TW202000232A

TW202000232A - 用以治療或預防異位性骨化之醫藥組成物

Info

Publication number: TW202000232A
Application number: TW108107084A
Authority: TW
Inventors: 片桐岳信; 塚本翔; 熊谷桂吾; 辻真之介
Original assignee: 學校法人埼玉醫科大學; 日商第一三共股份有限公司
Priority date: 2018-03-05
Filing date: 2019-03-04
Publication date: 2020-01-01
Also published as: CN111836643A; US20210009709A1; CA3093205A1; EP3763386A1; EP3763386A4; US11859006B2; WO2019172165A1; SG11202008280TA; JP7125979B2; JPWO2019172165A1; MX2020008582A; BR112020017451A2; KR20200128017A; RU2020132133A; AU2019231380A1

Abstract

此申請案有關於一種醫藥組成物，其係用以使用於具有異位性骨化及/或腦腫瘤的患者之治療及/或預防方法的醫藥組成物，其特徵為患者具有為異位性骨化或腦腫瘤之原因的ALK2蛋白質之活性化型變異，且ALK2之第330號的胺基酸殘基為脯胺酸，以及此組成物之有效成分為包含與ALK2結合的性質、交聯ALK2的性質、及抑制BMP訊息傳達的性質之抗ALK2抗體或其抗原結合片段。

Description

用以治療或預防異位性骨化之醫藥組成物

本發明係關於一種用以治療及/或預防異位性骨化及/或腦腫瘤之醫藥組成物，其特徵為對具有ALK2之活性化型變異，且於ALK2之第330號的胺基酸殘基無變異的患者，投予具有ALK2結合性及交聯能力的抗ALK2抗體。

進行性骨化性纖維發育不良(fibrodysplasia ossificans progressiva(FOP))為於骨骼肌、腱、韌帶等通常並不會有骨組織形成的軟組織中，異位性形成軟骨組織、骨組織的遺傳性疾病(非專利文獻1-3)。本疾病中，異位性骨化發生於包含顏面的全身，異位性骨組織與既存之骨組織癒合而關節的可動區域顯著減少、或發生身體變形(非專利文獻1-3)。

FOP中的異位性骨化，已知除了伴隨著成長而慢性進行之外，有伴隨由於肌肉損傷、病毒感染等發生之被稱為病發(flare up)的症狀而進行的急性之異位性骨化(非專利文獻1)。病發係以炎症反應、或長期間持續的疼痛為主症狀的膨脹，除了被如會發生肌肉損傷的瘀傷或跌倒、肌肉注射等誘導之外，亦已知有原因不明確的突發例。於FOP，由於在病發後會有異位性骨組織形成，生檢、手術等之侵入性醫療行為被認為是禁忌，而無法外科地去除異位性骨組織。又，於FOP所形成的異位性骨組織，因由正常軟骨細胞或成骨細胞所形成，與正常骨組織同樣地被代謝，所以亦無法使用藥物等而內科地僅去除異位性骨組織。

可抑制FOP之異位性骨化的根本性治療法並未被確立，僅進行針對疼痛等的對應療法。因此，去除於FOP所形成的異位性骨組織係極為困難，期待有於異位性骨化發生之前可期待預防效果之藥物的開發。

作為FOP之責任基因，於包含骨骼肌組織的軟組織中，鑑定出了編碼會誘導異位性骨形成之骨形成蛋白質(Bone morphogenetic protein(BMP))的受體之一種的Activin Like Kinase 2(ALK2；類活化素激酶2)基因(非專利文獻4)。ALK2與被稱為活化素A第I型受體1(Activin A type I Receptor 1(ACVR1))的基因相同。由家族性、及散發性FOP症例，發現伴隨了胺基酸取代的ALK2(非專利文獻4)。

人類及小鼠ALK2，具有包含509個胺基酸之訊息肽的一次跨膜型蛋白質，係作為會與BMP結合之跨膜型的絲胺酸蘇胺酸激酶受體而發揮機能(非專利文獻1-3)。於N末端側之細胞外區域結合BMP，藉由細胞內之絲胺酸蘇胺酸激酶(serine threonine kinase)而將下游之細胞內資訊傳達系統活性化。

BMP之受體，由彼等之構造及機能而被分類為包含ALK2的I型受體、及II型受體之2種類(非專利文獻1-3)。II型受體為即使不結合BMP亦顯示激酶活性之組成活性(constitutive activity)型酵素。另一方面，包含ALK2的I型受體在不與BMP結合的狀態為不活性型的酵素，與BMP之結合依存性地顯示激酶活性。這被認為是因為藉由與BMP的結合，而II型受體之激酶將I型受體之細胞內結構域(domain)作為基質而磷酸化，使立體構造變化而將I型受體活性化(非專利文獻1-3)。

已知若取代I型受體之細胞內區域之特定胺基酸，則會成為被II型受體非依存性地活性化之組成活性型受體(非專利文獻1-3)。若使此I型受體之組成活性型變異體過度表現，則即使不施加BMP刺激，細胞內資訊傳達系統亦會被活性化。因此，認為I型受體為將BMP的資訊自細胞外往細胞內傳達的責任分子。

自家族性及典型的散發性FOP症例被鑑定出的ALK2之變異，為Arg206取代為His的R206H變異體(非專利文獻4)。迄今自FOP症例被鑑定出的基因變異，已被證實全部發生ALK2之細胞內區域之胺基酸變異。此等之FOP症例之變異的多數係集中於ALK2之細胞內區域之ATP結合區域附近(非專利文獻5)。

若使於FOP被鑑定出的ALK2變異體於培養細胞中過度表現，則即使不施加BMP刺激，BMP之細胞內資訊傳達系統亦會被活性化(非專利文獻6)。於是，開發了一種抗ALK2抗體作為FOP之治療藥，其係藉由作用於ALK2之細胞外區域而抑制訊息傳達，而即使對包含ALK2之野生型及新穎變異體的細胞內區域之各種變異體亦可期待抑制作用(專利文獻1)。

又，瀰漫型內因性橋腦神經膠細胞瘤(Diffuse Intrinsic Pontine Glioma(DIPG))係可見集中於橋腦的瀰漫性(浸潤性)星狀細胞瘤，據稱佔兒童腦幹腫瘤之約75~80%，因腦幹係控制呼吸等之必須機能而為長期生存率不足10%的罕見疾病。自DIPG症例亦鑑定出與FOP症例相同的ALK2之變異(非專利文獻7)。因此，有藉由抗ALK2抗體而可治療DIPG等之腦腫瘤的可能性。

[先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]國際公開第WO2016/121908號

[非專利文獻]

[非專利文獻1]T.Katagiri, J.Oral Biosci., 52, 33-41(2010)

[非專利文獻2]T.Katagiri, J.Oral Biosci., 54, 119-123(2012)

[非專利文獻3]T.Katagiri and S.Tsukamoto, Biol.Chem., 394, 703-714(2013)

[非專利文獻4]E.M.Shore et al., Nat.Genet., 38, 525-527(2006)

[非專利文獻5]A.Chaikuad et al., J.Biol.Chem., 287, 36990-36998(2012)

[非專利文獻6]T.Fukuda et al., J.Biol.Chem., 284, 7149-7156(2009)

[非專利文獻7]K.R.Taylor et al., Nat Genet., 46, 457-461(2014)

本發明之目的係提供異位性骨化及/或腦腫瘤之有效果的治療及/或預防方法、以及用以於該方法使用之醫藥組成物。

本發明人等，進行抗ALK2抗體作為FOP之治療藥的評價的結果，發現了在對FOP模式小鼠投予抗ALK2抗體的情形，異位性骨化會被促進。本發明人等，為了解決上述課題而專心進行了檢討後，本次發現抗ALK2抗體雖會促進具有R206H變異的小鼠ALK2之細胞內訊息傳達，但於使用了具有R206H變異的人類ALK2的情形，相反地會抑制細胞內訊息傳達。於是，將人類ALK2及小鼠ALK2之細胞內及細胞外各自取代後，證實了若細胞內區域具有R206H變異的小鼠ALK2，則抗ALK2抗體會促進細胞內訊息傳達。比較了人類ALK2及小鼠ALK2之細胞內區域之胺基酸序列後，僅第182號之胺基酸殘基(於人類為天冬胺酸(D)，於小鼠為麩胺酸(E))、及第330號之胺基酸殘基(於人類為脯胺酸(P)，於小鼠為絲胺酸(S))不同。於是，製作了將具有R206H變異的人類ALK2之第182號之天冬胺酸(D)、及第330號之脯胺酸(P)各自以為小鼠之胺基酸殘基的麩胺酸(E)及絲胺酸(S)取代的變異體，檢討了抗ALK2抗體之作用。其結果得知，在具有R206H變異的人類ALK2之第330號的脯胺酸(P)被取代為絲胺酸(S)的情形，抗ALK2抗體會促進細胞內訊息傳達。發現了將第330號之脯胺酸(P)取代為天冬胺酸(D)、麩胺酸(E)或丙胺酸(A)，亦可獲得同樣的結果。進一步證實了，在不具有R206H變異的人類ALK2之第328號之甘胺酸(G)被取代為纈胺酸(V)的情形，藉由抗ALK2抗體，而經由ALK2的BMP訊息傳達會亢進。其結果，本發明人等發現，於具有ALK2之活性化型變異的患者中，僅對於在ALK2之第330號的胺基酸殘基無變異的患者及/或無G328V變異的患者投予抗ALK2抗體，藉此可有效果地治療及/或預防異位性骨化及/或腦腫瘤，而完成了本發明。

即，本發明包含以下之發明。

(1)一種用於使用於具有異位性骨化的患者之治療及/或預防方法之醫藥組成物，該醫藥組成物之特徵為前述患者具有為異位性骨化之原因的類活化素激酶2(ALK2)蛋白質之活性化型變異，且前述ALK2之第330號的胺基酸殘基為脯胺酸，以及前述組成物之有效成分為包含與前述ALK2結合的性質、將前述ALK2交聯的性質、及抑制BMP訊息傳達的性質為抗ALK2抗體或前述抗體之抗原結合片段。

(2)如前述(1)記載之醫藥組成物，其中前述ALK2為不具有G328V變異。

(3)如前述(1)記載之醫藥組成物，其中前述方法包含下列步驟：(a)檢測患者之ALK2之活性化型變異的有無的步驟；(b)篩選具有ALK2之活性化型變異的患者的步驟；(c)確認於患者之ALK2之第330號的胺基酸殘基無變異的步驟；及(d)對篩選出的患者投予抗ALK2抗體或前述抗體之抗原結合片段的步驟。

(4)如前述(3)記載之醫藥組成物，其中前述步驟(c)進一步包含確認患者之ALK2不具有G328V變異的步驟。

(5)如前述(3)記載之醫藥組成物，其中成為前述抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段的投予對象之患者的篩選包含：(a)檢測異位性骨化之患者中的ALK2之活性化型變異的有無的步驟；(b)篩選具有ALK2之活性化型變異的患者的步驟；及(c)排除於ALK2之第330號的胺基酸殘基具有變異的患者的步驟。

(6)如前述(5)記載之醫藥組成物，其中前述步驟(c)進一步包含排除具有ALK2之G328V變異的患者的步驟。

(7)如前述(1)~(6)中任一項記載之醫藥組成物，其中前述抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段會與包含序列識別號1所示的胺基酸序列之第21號~第123號之胺基酸殘基的多肽特異性結合。

(8)如前述(1)~(7)中任一項記載之醫藥組成物，其中前述抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段會與下列(i)或(ii)結合：(i)包含序列識別號1所示的胺基酸序列中之第38號之麩胺酸、第39號之甘胺酸、第59號之異白胺酸、第60號之天冬醯胺、第61號之天冬胺酸、第62號之甘胺酸、第63號之苯丙胺酸、第64號之組胺酸、第65號之纈胺酸、第66號之酪胺酸、第102號之天冬醯胺、第104號之蘇胺酸、第106號之麩醯胺酸、第107號之白胺酸之各殘基的表位(epitope)，或(ii)包含序列識別號1所示的胺基酸序列中之第38號之麩胺酸、第39號之甘胺酸、40號之白胺酸、第59號之異白胺酸、第60號之天冬醯胺、第61號之天冬胺酸、第62號之甘胺酸、第63號之苯丙胺酸、第64號之組胺酸、第65號之纈胺酸、第66號之酪胺酸、及第104號之蘇胺酸之各殘基的表位。

(9)如前述(1)~(7)中任一項記載之醫藥組成物，其中前述抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段係與前述(8)記載之抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段競爭對ALK2的結合。

(10)如前述(1)~(9)中任一項記載之醫藥組成物，其中前述抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段為單株抗體、多株抗體、嵌合抗體、人類化抗體、人類抗體、二特異性抗體(diabodies)、多特異性抗體、或F(ab’)₂。

(11)如前述(1)~(10)中任一項記載之醫藥組成物，其中前述抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段之重鏈序列包含具有CDRH1、CDRH2、CDRH3的可變區，且前述CDRH1、CDRH2、及CDRH3各自由下列所示的胺基酸序列而成：序列識別號5、序列識別號6、及序列識別號7；序列識別號11、序列識別號12、及序列識別號13；序列識別號18、序列識別號19、及序列識別號20；或序列識別號24、序列識別號25、及序列識別號26；以及，輕鏈序列包含具有CDRL1、CDRL2、CDRL3的可變區，且前述CDRL1、CDRL2、及CDRL3各自由下列所示的胺基酸序列而成：序列識別號8、序列識別號9、及序列識別號10；序列識別號8、序列識別號17、及序列識別號10；序列識別號14、序列識別號15、及序列識別號16；序列識別號21、序列識別號22、及序列識別號23；或序列識別號27、序列識別號28、及序列識別號29。

(12)如前述(1)~(11)中任一項記載之醫藥組成物，其中前述抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段之重鏈可變區序列為：a1)由序列識別號31所示的胺基酸序列之第20號~第142號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列；a2)由序列識別號33所示的胺基酸序列之第20號~第142號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列；a3)由序列識別號34所示的胺基酸序列之第20號~第140號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列；a4)由序列識別號36所示的胺基酸序列之第20號~第140號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列；a5)由序列識別號38所示的胺基酸序列之第20號~第140號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列；a6)由序列識別號39所示的胺基酸序列之第20號~第140號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列；a7)與選自前述a1)至a6)之胺基酸序列的任一者之胺基酸序列具有至少95%之同一性的胺基酸序列；a8)與選自前述a1)至a6)之胺基酸序列的任一者之胺基酸序列具有至少99%之同一性的胺基酸序列；或a9)於選自前述a1)至a6)之胺基酸序列的任一者之胺基酸序列有1或數個之胺基酸殘基被取代、刪除或添加的胺基酸序列；以及輕鏈可變區序列為：b1)由序列識別號32所示的胺基酸序列之第21號~ 第133號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列；b2)由序列識別號35所示的胺基酸序列之第21號~第129號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列；b3)由序列識別號37所示的胺基酸序列之第21號~第129號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列；b4)與選自前述b1)至b3)之胺基酸序列的任一者之胺基酸序列具有至少95%之同一性的胺基酸序列；b5)與選自前述b1)至b3)之胺基酸序列的任一者之胺基酸序列具有至少99%之同一性的胺基酸序列；或b6)於選自前述b1)至b3)之胺基酸序列的任一者之胺基酸序列有1或數個之胺基酸殘基被取代、刪除或添加的胺基酸序列。

(13)如前述(12)記載之醫藥組成物，其中前述抗ALK2抗體為下列抗體：包含含有由序列識別號31所示的胺基酸序列之第20號~第142號之胺基酸殘基而成的重鏈可變區的重鏈及含有由序列識別號32所示的胺基酸序列之第21號~第133號之胺基酸殘基而成的輕鏈可變區的輕鏈的抗體；包含含有由序列識別號33所示的胺基酸序列之第20號~第142號之胺基酸殘基而成的重鏈可變區的重鏈及含有由序列識別號32所示的胺基酸序列之第21號~第133號之胺基酸殘基而成的輕鏈可變區的輕鏈的抗體；包含含有由序列識別號34所示的胺基酸序列之第20號~第140號之胺基酸殘基而成的重鏈可變區的重鏈及含有由序列識別號35所示的胺基酸序列之第21號~第129號之胺基酸殘基而成的輕鏈可變區的輕鏈的抗體；包含含有由序列識別號36所示的胺基酸序列之第20號~第140號之胺基酸殘基而成的重鏈可變區的重鏈及含有由序列識別號37所示的胺基酸序列之第21號~第129號之胺基酸殘基而成的輕鏈可變區的輕鏈的抗體；包含含有由序列識別號38所示的胺基酸序列之第20號~第140號之胺基酸殘基而成的重鏈可變區的重鏈及含有由序列識別號35所示的胺基酸序列之第21號~第129號之胺基酸殘基而成的的輕鏈可變區的輕鏈的抗體；或包含含有由序列識別號39所示的胺基酸序列之第20號~第140號之胺基酸殘基而成的重鏈可變區的重鏈及含有由序列識別號37所示的胺基酸序列之第21號~第129號之胺基酸殘基而成的輕鏈可變區的輕鏈的抗體。

