MXPA05006724A

MXPA05006724A - Metodo para producir proteinas policlonales recombinantes.

Info

Publication number: MXPA05006724A
Application number: MXPA05006724A
Authority: MX
Inventors: Sharon Jacqueline
Original assignee: Symphogen As
Priority date: 2003-01-07
Filing date: 2004-01-07
Publication date: 2005-09-08
Also published as: KR101024443B1; SI1583830T1; WO2004061104A3; EP1762617A1; ATE338816T1; AU2004203727B2; IL169101A; ES2273202T3; EP1583830A2; HK1078896A1; WO2004061104A2; JP2006515520A; EA200501101A1; DK1583830T3; KR20050101538A; US9163232B2; US20090136498A1; JP4589914B2; EA013225B1; DE602004002275D1

Abstract

La invencion se relaciona con un metodo para producir una composicion proteinica policlonal recombinante, en particular una composicion de anticuerpo policlonal recombinante. El metodo comprende obtener una coleccion de celulas transfectadas con una biblioteca de secuencias de acido nucleico variantes, en donde cada celula en la coleccion esta transfectada con, y es capaz de expresar un miembro de la biblioteca, el cual codifica para un miembro diferente de una proteina policlonal que se une a un antigeno particular y el cual se localiza en el mismo sitio unico en el genoma de las celulas individuales en la coleccion, en donde la secuencia de acido nucleico se relaciona artificialmente con la celula en la coleccion. Las celulas se cultivan bajo condiciones adecuadas para expresion de la proteina policlonal, la cual se obtiene de las celulas o del sobrenadante de cultivo. La secuencia de acido nucleico es introducida en las celulas por transfeccion con una biblioteca de vectores para integracion especifica en el sitio. El presente metodo es adecuado para la fabricacion de anticuerpos policlonales recombinantes y de esta manera vuelve disponible una sustitucion superior de productos terapeuticos de inmunoglobulina derivados de plasma.

Description

METODO PARA PRODUCIR PROTEINAS POLICLONALES RECOMBINANTES CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención forma la base de una plataforma de tecnología para producir proteínas policlonales recombinantes, tales como las proteína de la superfamilia de las inmunoglobulinas, por ejemplo las formas solubles o unidas a membrana de los receptores de linfocitos B o T, para ser utilizados como una clase nueva de sustancias terapéuticas en el tratamiento, disminución o prevención de diversas infecciones, enfermedades inflamatorias, rechazo de transplantes, cáncer y alergias. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Muchas enfermedades infecciosas y cánceres carecen de tratamiento eficaces . Los anticuerpos monoclonales generalmente no han tenido éxito contra estos objetivos. Debido particularmente a la variabilidad de los objetivos complejos y las mutaciones adaptables de las proteínas objetivo que provocan que el sistema inmunológico escape del reconocimiento de anticuerpo monoclonal . Por otra parte, los anticuerpos policlonales son capaces de dirigir una pluralidad de objetivos dinámicos, por ejemplo sobre virus o células cancerosas. Además, los anticuerpos policlonales tienen la mayor probabilidad de retener actividad en caso de mutación antigénica. REF: 164365 Existen diferentes sustancias terapéuticas de anticuerpos policlonales disponibles comercialmente que incluyen: 1) inmunoglobulina humana normal aislada de sangre de donadores humanos normales; 2) inmunoglobulina hiperinmune humana derivada de la sangre de donadores humanos individuales que presentan anticuerpos contra un objetivo de enfermedad particular, por ejemplo un virus el cual previamente se ha encontrado a través de infección o vacunación; y 3) inmunoglobulina hiperinmune derivada de la sangre de animales inmunizados. La inmunoglobulina purificada de sangre humana ha demostrado ser eficaz contra infecciones producidas por el virus de hepatitis B, el virus sincitial respiratorio, citomegalovirus y otros herpes virus, virus de la rabia, toxina botulínica, etcétera así como la profilaxis neonatal contra la característica de Rh D. La inmunoglobulina purificada de sangre de conejos inmunizados con linfocitos T humanos se utiliza para proporcionar inmunosupresión de linfocitos T en el tratamiento o prevención de rechazo de transplantes (por ejemplo timoglobulina) . La inmunoglobulina humana normal se ha utilizado para reforzar al sistema inmunológico de pacientes inmunodeficientes así como en el tratamiento de diversos desórdenes autoinmunes . No obstante, el uso ampliamente diseminado de la inmunoglobulina se ha limitado debido al suministro limitado de materia prima de sangre del donador, problemas con variaciones de un lote a otro y seguridad variable. Las inmunoglobulinas derivadas de animales en particular se enfrentan con los mismos problemas de la inmunogenicidad a los que se observan en anticuerpos monoclonales derivados de animales en la década délos 80 y de los 90. Finalmente, al igual que con otros productos derivados de la sangre, permanece el riesgo de transmisión de agentes infecciosos tales como VIH, herpes o virus de hepatitis. En consecuencia, aunque los médicos reconocen que los anticuerpos policlonales son el procedimiento terapéutico de elección en algunas situaciones, su uso ha sido muy limitado. Surge soluciones nuevas para generar inmunoglobulinas humanas con técnicas de animales transgénicos . Se han generado animales transgénicos que presentan loci para inmunoglobulina humana (patente de E.U.A. No. 6,111,166). Estos ratones producen inmunoglobulinas completamente humanas y anticuerpos contra un objetivo específico que puede ser generado por técnicas de inmunización habituales. No obstante, los alimentos de anticuerpos más grandes se limitan debido al tamaño relativamente pequeño de los ratones. Los animales más grandes también se han vuelto transgénicos para los genes de inmunoglobulina humana, por ejemplo de vacas, borregos, conejos y pollos (Kuroiwa, Y. et al. Nature Biotechnology; 2002; 20: 889-893). No obstante, la producción de anticuerpos policlonales para el tratamiento a partir de la sangre de dichos animales no está libre de complicaciones. En primer lugar, la inmunofisiología del animal y los humanos puede mostrar deficiencias considerables que provocan una diferencia en el repertorio inmunológico resultante, en el rearreglo funcional y la diversidad de la respuesta de anticuerpos . En segundo lugar, la inestabilidad mitótica de loci de inmunoglobulina introducidos puede afectar la producción a largo plazo de anticuerpos. En tercer lugar, técnicamente es demandante suprimir los loci de inmunoglobulina propio de los animales de manera que, por ejemplo, la producción de anticuerpo animal no exceda la producción de anticuerpo humano. En cuarto lugar, el riesgo de transmisión de los agentes infecciosos tales como virus, priones u otros patógenos acompaña a la administración de anticuerpos humanos producidos en animales . En consecuencia, existe la necesidad de fabricar tecnologías para producir proteínas policlonales recombinantes tales como anticuerpos en cantidades suficientemente grandes y con variaciones mínimas de un lote a otro, para usos clínicos inocuos . Los métodos eficaces para fabricar proteínas recombinantes homogéneas que utilizan líneas de expresión de células eucarióticas (en particular de mamífero) se han desarrollado para la producción de una diversidad de proteínas que incluyen anticuerpos monoclonales , interleucinas , interferones , factor de necrosis tumoral, factores de coagulación VII, VIII y IX. Muchas de estas técnicas se basan en la transfección e integración aleatoria del gen de interés en el genoma de la línea de células de expresión seguido por selección, amplificación- y caracterización del clon de expresión altamente productor y propagación de este clona como una línea de células de expresión maestra. La expresión de. un. gen extraño insertado puede ser alterada por "efectos de posición" a partir del ADN genómico circundante. En muchos casos, el gen se inserta en sitios en donde los efectos de posición son suficientemente fuertes para inhibir la síntesis del producto del gen introducido. Además, la expresión con frecuencia es inestable debido a mecanismos bloqueadores (por ejemplo metilación) impuestos por el ADN anfitrión cromosómico circundante. Los sistemas que permiten la integración y expresión de un gen de interés en células de mamífero en un lugar genómico específico se han desarrollado para la expresión de una composición de proteína recombinante homogénea (patentes de E.U.A. NOS. 4,959,317 y 5,654,182; WO 98/41645; WO 01/07572) . El documento WO 98/41645 describe la integración de sitio específicapara la producción de una línea de células de mamífero que secreta, por ejemplo, anticuerpo. No obstante, esta expresión es monoclonal y no hay indicación de las transíecciones se puedan realizar con una biblioteca de vectores . Tampoco hay sugerencias respecto a cómo mantener la diversidad original generada por las combinaciones específicas VH-Vi, en una biblioteca. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona soluciones para generar una línea de células productoras para expresión y producción de una proteína policlonal recombinante, evitar desviaciones significativas entre miembros individuales que constituyen la proteína policlonal. Además, la presente invención no utiliza animales en la producción de proteínas policlonales por lo que elimina las dificultades éticas y clínicas relacionadas con tales soluciones . La presente invención proporciona métodos para producir una línea de células de producción policlonal recombinante para la producción de una proteína policlonal recombinante, con frecuencia seleccionada de la superfamilia de inmunoglobulinas . Especialmente, son de interés la producción de anticuerpos policlonales, receptores de linfocitos T policlonales o fragmentos policlonales de los mismos . La presente invención permite la producción comercial de una proteína policlonal recombinante para uso en composiciones farmacéuticas . Una característica importante de la invención es que durante el procedimiento de fabricación la expresión' deseada de las moléculas individuales que constituyen la proteína policlonal se mantiene en un nivel no significativo, lo que minimiza la variación no deseada de lote a lote. Un aspecto de la presente invención se relaciona con un método para fabricar una proteína policlonal recombinante de interés, en donde la proteína policlonal comprende (o consiste de) miembros distintos que unen un antígeno particular, el método comprende: a) proporcionar una colección de células que comprenden una biblioteca de secuencias de ácido nucleico variante, en donde cada una de las secuencias de ácido nucleico codifica para un miembro distinto de la proteína policlonal y en donde cada una de las secuencias de ácido nucleico está integrada al mismo sitio único del genoma de cada célula individual en la colección de células; b) cultivar la colección de células bajo condiciones que faciliten la expresión de la proteína policlonal; y c) recuperar la proteína policlonal expresada del cultivo celular, la fracción celular o el medio de cultivo celular. Un aspecto adicional de la presente invención se relaciona con un método para generar una colección de células adecuado como una línea de células de producción policlonalrecombinantes , el método comprende: a) proporcionar una biblioteca de vectores que comprenden una población de secuencias de ácido nucleico variantes, en donde cada uno de los vectores comprende: 1) una copia única de una secuencia de ácido nucleico distinta que codifica para un miembro distinto de una prote na policlonal que comprende (o que consiste de) miembros distintos qué unen un antígeno particular, y 2) una o más secuencias de reconocimiento de recombinasa; b) introducir la biblioteca de vectores dentro de una línea de células hospederas, en donde el genoma de cada célula individual de la línea de células hospederas comprende secuencias de reconocimiento de recombinasa, que coinciden con los del vector, en un sitio específico único en su genoma; c) asegurar la presencia en las células de una o más recombinasas de manera que las secuencias de ácido nucleico variantede la etapa (a) se integren específicamente en el sitio en las células de la línea de células hospederas, en donde una o más recombinasas son: i) expresadas por las células en las cuales se introduce la secuencia de ácido nucleico; ii) codificado operativamente por los vectores de la etapa a; iii) proporcionado a través de la expresión de un segundo vector; o iv) proporcionado a las célula como una proteína; y b) seleccionar células que comprenden una copia integrada de la biblioteca de secuencias de ácido nucleico variantes. En ambos métodos de la invención, se comprenderá que la proteína policlonal normalmente es aquella que no se asocia naturalmente con las células en donde se lleva a cabo la expresión. La presente invención describe varios métodos mediante los cuales se puede introducir una biblioteca de secuencias de ácido nucleico variantedentro de una linea de células hospederas con el fin de generar una colección de células adecuadas como una linea de células productoras policlonales . Estos métodos incluyen la transfección a granel de una colección de células con la biblioteca, la tranfección semi a granel de alícuotas de células con fracciones de la biblioteca o transfección individual en donde las células hospederas son transfectadas con miembros individuales de la biblioteca seguido por acumulación de los clones generados por selección. Preferiblemente, la presente invención utiliza células de mamífero (líneas de células o tipos de células) como una línea de células anfitrionas . En un aspecto de la invención, los miembros individuales de una proteína policlonal son codificados a partir de pares de segmentos de genes independientes . Las proteínas policlonales, en donde los miembros individuales están constituidos de dos cadenas polipeptídicas, incluyen las formas solubles o unidas a membrana de anticuerpos y receptores de linfocitos T. En modalidades adicionales de la presente invención un par de segmentos de gen codifica para la región variable de la cadena pesada y la cadena ligera de anticuerpo, o una región variable de cadena a. y de cadena ß de receptor de linfocito T o una región variable de la cadena ? y la cadena d del recetor de linfocito T.

La presente invención proporciona además una línea de células de producción policlonalrecombinantes que comprenden una colección de células transfectadas con una biblioteca de secuencias de ácido nucleico variantes, en donde cada célula en la colección es transfectada y es capaz de expresar un miembro de la biblioteca, la cual codifica para un miembro distinto de una proteína policlonal que se une a un antígeno particular y la cual se localiza en el mismo sitio único en el genoma de células individuales en la colección, en donde la secuencia de ácido nucleico se asocia artificialmente con la célula en la colección. La línea celular preferiblemente se origina de una línea de células de mamífero tal como células de ovario de hámster chino (CHO) , células COS, células BHK, células de mieloma (por ejemplo células Sp2/0, NSO), YB2/0, NIH 3T3 , células humanas de fibroblastos o inmortalizadas tales como células HeLa, células HE 293 o PER.C6. No obstante, también se pueden utilizar células eucarióticas o procarióticas diferentes de mamífero tales como células vegetales, células de insectos, células de levadura, bacterias, hongos, etcétera. También se incluyen por la presente invención una biblioteca de vectores para integración de sitio especxficaque comprende una población de secuencias de ácido nucleico varianteque existen en la naturaleza, en donde cada uno de los vectores comprenden: 1) una copia de una secuencia de ácido nucleico distinta que codifica para un número distinto de una proteína policlonal que se une a un antígeno particular, y 2) una o más secuencias de reconocimiento de recombinasa. En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende, como un ingrediente activo, un anticuerpo policlonal recombinante (o un fragmento del mismo) o un receptor de linfocito T policlonal (o un fragmento del mismo) , que se obtiene preferiblemente por los métodos de la invención. La proteína policlonal recombinante de la composición es específica o reactiva contra un objetivo de enfermedad predeterminado. Tales composiciones farmacéuticas se pueden utilizar para el tratamiento, disminución o prevención de enfermedades tales como cáncer, enfermedades infecciosas e inflamatorias, alergia, asma y otras enfermedades respiratorias, enfermedades autoinraunes, mal funcionamiento inmunológico, enfermedades cardiovasculares, enfermedades en el sistema nervioso central, enfermedades metabólicas y endocrinas, rechazo de transplante o embarazo no deseado, en un mamífero tal como un humano, un animal doméstico o una mascota. DEFINICIONES Mediante los términos "proteína" o "polipéptido" se quiere significar cualquier cadena de aminoácidos, sin importar la longitud o modificación post-traduccional . Las proteínas pueden existir como monómeros o multímeros que están constituidos de dos o más cadenas polipeptídicas ensambladas , fragmentos de prote nas, polipéptidos, oligopéptidos o péptidos . Como se utiliza en la presente, los términos "proteína policlonal" o "policlonalidad" se refiere a una composición proteínica que comprende moléculas de proteína diferentes pero homologas, que se seleccionan preferiblemente de la superfamilia de inmunoglobulina. Así, cada molécula de proteína es homologa con otras moléculas de la composición, pero también contiene una o más cadenas de una secuencia polipeptídica variable las cuales están caracterizadas por diferencias en la secuencia de aminoácidos entre los miembros individuales de la proteína policlonal. Los ejemplos conocidos de tales proteínas policlonales incluyen moléculas de anticuerpo o de inmunoglobulina, receptores de linfocito T y receptores de linfocito B. Una proteína policlonal puede consistir de un subconjunto definido de moléculas proteínas, las cuales han sido definidas por un rasgo común tal como una actividad de unión compartida hacia un objetivo deseado, por ejemplo, en el caso de un anticuerpo policlonal contra el antígeno objetivo deseado. El término "proteína policlonal de interés" cubre a un subconjunto de proteína policlonal definido, el cual comparte una característica común, tal como actividad de unión hacia un objetivo deseado, por ejemplo en el caso de anticuerpos policlonales descritos por la actividad de unión o especificidad contra el antígeno objetivo, el antígeno es uno o más de, por ejemplo, proteínas separadas, microorganismos, parásitos, tipos de células, alérgenos o moléculas de carbohidrato o cualquier otra estructura, molécula o sustancia que pueda ser el objetivo de unión de anticuerpo específico o mezclas de dichos antígenos. Los términos "un miembro de una composición de proteína policlonal recombinante" o "un miembro de una proteína policlonal recombinante" indica una molécula de proteína o una composición proteínica que comprende moléculas de proteína diferentes pero homologas, en donde cada molécula de proteína es homologa a las otras moléculas de la composición, pero la cual contiene una o más cadenas de una secuencia polipeptídica variable, las cuales están caracterizadas por diferencias en las secuencias de aminoácidos entre los miembros individuales de la proteína policlonal . Los términos "secuencia polipeptídica variable" y "región variable" se utilizan de manera intercambiable. Los términos "un miembro distinto de una proteína policlonal recombinante" indica una molécula de proteína de una composición proteínica que comprende moléculas proteínicas diferentes pero homologas, en donde cada molécula de proteína es homologa a las otras moléculas de la composición, pero que también contiene una o más cadenas de una secuencia polipeptídica variable, las cuales están caracterizadas por diferencias en la secuencia de aminoácidos entre los miembros individuales de la proteína policlonal. El término "anticuerpo" describe un componente funcional del suero y con frecuencia se denomina ya sea como una colección de moléculas (anticuerpos o inmunoglobulina) o como una molécula (la molécula de anticuerpo o la molécula de inmunoglobulina) . Una molécula de anticuerpo es capaz de unirse a o de reaccionar con un determinante antigénico específico (el antígeno o el epítopo antigénico) el cual a su vez puede llevar a la inducción de mecanismos efectores inmunológicos . Una molécula de anticuerpo individual habitualmente se considera como monoespecífica y una composición de moléculas de anticuerpo puede ser monoclonal (es decir, consistir de moléculas de anticuerpo idénticas) o policlonal (es decir, consistir de moléculas de anticuerpo diferentes que reaccionan con epítopos iguales o diferentes en el mismo antígeno o incluso en antígenos distintos y diferentes) . Cada molécula de anticuerpo tiene una estructura única que permite que se una específicamente a su antígeno correspondiente y todas las moléculas de anticuerpo naturales tienen la misma estructura básica general de dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas . Los anticuerpos también se conocen colectivamente como inmunoglobulinas . El término anticuerpo o anticuerpos, como se utiliza en la presente, también se relaciona con anticuerpos quiméricos y de cadena sencilla asi como fragmentos de unión de anticuerpos tales como los fragmentos Fab, Fv o los fragmentos scFv, así como las formas multiméricas tales como las moléculas de IgA diméricas o IgM pentavalente. El término "anticuerpo policlonal" describe una composición de moléculas de anticuerpo diferentes las cuales son capaces de unirse o de reaccionar con varios determinantes antigénicos específicos diferentes en antígenos iguales o diferentes. Habitualmente, la variabilidad de un anticuerpo policlonal se describe que se localiza en lo que se denominan regiones variables del anticuerpo policlonal. No obstante, en el contexto de la presente invención, la condición policlonal (policlonalidad) se puede entender que describe diferencias entre moléculas de anticuerpo individuales que se encuentran en las denominadas regiones constante, por ejemplo, en el caso de mezclas de anticuerpos que contienen dos o más isotipos de anticuerpo tales como los isotipos humanos IgGl , IgG2 , IgG3 , IgG4, IgAl e IgA2 o isotipos murinos IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3 e IgA. Un "anticuerpo policlonal recombinante de interés" describe un subconjunto de anticuerpo policlonal recombinante definido, el cual se caracteriza por su capacidad para unirse a un objetivo deseado o a una conjunto deseado de objetivos, - le ¬ los objetivos son, por ejemplo, una proteína separada, un microorganismo, un parásito, una célula, un alérgeno o una molécula de carbohidrato u otra estructura, molécula o sustancia la cual puede ser el objetivo de la unión de anticuerpo específica, o mezclas de los mismos. El término "inmunoglobulina" se utiliza comúnmente como una designación colectiva de la mezcla de anticuerpos que se encuentran en sangre o suero, pero también se puede utilizar para designar una mezcla de anticuerpos derivados de otras fuentes . El término "molécula de inmunoglobulina" indica una molécula de anticuerpo individual, por ejemplo que es una parte de la inmunoglobulina o parte de cualquier composición de anticuerpo policlonal o monoclonal. Cuando se afirma que un miembro de una proteína policlonal se une a un antígeno, por la presente se quiere significar una unión que tiene una constante de unión que es menor de 1 irtM, de manera preferible menor a 100 M, e incluso de manera más preferible inferior a 10 nM. El término "una biblioteca de moléculas de ácido nucleico variante de interés" se utiliza para describir la colección de moléculas de ácido nucleico las cuales codifican colectivamente para una "proteína policlonal recombinante de interés". Cuando se utiliza para transíección, la biblioteca de moléculas de ácido nucleico variantede interés está contenida en una biblioteca de vectores de expresión. Tal biblioteca típicamente tiene por lo menos 3, 5, 10 ,20, 50, 1000, 104, 105 o 105 miembros distintos. Como se utiliza en la presente, los términos "una copia de una secuencia de ácido nucleico distinta de interés" no debe tomarse literalmente como una cadena única de ácidos nucleicos que corresponde a un segmento de gen único, sino más bien como una copia de todos los segmentos de gen que se requieren para producir todas las subunidades de una molécula de la proteína de interés, y que se ensamblan en una molécula de ácido nucleico tal como, por ejemplo, un vector. Algunos ejemplos, en donde habitualmente se requiere más de un segmento de gen para dar lugar a una molécula completa de una proteína de interés incluyen receptores de linfocitos B, anticuerpos y fragmentos de anticuerpos tales como los Fab's y dominios variables, o receptores de linfocitos T. Cuando se introducen en la célula, los segmentos de gene los cuales juntos codifican para la proteína de interés ensamblada completamente, residen en el mismo vector y de esta manera se unen enlazándose en una secuencia de ácido nucleico única, posiblemente como elementos de transcripción separados bajo el control de promotores diferentes . El término "un gen de interés", como se utiliza en la presente, se refiere a una secuencia de ácido nucleico constituida de uno o más segmentos de genes (genómicos o de ADNc) que codifican para un miembro de una proteína de interés. La forma plural "genes de interés" se refiere a una biblioteca de secuencias de ácido nucleico que codifican para una proteína de interés policlonal. El término "GOI" se utiliza como una abreviatura de (uno) o varios de los genes de interés . Como se utiliza en la presente, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico en la cual se puede insertar una secuencia de ácido nucleico para transporte entre ambientes genéticos diferentes o para expresión en una célula anfitriona. Un vector capaz de integrarse en el genoma de una célula hospedera en un locus específico predeterminado en el genoma en la presente se denomina un "vector para integración específica de sitio" si el vector presenta elementos reguladores para transcripción de la secuencia de ácido nucleico insertado en el vector (por lo menos un promotor adecuado) , el vector en la presente se denomina "un vector de expresión" . Si el vector de expresión es capaz de integrarse en un locus específico predeterminado en el genoma de la célula anfitriona, el vector de expresión se puede denominar "un vector de expresión para integración específica de sitios". Si la secuencia de ácido nucleico insertada en los vectores identificados en lo anterior codifica para una proteína de interés como se define en la presente, se utilizan los siguientes términos "vector de interés", "vector de interés", "vector de interés para integración específica en el sitio", "vector de expresión de interés" y "vector de expresión de interés para integración específica en el sitio" . El término "un vector de codificación de isotipo" se refiere a un vector que presenta secuencias de ácido nucleico que codifican para un isotipo de anticuerpo. En la presente especificación, se utilizan de manera intercambiable un "vector fagémido" y "vector de fago". Los términos "plásmido" y "vector" se utilizan de manera intercambiable. La invención se pretende que incluya a tales otras formas de vectores, las cuales tienen funciones equivalentes, por ejemplo plásmidos, fagémidos y genomas de virus o cualquier otra molécula capaz de dirigir la producción de una proteína de interés en un anfitrión adecuado. El término "cada miembro de la biblioteca de vectores de interés" se utiliza para describir moléculas de vectores individuales con una secuencia de ácido nucleico distintas derivadas de una biblioteca de vectores de interés, en donde la secuencia de ácido nucleico codifica para un miembro de la proteína policlonal recombinante de interés. El término "transferencia de masas" se utiliza para describir la transferencia de secuencias de ácido nucleico de interés de una población de vectores a otra población de vectores y al hacer esto para cada ADN simultáneamente sin restaurar para aislamiento de los ADN individuales de interés .

