KR20140138215A

KR20140138215A - 신규 항 Ｓｉｇｌｅｃ-15 항체

Info

Publication number: KR20140138215A
Application number: KR20147026900A
Authority: KR
Inventors: 요시하루 히루마; 준 하세가와
Original assignee: 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤
Priority date: 2012-03-30
Filing date: 2013-03-29
Publication date: 2014-12-03
Also published as: BR112014024267A8; CA2868965A1; TW201345925A; CN104321430A; EP2832855A1; RU2014143770A; WO2013147212A1; US20150125470A1; MX2014011826A; AU2013241002A1; HK1204797A1; JPWO2013147212A1; EP2832855A4

Abstract

파골 세포에서 강하게 발현하는 유전자로 코드되는 단백질을 표적으로 한 골대사 이상 치료 및/또는 예방용 의약 조성물을 제공하는 것. 인간 Siglec-15 를 특이적으로 인식하고, 파골 세포의 형성을 억제하는 활성을 갖는 항체를 포함하는 의약 조성물의 제공 등.

Description

신규 항 Ｓｉｇｌｅｃ-15 항체 {NOVEL ANTI-SIGLEC15 ANTIBODY}

본 발명은 골대사 이상의 치료 및/또는 예방약으로서 유용한 물질, 그리고 골대사 이상의 치료 및/또는 예방 방법에 관한 것이다.

골은, 스스로의 형태 변화나 혈중 칼슘 농도의 유지를 위해서, 항상 형성과 흡수를 반복하여 재구축을 실시하는 동적인 기관으로서 알려져 있다. 정상적인 골에서는 골아 세포에 의한 골형성과 파골 세포에 의한 골흡수와는 평형 관계에 있고, 골량은 일정하게 유지되어 있다. 한편, 골형성과 골흡수의 평형 관계가 무너지면, 골다공증 등의 골대사 이상이 된다 (예를 들어, 비특허문헌 1 및 2 를 참조).

골대사를 조절하는 인자로서는, 전신성의 호르몬이나 국소성의 사이토카인이 많이 보고되어 있고, 그들 인자의 공동 작용에 의해 골의 형성과 유지가 되고 있다 (예를 들어, 비특허문헌 1 및 3 을 참조). 가령에 의한 골조직의 변화로서는, 골다공증의 발증이 널리 알려져 있지만, 그 발증 기구는 성 호르몬의 분비 저하나 그 리셉터 이상, 골 국소에 있어서의 사이토카인 발현의 변동, 노화 유전자의 발현, 파골 세포나 골아 세포의 분화 혹은 기능 부전 등 다방면에 걸쳐져 있고, 가령에 의한 단순한 생리 현상으로서 이해하는 것은 곤란하다. 원발성 골다공증은 에스트로겐의 분비 저하에 의한 폐경 후 골다공증과 가령에 의한 노인성 골다공증으로 대별되고 있지만, 그 발증 기구의 해명과 치료약 개발을 위해서는, 골흡수와 골형성의 조절 기구에 대한 기초적 연구의 진전이 필수이다.

파골 세포는 조혈간 세포에서 유래하는 다핵의 세포이며, 골과의 접착면에 염소 이온과 수소 이온을 방출함으로써, 세포와 골의 접착면의 간극을 산성화함과 함께 산성 프로테아제인 카텝신 K 등을 분비한다 (예를 들어, 비특허문헌 4 를 참조). 이 결과, 인산 칼슘의 분해, 산성 프로테아제의 활성화와 골 기질 단백질의 분해가 일어나 골흡수가 진행된다.

파골 세포의 선구 세포는 골 표면의 골아 세포/스트로마 세포의 세포막 상에 발현하는 RANKL (Receptor activator of NF-κB ligand) 의 자극을 받아, 파골 세포로 분화하는 것이 밝혀졌다 (예를 들어, 비특허문헌 5 및 6 을 참조). RANKL 은 골아 세포/스트로마 세포가 산생하는 막 단백질이며, 그 발현은 골흡수 인자에 의해 조절되는 것, 및 RANKL 은 파골 세포 선구 세포로부터 성숙 다핵 파골 세포로의 분화를 유도하는 것 등이 밝혀졌다 (예를 들어, 비특허문헌 5 및 7 을 참조). 또한, RANKL 을 녹아웃한 마우스가 대리석골병형의 병태를 발증하는 것이 알려져, RANKL 이 생리적인 파골 세포 분화 유도 인자인 것이 증명되었다 (예를 들어, 비특허문헌 8 을 참조).

골대사 질환의 치료나 치료 기간의 단축을 도모하는 의약품으로서, 비스포스포네이트, 활성형 비타민 D₃, 칼시토닌 및 그 유도체, 에스트라디올 등의 호르몬, SERMs (Selective estrogen receptor modulators), 이프리플라본, 비타민 K₂ (메나테트레논), PTH 및 칼슘 제제 등이 사용되고 있다. 그러나, 이들의 약제는 치료 결과에 있어서 반드시 만족할 수 있는 것이 아니라, 보다 치료 효과가 높은 약제의 개발이 요망되고 있었다.

면역계 세포의 세포막 상은 시알산 함유 당사슬 등의 다양한 당 사슬에 의해 고도로 덮여 있고, 여러 가지 당 사슬 결합 단백질에 의해 인식되고 있다. 시알산 결합 면역 글로불린형 렉틴 (Sialic-acid-binding immunoglobulin-like lectins, 이하, 「Siglecs」 라고 한다.) 은 시알산 함유 당 사슬을 인식하여 결합하는 I 형 막 단백질 패밀리이다. Siglecs 는 면역계 세포의 세포막 상에서 많이 발현되고 있고, 동 면역계 세포의 세포막 상에 존재하는 시알산을 인식하여 세포간 상호작용이나 세포 기능을 조절하여, 면역 응답에 관여하고 있다고 생각되고 있지만 (예를 들어, 비특허문헌 9 를 참조), 생리적 기능이 분명하게 되어 있지 않은 Siglecs 분자도 많다. Siglec-15 (Sialic-acid binding immunoglobulin-like lectin 15) 는 Siglecs 에 속하는 것이 새롭게 보고된 분자이고 (예를 들어, 비특허문헌 10 을 참조), CD33L3 (CD33 molecule-like 3) 으로 불리는 분자와 동일하다. 이 분자는 어류로부터 인간까지 진화적인 보존도가 높고, 인간 비장 및 림프절에 있어서, 수상 세포/매크로파지계의 세포에 강하게 발현되는 것이 밝혀졌다. 또 시알산 프로브를 사용한 결합 시험의 결과, 인간 Siglec-15 는 Neu5Acα2-6GalNAc 와, 마우스 Siglec-15 는 또한 Neu5Acα2-3Galβ1-4Glc 와 결합하는 것 등도 밝혀졌다 (예를 들어, 비특허문헌 10 을 참조). 최근까지, Siglec-15 의 생리적 역할은 분명하지 않았지만, 파골 세포의 분화, 성숙에 수반하여 Siglec-15 의 발현이 항진되고, RNA 간섭에 의해 Siglec-15 의 발현을 저하시키면 파골 세포의 분화가 억제되는 것이 보고되었다 (예를 들어, 특허문헌 1 을 참조). 또한, 항 Siglec-15 항체가 파골 세포 분화에 미치는 작용에 대해, 특허문헌 2 (2009 년 4 월 16 일 공개) 및 특허문헌 3 (2010 년 10 월 14 일 공개) 에 있어서 처음으로 밝혀졌다. 또한 특허문헌 4 에 있어서도 파골 세포의 분화를 억제하는 항체가 개시되었지만, 보다 강력한 작용을 나타내는 항체의 탐색이 계속되고 있다.

국제 공개 제WO07/093042호 팜플렛 국제 공개 제WO09/048072호 팜플렛 국제 공개 제WO10/117011호 팜플렛 국제 공개 제WO11/041894호 팜플렛

Endocrinological Review, (1992) 13, p 66-80 Principles of Bone Biology, Academic Press, New York, (1996) p 87-102 Endocrinological Review, (1996) 17, p 308-332 American Journal of Physiology, (1991) 260, C1315-C1324 Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America, (1998) 95, p 3597-3602, Cell, (1998) 93, p 165-176 Journal of Bone and Mineral Research, (1998) 23, S222 Nature, (1999) 397, p 315-323 Nature Reviews Immunology, (2007) 7, p 255-266 Glycobiology, (2007) 17, p 838-846

본 발명의 목적은 골다공증, 관절 류머티즘, 암의 골전이 등으로 보여지는 여러 가지의 골대사 이상시에 특이적으로 발현하는 유전자, 파골 세포의 분화 성숙과 활성을 저해하는 물질, 및 골대사 이상의 치료 및/또는 예방제를 제공하는 것에 있다.

본 발명자들은 골대사 이상의 치료 및/또는 예방 효과를 갖는 물질을 탐색하는 목적으로, 파골 세포의 분화, 성숙 및 활성화의 기구 (메커니즘) 의 해명을 목표로 한 연구를 실시한 결과, 파골 세포의 분화, 성숙에 수반하여 Siglec-15 유전자의 발현이 상승하는 것을 알아냈다. 또, 본 발명자들은, Siglec-15 와 특이적으로 결합하는 항체에 의해, 파골 세포의 분화가 억제되는 것을 알아냈다. 또한 발명자들은, 얻어진 래트 항마우스 Siglec-15 항체를 인간화하여, 본 발명을 완성시켰다.

즉, 본 발명은 이하의 발명을 포함한다.

(1) 중사슬 배열이 CDRH1, CDRH2, CDRH3 을 갖는 가변 영역을 포함하고, 상기 CDRH1 은 배열 번호 31 에 나타나는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRH2 는 배열 번호 32 에 나타나는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRH3 은 배열 번호 33 에 나타나는 아미노산 배열 또는 그 아미노산 배열에 있어서 1 내지 3 개의 아미노산이 치환된 아미노산 배열로 이루어지는 것 ； 및

경사슬 배열이 CDRL1, CDRL2, CDRL3 을 갖는 가변 영역을 포함하고, 상기 CDRL1 은 배열 번호 34 에 나타나는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRL2 는 배열 번호 35 에 나타나는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRL3 은 배열 번호 36 에 나타나는 아미노산 배열로 이루어지는 것

을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편.

(2) 중사슬 배열이 CDRH1, CDRH2, CDRH3 을 갖는 가변 영역을 포함하고, 상기 CDRH1 은 배열 번호 31 에 나타나는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRH2 는 배열 번호 32 에 나타나는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRH3 은 배열 번호 33 에 나타나는 아미노산 배열 또는 배열 번호 49 에 나타나는 아미노산 배열로 이루어지는 것 ； 및

을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편.

(3) 배열 번호 2 에 나타나는 아미노산 배열의 1 내지 121 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 가변 영역 배열 및 배열 번호 4 에 나타나는 아미노산 배열의 1 내지 109 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 가변 영역 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 (1) 또는 (2) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편.

(4) Fab, F(ab')2, Fab' 및 Fv 로 이루어지는 군에서 선택되는, (1) 내지 (3) 에 기재된 항체의 항원 결합 단편.

(5) scFv 인 것을 특징으로 하는, (1) 내지 (3) 에 기재된 항체.

(6) 키메라 항체인 것을 특징으로 하는, (1) 내지 (4) 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편.

(7) 배열 번호 8 에 나타나는 아미노산 배열의 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 배열 및 배열 번호 10 에 나타나는 아미노산 배열의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 배열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 (6) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편.

(8) 인간화되어 있는 것을 특징으로 하는, (1), (2) 또는 (4) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편.

(9) 중사슬이 인간 면역 글로불린 G2 중사슬의 정상 영역을 포함하고, 경사슬이 인간 면역 글로불린 κ 경사슬의 정상 영역을 포함하는, (6) 또는 (8) 에 기재된 항체.

(10) 파골 세포의 형성 및/또는 파골 세포에 의한 골흡수를 억제하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편으로서,

(a) 이하의 아미노산 배열로 이루어지는 군에서 선택되는 중사슬 가변 영역 배열 ：

a1) 배열 번호 12 에 나타나는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ；

a2) 배열 번호 14 에 나타나는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ；

a3) 배열 번호 16 에 나타나는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ；

a4) 배열 번호 18 에 나타나는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ；

a5) 배열 번호 20 에 나타나는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ；

a6) 배열 번호 22 에 나타나는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ；

a7) 배열 번호 38 에 나타나는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ；

a8) 배열 번호 40 에 나타나는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ；

a9) 배열 번호 42 에 나타나는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ；

a10) 배열 번호 44 에 나타나는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ；

a11) a1) 내지 a10) 에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 배열과 적어도 95 ％ 의 상동성을 가지는 아미노산 배열 ；

a12) a1) 내지 a10) 에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 배열과 적어도 99 ％ 의 상동성을 가지는 아미노산 배열 ；

a13) a1) 내지 a10) 에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 배열에 1 내지 수 개의 아미노산 잔기가 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 배열 ； 및

(b) 이하의 아미노산 배열로 이루어지는 군에서 선택되는 경사슬 가변 영역 배열 ：

b1) 배열 번호 24 에 나타나는 아미노산 배열의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ；

b2) 배열 번호 26 에 나타나는 아미노산 배열의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ；

b3) 배열 번호 28 에 나타나는 아미노산 배열의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ；

b4) 배열 번호 30 에 나타나는 아미노산 배열의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ；

b5) 배열 번호 46 에 나타나는 아미노산 배열의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ；

b6) 배열 번호 48 에 나타나는 아미노산 배열의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ；

b7) b1) 내지 b6) 에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 배열과 적어도 95 ％ 의 상동성을 가지는 아미노산 배열 ；

b8) b1) 내지 b6) 에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 배열과 적어도 99 ％ 의 상동성을 가지는 아미노산 배열 ；

b9) b1) 내지 b6) 에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 배열에 1 내지 수 개의 아미노산 잔기가 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 배열

을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편.

(11) 배열 번호 14 에 나타나는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 가변 영역 배열 및 배열 번호 24 에 나타나는 아미노산 배열의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 가변 영역 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 (10) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편.

(12) 배열 번호 14 에 나타나는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 가변 영역 배열 및 배열 번호 26 에 나타나는 아미노산 배열의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 가변 영역 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 (10) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편.

(13) 배열 번호 14 에 나타나는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 가변 영역 배열 및 배열 번호 28 에 나타나는 아미노산 배열의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 가변 영역 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 (10) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편.

(14) 배열 번호 38 에 나타나는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 가변 영역 배열 및 배열 번호 48 에 나타나는 아미노산 배열의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 가변 영역 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 (10) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편.

(15) 배열 번호 40 에 나타나는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 가변 영역 배열 및 배열 번호 46 에 나타나는 아미노산 배열의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 가변 영역 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 (10) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편.

(16) 배열 번호 42 에 나타나는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 가변 영역 배열 및 배열 번호 24 에 나타나는 아미노산 배열의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 가변 영역 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 (10) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편.

(17) 배열 번호 44 에 나타나는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 가변 영역 배열 및 배열 번호 24 에 나타나는 아미노산 배열의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 가변 영역 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 (10) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편.

(18) 배열 번호 14 의 아미노산 배열에 나타나는 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 배열 및 배열 번호 24 에 나타나는 아미노산 배열의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 배열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 (10) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편.

(19) 배열 번호 14 에 나타나는 아미노산 배열의 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 배열 및 배열 번호 26 에 나타나는 아미노산 배열의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 배열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 (10) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편.

(20) 배열 번호 14 에 나타나는 아미노산 배열의 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 배열 및 배열 번호 28 에 나타나는 아미노산 배열의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 배열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 (10) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편.

(21) 배열 번호 38 에 나타나는 아미노산 배열의 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 배열 및 배열 번호 48 에 나타나는 아미노산 배열의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 배열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 (10) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편.

(22) 배열 번호 40 에 나타나는 아미노산 배열의 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 배열 및 배열 번호 46 에 나타나는 아미노산 배열의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 배열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 (10) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편.

(23) 배열 번호 42 에 나타나는 아미노산 배열의 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 배열 및 배열 번호 24 에 나타나는 아미노산 배열의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 배열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 (10) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.

(24) 배열 번호 44 에 나타나는 아미노산 배열의 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 배열 및 배열 번호 24 에 나타나는 아미노산 배열의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 배열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 (10) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편.

(25) (11) 내지 (24) 중 어느 한 항에 기재된 항체에 있어서, 카르복실기 말단측의 1 내지 수 개의 아미노산이 결실된 중사슬을 포함하는 항체.

(26) (1) 내지 (25) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편 중 적어도 어느 하나를 함유하는 것을 특징으로 하는 의약 조성물.

(27) 골대사 이상의 치료 및/또는 예방제인 것을 특징으로 하는, (26) 에 기재된 의약 조성물.

(28) (1) 내지 (25) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편 중 적어도 어느 하나, 그리고, 비스포스포네이트, 활성형 비타민 D₃, 칼시토닌 및 그 유도체, 에스트라디올 등의 호르몬, SERMs (selective estrogen receptor modulators), 이프리플라본, 비타민 K₂ (메나테트레논), 칼슘 제제, PTH (parathyroid hormone), 비스테로이드성 항염증제, 가용성 TNF 리셉터, 항 TNFα 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편, 항 PTHrP (parathyroid hormone-related protein) 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편, IL-1 리셉터 안타고니스트, 항 IL-6 리셉터 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편, 항 RANKL 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편, 및 OCIF (osteoclastogenesis inhibitory factor) 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나를 함유하는 것을 특징으로 하는 골대사 이상의 치료 및/또는 예방용 의약 조성물.

(29) 골대사 이상이 골다공증, 관절 류머티즘에 수반되는 골파괴, 암성 고칼슘혈증, 다발성 골수종이나 암의 골전이에 수반되는 골파괴, 거세포종, 골감소증, 치근막염에 의한 이의 상실, 인공 관절 주위의 골융해, 만성 골수염에 있어서의 골파괴, 골파제트병, 신장성 골이영양증, 및 골형성 부전증으로 이루어지는 군에서 선택되는, (27) 또는 (28) 에 기재된 의약 조성물.

(30) 골대사 이상이 골다공증, 관절 류머티즘에 수반되는 골파괴, 또는 암의 골전이에 수반되는 골파괴인 것을 특징으로 하는, (29) 에 기재된 의약 조성물.

(31) 골대사 이상이 골다공증인 것을 특징으로 하는, (30) 에 기재된 의약 조성물.

(32) 골다공증이 폐경 후 골다공증, 노인성 골다공증, 스테로이드나 면역 억제제 등의 치료용 약제의 사용에 의한 속발성 골다공증, 또는 관절 류머티즘에 수반되는 골다공증인 것을 특징으로 하는, (31) 에 기재된 의약 조성물.

(33) (1) 내지 (25) 에 기재된 항체, 그 항체의 항원 결합 단편, 또는 (27) 혹은 (28) 에 기재된 의약 조성물 중 적어도 어느 하나를 투여하는 것을 특징으로 하는 골대사 이상의 치료 및/또는 예방 방법.

(34) (1) 내지 (25) 에 기재된 항체, 그 항체의 항원 결합 단편, 또는 (28) 에 기재된 의약 조성물 중 적어도 어느 하나, 그리고, 비스포스포네이트, 활성형 비타민 D₃, 칼시토닌 및 그 유도체, 에스트라디올 등의 호르몬, SERMs (selective estrogen receptor modulators), 이프리플라본, 비타민 K₂ (메나테트레논), 칼슘 제제, PTH (parathyroid hormone), 비스테로이드성 항염증제, 가용성 TNF 리셉터, 항 TNFα 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편, 항 PTHrP (parathyroid hormone-related protein) 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편, IL-1 리셉터 안타고니스트, 항 IL-6 리셉터 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편, 항 RANKL 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편, 및 OCIF (osteoclastogenesis inhibitory factor) 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나를 동시 또는 잇따라 투여하는 것을 특징으로 하는 골대사 이상의 치료 및/또는 예방 방법.

(35) 골대사 이상이 골다공증, 관절 류머티즘에 수반되는 골파괴, 또는 암의 골전이에 수반되는 골파괴인 것을 특징으로 하는, (33) 또는 (34) 에 기재된 치료 및/또는 예방 방법.

(36) 골대사 이상이 골다공증인 것을 특징으로 하는, (35) 에 기재된 치료 및/또는 예방 방법.

(37) 골다공증이 폐경 후 골다공증, 노인성 골다공증, 스테로이드나 면역 억제제 등의 치료용 약제의 사용에 의한 속발성 골다공증, 또는 관절 류머티즘에 수반되는 골다공증인 것을 특징으로 하는, (36) 에 기재된 치료 및/또는 예방 방법.

(38) (1) 내지 (25) 중 어느 한 항에 기재된 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드.

(39) (38) 에 기재된 폴리뉴클레오티드로서, 배열 번호 1 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 1 내지 363 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 및 배열 번호 3 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 1 내지 327 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.

(40) 배열 번호 7 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1398 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 및 배열 번호 9 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 702 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 (39) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(41) (38) 에 기재된 폴리뉴클레오티드로서,

(a) 이하의 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드 ：

a1) 배열 번호 11 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ；

a2) 배열 번호 13 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ；

a3) 배열 번호 15 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ；

a4) 배열 번호 17 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ；

a5) 배열 번호 19 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ；

a6) 배열 번호 21 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ；

a7) 배열 번호 37 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ；

a8) 배열 번호 39 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ；

a9) 배열 번호 41 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ；

a10) 배열 번호 43 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ；

a11) a1) 내지 a10) 에서 선택되는 어느 하나의 뉴클레오티드 배열과 적어도 95 ％ 의 상동성을 가지는 아미노산 배열 ；

a12) a1) 내지 a10) 에서 선택되는 어느 하나의 뉴클레오티드 배열과 적어도 99 ％ 의 상동성을 가지는 아미노산 배열 ；

a13) a1) 내지 a10) 에서 선택되는 어느 하나의 뉴클레오티드 배열과 상보적인 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건으로 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드가 보유하는 뉴클레오티드 배열 ；

a14) a1) 내지 a10) 에서 선택되는 어느 하나의 뉴클레오티드 배열에 1 내지 수 개의 아미노산 잔기가 치환, 결실 또는 부가된 뉴클레오티드 배열 ； 및

(b) 이하의 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드 ：

b1) 배열 번호 23 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 387 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ；

b2) 배열 번호 25 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 387 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ；

b3) 배열 번호 27 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 387 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ；

b4) 배열 번호 28 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 387 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ；

b5) 배열 번호 45 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 387 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ；

b6) 배열 번호 47 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 387 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ；

b7) b1) 내지 b6) 에서 선택되는 어느 하나의 뉴클레오티드 배열과 적어도 95 ％ 의 상동성을 가지는 아미노산 배열 ；

b8) b1) 내지 b6) 에서 선택되는 어느 하나의 뉴클레오티드 배열과 적어도 99 ％ 의 상동성을 가지는 아미노산 배열 ；

b9) b1) 내지 b6) 에서 선택되는 어느 하나의 뉴클레오티드 배열과 상보적인 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건으로 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드가 보유하는 뉴클레오티드 배열 ；

b10) b1) 내지 b6) 에서 선택되는 어느 하나의 뉴클레오티드 배열에 1 내지 수 개의 뉴클레오티드가 치환, 결실 또는 부가된 뉴클레오티드 배열

을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.

(42) 배열 번호 13 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 23 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 387 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 (41) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(43) 배열 번호 13 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 25 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 387 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 (41) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(44) 배열 번호 13 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 27 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 387 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 (41) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(45) 배열 번호 37 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 47 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 387 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 (41) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(46) 배열 번호 39 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 45 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 387 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 (41) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(47) 배열 번호 41 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 23 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 387 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 (41) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(48) 배열 번호 43 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 23 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 387 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 (41) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(49) 배열 번호 13 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1398 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 23 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 702 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 (41) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(50) 배열 번호 13 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1398 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 25 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 702 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 (41) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(51) 배열 번호 13 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1398 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 27 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 702 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 (41) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(52) 배열 번호 37 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1398 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 47 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 702 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 (41) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(53) 배열 번호 39 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1398 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 45 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 702 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 (41) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(54) 배열 번호 41 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1398 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 23 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 702 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 (41) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(55) 배열 번호 43 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1398 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 23 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 702 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 (41) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(56) (38) 내지 (55) 에 기재된 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.

(57) (38) 내지 (55) 에 기재된 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질 전환 숙주 세포.

(58) (56) 에 기재된 벡터를 포함하는 형질 전환 숙주 세포.

(59) (57) 또는 (58) 에 기재된 숙주 세포를 배양하고, 배양 산물로부터 항체를 정제하는 공정을 포함하는 (1) 내지 (25) 중 어느 한 항에 기재된 항체의 생산 방법.

본 발명에 의하면, 파골 세포의 분화 성숙, 및 골흡수 활성의 저해를 작용 기전으로 하는, 골대사 이상의 치료제 및/또는 예방제를 얻을 수 있다.