(14)如前述(1)~(13)中任一項記載之醫藥組成物，其中前述ALK2之活性化型變異為選自L196P、delP197_F198insL、R202I、R206H、Q207E、R258S、R258G、G325A、G328E、G328R、G328W、G356D、及R375P之至少一者。

(15)如前述(1)~(13)中任一項記載之醫藥組成物，其中前述ALK2之活性化型變異為R206H變異。

(16)如前述(1)~(15)中任一項記載之醫藥組成物，其中前述異位性骨化為進行性骨化性纖維形成異常症(FOP)。

(17)一種用以使用於具有腦腫瘤的患者之治療及/或預防方法之醫藥組成物，前述醫藥組成物之特徵為前述患者具有為腦腫瘤之原因的類活化素激酶2(ALK2)蛋白質之活性化型變異，以及前述組成物之有效成分為包含與前述ALK2結合的性質、將前述ALK2交聯的性質、及抑制BMP訊息傳達的性質之抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段。

(18)如前述(17)記載之醫藥組成物，其中前述患者之ALK2之第330號的胺基酸殘基為脯胺酸。

(19)如前述(17)或(18)記載之醫藥組成物，其中前述ALK2之活性化型變異為選自R206H、R258G、G328E、G328W、及G356D之至少一者。

(20)如前述(17)~(19)中任一項記載之醫藥組成物，其中前述抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段為定義於前述(7)~(13)之任一者的抗ALK2抗體或其抗原結合片段。

(21)如前述(17)~(20)中任一項記載之醫藥組成物，其中前述腦腫瘤為瀰漫型內因性橋腦神經膠細胞瘤(DIPG)。

(22)一種預測由於抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段之投予所致的副作用的表現風險的方法，該方法包含下列步驟：(a)檢測患者的ALK2之活性化型變異及第330號之胺基酸殘基的變異之有無的步驟；及(b)將具有ALK2之活性化型變異且於第330號之胺基酸殘基無變異的患者判定為抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段之投予所致的副作用的表現風險低的步驟。

(23)一種預測利用抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段之投予的治療及/或預防反應性的方法，前述方法包含下列步驟：(a)檢測患者的ALK2之活性化型變異及第330號之胺基酸殘基的變異之有無的步驟；及(b)將具有ALK2之活性化型變異且於第330號之胺基酸殘基無變異的患者判定為利用抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段之投予有治療及/或預防反應性的步驟。

(24)一種篩選利用抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段之投予的治療及/或預防之對象患者的方法，前述方法包含下列步驟：(a)檢測患者的ALK2之活性化型變異及第330號之胺基酸殘基的變異之有無的步驟；及(b)篩選具有ALK2之活性化型變異且於第330號之胺基酸殘基無變異的患者作為利用抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段之投予的治療及/或預防之對象患者的步驟。

(25)一種利用抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段之投予的疾病之治療及/或預防方法，前述方法包含下列步驟：(a)檢測患者的ALK2之活性化型變異及第330號之胺基酸殘基的變異之有無的步驟；及(b)對具有ALK2之活性化型變異且於第330號之胺基酸殘基無變異的患者，投予抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段的步驟。

(26)如前述(25)記載之方法，其進一步包含進行前述(22)~(24)中任一項記載之方法之步驟(b)。

(27)如前述(22)~(26)中任一項記載之方法，其中前述抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段之投予為前述(1)~(21)中任一項記載之醫藥組成物之投予。

(28)如前述(22)~(27)中任一項記載之方法，其中前述步驟(b)進一步包含確認ALK2之活性化型變異並非G328V變異的步驟。

(29)如前述(22)~(27)中任一項記載之方法，其中前述ALK2之活性化型變異為選自L196P、delP197_F198insL、R202I、R206H、Q207E、R258S、R258G、G325A、G328E、G328R、G328W、G356D、及R375P之至少一者。

(30)如前述(22)~(27)中任一項記載之方法，其中前述ALK2之活性化型變異為選自R206H、R258G、G328E、G328W、及G356D之至少一者。

(31)如前述(25)~(30)中任一項記載之方法，其中前述患者所罹患的疾病為異位性骨化或腦腫瘤。

(32)如前述(31)記載之方法，其中前述患者所罹患的疾病為異位性骨化。

(33)如前述(25)~(31)中任一項記載之方法，其中前述患者所罹患的疾病為進行性骨化性纖維形成異常症(FOP)或瀰漫型內因性橋腦神經膠細胞瘤(DIPG)。

(34)如前述(33)記載之方法，其中前述患者所罹患的疾病為進行性骨化性纖維形成異常症(FOP)。

本說明書包含成為本案之優先權的基礎的日本國專利申請案號第2018-039066號之揭示內容。

依據本發明，而提供對特定之患者之異位性骨化及/或腦腫瘤之有效率的治療及/或預防方法、以及用以使用於該方法的醫藥組成物。又，依據本發明，而提供預測由於抗ALK2抗體之投予所致的副作用的表現風險的方法、預測利用抗ALK2抗體之投予的治療及/或預防反應性的方法、以及篩選利用抗ALK2抗體之投予的治療及/或預防之對象的方法。進一步又依據本發明，而提供利用抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段之投予的治療及/或預防起因於ALK2之活性化型變異的疾病(例如，異位性骨化、腦腫瘤等)之方法。

圖1為藉由BMP特異的螢光素酶報導子(luciferase reporter)顯示了抗ALK2抗體(27D-H2L2_LALA)係於表現小鼠R206H ALK2的HEK293細胞活化BMP訊息傳達(圖1A)，而另一方面，於表現人類R206H ALK2的HEK293細胞並不活化BMP訊息傳達(圖1B)的圖。縱軸表示相對於未處理對照(即，不含前述抗ALK2抗體的對照)的相對螢光素酶活性(Relative luc activity)，另一方面，橫軸表示抗體濃度。對照ALK2為小鼠野生型ALK2(Mouse WT ALK2)及人類野生型ALK2(Human WT ALK2)，對照抗體(Ctrl)為IgG1。

圖2係為藉由BMP特異的螢光素酶報導子顯示了F(ab’)₂(27D-H2L2_F(ab’)₂)與抗ALK2抗體(27D-H2L2_LALA)同樣地僅於表現小鼠R206H ALK2的HEK293細胞活化BMP訊息傳達(圖2A)，而Fab(27D-H2L2_Fab)於表現小鼠及人類R206H ALK2之任一者的HEK293細胞皆不活化BMP訊息傳達(各自為圖2A、圖2B)的圖。縱軸表示相對於未處理對照(即，不含前述F(ab’)₂的對照)的相對螢光素酶活性(Relative luc activity)，另一方面，橫軸表示抗體濃度。又，對照抗體(Ctrl)為IgG1。

圖3係為藉由Nanoluc Binary Technology顯示了A2-27D、27D-H2L2_LALA及27D-H2L2_F(ab’)₂誘導ALK2之交聯形成(複合體形成)的圖。相對於此，27D-H2L2_Fab並未誘導ALK2之交聯形成(複合體形成)。縱軸表示螢光素酶活性，另一方面，橫軸表示抗體濃度。

圖4係顯示了於人類、猴、犬、大鼠及小鼠之ALK2蛋白質之序列比較中，第182號之胺基酸殘基(人類「D」、小鼠「E」)及第330號之胺基酸殘基(人類「P」、小鼠「S」)在人類及小鼠並未被保存的序列比對。

圖5係為藉由BMP特異的螢光素酶報導子顯示了抗ALK2抗體(A2-27D)於將胺基酸編號第330號之脯胺酸取代為絲胺酸之表現人類R206H ALK2的HEK293細胞中，活化BMP訊息傳達的圖。還顯示了於將胺基酸編號第330號之絲胺酸取代為脯胺酸之表現小鼠R206HALK2的HEK293細胞，BMP訊息傳達之活性化被抑制(資料未呈示)。進一步又藉由BMP特異的螢光素酶報導子顯示了抗ALK2抗體於表現小鼠R206H ALK2的HEK293細胞中活化BMP訊息傳達，而在表現人類WT ALK2、或將胺基酸編號第182號之天冬胺酸取代為麩胺酸的人類ALK2等之圖示的其他之人類ALK2變異體的HEK293細胞並不活化BMP訊息傳達、或會抑制(或阻礙)。

圖6係為藉由BMP特異的螢光素酶報導子顯示了抗ALK2抗體(A2-27D)於將胺基酸編號第330號之脯胺酸(P)取代為絲胺酸(S)、天冬胺酸(D)、麩胺酸(E)、丙胺酸(A)之表現人類R206H ALK2的HEK293細胞活化BMP訊息傳達，而對於取代為纈胺酸(V)的人類R206H ALK2不活化BMP訊息傳達的圖。進一步又對於具有上述取代但不包含R206H變異的人類WT ALK2，抗ALK2抗體並未活化BMP訊息傳達。還一併顯示了關於對具有圖中所示的變異的小鼠ALK2的BMP訊息傳達之活性化的有無。對照(Control)為大鼠IgG2。

圖7係為藉由BMP特異的螢光素酶報導子顯示了4種類之抗ALK2抗體(27D-H2L2_LALA、15A-H4L6_IgG2、A2-11E、A2-25C)於表現小鼠R206H ALK2的HEK293細胞活化BMP訊息傳達(圖7A)，而於表現人類R206H ALK2變異體的HEK293細胞不活化BMP訊息傳達(圖7B)的圖。縱軸表示相對於未處理對照(即，不含前述抗ALK2抗體的對照)的相對螢光素酶活性(Relative luc activity)，另一方面，橫軸表示抗體濃度。

圖8係為藉由BMP特異的螢光素酶報導子顯示了抗ALK2抗體(A2-27D)於表現人類G328V及Q207D ALK2的HEK293細胞中活化BMP訊息傳達，而於表現其他人類ALK2變異體(R206H、L196P、PF197-8L(亦稱為「delP197_F198insL」)、R202I、Q207E、R258G、R258S、G325A、G328E、G328R、G328W、G356D、R375P)的HEK293細胞並不活化BMP訊息傳達的圖。活性係與實施例5同樣地測定。圖中，縱軸表示相對於未處理對照的螢光素酶活性，橫軸表示A2-27D之濃度。又，關於G328V(1/3)及Q207D(1/20)，於試驗中以G328V變異體為其他變異體的1/3量(例如，其他變異體為37.5ng/井時，為12.5ng/井)，Q207D變異體為其他變異體之1/20量(例如，其他變異體為37.5ng/井時，為1.875ng/井)的方式使用。

進一步詳細說明本發明。

1.定義

於本說明書中，所謂「基因」之用語係不僅包含DNA，亦包含mRNA、cDNA及cRNA。

於本說明書中，所謂「多核苷酸」之用語係以與核酸相同意義使用，例如亦包含DNA、RNA、探針、寡核苷酸、及引子等。

於本說明書中，「多肽」與「蛋白質」未被區別地使用。

於本說明書中，「RNA劃份(fraction)」係指包含RNA的劃份。

於本說明書中，「細胞」亦包含動物個體內之細胞、培養細胞。

於本說明書中，「ALK2」係以與ALK2蛋白質相同意義使用，包含野生型及變異體(亦稱為「變異型」)。

本說明書中的「抗體之抗原結合片段」，意指亦稱為「抗體之機能性片段」且具有與抗原之結合性的抗體之部分片段，包含F(ab’)₂、二特異性抗體(diabody)、線狀抗體或單鏈抗體、及由抗體片段所形成的多特異性抗體等。惟，與抗ALK2抗體同樣地，只要具有與ALK2的結合能力(或者，與ALK2結合的性質)且對ALK2的交聯能力(或者，交聯ALK2的性質)，則並未限定於此等之分子。又，較佳為上述抗體之抗原結合片段進一步與抗ALK2抗體同樣地，具有BMP訊息傳達抑制能(或者，抑制(亦稱為「阻礙」)BMP訊息傳達的性質)。進一步又，此等之抗原結合片段，不僅包含抗體蛋白質之全長分子以適當酵素處理者，亦包含使用基因工程改變的抗體基因而於適當宿主細胞產生的蛋白質。

本說明書中的「表位」係指亦稱為抗體之「抗原結合部位」且一般由抗原之至少7個胺基酸、至少8個胺基酸、至少9個胺基酸、或至少10個胺基酸而成之抗體會結合的抗原部位，於本說明書，意指特定之抗ALK2抗體會結合的ALK2之部分肽或部分立體構造。為前述之ALK2之部分肽的表位，係可藉由例如免疫試驗法等之所屬技術領域中具通常知識者熟知的方法來決定，但可藉由例如以下之方法來進行。製作ALK2之各式各樣的部分構造。於部分構造之製作，可使用周知之寡肽合成技術。例如，使用所屬技術領域中具通常知識者周知之基因重組技術製作自ALK2之C末端或N末端以適當長度依序縮短的一連串多肽後，檢討對於彼等之抗體的反應性，且於決定大略的辨識部位後，合成更短的肽而檢討與彼等肽之反應性，可藉此而決定表位。又，特定之ALK2抗體會結合的為ALK2之部分立體構造的表位，可藉由X射線結晶構造解析而特定與前述之抗體鄰接的ALK2之胺基酸殘基來決定。若第二抗ALK2抗體結合於第一抗ALK2抗體之結合的部分肽或部分立體構造，則可判定第一抗體與第二抗體具有共通的表位。又，藉由確認第二抗ALK2抗體對於第一抗ALK2抗體之ALK2的結合為競爭(即，第二抗體會妨礙第一抗體與ALK2的結合)，而即使並未決定具體的表位序列或構造，亦可判定第一抗體與第二抗體具有共通的表位。再者，第一抗體與第二抗體會結合於共通的表位，且第一抗體具有經由ALK2的BMP訊息傳達之阻礙活性等之活性的情形，可期待第二抗體亦具有相同活性。

已知抗體分子之重鏈及輕鏈各自有3處的互補性決定區域(CDR：Complementarity Determining Region)。互補性決定區域亦稱為高度變異區域(hypervariable domain)，位於抗體之重鏈及輕鏈的可變區內，為一次構造的變異性特別高的部位，於重鏈及輕鏈之多肽鏈之一次構造上，各自分離於3處。於本說明書中，關於抗體之互補性決定區域，係將重鏈之互補性決定區域自重鏈胺基酸序列之胺基末端側標記為CDRH1、CDRH2、CDRH3，將輕鏈之互補性決定區域自輕鏈胺基酸序列之胺基末端側標記為CDRL1、CDRL2、CDRL3。此等之部位係於立體構造上相互接近，而決定對於所結合的抗原的特異性。

於本發明，「於嚴格條件下雜交」係指於市售之雜交溶液ExpressHyb Hybridization Solution(Clontech公司製)中，於約50~70℃(例如68℃)雜交，或在藉由使用固定了DNA的濾紙而於約0.7~1.0M之NaCl存在下，於約50~70℃(例如68℃)進行雜交後，使用約0.1~2倍濃度之SSC溶液(1倍濃度SSC係包含150mM NaCl、15mM檸檬酸鈉。又，亦可因應必要而使該溶液含有約0.1~0.5%SDS)，於約50~70℃(例如68℃)洗淨而可鑑定的條件或與此同等之條件下雜交。