Tales poblaciones de vectores pueden ser bibliotecas que contienen, por ejemplo, regiones variables, promotores, líderes o elementos de mejoramiento de interés. Estas secuencias después se pueden mover sin aislamiento previo desde, por ejemplo, un vector de fago a un vector de expresión de mamífero. Especialmente para secuencias de anticuerpo, esta técnica asegura que el enlace entre la diversidad de VH Y L no se pierda mientras se mueven bibliotecas, por ejemplo, desde un vector de selección (por ejemplo un vector de presentación de fago) a un vector de expresión de mamífero. Por lo tanto se retiene la paridad original de VH y VL. El término ¾transfección" se utiliza en la presente como un término amplio para introducir ADN extraño en una célula. El término también significa cubrir otros métodos equivalentes funcionales para introducir ADN extraño en una célula tales como, por ejemplo transformación, infección, traducción o fusión de una célula donadora y una célula aceptora . El término Mselección" se utiliza para describir un método en donde las células han adquirido ciertas características que permiten el aislamiento de las células que no hayan adquirido dicha característica. Tales características pueden ser resistentes a un agente citotoxico o producción de un nutriente, enzima o color esenciales. Los términos "gen marcador seleccionable" , "gen marcador se selección", "gen de selección" y "gen marcador" se utilizan para describir un gen que codifica para un marcador seleccionable (por ejemplo un gen que confiere resistencia contra algún medicamento citotóxico tal como ciertos antibióticos, un gen capaz de producir un nutriente esencial el cual puede ser suprimido del medio de crecimiento, un gen que codifica para una enzima que produce metabolitos analizables o un gen que codifica para una proteína coloreada la cual, puede ser clasificada, por e emplo, por fax) , la cual es cointroducida en las células junto con uno o varios de los genes de interés . El término "proteína recombinante" se utiliza para describir una proteína que se expresa a partir de una línea celular transfectada con un vector de expresión que comprende la secuencia codificante de la proteína. Como se utiliza en la presente, el término "unido operablemente" se refiere a un segmento que está unido a otro segmento cuando se coloca en una relación funcional con el otro segmento. Por ejemplo, un ADN que codifica para una secuencia señal está unido operablemente a un ADN que codifica para un polipéptido si se expresa como un líder que participa en la trasferencia del polipéptido al retículo endoplásmico . Además, un promotor o me orador está unido operablemente a una secuencia codificante si estimula la transcripción de la secuencia.

El té-rmino "la mayor parte de las células individuales" se refiere a un porcentaje de las células tal como más de 80%, de manera preferible más de 85%, de manera más preferible 90%, 95% o incluso 99% o mayor. Como se utiliza en la presente, el término "genoma" no debe ser tomado literalmente como el complemento normal de los cromosomas presentes en una célula, sino también como elementos extracromosómicos que se pueden introducir o mantener en una célula. Tales elementos extracromosómicos pueden incluir, pero no se limitan a minicromosomas, YAC (cromosomamas artificiales de levadura) , MAC (cromosomas artificiales de ratón) o HAC (cromosomas artificiales humanos) . El término "promotor" se refiere a una región de ADN involucrada en la unión de AR polimerasa para iniciar la transcripción. El término "promotor es cabeza a cabeza" se refiere a un par promotor que está colocado en proximidad cercana de manera que la transcripción de los dos fragmentos de genes activados por los promotores se produce en direcciones opuestas . También se puede construir un promotor cabeza a cabeza con un separador constituido de ácidos nucleicos que no se traducen, entre los dos promotores . Tal fragmento intermedio puede contener fácilmente más de 500 nucleótidos . Un "gen de resistencia a antibiótico" es un gen que codifica para una proteína que puede vencer el efecto inhibidor o tóxico que tiene un antibiótico sobre una célula asegurando la supervivencia y permitiendo continuar la proliferación de células en presencia del antibiótico. El término "sitio interno de entrada de ribosoma o "IRES" describe una estructura diferente de la estructura 5' de remate normal de un ARNm. Ambas estructuras pueden ser reconocidas por un ribosoma para iniciar la exploración en búsqueda de un codón AUG para iniciar la traducción. Mediante la utilización de una secuencia promotora en dos AUG de iniciación, se puede traducir una primera y una segunda secuencia polipeptídicas a partir de un ARN, único. De esta manera, para permitir la traducción conjunta de una primera y segunda secuencia polinucleotídicas a partir de un único ARNm bicistronico, la primera y segunda secuencias polinucleotídicas se pueden fusionar transcripcionalmente vía una secuencia enlazante que incluye una secuencia IRES que permite la traducción de la secuencia polinucleotídica corriente debajo de la secuencia IRES. En este caso se traducirá una molécula de ARN bicistrónica transcrita desde el extremo 5 ' rematado y desde a secuencia IRES interna de la molécula de ARN bicistrónica y de esta manera se producirá un primero y un segundo polipéptidos . El término "expresión inducible" se utiliza para describir una expresión que requiere la interacción de una molécula inductora o la liberación de una molécula correpresora y una proteina reguladora para que se lleve a cabo la expresión. El término "expresión constitutiva" se refiere a una expresión la cual no es habitualmente inducible. El término "recombinasa" se refiere a una enzima que cataliza la recombinación entre dos o más sitios de recombinación. Las recombinasas útiles en la presente invención catalizan la recombinación en sitios de recombinación específicos que son secuencias específicas de ácido nucleico reconocidas por una recombinasa particular. El término "mezclado" describe situaciones en donde dos o más miembros distintos de una proteína policlonal constituida de dos cadenas polipeptídicas diferentes, por ejemplo de la superfamilia de inmunoglobulinas , se expresan a partir de una célula individual. Esta situación puede surgir cuando la célula integral se ha integrado en el genoma con más de un par de segmentos de gen, en donde cada par de segmentos de gen codifica para un miembro distinto de la proteína policlonal. En tales situaciones. Se puede realizar las combinaciones no deseadas de las cadenas polipeptídicas expresadas a partir de los segmentos de gen. Estas combinaciones no deseadas de cadenas de polipéptidos pueden no tener ningún efecto terapéutico. El término "mezclado de la cadena de V"H-VL" es un ejemplo del mezclado definido en lo anterior. En este ejemplo, los segmentos de genes que codifican para VH y VL constituyen un par de segmento de genes . El mezclado se produce cuando se generan combinaciones no deseadas de polipéptidos VH y VL a partir de una célula en donde se integran en la misma célula dos pares de segmentos de genes que codifican para VH y VL diferentes. Tal molécula de anticuerpo mezclada probablemente no retenga la especificidad original y por lo tanto puede no tener efecto terapéutico alguno. El término wlínea de células productoras policlonales recombinantes" se refiere a una población de células que expresan proteínas que son transíectadas con una biblioteca o secuencias de ácido nucleico variante de interés tales como las células individuales, las cuales juntas constituyen la línea de células de producción policlonal recombinantes, presentan únicamente una copia de una secuencia de ácido nucleico distinta de interés, las cuales codifican para un miembro de la proteína policlonal recombinante de interés, y cada una de las copias se integra en el mismo sitio del genoma de cada célula. Las células que constituyen a línea de células de producción policlonal recombinante se seleccionan por su capacidad para retener la copia integrada de las distintas secuencias de ácido nucleico de interés, por ejemplo, mediante selección de antibióticos. Las células las cuales pueden constituir tal línea de células productoras pueden ser, por ejemplo, bacterias, hongos, células eucarióticas tales como levaduras, células de insecto o células de mamífero, especialmente - líneas de células de mamífero inmortales tales como células CHO, células COS, células BHK. Células de mieloma (por ejemplo células Sp2/0. NSO) , NIH 3T3, YB2/0 y células humanas inmortalizadas tales como células HeLa, células HEK 293 o PER.C6. El término "punto caliente" como en "líneas de células de punto caliente" se refiere a un locus preestablecido del genoma de la célula que ha sido seleccionado o generado y caracterizado por una transcripción altamente eficaz de una secuencia de ácido nucleico integrada de interés ante la integración del vector de expresión en dicho sitio. El término "desviación" se utiliza para indicar el fenómeno durante la producción de proteína policlonal recombinante, en donde la composición de un vector policlonal, una línea de células policlonales o una proteína policlonal se altera con respecto al tiempo debido a las mutaciones genéticas aleatorias, diferencias en la cinética de proliferación entre células individuales, diferencias en los niveles de expresión entre diferentes secuencias de constructo (plásmido recombinante) de expresión o diferencias en la eficiencia de clonación de ADN. El término "RFLP" se refiere a "polimorfismo de longitud de fragmento de restricción", un método por el cual se analiza el patrón de migración en gel de fragmentos de moléculas de ácido nucleico después de su separación con enzimas de restricción. El término "HDS" se refiere a un método de cribado de alta densidad en donde se prueban en paralelo muchas moléculas separadas sobre membranas de manera gue se criban grandes cantidades de compuestos de prueba para una actividad dada, simultáneamente . Como se utiliza en la presente, "PCR TaqMan" se refiere a un ensayo de PCR basado en el sistema TaqMan descrito por Holland, P. . Et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 88: 7276-7280 (1991). El término "5' UTR" se refiere a una región no traducida 5' en el ARNm. El término "PCR Pfu" se refiere a una reacción de PCR gue se lleva a cabo utilizando ADN polimerasa Pfu (aislada de Pyrococcus furiosus) , la cual se utiliza debido a gue tiene la fidelidad más alta entre las polimerasas termoestables conocidas. Abreviaturas: "CMV" = citomegalovirus (humano). "MSPSV" = virus de sarcoma mieloproliferativo . "AdMLP" = promotor temprano mayor de adenovirus . SV40 poli A = secuencia de señal poli A del virus simio 40. GFP = proteínas fluorescentes verdes, PVDF = difluoruro de polivinilideno. TcR = receptor de linfocitos T. ELISA = ensayo inmunosorbente unido a enzima. LTR = secuencia repetida terminal larga. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1: Es una representación esquemática de un vector de expresión de "promotor cabeza a cabeza" que comprende los siguientes elementos : Amp pro = A que permite la expresión del gen de resistencia a ampicilina. Amp = un gen de resistencia a ampicilina. Origen pUC = origen de replicación pUC. Sitios de enzimas de restricción: Notl y EcoRL . Promotor A/promotor B = cásete promotor cabeza a cabeza que incluye secuencias líder (por ejemplo CMV/ PSV) . V pesada = secuencia que codifica para la cadena pesada variable de una GOI. C cadena ? = secuencias que codifican para una cadena pesada constante (por ejemplo las secuencias de ratón de la cadena pesada constante igGl o lgG2B) R-B-globina pA = secuencia de poli A de globina ß de conejo. BGH poli A = secuencia poli A de hormonas del crecimiento bovina, V = secuencia que codifica para la región variable ? de una GOI . Cadena C = secuencia que codifica para la cadena ? constante. Sitio FRT = sitio de recombinación FRT. Higromicina = gen para resistencia a higromicina. SV40 poli A = secuencia de señal poli A. Figura 2 : Es una representación esquemática de un vector de expresión para la expresión unidireccional que comprende los siguientes elementos: Amp pro = un promotor que permite la expresión de un gen de resistencia a ampicilina.