도 1 은 클로닝한 래트 ＃24A3 중사슬 가변 영역의 뉴클레오티드 배열, 및 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 2 는 클로닝한 래트 ＃24A3 경사슬 가변 영역의 뉴클레오티드 배열, 및 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 3 은 인간 키메라 ＃24A3 항체 중사슬의 뉴클레오티드 배열, 및 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 4 는 인간 키메라 ＃24A3 항체 경사슬의 뉴클레오티드 배열, 및 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 5 는 h＃24A3-H1 의 뉴클레오티드 배열, 및 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 6 은 h＃24A3-H2 의 뉴클레오티드 배열, 및 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 7 은 h＃24A3-H3 의 뉴클레오티드 배열, 및 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 8 은 h＃24A3-H4 의 뉴클레오티드 배열, 및 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 9 는 h＃24A3-H5 의 뉴클레오티드 배열, 및 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 10 은 h＃24A3-H6 의 뉴클레오티드 배열, 및 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 11 은 h＃24A3-L1 의 뉴클레오티드 배열, 및 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 12 는 h＃24A3-L2 의 뉴클레오티드 배열, 및 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 13 은 h＃24A3-L3 의 뉴클레오티드 배열, 및 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 14 는 h＃24A3-L4 의 뉴클레오티드 배열, 및 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 15 는 래트 ＃24A3 항체의 각 CDR 배열의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 16 은 래트 항인간 Siglec-15 모노클로날 항체 ＃24A3 의 인간 키메라 항체에 의한 인간 정상 파골 세포의 분화의 억제를 나타낸 그래프이다 (N = 6).
도 17 은 h＃24A3-H2b 의 뉴클레오티드 배열, 및 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 18 은 h＃24A3-H2c 의 뉴클레오티드 배열, 및 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 19 는 h＃24A3-H2d 의 뉴클레오티드 배열, 및 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 20 은 h＃24A3-H2e 의 뉴클레오티드 배열, 및 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 21 은 h＃24A3-L2b 의 뉴클레오티드 배열, 및 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 22 는 h＃24A3-L3b 의 뉴클레오티드 배열, 및 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 23 은 래트 항인간 Siglec-15 모노클로날 항체 ＃24A3 의 인간화 항체에 의한 인간 정상 파골 세포의 분화의 억제를 나타낸 그래프이다 (N = 6).
도 24 는 h＃24A3-H2d/L1 항체의 열안정성을 측정한 서모그램이다.
도 25 는 h＃24A3-H2e/L1 항체의 열안정성을 측정한 서모그램이다.
도 26 은 h＃24A3-H2b/L3b 항체의 열안정성을 측정한 서모그램이다.
도 27 은 h＃24A3-H2c/L2b 항체의 열안정성을 측정한 서모그램이다.

본 명세서 중에 있어서, 「유전자」 라는 말에는, DNA 뿐만 아니라 mRNA, cDNA 및 cRNA 도 포함되는 것으로 한다.

본 명세서 중에 있어서, 「폴리뉴클레오티드」 라는 말은 핵산과 동일한 의미로 사용하고 있고, DNA, RNA, 프로브, 올리고 뉴클레오티드, 및 프라이머도 포함되어 있다.

본 명세서 중에 있어서는, 「폴리펩티드」 와 「단백질」 은 구별하지 않고 사용하고 있다.

본 명세서 중에 있어서, 「RNA 획분」 이란, RNA 를 포함하고 있는 획분을 말한다.

본 명세서 중에 있어서, 「세포」 에는, 동물 개체 내의 세포, 배양 세포도 포함하고 있다.

본 명세서 중에 있어서, 「Siglec-15」 는 Siglec-15 단백질과 동일한 의미로 사용하고 있다.

본 명세서 중에 있어서, 「파골 세포의 형성」 은 「파골 세포의 분화」 또는 「파골 세포의 성숙」 과 동일한 의미로 사용하고 있다.

본 명세서 중에 있어서의 「항체의 항원 결합 단편」 이란, 「항체의 기능성 단편」 이라고도 불리고, 항원과의 결합 활성을 갖는 항체의 부분 단편을 의미하고 있고, Fab, F(ab')2, Fv, scFv, diabody, 선상 항체, 및 항체 단편으로 형성된 다특이성 항체 등을 포함한다. 또, F(ab')2 를 환원 조건하에서 처리한 항체의 가변 영역의 1 가의 단편인 Fab' 도 항체의 항원 결합 단편에 포함된다. 단, 항원과의 결합능을 가지고 있는 한 이들의 분자로 한정되지 않는다. 또, 이들의 항원 결합 단편에는, 항체 단백질의 전체 길이 분자를 적당한 효소로 처리한 것 뿐만 아니라, 유전자 공학적으로 개변된 항체 유전자를 사용하여 적당한 숙주 세포에 있어서 산생된 단백질도 포함된다.

본 명세서에 있어서의, 「에피토프」 란, 특정의 항 Siglec-15 항체가 결합하는 Siglec-15 의 부분 펩티드 또는 부분 입체 구조를 의미한다. 상기의 Siglec-15 의 부분 펩티드인 에피토프는 면역 에세이법 등 당업자에게 잘 알려져 있는 방법에 의해 결정할 수 있지만, 예를 들어 이하의 방법에 의해 실시할 수 있다. Siglec-15 의 여러 가지 부분 구조를 제작한다. 부분 구조의 제작에 있어서는, 공지된 올리고 펩티드 합성 기술을 사용할 수 있다. 예를 들어, Siglec-15 의 C 말단 혹은 N 말단으로부터 적당한 길이로 순차 짧게 한 일련의 폴리펩티드를 당업자에게 주지의 유전자 재조합 기술을 사용하여 제작한 후, 그들에 대한 항체의 반응성을 검토하고, 대략적인 인식 부위를 결정한 후에, 더욱 짧은 펩티드를 합성하여 그들의 펩티드와의 반응성을 검토하는 것에 의해, 에피토프를 결정할 수 있다. 또, 특정의 Siglec-15 항체가 결합하는 Siglec-15 의 부분 입체 구조인 에피토프는 X 선 결정 구조 해석에 의해 상기의 항체와 인접하는 Siglec-15 의 아미노산 잔기를 특정함으로써 결정할 수 있다. 제 1 항 Siglec-15 항체가 결합하는 부분 펩티드 또는 부분 입체 구조에 제 2 항 Siglec-15 항체가 결합하면, 제 1 항체와 제 2 항체가 공통의 에피토프를 갖는다고 판정할 수 있다. 또, 제 1 항 Siglec-15 항체의 Siglec-15 에 대한 결합에 대해 제 2 항 Siglec-15 항체가 경합하는 (즉, 제 2 항체가 제 1 항체와 Siglec-15 의 결합을 방해한다) 것을 확인함으로써, 구체적인 에피토프의 배열 또는 구조가 결정되어 있지 않아도, 제 1 항체와 제 2 항체가 공통의 에피토프를 갖는다고 판정할 수 있다. 또한, 제 1 항체와 제 2 항체가 공통의 에피토프에 결합하고, 또한 제 1 항체가 항원의 중화 활성 등의 특수한 효과를 갖는 경우, 제 2 항체도 동일한 활성을 갖는 것을 기대할 수 있다.

항체 분자의 중사슬 및 경사슬에는 각각 3 지점의 상보성 결정 영역 (CDR ： Complemetarity determining region) 이 있는 것이 알려져 있다. 상보성 결정 영역은, 초가변 영역 (hypervariable domain) 이라고도 불리고, 항체의 중사슬 및 경사슬의 가변 영역 내에 있고, 1 차 구조의 변이성이 특히 높은 부위이며, 중사슬 및 경사슬의 폴리펩티드 사슬의 1 차 구조 상에 있어서, 각각 3 지점으로 분리되어 있다. 본 명세서 중에 있어서는, 항체의 상보성 결정 영역에 대해, 중사슬의 상보성 결정 영역을 중사슬 아미노산 배열의 아미노 말단측으로부터 CDRH1, CDRH2, CDRH3 으로 표기하고, 경사슬의 상보성 결정 영역을 경사슬 아미노산 배열의 아미노 말단측으로부터 CDRL1, CDRL2, CDRL3 으로 표기한다. 이들의 부위는 입체 구조 상에서 서로 근접하여, 결합하는 항원에 대한 특이성을 결정하고 있다.

본 발명에 있어서, 「스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈한다」 란, 시판되는 하이브리다이제이션 용액 ExpressHyb Hybridization Solution (크론텍크사 제조) 중, 68 ℃ 에서 하이브리다이즈하는 것, 또는, DNA 를 고정한 필터를 사용하여 0.7 - 1.0 M 의 NaCl 존재하 68 ℃ 에서 하이브리다이제이션을 실시한 후, 0.1 - 2 배 농도의 SSC 용액 (1 배 농도 SSC 란 150 mM NaCl, 15 mM 시트르산나트륨으로 이루어진다) 을 사용하여 68 ℃ 에서 세정함으로써 동정할 수 있는 조건 또는 그것과 동등한 조건으로 하이브리다이즈하는 것을 말한다.

본 명세서에 있어서, 「1 내지 수 개」 및 「1 혹은 수 개」 인 기재가 있는 경우의 「수 개」 란, 2 내지 10 개를 나타내고 있다. 바람직하게는, 10 개 이하, 5 혹은 6 개 이하, 또는 2 혹은 3 개이다.

1. Siglec-15

본 발명자들에 의해, Siglec-15 유전자는 거세포종에 있어서 특이적으로 발현하고 있는 것을 알아냈다. 또, 본 발명자들에 의해 Siglec-15 유전자는 단구 유래 세포주가 파골 세포로 분화할 때에 발현량이 증가하는 것도 알아냈다.

본 발명에서 사용하는 Siglec-15 는 인간, 인간 이외의 포유 동물 (예를 들어, 모르모트, 래트, 마우스, 토끼, 돼지, 양, 소, 원숭이 등) 혹은 닭의 단구 세포 혹은 골수 세포로부터 직접 정제하여 사용하거나, 혹은 상기 세포의 세포막 획분을 조제하여 사용할 수 있고, 또, Siglec-15 를 in vitro 로 합성하거나, 혹은 유전자 조작에 의해 숙주 세포에 산생시킴으로써 얻을 수 있다. 유전자 조작에서는, 구체적으로는, Siglec-15 cDNA 를 발현 가능한 벡터에 삽입한 후, 전사와 번역에 필요한 효소, 기질 및 에너지 물질을 포함하는 용액 중에서 합성하거나, 혹은 다른 원핵 생물, 또는 진핵 생물의 숙주 세포를 형질 전환시키는 것에 의해 Siglec-15 를 발현시킴으로써, 그 단백질을 얻을 수 있다.

인간 Siglec-15 의 cDNA 의 뉴클레오티드 배열은 GenBank 에 액세션 번호 ： NM＿213602 로 등록되어 있다. 마우스 Siglec-15 의 cDNA 의 뉴클레오티드 배열은 GenBank 에 액세션 번호 ： XM＿884636 으로 등록되어 있다. 또한, Siglec-15 는 CD33 antigen-like 3, CD33 molecule-like 3, CD33-like 3 또는 CD33L3 으로 불리는 경우가 있고, 이들은 모두 동일한 분자를 나타내고 있다.

Siglec-15 의 cDNA 는 예를 들어, Siglec-15 의 cDNA 를 발현하고 있는 cDNA 라이브러리를 주형으로 하여, Siglec-15 의 cDNA 를 특이적으로 증폭하는 프라이머를 사용하여 폴리머라아제 연쇄 반응 (이하 「PCR」 이라고 한다) (Saiki, R.K., et al., Science, (1988) 239, 487-49) 을 실시하는, 이른바 PCR 법에 의해 취득할 수 있다.

또한, 인간 또는 마우스의 Siglec-15 를 코드하는 뉴클레오티드 배열과 상보적인 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건으로 하이브리다이즈하고, 또한, Siglec-15 와 동등한 생물 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드도 Siglec-15 의 cDNA 에 포함된다. 또한, 인간 혹은 마우스 Siglec-15 유전자 자리로부터 전사되는 스플라이싱 베어리언트 또는 이것에 스트린젠트한 조건으로 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드로서, 또한, Siglec-15 와 동등한 생물 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드도 Siglec-15 의 cDNA 에 포함된다.

또, 인간 또는 마우스의 Siglec-15 의 아미노산 배열, 또는 이들의 배열로부터 시그널 배열이 제거된 아미노산 배열에 있어서, 1 혹은 수 개의 아미노산이 치환, 결실, 또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, Siglec-15 와 동등한 생물 활성을 갖는 단백질도 Siglec-15 에 포함된다. 또한, 인간 혹은 마우스 Siglec-15 유전자 자리로부터 전사되는 스플라이싱 베어리언트에 코드되는 아미노산 배열 또는 그 아미노산 배열에 있어서, 1 혹은 수 개의 아미노산이 치환, 결실, 또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한, Siglec-15 와 동등한 생물 활성을 갖는 단백질도 Siglec-15 에 포함된다.

2. 골대사 이상의 검출

Siglec-15 유전자는, 인간 각종 골조직 검체군에 있어서의 유전자의 발현량의 해석을 하면, 파골 세포형의 다핵 거세포가 다수 출현하는 골종양이며, 임상적 소견으로서 골용해성의 골파괴를 특징으로 한다 (Bullough et al., Atlas of Orthopedic Pathology 2nd edition, pp 17.6-17.8, Lippincott Williams ＆ Wilkins Publishers (1992)) 거세포종 (Giant cell tumor ； GCT) 에 있어서 유의하게 발현량이 증가하고 있는 것을 알아냈다.

또, Siglec-15 유전자는 단구 유래 세포주가 파골 세포로 분화할 때에 발현량이 증가하는 것도 알아냈다.

따라서, Siglec-15 는 GCT 와 같은 골흡수가 항진하는 인간의 병태에 관여하고 있다고 생각된다. 즉, Siglec-15 유전자 및/또는 Siglec-15 의 각 세포, 및/또는 각 조직에 있어서의 발현량을 측정함으로써 Siglec-15 의 과잉 발현을 수반하는 골대사 이상의 상태를 판정할 수 있다. 또한, 본 명세서에 있어서의 골대사 이상이란, 정미의 골상실에 의해 특징 부여되는 장해이며, 구체적으로는 골다공증 (폐경 후 골다공증, 노인성 골다공증, 스테로이드나 면역 억제제 등의 치료용 약제의 사용에 의한 속발성 골다공증, 관절 류머티즘에 수반되는 골다공증), 관절 류머티즘에 수반되는 골파괴, 암성 고칼슘혈증, 다발성 골수종이나 암의 골전이에 수반되는 골파괴, 거세포종, 골감소증, 치근막염에 의한 이의 상실, 인공 관절 주위의 골융해, 만성 골수염에 있어서의 골파괴, 골 파제트병, 신장성골이영양증, 골형성 부전증 등을 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다.

본 발명에 있어서 Siglec-15 유전자 및/또는 Siglec-15 의 발현량을 조사하는 대상이 되는 「검체」 란, 피험자나 임상 검체 등으로부터 얻어진, 골수, 골, 전립선, 정소, 음경, 방광, 신장, 구강, 인두, 입술, 혀, 잇몸, 비인두, 식도, 위, 소장, 대장, 결장, 간장, 담낭, 췌장, 코, 폐, 연부 조직, 피부, 유방, 자궁, 난소, 뇌, 갑상선, 림프절, 근육, 지방 조직 등의 조직, 혈액, 체액 또는 배설물 등의 시료를 의미하지만, 본 발명에 있어서는 혈액 또는 골수가 보다 바람직하다.

파골 세포의 분화에 관련되는 것이 알려져 있는 RANKL 에 대해서는, 녹아웃 마우스가 제작되어 있고, RANKL 의 기능이 상실된 경우의 표현형에 대해 해석이 이루어져 있다 (Young-Yun Kong, et.al., Nature (1999) 397, p.315-323). Siglec-15 에 대해서도 동일하게 녹아웃 마우스를 제작함으로써, Siglec-15 의 기능이 상실된 경우의 표현형의 해석을 실시할 수 있다.

3. 항 Siglec-15 항체의 제조

본 발명의 Siglec-15 에 대한 항체는, 통상적인 방법을 사용하여, Siglec-15 또는 Siglec-15 의 아미노산 배열에서 선택되는 임의의 폴리펩티드를 동물에게 면역하고, 생체 내에 산생되는 항체를 채취, 정제함으로써 얻을 수 있다. 항원이 되는 Siglec-15 의 생물종은 인간으로 한정되지 않고, 마우스, 래트 등의 인간 이외의 동물에서 유래하는 Siglec-15 를 동물에게 면역할 수도 있다. 이 경우에는, 취득된 이종 Siglec-15 에 결합하는 항체와 인간 Siglec-15 의 교차성을 시험함으로써, 인간의 질환에 적용 가능한 항체를 선별할 수 있다.

또, 공지된 방법 (예를 들어, Kohler and Milstein, Nature (1975) 256, p. 495-497, Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, p. 365-367, Plenum Press, N. Y. (1980)) 에 따라, Siglec-15 에 대한 항체를 산생하는 항체 산생 세포와 미엘로마 세포를 융합시킴으로써 하이브리도마를 수립하고, 모노클로날 항체를 얻을 수도 있다. 이와 같은 방법의 구체적인 예는 국제 공개 제WO09/48072호 팜플렛 (2009 년 4 월 16 일 공개) 및 제WO10/117011호 팜플렛 (2010 년 10 월 14 일 공개) 에 기재되어 있다. 그러나, 모노클로날 항체를 취득하는 방법은 이미 고전적으로 확립된 분야에 해당하고, 상기의 구체예로 한정되는 것은 아니다.

또한, 항원이 되는 Siglec-15 는 Siglec-15 유전자를 유전자 조작에 의해 숙주 세포에 산생시킴으로써 얻을 수 있다. 구체적으로는, Siglec-15 유전자를 발현 가능한 벡터를 제작하고, 이것을 숙주 세포에 도입하여 그 유전자를 발현시켜, 발현된 Siglec-15 를 정제하면 된다.

이와 같이 하여 수립된 하이브리도마주의 예로서는, 본 명세서에 기재된 하이브리도마 ＃24A3 을 들 수 있다. 또한, 본 명세서 중에 있어서는, 하이브리도마 ＃24A3 이 산생하는 항체를, 「＃24A3 항체」 또는 간단히 「＃24A3」 이라고 기재한다. 또, 본 명세서에 있어서는 ＃24A3 항체 이외의 항체에 대해서도, 동일한 방법으로 항체명을 기재한다. ＃24A3 항체의 중사슬 가변 영역을 포함하는 부분 단편은 배열표의 배열 번호 2 의 1 내지 121 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는다. 또, ＃24A3 항체의 경사슬 가변 영역 배열을 포함하는 부분 단편은 배열표의 배열 번호 4 의 1 내지 109 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는다.

본 발명의 항체에는, 상기 Siglec-15 에 대한 모노클로날 항체에 더하여, 인간에 대한 이종 항원성을 저하시키는 것 등을 목적으로서 인위적으로 개변한 유전자 재조합형 항체, 예를 들어, 키메라 (Chimeric) 항체, 인간화 (Humanized) 항체, 인간 항체 등도 포함된다. 이들 항체는 이미 알려진 방법을 사용하여 제조할 수 있다.

키메라 항체로서는, 항체의 가변 영역과 정상 영역이 서로 이종인 항체, 예를 들어 마우스 또는 래트 유래 항체의 가변 영역을 인간 유래의 정상 영역에 접합한 키메라 항체를 들 수 있다 (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 81, 6851-6855, (1984) 참조). 래트 항마우스 항체 ＃24A3 유래의 키메라 항체의 일례로서, 배열표의 배열 번호 8 의 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 중사슬, 및 배열 번호 10 의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 경사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있다.

인간화 항체로서는, 상보성 결정 영역 (CDR ； complementarity determining region) 만을 인간 유래의 항체에 삽입한 항체 (Nature (1986) 321, p. 522-525 참조), CDR 이식법에 의해, CDR 의 배열에 더하여 일부의 프레임 워크의 아미노산 잔기도 인간 항체에 이식한 항체 (국제 공개 제WO90/07861호 팜플렛) 를 들 수 있다.

＃24A3 항체 유래의 인간화 항체로서는, ＃24A3 의 6 종 모든 CDR 배열을 유지하고, 파골 세포의 형성을 억제하는 활성을 가지는 한, 본 발명의 항체에 포함된다. 또한, ＃24A3 항체의 중사슬 가변 영역은 배열 번호 31 에 나타나는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH1 (RYDVS), 배열 번호 32 에 나타나는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH2 (VIHPGSGGTGYNEKFKA), 및 배열 번호 33 에 나타나는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH3 (RGLNSGYWFFDF) 을 보유하고 있다. 또, ＃24A3 항체의 경사슬 가변 영역은 배열 번호 34 에 나타나는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL1 (KASQNVGSNVD), 배열 번호 35 에 나타나는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL2 (ESTNRYT), 및 배열 번호 36 에 나타나는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL3 (MQSNFFPFT) 을 보유하고 있다. 이들 CDR 의 아미노산 배열은 도 15 에도 기재되어 있다.

또, 추가로 각 CDR 중의 1 내지 3 개의 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환한 CDR 개변 인간화 항체도, 파골 세포의 형성을 억제하는 활성을 가지는 한, 본 발명의 항체에 포함된다. CDRH3 에 있어서의 아미노산 치환예로서는, 배열 번호 33 에 나타나는 아미노산 배열에 있어서 1 개의 아미노산을 치환한 CDRH3 을 들 수 있다. 바람직하게는, 배열 번호 49 에 나타나는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH3 (RGLNKGYWFFDF) 이다. 이 CDR 의 아미노산 배열은 도 15 에도 기재되어 있다.

래트 항체 ＃24A3 의 인간화 항체의 실례로서는, 배열표의 배열 번호 12 의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기, 배열 번호 14 의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기, 배열 번호 16 의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기, 배열 번호 18 의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기, 배열 번호 20 의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기, 배열 번호 22 의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열, 배열 번호 38 의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열, 배열 번호 40 의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열, 배열 번호 42 의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열, 또는 배열 번호 44 의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬, 및 배열 번호 24 의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기, 배열 번호 26 의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기, 배열 번호 28 의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기, 배열 번호 30 의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기, 배열 번호 46 의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기, 또는 배열 번호 48 의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬의 임의의 조합을 들 수 있다.

바람직한 조합으로서는, 배열 번호 12 의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬 및 배열 번호 24 의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 12 의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬 및 배열 번호 26 의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 12 의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬 및 배열 번호 28 의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 14 의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬 및 배열 번호 24 의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 14 의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬 및 배열 번호 26 의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 14 의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬 및 배열 번호 28 의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 16 의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬 및 배열 번호 24 의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 16 의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬 및 배열 번호 26 의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 16 의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬 및 배열 번호 28 의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 18 의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬 및 배열 번호 24 의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 18 의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬 및 배열 번호 26 의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 18 의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬 및 배열 번호 28 의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 20 의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬 및 배열 번호 24 의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 20 의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬 및 배열 번호 26 의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 20 의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬 및 배열 번호 28 의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬로 이루어지는 항체, 또는 배열 번호 22 의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬 및 배열 번호 30 의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있다.

보다 바람직한 조합으로서는, 배열 번호 12 의 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 중사슬 및 배열 번호 24 의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 12 의 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 중사슬 및 배열 번호 26 의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 12 의 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 중사슬 및 배열 번호 28 의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 14 의 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 중사슬 및 배열 번호 24 의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 14 의 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 중사슬 및 배열 번호 26 의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 14 의 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 중사슬 및 배열 번호 28 의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 경사슬 로 이루어지는 항체, 배열 번호 16 의 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 중사슬 및 배열 번호 24 의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 16 의 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 중사슬 및 배열 번호 26 의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 16 의 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 중사슬 및 배열 번호 28 의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 18 의 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 중사슬 및 배열 번호 24 의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 18 의 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 중사슬 및 배열 번호 26 의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 18 의 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 중사슬 및 배열 번호 28 의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 20 의 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 중사슬 및 배열 번호 24 의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 20 의 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 중사슬 및 배열 번호 26 의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 20 의 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 중사슬 및 배열 번호 28 의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 경사슬로 이루어지는 항체, 또는 배열 번호 22 의 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 중사슬 및 배열 번호 30 의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 경사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있다.

또한 바람직한 조합으로서는, 배열 번호 14 의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬 및 배열 번호 24 의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 14 의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬 및 배열 번호 26 의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 14 의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬 및 배열 번호 28 의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 38 의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬 및 배열 번호 48 의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 40 의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬 및 배열 번호 46 의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 42 의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬 및 배열 번호 24 의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬로 이루어지는 항체, 또는 배열 번호 44 의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬 및 배열 번호 24 의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있다.

가장 바람직한 조합으로서는, 배열 번호 14 의 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 중사슬 및 배열 번호 24 의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 14 의 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 중사슬 및 배열 번호 26 의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 14 의 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 중사슬 및 배열 번호 28 의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 38 의 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 중사슬 및 배열 번호 48 의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 40 의 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 중사슬 및 배열 번호 46 의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 42 의 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 중사슬 및 배열 번호 24 의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 경사슬로 이루어지는 항체, 배열 번호 44 의 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 중사슬 및 배열 번호 24 의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 경사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있다.

본 발명의 항체로서는, 또한, 인간 항체를 들 수 있다. 항 Siglec-15 인간 항체란, 인간 염색체 유래의 항체의 유전자 배열만을 갖는 인간 항체를 의미한다. 항 Siglec-15 인간 항체는 인간 항체의 중사슬과 경사슬의 유전자를 포함하는 인간 염색체 단편을 갖는 인간 항체 산생 마우스를 사용한 방법 (Tomizuka, K. et al., Nature Genetics (1997) 16, p. 133-143, ； Kuroiwa, Y. et. al., Nucl. AcidsRes. (1998) 26, p. 3447-3448 ； Yoshida, H. et. al., Animal Cell Technology ： Basic and Applied Aspects vol. 10, p. 69-73 (Kitagawa, Y., Matsuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999. ； Tomizuka, K. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, p. 722-727 등을 참조.) 에 의해 취득할 수 있다.

이와 같은 인간 항체 산생 마우스는, 구체적으로는, 내재성 면역 글로불린 중사슬 및 경사슬의 유전자 자리가 파괴되고, 대신에 효모 인공 염색체 (Yeast artificial chromosome, YAC) 벡터 등을 개재하여 인간 면역 글로불린 중사슬 및 경사슬의 유전자 자리가 도입된 유전자 재조합 동물을, 녹아웃 동물 및 트랜스제닉 동물의 제작, 및 이들의 동물끼리를 교배시킴으로써 만들어 낼 수 있다.

또, 유전자 재조합 기술에 의해, 그러한 인간 항체의 중사슬 및 경사슬의 각각을 코드하는 cDNA, 바람직하게는 그 cDNA 를 포함하는 벡터에 의해 진핵 세포를 형질 전환하고, 유전자 재조합 인간 모노클로날 항체를 산생하는 형질 전환 세포를 배양함으로써, 이 항체를 배양 상청 중에서 얻을 수도 있다. 여기서, 숙주로서는 예를 들어 진핵 세포, 바람직하게는 CHO 세포, 임파구나 미엘로마 등의 포유 동물세포를 사용할 수 있다.