於本說明書中，有「1或數個」之記載的情形之「數個」係表示2~10個。較佳為10個以下，更佳為5或6個以下，進一步更佳為2或3個。

於本發明中，「交聯能力」係指1個抗體或抗原結合片段結合而交聯(即，交聯)於2分子之ALK2蛋白質之各自的細胞外區域的能力。通常，於BMP配位體存在下，ALK2會形成複合體，將下游之SMAD1/5/8活性化，但藉由抗ALK2抗體，2分子之ALK2之交聯被誘導，於配位體非存在下亦有發生複合體樣形成的可能性。本發明人此次發現，於變異型人類ALK2蛋白質之第330號的胺基酸殘基為脯胺酸時，及依情況而於變異型人類ALK2蛋白質無G328V變異時，與ALK2結合的抗ALK2抗體會抑制BMP訊息傳達(或阻礙)，相對於此，該第330號之脯胺酸為絲胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、丙胺酸等之其他胺基酸殘基時，BMP訊息傳達會被促進(或活性化)。基於此知識見解，而能夠特定變異型人類ALK2蛋白質之第330號的胺基酸殘基為脯胺酸、及依情況於變異型人類ALK2蛋白質無G328V變異之患者，而藉由抗ALK2抗體來施予有效的治療。

BMP訊息傳達之促進，係指經由ALK2受體分子而將下游之細胞內資訊傳達系統活性化。

於本發明中，「患者」不僅為罹患疾病的人類，亦可為有罹患疾病之懷疑的人類。

就本發明中所使用的「生物學的試料」而言，只要能檢測出ALK2的變異的有無者，則無特別限制，但例如為血液樣品或腫瘤樣品。亦可為自此等之試料所獲得的蛋白質提取物、核酸提取物(例如mRNA提取物、自mRNA提取物所調製的cDNA調製物或cRNA調製物等)。

2. ALK2

ALK2基因為編碼於包含骨骼肌組織的軟組織中誘導異位性骨形成的BMP之受體之一種的FOP之責任基因。由家族性、及散發性FOP症例，發現伴隨著胺基酸取代的變異型ALK2。就人類ALK2之活性化型變異而言，已知序列識別號1之胺基酸序列中，L196P(第196號之白胺酸被取代為脯胺酸的變異)、delP197_F198insL(亦稱為「PF197-8L」)(第197號之脯胺酸及第 198號之苯丙胺酸缺失，且插入有白胺酸的變異)、R202I(第202號之精胺酸被取代為異白胺酸的變異)、R206H(第206號之精胺酸被取代為組胺酸的變異)、Q207E(第207號之麩醯胺酸被取代為麩胺酸的變異)、R258S(第258號之精胺酸被取代為絲胺酸的變異)、R258G(第258號之精胺酸被取代為甘胺酸的變異)、G325A(第325號之甘胺酸被取代為丙胺酸的變異)、G328E(第328號之甘胺酸被取代為麩胺酸的變異)、G328R(第328號之甘胺酸被取代為精胺酸的變異)、G328W(第328號之甘胺酸被取代為色胺酸的變異)、G356D(第356號之甘胺酸被取代為天冬胺酸的變異)、R375P(第375號之精胺酸被取代為脯胺酸的變異)等。

又，亦由DIPG症例發現伴隨著胺基酸取代的變異型ALK2。就人類ALK2之活性化型變異而言，已知序列識別號1之胺基酸序列中，R206H、R258G、G328E、G328V(第328號之甘胺酸被取代為纈胺酸的變異)、G328W、G356D等。

本發明中所使用的ALK2，可藉由活體外合成、或利用基因操作而使宿主細胞產生而獲得。具體而言，可藉由將ALK2 cDNA併入可表現的載體後，於包含轉錄及轉譯所必要的酵素、基質及能量物質的溶液中加以合成，或者使其他之原核生物、或真核生物之宿主細胞轉形以使ALK2表現，而獲得該蛋白質。

於本發明使用的ALK2為源自包含人類及小鼠的哺乳動物的ALK2，例如人類ALK2之胺基酸序列及核苷酸序列可藉由參照GenBank登錄號NM-001105而取得，於本說明書中亦揭示胺基酸序列為序列識別號1，核苷酸序列為序列識別號2。小鼠ALK2之胺基酸序列及核苷酸序列可藉由參照GenBank登錄號NP-001103674而取得，於本說明書中亦揭示胺基酸序列為序列識別號3，核苷酸序列為序列識別號4。此外，猴、大鼠及犬之ALK2之胺基酸序列藉由各自參照GenBank登錄號NM-001260761(序列識別號40)、NP_077812(序列識別號42)、XM_549615.5(序列識別號41)而可取得。又，ALK2有時稱為ACVR1(活化素A第I型受體1)或ACTR1(活化素受體第1型)，此等全部表示相同分子。

ALK2之cDNA，例如可藉由所謂的PCR法而取得，其係將表現ALK2之cDNA的cDNA庫作為模板，使用將ALK2之cDNA特異性增幅的引子，而進行聚合酶連鎖反應(以下稱為「PCR」)(Saiki,R.K.,et al.,Science,(1988)239,487-49)。

3. ALK2變異之檢測

於本發明中，「檢測變異」原則上意指檢測基因體DNA上之變異，但於該基因體DNA上之變異反映在轉錄產物的鹼基變化或轉譯產物的胺基酸變化的情形，意味亦包含檢測此等轉錄產物或轉譯產物的該變化(即，間接的檢測)。

本發明之方法之較佳態樣，係藉由將患者之ALK2基因區域之鹼基序列直接定序，而檢測變異的方法。於本發明中，「ALK2基因區域」意指包含ALK2基因的基因體DNA上之一定區域。該區域亦包含ALK2基因之表現控制區域(例如，啟動子區域、強化子區域)、或ALK2基因之3’末端非轉譯區域等。此等區域中的變異，例如，會影響ALK2基因之轉錄活性。

於此方法中，首先自來自患者的生物學的試料調製DNA試料。就DNA試料而言，可列舉例如基因體DNA試料、及藉由自RNA的反轉錄所調製的cDNA試料。

就自生物學的試料提取基因體DNA或RNA的方法而言，並無特別限制，可適當選擇周知之手法，例如，就提取基因體DNA的方法而言，可列舉使用SDS苯酚法(將保存於包含尿素的溶液或乙醇中的組織，以蛋白質分解酵素(proteinase K)、界面活性劑(SDS)、及苯酚使該組織之蛋白質變性，並以乙醇自該組織使DNA沉澱而提取的方法)、Clean Columns(註冊商標、NexTec公司製)、AquaPure(註冊商標、Bio-Rad公司製)、ZR Plant/Seed DNA Kit(Zymo Research公司製)、AquaGenomicSolution(註冊商標、Mo Bi Tec公司製)、prepGEM(註冊商標、ZyGEM公司製)、BuccalQuick(註冊商標、TrimGen公司製)的DNA提取方法等。又，就提取RNA的方法而言，可列舉例如，使用苯酚與離散劑(chaotrope)鹽的提取方法(更具體而言，係使用TRIzol(Invitrogen公司製)、ISOGEN(和光純藥公司製)等之市售套組的提取方法)、或其他市售套組(RNAPrep總RNA提取套組(Beckman Coulter公司製)、RNeasy Mini(QIAGEN公司製)、RNA提取套組(Pharmacia Biotech公司製)等)的方法。再者，就自提取的RNA調製cDNA所使用的反轉錄酶而言，並無特別限制，可列舉例如，源自RAV(Rous氏肉瘤相關病毒(Rous associated virus))或AMV(禽骨髓母細胞瘤病毒(Avian myeloblastosis virus))等之反轉錄病毒的反轉錄酶、或源自MMLV(莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus))等之小鼠之反轉錄病毒的反轉錄酶。

於此態樣中，接著，將包含ALK2基因區域之變異部位的DNA單離，定序經單離的DNA之鹼基序列。該DNA之單離，例如，可藉由使用以包夾ALK2基因區域之變異的方式設計的一對寡核苷酸引子，以基因體DNA、或RNA為模板的PCR等來進行。單離的DNA之鹼基序列之定序，可藉由例如馬克薩姆-吉爾伯特法(Maxam-Gilbert method)或桑格法(Sanger method)等之所屬技術領域中具通常知識者周知之方法、利用次世代定序的方法等來進行。

可藉由將所定序的DNA或cDNA之鹼基序列與對照(例如，源自健康人之生物學的試料之對應的DNA或cDNA之鹼基序列)比較，來判別患者之ALK2基因區域之變異之有無。

用以檢測ALK2基因區域之變異的方法，除了直接定序DNA或cDNA之鹼基序列的方法以外，可藉由可檢測變異的各種方法進行。

例如，本發明中的變異之檢測亦可藉由如以下的方法進行。首先，自生物學的試料調製DNA或cDNA試料。其次，調製具有與包含ALK2基因區域的變異的鹼基序列互補的鹼基序列，且經報導子螢光色素及猝熄劑(quencher)螢光色素所標識的寡核苷酸探針。而且，使前述寡核苷酸探針於嚴格條件對前述DNA試料雜交，進一步將前述寡核苷酸探針所雜交的前述DNA試料作為模板，將包含ALK2基因區域之前述變異的鹼基序列增幅。而且，藉由伴隨前述增幅的寡核苷酸探針之分解，而檢測前述報導子螢光色素所發出的螢光(訊息)，其次將檢測出的前述螢光與對照比較。就此種方法而言，可列舉例如雙染料探針法、TaqMan(註冊商標)探針法等。

又於另外的方法中，係自生物學的試料調製DNA或cDNA試料。其次，於包含被插入DNA雙鏈間就會發出螢光的嵌入劑(intercalator)的反應系統中，以前述DNA試料作為模板，而將包含ALK2基因區域之前述變異的鹼基序列增幅。然後，使前述反應系之溫度變化，檢測前述嵌入劑所發出的螢光的強度的變動，將檢測出的伴隨前述溫度的變化的前述螢光之強度的變動與對照比較。就此種方法而言，可列舉例如HRM(high resolution melting、高分解熔解曲線解析)法。

又於另外的方法，首先，自生物學的試料調製DNA或cDNA試料。其次，將包含ALK2基因區域之變異部位的DNA增幅。再者，將增幅的DNA利用限制酵素切斷。其次，將DNA片段按其大小而分離。其次，將檢測出的DNA片段的大小與對照比較。就此種方法而言，可列舉例如，利用限制片段長度多型性(Restriction Fragment Length Polymorphism/RFLP)的方法、PCR-RFLP法等。

又於另外的方法中，首先，自生物學的試料調製DNA或cDNA試料。其次，將包含ALK2基因區域之變異部位的DNA增幅。進一步使增幅的DNA解離為單股DNA。其次，使解離的單股DNA於非變性膠體上分離。將經分離的單股DNA之在膠體上之移動度與對照比較。就此種方法而言，可列舉例如PCR-SSCP(single-strand conformation polymorphism，單股結構多樣性)法等。

又於另外的方法中，首先，自生物學的試料調製DNA或cDNA試料。其次，將包含ALK2基因區域之變異部位的DNA增幅。進一步將經增幅的DNA於DNA變性劑之濃度逐漸增加的膠體上分離。其次，將經分離的DNA之在膠體上的移動度與對照比較。就此種方法而言，可列舉例如，變性劑濃度梯度膠體電泳(denaturant gradient gel electrophoresis：DGGE)法等。

作為另一種方法，有使用自生物學的試料調製的包含ALK2基因區域之變異部位的DNA、及固定有與該DNA於嚴格條件雜交的寡核苷酸探針之基板的方法。就此種方法而言，可列舉例如，DNA陣列法等。

又於另外的方法中，首先，自生物學的試料調製DNA或cDNA試料。又，調製「具有與ALK2基因區域之變異部位的鹼基之1個鹼基3’側之鹼鹼基及其3’側之鹼基序列互補的鹼基序列的寡核苷酸引子」。其次，將該DNA作為模板，使用該引子來進行ddNTP引子伸長反應。其次，將引子伸長反應產物以質譜儀進行質量測定。其次，自質量測定之結果決定基因型。其次，將決定的基因型與對照比較。就此種方法而言，可列舉例如，MALDI-TOF/MS法等。

又於另外的方法中，首先，自生物學的試料調製DNA或cDNA試料。其次，調製由5’-「與ALK2基因區域之變異部位之鹼基及其5’側之鹼基序列互相的鹼基序列」-「ALK2基因區域之變異部位之1個鹼基3’側之鹼基及其3’側之鹼基序列不雜交的鹼基序列」-3’(片)而成的寡核苷酸探針。又，調製「具有與ALK2基因區域之變異部位之鹼基及其3’側之鹼基序列互補的鹼基序列的寡核苷酸探針」。其次，使上述2種類之寡核苷酸探針與調製的DNA雜交。其次，將經雜交的DNA以單股DNA切斷酵素切斷，使片游離。就單股DNA切斷酵素而言，並無特別限制，可列舉例如裂解酶(cleavase)。於本方法中，其次，使為具有與片互補的序列的寡核苷酸探針，且標識有報導子螢光及猝熄劑螢光的寡核苷酸探針與片雜交。其次，測定發生的螢光之強度。其次，將所測定的螢光之強度與對照比較。就此種方法而言，可列舉例如，侵入法(Invader method)等。

又於另外的方法中，首先，自生物學的試料調製DNA或cDNA試料。其次，將包含ALK2基因區域之變異部位的DNA增幅。而且，使增幅的DNA解離成單股，所解離的單股DNA中，僅分離單鏈。其次，由ALK2基因區域之變異部位的鹼基的附近1個鹼基接著1個鹼基進行伸長反應，使此時所生成的焦磷酸酵素性發光，測定發光的強度。然後，將所測定的螢光之強度與對照比較。就此種方法而言，可列舉例如，焦磷酸定序法(pyrosequencing method)等。

又於另外的方法中，首先，自生物學的試料調製DNA或cDNA試料。其次，將包含ALK2基因區域之變異部位的DNA增幅。其次，調製「具有與ALK2基因區域之變異部位之鹼基的1個鹼基3’側之鹼基及其3’側之鹼基序列互補的鹼基序列的寡核苷酸引子」。其次，於經螢光標示的核苷酸存在下，將增幅的DNA作為模板，使用調製的引子而進行一鹼基伸長反應。然後，測定螢光之偏光度。其次，將所測定的螢光之偏光度與對照比較。就此種方法而言，可列舉例如，AcycloPrime法等。

又於另外的方法中，首先，自生物學的試料調製DNA或cDNA試料。其次，將包含ALK2基因區域之變異部位的DNA增幅。其次，調製「具有與ALK2基因區域之變異部位之鹼基的1鹼基3’側之鹼基及其3’側之鹼基序列互補的鹼基序列的寡核苷酸引子」。其次，於經螢光標示的核苷酸存在下，將經增幅的DNA作為模板，使用調製的引子，而進行一鹼基伸長反應。其次，判定一鹼基伸長反應所使用的鹼基種類。其次，將經判定的鹼基種類與對照比較。就此種方法而言，可列舉例如，SNuPE法等。

又，自生物學的試料調製的試料可為蛋白質。此種情形，為了檢測變異，可利用使用會特異性地與因該變異而發生胺基酸變化的部位結合之分子(例如，抗體)的方法等。

4.異位性骨化及/或腦腫瘤之檢測

藉由經由ALK2的BMP訊息傳達，而異位性骨化及/或腦腫瘤會被引發。

「異位性骨化」係意指於原本沒有骨骼的部位有骨骼形成。就「異位性骨化」而言，可列舉進行性骨化性纖維形成異常症(FOP)、進行性骨異形成(POH)等，但只要為藉由經由具有活性化型變異的ALK2的BMP訊息傳達而被引起的異位性骨化，則不限定於此等。

「腦腫瘤」意指於頭蓋內組織產生的腫瘤。就「腦腫瘤」而言，可列舉瀰漫型內因性橋腦神經膠細胞瘤(DIPG)、腦幹神經膠瘤(brain stem glioma)、神經膠母細胞瘤(glioblastoma)、多形性神經膠母細胞瘤(GBM)、非神經膠母細胞瘤腦腫瘤、腦脊髓膜瘤(meningioma)、中樞神經系統淋巴瘤、神經膠質瘤、星狀細胞瘤、未分化星狀細胞瘤、寡樹突細胞瘤(oligodendroglioma)、寡星狀膠質瘤(oligoastrocytoma)、神經管胚細胞瘤(medulloblastoma)、管膜瘤(ependymoma)等，但只要為藉由經由具有活性化型變異的ALK2的 BMP訊息傳達而被引起的腦腫瘤，則不限定於此等。