Amp = un gen de resistencia a ampicilina. PUC ori = un origen de replicación pUC. Promotor A = promotor de mamífero que incluye secuencias líder (por ejemplo AdMLP) . V pesada = secuencia que codifica para la cadena pesada variable de una GOI . C cadena ? = secuencias que codifican para la cadena pesada constante (por ejemplo las secuencias para la cadena pesada constante de IgGl de ratón) . hGH poli A = secuencia poli A de hormona del crecimiento humana. bGH poli A = secuencia poli A de hormona del crecimiento bovina. V ? = secuencia que codifica para la cadena ligera ? variable de una GOI . C = secuencia que codifica para la cadena ? constante . FRT = un sitio de recombinación FRT. Higromicina = gen para resistencia a higromicina. SV40 poli A = una secuencia de señal poli A. Las secuencias de hGH poli A y el promotor A se pueden separar por una estructura IRES. Figura 3: Es un diagrama de flujo que establece la generación de una línea de células de producción policlonalrecombinantes y la producción de una proteína policlonal recombinante . 1) ilustra una estrategia de transfección a granel; 2) ilustra una estrategia de transfección semi a granel y 3) ilustra una estrategia de transfección individual. A) ilustra la biblioteca de vectores (líneas horizontales) , las puntas de flecha ilustran el agrupamiento de los vectores. En la estrategia 1, los vectores se agrupan a granel, y la estrategia 2 se agrupan en fracciones más pequeñas (semi a granel) mientras que en la estrategia 3 se mantienen separadas entre sí (individual) . B) ilustra la transfección en donde el número de tubos depende del agrupamiento de los vectores que constituyen la biblioteca. C) ilustra la selección de células que se han integrado específicamente en el sitio de GOI dentro del genoma de célula, anfitriona, D) ilustra la generación de un concentrado de biblioteca GOI policlonal, en donde las células seleccionadas que constituyen la biblioteca integrada se almacenan en un congelador. Es opcional acumular clones individuales o acumular los clones. E) ilustra el inicio de una fase de fabricación, en donde los clones del concentrado se calientan (ya sea individualmente, a partir de fracciones más pequeñas o a partir de un acumulado) y se adaptan para crecimiento en suspensión. La adaptación a medios sin suero se puede realizar después de la etapa de selección o en esta etapa. F) ilustra la etapa en la producción en donde la línea de células policlonales se propaga para siembra en un biorreactor más grande (las etapas de sembrado intermedias son una opción, aunque no se ilustran) . En la estrategia 2 y 3, esta es la etapa en donde el concentrado de clon de célula policonal ya no se mantienen como clones individuales o fracciones semi a granel, sino que se acumulan en una colección de células, formando una línea de células de producción policlonalrecombinantes . G) ilustra la producción final que se obtiene a partir de un biorreactor de producción. Después de la fase de producción, la composición de proteínas policlonales se cosecha para purificación y caracterización del producto. Las Figuras 4A-4E: Son diagramas de flujo que ilustra la generación de un vector de expresión de mamífero. (Fig. 4A) Representación esquemática de un vector fagémido, pSymvclO, el cual presenta una secuencia que codifica para un miembro de la GOI. P tac y P lacZ = cásete de promotor bacteriano cabeza a cabeza. V ? = secuencia que codifica para la cadena ligera ? variable de una GOI. Cadena ? C = secuencia que codifica para la cadena ligera ? constante de ratón. P pesado: una secuencia que codifica para la cadena pesada variable de una GOI. Cadena ? C = secuencia que codifica para el dominio CHl de la cadena pesada constante. Sitios de enzima de restricción: EcoRI, Noti, Sacl y Xhol. cpIII = proteína III de fago. Amp pro = un promotor que permite la expresión del gen de resistencia a ampicilina. Amp = un gen de resistencia a ampicilina. PUC Orí - un origen de replicción pUC. Etapa 1: Por digestión de restricción con Sacl y Xhol, se puede cortar el cásete promotor bacteriano a partir de pSymvclO y por ligación, se puede sustituir con un cásete (Fig. 4B) promotor de mamífero que también se ha preparado por digestión de restricción con Sacl y .Xhol. (Fig.4C) Representación esquemática de un vector fagémido, pSymvcl2, que presenta secuencias de GOI, después de intercambio de promotor con un cásete promotor cabeza a cabeza de mamífero. Promotor A/promotor B = cásete de selección promotor cabeza a cabeza (por ejemplo CMV/MPSV) V = secuencia que codifica para una cadena ligera ? variable de una GOI. Cadena ? C = secuencia que codifica para la cadena constante de ratón. V pesada = secuencia que codifica para una cadena pesada variable de un GOI. Cadena ? C = secuencia que codifica para el dominio CHl de la cadena pesada constante. Sitios de enzima de restricción: Notl, Sacl, Xhol y EcoRI. cpII - proteína III de fago. Amp pro = un promotor que permite la expresión del gen de resistencia a ampicilina. Amp = un gen de resistencia a ampicilina. pUC Ori = un origen de replicación pUC. Etapa 2: Por digestión de restricción de pSymvcl2 con .EcoRI y Noti , un fragmento de ácido nucleico que contiene la totalidad del cásete promotor y V pesada se puede cortar de pSymvcl2 y se puede ligar en un vector que codifica para isotipo, por ejemplo pSymvc20, (fig. 4D) también se ha preparado por digestión de restricción con EcoRI y Notl, por lo que se genera el vector de expresión de mamífero pSymvc21 (Fig. 4E) . (Fig. 4E) representación esquemática de un vector de expresión de mamífero, pSymvc21, con las regiones pesadas variable y ? de GOI, para expresión de anticuerpo. Este vector de expresión de mamífero comprende los siguientes elementos : Amp pro = un promotor que permite la expresión del gen de resistencia a ampicilina. Amp = un gen de resistencia a ampicilina, pUC Ori = un origen de replicación pUC. Sitios de enzimas de restricción: I7otI y ScoRI. Promotor A/promotor B = cásete de selección promotor cabeza a cabeza (es decir CMV/MPSV) V — secuencia V ? que codifica para la cadena ligera variable de una GOI. Cadena C: secuencia codificante para la cadena ligera ? constante de mamífero (por ejemplo una cadena capa de ratón) . V pesada = secuencia V pesada que codifica para una cadena pesada variable de una GOI. C cadena ? o cadena C = secuencias que codifican para una cadena pesada constante de mamífero (por ejemplo las secuencias para la cadena pesada constante IgGl o IgG2B de ratón) , R-B-globina pA = una secuencia poli A de globina ß de conejo. bGH poli A = secuencia poli A de hormona del crecimiento bovino. Sitio FRT = sitios de recombinación FRT. Higromicina = gen para resistencia a higromicina. SV40 poli A = secuencia poli A de SV40. Naturalmente, el orden de las etapas 1 y 2 se puede invertir de manera que un fragmento de pSymvclO contenga la totalidad del cásete promotor bacteriano ? y la cadena V se puede cortar de pSymvclO utilizando digestión de restricción EcoRX y Notl, la cual después se puede ligar en un vector codificante de isotipo, por ejemplo pSymvc20. El intercambio de promotor puede realizarse en pSymvc20 por digestión de restricción utilizando Sacl y Xhol y ligación con el fragmento de cásete promotor de mamífero digerido con Sacl + XhoT, por ejemplo tal como la figura 4B. Figura 5: Histograma que muestra la distribución de genotipo en células TG1 transformadas con la preparación de plásmido 1. Em 223-228 se refiere a vectores con promotores bacterianos que codifican contra microglobulina ß2 (contra B2M) , contrafosfatasa alcalina (contra AP) , contra ovalbúmina (contra OVA), contrafactor VIII (contra FVIII), contra lisozima (contra LYS) , contra haptoglobina (contra HAP) , respectivamente. Em 223-228 son vectores para el tipo pSymvclO . El número de genotipos individuales recordados por el patrón de fragmento determinado por RFLP corresponde al número de colonias individuales entre el número total de colonias tomadas . Figura 6: Histograma que muestra la distribución de genotipo en células TG1 transformadas con la preparación de plásmido 2. Em 229-234 se refiere a vectores con promotores de mamífero (C V/MPSV) que codifican contra microglobulina ß2 (contra B2M) , contrafosfatasa alcalina (contra AP) , contra ovalbúmina (contra OVA) , contrafactor VIII (contra FVIII) y contra lisozima (contra LYS) , contra haptoglobina (contra HAP), respectivamente. Em 229-234 son vectores del tipo pSymvcl2. El número de clones representa el número de clones observados que recuerda el patrón de secuencia determinado por RFLP de dicho tipo Em (no se ha llevado a cabo un análisis de secuencia completo) . Figura 7 : Histograma que muestra la distribución de genotipo en células TGl transformadas con la preparación de plásmido 3. Em 235-240 se refiere a un vector de expresión de mamífero IgGl de ratón (que incluye una señal poli A globina ß de conejo) y que codifica para anticuerpo contra microglobulina ß2 (contra B2M) , contra fosfatasa alcalina (contra AP) , contra ovalbúmina (contra OVA) , contra factor VIII (contra FVIII) , contra lisozima (contra LYS) , contra haptoglobina (contra HAP) , respectivamente. Em 235-240 son vectores del tipo pSymvc21. El número de clones representa el número de clones observados que recuerdan el patrón de secuencia determinado por RFLP de dicho tipo Em (no se ha llevado a cabo un análisis de secuencia completo) . Figura 8: Histograma que muestra la distribución de genotipo en células TGl transformadas con la preparación de plásmido de digestión/ligación (transferencia de masa dentro del vector de expresión de mamífero sin amplificación de ADN en E. coli después de la etapa de preparación del plásmido 1) . Las Figuras 9A-9B: Histogramas que muestran la distribución de genotipo de CHO-Flp-In en células transfectadas con una mezcla de vectores de expresión de mamífero que codifican para seis genes de interés en Fig. 9A) día 16 y Fig. 9B) día 34 posterior a la transfeccion. Figura 10: ELISA específica de antígeno de sobrenadantes derivados de células CHO-Flp-In 34 días después de la transfeccion a granel con una mezcla de vectores de expresión que codifican para los seis genes de interés. Figura 11: ELISA contrarrecubrimiento ? de sobrenadantes derivados y acumulados de células CHO-Flp-In 34 días después de transfeccion ya sea con un vector de expresión único que codifica para un gen de interés o con una mezcla de vectores de expresión que codifican para seis genes de interés . Figuras 12A-12C: ELISA específica de antígeno cuantitativa de sobrenadantes derivados de el clon de CHO Flp- n 019 los días 17, 31, 45, 59 y 73 después de la transfeccion a granel con una mezcla de vectores de expresión que codifican para los seis genes de interés. Fig. 12A, 12B y 12C representan tres experimentos de transfeccion diferentes. Figura 13 : ELISA específica de antígeno de sobrenadantes derivados de CHO Flp-In en cultivos de células en los días 8, 17, 30, 45, 57, 72 y 85 después de mezclar líneas de células CHO Flp-In que expresan miembros individuales de la biblioteca mini seis . Los resultados se muestran como media ± desviación estándar (SD) de tres experimentos independientes .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El sistema de expresión de proteína policlonal recombinante La presente invención proporciona métodos para la fabricación consistentes · de proteínas policlonales recombinantes que preferiblemente se seleccionan de la superfamilia de inmunoglobulina, una familia de proteínas con dominios similares a inmunoglobulina. La mayor parte de los miembros están involucrados en sucesos de .reconocimiento de superficie celular. La secuencia de homología sugiere que los anticuerpos, los receptores de linfocitos T, las moléculas de CPH, algunas moléculas de adhesión celular y receptores de citocinas comparten una homología cercana. Especialmente los miembros de esta familia que contiene regiones variables son adecuados para la generación de proteínas policlonales recombinantes de acuerdo con la presente invención. Tales miembros incluyen anticuerpos, anticuerpos unidos a membrana (receptores de linfocitos B) , fragmentos Fab. Fragmentos Fv, fragmentos Fv de cadena sencilla (scFv) , receptores de linfocitos T (TcR) , TcR solubles, fragmentos de dominio variable de TcR, fragmentos de dominio variable de TcR unidos por un enlazante polipeptídico u otro anticuerpo o fragmentos derivados de TcR. En particular, se contempla que la presente invención abrirá la posibilidad de fabricación a gran escala y producción de una clase nueva de sustancias terapéuticas que comprenden anticuerpos policlonales terapéuticos recombinantes o TcR. Una de las ventajas principales del método de fabricación de la presente invención es que todos los miembros que constituyen la proteína policlonal recombinante se pueden producir entre uno y aproximadamente 10 biorreactores o equivalentes de los mismos. Además, la composición de proteína policlonal recombinante se puede purificar del reactor como una preparación única sin tener que separar los miembros individuales que constituyen la proteína policlonal recombinante durante el procedimiento. En contraste, si uno desea imitar una composición de anticuerpo policlonal recombinante al mezclar anticuerpos monoclonales purificados mixtos (como se propone, por ejemplo en WO 91/16074) se requeriría la fabricación separada en un biorreactor de cada anticuerpo para ser incluido en la composición y muy probablemente los anticuerpos serían purificados individualmente también. Tal producción de una mezcla monoclonal puede ser muy costosa y puede consumir mucho tiempo y espacio en comparación con el método de elaboración de un anticuerpo policlonal recombinante u otras proteínas policlonales como se describen en la presente. De esta manera, el método como se describe en WO 91/16074 puede resultar de manera natural en un límite práctico respecto al número de anticuerpos monoclonales que se pueden incluir en dicha mezcla, muy probablemente inferior a 10, mientras que la tecnología como se describe en la presente generalmente puede producir un anticuerpo policlonal con tantos miembros individuales como se desee. Con el fin de obtener una expresión predecible de una proteína policlonal recombinante a partir de una línea de células de producción policlonalrecombinantes, se deben comprender de manera razonablemente bien las propiedades reguladoras del sitio de integración genómico . La técnicas convencionales de transfección y expresión de proteína recombinante utilizando la integración aleatoria son indeseables para la producción de una proteína policlonal recombinante dado que la naturaleza aleatoria del procedimiento provocará que el número y posiciones de las secuencias de ácido nucleico integradas varíen de una célula a otra. Así, si la proteína policlonal recombinante se produce por tales protocolos tradicionales, probablemente resultará en un cultivo celular heterogéneo con tasas de expresión variables de miembros individuales de la proteína policlonal e inestabilidad genética debido a efectos de posición del ADN integrado. Esto muy probablemente resultará en una expresión desviada de los miembros que constituyen la proteína policlonal . La introducción en un sitio genómico predefinido es por lo tanto deseable y en principio esto se puede obtener por recombinación homologa. No obstante, debido al dominio de los sucesos de recombinación ilegítimos, la recombinación homologa es muy ineficiente. Además, cuando la proteína policlonal es un anticuerpo de receptor de linfocito T (TcR) , surge otro problema con el uso de protocolos de transfección convencionales que resultan en integración aleatoria. Los anticuerpos y los TcR son codificados a partir de pares de segmentos de genes independientes, las secuencias que codifican para las cadenas ligera y pesada para anticuerpos en la cadena a y ß o de las secuencias que codifican para d y ? para los TcR. Los productos polipeptídicos a partir de estos segmentos de gen se unen covalentemente durante el procesamiento intracelular de la molécula de anticuerpo o el TcR. La tecnología de transfección convencional resulta en la integración aleatoria y lleva a la introducción de varias copias de las cadenas pesada y ligera diferentes o las cadenas a y ß en la misma célula, lo que resulta en combinaciones aleatorias de las cadenas pesada y ligera, las denominadas mezclado de las cadenas VH-VL o el mezclado de la cadena a-ß. En consecuencia, esto deteriora el desempeño de los anticuerpos expresados o los TcR, lo que provoca pérdida de afinidad o de especificidad, la posible presentación de especificidades nuevas o reduce la actividad específica. Para resolver estos problemas, el sistema de expresión de la presente invención utiliza integración de sitio específicaen el genoma de las células hospederas individuales. El sistema de la presente invención asegura que la biblioteca de vectores de interés comprende secuencias de ácido nucleico viariantes de interés se pueden insertar dentro de un lugar cromosomico precaracterizado por un procedimiento de intercambio de cásete mediado por recombinasa y de esta manera se genera una línea celular, en donde la célula individual expresa un miembro distinto único de la proteína policlonal recombinante de interés . Como se describe en lo siguiente, se pueden presentar integraciones múltiples en algunas de las células que constituyen la línea de células productoras policlonales recombinantes . No obstante, esto no se considera que representa un problema en la medida en que la mayor parte de las células individuales expresan un miembro distinto único de la proteína policlonal recombinante. Se pueden utilizar recombinasas tales como Cre, Flp, recombinasa ß, Gin, Pin, PinB. PinD, R/RS, integrasa ? o integrasa de fago í>C31. Las recombinasas adecuadas para integración en la ubicación cromosómica se pueden proporcionar ya sea: (i) por expresión a partir del genoma propio de las células en las cuales se introduce la secuencia de ácido nucleico, (ii) al ser codificado operativamente por la secuencia de ácido nucleico insertada en la célula, (iii) a través de la expresión a partir de una segunda molécula de ácido nucleico o (iv) como una proteína. En una modalidad preferida, la secuencia variante de ácido nucleico contenida en el vector de interés se integra en un locus que media la transcripción y expresión de alto nivel de la secuencia de ácido nucleico de interés en lo que se denomina un "punto caliente" . La linea de célula hospedera utilizada preferiblemente es una línea de célula de mamífero que comprende aquellas utilizadas típicamente para la expresión de proteínas biofarmacéuticas, por ejemplo células CHO, células COS, células BHK, células de mieloma (por ejemplo células Sp2/0, NSO), YB2/0, NIH 3T3 y células humanas inmortalizadas, tales como células HeLa. Células HEK 293 o PER.C6. En la presente invención se utilizan células CHO. No obstante, una persona habitualmente experta en la técnica podrá ser capaz fácilmente de sustituir las células CHO con otras células de mamífero como se describe, o incluso utilizar otros tipos de células que incluyen células vegetales, células de levadura, células de insecto, hongos y bacterias. Por lo tanto, la selección del tipo de célula no se pretende que sea limitante de la invención. En una modalidad preferida, se utilizan para la elaboración células de mamífero que contienen un punto caliente precaracterizado, que media niveles de expresión altos de la proteína policlonal recombinante de interés. En una modalidad adicional de la presente invención, las secuencias de ácido nucleico variante de interés se integran de una manera específica de sitio utilizando el mismo sitio de integración cromosómico en las células anfitrionas . Tal incorporación en un sitio específico único minimiza los efectos de posición que de otra manera se observan con la integración aleatoria o la integración en sitios múltiples en un genoma. Especialmente, cuando se expresan proteínas policlonales constituidas de más de una cadena polipeptídica, es relevante de manera adicional tener un sitio único en el cual se produzca en el genoma la integración específica de sitio. Esto es debido al hecho de que si una célula única expresa más de un integrante, es probable que se presente mezclado entre subunidades . En un sistema de integración específico de sitio, las células hospederas individuales están expresando la misma estructura de proteína general además de las diferencias observadas en la región variable de la proteína policlonal recombinante de interés, por ejemplo, la región de unión a antígeno de anticuerpos o los TcR. Por lo tanto, la mayor parte de la células dentro de tal acumulado de células puede mostrar características similares con respecto a la productividad y estabilidad genética y por lo tanto esta tecnología ofrece la posibilidad de una producción controlada de una proteína policlonal recombinante, por ejemplo, un anticuerpo policlonal recombinante o los TcR. La proteína policlonal recombinante de la presente invención está diseñada para cubrir una composición proteínica que comprende moléculas proteínicas diferentes pero homologas, las cuales son variables de manera natural lo que significa que, en modalidades preferidas, la biblioteca de ácidos nucleicos variantes comprende una diversidad que existe en la naturaleza. Por lo tanto, cada molécula de proteína es homologa con las otras moléculas de la composición, pero también contiene uno o más tramos de una secuencia polipeptídica variable, los cuales están caracterizados por diferencias en la secuencia de aminoácidos entre los miembros individuales de la proteína policlonal . La diferencia en una o varias de las secuencias de aminoácidos que constituyen la secuencia polipeptídica variable puede ser tan pequeña como un aminoácido. Preferiblemente, las diferencias en la secuencia de aminoácidos constituyen más de un aminoácido. Habitualmente, la variabilidad natural de un anticuerpo policlonal o un TcR se considera que se localiza en lo que se denominan regiones variables o regiones V de las cadenas polipeptídicas . En un aspecto de la presente invención, los miembros individuales en una proteína policlonal comprenden regiones variables que tienen una longitud de aproximadamente entre 80 y 120 aminoácidos. Las regiones variables pueden contener dominios hipervariables , por ejemplo regiones determinadoras de complentariedad (CDR) . En los TcR que se presentan de manera natural existen cuatro CDR en cada región variable. En anticuerpos que se presentan de manera natural existen tres CDR en la cadena pesada y tres CDR en la cadena ligera. En un aspecto adicional de la presente invención, las regiones variables de los miembros individuales de una proteína policlonal contienen por lo menos un dominio hipervariable que tiene entre 1 y 26 aminoácidos de largo, preferiblemente entre 4 y 16 aminoácidos de largo. Este dominio hipervariable puede corresponder a la región CDR3. Para anticuerpos, cada región variable preferiblemente constituye tres dominios hipervariables . Estos pueden corresponder a CDRl, CDR2 y CDR3. Para los TcR, cada región variable preferiblemente constituye cuatro dominios hipervariables. Estos pueden corresponder a CDRl, CDR2, CDR3 y CDR4. Los dominios hipervariables pueden constituir solos las secuencias variables dentro de una región variable de una proteína policlonal recombinante de la presente invención. En el contexto de la presente invención, la variabilidad en la secuencia polipeptídica (la policlonalidad) también se puede entender para describir diferencias entre moléculas de anticuerpo individuales que residen en las regiones denominadas constantes o regiones C de las cadenas polipeptídicas de anticuerpos, por ejemplo como en el caso de mezclas de anticuerpos que contienen dos o más isotipos de anticuerpos, tales como los isotipos humanos IgGl, IgG2, IgG3 , IgAl e IgA2, o los isotipos murinos IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3 e IgA. Por lo tanto, un anticuerpo policlonal recombinante puede comprender moléculas de anticuerpo que están caracterizadas por diferencias de secuencia entre las moléculas de anticuerpo individuales en la región variable (región V) o en la región constante (región C) o ambas. Con el fin de proporcionar secuencias variantes de ácido nucleico que codifican para proteínas que se unen a un antígeno en particular, se pueden utilizar muchos métodos conocidos en la técnica. Típicamente, la invención se beneficiará del uso de un procedimiento de cribado que permite la identificación y/o aislamiento de ácidos nucleicos que codifican para una proteína que se une a un antígeno particular. Varios de estos métodos incluyen lo que se denomina etapa de biopanoramización (examen y selección o biopanning) conocido a partir de tecnologías como presentación de fago ( ang, A.S. et al. 1991. Proc Nati Acad Sci U S A 88, 4363-4366), presentación de ribosoma (Schaffitzsel, C. et al. 1999. J. Immunol . Methods 231, 119-135), presentación de AND (Culi, M.G. et al. 1992. Proc Nati Acad Sci U S A 89, 1865-1869), presentación de ARN-péptido (Roberts, R. . , Szostak, J.W., 1997. Proc Nati Acad Sci U S A 94, 12297-12302), presentación covalente (WO 98/37186) , presentación de superficie bacteriana (Fuchs, P. Et al . 1991 Biotechnology 9, 1369-1372) , presentación de superficie de levadura (Boder, E.T., Wittrup. K.D., 1997. Nat Biotechnol 15, 553-557} y presentación de virus eucariótico (Grabherr, R. , Ernst, W. , 2001. Comb. Chem. High Throughput. Screen. 4, 185-192), los métodos que son bien conocidos en la técnica y la totalidad son auxiliares interesentes en la práctica de la presente invención. Las pruebas FACS y la clasificación por esferas magnéticas también es aplicable para propósitos de enriquecimiento (panoramización) utilizando antígeno marcado. También se pueden utilizar ensayos de inmunodetección tales como ELISA (Dreher, M.L. et al. 1991. J. Immunol. Methods 139, 197-205) y ELISPOT (Czerkinsky, C.C. et al. 1983, J. Immunol Methods 65, 109-21) ya sea después de la etapa de biopanoramización o solos. Una composición de proteína policlonal recombinante de interés comprende un subconjunto definido de proteínas, las cuales se han definido por una característica común tal como la actividad de unión compartida hacia un objetivo deseado, por ejemplo en el caso de anticuerpos policlonales contra el antígeno objetivo deseado. Típicamente, una composición de proteína policlonal tiene por lo menos 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 1000, 104, 105 o 106 miembros variantes distintos. El número de miembros distintos necesarios en la composición de proteína policlonal dependerán de la complejidad del objetivo.

En el caso de anticuerpos, la complejidad de uno o varios de los antígenos dirigidos influirá en el número de miembros variantes distintos necesarios en la composición de anticuerpo policlonal. Con objetivos poco o nada complejos, por ejemplo una proteina pequeña, una composición de anticuerpo policlonal que comprende entre 3 y 100 miembros variantes distintos serán suficientes, y se prefiere que el número de variantes no exceda de 90, o incluso de 80 ó 70. En muchos casos, el número de variantes distintas no excederá de 60 ó 50 y se prefiere que el número de variantes esté en el intervalo entre 5 y 40, por ejemplo entre 5 y 30. Cuanto más complejo sean los objetivos, por ejemplo virus con proteínas de superficie complejas o intercambiables o que abarquen varios subtipos de virus, una composición de anticuerpo policlonal que comprende entre 20 y 500 miembros variantes distintos será suficiente. Con objetivos muy complejos, en donde al antígeno comprende muchas moléculas diferentes, se puede requerir una composición de anticuerpo policlonal que comprenda entre 50 y 10,000 miembros variantes distintos . En los mamíferos, existen varios ejemplos conocidos de proteínas policlonales que se presentan de manera natural ya sea circulando ¦ libremente en la sangre tales como anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina o que están presentes sobre superficies de células tales como los receptores de linfocitos T y los receptores de linfocitos B.

La diversidad de estas proteínas policlonales que existen en la naturaleza, en algunos mamíferos se obtienen por recombinación genética de genes que codifican para regiones variables de estas proteínas. Se sabe además que los anticuerpos incrementan su diversidad por mutación somática. La presente invención puede utilizar estas diversidades naturales al aislar las secuencias responsables de la diversidad (por ejemplo, los dominios variables o regiones CDR de moléculas de inmunoglobulina o las TcR) y generar una biblioteca a partir de las mismas) . Para proteínas codificadas a partir de dos segmentos de gen independientes, por ejemplo la cadena pesada variable de anticuerpo y la cadena ligera variable, la cadena TcRa y la cadena p o la cadena TcR d y la cadena ?, cada vector en la biblioteca constituirá un par de estas secuencias codificantes de la región variable. La generación de bibliotecas de pares de secuencias codificantes de región variable es bien conocida en la técnica. Las bibliotecas que comprenden diversidades que se presentan de manera natural son, por ejemplo, bibliotecas de combinación (pariamiento aleatorio de las secuencias codificantes de región variable) así como bibliotecas de par asociado (par de secuencias codificantes de región variable derivadas de la misma célula) . Las bibliotecas adicionales generadas a partir de fragmentos de gen CDR aisladas, las cuales se incorporan en una infraestructura apropiada (por ejemplo Soderlind, E. et al., 2000. Nat. Biotechnol 18, 852-856) , tal como el anticuerpo o la región variable de TcR, son aplicables con la presente invención. Las bibliotecas preferiblemente se criban para obtener bibliotecas secundarias (bibliotecas de interés) con una especificidad deseada. Las diversidades de proteínas también se pueden elaborar de una manera artificial, por ejemplo de manera sintética o por mutación. Las mutaciones pueden ser mutaciones aleatorias o puntuales de una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína única, y de esta manera generar una población policlonal de la proteína única. Otro ejemplo de generación de bibliotecas de anticuerpos artificiales se describen en EP 0 859 841, un método el cual se basa en la generación de una biblioteca de infraestructuras de región variable las cuales se pueden combinar con otra biblioteca de CDR. En una modalidad preferida de la invención, la proteína policlonal recombinante es un anticuerpo policlonal recombinante o un fragmento de anticuerpo. En otra modalidad preferida de la invención, la proteína policlonal recombinante es una TcR policlonal recombinante o un fragmento de TcR. Además de la diversidad que se obtiene por la recombinación genética y somática en las denominadas regiones variables, existen diferentes isotipos de las inmunoglobulinas las cuales se definen por la cadena pesada. Los isotipos principales son IgM, IgG, igA, IgD e IgE. Una proteína policlonal recombinante de la presente invención por lo tanto puede estar constituida de los diferentes isotipos de las subclases más preferidas de las subclases diferentes . La policlonalidad de las inmunoglobulinas se puede presentar en la parte constante o en el dominio variable de la molécula de inmunoglobulina o tanto en la parte constante como en el dominio variable. La policlonalidad en la denominada región constante, particularmente la cadena pesada de los anticuerpos es de interés con respecto a la aplicación terapéutica de anticuerpos. Los diversos isotipos de inmunoglobulina tienen funciones biológicas diferentes (resumidas en la tabla 1), las cuales pueden ser deseables para combinarse cuando se utilizan anticuerpos para tratamiento debido a los diferentes isotipos de inmunoglobulina que pueden estar infectados en diferentes aspectos de respuestas inmunológicas naturales (Canfield and Morrison 1991. J. Exp. Med. 173, 1483-91; Kumpel et al. 2002. Transfus. Clin. Biol . 9, 45-53; Stirnadel et al. 2000. Epidemiol. Infect. 124, 153-162) .

Tabla 1: Funciones biológicas de los isotipos de inmunoglobulina humana Una modalidad adicional de la presente invención es una línea de células de producción policlonalrecoinbinante que comprende una colección de células transfectadas con una biblioteca de secuencias de ácido nucleico variantes, en donde cada célula en la colección es transfectada y es capaz de expresar un miembro de la biblioteca, el cual codifica para un miembro distinto de una proteína policlonal que se une a un antígeno particular y el cual se localiza en el mismo sitio único en el genoma de las células individuales en la colección, en donde la secuencia de ácido nucleico no está asociada naturalmente con las célula en la colección. En una modalidad adicional de la modalidad anterior, las secuencias de ácido nucleico variante que codifican para la proteína policlonal (preferiblemente de la super familia de inmunoglobulina) se derivan todas de secuencias que se presentan de manera natural, por ejemplo aisladas de un donador . La composiciones de células que contienen ácidos nucleicos variantes localizadas en un sitio específico único en el genoma dentro de cada célula se han descrito en WO 02/44361. Este documento describe el uso de las células para identificar moléculas que tienen propiedades deseables, pero la referencia no se relaciona con el suministro de un sistema de producción o con el suministro de una proteína policlonal caracterizada por una unión específica a un antígeno. Diversidad Clonal Una de las características de una proteína policlonal es que está constituida por cierta cantidad de moléculas proteínas individuales en donde cada molécula de proteína es homologa a las otras moléculas de la proteína policlonal pero también tiene variabilidad que está caracterizada por diferencias en las secuencias de aminoácidos entre los miembros individuales de la proteína policlonal . Preferiblemente, las diferencias están confinadas a distintas áreas de la estructura general de la proteína policlonal .