또, 인간 항체 라이브러리에서 선별한 파지 디스플레이 유래의 인간 항체를 취득하는 방법 (Wormstone, I. M. et. al, Investigative Ophthalmology ＆ Visual Science. (2002) 43 (7), p. 2301-2308 ； Carmen, S. et. al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), p. 189-203 ； Siriwardena, D. et. al., Ophthalmology (2002) 109 (3), p. 427-431 등 참조.) 도 알려져 있다.

예를 들어, 인간 항체의 가변 영역을 한 개 사슬 항체 (scFv) 로서 파지 표면에 발현시켜, 항원에 결합하는 파지를 선택하는 파지 디스플레이법 (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), p. 1105-1116) 을 사용할 수 있다. 항원에 결합함으로써 선택된 파지의 유전자를 해석함으로써, 항원에 결합하는 인간 항체의 가변 영역을 코드하는 DNA 배열을 결정할 수 있다. 항원에 결합하는 scFv 의 DNA 배열이 밝혀지면, 당해 배열을 갖는 발현 벡터를 제작하고, 적당한 숙주에 도입하여 발현시킴으로써 인간 항체를 취득할 수 있다 (WO92/01047, WO92/20791, WO93/06213, WO93/11236, WO93/19172, WO95/01438, WO95/15388, Annu. Rev. Immunol (1994) 12, p. 433-455, Nature Biotechnology (2005) 23 (9), p. 1105-1116).

상기의 항체는 실시예 3 또는 실시예 10 에 나타낸 방법 등에 의해 항원에 대한 결합성을 평가하여, 바람직한 항체를 선발할 수 있다. 항체의 성질을 비교할 때의 다른 지표의 일례로서는, 항체의 안정성을 들 수 있다. 시차주사 칼로리메트리 (DSC) 는 단백의 상대적 구조 안정성이 좋은 지표가 되는 열변성 중점 (Tm) 을 재빠르게, 또 정확하게 측정할 수 있는 방법이다. DSC 를 사용하여 Tm 값을 측정하고, 그 값을 비교함으로써, 열안정성의 차이를 비교할 수 있다. 항체의 보존 안정성은 항체의 열안정성과 어느 정도의 상관을 나타내는 것이 알려져 있고 (Lori Burton, et. al., Pharmaceutical Development and Technology (2007) 12, p. 265-273), 열안정성을 지표로, 바람직한 항체를 선발할 수 있다. 항체를 선발하기 위한 다른 지표로서는, 적절한 숙주 세포에 있어서의 수량이 많은 것, 및 수용액 중에서의 응집성이 낮은 것을 들 수 있다. 예를 들어 수량이 가장 높은 항체가 가장 높은 열안정성을 나타낸다고는 할 수 없기 때문에, 이상에 기술한 지표에 기초하여 종합적으로 판단하여, 인간에의 투여에 가장 적합한 항체를 선발할 필요가 있다.

또, 항체의 중사슬 및 경사슬의 전체 길이 배열을 적절한 링커를 사용하여 연결하고, 한 개 사슬 이뮤노글로불린 (single chain immunoglobulin) 을 취득하는 방법도 알려져 있다 (Lee, H-S, et. al., Molecular Immunology (1999) 36, p. 61-71 ； Shirrmann, T. et. al., mAbs (2010), 2, (1) p. 1-4). 이와 같은 한 개 사슬 이뮤노글로불린은 2 량체화함으로써, 본래는 4 량체인 항체와 유사한 구조와 활성을 유지하는 것이 가능하다. 또, 본 발명의 항체는 단일의 중사슬 가변 영역을 가지며, 경사슬 배열을 갖지 않는 항체이어도 된다. 이와 같은 항체는 단일 도메인 항체 (single domain antibody ： sdAb) 또는 나노보디 (nanobody) 로 불리고 있고, 실제로 낙타 또는 라마에서 관찰되고, 항원 결합능이 유지되어 있는 것이 보고되어 있다 (Muyldemans S. et. al., Protein Eng. (1994) 7 (9), 1129-35, Hamers-Casterman C. et. al., Nature (1993) 363 (6428) 446-8). 상기의 항체는 본 발명에 있어서의 항체의 항원 결합 단편의 일종으로 해석하는 것도 가능하다.

또, 본 발명의 항체에 결합하고 있는 당 사슬 수식을 조절함으로써, 항체 의존성 세포 장해 활성을 증강하는 것이 가능하다. 항체의 당 사슬 수식의 조절 기술로서는, WO99/54342, WO00/61739, WO02/31140 등이 알려져 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.

항체 유전자를 일단 단리한 후, 적당한 숙주에 도입하여 항체를 제작하는 경우에는, 적당한 숙주와 발현 벡터의 조합을 사용할 수 있다. 항체 유전자의 구체예로서는, 본 명세서에 기재된 항체의 중사슬 배열을 코드하는 유전자, 및 경사슬 배열을 코드하는 유전자를 조합한 것을 들 수 있다. 숙주 세포를 형질 전환할 때에는, 중사슬 배열 유전자와 경사슬 배열 유전자는 동일한 발현 벡터에 삽입되어 있는 것이 가능하고, 또 다른 발현 벡터에 삽입되어 있는 것도 가능하다. 진핵 세포를 숙주로서 사용하는 경우, 동물 세포, 식물 세포, 진핵 미생물을 사용할 수 있다. 동물 세포로서는, (1) 포유류 세포, 예를 들어, 원숭이의 세포인 COS 세포 (Gluzman, Y. Cell (1981) 23, p. 175-182, ATCC CRL-1650), 마우스 선유아 세포 NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658) 이나 차이니즈·햄스터 난소 세포 (CHO 세포, ATCC CCL-61) 의 디하이드로 엽산 환원 효소 결손주 (Urlaub, G. and Chasin, L. A. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (1980) 77, p. 4126-4220) 를 들 수 있다. 또, 원핵 세포를 사용하는 경우에는, 예를 들어, 대장균, 고초균을 들 수 있다. 이들 세포에 목적으로 하는 항체 유전자를 형질 전환에 의해 도입하여, 형질 전환된 세포를 in vitro 로 배양함으로써 항체가 얻어진다. 이상의 배양법에 있어서는 항체의 배열에 의해 수량이 상이한 경우가 있고, 동등한 결합 활성을 가지는 항체 중에서 수량을 지표로 의약으로서의 생산이 용이한 것을 선별하는 것이 가능하다.

본 발명의 항체의 아이소타입으로서의 제한은 없고, 예를 들어 IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA (IgA1, IgA2), IgD 혹은 IgE 등을 들 수 있지만, 바람직하게는 IgG 또는 IgM, 더욱 바람직하게는 IgG1 또는 IgG2 를 들 수 있다.

또 본 발명의 항체는 항체의 항원 결합부를 갖는 항체의 항원 결합 단편 또는 그 수식물이어도 된다. 항체를 파파인, 펩신 등의 단백질 분해 효소로 처리하거나, 혹은 항체 유전자를 유전자 공학적 수법에 의해 개변하여 적당한 배양 세포에 있어서 발현시킴으로써, 그 항체의 단편을 얻을 수 있다. 이와 같은 항체 단편 중에서, 항체 전체 길이 분자가 가지는 기능의 모두 또는 일부를 유지하고 있는 단편을 항체의 항원 결합 단편이라고 부를 수 있다. 항체의 기능으로서는, 일반적으로는 항원 결합 활성, 항원의 활성을 중화하는 활성, 항원의 활성을 증강하는 활성, 항체 의존성 세포 장해 활성, 보체 의존성 세포 상해 활성 및 보체 의존성 세포성 세포 상해 활성을 들 수 있다. 본 발명에 있어서의 항체의 항원 결합 단편이 유지하는 기능은 Siglec-15 에 대한 결합 활성이며, 바람직하게는 파골 세포의 형성을 억제하는 활성이며, 보다 바람직하게는 파골 세포의 세포 융합의 과정을 억제하는 활성이다.

예를 들어, 항체의 단편으로서는, Fab, F(ab') 2, Fv, 또는 중사슬 및 경사슬의 Fv 를 적당한 링커로 연결시킨 싱글 체인 Fv (scFv), diabody (diabodies), 선상 항체, 및 항체 단편으로 형성된 다특이성 항체 등을 들 수 있다. 또, F(ab')2 를 환원 조건하에서 처리한 항체의 가변 영역의 1 가의 단편인 Fab' 도 항체의 단편에 포함된다.

또한, 본 발명의 항체는 적어도 2 종류의 상이한 항원에 대해 특이성을 갖는 다특이성 항체이어도 된다. 통상적으로 이와 같은 분자는 2 종류의 항원에 결합하는 것이지만 (즉, 이중 특이성 항체 (bispecific antibody)), 본 발명에 있어서의 「다특이성 항체」 는 그 이상 (예를 들어, 3 종류) 의 항원에 대해 특이성을 갖는 항체를 포함하는 것이다.

본 발명의 다특이성 항체는 전체 길이로 이루어지는 항체, 또는 그러한 항체의 단편 (예를 들어, F(ab')2 이중 특이성 항체) 이어도 된다. 이중 특이성 항체는 2 종류의 항체의 중사슬과 경사슬 (HL 쌍) 을 결합시켜 제작할 수도 있고, 상이한 모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마를 융합시켜, 이중 특이성 항체 산생 융합 세포를 제작하는 것에 의해서도, 제작할 수 있다 (Millstein et al., Nature (1983) 305, p. 537-539).

본 발명의 항체는 한 개 사슬 항체 (scFv 라고도 기재한다) 이어도 된다. 한 개 사슬 항체는 항체의 중사슬 가변 영역과 경사슬 가변 영역을 폴리펩티드의 링커로 연결함으로써 얻어진다 (Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 113 (Rosenberg 및 Moore 편, Springer Verlag, New York, p. 269-315 (1994), Nature Biotechnology (2005), 23, p. 1126-1136). 또, 2 개의 scFv 를 폴리펩티드 링커로 결합시켜 제작되는 BiscFv 단편을 이중 특이성 항체로서 사용할 수도 있다.

한 개 사슬 항체를 제작하는 방법은 당기술 분야에 있어서 주지이다 (예를 들어, 미국 특허 제4,946,778호, 미국 특허 제5,260,203호, 미국 특허 제5,091,513호, 미국 특허 제5,455,030호 등을 참조). 이 scFv 에 있어서, 중사슬 가변 영역과 경사슬 가변 영역은 콘주게이트를 만들지 않는 링커, 바람직하게는 폴리펩티드 링커를 개재하여 연결된다 (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (1988), 85, p. 5879-5883). scFv 에 있어서의 중사슬 가변 영역 및 경사슬 가변 영역은 동일한 항체에서 유래해도 되고, 다른 항체에서 유래해도 된다. 가변 영역을 연결하는 폴리펩티드 링커로서는, 예를 들어 12 ∼ 19 잔기로 이루어지는 임의의 한 개 사슬 펩티드가 사용된다.

scFv 를 코드하는 DNA 는, 상기 항체의 중사슬 또는 중사슬 가변 영역을 코드하는 DNA, 및 경사슬 또는 경사슬 가변 영역을 코드하는 DNA 중, 그들의 배열 중 전부 또는 원하는 아미노산 배열을 코드하는 DNA 부분을 주형으로 하고, 그 양단을 규정하는 프라이머쌍을 사용하여 PCR 법에 의해 증폭하고, 이어서, 또한 폴리펩티드 링커 부분을 코드하는 DNA, 및 그 양단이 각각 중사슬, 경사슬과 연결되도록 규정하는 프라이머쌍을 조합하여 증폭함으로써 얻어진다.

또, 일단 scFv 를 코드하는 DNA 가 제작되면, 그들을 함유하는 발현 벡터, 및 그 발현 벡터에 의해 형질 전환된 숙주를 통상적인 방법에 따라 얻을 수 있고, 또, 그 숙주를 사용함으로써, 통상적인 방법에 따라 scFv 를 얻을 수 있다. 이들의 항체 단편은 상기와 마찬가지로 하여 유전자를 취득하여 발현시키고, 숙주에 의해 산생시킬 수 있다.

본 발명의 항체는 다량화하여 항원에 대한 친화성을 높인 것이어도 된다. 다량화하는 항체로서는, 1 종류의 항체이거나, 동일한 항원의 복수의 에피토프를 인식하는 복수의 항체이어도 된다. 항체를 다량화하는 방법으로서는, IgG CH3 도메인과 2 개의 scFv 의 결합, 스트렙토아비딘과의 결합, 헬릭스턴헬릭스 모티프의 도입 등을 들 수 있다.

본 발명의 항체는 아미노산 배열이 상이한 복수 종류의 항 Siglec-15 항체의 혼합물인, 폴리클로날 항체이어도 된다. 폴리클로날 항체의 일례로서는, CDR 이 상이한 복수 종류의 항체의 혼합물을 들 수 있다. 그러한 폴리클로날 항체로서는, 상이한 항체를 산생하는 세포의 혼합물을 배양하고, 그 배양물로부터 정제된 항체를 사용할 수 있다 (WO2004/061104호 참조).

본 발명의 항체는 상기의 항체의 중사슬 및/또는 경사슬과 비교하여 80 ％ 내지 99 ％ 라는 동일성을 갖는 항체이어도 된다. 상기의 중사슬 아미노산 배열 및 경사슬 아미노산 배열과 높은 상동성을 나타내는 배열을 조합시킴으로써, 상기의 각 항체와 동등한 항원 결합능, 파골 재형성 억제 작용 및/또는 파골 세포에 의한 골흡수의 억제 작용을 갖는 항체를 선택하는 것이 가능하다. 이와 같은 상동성은 일반적으로는 80 ％ 이상의 상동성이며, 바람직하게는 90 ％ 이상의 상동성이며, 보다 바람직하게는 95 ％ 이상의 상동성이며, 가장 바람직하게는 99 ％ 이상의 상동성이다. 또, 중사슬 및/또는 경사슬의 아미노산 배열에 1 내지 수 개의 아미노산 잔기가 치환, 결실 및/또는 부가된 아미노산 배열을 조합하는 것에 의해서도, 상기의 각 항체와 동등한 각종 작용을 갖는 항체를 선택하는 것이 가능하다. 치환, 결실 및/또는 부가되는 아미노산 잔기수는 일반적으로는 10 아미노산 잔기 이하이며, 바람직하게는 5 내지 6 아미노산 잔기 이하이며, 보다 바람직하게는 2 내지 3 아미노산 잔기 이하이며, 가장 바람직하게는 1 아미노산 잔기이다.

또한, 포유류 배양 세포에서 생산되는 항체의 중사슬의 카르복실 말단의 리신 잔기가 결실되는 것이 알려져 있고 (Journal of Chromatography A, 705 ： 129-134 (1995)), 또, 동 중사슬 카르복실 말단의 글리신, 리신의 2 아미노산 잔기가 결실되고, 새롭게 카르복실 말단에 위치하는 프롤린 잔기가 아미드화되는 것이 알려져 있다 (Analytical Biochemistry, 360 ： 75-83 (2007)). 그러나, 이들의 중사슬 배열의 결실 및 수식은 항체의 항원 결합능 및 이펙터 기능 (보체의 활성화나 항체 의존성 세포 장해 작용 등) 에는 영향을 미치지 않는다. 따라서, 본 발명에는 당해 수식을 받은 항체도 포함되고, 중사슬 카르복실 말단에 있어서 1 또는 2 개의 아미노산이 결실된 결실체, 및 아미드화된 당해 결실체 (예를 들어, 카르복실 말단 부위의 프롤린 잔기가 아미드화된 중사슬) 등을 들 수 있다. 단, 항원 결합능 및 이펙터 기능이 유지되고 있는 한, 본 발명에 관련된 항체의 중사슬의 카르복실 말단의 결실체는 상기의 종류로 한정되지 않는다. 본 발명에 관련된 항체를 구성하는 2 개의 중사슬은 완전 길이 및 상기의 결실체로 이루어지는 군에서 선택되는 중사슬 중 어느 1 종이어도 되고, 어느 2 종을 조합한 것이어도 된다. 각 결실체의 양 비는 본 발명에 관련된 항체를 산생하는 포유류 배양 세포의 종류 및 배양 조건에 영향을 받을 수 있지만, 본 발명에 관련된 항체의 주성분으로서는 2 개의 중사슬의 쌍방에서 카르복실 말단의 하나의 아미노산 잔기가 결실되어 있는 경우를 들 수 있다.

2 종류의 아미노산 배열간의 상동성은 Blast algorithm version 2.2.2 (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), 「Gapped BLAST and PSI-BLAST ： a new generation of protein database search programs」, Nucleic Acids Res. 25 ： 3389-3402) 의 디폴트 파라미터를 사용함으로써 결정할 수 있다. Blast algorithm 은 인터넷에서 www.ncbi.nlm.nih.gov/blast 에 액세스하는 것에 의해서도 사용할 수 있다. 또한, 상기의 Blast algorithm 에 의해 Identity (또는 Identities) 및 Positivity (또는 Positivities) 의 2 종류의 퍼센티지의 값이 계산된다. 전자는 상동성을 구해야 할 2 종류의 아미노산 배열간에서 아미노산 잔기가 일치한 경우의 값이며, 후자는 화학 구조가 유사한 아미노산 잔기도 고려한 수치이다. 본 명세서에 있어서는, 아미노산 잔기가 일치하고 있는 경우의 Identity (동일성) 의 값으로써 상동성의 값으로 한다.

항체의 수식물로서, 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 등의 각종 분자와 결합한 항체를 사용할 수도 있다.

본 발명의 항체는 또한 이들의 항체와 다른 약제가 콘주게이트를 형성하고 있는 것 (Immunoconjugate) 이어도 된다. 이와 같은 항체의 예로서는, 그 항체가 방사성 물질이나 약리 작용을 갖는 화합물과 결합하고 있는 것을 들 수 있다 (Nature Biotechnology (2005) 23, p. 1137-1146).

얻어진 항체는 균일하게까지 정제할 수 있다. 항체의 분리, 정제는 통상적인 단백질로 사용되고 있는 분리, 정제 방법을 사용하면 된다. 예를 들어 칼럼 크로마토그래피, 필터 여과, 한외 여과, 염석, 투석, 조제용 폴리아크릴아미드겔 전기 영동, 등전점 전기 영동 등을 적절히 선택, 조합하면, 항체를 분리, 정제할 수 있지만 (Strategies for Protein Purification and Characterization ： A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996) ； Antibodies ： A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), 이들로 한정되는 것은 아니다.

크로마토그래피로서는, 어피니티 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피 등을 들 수 있다.

이들의 크로마토그래피는 HPLC 나 FPLC 등의 액체 크로마토그래피를 사용하여 실시할 수 있다.

어피니티 크로마토그래피에 사용하는 칼럼으로서는, 프로테인 A 칼럼, 프로테인 G 칼럼을 들 수 있다.

예를 들어 프로테인 A 칼럼을 사용한 칼럼으로서 Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (파르마시아) 등을 들 수 있다.

또 항원을 고정화한 담체를 사용하여, 항원에의 결합성을 이용하여 항체를 정제하는 것도 가능하다.

4. 항 Siglec-15 항체를 함유하는 의약

상기 서술한 「3. 항 Siglec-15 항체의 제조」 의 항에 기재된 방법으로 얻어지는 항 Siglec-15 항체 중에서, Siglec-15 의 생물 활성을 중화하는 항체를 얻을 수 있다. 이들 Siglec-15 의 생물 활성을 중화하는 항체는, 생체 내에서의 Siglec-15 의 생물 활성, 즉, 파골 세포의 분화 및/또는 성숙을 저해하는 점에서, 의약으로서 파골 세포의 분화 및/또는 성숙 이상에서 기인하는 골대사 이상에 대한 치료 및/또는 예방제로서 사용할 수 있다. 골대사 이상은 정미의 골상실 (골감소증 또는 골용해증) 에 의해 특징이 부여되는 어느 장해이어도 된다. 일반적으로, 항 Siglec-15 항체에 의한 치료 및/또는 예방은 골흡수를 억제할 필요가 있는 경우에 적용된다. 항 Siglec-15 항체로 치료 및/또는 예방 가능한 골대사 이상으로서는, 골다공증 (폐경 후 골다공증, 노인성 골다공증, 스테로이드나 면역 억제제 등의 치료용 약제의 사용에 의한 속발성 골다공증, 관절 류머티즘에 수반되는 골다공증), 관절 류머티즘에 수반되는 골파괴, 암성 고칼슘혈증, 다발성 골수종이나 암의 골전이에 수반되는 골파괴, 거세포종, 골감소증, 치근막염에 의한 이의 상실, 인공 관절 주위의 골융해, 만성 골수염에 있어서의 골파괴, 골 파제트병, 신장성 골이영양증, 골형성 부전증 등을 들 수 있지만, 파골 세포에 의한 정미의 골상실을 수반하는 질환이면, 이들로 한정되지 않는다. 상기의 의약으로서의 항 Siglec-15 항체의 예로서, ＃24A3 항체로부터 「3. 항 Siglec-15 항체의 제조」 에 기재된 방법에 의해 제작된 키메라 항체 또는 인간화 항체를 들 수 있다. 또, ＃24A3 항체와 동일한 에피토프를 갖는 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체도 의약으로서 사용 가능하다. 어느 항 Siglec-15 항체가 ＃24A3 항체와 동일한 에피토프를 가지는 것은, Siglec-15 의 특정 부분 펩티드에 대해 이들의 항체가 공통적으로 결합하는지의 여부를 관찰함으로써 확인할 수 있다. 또, 어느 항 Siglec-15 항체가 Siglec-15 와의 결합에 있어서 ＃24A3 항체와 경합하는 것이면, 이들의 항체가 공통의 에피토프를 갖는다고 판정할 수 있다.

in vitro 에서의 항 Siglec-15 항체에 의한 Siglec-15 의 생물 활성의 중화 활성은 예를 들어 Siglec-15 를 과잉 발현하고 있는 세포의 파골 세포로의 분화의 억제 활성으로 측정할 수 있다. 예를 들어, 마우스 단구 유래 세포주 RAW264.7 세포 또는 RAW264 세포에 여러 가지의 농도로 항 Siglec-15 항체를 첨가하고, RANKL 혹은 TNF-α 자극에 의한, 파골 세포로의 분화의 억제 활성을 측정할 수 있다. 또, 골수 유래의 초대 배양 세포에 여러 가지의 농도로 항 Siglec-15 항체를 첨가하고, RANKL, TNF-α 혹은 활성형 비타민 D₃ 자극에 의한, 파골 세포로의 분화의 억제 활성을 측정할 수 있다. 또한, 정상 인간 파골 전구 세포 (Normal Human Natural Osteoclast Precursor Cells, 산코 준야쿠에서 구입 가능, 카탈로그 번호 2T-110) 에 여러 가지의 농도로 항 Siglec-15 항체를 첨가하고, RANKL 및 M-CSF 자극에 의한, 파골 세포로의 분화의 억제 활성을 측정할 수 있다. 이와 같은 파골 세포의 분화 억제 효과는 파골 세포의 타르타르산 내성 산성 포스파타제 (TRAP) 활성의 억제를 지표로서 측정할 수 있다. 또, TRAP 양성 다핵 파골 세포의 형성의 억제, 즉 파골 세포의 세포 융합의 억제를 지표로 해도, 파골 세포의 분화 억제 효과를 측정할 수 있다. 또한, 대퇴골 및/또는 경골 유래의 세포를 사용한 피트 어세이 (Takada et al., Bone and Mineral, (1992) 17, 347-359) 실험에 있어서, 대퇴골 및/또는 경골 유래의 세포에 여러 가지의 농도로 항 Siglec-15 항체를 첨가하여 상아 절편 상의 피트의 형성을 관찰함으로써, in vitro 에 있어서의 파골 세포에 의한 골흡수의 억제 활성을 측정할 수 있다. in vitro 에 있어서의 파골 세포에 의한 골흡수의 억제 활성의 측정계로서는, 유로퓸이 결합된 인간 콜라겐을 코팅한 플레이트를 사용하는 것도 가능하다. in vivo 에서의 실험 동물을 이용한 항 Siglec-15 항체의 골대사 이상에 대한 치료 또는 예방 효과는, 예를 들어, 골다공증 모델 동물 또는 Siglec-15 를 과잉으로 발현하고 있는 트랜스제닉 동물에 항 Siglec-15 항체를 투여하고, 파골 세포의 변화를 측정함으로써 확인할 수 있다. 상기의 골다공증 모델 동물로서, 난소 적출 래트 또는 난소 적출 원숭이를 들 수 있다. 이들의 실험 동물에 항 Siglec-15 항체를 투여한 후에 골밀도 또는 골대사 마커를 측정함으로써, 항 Siglec-15 항체에 의한 골흡수 활성의 억제 효과를 측정할 수 있다. 골대사 마커로서는, 골흡수 마커인 뇨 중 데옥시피리디놀린, 뇨 중 N-telopeptide of type I collagen (NTX), 뇨 중 C-telopeptide of type I collagen (CTX), 혈중 NTX, 혈중 CTX, 혈중 Tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP5b) 등이나, 골형성 마커인 혈중 골형 알칼리포스파타제 (BAP), 혈중 오스테오칼신 (BGP), Procollagen type I C-peptide (P1NP) 등을 들 수 있지만, 이들의 골대사 마커로 한정되는 것은 아니다.

이와 같이 하여 얻어진 Siglec-15 의 생물 활성을 중화하는 항체는, 의약으로서 특히 골다공증, 관절 류머티즘에 수반되는 골파괴, 암의 골전이에 수반되는 골파괴 등의 골 대사 이상의 치료 또는 예방을 목적으로 한 의약 조성물로서, 혹은 이와 같은 질환의 면역학적 진단을 위한 항체로서 유용하다.