ALK2係結合BMP的跨膜型之絲胺酸蘇胺酸激酶受體，於N末端側之細胞外區域結合BMP，並藉由細胞內之絲胺酸蘇胺酸激酶而將下游之細胞內資訊傳達系統活性化。骨形成蛋白質(BMP)為屬於轉形生長因子β(transforming growth factor β(TGF-β))超家族的多機能成長因子，已有約20個之BMP家族成員被鑑定。BMP因已被確認於包含骨骼肌組織的軟組織中會誘導異位性骨形成，而被認為參與促進異常骨形成的疾病。相較於ALK2，BMP-2或BMP-4被認為對ALK3的親和性較高。相較於ALK2，ALK3係普遍存在地表現，認為因此而於各式各樣的部位誘導異位性骨化的實驗中，一般而言常使用BMP-2或BMP-4。另一方面認為，BMP-7對ALK2的親和性相對較高，且BMP-9通常對ALK1的親和性高，但已知對ALK2亦具有比較高的親和性。在FOP，由於發生經由ALK2的異位性骨化，因此認為可藉由驗證對於因BMP-7及BMP-9之經由ALK2的訊息之活性化所致異位性骨誘導的藥效，而確認對FOP的治療及/或預防效果之有無。

若於BMP存在下培養肌母細胞(myoblast)(C2C12細胞)，則藉由對BMP特異性的細胞內訊息傳達機構，而向成熟肌細胞之分化被抑制，取而代之，會誘導向成骨細胞的分化。因此，可藉由使用了C2C12細胞之利用BMP的向成骨細胞的分化誘導模式，而解析經由ALK2的BMP訊息傳達。

5.抗ALK2抗體之製造

本發明中所使用的抗ALK2的抗體，可按照周知之方法(例如，Kohler and Milstein,Nature(1975)256,p.495-497、Kennet,R.ed.,Monoclonal Antibodies,p.365-367,Plenum Press,N.Y.(1980))獲得。即，可藉由使產生抗ALK2的抗體的抗體產生細胞與骨髓瘤細胞融合而建立融合瘤，而獲得單株抗體。所取得的抗體係藉由試驗對ALK2的結合性及交聯能力，而可篩選能適用於人類疾病的抗體。

又，本說明書中，分配賦予抗體特徵的CDR/FR的胺基酸位置係按照KABAT編號分配(KABAT et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。

本發明所使用的抗體中，除了上述對ALK2的單株抗體，亦包含同樣具有治療/預防效果之例如多株抗體、或以使對人類的異種抗原性降低等為目的而人為地進行了改變的基因重組型抗體(例如，嵌合(chimeric)抗體、人類化(humanized)抗體、人類抗體等)。此等之抗體可使用已知方法而製造。

就嵌合抗體而言，可列舉抗體之可變區與恆定區(Fc)彼此為異種的抗體，例如，將來自小鼠或大鼠的抗體之可變區與來自人類的恆定區接合的嵌合抗體(參照Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81,6851-6855 (1984))。

就人類化抗體而言，可列舉僅將CDR組入來自人類的抗體的抗體(參照Nature(1986)321,p.522-525)、藉由CDR移植法而除了CDR之序列外將一部分之框架區胺基酸殘基亦移植於人類抗體的抗體(國際公開第WO90/07861號)。

就於本發明可利用的抗ALK2抗體之例而言，未限定於以下者，但可列舉例如以下之包含重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列的抗ALK2抗體。

一種抗ALK2抗體，前述抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段之重鏈序列包含具有CDRH1、CDRH2、CDRH3的可變區，且前述CDRH1、CDRH2、及CDRH3各自由下列所示胺基酸序列而成：序列識別號5、序列識別號6、及序列識別號7；序列識別號11、序列識別號12、及序列識別號13；序列識別號18、序列識別號19、及序列識別號20；或序列識別號24、序列識別號25、及序列識別號26；以及輕鏈序列包含具有CDRL1、CDRL2、CDRL3的可變區，且前述CDRL1、CDRL2、及CDRL3各自由下列所示胺基酸序列而成：序列識別號8、序列識別號9、及序列識別號10；序列識別號8、序列識別號17、及序列識別號10；序列識別號14、序列識別號15、及序列識別號16；序列識別號21、序列識別號22、及序列識別號23；或序列識別號27、序列識別號28、及序列識別號29；或者，與前述抗ALK2抗體競爭對前述ALK2之結合，且具有交聯前述ALK2的性質及抑制BMP訊息傳達的性質的抗體。

或者，一種抗ALK2抗體，前述抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段之重鏈可變區序列為：a1)由序列識別號31所示的胺基酸序列之第20號~第142號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列；a2)由序列識別號33所示的胺基酸序列之第20號~第142號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列；a3)由序列識別號34所示的胺基酸序列之第20號~第140號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列；a4)由序列識別號36所示的胺基酸序列之第20號~第140號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列；a5)由序列識別號38所示的胺基酸序列之第20號~第140號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列；a6)由序列識別號39所示的胺基酸序列之第20號~第140號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列；a7)與選自前述a1)至a6)之胺基酸序列的任一者之胺基酸序列具有至少95%之同一性的胺基酸序列；a8)與選自前述a1)至a6)之胺基酸序列的任一者之胺基酸序列具有至少99%之同一性的胺基酸序列；或a9)於選自前述a1)至a6)之胺基酸序列的任一者之胺基酸序列有1或數個之胺基酸殘基被取代、刪除或添加的胺基酸序列；以及輕鏈可變區序列為：b1)由前述序列識別號32所示的胺基酸序列之第21號~第133號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列；b2)由前述序列識別號35所示的胺基酸序列之第21號~第129號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列；b3)由前述序列識別號37所示的胺基酸序列之第21號~第129號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列；b4)與選自前述b1)至b3)之胺基酸序列的任一者之胺基酸序列具有至少95%之同一性的胺基酸序列；b5)與選自前述b1)至b3)之胺基酸序列的任一者之胺基酸序列具有至少99%之同一性的胺基酸序列；或b6)於選自前述b1)至b3)之胺基酸序列的任一者之胺基酸序列有1或數個之胺基酸殘基被取代、刪除或添加的胺基酸序列；或者，與前述抗ALK2抗體競爭對前述ALK2之結合，且具有交聯前述ALK2的性質及抑制BMP訊息傳達的性質的抗體。

進一步具體而言，作為本發明可利用的抗ALK2抗體之例，可列舉本發明人等於WO2016/121908揭示的抗ALK2抗體。

就大鼠抗ALK2抗體之例而言，可列舉WO2016/121908之實施例1記載之A2-11E、A2-15A、A2-25C、A2-27D。

就人類嵌合化抗ALK2抗體之例而言，可列舉WO2016/121908之實施例5記載之cA2-15A、cA2-27D。

就源自A2-15A抗體之人類化抗體而言，只要包含A2-15A之6種全部的CDR序列，且具有對ALK2的結合性及交聯能力，就包含於本發明所使用的抗體。又，A2-15A抗體之重鏈可變區包含由序列識別號5所示的胺基酸序列而成的CDRH1(GFTFSHYYMA)、由序列識別號6所示的胺基酸序列而成的CDRH2(SITNSGGSINYRDSVKG)、及由序列識別號7所示的胺基酸序列而成的CDRH3(EGGENYGGYPPFAY)。又，A2-15A抗體之輕鏈可變區包含由序列識別號8所示的胺基酸序列而成的CDRL1(RANQGVSLSRYNLMH)、由序列識別號9所示的胺基酸序列而成的CDRL2(RSSNLAS)、及由序列識別號10所示的胺基酸序列而成的CDRL3(QQSRESPFT)。再者，又，包含與前述A2-15A抗體競爭對前述ALK2的結合，且具有交聯前述ALK2的性質及抑制BMP訊息傳達的性質的抗體。

就源自A2-27D抗體之人類化抗體而言，只要包含A2-27D之6種全部之CDR序列，且具有對ALK2的結合性及交聯能力，就包含於本發明所使用的抗體。又，A2-27D抗體之重鏈可變區包含由序列識別號11所示的胺基酸序列而成的CDRH1(GSTFSNYGMK)、由序列識別號12所示的胺基酸序列而成的CDRH2(SISRSSTYIYYADTVKG)、及由序列識別號13所示的胺基酸序列而成的CDRH3(AISTPFYWYFDF)。又，A2-27D 抗體之輕鏈可變區包含由序列識別號14所示的胺基酸序列而成的CDRL1(LASSSVSYMT)、由序列識別號15所示的胺基酸序列而成的CDRL2(GTSNLAS)、及由序列識別號16所示的胺基酸序列而成的CDRL3(LHLTSYPPYT)。再者，又，包含與前述A2-27D抗體競爭對前述ALK2的結合，且具有交聯前述ALK2的性質及抑制BMP訊息傳達的性質的抗體。

就源自A2-11E抗體之人類化抗體而言，只要包含A2-11E之6種全部之CDR序列，且具有對ALK2的結合性及交聯能力，就包含於本發明所使用的抗體。又，A2-11E抗體之重鏈可變區包含由序列識別號18所示的胺基酸序列而成的CDRH1(GFTFSNYYMY)、由序列識別號19所示的胺基酸序列而成的CDRH2(SINTDGGSTYYPDSVKG)、及由序列識別號20所示的胺基酸序列而成的CDRH3(STPNIPLAY)。又，A2-11E抗體之輕鏈可變區包含由序列識別號21所示的胺基酸序列而成的CDRL1(KASQNIYKYLN)、由序列識別號22所示的胺基酸序列而成的CDRL2(YSNSLQT)、及由序列識別號23所示的胺基酸序列而成的CDRL3(FQYSSGPT)。再者，包含與前述A2-11E抗體競爭對前述ALK2之結合，且具有交聯前述ALK2的性質及抑制BMP訊息傳達的性質的抗體。

就源自A2-25C抗體之人類化抗體而言，只要包含A2-25C之6種全部之CDR序列，且具有對ALK2的結合性及交聯能力，就包含於本發明所使用的抗體。又，A2-25C抗體之重鏈可變區包含由序列識別號24所示的胺基酸序列而成的CDRH1(GFTFSYYAMS)、由序列識別號25所示的胺基酸序列而成的CDRH2(SISRGGDNTYYRDTVKG)、及由序列識別號26所示的胺基酸序列而成的CDRH3(LNYNNYFDY)。又，A2-25C抗體之輕鏈可變區包含由序列識別號27所示的胺基酸序列而成的CDRL1(QASQDIGNWLS)、由序列識別號28所示的胺基酸序列而成的CDRL2(GATSLAD)、及由序列識別號29所示的胺基酸序列而成的CDRL3(LQAYSAPFT)。再者，又，包含與前述A2-25C抗體競爭對前述ALK2之結合，且具有交聯前述ALK2的性質及抑制BMP訊息傳達的性質的抗體。

又，進一步將各CDR中之1~3個之胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基的CDR改變人類化抗體，亦只要具有對ALK2的結合性及交聯能力，就包含於本發明所使用的抗體。就CDRL2中的胺基酸取代例而言，可列舉於序列識別號30所示的胺基酸序列(人類化hA2-15A-L4)中，取代1個胺基酸的CDRL2。較佳為由序列識別號17所示的胺基酸序列而成的CDRL2(RSSNLAQ)。

就源自A2-15A抗體之人類化抗體之實例而言，可列舉包含下列重鏈及輕鏈的抗體，其包含：包含由序列識別號31所示的胺基酸序列(人類化hA2-15A-H4)之20~142號之胺基酸殘基而成的重鏈可變區序列的重鏈及包含由序列識別號32所示的胺基酸序列(人類化 hA2-15A-L6)之第21~133號之胺基酸殘基而成的輕鏈可變區序列的輕鏈；或包含由序列識別號33所示的胺基酸序列(人類化hA2-15A-H4 IgG2)之第20~142號之胺基酸殘基而成的重鏈可變區序列的重鏈及包含由序列識別號32所示的胺基酸序列之第21~133號之胺基酸殘基而成的輕鏈可變區序列的輕鏈；或者與前述A2-15A抗體之任一者競爭對前述ALK2之結合，且具有交聯前述ALK2的性質及抑制BMP訊息傳達的性質的抗體。

就適合的組合而言，可列舉包含下列重鏈及輕鏈的抗體：包含由序列識別號31所示的胺基酸序列之第20~472號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列的重鏈及包含由序列識別號32所示的胺基酸序列之第21~238號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列的輕鏈；或包含由序列識別號33所示的胺基酸序列之第20~468號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列的重鏈及包含由序列識別號32所示的胺基酸序列之第21~238號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列的輕鏈；或者與前述抗體之任一者競爭對前述ALK2的結合，且具有交聯前述ALK2的性質及抑制BMP訊息傳達的性質的抗體。

就源自A2-27D抗體之人類化抗體之實例而言，可列舉包含下列重鏈及輕鏈的抗體，其包含：包含由序列識別號34所示的胺基酸序列(人類化hA2-27D-H2)之第20~140號之胺基酸殘基而成的重鏈可變區序列的重鏈及包含由序列識別號35所示的胺基酸序列(人類化hA2-27D-L2)之第21~129號之胺基酸殘基而成的輕鏈可變區序列的輕鏈；包含由序列識別號36所示的胺基酸序列(人類化hA2-27D-H3)之第20~140號之胺基酸殘基而成的重鏈可變區序列的重鏈及包含由序列識別號37所示的胺基酸序列(人類化hA2-27D-L4)之第21~129號之胺基酸殘基而成的輕鏈可變區序列的輕鏈；包含由序列識別號38所示的胺基酸序列(人類化hA2-27D-H2-LALA)之第20~140號之胺基酸殘基而成的重鏈可變區序列的重鏈及包含由序列識別號35所示的胺基酸序列之第21~129號之胺基酸殘基而成的輕鏈可變區序列的輕鏈；或包含由序列識別號39所示的胺基酸序列(人類化hA2-27D-H3-LALA)之第20~140號之胺基酸殘基而成的重鏈可變區序列的重鏈及包含由序列識別號37所示的胺基酸序列之第21~129號之胺基酸殘基而成的輕鏈可變區序列的輕鏈；或者與前述抗體之任一者競爭對前述ALK2的結合，且具有交聯前述ALK2的性質及抑制BMP訊息傳達的性質的抗體。

就適合的組合而言，可列舉包含下列重鏈及輕鏈的抗體，其包含：包含由序列識別號34所示的胺基酸序列之第20~470號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列的重鏈及包含由序列識別號35所示的胺基酸序列之第21~234號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列的輕鏈；包含由序列識別號36所示的胺基酸序列之第20~470號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列的重鏈及包含由序列識別號37所示的胺基酸序列之第21~234號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列的輕鏈；包含由序列識別號38所示的胺基酸序列之第20~470號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列的重鏈及包含由序列識別號35所示的胺基酸序列之第21~234號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列的輕鏈；或包含由序列識別號39所示的胺基酸序列之第20~470號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列的重鏈及包含由序列識別號37所示的胺基酸序列之第21~234號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列的輕鏈；或者與前述抗體之任一者競爭對前述ALK2的結合，且具有交聯前述ALK2的性質及抑制BMP訊息傳達的性質的抗體。

本發明中所使用的抗體而言，可進一步列舉人類抗體。抗ALK2人類抗體意指僅具有源自人類染色體之抗體之基因序列的人類抗體。抗ALK2人類抗體可藉由使用具有含人類抗體之重鏈與輕鏈之基因的人類染色體片段的人類抗體產生小鼠之方法(參照Tomizuka,K.et al.,Nature Genetics(1997)16,p.133-143,；Kuroiwa,Y.et.al.,Nucl.Acids Res.(1998)26,p.3447-3448；Yoshida,H.et.al.,Animal Cell Technology：Basic and Applied Aspects vol.10,p.69-73(Kitagawa,Y.,Matsuda,T.and Iijima,S.eds.),Kluwer Academic Publishers,1999.；Tomizuka,K.et.al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)97,p.722-727等)而取得。

此種人類抗體產生小鼠，具體而言，可藉由基因剃除動物及轉基因動物的製作、及此等動物彼此交配，而作出使內源性免疫球蛋白(endogenous immunoglobulin)重鏈及輕鏈之基因座被破換，且經由人類人工染色體(human artificial chromosome，HAC)載體或小鼠人工染色體(mouse artificial chromosome，MAC)載體等之載體而導入人類免疫球蛋白重鏈及輕鏈之基因座作為取代的基因重組動物。

