다. 상기 세포를, 5% FBS를 함유하는 PBS로 1회 세척하였다. 그 다음, 5% FBS를 함유하는 PBS로 1000배 희석된 항-마우스 IgG FITC 접합체를 상기 세포에 첨가하고, 발생된 현탁액을 4℃에서 1시간 동안 방치하였다. 상기 세포를, 5% FBS를 함유하는 PBS로 3회 세척한 후, 5% FBS를 함유하는 PBS에 재현탁하고, 유동 세포측정기(BD FACSCalibur)를 이용하여 검출하였다. 플로우조를 이용하여 데이터를 분석하였다. FITC 형광 강도의 막대그래프를 작성하였다. MAb1의 막대그래프가 음성 대조군 마우스 IgG1 또는 마우스 IgG2a의 막대그래프에 비해 보다 강한 형광 강도 영역으로 이동하였을 때 상기 항체가 특이적 방식으로 결합한다는 결론을 내렸다. 상기 결과는 MAb1이 hROBO1, hROBO2 또는 hROBO3에 결합하지 않지만 hROBO4에는 특이적으로 결합한다는 것을 입증하였다(도 8). 이와 관련하여, 양성 대조군 항체를 사용하여 hROBO4, hROBO1, hROBO2 및 hROBO3 각각이 세포막 상에서 발현된다는 것을 확인하였다(도 8).
4)-5 에피토프 결정
4)-5-1 항원 유전자 발현 세포의 제조
HEK293 세포를 60-mm 디쉬(코닝 인코포레이티드에 의해 제조됨)에 1.5 x 106개 세포/디쉬의 농도로 접종하고, 5% CO2 조건 하에서 37℃에서 10% FBS를 함유하는 DMEM 배지에서 밤새 배양하였다. 다음 날, 퓨진6 형질감염 시약을 사용하여 HEK293 세포를 pCI-FLAG-hROBO4-28, pCI-FLAG-hROBO4-46, pCI-FLAG-hROBO4-132, pCI-FLAG-hROBO4-210, pCI-FLAG-hROBO4-225 또는 pCI-FLAG-hROBO4-341로 형질감염시키고 5% CO2 조건 하에서 37℃에서 밤새 더 배양하였다. 다음 날, 발현 벡터로 형질감염된 세포를 TrypLE 익스프레스(라이프 테크놀로지스 코포레이션에 의해 제조됨)로 처리하고, 5% FBS를 함유하는 PBS로 세척한 후, 5% FBS를 함유하는 PBS에 현탁하였다. 수득된 세포 현탁액을 유동 세포측정 분석에서 사용하였다.
4)-5-2 유동 세포측정 분석
4)-5-1에서 제조된 각각의 세포 현탁액을 원심분리하고, 상청액을 제거하였다. 그 다음, MAb1, 마우스에서 생성된 양성 대조군 단일클론 항-FLAG M2 항체 또는 음성 대조군 마우스 IgG2a를 발현 벡터로 형질감염된 2 x 105개의 세포에 10 ㎍/㎖의 농도로 첨가하고, 발생된 현탁액을 4℃에서 1시간 동안 방치하였다. 상기 세포를, 5% FBS를 함유하는 PBS로 1회 세척하였다. 그 다음, 5% FBS를 함유하는 PBS로 1000배 희석된 항-마우스 IgG FITC 접합체를 상기 세포에 첨가하고, 발생된 현탁액을 4℃에서 1시간 동안 방치하였다. 상기 세포를, 5% FBS를 함유하는 PBS로 3회 세척한 후, 5% FBS를 함유하는 PBS에 재현탁하고, 유동 세포측정기(BD FACSCalibur, 비디 바이오사이언시스)를 이용하여 검출하였다. 플로우조를 이용하여 데이터를 분석하였다. FITC 형광 강도의 막대그래프를 작성하였다. MAb1의 막대그래프가 음성 대조군 마우스 IgG2a의 막대그래프에 비해 보다 강한 형광 강도 영역으로 이동하였을 때 상기 항체가 세포에 결합한다는 결론을 내렸다. 상기 결과는 MAb1이 pCI-FLAG-hROBO4-28, pCI-FLAG-hROBO4-46 또는 pCI-FLAG-hROBO4-132로 형질감염된 세포에 결합하고 pCI-FLAG-hROBO4-210, pCI-FLAG-hROBO4-225 또는 pCI-FLAG-hROBO4-341로 형질감염된 세포에는 결합하지 않는다는 것을 입증하였다. 따라서, MAb1은 서열번호 2에 제시된 인간 ROBO4의 아미노산 132 내지 209의 아미노산 서열을 인식한다는 것이 밝혀졌다(도 9). 이와 관련하여, 양성 대조군 항-FLAG 항체를 사용하여 각각의 세포내 영역/도메인 결실 변이체가 세포막 상에서 발현된다는 것을 확인하였다(도 9).
4)-6 레이저-유도된 맥락막 혈관신생을 갖는 원숭이 모델에서의 약물 효능 평가
4)-6-1 마취
메데토미딘 염산염(니폰 젠야쿠 고교 컴파니 리미티드(Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.)에 의해 제조됨)을 0.04 mg/kg의 복용량으로 각각의 사이노몰구스 원숭이에게 근육내 주사하였다. 그로부터 15분 후, 케타민 염산염(다이이치 산쿄 컴파니 리미티드(Daiichi Sankyo Co., Ltd.)에 의해 제조됨)을 15 mg/kg의 복용량으로 상기 사이노몰구스 원숭이에게 근육내 주사하였다.
4)-6-2 모델 제조
4)-6-1에서 마취된 각각의 사이노몰구스 원숭이를 원숭이 의자에 억류시켰다. 눈 표면의 마취/진통 처리를 위해 4% 자일로카인(Xylocaine) 점안제(아스트라제네카 피엘씨(AstraZeneca plc)에 의해 제조됨)를 양 눈에 도포하였다. 산동(mydriasis)을 위해 5 mg/㎖ 트로픽아미드 - 5 mg/㎖ 페닐에프린 염산염 혼합물 점안제(산텐 파마슈티칼 컴파니 리미티드(Santen Pharmaceutical Co., Ltd.)에 의해 제조됨)를 눈에 도포하였다. 녹색 레이저 광응고기 오큐라이트(OcuLight) GLx(이리덱스 코포레이션(Iridex Corp.)에 의해 제조됨)를 이용하여 망막의 황반 영역을 레이저 조사(조사된 열의 양: 350 내지 500 mW, 조사 시간: 0.1초, 점 크기: 50 ㎛, 점의 수: 6개 또는 9개의 점)로 열적으로 손상시켰다.
4)-6-3 시험 물질의 투여
모델 제조 후 7일째 날, 33G 나노패스(Nanopass) 바늘을 결막으로부터 유리체 내로 삽입하고, PE20 폴리에틸렌 튜브를 통해 100 ㎕ 해밀톤 주사기를 이용하여 50 ㎕의 비히클 또는 13.2 mg/㎖의 MAb1을 2분에 걸쳐 상기 유리체 내로 주사하였다. 4개의 눈을 포함하는 각각의 군에 대해 시험을 수행하였다. 투여의 완료 후, 0.5% 레보플록사신 수화물 점안제(산텐 파마슈티칼 컴파니 리미티드에 의해 제조됨)를 눈에 도포하였다.
4)-6-4 약물 효능 평가
모델 제조 후 7일째 날, 14일째 날 및 21일째 날, 마취 하에서 하이브리드 안저 카메라 CX-1(캐논 인코포레이티드(Canon Inc.)에 의해 제조됨)을 이용하여 상용적인 방법으로 안저를 촬영하였다. 그 다음, 10% 플루오레세인을 0.1 ㎖/kg의 복용량으로 정맥내 주사하였다. 플루오레세인의 정맥내 주사의 완료 후, 형광 혈관조영술을 1분 내지 최대 6분마다 수행하였다. 이미지 데이터를 저장하고, 플루오레세인이 축적된 부위의 면적을 이미지 분석기(윈루프(WinRoof), 미타니 코포레이션(Mitani Corp.)에 의해 제조됨)를 이용하여 계산하였다. 새로 형성된 혈관의 양을 하기 방정식에 따라 계산하였다: 새로 형성된 혈관의 양 = 모델 제조 후 21일째 날 플루오레세인이 축적된 부위의 면적 - 모델 제조 후 7일째 날 플루오레세인이 축적된 부위의 면적. 비히클을 투여받은 군과 MAb1을 투여받은 군 사이에 새로 형성된 혈관의 양을 비교한 결과, MAb1을 투여받은 군에서 4개의 눈 중 3개의 눈이 새로 형성된 혈관의 양을 감소시킨다는 것을 확인하였지만, 남은 1개의 눈과 비히클 군 사이에는 새로 형성된 혈관의 양에서의 차이가 확인되지 않았다. 이것은 MAb1의 투여가 레이저-유도된 맥락막 혈관신생을 억제하였다는 것을 의미한다(도 10).
(실시예 5) MAb1 cDNA의 클로닝 및 서열결정
5)-1 MAb1 중쇄 및 경쇄의 N-말단 아미노산 서열의 결정
MAb1의 중쇄 및 경쇄의 N-말단 아미노산 서열을 결정하기 위해, 실시예 2)-8에서 정제된 MAb1을 SDS-PAGE로 분리하였다. 이로써 겔에서 분리된 단백질을 상기 겔로부터 세퀴-블롯(Sequi-Blot) PVDF 막(바이오-라드 라보라토리스 인코포레이티드)으로 옮긴 후 세척 완충제(25 mM NaCl, 10 mM 붕산나트륨 완충제, pH 8.0)로 세척한 다음, 염색 용액(50% 메탄올, 20% 아세트산, 0.05% 쿠마시 브릴리언트 블루)에 5분 동안 침지시켜 염색한 후, 90% 메탄올로 탈색하였다. PVDF 막 상에서 가시화된 중쇄에 상응하는 밴드 부분(보다 작은 이동을 갖는 밴드) 및 경쇄에 상응하는 밴드 부분(보다 큰 이동을 갖는 밴드)을 절단하였다. 프로사이스(Procise) cLC 단백질 서열결정기 모델 492cLC(어플라이드 바이오시스템스 인코포레이티드)를 이용하여 그들 각각의 N-말단 아미노산 서열을 자동 에드만(Edman) 방법(문헌(Edman et al., (1967) Eur. J. Biochem. 1, 80) 참조)에 따라 확인하였다. 결과적으로, MAb1의 중쇄에 상응하는 밴드의 N-말단 아미노산 서열은 EVQLVESGGGLVKPGGSLKL이고, 경쇄에 상응하는 밴드의 N-말단 아미노산 서열은 DAVMTQTPLSLPVSL이었다.