Tales áreas son, por ejemplo, la región variable de un anticuerpo o TcR y posiblemente confinadas de manera adicional a las regiones CDR en estas áreas . Esta variabilidad también se puede describir como una diversidad, la cual puede ser identificada tanto a nivel de ácido nucleico así como a nivel de proteína funcional, por ejemplo, las diferencias de especificidad y afinidad hacia el objetivo. La diversidad clonal de la línea celular se puede analizar por RFLP (o secuenciado de productos de (RT) -PCR, en clones aislados de un acumulado de células que expresan una proteína policlonal recombinante. La diversidad también puede ser analizada por pruebas funcionales (por ejemplo ELISA) en una proteína policlonal recombinante producida por la línea celular. La desviación clonal (es decir, un cambio gradual en el contenido de los anticuerpos individuales que constituyen el anticuerpo policlonal), si existe, se puede calcular al comparar la diversidad clonal de la biblioteca inicial, utilizada para transfección, con la diversidad encontrada en el acumulado de células (línea celular) que expresan la proteína policlonal recombinante. La diversidad clonal de una proteína policlonal expresada a partir de una línea celular se puede determinar como la cobertura objetivo por la proteína policlonal. En este caso, se considera que se adquiere diversidad suficiente cuando aproximadamente 25-100% de las moléculas objetivo deseadas se unen por la proteína policlonal. Por ejemplo, en el caso de un anticuerpo policlonal, la unión de un anticuerpo a por lo menos 25% de los epítopos no idénticos sobre la superficie de un antígeno objetivo proporciona una diversidad suficiente en la composición. Preferiblemente, la diversidad clonal por cobertura objetivo es por lo menos 50%, e incluso de manera más preferible por lo menos 75%. Para anticuerpos, tal cobertura objetivo puede determinarse, por ejemplo, por mapeo de epítopo. De manera alternativa, la diversidad clonal se puede determinar como la distribución de miembros individuales de la composición policlonal. Esta distribución se puede determinar como el número total de miembros individuales diferentes en la composición de proteína policlonal final en comparación con el número de secuencias codificantes diferentes introducidas originalmente en la línea celular durante la transfeccion. En este caso se considera que se adquiere diversidad suficiente cuando por lo menos 50% de las secuencias codificantes utilizadas originalmente en la transfeccion se pueden identificar como miembros individuales diferentes de las proteínas policlonales finales, y preferiblemente por lo menos 75%. La distribución de miembros individuales de la composición policlonal también se pueden determinar con respecto a la distribución mutua entre los miembros individuales . En este caso se considera que se adquiere suficiente diversidad clonal si no hay un solo miembro de la composición que constituya más de 75% del número total de miembros individuales en la composición de proteína policlonal final. Preferiblemente, ningún miembro individual excede más de 50%, incluso de manera más preferible con 25% y de manera mucho más preferible 10% del número total de miembros individuales en la composición policlonal final. La determinación de diversidad clonal en base en la distribución de los miembros individuales en la composición policlonal se puede llevar a cabo por análisis de RFLP, análisis de secuencia y análisis de proteína tal como las soluciones descritas posteriormente para la caracterización de una composición policlonal . La diversidad clonal se puede reducir como resultado de la desviación clonal la cual puede surgir: a) durante el proceso de clonación, b) como resultado de variaciones en la proliferación celular, o c) mediante mezclado de integrantes múltiples. Si surgen tales desviaciones, cada una de estas fuentes de una pérdida de diversidad clonal se corrige fácilmente por modificaciones menores a los métodos como se describen en la presente. Con el fin de limitar la desviación introducida por clonación de los dominios variables en los vectores apropiados, la transferencia de los genes de interés desde un vector a otro se puede diseñar de manera tal que se limita la desviación de clonación. Las técnicas de transferencia de masa y una selección cuidadosa de la cepa de E. coli utilizada para amplificación puede reducir la desviación de clonación. Otra posibilidad es realizar una transferencia individual de cada polinucleótido que codifica para un miembro individual de la proteína policlonal, entre vectores de la invención. Es posible que las variaciones en las tasas o velocidades de proliferación celular de las células individuales en la línea de células puede introducir, durante un período de tiempo prolongado, una desviación en la expresión de proteína policlonal recombinante, al incrementar o reducir la presencia de algunos miembros de la proteína policlonal recombinante expresada por la línea celular. Una razón para tales variaciones en las velocidades y proliferación puede ser que la población de células que constituyen la línea de células iniciales utilizadas para la transfección inicial sea heterogénea. Se sabe que las células individuales en una línea celular se desarrollan de manera diferente durante un período de tiempo prolongado. Para asegurar un material inicial más homogéneo se puede realizar la subclonación de la línea celular antes de la transfección con la biblioteca de interés utilizando una dilución limitante de la línea celular disminuyendo hasta nivel de célula única y hacer crecer cada célula única hasta una población nueva de células (lo denominado subclonación celular por dilución limitante) . Una o más de estas poblaciones de células después se seleccionan como material inicial en base en sus propiedades de proliferación y expresión. Además, la presión de selección utilizada para asegurar que sobrevivirán únicamente las células que han recibido integrantes específicos de sitio, puede alterar las velocidades de proliferación de células individuales dentro de una línea de células policlonales . Esto puede deberse al favorecimiento de las células que experimentan ciertos cambios genéticos con el fin de adaptarlos a la presión de selección. De esta manera, la elección del marcador de selección también puede influir en la proliferación de desviación inducida por la velocidad. Si esto sucede, se deben probar marcadores de selección diferentes. En los casos en donde la selección se basa en una sustancia que es tóxica para las células, la concentración óptima debe ser probada con precaución, e igualmente si la selección se necesita a través de todo el período de producción o únicamente en la fase inicial. Una solución adicional para asegurar una población de células bien definida es utilizar la clasificación de células activada por fluorescencia (FACS) después de los procedimientos de transfección y selección. Se pueden utilizar anticuerpos marcados con fluorescencia para aumentar la concentración de células altamente productivas derivadas de un acumulado de células transfectadas con constructos de IgG (Brezinsky et al., J. 2003. Immunol Methods 277, 141-155). Este método también se puede utilizar para clasificar células que expresan concentraciones similares de inmunoglobulina, y de esta manera se genera una población celular homogénea con respecto a la productividad. De igual manera, al utilizar el marcado con un colorante fluorescente, éster succinimidílico del diacetato de 5, 6-carboxifluoresceína (CFSE) , las células experimentan velocidades de proliferación similares y se pueden seleccionar por métodos de FACS. Incluso si no se desarrolla una desviación inducida por velocidad de proliferación, la pérdida de representación excesiva de miembros individuales puede no necesariamente ser critica, dependiendo de los requerimientos de diversidad del producto de proteína policlonal recombinante final y la estabilidad de diversidad con respecto al tiempo. En los integrantes únicos específicos de sitio, las células únicamente diferirán en la secuencia de las regiones variables de los anticuerpos que se van a expresar. Por lo tanto, los diferentes efectos celulares impuestos por la variación en el sitio de integración y los elementos reguladores de gen se eliminan y tienen efectos mínimos sobre la velocidad de proliferación celular. Ni el mezclado ni las integraciones múltiples probablemente generen problemas en la velocidad de proliferación de la línea de células productoras, dado que estos son sucesos raros . Las integraciones aleatorias generalmente se producen con una eficacia de aproximadamente 105, mientras que la integración de sitio especificase produce con una eficacia de aproximadamente 103. Si las integraciones múltiples inesperadamente presentan un problema, una alternativa es repetir la transfeccion con la biblioteca de vectores de interés, debido a que la probabilidad de que vuelva a presentar suceso es muy pequeña, como se describe en lo anterior. En el ejemplo 3 a continuación se describen alternativas adicionales. Otro método para controlar la desviación clonal no deseada es realizar la transfeccion con la biblioteca completa de vectores de interés en varios subacumulados o dividir el acumulado celular en un punto de tiempo temprano antes de la transfeccion en subacumulados. En este punto, la desviación no debe volverse significativa y debe ser estadísticamente posible adquirir subacumulaciones que carezcan de clones con una ventaja de proliferación no deseada. La exclusión resultante de clones no deseados debe concordar con los requerimientos de diversidad en el producto de proteína policlonal recombinante. Considerando la estadística, la transfeccion a granel de una gran cantidad de células también constituye una manera de resolver la desviación clonal no deseada. En este enfoque, una línea de células hospederas se transfecta a granel con la biblioteca de secuencias de ácido nucleico variantes . Tal biblioteca constituye muchas copias de cada miembro distinto de la biblioteca. Estas copias preferiblemente se pueden integrar en una gran cantidad de células anfitrionas. Preferiblemente se transfectan por lo menos 100, 1000, 10,000 ó 100,000 células individuales con copias de miembros distintos de la biblioteca de las secuencias de ácido nucleico variantes. De esta manera, si una biblioteca de secuencias de ácido nucleico variante distinta está constituida de 1000 miembros distintos los cuales cada uno se integran en 1000 células individuales, surgen de la transfección 106 clones que contienen un GOI integrado específicamente al sitio. De esta manera, la curva de gaus de células individuales que duplican la velocidad puede alterar la población general únicamente en grados muy pequeños. Esto incrementará la probabilidad de mantener constante la composición clonal con respecto al tiempo incluso si un porcentaje pequeño de las células productoras muestran propiedades aberrantes de crecimiento o expresión. De manera alternativa, la biblioteca de vectores de interés se puede dividir en fracciones que contienen aproximadamente 5 a 50 vectores individuales de la biblioteca. Preferiblemente, una fracción de la biblioteca constituye 10 a 15 vectores individuales. Después cada fracción se transfecta en una alícuota de células. Las alícuotas individuales de células después pueden ser seguidas por un período de tiempo para ver si se desarrolla desviación clonal en alguna de ellas. Si esto sucede, dichas alícuotas de células se pueden omitir antes de que se reconstituya la recolección de células por acumulado de las alícuotas de células remanentes. Opcionalmente, las alícuotas de las células se mantienen separadas durante la producción, y la composición de anticuerpo policlonal se ensambla al combinar los productos de cada alícuota en vez de las alícuotas de células antes de la producción. El número de acumulados que se pueden manejar que espera que esté entre 5 y 10 (véase la descripción previa de anticuerpos monoclonales) . De manera alternativa, se puede implementar una método de alto rendimiento en el cual las células se transfectan por separado utilizando vectores y células en base en clones únicos a partir de una biblioteca inicial de vectores de interés . Esto puede eliminar cualquier posible desviación de secuencia durante la transfección e integración. Opcionalmente, los transfectantes solos pueden ser sometidos a genotipo y un acumulado completamente diverso de células ensamblado justo antes de la producción de lo anterior, si es apropiado. De manera alternativa, la transfección individual de una gran cantidad de células, que genera muchos clones con los mismos miembros distintos de la biblioteca de las secuencias de ácido nucleico variantepueden generar las mismas ventajas estadísticas descritas para la transfección a granel, cuando las células transfectadas individualmente se acumulan antes de la elaboración de la proteína policlonal . La célula anfitriona Una célula hospedera adecuada comprende, en una región de su genoma, uno o más sitios de recombinación adecuados, es decir, secuencias de ácido nucleico reconocibles por una o más enzimas recombinasa. Para poder seleccionar los integrantes (es decir, células que tienen una copia integrada de la secuencia de ácido nucleico de interés en un sitio de integración) , el sitio de recombinación está unido operablemente a un primer gen de selección (por ejemplo un gen de resistencia a antibiótico) situado 3' respecto al sitio de recombinación. Además, un promotor débil (por ejemplo un promotor temprano SV40 truncado) y un codón de inicio de transcripción se pueden situar 5' respecto al sitio de recombinación que constituye una parte integral de la región codificante marcadora de resistencia. De esta manera, el codón de inicio de transcripción inicia el principio de la transcripción del gen de selección en la célula hospedera antes de la transfección con la biblioteca de vectores de expresión que codifican para la proteína policlonal . Las células hospederas para integración de sitio específicacomo se describen en lo anterior se pueden generar de cualquier célula que pueda integrar ADN en sus cromosomas o retener elementos extracromosomicos tales como minicromosornas, YAC (cromosomas artificiales de levadura) , MAC (cromosomas artificiales de ratón) o HAC (cromosomas artificiales humanos) . Los MAC y HAC se describen con detalle en WO 97/40183, incorporado en la presente como referencia. Preferiblemente se utilizan células de mamífero tales como células CHO, células COS, células BHK, células de mieloma (por ejemplo células Sp2/0 o NSO) , fibroblastos tales como NIH 3T3 y células humanas inmortalizadas tales como células HeLa, células HE 293 o PER.C6. No obstante, también se puede utilizar células eucarióticas o procarióticas diferentes de mamífero tales como células vegetales, células de insecto, células de levadura, hongos, E. coli, etcétera. En una modalidad de la presente invención, la línea de células la cual se va a utilizar como material inicial se subclona al realizar lo que se denomina dilución limitante de la línea celular descendentemente hasta nivel de una sola célula, seguido por crecimiento de cada célula única en una población nueva de células antes de la transfeccion con la biblioteca de vectores de interés. Tal subclonación también se puede realizar posteriormente en el proceso de selección de la línea celular recta, si se desea. Las células hospederas para integración de sitio especificase pueden obtener por transfeccion con un plásmido integrado aleatoriamente que comprende un promotor débil (por ejemplo, un promotor temprano SV40 truncado) , un codón de inicio de transcripción, un sitio de recombinación situado 3 ' respecto al codón de inicio. Preferiblemente, el plásmido de integración también comprende un gen marcador acoplado a un primer gen de selección. Un ejemplo de dicho plásmido de integración es pFRT/LacZeo2 de Invitrogen (Carlsbad, CA) . El gen marcador se puede utilizar para evaluar la fuerza de expresión relativa en el lugar genómico utilizado para insertar una secuencia de ácido nucleico de interés. Se puede unir un gen marcador (por ejemplo ß-galactosidada (LacZ) , proteína fluorescente verde (GFP) o un marcador se superficie celular) al gen de primera selección en fusión de gen o unido transcripcionalmente por un IRES (sitio de entrada ribosómico interno) de manera tal que se produzca la expresión conjunta del primer gen de selección y el gen marcador. El uso de un gen de selección que establece una presión de supervivencia sobre las células (por ejemplo resistencia a medicamentos o supresión nutricional) combinado con un marcador que permite la evaluación de los niveles de expresión relativos de una línea celular a una línea celular es un método eficaz para asegurar células altamente productoras las cuales mantienen al plásmido integrado dentro del genoma. Las células con la secuencia de recombinación insertada en un punto con una transcripción particularmente activa llevará a una expresión elevada del gen marcador, por ejemplo GFP o LacZ. Los expresores altos se pueden seleccionar por clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) y se pueden clonar. En este punto, también deben analizarse si el integrante es un integrante único. Esto se puede realizar por PCR en tiempo real y transferencia Southern. Otro método para evaluar los niveles de expresión relativos a partir de células transfectadas con un plásmido integrante es realizar una etapa de integración-corte adicional sobre las células generadas como se describe en lo anterior. Este acumulado de células seleccionadas se transfectan nuevamente con un plásmido que codifica para una recombinasa que corresponde al sitio de recombinación del plásmido de integración y un segundo plásmido que contiene un segundo marcador de selección sin un codón de inicio, cuya región codificante es precedida por una secuencia de recombinación que de igual manera corresponde al primer plásmido de integración. Este segundo plásmido también contiene la secuencia codificante para una proteína marcadora fluorescente (por ejemplo GFP (o proteínas fluorescentes equivalentes) activadas por un promotor de mamífero. La recombinasa media la integración de este plásmido en el genoma de la célula hospedera en donde se ha insertado por el plásmido de integración una secuencia de recombinación similar previamente. Las células con la secuencia de recombinación insertada en un punto con transcripción particularmente activa - 57 - generarán una expresión alta de la proteína fluorescente. Las células con alto nivel de expresión se seleccionan por clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) y se clonan. Los clones con una expresión consistentemente elevada y que contienen una copia del plásmido insertado se transfectan con la recoiabinasa y se seleccionan por el marcador de selección, identificando a las células en donde se ha separado por la recombinasa la segunda secuencia plasmídica, haciendo que el primer marcador de selección funcione nuevamente. Estas células aún contienen la primera secuencia de recombinación insertada en un punto caliente transcripcional y ahora se pueden utilizar para la expresión de genes de interés . La línea de células, las cuales obtienen una expresión elevada del gen marcador ante la integración de una sola copia del plásmido, se utilizan para transfección con el gen de interés. El sitio de recombinación en la célula hospedera preferiblemente se localiza en un gen o región de expresión particularmente activa, es decir, en el denominado punto caliente. El vector para la integración especifica de sitio Un vector adecuado comprende un sitio de recombinación adecuado unido a un gen de selección adecuado diferente del gen de selección utilizado para la construcción de la célula anfitriona. Los genes de selección adecuados para uso en la expresión de células de mamífero incluyen, pero no se limitan a genes que habilitan para selección nutricional tal como el gen para timidina cinasa (TK) , el gen para glutamina sintetasa (GS) , el gen para triptofano sintasa (trpB) o el gen para histidinol deshidrogenasa (hisD) . Además, los marcadores de selección son genes resistentes a antimetabolitos que confieren resistencia a medicamentos, tal como el gel para dihidrofolato reductasa (dhfr) , el cual se puede seleccionar con un medio deficiente en hipoxantina y timidina y se puede seleccionar adicionalmente para metotrexato, el gen de xantina-guanina fosforibosiltransferasa (gpt) , el cual se puede seleccionar con ácido micofenólico, el gen para neomicina fosfotransferasa (neo) el cual se puede seleccionar con G418 en una célula eucariotica y con neomicina o canamicina en células procarióticas , el gen para higromicina B fosfotransferasa (hyg, hph, hpt) se puede seleccionar con higromicina, el gen para puromicina N-acetiltransferasa (pac) , el cual se puede seleccionar con puromicina o el gen para blasticidina S desaminasa (Bsd) el cual se puede seleccionar con blasticidina. Finalmente, los genes que codifican para proteínas que permiten la clasificación, por ejemplo mediante citometría de flujo, también se pueden' utilizar como marcadores de selección tales como proteína fluorescente verde (GFP) , el receptor de factor de crecimiento nervioso (NGFR) u otras proteínas de membrana o ß-galactosidasa (LacZ) .

En un aspecto de la presente invención, el gen seleccionable no está precedido por un promotor ni está equipado con un codón de inicio de traducción. El promotor y el codón ATG se proporcionan en el sitio de recombinación específico de sitio que se selecciona. Si el vector se integra en un lugar diferente al sitio de recombinación seleccionado en el genoma de la célula anfitriona, no se puede presentar expresión de esta segunda selección debido a la carencia de un codón promotor y de inicio. Si la integración se produce en el sitio de recombinación seleccionado en el genoma de la célula anfitriona, se expresa el segundo gen de selección y se pierde la expresión del primer gen de selección. La integración se puede llevar a cabo, por ejemplo utilizando lo que se denomina un sitio FRT (5 ' -gaagttcctattccgaagttcctattctctagaaagtataggaacttc-3 ' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1) y variantes de la misma) en el genoma y sobre el vector para integración de sitio específica unto con la recombinasa Flp o mutantes de la misma a partir de Saccharo yces cerevisiae. No obstante, se pueden utilizar igualmente bien otros sistemas de recombinasa que incluyen aquellos de recombinasa Cre y una variedad de sitios lox tales como loP del bacteriófago Pl o variantes o mutantes de los mismos, por ejemplo 1??66, 1??71, lox76, 1??75, 1??43, lox44 y lox511 (C. Gorman and Bullock, Curr. Opinión in Biotechnology 2000, 11: 455-460) o utilizando una integrasa de fago 3>C31 o integrasa ?, la cual lleva a cabo la recombinación entre un sitio attP y el sitio attB (A.C. Groth et al. PNAS 2000, 97: 5995-6000). Los sistemas de recombinasa adicionales que se pueden utilizar en la presente invención son, pero no se limitan al sistema de seis recombinasa ß a partir del plásmido bacteriano pSMl9035, el sistema Gin-gix del bacteriófago Mu o el sistema R-RS de Zygosaccharomyces rouxii . Una variante adicional del sistema de recombinación específico de sitio es utilizar sitios de recombinación no homólogos. En tal sistema se introducen en el genoma anfitrión dos sitios de recombinación no idénticos para la generación de sitios objetivo específicos. Los sitios de recombinación corresponden a aquellos que flanquean al sitio objetivo y también flanquean al constructo que contiene el gen de interés. Tal sistema se ha establecido en WO 99/25854 la cual se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. El uso de sitios de recombinación no homólogos ha demostrado suprimir el corte de GOI del cromosoma. Los sitios de recombinación no idénticos pueden estar constituidos de cualquiera de los sitios de recombinación descritos en lo anterior en la medida en que se proporcionen las recombinasas correspondientes. Por ejemplo, los sitios de recombinación no idénticos pueden consitir de un sitio FRT y un sitio FRT mutante utilizando una recombinasa Flp para integración o un sitio FRT y un sitio loxP utilizando recombinasas Flp y Cre para la integración. Además se ha descrito en Verhoeyen et al., Hura. Gene Ther. 2001 12, 933-44 un sistema que utiliza dos sitios FRT diferentes . En esta solución el plásmido integrante se transfiere a las células hospederas por infección retroviral . El plásmido consiste de una combinación de un gen indicador y un primer gen marcador de selección así como los elementos retrovirales requeridos para infección. El 3'LTR retroviral contiene dos sitios FRT. Un segundo gen marcador de selección no funcional el cual carece de un promotor y el codón de inicio de traducción se localiza 3 ' respecto a estos sitios . Durante el proceso de infección normal, la secuencia 3'LTR se acopla a 5'LTR. Esto resulta en el flanqueo del gen indicador y el primer gen marcador de selección por dos sitios FRT diferentes en cada lado. La secuencia entre los sitios FRT exteriores se puede cambiar contra un GOI bajo el control de un promotor fuerte. El c sete que contiene el GOI está flanqueado por el mismo conjunto de sitios FRT. La reacción es catalizada por la recombinasa Flp. En el plásmido de intercambio transfectado se localiza de manera adicional hacia el extremo 3 ' de GOI un elemento IRES y un codón de inicio de traducción. Después de sustitución del cásete integrado el gen marcador de selección no funcional que se localiza en la secuencia 3'LTR fuera de los sitios FRT se activa por el codón de inicio de traducción que se proporciona por el cásete constitutivo de GOI . El estado de intercambio se puede enriquecer adicionalmente si está presente en el vector de integración un marcador de selección negativo (por ejemplo timidina cinasa) . El vector integrante también se puede transferir a las células hospederas por transfección estándar. En este caso, el cásete integrante está flanqueado por un FRT en el extremo 5' y un sitio FRT' diferente en el extremo 3'. El segundo gen marcador de resistencia deficiente en ATG está colocado adicionalmente corriente abajo del sitio FRT' 3'. El cambio para un GOI procede como se describe para el sistema retroviral . Otro sistema que evita el corte de GOI después de su integración de sitio especifico en el cromosoma es la integrasa F031, también mencionada antes. Este sistema se ha descrito profundamente en solicitudes de patentes WO 01/07572 y WO 02/08409, incorporadas en la presente como referencia en su totalidad. En un aspecto adicional de la invención, el vector para la integración de sitio específico del gen de interés comprende además ADN que codifica para un miembro de la proteína policlonal recombinante de interés, opcionalmente precedido por su propio promotor de mamífero que dirige la expresión de la proteína. Si un miembro de la proteína policlonal recombinante de interés comprende más de una cadena proteínica, por ejemplo, si el miembro es un anticuerpo o un receptor de linfocitos T, el ADN que codifica para las cadenas de la proteína se puede detectar por su propio promotor de mamífero que dirige los altos niveles de expresión (bidireccional o unidireccional, véase la figura 1 y 2, respectivamente) de cada una de las cadenas. En una expresión bidireccional se puede utilizar una configuración promotora cabeza a cabeza en el vector de expresión y para la expresión unidireccional de dos promotores o un promotor combinado, por ejemplo, con una secuencia IRES que puede ser utilizada para expresión. Las configuraciones de promotor cabeza a cabeza adecuadas son, por ejemplo, pero no están limitadas al promotor AdMLP junto con el promotor de metalotioneina-1 de ratón en ambas orientaciones, el promotor AdMLP junto con el promotor de factor-1 de elongación en ambas orientaciones o el promotor CMV junto con el promotor MPSV en ambas orientaciones . Una secuencia de ácido nucleico que codifica para una secuencia líder funcional puede ser incluida en el vector de expresión para dirigir el producto de gen al retículo endoplásmico o a un lugar específico dentro de la célula tal como un organelo. Una señal de poliadenilación fuerte se puede situar 3 ' respecto a la secuencia de ADN que codifica para la proteína. La señal de poliadenilación asegura la terminación y la poliadenilación del transcrito de ARN naciente y se relaciona con la estabilidad del mensaje. El ADN que codifica para un miembro de la proteína policlonal recombinante de interés puede codificar, por ejemplo, para las cadenas tanto pesada como ligera de un anticuerpo o fragmentos de anticuerpo, cada secuencia de gen opcionalmente está precedida por sus propios elementos promotores de mamífero o seguido por señales fuertes poli A que dirigen el alto nivel de expresión de cada una de las dos cadenas . El vector de expresión para la integración de sitio específicapuede presentar elementos reguladores transcripcionales adicionales tales como me oradores o UCOE (elementos de abertura de cromatina ubicuos) para la expresión aumentada en el sitio de integración. Los mejoradores son secuencias de ácido nucleico que interactúan específicamente con proteínas celulares involucradas en la transcripción. Los UCOE abren la cromatina o mantienen la cromatina en un estado abierto y facilitan la expresión reproducible de un gen unido operablemente (descrita con mayor detalle en WO 00/05393, incorporada en la presente como referencia en su totalidad) . Cuando uno o más de los elementos reguladores descritos en lo anterior se integran en el cromosoma de una célula hospedera se les denomina elementos reguladores heterólogos .