又，藉由基因重組技術，而利用編碼此種人類抗體之重鏈及輕鏈之各者的cDNA，較佳為利用含該cDNA的載體來將真核細胞轉形，並培養產生基因重組人類單株抗體的轉形細胞，藉此亦可自培養上清液中獲得此抗體。其中，就宿主而言，可使用例如真核細胞，較佳為CHO細胞、淋巴球、或骨髓瘤等之哺乳動物細胞。

又，亦已知取得自人類抗體庫挑選之來自噬菌體顯示(phage display)之人類抗體的方法(參照Wormstone,I.M.et.al,Investigative Ophthalmology & Visual Science.(2002)43(7),p.2301-2308；Carmen,S.et.al.,Briefings in Functional Genomics and Proteomics(2002),1(2),p.189-203；Siriwardena,D.et.al.,Ophthalmology(2002)109(3),p.427-431等)。

例如，可使用將人類抗體之可變區作為單鏈抗體(scFv)而使其於噬菌體表面表現，而選擇與抗原結合的噬菌體的噬菌體顯示法(Nature Biotechnology(2005),23,(9),p.1105-1116)。藉由解析與抗原結合而選擇的噬菌體之基因，可決定編碼與抗原結合的人類抗體之可變區的DNA序列。若與抗原結合的scFv之DNA序列變得清楚，則可藉由製作具有該序列的表現載體，導入適當宿主使其表現，而取得人類抗體(WO92/01047、 WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438、WO95/15388、Annu.Rev.Immunol(1994)12,p.433-455、Nature Biotechnology(2005)23(9),p.1105-1116)。

就於本發明可利用的抗ALK2抗體而言，亦包含與WO2016/121908揭示的抗ALK2抗體具有相同表位的抗體。可列舉例如，與A2-11E抗體、A2-15A抗體、A2-25C抗體及/或A2-27D抗體具有相同表位的抗體。

抗體結合或辨識抗原之部分高次構造的情形，該抗體之表位可使用X射線構造解析，藉由特定與該抗體鄰接的抗原上之胺基酸殘基而決定。例如，藉由使抗體或其片段及抗原或使其片段結合而結晶化，進行構造解析，可特定與抗體具有相互作用距離的抗原上之胺基酸殘基。相互作用距離為8埃(Å)以下，適合為6埃以下，更適合為4埃以下。此種具有與抗體之相互作用距離的胺基酸殘基能以1個或其以上而構成抗體之表位(抗原結合部位)。該胺基酸殘基為2個以上的情形，各胺基酸可於一次序列上彼此不鄰接。

與上述ALK2蛋白質之表位結合的抗體或其抗原結合片段之例係如以下。

抗ALK2抗體或其抗原結合片段可與由人類ALK2之胺基酸序列(序列識別號1)中之第21號~123號之胺基酸殘基而成的多肽特異性結合。

A2-27D抗體會辨識人類ALK2上之部分高次構造。人類ALK2之胺基酸序列(序列識別號1)中，與 A2-27D抗體具有相互作用距離的胺基酸殘基，即表位，係由第38號之麩胺酸(Glu)、第39號之甘胺酸(Gly)、第59號之異白胺酸(Ile)、第60號之天冬醯胺(Asn)、第61號之天冬胺酸(Asp)、第62號之甘胺酸(Gly)、第63號之苯丙胺酸(Phe)、第64號之組胺酸(His)、第65號之纈胺酸(Val)、第66號之酪胺酸(Tyr)、第102號之天冬醯胺(Asn)、第104號之蘇胺酸(Thr)、第106號之麩醯胺酸(Gln)、第107號之白胺酸(Leu)之各殘基所構成。與該表位結合、或與該胺基酸殘基具有相互作用距離的抗體、其抗原結合片段或其修飾體亦包含於本發明所使用的抗體。

A2-25C抗體會辨識人類ALK2上之部分高次構造。人類ALK2之胺基酸序列(序列識別號1)中，與A2-25C抗體具有相互作用距離的胺基酸殘基，即表位，係由第38號之麩胺酸(Glu)、第39號之甘胺酸(Gly)、40號之白胺酸(Leu)、第59號之異白胺酸(Ile)、第60號之天冬醯胺(Asn)、第61號之天冬胺酸(Asp)、第62號之甘胺酸(Gly)、第63號之苯丙胺酸(Phe)、第64號之組胺酸(His)、第65號之纈胺酸(Val)、第66號之酪胺酸(Tyr)、第104號之蘇胺酸(Thr)之各殘基所構成。與該表位結合、或與該胺基酸殘基具有相互作用距離的抗體、其抗原結合片段或其修飾體亦包含於本發明所使用的抗體。

或者，抗ALK2抗體或其抗原結合片段亦可為與上述之抗ALK2抗體或其抗原結合片段(例如，A2-27D抗體、A2-25C抗體等)競爭對ALK2的結合的抗體或其抗原結合片段。

上述之抗體可依據WO2016/121908之實施例2、實施例6、實施例9或實施例10所示方法等而評價對抗原的結合性，並選出適合的抗體。抗體之解離常數(K_D)，例如1×10^-6~1×10^-12M、或其以下，但只要可獲得目的之治療或預防效果，則不限定於此範圍。抗體與抗原(ALK2)之解離常數可使用以表面電漿共振(SPR)為檢測原理的Biacore T200(GE Healthcare Bioscience公司)來測定。例如，對作為配位體而對固定化的抗原，使設定為適當濃度的抗體與分析物反應，藉由測量其結合及解離，可獲得結合速度常數k_a1、解離速度常數k_d1及解離常數(K_D；K_D=k_d1/k_a1)。對ALK2的結合性評價並未限定於Biacore T200之使用，亦可為藉由將表面電漿共振(SPR)作為檢測原理的機器、將結合平衡除外法(動力學排除分析法(Kinetic Exclusion Assay))作為檢測原理的KinExA(Sapidyne Instruments公司)、將生物膜層干涉法(Bio-Layer Interferometry)作為檢測原理的BLItz系統(Pall公司)或者ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)法等。

上述之抗體，例如，可藉由後述之實施例4所示的方法等而評價對抗原的交聯能力，篩選適合的抗體。即，可使用NanoLuc Binary Technology：NanoBiT(Promega公司)，使ALK2與LgBiT或與SmBiT的融合體於活體外細胞內使表現，利用LgBiT及SmBiT之構造的互補性所致的發光來檢測抗體與ALK2蛋白質的相互作用。

就比較抗體性質之際之另一指標之一例而言，可列舉抗體之安定性。示差掃描熱析儀(DSC)係可快速或正確地測量作為蛋白之相對構造安定性之良好指標的熱變性中點(Tm)的方法。使用DSC來測量Tm值，藉由比較其值，可比較熱安定性的差異。已知抗體之保存安定性與抗體之熱安定性呈現某程度的相關(Lori Burton,et.al.,Pharmaceutical Development and Technology(2007)12,p.265-273)，將熱安定性作為指標，可選出適合的抗體。作為用以選出抗體的其他指標，可列舉適當宿主細胞中的產量高、及於水溶液中之凝集性低。例如產量之最高抗體並非皆顯示最高熱安定性，有必要基於以上所述指標而綜合性地判斷，來選出最適合對人類投予的抗體。

又，亦已知將抗體之重鏈及輕鏈之全長序列使用適當連結物(linker)來連結，而取得單鏈免疫球蛋白(single chain immunoglobulin)的方法(Lee,H-S,et.al.,Molecular Immunology(1999)36,p.61-71；Shirrmann,T.et.al.,mAbs(2010),2,(1)p.1-4)。此種單鏈免疫球蛋白藉由作二聚體化，可保持與原本為四聚體的抗體類似的構造及活性。又，本發明所使用的抗體可為具有單一之重鏈可變區，且不具有輕鏈序列的抗體。此種抗體稱為單一結構域抗體(single domain antibody：sdAb)或奈米抗體(nanobody)或駱駝科(Camelidae)抗體(重鏈抗體)，已報告實際上於駱駝或駱馬被觀察到，且保持有抗原結合能力(Muyldemans S.et.al.,Protein Eng.(1994)7(9),1129-35,Hamers-Casterman C.et.al.,Nature(1993)363(6428)446-8)。上述之抗體亦可解釋為本發明中的抗體之抗原結合片段之一種。

又，本發明所使用的抗體，藉由調節結合的糖鏈修飾，可增強抗體依存性細胞毒殺活性(antibody-dependentcellular cytotoxicity)。就抗體之糖鏈修飾之調節技術而言，已知WO99/54342、WO2000/61739、WO2002/31140等，但並不限定於此等。

一旦單離抗體基因後，導入適當宿主而製作抗體的情形，可使用適當宿主與表現載體之組合。

就抗體基因之具體例而言，可列舉編碼WO2016/121908記載的抗體之重鏈序列的基因(或多核苷酸)、編碼輕鏈序列的基因(或多核苷酸)、或者，組合彼等基因(或多核苷酸)者。

將宿主細胞轉形之際，重鏈序列基因(或多核苷酸)與輕鏈序列基因(或多核苷酸)可被插入相同之表現載體，又亦可被插入不同的表現載體。將真核細胞作為宿主使用的情形，可使用動物細胞、植物細胞、真核微生物。就動物細胞而言，可列舉哺乳類細胞，例如，為猴細胞的COS細胞(Gluzman,Y.Cell(1981)23,p.175-182、ATCC CRL-1650)、小鼠纖維母細胞NIH3T3(ATCC No.CRL-1658)或中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞、ATCC CCL-61)之二氫葉酸還原酵素缺損株(Urlaub,G.and Chasin,L.A.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. (1980)77,p.4126-4220)。又，使用原核細胞的情形，可列舉例如，大腸菌、枯草菌。可藉由利用轉形而將為目的之抗體基因導入此等之細胞，將經轉形細胞於活體外培養，而獲得抗體。於以上之培養法中，有依抗體之序列而產量不同的情形，可以產量為指標而自具有同等結合活性的抗體之中挑選容易作為醫藥生產者。

就本發明中所使用的抗體之同型(isotype)而言，只要具有對ALK2的交聯能力者即可，可列舉例如IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA(IgA1、IgA2)、IgD或者IgE等，但較佳為IgG或IgM，更佳為IgG1、IgG2或IgG4。

使用IgG1作為本發明所使用的抗體之同型的情形，係藉由將恆定區之胺基酸殘基的一部分取代，而可調整效應物(effector)機能(參照WO88/07089、WO94/28027、WO94/29351)。就IgG1之變異體而言，可列舉IgG1 LALA(IgG1-L234A，L235A)、IgG1 LAGA(IgG1-L235A，G237A)等，較佳為IgG1 LALA。

使用IgG4作為本發明所使用的抗體之同型的情形，係藉由將恆定區之胺基酸殘基之一部分作取代，而IgG4特有的分割被抑制，可延長半衰期(參照(Molecular Immunology,30,1 105-108(1993))。就IgG4之變異體而言，可列舉IgG4 pro(IgG4-S241P)等。

又本發明所使用的抗體，可為具有抗體之抗原結合部的抗體之抗原結合片段或其修飾物。將抗體以木瓜酵素、胃蛋白酶等之蛋白質分解酵素處理，或者將抗體基因藉由基因工程手法改造而於適當培養細胞中表現，藉此可獲得該抗體之片段。於此種抗體片段中，可將保持抗體全長分子所具有的機能全部或一部分的片段稱為抗體之抗原結合片段。就抗體之機能而言，一般可列舉抗原結合性、抑制抗原活性的活性、增強抗原活性的活性、抗體依存性細胞毒殺活性、補體依存性細胞毒殺活性、及補體依存性細胞性細胞毒殺活性。本發明中的抗體之抗原結合片段所保持的機能為對ALK2的結合性及交聯能力。對ALK2的結合性係指抗體或抗原結合片段與ALK2分子(較佳為特異性地)結合的性質，較佳為抑制ALK2之活性，更佳為抑制經由ALK2的BMP訊息傳達，最佳為抑制、輕減或退縮異位性骨化及/或腦腫瘤的活性。

例如，就抗體之片段而言，可列舉F(ab’)₂等。

本發明中所使用的抗體可為多量化而提高了對抗原的親和性者。就多量化的抗體而言，可為1種類之抗體，亦可為辨識相同抗原之複數個表位的複數之抗體。就將抗體多量化的方法而言，可列舉IgG CH3結構域與2個之scFv的結合、與鏈親和素(streptavidin)的結合、螺旋-轉角-螺旋基序(helix-turn-helix motif)之導入等。

本發明中所使用的抗體可為胺基酸序列不同的複數種類之抗ALK2抗體之混合物的多株抗體。就多株抗體之一例而言，可列舉CDR不同的複數種類之抗體之混合物。就此種多株抗體而言，可培養產生不同抗體的細胞之混合物，使用自該培養物純化的抗體(參照WO2004/061104)。

本發明中所使用的抗體，可為與上述之抗體之重鏈及/或輕鏈比較而具有80%~99%之同一性的抗體。其中，「同一性」的用語係設為具有於所屬技術領域使用的一般的定義者。同一性之%係指將2個胺基酸序列以使胺基酸的一致性程度成為最大的方式並列(alignment)時每一總計胺基酸數(包含缺口)之相同胺基酸數的百分比。可藉由組合顯示與上述之重鏈胺基酸序列及輕鏈胺基酸序列高同一性的序列，而選擇具有與上述之各抗體同等之抗原結合能力、BMP訊息傳遞之抑制作用及交聯能力的抗體。此種同一性一般而言為80%以上或85%以上之同一性，較佳為90%以上、91%以上、92%以上、93%以上或94%以上之同一性，更佳為95%以上、96%以上、97%以上或98%以上之同一性，最佳為99%以上之同一性。又，藉由將於重鏈及/或輕鏈之胺基酸序列有1或數個之胺基酸殘基取代、刪除及/或附加的胺基酸序列組合，亦可選擇具有與上述之各抗體同等之各種作用的抗體。取代、刪除及/或附加的胺基酸殘基數，一般而言為10個胺基酸殘基以下，較佳為5~6個胺基酸殘基以下，更佳為2~3個胺基酸殘基以下，最佳為1個胺基酸殘基。

又，已知於哺乳類培養細胞生產的抗體之重鏈的羧基末端之離胺酸殘基有缺失(Journal of Chromatography A,705：129-134(1995))，又，已知相同地重鏈羧基末端之甘胺酸、離胺酸之2個胺基酸殘基有缺失，位於新的羧基末端的脯胺酸殘基被醯胺化者(Analytical Biochemistry,360：75-83(2007))。

進一步又已知於抗體之製作時，抗體之重鏈或輕鏈之N末端之麩醯胺酸或麩胺酸殘基經焦麩胺醯基(pyroglutamyl)化修飾者，本發明所使用的抗體可具有如此修飾(WO2013/147153)。

然而，此等重鏈序列之缺失、或重鏈或輕鏈序列之修飾並不影響抗體之抗原結合能力及效應物機能(補體之活性化或抗體依存性細胞毒殺作用等)。

因此，本發明所使用的抗體中亦包含受到該缺失或修飾的抗體，可列舉於重鏈羧基末端有1或2個胺基酸缺失的缺失體、及經醯胺化的該缺失體(例如，羧基末端部位之脯胺酸殘基經醯胺化的重鏈)、重鏈或輕鏈之N末端胺基酸殘基經焦麩胺醯基化的抗體等。惟，只要保有抗原結合能力及效應物機能，本發明中所使用的抗體之重鏈之羧基末端之缺失體並不限定於上述之種類。構成本發明中所使用的抗體的2條重鏈可為完全長度及選自包含上述缺失體的群組的重鏈之任一種，亦可為組合任意二種者。各缺失體之量比雖受到產生本發明所使用的抗體的哺乳類培養細胞的種類及培養條件的影響，但作為抗體之主成分，可列舉2條重鏈之雙方，羧基末端之1個胺基酸殘基有缺失的情形。