관절 류머티즘 (RA) 의 치료에 있어서, 질환의 발증에 수반하여 발생하는 골상실이 큰 과제가 되고 있다. RA 에 수반되는 이 골상실에 있어서는, 파골 세포가 중심적인 역할을 달성하고 있는 것이 보고되어 있다. RA 에 있어서의 파골 세포의 유도 (분화, 성숙), 활성화, 및 골파괴의 원인으로서 가장 중요하다고 생각되고 있는 사이토카인은 RANKL 과 TNF-α 이다 (Romas E et al., Bone 30, p 340-346, 2002). RANKL 의 디코이 리셉터인 OCIF/OPG 에서는 RANKL 로 유도되는 파골 세포 형성은 억제할 수 있지만, TNF-α 로 유도되는 파골 세포 형성은 억제되지 않는다. 그 한편, 본 발명에 있어서의 항 Siglec-15 항체에 의해, RANKL 로 유도되는 파골 세포 형성과 TNF-α 로 유도되는 파골 세포 형성의 양방이 효과적으로 억제되었다. 따라서, 본 발명의 항 Siglec-15 항체에 의해, RA 등에 있어서의 TNF-α 로 유도되는 골상실과 골파괴가, RANKL 블록커 (OCIF/OPG, 항 RANKL 항체 등) 이상으로 강력하게 억제할 수 있는 것이 기대된다.

항 Siglec-15 항체는, 하나의 예로서는, 골대사 이상의 치료 또는 예방에 대해서는 그 항체 단독으로, 혹은 적어도 하나의 다른 골질환 치료제와 병용하여 투여할 수 있다. 또 하나의 예로서 항 Siglec-15 항체는 치료 상 유효한 양의 항골대사 이상 치료 약제와 병용하여 투여할 수 있다. 항 Siglec-15 항체와 병용하여 투여할 수 있는 다른 치료제로서는, 비스포스포네이트 (예를 들어, alendronate, etidronate, ibandronate, incadronate, pamidronate, risedronate, 또는 zoledronate), 활성형 비타민 D₃, 칼시토닌 및 그 유도체, 에스트라디올 등의 호르몬, SERMs (Selective estrogen receptor modulators), 이프리플라본, 비타민 K₂ (메나테트레논), 칼슘 제제, PTH (parathyroid hormone), 비스테로이드성 항염증제 (예를 들어, celecoxib 또는 rofecoxib), 가용성 TNF 리셉터 (예를 들어, etanercept), 항 TNFα 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편 (예를 들어, infliximab), 항 PTHrP (parathyroid hormone-related protein) 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편, IL-1 리셉터 안타고니스트 (예를 들어 anakinra), 항 IL-6 리셉터 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편 (예를 들어, tocilizumab), 항 RANKL 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편 (예를 들어, denosumab), 및 OCIF (osteoclastogenesis inhibitory factor) 등을 들 수 있지만 이들로 한정되지 않는다. 골대사 이상의 상태나 어느 정도의 치료 및/또는 예방을 목표로 하는지에 따라서, 2, 3 혹은 그 이상의 다른 치료제를 투여할 수도 있고, 그들의 다른 치료제는 동일한 제제 중에 봉입함으로써 동시에 투여할 수 있다. 다른 치료제와 항 Siglec-15 항체는 동일한 제제 중에 봉입함으로써 동시에 투여할 수도 있다. 또, 항 Siglec-15 항체와 다른 치료제를 각각의 제제에 봉입하여 동시에 투여할 수도 있다. 또한, 다른 약제와 항 Siglec-15 항체를 잇따라 따로 따로 투여할 수도 있다. 즉, 다른 치료제를 투여한 후에 항 Siglec-15 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편을 유효 성분으로서 함유하는 치료제를 투여하거나, 혹은 항 Siglec-15 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편을 유효 성분으로서 함유하는 치료제를 투여한 후에 다른 치료제를 투여해도 된다. 유전자 치료에 있어서 투여하는 경우에는, 단백질성의 골질환 치료제의 유전자와 항 Siglec-15 항체의 유전자는 각각의 혹은 동일한 프로모터 영역의 하류에 삽입할 수 있고, 각각의 혹은, 동일한 벡터에 도입할 수 있다.

항 Siglec-15 항체, 혹은 그 프래그먼트에 대해 골질환 치료제를 결합시킴으로써, M. C. Garnet 「Targeted drug conjugates ： principles and progress」, Advanced Drug Delivery Reviews, (2001) 53, 171-216 에 기재된 표적형 약물 복합체를 제조할 수 있다. 이 목적으로는, 항체 분자 외에, 파골 세포의 인식성을 완전 소실하고 있지 않는 한, 어느 항체 프래그먼트도 적용 가능하지만, 예를 들어, Fab, F(ab')2, Fv 등의 프래그먼트를 예로서 들 수 있고, 본 발명에 있어서도 동일하게, 항체 및 그 프래그먼트를 사용할 수 있다. 항 Siglec-15 항체 또는 그 항체의 프래그먼트와 골질환 치료제의 결합 양식은 M. C. Garnet 「Targeted drug conjugates ： principles and progress」, Advanced Drug Delivery Reviews, (2001) 53, 171-216, G. T. Hermanson 「Bioconjugate Techniques」 Academic Press, California (1996), Putnam and J. Kopecek 「Polymer Conjugates with Anticancer Activity」 Advances in Polymer Science (1995) 122, 55-123 등에 기재되는 여러 가지의 형태가 있을 수 있다. 즉, 항 Siglec-15 항체와 골질환 치료제가 화학적으로 직접 혹은 올리고 펩티드 등의 스페이서를 개재하여 결합되는 양식이나, 적당한 약물 담체를 개재하여 결합되는 양식을 들 수 있다. 약물 담체의 예로서는, 리포솜이나 수용성 고분자를 들 수 있다. 이들 약물 담체가 개재되는 양식으로서는, 보다 구체적으로는, 항체와 골질환 치료제가 리포솜에 포함되고, 그 리포솜과 항체가 결합한 양식, 및, 골질환 치료제가 수용성 고분자 (분자량 1000 내지 10 만 정도의 화합물) 에 화학적으로 직접 혹은 올리고 펩티드 등의 스페이서를 개재시켜 결합되고, 그 수용성 고분자에 항체가 결합한 양식을 예로서 들 수 있다. 항체 (또는 그 프래그먼트) 와 골질환 치료제, 리포솜 및 수용성 고분자 등의 약물 담체의 결합은 G. T. Hermanson 「Bioconjugate Techniques」 Academic Press, California (1996), Putnam and J. Kopecek 「Polymer Conjugates with Anticancer Activity」 Advances in Polymer Science (1995) 122, 55-123 에 기재된 방법 등의 당업자 주지의 방법에 의해 실시할 수 있다. 골질환 치료제의 리포솜에의 포함은 D. D. Lasic 「Liposomes ： From Physics to Applications」, Elsevier Science Publishers B. V., Amsterdam (1993) 등에 기재된 방법 등의 당업자 주지의 방법에 의해 실시할 수 있다. 골질환 치료제의 수용성 고분자에의 결합은 D. Putnam and J Kopecek 「Polymer Conjugates with Anticancer Activity」 Advances in Polymer Science (1995) 122, 55-123 에 기재된 방법 등의 당업자 주지의 방법에 의해 실시할 수 있다. 항체 (또는 그 프래그먼트) 와 단백질성의 골질환 치료제 (또는 그 프래그먼트) 의 복합체는, 상기의 방법 외에, 유전자 공학적으로, 당업자 주지의 방법에 의해 제작할 수 있다.

본 발명은 치료 및/또는 예방에 유효한 양의 항 Siglec-15 항체와 약학상 허용되는 희석제, 담체, 가용화제, 유화제, 보존제 및/또는 보조제를 포함하는 의약 조성물도 제공한다.

본 발명은 치료 및/또는 예방에 유효한 양의 항 Siglec-15 항체와 치료 및/또는 예방에 유효한 양의 적어도 하나의 골질환 치료제와 약학상 허용되는 희석제, 담체, 가용화제, 유화제, 보존제 및/또는 보조제를 포함하는 의약 조성물도 제공한다. 골질환 치료제로서는, 비스포스포네이트 (예를 들어, alendronate, etidronate, ibandronate, incadronate, pamidronate, risedronate, 또는 zoledronate), 활성형 비타민 D₃, 칼시토닌 및 그 유도체, 에스트라디올 등의 호르몬, SERMs (selective estrogen receptor modulators), 이프리플라본, 비타민 K₂ (메나테트레논), 칼슘 제제, PTH (parathyroid hormone), 비스테로이드성 항염증제 (예를 들어, celecoxib 또는 rofecoxib), 가용성 TNF 리셉터 (예를 들어, etanercept), 항 TNFα 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편 (예를 들어, infliximab), 항 PTHrP (parathyroid hormone-related protein) 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편, IL-1 리셉터 안타고니스트 (예를 들어 anakinra), 항 IL-6 리셉터 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편 (예를 들어, tocilizumab), 항 RANKL 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편 (예를 들어, denosumab), 및 OCIF (osteoclastogenesis inhibitory factor) 등을 들 수 있지만 이들로 한정되지 않는다.

본 발명의 의약 조성물에 있어서 허용되는 제제에 사용하는 물질로서는 바람직하게는 투여량이나 투여 농도에 있어서, 의약 조성물이 투여되는 자에 대해 비독성인 것이 바람직하다.

본 발명의 의약 조성물은 pH, 침투압, 점도, 투명도, 색, 등장성, 무균성, 안정성, 용해율, 서방율, 흡수율, 침투율을 변경하거나, 유지하거나 하기 위한 제제용의 물질을 포함할 수 있다. 제제용의 물질로서 이하의 것을 들 수 있지만, 이들에 제한되지 않는다 ： 글리신, 알라닌, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신 등의 아미노산류, 항균제, 아스코르브산, 황산나트륨 또는 아황산수소나트륨 등의 항산화제, 인산, 시트르산, 붕산 버퍼, 탄산수소나트륨, 트리스-염산 (Tris-Hcl) 용액 등의 완충제, 만니톨이나 글리신 등의 충전제, 에틸렌디아민 4 아세트산 (EDTA) 등의 킬레이트제, 카페인, 폴리비닐피롤리딘, β-시클로덱스트린이나 하이드록시프로필-β-시클로덱스트린 등의 착화제, 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린 등의 증량제, 단당류, 이당류 등의 다른 탄수화물, 착색제, 향미제, 희석제, 유화제나 폴리비닐피롤리딘 등의 친수 폴리머, 저분자량 폴리펩티드, 염 형성 카운터 이온, 염화벤즈알코늄, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 페네틸알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로렉시딘, 소르브산 또는 과산화수소 등의 방부제, 글리세린, 프로필렌·글리콜 또는 폴리에틸렌글리콜 등의 용매, 만니톨 또는 소르비톨 등의 당 알코올, 현탁제, 소르비탄에스테르, 폴리소르베이트 20 이나 폴리소르베이트 80 등의 폴리소르베이트, 트리톤 (triton), 트로메타민 (tromethamine), 레시틴 또는 콜레스테롤 등의 계면 활성제, 수크로오스나 소르비톨 등의 안정화 증강제, 염화나트륨, 염화칼륨이나 만니톨·소르비톨 등의 탄성 증강제, 수송제, 부형제, 및/또는 약학상의 보조제. 이들 제제용 물질의 첨가량은 항 Siglec-15 항체의 중량에 대해 0.01 ∼ 100 배, 특히 0.1 ∼ 10 배 첨가하는 것이 바람직하다. 제제 중의 바람직한 의약 조성물의 조성은 당업자에 의해, 적용 질환, 적용 투여 경로 등에 따라 적절히 결정할 수 있다.

의약 조성물 중의 부형제나 담체는 액체이거나 고체이어도 된다. 적당한 부형제나 담체는 주사용의 물이나 생리 식염수, 인공 뇌척수액이나 비경구 투여에 통상적으로 사용되고 있는 다른 물질이어도 된다. 중성의 생리 식염수나 혈청 알부민을 포함하는 생리 식염수를 담체에 사용할 수도 있다. 의약 조성물에는 pH 7.0 - 8.5 의 Tris 버퍼, pH 4.0 - 5.5 의 아세트산 버퍼, pH 3.0 - 6.2 의 시트르산 버퍼를 포함할 수 있다. 또, 이들의 버퍼에 소르비톨이나 다른 화합물을 포함할 수도 있다. 본 발명의 의약 조성물에는 항 Siglec-15 항체를 포함하는 의약 조성물 그리고, 항 Siglec-15 항체 및 적어도 하나의 골질환 치료제를 포함하는 의약 조성물을 들 수 있고, 본 발명의 의약 조성물은 선택된 조성과 필요한 순도를 갖는 약제로서, 동결 건조품 혹은 액체로서 준비된다. 항 Siglec-15 항체를 포함하는 의약 조성물 그리고, 항 Siglec-15 항체 및 적어도 하나의 골대사 이상 치료약제를 포함하는 의약 조성물은 수크로오스와 같은 적당한 부형제를 사용한 동결 건조품으로서 성형될 수도 있다.

본 발명의 의약 조성물은 비경구 투여용으로 조제할 수도 있고, 경구에 의한 소화관 흡수용으로 조제할 수도 있다. 제제의 조성 및 농도는 투여 방법에 의해 결정할 수 있고, 본 발명의 의약 조성물에 포함되는, 항 Siglec-15 항체의 Siglec-15 에 대한 친화성, 즉, Siglec-15 에 대한 해리 정수 (Kd 값) 에 대해, 친화성이 높을 (Kd 값이 낮을) 수록, 인간에 대한 투여량을 적게 해도 약효를 발휘할 수 있기 때문에, 이 결과에 기초하여 본 발명의 의약 조성물의 인간에 대한 투여량을 결정할 수도 있다. 투여량은, 인간형 항 Siglec-15 항체를 인간에 대해 투여할 때에는, 약 0.1 ∼ 100 mg/kg 을 1 ∼ 180 일간에 1 회 투여하면 된다.

본 발명의 의약 조성물의 형태로서는, 점적을 포함하는 주사제, 좌제, 경비제, 설하제, 경피 흡수제 등을 들 수 있다.

실시예

이하, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들로 한정되는 것은 아니다. 또한, 하기 실시예에 있어서 유전자 조작에 관한 각 조작은 특별히 명시가 없는 한, 「몰레큘러 클로닝 (Molecular Cloning)」 (Sambrook, J., Fritsch, E. F. 및 Maniatis, T. 저술, Cold Spring Harbor Laboratory Press 에서 1989 년에 발간) 에 기재된 방법에 의해 실시하거나, 또는, 시판되는 시약이나 키트를 사용하는 경우에는 시판품의 지시서에 따라 사용했다.

(실시예 1)

가용형 인간 Siglec-15 단백질 함유 배양액의 조제와 정제

인간 Siglec-15 의 세포외 영역 cDNA 를 PCR 로 증폭하고, pDNOR221 벡터 (인비트로젠사 제조) 에 삽입함으로써 엔트리 클론을 제작했다. 이 엔트리 클론으로부터, 인서트의 C 말측에 V5 에피토프와 6 × His 태그가 부가되도록 설계된 디스토네이션 벡터인 pDONM 에 재조합을 실시함으로써 발현 플라스미드 (가용형 인간 Siglec-15/pDONM) 를 얻었다. 가용형 인간 Siglec-15/pDONM 을 293-F 세포에 트랜스펙션하고, 6 ∼ 12 ％ CO₂ 농도, 37 ℃ 에서 96 시간 (4 일간) 교반 배양했다. 배양액을 회수하고, 원심 분리함으로써 가용형 인간 Siglec-15 단백질 함유 배양 상청을 조제했다. 얻어진 배양 상청을 Ni-Sepharose HP 칼럼 (아마샴 바이오사이언스사 제조) 을 사용하여 조정제하고, 계속해서 Resource Q 칼럼 (아마샴 바이오사이언스사 제조) 을 사용하여 분획했다. SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동 (환원 조건하) 과 은 염색에 의해 가용형 인간 Siglec-15 단백질의 검출과 순도 검정을 실시한 결과, Resource Q 칼럼에 흡착되지 않은 단백질 획분에 분자량 약 35 kDa 의 단백질 (가용형 인간 Siglec-15 단백질) 이 효율적으로 정제 농축된 것이 확인되었다.

(실시예 2)

래트항 인간 Siglec-15 모노클로날 항체 ＃24A3 산생 하이브리도마의 수립 및 정제 항체의 조제

실시예 1 에서 제작한 정제 가용형 인간 Siglec-15 단백질을 래트에게 면역했다. 시험 채혈에 의해 항체가의 상승을 확인한 후 안락사시켜, 비장을 적출했다. 세포 융합은 일반적인 마우스 (래트) 비장 세포와 미엘로마 세포의 융합법에 따라 실시했다. 스크리닝에 의해 항체가가 높은 35 클론을 선발하고, 또한 1 차, 2 차 클로닝 조작을 실시했다. 그 결과, 항체가가 높은 하이브리도마로서 ＃24A3 의 수립에 성공했다. 수립한 하이브리도마를 1×10⁷ 세포/마우스가 되도록 누드 마우스의 복강 내에 이식했다. 이식 후, 복수의 축적이 충분히 보여진 시점에서 복수를 채취하여 IgG 획분을 정제했다. 이상의 조작에 의해, 래트 항인간 Siglec-15 모노클로날 항체 ＃24A3 을 조제했다.

(실시예 3)

래트항 인간 Siglec-15 모노클로날 항체 ＃24A3 의 인간 Siglec-15 단백질에 대한 결합성 평가

3-1) 인간 Siglec-15 V-set 도메인의 발현 정제

인간 Siglec-15 V-set 도메인 (NCBI 의 단백 데이터베이스의 ACCESSION 번호 NP＿998767 의 아미노산 배열의 39 내지 165 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 폴리펩티드) 의 N 말단측에 His 태그, 및, FactorXa 인식 배열을 연결시킨 단백을 코드하는 DNA 를 벡터 pDEST14 (인비트로젠사, 카탈로그 번호 ： 11801-016) 에 삽입했다. 이 플라스미드를 사용하여, 대장균 Rosetta-gamiB (DE3) (노바젠사, 카탈로그 번호 ： 71136-4) 를 형질 전환하고, TB 배지 (인비트로젠사, 카탈로그 번호 ： 22711-022) 에서 배양했다. 배양 후, 초음파 파쇄한 균체를 원심 분리하여, 상청을 HisTrap HP 칼럼 (GE 헬스케어사, 카탈로그 번호 ： 17-5247-01) 으로 정제했다. 그 후, FactorXa (NEW ENGLAND BioLabs 사, 카탈로그 번호 P8010L) 로 His 태그를 절단 후, Mono S5/50 GL 칼럼 (GE 헬스케어사, 카탈로그 번호 ： 17-5168-01), 또한, Superdex 75 10/300 칼럼 (GE 헬스케어사, 카탈로그 번호 ： 17-5174-01) 을 사용하여, 전기 영동으로 분자량 14 kDa 의 단일 밴드가 될 때까지 인간 Siglec-15 V-set 도메인을 정제했다.

3-2) 래트 ＃32A3 과 인간 Siglec-15 V-set 도메인의 해리 정수의 측정

래트 ＃24A3 항체와 인간 Siglec-15 V-set 도메인의 해리 정수 측정은, Biacore T200 (GE 헬스케어 바이오사이언스 (주)) 을 사용하여, 항체를 리간드로서 고정화하고, 항원을 애널라이트로서 측정했다. 또한, 대조가 되는 항체로서 래트 ＃32A1 항체를 사용했다. 래트 ＃32A1 항체는, 국제 공개 제WO09/48072호 팜플렛 및 제WO10/117011호 팜플렛에, 그 조제 방법, 그리고 중사슬 및 경사슬의 배열 정보가 기재되어 있다. 또한, 래트 ＃32A1 항체를 산생하는 하이브리도마 ＃32A1 은 일본 독립 행정법인 산업기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터 (소재지 ： 우편 번호 305-8566 일본 이바라키현 츠쿠바시 히가시 1 쵸메 1 번지 1 중앙 제 6) 에 2008 년 8 월 28 일부로 기탁되어, anti-Siglec-15 Hybridoma ＃32A1 의 명칭으로 수탁 번호 FERM BP-10999 가 부여되어 있다.

＃32A1 또는 ＃24A3 항체는, 아민 커플링법으로 센서 칩 CM5 (GE 헬스케어 바이오사이언스 (주)) 에 고정화한 항마우스 IgG 항체 (GE 헬스케어 바이오사이언스 (주)) 를 개재하여, 약 50 RU 를 결합시켰다. 런닝 버퍼로서 HBS-EP＋ (10 mM HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.05 ％ Surfactant P20) 를 사용했다. 항체를 결합한 칩 위에, 항원의 희석 계열 용액 (0.003 - 2 nM) 을 유속 90 ㎕/분으로 233 초간 첨가하고, 계속해서 3600 초간의 해리상을 모니터했다. 재생 용액으로서 3M MgCl2 를 유속 10 ㎕/분으로 30 초간 첨가했다. 데이터의 해석에는, 분석 소프트웨어 (Biacore T200 Evaluation Software, version1.0) 의 1 ： 1 결합 모델을 사용하여, 결합 속도 정수 kon, 해리 속도 정수 koff 및 해리 정수 (KD ； KD = koff/kon) 를 산출했다. 그 결과, KD 값은 ＃32A1 이 1.5 E - 10［M］, ＃24A3 이 7.0 E - 11［M］이며, ＃24A3 은 ＃32A1 보다 약 2 배 강한 친화성을 가지고 있었다.

(실시예 4)

래트 항인간 Siglec-15 모노클로날 항체 ＃24A3 의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 증폭과 염기 배열의 해석

4-1) ＃24A3 의 중사슬과 경사슬의 N 말단 아미노산 배열의 동정

＃24A3 의 중사슬과 경사슬의 N 말단 아미노산 배열을 동정하기 위해서, 실시예 2 에서 조제한 ＃24A3 을 SDS-PAGE 로 분리했다. 분리 후의 겔로부터 Sequi-Blot PVDF 막 (BIO-RAD 사) 에 겔 중의 단백질을 전사하고, 세정 버퍼 (25 mM NaCl, 10 mM 붕산나트륨 버퍼 pH 8.0) 로 세정한 후, 염색액 (50 ％ 메탄올, 20 ％ 아세트산, 0.05 ％ 쿠마시 브릴리언트 블루) 에 5 분간 담가 염색하고 나서, 90 ％ 메탄올로 탈색했다. PVDF 막 상에서 가시화된 중사슬 (이동도가 작은 쪽의 밴드) 및 경사슬 (이동도가 큰 쪽의 밴드) 에 상당하는 밴드 부분을 잘라냈다. 중사슬에 상당하는 밴드에 대해서는, 소량의 0.5 ％ 폴리비닐피롤리돈/100 mM 아세트산 용액 중에서, 37 ℃ 에서 30 분간 보온한 후, 물로 잘 세정하고, 다음으로, Pfu 피로글루탐산아미노펩티다아제킷트 (다카라 바이오 주식회사) 를 사용하여 수식 N 말단 잔기를 제거하고, 물로 세정한 후 바람에 건조시켰다. Procise cLC 프로테인 시퀸서 Model 492cLC (Applied Bio systems) 를 사용하여, 자동 에드만법 (Edman et al. (1967) Eur. J. Biochem. 1, 80 참조) 에 의해 각각의 N 말단 아미노산 배열의 동정을 시도했다. 그 결과, ＃24A3 의 중사슬에 상당하는 밴드의 N 말단의 아미노산 배열은 VQLQQSGAELTKP 이며, 경사슬에 상당하는 밴드의 N 말단 아미노산 배열은 DIVMTQSPTSMSIS 였다.

4-2) ＃24A3 산생 하이브리도마로부터의 mRNA 의 조제

＃24A3 의 가변 영역을 포함하는 cDNA 를 증폭하기 위해, ＃24A3 산생 하이브리도마로부터 mRNA Isolation kit (Roche applied science 사) 를 사용하여 mRNA 를 조제했다.

4-3) cDNA (5'-RACE-Ready cDNA) 의 합성

cDNA (5'-RACE-Ready cDNA) 의 합성은 상기 4-2) 에서 조제한 mRNA 의 100 ng 를 사용하여, SMARTer RACE cDNA Amplification Kit (Clontech 사) 를 사용하여 실시했다.

4-4) 5'-RACE PCR 에 의한 ＃24A3 의 중사슬 가변 영역을 포함하는 cDNA 의 증폭과 배열의 결정

＃24A3 의 중사슬 유전자의 가변 영역의 cDNA 를 PCR 로 증폭하기 위한 프라이머로서 UPM (Universal Primer A Mix ： SMARTer RACE cDNA Amplification Kit 에 부속), 및

5'-CTCCAGAGTTCCAGGTCACGGTGACTGGC-3'(RG2AR3) 의 배열을 갖는 올리고 뉴클레오티드를 사용했다. UPM 은 SMARTer RACE cDNA Amplification Kit (Clontech 사) 에 부속인 것을 사용하고, RG2AR3 은 데이터베이스의 래트 중사슬 (IgG2a) 의 정상 영역의 배열로부터 설계했다.

이 프라이머의 조합과, 상기 4-3) 에서 합성한 cDNA(5'-RACE-Ready cDNA) 를 주형으로 한 5'-RACE PCR 에 의해 ＃24A3 의 중사슬의 가변 영역을 포함하는 cDNA 를 증폭했다. PCR 은, Polymerase 로서 KOD-plus- (TOYOBO 사) 를 사용하여, SMARTer RACE cDNA Amplification Kit (Clontech 사) 의 매뉴얼에 따라, 터치다운 PCR 프로그램으로 실시했다.

5'-RACE PCR 로 증폭한 중사슬의 가변 영역을 포함하는 cDNA 를 Min Elute PCR Purification Kit (QIAGEN 사) 를 사용하여 정제 후, Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit (Invitrogen 사) 를 사용하여 클로닝하고, 클로닝한 중사슬의 가변 영역을 포함하는 cDNA 의 뉴클레오티드 배열의 시퀀스 해석을 실시했다.