Establecimiento de un sistema de expresión para expresión de alto nivel de proteínas Se conocen bien en la técnica métodos para introducir una secuencia de ácido nucleico en una célula. Estos métodos típicamente incluyen el uso de un vector de ADN para introducir la secuencia de interés en la célula, el genoma o un elemento extracromosómico . La transfección de las células se puede llevar a cabo por numerosos métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica que incluyen precipitación con fosfato de calcio, electroporación, microinyección, fusión de liposomas, fusión de eritrocitos acrómicos (RBC ghost) , fusión de protoplasto y similar. Para la transfección de una línea de células hospederas se utiliza una biblioteca de vectores de interés en donde cada vector comprende únicamente una copia de una secuencia de ácido nucleico que codifica para un miembro de una proteína policlonal recombinante. Esta biblioteca de vectores de expresión de interés codifica colectivamente para la proteína policlonal recombinante de interés . Los vectores adecuados para integración de sitio especificase describen en la sección anterior. Los vectores individuales que constituyen la biblioteca de secuencias de ácido nucleico variante de interés se pueden mezclar juntas en una composición única o los vectores individuales que codifican para cada miembro de biblioteca se pueden mantener en composiciones separadas o en mezclas de aproximadamente 5 a 50 vectores individuales de la biblioteca en una composición. La generación de una línea de células de producción policlonalrecombinantes y la producción de una proteína policlonal recombinante a partir de dicha línea celular se puede obtener por diferentes estrategias de transfección y elaboración. Estas estrategias se delinean en la figura 3. Una manera es utilizar una biblioteca de vectores mezclada junta dentro de una composición única para la transfección de una línea de células anfitrionas. Este método se denomina transfección a granel o transfección en granel. Generalmente, el vector y el diseño de célula hospedera descrito previamente aseguran que una línea de células policlonal se obtendrá ante la selección apropiada. En tal línea celular, la mayor parte de las células individuales tienen una copia integrada de una molécula de ácido nucleico que codifica para un miembro distinto de una proteína policlonal recombinante a partir de una biblioteca de secuencias de ácido nucleico de interés en el genoma. La copia única de la secuencia de ácido nucleico se integra en un sitio específico único del genoma de cada célula en la recolección de células, y de esta manera se genera una línea de células policlonales constituida de células individuales que expresan miembros individuales de la proteína policlonal de interés . Se generará un acumulado concentrado de la línea de células policlonales antes del inicio de la elaboración de la proteína policlonal recombinante. Otra manera es utilizar una biblioteca de vectores divididos en fracciones que contienen aproximadamente 5 a 50 vectores individuales de la biblioteca en una composición para transfeccion. Preferiblemente, una fracción de la biblioteca constituye 10 a 20 vectores individuales. Cada composición después se transfecta en una alícuota de células anfitrionas. Este método se denomina transfeccion semi a granel. El número de alícuotas transfectadas dependerá del tamaño de la biblioteca y el número de vectores individuales en cada fracción. Si la biblioteca constituye, por ejemplo, 100 miembros variantes distintos, los cuales se dividen en fracciones que contienen 20 miembros variantes distintos en una composición, se necesitarían 5 alícuotas de células hospederas que sean transfectadas con una composición de biblioteca que constituye una fracción distinta de la biblioteca original . Las alícuotas de las células hospederas se seleccionan para integración específica de sitio. Preferiblemente, se seleccionan por separado alícuotas distintas. No obstante, también pueden ser acumuladas antes de la selección. Las alícuotas pueden ser analizadas por su diversidad clonal y únicamente aquellas con diversidad suficiente serán las que se utilicen para generar un concentrado de biblioteca GOI policlonal. Para obtener la línea de células policlonales que se desea para producción, las alícuotas se pueden mezclar antes de la generación del concentrado congelado, inmediatamente después de que han sido recuperadas del concentrado o después de un período breve de proliferación y adaptación. Opcionalmente, las alícuotas de las células se mantienen con una producción de rendimiento separado, y la composición de proteína policlonal se ensambla al combinar los productos de cada alícuota en vez de las alícuotas de las células antes de la producción. Una tercera manera es un método de alto rendimiento en el cual las células hospederas son transfectadas por separado utilizando los vectores individuales que constituyen la biblioteca de interés . Este método se denomina transfección individual. Las células hospederas transfectadas individualmente preferiblemente se seleccionan por separado para integración específica de sitio. No obstante, también pueden ser acumuladas antes de la selección. Los clones de células individuales generados ante la selección se pueden analizar con respecto al tiempo de proliferación y un patrón de integración y preferiblemente aquellos con velocidades de crecimiento similares y una integración de sitio específicaúnica se utilizan para generar un concentrado de biblioteca GOI policlonal . Los clones de células individuales se pueden mezclar para obtener la línea de células policlonales deseada antes de la generación del concentrado, inmediatamente después de que se han recuperado del concentrado o después de un tiempo breve de proliferación y adaptación. Esta solución puede eliminar cualquier posible desviación de secuencia residual durante la tranfección, integración y selección. De manera alternativa, las células hospederas transfectadas individualemente se mezclan antes de que se realice la selección, y esto permitirá el control de la desviación de secuencia debido a transfección. Una característica compartida en las estrategias de fabricación delineada y lo anterior es que los miembros individuales que constituyen la proteína policlonal recombinante se pueden producir en uno o en un número limitado de biorreactores, con aproximadamente 10 como máximo. La única diferencia es la etapa en la cual uno selecciona generar la colección de células que constituyen la línea de células de producción policlonal recombinante. La línea de célula hospedera para ser utilizada para expresión y producción de una proteína policlonal recombinante de interés tiene una o más moléculas de ácido nucleico reconocibles por una o varias enzimas recombinasas (por ejemplo, células preparadas de antemano que tienen un sitio FRT en un lugar predeterminado en el genoma como se describe, por ejemplo, en el documento de E.U.A. 5,677,177). El vector para integración de sitio específicapreferiblemente se integra en un locus genómico predefinido que media la expresión de alto nivel, un denominado punto caliente. Si necesitan incrementarse los niveles de expresión, la amplificación de gen se puede realizar utilizando la selección por un gen de DHFR o un gen para glutamina sintetasa (GS) . Esto requiere el uso de vectores que comprenden tal marcador de selección. Para la elaboración de una proteína policlonal, en donde cada miembro proteínico está constituido de más de dos cadenas polipeptídicas, la combinación de las cadenas puede ser de importancia para la afinidad, especificidad y actividad de la proteína que constituyen. Esto se puede ver, por ejemplo, para anticuerpos TcR. Por ejemplo, es la combinación de la cadena pesada variable de anticuerpo y la cadena ligera variable la que se sabe que afecta la afinidad y especificidad de un anticuerpo formado a partir de las cadenas. De esta manera, cuando se han seleccionado una biblioteca de secuencias codificantes de anticuerpo por su capacidad para producir anticuerpos con afinidad por cierto objetivo, es deseable asegurar que la combinación de la cadena pesada variable y la cadena ligera variable en el producto final correspondan a esto. Por esta razón, las cadenas polipeptídicas que constituyen un miembro individual de la proteína policlonal se colocan en el mismo vector utilizado para integración y de esta manera aseguran que se mantengan juntas durante el proceso. La siguiente descripción es un ejemplo de la manera en la que se obtiene un anticuerpo policlonal recombinante que expresa una línea celular, en donde el mezclado de las cadenas es mínimo, en caso de que llegue a existir. Se construye un cásete promotor universal para expresión constitutiva que tiene dos promotores colocados en dirección transcripcional opuesta, tal como la construcción cabeza a cabeza rodeada por la cadena pesada variable y la totalidad de la cadena ligera ?, lo que permite la transferencia del constructo completo en un vector que comprende un sitio FRT y un gen de resistencia a higroitiicina y la región constante de la cadena pesada. Se contempla que el cásete promotor para expresión inducible también se puede utilizar. Además, los promotores se pueden colocar con lo que resultará cola a cola en la trancripción en la dirección opuesta o cola a cabeza para trancripción unidireccional. Las células CHO-Flp-In (Invitrogen, Carlsbad CA) las cuales expresan de manera estable el gen de fusión lacZ-Zeocina se utilizan para el experimento, volviendo a las células resistentes al antibiótico zeocina. Las células se mantienen en un medio que contiene zeocina. Las células se transfectan a granel con la biblioteca de vectores para integración de sitio específicaque codifica para el anticuerpo policlonal y un marcador de selección diferente (higromicina fosfotransferasa) junto con un plásmido que expresa la recombinasa Flp. También se puede utilizar un promotor inducible para control de la expresión. Después de la transfección, las células se cultivan en presencia de higromicina. Las células que son resistentes a higromicina posteriormente se hacen crecer en sistemas de cultivo diferentes tales como matraces de cultivo pequeños convencionales, fábricas de células multiestratificadas Nunc, biorreactores de alto rendimiento pequeños (MiniPerm, INTEGRA-CELLine) y matraces gitatorios para biorreactores de fibra hueca. Las células se prueban para la producción de anticuerpos utilizando ELISA. Se seleccionan líneas de células policlonales para determinar su viabilidad en crecimiento en suspensión en medio libre de suero sin presión de selección por períodos prolongados. Los concentrados de líneas de células se han crecer en presencia de higromicina. Evaluación de la conservación de políclonalidad en el sistema de expresión De acuerdo con la presente invención, con frecuencia es importante asegurar que la políclonalidad en el sistema de expresión no se ha alterado gravemente durante la producción de manera que es posible detener la producción cuando la políclonalidad se ha alterado en realidad. Esto se realiza, de acuerdo con la invención, al vigilar las concentraciones de expresión relativas de las secuencias de ácido nucleico variantes. Los niveles de expresión de pueden monitorear, por ejemplo, a nivel de AKNm utilizando, por ejemplo, análisis RFLP, arreglos o PC en tiempo real, o a nivel de proteína utilizando, por ejemplo, electroforesis en gel de poliacrilamida bidimensional , espectrometría de masas o diversas técnicas cromoatográficas . Con estas técnicas, será posible establecer un valor de línea de base para muchas o la totalidad de los niveles de expresión individuales y después tomar muestras del cultivo durante la producción con el fin de calibrar si han cambiado los niveles de expresión (tanto en total como relativamente) . En la práctica normal de la invención, se puede establecer una gama de valores que rodean a los valores de línea de base, y .se encuentra que los niveles de expresión relativos están fuera de los intervalos, entonces finaliza la producción. Para ser capaces de evaluar la estabilidad y capacidad de reproducción del sistema de expresión, se preparan vectores de expresión que codifican para seis fragmentos distintos de Fab (las seis minibibliotecas) con reactividad contra ovalbúmina de pollo (OVA) , fosfatasa alcalina bovina (AP) , microglobulina ß2 humana (P2m) , haptoglobina humana (HAP) , factor VIII humano (FVIII) y lisozima de clara de huevo (LYS) . Las diferentes secuencias que codifican para fragmentos Fab no son idénticas y por lo tanto presentan patrones RFLP diferentes, por lo que se puede utilizar RFLP para analizar la composición de genotipo.

Las seis minibibliotecas se introducen en células CHO-Flp por transfección utilizando un vector de expresión con un cásete promotor cabeza a cabeza. Las células CHO-Flp-In después se transfectan a granel con una mezcla de vectores de expresión de interés que codifican para los seis anticuerpos distintos lo que resulta en una línea de células policlonales que expresan los seis anticuerpos en combinación conocida o las células se transfectan individualmente con un miembro de la biblioteca de expresión de interés seguida por mezclado de las células transfectadas, lo que genera una línea de células que expresan anticuerpo policlonal recombinante la cual expresa los seis anticuerpos en una combinación conocida. De esta manera, es posible probar si la transfección de las células de mamífero se producen sin generar una desviación para uno o varios clones individuales del anticuerpo policlonal recombinante que expresa la línea celular. Además, es posible verificar para desviación de proliferación y desviación causada por la purificación de la composición policlonal de los anticuerpos. Establecimiento de la línea de células productora de anticuerpo policlonal recombinante contra ovalbúmina Se seleccionan clones de fago que unen ovalbúmina utilizando la presentación de fago y ELISA para identificar los clones pertinentes . Se utilizan dos sistemas para identificar anticuerpos a partir de los clones que unen ovalbúmina, es decir, placas de ELISA recubiertas con ovalbúmina o un método de cribado de alta densidad (HDS) , que se basa en la inmovilización de ovalbúmina sobre membranas PVDF. De esta manera se obtiene un conjunto de anticuerpos de los cuales algunos reconocen ovalbúmina inmovilizada en la placa de ELISA y otros reconocen ovalbúmina inmovilizada en la membrana PVDF. Los clones de fago que unen ovalbúmina seleccionados pueden tener sus secuencias de ADN de cadena pesada variable y unida a promotores de mamífero y que se transfiere en un vector del tipo pSymvc20 (figura 4D) para expresión de anticuerpo que genera una colección de clones del tipo pSymvc21 (figura 4E) . Las células CHO-Flp-In se transfectan a granel con una mezcla de clones pSymvc21 o las células se transfectan individualmente con un plásmido que expresa anticuerpo pSymvc21 seguido por mezclado de las células transfectadas que expresan los otros anticuerpos de unión de ovalbúmina. El procedimiento de generación de un anticuerpo policlonal contra ovalbúmina produce una línea celular que puede ser vigilada por secuenciado de ADN, análisis de PCR TaqMan o RFLP de células que expresan anticuerpo individuales así como ELISA, cromatografía líquida (LC) bidimensional (2D) y espectrometría de masas (MS) de la mezcla de anticuerpos producida.

Cultivo de células y producción de un anticuerpo policlonal recombinante La línea de células policlonales producidas como se describe en lo anterior se hace crecer en un medio adecuado bajo condiciones adecuadas para expresar la proteína policlonal de interés codificada por las secuencias de ácido nucleico varianteinsertadas en el genoma de las células . El cultivo celular se puede realizar en varias etapas. Una primera etapa es cuando la línea de células policlonales se selecciona por integrantes específicos de sitio. Cuando se utilizan células de mamífero, las células seleccionadas después se adaptan preferiblemente para crecer en suspensión así como en condiciones sin suero. Esto se puede realizar en una o dos etapas y con o sin presión de selección. Cuando la línea de células policlonales está adaptada a las condiciones apropiadas se puede iniciar el aumento de producción. En este punto se puede congelar un concentrado de células de trabajo. Preferiblemente se utilizan biorreactores de entre 30 y 100 litros, pero se pueden utilizar biorreactores menores o mayores. El tiempo de producción adecuado así como la selección del tamaño de biorreactor dependen del rendimiento deseado de proteína a partir del lote y los niveles de expresión de la línea celular. El tiempo puede variar desde un par de días hasta 3 meses . La proteína policlonal recombinante expresada se aisla de las células o del sobrenadante. La proteína reconibinante se purifica y caracteriza de acuerdo con procedimientos conocidos por las personas expertas en la técnica. Los ejemplos de procedimientos de purificación y caracterización se describen a continuación. Purificación de una proteína policlonal reconibinante a partir de un sobrenadante de cultivo El aislamiento de proteínas específicas a partir de sobrenadante de cultivo es posible utilizando diversas técnicas cromatográficas que utilizan diferencias en las propiedades fisicoquímicas de las proteínas, por ejemplo diferencias en el peso molecular, carga neta, hidrofobicidad o afinidad hacia un ligando o proteína específicos . De esta manera, las proteínas se separan de acuerdo con el peso molecular utilizando cromatografía de filtración en gel o de acuerdo con la carga neta utilizando cromatografía de intercambio iónico (catión-anión) o alternativamente utilizando cromatoenfoque. De manera similar, las proteínas se pueden separar después de hidrofobicidad utilizando cromatografía de interacción hidrofóbica o cromatografía de afinidad utilizando diferencias en afinidad hacia un ligando o proteína inmovilizada específica. La separación de mezclas complejas de proteínas de esta manera se obtiene por combinación secuencial de diversos principios cromatográficos . Una mezcla de proteínas por lo tanto inicialmente se puede separar, de acuerdo, con la carga neta utilizando cromatografía de intercambio iónico y proteínas de carga neta similar que posteriormente se pueden separar de acuerdo con el peso molecular utilizando cromatografía de filtración en gel o después de hidrofobicidad utilizando cromatografía de interacciones idrofóbicas en presencia de una alta concentración de una sal seleccionada. La cromatografía de afinidad combinada con etapas de purificación subsecuentes tales como cromatografía de intercambio iónico, interacciones hidrofóbicas y filtración en gel con frecuencia se han utilizado para la purificación de igG (policlonales así como monoclonales ) y TcR a partir de fuentes diferentes, por ejemplo fluido ascítico, sobre sobrenadantes de cultivo celular y suero. La purificación por afinidad, en donde la separación se basa en una interacción reversible entre uno o varias proteínas y un ligando específico acoplado a una matriz cromatográfica, es un método sencillo y rápido el cual ofrece alta selectividad, habitualmente alta capacidad y concentración en un volumen menor. La proteína A y la proteína G, dos proteínas de superficie de células bacterianas, tienen alta afinidad por la región Fc y se han utilizado, en una forma inmovilizada, para muchas aplicaciones sistemáticas que incluyen purificación de IgG policlonal y sus subclases a partir de diversas especies así como absorción y purificación de complejos inmunológicos . Después de la cromatografía de afinidad, se pueden realizar etapas de cromatografía posteriores, por ejemplo intercambio iónico o cromatografía de interacción hidrofóbica para separar a las proteínas de las células hospederas, proteína A fugada y ADN. La filtración en gel, como una etapa de purificación final, se puede utilizar para separar moléculas contaminantes tales como dimeros y otros agregados y transferir la muestra a un amortiguador de almacenamiento. Dependiendo de la fuente y las condiciones de expresión, puede ser necesario incluir una etapa de purificación adicional para obtener el nivel requerido de pureza de anticuerpo. La cromatografía de interacción hidrofóbica o la cromatografía de intercambio iónica por lo tanto se utilizan con frecuencia en combinación con proteína A y cromatografía de filtración en gel para purificar anticuerpos para uso terapéutico. Con el fin de purificar otras clases de anticuerpos, se han utilizado medios de cromatografía de afinidad alternativa dado que las proteínas A y G no unen IgA e IgM. Se puede utilizar una purificación por inmunoafinidad (anticuerpos monoclonales contra IgA o contra IgM acoplados a fase sólida) o alternativamente se puede utilizar estrategias de purificación etapas múltiples que incluyen intercambio iónico e interacción hidrofóbica. Caracterización estructural La caracterización estructural de proteínas policlonales tales como anticuerpos y los TcR requiere una alta resolución (separación) debido a la complejidad de la mezcla (diversidad clonal y glucosilación) . Las soluciones tradicionales tales como filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico o electroforesis pueden no tener suficiente resolución para diferenciar entre los anticuerpos individuales. Se han utilizado la electroforesis en gel de poliacrilamida bidimensional (2D-PAGE) para elaborar perfiles de mezclas de proteínas complejas seguido por espectrometría de masas (MS) o cromatografía líquida (LC)-MS (por ejemplo proteómico) . 2D-PAGE el cual combina la separación en base en la carga de la proteína y la masa, ha demostrado ser útil para diferenciación entre inmunoglobulinas policlonal, oligoclonal y monoclonal en muestras de suero. No obstante, este método tiene ciertas limitaciones. Las técnicas cromatográficas, en particular capilar y LC acopladas a MS de ionización de electroaspersión se aplican cada vez más para el análisis de mezclas peptídicas complejas. Se ha utilizado LC-MS para la caracterización de anticuerpos monoclonales y recientemente también para determinar el perfil de cadenas ligeras de anticuerpos policlonales. El análisis de muestras muy complejas requiere más poder de resolución del sistema cromatográfico, lo cual se puede obtener por separación en dos (o más) dimensiones. Tal solución se puede basar en el intercambio iónico en la primera dimensión y la cromatografía en fase inversa (o interacción hidrofóbica) en la segunda dimensión acoplado opcionalmente a MS. Caracterización funcional Una proteína policlonal puede ser caracterizada, por ejemplo, funcionalmente a través de estudios de comparación con proteínas policlonales con especificidad hacia el mismo objetivo o una actividad similar. Tales estudios se pueden llevar a cabo in vitro así como in vivo. Una caracterización funcional in vitro de un anticuerpo policlonal puede ser, por ejemplo, la inmunoprecipitación la cual es una técnica altamente específica para la separación analítica de antígenos objetivo a partir de lisados de células crudas . Al combinar la inmunoprecipitación con otras técnicas tales como SDS-PAGE seguido por tinción de proteínas (azul de Coomassie, tinción con plata o marcado con biotina) o inmunotransferencia, es posible detectar y cuantificar antígenos, por ejemplo y por lo tanto evaluar algunas de las propiedades funcionales de los anticuerpos . Aunque este método no proporciona un cálculo respecto al número de moléculas de anticuerpo ni sus afinidades de unión, proporciona una visualización de las proteínas objetivo y por lo tanto de la especificidad. De igual manera, este método se puede utilizar para vigilar las diferencias potenciales de los anticuerpos hacia los antígenos (la integridad de la diversidad clonal) durante el procedimiento de expresión. Una caracterización funcional in vivo de un anticuerpo policlonal pueden ser, por ejemplo, estudios de infección. Un animal experimental tal como un ratón puede ser infectado, por ejemplo, con un virus específico, hacia el cual se ha desarrollado un anticuerpo policlonal. El grado con el cual se puede inhibir la inhibición indicará la funcionalidad del anticuerpo policlonal . Composiciones terapéuticas En una modalidad de la invención, una composición farmacéutica que comprende una proteína policlonal recombinante seleccionada de la superfamilia de inmunoglobulina como el ingrediente activo se diseña para el tratamiento o prevención de una enfermedad en un mamífero tal como una enfermedad que se selecciona de cáncer, infecciones, enfermedades inflamatorias, alergia, asma y otras enfermedades respiratorias, enfermedades autoinmunes, malfuncionamiento inmunológico, enfermedades cardiovasculares, enfermedades en el sistema nervioso central, enfermedades metabólicas y endocrinas, rechazo de transplantes y embarazo no deseado. El mamífero preferiblemente es un humano, animal doméstico o una mascota. En una modalidad preferida de la presente invención, la composición farmacéutica comprende un anticuerpo policlonal recombinante o un fragmento de anticuerpo como el ingrediente activo y un excipiente farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad preferida de la presente invención, la composición farmacéutica comprende un receptor de linfocito T policlonal recombinante o un fragmento de receptor de linfocito T como el ingrediente activo y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Para el tratamiento o prevención de infecciones, la composición farmacéutica de acuerdo con la invención comprende una proteína policlonal recombinante de interés capaz de reaccionar con, o de unirse a un microorganismo infeccioso tal como un microorganismo que se selecciona de bacterias, micobacterias , virus, micoplasmas, rickettsia, espiroquetas, protozoarios, hongos, helmintos y ectoparásitos . Las proteínas policlonales humanas recombinantes se pueden administrar dentro de un diluyente, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable en forma de dosificación unitaria. Se puede utilizar la práctica farmacéutica convencional para proporcionar formulaciones o composiciones adecuadas para administrar los compuestos a pacientes que padecen de una enfermedad, por ejemplo causada por proliferación celular excesiva. La administración puede comenzar antes de que el paciente presente síntomas . Se puede utilizar cualquier vía de administración apropiada, por ejemplo la administración puede ser parenteral, intravenosa, intraarterial , subcutánea, intramuscular, intracraneal, intraorbital , oftálmica, intraventricular, intracapsular, intraespinal , intracisternal , intraperitoneal, intranasal, aerosol, supositorio o administración oral (bucal) . Por ejemplo, las formulaciones terapéuticas pueden estar en forma de soluciones o suspensiones líquidas; para administración oral, las formulaciones pueden estar en forma de tabletas o cápsulas de goma masticable, las composiciones adecuadas para aplicación sobre la piel pueden estar en forma de cremas, pomadas, lociones, geles, almohadillas y otros, las composiciones adecuadas para aplicación en la mucosa vaginal o urogenital pueden estar en forma de vagitorios, geles u otros y para formulaciones intranasales, en forma de polvos, gotas nasales o aerosoles. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se preparan de una manera conocida por si misma, por ejemplo, por medio de procedimientos convencionales de disolución, liofilización, mezclado, granulado y elaboración de confituras. Las composiciones farmacéuticas se pueden formular de acuerdo con la práctica farmacéutica convencional (véase, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed. ) , ed A. R. Gennaro, 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA and Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. S arbrick and J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New York, NY) . Las soluciones del ingrediente activo y también las suspensiones, y especialmente las soluciones o suspensiones acuosas isotónicas se utilizan preferiblemente, siendo posible, por ejemplo en el caso de composiciones liofilizadas que comprenden el ingrediente activo solo o junto con un portador, por ejemplo manitol, que tales soluciones o suspensiones se produzcan antes de su uso. Las composiciones farmacéuticas pueden ser esterilizadas o pueden comprender excipientes, por ejemplo conservadores, estabilizantes, agentes humectantes o emulsificantes , solubilizantes, sales para regular la presión osmótica o amortiguadores, y se preparan de una manera conocida por sí misma, por ejemplo por medios convencionales de procedimiento de disolución o liofilización. Las soluciones o suspensiones pueden comprender sustancias que incrementan la viscosidad, tales como carboximetilcelulosa de sodio, carboximetilcelulosa, dextrano, polivinilpirrolidona o gelatina. Las composiciones de inyección se preparan de la ' manera habitual bajo condiciones estériles; lo mismo se aplica también a la introducción de las composiciones en ampolletas o frascos y sellado de los recipientes. Las composiciones farmacéuticas para administración oral se pueden obtener al combinar el ingrediente activo con portadores sólidos, si se desea granulando una mezcla resultante y procesando la mezcla, si se desea o es necesario, después de la adición de los excipientes apropiados en tabletas , núcleos de grageas o cápsulas . También es posible que se incorporen en recipientes de plástico que permitan que los ingredientes activos difundan o se liberen en cantidades medidas . Las composiciones farmacéuticas comprenden de aproximadamente 1% a aproximadamente 95%, de manera preferible de aproximadamente 20% a aproximadamente 90% del ingrediente activo. Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención pueden estar, por ejemplo en una forma de dosis unitaria por ejemplo en forma de ampolletas, frascos, supositorios, grageas, tabletas o cápsulas. Las formulaciones se pueden administrar a pacientes humanos en cantidades terapéuticamente eficaces (por ejemplo cantidades que evitan, eliminan o reducen una condición patológica) para proporcionar terapia para una enfermedad o condición. La dosificación preferida de agente terapéutico que se va a administrar probablemente depende de variables tales como el tipo y grado de desorden, el estado de salud general del paciente particular, la formulación de los excipientes que constituyen el compuesto y su vía de administración. Si se desea, el tratamiento con anticuerpos policlonales humanos recombinantes se puede combinar con tratamientos más tradicionales. Por ejemplo en el tratamiento de cáncer tales terapias de combinación (politerapias) pueden adquirir la forma de cirugía o administración de sustancias quimioterapéuticas u otros agentes contra el cáncer. En otra modalidad de la invención, la composición farmacéutica de acuerdo con la invención comprende una proteína policlonal recombinante de interés capaz de reaccionar o de unirse a un microorganismo infeccioso tal como un microorganismo que se selecciona de bacterias, microbacterias, virus, micoplasma, rickettsia, espiroquetas, protozoarios, hongos, helmintos y ectoparásitos . Usos terapéuticos de las composiciones de acuerdo con la invención Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención se pueden utilizar para el tratamiento, disminución o prevención de una enfermedad en un mamífero. Las enfermedades que pueden ser tratadas con las presentes composiciones farmacéuticas incluyen cáncer, enfermedades infecciosas, enfermedades inflamatorias, alergia, asma y otras enfermedades respiratorias, enfermedades autoinmunes, enfermedades cardiovasculares, enfermedades en el sistema nervioso central, enfermedades metabólicas y endocrinas, rechazo de transplantes y embarazo no deseado. Un aspecto de la presente invención es un método para tratamiento, disminución o profilaxis de enfermedades en un animal, en donde se administra una cantidad efectiva del anticuerpo policlonal recombinante o de un fragmento de anticuerpo. En un aspecto adicional se administra una cantidad eficaz del receptor de linfocitos T policlonal o recombinante o un fragmento del receptor de linfocitos T. Un aspecto adicional de la presente invención es el uso de un anticuerpo policlonal recombinante o un receptor de linfocitos T policlonal recombinante o fragmentos de anticuerpos o receptores de linfocitos T para la preparación de una composición para el tratamiento de enfermedades que se seleccionan de un grupo que consiste de cáncer, una infección, una enfermedad inflamatoria, una alergia, asma u otra enfermedad respiratoria, mal funcionamiento inmunológico, una enfermedad autoinmune, una enfermedad cardiovascular, una enfermedad en el sistema nervioso central, una enfermedad metabólica, enfermedades endocrinas, rechazo de transplantes y embarazo no deseado. Uso diagnóstico y uso detección ambiental Otra modalidad de la invención se relaciona con equipos de diagnóstico y equipos para uso de detección ambiental así como métodos para utilizar estos equipos . Los equipos de acuerdo con la presente invención comprenden una proteína policlonal recombinante preparada de acuerdo con la invención, proteína la cual puede ser marcada con una marca detectable o puede no ser marcada para detección sin marca, Sí se marca, la proteína policlonal recombínate presente se puede agregar a una muestra sospechosa de contener la molécula objetivo y se detecta la presencia o ausencia de la etiqueta que indica la presencia o ausencia de la molécula objetivo. La muestra que se va a probar puede ser- una muestra de fluido corporal tal como sangre, suero, plasma, líquido cefalorraquidio, linfa u orina o bien una muestra que no sea de mamífero tal como una muestra de una fuente ambiental sospechosa de albergar un contaminante. Las muestras que no son de mamífero pueden ser agua o aire o tierra contaminada. La detección sin marca abarca la medición de un cambio de refracción en BIAcore mediante la unión en donde la proteína policlonal recombinante se utiliza para retener a la molécula objetivo . EJEMPLOS Los siguientes ejemplos describen la manera en que los anticuerpos policlonales recombinantes se expresan y se producen en una línea celular altamente productora, en donde uno o varios de los genes/vectores de interés se han insertado por integración de sitio específicaen un sitio "punto caliente" cromosómico precaracterizado . En los ejemplos se utilizan células CHO como una célula anfitriona. Las ventajas de la misma incluyen la disponibilidad de un medio de crecimiento adecuado, su capacidad para crecer eficazmente a alta densidad en cultivo y su capacidad para expresar proteínas de mamífero tales como anticuerpos en una forma biológicamente activa. En general, la transformación de E. coli y la transfección de células de mamífero de acuerdo con la presente invención se puede realizar de acuerdo con métodos convencionales. Para mejorar comprensión de la invención, se describe en los ejemplos siguientes la construcción de los vectores ejemplares y su uso en la producción de elaboración policlonal recombinante de una línea celular para expresión de proteína policlonal recombinante. Los siguientes ejemplos ilustran la invención, pero no debe ser considerada como limitante del alcance de la invención. EJEMPLO 1 Integración de sitio específicaversus integración aleatoria Para el siguiente experimento de transfección, se utilizan células CHO Flp-In (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Se prueba la eficiencia del sistema utilizando fosfotasa" alcalina secretada humana (SEAP) como un gen indicador. Se preparan dos constructos plasmídicos : 1. SEAP insertado en pcDNA3.lhygro+ (Invitrogen, Carlsbad, CA) (para integración aleatoria) 2. SEAP insertado en pcDNA5/FRT (Invitrogen, Carlsbad, CA) (para integración específica de si-tio) : : ' Los dos constructos plasmídicos son muy similares con respecto a los elementos reguladores, es decir, promotor, poliadenilación, etc. lo cual hace posible utilizar los plásmidos para comparar la integración aleatoria con integración específica de sitio. Las células CHO Flp-In se transfectan con el constructo plasmídico 1 solo o el constructo plasmídico 2 junto con el plásmido que codifica para recombinasa pOG44 de acuerdo con el procedimiento descrito en Invitrogen. Los transfectantes se seleccionan utilizando higromicina y se mide la producción de SEAP a partir de acumulados de transfectantes . Las células transfectadas por integración de sitio especificaproducen aproximadamente 6 veces más SEAp que las células transfectadas por integración aleatoria demostrando la eficiencia del sistema y de la línea celular. EJEMPLO 2 Diseño y preparación de un vector de expresión para integración de sitio específicaen una célula anfitriona Un vector de expresión adecuado para integración de sitio especificadentro de una región cromosómica de punto caliente de una célula hospedera se puede ensamblar, constituido de los siguientes elementos de ADN: a) un sitio -de recombinación FRT unido a un gen de resistencia a higromicina, b) un origen de replicación pUC, c) un gen de resistencia a ampicilina (bla) , d) un promotor bla que permite la expresión del gen de resistencia a ampicilina (bla) , e) uno o varios genes que codifican para una proteína de interés (GOI) , f) uno o varios promotores que permiten la expresión de GOI, y g) opcionalmente, elementos reguladores transcripcionales o traduccionales adicionales tales como mejoradores o UCOE para expresión aumentada en el sitio de integración de un IRES. Para proporcionar una mejor comprensión de la construcción del vector de expresión, se describen con detalle cada uno de los elementos : a) Se utiliza un sitio de recombinación FRT unido al gen de resistencia a higromxcina para integración mediada por recombinasa Flp y selección de una línea celular con la mayor parte de los integrantes solos. El gen de higromicina nunca va precedido por un promotor ni equipado con un codón de inicio de traducción, pero la señal de poliadenadenilación se agrega a 3' al gen. El sitio FRT utilizado es 5'-gaagttcctattccgaagttcctattctctagaaagtataggaacttc-31 (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1) . ~b) se incluye un origen de replicación pUC para permitir una replicación con un alto número de copias en una célula hospedera E. coli . c) Se incluye un gen de resistencia a ampicilina (bla) (ß-lactamasa) que permite la selección de transformantes de E. coli . d) un promotor bla que permite la expresión del gen de resistencia a ampicilina (bla) en E. coli. e) Se incluye GOI que codifica para una proteína de interés, por ejemplo una proteína policlonal recombinante, un anticuerpo, las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo así como las secuencias nucleotídicas que codifican para la totalidad o una porción ya sea de la región constante o la región variable de una molécula de anticuerpo y opcionalmente la totalidad o una porción de la secuencia nucleotídica reguladora que controla la expresión de una molécula de anticuerpo . Los loci de inmunoglobulina para cadenas pesadas pueden incluir pero no se limitan a la totalidad o una porción de la región v, D, J y de bisagra (que incluye secuencias intermedias, también conocidas como intrones) y secuencias flanqueantes asociadas con o adyacentes al gen de la región constante de la cadena pesada particular y pueden incluir regiones que se localizan dentro o hacia el extremo 31 de la región constante (que incluyen intrones) . Los loci de inmunoglobulina para las cadenas ligeras pueden incluir pero no se limitan a las regiones V y J, sus secuencias flanqueantes hacia el extremo 5 ' y las secuencias intermedias (intrones) asociados con o adyacentes al gen para la región constante de la cadena ligera y pueden incluir regiones que se localizan dentro o corriente debajo de la región constante (que incluyen intrones) . Para la modificación de la totalidad o una porción de la región constante de un anticuerpo, la modificación de las secuencias de la invención puede incluir, pero no se limita a una región constante de anticuerpo que tiene una función efectora, una clase u origen particulares (por ejemplo las regiones constantes de IgG, IgA, Ig , IgD o IgE de las inmunoglobulinas humanas o de cualquier otra especie) o una porción de una región constante que modifica la actividad o las propiedades de la región constante del anticuerpo; así como genes los cuales codifican para otras moléculas que confieren parte de la función nueva a una molécula de anticuerpo modificada, por ejemplo una enzima, toxina y similar. Uno o varios de los genes que codifican para una proteína de interés se pueden unir operativamente a secuencias nucleotídicas que codifican para secuencias líder funcionales que dirigen el producto del gen a la vía secretora. Además, en una posición 3' respecto a la GOI que codifica para la proteína de interés, por ejemplo tal como un anticuerpo policlonal que comprende cadena pesada y ligera puede haber señales de poliadenilación fuerte. El uso de IgGl isotipo de ratón en los siguientes ejemplos es con propósitos ilustrativos y no pretende limitar el alcance de la invención. f) Se proporcionan promotores que permiten la expresión de GOI . Por lo tanto, se describe un cásete que comprende un promotor y elementos mej oradores para expresión. En el vector de expresión cada uno de los genes de anticuerpo puede estar precedido por sus propios elementos promotores de mamífero que dirigen la expresión de alto nivel de cada una de las dos cadenas ya sea que se utilicen unidireccionalmente o bidireccionalmente en una orientación de trascripción de casetes de cola a cola. En una orientación de expresión bidireccional, se puede utilizar una configuración de promotor cabeza a cabeza (en la construcción de dicho sistema se describe con detalles en la patente de E. U. A. No. 5,789,208 la cual se incorpora en la presente como referencia en su totalidad) . En un sistema de expresión unidireccional también se pueden -utilizar dos promotores o un promotor combinado con, por ejemplo, .¦ una secuencia IRES para expresión. Para la construcción de los promotores cabeza a cabeza, una amplificación por PCR Pfu de los promotores se realiza individualmente. El cebador 5' se iniciará en la base más hacia 5' del promotor, el cebador en el extremo 3' incluirá un sitio de restricción único tal como un sitio Xbal. Después de la amplificación por PCR, los fragmentos se pueden separar en un gel de agarosa y se pueden aislar del gel utilizando columnas QiaQuick (Qiagen) . Esto es . seguido por digestión de restricción con bal, inactivación con calor a 65°C durante 20 minutos y purificación en columna de los fragmentos utilizando QiaQuick. Los fragmentos después se mezclan y unen ligándolos utilizando ligasa para E. coli (New England Biolabs (NEB) ) , una enzima que liga preferencialmente los extremos pegajosos. La mezcla de ligación se amplifica por PCR con los cebadores 5 ' del primer promotor para proporcionar el fragmento completo de cabeza a cabeza (promotor A/promotor B) .Este fragmento se somete a cinasa con la polinucleot docinasa T4 (PNK) (NEB) , la enzima es inactivada por calor a 65°C durante 20 minutos, y el fragmento se liga (extremo romo) en el vector de interés (pSymvclO amplificado por PCR (véase la figura 4) , en donde los cebadores utilizados para amplificación se reasocian sobre cada lado de la región promotora amplificando todo excepto al promotor) utilizando ligasa T4 (NEB) . Las figuras 1 y 2 muestran los vectores de expresión que comprenden promotores para bidireccional y unidireccional, respectivamente. Estos promotores pretenden ilustrar, pero no limitar la selección de promotor en la invención. g) El vector de expresión puede presentar elementos reguladores transcripcionales o traduceionales tales como mejoradores o UCOE, para expresión aumentada en el sitio de integración o IRES.