二種類之胺基酸序列間之同一性可藉由使用Blast algorithm version 2.2.2(Altschul,Stephen F., Thomas L.Madden,Alejandro A.Schaffer,Jinghui Zhang,Zheng Zhang,Webb Miller,and David J.Lipman(1997),「Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database search programs」,Nucleic Acids Res.25：3389-3402)之默認參數(defaultparameter)來決定。Blast algorithm亦可藉由於網際網路存取www.ncbi.nlm.nih.gov/blast來使用。又，藉由上述之Blast algorithm計算同一性(Identity(或Identities))及正確性(Positivity(或Positivities))之2種類的百分比的值。前者係於應求得同一性的二種類之胺基酸序列之間胺基酸殘基為一致的情形之值，後者係亦考慮化學構造類似的胺基酸殘基的數值。於本說明書中，係將具有胺基酸殘基為一致的情形之同一性(Identity)之值設為同一性之值。

作為抗體之修飾物，亦可使用與聚乙二醇(PEG)等之各種分子結合的抗體。

本發明所使用的抗體進一步可為此等之抗體與其他之藥劑形成結合物(免疫結合物(Immunoconjugate))。就此種抗體之例而言，可列舉該抗體與放射性物質或具有藥理作用的化合物結合之物(Nature Biotechnology(2005)23,p.1137-1146)。

所獲得的抗體可純化至均一。抗體之分離、純化係使用於通常蛋白質使用的分離、純化方法即可。例如若將管柱層析、過濾器過濾、限外濾過、鹽析、透析、調製用聚丙烯醯胺膠體電泳、等電點電泳等適當選擇、組合，可將抗體分離、純化(Strategies for Protein Purification and Characterization：A Laboratory Course Manual,Daniel R.Marshak et al.eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996)；Antibodies：A Laboratory Manual.Ed Harlow and David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory(1988))但未限定於此等。

就層析而言，可列舉親和性層析、離子交換層析、疏水性層析、膠體過濾層析、逆相層析、吸附層析等。

此等之層析可使用HPLC或FPLC等之液體層析來進行。

就於親和性層析使用的管柱而言，可列舉Protein A管柱、Protein G管柱。

例如就使用Protein A管柱的管柱而言，可列舉Hyper D、POROS、Sepharose F.F.(GE HEALTHCARE)等。

又使用將抗原固定化的擔體，而利用對抗原之結合性來純化抗體亦為可能的。

表示本發明中的抗ALK2抗體之與ALK2的結合親和性的K_D值較佳為10^-6M以下，例如10^-7M以下、10^-8M以下、10^-9M以下、10^-10M以下、10^-11M以下、10^-12M以下等。

6.異位性骨化及/或腦腫瘤之治療方法及用以使用於該方法的醫藥組成物

本發明提供起因於ALK2之活性化型變異的疾病之治療及/或預防方法，其包含使用來自患者的生物學的試料，檢測該生物學的試料中之ALK2的活性化型變異的有無，對於具有ALK2之活性化型變異且於第330號之胺基酸殘基(人類ALK2序列的情形為脯胺酸殘基)無變異的患者，投予抗ALK2抗體。就起因於ALK2之活性化型變異的疾病而言，可列舉例如，進行性骨化性纖維形成異常症(FOP)、進行性骨異形成(POH)、外傷性之異位性骨化、人工關節取代術後之異位性骨化、瀰漫型內因性橋腦神經膠細胞瘤(DIPG)、脊椎關節炎(SpA)、強直性脊椎炎(AS)、貧血、毛髮稀疏等，較佳為進行性骨化性纖維形成異常症(FOP)、進行性骨異形成(POH)、外傷性之異位性骨化、或人工關節取代術後之異位性骨化，更佳為進行性骨化性纖維形成異常症(FOP)，但若為起因於ALK2之活性化型變異的疾病，並未限定於此等。於FOP之患者亦可見手腳的指癒合或變形、頸椎癒合或變形等，亦觀察到聽力損失，但此等亦包含於起因於ALK2之活性化型變異的疾病。

本發明也為提供一種用以使用於具有異位性骨化的患者之治療及/或預防方法的醫藥組成物，該前述醫藥組成物之特徵為前述患者具有為異位性骨化之原因的ALK2蛋白質之活性化型變異，且前述ALK2之第330號的胺基酸殘基為脯胺酸，以及前述組成物之有效成分為包含與前述ALK2結合的性質、交聯前述ALK2的性質、及抑制BMP訊息傳達的性質之抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段。

於實施形態中，上述方法包含：(a)檢測患者之ALK2之活性化型變異的有無的步驟；(b)篩選具有ALK2之活性化型變異的患者的步驟；(c)確認於患者之ALK2之第330號的胺基酸殘基無變異的步驟；及(d)對篩選出的患者投予抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段的步驟。

於另外的實施形態，上述步驟(c)進一步包含確認患者之ALK2不具有G328V變異的步驟。

又於另外的實施形態，成為上述抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段的投予對象之患者的篩選包含：(a)篩選異位性骨化之患者中的ALK2之活性化型變異的有無的步驟；(b)篩選具有ALK2之活性化型變異的患者的步驟；及(c)排除於ALK2之第330號的胺基酸殘基具有變異的患者的步驟。

於另一實施形態，上述步驟(c)進一步包含排除具有ALK2之G328V變異的患者的步驟。

就本發明中的「異位性骨化」而言，可列舉例如，進行性骨化性纖維形成異常症(FOP)等，較佳為進行性骨化性纖維形成異常症(FOP)。

全部之FOP的患者被認定於ALK2有活性化型突變，迄今已報告10種類以上之突變之種類。已知彼等突變全部為存在於ALK2蛋白質之細胞內區域的胺基酸突變(誤義突變(missense mutation))，於細胞外區域之胺基酸序列無變化。因此，藉由使用與ALK2之細胞外區域結合的抗ALK2抗體，無論變異的種類為何，皆可獲得對FOP的治療及/或預防效果。

FOP之治療意指FOP症狀之治癒、症狀之改善、症狀之減輕、或症狀進行之抑制。

FOP之預防意指回避或抑制病發或異位性骨化發病。

或者，本發明提供一種腦腫瘤之治療及/或預防方法，其包含使用來自患者的生物學的試料，檢測該生物學的試料中之ALK2之活性化型變異的有無，對具有G328V變異以外之ALK2的活性化型變異的患者，投予抗ALK2抗體。

本發明又提供一種用以使用於具有腦腫瘤的患者之治療及/或預防方法的醫藥組成物，該醫藥組成物之特徵為前述患者具有為腦腫瘤之原因的ALK2蛋白質之活性化型變異，以及前述組成物之有效成分為包含與前述ALK2結合的性質、交聯前述ALK2的性質、及抑制BMP訊息傳達的性質之抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段。

就本發明中的「腦腫瘤」而言，可列舉例如，瀰漫型內因性橋腦神經膠細胞瘤(DIPG)、腦幹神經膠瘤、神經膠母細胞瘤、多形性神經膠母細胞瘤(GBM)、非神經膠母細胞瘤腦腫瘤、腦脊髓膜瘤、中樞神經系統淋巴瘤、神經膠質瘤、星細胞瘤、未分化星細胞瘤、寡樹突細胞瘤、寡星狀膠質瘤、神經管胚細胞瘤、管膜瘤等，較佳為瀰漫型內因性橋腦神經膠細胞瘤(DIPG)。

DIPG之患者亦被認定ALK2有活性化型變異。就人類ALK2之變異型而言，已知R206H、R258G、G328E、G328V、G328W、及G356D，除G328V變異以外，與於FOP之患者觀察到的變異共通。除去有G328V變異存在的情形，因抗ALK2抗體顯示ALK2阻礙活性，本發明所使用的抗ALK2抗體於具有除了G328V變異以外的ALK2活性化型變異的患者，具有對DIPG的治療及/或預防效果。

於活體外之由抗ALK2抗體所致的ALK2之生物活性(BMP訊息抑制活性)，可藉由例如，使用插入有BMP反應序列的報導質體(reporter plasmid)的螢光素酶分析、SMAD1/5/8之磷酸化、BMP標的基因之表現解析、或測量利用由BMP配位體所致的刺激而被誘導向成骨細胞分化的小鼠肌母細胞C2C12中的鹼性磷酸酶活性而確認。

於活體內之利用實驗動物的抗ALK2抗體之對異位性骨化治療或預防效果，可藉由例如，對小鼠肌肉移植含有BMP配位體的丸粒的異位性骨化誘導模型、或導入有突變ALK2的FOP模型小鼠，將抗ALK2抗體皮下或靜脈投予，解析異位性骨之形成來確認。或者，對腦腫瘤的治療或預防效果，可藉由例如，對免疫不全小鼠，於腦或皮下等移植來自患者的腫瘤細胞的模式，將抗ALK2抗體皮下或靜脈投予，解析腫瘤的增殖或小鼠的生存日數來確認。

於本發明之方法中，成為治療或預防的對象的患者，為具有ALK2之活性化型變異的患者，且於ALK2之第330號的胺基酸殘基無變異的患者(第330號之胺基酸殘基為脯胺酸的患者)、或無G328V變異的患者(第328號之胺基酸殘基未被取代為纈胺酸的患者)，較佳為不具有ALK2之第330號的胺基酸殘基的變異，且具有除G328V變異以外之ALK2之活性化型變異的患者。就ALK2之活性化型變異而言，可列舉L196P、delP197_F198insL(亦稱為「PF-197-8L」)、R202I、R206H、Q207E、R258S、R258G、G325A、G328E、G328R、G328W、G356D、R375P等，但只要是使ALK2活性化的變異，則不限定於此等。

於本發明所使用的抗ALK2抗體，對於異位性骨化之治療或預防，可以該抗體單獨投予、或者與至少一種之其他之異位性骨化治療劑併用而投予，對於腦腫瘤之治療或預防，可以該抗體單獨投予、或者與至少一種之其他之腦腫瘤治療劑、放射線治療、免疫療法、或化學療法等併用而投予。

就可與抗ALK2抗體併用的其他異位性骨化治療劑而言，可列舉消炎劑、類固醇劑、雙膦酸鹽、肌肉鬆弛劑、視網酸受體(RAR)γ促效劑等，但未限定於此等。

就消炎劑而言，可列舉阿斯匹林(aspirin)、雙氯芬酸(diclofenac)、吲哚美辛(indomethacin)、伊布洛芬(ibuprofen)、酮洛芬(ketoprofen)、萘普生(naproxen)、匹若西卡(piroxicam)、羅菲可西保(rofecoxib)、塞來昔布(celecoxib)、硫唑嘌呤(azathioprine)、青黴胺(penicillamine)、胺甲蝶呤(methotrexate)、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、來氟米特(leflunomide)、英夫利昔單抗(infliximab)、依那西普(etanercept)等，較佳為吲哚美辛、伊布洛芬、匹若西卡、或塞來昔布。

就類固醇劑而言，可列舉普賴蘇穠(prednisolone)、氯地米松(beclomethasone)、貝皮質醇(betamethasone)、氟替卡松(fluticasone)、地塞米松(dexamethasone)、氫化可體松(hydrocortisone)等，較佳為普賴蘇穠。

就雙膦酸鹽而言，可列舉阿侖膦酸鹽(alendronate)、斯孟膦酸鹽(cimadronate)、氯屈膦酸鹽(clodronate)、依替膦酸鹽(etidronate)、伊班磷酸鹽(ibandronate)、因卡膦酸鹽(incadronate)、米諾膦酸鹽(minodronate)、奈立膦酸鹽(neridronate)、奥帕膦酸鹽(olpadronate)、帕米膦酸鹽(pamidronate)、吡膦酸鹽(piridronate)、利塞膦酸鹽(risedronate)、替魯膦酸鹽(tiludronate)、唑來膦酸鹽(zoledronate)等，較佳為帕米膦酸鹽、或唑來膦酸鹽。

就肌肉鬆弛劑而言，可列舉環苯扎林(cyclobenzaprine)、美他沙酮(metaxalone)、巴氯芬(baclofen)等，較佳為巴氯芬。

就視網酸受體γ促效劑而言，可列舉帕羅伐汀(Palovarotene)等。

就可與抗ALK2抗體併用而投予的其他之腦腫瘤治療劑而言，可列舉例如，替莫唑胺(temozolomide)、貝伐單抗(bevacizumab)、卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、鹽酸丙卡巴肼(procarbazine hydrochloride)、長春新鹼(vincristine)等。

按照異位性骨化或腦腫瘤之狀態或以何種程度之治療及/或預防為目標，亦可投予2、3或其以上之其他治療劑，彼等之其他治療劑可藉由封入相同製劑中而同時投予。其他治療劑與抗ALK2抗體亦可藉由封入同一製劑中而同時投予。又，亦可將抗ALK2抗體與其他治療劑封入各別製劑而同時投予。再者，亦可將其他藥劑與抗ALK2抗體互為前後而各別投予。再者，亦可將其他之藥劑與抗ALK2抗體相前後而各別投予。即，投予其他之治療劑後，投予含有抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段作為有效成分的治療劑，或者亦可投予含有抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段作為有效成分的治療劑後，投予其他之治療劑。於基因治療而投予的情形，蛋白質性之異位性骨化或腦腫瘤治療劑之基因與抗ALK2抗體之基因，可插入各別或相同啟動子區域的下游，並可導入各別或相同載體。

藉由使異位性骨化或腦腫瘤治療劑結合抗ALK2抗體、或其片段，可製造M.C.Garnet「Targeted drug conjugates：principles and progress」，Advanced Drug Delivery Reviews，(2001)53，171-216記載之標的型藥物複合體。於此目的，除了抗體分子之外，只要與ALK2之結合能力(或者，辨識性)及對ALK2的交聯能力未完全消失，亦可適用任一種之抗體片段，可列舉例如，以F(ab’)₂等之片段為例。抗ALK2抗體或該抗體之片段與FOP治療劑之結合樣式可有M.C.Garnet「Targeted drug conjugates：principles and progress」,Advanced Drug Delivery Reviews,(2001)53,171-216、G.T.Hermanson「Bioconjugate Techniques」Academic Press,California(1996)、Putnam and J.Kopecek「Polymer Conjugates with Anticancer Activity」Advances in Polymer Science(1995)122,55-123等記載的各種形態。即，可列舉使抗ALK2抗體與異位性骨化或腦腫瘤治療劑化學地直接或介隔寡肽等之間隔物而結合的樣式、介隔適當藥物擔體而結合的樣式。就藥物擔體之例而言，可列舉脂質體、奈米粒子、奈米微胞(nano micelle)、水溶性高分子等之藥物遞送系統(drug delivery system)(例如X.Yu et al.,J Nanomater.2016；2016：doi：10.1155/2016/1087250、J.Wang et al.,Drug Delivery,25：1,1319-1327,DOI：10.1080/10717544.2018.1477857)。作為介隔此等藥物擔體的樣式，更具體而言，可列舉異位性骨化或腦腫瘤治療劑包含於脂質體，而該脂質體與抗體結合的樣式；及異位性骨化或腦腫瘤治療劑化學地直接結合水溶性高分子(分子量1000~10萬左右之化合物)或者介隔寡肽等之間隔物而結合，且該水溶性高分子與抗體結合的樣式為例。抗體(或該片段)與異位性骨化或腦腫瘤治療劑、脂質體及水溶性高分子等之藥物擔體之結合可利用G.T.Hermanson「Bioconjugate Techniques」Academic Press,California(1996)、Putnam and J.Kopecek「Polymer Conjugates with Anticancer Activity」Advances in Polymer Science(1995)122,55-123記載之方法等之所屬技術領域中具通常知識者周知之方法來實施。異位性骨化或腦腫瘤治療劑之包含於脂質體，可利用D.D.Lasic「Liposomes：From Physics to Applications」,Elsevier Science Publishers B.V.,Amsterdam(1993)等記載之方法等之所屬技術領域中具通常知識者周知之方法來實施。異位性骨化或腦腫瘤治療劑之對水溶性高分子的結合，可利用D.Putnam and J Kopecek「Polymer Conjugates with Anticancer Activity」Advances in Polymer Science(1995)122,55-123記載之方法等之所屬技術領域中具通常知識者周知的方法來實施。抗體(或其片段)與蛋白質性之異位性骨化或與腦腫瘤治療劑(例如抗體或其片段)之複合體，除上述之方法外，可利用基因工學之所屬技術領域中具通常知識者周知之方法而製作。

本發明所使用的抗ALK2抗體之投予量，於將人類型抗ALK2抗體對患者投予之際，例如將約0.1~100mg/kg體重於1~180日投予1次或複數次即可。然而，投予量或投予次數一般因考慮患者之性別、體重、年齡、症狀、嚴重程度、副作用等而決定，故並未限定於上述之用量或用法。