시퀀스 프라이머로서, 데이터베이스의 래트 중사슬의 정상 영역의 배열로부터 설계한

5'-CTCCAGAGTTCCAGGTCACGGTGACTGGC-3'(RG2AR3) 의 배열을 갖는 올리고 뉴클레오티드, 및 NUP (Nested Universal Primer A ： SMARTer RACE cDNA Amplification Kit 에 부속) 를 사용했다.

시퀀스 해석은 유전자 배열 해석 장치 (「ABI PRISM 3700 DNA Analyzer ； Applied Biosystems」 혹은 「Applied Biosystems 3730xl Analyzer ； Applied Biosystems」) 를 사용하여 실시하고, 시퀀스 반응은 GeneAmp 9700 (Applied Biosystems 사) 을 사용했다.

결정된 ＃24A3 의 중사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 배열을 배열표의 배열 번호 1 에 나타내고, 아미노산 배열을 배열 번호 2 에 나타냈다. 배열 번호 1 의 뉴클레오티드 배열 및 배열 번호 2 의 아미노산 배열은 도 1 에도 기재되어 있다.

뉴클레오티드 배열로부터 결정된 ＃24A3 의 중사슬의 가변 영역의 아미노산 배열은 상기 4-1) 에서 결정한 N 말단 아미노산 배열과 일치했다.

4-5) 5'-RACE PCR 에 의한 ＃24A3 의 경사슬 가변 영역을 포함하는 cDNA 의 증폭과 배열의 결정

＃24A3 의 경사슬 유전자의 가변 영역의 cDNA 를 PCR 로 증폭하기 위한 프라이머로서, UPM (Universal Primer A Mix ： SMARTer RACE cDNA Amplification Kit 에 부속)

및

5'-TCAGTAACACTGTCCAGGACACCATCTC-3'(RKR5) 의 배열을 갖는 올리고 뉴클레오티드를 사용했다. UPM 은 SMARTer RACE cDNA Amplification Kit (Clontech 사) 에 부속인 것을 사용하고, RKR3 은 데이터베이스의 래트 경사슬의 정상 영역의 배열로부터 설계했다.

이 프라이머의 조합과, 상기 4-3) 에서 합성한 cDNA (5'-RACE-Ready cDNA) 를 주형으로 한 5'-RACE PCR 에 의해 ＃24A3 의 경사슬의 가변 영역을 포함하는 cDNA 를 증폭했다. PCR 은, Polymerase 로서 KOD-plus- (TOYOBO 사) 를 사용하여, SMARTer RACE cDNA Amplification Kit (ClontechH 사) 의 매뉴얼에 따라, 터치다운 PCR 프로그램으로 실시했다.

5'-RACE PCR 로 증폭한 경사슬의 가변 영역을 포함하는 cDNA 를 Min Elute PCR Purification Kit (QIAGEN 사) 를 사용하여 정제 후, Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit (Invitrogen 사) 를 사용하여 클로닝하고, 클로닝한 경사슬의 가변 영역을 포함하는 cDNA 의 뉴클레오티드 배열의 시퀀스 해석을 실시했다.

시퀀스 프라이머로서, 데이터베이스의 래트 경사슬의 정상 영역의 배열로부터 설계한

5'-TCAGTAACACTGTCCAGGACACCATCTC-3'(RKR5) 의 배열을 갖는 올리고 뉴클레오티드, 및 NUP (Nested Universal Primer A ： SMARTer RACE cDNA Amplification Kit 에 부속) 를 사용했다.

결정된 ＃24A3 의 경사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 배열을 배열표의 배열 번호 3 에 나타내고, 아미노산 배열을 배열 번호 4 에 나타냈다. 배열 번호 3 의 뉴클레오티드 배열 및 배열 번호 4 의 아미노산 배열은 도 2 에도 기재되어 있다. 뉴클레오티드 배열로부터 결정된 ＃24A3 의 경사슬의 가변 영역의 아미노산 배열은 상기 4-1) 에서 결정한 N 말단 아미노산 배열과 일치했다.

(실시예 5)

래트 항인간 Siglec-15 모노클로날 항체 ＃24A3 의 인간 키메라 항체 유전자 발현 콘스트럭트의 제작

5-1) 키메라 및 인간화 경사슬 발현 벡터 pCMA-LK 의 구축

플라스미드 pcDNA3.3-TOPO/LacZ (Invitrogen 사) 를 제한 효소 XbaI 및 PmeI 로 소화하여 얻어지는 약 5.4 kb 의 프래그먼트와, 배열 번호 5 에 나타내는 인간 κ 사슬 분비 시그널 및 인간 κ 사슬 정상 영역을 코드하는 뉴클레오티드 배열을 포함하는 DNA 단편을 In-Fusion Advantage PCR 클로닝 키트 (Clontech 사) 를 사용하여 결합하고, pcDNA3.3/LK 를 제작했다.

pcDNA3.3/LK 를 주형으로 하여, 하기 프라이머 세트로 PCR 을 실시하고, 얻어진 약 3.8 kb 의 프래그먼트를 인산화 후 셀프라이게이션함으로써 CMV 프로모터의 하류에 시그널 배열, 클로닝 사이트, 및 인간 κ 사슬 정상 영역을 가지는, 키메라 및 인간화 경사슬 발현 벡터 pCMA-LK 를 구축했다.

프라이머 세트

5-2) 키메라 및 인간화 IgG2 타입 중사슬 발현 벡터 pCMA-G2 의 구축

pCMA-LK 를 XbaI 및 PmeI 로 소화하여 κ 사슬 분비 시그널 및 인간 κ 사슬 정상 영역을 제거한 DNA 단편과, 인간 중사슬 분비 시그널 및 인간 IgG2 정상 영역을 코드하는 뉴클레오티드 배열을 포함하는 DNA 단편 (배열 번호 6) 을 In-Fusion Advantage PCR 클로닝 키트 (Clontech 사) 를 사용하여 결합하고, CMV 프로모터의 하류에 시그널 배열, 클로닝 사이트, 인간 IgG2 중사슬 정상 영역을 가지는 키메라 및 인간화 IgG2 타입 중사슬 발현 벡터 pCMA-G2 를 구축했다.

5-3) 인간 키메라 ＃24A3 경사슬 발현 벡터의 구축

실시예 4) 에서 얻어진 ＃24A3 경사슬의 가변 영역을 포함하는 cDNA 를 템플릿으로 하여, KOD-Plus- (TOYOBO 사) 와 하기의 프라이머 세트로 경사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 를 포함하는 DNA 단편을 증폭하고, 키메라 및 인간화 항체 경사슬 발현 범용 벡터 pCMA-LK 를 제한 효소 BsiWI 로 절단한 지점에 In-Fusion Advantage PCR 클로닝 키트 (Clontech 사) 를 사용하여 삽입함으로써, 인간 키메라 ＃24A3 경사슬 발현 벡터를 구축했다. 얻어진 발현 벡터를 「pCMA-LK/24A3」 이라고 명명했다. 제작된 인간 키메라 ＃24A3 경사슬 유전자는 배열표의 배열 번호 9 에 기재된 뉴클레오티드 배열을 가지고 있고, 배열표의 배열 번호 10 에 기재된 아미노산 배열을 코드하고 있다. 배열 번호 9 의 뉴클레오티드 배열의 1 내지 60 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 61 내지 387 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 388 내지 702 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 경사슬 가변 영역 배열, 경사슬 정상 영역 배열을 코드하고 있다. 배열 번호 10 의 아미노산 번호 1 내지 20 에 나타나는 아미노산 배열이 분비 시그널, 배열 번호 21 내지 129 에 나타나는 아미노산 배열이 경사슬 가변 영역, 그리고 아미노산 번호 130 내지 234 로 나타나는 아미노산 배열이 경사슬 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 9 의 뉴클레오티드 배열 및 배열 번호 10 의 아미노산 배열은 도 4 에도 기재되어 있다.

인간 키메라 ＃24A3 경사슬용 프라이머 세트

5-4) 인간 키메라 ＃24A3 중사슬 발현 벡터의 구축

실시예 4) 에서 얻어진 ＃24A3 중사슬의 가변 영역을 포함하는 cDNA 를 템플릿으로 하여, KOD-Plus- (TOYOBO 사) 와 하기의 프라이머 세트로 중사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 를 포함하는 DNA 단편을 증폭하고, 키메라 및 인간화 IgG2 타입 중사슬 발현 벡터 pCMA-G2 를 제한 효소 BlpI 로 절단한 지점에 In-Fusion Advantage PCR 클로닝 키트 (Clontech 사) 를 사용하여 삽입함으로써, 인간 키메라 ＃24A3 중사슬 발현 벡터를 구축했다. 얻어진 발현 벡터를 「pCMA-G2/24A3」 이라고 명명했다. 제작된 인간 키메라 ＃24A3 중사슬 유전자는 배열표의 배열 번호 7 에 기재된 뉴클레오티드 배열을 가지고 있고, 배열표의 배열 번호 8 에 기재된 아미노산 배열을 코드하고 있다. 배열 번호 7 의 뉴클레오티드 배열의 1 내지 57 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 58 내지 420 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 421 내지 1398 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 중사슬 가변 영역 배열, 중사슬 정상 영역 배열을 코드하고 있다. 배열 번호 8 의 아미노산 번호 1 내지 19 에 나타나는 아미노산 배열이 분비 시그널, 20 내지 140 번째에 나타나는 아미노산 배열이 중사슬 가변 영역, 그리고 아미노산 번호 141 내지 466 으로 나타나는 아미노산 배열이 중사슬 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 7 의 뉴클레오티드 배열 및 배열 번호 8 의 아미노산 배열은 도 3 에도 기재되어 있다.

인간 키메라 ＃24A3 중사슬용 프라이머 세트

(실시예 6)

래트 항인간 Siglec-15 모노클로날 항체 ＃24A3 의 인간 키메라 항체의 조제

6-1) 래트 항인간 Siglec-15 모노클로날 항체 ＃24A3 의 인간 키메라 항체의 생산

FreeStyle 293F 세포 (Invitrogen 사) 는 매뉴얼에 따라, 계대, 배양을 실시했다. 대수 증식기의 1.2 × 10⁹개의 FreeStyle 293F 세포 (Invitrogen 사) 를 3L Fernbach Erlenmeyer Flask (CORNING 사) 에 파종하고, FreeStyle293 expression medium (Invitrogen 사) 으로 희석하여 1.0 × 10⁶ 세포/㎖ 로 조제한 후에, 37 ℃, 8 ％ CO₂ 인큐베이터 내에서 90 rpm 으로 1 시간 진탕 배양했다. Polyethyleneimine (Polyscience ＃24765) 3.6 mg 을 Opti-Pro SFM 배지 (Invitrogen 사) 20 ㎖ 에 용해하고, 다음으로 NucleoBond Xtra (TaKaRa 사) 를 사용하여 조제한 H 사슬 발현 벡터 (0.4 mg) 및 L 사슬 발현 벡터 (0.8 mg) 를 20 ㎖ 의 Opti-Pro SFM 배지 (Invitrogen 사) 에 현탁했다. Polyethyleneimine/Opti-Pro SFM 혼합액 20 ㎖ 에, 발현 벡터/Opti-Pro SFM 혼합액 20 ㎖ 를 첨가하여 온화하게 교반하고, 게다가 5 분간 방치한 후에 FreeStyle 293F 세포에 첨가했다. 37 ℃, 8 ％ CO₂ 인큐베이터에서 7 일간, 90 rpm 으로 진탕 배양하여 얻어진 배양 상청을 Disposable Capsule Filter (Advantec ＃CCS-045-E1H) 로 여과했다.

pCMA-G2/24A3 과 pCMA-LK/24A3 의 조합에 의해 취득된 래트 항인간 Siglec-15 모노클로날 항체 ＃24A3 의 인간 키메라 항체를 c＃24A3 이라고 명명했다.

6-2) 래트 항인간 Siglec-15 모노클로날 항체 ＃24A3 의 인간 키메라 항체의 정제

상기 6-1) 에서 얻어진 배양 상청으로부터 항체를, rProteinA 어피니티 크로마토그래피 (4 - 6 ℃ 하) 와 세라믹 하이드록시 어퍼타이트 (실온하) 의 2 단계 공정으로 정제했다. rProteinA 어피니티 크로마토그래피 정제 후와 세라믹 하이드록실 어퍼타이트 정제 후의 버퍼 치환 공정은 4 - 6 ℃ 하에서 실시했다. 최초로, 배양 상청을, PBS 로 평형화한 MabSelectSuRe (GE Healthcare Bioscience 사 제조, HiTrap 칼럼) 에 어플라이했다. 배양액이 칼럼에 모두 들어간 후, 칼럼 용량 2 배 이상의 PBS 로 칼럼을 세정했다. 다음으로 2 M 아르기닌 염산염 용액 (pH 4.0) 으로 용출하고, 항체가 포함되는 획분을 모았다. 그 획분을 투석 (Thermo Scientific 사, Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette) 에 의해 PBS 로 치환한 후, 5 mM 인산나트륨/50 mM MES/pH 7.0 의 버퍼로 5 배 희석한 항체 용액을, 5 mM NaPi/50 mM MES/30 mM NaCl/pH 7.0 의 버퍼로 평형화된 세라믹 하이드록시 어퍼타이트 칼럼 (닛폰 바이오래드, Bio-Scale CHT TypeI Hydroxyapatite Column) 에 어플라이했다. 염화나트륨에 의한 직선적 농도 구배 용출을 실시하여, 항체가 포함되는 획분을 모았다. 그 획분을 투석 (Thermo Scientific 사, Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette) 에 의해 HBSor (25 mM 히스티딘/5 ％ 소르비톨, pH 6.0) 로의 버퍼 치환을 실시했다. 마지막으로 Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20 (분획 분자량 UF10K, Sartorius 사, 4 ℃ 하) 으로 농축하고, IgG 농도를 10 mg/㎖ 로 조제하여 정제 샘플로 했다.

(실시예 7)

래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 ＃24A3 의 인간화 항체의 설계

a) ＃24A3 의 인간화 버젼의 설계

a)-i) ＃24A3 의 가변 영역의 분자 모델링

＃24A3 의 가변 영역의 분자 모델링은 상동성 모델링으로서 일반적으로 공지된 방법 (Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991)) 에 의해 실행되었다. Protein Data Bank (Nuc. Acid Res. 35, D301-D303 (2007)) 에 등록되는 인간 면역 글로불린의 가변 영역의 1 차 배열 (X 선 결정 구조로부터 유도되는 삼차원 구조가 입수 가능하다) 을, 위에서 결정된 ＃24A3 의 가변 영역과 비교했다. 결과적으로, 12E8 이, ＃24A3 의 경사슬의 가변 영역에 대해 동일하게 프레임 워크 중에 결손이 있는 항체 중에서, 가장 높은 배열 상동성을 갖는다고 하여 선택되었다. 또, 2OSL 이 ＃24A3 의 중사슬의 가변 영역에 대해 가장 높은 배열 상동성을 갖는다고 하여 선택되었다. 프레임 워크 영역의 삼차원 구조는, ＃24A3 의 경사슬 및 중사슬에 대응하는 12E8 및 2OSL 의 좌표를 조합하여, 「프레임 워크 모델」 을 얻는 것에 의해 제작되었다. 이어서, 각각의 CDR 에 대한 대표적인 컴포메이션이 프레임 워크 모델에 삽입되었다.

마지막으로, 에너지의 점에서 ＃24A3 의 가변 영역의 가능성이 있는 분자 모델을 얻기 위해서, 불리한 원자간 접촉을 제거하기 위한 에너지 계산을 실시했다. 상기 순서를, 시판되는 단백질 입체 구조 해석 프로그램 DiscoveryStudio (Accelrys, Inc.) 를 사용하여 실시했다.

a)-ii) 인간화 ＃24A3 에 대한 아미노산 배열의 설계

인간화 ＃24A3 항체의 구축을, CDR 그라프팅 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)) 으로서 일반적으로 공지된 방법에 의해 실시했다. 억셉터 항체는 프레임 워크 영역 내의 아미노산 상동성에 기초하여 2 종류 선택되었다. ＃24A3 의 프레임 워크 영역의 배열을, 항체의 아미노산 배열의 Kabat 데이터베이스 (Nuc. Acid Res. 29, 205-206 (2001)) 의 모든 인간 프레임 워크와 비교해서, 결과적으로, HuMc3 항체가 프레임 워크 영역에 대한 74 ％ 의 배열 상동성에서 기인하여, 억셉터로서 선택되었다. HuMc3 에 대한 프레임 워크 영역의 아미노산 잔기를, ＃24A3 에 대한 아미노산 잔기와 정렬시켜, 상이한 아미노산이 사용되는 위치를 동정했다. 이들 잔기의 위치는 위에서 구축된 ＃24A3 의 삼차원 모델을 사용하여 분석되고, 그리고 억셉터 상에 그라프팅될 도너 잔기가 Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)) 에 의해 부여되는 기준에 의해 선택되었다. 선택된 몇 개의 도너 잔기를 억셉터 항체에 이입함으로써, 인간화 ＃32A1 배열을 이하의 실시예에 기재되는 바와 같이 구축했다. 또, ＃24A3 의 각 CDR 중의 1 내지 3 개의 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환한 CDR 개변 인간화 ＃24A3 배열에 대해서도 이하의 실시예에 기재되는 바와 같이 구축했다.

b) ＃24A3 중사슬의 인간화

b)-i) h＃24A3-H1 타입 중사슬 ：

배열표의 배열 번호 8 에 나타나는 인간 키메라 ＃24A3 중사슬의 아미노산 번호 24 (글루타민) 를 발린으로, 아미노산 번호 30 (류신) 을 발린으로, 아미노산 번호 31 (트레오닌) 을 리신으로, 아미노산 번호 35 (세린) 를 알라닌으로, 아미노산 번호 39 (이소류신) 를 발린으로, 아미노산 번호 43 (트레오닌) 을 알라닌으로, 아미노산 번호 49 (프롤린) 를 트레오닌으로, 아미노산 번호 56 (이소류신) 을 발린으로, 아미노산 번호 57 (리신) 을 아르기닌으로, 아미노산 번호 59 (아르기닌) 를 알라닌으로, 아미노산 번호 63 (알라닌) 을 글리신으로, 아미노산 번호 67 (이소류신) 을 메티오닌으로, 아미노산 번호 86 (리신) 을 아르기닌으로, 아미노산 번호 87 (알라닌) 을 발린으로, 아미노산 번호 89 (류신) 를 이소류신으로, 아미노산 번호 90 (알라닌) 을 트레오닌으로, 아미노산 번호 91 (발린) 을 알라닌으로, 아미노산 번호 95 (세린) 를 트레오닌으로, 아미노산 번호 99 (페닐알라닌) 를 티로신으로, 아미노산 번호 101 (글루타민) 을 글루탐산으로, 아미노산 번호 106 (트레오닌) 을 아르기닌으로, 아미노산 번호 107 (프롤린) 을 세린으로, 아미노산 번호 132 (프롤린) 를 글루타민으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 ＃24A3 중사슬을 「h＃24A3-H1 타입 중사슬」 이라고 명명했다.

h＃24A3-H1 타입 중사슬의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 12 에 기재되어 있다. 배열 번호 12 의 아미노산 배열의 1 내지 19 번째의 아미노 잔기로 이루어지는 배열, 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 141 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 중사슬 가변 영역, 중사슬 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 12 의 아미노산 배열을 코드하는 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 11 에 기재되어 있다. 배열 번호 11 의 뉴클레오티드 배열의 1 내지 57 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 58 내지 420 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 421 내지 1398 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 중사슬 가변 영역 배열, 중사슬 정상 영역 배열을 코드하고 있다. 배열 번호 11 의 뉴클레오티드 배열 및 배열 번호 12 의 아미노산 배열은 도 5 에도 기재되어 있다.

b)-ii) h＃24A3-H2 타입 중사슬 ：

배열표의 배열 번호 8 에 나타나는 인간 키메라 ＃24A3 중사슬의 아미노산 번호 24 (글루타민) 를 발린으로, 아미노산 번호 30 (류신) 을 발린으로, 아미노산 번호 31 (트레오닌) 을 리신으로, 아미노산 번호 35 (세린) 를 알라닌으로, 아미노산 번호 39 (이소류신) 를 발린으로, 아미노산 번호 43 (트레오닌) 을 알라닌으로, 아미노산 번호 56 (이소류신) 을 발린으로, 아미노산 번호 57 (리신) 을 아르기닌으로, 아미노산 번호 59 (아르기닌) 를 알라닌으로, 아미노산 번호 63 (알라닌) 을 글리신으로, 아미노산 번호 67 (이소류신) 을 메티오닌으로, 아미노산 번호 86 (리신) 을 아르기닌으로, 아미노산 번호 87 (알라닌) 을 발린으로, 아미노산 번호 89 (류신) 를 이소류신으로, 아미노산 번호 90 (알라닌) 을 트레오닌으로, 아미노산 번호 91 (발린) 을 알라닌으로, 아미노산 번호 95 (세린) 를 트레오닌으로, 아미노산 번호 99 (페닐알라닌) 를 티로신으로, 아미노산 번호 101 (글루타민) 을 글루탐산으로, 아미노산 번호 106 (트레오닌) 을 아르기닌으로, 아미노산 번호 107 (프롤린) 을 세린으로, 아미노산 번호 132 (프롤린) 를 글루타민으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 ＃24A3 중사슬을 「h＃24A3-H2 타입 중사슬」 이라고 명명했다.

h＃24A3-H2 타입 중사슬의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 14 에 기재되어 있다. 배열 번호 14 의 아미노산 배열의 1 내지 19 번째의 아미노잔기로 이루어지는 배열, 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 141 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 중사슬 가변 영역, 중사슬 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 14 의 아미노산 배열을 코드하는 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 13 에 기재되어 있다. 배열 번호 13 의 뉴클레오티드 배열의 1 내지 57 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 58 내지 420 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 421 내지 1398 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 중사슬 가변 영역 배열, 중사슬 정상 영역 배열을 코드하고 있다. 배열 번호 13 의 뉴클레오티드 배열 및 배열 번호 14 의 아미노산 배열은 도 6 에도 기재되어 있다.

b)-iii) h＃24A3-H3 타입 중사슬 ：

배열표의 배열 번호 8 에 나타나는 인간 키메라 ＃24A3 중사슬의 아미노산 번호 24 (글루타민) 를 발린으로, 아미노산 번호 30 (류신) 을 발린으로, 아미노산 번호 31 (트레오닌) 을 리신으로, 아미노산 번호 35 (세린) 를 알라닌으로, 아미노산 번호 39 (이소류신) 를 발린으로, 아미노산 번호 43 (트레오닌) 을 알라닌으로, 아미노산 번호 57 (리신) 을 아르기닌으로, 아미노산 번호 59 (아르기닌) 를 알라닌으로, 아미노산 번호 63 (알라닌) 을 글리신으로, 아미노산 번호 86 (리신) 을 아르기닌으로, 아미노산 번호 89 (류신) 를 이소류신으로, 아미노산 번호 90 (알라닌) 을 트레오닌으로, 아미노산 번호 95 (세린) 를 트레오닌으로, 아미노산 번호 99 (페닐알라닌) 를 티로신으로, 아미노산 번호 101 (글루타민) 을 글루탐산으로, 아미노산 번호 106 (트레오닌) 을 아르기닌으로, 아미노산 번호 107 (프롤린) 을 세린으로, 아미노산 번호 132 (프롤린) 를 글루타민으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 ＃24A3 중사슬을 「h＃24A3-H3 타입 중사슬」 이라고 명명했다.

h＃24A3-H3 타입 중사슬의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 16 에 기재되어 있다. 배열 번호 16 의 아미노산 배열의 1 내지 19 번째의 아미노 잔기로 이루어지는 배열, 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 141 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 중사슬 가변 영역, 중사슬 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 16 의 아미노산 배열을 코드하는 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 15 에 기재되어 있다. 배열 번호 15 의 뉴클레오티드 배열의 1 내지 57 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 58 내지 420 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 421 내지 1398 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 중사슬 가변 영역 배열, 중사슬 정상 영역 배열을 코드하고 있다. 배열 번호 15 의 뉴클레오티드 배열 및 배열 번호 16 의 아미노산 배열은 도 7 에도 기재되어 있다.

b)-iv) h＃24A3-H4 타입 중사슬 ：

배열표의 배열 번호 8 로 나타나는 인간 키메라 ＃24A3 중사슬의 아미노산 번호 24 (글루타민) 를 발린으로, 아미노산 번호 30 (류신) 을 발린으로, 아미노산 번호 31 (트레오닌) 을 리신으로, 아미노산 번호 35 (세린) 를 알라닌으로, 아미노산 번호 39 (이소류신) 를 발린으로, 아미노산 번호 59 (아르기닌) 를 알라닌으로, 아미노산 번호 63 (알라닌) 을 글리신으로, 아미노산 번호 86 (리신) 을 아르기닌으로, 아미노산 번호 90 (알라닌) 을 트레오닌으로, 아미노산 번호 95 (세린) 를 트레오닌으로, 아미노산 번호 99 (페닐알라닌) 를 티로신으로, 아미노산 번호 101 (글루타민) 을 글루탐산으로, 아미노산 번호 106 (트레오닌) 을 아르기닌으로, 아미노산 번호 107 (프롤린) 을 세린으로, 아미노산 번호 132 (프롤린) 를 글루타민으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 ＃24A3 중사슬을 「h＃24A3-H4 타입 중사슬」 이라고 명명했다.

h＃24A3-H4 타입 중사슬의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 18 에 기재되어 있다. 배열 번호 18 의 아미노산 배열의 1 내지 19 번째의 아미노 잔기로 이루어지는 배열, 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 141 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 중사슬 가변 영역, 중사슬 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 18 의 아미노산 배열을 코드하는 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 17 에 기재되어 있다. 배열 번호 17 의 뉴클레오티드 배열의 1 내지 57 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 58 내지 420 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 421 내지 1398 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 중사슬 가변 영역 배열, 중사슬 정상 영역 배열을 코드하고 있다. 배열 번호 17 의 뉴클레오티드 배열 및 배열 번호 18 의 아미노산 배열은 도 8 에도 기재되어 있다.

