KR101534884B1 - 파골 세포 관련 단백질 Ｓｉｇｌｅｃ-15 를 표적으로 한 항체 - Google Patents

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Abstract

파골 세포에서 강하게 발현되는 유전자를 사용한 골대사 이상의 검출 방법, 골대사 이상 치료 및/또는 예방 효과를 갖는 화합물의 스크리닝법, 및 골대사 이상 치료 및/또는 예방용 의약 조성물을 제공하는 것. 인간 Siglec-15 유전자의 발현을 지표로 한 골대사 이상의 검출 방법, 및 인간 Siglec-15 를 특이적으로 인식하여, 파골 세포의 형성을 억제하는 활성을 갖는 항체를 함유하는 의약 조성물의 제공 등.

Description

파골 세포 관련 단백질 Ｓｉｇｌｅｃ-15 를 표적으로 한 항체 {ANTIBODY TARGETING OSTEOCLAST-RELATED PROTEIN Siglec-15}
본 발명은 골대사 이상의 치료 및/또는 예방약으로서 유용한 물질, 골대사 이상의 치료 및/또는 예방약으로서 유용한 물질의 스크리닝 방법, 골대사 이상의 검사 방법 그리고 골대사 이상의 치료 및/또는 예방 방법에 관한 것이다.
뼈는, 스스로의 형태 변화나 혈중 칼슘 농도 유지를 위해, 항상 형성과 흡수를 반복하여 재구축을 실시하는 동적인 기관으로서 알려져 있다. 정상적인 뼈에서는 골아 세포에 의한 골형성과 파골 세포에 의한 골흡수는 평형 관계에 있어, 골량 (骨量) 은 일정하게 유지되어 있다. 한편, 골형성과 골흡수의 평형 관계가 무너지면, 골다공증 등의 골대사 이상이 된다 (Endocrinological Review, (1992) 13, p66-80, Principles of Bone Biology, Academic Press, New York, (1996) p87-102).
골대사를 조절하는 인자로는, 전신성의 호르몬이나 국소성의 사이토카인이 다수 보고되어 있고, 그들 인자의 공동 작용에 의해 뼈의 형성과 유지가 이루어지고 있다 (Endocrinological Review, (1992) 13, p66-80, Endocrinological Review), (1996) 17, p308-332). 가령에 의한 골조직의 변화로는, 골다공증의 발증이 널리 알려져 있지만, 그 발증 기구는 성 호르몬의 분비 저하나 그 리셉터 이상, 뼈 국소에 있어서의 사이토카인 발현의 변동, 노화 유전자의 발현, 파골 세포나 골아 세포의 분화 또는 기능 부전 등 여러 갈래에 걸쳐 있어, 가령에 의한 단순한 생리 현상으로서 이해하는 것은 곤란하다. 원발성 골다공증은 에스트로겐의 분비 저하에 의한 폐경 후 골다공증과 가령에 의한 노인성 골다공증으로 크게 구별되는데, 그 발증 기구의 해명과 치료약 개발을 위해서는, 골흡수와 골형성의 조절 기구에 대한 기초적 연구의 진전이 필수적이다.
파골 세포는, 조혈간세포에서 유래하는 다핵의 세포로서, 뼈와의 접착면에 염소 이온과 수소 이온을 방출함으로써, 세포와 뼈의 접착면의 간극을 산성화시킴과 함께 산성 프로테아제인 카텝신 K 등을 분비한다 (American Journal of Physiology, (1991) 260, C1315-C1324). 그 결과, 인산칼슘의 분해, 산성 프로테아제의 활성화와 골기질 단백질의 분해가 야기되어, 골흡수가 진행된다.
파골 세포의 전구 세포는 골표면의 골아 세포/스트로마 세포의 세포막 상에 발현되는 RANKL (Receptor activator of NF-κB ligand) 의 자극을 받아, 파골 세포로 분화됨이 밝혀졌다 (Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America, (1998) 95, p3597-3602, Cell, (1998) 93, p165-176). RANKL 은 골아 세포/스트로마 세포가 생성하는 막 단백질로서, 그 발현은 골흡수 인자에 의해 조절되는 것, 및 RANKL 은 파골 세포 전구 세포에서 다핵 파골 세포로의 분화를 유도하는 것 등이 밝혀졌다 (Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America, (1998) 95, p3597-3602, Journal of Bone and Mineral Research, (1998) 23, S222). 또한, RANKL 을 녹아웃시킨 마우스가, 대리석골병형 병태를 발증시키는 것을 알아내어, RANKL 이 생리적인 파골 세포 분화 유도 인자임이 증명되었다 (Nature, (1999) 397, p315-323).
골대사 질환의 치료나 치료 기간의 단축을 도모하는 의약품으로서, 비스포스포네이트, 활성형 비타민 D3, 칼시토닌 및 그 유도체, 에스트라디올 등의 호르몬 제제, SERMs (Selective estrogen receptor modulators), 이프리플라본, 비타민 K2 (메나테트레논), PTH 제제 및 칼슘 제제 등이 사용되고 있다. 그러나, 이들 약제는 치료 결과에 있어서 반드시 만족할 수 있는 것이 아니어서, 보다 치료 효과가 높은 약제의 개발이 요망되었다.
면역계 세포의 세포막 상은 시알산 등의 다양한 당사슬에 의해 고도로 덮여져 있고, 다양한 당사슬 결합 단백질에 의해 인식되고 있다. 시알산 결합 면역 글로불린 유사 렉틴 (Sialic-acid-binding immunoglobulin-like lectins, 이하, 「Siglecs」라고 한다) 은, 시알산 함유 당사슬을 인식하여 결합시키는 Ⅰ 형 막 단백질 패밀리이다. Siglecs 는 면역계 세포의 세포막 상에서 많이 발현되어 있고, 동일하게 면역계 세포의 세포막 상에 존재하는 시알산을 인식하여 세포간 상호 작용이나 세포 기능을 조절하고, 면역 응답에 관여하고 있는 것으로 생각되지만 (Nature Reviews Immunology, (2007) 7, p255-266), 생리적 기능이 밝혀지지 않은 Siglecs 분자도 많다. Siglec-15 (Sialic-acid binding immunoglobulin-like lectin 15) 는, Siglecs 에 속하는 것이 새롭게 보고된 분자로서 (Glycobiology, (2007) 17, p838-846), CD33L3 (CD33 molecule-like 3) 으로 불리는 분자와 동일하다. 이 분자는 어류에서 인간까지 진화적인 보존도가 높고, 인간 비장 및 림프절에 있어서, 수상 (樹狀) 세포/매크로파지계의 세포에 강하게 발현됨이 밝혀졌다. 또한 시알산 프로브를 사용한 결합 시험의 결과, 인간 Siglec-15 는 Neu5Ac
Figure 112010014520647-pct00001
2-6GalNAc 와, 마우스 Siglec-15 는 추가로 Neu5Ac
Figure 112010014520647-pct00002
2-3Galβ1-4Glc 와 결합되는 것 등도 밝혀졌다 (Glycobiology, (2007) 17, p838-846). 최근까지 Siglec-15 의 생리적 역할은 명확하지는 않았지만, 파골 세포의 분화, 성숙에 수반되어 Siglec-15 의 발현이 항진되고, RNA 간섭에 의해 Siglec-15 의 발현을 저하시킴으로써 파골 세포의 분화가 억제됨이 보고되었다 (국제공개 팸플릿 WO2007/093042). 그러나, 항 Siglec-15 항체가 파골 세포 분화에 미치는 작용에 대해서는 지금까지 밝혀지지 않았다.
본 발명의 목적은, 골다공증, 관절 류머티즘, 암의 골전이 등에 보여지는, 골파괴 등의 다양한 골대사 이상시에 특이적으로 발현되는 유전자, 파골 세포의 분화 성숙과 활성을 저해하는 물질, 골대사 이상의 치료 및/또는 예방제를 스크리닝하기 위한 신규 방법, 및 파골 세포의 분화 성숙과 활성을 저해하는 물질, 골대사 이상의 치료 및/또는 예방제를 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은, 골대사 이상의 치료 및/또는 예방 효과를 갖는 물질을 탐색할 목적으로, 파골 세포의 분화, 성숙 및 활성화의 기구 (메커니즘) 의 해명을 목표로 한 연구를 실시한 결과, 파골 세포의 분화, 성숙에 수반되어 Siglec-15 유전자의 발현이 상승하는 것을 알아내고, Siglec-15 와 특이적으로 결합되는 항체에 의해 파골 세포의 분화가 억제되는 것을 알아내어, 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명은 이하의 발명을 포함한다.
(1) 이하의 (a) 내지 (i) 중 어느 하나에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 1 개 또는 2 개 이상의 폴리펩티드를 특이적으로 인식하여, 파골 세포의 형성 및/또는 파골 세포에 의한 골흡수를 억제하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편 :
(a) 배열표의 배열 번호 2 에 나타내어지는 아미노산 배열 ;
(b) 배열표의 배열 번호 2 에 나타내어지는 아미노산 배열의 21 번째 내지 328 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;
(c) 배열표의 배열 번호 2 에 나타내어지는 아미노산 배열의 1 번째 내지 260 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;
(d) 배열표의 배열 번호 2 에 나타내어지는 아미노산 배열의 21 번째 내지 260 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;
(e) 배열표의 배열 번호 4 에 나타내어지는 아미노산 배열 ;
(f) 배열표의 배열 번호 4 에 나타내어지는 아미노산 배열의 21 번째 내지 341 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;
(g) 배열표의 배열 번호 4 에 나타내어지는 아미노산 배열의 1 번째 내지 258 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;
(h) 배열표의 배열 번호 4 에 나타내어지는 아미노산 배열의 21 번째 내지 258 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;
(i) (a) 내지 (h) 에 기재된 아미노산 배열에 1 내지 수 아미노산 잔기의 치환, 결실 또는 부가를 수반하는 아미노산 배열.
(2) 이하의 (j) 내지 (n) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 배열로 코드되는 아미노산 배열로 이루어지는 1 개 또는 2 개 이상의 폴리펩티드를 특이적으로 인식하여, 파골 세포의 형성 및/또는 파골 세포에 의한 골흡수를 억제하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편 :
(j) 배열 번호 1 에 나타내어지는 뉴클레오티드 배열 ;
(k) 배열 번호 3 에 나타내어지는 뉴클레오티드 배열 ;
(l) 배열 번호 19 에 나타내어지는 뉴클레오티드 배열 ;
(m) 배열 번호 43 에 나타내어지는 뉴클레오티드 배열 ;
(n) (j) 내지 (m) 에 기재된 뉴클레오티드 배열과 상보적인 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 가혹한 조건에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드가 보유하는 뉴클레오티드 배열.
(3) 파골 세포의 세포 융합 과정을 억제하는 (1) 또는 (2) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
(4) TNF
Figure 112010014520647-pct00003
에 의해 유도되는 파골 세포의 형성을 억제하는 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
(5) 30 ㎍/㎖ 이하의 농도에 있어서, in vitro 에서의 파골 세포의 형성을 억제하는 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
(6) 3 ㎍/㎖ 이하의 농도에 있어서, in vitro 에서의 파골 세포의 형성을 억제하는 (5) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
(7) 1 ㎍/㎖ 이하의 농도에 있어서, in vitro 에서의 파골 세포의 형성을 억제하는 (6) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
(8) 63 ng/㎖ 내지 1 ㎍/㎖ 의 농도에 있어서, in vitro 에서의 파골 세포의 형성을 억제하는 (7) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
(9) 파골 세포에 의한 골흡수를 억제하는 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
(10) 3 ㎍/㎖ 이하의 농도에 있어서, in vitro 에서의 파골 세포에 의한 골흡수를 억제하는 (9) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
(11) 0.3 ㎍/㎖ 내지 3 ㎍/㎖ 의 농도에 있어서, in vitro 에서의 파골 세포에 의한 골흡수를 억제하는 (10) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
(12) 이하의 공정 1) 및 2) 를 포함하는 방법에 의해 얻어지는 (1) 내지 (11) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편 :
1) 이하의 (a) 내지 (i) 중 어느 하나에 기재된 아미노산 배열 :
(a) 배열표의 배열 번호 2 에 나타내어지는 아미노산 배열 ;
(b) 배열표의 배열 번호 2 에 나타내어지는 아미노산 배열의 21 번째 내지 328 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;
(c) 배열표의 배열 번호 2 에 나타내어지는 아미노산 배열의 1 번째 내지 260 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;
(d) 배열표의 배열 번호 2 에 나타내어지는 아미노산 배열의 21 번째 내지 260 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;
(e) 배열표의 배열 번호 4 에 나타내어지는 아미노산 배열 ;
(f) 배열표의 배열 번호 4 에 나타내어지는 아미노산 배열의 21 번째 내지 341 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;
(g) 배열표의 배열 번호 4 에 나타내어지는 아미노산 배열의 1 번째 내지 258 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;
(h) 배열표의 배열 번호 4 에 나타내어지는 아미노산 배열의 21 번째 내지 258 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;
(i) (a) 내지 (h) 에 기재된 아미노산 배열에 1 내지 수 아미노산 잔기의 치환, 결실 또는 부가를 수반하는 아미노산 배열;
로 이루어지는 1 개 또는 2 개 이상의 폴리펩티드를 특이적으로 인식하는 항체를 제조하는 공정 ;
2) 파골 세포 형성 억제 활성 및/또는 골흡수 억제 활성을 나타내는 항체를 선별하는 공정.
(13) 이하의 공정 1) 및 2) 를 포함하는 방법에 의해 얻어지는 (1) 내지 (11) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편 :
1) 이하의 (j) 내지 (n) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 배열로 코드되는 아미노산 배열 :
(j) 배열 번호 1 에 나타내어지는 뉴클레오티드 배열 ;
(k) 배열 번호 3 에 나타내어지는 뉴클레오티드 배열 ;
(l) 배열 번호 19 에 나타내어지는 뉴클레오티드 배열 ;
(m) 배열 번호 43 에 나타내어지는 뉴클레오티드 배열 ;
(n) (j) 내지 (m) 에 기재된 뉴클레오티드 배열과 상보적인 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 가혹한 조건에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드가 보유하는 뉴클레오티드 배열 ;
로 이루어지는 1 개 또는 2 개 이상의 폴리펩티드를 특이적으로 인식하는 항체를 제조하는 공정 ;
2) 파골 세포 형성 억제 활성 및/또는 골흡수 억제 활성을 나타내는 항체를 선별하는 공정.
(14) 모노클로널 항체인 것을 특징으로 하는 (1) 내지 (13) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
(15) 하이브리도마 #32A1 (FERM BP-10999) 이 생성하는 항체와 동일한 에피토프 특이성을 갖는 것을 특징으로 하는 (14) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
(16) 하이브리도마 #32A1 (FERM BP-10999) 이 생성하는 항체와 경합하는 것을 특징으로 하는 (14) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
(17) 하이브리도마 #32A1 (FERM BP-10999) 이 생성하는 항체인 것을 특징으로 하는 (14) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
(18) 하이브리도마 #41B1 (FERM BP-11000) 이 생성하는 항체와 동일한 에피토프 특이성을 갖는 것을 특징으로 하는 (14) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
(19) 하이브리도마 #41B1 (FERM BP-11000) 이 생성하는 항체와 경합하는 것을 특징으로 하는 (14) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
(20) 하이브리도마 #41B1 (FERM BP-11000) 이 생성하는 항체인 것을 특징으로 하는 (14) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
(21) 키메라 항체인 것을 특징으로 하는 (1) 내지 (20) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
(22) 인간화되어 있는 것을 특징으로 하는 (1) 내지 (21) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
(23) 인간 항체인 것을 특징으로 하는 (1) 내지 (16), (18) 또는 (19) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
(24) IgG 항체인 것을 특징으로 하는 (1) 내지 (23) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
(25) Fab, F(ab')2, Fab' 및 Fv 로 이루어지는 군에서 선택되는 (1) 내지 (24) 에 기재된 항체의 기능성 단편.
(26) scFv 인 것을 특징으로 하는 (1) 내지 (16), (18) 또는 (19) 중 어느 하나에 기재된 항체.
(27) (1) 내지 (26) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편 중 적어도 어느 1 개를 함유하는 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
(28) 골대사 이상의 치료 및/또는 예방제인 것을 특징으로 하는 (27) 에 기재된 의약 조성물.
(29) (1) 내지 (26) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편 중 적어도 어느 1 개, 그리고 비스포스포네이트, 활성형 비타민 D3, 칼시토닌 및 그 유도체, 에스트라디올 등의 호르몬 제제, SERMs (selective estrogen receptor modulators), 이프리플라본, 비타민 K2 (메나테트레논), 칼슘 제제, PTH (parathyroid hormone) 제제, 비스테로이드성 항염증제, 가용성 TNF 리셉터 제제, 항 TNF
Figure 112010014520647-pct00004
항체 또는 그 항체의 기능성 단편, 항 PTHrP (parathyroid hormone-related protein) 항체 또는 그 항체의 기능성 단편, IL-1 리셉터 안타고니스트, 항 IL-6 리셉터 항체 또는 그 항체의 기능성 단편, 항 RANKL 항체, 또는 그 항체의 기능성 단편 및 OCIF (osteoclastogenesis inhibitory factor) 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 어느 1 개를 함유하는 것을 특징으로 하는 골대사 이상의 치료 및/또는 예방용 의약 조성물.
(30) 골대사 이상이 골다공증, 관절 류머티즘에 수반되는 골파괴, 암성 고칼슘혈증, 다발성 골수종이나 암의 골전이에 수반되는 골파괴, 거세포종, 치근막염에 의한 치아의 상실, 인공 관절 주위의 골융해, 만성 골수염에 있어서의 골파괴, 골페이젯병, 신성 (腎性) 골이영양증, 및 골형성 부전증으로 이루어지는 군에서 선택되는 (28) 또는 (29) 에 기재된 의약 조성물.
(31) 골대사 이상이 골다공증, 관절 류머티즘에 수반되는 골파괴, 또는 암의 골전이에 수반되는 골파괴인 것을 특징으로 하는 (30) 에 기재된 의약 조성물.
(32) 골다공증이 폐경 후 골다공증, 노인성 골다공증, 스테로이드나 면역 억제제 등의 치료용 약제의 사용에 의한 속발성 골다공증, 또는 관절 류머티즘에 수반되는 골다공증인 것을 특징으로 하는 (31) 에 기재된 의약 조성물.
(33) (1) 내지 (26) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편 중 적어도 어느 1 개를 투여하는 것을 특징으로 하는 골대사 이상의 치료 및/또는 예방 방법.
(34) (1) 내지 (26) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편 중 적어도 어느 1 개, 그리고 비스포스포네이트, 활성형 비타민 D3, 칼시토닌 및 그 유도체, 에스트라디올 등의 호르몬 제제, SERMs (selective estrogen receptor modulators), 이프리플라본, 비타민 K2 (메나테트레논), 칼슘 제제, PTH (parathyroid hormone) 제제, 비스테로이드성 항염증제, 가용성 TNF 리셉터 제제, 항 TNF
Figure 112010014520647-pct00005
항체 또는 그 항체의 기능성 단편, 항 PTHrP (parathyroid hormone-related protein) 항체 또는 그 항체의 기능성 단편, IL-1 리셉터 안타고니스트, 항 IL-6 리셉터 항체 또는 그 항체의 기능성 단편, 항 RANKL 항체 또는 그 항체의 기능성 단편, 및 OCIF (osteoclastogenesis inhibitory factor) 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 어느 1 개를 동시 또는 연속적으로 투여하는 것을 특징으로 하는 골대사 이상의 치료 및/또는 예방 방법.
(35) 골대사 이상이 골다공증, 관절 류머티즘에 수반되는 골파괴, 또는 암의 골전이에 수반되는 골파괴인 것을 특징으로 하는 (33) 또는 (34) 에 기재된 치료 및/또는 예방 방법.
(36) 골다공증이 폐경 후 골다공증, 노인성 골다공증, 스테로이드나 면역 억제제 등의 치료용 약제의 사용에 의한 속발성 골다공증, 또는 관절 류머티즘에 수반되는 골다공증인 것을 특징으로 하는 (35) 에 기재된 치료 및/또는 예방 방법.
(37) 하이브리도마 #32A1 (FERM BP-10999).
(38) 하이브리도마 #41B1 (FERM BP-11000).
본 발명에 의하면, 파골 세포의 분화 성숙과 활성의 저해를 작용 기전으로 하는 골대사 이상의 치료제 및/또는 예방제를 얻을 수 있다.
도 1 은 인간 거세포종 조직에 있어서의 RANK, RANKL, 카텝신 K 및 TRAP 유전자의 발현 프로파일 해석을 나타낸 그래프이다.
도 2 는 인간 거세포종 조직에 있어서의 Siglec-15 유전자의 발현 프로파일 해석을 나타낸 그래프이다.
도 3 은 RAW264.7 또는 마우스 골수 세포로부터 파골 세포 분화를 유도하였을 때의 Siglec-15 유전자 발현량의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 4 는 RAW264.7 세포의 파골 세포 분화에 수반되는 카텝신 K 및 TRAP 유전자의 발현을 나타낸 그래프이다.
도 5 는 RAW264.7 세포의 파골 세포 분화에 수반되는 Siglec-15 유전자의 발현을 나타낸 그래프이다.
도 6 은 293F 세포에 의한 마우스 Siglec-15-His 발현의 배양 시간에 따른 변동을, SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동과 항 6 His-HRP 항체를 사용한 웨스턴 블로팅으로 검출한 결과이다.
도 7 은 293F 세포에 의한 마우스 Siglec-15-Fc 발현의 배양 시간에 따른 변동을, SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동과 항인간 IgG Fc-HRP 항체를 사용한 웨스턴 블로팅으로 검출한 결과이다.
도 8 은 HisTrap HP 칼럼 크로마토와 Resource Q 칼럼 크로마토로 정제한 마우스 Siglec-15-His 의 순도를 SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동과 은 염색으로 평가한 결과이다.
도 9 는 HisTrap HP 칼럼 크로마토와 Resource Q 칼럼 크로마토로 정제한 마우스 Siglec-15-His 의 거동을 SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동과 항 V5-HRP 항체를 사용한 웨스턴 블로팅으로 검출한 결과이다.