5)-2 MAb1 생성 하이브리도마로부터의 mRNA의 제조
MAb1의 중쇄 및 경쇄 코딩 cDNA들을 클로닝하기 위해, mRNA 단리 키트(로슈 어플라이드 사이언스(Roche Applied Science))를 사용하여 MAb1 생성 하이브리도마로부터 mRNA를 제조하였다.
5)-3 MAb1 cDNA의 클로닝 및 서열결정
MAb1 중쇄 및 경쇄 각각의 γ1 및 κ 동종형(실시예 2)-7 및 5-1)을 기초로 결정된 중쇄 및 경쇄의 N-말단 아미노산 서열, 및 카바트와 그의 동료들에 의해 구축된 항체 아미노산 서열 데이터베이스(문헌(Strausberg, R. L., et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99. 16899-16903) 및 문헌(Kabat, E. A., et al. (1991) in Sequences of Proteins of Immunological Interest Vol. I and II, U. S. Department of Health and Human Services) 참조)를 참조하여 항체 유전자의 코딩 영역의 5'-말단 서열 및 상기 항체 유전자의 정지 코돈 함유 3'-말단 서열 각각에 혼성화하는 여러 올리고뉴클레오티드 프라이머들을 합성하였다. 5)-2에서 제조된 mRNA 및 타카라 원 스텝(One Step) RNA PCR 키트(AMV)(타카라 바이오 인코포레이티드)를 사용하여 중쇄 및 경쇄 코딩 cDNA들을 증폭하였다. 그 결과, 하기 프라이머 세트를 사용하여 항체의 중쇄 및 경쇄 코딩 cDNA들을 성공적으로 증폭하였다:
중쇄에 대한 프라이머 세트
Figure 112014100448286-pct00019
경쇄에 대한 프라이머 세트
Figure 112014100448286-pct00020
pEF6/V5-His TOPO TA 발현 키트(인비트로겐 코포레이션(Invitrogen Corp.))를 사용하여 PCR에 의해 증폭된 중쇄 및 경쇄 cDNA들을 별도로 클로닝하였다. 유전자 서열결정기("ABI PRISM 3700 DNA 분석기; 어플라이드 바이오시스템스" 또는 "어플라이드 바이오시스템스 3730x1 분석기; 어플라이드 바이오시스템스")를 이용하여 중쇄 및 경쇄의 각각의 가변 영역을 코딩하는 클로닝된 cDNA들의 뉴클레오티드 서열을 결정하였다. GeneAmp 9700(어플라이드 바이오시스템스 인코포레이티드)을 이용하여 서열결정 반응을 수행하였다.
MAb1의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 cDNA의 결정된 뉴클레오티드 서열은 서열번호 30에 제시되어 있고, 그의 아미노산 서열은 서열번호 31에 제시되어 있다. 마우스 항체 MAb1의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 32에 제시되어 있고 그의 아미노산 서열은 서열번호 33에 제시되어 있다.
(실시예 6) 키메라 MAb1(cMAb1)의 제조
6)-1 발현 벡터 pCMA-LK, pCMA-G1 및 pCMA-G2의 제조
6)-1-1 인간화된 키메라 경쇄 발현 벡터 pCMA-LK의 구축
플라스미드 pcDNA3.3-TOPO/LacZ(인비트로겐 코포레이션)를 제한효소 XbaI 및 PmeI로 분해하고, 인-퓨전 어드밴티지(In-Fusion Advantage) PCR 클로닝 키트(클론텍 라보라토리스 인코포레이티드(Clontech Laboratories, Inc.))를 사용하여 대략 5.4 kB의 수득된 단편을, 인간 κ 쇄 분비 신호 및 인간 κ 쇄 불변 영역을 코딩하는 DNA 서열(서열번호 34)을 포함하는 DNA 단편에 연결하여 pcDNA3.3/LK를 제조하였다.
pcDNA3.3/LK를 주형으로서 사용하고 하기 제시된 프라이머 세트를 사용하여 PCR을 수행하였다. 대략 3.8 kB의 수득된 단편을 인산화한 후 자가-연결함으로써, CMV 프로모터의 다운스트림에서 신호 서열 코딩 서열, 클로닝 부위 및 인간 κ 쇄 불변 영역 코딩 서열을 갖는 인간화된 키메라 경쇄 발현 벡터 pCMA-LK를 pcDNA3.3/LK로부터 구축하였다.
프라이머 세트
Figure 112014100448286-pct00021
6)-1-2 인간화된 키메라 IgG1형 중쇄 발현 벡터 pCMA-G1의 구축
pCMA-LK를 XbaI 및 PmeI로 분해하여 κ 쇄 분비 신호 및 인간 κ 쇄 불변 영역을 코딩하는 서열을 제거하였다. 인-퓨전 어드밴티지 PCR 클로닝 키트(클론텍 라보라토리스 인코포레이티드)를 사용하여 발생된 DNA 단편을, 인간 중쇄 신호 서열 및 인간 IgG1 불변 영역의 아미노산들을 코딩하는 DNA 서열(서열번호 35)을 포함하는 DNA 단편에 연결함으로써, CMV 프로모터의 다운스트림에서 신호 서열 코딩 서열, 클로닝 부위 및 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 코딩 서열을 갖는 인간화된 키메라 IgG1형 중쇄 발현 벡터 pCMA-G1을 구축하였다.
6)-1-3 인간화된 키메라 IgG2형 중쇄 발현 벡터 pCMA-G2의 구축
pCMA-LK를 XbaI 및 PmeI로 분해하여 κ 쇄 분비 신호 및 인간 κ 쇄 불변 영역을 코딩하는 서열을 제거하였다. 인-퓨전 어드밴티지 PCR 클로닝 키트(클론텍 라보라토리스 인코포레이티드)를 사용하여 발생된 DNA 단편을, 인간 중쇄 신호 서열 및 인간 IgG2 불변 영역의 아미노산들을 코딩하는 DNA 서열(서열번호 36)을 포함하는 DNA 단편에 연결함으로써, CMV 프로모터의 다운스트림에서 신호 서열 코딩 서열, 클로닝 부위 및 인간 IgG2 중쇄 불변 영역 코딩 서열을 갖는 인간화된 키메라 IgG2형 중쇄 발현 벡터 pCMA-G2를 구축하였다.
6)-2 키메라 MAb1 경쇄 발현 벡터의 구축
MAb1의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 cDNA를 주형으로서 사용하고 KOD-Plus-(도요보 컴파니 리미티드(TOYOBO CO., LTD)) 및 하기 제시된 프라이머 세트를 사용하여 경쇄 가변 영역을 코딩하는 cDNA를 포함하는 부위를 증폭하고, 인-퓨전 어드밴티지 PCR 클로닝 키트(클론텍 라보라토리스 인코포레이티드)를 사용하여 인간화된 키메라 항체 경쇄 발현을 위한 일반 목적 벡터 pCMA-LK의 제한효소 BsiWI-절단된 부위 내로 삽입함으로써 키메라 MAb1 경쇄 발현 벡터를 구축하였다. 수득된 발현 벡터를 "pCMA-LK/MAb1 L"로서 명명하였다. 키메라 MAb1 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 37에 제시되어 있고, 그의 아미노산 서열은 서열번호 38에 제시되어 있다. 서열번호 37의 뉴클레오티드 1 내지 60은 신호 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 서열번호 37의 뉴클레오티드 61 내지 402는 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 서열번호 37의 뉴클레오티드 403 내지 717은 불변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 서열번호 38의 아미노산 번호 1 내지 20은 신호 서열의 아미노산을 나타낸다. 서열번호 38의 아미노산 번호 21 내지 134는 가변 영역의 아미노산을 나타낸다. 아미노산 135 내지 239는 불변 영역의 아미노산을 나타낸다.
경쇄용 프라이머 세트
Figure 112014100448286-pct00022
6)-3 키메라 MAb1 IgG1형 중쇄 발현 벡터의 구축
MAb1의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 cDNA를 주형으로서 사용하고 KOD-Plus-(도요보 컴파니 리미티드) 및 하기 제시된 프라이머 세트를 사용하여 중쇄 가변 영역을 코딩하는 cDNA를 증폭하고, 인-퓨전 어드밴티지 PCR 클로닝 키트(클론텍 라보라토리스 인코포레이티드)를 사용하여 인간화된 키메라 IgG1형 중쇄 발현 벡터 pCMA-G1의 제한효소 BsiWI-절단된 부위 내로 삽입함으로써 키메라 MAb1 IgG1형 중쇄 발현 벡터를 구축하였다. 수득된 발현 벡터를 "pCMA-G1/MAb1 H"로서 명명하였다. 키메라 MAb1 IgG1형 중쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 39에 제시되어 있고, 그의 아미노산 서열은 서열번호 40에 제시되어 있다. 서열번호 39의 뉴클레오티드 1 내지 57은 신호 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 서열번호 39의 뉴클레오티드 58 내지 411은 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 서열번호 39의 뉴클레오티드 412 내지 1401은 불변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 서열번호 40의 아미노산 번호 1 내지 19는 신호 서열의 아미노산을 나타낸다. 서열번호 40의 아미노산 번호 20 내지 137은 가변 영역의 아미노산 서열을 나타낸다. 아미노산 138 내지 467은 불변 영역의 아미노산 서열을 나타낸다.
IgG1형 중쇄용 프라이머 세트
Figure 112014100448286-pct00023
6)-4 키메라 MAb1 IgG2형 중쇄 발현 벡터의 구축
MAb1의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 cDNA를 주형으로서 사용하고 KOD-Plus-(도요보 컴파니 리미티드) 및 하기 제시된 프라이머 세트를 사용하여 중쇄 가변 영역을 코딩하는 cDNA를 포함하는 부위를 증폭하고, 인-퓨전 어드밴티지 PCR 클로닝 키트(클론텍 라보라토리스 인코포레이티드)를 사용하여 인간화된 키메라 IgG2형 중쇄 발현 벡터 pCMA-G2의 제한효소 BsiWI-절단된 부위 내로 삽입함으로써 키메라 MAb1 IgG2형 중쇄 발현 벡터를 구축하였다. 수득된 발현 벡터를 "pCMA-G2/MAb1"로서 명명하였다. 키메라 MAb1 IgG2형 중쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 41에 제시되어 있고, 그의 아미노산 서열은 서열번호 42에 제시되어 있다.