EJEMPLO 3 Evaluación de la conservación de la policlonalidad en el sistema de producción desarrollado Con el fin de poder evaluar la estabilidad y capacidad de reproducción del sistema de elaboración, se prepara una línea celular que expresa una composición policlonal de anticuerpos distintos en una combinación conocida. La composición de anticuerpo policlonal se denomina una composición mini seis . La biblioteca de las secuencias de ácido nucleico que codifican para la composición mini seis se denomina como la biblioteca mini seis . (a) Origen del clon Se utilizan en este ejemplo las siguientes secuencias que codifican para fragmentos Fab (los genes de interés) con reactividad contra los antxgenos 1-6: 1. Ovalbumina (OVA) . Los fragmentos que codifican para Fab se seleccionan a partir de una biblioteca de presentación de fago contra OVAmurina. 2. Fosfatasa alcalina (AP) . Los fragmentos que codifican para Fa .. se seleccionan de una biblioteca de presentación de fago contra APmur-ino.. 3. Microglobulina ß2 (ß2p?) . Los fragmentos que codifican para Fab se clonan a partir de el hibridoma BB .l (una obsequio del Doctor L. 0. Pedersen, Dinamarca), el cual se genera contra ß2p?. 4. Haptoglobina humana (HAP) : El Fab que codifica para los fragmentos se selecciona de una biblioteca de presentación de fago de haptoglobina murina contra humano. 5. El factor VIII (FVIII) . El anticuerpo monoclonal original de este fragmento Fab es un anticuerpo monoclonal FVIII F25 (obsequio de Novo Nordisk, Dinamarca) . El ADN que codifica para VH y las cadenas ? completas de este fragmento Fab se subclonan en un fagemido seguido por inserción en el c sete promotor procariotico dentro del constructo. 6. lisozima de huevo de gallina (LYS) . Este constructo se genera a partir del clon DI.3 scFv (Boulot, G. et al., J. Mol. Biol.., 213(4) (1990) 617-619) por amplificación por PCR de los fragmentos VH y VK y clonación en un fagemido. Los clones de fagemido existen en acumulados de glicerol transformados en Escherichia coli cepa TGl (que se mantienen a -80°C) o como preparaciones de ADN fagemido. (b) Análisis de RFLP y secuenciado de ADN en la biblioteca mini seis . Las secuencias nucleotídicas que codifican para las cadenas pesadas de los fragmentos Fab se analizan por RFLP como sigue: los patrones de banda que se obtienen después del digerido de los fragmentos generados por PCR con la enzima NlalII y Hinf I son los que se examinan. Los diferentes fragmentos de Fab que codifican para secuencias muestran patrones muy diferentes y distinguibles fácilmente. Las secuencias nucleotídicas gue codifican para los fragmentos VH y VL se secuencian y se encuentran las secuencias que corresponden al patrón RFLP. Además, las secuencias nucleotidicas que codifican para los marcos de lectura abierta y que se traducen en polipéptidos bien definidos. (c) Análisis de ELISA de la composición mini seis Los fragmentos Fab que se expresan a partir de clones se analizan utilizando ELISA, en el cual todos los fragmentos Fab se analizan para determinar reactividad con todos los antígenos . Se monitorea la expresión de Fab utilizando ELISA contra ?. Se prueban todos los fragmentos de Fab por duplicado en ELISA. Todos los clones expresan fragmentos Fab, y los fragmentos Fab reaccionan de manera específica con su antígeno pertinente. No se encuentran problemas de fondo en el análisis de ELISA. Los clones de los seis fagemidos - existen en concentrados de glicerol de Escherichia coli cepa TG1 transformados individualmente, los cuales se utilizan en el sistema de modelo para inoculación como se describe en lo siguiente. (d) Diseño de un sistema de modelo policlonal con seis anticuerpos distintos en combinación conocida. Los seis clones que expresan Fab seleccionados (clones que expresan fragmentos Fab de anticuerpo contra OVA, contra AP, contra ß2??, contra HAP, contra FVIII y contra LYS) se caracterizan por probar la reactividad de los fragmentos Fab expresados contra los antígenos pertinentes. Estos clones forman parte de un sistema de modelo policlonal para probar la expresión y producción, de seis anticuerpos distintos en una combinación conocida (la combinación mini seis) . Todos los fragmentos Fab que codifican para secuencias nucleotídicas (la biblioteca mini seis) se transfieren en un vector fagemido (ilustrado por pSymvclO, figura 4?) . (d.l) Transferencia individual de los GOI desde el vector fagemido a un vector para expresión en mamífero La transferencia de los genes de interés (la biblioteca mini seis) de un vector fagemido a un vector para expresión de mamífero, en este ejemplo se realiza por un procedimiento de dos etapas . La primera etapa es sustituir los promotores procarióticos con un cásete de promotor de mamífero en una orientación cabeza a cabeza. Esta etapa es seguida por la transferencia de la región variable de los GOI, el cásete de promotor y al constante ? para el vector de expresión como se describe con detalle en lo siguiente, y como se ilustra en la figura 4. El cásete de promotor de cabeza a cabeza (promotor A/promotor B) se inserta en el vector fagemido para cada clon mediante la utilización de una digestión de Sacl/Xhol seguida por una ' ligación que resulta en el cambio de promotores de bacterianos a mamífero. Después se utiliza un digerido EcoRl y Notl para mover la cadena pesada variable, el cásete de promotor cabeza a cabeza (promotor A/promotor B) y completar la cadena ? (fragmento EcoRI/Notl) del vector fagemido en el vector de expresión. Un ejemplo de la transferencia individual de cada clon se proporciona con el diagrama de flujo en la figura 4. Esta figura muestra el plásmido pSymvclO en donde las secuencias que codifican para la cadena pesada y de interés (por ejemplo gc032 OVA) están presentes en el vector fagemido en el cual se liga el constructo de cásete promotor de mamífero cabeza a cabeza para sustituir los promotores bacterianos utilizando la transferencia del fragmento Sacl/Xhol que genera pSymvcl2. A partir de este constructo, la secuencia que codifica para la cadena pesada variable que incluye al cásete promotor y a la totalidad de la secuencia codificante para la cadena ? se transfieren al vector que codifica para el isotipo de mamíferos (pSymvc20) por una transferencia Notl/EcoRl. El vector resultante (pSymvc21) expresa el anticuerpo de ratón de interés (por ejemplo un anticuerpo igGl contra OVA) . La secuencia codificante de cadena pesada variable, el cásete de promotor de mamífero y la totalidad de la secuencia codificante de cadena ? de cada uno de los seis clones se transfiere individualmente por una transferencia Notl/EcoRI lo que resulta en el vector de expresión de mamíferos pSymvc21, el cual expresa cada una de las secuencias de anticuerpo codificadas por GOI como anticuerpos IgGl de ratón. Los seis clones pSymvc21 individuales que contienen los seis GOI se mantienen como concentrados de glicerol TGl . Para transíección en células CHO Flp-In, los concentrados TGl se propagan individualmente y después de normalización a D06DO para el número de células de E. coli, los seis cultivos se mezclan y utilizan para preparación del plásmido . Esta preparación de plásmido comprende a los seis GOI (la biblioteca mini seis) que se utiliza para transfección a granel de células de mamífero para la expresión de proteína policlonal recombinante. (d.2) Transferencia en masa de - los GOI desde los vectores fagemidos en vectores para- expresión de mamífero Los GOI (la biblioteca mini seis) (aquí los fragmentos EcoRl/Notl) los cuales se localizan en los vectores fagemidos que codifican para seis fragmentos Fab distintos (contra OVA, contra AP, contra p2m, contra HAP, contra FVIII, y contra LYS) se transfieren en masa^ como una mezcla de los seis constructos de vector en vectores para expresión en mamífero lo que resulta en una mezcla de seis vectores de expresión distintos . El procedimiento experimental respecto a la transferencia de masas sigue el procedimiento que se describe en (d.l) con la excepción de que se realiza en masa, es decir, la totalidad de los seis GOI (que incluyen a las cadenas pesadas variables , que incluyen al cásete promotor cabeza a cabeza y las cadenas ? completas) se transfieren simultáneamente como una mezcla de los seis vectores fagemidos . Preparaciones de los plásmidos de la biblioteca mini seis La preparación plasmídica 1 se refiere a una preparación plasmídica de una mezcla de seis vectores fagemidos (con las secuencias codificantes de anticuerpo contenidas en el vector pSymvclO) . La preparación plasmídica 2 se refiere a una preparación plasmídica de seis vectores fagemidos con las secuencias codificantes contenidas en el vector pSymvcl2 después de la etapa 1 de transferencia de masa (véase figura 4C) , lo que resulta en un cambio de los promotores procarióticos con los constructos de cásete de promotor de mamífero . La preparación plasmídica 3 se refiere a una preparación plasmídica después de la etapa 2 de transferencia de masa (véase figura 4D) lo cual proporciona intercambio de la cadena pesada variable, el cásete promotor cabeza a cabeza y la cadena ? completa a partir de pSymvcl2 al vector de expresión de mamíferos (pSymvc21), y por lo tanto permite la expresión de seis anticuerpos seleccionados como anticuerpos IgGl de ratón de longitud completa. Determinación de genotipo de células TGl transformadas con preparaciones plasmidícas utilizadas en la transferencia de masas Las células TGl se transforman con la biblioteca mini seis a granel por electroporación y después de incubación durante la noche en placas 2xYT (Sigma Y 2627) , se toman colonias individuales. En cada experimento se toman 180 colonias y se incuban en formatos de 96 pozos en medio líquido 2xYT durante 4 horas. Las alícuotas de los cultivos se diluyen con agua, se desnaturalizan y utilizan como plantilla en PCR. En todos los experimentos, la cadena pesada variable se amplifica. Las secuencias de cebador para los vectores fagemidos (tipo pSymvclO) son: 5 ' -GCATTGACAGGAGGTTGAGGC-3 ' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO 2) y 5 ' -GCTGCCGACCGCTGCTGCTGGTC-3 ' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO 3) Los cebadores para vectores con cásete de promotor de mamífero son (tipo pSymvcl2) : 5 ' -GCATTGACAGGAGGTTGAGGC-3 ' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO 4) y 5 ' -GTGTCCACTCTGAGGTTCAG-3 ' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO 5) Los cebadores para los constructos pSymvc21 son: 5 ' -CAAATAGCCCTTGACCAGGC-3 ' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO 6) y 5 ' -GTGTCCACTCTGAGGTTCAG-3 ' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO 7) Todos los productos de PCR se digieren tanto con Nlalll y Hinfl para asegurar la determinación inequívoca del genotipo. Los fragmentos de digestión se analizan por electroforesis en gel de agarosa y se visualizan las bandas por tinción con EtBr. El número de genotipos individuales recordados por el patrón de fragmentos determinado por RFLP corresponde al número de colonias individuales que representan cada una de los seis anticuerpos entre el número total de colonias tomadas . (d.2a) Transferencia de masa del vector fagémido a un vector de mamífero después de amplificación de ADN en células de E. coli (método de amplificación en dos etapas) . Se prepara la preparación plasmídica una de cada uno de los seis concentrados de glicerol de E.. coli TG1 que contienen uno de los seis vectores fagémidos que constituyen la biblioteca mini seis. Los concentrados se propagan individualmente y después de normalización hasta D06oo para el número de E. coli, los seis cultivos se mezclan en cantidades iguales y se utilizan para preparación de plásmido lo que resulta en la preparación plasmídica 1. La distribución de genotipo de los seis vectores fagémidos en la preparación plasmídica 1 se prueba por transformación en células TGl electrocompetentes y análisis subsecuente por RFLP. En la figura 5 se muestra la distribución de los diferentes genotipos en células TGl . La preparación plasmídica 1 que comprende al vector fagémido policlonal que expresa una mezcla igual de los seis genotipos de fragmentos Fab seleccionados se digiere con SacT/Xhol. Después se inserta por ligación el cásete promotor cabeza a cabeza (promotor CMV/promotor MPSV) . Se prueba la distribución de genotipo de los vectores después de intercambio de promotor en el vector en células TGl después de transformación con ADN desde la etapa de ligación (figura 6) . Las células se siembran en placa y se hacen crecer sobre placas de agar grandes (245 m x 245 mm) 2x YT y se prepara la preparación plasmídica 2 para generar el vector fagémido que ahora contiene el cásete -promotor cabeza a cabeza (pSymvcl2) . A partir de la preparación plasmídica 2, la secuencia codificante de cadena pesada variable, que incluye el cásete promotor y la secuencia de cadena ? completa se recorta del vector fagémido por digerido con Notl/EcóRl y se transfiere al vector (pSymvc20) que ya contiene los dominios de la región constante de IgGl de ratón. Esto resulta en una colección de vectores pSymvc21, los cuales expresan la región variable de seis clones de anticuerpo seleccionados como anticuerpos IgGl de ratón de longitud completa. La transferencia de promotor alternativamente se puede realizar en el vector de mamífero que codifica para un isotipo, inversión de la orden de digerido de restricción comenzando con Notl/EcoRI para transferencia del ADN de interés al vector de mamífero después fragmento de digerido de restricción Sacl/Xhol para inserción de la región promotora. La distribución de genotipos después de transferencia de la secuencia codificante de cadena pesada variable, el cásete promotor y la secuencia codificante de la cadena ? completa dentro del vector de expresión se prueban por transformación de células TGl con ADN de la segunda etapa de ligación (figura 7) . Las células se siembran en placas sobre placas de agar grandes (245 mm x 245 MI) 2X YT y se prepara la preparación plasmídica 3 (pSymvc21) , en la cual la región variable de los seis clones se expresa en el contexto de la infraestructura de anticuerpo IgGl de ratón. Se puede utilizar la preparación plasmídica 3 para la transfección a granel de células de mamífero a velocidad de gen de una línea de célula productora poli-clonal .recombinante para la expresión de anticuerpo policlonal recombinante. Los resultados de la transferencia de masas a partir del vector fagémido a un vector de mamífero que codifica para isotipo después de amplificación de ADN en células E. coli, muestra que es posible obtener una distribución equilibrada de los seis constructos de vector después de que se han propagado individualmente y se han mezclado (preparación plasmídica 1, figura 5) . Los seis constructos, después de intercambio del cásete promotor (preparación plasmídica 2, figura 6) así como después de la inserción en el vector que codifica para isotipo IgGl de ratón (preparación plasmídica 3 , figura 1 ) son todos detectables a niveles comparables . (d.2b) Transferencia de masa de un vector fagémido a un vector para expresión de mamíferos sin amplificación de ADN en E. coli, después de la etapa de preparación plasmídica 1 (método de amplificación de una etapa) . El ADN de la preparación plasmídica 1 (aguí se utilizan 25 \ig) que comprenden el vector fagémido policlonal (pSymvclO) que expresa una mezcla igual de los seis genotipos de fragmento Fab seleccionados se digiere con Sacl/Xhol para intercambio de promotores. El fragmento vector Sacl/Xhol se purifica y liga con un cásete promotor cabeza a cabeza (promotor CMV/promotor MPSV) . Después del intercambio de promotores sin realizar ninguna amplificación, el vector con el cásete promotor CMV/MPSV se digiere con Notl/EcóRI para recorte de la región completa con la secuencia que codifica para la cadena pesada variable, que incluye el cásete promotor y la totalidad de la secuencia codificante de la cadena ? a partir del vector fagémido para transferencia de masa en un vector para expresión de mamífero. Después de ligar el fragmento Notl/EcoRl que codifica para la cadena pesada variable, el cásete promotor y la cadena ? dentro de un vector que codifica para IgGl de ratón (pSymvc20) , se obtiene un vector de expresión el cual expresa la región variable de los seis clones seleccionados en el contexto de los anticuerpos de longitud completa de IgGl de ratón. En la figura 1 se ilustra la composición de este vector de expresión. Después de que la transferencia de masas resulta en intercambio de promotor en el vector y la transferencia de las secuencias nucleotídicas que codifican para la cadena pesada variable, el cásete promotor y la cadena ? completa dentro de un vector para expresión de mamífero, se prueba la distribución de genotipos por transformación de células TG1 con un plásmido de la segunda etapa de ligación. Las células s.e siembran en placas sobre placas grandes de agar 2xYT (245 MI x 245 mm) 2xYT y se prepara una preparación plasmídica de esta preparación plasmídica de digestión doble/ligación (vector pSymvc21, en el cual la región variable de los seis clones se expresa en el contexto de anticuerpos IgGl de ratón, que corresponden ..a. la preparación plasmídica 3 de d.2a). La distribución de genotipo en células TG1 después de transformación con la preparación plasmídica a partir del método de amplificación de una etapa se muestra en la figura 8.