도 10 은 HiTrap protein A 칼럼 크로마토로 정제한 마우스 Siglec-15-Fc 의 순도를 SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동과 은 염색으로 평가한 결과이다.
도 11 은 정제된 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체가 Siglec-15-Fc 뿐만 아니라 Siglec-15-His 에도 결합되는 것을, SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동과 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체와 항토끼 IgG-HRP 항체를 사용한 웨스턴 블로팅으로 확인한 결과이다.
도 12 는 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체를 마우스 Siglec-15-Fc 를 고상화시킨 어피니티 칼럼으로 정제한 크로마토그램이다.
도 13 은 마우스 Siglec-15-Fc 고상화 어피니티 칼럼 크로마토로 정제한 마우스 Siglec-15-Fc 의 순도를 SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동과 은 염색으로 평가한 결과이다.
도 14 는 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체를 Superose 6·겔 여과 칼럼으로 정제한 크로마토그램이다.
도 15 는 어피니티 정제된 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체의 첨가에 의한, 마우스 골수 비부착 세포의 파골 세포 분화 (RANKL 자극) 에 대한 영향을 시험한 결과이다 (N ＝ 3).
도 16 은 겔 여과 정제된 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체의 첨가에 의한, 마우스 골수 비부착 세포의 파골 세포 분화 (RANKL 자극) 에 대한 영향을 TRAP 효소 활성으로 시험한 결과이다 (N ＝ 3).
도 17 은 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체의 첨가에 의한 마우스 골수 비부착 세포의 파골 세포 분화 (RANKL 자극) 억제 항원에 의한 중화를 TRAP 효소 활성으로 시험한 결과이다 (N ＝ 3).
도 18 은 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체의 첨가에 의한, 마우스 골수 비부착 세포의 파골 세포 분화 (TNF
Figure 112010014520647-pct00006
자극) 에 대한 영향을 TRAP 효소 활성으로 시험한 결과이다 (N ＝ 3).
도 19 는 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체의 첨가에 의한, 마우스 골수 비부착 세포의 파골 세포 분화 (TNF
Figure 112010014520647-pct00007
자극) 에 대한 영향을 TRAP 염색으로 평가한 현미경 사진이다.
도 20 은 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체의 첨가에 의한, 마우스 골수 세포로부터의 파골 세포 분화 (활성형 비타민 D3 자극) 억제를 TRAP 효소 활성으로 나타낸 그래프이다 (N ＝ 6).
도 21 은 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체의 첨가에 의한, 마우스 골수 세포로부터의 거대 파골 세포 형성 (활성형 비타민 D3 자극) 억제를 TRAP 염색으로 나타낸 현미경 사진이다.
도 22 는 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체의 첨가에 의한, 마우스 골수 세포로부터의 거대 파골 세포 형성 (인간 RANKL 자극) 억제를 TRAP 염색으로 나타낸 현미경 사진이다.
도 23 은 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체의 첨가에 의한, RAW264.7 세포로부터의 거대 파골 세포 형성 (인간 RANKL 자극) 억제 및 가용형 Siglec-15 에 의한 그 억제 작용의 해제를 TRAP 염색으로 나타낸 현미경 사진이다.
도 24 는 마우스 Siglec-15-Fc 고상화 플레이트에 대한 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로널 항체의 결합을 ELISA 법으로 시험한 결과이다. 심볼 (◆) 는 #1A1 항체를, 심볼 (■) 는 #3A1 항체를, 심볼 (▲) 는 #8A1 항체를, 심볼 (×) 는 #24A1 항체를, 심볼 (●) 는 #32A1 항체를, 심볼 (○) 는 #34A1 항체를, 심볼 (＋) 는 #39A1 항체를, 심볼 (-) 는 #40A1 항체를, 심볼 (－) 는 #41B1 항체를, 심볼 (◇) 는 #61A1 항체를, 심볼 (□) 는 컨트롤 IgG 를 각각 나타내고 있다.
도 25 는 항마우스 Siglec-15 모노클로널 항체 (#3A1, #8A1 또는 #32A1) 의 첨가에 의한, 마우스 골수 비부착 세포의 파골 세포 분화 (RANKL 자극) 에 대한 영향을 시험한 결과이다. 또한, 도면 중의 래트 컨트롤 IgG 는 도 25 및 26 에서 공통되는 음성 컨트롤이다.
도 26 은 항마우스 Siglec-15 모노클로널 항체 (#34A1, #39A1 또는 #40A1) 의 첨가에 의한, 마우스 골수 비부착 세포의 파골 세포 분화 (RANKL 자극) 에 대한 영향을 시험한 결과이다. 또한, 도면 중의 토끼 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체 No.3 은 도 25 및 26 에서 공통되는 양성 컨트롤이다.
도 27 은 정상 인간 파골 전구 세포로부터 파골 세포 분화를 유도하였을 때의 카텝신 K, TRAP 및 Siglec-15 유전자의 발현 변화를 나타낸 그래프이다.
도 28 은 HisTrap HP 칼럼 크로마토와 Resource Q 칼럼 크로마토로 정제한 인간 Siglec-15-His 의 순도를 SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동으로 검토한 결과이다.
도 29 는 Protein A 칼럼 크로마토로 정제한 인간 Siglec-15-Fc 의 순도를 SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동으로 검토한 결과이다.
도 30 은 항인간 Siglec-15 폴리클로널 항체를 인간 Siglec-15-Fc 를 고상화시킨 어피니티 칼럼으로 정제한 크로마토그램이다.
도 31 은 항인간 Siglec-15 폴리클로널 항체의 첨가에 의한, 정상 인간 파골 전구 세포로부터의 거대 파골 세포 형성 억제를 TRAP 염색으로 나타낸 현미경 사진이다.
도 32 는 항인간 Siglec-15 폴리클로널 항체의 첨가에 의한, 정상 인간 파골 전구 세포로부터의 다핵 파골 세포 형성에 대한 영향을, 5 개 이상의 핵을 갖는 TRAP 양성 세포를 도립 (倒立) 현미경으로 계수함으로써 평가한 결과이다.
도 33 은 인간 Siglec-15-Fc 고상화 플레이트에 대한 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로널 항체의 결합을 ELISA 법으로 시험한 결과이다. 심볼 (◆) 는 #1A1 항체를, 심볼 (■) 는 #3A1 항체를, 심볼 (▲) 는 #8A1 항체를, 심볼 (×) 는 #24A1 항체를, 심볼 (●) 는 #32A1 항체를, 심볼 (○) 는 #34A1 항체를, 심볼 (＋) 는 #39A1 항체를, 심볼 (-) 는 #40A1 항체를, 심볼 (－) 는 #41B1 항체를, 심볼 (◇) 는 #61A1 항체를, 심볼 (□) 는 컨트롤 IgG 를 각각 나타내고 있다.
도 34 는 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로널 항체의 첨가에 의한, 정상 인간 파골 전구 세포로부터의 거대 파골 세포 형성 억제를 TRAP 염색으로 나타낸 현미경 사진이다.
도 35 는 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로널 항체 (#32A1 항체) 의 첨가에 의한, 정상 인간 파골 전구 세포로부터의 거대 파골 세포 형성 억제를 TRAP 염색으로 나타낸 현미경 사진이다.
도 36 은 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로널 항체 (#32A1 항체) 의 첨가에 의한, 정상 인간 파골 세포의 골흡수 활성 억제를 나타낸 그래프이다 (N ＝ 6).
본 명세서 중에 있어서, 「유전자」라는 말에는, DNA 뿐만 아니라 mRNA, cDNA 및 cRNA 도 포함되는 것으로 한다.
본 명세서 중에 있어서, 「폴리뉴클레오티드」라는 말은 핵산과 동일한 의미로 사용하고 있고, DNA, RNA, 프로브, 올리고뉴클레오티드 및 프라이머도 포함되어 있다.
본 명세서 중에 있어서는, 「폴리펩티드」와「단백질」은 구별하지 않고 사용하고 있다.
본 명세서 중에 있어서, 「RNA 획분」이란, RNA 를 함유하고 있는 획분을 말한다.
본 명세서 중에 있어서, 「세포」에는, 동물 개체 내의 세포, 배양 세포도 포함하고 있다.
본 명세서 중에 있어서, 「Siglec-15」는, Siglec-15 단백질과 동일한 의미로 사용하고 있다.
본 명세서 중에 있어서, 「파골 세포의 형성」은, 「파골 세포의 분화」또는 「파골 세포의 성숙」과 동일한 의미로 사용하고 있다.
본 명세서 중에 있어서의 「항체의 기능성 단편」이란, 항원과의 결합 활성을 갖는 항체의 부분 단편을 의미하고 있으며, Fab, F(ab')2, scFv 등을 포함한다. 또한, F(ab')2 를 환원 조건하에서 처리한 항체의 가변 영역의 1 가의 단편인 Fab' 도 항체의 기능성 단편에 포함된다. 단, 항원과의 결합능을 갖고 있는 한 이들 분자에 한정되지 않는다. 또한, 이들 기능성 단편에는, 항체 단백질의 전장 (全長) 분자를 적당한 효소로 처리한 것뿐만 아니라, 유전자 공학적으로 개변된 항체 유전자를 사용하여 적당한 숙주 세포에 있어서 생성된 단백질도 포함된다.
본 명세서에 있어서의, 「에피토프」란, 특정한 항 Siglec-15 항체가 결합되는 Siglec-15 의 부분 펩티드를 의미한다. 상기의 Siglec-15 의 부분 펩티드인 에피토프는, 면역 어세이법 등 당업자에게 잘 알려져 있는 방법에 의해 결정할 수 있는데, 예를 들어 이하의 방법에 의해 실시할 수 있다. Siglec-15 의 다양한 부분 구조를 제조한다. 부분 구조의 제조시에는, 공지된 올리고펩티드 합성 기술을 사용할 수 있다. 예를 들어, Siglec-15 의 C 말단 또는 N 말단으로부터 적당한 길이로 순차적으로 짧게 한 일련의 폴리펩티드를 당업자에게 주지된 유전자 재조합 기술을 사용하여 제조한 후, 그것들에 대한 항체의 반응성을 검토하고, 대략적인 인식 부위를 결정한 후, 더욱 짧은 펩티드를 합성하고 그들의 펩티드와의 반응성을 검토함으로써, 에피토프를 결정할 수 있다. 제 1 항 Siglec-15 항체가 결합되는 부분 펩티드에 제 2 항 Siglec-15 항체가 결합되면, 제 1 항체와 제 2 항체가 공통의 에피토프를 갖는 것으로 판정할 수 있다. 또한, 제 1 항 Siglec-15 항체의 Siglec-15 에 대한 결합에 대하여 제 2 항 Siglec-15 항체가 경합하는 (즉, 제 2 항체가 제 1 항체와 Siglec-15 의 결합을 방해하는) 것을 확인함으로써, 구체적인 에피토프의 배열이 결정되어 있지 않아도, 제 1 항체와 제 2 항체가 공통의 에피토프를 갖는 것으로 판정할 수 있다. 또, 제 1 항체와 제 2 항체가 공통의 에피토프에 결합되고, 또한 제 1 항체가 항원의 중화 활성 등의 특수한 효과를 갖는 경우, 제 2 항체도 동일한 활성을 갖는 것을 기대할 수 있다.
본 발명에 있어서, 「가혹한 조건하에서 하이브리다이즈한다」란, 시판되는 하이브리다이제이션 용액 ExpressHyb Hybridization Solution (클론테크사 제조) 중, 68 ℃ 에서 하이브리다이즈하는 것, 또는 DNA 를 고정시킨 필터를 사용하여 0.7 - 1.0 M 의 NaCl 존재하 68 ℃ 에서 하이브리다이제이션을 실시한 후, 0.1 - 2 배 농도의 SSC 용액 (1 배 농도 SSC 란 150 mM NaCl, 15 mM 시트르산나트륨으로 이루어진다) 을 사용하여 68 ℃ 에서 세정함으로써 동정할 수 있는 조건 또는 그것과 동등한 조건에서 하이브리다이즈하는 것을 말한다.
1. Siglec-15
본 발명자들은, Siglec-15 유전자는 거세포종에 있어서 특이적으로 발현되어 있는 것을 알아냈다. 또한, 본 발명자들은 Siglec-15 유전자는 단구 (單球) 유래 세포주가 파골 세포로 분화될 때에 발현량이 증가하는 것도 알아냈다.
본 발명에서 사용하는 Siglec-15 는 인간, 비인간 포유 동물 (예를 들어, 모르모트, 래트, 마우스, 토끼, 돼지, 양, 소, 원숭이 등) 또는 닭의 단구 세포 또는 골수 세포로부터 직접 정제하여 사용하거나, 또는 상기 세포의 세포막 획분을 조제하여 사용할 수 있고, 또한 Siglec-15 를 in vitro 에서 합성하거나, 또는 유전자 조작에 의해 숙주 세포에 생성시킴으로써 얻을 수 있다. 유전자 조작에서는, 구체적으로는, Siglec-15 cDNA 를 발현시킬 수 있는 벡터에 삽입한 후, 전사와 번역에 필요한 효소, 기질 및 에너지 물질을 함유하는 용액 중에서 합성하거나, 또는 기타 원핵 생물 또는 진핵 생물의 숙주 세포를 형질 전환시킴으로써 Siglec-15 를 발현시킴으로써, 그 단백질을 얻을 수 있다.
인간 Siglec-15 의 cDNA 의 뉴클레오티드 배열은, GenBank 에 액세션 번호 : NM_213602 로 등록되어, 배열표의 배열 번호 1 에도 나타나 있고, 그 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 2 에 나타나 있다. 마우스 Siglec-15 의 cDNA 의 뉴클레오티드 배열은, GenBank 에 액세션 번호 : XM_884636 으로 등록되어, 배열표의 배열 번호 3 에도 나타나 있고, 그 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 4 에 나타나 있다. 시그널 배열이 제거된 성숙 인간 Siglec-15 는, 배열 번호 2 에 나타내어지는 아미노산 배열의 21 번째 내지 328 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열에 상당한다. 또한, 시그널 배열이 제거된 마우스 Siglec-15 는, 배열 번호 4 에 나타내어지는 아미노산 배열의 21 번째 내지 341 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열에 상당한다. 또한, Siglec-15 는 CD33 antigen-like 3, CD33 molecule-like 3, CD33-like 3 또는 CD33L3 으로 불리는 경우가 있으며, 이들은 전부 동일한 분자를 나타내고 있다.
Siglec-15 의 cDNA 는 예를 들어, Siglec-15 의 cDNA 를 발현시키고 있는 cDNA 라이브러리를 주형 (鑄型) 으로 하고, Siglec-15 의 cDNA 를 특이적으로 증폭시키는 프라이머를 사용하여 폴리머라아제 연쇄 반응 (이하「PCR」이라고 한다) (Saiki, R. K., et al., Science, (1988) 239, 487-49) 을 실시하는, 이른바 PCR 법에 의해 취득할 수 있다.
또한, 배열표의 배열 번호 1 및 3 에서 선택되는 적어도 어느 1 개에 나타내어지는 뉴클레오티드 배열과 상보적인 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 가혹한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 Siglec-15 와 동등한 생물 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드도 Siglec-15 의 cDNA 에 포함된다. 또한, 인간 또는 마우스 Siglec-15 유전자좌로부터 전사되는 스플라이싱 베어리언트 또는 이것에 가혹한 조건에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드이고, 또한 Siglec-15 와 동등한 생물 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드도 Siglec-15 의 cDNA 에 포함된다.
또한, 배열표의 배열 번호 2 및 4 에서 선택되는 적어도 어느 1 개에 나타내어지는 아미노산 배열, 또는 이들 배열에서 시그널 배열이 제거된 아미노산 배열에 있어서, 1 개 또는 수 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, Siglec-15 와 동등한 생물 활성을 갖는 단백질도 Siglec-15 에 포함된다. 또한, 인간 또는 마우스 Siglec-15 유전자좌로부터 전사되는 스플라이싱 베어리언트로 코드되는 아미노산 배열 또는 그 아미노산 배열에 있어서, 1 개 또는 수 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 Siglec-15 와 동등한 생물 활성을 갖는 단백질도 Siglec-15 에 포함된다.
2. 골대사 이상의 검출
Siglec-15 유전자는, 인간 각종 골조직 검체군에 있어서의 유전자의 발현량을 해석하면, 파골 세포형 다핵 거세포가 다수 출현하는 골종양이고, 임상적 소견으로서 골용해성의 골파괴를 특징으로 한다 (Bullough et al., Atlas of Orthopedic Pathology 2nd edition, pp17.6-17.8, Lippincott Williams ＆ Wilkins Publishers (1992)) 거세포종 (Giant cell tumor ; GCT) 에 있어서 유의하게 발현량이 증가하고 있는 것을 알아냈다.
또한, Siglec-15 유전자는 단구 유래 세포주가 파골 세포로 분화될 때에 발현량이 증가하는 것도 알아냈다.
따라서, Siglec-15 는 GCT 와 같은 골흡수가 항진되는 인간의 병태에 관여하고 있는 것으로 생각된다. 즉, Siglec-15 유전자 및/또는 Siglec-15 의 각 세포, 및/또는 각 조직에 있어서의 발현량을 측정함으로써 Siglec-15 의 과잉 발현을 수반하는 골대사 이상 상태를 판정할 수 있다. 또한, 본 명세서에 있어서의 골대사 이상이란, 골다공증 (폐경 후 골다공증, 노인성 골다공증, 스테로이드나 면역 억제제 등의 치료용 약제의 사용에 의한 속발성 골다공증, 관절 류머티즘에 수반되는 골다공증), 관절 류머티즘에 수반되는 골파괴, 암성 고칼슘혈증, 다발성 골수종이나 암의 골전이에 수반되는 골파괴, 거세포종, 치근막염에 의한 치아의 상실, 인공 관절 주위의 골융해, 만성 골수염에 있어서의 골파괴, 골페이젯병, 신성 골이영양증, 골형성 부전증 등을 들 수 있는데, 이들에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명에 있어서 Siglec-15 유전자 및/또는 Siglec-15 의 발현량을 조사하는 대상이 되는 「검체」란, 피험자나 임상 검체 등으로부터 얻어진 골수, 뼈, 전립선, 정소, 음경, 방광, 신장, 구강, 인두, 구순, 혀, 치육, 비인두, 식도, 위, 소장, 대장, 결장, 간장, 담낭, 췌장, 코, 폐, 연부 조직, 피부, 유방, 자궁, 난소, 뇌, 갑상선, 림프절, 근육, 지방 조직 등의 조직, 혈액, 체액 또는 배설물 등의 시료를 의미하는데, 본 발명에 있어서는 혈액 또는 골수가 보다 바람직하다.
3. 파골 세포로의 분화 억제 물질의 스크리닝 방법
본 발명의 하나의 양태로서, Siglec-15 유전자 및/또는, Siglec-15 의 발현량을 측정하는 것에 의한 파골 세포의 분화 억제 물질의 스크리닝 방법을 들 수 있다.
본 발명의 하나의 양태로서, Siglec-15 가 갖는 성숙 파골 세포로의 분화 유도 활성을 저해하는 물질을 동정함으로써, 골대사 이상의 치료 효과 및/또는 예방 효과를 갖는 물질을 스크리닝하는 방법을 들 수 있다.