IgG2형 중쇄용 프라이머 세트
Figure 112014100448286-pct00024
(실시예 7) IgG1형 키메라 MAb1 항체 및 IgG2형 키메라 MAb1 항체의 제조
7)-1 IgG1형 키메라 MAb1 항체 및 IgG2형 키메라 MAb1 항체의 제조
프리스타일 293-F 세포(인비트로겐 코포레이션)를 매뉴얼에 따라 하위배양하고 배양하였다. 대수생장기에 있는 1.2 x 109개 세포의 프리스타일 293-F 세포(인비트로겐 코포레이션)를 3 ℓ 페른바흐(Fernbach) 삼각 플라스크(코닝 인코포레이티드)에 접종하고 프리스타일 293 발현 배지(인비트로겐 코포레이션)를 사용하여 1.0 x 106개 세포/㎖로 희석한 후, 37℃에서 90 rpm에서 8% CO2 항온처리기 내에서 1시간 동안 진탕배양하였다. 3.6 mg의 폴리에틸렌이민(폴리사이언시스 인코포레이티드(Polysiences Inc.), #24765)을 20 ㎖의 옵티-프로(Opti-Pro) SFM 배지(인비트로겐 코포레이션)에 용해시켰다. 그 다음, 퓨어링크 하이퓨어(PureLink HiPure) 플라스미드 키트(인비트로겐 코포레이션)를 사용하여 제조한 H 쇄 발현 벡터(0.4 mg) 및 L 쇄 발현 벡터(0.8 mg)를 20 ㎖의 옵티-프로 SFM 배지(인비트로겐 코포레이션)에 현탁하였다. 20 ㎖의 발현 벡터/옵티-프로 SFM 혼합물 용액을 20 ㎖의 폴리에틸렌이민/옵티-프로 SFM 혼합물 용액에 첨가하고, 혼합물을 점진적으로 교반하고 5분 동안 더 방치한 후 프리스타일 293-F 세포에 첨가하였다. 세포를 37℃에서 90 rpm에서 8% CO2 항온처리기 내에서 7일 동안 진탕배양하고 수득된 배양 상청액을 일회용 캡슐 필터(어드밴텍(Advantec), #CCS-045-E1H)를 통해 여과하였다.
pCMA-G1/MAb1 H와 pCMA-LK/MAb1 L의 조합 및 pCMA-G2/MAb1 H와 pCMA-LK/MAb1 L의 조합에 의해 수득된 IgG1형 키메라 MAb1 항체 및 IgG2형 키메라 MAb1 항체는 각각 "cMAb1-1" 및 "cMAb1-2"로서 약칭된다. 용어"cMAb1"은 IgG1형 키메라 MAb1 항체 및 IgG2형 키메라 MAb1 항체 둘다를 의미한다.
7)-2 cMAb1-1 및 cMAb1-2의 정제
상기 7-1)에서 수득된 배양 상청액을 (4℃ 내지 6℃에서) r단백질 A 친화성 크로마토그래피로 정제하였다. r단백질 A 친화성 크로마토그래피 정제 후 완충제 교체 단계를 실온에서 수행하였다. 먼저, 1100 내지 1200 ㎖의 배양 상청액을 PBS로 평형화된 맙셀렉트 슈어(지이 헬쓰케어 바이오-사이언시스 코포레이션에 의해 제조됨, 하이트랩 컬럼; 부피 1 ㎖ x 2개가 연결됨)에 적용하였다. 전체 배양 용액을 컬럼에 넣은 후, 컬럼을 PBS로 세척하였다. 그 다음, 2 M 아르기닌 염산염 용액(pH 4.0)을 사용하여 용출을 수행함으로써 항체 함유 분획을 수집하였다. 탈염 컬럼(지이 헬쓰케어 바이오-사이언시스 코포레이션에 의해 제조됨, 하이트랩 탈염 컬럼; 부피 5 ㎖ x 2개가 연결됨)을 사용하여 이 분획 중의 완충제를 PBS로 교체하였다. 마지막으로, 원심분리 UF 필터 장치 비바스핀(VIVASPIN)20(분자량 컷오프: 30 K, 사르토리우스(Sartorius), 4℃)을 사용하여 분획을 20.0 mg/㎖ 이상의 IgG 농도로 농축하고 정제 샘플로서 사용하였다.
7)-3 cMAb1-1 및 cMAb1-2의 성질
7)-3-1 ROBO4 다운스트림 신호의 활성화
인간 IgG(시그마-알드리치 코포레이션에 의해 제조됨)를 음성 대조군으로서 사용하였고, 인간 IgG, cMAb1-1 또는 cMAb1-2를 0.313 ㎍/㎖의 최종 농도로 배지에 첨가하였다는 점을 제외하고 4)-1의 방법에 따라 이 시험을 수행하였다. 그 결과, 음성 대조군 인간 IgG는 인간 ROBO4를 일시적으로 발현하는 세포에서 IL-8 프로모터 활성에 영향을 미치지 않은 반면, cMAb1-1 및 cMAb1-2는 IL-8 프로모터 활성을 증가시켰다(도 11). 이들 결과는 cMAb1-1 또는 cMAb1-2가 MAb1에서와 같이 ROBO4의 다운스트림 신호를 활성화시킨다는 것을 입증하였다.
7)-3-2 HUVEC 이동 시험
인간 IgG를 음성 대조군으로서 사용하였고, 인간 IgG, cMAb1-1 또는 cMAb1-2를 0.5 ㎍/㎖의 최종 농도로 배지에 첨가하였다는 점을 제외하고 4)-2의 방법에 따라 이 시험을 수행하였다. 그 결과, cMAb1-1 또는 cMAb1-2는 bFGF에 의해 유도된 HUVEC의 이동을 억제하였다(도 12). 이들 결과는 cMAb1-1 또는 cMAb1-2가 MAb1에서와 같이 HUVEC의 이동을 억제한다는 것을 입증하였다.
(실시예 8) 마우스 항-인간 ROBO4 단일클론 항체 MAb1의 인간화된 항체의 디자인
8)-1 MAb1의 인간화된 버전의 디자인
8)-1-1 MAb1 가변 영역의 분자 모델링
MAb1 가변 영역의 분자 모델링을 일반적으로 공지된 상동성 모델링 방법(Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991))으로 수행하였다. 이로써 결정된 MAb1 가변 영역의 1차 서열을 단백질 데이터 은행(Nuc. Acid Res. 35, D301-D303 (2007))에 등록된 인간 면역글로불린 가변 영역의 1차 서열(x-선 결정 구조로부터 유도된 3차원 구조로서 입수가능함)과 비교하였다. 그 결과, 3FFD는 골격을 결여한 항체들 사이에 MAb1 중쇄 가변 영역에 대한 그의 가장 높은 서열 상동성 때문에 선택되었다. 또한, 1T66은 MAb1 경쇄 가변 영역에 대한 그의 가장 높은 서열 상동성 때문에 선택되었다. MAb1 중쇄 및 경쇄에 상응하는 3FFD 및 1T66의 배위의 조합으로부터 "골격 모델"을 수득함으로써 골격 영역의 3차원 구조를 작성하였다. MAb1의 CDR들의 경우, CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1 및 CDRH2를 문헌(Thornton et al., J. Mol. Biol., 263, 800-815, (1996))의 분류에 따라 각각 클러스터 16A, 7A, 9A, 10A 및 10B로 배정하였다. H3 규칙(FEBS letter 399, 1-8 (1996))을 이용하여 CDRH3을 k(7)B로 분류하였다. 그 후, 각각의 CDR의 전형적인 입체구조를 골격 모델 내로 도입하였다.
마지막으로, 불리한 원자간 접촉을 배제하기 위한 에너지 계산을 수행하여 에너지 관점에서 MAb1 가변 영역일 가능성이 높은 분자 모델을 수득하였다. 상업적으로 입수가능한 단백질 3차원 구조 예측 프로그램 프라임(Prime) 및 배위 검색 프로그램 마크로모델(MacroModel)(슈로딩거 엘엘씨(Schrodinger, LLC))을 이용하여 이들 절차들을 수행하였다.
8)-1-2 인간화된 MAb1 아미노산 서열의 디자인
각각의 인간화된 MAb1 항체(hMAb1)를 일반적으로 공지된 CDR 이식 방법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989))으로 구축하였다. 골격 영역 내의 아미노산의 상동성을 기초로 2종의 상이한 수용자 항체들을 선택하였다. MAb1 골격 영역의 서열을 카바트 항체 아미노산 서열 데이터베이스(Nuc. Acid Res. 29, 205-206 (2001)) 내의 모든 인간 골격들과 비교하였다. 그 결과, B3 항체가 골격 영역에 대한 그의 83% 서열 상동성 때문에 수용자로서 선택되었다. B3 골격 영역의 아미노산 잔기들을 MAb1의 아미노산 잔기들과 정렬하여 사용된 상이한 아미노산들의 위치를 확인하였다. 상기 구축된 MAb1의 3차원 모델을 사용하여 상기 잔기들의 이들 위치를 분석하였다. 그 다음, 수용자 상으로 이식될 공여자 잔기를 문헌(Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989))에 의해 제공된 기준에 따라 선택하였다. 하기 실시예에 기재된 바와 같이, 일부 선택된 공여자 잔기를 수용자 항체 내로 삽입하여 인간화된 MAb1의 서열을 구축하였다. 또한, 하기 실시예에 기재된 바와 같이, hMAb1의 각각의 CDR 내의 1개 내지 3개 아미노산 잔기(들)를 다른 아미노산 잔기로 치환시켜 hMAb1 변이체를 구축하였다.