本發明所使用的抗ALK2抗體，非限定地，可列舉例如包含點滴的注射劑、栓劑、經鼻劑、舌下劑、經皮吸收劑等。投予路徑為經口路徑或非經口路徑，非經口路徑，非限定地，可列舉例如靜脈內、動脈內、肌肉內、直腸內、經黏膜內、皮內、腹腔內、腦室內等之路徑。

7.關於患者之治療及/或預防是否適格的判定

為了藉由投予本發明中的包含上述抗ALK2抗體及該抗體的醫藥組成物而有效治療及/或預防具有ALK2蛋白質之變異(例如，ALK2之活性化型變異)的患者，可實施以下之方法。

第1方法係一種預測由於抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段之投予所致的副作用的表現風險的方法，該方法包含下列步驟：(a)檢測患者的ALK2之活性化型變異及第330號之胺基酸殘基的變異之有無的步驟；及(b)將具有ALK2之活性化型變異且於第330號之胺基酸殘基無變異的患者判定為抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段之投予所致的副作用的表現風險低的步驟。

第2方法係一種預測由於抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段之投予所致的治療及/或預防反應性的方法，該方法包含下列步驟：(a)檢測患者的ALK2之活性化型變異及第330號之胺基酸殘基的變異之有無的步驟；及(b)將具有ALK2之活性化型變異且於第330號之胺基酸殘基無變異的患者判定為利用抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段之投予有治療及/或預防反應性的步驟。

第3方法係一種篩選利用抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段之投予的治療及/或預防之對象患者的方法，該方法包含下列步驟：(a)檢測患者的ALK2之活性化型變異及第330號之胺基酸殘基的變異之有無的步驟；及(b)篩選具有ALK2之活性化型變異且於第330號之胺基酸殘基無變異的患者作為利用抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段之投予的治療及/或預防之對象患者的步驟。

第4方法係一種利用抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段之投予的疾病之治療及/或預防方法，該方法包含下列步驟：(a)檢測患者的ALK2之活性化型變異及第330號之胺基酸殘基的變異之有無的步驟；及(b)對具有ALK2之活性化型變異且於第330號之胺基酸殘基無變異的患者，投予抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段的步驟。

於第4方法，可進一步包含進行第1~第3中任一項記載之方法之步驟(b)之任一者，即，(第1方法之步驟(b))將具有ALK2之活性化型變異且於第330號之胺基酸殘基無變異的患者判定為抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段之投予所致的副作用的表現風險低的步驟、(第2方法之步驟(b))將具有ALK2之活性化型變異且於第330號之胺基酸殘基無變異的患者判定為利用抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段之投予有治療及/或預防反應性的步驟、(第3方法之步驟(b))篩選具有ALK2之活性化型變異且於第330號之胺基酸殘基無變異的患者作為利用抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段之投予的治療及/或預防之對象患者的步驟。

因此，判定是否為利用抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段之投予的治療及/或預防為適格的患者、是否對患者無副作用等後，對認為適格的患者，可對患者實施投予抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段而引發治療效果之所謂的訂製治療(tailored treatment)。

本說明書中所使用的所謂「判定」的用語，包含決定、評價、或判定支持。

於上述第1方法至第4方法，上述抗ALK2抗體或其抗原結合片段之投予，較佳為上述6.記載並說明的醫藥組成物之投予。

於上述第1方法至第4方法，上述步驟(b)可進一步包含確認ALK2之活性化型變異並非G328V變異的步驟。

再者，於上述第1方法至第4方法，上述ALK2之活性化型變異較佳為選自L196P、delP197_F198insL、R202I、R206H、Q207E、R258S、R258G、G325A、G328E、G328R、G328W、G356D、及R375P之至少一者，或者選自R206H、R258G、G328E、G328W、及G356D之至少一者。

再者又，於上述第1方法至第4方法，上述患者為疾病未被特定的被驗者、或者被懷疑具有起因於ALK2之活性化型變異的疾病的被驗者，以及應治療的上述疾病，例如起因於ALK2之活性化型變異的疾病，較佳為異位性骨化或腦腫瘤，更佳為異位性骨化。此等疾病之具體例記載於上述6.。雖無意限定，但進一步較佳的疾病，為進行性骨化性纖維形成異常症(FOP)或瀰漫型內因性橋腦神經膠細胞瘤(DIPG)，更佳為進行性骨化性纖維形成異常症(FOP)。

[實施例]

藉由實施例而具體說明本發明，但本發明並未被限定於此等。又，於下述實施例關於基因操作的各操作只要未特別明示，皆藉由「分子選殖(Molecular Cloning)」(Sambrook,J.,Fritsch,E.F.及Maniatis,T.著，Cold Spring Harbor Laboratory Press，於1989年發刊)記載之方法進行，或於使用市售之試藥或套組的情形，按照市售品之指示書來使用。

<實施例1> 抗ALK2抗體(27D-H2L2_LALA)之BMP訊息傳達活性化作用之利用螢光素酶報導子試驗(luciferase reporter assay)的評價

實驗所使用的抗ALK2抗體(27D-H2L2_LALA)係依據WO2016/121908之實施例12記載之方法製作。

經由製作的抗ALK2抗體的BMP細胞內訊息傳達之活性化作用，使用BMP特異的螢光素酶報導子而解析。將HEK293A細胞，以成為1×10⁴個細胞/井的方式，接種於螢光素酶試驗用96井白色盤(CORNING公司製)，於含10%FBS的DMEM培養基中，於37℃、5%CO₂之條件下培養一晚。次日，將人類或小鼠ALK2之野生型及R206H變異型表現質體各自與pGL4.26/Id1WT4F-luc(Genes Cells,7,949(2002))一起，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen公司製)而導入。3小時後，培養基與新鮮OPTI-MEM I(LifeTechnologies公司製)交換後，添加階段稀釋的抗體，再培養一晚。次日，使用One-Glo Luciferase Assay System(Promega公司製)，以平盤讀數機SpectraMaxM4(Molecular Devices公司製)測定螢光素酶活性。

將結果記載於圖1。確認27D-H2L2_LALA僅於表現小鼠之R206H變異型ALK2的HEK293細胞使BMP特異的螢光素酶活性濃度依存地上升(圖1A之下圖)。另一方面，於人類之R206H變異型ALK2(圖1B之下圖)或人類‧小鼠之野生型ALK2(圖1A之上圖、圖1B之上圖)之表現細胞，未觀察到BMP報導子之活性上升。

<實施例2> 抗ALK2抗體(27D-H2L2_LALA)之Fab(27D-H2L2_Fab)及F(ab’) ₂(27D-H2L2_F(ab’) ₂)之調製 2)-1 27D-H2L2_LALA之Fab化

利用Papain from Papaya latex(SIGMA-ALDRICH)將27D-H2L2_LALA限定地切斷，以HiLoad 26/600 Superdex 200 pg(GE Healthcare)去除Fc片段等後，以HiTrap MabSelect SuRe,1mL(GE Healthcare)分離未反應之27D-H2L2_LALA，並回收Fab。

2)-2 27D-H2L2_LALA之F(ab’) ₂化

利用Endoproteinase Glu-C(SIGMA-ALDRICH)將27D-H2L2_LALA限定地切斷，以HiTrap MabSelect SuRe，10mL(GE Healthcare)分離未反應之27D-H2L2_LALA後，使用Bio-Scale CHT Type I、5mL(BIO-RAD)回收F(ab’)₂。

<實施例3> 抗ALK2抗體之Fab(27D-H2L2_Fab)及F(ab’) ₂(27D-H2L2_F(ab’) ₂)中的BMP訊息傳達活性化作用之利用螢光素酶報導子試驗的評價

經由以實施例2製作的27D-H2L2_Fab及27D-H2L2_F(ab’)₂的BMP細胞內訊息傳達之活性化作用，使用BMP特異的螢光素酶報導子解析。作為比較對照，使用為全長之抗ALK2抗體的27D-H2L2_LALA。螢光素酶報導子試驗係以與實施例1相同的方法進行。

將結果記載於圖2。確認27D-H2L2_F(ab’)₂，與27D-H2L2_LALA同樣地，僅於表現小鼠之R206H變異型ALK2的HEK293細胞使BMP特異的螢光素酶活性濃度依存性地上升。另一方面，27D-H2L2_Fab於任一條件亦未觀察到BMP報導子之活性上升。

<實施例4> 由於抗ALK2抗體所致的ALK2分子之交聯活性的活體外評價

於實施例1、3確認的由於27D-H2L2_LALA及27D-H2L2_F(ab’)₂所致的BMP特異的螢光素酶報導子之活性化作用，於檢驗由於ALK2分子之交聯所致的可能性的目的，進行NanoBiT試驗(Promega公司製)。構築於pBit1.1-C〔TK/LgBiT〕與pBit2.1-C〔TK/SmBiT〕Vector(Promega公司製)中插入全長人類ALK2的表現載體。將C2C12細胞以成為5×10³細胞/井的方式，接種於螢光素酶試驗用96井白色盤(Greiner公司製)，於含15%FBS的DMEM培養基中，於37℃、5%CO₂之條件下培養一晚。次日，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen公司製)將2種類之ALK2表現質體導入。2.5小時後，將培養基與新鮮OPTI-MEM I(LifeTechnologies公司製)交換後，再培養一晚。次日，一起添加階段稀釋的抗體與Nano-Glo Live Cell Assay System(Promega公司製)基質，培養15分鐘後，以平盤讀數機GENios(TECAN公司製)測定螢光素酶活性。

將結果示於圖3。確認雖A2-27D、27D-H2L2_LALA及27D-H2L2_F(ab’)₂抗體之濃度依存性地促進ALK2之交聯形成(或，ALK2之複合體形成)，但27D-H2L2_Fab並未誘導ALK2之交聯形成(或，ALK2之複合體形成)。

<實施例5> 第182及第330號之胺基酸取代對於由於抗ALK2抗體所致的BMP特異的螢光素酶報導子之活性化作用的影響的驗証 5)-1 人類‧食蟹猴‧犬‧大鼠‧小鼠之全長ALK2之胺基酸序列的排列比對

將序列比對的結果示於圖4。比較人類、食蟹猴、犬、大鼠及小鼠之ALK2細胞內區域的胺基酸時，第182號與第330號之胺基酸殘基不同。

5)-2 第182號及第330號之胺基酸取代對於由於抗ALK2抗體所致的BMP特異的螢光素酶報導子之活性化作用的影響的驗証

為了解析人類與小鼠之ALK2之細胞內區域中不同的D182E及P330S之角色，使用於人類ALK2之野生型及R206H變異體中各自導入D182E或P330S變異的pcDEF3而構築表現載體。將HEK293A細胞，以成為 1×10⁴細胞/井的方式，接種於螢光素酶報導子試驗用96井白色盤(Greiner公司製)，於含10%FBS的DMEM培養基中，於37℃、5%CO₂之條件下培養一晚。次日，將ALK2表現載體與pGL4.26/Id1WT4F-luc(Genes Cells,7,949(2002))、phRL SV40(Promega公司製)，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen公司製)而導入。2.5小時後，將培養基與含階段稀釋的抗體A2-27D的新鮮OPTI-MEM I(LifeTechnologies公司製)交換，再培養1晚。次日，使用Dual-Glo Luciferase Assay System(Promega公司製)，以平盤讀數機GENios(TECAN公司製)測定螢火蟲、及海腎(Renilla)之螢光素酶活性。

將結果示於圖5。確認與小鼠之R206H變異型ALK2同樣地，僅導入P330S變異的R206H變異型人類ALK2係A2-27D之濃度依存性地活性上升。

<實施例6> 第330號之胺基酸取代對於由於抗ALK2抗體所致的BMP特異的螢光素酶報導子之活性化作用的影響的驗証

為了解析人類ALK2之P330之角色，於人類ALK2之野生型及R206H變異體，構築使用各自導入P330D、P330E、P330A、P330V變異的pcDEF3的表現載體。又，為了解析小鼠ALK2之S330之角色，構築於小鼠ALK2之野生型及R206H變異體，各自導入S330P變異的表現載體。以與實施例5同樣之方法，將此等之表現載體導入HEK293A細胞，以含A2-27D的培養基培養一晚後，測定螢光素酶活性。

將結果示於圖6。小鼠之R206H變異體，導入S330P變異時，藉由A2-27D而活性被抑制(即，拮抗劑活性)，但S330(第330號之胺基酸殘基為絲胺酸)時，藉由A2-27D而活性被促進(即，促效劑活性)。另一方面清楚可知，人類之R206H變異體，導入P330S、P330D，P330E、P330A變異時，藉由A2-27D而活性被促進(即，促效劑活性)，於P330V變異，活性被抑制。

<實施例7> 4種類之抗ALK2抗體(27D-H2L2_LALA、15A-H4L6_IgG2、A2-11E、A2-25C)之BMP訊息傳達活性化作用之利用螢光素酶報導子試驗的評價

於實驗使用的抗ALK2抗體(27D-H2L2_LALA、15A-H4L6_IgG2、A2-11E、A2-25C)係依據WO2016/121908之實施例12、11及1記載之方法製作。

經由製作的抗ALK2抗體的BMP細胞內訊息傳達之活性化作用，利用與實施例1同樣之方法，使用BMP特異的螢光素酶報導子而解析。

將結果示於圖7。15A-H4L6_IgG2、A2-11E、A2-25C係與27D-H2L2_LALA同樣地，確認僅於使小鼠之R206H變異型ALK2表現的HEK293細胞，使BMP特異的螢光素酶活性濃度依存性地上升。另一方面，於人類之R206H變異型ALK2表現細胞未觀察到BMP報導子之活性上升。

<實施例8> 對R206H變異以外之各式各樣的變異型ALK2之由於抗ALK2抗體所致的BMP特異的螢光素酶報導子之活性化作用的驗証

構築使用於FOP及DIPG發現的14種類之人類ALK2變異體(L196P、P197F198del_insL(亦稱為PF197-8L)、R202I、R206H、Q207E、R258G、R258S、G325A、G328E、G328R、G328V、G328W、G356D、R375P)、及導入組成活性型變異體Q207D變異的pcDEF3的表現載體。使此等與實施例5、6同樣地於HEK293細胞中過度表現，於含階段稀釋的A2-27D的培養基中培養一晚後，測定螢光素酶活性。此時，G328V變異體為其他之變異體之1/3量(例如，其他之變異體為37.5ng/井時，其為12.5ng/井)，Q207D變異體為1/20量(例如，其他之變異體為37.5ng/井時，其為1.875ng/井)的方式使用於試驗。

將結果示於圖8。確認人類ALK2變異體之中，僅於DIPG發現的G328V、及組成活性型Q207D，與A2-27D之濃度依存性地促進活性，其他之人類ALK2變異體則A2-27D之濃度依存性地被抑制。

[產業上之可利用性]

依據本發明，清楚得知藉由對具有ALK2之活性化型變異且於ALK2之第330號的胺基酸殘基無變異的患者，較佳為無G328V變異的患者，投予具有與ALK2之結合能力及對ALK2的交聯能力的抗ALK2抗體，可有效果地治療及/或預防異位性骨化及/或腦腫瘤。又，依據本發明，清楚得知可預測由於抗ALK2抗體之投予所致的副作用的表現風險、可預測利用抗ALK2抗體之投予的治療及/或預防反應性、以及可篩選利用抗ALK2抗體之投予的治療及/或預防之對象。

[序列表非關鍵詞文字]