또한, 「피험 물질」이란, 본 발명의 스크리닝 방법으로 파골 세포로의 분화 억제 활성을 조사하는 대상이 되는 물질을 말한다. 피험 물질로는, 화합물, 미생물의 대사 산물, 식물이나 동물 조직의 추출물, 그들의 유도체 또는 그들의 혼합물 등을 들 수 있다. 또한, Siglec-15 의 발현량을 저하시키도록 설계된 핵산 또는 그 유도체 (안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, dsRNA, siRNA 등을 포함한다) 를 피험 물질로서 사용할 수도 있다. 피험 물질의 투여량이나 농도는 적절히 설정하거나, 또는 예를 들어 희석 계열을 제조하거나 하여 복수 종의 투여량을 설정해도 되고, 고체, 액체 등 적당한 상태에서 투여할 수 있으며, 적당한 버퍼에 용해시키거나, 또는 안정화제 등을 첨가해도 된다. 배양 세포를 사용하는 스크리닝 방법의 경우에는, 배지에 첨가하여 배양할 수 있다. 배지에 첨가하는 경우에는 배양 개시시부터 첨가해도 되고, 배양 도중에 첨가해도 되고, 또한, 첨가의 횟수도 1 회에 한정되지 않는다. 피험 물질 존재하에서 배양하는 기간도 적절히 설정해도 되는데, 바람직하게는 30 분 내지 2 주일이고, 보다 바람직하게는 30 분 내지 72 시간이다. 포유 동물 개체에 피험 물질을 투여하는 경우에는, 피험 물질의 물성 등에 따라 경구 투여, 정맥 주사, 복강 내 주사, 경피 투여, 피하 주사 등의 투여 형태를 구분하여 사용할 수 있다. 또한 피험 물질의 투여에서 검체를 얻을 때까지의 시간은 적당히 선택할 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법에 있어서 사용되는 배양 세포는, Siglec-15 를 발현시키는 포유 동물 세포인 한에 있어서, 정상적인 세포이어도 되고, 수립 세포주이어도 되고, 암 세포 등의 이상 증식을 나타내는 세포이어도 되며, 예를 들어, 정상 인간 파골 전구 세포 (Normal Human Natural Osteoclast Precursor Cells, 산코 쥰야쿠로부터 구입 가능, 카탈로그 번호 2T-110), 마우스 단구 유래 세포 RAW264.7 (ATCC Cat. No.TIB-71), RAW264 세포 (ECACC Cat. No.85062803), 마우스 골수 유래 초대 배양 세포 등을 들 수 있는데 이들에 한정되지 않는다. 배양 세포의 동물종으로는, 인간, 마우스 또는 그 밖의 포유 동물 (모르모트, 래트, 토끼, 돼지, 양, 소, 원숭이 등), 및 닭 등이 바람직하지만, 이들에 한정되지 않는다. 또한, 배양 세포로는 Siglec-15 를 과잉 발현시키고 있는 포유 동물 세포를 사용하는 것이 보다 바람직하고, 예를 들어 Siglec-15 유전자를 그 프로모터 영역과 함께 도입하고, Siglec-15 를 과잉 발현시키는 RAW264.7 세포, RAW264 세포, 293 세포, CHO 세포, COS7 세포 등을 들 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법에는, 배양 세포를 사용하지 않고, 포유 동물 개체에 피험 물질을 투여하고, 그 후 그 동물 개체로부터 적출된 그 장기 또는 조직 세포에 있어서의 Siglec-15 유전자의 발현을 검출하는 방법도 포함된다. 유전자 발현의 검출 대상이 되는 장기 또는 조직은, Siglec-15 를 발현시키는 것이면 되는데, 바람직하게는 골대사 이상에 관계된 조직이고, 보다 바람직하게는 골조직 및 골수이다. 포유 동물종으로는 비인간 포유 동물을 사용할 수 있고, 마우스, 래트 또는 햄스터가 바람직하고, 마우스 또는 래트가 보다 바람직하다. 또한, 골대사 이상을 나타내는 동물 모델로서, 난소 적제 동물, 정소 적제 동물, 종양 세포를 피하, 피내, 좌심실, 골수, 정맥 또는 복강 등에 이식한 담암 (擔癌) 동물, 좌골 신경 절제 동물, 아쥬반트 관절염 모델 동물, 콜라겐 유발성 관절염 모델 동물, 글루코코르티코이드 유발성 골다공증 모델 동물, 노화 촉진 마우스 (SAMP6 마우스, Matsushita et al., Am. J. Pathol. 125, 276-283 (1986)), 갑상선·부갑상선 적제 동물, 부갑상선 호르몬 관련 펩티드 (PTHrP) 지속 주입 동물, 파골 세포 형성 억제 인자 (OCIF) 녹아웃 마우스 (Mizuno et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., (1998) 247, 610-615), 가용형 RANKL 투여 동물 등을 사용할 수 있다. 또한, 치주병에 의한 치아의 상실 모델 동물이나, Siglec-15 를 과잉 발현시킨 동물을 사용할 수도 있다. 또한 스크리닝으로 선택된 피험 물질을 상기의 동물 모델에 투여하고, 골조직에 있어서의 성숙 파골 세포의 수, 골밀도, 골강도, 골형태 계측에 의해 취득할 수 있는 각 파라미터, 혈중 및 뇨중에 있어서의 골대사 파라미터 (CTx, NTx 등), 또는 혈중 Ca 농도 등, 골대사 이상에 의해 변동되는 파라미터를 측정함으로써, 그 피험 물질의 골대사 이상에 대한 치료 효과 및/또 예방 효과를 평가할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서 사용되는 배양 세포는, 피험 물질을 첨가하지 않은 경우에 Siglec-15 를 발현시킬 수 있는 조건이면, 어떠한 조건에서 배양해도 된다. 예를 들어, 그 배양 세포에 대해 공지된 배양 조건이 알려져 있고, 그 조건하에서 그 세포가 Siglec-15 를 발현시키는 경우에는, 그 조건에서 배양해도 된다. 또한, 포유 동물 개체로부터 적출된 장기 또는 조직에 있어서의 Siglec-15 의 발현을 검출하는 경우에 있어서의, 그 동물의 사육 조건도, 피험 물질을 첨가하지 않은 경우에 Siglec-15 를 발현시킬 수 있는 조건이면 된다.
또한, 피험 물질의 Siglec-15 발현에 대한 영향을 조사하기 위해서는, Siglec-15 유전자의 발현량을 측정하는 방법과, Siglec-15 유전자의 번역 산물인 Siglec-15 의 발현량을 측정하는 방법이 있다. Siglec-15 유전자, 및/또는 Siglec-15 의 발현을 억제하는 피험 물질은 골대사 이상, 바람직하게는 골다공증, 관절 류머티즘 및/또는 암의 골전이에 수반되는 골파괴에 대한 치료 효과 및/또는 예방 효과를 갖는 물질인 것으로 생각된다.
배양 세포에 있어서의 Siglec-15 유전자의 발현량 측정, Siglec-15 의 발현량 측정에 대해서는, Northern 해석, 정량적 PCR 법, ELISA 법 등에 의해 실시할 수 있다. 또한, 포유 동물 유래 배양 세포를 사용하는 경우에는, 필요에 따라 배지에는 피험 물질과 함께 RANKL, TNF-
Figure 112010014520647-pct00008
, M-CSF 또는 활성형 비타민 D3 등을 적당량 첨가하고, 피험 물질을 첨가하지 않은 컨트롤에 있어서도 RANKL, TNF-
Figure 112010014520647-pct00009
, M-CSF 또는 활성형 비타민 D3 등을 적당량 첨가한다.
또한, Siglec-15 에 대한 내재성 리간드의 결합량을 측정하는 실험계를 구축하고, 피험 물질의 첨가에 의해 그 내재성 리간드의 Siglec-15 에 대한 결합이 저해되는지의 여부를 평가함으로써 파골 세포로의 분화 억제 물질의 스크리닝을 실시할 수 있다.
이하의 (1) 내지 (3) 에 있어서 각 스크리닝법에 대해 서술한다.
(1) Siglec-15 유전자를 사용하는 방법
본 발명의 스크리닝 방법으로는 예를 들어, 포유 동물 유래 배양 세포를 사용하는 방법, 및 포유 동물 개체를 사용하는 방법에 대해 각각 이하와 같이 이루어진다.
(a) 포유 동물 유래 배양 세포를 사용하는 방법
(ⅰ) 이하의 공정 a) 내지 c) 를 포함한다 :
a) 피험 물질을 첨가한 배지에서 배양한 포유 동물 유래 배양 세포로부터, 전체 RNA 를 추출하는 공정 ;
b) a) 유래의 전체 RNA 와 피험 물질을 첨가하지 않고 배양한 포유 동물 배양 세포 유래 전체 RNA 사이에 있어서의, Siglec-15 유전자의 발현량 차이를 검출하는 공정 ;
c) b) 에 기재된 유전자의 발현량 차이를 해석하여, 피험 물질의 골대사 이상에 대한 치료 및/또는 예방 효과를 판정하는 공정.
(ⅱ) 이하의 공정 a) 내지 d) 를 포함한다.
a) 피험 물질을 첨가한 배지에서 배양한 포유 동물 유래 배양 세포로부터, 전체 RNA 를 추출하는 공정 ;
b) 피험 물질을 첨가하지 않은 배지에서 배양한 포유 동물 유래 배양 세포로부터, 전체 RNA 를 추출하는 공정 ;
c) 상기 a) 유래의 전체 RNA 와 b) 유래의 전체 RNA 에 있어서의, Siglec-15 유전자의 발현량을 측정하는 공정 ;
d) 상기 a) 유래의 전체 RNA 와 b) 유래의 전체 RNA 사이에 있어서의 상기 c) 에 의해 측정된 유전자의 발현량 차이를 해석하여, 피험 물질의 골대사 이상에 대한 치료 및/또는 예방 효과를 판정하는 공정.
(b) 포유 동물 개체를 사용하는 방법
(ⅰ) 이하의 공정 a) 내지 c) 를 포함한다.
a) 피험 물질을 투여한 포유 동물 개체로부터 채취한 검체로부터, 전체 RNA 를 추출하는 공정 ;
b) a) 유래의 전체 RNA 와 피험 물질을 투여하지 않은 동물 개체로부터 채취한 검체로부터 얻은 전체 RNA 사이에 있어서의, Siglec-15 유전자의 발현량 차이를 검출하는 공정 ;
c) 상기 b) 에 기재된 유전자의 발현량 차이를 해석하여, 피험 물질의 골대사 이상에 대한 치료 및/또는 예방 효과를 판정하는 공정.
(ⅱ) 이하의 공정 a) 내지 d) 를 포함한다.
a) 피험 물질을 투여한 포유 동물 개체로부터 채취한 검체로부터, 전체 RNA 를 추출하는 공정 ;
b) 피험 물질을 투여하지 않은 포유 동물 개체로부터 채취한 검체로부터, 전체 RNA 를 추출하는 공정 ;
c) 상기 공정 a) 유래의 전체 RNA 와 상기 공정 b) 유래의 전체 RNA 에 있어서의, Siglec-15 유전자의 발현량을 측정하는 공정 ;
d) c) 에 기재된 유전자의 발현량 차이를 해석하여, 피험 물질의 골대사 이상에 대한 치료 및/또는 예방 효과를 판정하는 공정.
(2) Siglec-15 를 사용하는 방법
Siglec-15 의 발현량을 측정하는 것을 이용한 스크리닝 방법에 대해서는 포유 동물 배양 세포를 사용한 방법과 동물 개체를 사용한 방법에 대해 각각 이하의 공정을 포함한다.
(a) 포유 동물 유래 배양 세포를 사용하는 방법
(ⅰ) 이하의 공정 a) 및 b) 를 포함한다 :
a) 피험 물질을 첨가한 배지에서 배양한 포유 동물 유래 배양 세포에 있어서의, Siglec-15 의 발현량을 측정하는 공정 ;
b) a) 에서 측정된 단백질의 발현량과, 피험 물질을 첨가하지 않은 배지에서 배양한 포유 동물 유래 배양 세포에 있어서의 그 단백질의 발현량 차이를 해석하여, 피험 물질의 골대사 이상에 대한 치료 효과 및/또는 예방 효과를 판정하는 공정.
(ⅱ) 이하의 공정 a) 내지 c) 를 포함한다 :
a) 피험 물질을 첨가한 배지에서 배양한 포유 동물 유래 배양 세포에 있어서의, Siglec-15 의 발현량을 측정하는 공정 ;
b) 피험 물질을 첨가하지 않은 배지에서 배양한 포유 동물 유래 배양 세포에 있어서의, 상기 a) 에 기재된 단백질의 발현량을 측정하는 공정 ;
c) 상기 a) 에서 측정된 단백질의 발현량과, 상기 b) 에서 측정된 그 단백질의 발현량 차이를 검출하여, 피험 물질의 골대사 이상에 대한 치료 효과 및/또는 예방 효과를 판정하는 공정.
(ⅲ) 이하의 공정 a) 내지 c) 를 포함한다 :
a) 피험 물질을 첨가한 배지에서 배양한 포유 동물 유래 배양 세포로부터 얻은 전체 단백질을 고상화시키는 공정 ;
b) 상기 고상화 단백질에 있어서의, Siglec-15 의 발현량을 측정하는 공정 ;
c) 상기 b) 에서 검출된 Siglec-15 의 발현량과, 피험 물질을 첨가하지 않은 배지에서 배양한 포유 동물 유래 배양 세포로부터 얻은 전체 단백질에 있어서의 그 단백질의 발현량 차이를 해석하여, 피험 물질의 골대사 이상에 대한 치료 효과 및/또는 예방 효과를 판정하는 공정.
(ⅳ) 이하의 공정 a) 내지 e) 를 포함한다 :
a) 피험 물질을 첨가한 배지에서 배양한 포유 동물 유래 배양 세포로부터 얻은 전체 단백질을 고상화시키는 공정 ;
b) 피험 물질을 첨가하지 않은 배지에서 배양한 포유 동물 유래 배양 세포로부터 얻은 전체 단백질을 고상화시키는 공정 ;
c) 상기 공정 a) 에 기재된 고상화 단백질에 있어서의 Siglec-15 의 발현량을 그 단백질에 특이적으로 결합되는 항체 또는 리간드를 사용하여 측정하는 공정 ;
d) 상기 공정 b) 에 기재된 고상화 단백질에 있어서의 Siglec-15 의 발현량을 그 단백질에 특이적으로 결합되는 항체 또는 리간드를 사용하여 측정하는 공정 ;
e) 상기 공정 c) 에서 측정된 단백질의 발현량과, 상기 공정 d) 에서 측정된 단백질의 발현량 차이를 해석하여, 피험 물질의 골대사 이상에 대한 치료 효과 및/또는 예방 효과를 판정하는 공정.
(b) 포유 동물 개체를 사용하는 방법
(ⅰ) 이하의 공정 a) 및 b) 를 포함한다 :
a) 피험 물질이 투여된 포유 동물 개체로부터 채취한 검체에 있어서의, Siglec-15 의 발현량을 측정하는 공정 ;
b) 상기 공정 a) 에서 측정된 Siglec-15 의 발현량과, 피험 물질이 투여되지 않은 포유 동물 개체로부터 채취한 검체에 있어서의 그 단백질의 발현량의 차이를 해석하여, 피험 물질의 골대사 이상에 대한 치료 효과 및/또는 예방 효과를 판정하는 공정.
(ⅱ) 이하의 공정 a) 내지 c) 를 포함한다 :
a) 피험 물질이 투여된 포유 동물 개체로부터 채취한 검체에 있어서의, Siglec-15 의 발현량을 그 단백질에 특이적으로 결합되는 항체 또는 리간드를 사용하여 측정하는 공정 ;
b) 피험 물질이 투여되지 않은 포유 동물 개체로부터 채취한 검체에 있어서의, 그 단백질의 발현량을 측정하는 공정 ;
c) a) 에서 측정된 Siglec-15 의 발현량과, b) 에서 측정된 그 단백질의 발현량 차이를 해석하여, 피험 물질의 골대사 이상에 대한 치료 효과 및/또는 예방 효과를 판정하는 공정.
(ⅲ) 이하의 공정 a) 내지 c) 를 포함한다 :
a) 피험 물질이 투여된 포유 동물 개체로부터 채취한 검체 중의 전체 단백질을 고상화시키는 공정 ;
b) 상기 고상화 단백질에 있어서의, Siglec-15 의 발현량을 측정하는 공정 ;
c) 상기 b) 에서 검출된 Siglec-15 의 발현량과, 피험 물질이 투여되지 않은 포유 동물 개체로부터 채취한 검체 중에 있어서의 그 단백질의 발현량 차이를 해석하여, 피험 물질의 골대사 이상에 대한 치료 및/또는 예방 효과를 판정하는 공정.
(ⅳ) 이하의 공정 a) 내지 e) 를 포함한다 :
a) 피험 물질이 투여된 포유 동물 개체로부터 채취한 검체 중의 전체 단백질을 고상화시키는 공정 ;
b) 피험 물질이 투여되지 않은 포유 동물 개체로부터 채취한 검체 중의 전체 단백질을 고상화시키는 공정 ;
c) 상기 공정 a) 에 기재된 고상화 단백질에 있어서의, Siglec-15 의 발현량을 그 단백질에 특이적으로 결합되는 항체 또는 리간드를 사용하여 검출하는 공정 ;
d) 상기 b) 에 기재된 고상화 단백질에 있어서의, Siglec-15 의 발현량을 그 단백질에 특이적으로 결합되는 항체 또는 리간드를 사용하여 검출하는 공정 ;
e) 상기 c) 에서 검출된 단백질의 발현량과, 상기 d) 에서 검출된 그 단백질의 발현량 차이를 해석하여, 피험 물질의 골대사 이상에 대한 치료 효과 및/또는 예방 효과를 판정하는 공정.
(3) 내재성 리간드를 사용한 스크리닝 방법
피험 물질의 첨가에 의해 내재성 리간드의 Siglec-15 에 대한 결합이 저해되는지의 여부를 관찰함으로써도 파골 세포의 분화 억제 물질의 스크리닝을 실시할 수 있다. Siglec-15 에 대한 내재성 리간드로서 기능하는 시알산 함유 당사슬로는, 인간 및 마우스 Siglec-15 에 결합되는 Neu5Ac
Figure 112010014520647-pct00010
2-6GalNAc 및 마우스 Siglec-15 에 결합되는 Neu5Ac
Figure 112010014520647-pct00011
2-3Galβ1-4Glc 를 들 수 있는데, Siglec-15 에 대한 결합능을 갖는 한 이들 당사슬에 한정되지 않는다. 이들 내재성 리간드는, Siglec-15 와의 결합을 시험할 목적으로, 적당한 태그, 라디오아이소토프 또는 형광 물질에 의해 라벨링할 수 있다. 예를 들어, Neu5Ac
Figure 112010014520647-pct00012
2-6GalNAc 와 같은 시알산 함유 올리고당을 결합시킨 비오틴화폴리아크릴아미드는, Siglec-15 에 결합되는 프로브로서 스크리닝에 이용할 수 있다. 내재성 리간드를 결합시키는 Siglec-15 로는, Siglec-15 발현 세포 또는 그 세포로부터 조제된 막 획분을 사용할 수 있다. 또한, Siglec-15 발현 세포로부터 Siglec-15 를 단리, 정제하여 스크리닝에 제공할 수도 있다. 또한, Siglec-15 발현 세포로는, Siglec-15 를 발현시키고 있는 배양 세포주, 적당한 배양 세포에 Siglec-15 유전자를 유전자 공학적으로 일과적 또는 항상적으로 발현시킨 세포, 또는 생체 내로부터 얻어지는 Siglec-15 를 발현시키는 세포 중 어느 것을 사용할 수도 있다. 이와 같은 내재성 리간드를 사용한 스크리닝법은 이하와 같은 공정에 의해 실시할 수 있다.
(ⅰ) 이하의 공정 a) 및 b) 를 포함한다 :
a) Siglec-15 의 내재성 리간드 및 피험 물질을 Siglec-15 발현 세포에 첨가하는 공정 ;
b) 피험 물질의 첨가시와 비첨가시에 있어서의 내재성 리간드의 Siglec-15 발현 세포에 대한 결합량을 비교함으로써, 피험 물질의 골대사 이상에 대한 치료 및/또는 예방 효과를 판정하는 공정.
(ⅱ) 이하의 공정 a) 내지 c) 를 포함한다 :
a) Siglec-15 발현 세포의 세포막 획분을 조제하는 공정 ;
b) Siglec-15 의 내재성 리간드 및 피험 물질을 그 세포막 획분에 첨가하는 공정 ;
c) 피험 물질의 첨가시와 비첨가시에 있어서의 내재성 리간드의 그 세포막 획분에 대한 결합량을 비교함으로써, 피험 물질의 골대사 이상에 대한 치료 및/또는 예방 효과를 판정하는 공정.
(ⅲ) 이하의 a) 내지 c) 의 공정을 포함한다 :
a) Siglec-15 를 조제하는 공정 ;
b) Siglec-15 의 내재성 리간드 및 피험 물질을 a) 의 Siglec-15 에 첨가하는 공정 ;
c) 피험 물질의 첨가시와 비첨가시에 있어서의 내재성 리간드의 Siglec-15 에 대한 결합량을 비교함으로써, 피험 물질의 골대사 이상에 대한 치료 및/또는 예방 효과를 판정하는 공정.
적당한 세포에 유전자 공학적으로 Siglec-15 를 발현시키고, 이것을 정제하여 스크리닝에 제공하는 경우, 스크리닝의 표적이 되는 Siglec-15 는 이하의 (a) 내지 (i) 에 나타내어지는 아미노산 배열로 이루어지는 폴리펩티드에서 선택할 수 있다 ;
(a) 배열표의 배열 번호 2 에 나타내어지는 아미노산 배열 ;
(b) 배열표의 배열 번호 2 에 나타내어지는 아미노산 배열의 21 번째 내지 328 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;
(c) 배열표의 배열 번호 2 에 나타내어지는 아미노산 배열의 1 번째 내지 260 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;
(d) 배열표의 배열 번호 2 에 나타내어지는 아미노산 배열의 21 번째 내지 260 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;
(e) 배열표의 배열 번호 4 에 나타내어지는 아미노산 배열 ;
(f) 배열표의 배열 번호 4 에 나타내어지는 아미노산 배열의 21 번째 내지 341 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;
(g) 배열표의 배열 번호 4 에 나타내어지는 아미노산 배열의 1 번째 내지 258 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;
(h) 배열표의 배열 번호 4 에 나타내어지는 아미노산 배열의 21 번째 내지 258 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;
(i) (a) 내지 (h) 에 기재된 아미노산 배열에 1 내지 수 아미노산 잔기의 치환, 결실 또는 부가를 수반하는 아미노산 배열.
스크리닝의 표적이 되는 Siglec-15 는 이하의 (j) 내지 (n) 에 나타내어지는 뉴클레오티드 배열로 코드되는 아미노산 배열로 이루어지는 폴리펩티드에서도 선택할 수 있다 ;
(j) 배열 번호 1 에 나타내어지는 뉴클레오티드 배열 ;
(k) 배열 번호 3 에 나타내어지는 뉴클레오티드 배열 ;
(l) 배열 번호 19 에 나타내어지는 뉴클레오티드 배열 ;
(m) 배열 번호 43 에 나타내어지는 뉴클레오티드 배열 ;
(n) (j) 내지 (m) 에 기재된 뉴클레오티드 배열과 상보적인 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 가혹한 조건에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드가 보유하는 뉴클레오티드 배열.
또한, 이들 폴리펩티드에 적절한 태그를 연결시킨 폴리펩티드, 또는 기타 가용성 단백질과 융합시킨 폴리펩티드도 스크리닝의 표적으로서 사용할 수 있다. 또한, 배열표의 배열 번호 2 에 기재된 아미노산 배열의 1 번째 내지 20 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 폴리펩티드는 인간 Siglec-15 의 시그널 펩티드에 상당하고, 21 번째 내지 260 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 폴리펩티드는 인간 Siglec-15 의 성숙 단백질의 세포 외 영역에 상당한다. 또한, 배열표의 배열 번호 4 에 기재된 아미노산 배열의 1 번째 내지 20 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 폴리펩티드는 마우스 Siglec-15 의 시그널 펩티드에 상당하고, 21 번째 내지 258 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 폴리펩티드는 마우스 Siglec-15 의 성숙 단백질의 세포 외 영역에 상당한다. 또한, 배열 번호 43 에 나타내어지는 뉴클레오티드 배열은 배열 번호 1 에 나타내어지는 뉴클레오티드 배열로 코드되는 인간 Siglec-15 의 세포 외 영역을 코드하고 있고, 배열 번호 19 에 나타내어지는 뉴클레오티드 배열은 배열 번호 3 에 나타내어지는 뉴클레오티드 배열로 코드되는 마우스 Siglec-15 의 세포 외 영역을 코드하고 있다.
(1) 내지 (3) 의 스크리닝법으로 선발된 파골 세포의 분화 억제 물질의 후보 물질에 대하여, 실시예 17, 19 및 20 에 나타내는 파골 세포의 타르타르산 내성 산성 포스파타아제 (Tartrate-Resistant Acid Phosphatase : TRAP) 활성 억제를 지표로 하여 2 차 평가를 실시할 수 있다. 또한, 실시예 19, 21, 22 및 35 에 나타내는 바와 같이, TRAP 양성 다핵 파골 세포의 형성 억제, 즉 파골 세포의 세포 융합 억제를 지표로 해서도 2 차 평가를 실시할 수 있다.