8)-2 cMAb1 중쇄의 인간화
8)-2-1 hMAb1-H1형 중쇄:
서열번호 42로 표시된 cMAb1-2 중쇄에서 아미노산 32(라이신)를 글루타민으로 치환시키고 아미노산 38(라이신)을 아르기닌으로 치환시키고 아미노산 59(쓰레오닌)를 알라닌으로 치환시키고 아미노산 61(글루탐산)을 글리신으로 치환시키고 아미노산 63(아르기닌)을 글리신으로 치환시키고 아미노산 95(글루탐산)를 라이신으로 치환시키고 아미노산 103(세린)을 아스파라긴으로 치환시키고 아미노산 107(세린)을 알라닌으로 치환시키고 아미노산 112(메티오닌)를 발린으로 치환시키고 아미노산 114(페닐알라닌)를 티로신으로 치환시키고 아미노산 129(히스티딘)를 글루타민으로 치환시키고 아미노산 132(쓰레오닌)를 류신으로 치환시키고 아미노산 133(류신)을 발린으로 치환시킴으로써 디자인된 인간화된 MAb1 중쇄를 "hMAb1-H1형 중쇄"로서 명명하였다.
hMAb1-H1형 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 56에 제시되어 있다. 서열번호 56의 아미노산 서열에서 아미노산 잔기 1 내지 19로 구성된 서열, 아미노산 잔기 20 내지 137로 구성된 서열 및 아미노산 잔기 138 내지 463으로 구성된 서열은 각각 신호 서열, 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역에 상응한다. 서열번호 56의 아미노산 서열에서 아미노산 잔기 50 내지 54로 구성된 서열, 아미노산 잔기 69 내지 85로 구성된 서열 및 아미노산 잔기 118 내지 126으로 구성된 서열은 각각 CDRH1 서열, CDRH2 서열 및 CDRH3 서열에 상응한다. 서열번호 56의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 55에 제시되어 있다. 서열번호 55의 뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오티드 1 내지 57로 구성된 서열, 뉴클레오티드 58 내지 411로 구성된 서열 및 뉴클레오티드 412 내지 1389로 구성된 서열은 각각 신호 서열, 중쇄 가변 영역 서열 및 중쇄 불변 영역 서열을 코딩한다. 서열번호 55의 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 56의 아미노산 서열은 각각 도 31 및 32에도 제시되어 있다.
8)-2-2 hMAb1-H2형 중쇄:
서열번호 42로 표시된 cMAb1-2 중쇄에서 아미노산 32(라이신)를 글루타민으로 치환시키고 아미노산 38(라이신)을 아르기닌으로 치환시키고 아미노산 59(쓰레오닌)를 알라닌으로 치환시키고 아미노산 61(글루탐산)을 글리신으로 치환시키고 아미노산 63(아르기닌)을 글리신으로 치환시키고 아미노산 72(아스파라긴)를 글루타민으로 치환시키고 아미노산 95(글루탐산)를 라이신으로 치환시키고 아미노산 103(세린)을 아스파라긴으로 치환시키고 아미노산 107(세린)을 알라닌으로 치환시키고 아미노산 112(메티오닌)를 발린으로 치환시키고 아미노산 114(페닐알라닌)를 티로신으로 치환시키고 아미노산 129(히스티딘)를 글루타민으로 치환시키고 아미노산 132(쓰레오닌)를 류신으로 치환시키고 아미노산 133(류신)을 발린으로 치환시킴으로써 디자인된 인간화된 MAb1 중쇄를 "hMAb1-H2형 중쇄"로서 명명하였다.
hMAb1-H2형 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 58에 제시되어 있다. 서열번호 58의 아미노산 서열에서 아미노산 잔기 1 내지 19로 구성된 서열, 아미노산 잔기 20 내지 137로 구성된 서열 및 아미노산 잔기 138 내지 463으로 구성된 서열은 각각 신호 서열, 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역에 상응한다. 서열번호 58의 아미노산 서열에서 아미노산 잔기 50 내지 54로 구성된 서열, 아미노산 잔기 69 내지 85로 구성된 서열 및 아미노산 잔기 118 내지 126으로 구성된 서열은 각각 CDRH1 서열, CDRH2 서열 및 CDRH3 서열에 상응한다. 서열번호 58의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 57에 제시되어 있다. 서열번호 57의 뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오티드 1 내지 57로 구성된 서열, 뉴클레오티드 58 내지 411로 구성된 서열 및 뉴클레오티드 412 내지 1389로 구성된 서열은 각각 신호 서열, 중쇄 가변 영역 서열 및 중쇄 불변 영역 서열을 코딩한다. 서열번호 57의 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 58의 아미노산 서열은 각각 도 33 및 34에도 제시되어 있다.
8)-2-3 hMAb1-H3형 중쇄:
서열번호 42로 표시된 cMAb1-2 중쇄에서 아미노산 32(라이신)를 글루타민으로 치환시키고 아미노산 38(라이신)을 아르기닌으로 치환시키고 아미노산 59(쓰레오닌)를 알라닌으로 치환시키고 아미노산 61(글루탐산)을 글리신으로 치환시키고 아미노산 95(글루탐산)를 라이신으로 치환시키고 아미노산 103(세린)을 아스파라긴으로 치환시키고 아미노산 107(세린)을 알라닌으로 치환시키고 아미노산 112(메티오닌)를 발린으로 치환시키고 아미노산 114(페닐알라닌)를 티로신으로 치환시키고 아미노산 129(히스티딘)를 글루타민으로 치환시키고 아미노산 132(쓰레오닌)를 류신으로 치환시키고 아미노산 133(류신)을 발린으로 치환시킴으로써 디자인된 인간화된 MAb1 중쇄를 "hMAb1-H3형 중쇄"로서 명명하였다.
hMAb1-H3형 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 60에 제시되어 있다. 서열번호 60의 아미노산 서열에서 아미노산 잔기 1 내지 19로 구성된 서열, 아미노산 잔기 20 내지 137로 구성된 서열 및 아미노산 잔기 138 내지 463으로 구성된 서열은 각각 신호 서열, 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역에 상응한다. 서열번호 60의 아미노산 서열에서 아미노산 잔기 50 내지 54로 구성된 서열, 아미노산 잔기 69 내지 85로 구성된 서열 및 아미노산 잔기 118 내지 126으로 구성된 서열은 각각 CDRH1 서열, CDRH2 서열 및 CDRH3 서열에 상응한다. 서열번호 60의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 59에 제시되어 있다. 서열번호 59의 뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오티드 1 내지 57로 구성된 서열, 뉴클레오티드 58 내지 411로 구성된 서열 및 뉴클레오티드 412 내지 1389로 구성된 서열은 각각 신호 서열, 중쇄 가변 영역 서열 및 중쇄 불변 영역 서열을 코딩한다. 서열번호 59의 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 60의 아미노산 서열은 각각 도 35 및 36에도 제시되어 있다.
8)-2-4 hMAb1-H4형 중쇄:
서열번호 42로 표시된 cMAb1-2 중쇄에서 아미노산 32(라이신)를 글루타민으로 치환시키고 아미노산 38(라이신)을 아르기닌으로 치환시키고 아미노산 59(쓰레오닌)를 알라닌으로 치환시키고 아미노산 61(글루탐산)을 글리신으로 치환시키고 아미노산 72(아스파라긴)를 글루타민으로 치환시키고 아미노산 95(글루탐산)를 라이신으로 치환시키고 아미노산 103(세린)을 아스파라긴으로 치환시키고 아미노산 107(세린)을 알라닌으로 치환시키고 아미노산 112(메티오닌)를 발린으로 치환시키고 아미노산 114(페닐알라닌)를 티로신으로 치환시키고 아미노산 129(히스티딘)를 글루타민으로 치환시키고 아미노산 132(쓰레오닌)를 류신으로 치환시키고 아미노산 133(류신)을 발린으로 치환시킴으로써 디자인된 인간화된 MAb1 중쇄를 "hMAb1-H4형 중쇄"로서 명명하였다.
hMAb1-H4형 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 62에 제시되어 있다. 서열번호 62의 아미노산 서열에서 아미노산 잔기 1 내지 19로 구성된 서열, 아미노산 잔기 20 내지 137로 구성된 서열 및 아미노산 잔기 138 내지 463으로 구성된 서열은 각각 신호 서열, 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역에 상응한다. 서열번호 62의 아미노산 서열에서 아미노산 잔기 50 내지 54로 구성된 서열, 아미노산 잔기 69 내지 85로 구성된 서열 및 아미노산 잔기 118 내지 126으로 구성된 서열은 각각 CDRH1 서열, CDRH2 서열 및 CDRH3 서열에 상응한다. 서열번호 62의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 61에 제시되어 있다. 서열번호 61의 뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오티드 1 내지 57로 구성된 서열, 뉴클레오티드 58 내지 411로 구성된 서열 및 뉴클레오티드 412 내지 1389로 구성된 서열은 각각 신호 서열, 중쇄 가변 영역 서열 및 중쇄 불변 영역 서열을 코딩한다. 서열번호 61의 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 62의 아미노산 서열은 각각 도 37 및 38에도 제시되어 있다.
8)-3 MAb1 경쇄의 인간화
8)-3-1 hMAb1-L1형 경쇄:
서열번호 38로 표시된 cMAb1 경쇄에서 아미노산 22(알라닌)를 이소류신으로 치환시키고 아미노산 27(쓰레오닌)을 세린으로 치환시키고 아미노산 34(세린)를 쓰레오닌으로 치환시키고 아미노산 37(아스파르트산)을 글루탐산으로 치환시키고 아미노산 38(글루타민)을 프롤린으로 치환시키고 아미노산 62(페닐알라닌)를 류신으로 치환시키고 아미노산 84(류신)를 프롤린으로 치환시키고 아미노산 108(페닐알라닌)을 발린으로 치환시키고 아미노산 112(페닐알라닌)를 티로신으로 치환시키고 아미노산 125(글리신)를 프롤린으로 치환시키고 아미노산 129(류신)를 발린으로 치환시키고 아미노산 130(글루탐산)을 아스파르트산으로 치환시키고 아미노산 134(알라닌)를 쓰레오닌으로 치환시킴으로써 디자인된 인간화된 MAb1 경쇄를 "hMAb1-L1형 경쇄"로서 명명하였다.
hMAb1-L1형 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 64에 제시되어 있다. 서열번호 64의 아미노산 서열에서 아미노산 잔기 1 내지 20으로 구성된 서열, 아미노산 잔기 21 내지 134로 구성된 서열 및 아미노산 잔기 135 내지 239로 구성된 서열은 각각 신호 서열, 경쇄 가변 영역 및 경쇄 불변 영역에 상응한다. 서열번호 64의 아미노산 서열에서 아미노산 잔기 44 내지 59로 구성된 서열, 아미노산 잔기 75 내지 81로 구성된 서열 및 아미노산 잔기 114 내지 122로 구성된 서열은 각각 CDRL1 서열, CDRL2 서열 및 CDRL3 서열에 상응한다. 서열번호 64의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 63에 제시되어 있다. 서열번호 63의 뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오티드 1 내지 60으로 구성된 서열, 뉴클레오티드 61 내지 402로 구성된 서열 및 뉴클레오티드 403 내지 717로 구성된 서열은 각각 신호 서열, 경쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 불변 영역 서열을 코딩한다. 서열번호 63의 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 64의 아미노산 서열은 각각 도 39 및 40에도 제시되어 있다.