b)-v) h＃24A3-H5 타입 중사슬 ：

배열표의 배열 번호 8 에 나타나는 인간 키메라 ＃24A3 중사슬의 아미노산 번호 24 (글루타민) 를 발린으로, 아미노산 번호 30 (류신) 을 발린으로, 아미노산 번호 31 (트레오닌) 을 리신으로, 아미노산 번호 35 (세린) 를 알라닌으로, 아미노산 번호 39 (이소류신) 를 발린으로, 아미노산 번호 95 (세린) 를 트레오닌으로, 아미노산 번호 99 (페닐알라닌) 를 티로신으로, 아미노산 번호 101 (글루타민) 을 글루탐산으로, 아미노산 번호 106 (트레오닌) 을 아르기닌으로, 아미노산 번호 107 (프롤린) 을 세린으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 ＃24A3 중사슬을 「h＃24A3-H5 타입 중사슬」 이라고 명명했다.

h＃24A3-H5 타입 중사슬의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 20 에 기재되어 있다. 배열 번호 20 의 아미노산 배열의 1 내지 19 번째의 아미노 잔기로 이루어지는 배열, 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 141 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 중사슬 가변 영역, 중사슬 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 20 의 아미노산 배열을 코드하는 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 19 에 기재되어 있다. 배열 번호 19 의 뉴클레오티드 배열의 1 내지 57 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 58 내지 420 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 421 내지 1398 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 중사슬 가변 영역 배열, 중사슬 정상 영역 배열을 코드하고 있다. 배열 번호 19 의 뉴클레오티드 배열 및 배열 번호 20 의 아미노산 배열은 도 9 에도 기재되어 있다.

b)-vi) h＃24A3-H6 타입 중사슬 ：

배열표의 배열 번호 8 에 나타나는 인간 키메라 ＃24A3 중사슬의 아미노산 번호 24 (글루타민) 를 발린으로, 아미노산 번호 30 (류신) 을 발린으로, 아미노산 번호 31 (트레오닌) 을 리신으로, 아미노산 번호 35 (세린) 를 알라닌으로, 아미노산 번호 39 (이소류신) 를 발린으로, 아미노산 번호 95 (세린) 를 트레오닌으로, 아미노산 번호 101 (글루타민) 을 글루탐산으로, 아미노산 번호 106 (트레오닌) 을 아르기닌으로, 아미노산 번호 107 (프롤린) 을 세린으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 ＃24A3 중사슬을 「h＃24A3-H6 타입 중사슬」 이라고 명명했다.

h＃24A3-H6 타입 중사슬의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 22 에 기재되어 있다. 배열 번호 22 의 아미노산 배열의 1 내지 19 번째의 아미노 잔기로 이루어지는 배열, 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 141 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 중사슬 가변 영역, 중사슬 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 22 의 아미노산 배열을 코드하는 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 21 에 기재되어 있다. 배열 번호 21 의 뉴클레오티드 배열의 1 내지 57 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 58 내지 420 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 421 내지 1398 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 중사슬 가변 영역 배열, 중사슬 정상 영역 배열을 코드하고 있다. 배열 번호 21 의 뉴클레오티드 배열 및 배열 번호 22 의 아미노산 배열은 도 10 에도 기재되어 있다.

c) ＃24A3 경사슬의 인간화

c)-i) h＃24A3-L1 타입 경사슬 ：

배열표의 배열 번호 10 에 나타나는 인간 키메라 ＃24A3 경사슬의 아미노산 번호 29 (트레오닌) 를 아스파르트산으로, 아미노산 번호 31 (메티오닌) 을 류신으로, 아미노산 번호 32 (세린) 를 알라닌으로, 아미노산 번호 33 (이소류신) 을 발린으로, 아미노산 번호 35 (발린) 를 류신으로, 아미노산 번호 37 (아스파르트산) 을 글루탐산으로, 아미노산 번호 39 (발린) 를 알라닌으로, 아미노산 번호 41 (메티오닌) 을 이소류신으로, 아미노산 번호 60 (트레오닌) 을 프롤린으로, 아미노산 번호 63 (세린) 을 프롤린으로, 아미노산 번호 83 (트레오닌) 을 세린으로, 아미노산 번호 93 (페닐알라닌) 을 류신으로, 아미노산 번호 97 (아스파라긴) 을 세린으로, 아미노산 번호 98 (발린) 을 류신으로, 아미노산 번호 103 (류신) 을 발린으로, 아미노산 번호 120 (세린) 을 글루타민으로, 아미노산 번호 122 (이소류신) 를 트레오닌으로, 아미노산 번호 124 (류신) 를 발린으로, 아미노산 번호 129 (알라닌) 를 트레오닌으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 ＃24A3 경사슬을 「h＃24A3-L1 타입 경사슬」 이라고 명명했다.

h＃24A3-L1 타입 경사슬의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 24 에 기재되어 있다. 배열 번호 24 의 아미노산 배열의 1 내지 20 번째의 아미노 잔기로 이루어지는 배열, 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 130 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 경사슬 가변 영역, 경사슬 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 24 의 아미노산 배열을 코드하는 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 23 에 기재되어 있다. 배열 번호 23 의 뉴클레오티드 배열의 1 내지 60 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 61 내지 387 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 388 내지 702 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 경사슬 가변 영역 배열, 경사슬 정상 영역 배열을 코드하고 있다. 배열 번호 23 의 뉴클레오티드 배열 및 배열 번호 24 의 아미노산 배열은 도 11 에도 기재되어 있다.

c)-ii) h＃24A3-L2 타입 경사슬 ：

배열표의 배열 번호 10 으로 나타나는 인간 키메라 ＃24A3 경사슬의 아미노산 번호 29 (트레오닌) 를 아스파르트산으로, 아미노산 번호 31 (메티오닌) 을 류신으로, 아미노산 번호 32 (세린) 를 알라닌으로, 아미노산 번호 33 (이소류신) 을 발린으로, 아미노산 번호 35 (발린) 를 류신으로, 아미노산 번호 37 (아스파르트산) 을 글루탐산으로, 아미노산 번호 39 (발린) 를 알라닌으로, 아미노산 번호 41 (메티오닌) 을 이소류신으로, 아미노산 번호 60 (트레오닌) 을 프롤린으로, 아미노산 번호 83 (트레오닌) 을 세린으로, 아미노산 번호 97 (아스파라긴) 을 세린으로, 아미노산 번호 98 (발린) 을 류신으로, 아미노산 번호 103 (류신) 을 발린으로, 아미노산 번호 120 (세린) 을 글루타민으로, 아미노산 번호 122 (이소류신) 를 트레오닌으로, 아미노산 번호 124 (류신) 를 발린으로, 아미노산 번호 129 (알라닌) 를 트레오닌으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 ＃24A3 경사슬을 「h＃24A3-L2 타입 경사슬」 이라고 명명했다.

h＃24A3-L2 타입 경사슬의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 26 에 기재되어 있다. 배열 번호 26 의 아미노산 배열의 1 내지 20 번째의 아미노 잔기로 이루어지는 배열, 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 130 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 경사슬 가변 영역, 경사슬 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 26 의 아미노산 배열을 코드하는 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 25 에 기재되어 있다. 배열 번호 25 의 뉴클레오티드 배열의 1 내지 60 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 61 내지 387 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 388 내지 702 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 경사슬 가변 영역 배열, 경사슬 정상 영역 배열을 코드하고 있다. 배열 번호 25 의 뉴클레오티드 배열 및 배열 번호 26 의 아미노산 배열은 도 12 에도 기재되어 있다.

c)-iii) h＃24A3-L3 타입 경사슬 ：

배열표의 배열 번호 10 에 나타나는 인간 키메라 ＃24A3 경사슬의 아미노산 번호 29 (트레오닌) 를 아스파르트산으로, 아미노산 번호 31 (메티오닌) 을 류신으로, 아미노산 번호 32 (세린) 를 알라닌으로, 아미노산 번호 33 (이소류신) 을 발린으로, 아미노산 번호 35 (발린) 를 류신으로, 아미노산 번호 37 (아스파르트산) 을 글루탐산으로, 아미노산 번호 39 (발린) 를 알라닌으로, 아미노산 번호 41 (메티오닌) 을 이소류신으로, 아미노산 번호 60 (트레오닌) 을 프롤린으로, 아미노산 번호 97 (아스파라긴) 을 세린으로, 아미노산 번호 98 (발린) 을 류신으로, 아미노산 번호 103 (류신) 을 발린으로, 아미노산 번호 120 (세린) 을 글루타민으로, 아미노산 번호 122 (이소류신) 를 트레오닌으로, 아미노산 번호 124 (류신) 를 발린으로, 아미노산 번호 129 (알라닌) 를 트레오닌으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 ＃24A3 경사슬을 「h＃24A3-L3 타입 경사슬」 이라고 명명했다.

h＃24A3-L3 타입 경사슬의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 28 에 기재되어 있다. 배열 번호 28 의 아미노산 배열의 1 내지 20 번째의 아미노 잔기로 이루어지는 배열, 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 130 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 경사슬 가변 영역, 경사슬 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 28 의 아미노산 배열을 코드하는 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 27 에 기재되어 있다. 배열 번호 27 의 뉴클레오티드 배열의 1 내지 60 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 61 내지 387 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 388 내지 702 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 경사슬 가변 영역 배열, 경사슬 정상 영역 배열을 코드하고 있다. 배열 번호 27 의 뉴클레오티드 배열 및 배열 번호 28 의 아미노산 배열은 도 13 에도 기재되어 있다.

c)-iv) h＃24A3-L4 타입 경사슬 ：

배열표의 배열 번호 10 에 나타나는 인간 키메라 ＃24A3 경사슬의 아미노산 번호 29 (트레오닌) 를 아스파르트산으로, 아미노산 번호 31 (메티오닌) 을 류신으로, 아미노산 번호 32 (세린) 를 알라닌으로, 아미노산 번호 33 (이소류신) 을 발린으로, 아미노산 번호 35 (발린) 를 류신으로, 아미노산 번호 37 (아스파르트산) 을 글루탐산으로, 아미노산 번호 39 (발린) 를 알라닌으로, 아미노산 번호 41 (메티오닌) 을 이소류신으로, 아미노산 번호 97 (아스파라긴) 을 세린으로, 아미노산 번호 98 (발린) 을 류신으로, 아미노산 번호 103 (류신) 을 발린으로, 아미노산 번호 122 (이소류신) 를 트레오닌으로, 아미노산 번호 124 (류신) 를 발린으로, 아미노산 번호 129 (알라닌) 를 트레오닌으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 ＃24A3 경사슬을 「h＃24A3-L4 타입 경사슬」 이라고 명명했다.

h＃24A3-L4 타입 경사슬의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 30 에 기재되어 있다. 배열 번호 30 의 아미노산 배열의 1 내지 20 번째의 아미노 잔기로 이루어지는 배열, 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 130 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 경사슬 가변 영역, 경사슬 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 30 의 아미노산 배열을 코드하는 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 29 에 기재되어 있다. 배열 번호 29 의 뉴클레오티드 배열의 1 내지 60 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 61 내지 387 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 388 내지 702 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 경사슬 가변 영역 배열, 경사슬 정상 영역 배열을 코드하고 있다. 배열 번호 29 의 뉴클레오티드 배열 및 배열 번호 30 의 아미노산 배열은 도 14 에도 기재되어 있다.

d) h＃24A3 중사슬의 인간화 (제 2)

d)-i) h＃24A3-H2b 타입 중사슬 ：

배열표의 배열 번호 8 에 나타나는 인간 키메라 ＃24A3 중사슬의 아미노산 번호 24 (글루타민) 를 발린으로, 아미노산 번호 30 (류신) 을 발린으로, 아미노산 번호 31 (트레오닌) 을 리신으로, 아미노산 번호 35 (세린) 를 알라닌으로, 아미노산 번호 39 (이소류신) 를 발린으로, 아미노산 번호 43 (트레오닌) 을 알라닌으로, 아미노산 번호 56 (이소류신) 을 발린으로, 아미노산 번호 57 (리신) 을 아르기닌으로, 아미노산 번호 59 (아르기닌) 를 알라닌으로, 아미노산 번호 63 (알라닌) 을 글리신으로, 아미노산 번호 67 (이소류신) 을 메티오닌으로, 아미노산 번호 86 (리신) 을 아르기닌으로, 아미노산 번호 87 (알라닌) 을 발린으로, 아미노산 번호 89 (류신) 를 이소류신으로, 아미노산 번호 90 (알라닌) 을 트레오닌으로, 아미노산 번호 91 (발린) 을 알라닌으로, 아미노산 번호 95 (세린) 를 트레오닌으로, 아미노산 번호 99 (페닐알라닌) 를 티로신으로, 아미노산 번호 101 (글루타민) 을 글루탐산으로, 아미노산 번호 106 (트레오닌) 을 아르기닌으로, 아미노산 번호 107 (프롤린) 을 세린으로, 아미노산 번호 122 (세린) 를 리신으로, 아미노산 번호 132 (프롤린) 를 글루타민으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 ＃24A3 중사슬을 「h＃24A3-H2b 타입 중사슬」 이라고 명명했다.

h＃24A3-H2b 타입 중사슬의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 38 에 기재되어 있다. 배열 번호 38 의 아미노산 배열의 1 내지 19 번째의 아미노 잔기로 이루어지는 배열, 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 141 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 중사슬 가변 영역, 중사슬 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 38 의 아미노산 배열을 코드하는 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 37 에 기재되어 있다. 배열 번호 37 의 뉴클레오티드 배열의 1 내지 57 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 58 내지 420 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 421 내지 1398 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 중사슬 가변 영역 배열, 중사슬 정상 영역 배열을 코드하고 있다. 배열 번호 37 의 뉴클레오티드 배열 및 배열 번호 38 의 아미노산 배열은 도 17 에도 기재되어 있다.

d)-ii) h＃24A3-H2c 타입 중사슬 ：

배열표의 배열 번호 8 에 나타나는 인간 키메라 ＃24A3 중사슬의 아미노산 번호 24 (글루타민) 를 발린으로, 아미노산 번호 30 (류신) 을 발린으로, 아미노산 번호 31 (트레오닌) 을 리신으로, 아미노산 번호 35 (세린) 를 알라닌으로, 아미노산 번호 39 (이소류신) 를 발린으로, 아미노산 번호 43 (트레오닌) 을 알라닌으로, 아미노산 번호 56 (이소류신) 을 발린으로, 아미노산 번호 57 (리신) 을 아르기닌으로, 아미노산 번호 59 (아르기닌) 를 알라닌으로, 아미노산 번호 63 (알라닌) 을 글리신으로, 아미노산 번호 86 (리신) 을 아르기닌으로, 아미노산 번호 87 (알라닌) 을 발린으로, 아미노산 번호 89 (류신) 를 이소류신으로, 아미노산 번호 90 (알라닌) 을 트레오닌으로, 아미노산 번호 91 (발린) 을 알라닌으로, 아미노산 번호 95 (세린) 를 트레오닌으로, 아미노산 번호 99 (페닐알라닌) 를 티로신으로, 아미노산 번호 101 (글루타민) 을 글루탐산으로, 아미노산 번호 106 (트레오닌) 을 아르기닌으로, 아미노산 번호 107 (프롤린) 을 세린으로, 아미노산 번호 122 (세린) 를 리신으로, 아미노산 번호 132 (프롤린) 를 글루타민으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 ＃24A3 중사슬을 「h＃24A3-H2c 타입 중사슬」 이라고 명명했다.

h＃24A3-H2c 타입 중사슬의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 40 에 기재되어 있다. 배열 번호 40 의 아미노산 배열의 1 내지 19 번째의 아미노 잔기로 이루어지는 배열, 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 141 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 중사슬 가변 영역, 중사슬 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 40 의 아미노산 배열을 코드하는 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 39 에 기재되어 있다. 배열 번호 39 의 뉴클레오티드 배열의 1 내지 57 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 58 내지 420 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 421 내지 1398 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 중사슬 가변 영역 배열, 중사슬 정상 영역 배열을 코드하고 있다. 배열 번호 39 의 뉴클레오티드 배열 및 배열 번호 40 의 아미노산 배열은 도 18 에도 기재되어 있다.

d)-iii) h＃24A3-H2d 타입 중사슬 ：

배열표의 배열 번호 8 에 나타나는 인간 키메라 ＃24A3 중사슬의 아미노산 번호 24 (글루타민) 를 발린으로, 아미노산 번호 30 (류신) 을 발린으로, 아미노산 번호 31 (트레오닌) 을 리신으로, 아미노산 번호 35 (세린) 를 알라닌으로, 아미노산 번호 39 (이소류신) 를 발린으로, 아미노산 번호 43 (트레오닌) 을 알라닌으로, 아미노산 번호 56 (이소류신) 을 발린으로, 아미노산 번호 57 (리신) 을 아르기닌으로, 아미노산 번호 59 (아르기닌) 를 알라닌으로, 아미노산 번호 63 (알라닌) 을 글리신으로, 아미노산 번호 67 (이소류신) 을 메티오닌으로, 아미노산 번호 86 (리신) 을 아르기닌으로, 아미노산 번호 89 (류신) 를 이소류신으로, 아미노산 번호 90 (알라닌) 을 트레오닌으로, 아미노산 번호 91 (발린) 을 알라닌으로, 아미노산 번호 95 (세린) 를 트레오닌으로, 아미노산 번호 99 (페닐알라닌) 를 티로신으로, 아미노산 번호 101 (글루타민) 을 글루탐산으로, 아미노산 번호 106 (트레오닌) 을 아르기닌으로, 아미노산 번호 107 (프롤린) 을 세린으로, 아미노산 번호 122 (세린) 를 리신으로, 아미노산 번호 132 (프롤린) 를 글루타민으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 ＃24A3 중사슬을 「h＃24A3-H2d 타입 중사슬」 이라고 명명했다.

h＃24A3-H2d 타입 중사슬의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 42 에 기재되어 있다. 배열 번호 42 의 아미노산 배열의 1 내지 19 번째의 아미노 잔기로 이루어지는 배열, 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 141 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 중사슬 가변 영역, 중사슬 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 42 의 아미노산 배열을 코드하는 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 41 에 기재되어 있다. 배열 번호 41 의 뉴클레오티드 배열의 1 내지 57 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 58 내지 420 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 421 내지 1398 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 중사슬 가변 영역 배열, 중사슬 정상 영역 배열을 코드하고 있다. 배열 번호 41 의 뉴클레오티드 배열 및 배열 번호 42 의 아미노산 배열은 도 19 에도 기재되어 있다.

d)-iiii) h＃24A3-H2e 타입 중사슬 ：

배열표의 배열 번호 8 에 나타나는 인간 키메라 ＃24A3 중사슬의 아미노산 번호 24 (글루타민) 를 발린으로, 아미노산 번호 30 (류신) 을 발린으로, 아미노산 번호 31 (트레오닌) 을 리신으로, 아미노산 번호 35 (세린) 를 알라닌으로, 아미노산 번호 39 (이소류신) 를 발린으로, 아미노산 번호 43 (트레오닌) 을 알라닌으로, 아미노산 번호 56 (이소류신) 을 발린으로, 아미노산 번호 57 (리신) 을 아르기닌으로, 아미노산 번호 59 (아르기닌) 를 알라닌으로, 아미노산 번호 63 (알라닌) 을 글리신으로, 아미노산 번호 67 (이소류신) 을 메티오닌으로, 아미노산 번호 86 (리신) 을 아르기닌으로, 아미노산 번호 87 (알라닌) 을 발린으로, 아미노산 번호 89 (류신) 를 이소류신으로, 아미노산 번호 90 (알라닌) 을 트레오닌으로, 아미노산 번호 95 (세린) 를 트레오닌으로, 아미노산 번호 99 (페닐알라닌) 를 티로신으로, 아미노산 번호 101 (글루타민) 을 글루탐산으로, 아미노산 번호 106 (트레오닌) 을 아르기닌으로, 아미노산 번호 107 (프롤린) 을 세린으로, 아미노산 번호 122 (세린) 를 리신으로, 아미노산 번호 132 (프롤린) 를 글루타민으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 ＃24A3 중사슬을 「h＃24A3-H2e 타입 중사슬」 이라고 명명했다.

h＃24A3-H2e 타입 중사슬의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 44 에 기재되어 있다. 배열 번호 44 의 아미노산 배열의 1 내지 19 번째의 아미노 잔기로 이루어지는 배열, 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 141 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 중사슬 가변 영역, 중사슬 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 44 의 아미노산 배열을 코드하는 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 43 에 기재되어 있다. 배열 번호 43 의 뉴클레오티드 배열의 1 내지 57 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 58 내지 420 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 421 내지 1398 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 중사슬 가변 영역 배열, 중사슬 정상 영역 배열을 코드하고 있다. 배열 번호 43 의 뉴클레오티드 배열 및 배열 번호 44 의 아미노산 배열은 도 20 에도 기재되어 있다.

e) h＃24A3 경사슬의 인간화 (제 2)

e)-i) h＃24A3-L2b 타입 경사슬

배열표의 배열 번호 10 에 나타나는 인간 키메라 ＃24A3 경사슬의 아미노산 번호 29 (트레오닌) 를 아스파르트산으로, 아미노산 번호 31 (메티오닌) 을 류신으로, 아미노산 번호 32 (세린) 를 알라닌으로, 아미노산 번호 33 (이소류신) 을 발린으로, 아미노산 번호 35 (발린) 를 류신으로, 아미노산 번호 37 (아스파르트산) 을 글루탐산으로, 아미노산 번호 39 (발린) 를 알라닌으로, 아미노산 번호 41 (메티오닌) 을 이소류신으로, 아미노산 번호 60 (트레오닌) 을 프롤린으로, 아미노산 번호 83 (트레오닌) 을 세린으로, 아미노산 번호 93 (페닐알라닌) 을 류신으로, 아미노산 번호 97 (아스파라긴) 을 세린으로, 아미노산 번호 98 (발린) 을 류신으로, 아미노산 번호 103 (류신) 을 발린으로, 아미노산 번호 120 (세린) 을 글루타민으로, 아미노산 번호 122 (이소류신) 를 트레오닌으로, 아미노산 번호 124 (류신) 를 발린으로, 아미노산 번호 129 (알라닌) 를 트레오닌으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 ＃24A3 경사슬을 「h＃24A3-L2b 타입 경사슬」 이라고 명명했다.

h＃24A3-L2b 타입 경사슬의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 46 에 기재되어 있다. 배열 번호 46 의 아미노산 배열의 1 내지 20 번째의 아미노 잔기로 이루어지는 배열, 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 130 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 경사슬 가변 영역, 경사슬 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 46 의 아미노산 배열을 코드하는 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 45 에 기재되어 있다. 배열 번호 45 의 뉴클레오티드 배열의 1 내지 60 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 61 내지 387 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 388 내지 702 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 경사슬 가변 영역 배열, 경사슬 정상 영역 배열을 코드하고 있다. 배열 번호 45 의 뉴클레오티드 배열 및 배열 번호 46 의 아미노산 배열은 도 21 에도 기재되어 있다.

e)-ii) h＃24A3-L3b 타입 경사슬

배열표의 배열 번호 10 에 나타나는 인간 키메라 ＃24A3 경사슬의 아미노산 번호 29 (트레오닌) 를 아스파르트산으로, 아미노산 번호 31 (메티오닌) 을 류신으로, 아미노산 번호 32 (세린) 를 알라닌으로, 아미노산 번호 33 (이소류신) 을 발린으로, 아미노산 번호 35 (발린) 를 류신으로, 아미노산 번호 37 (아스파르트산) 을 글루탐산으로, 아미노산 번호 39 (발린) 를 알라닌으로, 아미노산 번호 41 (메티오닌) 을 이소류신으로, 아미노산 번호 60 (트레오닌) 을 프롤린으로, 아미노산 번호 93 (페닐알라닌) 을 류신으로, 아미노산 번호 97 (아스파라긴) 을 세린으로, 아미노산 번호 98 (발린) 을 류신으로, 아미노산 번호 103 (류신) 을 발린으로, 아미노산 번호 120 (세린) 을 글루타민으로, 아미노산 번호 122 (이소류신) 를 트레오닌으로, 아미노산 번호 124 (류신) 를 발린으로, 아미노산 번호 129 (알라닌) 를 트레오닌으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 ＃24A3 경사슬을 「h＃24A3-L3b 타입 경사슬」 이라고 명명했다.

h＃24A3-L3b 타입 경사슬의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 48 에 기재되어 있다. 배열 번호 48 의 아미노산 배열의 1 내지 20 번째의 아미노 잔기로 이루어지는 배열, 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 130 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 경사슬 가변 영역, 경사슬 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 48 의 아미노산 배열을 코드하는 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 47 에 기재되어 있다. 배열 번호 47 의 뉴클레오티드 배열의 1 내지 60 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 61 내지 387 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 388 내지 702 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 경사슬 가변 영역 배열, 경사슬 정상 영역 배열을 코드하고 있다. 배열 번호 47 의 뉴클레오티드 배열 및 배열 번호 48 의 아미노산 배열은 도 22 에도 기재되어 있다.

(실시예 8)

래트 항인간 Siglec-15 모노클로날 항체 ＃24A3 의 인간화 항체의 발현 벡터의 제작

8-1) 래트 항인간 Siglec-15 모노클로날 항체 ＃24A3 의 인간화 항체의 중사슬 발현 벡터의 구축

실시예 7-b) 에 기재된, 래트 항인간 Siglec-15 모노클로날 항체 ＃24A3 의 인간화 항체의 중사슬 가변 영역을 코드하는 유전자를 포함하는 DNA 를 합성하고 (GENEART 사, 인공 유전자 합성 서비스), 키메라 및 인간화 IgG2 타입 중사슬 발현 범용 벡터 (pCMA-G2) 를 제한 효소 BlpI 로 절단한 지점에 삽입함으로써, 래트 항인간 Siglec-15 모노클로날 항체 ＃24A3 의 인간화 항체의 중사슬 발현 벡터를 구축했다.