(4) 그 밖의 방법
Siglec-15 를 과잉 발현시킨 포유 동물 개체에 피험 물질을 투여한 경우와 투여하지 않은 경우에 대해, 시간 경과적으로 골대사 이상의 발생률, 골대사 이상의 정도 및/또는 생존율 등을 측정한다. 피험 물질을 투여한 포유 동물에서 골대사 이상의 발생률이 유의하게 저하되어 있는, 골대사 이상의 정도가 유의하게 작은, 및/또는 생존율이 약 10 ％ 이상, 바람직하게는 약 30 ％ 이상, 보다 바람직하게는 약 50 ％ 이상 상승된 경우에, 피험 물질은 골대사 이상에 대한 치료 및/또는 예방 효과를 갖는 화합물로서 선택할 수 있다.
4. 항 Siglec-15 항체의 제조
본 발명의 Siglec-15 에 대한 항체는, 통상적인 방법을 사용하여, Siglec-15 또는 Siglec-15 의 아미노산 배열에서 선택되는 임의의 폴리펩티드를 동물에게 면역시키고, 생체 내에 생성되는 항체를 채취, 정제함으로써 얻을 수 있다. 항원이 되는 Siglec-15 의 생물종은 인간에 한정되지 않고, 마우스, 래트 등의 인간 이외의 동물에서 유래하는 Siglec-15 를 동물에게 면역시킬 수도 있다. 이 경우에는, 취득된 이종 Siglec-15 에 결합되는 항체와 인간 Siglec-15 의 교차성을 시험함으로써, 인간의 질환에 적용할 수 있는 항체를 선별할 수 있다.
또한, 공지된 방법 (예를 들어, Kohler and Milstein, Nature (1975) 256, p.495-497, Kennet, R. ed., Monoclonal Antibody, p.365-367, Prenum Press, N. Y. (1980)) 에 따라, Siglec-15 에 대한 항체를 생성하는 항체 생성 세포와 미엘로마 세포를 융합시킴으로써 하이브리도마를 수립하여, 모노클로널 항체를 얻을 수도 있다.
또한, 항원이 되는 Siglec-15 는 Siglec-15 유전자를 유전자 조작에 의해 숙주 세포에 생성시킴으로써 얻을 수 있다.
구체적으로는, Siglec-15 유전자를 발현시킬 수 있는 벡터를 제조하고, 이것을 숙주 세포에 도입하여 그 유전자를 발현시키고, 발현된 Siglec-15 를 정제하면 된다. 이하, 구체적으로 Siglec-15 에 대한 항체의 취득 방법을 설명한다.
(1) 항원의 조제
항 Siglec-15 항체를 제조하기 위한 항원으로는, Siglec-15 또는 그 적어도 6 개가 연속된 부분 아미노산 배열로 이루어지는 폴리펩티드, 또는 이들에 임의의 아미노산 배열이나 담체가 부가된 유도체를 들 수 있다. 또한, 「3. 파골 세포로의 분화 억제 물질의 스크리닝 방법」에 있어서, 스크리닝의 표적으로서 예시한 Siglec-15 도 항 Siglec-15 항체를 제조하기 위한 항원으로서 들 수 있다.
Siglec-15 는, 인간의 종양 조직 또는 종양 세포로부터 직접 정제하여 사용 할 수 있고, 또한 Siglec-15 를 in vitro 에서 합성하거나, 또는 유전자 조작에 의해 숙주 세포에 생성시킴으로써 얻을 수 있다.
유전자 조작에서는, 구체적으로는, Siglec-15 의 cDNA 를 발현시킬 수 있는 벡터에 삽입한 후, 전사와 번역에 필요한 효소, 기질 및 에너지 물질을 함유하는 용액 중에서 합성하거나, 또는 기타 원핵 생물 또는 진핵 생물의 숙주 세포를 형질 전환시킴으로써 Siglec-15 를 발현시킴으로써, 항원을 얻을 수 있다.
또한, 막 단백질인 Siglec-15 의 세포 외 영역과 항체의 정상 영역을 연결시킨 융합 단백질을 적절한 숙주·벡터계에 있어서 발현시킴으로써, 분비 단백질로서 항원을 얻을 수도 있다.
Siglec-15 의 cDNA 는 예를 들어, Siglec-15 의 cDNA 를 발현시키고 있는 cDNA 라이브러리를 주형으로 하고, Siglec-15 cDNA 를 특이적으로 증폭시키는 프라이머를 사용하여 폴리머라아제 연쇄 반응 (이하 「PCR」이라고 한다) (Saiki, R. K., et al. Science (1988) 239, p.487-489 참조) 을 실시하는, 이른바 PCR 법에 의해 취득할 수 있다.
폴리펩티드의 인·비트로 (in vitro) 합성으로는, 예를 들어 로슈·다이아그노스틱스사 제조의 래빗 트랜스레이션 시스템 (RTS) 을 들 수 있는데, 이것에 한정되지 않는다.
원핵 세포의 숙주로는, 예를 들어, 대장균 (Escherichia coli) 이나 고초균 (Bacillus subtilis) 등을 들 수 있다. 목적으로 하는 유전자를 이들 숙주 세포 내에서 형질 전환시키려면, 숙주와 적합할 수 있는 종에서 유래하는 레플리콘 즉 복제 기점과, 조절 배열을 포함하고 있는 플라스미드 벡터에 의해 숙주 세포를 형질 전환시킨다. 또한, 벡터로는, 형질 전환 세포에 표현 형질 (표현형) 의 선택성을 부여할 수 있는 배열을 갖는 것이 바람직하다.
진핵 세포의 숙주 세포에는, 척추 동물, 곤충, 효모 등의 세포가 포함되고, 척추 동물 세포로는, 예를 들어, 원숭이의 세포인 COS 세포 (Gluzman, Y. Cell (1981) 23, p.175-182, ATCC CRL-1650), 마우스 선유아 세포 NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658) 이나 차이니즈·햄스터 난소 세포 (CHO 세포, ATCC CCL-61) 의 디히드로엽산 환원 효소 결손주 (Urlaub, G. and Chasin, L. A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, p.4126-4220) 등이 자주 사용되고 있으나, 이들에 한정되지 않는다.
상기와 같이 하여 얻어지는 형질 전환체는, 통상적인 방법에 따라 배양할 수 있고, 그 배양에 의해 세포 내 또는 세포 외에 목적으로 하는 폴리펩티드가 생성된다.
그 배양에 사용되는 배지로는, 채용된 숙주 세포에 따라 관용되는 각종의 것을 적절히 선택할 수 있고, 대장균이면, 예를 들어, LB 배지에 필요에 따라 암피실린 등의 항생 물질이나 IPMG 를 첨가하여 사용할 수 있다.
상기 배양에 의해, 형질 전환체의 세포 내 또는 세포 외에 생성되는 재조합 단백질은, 그 단백질의 물리적 성질이나 화학적 성질 등을 이용한 각종의 공지된 분리 조작법에 의해 분리·정제할 수 있다.
그 방법으로는, 구체적으로는 예를 들어, 통상적인 단백질 침전제에 의한 처리, 한외 여과, 분자 체 크로마토그래피 (겔 여과), 흡착 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피 등의 각종 액체 크로마토그래피, 투석법, 이들의 조합 등을 예시할 수 있다.
또한, 발현시키는 재조합 단백질에 6 잔기로 이루어지는 히스티딘을 연결시킴으로써, 니켈 어피니티 칼럼으로 효율적으로 정제할 수 있다. 또는, 발현시키는 재조합 단백질에 IgG 의 Fc 영역을 연결시킴으로써, 프로테인 A 칼럼으로 효율적으로 정제할 수 있다.
상기 방법을 조합함으로써 용이하게 고수율, 고순도로 목적으로 하는 폴리펩티드를 대량으로 제조할 수 있다.
(2) 항 Siglec-15 모노클로널 항체의 제조
Siglec-15 와 특이적으로 결합되는 항체의 예로서, Siglec-15 와 특이적으로 결합되는 모노클로널 항체를 들 수 있는데, 그 취득 방법은 이하에 기재하는 바와 같다.
모노클로널 항체의 제조시에는, 일반적으로 하기와 같은 작업 공정이 필요하다.
즉,
(a) 항원으로서 사용하는 생체 고분자의 정제,
(b) 항원을 동물에게 주사함으로써 면역시킨 후, 혈액을 채취하여 그 항체가를 검정하고 비장 적출의 시기를 결정하고 나서, 항체 생성 세포를 조제하는 공정,
(c) 골수종 세포 (이하 「미엘로마」라고 한다) 의 조제,
(d) 항체 생성 세포와 미엘로마의 세포 융합,
(e) 목적으로 하는 항체를 생성하는 하이브리도마군의 선별,
(f) 단일 세포 클론으로의 분할 (클로닝),
(g) 경우에 따라서는, 모노클로널 항체를 대량으로 제조하기 위한 하이브리도마의 배양, 또는 하이브리도마를 이식한 동물의 사육,
(h) 이와 같이 하여 제조된 모노클로널 항체의 생리 활성, 및 그 결합 특이성의 검토, 또는 표지 시약으로서의 특성의 검정 등이다.
이하, 모노클로널 항체의 제조법을 상기 공정을 따라 상세히 서술하는데, 그 항체의 제조법은 이것에 제한되지 않고, 예를 들어 비장 세포 이외의 항체 생성 세포 및 미엘로마를 사용할 수도 있다.
(a) 항원의 정제
항원으로는, 상기한 것과 같은 방법으로 조제한 Siglec-15 또는 그 일부를 사용할 수 있다.
또한, Siglec-15 발현 재조합체 세포로부터 조제한 막 획분, 또는 Siglec-15 발현 재조합체 세포 자체, 또한 당업자에게 주지된 방법을 사용하여, 화학 합성한 본 발명의 단백질의 부분 펩티드를 항원으로서 사용할 수도 있다.
(b) 항체 생성 세포의 조제
공정 (a) 에서 얻어진 항원과, 프로인드의 완전 또는 불완전 아쥬반트, 또는 칼리명반과 같은 보조제를 혼합하고, 면역원으로서 실험 동물에게 면역시킨다. 실험 동물은 공지된 하이브리도마 제조법에 사용되는 동물을 지장없이 사용할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어 마우스, 래트, 염소, 양, 소, 말 등을 사용할 수 있다. 단, 적출된 항체 생성 세포와 융합시키는 미엘로마 세포의 입수 용이성 등의 관점에서, 마우스 또는 래트를 피면역 동물로 하는 것이 바람직하다.
또한, 실제로 사용하는 마우스 및 래트의 계통은 특별히 제한은 없고, 마우스의 경우에는, 예를 들어 각 계통 A, AKR, BALB/c, BDP, BA, CE, C3H, 57BL, C57BL, C57L, DBA, FL, HTH, HT1, LP, NZB, NZW, RF, R Ⅲ, SJL, SWR, WB, 129 등이, 또한 래트의 경우에는, 예를 들어, Wistar, Low, Lewis, Spraque, Dawley, ACI, BN, Fischer 등을 사용할 수 있다.
이들 마우스 및 래트는 예를 들어 일본 쿠레아, 일본 찰스 리버 등 실험 동물 사육 판매 업자로부터 입수할 수 있다.
이 중, 후술하는 미엘로마 세포와의 융합 적합성을 감안하면, 마우스에서는 BALB/c 계통이, 래트에서는 Wistar 및 Low 계통이 피면역 동물로서 특히 바람직하다.
또한, 항원인 인간과 마우스에서의 상동성을 고려하여, 자기 항체를 제거하는 생체 기구를 저하시킨 마우스, 즉 자기 면역 질환 마우스를 사용하는 것도 바람직하다.
또한, 이들 마우스 또는 래트의 면역시의 주령은, 바람직하게는 5 ∼ 12 주령, 더욱 바람직하게는 6 ∼ 8 주령이다.
Siglec-15 또는 이 재조합체에 의해 동물을 면역시키려면, 예를 들어, Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology Vol.Ⅰ.Ⅱ.Ⅲ., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E. A. and Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Spigfield, Illinois (1964) 등에 상세하게 기재되어 있는 공지된 방법을 사용할 수 있다.
이들 면역법 중, 본 발명에 있어서 바람직한 방법을 구체적으로 나타내면, 예를 들어 이하와 같다.
즉, 먼저 항원인 막 단백질 획분, 또는 항원을 발현시킨 세포를 동물의 피내 또는 복강 내에 투여한다.
단, 면역 효율을 높이기 위해서는 양자의 병용이 바람직하며, 전반에는 피내 투여를 실시하고, 후반 또는 최종 회에만 복강 내 투여를 실시하면, 특히 면역 효율을 높일 수 있다.
항원의 투여 스케줄은 피면역 동물의 종류, 개체 차이 등에 따라 상이한데, 일반적으로는 항원 투여 횟수 3 ∼ 6 회, 투여 간격 2 ∼ 6 주일이 바람직하고, 투여 횟수 3 ∼ 4 회, 투여 간격 2 ∼ 4 주일이 더욱 바람직하다.
또한, 항원의 투여량은 동물의 종류, 개체 차이 등에 따라 상이한데, 일반적으로는 0.05 ∼ 5 ㎎, 바람직하게는 0.1 ∼ 0.5 ㎎ 정도로 한다.
추가 면역은, 이상과 같은 항원 투여의 1 ∼ 6 주일 후, 바람직하게는 2 ∼ 4 주일 후, 더욱 바람직하게는 2 ∼ 3 주일 후에 실시한다.
또한, 추가 면역을 실시할 때의 항원 투여량은 동물의 종류, 크기 등에 따라 상이한데, 일반적으로 예를 들어 마우스의 경우에는 0.05 ∼ 5 ㎎, 바람직하게는 0.1 ∼ 0.5 ㎎, 더욱 바람직하게는 0.1 ∼ 0.2 ㎎ 정도로 한다.
상기 추가 면역으로부터 1 ∼ 10 일 후, 바람직하게는 2 ∼ 5 일 후, 더욱 바람직하게는 2 ∼ 3 일 후에 피면역 동물로부터 항체 생성 세포를 포함하는 비장 세포 또는 림프구를 무균적으로 취출한다.
또한, 그 때에 항체가를 측정하여, 항체값이 충분히 높아진 동물을 항체 생성 세포의 공급원으로서 사용하면, 이후의 조작 효율을 높일 수 있다.
여기서 사용되는 항체가의 측정법으로는, 예를 들어, RIA 법 또는 ELISA 법을 들 수 있는데 이들 방법에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서의 항체가의 측정은, 예를 들어 ELISA 법에 의하면, 이하에 기재하는 바와 같은 순서에 따라 실시할 수 있다.
먼저, 정제 또는 부분 정제된 항원을 ELISA 용 96 웰 플레이트 등의 고상 표면에 흡착시키고, 또한 항원이 흡착되어 있지 않은 고상 표면을 항원과 무관계인 단백질, 예를 들어 소 혈청 알부민 (이하 「BSA」라고 한다) 에 의해 덮고, 그 표면을 세정한 후, 제 1 항체로서 단계 희석시킨 시료 (예를 들어 마우스 혈청) 에 접촉시켜, 상기 항원에 시료 중의 항체를 결합시킨다.
또한 제 2 항체로서 효소 표지된 마우스 항체에 대한 항체를 첨가하여 마우스 항체에 결합시키고, 세정 후 그 효소의 기질을 첨가하고, 기질 분해에 기초한 발색에 따른 흡광도의 변화 등을 측정함으로써 항체가를 산출한다.
이들 비장 세포 또는 림프구로부터의 항체 생성 세포의 분리는, 공지된 방법 (예를 들어, Kohler et al., Nature (1975) 256, p.495,; Kohler et al., Eur. J. Immunol. (1977) 6, p.511,; Milstein et al., Nature (1977), 266, p.550,; Walsh, Nature, (1977) 266, p.495,) 에 따라 실시할 수 있다.
예를 들어, 비장 세포의 경우에는, 비장을 세절하고 세포를 스테인리스 메시로 여과한 후, 이글 최소 필수 배지 (MEM) 에 부유시켜 항체 생성 세포를 분리하는 일반적 방법을 채용할 수 있다.
(c) 골수종 세포 (이하, 「미엘로마」라고 한다) 의 조제
세포 융합에 사용되는 미엘로마 세포에는 특별한 제한은 없고, 공지된 세포주로부터 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 단, 융합 세포로부터 하이브리도마를 선택할 때의 편리성을 고려하여, 그 선택 수속이 확립되어 있는 HGPRT (Hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase) 결손주를 사용하는 것이 바람직하다.
즉, 마우스 유래의 X63-Ag8 (X63), NS1-ANS/1 (NS1), P3X63-Ag8.Ul (P3Ul), X63-Ag8.653 (X63.653), SP2/0-Ag14 (SP2/0), MPC11-45.6TG1.7 (45.6TG), FO, S149/5XXO, BU.1 등, 래트 유래의 210.RSY3.Ag.1.2.3 (Y3) 등, 인간 유래의 U266AR (SKO-007), GM1500·GTG-A12 (GM1500), UC729-6, LICR-LOW-HMy2 (HMy2), 8226AR/NIP4-1 (NP41) 등이다.
이들 HGPRT 결손주는 예를 들어 American Type Culture Collection (ATCC) 등으로부터 입수할 수 있다.
이들 세포주는, 적당한 배지, 예를 들어 8-아자구아닌 배지 [RPMI-1640 배지에 글루타민, 2-메르캅토에탄올, 겐타마이신 및 소 태아 혈청 (이하 「FCS」라고 한다) 을 첨가한 배지에 8-아자구아닌을 첨가한 배지], 이스코브 개변 둘베코 배지 (Iscove's Modified Dulbecco's Medium ; 이하 「IMDM」이라고 한다), 또는 둘베코 개변 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle Medium ; 이하 「DMEM」이라고 한다) 에서 계대 배양하는데, 세포 융합의 3 내지 4 일 전에 정상 배지 [예를 들어, 10 ％ FCS 를 함유하는 ASF104 배지 (아지노모토 (주) 사 제조)] 에서 계대 배양하고, 융합 당일에 2 × 107 이상의 세포수를 확보해 둔다.
(d) 세포 융합
항체 생성 세포와 미엘로마 세포의 융합은, 공지된 방법 (Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology Vol.Ⅰ.Ⅱ.Ⅲ., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E. A. and Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Springfield, Illinois (1964) 등) 에 따라, 세포의 생존율을 극도로 저하시키지 않을 정도의 조건하에서 적절히 실시할 수 있다.
그러한 방법은, 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜 등의 고농도 폴리머 용액 중에서 항체 생성 세포와 미엘로마 세포를 혼합하는 화학적 방법, 전기적 자극을 이용하는 물리적 방법 등을 사용할 수 있다.
이 중, 상기 화학적 방법의 구체예를 나타내면 이하와 같다.
즉, 고농도 폴리머 용액으로서 폴리에틸렌글리콜을 사용하는 경우에는, 분자량 1500 ∼ 6000, 바람직하게는 2000 ∼ 4000 의 폴리에틸렌글리콜 용액 중에서, 30 ∼ 40 ℃, 바람직하게는 35 ∼ 38 ℃ 의 온도에서 항체 생성 세포와 미엘로마 세포를 1 ∼ 10 분간, 바람직하게는 5 ∼ 8 분간 혼합한다.
(e) 하이브리도마군의 선택
상기 세포 융합에 의해 얻어지는 하이브리도마의 선택 방법은 특별히 제한은 없지만, 통상적으로 HAT (히포크산틴·아미노프테린·티미딘) 선택법 (Kohler et al., Nature (1975) 256, p.495 ; Milstein et al., Nature (1977) 266, p.550) 이 사용된다.
이 방법은, 아미노프테린에서 생존할 수 없는 HGPRT 결손주의 미엘로마 세포를 사용하여 하이브리도마를 얻는 경우에 유효하다.
즉, 미융합 세포 및 하이브리도마를 HAT 배지에서 배양함으로써, 아미노프테린에 대한 내성을 가진 하이브리도마만을 선택적으로 잔존시키고, 또한 증식시킬 수 있다.
(f) 단일 세포 클론으로의 분할 (클로닝)
하이브리도마의 클로닝법으로는, 예를 들어 메틸셀룰로오스법, 연 (軟) 아가로오스법, 한계 희석법 등의 공지된 방법을 사용할 수 있다 (예를 들어 Barbara, B. M. and Stanley, M. S. : Selected Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman and Company, San Francisco (1980) 참조). 이들 방법 중, 특히 한계 희석법이 바람직하다.
이 방법에서는, 마이크로 플레이트에 래트 태아 유래 선유아 세포주, 또는 정상 마우스 비장 세포, 흉선 세포, 복수 (腹水) 세포 등의 피더 (feeder) 를 접종시켜 둔다.
한편, 미리 하이브리도마를 0.2 ∼ 0.5 개/0.2 ㎖ 가 되도록 배지 중에서 희석시키고, 이 희석된 하이브리도마의 부유액을 각 웰에 0.1 ㎖ 씩 넣고, 일정 기간마다 (예를 들어 3 일마다) 약 1/3 의 배지를 새로운 것으로 교환하면서 2 주일 정도 배양을 계속함으로써 하이브리도마의 클론을 증식시킬 수 있다.
항체가가 확인된 웰에 대해, 예를 들어 한계 희석법에 의한 클로닝을 2 ∼ 4 회 반복하고, 안정적으로 항체가가 확인된 것을 항 Siglec-15 모노클로널 항체 생성 하이브리도마주로서 선택한다.