8)-3-2 hMAb1-L2형 경쇄:
서열번호 38로 표시된 cMAb1 경쇄에서 아미노산 22(알라닌)를 이소류신으로 치환시키고 아미노산 27(쓰레오닌)을 세린으로 치환시키고 아미노산 34(세린)를 쓰레오닌으로 치환시키고 아미노산 37(아스파르트산)을 글루탐산으로 치환시키고 아미노산 38(글루타민)을 프롤린으로 치환시키고 아미노산 52(세린)를 글루탐산으로 치환시키고 아미노산 54(글리신)를 라이신으로 치환시키고 아미노산 56(쓰레오닌)을 류신으로 치환시키고 아미노산 62(페닐알라닌)를 류신으로 치환시키고 아미노산 84(류신)를 프롤린으로 치환시키고 아미노산 108(페닐알라닌)을 발린으로 치환시키고 아미노산 112(페닐알라닌)를 티로신으로 치환시키고 아미노산 125(글리신)를 프롤린으로 치환시키고 아미노산 129(류신)를 발린으로 치환시키고 아미노산 130(글루탐산)을 아스파르트산으로 치환시키고 아미노산 134(알라닌)를 쓰레오닌으로 치환시킴으로써 디자인된 인간화된 MAb1 경쇄를 "hMAb1-L2형 경쇄"로서 명명하였다.
hMAb1-L2형 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 66에 제시되어 있다. 서열번호 66의 아미노산 서열에서 아미노산 잔기 1 내지 20으로 구성된 서열, 아미노산 잔기 21 내지 134로 구성된 서열 및 아미노산 잔기 135 내지 239로 구성된 서열은 각각 신호 서열, 경쇄 가변 영역 및 경쇄 불변 영역에 상응한다. 서열번호 66의 아미노산 서열에서 아미노산 잔기 44 내지 59로 구성된 서열, 아미노산 잔기 75 내지 81로 구성된 서열 및 아미노산 잔기 114 내지 122로 구성된 서열은 각각 CDRL1 서열, CDRL2 서열 및 CDRL3 서열에 상응한다. 서열번호 66의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 65에 제시되어 있다. 서열번호 65의 뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오티드 1 내지 60으로 구성된 서열, 뉴클레오티드 61 내지 402로 구성된 서열 및 뉴클레오티드 403 내지 717로 구성된 서열은 각각 신호 서열, 경쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 불변 영역 서열을 코딩한다. 서열번호 65의 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 66의 아미노산 서열은 각각 도 41 및 42에도 제시되어 있다.
(실시예 9) 인간화된 MAb1의 제조
9)-1 인간화된 MAb1 중쇄 발현 벡터의 구축
9)-1-1 hMAb1-H1형 중쇄 발현 벡터의 구축
서열번호 56의 아미노산 20 내지 137로 표시된 hMAb1-H1형 중쇄 가변 영역을 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA를 합성하고(진아트(GeneArt) 인공 유전자 합성 서비스) 제한효소 BlpI로 절단하였다. 수득된 DNA 단편을 인간화된 키메라 IgG2형 중쇄 발현 벡터(pCMA-G2)의 제한효소 BlpI-절단된 부위에 삽입하여 hMAb1-H1형 중쇄 발현 벡터를 구축하였다. 수득된 발현 벡터를 "pCMA-G2/hMAb1-H1"로서 명명하였다. hMAb1-H1형 중쇄의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 55에 제시되어 있다.
9)-1-2 hMAb1-H2형 중쇄 발현 벡터의 구축
9)-1-1에서 구축된 pCMA-G2/hMAb1-H1을 주형으로서 사용하고 하기 제시된 프라이머 세트 및 퀵체인지 XL 부위-지정된 돌연변이유발 키트(아질런트 테크놀로지스 인코포레이티드)를 사용하여 hMAb1-H2형 중쇄 발현 벡터를 구축하였다. 수득된 발현 벡터를 "pCMA-G1/hMAb1-H2"로서 명명하였다. hMAb1-H2형 중쇄의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 57에 제시되어 있고, 그의 아미노산 서열은 서열번호 58에 제시되어 있다.
프라이머 세트:
Figure 112014100448286-pct00025
9)-1-3 hMAb1-H3형 중쇄 발현 벡터의 구축
서열번호 60의 아미노산 20 내지 137로 표시된 hMAb1-H3형 중쇄 가변 영역을 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA를 합성하고(진아트 인공 유전자 합성 서비스) 제한효소 BlpI로 절단하였다. 수득된 DNA 단편을 인간화된 키메라 IgG2형 중쇄 발현 벡터(pCMA-G2)의 제한효소 BlpI-절단된 부위에 삽입하여 hMAb1-H3형 중쇄 발현 벡터를 구축하였다. 수득된 발현 벡터를 "pCMA-G2/hMAb1-H3"으로서 명명하였다. hMAb1-H3형 중쇄의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 59에 제시되어 있다.
9)-1-4 hMAb1-H4형 중쇄 발현 벡터의 구축
9)-1-3에서 구축된 pCMA-G2/hMAb1-H3을 주형으로서 사용하고 하기 제시된 프라이머 세트 및 퀵체인지 XL 부위-지정된 돌연변이유발 키트(아질런트 테크놀로지스 인코포레이티드)를 사용하여 hMAb1-H4형 중쇄 발현 벡터를 구축하였다. 수득된 발현 벡터를 "pCMA-G1/hMAb1-H4"로서 명명하였다. hMAb1-H4형 중쇄의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 61에 제시되어 있고, 그의 아미노산 서열은 서열번호 62에 제시되어 있다.
프라이머 세트:
Figure 112014100448286-pct00026
9)-2 인간화된 MAb1 경쇄 발현 벡터의 구축
9)-2-1 hMAb1-L1형 경쇄 발현 벡터의 구축
서열번호 64의 아미노산 21 내지 134로 표시된 hMAb1-L1형 경쇄 가변 영역을 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA를 합성하고(진아트 인공 유전자 합성 서비스) 제한효소 BsiWI로 절단하였다. 수득된 DNA 단편을 인간화된 키메라 항체 경쇄 발현을 위한 일반 목적 벡터(pCMA-LK)의 제한효소 BsiWI-절단된 부위에 삽입하여 hMAb1-L1형 경쇄 발현 벡터를 구축하였다. 수득된 발현 벡터를 "pCMA-LK/hMAb1-L1"로서 명명하였다. hMAb1-L1형 경쇄의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 63에 제시되어 있다.
9)-2-2 hMAb1-L2형 경쇄 발현 벡터의 구축
9)-2-1에서 구축된 pCMA-LK/hMAb1-L1을 주형으로서 사용하고 KOD-Plus-(도요보 컴파니 리미티드) 및 프라이머 세트 A 및 B 각각을 사용하여 DNA 단편을 PCR로 수득하고 프라이머 세트 C를 사용하여 중첩 연장 PCR로 연결함으로써 hMAb1-L2형 경쇄를 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA를 제조하였다. 이 DNA를 제한효소 XbaI 및 PmeI로 절단하여 DNA 단편을 수득한 후, 이 DNA 단편을 인간화된 키메라 항체 경쇄 발현을 위한 일반 목적 벡터(pCMA-LK)의 제한효소 XbaI/PmeI-절단된 부위에 삽입하여 hMAb1-L2형 경쇄 발현 벡터를 구축하였다. 수득된 발현 벡터를 "pCMA-LK/hMAb1-L2"로서 명명하였다. hMAb1-L2형 경쇄의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 65에 제시되어 있고, 그의 아미노산 서열은 서열번호 66에 제시되어 있다.
프라이머 세트 A
Figure 112014100448286-pct00027
프라이머 세트 B
Figure 112014100448286-pct00028
프라이머 세트 C
Figure 112014100448286-pct00029
(실시예 10) 인간화된 MAb1의 제조
10-7-1) 인간화된 MAb1의 제조
프리스타일 293-F 세포(인비트로겐 코포레이션)를 매뉴얼에 따라 하위배양하고 배양하였다.
대수생장기에 있는 1.2 x 109개 세포의 프리스타일 293-F 세포(인비트로겐 코포레이션)를 3 ℓ 페른바흐 삼각 플라스크(코닝 인코포레이티드)에 접종하고 프리스타일 293 발현 배지(인비트로겐 코포레이션)를 사용하여 1.0 x 106개 세포/㎖로 희석한 후, 37℃에서 90 rpm에서 8% CO2 항온처리기 내에서 1시간 동안 진탕배양하였다. 3.6 mg의 폴리에틸렌이민(폴리사이언시스 인코포레이티드, #24765)을 20 ㎖의 옵티-프로 SFM 배지(인비트로겐 코포레이션)에 용해시켰다. 그 다음, 퓨어링크 하이퓨어 플라스미드 키트(인비트로겐 코포레이션)를 사용하여 제조한 H 쇄 발현 벡터(0.4 mg) 및 L 쇄 발현 벡터(0.8 mg)를 20 ㎖의 옵티-프로 SFM 배지(인비트로겐 코포레이션)에 현탁하였다. 20 ㎖의 발현 벡터/옵티-프로 SFM 혼합물 용액을 20 ㎖의 폴리에틸렌이민/옵티-프로 SFM 혼합물 용액에 첨가하고, 혼합물을 점진적으로 교반하고 5분 동안 더 방치한 후 프리스타일 293-F 세포에 첨가하였다. 세포를 37℃에서 90 rpm에서 8% CO2 항온처리기 내에서 7일 동안 진탕배양하고 수득된 배양 상청액을 일회용 캡슐 필터(어드밴텍, #CCS-045-E1H)를 통해 여과하고 7)-2에 기재된 방식과 동일한 방식으로 정제하였다.
pCMA-G2/hMAb1-H1과 pCMA-LK/hMAb1-L1의 조합에 의해 수득된 인간화된 MAb1 항체를 "H-1040"으로서 명명하였다. pCMA-G2/hMAb1-H2와 pCMA-LK/hMAb1-L1의 조합에 의해 수득된 인간화된 MAb1 항체를 "H-1140"으로서 명명하였다. pCMA-G2/hMAb1-H2와 pCMA-LK/hMAb1-L2의 조합에 의해 수득된 인간화된 MAb1 항체를 "H-1143"으로서 명명하였다. pCMA-G2/hMAb1-H3과 pCMA-LK/hMAb1-L1의 조합에 의해 수득된 인간화된 MAb1 항체를 "H-2040"으로서 명명하였다. pCMA-G2/hMAb1-H4와 pCMA-LK/hMAb1-L1의 조합에 의해 수득된 인간화된 MAb1 항체를 "H-2140"으로서 명명하였다. pCMA-G2/hMAb1-H4와 pCMA-LK/hMAb1-L2의 조합에 의해 수득된 인간화된 MAb1 항체를 "H-2143"으로서 명명하였다.