El método de amplificación de una etapa puede introducir cierto mezclado entre las cadenas pesada y ligera a partir de seis secuencias que codifican para Fab lo que resulta de la generación de productos de ligación no deseados, los cuales normalmente se omiten durante la amplificación en E. coli. No obstante, si se produce tal mezclado, se puede introducir una etapa de cribado para asegurar que se mantiene diversidad clonal suficiente. (d.2c) Transfección directa de células de mamífero posterior al intercambio de promotor El producto de las preparaciones plasmídicas de la biblioteca mini seis ya sea por el método de amplificación de dos etapas o por el método de amplificación de una etapa se puede utilizar directamente para transfectar células de mamífero a granel para expresión de anticuerpo policlonal recombinante. (d.3) Prueba de las células de mamífero transfectadas Se puede utilizar la combinación conocida de anticuerpo del sistema de modelo policlonal mini seis para probar y asegurar que se ha producido la transferencia de masa y transfección en células de mamífero por una manera que mantiene la diversidad clonal y sin introducir desviaciones en la composición de los genotipos de secuencia variable de anticuerpo durante la transfección y cultivo subsecuente. Los métodos por medio de los cuales la composición genotípica se monitorea a través del procedimiento de transferencia de masas, transfeccion a granel y expresión de mamífero pueden comprender a los siguientes : Secuenciado de ADN de los clones aislados - Análisis de RFLP de los clones individuales ELISA de la mezcla de anticuerpo producida Espectrometría de masas de la mezcla de anticuerpos producida PCR Taqman de la composición relativa de las secuencias genómicas y AR m que expresa las diferentes cadenas pesadas y ligeras Las desviaciones en la composición genotípica introducidas durante el procedimiento de transfeccion tienden a presentarse y pueden ser causadas por integración aleatoria o integrantes múltiples . Como se describe en la descripción detallada, no es probable que genere problemas cuando se utiliza una línea de células hospederas diseñada previamente para integración específica de sitio. No obstante, se puede controlar de diversas maneras. La selección contra integración en una ubicación genómica aleatoria (una ubicación diferente a la ubicación específica de sitio) se puede realizar utilizando cantidades muy pequeñas de ADN, por ejemplo de 1 µg/107 células cuando se realiza la transfeccion con Lipofectamine o de 0.2 pg/107 células cuando se realice la transfeccion por electroporación. Además, el ADN que se va a integrar se puede suministrar en forma superenrollada; una forma que se sabe no es favorable para la integración aleatoria. Las integraciones simples o múltiples fuera del sitio objetivo designado previamente se eliminarán por selección negativa, debido a que el marcador seleccionable estará presente en el genoma sin un promotor o un codón de inicio. De esta manera, los receptores de los sucesos de integración aleatorios no sobreviven al proceso de selección. Los transformantes que tienen integraciones múltiples en donde uno de los sucesos de recombinación se producen en el sitio objetivo sobrevivirán al proceso de selección; no obstante, la probabilidad de este tipo de integraciones múltiples es muy baja. Por lo tanto, este evento puede generar un mezclado mínimo de la proteína policlonal . Además, debido a que pueden existir 100 a 1000 otros clones que codifiquen para la misma proteína policlonal recombinante, incluso si la expresión ectópica es alta, el efecto de mezclado puede ser menor de aproximadamente 1% si se producen integraciones múltiples. Como se ha mencionado previamente, la probabilidad de integración ectópica se puede reducir al reducir la cantidad de ADN utilizado en el método. El suceso con menos probabilidad es una integración múltiple en tándem en el sitio objetivo. Utilizando el sistema de reco binasa Flp descrito aquí, este tipo de suceso será raro debido a la actividad de corte del . cromosoma la cual es significati amente mayor que la actividad de integración. No obstante, si se produce la integración en tándem a una frecuencia inaceptablemente alta, se puede cambiar el sistema Flp por uno en el cual únicamente es posible solo una copia única del inserto (véase, por ejemplo, el documento WO 99/25854; incorporado como referencia) . (e) Expresión de los seis anticuerpos distintos en combinación conocida en células de mamífero De manera general, con el fin de minimizar las velocidades de proliferación variable, es preferible integrar cada GOI específico (en este caso, cada miembro individual de la biblioteca mini seis) en por lo menos 100, preferiblemente 1000 y de manera más preferible en 10000 células. Una línea de células policlonales gue contiene una gran cantidad de células individuales que expresan el mismo GOI (para la totalidad de los GOI) se espera estadísticamente que esté menos alterada por diferencias en las velocidades de proliferación de células individuales y que tenga una posibilidad reducida ' de desviación en la composición de proteína policlonal final. Además, puede ser una ventaja asegurar una línea de células hospederas homogéneas para la expresión. Esto se puede llevar a cabo por subclonación de la línea de células hospederas antes de la transfección. Este procedimiento se describe en el párrafo respecto a la diversidad clonal . Para bibliotecas policlonales en las cuales es deseable un mayor control de desviación, la composición final del producto proteínico policlonal se puede controlar al introducir un elemento de control transcripcional inducible dentro de la plataforma de vector de expresión. Los elementos de control inducibles adecuados incluyen, por ejemplo, el encendído/apagado de BD Tet (BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ) y el Gene Switch (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Estos interruptores de transcripción se pueden inducir en un punto en el tiempo apropiado (por ejemplo, cuando el acumulado de las células se ha expandido por completo) para minimizar cualquier desviación de proliferación debida a la variación en la expresión de genes o el producto proteínico. El presente experimento no se realiza con tales elementos de control. Después de transferir los seis GOI seleccionados desde el vector fagémido a los vectores de expresión del mamífero, ya sea individualmente como se describe en (d.l) o por transferencia de masa como se describe en (d.2), los vectores de expresión de mamífero se utilizan para transfección en un punto caliente en una línea de células CHO-Flp-In mediante la utilización de integración de sitio específicapara expresar seis anticuerpos distintos como se describe en lo siguiente. Para el GOI transferido individualmente (d.l), el ADN plasmídico se propaga individualmente y se utiliza para transfección individual en células CHO Flp-In o en los concentrados TGl cuando se propagan individualmente, y después de la normalización de D06oo para los números de células de E. coli, los seis cultivos se mezclan y se utilizan para preparación plasmidica. Esta preparación plasmídica contiene los seis genes de interés que se utilizan para transfección a granel de células de mamífero para la expresión de anticuerpo policlonal recombinante. Para la GOI sometida a transferencia de masas (d.2a o d.2b) el ADN plasmídico ya se ha transfectado en células CHO-Flp-ln o se ha amplificado y purificado (Preparación plasmídica 3) de acuerdo con el procedimiento descrito en (d.2a o d2.b) y después se utiliza para transfección a granel. (e.1) Cultivo celular La línea de células hospederas CHO Flp-In (Invitrogen, Carlsbad, CA) se mantiene en medio F-12 de Ham con la adición de glutamina 2 mM, y FCS (10%) y 100 pg/ml de Zeocina (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Para el subcultivo, las células se separan por tratamiento con tripsina y se dividen de acuerdo con las instrucciones del- fabricante. Las células se hacen crecer a C02 5%, 37aC. El medio y los aditivos de medio son de Gibco. La línea de células expresa de manera estable el gen de fusión lacZ-Zeocina, volviendo a las células resistentes al antibiótico Zeocina, una resistencia que, ante la integración de sitio específicade un gen extraño se perderá. Las células contienen una copia única del sitio objetivo de recombinación Flp (FRT) , y de esta manera están listas para ser utilizadas como una línea de células · hospederas para la integración dirigida al sitio mediante el uso del sistema Flp-In (Invitrogen, Carlsbad, CA) . (e.2 ) ransfeccion de células CHO Se inoculan a placas de cultivo de tejido con 6 pozos, con 4.0 x 105 células CHO-Flp-In/pozo y se incuban durante la noche a 37aC/C02 5%. La transfeccion de estas células se realiza probando diferentes métodos de transfeccion utilizando (Roche) , Lipofectina1®, LipofectAmine"11, o LipofectAMINE 2000m (Gibco) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. En este ejemplo se utiliza lipofectAMINE 2000MR como reactivo de transfeccion. Brevemente, en el día antes de la transfeccion, se siembran para crecimiento exponencial células CHO-Flp-In como se describe en lo anterior y se incuban durante la noche a 372C/C02 5%. Los pozos con una confluencia de células de 85-95% se utilizan para la cotransfección. Se preparan dos tubos con los siguientes contenidos : Tubo 1: 0.5 µg de un vector de expresión individual con GOI descrito en (d.l) (por ejemplo, pSymvc21 con OVA) +· 4.5 µg de mp040 (una maxipreparación de pOG44) (un plásmido que expresa recombinasa Flp) que se agrega a 250 µ? de Optimem (tubos Eppendorf de 1.5 mi). Tubo 2: Se agregan 7.5 µ? de LipofectAMINE 2000^ a 250 µ? de Optimem (Tubos Eppendorf de 1.5 mi) y se incuba a temperatura ambiente (T.A.) durante 5 min. El contenido del tubo 2 se transfiere al tubo 1 seguido por incubación a T.A. durante 20 min. Los complejos de ADN-Lipofectamine se transfieren a los pozos con celdas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de 24 h, las células se separan por tripsina, se dividen (1:3) y se distribuyen en un matraz T-25 y en cajas de petri de 100 mm y se cultivan en una mezcla nutritiva fresca F-12 Ham + FCS 10% + medio L-glutamina 2 mM con 900 g de higromicina B/ml, como presión de selección. (e.3 ) Selección de integrantes específicos de sitio y subcultivo de células transfectadas Las células se- cultivan bajo presión de selección con higromicina B durante dos a tres semanas, en este período las células se refrescan cada 2 a 4 días con medio nuevo que contiene la misma concentración del agente de selección. El acumulado sobreviviente de células en el matraz T-25 y en cajas de Petri se separa por tripsina, se divide (1:6) y se distribuye en matraces T para propagación adicional bajo la presión de selección mencionada antes . Se toman algunos clones únicos (utilizando lo que se denominan cilindros de clonación) de las cajas de Petri que contienen los transfectantes generados de acuerdo con el método que se describe en (d.l), y se transfieren a pozos nuevos para propagación y uso de estudios del nivel de expresión. Cada acumulado de células o clones únicos que es resistente a la concentración límite de higromicina B posteriormente se hace crecer hasta confluencia en placas de 6 pozos, se vuelve a sembrar en placas en cajas de Petri, matraces T-25, T-80 y T-175 en su medio respectivo más higromicina B. Cuando las células con crecimiento exponencial alcanzan 80% de confluencia en matraces de cultivo de tejido T80, los frascos de cada línea de células se congelan y almacenan en un congelador de nitrógeno líquido N2 (L) . Para transfección con una mezcla de plásmidos que contienen los seis genes de interés (la biblioteca mini seis) , los seis cultivos individuales se normalizan a una D06oo para los números de E. coli, mezclados y utilizados para una preparación plasmídica policlonal que contiene los seis genes de- interés . Un procedimiento de transfección que utiliza 7.5 veces tantos reactivos y células como los que se describen en lo anterior se lleva a cabo, lo que produce una línea de células policlonales recombinantes que expresan una mezcla de seis anticuerpos -distintos. Las seis líneas de células que expresan miembros individuales de los anticuerpos seleccionados y la línea de células que expresa la mezcla de los seis anticuerpos distintos en donde, durante el cultivo y propagación probado para la producción de anticuerpos por medio de la prueba de ELISA específica para antígeno. (f) Vigilancia de la composición de una línea de células policlonales que expresa seis anticuerpos distintos de combinación conocida Al generar una mezcla de los seis genes seleccionados de interés adecuados en vectores de expresión seguidos por una transfeccion a granel e integración de sitio específicadentro de CHO-Flp-In en células, se genera una línea de células policlonales que expresan seis anticuerpos distintos . La línea celular es seguida durante 34 días en el cual se hace un seguimiento de la distribución del genotipo, expresión de anticuerpo y velocidades de proliferación. Los resultados se describen en lo siguiente. (f .1).Distribución del genotipo de los seis genes seleccionados de interés en células CHO-Flp-In transfectadas con la preparación plasmídica a partir de una mezcla normalizada en ??e?? de células. La línea de. células CHO-Flp-In policlonal se somete a tripsinización y la suspensión celular se diluye a 10 células/ml. Posteriormente se transfieren 200 µ? de cada pozo de un total de 10 placas de 96 pozos. Aproximadamente 10 días después, se identifican por microscopía los pozos con colonias únicas. Los pozos con colonias únicas se lavan Ix en PBS y se agregan 50 µ? de. agua. Las placas se incuban a 802C durante 10 min y los lisados se transfieren a otra placa de 96 pozos. Se utilizan 10 µ? de los lisados en 25 µ? de OneStep RT-PCR (Qiagen) con los siguientes cebadores: 5 ' CAAATAGCCCTTGACCAGGC-3 ' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 6) y 51 -GTGTCCACTCTGAGGTTCAG-31 (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 7) Se realiza RFLP utilizando Hinfl y NZalII en 10 µ? de mezclas RT-PCR y 15 µ? de reacciones que se incuban a 37 aC durante 2 horas . Los fragmentos de digestión se visualizan utilizando electroforesis en gel de agarosa seguido por tinción con EtBr del gel . La distribución del genotipo de las células que producen contra OVA, contra AP, contra B2m, contra HAP, contra FVIII y contra LYS es seguido con respecto al tiempo (días 16 y 34 después de la transfección) , véase la figura 9. (f.2) ELISA de las muestras derivadas de células CHO-Flp-In transfectadas con la preparación plasmídica a partir de la mezcla normalizada a D050o de E. coli, (d.l) La línea de células policlonales CHO-Flp-In (e.3) se tripsiniza y se siembran en placas 3' x 106 células en matraces T-75 en HAM F-12 + FCS 10% + L-glutamina 2 ii y 900 g de higromicina. Se cambia el medio cada día y al día 3 se seleccionan los sobrenadantes por ELISA. Los antígenos (microglobulina ß2 (un regalo de la Universidad de Copenhague) , fosfatasa alcalina (Sigma) , ovalbúmina (Sigma) , factor VIII (un regalo de Novo Nordisk, Dinamarca) , lisoziirta de clara de huevo de gallina (Sigma) y haptoglobina (Sigma) ) se diluye en amortiguador carbonato 50 mM a 10 µg/ml. Las placas de ELISA se recubren con antígeno (50 µ? a cada pozo) y se incuban durante la noche a 42C. Los pozos se lavan cuatro veces con amortiguador de lavado (lx PBS/0.05% Tween 20) y se bloquean durante 1 hora con polvo de leche desnatada 2% en amortiguador de lavado (100 µ? a cad pozo) . Se agregan muestras de 50 µ? a los pozos y las placas se incuban durante 1 hora a t.a. Las placas se lavan 4x y se agregan anticuerpos secundarios (conjugado de chivo contra IgG de ratón/HRP (Sigma) ) durante 1 hora seguido por lavado 4x. Se desarrolla la prueba de ELISA con sustrato TMB (50 µ? en cada pozo, DA O S1600) durante 5 minutos y las reacciones se detienen al agregar 50 µ? de H2SO4 1 M. Las placas se leen de inmediato a 450 nm. Los datos que demuestran la expresión de la totalidad de los seis anticuerpos de interés en lisados derivados en el día 34 posterior a la transfeccion con la mezcla de vectores de expresión que codifican para los seis genes de interés se muestran en la figura 10. Debe hacerse notar que dado que los datos presentados en la figura 10 se derivan de seis ensayos de ELISA específicos de antígeno diferentes, las lecturas de DO450 no son comparables directamente en términos de cantidad de anticuerpo. Los niveles de expresión de anticuerpo se analizan adicionalmente por medio de ELISA de recubrimiento contra en acumulados de células CHO-Flp-In transfectados con cada GOI individual o la mezcla de seis GOI . El resultado se muestra en la figura 11. Esto muestra que los niveles de expresión de anticuerpo son comparables entre líneas de células transfectadas individualmente (por ejemplo una línea celular transfectada con un vector que codifica contra ß2?? expresa una cantidad comparable de anticuerpo comparada con una línea celular transfectada con un vector que codifica para anticuerpo contra AP) . El término acumulados de células CHO-Flp- n transfectadas con GOI individual, se utiliza aquí debido a que las líneas de células individuales no se derivan de clones únicos, sino acumulados de clones como se describe en e.3. (g) Conclusiones del experimento En primer lugar, estas evaluaciones (pruebas) de la conservación de la policlonalidad en el sistema de elaboración muestran que la transferencia de masa de los seis genes seleccionados de interés de la biblioteca mini seis (que codifican contra OVA, contra AP, contra p2m, contra HAP, contra FVIII y contra LYS) a partir de los vectores fagémidos en vectores de expresión de mamífero es posible sin la introducción de desviación de selección o de proliferación (figura 7) y de esta manera terminan con frecuencias comparables de los seis genes seleccionados de interés . En segundo lugar, la transfección a granel de las células CHO-Flp-In con una mezcla de los constructos que contienen los seis genes seleccionados de interés también resulta en una distribución comparable de los constructos en células de mamífero aisladas. Las distribuciones de genotipo de los seis genes seleccionados de interés con respecto al tiempo (día 16 y 34 después de la transfección) también son similares (figura 9) , lo que indica que el sistema de expresión hasta el día 34 mantiene una distribución igual original de los seis genotipos sin introducir desviación de proliferación. En tercer lugar, las células transíectadas a granel con la mezcla de los seis genes de interés mostraron la expresión de la totalidad de los seis anticuerpos, como se examina por la prueba de ELISA específica para antígeno sobre los sobrenadantes de las células 34 días después de la transfección (figura 10) . Los resultados de ELISA para los antígenos diferentes no son comparables directamente en términos de cantidades de anticuerpo debido a las diferentes afinidades de unión. No obstante, una captura de ELISA en base en el recubrimiento con anticuerpo de chivo contra cadena ? de ratón realizada sobre los sobrenadantes a partir de a) las seis líneas de células CHO-Flp-In transfectadas individualmente generadas utilizando la preparación de vector como se describe en (d.l) y b) en sobrenadantes de la línea de células policlonales que expresan una mezcla de los seis genes seleccionados de interés muestran niveles de expresión de anticuerpo comparables a partir de los seis genotipos . En resumen, se ha demostrado que es factible transferir un GOI policlonal en masa desde un vector fagémido a un vector de expresión de mamífero . Esto ha sido descrito previamente por Sharon (documento de E.U.A. 5,789,208). Además, una mezcla de constructos de expresión de mamífero pueden ser transfectados en células de mamífero a granel y se pueden mantener a una frecuencia comparable por lo menos hasta el día 34 posterior a la transfección. EJEMPLO 3A Evaluación de la conservación de la policlonalidad en cultivos celulares generados por transfección a granel de un subclon de la línea celular CHO-Flp-In con la biblioteca mini seis. (a) Subclonación de la línea celular CHO-Flp-In "original " . La línea celular CHO-Flp-In original (Invitrogen) se cultiva como se describe (Ejemplo 3, sección e.l) . Después de tripsinización las células se cuentan y se siembran en placa con una célula por pozo en placas de cultivo de 96 pozos. Aproximadamente 14 días después 20 pozos con colonias solas se identifican y las células se someten a tripsinización y se transfieren a placas de 24 pozos. Uno de los subclones, CHO-Flp-In clon 019, se selecciona para estudios posteriores después de caracterización de comportamiento de crecimiento así como niveles de expresión. (b) Transfección a granel y selección de células CHO-Flp-In clon 019 La transfección se realiza en triplicado, y la selección de las células CHO-Flp-In clon 019 es realizada esencialmente como se describe (Ejemplo 3, sección e.2 y e.3), con la excepción de que el marcador de selección de neomicina sustituye al marcador de higromicina en pSymvc21 (figura 4.e) . En consecuencia, se utiliza geniticina (450 µg/ml) en vez de higromicina B durante la selección y cultivo de las células . (c) ELISA de las muestras obtenidas de células CHO- Flp-In clon 019 transfectadas a granel con la biblioteca mini seis . Las células se cultivan durante 73 días posterior a la transfección y se toman muestras de ELISA los días 17, 31, 45, 59 y 73. Se realiza una prueba de ELISA cuantitativa (utilizando anticuerpos mini seis purificados individualmente como estándares), como se ha descrito (Ejemplo 3, sección f.2). En las figuras 12A-12C se muestran los resultados de tres transfecciones independientes. Se observan perfiles de expresión diferentes entre las diferentes transfecciones . No obstante, la totalidad de los seis anticuerpos son detectables en todos los experimentos hasta el día 59. (d) Conclusión del experimento Los experimentos con el sistema de selección de neomicina en células CHO-Flp-In clon 019 muestra perfiles de expresión relativamente conservados de lotes individuales, para dos meses después de la transfección a granel (figuras 12A-12C) . Tal período de estabilidad es suficiente para propósitos de fabricación. La variación de un lote a otro que se observa puede relacionarse con la generación y acumulación de una concentración de congelación grande del lote individual antes de la producción. EJEMPLO 3B Evaluación de la conservación de policlonalidad en cultivos celulares generados al mezclar células CHO-Flp-In clon 019 transfectadas individualmente después de la selección. (a) Transfección y selección individual de células CHO-Flp-In Los procedimientos experimentales para la generación de seis líneas celulares que expresan los miembros individuales de la biblioteca mini seis se ha descrito previamente (Ejemplo 3, sección e.3). Las seis líneas de células que expresan miembros individuales de la biblioteca mini seis se mezclan inmediatamente después de la selección en números iguales (5 x 105 de cada línea celular) y la población de células mixtas se cultiva durante 85 días. Se realizan tres mezclas separadas a partir de las líneas de células individuales . (b) ELISA de muestras obtenidas a partir de cultivos de células policlonales generadas en el inciso (a) Se toman muestras cada 15 días y la composición de los anticuerpos que se expresan a partir de la biblioteca mini seis se determina por ELISA como se ha descrito (Ejemplo 3, sección f .2) . Se realiza la prueba de ELISA los días 8, 17, 30, 45, 57, 72 y 85 después del mezclado. En la figura 13 se muestran los resultados (media ± SD (desviación estándar) de experimentos por triplicado) . La totalidad de los seis anticuerpos fueron detectables 85 días después del mezclado. Como se mencionó previamente (Ejemplo 3, sección f.2), las lecturas para los diferente anticuerpos no es comparable directamente pero los datos presentados en la figura 3 muestran perfiles de expresión relativamente estables por lo menos hasta el día 45 después del mezclado, después de lo cual se observa un descenso general en la productividad. Además, la comparación de los resultados obtenidos de tres mezclas independientes muestra perfiles de expresión similares con respecto al tiempo de los anticuerpos mini seis, lo que indica que los resultados son reproducibles . (c) Conclusión de los experimentos Los cultivos de células