이와 같이 하여 클로닝된 하이브리도마주의 예로는, 하이브리도마 #32A1 및 하이브리도마 #41B1 을 들 수 있다. 하이브리도마 #32A1 및 하이브리도마 #41B1 은, 일본 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터 (소재지 : 우편번호 305-8566 일본 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1 쵸메 1 반치 1 츄오우 다이 6) 에 2008년 8월 28일자로 기탁되고, 하이브리도마 #32A1 은 anti-Siglec-15 Hybridoma #32A1 의 명칭으로 기탁 번호 FERM BP-10999 가 부여되고, 하이브리도마 #41B1 은 anti-Siglec-15 Hybridoma #41B1 의 명칭으로 기탁 번호 FERM BP-11000 이 부여되어 있다. 또한, 본 명세서 중에 있어서는, 하이브리도마 #32A1 이 생성하는 항체를 「#32A1 항체」또는 간단히 「#32A1」이라고 기재하고, 하이브리도마 #41B1 이 생성하는 항체를 「#41B1 항체」또는 간단히 「#41B1」이라고 기재한다. 또한, 본 명세서의 실시예에 있어서 #32A1 항체 및 #41B1 항체 이외에 취득된 항체에 대해서도, 동일한 방법으로 항체명을 기재한다.
(g) 하이브리도마의 배양에 의한 모노클로널 항체의 조제
이와 같이 하여 선택된 하이브리도마는, 이것을 배양함으로써 모노클로널 항체를 효율적으로 얻을 수 있는데, 배양에 앞서 목적으로 하는 모노클로널 항체를 생성하는 하이브리도마를 스크리닝하는 것이 바람직하다.
이 스크리닝에는 그 자체가 이미 알려진 방법을 채용할 수 있다.
본 발명에 있어서의 항체가의 측정은, 예를 들어 상기 (b) 의 항목에서 설명한 ELISA 법에 의해 실시할 수 있다.
이상과 같은 방법에 의해 얻은 하이브리도마는, 액체 질소 중 또는 -80 ℃ 이하의 냉동고 중에 동결 상태로 보존할 수 있다.
클로닝을 완료한 하이브리도마는, 배지를 HT 배지에서 정상 배지로 바꾸어 배양된다.
대량 배양은, 대형 배양병을 사용한 회전 배양, 또는 스피너 배양으로 실시된다. 이 대량 배양에 있어서의 상청으로부터 겔 여과 등, 당업자에게 주지된 방법을 사용하여 정제함으로써, 본 발명의 단백질에 특이적으로 결합되는 모노클로널 항체를 얻을 수 있다.
또한, 동일 계통의 마우스 (예를 들어, 상기의 BALB/c), 또는 Nu/Nu 마우스의 복강 내에 하이브리도마를 주사하고, 그 하이브리도마를 증식시킴으로써, 본 발명의 모노클로널 항체를 대량으로 함유하는 복수를 얻을 수 있다.
복강 내에 투여하는 경우에는, 사전 (3 ∼ 7 일 전) 에 2,6,10,14-테트라메틸펜타데칸 (2,6,10,14-tetramethyl pentadecane) (프리스탄) 등의 광물유를 투여하면, 보다 다량의 복수가 얻어진다.
예를 들어, 하이브리도마와 동일한 계통의 마우스의 복강 내에 미리 면역 억제제를 주사하여, T 세포를 불활성화시킨 후, 20 일 후에 106 ∼ 107 개의 하이브리도마·클론 세포를, 혈청을 함유하지 않는 배지 중에 부유 (0.5 ㎖) 시키고 복강 내에 투여하여, 통상적으로 복부가 팽만하고, 복수가 고인 시점에서 마우스로부터 복수를 채취한다.
이 방법에 의해, 배양액 중에 비해 약 100 배 이상의 농도의 모노클로널 항체가 얻어진다.
상기 방법에 의해 얻은 모노클로널 항체는, 예를 들어 Weir, D. M. : Handbook of Experimental Immunology, Vol.Ⅰ.Ⅱ.Ⅲ, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1978) 에 기재되어 있는 방법으로 정제할 수 있다.
즉, 황안 염석법, 겔 여과법, 이온 교환 크로마토그래피법, 어피니티 크로마토그래피법 등이다.
정제의 간편한 방법으로는, 시판되는 모노클로널 항체 정제 키트 (예를 들어, MAb Trap GⅡ 키트 ; 파마시아사 제조) 등을 이용할 수도 있다.
이렇게 하여 얻어지는 모노클로널 항체는, Siglec-15 에 대하여 높은 항원 특이성을 갖는다.
(h) 모노클로널 항체의 검정
이렇게 하여 얻어진 모노클로널 항체의 아이소타입 및 서브클래스의 결정은 이하와 같이 실시할 수 있다.
먼저, 동정법으로는 옥터로니 (Ouchterlony) 법, ELISA 법 또는 RIA 법을 들 수 있다.
옥터로니법은 간편하기는 하지만, 모노클로널 항체의 농도가 낮은 경우에는 농축 조작이 필요하다.
한편, ELISA 법 또는 RIA 법을 사용한 경우에는, 배양 상청을 그대로 항원 흡착 고상과 반응시키고, 추가로 제 2 차 항체로서 각종 이뮤노글로불린 아이소타입, 서브클래스에 대응하는 항체를 사용함으로써, 모노클로널 항체의 아이소타입, 서브클래스를 동정할 수 있다.
또한, 더욱 간편한 방법으로서, 시판되는 동정용 키트 (예를 들어, 마우스 타이퍼 키트 ; 바이오래드사 제조) 등을 이용할 수도 있다.
또한, 단백질의 정량은 폴린로우리법, 및 280 ㎚ 에 있어서의 흡광도 [1.4 (OD280) ＝ 이뮤노글로불린 1 ㎎/㎖] 로부터 산출하는 방법에 의해 실시할 수 있다.
(3) 그 밖의 항체
본 발명의 항체에는, 상기 Siglec-15 에 대한 모노클로널 항체에 추가하여, 인간에 대한 이종 항원성을 저하시키는 것 등을 목적으로 하여 인위적으로 개변한 유전자 재조합형 항체, 예를 들어, 키메라 (Chimeric) 항체, 인간화 (Humanized) 항체, 인간 항체 등도 포함된다. 이들 항체는 이미 알려진 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
키메라 항체로는, 항체의 가변 영역과 정상 영역이 서로 이종인 항체, 예를 들어 마우스 유래 항체의 가변 영역을 인간 유래의 정상 영역에 접합시킨 키메라 항체를 들 수 있다 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, 6851-6855, (1984) 참조).
인간화 항체로는, 상보성 결정 영역 (CDR ; complementarity determining region) 만을 인간 유래의 항체에 삽입한 항체 (Nature (1986) 321, p.522-525 참조), CDR 이식법에 의해 CDR 의 배열에 추가하여 일부의 프레임 워크의 아미노산 잔기도 인간 항체에 이식한 항체 (국제공개 팸플릿 WO90/07861) 를 들 수 있다.
또한, 인간 항체를 들 수 있다. 항 Siglec-15 인간 항체란, 인간 염색체 유래 항체의 유전자 배열만을 갖는 인간 항체를 의미한다. 항 Siglec-15 인간 항체는, 인간 항체의 H 사슬과 L 사슬의 유전자를 포함하는 인간 염색체 단편을 갖는 인간 항체 생성 마우스를 사용한 방법 (Tomizuka, K. et al., Nature Genetics (1997) 16, p.133-143,; Kuroiwa, Y. et. al., Nuc. Acids Res. (1998) 26, p.3447-3448 ; Yoshida, H. et. al., Animal Cell Technology : Basic and Applied Aspects vol.10, p.69-73 (Kitagawa, Y., Matuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999.; Tomizuka, K. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, p.722-727 등을 참조) 에 의해 취득할 수 있다.
이와 같은 트랜스제닉 동물은, 구체적으로는, 비인간 포유 동물의 내재성 면역 글로불린 중 (重) 사슬 및 경 (輕) 사슬의 유전자좌가 파괴되고, 대신에 효모 인공 염색체 (Yeast artificial chromosome, YAC) 벡터 등을 개재하여 인간 면역 글로불린 중사슬 및 경사슬의 유전자좌가 도입된 유전자 재조합 동물을, 녹아웃 동물 및 트랜스제닉 동물의 제조, 및 이들 동물끼리를 교배시킴으로써 제조할 수 있다.
또한, 유전자 재조합 기술에 의해, 그러한 인간 항체의 중사슬 및 경사슬 각각을 코드하는 cDNA, 바람직하게는 그 cDNA 를 포함하는 벡터에 의해 진핵 세포를 형질 전환시키고, 유전자 재조합 인간 모노클로널 항체를 생성하는 형질 전환 세포를 배양함으로써, 이 항체를 배양 상청 중으로부터 얻을 수도 있다.
여기서, 숙주로는 예를 들어 진핵 세포, 바람직하게는 CHO 세포, 림프구나 미엘로마 등의 포유 동물 세포를 사용할 수 있다.
또한, 인간 항체 라이브러리로부터 선별된 파지 디스플레이 유래의 인간 항체를 취득하는 방법 (Wormstone, I. M. et. al, Investigative 0phthalmology ＆ Visual Science. (2002) 43 (7), p.2301-2308 ; Carmen, S. et. al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), p.189-203 ; Siriwardena, D. et. al., Opthalmology (2002) 109 (3), p.427-431 등 참조) 도 알려져 있다.
예를 들어, 인간 항체의 가변 영역을 1 개 사슬 항체 (scFv) 로서 파지 표면에 발현시키고, 항원에 결합되는 파지를 선택하는 파지 디스플레이법 (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), p.1105-1116) 을 사용할 수 있다.
항원에 결합됨으로써 선택된 파지의 유전자를 해석함으로써, 항원에 결합되는 인간 항체의 가변 영역을 코드하는 DNA 배열을 결정할 수 있다.
항원에 결합되는 scFv 의 DNA 배열이 밝혀지면, 당해 배열을 갖는 발현 벡터을 제조하고, 적당한 숙주에 도입하여 발현시킴으로써 인간 항체를 취득할 수 있다 (WO92/01047, WO92/20791, WO93/06213, WO93/11236, WO93/19172, WO95/01438, WO95/15388, Annu. Rev. Immunol (1994) 12, p.433-455, Nature Biotechnology (2005) 23 (9), p.1105-1116).
항체 유전자를 일단 단리시킨 후, 적당한 숙주에 도입하여 항체를 제조하는 경우에는, 적당한 숙주와 발현 벡터의 조합을 사용할 수 있다.
진핵 세포를 숙주로서 사용하는 경우, 동물 세포, 식물 세포, 진핵 미생물을 사용할 수 있다.
동물 세포로는, 포유류 세포, 예를 들어, 원숭이의 세포인 COS 세포 (Gluzman, Y. Cell (1981) 23, p.175-182, ATCC CRL-1650), 마우스 선유아 세포 NIH3T3 (ATCC No.CRL-1658) 나 차이니즈·햄스터 난소 세포 (CHO 세포, ATCC CCL-61) 의 디히드로엽산 환원 효소 결손주 (Urlaub, G. and Chasin, L. A. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1980) 77, p.4126-4220) 를 들 수 있다.
원핵 세포를 사용하는 경우에는, 예를 들어, 대장균, 고초균을 들 수 있다.
이들 세포에, 목적으로 하는 항체 유전자를 형질 전환에 의해 도입하고, 형질 전환된 세포를 in vitro 에서 배양함으로써 항체가 얻어진다.
본 발명의 항체의 아이소타입으로서의 제한은 없고, 예를 들어 IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA (IgA1, IgA2), IgD 또는 IgE 등을 들 수 있는데, 바람직하게는 IgG 또는 IgM 을 들 수 있다.
또한 본 발명의 항체는, 항체의 항원 결합부를 갖는 항체의 기능성 단편 또는 그 수식물이어도 된다. 항체를 파파인, 펩신 등의 단백질 분해 효소로 처리하거나, 또는 항체 유전자를 유전자 공학적 수법에 의해 개변시키고 적당한 배양 세포에 있어서 발현시킴으로써, 그 항체의 단편을 얻을 수 있다. 이와 같은 항체 단편 중에서, 항체 전장 분자가 갖는 기능의 전부 또는 일부를 유지하고 있는 단편을 항체의 기능성 단편이라고 할 수 있다. 항체의 기능으로는, 일반적으로는 항원 결합 활성, 항원의 활성을 중화시키는 활성, 항원의 활성을 증강시키는 활성, 항체 의존성 세포 장해 활성, 보체 의존성 세포 상해 활성 및 보체 의존성 세포성 세포 상해 활성을 들 수 있다. 본 발명에 있어서의 항체의 기능성 단편이 유지하는 기능은, 바람직하게는 파골 세포의 형성을 억제하는 활성이고, 보다 바람직하게는 파골 세포의 세포 융합 과정을 억제하는 활성이다.
예를 들어, 항체의 단편으로는, Fab, F(ab')2, Fv, 또는 중사슬 및 경사슬의 Fv 를 적당한 링커로 연결시킨 싱글 체인 Fv (scFv), diabody (diabodies), 선 형상 항체, 및 항체 단편으로 형성된 다특이성 항체 등을 들 수 있다. 또한, F(ab')2 를 환원 조건하에서 처리한 항체의 가변 영역의 1 가의 단편인 Fab' 도 항체의 단편에 포함된다.
또한, 본 발명의 항체는 적어도 2 종류의 상이한 항원에 대하여 특이성을 갖는 다특이성 항체이어도 된다.
통상적으로 이와 같은 분자는 2 개의 항원을 결합시키는 것이지만 (즉, 2 중 특이성 항체 (bispecific antibody)), 본 발명에 있어서의 「다특이성 항체」는, 그 이상 (예를 들어, 3 종류) 의 항원에 대하여 특이성을 갖는 항체를 포함하는 것이다.
본 발명의 항체는, 다특이성 항체는 전장으로 이루어지는 항체, 또는 그러한 항체의 단편 (예를 들어, F(ab')2 2 중 특이성 항체) 이어도 된다. 2 중 특이성 항체는 2 종류 항체의 중사슬과 경사슬 (HL 쌍) 을 결합시켜 제조할 수도 있고, 상이한 모노클로널 항체를 생성하는 하이브리도마를 융합시키고, 2 중 특이성 항체 생성 융합 세포를 제조함으로써도 제조할 수 있다 (Millstein et al., Nature (1983) 305, p.537-539).
본 발명의 항체는 1 개 사슬 항체 (scFv 라고도 기재한다) 이어도 된다. 1 개 사슬 항체는, 항체의 중사슬 V 영역과 경사슬 V 영역을 폴리펩티드의 링커로 연결시킴으로써 얻어진다 (Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 113 (Rosenburg 및 Moore 편저, Springer Verlag, New York, p.269-315 (1994), Nature Biotechnology (2005), 23, p.1126-1136). 또한, 2 개의 scFv 를 폴리펩티드 링커로 결합시켜 제조되는 BiscFv 단편을 2 중 특이성 항체로서 사용할 수도 있다.
1 개 사슬 항체를 제조하는 방법은 당기술 분야에 있어서 주지되어 있다 (예를 들어, 미국특허 제4,946,778호, 미국특허 제5,260,203호, 미국특허 제5,091,513호, 미국특허 제5,455, 030호 등을 참조). 이 scFv 에 있어서, 중사슬 V 영역과 경사슬 V 영역은, 콘주게이트를 만들지 않는 링커, 바람직하게는 폴리펩티드 링커를 개재하여 연결된다 (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988), 85, p.5879-5883). scFv 에 있어서의 중사슬 V 영역 및 경사슬 V 영역은, 동일한 항체에서 유래해도 되고, 별개의 항체에서 유래해도 된다.
V 영역을 연결시키는 폴리펩티드 링커로는, 예를 들어 12 ∼ 19 잔기로 이루어지는 임의의 1 개 사슬 펩티드가 사용된다.
scFv 를 코드하는 DNA 는, 상기 항체의 중사슬 또는 중사슬 V 영역을 코드하는 DNA, 및 경사슬 또는 경사슬 V 영역을 코드하는 DNA 중, 그들의 배열 중 전부 또는 원하는 아미노산 배열을 코드하는 DNA 부분을 주형으로 하고, 그 양단 (兩端) 을 규정하는 프라이머 1 쌍을 사용하여 PCR 법에 의해 증폭시키고, 이어서, 추가로 폴리펩티드 링커 부분을 코드하는 DNA, 및 그 양단이 각각 중사슬, 경사슬과 연결되도록 규정하는 프라이머 쌍을 조합하여 증폭시킴으로써 얻어진다.
또한, 일단 scFv 를 코드하는 DNA 가 제조되면, 그것들을 함유하는 발현 벡터, 및 그 발현 벡터에 의해 형질 전환된 숙주를 통상적인 방법에 따라 얻을 수 있고, 또한 그 숙주를 사용함으로써, 통상적인 방법에 따라 scFv 를 얻을 수 있다.
이들 항체 단편은, 상기와 동일하게 하여 유전자를 취득하고 발현시키며, 숙주에 의해 생성시킬 수 있다.
본 발명의 항체는, 다량화되고 항원에 대한 친화성을 높인 것이어도 된다. 다량화되는 항체로는, 1 종류의 항체이어도 되고, 동일한 항원의 복수의 에피토프를 인식하는 복수의 항체이어도 된다. 항체를 다량화시키는 방법으로는, IgG CH3 도메인과 2 개의 scFv 의 결합, 스트렙트아비딘과의 결합, 헤릭스턴-헤릭스 모티프의 도입 등을 들 수 있다.
본 발명의 항체는, 아미노산 배열이 상이한 복수 종류의 항 Siglec-15 항체의 혼합물인 폴리클로널 항체이어도 된다. 폴리클로널 항체의 일례로는, CDR 이 상이한 복수 종류의 항체의 혼합물을 들 수 있다. 그러한 폴리클로널 항체로는, 상이한 항체를 생성하는 세포의 혼합물을 배양하고, 그 배양물로부터 정제된 항체를 사용할 수 있다 (WO2004/061104호 참조).
항체의 수식물로서, 폴리에틸렌글리콜 (PEC) 등의 각종 분자와 결합된 항체를 사용할 수도 있다.
본 발명의 항체는, 또한 이들 항체와 기타 약제가 콘주게이트를 형성하고 있는 것 (Immunoconjugate) 이어도 된다. 이와 같은 항체의 예로는, 그 항체가 방사성 물질이나 약리 작용을 갖는 화합물과 결합되어 있는 것을 들 수 있다 (Nature Biotechnology (2005) 23, p.1137-1146).
얻어진 항체는, 균일하게까지 정제할 수 있다. 항체의 분리, 정제는 통상적인 단백질에서 사용되고 있는 분리, 정제 방법을 사용하면 된다.
예를 들어 크로마토그래피 칼럼, 필터, 한외 여과, 염석, 투석, 조제용 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동, 등전점 전기 영동 등을 적절히 선택, 조합하면, 항체를 분리, 정제할 수 있지만 (Srategies for Protein Purification and Characterization : A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996) ; Antibodies : A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), 이들에 한정되는 것은 아니다.
크로마토그래피로는, 어피니티 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피 등을 들 수 있다.
이들 크로마토그래피는, HPLC 나 FPLC 등의 액체 크로마토그래피를 사용하여 실시할 수 있다.
어피니티 크로마토그래피에 사용하는 칼럼으로는, 프로테인 A 칼럼, 프로테인 G 칼럼을 들 수 있다.
예를 들어 프로테인 A 칼럼을 사용한 칼럼으로서, Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (Pharmacia) 등을 들 수 있다.
또한 항원을 고정화시킨 담체를 사용하고, 항원에 대한 결합성을 이용하여 항체를 정제할 수도 있다.