(실시예 11) 항-ROBO4 인간화된 항체의 성질
11)-1 결합 친화성
비아코어 3000(지이 헬쓰케어 바이오-사이언시스 코포레이션에 의해 제조됨)을 이용하되 고정된 항체를 리간드로서 사용하고 항원을 분석물로서 사용하여 각각의 항체와 rROBO4-ECD 사이의 해리 상수를 측정하였다. 아민 커플링 방법으로 센서 칩 CM5(지이 헬쓰케어 바이오-사이언시스 코포레이션에 의해 제조됨) 상에 고정된 항-인간 IgG 항체(지이 헬쓰케어 바이오-사이언시스 코포레이션에 의해 제조됨)를 통해 대략적으로 80 RU의 항체를 결합시켰다. 사용된 런닝 완충제는 0.05% 계면활성제 P20을 함유하는 PBS이었다. 항원의 연속 희석 용액(0.1 내지 200 nM)을 항체-결합된 칩 상에 300초 동안 30 ㎕/분의 유속으로 첨가하였다. 그 후, 해리 단계를 300초 동안 모니터링하였다. 3 M MgCl2을 30초 동안 10 ㎕/분의 유속으로 재생 용액으로서 첨가하였다. 분석 소프트웨어(비아에발루션(BIAevalution) 소프트웨어, 버전 4.1)의 1:1 결합 모델을 이용하여 데이터를 분석함으로써 결합 속도 상수 kon, 해리 속도 상수 koff 및 해리 상수(KD; KD = koff/kon)를 계산하였다. 그 결과, KD 값은 H-1040의 경우 0.41 nM이었고 H-1143의 경우 3.5 nM이었고 H-1140의 경우 3.9 nM이었고 H-2040의 경우 0.40 nM이었고 H-2143의 경우 1.7 nM이었고 H-2140의 경우 1.8 nM이었다.
11)-2 ROBO4 다운스트림 신호의 활성화
인간 IgG를 음성 대조군으로서 사용하였고, 인간 IgG, H-1040, H-1140, H-1143, H-2040, H-2140, H-2143 또는 cMAb1-2를 0.63 ㎍/㎖의 최종 농도로 배지에 첨가하였다는 점을 제외하고 4)-1의 방법에 따라 이 시험을 수행하였다. 그 결과, 음성 대조군 인간 IgG는 인간 ROBO4를 일시적으로 발현하는 세포에서 IL-8 프로모터 활성에 영향을 미치지 않은 반면, 모든 항-ROBO4 인간화된 항체들은 cMAb1-2와 동등한 수준에서 IL-8 프로모터 활성을 증가시켰다(도 49). 이들 결과는 모든 항-ROBO4 인간화된 항체들이 MAb1에서와 같이 ROBO4의 다운스트림 신호를 활성화시킨다는 것을 입증하였다.
11)-3 HUVEC 이동 시험
인간 IgG를 음성 대조군으로서 사용하였고, 인간 IgG, H-1143, H-2140 또는 H-2143을 0.5 ㎍/㎖의 최종 농도로 배지에 첨가하였다는 점을 제외하고 4)-2의 방법에 따라 이 시험을 수행하였고, 플레이트 판독기(엔비젼; 퍼킨 엘머 인코포레이티드)를 이용하여 각각의 웰의 형광 강도(여기 파장/형광 파장: 485 nm/538 nm)를 측정하였다. 그 결과, H-1143, H-2140 또는 H-2143은 bFGF에 의해 유도된 HUVEC의 이동을 억제하였다(도 50). 추가로, H-1140은 HUVEC 이동에 대한 억제 활성을 보였다. 이들 결과는 H-1140, H-1143, H-2140 또는 H-2143이 HUVEC의 이동을 억제한다는 것을 입증하였다.
11)-4 교차-종 반응성
11)-4-1 항원 유전자 발현 세포의 제조
세포를 4)-3-1의 방법에 따라 제조하였다.
11)-4-2 유동 세포측정 분석
인간 IgG를 음성 대조군으로서 사용하였고, FITC-아피니퓨어 염소 항-인간 IgG(Fcγ 단편 특이적)(잭슨 이뮤노리서치 라보라토리스 인코포레이티드에 의해 제조됨)를 2차 항체로서 사용하였고, 유동 세포측정기(FC500; 벡크만 코울터 인코포레이티드에 의해 제조됨)를 검출기로서 사용하였다는 점을 제외하고 4)-3-2의 방법에 따라 이 시험을 수행하였다. 그 결과, H-1143, H-2140 또는 H-2143은 모항체 MAb1에서와 같이 마우스 ROBO4 또는 래트 ROBO4에 결합하지 않았지만 인간 ROBO4 및 사이노몰구스 원숭이 ROBO4에는 결합한다는 것이 밝혀졌다(도 51, 52 및 53). 추가로, H-1140은 H-1143, H-2140 및 H-2143과 동일한 결과를 보였다.
11)-5 H-1140, H-1143, H-2140 또는 H-2143의 결합 특이성
11)-5-1 항원 유전자 발현 세포의 제조
pCI-FLAG-hROBO4-28을 인간 ROBO4 발현 벡터로서 사용하였다는 점을 제외하고 4)-4-1의 방법에 따라 세포를 제조하였다.
11)-5-2 유동 세포측정 분석
인간 IgG 또는 마우스 IgG2A를 음성 대조군으로서 사용하였고, 마우스 IgG에 대한 플루오레세인-접합된 염소 IgG 분획(카펠 라보라토리스 인코포레이티드(Cappel Laboratories, Inc.)에 의해 제조됨) 또는 FITC-아피니퓨어 염소 항-인간 IgG(Fcγ 단편 특이적)를 2차 항체로서 사용하였고, 유동 세포측정기(FC500)를 검출기로서 사용하였다는 점을 제외하고 4)-4-2의 방법에 따라 이 시험을 수행하였다. 결과적으로, H-1143, H-2140 또는 H-2143은 모항체 MAb1에서와 같이 hROBO1, hROBO2 또는 hROBO3에 결합하지 않았지만 hROBO4에는 특이적으로 결합한다는 것이 밝혀졌다(도 54). 추가로, H-1140은 H-1143, H-2140 및 H-2143과 동일한 결과를 보였다. 이와 관련하여, 양성 대조군 항체를 사용하여 hROBO4, hROBO1, hROBO2 및 hROBO3 각각이 세포막 상에서 발현된다는 것을 확인하였다(도 54).
11)-6 레이저-유도된 맥락막 혈관신생을 갖는 원숭이 모델에서의 약물 효능 평가
11)-6-1 마취
메데토미딘 염산염을 0.08 mg/kg의 복용량으로 각각의 사이노몰구스 원숭이에게 근육내 주사하였다. 그로부터 15분 후, 케타민 염산염을 15 mg/kg의 복용량으로 상기 사이노몰구스 원숭이에게 근육내 주사하였다.
11)-6-2 모델 제조
11)-6-1에서 마취된 각각의 사이노몰구스 원숭이를 누운 자세로 스테인레스 작업 테이블 상에 억류시켰다. 산동을 위해 5 mg/㎖ 트로픽아미드 - 5 mg/㎖ 페닐에프린 염산염 혼합물 점안제를 눈에 도포하였다. 녹색 레이저 광응고기 오큐라이트 GLx를 이용하여 망막의 황반 영역을 레이저 조사(조사된 열의 양: 500 mW, 조사 시간: 0.1초, 점 크기: 50 ㎛, 점의 수: 9개의 점)로 열적으로 손상시켰다. 작업 후, 크라빗(Cravit) 점안제를 작업처리된 눈에 적가하였다.
11)-6-3 시험 물질의 투여
모델 제조 후 7일째 날, 각각의 사이노몰구스 원숭이를 마취한 후, 누운 자세로 스테인레스 작업 테이블 상에 억류시켰다. 그 다음, 멸균 정제수로 4배 희석된 PA IODO 안구 및 눈 세척 용액(니텐 파마슈티칼 컴파니 리미티드(Nitten Pharmaceutical Co., Ltd.))을 눈에 도포하여 외부 눈을 소독하였다. 33G 바늘을 결막으로부터 유리체 내로 삽입하고, 1 ㎖ 주사기를 이용하여 1.1 mg/0.05 ㎖로 조절된 식염수 또는 0.05 ㎖의 H-2143을 상기 유리체 내로 주사하였다. 투여의 완료 후, 면봉을 이용하여 눈 및 귀용 린데론(Rinderon)-A 연고를 결막에 도포하고 눈의 개방 및 폐쇄를 통해 눈 표면 전체에 펴 발랐다.