policlonales constituidos de mezclas de células transfectadas individualmente con distintos miembros de la biblioteca mini seis muestran conservación de composición por lo menos hasta el día 45 después del mezclado. Una conservación de composición por 45 días en la mayor parte de los casos será un tiempo suficiente para propósitos de fabricación. Además, experimentos por triplicado proporcionan resultados similares, y de esta manera se indica que el mezclado de las células transfectadas individualmente con constructos diferentes resulta en cultivos de células mezcladas con poca variación de un lote a otro. EJEMPLO 4 Establecimiento de una línea de células productoras de anticuerpo policlonal recombinante contra ovalbúmina (a) Expresión de una composición de anticuerpo policlonal contra ovalbúmina Se ha identificado como sigue una colección de clones de fago que unen ovalbúmina completamente caracterizados. Se inmunizan i.p. y s.c. a ratones BalB/c de 48 semanas de edad, hembras, con 50 ]ig de OVA en adyuvante completo de Freund y se refuerzan con OVA en adyuvante incompleto de Freund los días 21 y 42 después del día 0 de inmunización, se confirma que todos los animales tienen suero convertido contra OVA, determinado por una prueba de ELISA específica para antígeno. Se extirpan los bazos de los ratones que responden mejor los días 31 y 52. Las bibliotecas de los fagémidos que muestran Fab se generan a partir de ARN del bazo utilizando un vector fagémido (SymvclO) como se ha descrito previamente. Las bibliotecas resultantes contienen aproximadamente 105 clones independientes. La selección de estas bibliotecas se realiza al hacer reaccionar 5 x 1011 fagémidos que muestran Fab con inmunotubos recubiertos con OVA o NUNC, seguido por lavado con elución ácida de fagos de unión. Conforme los silbatos de la primera ronda de panoramización contienen una proporción significativa de aglutinantes de OVA, los eluatos de la primera y segunda rondas de panomarizacion se criban para determinar los clones de fago que unen OVA. Inicialmente, los clones de fagos reactivos a OVA se identifican por ELISA. Brevemente, se recubren placas de ELISA con OVA y se hacen reaccionar con Fabs que muestra fago, seguido por un anticuerpo secundario -conjugado a HRP. Para controles negativos, se utilizan antígenos no relacionados (BSA) o Fab que muestran fagos no relacionados (contra AP) . Además se establece un método de HDS que se basa en la inmovilización de OVA sobre membranas de PVDF. Estos dos métodos resultan en la identificación de un subconjunto separado de clones, es decir, algunos clones que reconocen OVA en un ambiente y no en el otro y viceversa. Para los clones de fago que muestran Fab que reaccionan con OVA ya sea por ELISA o HDS, la secuencia nucleotídica que codifica para el dominio variable de VH se determina por secuenciado de ADN, y se calcula la diversidad genética por análisis filogenético utilizando el paquete de software vector NTI. El panel resultante incluye clones que unen OVA 127, para la totalidad de los cuales se ha establecido las secuencias nucleotídicas de la parte variable de VH. Los fragmentos de Fab expresados por los clones que unen OVA 127 tienen todos la capacidad de unirse a ovalbumina en forma ya sea nativa o desnaturalizada. A partir de este conjunto hemos identificado aproximadamente 30 clones diferentes contenidos en un vector fagémido, por ejemplo pSymvclO, para ser utilizados para transferencia de masa y expresión en mamíferos . Estos anticuerpos se expresan ya sea en forma de anticuerpos de ratón IgA, IgG2A o IgG2B. Debido a que han sido caracterizados completamente, las secuencias de ADN de estos clones productores de anticuerpo hemos sido capaces de vigilar la distribución de los genotipos a través de la transferencia de masa y el procedimiento de expresión en mamífero utilizando los mismos métodos a los utilizados para el sistema de modelo con los seis anticuerpos distintos descritos en el Ejemplo 3. (b) Transferencia de masa de las secuencias de anticuerpo específicas para OVA a un vector para expresión en mamífero La transferencia de genes de interés a partir de un vector fagémido a un vector de expresión es un procedimiento de dos etapas (que se ilustra en la figura 4) , en donde en la primera etapa, es el intercambio de promotores con el cásete promotor con una orientación cabeza a cabeza de los promotores de mamífero seleccionados, esto es seguido por transferencia de la región variable de los genes de interés y el cásete promotor a un vector de expresión. El cásete promotor cabeza a cabeza (promotor A/promotor B) se puede insertar dentro del vector fagémido de cada clon mediante la utilización del digerido Sacl/xhol seguido por una ligación que resulta en un intercambio de promotores del promotor bacteriano al de mamífero (pSymvcl2) . Un digerido de EcoRI y Noti después moverá las secuencias que codifican para la cadena pesada variable, el cásete promotor cabeza a cabeza (promotor A/promotor B) y la cadena ? completa del vector fagémido (pSymvcl2) (en un vector que codifica para isotipo, pSymvc20. El vector pSymvc20 puede aceptar cualquier fragmento Notl/EcoRX de un vector fagémido. Este fragmento puede transferir la secuencia que codifica para la cadena pesada variable para conectarla con las secuencias de cadena- pesada constante en pSymvc20 así como la totalidad de la secuencia que codifica para la cadena ? que se va a conectar con una secuencia poliA bGH. Esta transferencia de masa resultará en vectores de expresión como se muestra en la figura 1, los cuales expresan las regiones pesadas variables y la totalidad de las cadenas ? como anticuerpos de ratón IgG2B después de la transferencia de masa. El vector, pSymvc20, puede contener las regiones constantes de ratón de la cadena pesada de los genes IgA, IgG2A, IgG2B, IgE o IgGl y por lo tanto es capaz de expresar cualquiera de los isotipos de inmunoglobulina de ratón pertinentes de elección. (c) Expresión de un anticuerpo policlonal recombinante contra ovalbúmina Mediante transferencia de masa, las secuencias que codifican para la región variable de la cadena pesada de los promotores y la totalidad de la cadena se mueven de una biblioteca de vector de fago a los vectores codificantes de isotipo que resultan en una composición de vector de expresión de mamífero policlonal. Esto es seguido por transfección e integración de sitio específicadentro de una línea de células CHO-Flp-In, lo que genera una línea de células productoras de anticuerpo policlonal . recombinante. Esta última línea de células se genera al dirigir el gen de interés que codifica para cada miembro de la proteína policlonal recombinante dentro de la misma ubicación específica en el genoma de cada célula transfectada, y al mismo tiempo integra únicamente una copia del constructo de expresión que contiene la secuencia de ácido nucleico en cada célula transfectada . Los cultivos de células y el procedimiento de transfección y selección es el mismo al descrito en el Ejemplo 3 (e.l-e.3) . (d) Estabilidad de la composición de -vigilancia Para asegurar que la transferencia de masa y la transfección en células de mamífero se produce sin introducción de polarización considerable con respecto a la clonación, expresión y diversidad entre los clones individuales, el proceso de transferencia de masa y la expresión de mamíferos se puede vigilar con los siguientes métodos . 1) Análisis de tiempo de generación de los acumulados de células a partir de cada constructo transfectado, 2) Análisis de nivel de expresión de los acumulados de células a partir de cada constructo transfectado, 3) Análisis por RFLP sobre células solas, 4) ELISA de la mezcla de anticuerpos producida, 5) Espectrometría de masas de la mezcla de anticuerpos producida, 6) Análisis por PCR Taqman (PCR en tiempo real) sobre un tamaño de lote definido utilizando cebadores específicos de región V para identificar la proporción de cada clon diferente, o 7) Análisis del lote con respecto al tiempo cultivado con y sin presión de selección (higromicina) que se puede realizar para los siguientes parámetros : a) distribución clonal b) niveles de expresión de proteína (cantidad y distribución) c) estabilidad genómica d) efectos de adaptación a medio libre de suero . (e) Producción de una composición de anticuerpo policlonal recombinante contra ovalbúmina El anticuerpo policlonal recombinante que produce la línea de células CHO-Flp-In se hace crecer en diferentes sistemas de cultivo, que incluyen matraces de cultivo pequeños convencionales, fábricas de células multiestratificadas Nunc y biorreactores de alto rendimiento pequeños ( iniPerm, IN EGRA-CELLine) . Además, las líneas de células se adaptan a una suspensión libre de suero para cultivo subsecuente -en matraces giratorios , fibras huecas y biorreactores . El medio utilizado para hacer crecer las líneas de célula seleccionadas están libres de células, libres de proteínas o medios químicamente definidos, como se recomienda por el fabricante (ínvitrogen, B&D, Hyclone) . Los sobrenadantes de células unidas o en suspensión se cultivan sin selección (higromicina) y se recolectan. Los sobrenadantes recolectados se analizan y caracterizan como se describe (3f) . Se verifican los rendimientos de producción, la funcionalidad y la calidad de los anticuerpos producidos durante y después del crecimiento de las células bajo el lote de alimentación o condiciones de perfusión. Las células en suspensión se utilizan para inoculación de matraces giratorios más grandes o biorreactores . El anticuerpo policlonal de los sobrenadantes recolectados se purifica para uso posterior en estudios animales . Otras modalidades y usos de la invención serán evidentes para aquellos expertos en la técnica al considerar la especificación y la práctica de la invención que se describe en la presente. Se pretende que la especificación y los ejemplos se consideran únicamente como ejemplares, en donde el alcance verdadero y el espíritu de la invención está indicado por las reivindicaciones siguientes . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un método para generar una colección de células adecuadas como una línea de células de producción policlonal recombinante, caracterizado porque comprende: a) proporcionar una biblioteca de vectores que comprenden una población de secuencias de ácido nucleico variante, en donde cada uno de los vectores comprende: 1) una copia única de una secuencia de ácido nucleico diferente que codifica para un miembro diferente de una proteína policlonal que comprende miembros diferentes que unen un antígeno particular, y 2} una o más secuencias de reconocimiento de recombinasa; b) introducir la biblioteca de vectores en una línea de células hospederas, en donde el genoma de cada célula individual de la línea de células hospederas comprende secuencias de reconocimiento de recombinasa, hacer coincidir estas con el vector en iin sitio específico único en su genoma; c) asegurar la presencia en las células de una o más recombinasas de manera que las secuencias de ácido nucleico variantede la etapa (a) se integren de manera específica en el sitio en las células de la línea de células hospederas, en donde una o más de las recombinasas : i) se expresa por las células en las cuales se ha introducido la secuencia de ácido nucleico; ii) están codificadas operativamente por los vectores de la etapa a, iii) se proporcionan a través de la expresión de un segundo vector; o iv) se proporcionan a la célula como una proteína, y d) seleccionar células que comprenden una copia integrada de la biblioteca de las secuencias de ácido nucleico variante . 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína policlonal no está asociada artificialmente con la colección de células. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la proteína policlonal es un anticuerpo policlonal o un fragmento de anticuerpo. 4. El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la proteína policlonal es un receptor policlonal de linfocitos T o un fragmento de receptor de linfocitos T. 5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la biblioteca de vectores se introduce en la línea de células hospederas por transfección a granel de una colección de las células hospederas con la biblioteca de vectores. 6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la biblioteca de vectores se introduce en la línea de células hospederas mediante transfección semi a granel de alícuotas de las células hospederas con fracciones que comprenden 5 a 50 vectores individuales de la biblioteca de vectores, y las células se acomodan para formar una colección de células adecuadas como una línea de células productora policlonal recombinantes antes o después de la selección de la etapa (d) . 7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la biblioteca de vectores para la integración de sitio especificase introduce en la línea de células hospederas por transfección de las células hospederas por separado con miembros individuales de la biblioteca de vectores y las células se acumulan para formar una colección de células adecuada como una línea de células de producción policlonalrecombinantes antes o después de la selección de la etapa (d) . 8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la población de ácidos nucleicos variantes en la etapa (a) se aisla o identifica con la ayuda de un procedimiento de cribado que permite la identificación o aislamiento de ácidos nucleicos que codifican para la proteína que se une a un antígeno particular. 9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el procedimiento de cribado incluye una etapa de biopanoramización (examen y selección) y/o un ensayo de inmunodetección. 10. El método de conformidad con las reivindicación 8 ó 9, caracterizado porque el procedimiento de cribado se selecciona del grupo que consiste de presentación de fago, presentación de ribosoma, presentación de ADN, presentación de AR -péptido, presentación covalente, presentación de superficie bacteriana, presentación de superficie de levadura, presentación de virus eucariótico, ELISA y ELISPOT. 11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la biblioteca o las secuencias de ácido nucleico variantecomprenden por lo menos 3 secuencias de ácido nucleico variante . 12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque los miembros individuales de la biblioteca de secuencias de ácido nucleico variantese integran en un locus genómico predefinido único de células individuales en la colección de células, el locus es capaz de mediar el nivel de expresión alto de cada miembro de la proteína policlonal recombinante . 13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque cada secuencia distinta de ácido nucleico diferente comprende un par de segmentos de gen que codifican para un miembro de una proteína policlonal constituida de dos cadenas polipeptídicas diferentes . 1 . El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el par de segmentos de gen comprende una secuencia que codifica para una región variable de la cadena pesada de anticuerpo y una secuencia que codifica para la región variable de la cadena ligera de anticuerpo. 15. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el par de segmentos de gen comprende una secuencia que codifica para la región variable de la cadena . del receptor de linfocito T y una secuencia que codifica para la región variable de la cadena ß del receptor de linfocito T. 16. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el par de segmentos de gen comprende una secuencia que codifica para la región variable de la cadena ? del receptor de linfocito T y una secuencia que codifica para la región variable de la cadena d de receptor de linfocito T. 17. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la biblioteca de las secuencias de ácido nucleico variante comprende una diversidad que se presenta de manera natural que se localiza dentro de las secuencias de ácido nucleico variante. 18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la diversidad que ocurre naturalmente en las regiones CDR presentes en secuencias de ácido nucleico variante . 19. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la colección de células se deriva de una línea de células de mamífero o un tipo de célula. 20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la línea de células de mamífero se selecciona del grupo que consiste de células de ovario de hámster chino (CHO) , células COS, células BHK, YB2/0, NIH 3T3 , células de mieloma, fibroblastos, HeLa, HE 293, PER.C6 y líneas de células derivadas de las mismas . 21. Un método para la elaboración de una proteína policlonal, en donde la proteína policlonal comprende miembros distintos que se unen a un antxgeno particular, el método esta caracterizado porque comprende: a) proporcionar una colección de células que comprenden una biblioteca o secuencias de ácido nucleico variantes, en donde cada secuencia de ácido nucleico codifica para un miembro distinto de la proteína policlonal y en donde cada una de las secuencias de ácido nucleico está integrada en el mismo sitio único del genoma de cada célula individual en la colección de células; b) cultivar la colección de células bajo condiciones que facilitan la expresión de la proteína policlonal; y c) recuperar la proteína policlonal expresada de las células de cultivo celular o el sobrenadante de cultivo celular . 22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la colección de células en la etapa (a) generalmente es de acuerdo con el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20. 23. El método de conformidad con la reivindicación 21 ó 22, caracterizado porque la proteína policlonal no se asocia naturalmente con la colección de células . 24. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, caracterizado porque la biblioteca de ácidos nucleicos variantes en la etapa (a) se aislan o identifican en una etapa anterior por la ayuda de un procedimiento de. cribado que permite la identificación o aislamiento de ácidos nucleicos que codifican para la proteína que se une a un antígeno particular. 25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el procedimiento de cribado incluye un ensayo de biopanoramización o una etapa de inmunodeteccion. 26. El método de conformidad con la reivindicación 24 ó 25, caracterizado porque el procedimiento de cribado se selecciona del grupo que consiste de presentación de fago, presentación de ribosoma, presentación de ADN, presentación de AN-péptido, presentación covalente, presentación de superficie bacteriana, presentación de superficie de levadura, presentación de virus eucariótico, ELISA y ELISPOT. 27. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 26, caracterizado porque la prote na policlonal es un anticuerpo policlonal o un fragmento de anticuerpo . 28. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 26, caracterizado porque la proteína policlonal es un receptor de linfocito T policlonal o un fragmento de receptor de linfocito T. 29. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 28, caracterizado porque se vigilan los niveles de expresión relativos de las secuencias de ácido nucleico variante. 30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque se vigilan los niveles de expresión a nivel de ARm y/o a nivel de proteína. 31. El método de conformidad con la reivindicación 29 ó 30, caracterizado porque el cultivo en la etapa (b) finaliza a mas tardar cuando los niveles de expresión relativos están fuera de un intervalo predeterminado. 32. Una línea de células de producción policlonal recombinante caracterizada porque comprende una colección de células transfectadas con una biblioteca de secuencias de ácido nucleico variante, en donde cada células en la colección se transfecta y es capaz de expresar un miembro de la biblioteca, el cual codifica para un miembro distinto de una proteína policlonal gue se une a un antígeno particular y el cual se localiza en el mismo sitio único en el genoma de células individuales en la colección, en donde la secuencia de ácido nucleico no se asocia de manera natural con la célula en la colección. 33. La línea de células productora policlonal recombinante de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porgue la biblioteca de secuencias de ácido nucleico variantecodifica para un anticuerpo policlonal o un fragmento de anticuerpo gue tiene una diversidad gue se presenta de manera natural entre los miembros individuales del anticuerpo policlonal o los fragmentos anticuerpo. 34. La línea de células productora policlonale recombinante, de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porgue la biblioteca de secuencias de ácido nucleico variantecodifica para un receptor de linfocito T policlonal o un fragmento de receptor de linfocito T gue tiene una diversidad gue existe entre la naturaleza entre los miembros individuales del receptor de linfocito T policlonal o del fragmento de receptor de linfocito T. 35. La línea de células productora policlonal recombinante, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 32 a 34, caracterizada porque la colección de células se deriva de una línea de células de mamífero o un tipo de célula. 36. La línea celular productora policlonal recombinante de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque la línea de células de mamífero se selecciona del grupo que consiste de células de ovario de hámster chino (CHO) , células COS, células BHK, YB2/0, NIH 3T3 , células de mieloma, fibroblastos, HeLa, HEK 293, PER.C6 y líneas de células derivadas de las mismas . 37. Una biblioteca de vectores para integración de sitio específico, caracterizado porque comprende una población de secuencias de ácido nucleico variante que se presenta de manera natural, en donde cada uno de los vectores comprende: 1) una copia de una secuencia de ácido nucleico distinto que codifica para un miembro distinto de un proteína policlonal que se une a un antígeno particular y 2) una o más secuencias de reconocimiento de recombinasa. 38. La biblioteca de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada porque la población de secuencias de ácido nucleico varianteque se presenta de manera natural codifica para un anticuerpo policlonal o un fragmento de anticuerpo. 39. La biblioteca de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada porque la población de secuencias de ácido nucleico varianteque se presenta de manera natural codifica para un receptor de linfocitos T policlonal o un fragmento de receptor de linfocitos T. 40. La biblioteca de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37 a 39, caracterizada porque cada miembro de la biblioteca de vectores comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica para una recombinasa. 41. Una colección de células que comprende una biblioteca de ácido nucleico variantes, caracterizada porque cada una de las secuencias de ácido nucleico codifica para un miembro distinto de una proteína policlonal que comprende miembros distintos que unen un antígeno particular y en donde cada una de las secuencias de ácido nucleico se integra en el mismo sitio único del genoma de cada célula individual en la colección de células . 42. La colección de células de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque la biblioteca de secuencias de ácido nucleico variante es una biblioteca de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 37 a 40. 43. La_ colección de células de conformidad con la reivindicación 41 ó 42, caracterizada porque por lo menos 50% de las secuencias codificantes presentes originalmente en la biblioteca se pueden identificar como miembros individuales diferentes de la proteína policlonal final expresada a partir de la colección de células . 44. Un anticuerpo policlonal caracterizado porgue expresa la línea de células transfectada con una biblioteca de pares de segmentos de gen para VH y VL en donde cada célula en la línea de células está transfectada y es capaz de expresar un par de genes para VH y VL de la biblioteca, el cual codifica para un miembro diferente de un anticuerpo policlonal que se une a un antígeno particular y el cual se localiza en el mismo sitio único en el genoma de células individuales en la línea celular, en donde la secuencia de ácido nucleico no se asocia naturalmente con la célula en la colección. 45. La línea celular de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque la biblioteca de pares de segmentos de gen para VH y VL es una biblioteca de acuerdo con la reivindicación 38.