5. 항 Siglec-15 항체를 함유하는 의약
상기 서술한 「4. 항 Siglec-15 항체의 제조」의 항에 기재된 방법으로 얻어지는 항 Siglec-15 항체 중에서, Siglec-15 의 생물 활성을 중화시키는 항체를 얻을 수 있다. 이들 Siglec-15 의 생물 활성을 중화시키는 항체는, 생체 내에서의 Siglec-15 의 생물 활성, 즉, 파골 세포의 분화 및/또는 성숙을 저해하는 점에서, 의약으로서, 파골 세포의 분화 및/또는 성숙 이상에서 기인하는 골대사 이상에 대한 치료 및/또는 예방제로서 사용할 수 있다. 골대사 이상은 실질적인 골상실 (골감소증 또는 골용해증) 에 의해 특징지어지는 어느 장해이어도 된다. 일반적으로, 항 Siglec-15 항체에 의한 치료 및/또는 예방은 골흡수를 억제할 필요가 있는 경우에 적용된다. 항 Siglec-15 항체로 치료 및/또는 예방할 수 있는 골대사 이상으로는, 골다공증 (폐경 후 골다공증, 노인성 골다공증, 스테로이드나 면역 억제제 등의 치료용 약제의 사용에 의한 속발성 골다공증, 관절 류머티즘에 수반되는 골다공증), 관절 류머티즘에 수반되는 골파괴, 암성 고칼슘혈증, 다발성 골수종이나 암의 골전이에 수반되는 골파괴, 거세포종, 치근막염에 의한 치아의 상실, 인공 관절 주위의 골융해, 만성 골수염에 있어서의 골파괴, 골페이젯병, 신성 골이영양증, 골형성 부전증 등을 들 수 있는데, 파골 세포에 의한 실질적인 골상실을 수반하는 질환이면 이들에 한정되지 않는다. 상기의 의약으로서의 항 Siglec-15 항체의 예로서, #32A1 항체 또는 #41B1 항체로부터 4. (3) 「그 밖의 항체」에 기재된 방법에 의해 제조된 키메라 항체 또는 인간화 항체를 들 수 있다. 또한, #32A1 항체 또는 #41B1 항체와 동일한 에피토프를 갖는 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체도 의약으로서 사용할 수 있다. 어느 항 Siglec-15 항체가 #32A1 항체 또는 #41B1 항체와 동일한 에피토프를 갖는 것은, Siglec-15 의 특정한 부분 펩티드에 대하여 이들 항체가 공통적으로 결합되는지의 여부를 관찰함으로써 확인할 수 있다. 또한, 어느 항 Siglec-15 항체가, Siglec-15 와의 결합에 있어서 #32A1 항체 또는 #41B1 항체와 경합하는 것이면, 이들 항체가 공통의 에피토프를 갖는 것으로 판정할 수 있다.
in vitro 에서의 항 Siglec-15 항체에 의한 Siglec-15 의 생물 활성의 중화 활성은 예를 들어, Siglec-15 를 과잉 발현시키고 있는 세포의 파골 세포로의 분화 억제 활성으로 측정할 수 있다. 예를 들어, 마우스 단구 유래 세포주 RAW264.7 세포 또는 RAW264 세포에 다양한 농도로 항 Siglec-15 항체를 첨가하고, RANKL 또는 TNF-
Figure 112010014520647-pct00013
자극에 의한, 파골 세포로의 분화 억제 활성을 측정할 수 있다. 또한, 골수 유래의 초대 배양 세포에 다양한 농도로 항 Siglec-15 항체를 첨가하고, RANKL, TNF-
Figure 112010014520647-pct00014
또는 활성형 비타민 D3 자극에 의한, 파골 세포로의 분화 억제 활성을 측정할 수 있다. 또한, 정상 인간 파골 전구 세포 (Normal Human Natural Osteoclast Precursor Cells, 산코 쥰야쿠로부터 구입 가능, 카탈로그 번호 2T-110) 에 다양한 농도로 항 Siglec-15 항체를 첨가하고, RANKL 및 M-CSF 자극에 의한, 파골 세포로의 분화 억제 활성을 측정할 수 있다. 이와 같은 파골 세포의 분화 억제 효과는, 실시예 17, 19, 20 및 26 에 나타내는 파골 세포의 타르타르산 내성 산성 포스파타아제 (TRAP) 활성 억제를 지표로 하여 측정할 수 있다. 또한, 실시예 19, 21, 22 및 35 에 나타내는 바와 같이, TRAP 양성 다핵 파골 세포의 형성 억제, 즉 파골 세포의 세포 융합 억제를 지표로 해서도, 파골 세포의 분화 억제 효과를 측정할 수 있다. 상기의 파골 세포 분화의 시험계에 대하여, 본 발명의 항체는 30 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 세포 융합 억제 효과를 나타내고, 몇 개의 항체는 3 ㎍/㎖ 이하, 또는 1 ㎍/㎖ 이하의 농도에서도 억제 효과를 나타냈다. 더욱 저농도측에서의 효과를 시험한 경우, 63 ng/㎖ 내지 1 ㎍/㎖ 의 범위에서도 파골 세포의 분화 억제 효과가 복수의 항체에서 관찰되었다. 또한, 대퇴골 및/또는 경골 유래의 세포를 사용한 피트 어세이 (Takada et al., Bone and Mineral, (1992) 17, 347-359) 실험에 있어서, 대퇴골 및/또는 경골 유래의 세포에 다양한 농도로 항 Siglec-15 항체를 첨가하고 상아 절편 상의 피트 형성을 관찰함으로써, in vitro 에 있어서의 파골 세포에 의한 골흡수의 억제 활성을 측정할 수 있다. in vitro 에 있어서의 파골 세포에 의한 골흡수의 억제 활성의 측정계로는, 실시예 37 에 나타내고 있는 바와 같이, 유로퓸이 결합된 인간 콜라겐을 코팅한 플레이트를 사용할 수도 있다. 상기의 파골 세포에 의한 골흡수의 시험계에 있어서, 본 발명의 항체는 3 ㎍/㎖ 이하의 농도, 즉 0.3 ㎍/㎖ 내지 3 ㎍/㎖ 의 범위에서 골흡수를 억제하였다. in vivo 에서의 실험 동물을 이용한 항 Siglec-15 항체의 골대사 이상에 대한 치료 또는 예방 효과는, 예를 들어, 골다공증 모델 동물 또는 Siglec-15 를 과잉으로 발현시키고 있는 트랜스제닉 동물에게 항 Siglec-15 항체를 투여하고, 파골 세포의 변화를 측정함으로써 확인할 수 있다.
이와 같이 하여 얻어진 Siglec-15 의 생물 활성을 중화시키는 항체는, 의약으로서, 특히 골다공증, 관절 류머티즘에 수반되는 골파괴, 암의 골전이에 수반되는 골파괴 등의 골대사 이상의 치료 또는 예방을 목적으로 한 의약 조성물으로서, 또는 이와 같은 질환의 면역학적 진단을 위한 항체로서 유용하다.
관절 류머티즘 (RA) 의 치료에 있어서, 질환의 발증에 수반되어 발생하는 골상실이 큰 과제가 되고 있다. RA 에 수반되는 이 골상실에 있어서는, 파골 세포가 중심적인 역할을 하고 있다는 것이 보고되어 있다. RA 에 있어서의 파골 세포의 유도 (분화, 성숙), 활성화, 및 골파괴의 원인으로서 가장 중요한 것으로 생각되고 있는 사이토카인은 RANKL 과 TNF-
Figure 112010014520647-pct00015
이다 (Romas E et al., Bone 30, p340-346, 2002). 본 명세서의 실시예 19 에서도 나타낸 바와 같이, RANKL 의 디코이 리셉터인 OCIF/OPG 에서는 RANKL 로 유도되는 파골 세포 형성은 억제할 수 있지만, TNF-
Figure 112010014520647-pct00016
로 유도되는 파골 세포 형성은 억제되지 않는다. 그 한편으로, 본 발명에 있어서의 항 Siglec-15 항체에 의해, RANKL 로 유도되는 파골 세포 형성과 TNF-
Figure 112010014520647-pct00017
로 유도되는 파골 세포 형성의 양방이 효과적으로 억제되었다. 따라서, 본 발명의 항 Siglec-15 항체에 의해, RA 등에 있어서의 TNF-
Figure 112010014520647-pct00018
로 유도되는 골상실과 골파괴를, RANKL 블로커 (OCIF/OPG, 항 RANKL 항체 등) 이상으로 강력하게 억제할 수 있는 것이 기대된다.
항 Siglec-15 항체는, 하나의 예로는, 골대사 이상의 치료 또는 예방에 대해서는 그 항체 단독으로, 또는 적어도 1 개의 뼈에 관한 질환의 치료제와 함께 투여할 수 있다. 또한 하나의 예로서, 항 Siglec-15 항체는 치료상 유효한 양의 항골대사 이상 치료 약제와 함께 투여할 수 있다. 항 Siglec-15 항체와 함께 투여할 수 있는 치료제로는, 비스포스포네이트, 활성형 비타민 D3, 칼시토닌 및 그 유도체, 에스트라디올 등의 호르몬 제제, SERMs (Selective estrogen receptor modulators), 이프리플라본, 비타민 K2 (메나테트레논), 칼슘 제제, PTH (parathyroid hormone) 제제, 비스테로이드성 항염증제, 가용성 TNF 리셉터 제제, 항 TNF
Figure 112010014520647-pct00019
항체 또는 그 항체의 기능성 단편, 항 PTHrP (parathyroid hormone-related protein) 항체 또는 그 항체의 기능성 단편, IL-1 리셉터 안타고니스트, 항 IL-6 리셉터 항체 또는 그 항체의 기능성 단편, 항 RANKL 항체 또는 그 항체의 기능성 단편, 및 OCIF (osteoclastogenesis inhibitory factor) 등을 들 수 있는데 이들에 한정되지 않는다. 골대사 이상 상태나 어느 정도의 치료 및/또는 예방을 목표로 하는지에 따라, 2, 3 또는 그 이상의 종류의 약제를 투여할 수도 있고, 그들 약제는 동일한 제제 중에 봉입함으로써 함께 공급할 수 있다. 그들 약제와 항 Siglec-15 항체는 동일한 제제 중에 봉입함으로써 함께 공급할 수도 있다. 또한, 그들 약제는 치료 및/또는 예방용 키트로서 봉입함으로써 함께 공급할 수도 있다. 또한, 그들 약제와 항 Siglec-15 항체는 따로 공급할 수도 있다. 유전자 치료에 있어서 투여하는 경우에는, 단백질성의 골질환 치료제의 유전자와 항 Siglec-15 항체의 유전자는, 별개의 또는 동일한 프로모터 영역의 하류에 삽입할 수 있고, 별개의 또는 동일한 벡터에 도입할 수 있다.
항 Siglec-15 항체, 또는 그 프래그먼트에 대하여 골질환 치료제를 결합시킴으로써, M. C. Garnet 「Targeted drug conjugates : principles and progress」, Advanced Drug Delivery Reviews, (2001) 53, 171-216 에 기재된 표적형 약물 복합체를 제조할 수 있다. 이 목적으로는, 항체 분자 외에, 파골 세포의 인식성을 완전 소실하지 않는 한, 어느 항체 프래그먼트도 적용할 수 있지만, 예를 들어, Fab, F(ab')2, Fv 등의 프래그먼트를 예로서 들 수 있고, 본 발명에 있어서도 동일하게 항체 및 그 프래그먼트를 사용할 수 있다. 항 Siglec-15 항체 또는 그 항체의 프래그먼트와 골질환 치료제의 결합 양식은, M. C. Garnet 「Targeted drug conjugates : principles and progress」, Advanced Drug Delivery Reviews, (2001) 53, 171-216, G. T. Hermanson 「Bioconjugate Techniques」Academic Press, California (1996), Putnam and J. Kopecek 「Polymer Conjugates with Anticancer Activity」Advances in Polymer Science (1995) 122, 55-123 등에 기재되는 다양한 형태가 있을 수 있다. 즉, 항 Siglec-15 항체와 골질환 치료제가 화학적으로 직접 또는 올리고펩티드 등의 스페이서가 개재되어 결합되는 양식이나, 적당한 약물 담체를 개재하여 결합되는 양식을 들 수 있다. 약물 담체의 예로는, 리포솜이나 수용성 고분자를 들 수 있다. 이들 약물 담체가 개재되는 양식으로는, 보다 구체적으로는, 항체와 골질환 치료제가 리포솜에 포함되고, 그 리포솜과 항체가 결합된 양식, 및 골질환 치료제가 수용성 고분자 (분자량 1000 내지 10 만 정도의 화합물) 에 화학적으로 직접 또는 올리고펩티드 등의 스페이서를 개재시켜 결합되고, 그 수용성 고분자에 항체가 결합된 양식을 예로서 들 수 있다. 항체 (또는 그 프래그먼트) 와 골질환 치료제, 리포솜 및 수용성 고분자 등의 약물 담체의 결합은, G. T. Hermanson 「Bioconjugate Techniques」Academic Press, California (1996), Putnam and J. Kopecek 「Polymer Conjugates with Anticancer Activity」Advances in Polymer Science (1995) 122, 55-123 에 기재된 방법 등의 당업자에게 주지된 방법에 의해 실시할 수 있다. 골질환 치료제의 리포솜으로의 포함은, D. D. Lasic 「Liposomes : From Physics to Applications」, Elsevier Science Publishers B. V., Amsterdam (1993) 등에 기재된 방법 등의 당업자에게 주지된 방법에 의해 실시할 수 있다. 골질환 치료제의 수용성 고분자에 대한 결합은, D. Putnam and J. Kopecek 「Polymer Conjugates with Anticancer Activity」Advances in Polymer Science (1995) 122, 55-123 에 기재된 방법 등의 당업자에게 주지된 방법에 의해 실시할 수 있다. 항체 (또는 그 프래그먼트) 와 단백질성의 골질환 치료제 (또는 그 프래그먼트) 의 복합체는, 상기의 방법 외에, 유전자 공학적으로 당업자에게 주지된 방법에 의해 제조할 수 있다.
본 발명은, 치료 및/또는 예방에 유효한 양의 항 Siglec-15 항체와 약학상 허용되는 희석제, 담체, 가용화제, 유화제, 보존제 및/또는 보조제를 함유하는 의약 조성물도 제공한다.
본 발명은, 치료 및/또는 예방에 유효한 양의 항 Siglec-15 항체와 치료 및/또는 예방에 유효한 양의 적어도 1 개의 골질환 치료제와 약학상 허용되는 희석제, 담체, 가용화제, 유화제, 보존제 및/또는 보조제를 함유하는 의약 조성물도 제공한다. 골질환 치료제로는, 비스포스포네이트, 활성형 비타민 D3, 칼시토닌 및 그 유도체, 에스트라디올 등의 호르몬 제제, SERMs (selective estrogen receptor modulators), 이프리플라본, 비타민 K2 (메나테트레논), 칼슘 제제, PTH (parathyroid hormone) 제제, 비스테로이드성 항염증제, 가용성 TNF 리셉터 제제, 항 TNF
Figure 112010014520647-pct00020
항체 또는 그 항체의 기능성 단편, 항 PTHrP (parathyroid hormone-related protein) 항체 또는 그 항체의 기능성 단편, IL-1 리셉터 안타고니스트, 항 IL-6 리셉터 항체 또는 그 항체의 기능성 단편, 항 RANKL 항체 또는 그 항체의 기능성 단편, 및 OCIF (osteoclastogenesis inhibitory factor) 등을 들 수 있는데 이들에 한정되지 않는다.
본 발명의 의약 조성물에 있어서 허용되는 제제에 사용되는 물질로는 바람직하게는 투여량이나 투여 농도에 있어서, 의약 조성물이 투여되는 자에 대하여 비독성인 것이 바람직하다.
본 발명의 의약 조성물은, pH, 침투압, 점도, 투명도, 색, 등장성, 무균성, 안정성, 용해율, 서방률 (徐放率), 흡수율, 침투율을 변경하거나 유지하거나 하기 위한 제제용 물질을 함유할 수 있다. 제제용 물질로서 이하의 것을 들 수 있는데, 이들에 제한되지 않는다 : 글리신, 알라닌, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신 등의 아미노산류, 항균제, 아스코르브산, 황산나트륨 또는 아황산수소나트륨 등의 항산화제, 인산, 시트르산, 붕산 버퍼, 탄산수소, 트리스-염산 (Tris-HCl) 용액 등의 완충제, 만니톨이나 글리신 등의 충전제, 에틸렌디아민4아세트산 (EDTA) 등의 킬레이트제, 카페인, 폴리비닐피롤리딘, β-시클로덱스트린이나 히드록시프로필-β-시클로덱스트린 등의 착화제, 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린 등의 증량제, 단당류, 2 당류 등의 기타 탄수화물, 착색제, 향미제, 희석제, 유화제나 폴리비닐피롤리딘 등의 친수 폴리머, 저분자량 폴리펩티드, 염 형성 카운터이온, 염화벤즈알코늄, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 페네틸알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로렉시딘, 소르브산 또는 과산화수소 등의 방부제, 글리세린, 프로필렌·글리콜 또는 폴리에틸렌글리콜 등의 용매, 만니톨 또는 소르비톨 등의 당알코올, 현탁제, 소르비탄에스테르, 폴리소르베이트 20 이나 폴리소르베이트 80 등 폴리소르베이트, 트리톤 (triton), 트로메타민 (tromethamine), 레시틴 또는 콜레스테롤 등의 계면 활성제, 수크로오스나 소르비톨 등의 안정화 증강제, 염화나트륨, 염화칼륨이나 만니톨·소르비톨 등의 탄성 증강제, 수송제, 희석제, 부형제, 및/또는 약학상의 보조제. 이들 제제용 물질의 첨가량은, 항 Siglec-15 항체의 중량에 대하여 0.01 ∼ 100 배, 특히 0.1 ∼ 10 배 첨가하는 것이 바람직하다. 제제 중의 바람직한 의약 조성물의 조성은 당업자에 의해 적용 질환, 적용 투여 경로 등에 따라 적절히 결정할 수 있다.
의약 조성물 중의 부형제나 담체는 액체이어도 되고 고체이어도 된다. 적당한 부형제나 담체는 주사용의 물이나 생리 식염수, 인공 뇌 척수액이나 비경구 투여에 통상적으로 사용되고 있는 기타 물질이어도 된다. 중성의 생리 식염수나 혈청 알부민을 함유하는 생리 식염수를 담체에 사용할 수도 있다. 의약 조성물에는 pH 7.0 - 8.5 의 Tris 버퍼나 pH 4.0 - 5.5 의 아세트산 버퍼나 그것들에 소르비톨이나 기타 화합물을 함유할 수도 있다. 본 발명의 의약 조성물에는 항 Siglec-15 항체를 함유하는 의약 조성물 그리고, 항 Siglec-15 항체 및 적어도 1 개의 골질환 치료제를 함유하는 의약 조성물을 들 수 있으며, 본 발명의 의약 조성물은 선택된 조성과 필요한 순도를 갖는 약제로서, 동결 건조품 또는 액체로서 준비된다. 항 Siglec-15 항체를 함유하는 의약 조성물 그리고, 항 Siglec-15 항체 및 적어도 1 개의 골대사 이상 치료 약제를 함유하는 의약 조성물은 수크로오스와 같은 적당한 부형제를 사용한 동결 건조품으로서 성형될 수도 있다.
본 발명의 의약 조성물은 비경구 투여용으로 조제할 수도 있고, 경구에 의한 소화관 흡수용으로 조제할 수도 있다. 제제의 조성 및 농도는 투여 방법에 따라 결정할 수 있으며, 본 발명의 의약 조성물에 함유되는 항 Siglec-15 항체의 Siglec-15 에 대한 친화성, 즉, Siglec-15 에 대한 해리 상수 (Kd 값) 에 대하여, 친화성이 높을 (Kd 값이 낮을) 수록, 인간에 대한 투여량을 적게 하여 약효를 발휘할 수 있으므로, 그 결과에 기초하여 본 발명의 의약 조성물의 인간에 대한 투여량을 결정할 수도 있다. 투여량은, 인간형 항 Siglec-15 항체를 인간에 대하여 투여할 때에는, 약 0.1 ∼ 100 ㎎/㎏ 을 1 ∼ 180 일간에 1 회 투여하면 된다.
본 발명의 의약 조성물의 형태로는, 점적을 포함하는 주사제, 좌제, 경비제 (經鼻劑), 설하제 (舌下劑), 경피 흡수제 등을 들 수 있다.
6. 직접 상호 작용하는 물질의 탐색
본 발명의 다른 하나의 양태로는, Siglec-15 의 활동을 억제하는 물질을 얻는 것을 목적으로 한, 그 단백질의 입체 구조를 베이스로 한 드러그 디자인의 수법을 포함한다. 이와 같은 수법은, 래셔널 드러그 디자인법으로서 알려져 있으며, 효소 활성 등이나 리간드, 코팩터 또는 DNA 에 대한 결합 등을 효율적으로 저해 또는 활성화시키는 화합물의 탐색에 이용되고 있다. 그 예로서, 이미 출시된 항 HIV 제인 프로테아제의 저해제가 잘 알려져 있다. 본 발명의 Siglec-15 의 3 차원 구조 해석에 있어서도, X 선 결정 해석이나 핵자기 공명법과 같은 일반적으로 잘 알려져 있는 수법을 이용할 수 있다. 또한, Siglec-15 의 기능을 억제하는 물질의 탐색에는, 컴퓨터 드러그 디자인 (CADD) 을 활용한 설계도 가능하다. 그 예로는, 관절 류머티즘 치료의 새로운 게놈 신약으로서 기대되고 있는, AP-1 의 기능을 저해하는 저분자 화합물 (국제특허출원공개 WO99/58515호) 등이 알려져 있다. 이와 같은 방법에 의해, Siglec-15 에 직접 결합되거나, 또는 Siglec-15 와 기타 인자의 상호 작용을 저해함으로써, Siglec-15 의 기능을 억제하는 물질을 얻을 수 있다.
또한, 다른 하나의 양태는, 본 발명의 Siglec-15 가 회합되는 폴리펩티드, 즉 Siglec-15 의 파트너 단백질에 관한 것이다. 즉, 본 발명은 Siglec-15 의 활성을 조절하는 파트너 단백질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
이 스크리닝 방법의 하나의 양태는, Siglec-15 에 피험 단백질 시료를 접촉시켜, Siglec-15 에 결합되는 단백질을 선택하는 공정을 포함한다. 이와 같은 방법으로는, 예를 들어, 정제된 Siglec-15 를 사용하여, 이것에 결합되는 단백질의 어피니티 정제를 실시하는 방법을 들 수 있다. 구체적인 방법의 일례를 나타내면, Siglec-15 에 히스티딘 6 개로 이루어지는 배열을 어피니티 태그로 하여 융합시킨 것을 제조하고, 이것을 세포의 추출액 (미리 니켈-아가로오스 칼럼에 충전하고, 이 칼럼을 그대로 지나간 획분) 과 4 ℃ 에서 12 시간 인큐베이트하고, 이어서, 이 혼합물에 별도 니켈-아가로오스 담체를 첨가하고 4 ℃ 에서 1 시간 인큐베이트한다. 니켈-아가로오스 담체를 세정 버퍼로 충분히 세정한 후, 100 mM 이미다졸을 첨가함으로써, Siglec-15 와 특이적으로 결합되는 세포 추출액 중의 단백질을 용출시키고 정제하여, 이 구조를 결정한다. 이와 같이 하여, Siglec-15 와 직접 결합되는 단백질, 및 Siglec-15 와의 결합 활성은 갖지 않지만, 서브 유닛으로서 Siglec-15 에 직접 결합되는 단백질과 복합체를 형성함으로써 간접적으로 Siglec-15 에 결합되는 단백질을 정제할 수 있다. 다른 방법으로는, 파 웨스턴 블롯법이나, 효모나 포유류 동물 세포를 사용한 투 하이브리드 시스템법에 의한 클로닝도 가능하지만, 이들 방법에 한정되지 않는다.
이와 같이 하여, Siglec-15 와 직접 또는 간접적으로 상호 작용하는 파트너 단백질의 cDNA 가 얻어지면, Siglec-15 와 그 파트너 단백질의 상호 작용을 저해하는 물질의 기능적 스크리닝에 이용할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어, Siglec-15 와 글루타티온 S-트랜스페라아제의 융합 단백질을 조제하고, 항글루타티온 S-트랜스페라아제 항체로 덮은 마이크로 플레이트에 결합시킨 후, 비오틴화된 그 파트너 단백질을 이 융합 단백질과 접촉시켜, 그 융합 단백질과의 결합을 스트렙트아비딘화 알칼리포스파타아제로 검출한다. 비오틴화된 그 파트너 단백질 첨가시, 피험 물질도 첨가하고, 융합 단백질과 그 파트너 단백질의 결합을 촉진 또는 저해하는 물질을 선택한다. 이 방법에서는, 융합 단백질에 직접 작용하는 물질 또는 그 파트너 단백질에 직접 작용하는 물질이 얻어진다.
융합 단백질과 그 파트너 단백질의 결합이 간접적이어서, 어떠한 다른 인자를 개재하고 있는 경우에는, 예를 들어 그 인자를 포함하는 세포 추출액 존재하에서 동일하게 상기 어세이를 실시한다. 이 경우에는, 그 인자에 대하여 작용하는 물질도 선택될 가능성이 있다.