11)-6-4 약물 효능 평가
모델 제조 후 7일째 날, 14일째 날 및 21일째 날, 마취 하에서 하이브리드 안저 카메라 CX-1을 이용하여 상용적인 방법으로 안저를 촬영하였다. 그 다음, 플루오레세인을 0.05 ㎖/kg의 복용량으로 정맥내 주사하였다. 플루오레세인의 정맥내 주사의 완료 후, 형광 혈관조영술을 1분 내지 최대 10분마다 수행하고, 이미지 데이터를 저장하였다. 이미지 데이터로부터, 문헌(Zahn G et al., Arch. Ophthalmol. 2009 127: 1329-1335)의 방법에 따라 플루오레세인이 축적된 각각의 레이저-조사된 부위의 형광 강도를 기초로 중증도를 1 내지 5 등급의 규모로 분류하였다. 그 다음, 모든 레이저-조사된 부위들 중에서 중증도 분류에서 4 및 5 등급에 상응하는 부위의 비를 백분율 기준으로 계산하여 맥락막 혈관신생을 평가하였다. 식염수를 투여받은 군과 H-2143을 투여받은 군 사이에 맥락막 혈관신생을 비교한 결과, 4 및 5 등급의 비는 식염수를 투여받은 군에서 모델 제조로부터의 시간의 경과에 따라 증가한 반면, 이러한 증가는 H-2143을 투여받은 군에서 관찰되지 않았다. 이것은 H-2143의 투여가 레이저-유도된 맥락막 혈관신생을 억제하였다는 것을 의미한다(도 55).
[산업상 이용가능성]
본 발명에 의해 제공된 항체의 사용은 혈관신생 질환, 예컨대, 삼출성 연령 관련 황반 변성, 당뇨망막병증, 황반 부종, 양성 또는 악성 종양, 아테롬성동맥경화증, 수정체뒤섬유증식, 혈관종, 만성 염증, 안구 혈관신생 질환, 증식성 망막병증, 혈관신생 녹내장, 각막 조직 이식 또는 다른 조직 이식의 면역 거부, 류마티스 관절염, 건선, 급성 염증, 패혈증 또는 비만의 치료 또는 예방, 및 상기 혈관신생 질환의 검사 또는 진단을 가능하게 한다.
[서열목록의 무형식 텍스트]
서열번호 1: 전장 인간 ROBO4 cDNA의 뉴클레오티드 서열(도 13)
서열번호 2: 인간 ROBO4의 아미노산 서열(도 14)
서열번호 3: N-말단 FLAG-태그부착된 전장 인간 ROBO4의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
서열번호 4: N-말단 FLAG-태그부착된 전장 인간 ROBO4의 아미노산 서열
서열번호 5: 서열번호 2의 아미노산 46 내지 1007의 아미노산 서열로 구성된 인간 ROBO4의 N-말단 FLAG-태그부착된 세포외 영역/도메인 결실 변이체의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
서열번호 6: 서열번호 2의 아미노산 46 내지 1007의 아미노산 서열로 구성된 인간 ROBO4의 N-말단 FLAG-태그부착된 세포외 영역/도메인 결실 변이체의 아미노산 서열
서열번호 7: 서열번호 2의 아미노산 132 내지 1007의 아미노산 서열로 구성된 인간 ROBO4의 N-말단 FLAG-태그부착된 세포외 영역/도메인 결실 변이체의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
서열번호 8: 서열번호 2의 아미노산 132 내지 1007의 아미노산 서열로 구성된 인간 ROBO4의 N-말단 FLAG-태그부착된 세포외 영역/도메인 결실 변이체의 아미노산 서열
서열번호 9: 서열번호 2의 아미노산 210 내지 1007의 아미노산 서열로 구성된 인간 ROBO4의 N-말단 FLAG-태그부착된 세포외 영역/도메인 결실 변이체의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
서열번호 10: 서열번호 2의 아미노산 210 내지 1007의 아미노산 서열로 구성된 인간 ROBO4의 N-말단 FLAG-태그부착된 세포외 영역/도메인 결실 변이체의 아미노산 서열
서열번호 11: 서열번호 2의 아미노산 225 내지 1007의 아미노산 서열로 구성된 인간 ROBO4의 N-말단 FLAG-태그부착된 세포외 영역/도메인 결실 변이체의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
서열번호 12: 서열번호 2의 아미노산 225 내지 1007의 아미노산 서열로 구성된 인간 ROBO4의 N-말단 FLAG-태그부착된 세포외 영역/도메인 결실 변이체의 아미노산 서열
서열번호 13: 서열번호 2의 아미노산 341 내지 1007의 아미노산 서열로 구성된 인간 ROBO4의 N-말단 FLAG-태그부착된 세포외 영역/도메인 결실 변이체의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
서열번호 14: 서열번호 2의 아미노산 341 내지 1007의 아미노산 서열로 구성된 인간 ROBO4의 N-말단 FLAG-태그부착된 세포외 영역/도메인 결실 변이체의 아미노산 서열
서열번호 15: 마우스 ROBO4 cDNA의 뉴클레오티드 서열
서열번호 16: 마우스 ROBO4의 아미노산 서열
서열번호 17: 래트 ROBO4 cDNA의 뉴클레오티드 서열
서열번호 18: 래트 ROBO4의 아미노산 서열
서열번호 19: 원숭이 ROBO4 cDNA1의 뉴클레오티드 서열
서열번호 20: 원숭이 ROBO4 아미노산 서열 1
서열번호 21: 원숭이 ROBO4 cDNA2의 뉴클레오티드 서열
서열번호 22: 원숭이 ROBO4 아미노산 서열 2
서열번호 23: 인간 ROBO1 cDNA의 뉴클레오티드 서열
서열번호 24: 인간 ROBO1의 아미노산 서열
서열번호 25: 인간 ROBO2 cDNA의 뉴클레오티드 서열
서열번호 26: 인간 ROBO2의 아미노산 서열
서열번호 27: 인간 ROBO3 cDNA의 뉴클레오티드 서열
서열번호 28: 인간 ROBO4의 아미노산 서열
서열번호 29: IL-8 프로모터 영역의 뉴클레오티드 서열
서열번호 30: MAb1 중쇄 가변 영역을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열(도 15)
서열번호 31: MAb1 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열(도 16)
서열번호 32: MAb1 경쇄 가변 영역을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열(도 17)
서열번호 33: MAb1 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열(도 18)
서열번호 34: 인간 κ 쇄 분비 신호 및 인간 κ 쇄 불변 영역의 아미노산을 코딩하는 cDNA를 포함하는 뉴클레오티드 서열
서열번호 35: 인간 중쇄 신호 서열 및 인간 IgG1 불변 영역의 아미노산을 코딩하는 cDNA를 포함하는 뉴클레오티드 서열
서열번호 36: 인간 중쇄 신호 서열 및 인간 IgG2 불변 영역의 아미노산을 코딩하는 cDNA를 포함하는 뉴클레오티드 서열
서열번호 37: cMAb1 경쇄를 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열(도 19)
서열번호 38: cMAb1 경쇄의 아미노산 서열(도 20)
서열번호 39: cMAb1-1 중쇄를 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열(도 21)
서열번호 40: cMAb1-1 중쇄의 아미노산 서열(도 22)
서열번호 41: cMAb1-2 중쇄를 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열(도 23)
서열번호 42: cMAb1-2 중쇄의 아미노산 서열(도 24)
서열번호 43: MAb1 중쇄 CDRH1의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
서열번호 44: MAb1 중쇄 CDRH1의 아미노산 서열(도 25)
서열번호 45: MAb1 중쇄 CDRH2의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
서열번호 46: MAb1 중쇄 CDRH2의 아미노산 서열(도 26)
서열번호 47: MAb1 중쇄 CDRH3의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
서열번호 48: MAb1 중쇄 CDRH3의 아미노산 서열(도 27)
서열번호 49: MAb1 경쇄 CDRL1의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
서열번호 50: MAb1 경쇄 CDRL1의 아미노산 서열(도 28)
서열번호 51: MAb1 경쇄 CDRL2의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
서열번호 52: MAb1 경쇄 CDRL2의 아미노산 서열(도 29)
서열번호 53: MAb1 경쇄 CDRL3의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
서열번호 54: MAb1 경쇄 CDRL3의 아미노산 서열(도 30)
서열번호 55: hMAb1-H1형 중쇄를 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열(도 31)
서열번호 56: hMAb1-H1형 중쇄의 아미노산 서열(도 32)
서열번호 57: hMAb1-H2형 중쇄를 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열(도 33)
서열번호 58: hMAb1-H2형 중쇄의 아미노산 서열(도 34)
서열번호 59: hMAb1-H3형 중쇄를 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열(도 35)
서열번호 60: hMAb1-H3형 중쇄의 아미노산 서열(도 36)
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tcttgattac aaggatgacg acgataagcg tcaggaagat tttccacctc 120 gcattgttg 129 <210> 96 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 14R <400> 96 gctagctcag ctttcagttt cctctaattc ttc 33 <210> 97 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 15F <400> 97 gcggccgcat gagtctgctg atgtttacac aactactg 38 <210> 98 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 15R <400> 98 gctagcctat aattcacctg taaactgtcc ttgactgttg 40 <210> 99 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 16F <400> 99 gcggccgcat gctgcgctac ctgctgaaaa cgctgctg 38 <210> 100 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 16R <400> 100 gctagctcat cttggttcct ctcggcgttt ctgtcc 36 <210> 101 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 17F <400> 101 ggtaccgata aggaacaaat aggaag 26 <210> 102 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 17R <400> 102 gagctcagct tgtgtgctct gctgtc 26 <210> 103 <211> 20 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 103 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu 20 <210> 104 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 104 Asp Ala Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu 1 5 10 15 <210> 105 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer LYHF6 <400> 105 cctcaccatg aactttgg 18 <210> 106 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer G1EVR1 <400> 106 aagatatctt atttaccagg agagtgggag ag 32 <210> 107 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer MK19EIF1 <400> 107 aagaattcat gaagttgcct gttagg 26 <210> 108 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer KEVR1 <400> 108 aagatatctt aacactcatt cctgttgaag ct 32 <210> 109 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 3. 3-F1 <400> 109 tataccgtcg acctctagct agagcttggc 30 <210> 110 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 3. 3-R1 <400> 110 gctatggcag ggcctgccgc cccgacgttg 30 <210> 111 <211> 47 <212> DNA <213> primer MAb1 LF <400> 111 tctccggcgc gtacggcgat gctgtgatga cccaaactcc actctcc 47 <210> 112 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer MAb1 LR <400> 112 ggagggggcg gccacagccc gtttgatttc cagcttggtg cctcc 45 <210> 113 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer MAb1 HF <400> 113 cagatgggtg ctgagcgaag tgcagctggt ggagtctggg ggag 44 <210> 114 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer MAb1 H1R <400> 114 ttggtggagg ctgagctgac tgtgagagtg gtgccgtggc cccag 45 <210> 115 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer MAb1 2R <400> 115 ttggtgctgg ctgagctgac tgtgagagtg gtgccgtggc cccag 45 <210> 116 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer H-N53Q-F <400> 116 gggtggcaac catcagccaa ggcggcacct acacctac 38 <210> 117 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer H-N53Q-R <400> 117 gtaggtgtag gtgccgcctt ggctgatggt tgccaccc 38 <210> 118 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer L inf-F <400> 118 gcctccggac tctagagcca ccatggtgct gcagacccag gtgttc 46 <210> 119 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer L-EKL-R <400> 119 caggtacagg ttcttgttct cgttttccag gctctggctg cttctgcagc 50 <210> 120 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer L-EKL-F <400> 120 gaaaacgaga acaagaacct gtacctgaac tggtatctgc agaagcccg 49 <210> 121 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer L inf-R <400> 121 tagcctcccc cgtttaaacg ggcccctaac actcccccct g 41