8-2) 래트 항인간 Siglec-15 모노클로날 항체 ＃24A3 의 인간화 항체의 경사슬 발현 벡터의 구축

실시예 7-c) 에 기재된, 래트 항인간 Siglec-15 모노클로날 항체 ＃24A3 의 인간화 항체의 경사슬 가변 영역을 코드하는 유전자를 포함하는 DNA 를 합성하고 (GENEART 사, 인공 유전자 합성 서비스), 키메라 및 인간화 경사슬 발현 범용 벡터 (pCMA-LK) 를 제한 효소 BsiWI 로 절단한 지점에 삽입함으로써, 래트 항인간 Siglec-15 모노클로날 항체 ＃24A3 의 인간화 항체의 경사슬 발현 벡터를 구축했다.

8-3) 래트 항인간 Siglec-15 모노클로날 항체 ＃24A3 의 인간화 항체의 중사슬 발현 벡터의 구축 (제 2)

8-3-1) h＃24A3-H2b 타입 중사슬 발현 벡터의 구축

8-1) 에서 제작한 h＃24A3-H2 타입 중사슬 발현 벡터를 템플릿으로 하고, 하기 프라이머 세트와 KOD-Plus-Mutagenesis Kit (TOYOBO 사) 를 사용하여, 변이를 도입함으로써 h＃24A3-H2b 타입 중사슬 발현 벡터를 구축했다.

프라이머 세트 ：

8-3-2) h＃24A3-H2c 타입 중사슬 발현 벡터의 구축

8-3-1) 에서 제작한 h＃24A3-H2b 타입 중사슬 발현 벡터를 템플릿으로 하고, 하기 프라이머 세트와 KOD-Plus-Mutagenesis Kit (TOYOBO 사) 를 사용하여, 변이를 도입함으로써 h＃24A3-H2c 타입 중사슬 발현 벡터를 구축했다.

프라이머 세트 ：

8-3-3) h＃24A3-H2d 타입 중사슬 발현 벡터의 구축

8-3-1) 에서 제작한 h＃24A3-H2b 타입 중사슬 발현 벡터를 템플릿으로 하고, 하기 프라이머 세트와 KOD-Plus-Mutagenesis Kit (TOYOBO 사) 를 사용하여, 변이를 도입함으로써 h＃24A3-H2d 타입 중사슬 발현 벡터를 구축했다.

프라이머 세트 ：

8-3-4) h＃24A3-H2e 타입 중사슬 발현 벡터의 구축

프라이머 세트 ：

8-4) 래트 항인간 Siglec-15 모노클로날 항체 ＃24A3 의 인간화 항체의 경사슬 발현 벡터의 구축 (제 2)

8-4-1) h＃24A3-L2b 타입 경사슬 발현 벡터의 구축

8-2) 에서 제작한 h＃24A3-L2 타입 경사슬 발현 벡터를 템플릿으로 하고, 하기 프라이머 세트와 KOD-Plus-Mutagenesis Kit (TOYOBO 사) 를 사용하여, 변이를 도입함으로써 h＃24A3-L2b 타입 경사슬 발현 벡터를 구축했다.

프라이머 세트 ：

8-4-2) h＃24A3-L3b 타입 경사슬 발현 벡터의 구축

8-2) 에서 제작한 h＃24A3-L3 타입 경사슬 발현 벡터를 템플릿으로 하고, 하기 프라이머 세트와 KOD-Plus-Mutagenesis Kit (TOYOBO 사) 를 사용하여, 변이를 도입함으로써 h＃24A3-L3b 타입 경사슬 발현 벡터를 구축했다.

프라이머 세트 ：

(실시예 9)

래트 항인간 Siglec-15 모노클로날 항체 ＃24A3 의 인간화 항체의 조제

9-1) 래트 항인간 Siglec-15 모노클로날 항체 ＃24A3 의 인간화 항체의 생산

FreeStyle 293F 세포 (Invitrogen 사) 는 매뉴얼에 따라, 계대, 배양을 실시하는 것이 가능하다. 대수 증식기의 1.2 × 10⁹개의 FreeStyle 293F 세포 (Invitrogen 사) 를 3 L Fernbach Erlenmeyer Flask (CORNING 사) 에 파종하고, FreeStyle 293 expression medium (Invitrogen 사) 으로 희석하여 1.0 × 10⁶ 세포/㎖ 로 조제한 후에, 37 ℃, 8 ％ CO₂ 인큐베이터 내에서 90 rpm 으로 1 시간 진탕 배양했다. Polyethyleneimine (Polyscience ＃24765) 3.6 mg 을 Opti-Pro SFM 배지 (Invitrogen 사) 20 ㎖ 에 용해하고, 다음으로 NucleoBond Xtra (TaKaRa 사) 를 사용하여 조제한 중사슬 발현 벡터 (0.4 mg) 및 경사슬 발현 벡터 (0.8 mg) 를 20 ㎖ 의 Opti-Pro SFM 배지 (Invitrogen 사) 에 현탁했다. Polyethyleneimine/Opti-Pro SFM 혼합액 20 ㎖ 에, 발현 벡터/Opti-Pro SFM 혼합액 20 ㎖ 를 첨가하여 온화하게 교반하고, 게다가 5 분간 방치한 후에 FreeStyle 293F 세포에 첨가했다. 37 ℃, 8 ％ CO₂ 인큐베이터에서 7 일간, 90 rpm 으로 진탕 배양하여 얻어진 배양 상청을 Disposable Capsule Filter (Advantec ＃CCS-045-E1H) 로 여과했다.

실시예 8-1), 및 8-3) 에서 제작한 래트 항인간 Siglec-15 모노클로날 항체 ＃24A3 의 인간화 항체의 중사슬 발현 벡터와, 실시예 8-2), 및 8-4) 에서 제작한 래트 항인간 Siglec-15 모노클로날 항체 ＃24A3 의 인간화 항체의 경사슬 발현 벡터의 조합에 의해, 래트항 인간 Siglec-15 모노클로날 항체 ＃24A3 의 인간화 항체를 취득했다.

9-2) 래트 항인간 Siglec-15 모노클로날 항체 ＃24A3 의 인간화 항체의 정제

상기 9-1) 에서 얻어진 배양 상청으로부터 항체를, rProteinA 어피니티 크로마토그래피 (4 - 6 ℃ 하) 와 세라믹 하이드록시 어퍼타이트 (실온하) 의 2 단계 공정으로 정제했다. rProtein A 어피니티 크로마토그래피 정제 후와 세라믹 하이드록실 어퍼타이트 정제 후의 버퍼 치환 공정은 4 - 6 ℃ 하에서 실시했다. 최초로, 배양 상청을, PBS 로 평형화한 MabSelectSuRe (GE Healthcare Bioscience 사 제조, HiTrap 칼럼) 에 어플라이했다. 배양액이 칼럼에 모두 들어간 후, 칼럼 용량 2 배 이상의 PBS 로 칼럼을 세정했다. 다음으로 2 M 아르기닌 염산염 용액 (pH 4.0) 으로 용출하고, 항체가 포함되는 획분을 모았다. 그 획분을 투석 (Thermo Scientific 사, Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette) 에 의해 PBS 로 치환한 후, 5 mM 인산나트륨/50 mM MES/pH 7.0 의 버퍼로 5 배 희석한 항체 용액을, 5 mM NaPi/50 mM MES/30 mM NaCl/pH 7.0 의 버퍼로 평형화된 세라믹 하이드록시 어퍼타이트 칼럼 (닛폰 바이오래드, Bio-Scale CHT TypeI Hydroxyapatite Column) 에 어플라이했다. 염화나트륨에 의한 직선적 농도 구배 용출을 실시하여, 항체가 포함되는 획분을 모았다. 그 획분을 투석 (Thermo Scientific 사, Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette) 에 의해 HBSor (25 mM 히스티딘/5 ％ 소르비톨, pH 6.0) 로의 버퍼 치환을 실시했다. 마지막으로 Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20 (분획 분자량 UF10K, Sartorius 사, 4 ℃ 하) 으로 농축하고, IgG 농도를 20 mg/㎖ 로 조제하여 정제 샘플로 했다.

또한, 본 명세서에서는, 예를 들어 h＃24A3-H1 중사슬 및 h＃24A3-L1 경사슬을 갖는 항체를 「h＃24A3-H1/L1」 또는 「h＃24A3-H1/L1 항체」 라고 호칭한다. 상기 9-1) 및 9-2) 의 방법에 의해 조제된 항체의 구체예로서, h＃24A3-H1/L1, h＃24A3-H1/L2, h＃24A3-H1/L3, h＃24A3-H2/L1, h＃24A3-H2/L2, h＃24A3-H2/L3, h＃24A3-H3/L1, h＃24A3-H3/L2, h＃24A3-H3/L3, h＃24A3-H4/L1, h＃24A3-H4/L2, h＃24A3-H4/L3, h＃24A3-H5/L1, h＃24A3-H5/L2, h＃24A3-H5/L3, h＃24A3-H6/L4, h＃24A3-H2b/L1, h＃24A3-H2b/L2b, h＃24A3-H2b/L3b, h＃24A3-H2c/L1, h＃24A3-H2c/L2b, h＃24A3-H2c/L3b, h＃24A3-H2d/L1, h＃24A3-H2d/L2b, h＃24A3-H2d/L3b, h＃24A3-H2e/L1, h＃24A3-H2e/L2b, 및 h＃24A3-H2e/L3b 를 들 수 있다.

(실시예 10)

래트 항인간 Siglec-15 모노클로날 항체 ＃24A3 의 키메라 항체 및 인간화 항체의 마우스 Siglec-15 단백질에 대한 결합성 평가

10-1) 키메라 항체의 결합성 평가

인간 키메라 ＃24A3 항체와 인간 Siglec-15 V-set 도메인의 해리 정수 측정은, Biacore T200 (GE 헬스케어 바이오사이언스 (주)) 을 사용하고, 항체를 리간드로서 고정화하여, 항원을 애널라이트로서 측정했다. 또한, 대조가 되는 항체로서 인간 키메라 ＃32A1 항체를 사용했다. 인간 키메라 ＃32A1 항체는, 국제 공개 제WO10/117011호 팜플렛에, 그 조제 방법, 그리고 중사슬 및 경사슬의 배열 정보가 기재되어 있다. 인간 키메라 ＃24A3 항체 또는 인간 키메라 ＃32A1 항체는, 아민 커플링법으로 센서 칩 CM5 (GE 헬스케어 바이오사이언스 (주)) 에 고정화한 항인간 IgG 항체 (GE 헬스케어 바이오사이언스 (주)) 를 개재하여, 약 50 RU 를 결합시켰다. 런닝 버퍼로서 HBS-EP＋ (10 mM HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.05 ％ Surfactant P20) 를 사용했다. 항체를 결합한 칩 위에, 항원의 희석 계열 용액 (0.003 - 2 nM) 을 유속 90 ㎕/분으로 233 초간 첨가하고, 계속해서 3600 초간의 해리상을 모니터했다. 재생 용액으로서 3 M MgCl2 를 유속 10 ㎕/분으로 30 초간 첨가했다. 데이터의 해석에는, 분석 소프트웨어 (Biacore T200 Evaluation Software, version 1.0) 의 1 ： 1 결합 모델을 사용하여, 결합 속도 정수 kon, 해리 속도 정수 koff 및 해리 정수 (KD ； KD = koff/kon) 를 산출했다. 그 결과, 인간 키메라 ＃24A3 항체의 KD 값은 1.7 E - 11［M］이며, 인간 키메라 ＃32A1 항체의 KD 값은 1.4 E - 10［M］이었다. 인간 키메라 ＃24A3 항체는 래트 ＃24A3 항체와 동등 이상의 친화성을 가지고 있었다. 또, 인간 키메라 ＃32A1 항체는 래트 ＃32A1 항체와 동등한 친화성을 가지고 있었다.

10-2) 인간화 항체의 결합성 평가

상기 10-1) 과 동일한 방법에 의해, 래트 항인간 Siglec-15 모노클로날 항체 ＃24A3 의 인간화 항체의 마우스 Siglec-15 단백질에 대한 결합성을 평가했다. 그 결과를 표 1 에 나타낸다.

인간화 ＃24A3 항체는 인간 키메라 ＃24A3 항체와 동등 이상의 친화성을 가지고 있었다.

(실시예 11)

래트 항인간 Siglec-15 모노클로날 항체 ＃24A3 의 키메라 항체 및 인간화 항체에 의한 인간 정상 파골 세포의 분화에 대한 영향

11-1) 키메라 항체에 의한 인간 정상 파골 세포의 분화에 대한 영향

타르타르산 저항성 산성 포스파타제 (TRAP) 는 파골 세포의 분화에 수반하여 발현이 상승하는 마커이며, 성숙한 파골 세포로부터 분비된다고 생각되고 있다. 따라서, 파골 세포의 배양 상청 중에 있어서의 TRAP 의 활성을 측정함으로써, 피험물질의 파골 세포 분화에 대한 영향을 in vitro 로 평가하는 것이 가능하다.

정상 인간 파골 전구 세포 (Normal Human Natural Osteoclast Precursor Cells, 산코 준야쿠에서 구입, 카탈로그 번호 2T-110) 를, 세포에 첨부된 프로토콜에 따라 96 구멍 플레이트에 1 × 10⁴ 세포/구멍이 되도록 파종했다. 또한 배지는 소 태아 혈청 (종농도 10 ％), 인간 RANKL (종농도 68.4 ng/㎖) 및 인간 M-CSF (종농도 33 ng/㎖) 등을 포함하는 OPGM 첨가 인자 세트 (산코 준야쿠에서 구입, 카탈로그 번호 PT-9501) 를 첨가한 파골 전구 세포용 기초 배지 (OPBM, 산코 준야쿠에서 구입, 카탈로그 번호 PT-8201) 를 사용했다. 이 배양 상청 중에, 실시예 2 에서 취득한 래트 ＃24A3 항체 및 실시예 6 에서 조제한 인간 키메라 ＃24A3 항체를, 각각 종농도 4, 20, 100, 500 ng/㎖ 가 되도록 첨가하고, CO₂ 인큐베이터 중에서 5 일간 배양했다. 배양 상청 75 ㎕ 를 채취하여, 기질 용액 (11 mg/㎖ p-니트로페닐인산 및 100 mM 타르타르산나트륨을 함유하는 0.2 M 아세트산나트륨 완충액 (pH 5.0)) 75 ㎕ 를 첨가하여 실온에서 30 분간 인큐베이트했다. 2 N 수산화나트륨 용액 50 ㎕ 를 첨가하여 효소 반응을 정지하고, 405 nm 의 흡광도를 측정하여 TRAP 활성의 지표로 했다 (도 16). 그 결과, 인간 키메라 ＃24A3 항체에 의해 4 ng/㎖ 내지 500 ng/㎖ 의 범위에서 TRAP 활성이 농도 의존적으로 억제되고, 인간 키메라 ＃24A3 항체가 인간 파골 세포의 분화를 억제하는 것이 확인되었다. 또 이 인간 키메라 항체의 억제 작용은, 원래의 래트 ＃24A3 항체의 억제 작용과 동등 이상인 점에서, 인간 키메라화에 의한 활성의 저하는 없다고 생각되었다.

11-2) 인간화 항체에 의한 인간 정상 파골 세포의 분화에 대한 영향

래트 항인간 Siglec-15 모노클로날 항체 ＃24A3 의 키메라 항체 및 인간화 항체에 의한 인간 정상 파골 세포의 분화에 대한 영향은 상기 11-1) 에 기재된 방법에 의해 시험하는 것이 가능하다.

정상 인간 파골 전구 세포를, 96 구멍 플레이트에 1 × 10⁴ 세포/구멍이 되도록 파종했다. 또한 배지 중의 인간 RANKL 은 종농도 66 ng/㎖ 가 되도록 조제했다. 이 배양 상청 중에, 실시예 9 에서 취득한 인간화 ＃24A3 항체 (h＃24A3-H2d/L1, h＃24A3-H2e/L1, h＃24A3-H2b/L3b 및 h＃24A3-H2c/L2b) 및 실시예 6 에서 조제한 인간 키메라 ＃24A3 항체를, 각각 종농도 4, 20, 100, 500 ng/㎖ 가 되도록 첨가하여, CO₂ 인큐베이터 중에서 6 일간 배양했다. 배양 상청 75 ㎕ 를 채취하고, 기질 용액 (11 mg/㎖ p-니트로페닐인산 및 100 mM 타르타르산나트륨을 함유하는 0.2 M 아세트산나트륨 완충액 (pH 5.0)) 75 ㎕ 를 첨가하여 실온에서 20 분간 인큐베이트했다. 2 N 수산화나트륨 용액 50 ㎕ 를 첨가하여 효소 반응을 정지하고, 405 nm 의 흡광도를 측정하여 TRAP 활성의 지표로 했다 (도 23). 그 결과, h＃24A3-H2d/L1, h＃24A3-H2e/L1 및 h＃24A3-H2b/L3b 에 의해 20 ng/㎖ 내지 500 ng/㎖ 의 범위에서, 또 h＃24A3-H2c/L2b 에 의해 4 ng/㎖ 내지 500 ng/㎖ 의 범위에서, TRAP 활성이 농도 의존적으로 억제되었다. 또한 이들의 억제 작용은 인간 키메라 ＃24A3 항체의 억제 작용과 거의 동등한 점에서, 인간화에 의한 활성의 저하는 거의 없다고 생각되었다. 이상에서, 인간화 ＃24A3 항체가 인간 파골 세포의 분화를 억제하는 것이 나타났다.

(실시예 12)

래트 항인간 Siglec-15 모노클로날 항체 ＃24A3 의 인간화 항체에 의한 인간 정상 파골 세포의 골흡수 활성에 대한 영향 (in vitro 생물 활성 평가)

파골 세포는 카텝신 K 등의 프로테아제를 방출함으로써, 골조직의 구성 성분인 I 형 콜라겐을 분해하는 것이 알려져 있다. OsteoLyse Assay Kit (Lonza 사 제조, 카탈로그 번호 PA-1500) 는 유로퓸이 결합된 인간 콜라겐을 코팅한 96 구멍 플레이트 (96-well OsteoLyse cell culture plate) 를 제공하고 있고, 동 플레이트 상에서 파골 세포를 배양했을 때에 상청에 유리되는 형광 콜라겐 단편량을 측정함으로써, 파골 세포의 골흡수 활성을 in vitro 로 평가하는 것이 가능하다. 래트 항인간 Siglec-15 모노클로날 항체 ＃24A3 의 인간화 항체에 의한 인간 정상 파골 세포의 골흡수 활성의 억제 효과는 이하에 나타내는 방법에 의해 평가가 가능하다.

정상 인간 파골 전구 세포 (Normal Human Natural Osteoclast Precursor Cells, 산코 준야쿠에서 구입, 카탈로그 번호 2T-110) 를, 세포에 첨부된 프로토콜에 따라 96-well OsteoLyse cell culture plate 에 1 × 10⁴ 세포/구멍이 되도록 파종한다. 또한 배지는 소 태아 혈청 (종농도 10 ％), 인간 RANKL (종농도 63.8 ng/㎖) 및 인간 M-CSF (종농도 33 ng/㎖) 등을 포함하는 OPGM 첨가 인자 세트 (산코 준야쿠에서 구입, 카탈로그 번호 PT-9501) 를 첨가한 파골 전구 세포용 기초 배지 (OPBM, 산코 준야쿠에서 구입, 카탈로그 번호 PT-8201) 를 사용한다. 이 배양 상청 중에, 실시예 10 에서 조제한 래트 항인간 Siglec-15 모노클로날 항체 ＃24A3 의 인간화 항체를 종농도 0.8 ∼ 500 ng/㎖ 가 되도록 첨가하고, CO₂ 인큐베이터 중에서 3 ∼ 7 일간 배양한다. 배양 상청 10 ㎕ 를 채취하고, OsteoLyse Assay Kit 에 부속된 Fluorophore Releasing Reagent 를 200 ㎕ 첨가하고, 형광 플레이트 리더 (ARVO MX, 파킨에르마사 제조) 를 사용하여 형광 강도를 측정 (Excitation ： 340 nm, Emission ： 615 nm) 함으로써, 배양 상청 중에 방출된 유리 형광 콜라겐 단편량을 정량한다.

(실시예 13)

래트 항인간 Siglec-15 모노클로날 항체 ＃24A3 의 인간화 항체의 난소 적출 래트를 사용한 생물학적 평가

실시예 9 에 있어서 취득된 인간화 항체가 나타내는, 난소 적출 래트에 있어서의 골밀도 감소 및 골흡수 활성에 대한 억제 효과는 이하에 기재된 방법으로 평가하는 것이 가능하다.

a) 동물 실험의 프로토콜

12 주령 자성 F344 래트 (닛폰 찰스·리버사에서 입수) 에 양측 난소 적제를 시술하여, 용매 투여군, 래트 항인간 Siglec-15 모노클로날 항체 ＃24A3 의 인간화 항체 투여군으로 나눈다. 또 가짜 수술군에 대해서도 1 군 설정한다. 항체를 투여하는 군에 대해서는, 0.1 ∼ 30 mg/kg 의 용량으로, 수술 다음날부터 피하에 단회 투여 혹은 반복 투여한다. 투여 개시 4 주 후에 절식하에서 24 시간 채뇨를 실시하여, 뇨 검체는 측정까지 -80 ℃ 에서 보존한다. 채뇨 종료 후에 래트를 안락사시켜, 요추를 적출한다.

b) 요추 골밀도의 측정

적출한 요추에 부착되어 있는 연조직을 제거하고, 제 4 ∼ 6 요추를 자른다. 골밀도 측정 장치 (DCS-600EX, 알로카사 제조) 를 사용하여 골밀도를 측정하고, 용매 투여군, 가짜 수술군과 비교함으로써, 인간화 항체의 효과를 판정한다.

c) 뇨 중 데옥시피리디놀린 배설량의 측정

I 형 콜라겐 가교의 각종 대사 산물은 골의 대사 회전, 특히 골흡수를 예민하게 반영하고, 그 중에서도 데옥시피리디놀린은 주로 골의 콜라겐에 국재하는 점에서 골흡수의 지표로서 신뢰성이 높다고 여겨지고 있다.

동결 보존되어 있던 뇨 검체를 융해하고, 원심 조작에 의해 불용 물질을 침전시켜 상청을 얻는다. 이 상청 중에 포함되는 데옥시피리디놀린량을, 오스테오린크스 「DPD」 (DS 파마 바이오메디칼사 제조) 를 사용하여 측정한다. 또, 상청 중의 크레아티닌 함량도 측정하고, 크레아티닌 보정을 실시한 데옥시피리디놀린량을 산출한다. 산출한 데옥시피리디놀린량에 대해, 용매 투여군, 가짜 수술군과 비교함으로써, 인간화 항체의 효과를 판정한다.

(실시예 14)

래트 항인간 Siglec-15 모노클로날 항체 ＃24A3 의 인간화 항체의 열안정성 측정

시차주사 칼로리메트리 (DSC) 를 사용하여 열안정성의 측정을 실시했다. 샘플은 0.5 mg/㎖ 의 농도로 HBSor 완충액 (25 mM 히스티딘 (pH 6.0) 5 ％ 소르비톨로 조제) 에 용해시켜, 400 ㎕ 씩 시료 용액으로서 DSC 측정에 사용했다. DSC 측정 조건은 이하와 같이 설정했다. 즉, 초기 온도는 20 ℃, 최종 온도를 100 ℃ 로 하고, 승온 속도를 200 ℃／1 시간, 필터 시간 2 초, 피드백 모드를 Low 로 했다. 참조액은 HBSor 을 사용했다. 모든 DSC 측정 장치로서는, 미국 GE 헬스케어 바이오사이언스 (주) 제조 VP-Capillary DSC Platform 을 사용했다. 시료 용액으로부터 얻어진 스캔 곡선에서 베이스라인 (시료 셀에도 참조 용액을 충전하여 얻어진 스캔 곡선) 을 제하여 베이스라인 보정을 실시했다. 다음으로, 각 샘플의 분자량으로부터 산출된 몰 농도를 사용하여 농도의 캘리브레이션을 실시했다. 도 24 가 h＃24A3-H2d/L1 항체의 서모그램, 도 25 가 h＃24A3-H2e/L1 항체의 서모그램, 도 26 이 h＃24A3-H2b/L3b 항체의 서모그램, 도 27 이 h＃24A3-H2c/L2b 항체의 서모그램을 나타낸다. 각각의 서모그램 중의 최대의 피크에 대해 피크 탑을 나타낸 온도를 열변성 중점 Tm 으로 하면, h＃24A3-H2d/L1 항체의 Tm 값이 87.9 ℃, h＃24A3-H2e/L1 항체의 Tm 값이 89.3 ℃, h＃24A3-H2b/L3b 항체의 Tm 값이 88.9 ℃, h＃24A3-H2c/L2b 항체의 Tm 값이 91.0 ℃ 였다.

산업상 이용가능성

본 발명의 키메라 또는 인간화 항 Siglec-15 항체는 파골 세포의 분화 또는 골흡수 활성의 억제능을 가지며, 그 항 Siglec-15 항체를 포함하는 의약 조성물은 골대사 이상 질환의 치료 또는 예방제가 될 수 있다.