또한, 얻어진 파트너 단백질이 Siglec-15 의 기능을 촉진시키는 활성을 갖고 있는 경우에는, 이미 기재한 Siglec-15 유전자의 발현 벡터를 응용한 시험 방법에 따라, 골대사 이상 치료 및/또는 예방제, 예를 들어, 골다공증의 치료 및/또는 예방제로서 유용한 후보 물질의 스크리닝을 실시할 수 있다. 또한, 얻어진 파트너 단백질이 Siglec-15 의 기능을 억제하는 활성을 갖고 있는 경우에는, 이와 같은 억제 인자를 코드하는 폴리뉴클레오티드는 골대사 이상의 유전자 치료에 사용할 수 있다.
그러한 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 동정된 저해 인자의 아미노산 배열을 해석하고, 그 아미노산 배열을 코드하는 올리고뉴클레오티드 프로브를 합성하고 cDNA 라이브러리나 게놈 라이브러리의 스크리닝을 실시함으로써 취득할 수 있다. 또한, Siglec-15 의 기능 저해 활성을 갖는 폴리펩티드가 랜덤하게 합성된 인공 펩티드 라이브러리 유래인 경우는, 그 펩티드의 아미노산 배열을 코드하는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 DNA 를 화학 합성한다.
유전자 치료에 있어서는, 그와 같이 하여 얻어진 저해 인자를 코드하는 유전자를, 예를 들어 바이러스 벡터에 삽입하고, 그 재조합 바이러스 벡터를 갖는 바이러스 (무독화된 것) 를 환자에게 감염시킨다. 환자 체내에서는 항골파괴 인자가 생성되어 파골 세포의 분화 억제 기능을 가지므로, 골대사 이상의 치료 및/또는 예방이 가능해진다.
유전자 치료제를 세포 내에 도입하는 방법으로는, 바이러스 벡터를 이용한 유전자 도입 방법 또는 비바이러스성의 유전자 도입 방법의 어느 방법도 적용할 수 있다.
바이러스 벡터에 의한 유전자 도입 방법으로는, 예를 들어 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스바이러스, 백시니아 바이러스, 폭스바이러스, 폴리오바이러스, 신비스바이러스 등의 DNA 바이러스 또는 RNA 바이러스에, Siglec-15 의 저해 인자 또는 그 변이체를 코드하는 DNA 를 삽입하여 도입하는 방법을 들 수 있다. 이 중, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 백시니아 바이러스를 사용한 방법이 특히 바람직하다. 비바이러스성의 유전자 도입 방법으로는, 발현 플라스미드를 직접 근육 내에 투여하는 방법 (DNA 백신법), 리포솜법, 리포펙틴법, 마이크로 인젝션법, 인산칼슘법, 일렉트로포레이션법 등을 들 수 있고, 특히 DNA 백신법, 리포솜법이 바람직하다.
또한 유전자 치료제를 실제로 의약으로서 작용시키려면, DNA 를 직접 체내에 도입하는 인 비보 (in vivo) 법 및 인간으로부터 어느 종류의 세포를 취출하여 체외에서 DNA 를 그 세포에 도입하고, 그 세포를 체내로 되돌리는 엑스 비보 (ex vivo) 법이 있다.
예를 들어, 그 유전자 치료제가 인 비보법에 의해 투여되는 경우에는, 질환, 증상 등에 따라 정맥, 동맥, 피하, 피내, 근육 내 등, 적당한 투여 경로에 의해 투여된다. 또한 인 비보법에 의해 투여하는 경우에는, 그 유전자 치료제는 일반적으로는 주사제로 되지만, 필요에 따라 관용의 담체를 첨가해도 된다. 또한, 리포솜 또는 막 융합 리포솜 (센다이바이러스-리포솜 등) 의 형태로 한 경우에는, 현탁제, 동결제, 원심 분리 농축 동결제 등의 리포솜 제제로 할 수 있다.
배열표의 배열 번호 1 또는 3 에 나타내어지는 뉴클레오티드 배열의 전장 배열 또는 부분 배열에 상보적인 뉴클레오티드 배열은, 이른바 안티센스 치료에 사용할 수 있다. 안티센스 분자는, 배열표의 배열 번호 1 또는 3 에 나타내어지는 뉴클레오티드 배열에서 선택되는 뉴클레오티드 배열의 일부에 상보적인, 통상적으로 15 내지 30 mer 로 이루어지는 DNA, 또는 그 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 또는 모르폴리노 유도체 등의 안정적인 DNA 유도체, 2'-O-알킬 RNA 등의 안정적인 RNA 유도체로서 사용될 수 있다. 그러한 안티센스 분자를 미량 주입, 리포솜 캡슐화에 의해, 또는 안티센스 배열을 갖는 벡터를 이용하여 발현시키는 등, 본 발명의 기술 분야에 있어서 주지된 방법으로 세포에 도입할 수 있다. 이와 같은 안티센스 요법은, 배열표의 배열 번호 1 또는 3 에 나타내어지는 뉴클레오티드 배열이 코드하는 단백질의 활성이 지나치게 증가함으로써 야기되는 병의 치료에 유용하다.
또한, 2 개 사슬의 단사슬 RNA (siRNA) 를 사용하는 방법을 들 수도 있다 ( 「진즈·앤드·디벨로프먼츠 (Genes and Developments)」), 2001년 1월 15일, 제 15 권, 제 2 호, p.188-200). 예를 들어, Siglec-15 유전자에 대한 siRNA 를 제조하고, 문헌에 기재된 방법에 따라 도입함으로써, Siglec-15 의 과잉 발현을 수반하는 골대사성 질환의 치료제로 할 수 있다.
실시예
이하, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다. 또한, 하기 실시예에 있어서 유전자 조작에 관한 각 조작은 특별히 명시가 없는 한, 「몰레큘러 클로닝 (Molecular Cloning)」(Sambrook, J., Fritsch, E. F. 및 Maniatis, T. 저, Cold Spring Harbor Laboratory Press 로부터 1989년에 발간) 에 기재된 방법에 의해 실시하거나, 또는 시판되는 시약이나 키트를 사용하는 경우에는 시판품의 지시서에 따라 사용하였다.
실시예 1. 거세포종 조직에 있어서의 인간 Siglec-15 유전자의 발현
거세포종 (Giant cell tumor ; GCT) 은, 조직학적으로 파골 세포와 유사한 다핵 거세포가 다수 출현하는 골종양으로서, 임상적 소견으로서 골용해성의 골파괴를 특징으로 한다 (Bullough et al., Atlas of Orthopedic Pathology 2nd edition, 17.6-17.8, Lippincott Williams ＆ Wilkins Publishers (1992)). 인간 Siglec-15 유전자와 부분적으로 중복되는 뉴클레오티드 배열을 갖는 EST 프로브 (Affymetrix Genechip HG-U133 probe 215856_at : 애피메트릭스사 제조) 에 대해, GeneLogic 사 제조의 데이터베이스 (Genesis 2006 Release 3.0) 를 사용하여 GCT 조직에 있어서의 발현 프로파일을 해석하였다. 또한, 파골 세포 분화에 중요한 역할을 하고 있는 RANK (Affymetrix Genechip HG-U133 probe 207037_at : 애피메트릭스사 제조) 및 RANKL (Affymetrix Genechip HG-U133 probe 210643_at : 애피메트릭스사 제조), 또한 파골 세포 분화 마커인 카텝신 K (Affymetrix Genechip HG-U133 probe 202450_s_at : 애피메트릭스사 제조) 및 TRAP (Affymetrix Genechip HG-U133 probe 204638_at : 애피메트릭스사 제조) 의 EST 프로브에 대해서도, 동일하게 GCT 조직에 있어서의 발현 프로파일을 해석하였다.
정상 골조직 13 예, GCT 조직 12 예, GCT 이외의 골종양 조직 16 예에 있어서 발현량을 비교한 결과, 정상 조직에 비해 GCT 조직에 있어서 RANK 및 RANKL 의 전사가 특이적으로 항진되었음이 밝혀졌다 (도 1-A). 한편, 골흡수의 항진이 반드시 일어나지 않을 것으로 생각되는 GCT 이외의 골종양 조직에서는, GCT 에 비해 RANK 및 RANKL 의 전사가 낮았으므로, GCT 에서는 파골 세포의 형성 및 활성화가 촉진되는 환경인 것이 시사되었다. 또한, 카텝신 K 및 TRAP 의 유전자 발현량을 비교한 결과, GCT 에 있어서 높게 전사되었고 (도 1-B), 골흡수 활성을 갖는 파골 세포가 다수 출현한 것이 시사되었다. 동일하게 Siglec-15 유전자에 대해 전사량을 비교한 결과, RANK, RANKL, 카텝신 K 및 TRAP 의 각 유전자와 동일하도록 GCT 에서 특이적으로 높게 전사되었음이 밝혀졌다 (도 2). 이 점에서, GCT 와 같은 골흡수가 항진되는 인간의 병태에 있어서, Siglec-15 가 관여하고 있음이 시사되었다.
실시예 2. 마우스 유래 성숙 파골 세포로부터의 전체 RNA 의 추출
a) 마우스 단구 유래 세포 RAW264.7 (ATCC Cat. No.TIB-71) 을 10 ％ 소 태아 혈청을 함유하는
Figure 112010014520647-pct00021
-MEM 배지에서 4.5 × 104 세포/㎖ 로 조제한 것을 75 ㎠ 플라스크 1 장당 10 ㎖ 뿌리고, 인간 RANKL (페프로테크사 제조) 을 최종 농도 40 ng/㎖ 가 되도록 첨가하고, CO2 인큐베이터 중에서 3 일간 배양하였다. 또한 인간 RANKL 미첨가의 배양도 동일하게 실시하였다.
배양 종료 후, 전체 RNA 추출용 시약 (ISOGEN : 닛폰 진사 제조) 을 시약에 첨부된 프로토콜에 따라 사용함으로써, 각각의 조건에서 배양한 RAW264.7 로부터 전체 RNA 를 추출하였다. 회수된 전체 RNA 는 -80 ℃ 로 보존하였다.
b) 마우스 골수 유래 초대 배양 세포를 활성형 비타민 D3 존재하에서 배양하면, TRAP 양성 다핵 파골 세포가 다수 출현한다 (Takahashi et al., Endocrinology, (1988) 122, 1373-1382).
8 주령 웅성 DDY 마우스를 에테르 마취하에서 경추 탈구로 안락사시키고, 대퇴골 및 경골을 적출하였다. 연조직을 제거한 후, 대퇴골 또는 경골의 양단을 잘라내고, 25 게이지의 주사 바늘을 갖는 주사통을 사용하여 10 ％ 소 태아 혈청을 함유하는
Figure 112010014520647-pct00022
-MEM 배지를 골수 중에 주입하고, 골수 세포를 채취하였다. 세포수를 계측한 후, 10 ％ 소 태아 혈청을 함유하는
Figure 112010014520647-pct00023
-MEM 배지에서 5 × 106 세포/㎖ 로 조제한 것을 96 웰 플레이트에 100 ㎕/웰 × 60 웰분 뿌리고, 활성형 비타민 D3 (시그마사 제조) 을 최종 농도 2 × 10-8 M 이 되도록 첨가하고, CO2 인큐베이터 중에서 8 일간 배양하였다. 또한 활성형 비타민 D3 미첨가의 배양도 동일하게 실시하였다. 또한, 배지 교환 및 활성형 비타민 D3 의 첨가는 3 일째 및 6 일째에 실시하였다.
이어서, 전체 RNA 추출용 시약 (ISOGEN : 닛폰 진사 제조) 을 시약에 첨부된 프로토콜에 따라 사용함으로써, 각각의 조건에서 배양한 세포로부터 전체 RNA 를 추출하였다. 회수된 전체 RNA 는 사용시까지 -80 ℃ 로 보존하였다.
실시예 3. 마우스 Siglec-15 오픈 리딩 프레임 (ORF) 배열의 취득
a) 퍼스트 스트랜드 cDNA 합성
실시예 2, a) 에서 제조한 전체 RNA 1 ㎍ 에 1 ㎕ 1 U/㎕ DNAseI, 1 ㎕ 10 × DNAseI Buffer (인비트로젠사 제조) 를 첨가하고 H2O 로 10 ㎕ 로 하고, 실온에서 15 분간 반응시킨 후, 1 ㎕ 25 mM EDTA 를 첨가하고 65 ℃ 에서 10 분간 가열하였다. 이 용액으로부터 8 ㎕ 를 분취하고, 1 ㎕ 50 μM oligo(dT)20 프라이머 및 1 ㎕ 10 mM dNTPs 를 첨가하고, 65 ℃ 에서 5 분간 가열한 후, 얼음 속에서 보온시켰다. 이 용액에 2 ㎕ 10 × RT Buffer (인비트로젠사 제조), 4 ㎕ 25 mM MgCl2, 2 ㎕ 0.1 M dithiothreitol, 1 ㎕ RNAse inhibitor (RNAseOUT, 40 U/㎕, 인비트로젠사 제조), 1 ㎕ Superscript Ⅲ 역전사 효소 (200 U/㎕, 인비트로젠사 제조) 를 첨가하여 전체량을 20 ㎕ 로 하고, 50 ℃ 에서 50 분간 반응시킨 후, 85 ℃ 에서 5 분간 가열하고, 얼음 속에서 1 분간 보온시킨 후, -20 ℃ 에서 보존하였다.
b) PCR 반응
마우스 Siglec-15 의 ORF cDNA 를 PCR 로 증폭시키기 위한 프라이머로서
5'-agaattccac cATGGAGGGG TCCCTCCAAC TC-3' (mSiglec-15-EcoRI kozak-F : 배열표의 배열 번호 5)
및
5'-cgccgctcga gTTATTTCTC ATGGTGAATG AC-3' (mSiglec-15-XhoI-R : 배열표의 배열 번호 6) 의 배열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 통상적인 방법에 따라 합성하였다. 이 프라이머의 조합과 a) 에서 제조한 cDNA 를 사용하여 High fidelity polymerase (인비트로젠사 제조) 를 사용하여 통상적인 방법에 따라 PCR 을 실시하였다. 서멀 사이클러의 설정 조건은, 94 ℃ 에서 2 분간 가열한 후, 「94 ℃ 에서 0.5 분, 55 ℃ 에서 0.5 분, 68 ℃ 에서 1.5 분」의 온도 사이클을 35 회 반복하고 나서, 68 ℃ 에서 5 분 가열하고, 4 ℃ 에서 보온으로 하였다.
c) pcDNA3.1 (＋) 벡터로의 클로닝
b) 에서 얻어진 PCR 반응액 및 pcDNA3.1 (＋) 벡터 (인비트로젠사 제조) 를 제한 효소 처리 (EcoRI, XhoI) 하고, 칼럼 정제 후, 통상적인 방법에 따라 리가아제 반응을 실시하였다. 대장균 DH5
Figure 112010014520647-pct00024
-T1 로 트랜스포메이션하고, 암피실린 함유 플레이트에 파종하였다. 이와 같이 하여 얻어진 대장균 콜로니로부터, 마우스 Siglec-15/pcDNA3.1 (＋) 플라스미드를 유지하는 형질 전환 대장균을 단리시켰다.
얻어진 플라스미드에 삽입되어 있는 ORF cDNA 의 전체 뉴클레오티드 배열을 DNA 시퀀서를 사용하여 해석한 결과, 배열표의 배열 번호 3 에 나타내어지는 배열임이 판명되었다. 이 뉴클레오티드 배열은, NCBI GenBank 데이터베이스에 「마우스 CD33L3」(등록 번호 : XM_884636) 으로서 등록되어 있는 예측 배열의 ORF 코드 영역과 동일하고, 또한 그 뉴클레오티드 배열로 코드되는 아미노산 배열 (배열표의 배열 번호 4) 은, 마우스 CD33L3 의 예측 아미노산 배열과 100 ％ 일치하였다.
실시예 4. 마우스 파골 세포 분화에 수반되는 Siglec-15 의 mRNA 발현 (리얼 타임 PCR 해석)
a) 실시예 2, a) 및 b) 에서 제조한 전체 RNA 1 ㎍ 에 1 ㎕ 1 U/㎕ DNAseI, 1 ㎕ 10 × DNAseI Buffer (인비트로젠사 제조) 를 첨가하고 H2O 로 10 ㎕ 로 하고, 실온에서 15 분간 반응시킨 후, 1 ㎕ 25 mM EDTA 를 첨가하고 65 ℃ 에서 10 분간 가열하였다. 이 용액으로부터 8 ㎕ 를 분취하고, 1 ㎕ 50 μM oligo(dT)20 프라이머 및 1 ㎕ 10 mM dNTPs 를 첨가하고, 65 ℃ 에서 5 분간 가열한 후, 얼음 속에서 보온시켰다. 이 용액에 2 ㎕ 10 × RT Buffer (인비트로젠사 제조), 4 ㎕ 25 mM MgCl2, 2 ㎕ 0.1 M dithiothreitol, 1 ㎕ RNAse inhibitor (RNAseOUT, 40 U/㎕, 인비트로젠사 제조), 1 ㎕ Superscript Ⅲ 역전사 효소 (200 U/㎕, 인비트로젠사 제조) 를 첨가하여 전체량을 20 ㎕ 로 하고, 50 ℃ 에서 50 분간 반응시킨 후, 85 ℃ 에서 5 분간 가열하고, 얼음 속에서 보온시켰다.
이와 같이 하여 제조한 1 개 사슬 cDNA 를 사용하여, 이하의 프라이머 및 형광 표지 프로브 (TaqMan 프로브, 어플라이드 바이오시스템즈사 제조) 의 조합에서 리얼 타임 PCR 을 실시하였다.
리얼 타임 PCR 조건 :
마우스 Siglec-15 증폭용 프라이머 :
5'-tcaggctcag gagtccaatt at-3' (TqM-mSiglec-15-F : 배열표의 배열 번호 7)
및
5'-ggtctagcct ggtactgtcc ttt-3' (TqM-mSiglec-15-R : 배열표의 배열 번호 8),
마우스 Siglec-15 검출용 TaqMan 프로브 :
5'-Fam-atttgagcca gatgagtcct ccaggcca-TAMRA-3' (TqM-mSiglec-15-probe : 배열표의 배열 번호 9),
마우스 L32 리보솜 단백질 증폭용 프라이머 :
5'-aagaagttca tcaggcacca gt-3' (TqM-mL32-F : 배열표의 배열 번호 10)
및
5'-cttgacattg tggaccagga ac-3' (TqM-mL32-R : 배열표의 배열 번호 11)
마우스 L32 리보솜 단백질 검출용 TaqMan 프로브 :
5'-Fam-aaacccagag gcattgacaa cagggtgc-TAMRA-3' (TqM-mL32-probe : 배열표의 배열 번호 12)
리얼 타임 PCR 시스템 (ABI 프리즘 7700 시퀀스 디텍터, (주) 퍼킨엘머 재팬·어플라이드 바이오시스템즈 사업부 제조) 을 사용하여 이하의 조건에서 리얼 타임 PCR 을 해석하였다. 또한 반응시에는 TaqMan Universal PCR Master Mix (어플라이드 바이오시스템즈사 제조) 를 사용하였다. 먼저 각 25 p㏖ 의 프라이머, 8 ng 의 1 개 사슬 cDNA 및 10 p㏖ 의 TaqMan 프로브에 증류수를 첨가하여 25 ㎕ 로 하고, 25 ㎕ TaqMan Universal PCR Master Mix 를 첨가하여 50 ㎕ 의 반응액을 조제하였다. 이 반응액을 50 ℃ 에서 2 분 가열한 후 95 ℃ 에서 10 분 가열하고, 「95 ℃ 에서 0.25 분, 60 ℃ 에서 1 분」의 온도 사이클을 40 회 반복하고 리얼 타임 PCR 을 해석하였다. 또한, 마우스 Siglec-15 의 mRNA 발현량은, L32 리보솜 단백질의 mRNA 발현량으로 보정하였다.
그 결과, Siglec-15 유전자의 발현량은, RAW264.7 에 RANKL 을 첨가하여 파골 세포를 유도한 경우, 또한 마우스 골수 유래 초대 배양 세포에 활성형 비타민 D3 을 첨가하여 파골 세포를 유도한 경우 어느 것에 있어서도, 발현량이 현저하게 상승하였다 (도 3).
b) RAW264.7 을 10 ％ 소 태아 혈청을 함유하는
Figure 112010014520647-pct00025
-MEM 배지에서 4.5 × 104 세포/㎖ 로 조제한 것을 75 ㎠ 플라스크 1 장당 10 ㎖ 뿌리고, 인간 RANKL (페프로테크사 제조) 을 최종 농도 40 ng/㎖ 가 되도록 첨가하고, CO2 인큐베이터 중에서 0, 1, 2, 3 일간 배양하였다. 또한 인간 RANKL 미첨가의 배양도 동일하게 실시하였다.
배양 종료 후, 전체 RNA 추출용 시약 (ISOGEN : 닛폰 진사 제조) 을 시약에 첨부된 프로토콜에 따라 사용함으로써, 각각의 조건에서 배양한 RAW264.7 로부터 전체 RNA 를 추출하였다. 회수된 전체 RNA 는 -80 ℃ 로 보존하였다.
회수된 전체 RNA 1 ㎍ 에 1 ㎕ 1 U/㎕ DNAseI, 1 ㎕ 10 × DNAseI Buffer (인비트로젠사 제조) 를 첨가하고 H2O 로 10 ㎕ 로 하고, 실온에서 15 분간 반응시킨 후, 1 ㎕ 25 mM EDTA 를 첨가하고 65 ℃ 에서 10 분간 가열하였다. 이 용액으로부터 8 ㎕ 를 분취하고, 1 ㎕ 50 μM oligo(dT)20 프라이머 및 1 ㎕ 10 mM dNTPs 를 첨가하고, 65 ℃ 에서 5 분간 가열한 후, 얼음 속에서 보온시켰다. 이 용액에 2 ㎕ 10 × RT Buffer (인비트로젠사 제조), 4 ㎕ 25 mM MgCl2, 2 ㎕ 0.1 M dithiothreitol, 1 ㎕ RNAse inhibitor (RNAseOUT, 40 U/㎕, 인비트로젠사 제조), 1 ㎕ Superscript Ⅲ 역전사 효소 (200 U/㎕, 인비트로젠사 제조) 를 첨가하여 전체량을 20 ㎕ 로 하고, 50 ℃ 에서 50 분간 반응시킨 후, 85 ℃ 에서 5 분간 가열하고, 얼음 속에서 보온시켰다.