Claims (34)

  1. 하기 (I) 내지 (III)에 기재된 성질:
    (I) 1 x 10-8 이하의 KD 값으로 ROBO4 단백질에 결합하는 성질;
    (II) 시험관내에서 교차-연결(cross-linking) 항체의 부재 하에서 혈관 내피 세포 이동을 억제하거나 저해하는 성질; 및
    (III) 생체내에서 혈관신생을 억제하거나 저해하는 성질
    을 갖는 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서,
    항체가 서열번호 44(도 25)로 표시된 아미노산 서열로 구성된 CDRH1, 서열번호 46(도 26)으로 표시된 아미노산 서열 또는 서열번호 68(도 44)로 표시된 아미노산 서열로 구성된 CDRH2 및 서열번호 48(도 27)로 표시된 아미노산 서열로 구성된 CDRH3을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 50(도 28)으로 표시된 아미노산 서열 또는 서열번호 70(도 46)으로 표시된 아미노산 서열로 구성된 CDRL1, 서열번호 52(도 29)로 표시된 아미노산 서열로 구성된 CDRL2 및 서열번호 54(도 30)로 표시된 아미노산 서열로 구성된 CDRL3을 포함하는 경쇄로 구성되는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 항체가 서열번호 31(도 16)로 표시된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 33(도 18)으로 표시된 아미노산 서열로 구성된 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  3. 제1항에 있어서, 항체가 하기 a) 내지 d)로부터 선택된 어느 한 중쇄 가변 영역 및 하기 e) 및 f)로부터 선택된 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편:
    a) 서열번호 56(도 32)의 아미노산 번호 20 내지 137로 표시된 아미노산 서열로 구성된 중쇄(hMAb1-H1형) 가변 영역, b) 서열번호 58(도 34)의 아미노산 번호 20 내지 137로 표시된 아미노산 서열로 구성된 중쇄(hMAb1-H2형) 가변 영역, c) 서열번호 60(도 36)의 아미노산 번호 20 내지 137로 표시된 아미노산 서열로 구성된 중쇄(hMAb1-H3형) 가변 영역, 및 d) 서열번호 62(도 38)의 아미노산 번호 20 내지 137로 표시된 아미노산 서열로 구성된 중쇄(hMAb1-H4형) 가변 영역; 및 e) 서열번호 64(도 40)의 아미노산 번호 21 내지 134로 표시된 아미노산 서열로 구성된 경쇄(hMAb1-L1형) 가변 영역, 및 f) 서열번호 66(도 42)의 아미노산 번호 21 내지 134로 표시된 아미노산 서열로 구성된 경쇄(hMAb1-L2형) 가변 영역.
  4. 제1항 있어서, 항체가 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역의 하기 조합 1) 내지 6) 중 어느 한 조합을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편:
    1) 서열번호 58(도 34)의 아미노산 번호 20 내지 137로 표시된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 가변 영역 및 서열번호 64(도 40)의 아미노산 번호 21 내지 134로 표시된 아미노산 서열로 구성된 경쇄 가변 영역,
    2) 서열번호 58(도 34)의 아미노산 번호 20 내지 137로 표시된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 가변 영역 및 서열번호 66(도 42)의 아미노산 번호 21 내지 134로 표시된 아미노산 서열로 구성된 경쇄 가변 영역,
    3) 서열번호 62(도 38)의 아미노산 번호 20 내지 137로 표시된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 가변 영역 및 서열번호 66(도 42)의 아미노산 번호 21 내지 134로 표시된 아미노산 서열로 구성된 경쇄 가변 영역,
    4) 서열번호 62(도 38)의 아미노산 번호 20 내지 137로 표시된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 가변 영역 및 서열번호 64(도 40)의 아미노산 번호 21 내지 134로 표시된 아미노산 서열로 구성된 경쇄 가변 영역,
    5) 서열번호 56(도 32)의 아미노산 번호 20 내지 137로 표시된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 가변 영역 및 서열번호 64(도 40)의 아미노산 번호 21 내지 134로 표시된 아미노산 서열로 구성된 경쇄 가변 영역, 및
    6) 서열번호 60(도 36)의 아미노산 번호 20 내지 137로 표시된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 가변 영역 및 서열번호 64(도 40)의 아미노산 번호 21 내지 134로 표시된 아미노산 서열로 구성된 경쇄 가변 영역.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, ROBO4 단백질이 인간 ROBO4 단백질인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, ROBO4 단백질이 서열번호 2의 아미노산 번호 1 내지 1007의 아미노산 서열로 구성된 단백질인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, ROBO4 단백질이 서열번호 2의 아미노산 번호 46 내지 1007의 아미노산 서열로 구성된 단백질인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  8. 제6항에 있어서, 서열번호 2의 아미노산 번호 132 내지 209의 아미노산 서열로 구성된 부위에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 키메라 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  11. 제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 인간화된 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  12. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 인간 IgG1 또는 인간 IgG2 중쇄 불변 영역을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  13. 제1항에 있어서, 중쇄와 경쇄의 하기 조합 1) 내지 6) 중 어느 한 조합을 포함하는 항체:
    1) 서열번호 58(도 34)의 아미노산 번호 20 내지 463으로 표시된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 및 서열번호 64(도 40)의 아미노산 번호 21 내지 239로 표시된 아미노산 서열로 구성된 경쇄 (H-1140),
    2) 서열번호 58(도 34)의 아미노산 번호 20 내지 463으로 표시된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 및 서열번호 66(도 42)의 아미노산 번호 21 내지 239로 표시된 아미노산 서열로 구성된 경쇄 (H-1143),
    3) 서열번호 62(도 38)의 아미노산 번호 20 내지 463으로 표시된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 및 서열번호 66(도 42)의 아미노산 번호 21 내지 239로 표시된 아미노산 서열로 구성된 경쇄 (H-2143),
    4) 서열번호 62(도 38)의 아미노산 번호 20 내지 463으로 표시된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 및 서열번호 64(도 40)의 아미노산 번호 21 내지 239로 표시된 아미노산 서열로 구성된 경쇄 (H-2140),
    5) 서열번호 56(도 32)의 아미노산 번호 20 내지 463으로 표시된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 및 서열번호 64(도 40)의 아미노산 번호 21 내지 239로 표시된 아미노산 서열로 구성된 경쇄 (H-1040), 및
    6) 서열번호 60(도 36)의 아미노산 번호 20 내지 463으로 표시된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 및 서열번호 64(도 40)의 아미노산 번호 21 내지 239로 표시된 아미노산 서열로 구성된 경쇄 (H-2040).
  14. 제13항에 따른 어느 한 항체에서 하나 이상의 변경을 포함하는 항체로서, 상기 변경이 N-연결된 글리코실화, O-연결된 글리코실화, N-말단 프로세싱, C-말단 프로세싱, 탈아미드화, 아스파르트산의 이성질체화, 메티오닌의 산화, 프롤린 잔기의 아미드화 및 카복실-말단에서 1개 또는 2개의 아미노산(들)이 결실된 중쇄로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 항체.
  15. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 서열 면에서 제13항에 따른 어느 한 항체와 95% 이상 동일하고; 인간 ROBO4에 대한 1 x 10-8 이하의 KD 값을 갖고; 시험관내에서 교차-연결 항체의 부재 하에서 혈관 내피 세포 이동을 억제하거나 저해하고; 생체내에서 혈관신생을 억제하거나 저해하는 항체.
  16. 하기 (I) 내지 (III)으로 구성된 군으로부터 선택되는 핵산:
    (I) 제1항에 따른 항체의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산,
    (II) 제1항에 따른 항체의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 구성된 핵산, 및
    (III) 제1항에 따른 항체의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 구성된 핵산.
  17. 제16항에 따른 핵산의 삽입체를 함유하는 재조합 벡터.
  18. 제16항에 따른 핵산 또는 상기 핵산의 삽입체를 함유하는 재조합 벡터를 내부에 도입하여 함유하는 재조합 세포.
  19. 제1항에 따른 항체를 생성하는 세포.
  20. 하기 단계 (I) 및 (II)를 포함하는, 제1항에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조 방법:
    (I) 제18항 또는 제19항에 따른 세포를 배양하는 단계; 및
    (II) 단계 (I)에서 수득된 배양물로부터 제1항에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 수집하는 단계.
  21. 제20항에 따른 제조 방법에 의해 제조된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  22. 제1항 내지 제4항, 제13항 및 제14항 중 어느 한 항에 있어서, N-연결된 글리코실화, O-연결된 글리코실화, N-말단 프로세싱, C-말단 프로세싱, 탈아미드화, 아스파르트산의 이성질체화, 메티오닌의 산화, 프롤린 잔기의 아미드화 및 1개 또는 2개의 카복실-말단 아미노산(들)이 결실된 중쇄로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 변경을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  23. 제1항 내지 제4항, 제13항 및 제14항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 활성 성분으로서 포함하는, 혈관신생 질환을 치료하거나 예방하는 데에 사용하기 위한 약학 조성물.
  24. 삭제
  25. 제1항 내지 제4항, 제13항 및 제14항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 활성 성분으로서 포함하는 혈관신생 억제제.
  26. 제23항에 있어서, 추가 치료제 또는 예방제와 병용되는 약학 조성물.
  27. 제25항에 있어서, 추가 치료제 또는 예방제와 병용되는 혈관신생 억제제.
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
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