序列識別號17：Gln為取代胺基酸殘基。

序列識別號30：人類化hA2-15A-L4之胺基酸序列。

序列識別號31：人類化hA2-15A-H4之胺基酸序列。

序列識別號32：人類化hA2-15A-L6之胺基酸序列。

序列識別號33：人類化hA2-15A-H4_IgG2型之胺基酸序列。

序列識別號34：人類化hA2-27D-H2之胺基酸序列。

序列識別號35：人類化hA2-27D-L2之胺基酸序列。

序列識別號36：人類化hA2-27D-H3之胺基酸序列。

序列識別號37：人類化hA2-27D-L4之胺基酸序列。

序列識別號38：人類化hA2-27D-H2_LALA之胺基酸序列。

序列識別號39：人類化hA2-27D-H3_LALA之胺基酸序列。

於本說明書所引用的全部刊物、專利及專利申請皆藉由引用直接併入本說明書。

<110> 埼玉醫科大學第一三共股份有限公司

<120> 用以治療或預防異位性骨化之醫藥組成物

<130> PH-7730-PCT

<150> JP 2018-039066

<151> 2018-03-05

<160> 42

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 509

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

<210> 2

<211> 3062

<212> DNA

<213> 智人

<400> 2

<210> 3

<211> 509

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 3

<210> 4

<211> 3312

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 4

<210> 5

<211> 10

<212> PRT

<213> 褐鼠

<400> 5

<210> 6

<211> 17

<212> PRT

<213> 褐鼠

<400> 6

<210> 7

<211> 14

<212> PRT

<213> 褐鼠

<400> 7

<210> 8

<211> 15

<212> PRT

<213> 褐鼠

<400> 8

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> 褐鼠

<400> 9

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> 褐鼠

<400> 10

<210> 11

<211> 10

<212> PRT

<213> 褐鼠

<400> 11

<210> 12

<211> 17

<212> PRT

<213> 褐鼠

<400> 12

<210> 13

<211> 12

<212> PRT

<213> 褐鼠

<400> 13

<210> 14

<211> 10

<212> PRT

<213> 褐鼠

<400> 14

<210> 15

<211> 7

<212> PRT

<213> 褐鼠

<400> 15

<210> 16

<211> 10

<212> PRT

<213> 褐鼠

<400> 16

<210> 17

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> Gln為經取代胺基酸殘基

<400> 17

<210> 18

<211> 10

<212> PRT

<213> 褐鼠

<400> 18

<210> 19

<211> 17

<212> PRT

<213> 褐鼠

<400> 19

<210> 20

<211> 9

<212> PRT

<213> 褐鼠

<400> 20

<210> 21

<211> 11

<212> PRT

<213> 褐鼠

<400> 21

<210> 22

<211> 7

<212> PRT

<213> 褐鼠

<400> 22

<210> 23

<211> 8

<212> PRT

<213> 褐鼠

<400> 23

<210> 24

<211> 10

<212> PRT

<213> 褐鼠

<400> 24

<210> 25

<211> 17

<212> PRT

<213> 褐鼠

<400> 25

<210> 26

<211> 9

<212> PRT

<213> 褐鼠

<400> 26

<210> 27

<211> 11

<212> PRT

<213> 褐鼠

<400> 27

<210> 28

<211> 7

<212> PRT

<213> 褐鼠

<400> 28

<210> 29

<211> 9

<212> PRT

<213> 褐鼠

<400> 29

<210> 30

<211> 238

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人類化hA2-15A-L4之胺基酸序列

<220>

<221> 訊息

<222> (1)..(20)

<220>

<221> V_區域

<222> (21)..(133)

<220>

<221> C_區域

<222> (134)..(238)

<400> 30

<210> 31

<211> 472

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人類化hA2-15A-H4之胺基酸序列

<220>

<221> 訊息

<222> (1)..(19)

<220>

<221> V_區域

<222> (20)..(142)

<220>

<221> C_區域

<222> (143)..(472)

<400> 31

<210> 32

<211> 238

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人類化hA2-15A-L6之胺基酸序列

<220>

<221> 訊息

<222> (1)..(20)

<220>

<221> V_區域

<222> (21)..(133)

<220>

<221> C_區域

<222> (134)..(238)

<400> 32

<210> 33

<211> 468

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人類化hA2-15A-H4_IgG2型之胺基酸序列

<400> 33

<210> 34

<211> 470

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人類化hA2-27D-H2之胺基酸序列

<220>

<221> 訊息

<222> (1)..(19)

<220>

<221> V_區域

<222> (20)..(140)

<220>

<221> C_區域

<222> (141)..(470)

<400> 34

<210> 35

<211> 234

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人類化hA2-27D-L2之胺基酸序列

<220>

<221> 訊息

<222> (1)..(20)

<220>

<221> V_區域

<222> (21)..(129)

<220>

<221> C_區域

<222> (130)..(234)

<400> 35

<210> 36

<211> 470

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人類化hA2-27D-H3之胺基酸序列

<220>

<221> 訊息

<222> (1)..(19)

<220>

<221> V_區域

<222> (20)..(140)

<220>

<221> C_區域

<222> (141)..(470)

<400> 36

<210> 37

<211> 234

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人類化hA2-27D-L4之胺基酸序列

<220>

<221> 訊息

<222> (1)..(20)

<220>

<221> V_區域

<222> (21)..(129)

<220>

<221> C_區域

<222> (130)..(234)

<400> 37

<210> 38

<211> 470

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人類化hA2-27D-H2_LALA之胺基酸序列

<400> 38

<210> 39

<211> 470

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人類化hA2-27D-H3_LALA之胺基酸序列

<400> 39

<210> 40

<211> 509

<212> PRT

<213> 恆河獼猴

<400> 40

<210> 41

<211> 509

<212> PRT

<213> 狼

<400> 41

<210> 42

<211> 509

<212> PRT

<213> 褐鼠

<400> 42

Claims

一種用以使用於具有異位性骨化的患者之治療及/或預防方法之醫藥組成物，該醫藥組成物之特徵為該患者具有為異位性骨化之原因的類活化素激酶2(ALK2)蛋白質之活性化型變異，且該ALK2之第330號的胺基酸殘基為脯胺酸，以及該組成物之有效成分為包含與該ALK2結合的性質、交聯該ALK2的性質、及抑制BMP訊息傳達的性質之抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段。
如請求項1之醫藥組成物，其中該ALK2不具有G328V變異。
如請求項1之醫藥組成物，其中該方法包含：(a)檢測患者之ALK2之活性化型變異的有無的步驟；(b)篩選具有ALK2之活性化型變異的患者的步驟；(c)確認於患者之ALK2之第330號的胺基酸殘基無變異的步驟；及(d)對篩選出的患者投予抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段的步驟。
如請求項3之醫藥組成物，其中該步驟(c)進一步包含確認患者之ALK2不具有G328V變異的步驟。
如請求項3之醫藥組成物，其中成為該抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段的投予對象之患者的篩選係包含：(a)檢測異位性骨化之患者中的ALK2之活性化型變異的有無的步驟；(b)篩選具有ALK2之活性化型變異的患者的步驟；及(c)排除於ALK2之第330號的胺基酸殘基具有變異的患者的步驟。
如請求項5之醫藥組成物，其中該步驟(c)進一步包含排除具有ALK2之G328V變異的患者的步驟。
如請求項1至6中任一項之醫藥組成物，其中該抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段會與包含序列識別號1所示的胺基酸序列之第21號~第123號之胺基酸殘基的多肽特異性結合。
如請求項1至7中任一項之醫藥組成物，其中該抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段會與下列(i)或(ii)結合，(i)包含序列識別號1所示的胺基酸序列中之第38號之麩胺酸、第39號之甘胺酸、第59號之異白胺酸、第60號之天冬醯胺、第61號之天冬胺酸、第62號之甘胺酸、第63號之苯丙胺酸、第64號之組胺酸、第65號之纈胺酸、第66號之酪胺酸、第102號之天冬醯胺、第104號之蘇胺酸、第106號之麩醯胺酸、及第107號之白胺酸之各殘基的表位(epitope)，或(ii)包含序列識別號1所示的胺基酸序列中之第38號之麩胺酸、第39號之甘胺酸、40號之白胺酸、第59號之異白胺酸、第60號之天冬醯胺、第61號之天冬胺酸、第62號之甘胺酸、第63號之苯丙胺酸、第64號之組胺酸、第65號之纈胺酸、第66號之酪胺酸、及第104號之蘇胺酸之各殘基的表位。
如請求項1至7中任一項之醫藥組成物，其中該抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段與如請求項8之抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段競爭對ALK2的結合。
如請求項1至9中任一項之醫藥組成物，其中該抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段為單株抗體、多株抗體、嵌合抗體、人類化抗體、人類抗體、二特異性抗體、多特異性抗體、或F(ab’) ₂。
如請求項1至10中任一項之醫藥組成物，其中該抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段之重鏈序列包含具有CDRH1、CDRH2、CDRH3的可變區，且該CDRH1、CDRH2、及CDRH3各自由下列所示的胺基酸序列而成：序列識別號5、序列識別號6、及序列識別號7；序列識別號11、序列識別號12、及序列識別號13；序列識別號18、序列識別號19、及序列識別號20；或序列識別號24、序列識別號25、及序列識別號26；以及輕鏈序列包含具有CDRL1、CDRL2、CDRL3的可變區，且該CDRL1、CDRL2、及CDRL3各自由下列所示的胺基酸序列而成：序列識別號8、序列識別號9、及序列識別號10；序列識別號8、序列識別號17、及序列識別號10；序列識別號14、序列識別號15、及序列識別號16；序列識別號21、序列識別號22、及序列識別號23；或序列識別號27、序列識別號28、及序列識別號29。
如請求項1至11中任一項之醫藥組成物，其中該抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段之重鏈可變區序列為：a1)由序列識別號31所示的胺基酸序列之第20號~第142號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列；a2)由序列識別號33所示的胺基酸序列之第20號~第142號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列；a3)由序列識別號34所示的胺基酸序列之第20號~第140號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列；a4)由序列識別號36所示的胺基酸序列之第20號~第140號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列；a5)由序列識別號38所示的胺基酸序列之第20號~第140號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列；a6)由序列識別號39所示的胺基酸序列之第20號~第140號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列；a7)與選自該a1)至a6)之胺基酸序列的任一者之胺基酸序列具有至少95%之同一性的胺基酸序列；a8)與選自該a1)至a6)之胺基酸序列的任一者之胺基酸序列具有至少99%之同一性的胺基酸序列；或a9)於選自該a1)至a6)之胺基酸序列的任一者之胺基酸序列有1或數個之胺基酸殘基被取代、刪除或添加的胺基酸序列；以及輕鏈可變區序列為：b1)由序列識別號32所示的胺基酸序列之第21號 ~第133號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列；b2)由序列識別號35所示的胺基酸序列之第21號~第129號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列；b3)由序列識別號37所示的胺基酸序列之第21號~第129號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列；b4)與選自該b1)至b3)之胺基酸序列的任一者之胺基酸序列具有至少95%之同一性的胺基酸序列；b5)與選自該b1)至b3)之胺基酸序列的任一者之胺基酸序列具有至少99%之同一性的胺基酸序列；或b6)於選自該b1)至b3)之胺基酸序列的任一者之胺基酸序列有1或數個之胺基酸殘基被取代、刪除或添加的胺基酸序列。
如請求項12之醫藥組成物，其中該抗ALK2抗體為下列抗體：包含含有由序列識別號31所示的胺基酸序列之第20號~第142號之胺基酸殘基而成的重鏈可變區的重鏈及含有由序列識別號32所示的胺基酸序列之第21號~第133號之胺基酸殘基而成的輕鏈可變區的輕鏈的抗體，包含含有由序列識別號33所示的胺基酸序列之第20號~第142號之胺基酸殘基而成的重鏈可變區的重鏈及含有由序列識別號32所示的胺基酸序列之第21號~第133號之胺基酸殘基而成的輕鏈可變區的輕鏈的抗體，包含含有由序列識別號34所示的胺基酸序列之第 20號~第140號之胺基酸殘基而成的重鏈可變區的重鏈及含有由序列識別號35所示的胺基酸序列之第21號~第129號之胺基酸殘基而成的輕鏈可變區的輕鏈的抗體，包含含有由序列識別號36所示的胺基酸序列之第20號~第140號之胺基酸殘基而成的重鏈可變區的重鏈及含有由序列識別號37所示的胺基酸序列之第21號~第129號之胺基酸殘基而成的輕鏈可變區的輕鏈的抗體，包含含有由序列識別號38所示的胺基酸序列之第20號~第140號之胺基酸殘基而成的重鏈可變區的重鏈及含有由序列識別號35所示的胺基酸序列之第21號~第129號之胺基酸殘基而成的的輕鏈可變區的輕鏈的抗體，或包含含有由序列識別號39所示的胺基酸序列之第20號~第140號之胺基酸殘基而成的重鏈可變區的重鏈及含有由序列識別號37所示的胺基酸序列之第21號~第129號之胺基酸殘基而成的輕鏈可變區的輕鏈的抗體。
如請求項1至13中任一項之醫藥組成物，其中該ALK2之活性化型變異為選自L196P、delP197_F198insL、R202I、R206H、Q207E、R258S、R258G、G325A、G328E、G328R、G328W、G356D、及R375P之至少一者。
如請求項1至13中任一項之醫藥組成物，其中該 ALK2之活性化型變異為R206H變異。
如請求項1至15中任一項之醫藥組成物，其中該異位性骨化為進行性骨化性纖維形成異常症(FOP)。
一種用以使用於具有腦腫瘤的患者之治療及/或預防方法之醫藥組成物，該醫藥組成物之特徵為該患者具有為腦腫瘤之原因的類活化素激酶2(ALK2)蛋白質之活性化型變異，以及該組成物之有效成分為含有與該ALK2結合的性質、交聯該ALK2的性質、及抑制BMP訊息傳達的性質之抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段。
如請求項17之醫藥組成物，其中該患者之ALK2之第330號的胺基酸殘基為脯胺酸。
如請求項17或18之醫藥組成物，其中該ALK2之活性化型變異為選自R206H、R258G、G328E、G328W、及G356D之至少一者。
如請求項17至19中任一項之醫藥組成物，其中該抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段為如請求項7至13中任一項定義的抗ALK2抗體或其抗原結合片段。
如請求項17至20中任一項之醫藥組成物，其中該腦腫瘤為瀰漫型內因性橋腦神經膠細胞瘤(DIPG)。
一種預測由於抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段之投予所致的副作用的表現風險的方法，該方法包含：(a)檢測患者的ALK2之活性化型變異及第330號之胺基酸殘基的變異之有無的步驟；及(b)將具有ALK2之活性化型變異且於第330號之胺基酸殘基無變異的患者判定為抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段之投予所致的副作用的表現風險低的步驟。
一種預測利用抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段之投予的治療及/或預防反應性的方法，該方法包含：(a)檢測患者的ALK2之活性化型變異及第330號之胺基酸殘基的變異之有無的步驟；及(b)將具有ALK2之活性化型變異且於第330號之胺基酸殘基無變異的患者判定為利用抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段之投予有治療及/或預防反應性的步驟。
一種篩選利用抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段之投予的治療及/或預防之對象患者的方法，該方法包含：(a)檢測患者的ALK2之活性化型變異及第330號之胺基酸殘基的變異之有無的步驟；及(b)篩選具有ALK2之活性化型變異且於第330號之胺基酸殘基無變異的患者作為利用抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段之投予的治療及/或預防之對象患者的步驟。
一種利用抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段之投予的疾病之治療及/或預防方法，該方法包含：(a)檢測患者的ALK2之活性化型變異及第330號之胺基酸殘基的變異之有無的步驟；及(b)對具有ALK2之活性化型變異且於第330號之胺基酸殘基無變異的患者，投予抗ALK2抗體或該抗體之抗原結合片段的步驟。
如請求項25之方法，其進一步包含如請求項22至24中任一項之方法之步驟(b)。
如請求項22至26中任一項之方法，其中該抗ALK2 抗體或該抗體之抗原結合片段之投予係如請求項1至21中任一項之醫藥組成物之投予。
如請求項22至27中任一項之方法，其中該步驟(b)進一步包含確認ALK2之活性化型變異並非G328V變異的步驟。
如請求項22至28中任一項之方法，其中該ALK2之活性化型變異為選自L196P、delP197_F198insL、R202I、R206H、Q207E、R258S、R258G、G325A、G328E、G328R、G328W、G356D、及R375P之至少一者。
如請求項22至28中任一項之方法，其中該ALK2之活性化型變異為選自R206H、R258G、G328E、G328W、及G356D之至少一者。
如請求項25至30中任一項之方法，其中該患者所罹患的疾病為異位性骨化或腦腫瘤。
如請求項31之方法，其中該患者所罹患的疾病為異位性骨化。
如請求項25至31中任一項之方法，其中該患者所罹患的疾病為進行性骨化性纖維形成異常症(FOP)或瀰漫型內因性橋腦神經膠細胞瘤(DIPG)。
如請求項33之方法，其中該患者所罹患的疾病為進行性骨化性纖維形成異常症(FOP)。