배열표 프리텍스트

배열 번호 1 ：＃24A3 의 중사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 배열

배열 번호 2 ：＃24A3 의 중사슬의 가변 영역의 아미노산 배열

배열 번호 3 ：＃24A3 의 경사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 배열

배열 번호 4 ：＃24A3 의 경사슬의 가변 영역의 아미노산 배열

배열 번호 5 ： 인간 κ 사슬 분비 시그널 및 인간 κ 사슬 정상 영역을 코드하는 뉴클레오티드 배열

배열 번호 6 ： 인간 중사슬 분비 시그널 및 인간 IgG2 정상 영역을 코드하는 뉴클레오티드 배열

배열 번호 7 ： 인간 키메라 ＃24A3 항체 중사슬의 뉴클레오티드 배열

배열 번호 8 ： 인간 키메라 ＃24A3 항체 중사슬의 아미노산 배열

배열 번호 9 ： 인간 키메라 ＃24A3 항체 경사슬의 뉴클레오티드 배열

배열 번호 10 ： 인간 키메라 ＃24A3 항체 경사슬의 아미노산 배열

배열 번호 11 ： h＃24A3-H1 의 뉴클레오티드 배열

배열 번호 12 ： h＃24A3-H1 의 아미노산 배열

배열 번호 13 ： h＃24A3-H2 의 뉴클레오티드 배열

배열 번호 14 ： h＃24A3-H2 의 아미노산 배열

배열 번호 15 ： h＃24A3-H3 의 뉴클레오티드 배열

배열 번호 16 ： h＃24A3-H3 의 아미노산 배열

배열 번호 17 ： h＃24A3-H4 의 뉴클레오티드 배열

배열 번호 18 ： h＃24A3-H4 의 아미노산 배열

배열 번호 19 ： h＃24A3-H5 의 뉴클레오티드 배열

배열 번호 20 ： h＃24A3-H5 의 아미노산 배열

배열 번호 21 ： h＃24A3-H6 의 뉴클레오티드 배열

배열 번호 22 ： h＃24A3-H6 의 아미노산 배열

배열 번호 23 ： h＃24A3-L1 의 뉴클레오티드 배열

배열 번호 24 ： h＃24A3-L1 의 아미노산 배열

배열 번호 25 ： h＃24A3-L2 의 뉴클레오티드 배열

배열 번호 26 ： h＃24A3-L2 의 아미노산 배열

배열 번호 27 ： h＃24A3-L3 의 뉴클레오티드 배열

배열 번호 28 ： h＃24A3-L3 의 아미노산 배열

배열 번호 29 ： h＃24A3-L4 의 뉴클레오티드 배열

배열 번호 30 ： h＃24A3-L4 의 아미노산 배열

배열 번호 31 ：＃24A3 항체의 CDRH1 의 아미노산 배열

배열 번호 32 ：＃24A3 항체의 CDRH2 의 아미노산 배열

배열 번호 33 ：＃24A3 항체의 CDRH3 의 아미노산 배열

배열 번호 34 ：＃24A3 항체의 CDRL1 의 아미노산 배열

배열 번호 35 ：＃24A3 항체의 CDRL2 의 아미노산 배열

배열 번호 36 ：＃24A3 항체의 CDRL3 의 아미노산 배열

배열 번호 37 ： h＃24A3-H2b 의 뉴클레오티드 배열

배열 번호 38 ： h＃24A3-H2b 의 아미노산 배열

배열 번호 39 ： h＃24A3-H2c 의 뉴클레오티드 배열

배열 번호 40 ： h＃24A3-H2c 의 아미노산 배열

배열 번호 41 ： h＃24A3-H2d 의 뉴클레오티드 배열

배열 번호 42 ： h＃24A3-H2d 의 아미노산 배열

배열 번호 43 ： h＃24A3-H2e 의 뉴클레오티드 배열

배열 번호 44 ： h＃24A3-H2e 의 아미노산 배열

배열 번호 45 ： h＃24A3-L2b 의 뉴클레오티드 배열

배열 번호 46 ： h＃24A3-L2b 의 아미노산 배열

배열 번호 47 ： h＃24A3-L3b 의 뉴클레오티드 배열

배열 번호 48 ： h＃24A3-L3b 의 아미노산 배열

배열 번호 49 ：＃24A3 항체의 변이 CDRH3 의 아미노산 배열

독립행정법인 산업기술 종합연구소 특허생물 기탁센터

FERMBP-10999

20080828

SEQUENCE LISTING <110> DAIICHI SANKYO COMPANY, LIMITED <120> Novel anti-Siglec-15 antibodies <130> FP1309 <150> JP2012-078841 <151> 2012-03-30 <160> 49 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 363 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220> <221> CDS <222> (1)..(363) <400> 1 cag gtc cag ctg cag cag tct gga gct gag ctg aca aag cct ggc tct 48 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Thr Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 tca gtg aag att tcc tgc aag act tct ggc tac acc ttt ccc agg tac 96 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Pro Arg Tyr 20 25 30 gat gta agt tgg atc aag cag agg cct gga cag gcc ctt gag tgg att 144 Asp Val Ser Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Ala Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga gtc att cat cca gga agt gga gga aca ggg tac aat gag aag ttc 192 Gly Val Ile His Pro Gly Ser Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 aag gcc aag gcc aca ttg gct gtg gac aca tcc tcc agc aca gcc ttc 240 Lys Ala Lys Ala Thr Leu Ala Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80 atg caa ctc agc agc ctg aca cct gag gac act gcg gtc tat tac tgt 288 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga cgg ggc ctc aat tcg ggg tac tgg ttc ttt gac ttc tgg ggc 336 Ala Arg Arg Gly Leu Asn Ser Gly Tyr Trp Phe Phe Asp Phe Trp Gly 100 105 110 cca gga acc ctg gtc act gtg tcc tca 363 Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 121 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 2 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Thr Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Pro Arg Tyr 20 25 30 Asp Val Ser Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Ala Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile His Pro Gly Ser Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ala Lys Ala Thr Leu Ala Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Gly Leu Asn Ser Gly Tyr Trp Phe Phe Asp Phe Trp Gly 100 105 110 Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 327 <212> DNA 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acaacgccct 240 gcagtccggg aactcccagg agagcgtgac cgagcaggac agcaaggaca gcacctacag 300 cctgagcagc accctgaccc tgagcaaagc cgactacgag aagcacaagg tgtacgcctg 360 cgaggtgacc caccagggcc tgagctcccc cgtcaccaag agcttcaaca ggggggagtg 420 ttaggggccc gtttaaacgg gggaggcta 449 <210> 6 <211> 1118 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide coding signal and constant regions of human IgG2 chain <400> 6 gcctccggac tctagagcca ccatgaaaca cctgtggttc ttcctcctgc tggtggcagc 60 tcccagatgg gtgctgagcc aggtgcaatt gtgcaggcgg ttagctcagc cagcaccaag 120 ggcccttccg tgttccctct ggccccttgt agccgttcca ccagcgagtc caccgccgcc 180 cttggctgtc tggtgaagga ctacttccct gagcctgtga ccgtgagctg gaactccgga 240 gcccttacca gcggcgtgca caccttccct gccgtgctgc agtccagcgg cctttactcc 300 ctgagctccg tggtgaccgt gcctagctcc aacttcggca cccaaaccta cacctgtaac 360 gtggaccaca agcctagcaa caccaaggtg gacaagaccg tggagcgtaa gtgttgtgtg 420 gagtgtcctc cttgtcctgc ccctcctgtg gccggacctt ccgtgttcct tttccctcct 480 aagcctaagg acaccctgat gatcagccgt acccctgagg tgacctgtgt ggtggtggac 540 gtgtcccacg aggaccctga ggtgcagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcac 600 aacgccaaga ccaagcctcg tgaggagcaa ttcaacagca ccttccgtgt ggtgtccgtg 660 cttaccgtgg tgcaccaaga ctggctgaac ggcaaggagt acaagtgtaa ggtgagcaac 720 aagggacttc ctgcccctat cgagaagacc atctccaaga ccaagggcca acctcgtgag 780 cctcaagtgt acacccttcc tcctagccgt gaggagatga ccaagaacca agtgtccctt 840 acctgtctgg tgaagggctt ctaccctagc gacatcgccg tggagtggga gtccaacgga 900 caacctgaga acaactacaa gaccacccct cctatgcttg acagcgacgg ctccttcttc 960 ctgtacagca agctgaccgt ggacaagtcc cgttggcaac aaggcaacgt gttcagctgt 1020 tccgtgatgc acgaggccct gcacaaccac tacacccaaa agagcctttc cctgagccct 1080 ggaaagtgat atcgggcccg tttaaacggg ggaggcta 1118 <210> 7 <211> 1398 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide coding heavy chain of chimeric #24A3 <220> <221> CDS <222> (1)..(1398) <400> 7 atg aaa cac ctg tgg ttc ttc ctc ctg ctg gtg gca gct ccc aga tgg 48 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 gtg ctg agc cag gtc cag ctg cag cag tct gga gct gag ctg aca aag 96 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Thr Lys 20 25 30 cct ggc tct tca gtg aag att tcc tgc aag act tct ggc tac acc ttt 144 Pro Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 ccc agg tac gat gta agt tgg atc aag cag agg cct gga cag gcc ctt 192 Pro Arg Tyr Asp Val Ser Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Ala Leu 50 55 60 gag tgg att gga gtc att cat cca gga agt gga gga aca ggg tac aat 240 Glu Trp Ile Gly Val Ile His Pro Gly Ser Gly Gly Thr Gly Tyr Asn 65 70 75 80 gag aag ttc aag gcc aag gcc aca ttg gct gtg gac aca tcc tcc agc 288 Glu Lys Phe Lys Ala Lys Ala Thr Leu Ala Val Asp Thr Ser Ser Ser 85 90 95 aca gcc ttc atg caa ctc agc agc ctg aca cct gag gac act gcg gtc 336 Thr Ala Phe Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 tat tac tgt gca aga cgg ggc ctc aat tcg ggg tac tgg ttc ttt gac 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Leu Asn Ser Gly Tyr Trp Phe Phe Asp 115 120 125 ttc tgg ggc cca gga acc ctg gtc act gtg agc tca gcc agc acc aag 432 Phe Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 130 135 140 ggc cct tcc gtg ttc cct ctg gcc cct tgt agc cgt tcc acc agc gag 480 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu 145 150 155 160 tcc acc gcc gcc ctt ggc tgt ctg gtg aag gac tac ttc cct gag cct 528 Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 165 170 175 gtg acc gtg agc tgg aac tcc gga gcc ctt acc agc ggc gtg cac acc 576 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 180 185 190 ttc cct gcc gtg ctg cag tcc agc ggc ctt tac tcc ctg agc tcc gtg 624 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 195 200 205 gtg acc gtg cct agc tcc aac ttc ggc acc caa acc tac acc tgt aac 672 Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn 210 215 220 gtg gac cac aag cct agc aac acc aag gtg gac aag acc gtg gag cgt 720 Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val 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Ala Leu Gln Ser 165 170 175 ggg aac tcc cag gag agc gtg acc gag cag gac agc aag gac agc acc 576 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190 tac agc ctg agc agc acc ctg acc ctg agc aaa gcc gac tac gag aag 624 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205 cac aag gtg tac gcc tgc gag gtg acc cac cag ggc ctg agc tcc ccc 672 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220 gtc acc aag agc ttc aac agg ggg gag tgt 702 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 48 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 48 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala 20 25 30 Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asn 35 40 45 Val Gly Ser Asn Val Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Glu Ser Thr Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp 65 70 75 80 Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser Asn 100 105 110 Phe Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 130 135 140 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 165 170 175 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 49 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 of #24A3 <400> 49 Arg Gly Leu Asn Lys Gly Tyr Trp Phe Phe Asp Phe 1 5 10

Claims

중사슬 배열이 CDRH1, CDRH2, CDRH3 을 갖는 가변 영역을 포함하고, 상기 CDRH1 은 배열 번호 31 에 나타나는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRH2 는 배열 번호 32 에 나타나는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRH3 은 배열 번호 33 에 나타나는 아미노산 배열 또는 그 아미노산 배열에 있어서 1 내지 3 개의 아미노산이 치환된 아미노산 배열로 이루어지는 것 ； 및
경사슬 배열이 CDRL1, CDRL2, CDRL3 을 갖는 가변 영역을 포함하고, 상기 CDRL1 은 배열 번호 34 에 나타나는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRL2 는 배열 번호 35 에 나타나는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRL3 은 배열 번호 36 에 나타나는 아미노산 배열로 이루어지는 것
을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편.
중사슬 배열이 CDRH1, CDRH2, CDRH3 을 갖는 가변 영역을 포함하고, 상기 CDRH1 은 배열 번호 31 에 나타나는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRH2 는 배열 번호 32 에 나타나는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRH3 은 배열 번호 33 에 나타나는 아미노산 배열 또는 배열 번호 49 에 나타나는 아미노산 배열로 이루어지는 것 ； 및
경사슬 배열이 CDRL1, CDRL2, CDRL3 을 갖는 가변 영역을 포함하고, 상기 CDRL1 은 배열 번호 34 에 나타나는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRL2 는 배열 번호 35 에 나타나는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRL3 은 배열 번호 36 에 나타나는 아미노산 배열로 이루어지는 것
을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
배열 번호 2 에 나타나는 아미노산 배열의 1 내지 121 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 가변 영역 배열 및 배열 번호 4 에 나타나는 아미노산 배열의 1 내지 109 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 가변 영역 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
Fab, F(ab')2, Fab' 및 Fv 로 이루어지는 군에서 선택되는 항체의 항원 결합 단편.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
scFv 인 것을 특징으로 하는 항체.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
키메라 항체인 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편.
제 6 항에 있어서,
배열 번호 8 에 나타나는 아미노산 배열의 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 배열 및 배열 번호 10 에 나타나는 아미노산 배열의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 배열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편.
제 1 항, 제 2 항 또는 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
인간화되어 있는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편.
제 6 항 또는 제 8 항에 있어서,
중사슬이 인간 면역 글로불린 G2 중사슬의 정상 영역을 포함하고, 경사슬이 인간 면역 글로불린 κ 경사슬의 정상 영역을 포함하는 항체.
파골 세포의 형성 및/또는 파골 세포에 의한 골흡수를 억제하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편으로서,
(a) 이하의 아미노산 배열로 이루어지는 군에서 선택되는 중사슬 가변 영역 배열 ：
a1) 배열 번호 12 에 나타나는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ；
a2) 배열 번호 14 에 나타나는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ；
a3) 배열 번호 16 에 나타나는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ；
a4) 배열 번호 18 에 나타나는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ；
a5) 배열 번호 20 에 나타나는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ；
a6) 배열 번호 22 에 나타나는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ；
a7) 배열 번호 38 에 나타나는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ；
a8) 배열 번호 40 에 나타나는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ；
a9) 배열 번호 42 에 나타나는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ；
a10) 배열 번호 44 에 나타나는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ；
a11) a1) 내지 a10) 에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 배열과 적어도 95 ％ 의 상동성을 가지는 아미노산 배열 ；
a12) a1) 내지 a10) 에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 배열과 적어도 99 ％ 의 상동성을 가지는 아미노산 배열 ；
a13) a1) 내지 a10) 에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 배열에 1 내지 수 개의 아미노산 잔기가 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 배열 ； 및
(b) 이하의 아미노산 배열로 이루어지는 군에서 선택되는 경사슬 가변 영역 배열 ：
b1) 배열 번호 24 에 나타나는 아미노산 배열의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ；
b2) 배열 번호 26 에 나타나는 아미노산 배열의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ；
b3) 배열 번호 28 에 나타나는 아미노산 배열의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ；
b4) 배열 번호 30 에 나타나는 아미노산 배열의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ；
b5) 배열 번호 46 에 나타나는 아미노산 배열의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ；
b6) 배열 번호 48 에 나타나는 아미노산 배열의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ；
b7) b1) 내지 b6) 에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 배열과 적어도 95 ％ 의 상동성을 가지는 아미노산 배열 ；
b8) b1) 내지 b6) 에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 배열과 적어도 99 ％ 의 상동성을 가지는 아미노산 배열 ；
b9) b1) 내지 b6) 에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 배열에 1 내지 수 개의 아미노산 잔기가 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 배열
을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편.
제 10 항에 있어서,
배열 번호 14 에 나타나는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 가변 영역 배열 및 배열 번호 24 에 나타나는 아미노산 배열의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 가변 영역 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편.
제 10 항에 있어서,
배열 번호 14 에 나타나는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 가변 영역 배열 및 배열 번호 26 에 나타나는 아미노산 배열의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 가변 영역 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편.
제 10 항에 있어서,
배열 번호 14 에 나타나는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 가변 영역 배열 및 배열 번호 28 에 나타나는 아미노산 배열의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 가변 영역 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편.
제 10 항에 있어서,
배열 번호 38 에 나타나는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 가변 영역 배열 및 배열 번호 48 에 나타나는 아미노산 배열의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 가변 영역 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편.
제 10 항에 있어서,
배열 번호 40 에 나타나는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 가변 영역 배열 및 배열 번호 46 에 나타나는 아미노산 배열의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 가변 영역 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편.
제 10 항에 있어서,
배열 번호 42 에 나타나는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 가변 영역 배열 및 배열 번호 24 에 나타나는 아미노산 배열의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 가변 영역 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편.
제 10 항에 있어서,
배열 번호 44 에 나타나는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 가변 영역 배열 및 배열 번호 24 에 나타나는 아미노산 배열의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 가변 영역 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편.
제 10 항에 있어서,
배열 번호 14 의 아미노산 배열에 나타나는 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 배열 및 배열 번호 24 에 나타나는 아미노산 배열의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 배열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편.
제 10 항에 있어서,
배열 번호 14 에 나타나는 아미노산 배열의 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 배열 및 배열 번호 26 에 나타나는 아미노산 배열의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 배열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편.
제 10 항에 있어서,
배열 번호 14 에 나타나는 아미노산 배열의 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 배열 및 배열 번호 28 에 나타나는 아미노산 배열의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 배열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편.
제 10 항에 있어서,
배열 번호 38 에 나타나는 아미노산 배열의 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 배열 및 배열 번호 48 에 나타나는 아미노산 배열의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 배열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편.
제 10 항에 있어서,
배열 번호 40 에 나타나는 아미노산 배열의 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 배열 및 배열 번호 46 에 나타나는 아미노산 배열의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 배열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편.
제 10 항에 있어서,
배열 번호 42 에 나타나는 아미노산 배열의 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 배열 및 배열 번호 24 에 나타나는 아미노산 배열의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 배열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
제 10 항에 있어서,
배열 번호 44 에 나타나는 아미노산 배열의 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 중사슬 배열 및 배열 번호 24 에 나타나는 아미노산 배열의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 경사슬 배열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편.
제 11 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
카르복실기 말단측의 1 내지 수 개의 아미노산이 결실된 중사슬을 포함하는 항체.
제 1 항 내지 제 25 항에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편 중 적어도 어느 하나를 함유하는 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
제 26 항에 있어서,
골대사 이상의 치료 및/또는 예방제인 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
제 1 항 내지 제 25 항에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편 중 적어도 어느 하나, 그리고, 비스포스포네이트, 활성형 비타민 D₃, 칼시토닌 및 그 유도체, 에스트라디올 등의 호르몬, SERMs (selective estrogen receptor modulators), 이프리플라본, 비타민 K₂ (메나테트레논), 칼슘 제제, PTH (parathyroid hormone), 비스테로이드성 항염증제, 가용성 TNF 리셉터, 항 TNFα 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편, 항 PTHrP (parathyroid hormone-related protein) 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편, IL-1 리셉터 안타고니스트, 항 IL-6 리셉터 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편, 항 RANKL 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편, 및 OCIF (osteoclastogenesis inhibitory factor) 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나를 함유하는 것을 특징으로 하는 골대사 이상의 치료 및/또는 예방용 의약 조성물.
제 27 항 또는 제 28 항에 있어서,
골대사 이상이 골다공증, 관절 류머티즘에 수반되는 골파괴, 암성 고칼슘혈증, 다발성 골수종이나 암의 골전이에 수반되는 골파괴, 거세포종, 골감소증, 치근막염에 의한 이의 상실, 인공 관절 주위의 골융해, 만성 골수염에 있어서의 골파괴, 골파제트병, 신장성 골이영양증, 및 골형성 부전증으로 이루어지는 군에서 선택되는 의약 조성물.
제 29 항에 있어서,
골대사 이상이 골다공증, 관절 류머티즘에 수반되는 골파괴, 또는 암의 골전이에 수반되는 골파괴인 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
제 30 항에 있어서,
골대사 이상이 골다공증인 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
제 31 항에 있어서,
골다공증이 폐경 후 골다공증, 노인성 골다공증, 스테로이드나 면역 억제제 등의 치료용 약제의 사용에 의한 속발성 골다공증, 또는 관절 류머티즘에 수반되는 골다공증인 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
제 1 항 내지 제 25 항에 기재된 항체, 그 항체의 항원 결합 단편, 또는 제 27 항 혹은 제 28 항에 기재된 의약 조성물 중 적어도 어느 하나를 투여하는 것을 특징으로 하는 골대사 이상의 치료 및/또는 예방 방법.
제 1 항 내지 제 25 항에 기재된 항체, 그 항체의 항원 결합 단편, 또는 제 27 항에 기재된 의약 조성물 중 적어도 어느 하나, 그리고, 비스포스포네이트, 활성형 비타민 D₃, 칼시토닌 및 그 유도체, 에스트라디올 등의 호르몬, SERMs (selective estrogen receptor modulators), 이프리플라본, 비타민 K₂ (메나테트레논), 칼슘 제제, PTH (parathyroid hormone), 비스테로이드성 항염증제, 가용성 TNF 리셉터, 항 TNFα 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편, 항 PTHrP (parathyroid hormone-related protein) 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편, IL-1 리셉터 안타고니스트, 항 IL-6 리셉터 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편, 항 RANKL 항체 또는 그 항체의 항원 결합 단편, 및 OCIF (osteoclastogenesis inhibitory factor) 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나를 동시 또는 잇따라 투여하는 것을 특징으로 하는 골대사 이상의 치료 및/또는 예방 방법.
제 33 항 또는 제 34 항에 있어서,
골대사 이상이 골다공증, 관절 류머티즘에 수반되는 골파괴, 또는 암의 골전이에 수반되는 골파괴인 것을 특징으로 하는 치료 및/또는 예방 방법.
제 35 항에 있어서,
골대사 이상이 골다공증인 것을 특징으로 하는 치료 및/또는 예방 방법.
제 36 항에 있어서,
골다공증이 폐경 후 골다공증, 노인성 골다공증, 스테로이드나 면역 억제제 등의 치료용 약제의 사용에 의한 속발성 골다공증, 또는 관절 류머티즘에 수반되는 골다공증인 것을 특징으로 하는 치료 및/또는 예방 방법.
제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 기재된 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드.
제 38 항에 기재된 폴리뉴클레오티드로서, 배열 번호 1 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 1 내지 363 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 및 배열 번호 3 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 1 내지 327 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제 39 항에 있어서,
배열 번호 7 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1398 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 및 배열 번호 9 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 702 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제 38 항에 기재된 폴리뉴클레오티드로서,
(a) 이하의 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드 ：
a1) 배열 번호 11 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ；
a2) 배열 번호 13 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ；
a3) 배열 번호 15 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ；
a4) 배열 번호 17 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ；
a5) 배열 번호 19 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ；
a6) 배열 번호 21 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ；
a7) 배열 번호 37 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ；
a8) 배열 번호 39 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ；
a9) 배열 번호 41 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ；
a10) 배열 번호 43 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ；
a11) a1) 내지 a10) 에서 선택되는 어느 하나의 뉴클레오티드 배열과 적어도 95 ％ 의 상동성을 가지는 아미노산 배열 ；
a12) a1) 내지 a10) 에서 선택되는 어느 하나의 뉴클레오티드 배열과 적어도 99 ％ 의 상동성을 가지는 아미노산 배열 ；
a13) a1) 내지 a10) 에서 선택되는 어느 하나의 뉴클레오티드 배열과 상보적인 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건으로 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드가 보유하는 뉴클레오티드 배열 ；
a14) a1) 내지 a10) 에서 선택되는 어느 하나의 뉴클레오티드 배열에 1 내지 수 개의 아미노산 잔기가 치환, 결실 또는 부가된 뉴클레오티드 배열 ； 및
(b) 이하의 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드 ：
b1) 배열 번호 23 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 387 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ；
b2) 배열 번호 25 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 387 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ；
b3) 배열 번호 27 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 387 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ；
b4) 배열 번호 28 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 387 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ；
b5) 배열 번호 45 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 387 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ；
b6) 배열 번호 47 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 387 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ；
b7) b1) 내지 b6) 에서 선택되는 어느 하나의 뉴클레오티드 배열과 적어도 95 ％ 의 상동성을 가지는 아미노산 배열 ；
b8) b1) 내지 b6) 에서 선택되는 어느 하나의 뉴클레오티드 배열과 적어도 99 ％ 의 상동성을 가지는 아미노산 배열 ；
b9) b1) 내지 b6) 에서 선택되는 어느 하나의 뉴클레오티드 배열과 상보적인 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건으로 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드가 보유하는 뉴클레오티드 배열 ；
b10) b1) 내지 b6) 에서 선택되는 어느 하나의 뉴클레오티드 배열에 1 내지 수 개의 뉴클레오티드가 치환, 결실 또는 부가된 뉴클레오티드 배열
을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제 41 항에 있어서,
배열 번호 13 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 23 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 387 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제 41 항에 있어서,
배열 번호 13 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 25 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 387 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제 41 항에 있어서,
배열 번호 13 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 27 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 387 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제 41 항에 있어서,
배열 번호 37 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 47 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 387 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제 41 항에 있어서,
배열 번호 39 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 45 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 387 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제 41 항에 있어서,
배열 번호 41 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 23 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 387 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제 41 항에 있어서,
배열 번호 43 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 23 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 387 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제 41 항에 있어서,
배열 번호 13 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1398 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 23 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 702 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제 41 항에 있어서,
배열 번호 13 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1398 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 25 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 702 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제 41 항에 있어서,
배열 번호 13 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1398 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 27 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 702 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제 41 항에 있어서,
배열 번호 37 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1398 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 47 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 702 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제 41 항에 있어서,
배열 번호 39 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1398 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 45 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 702 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제 41 항에 있어서,
배열 번호 41 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1398 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 23 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 702 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제 41 항에 있어서,
배열 번호 43 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1398 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 23 에 나타나는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 702 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제 38 항 내지 제 55 항에 기재된 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
제 38 항 내지 제 55 항에 기재된 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질 전환 숙주 세포.
제 56 항에 기재된 벡터를 포함하는 형질 전환 숙주 세포.
제 57 항 또는 제 58 항에 기재된 숙주 세포를 배양하고, 배양 산물로부터 항체를 정제하는 공정을 포함하는 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 기재된 항체의 생산 방법.