이와 같이 하여 제조한 1 개 사슬 cDNA 를 사용하여, 이하의 프라이머 및 형광 표지 프로브 (TaqMan 프로브, 어플라이드 바이오시스템즈사 제조) 의 조합에서 리얼 타임 PCR 을 실시하였다.
리얼 타임 PCR 조건 :
마우스 카텝신 K 증폭용 프라이머 :
5'-ggcatctttc cagttttaca gc-3' (TqM-mcatK-F : 배열표의 배열 번호 13)
및
5'-gttgttctta ttccgagcca ag-3' (TqM-mcatK-R : 배열표의 배열 번호 14),
마우스 카텝신 K 검출용 TaqMan 프로브 :
5'-Fam-atgtgaacca tgcagtgttg gtggtggg-TAMRA-3' (TqM-mcatK-probe : 배열표의 배열 번호 15),
마우스 TRAP 증폭용 프라이머 :
5'-gaacttcccc agcccttact ac-3' (TqM-mTRAP-F : 배열표의 배열 번호 16)
및
5'-aactgctttt tgagccagga c-3' (TqM-mTRAP-R : 배열표의 배열 번호 17)
마우스 TRAP 검출용 TaqMan 프로브 :
5'-Fam-ttgccagtca gcagcccaaa atgcct-TAMRA-3' (TqM-mTRAP-probe : 배열표의 배열 번호 18),
마우스 Siglec-15 증폭용 프라이머 :
5'-tcaggctcag gagtccaatt at-3' (TqM-mSiglec-15-F : 배열표의 배열 번호 7)
및
5'-ggtctagcct ggtactgtcc ttt-3' (TqM-mSiglec-15-R : 배열표의 배열 번호 8),
마우스 Siglec-15 검출용 TaqMan 프로브 :
5'-Fam-atttgagcca gatgagtcct ccaggcca-TAMRA-3' (TqM-mSiglec-15-probe : 배열표의 배열 번호 9),
마우스 L32 리보솜 단백질 증폭용 프라이머 :
5'-aagaagttca tcaggcacca gt-3' (TqM-mL32-F : 배열표의 배열 번호 10)
및
5'-cttgacattg tggaccagga ac-3' (TqM-mL32-R : 배열표의 배열 번호 11)
마우스 L32 리보솜 단백질 검출용 TaqMan 프로브 :
5'-Fam-aaacccagag gcattgacaa cagggtgc-TAMRA-3' (TqM-mL32-probe : 배열표의 배열 번호 12)
리얼 타임 PCR 시스템 (ABI 프리즘 7700 시퀸스 디텍터, (주) 퍼킨엘머 재팬·어플라이드 바이오시스템즈 사업부 제조) 을 사용하여 이하의 조건에서 리얼 타임 PCR 을 해석하였다. 또한 반응시에는 TaqMan Universal PCR Master Mix (어플라이드 바이오시스템즈사 제조) 를 사용하였다. 먼저 각 25 p㏖ 의 프라이머, 8 ng 의 1 개 사슬 cDNA 및 10 p㏖ 의 TaqMan 프로브에 증류수를 첨가하여 25 ㎕ 로 하고, 25 ㎕ TaqMan Universal PCR Master Mix 를 첨가하여 50 ㎕ 의 반응액을 조제하였다. 이 반응액을 50 ℃ 에서 2 분 가열한 후 95 ℃ 에서 10 분 가열하고, 「95 ℃ 에서 0.25 분, 60 ℃ 에서 1 분」의 온도 사이클을 40 회 반복하고 리얼 타임 PCR 해석을 실시하였다. 또한, 각 유전자의 mRNA 발현량은, L32 리보솜 단백질의 mRNA 발현량으로 보정하였다.
그 결과, 파골 세포의 마커 분자로서 알려져 있는 카텝신 K 및 TRAP 유전자는, RANKL 첨가 후 2 ∼ 3 일째에 걸쳐 발현량이 현저하게 상승하였다 (도 4-A, B). 동일하게, Siglec-15 유전자도 RANKL 첨가 후 2 ∼ 3 일째에 걸쳐 발현량이 현저하게 상승하였다 (도 5). 이 점에서, Siglec-15 유전자는 파골 세포 분화에 수반되어 발현이 상승하고, 특히 분화 후기에 강하게 발현됨이 밝혀졌다.
실시예 5. 가용형 마우스 Siglec-15 단백질의 발현 컨스트럭트의 제조
마우스 Siglec-15 단백질의 세포 외 영역을 코드하는 부분의 핵산 배열은 배열표의 배열 번호 19 이고, 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 20 이다. 이와 같은 부분 배열을 이용함으로써, 동물 세포 등의 배양 상청 중에 가용형 마우스 Siglec-15 단백질을 생성시킬 수 있다.
a) 가용형 마우스 Siglec-15 유전자의 PCR 에 의한 증폭
마우스 Siglec-15 의 세포 외 영역 cDNA 를 PCR 로 증폭시키기 위한 프라이머로서 5'-ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt caccATGGAG GGGTCCCTCC AACTC-3' (mSiglec-15-ECD-F : 배열표의 배열 번호 21)
및
5'-ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc TCCGGGGGCG CCGTGGAAGC GGAAC-3' (mSiglec-15-ECD-R : 배열표의 배열 번호 22) 의 배열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 통상적인 방법에 따라 합성하였다. 또한, 이들 프라이머는 Gateway 엔트리 클론 제조용 증폭용 프라이머로서, mSiglec-15-ECD-F 에는 attB1 배열이, mSiglec-15-ECD-R 에는 attB2 배열이 부가되도록 설계하였다. 이 프라이머의 조합과, 템플릿으로서 실시예 3 에서 제조한 마우스 Siglec-15/pcDNA3.1 (＋) 플라스미드를 사용하여 통상적인 방법에 따라 PCR 을 실시하였다. 서멀 사이클러의 설정 조건은, 94 ℃ 에서 5 분간 가열한 후, 「94 ℃ 에서 0.5 분, 55 ℃ 에서 0.5 분, 68 ℃ 에서 1.5 분」의 온도 사이클을 15 회 반복하고 나서, 68 ℃ 에서 5 분 가열하고, 4 ℃ 에서 보온으로 하였다.
b) Gateway BP 반응에 의한 엔트리 클론의 제조
λ 파지의 부위 특이적 재조합 시스템을 응용한 Gateway 테크놀로지 (인비트로젠사) 에 의해, 마우스 Siglec-15 세포 외 영역의 cDNA 를 삽입한 엔트리 클론을 이하의 방법으로 제조하였다. 먼저 a) 에서 제조한, attB 배열을 양단에 갖는 PCR 산물과 attP 배열을 갖는 도너 벡터인 pDNOR221 (인비트로젠사 제조) 사이에서, BP 클로나아제를 사용한 BP 반응을 실시하였다. 이 반응액을 사용하여 대장균 DH10B 를 형질 전환시키고, 약제 내성 클론에 대하여 콜로니 PCR 을 실시하고, 인서트 사이즈를 확인하였다. 인서트의 사이즈가 올바르게 확인된 클론에 대해, 인서트의 전체 DNA 배열의 시퀀스 해석을 실시한 결과, 목적으로 하는 마우스 Siglec-15 단백질의 세포 외 영역을 코드하는 핵산 배열 (배열표의 배열 번호 19) 과 완전히 일치하는 엔트리 클론이 얻어졌다.
c) Gateway LR 반응에 의한 발현 클론의 제조
λ 파지의 부위 특이적 재조합 시스템을 응용한 Gateway 테크놀로지 (인비트로젠사) 에 의해, 마우스 Siglec-15 세포 외 영역의 cDNA 를 삽입한 발현 클론을 이하의 방법으로 제조하였다. b) 에서 제조한 엔트리 클론은 인서트의 양단에 attL 배열을 갖고 있다. 이 엔트리 클론과 attR 배열을 갖는 2 종류의 데스티네이션 벡터 사이에서 LR 클로나아제를 사용한 LR 반응을 실시하였다. 또한 데스티네이션 벡터는, 인서트의 C 말단측에 V5 에피토프와 6 × His 태그가 부가되도록 설계된 pDONM, 및 인서트의 C 말단측에 인간 Fc 태그가 부가되도록 설계된 phIgFc 의 2 종류를 사용하였다. LR 반응에 의해 얻어진 반응액을 사용하여 대장균 DH10B 를 형질 전환시키고, 얻어진 약제 내성 클론에 대하여 콜로니 PCR 을 실시하고, 인서트 사이즈를 확인하였다. 인서트의 사이즈가 올바르게 확인된 클론에 대해, 인서트측에서 벡터측으로의 양 말단의 시퀀스를 해석하였다.
시퀀스용 프라이머 배열 :
5'-tgcgtgaagg tgcagggcag-3' (mSiglec-15-ECD-seq-upstm : 배열표의 배열 번호 23)
및
5'-cctcgcctgg tcgggtc-3' (mSiglec-15-ECD-seq-dnstm : 배열표의 배열 번호 24)
시퀀스 해석의 결과, pDONM 및 phIgFc 의 양방에서 올바르게 재조합된 발현 클론 (가용형 마우스 Siglec-15/pDONM 및 가용형 마우스 Siglec-15/phIgFc) 이 각각 얻어졌다. 가용형 마우스 Siglec-15/pDONM 을 동물 세포 등에 트랜스펙션시킴으로써, 배열표의 배열 번호 25 에 기재된 염기 배열을 갖는 mRNA 가 전사되고, 배열표의 배열 번호 26 에 기재된 아미노산 배열을 갖는 단백질 (마우스 Siglec-15-His) 이 번역된다. 가용형 마우스 Siglec-15/phIgFc 를 동물 세포 등에 트랜스펙션시킴으로써, 배열표의 배열 번호 27 에 기재된 염기 배열을 갖는 mRNA 가 전사되고, 배열표의 배열 번호 28 에 기재된 아미노산 배열을 갖는 단백질 (마우스 Siglec-15-Fc) 이 번역된다.
실시예 6. 가용형 마우스 Siglec-15 단백질 제조를 위한 최적 배양 시간의 검토
a) 293-F 세포를 사용한 단백질 발현
실시예 5 에서 얻어진 2 종류의 발현 플라스미드 (가용형 마우스 Siglec-15/pDONM 및 가용형 마우스 Siglec-15/phIgFc) 를 각각 약 100 ㎍ 조제하였다. 조제한 플라스미드 각 50 ㎍ 을 Opti-MEM (인비트로젠사 제조) 과 혼합하고, 필터 멸균시킨 후 트랜스펙션 시약인 293 fectin (인비트로젠사 제조) 을 64 ㎕ 첨가하고 실온에서 25 분간 인큐베이션하였다. 이들 혼화액을 FreeStyle 293 Expression Media (인비트로젠사 제조) 중에서 1.0 × 106 세포/㎖ × 50 ㎖ 가 되도록 진탕 플라스크 중에서 배양한 FreeStyle 293-F 세포 (인비트로젠사 제조) 에 첨가하고, 8.0 ％ CO2 농도, 37 ℃ 에서 96 시간 (4 일간) 회전 배양 (125 회전/분) 하였다. 배양액은 24 시간 간격으로 (배양 시간 : 0, 24, 48, 72, 96 시간) 소량을 회수하여, 원심 분리 후 배양 상청을 조제하였다. 이와 같이 하여 조제한 배양 상청 중에는, 마우스 Siglec-15 의 세포 외 영역 C 말단측에 V5 에피토프와 6 × His 태그가 부가된 단백질 (마우스 Siglec-15-His) 및 C 말단측에 인간 Fc 태그가 부가된 단백질 (마우스 Siglec-15-Fc) 이 각각 발현되는 것으로 생각된다.
b) 마우스 Siglec-15-His 발현 293F 세포의 배양 시간에 따른 발현량의 변동
a) 에 있어서 조제한 마우스 Siglec-15-His 발현 293F 세포의 배양액 (배양 시간 0, 24, 48, 72, 96 시간) 샘플과 시판되는 His 태그 함유 단백질 유전자 재조합형 인간 Osteoprotegerin/his (OPG-Fc-His) (R ＆ D 시스템즈사 제조) 를 사용하여, 환원 조건하의 SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동과 웨스턴 블로팅에 의한 발현량을 해석하였다. 즉 각 배양액을 Microcon YM-10 (밀리포어사 제조) 으로 20 배 농축시킨 샘플과 OPG-Fc-His 용액 5 ㎕ 에 동량의 SDS-처리액 (1 mM EDTA, 2.5 ％ SDS, 0.1 ％ 브로모페놀 블루, 및 5 ％ 2-메르캅토에탄올을 함유하는 10 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.0)) 을 첨가하고, 95 ℃ 에서 10 분간 가열하였다. 열처리한 각 샘플 0.8 ㎕ 를 SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동에 사용하였다. 전기 영동의 겔로서 8-25 ％ 폴리아크릴아미드 그레이디언트 겔 (아머샴 바이오사이언스사 제조) 을 사용하고, 전기 영동은 PhastSystem (아머샴 바이오사이언스사 제조) 을 사용하여 실시하였다. 또한 분자량 마커로서 ECL DualVue Western Blotting Markers (아머샴 바이오사이언스사 제조) 를 사용하였다. 전기 영동 종료 후에 겔 중의 단백질을, PhastTransfer Semi-dry Transfer Kit (아머샴 바이오사이언스사 제조) 와 PhastSystem 을 사용하여 PVDF 막 (Hybond-P, 아머샴 바이오사이언스사 제조) 에 전사 (블롯) 하였다. 이 PVDF 막을 0.1 ％ Tween 20 을 함유하는 블로킹제 (BlockAce, 유키지루시 유업사 제조) 10 ㎖ 중으로 옮기고, 실온에서 1 시간 천천히 진탕하였다. 이 블로킹 용액에 S-protein HRP 용액 (ECL DualVue Western Blotting Markers, 아머샴 바이오사이언스사 제조) 5 ㎕ 와 항 6His-HRP 항체 (PentaHis HRP Conjugate kit, 퀴아겐사 제조) 2 ㎕ 를 첨가하고, 실온에서 추가로 1 시간 천천히 진탕하였다. 이 PVDF 막을 0.01 ％ Tween 20 을 함유하는 인산염 완충 생리 식염수 (PBS) 50 ㎖ 중에서 천천히 5 분간 진탕하면서 4 회 세정하였다. 세정 후, PVDF 막을 ECL detection kit (ECL Western blotting detection reagents and analysis system, 아머샴 바이오사이언스사 제조) 의 프로토콜에 따라 처리하여 His 태그 함유 단백질의 밴드를 발색시키고, 그 발색을 ECL mini-camera (아머샴 바이오사이언스사 제조) 와 폴라로이드 필름 (Polapan 3200B, 폴라로이드사) 을 사용하여 검출하였다. 결과를 도 6 에 나타냈다. 그 결과로부터, 항 6His-HRP 항체에 반응하는 분자량 약 35 kDa 의 단백질 (마우스 Siglec-15-His) 을 가장 고농도로 생산하는 293F 세포의 배양 시간으로서 96 시간을 선택하였다.
c) 마우스 Siglec-15-Fc 발현 293F 세포의 배양 시간에 따른 발현량의 변동
a) 에 있어서 조제한 마우스 Siglec-15-Fc 발현 293F 세포의 배양액 (배양 시간 : 0, 24, 48, 72, 96 시간) 샘플과 인간 IgG (시그마사 제조) 를 사용하여, 비환원 조건하의 SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동과 웨스턴 블로팅에 의한 발현량을 해석하였다. 즉 각 배양액 샘플과 인간 IgG 용액 5 ㎕ 에 동량의 SDS-처리액을 첨가하고, 95 ℃ 에서 10 분간 가열하였다. 열처리한 각 샘플 0.8 ㎕ 를 사용하여 상기 b) 에 기재된 방법과 동일한 방법으로 SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동, PVDF 막에 대한 전사 (블로팅), 및 PVDF 막의 블로킹을 실시하였다. 블로킹된 PVDF 막에 S-protein HRP 용액 (ECL DualVue Western Blotting Markers, 아머샴 바이오사이언스사 제조) 5 ㎕ 와 항인간 IgG Fc-HRP 항체 (Anti-Human IgG (Fc specific) Peroxidase Conjugate, 시그마사 제조) 2 ㎕ 를 첨가하고, 실온에서 추가로 1 시간 천천히 진탕하였다. 상기 b) 에 기재된 방법과 동일하게 세정한 후, Fc 함유 단백질의 밴드 발색을 검출하였다. 결과를 도 7 에 나타냈다. 그 결과로부터, 항인간 Fc 항체에 반응하는 분자량 약 110 kDa 의 단백질 (마우스 Siglec-15-Fc) 을 가장 고농도로 생산하는 293F 세포의 배양 시간으로서 96 시간을 선택하였다.
실시예 7. 293-F 세포를 사용한 가용형 마우스 Siglec-15 단백질 함유 배양액의 대량 조제
실시예 5 에서 얻어진 2 종류의 발현 플라스미드 (가용형 마우스 Siglec-15/pDONM 및 가용형 마우스 Siglec-15/phIgFc) 를 각각 약 5 ㎎ 조제하였다. 또한, 대량 배양된 대장균으로부터의 플라스미드 정제에는, 인비트로젠 PureLink HiPure Plasmid Gigaprep Kit (인비트로젠사 제조) 를 사용하였다. 조제한 플라스미드를 Opti-MEM (인비트로젠사 제조) 과 혼합하고, 필터 멸균시킨 후 트랜스펙션 시약인 293 fectin (인비트로젠사 제조) 을 10 ㎖ 첨가하고 실온에서 20 분간 인큐베이션하였다. 이 혼화액을, FreeStyle 293 Expression Media (인비트로젠사 제조) 중에서 1.1 × 106 세포/㎖ × 5 ℓ (1 ℓ/플라스크를 5 개) 가 되도록 에를렌마이어 플라스크 중에서 배양한 FreeStyle 293-F 세포 (인비트로젠사 제조) 에 첨가하였다. 8.0 ％ CO2 농도, 37 ℃ 에서 96 시간 (4 일간) 회전 배양 (125 회전/분) 한 후 배양액을 회수하여, 원심 분리 후 배양 상청을 조제하였다. 이와 같이 하여 조제한 배양 상청 중에는, 마우스 Siglec-15 의 세포 외 영역 C 말단측에 V5 에피토프와 6 × His 태그가 부가된 단백질 (마우스 Siglec-15-His) 및 C 말단측에 인간 Fc 태그가 부가된 단백질 (마우스 Siglec-15-Fc) 이 각각 발현되는 것으로 생각된다.
실시예 8. 마우스 Siglec-15-His 의 정제
a) HisTrap HP 칼럼 크로마토
실시예 7 에서 조제한 마우스 Siglec-15-His 발현 293F 세포의 배양액 2 ℓ 에 225 ㎖ 의 10 x buffer (500 mM Tris, 1.5 M NaCl, 200 mM Imidazole, pH 8.0) 를 첨가하여 잘 교반한 후에 Sterivex GV 필터 (밀리포어사 제조) 로 여과하였다. 이 배양액을, 미리 파이로젠 제거제·PyroCLEAN (ALerCHEK 사 제조) 으로 처리하고 주사용 증류수로 세정해 둔 HisTrap HP 5 ㎖ 의 3 개 직렬 칼럼 (아머샴 바이오사이언스사 제조) 에 유속 2 ㎖/min 으로 넣었다. 300 mM NaCl 을 함유하는 50 mM TriS-HCl 완충액 (pH 8.0) 60 ㎖ 를 사용하여 유속 1 ㎖/min 으로 칼럼을 세정한 후, 300 mM NaCl, 500 mM Imidazole 을 함유하는 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.0) 50 ㎖ 를 사용하여 유속 1 ㎖/min 으로 칼럼에 흡착되어 있는 단백질을 용출시켰다. 용출된 액은, 미리 10 ％ Tween 20 10 ㎕ 를 첨가해 둔 Mini-sorp tube (눙크사 제조) 에 1 ㎖/Fr. 로 분취하였다. 용출된 단백질을 함유하는 획분 약 20 ㎖ (Fr.14-20) 를 원심 막 농축기 Amicon Ultra-15 (밀리포어사 제조) 에 의해 2.5 ㎖ 로 농축시킨 후, 0.01 ％ Tween 20 을 함유하는 인산염 완충 생리 식염수 (T-PBS) 로 평형화시켜 둔 PD-10 탈염 칼럼 (아머샴 바이오사이언스사 제조) 에 넣고, T-PBS 로 용출시켜, 용매를 T-PBS 로 치환시킨 샘플 3.5 ㎖ 를 얻었다.
b) Resource Q 칼럼 크로마토
HisTrap HP 칼럼 크로마토로 정제한 TBS-P 치환 샘플 3.5 ㎖ 에 0.1 ％ CHAPS 를 함유하는 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.5) 22.5 ㎖ 를 첨가하여 교반한 후, 4 ℃, 3,000 r.p.m. 으로 30 분간 원심시켜 침전물을 제거하였다. 이 상청액을 Millex GV 필터 (밀리포어사 제조) 로 여과한 후, 0.1 ％ CHAPS 를 함유하는 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.5) 으로 미리 평형화시켜 둔 Resource Q 6 ㎖ 칼럼 (아머샴 바이오사이언스사 제조) 에 유속 1 ㎖/min 으로 넣고, 계속해서 이 완충액을 사용하여 유속 1 ㎖/min 으로 칼럼을 세정하여, 칼럼에 흡착되지 않는 단백질 획분을 모았다. 칼럼에 흡착된 단백질은, 0.1 ％ CHAPS, 1 M NaCl 을 함유하는50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.5) 을 사용하여 유속 1 ㎖/min 으로 용출시켰다. 칼럼에 흡착되지 않은 획분 26.5 ㎖ 를, 원심 막 농축기 Amicon Ultra-15 (밀리포어사 제조) 에 의해 2.0 ㎖ 로 농축시킨 후, 4 ℃, 3,000 r.p.m. 으로 10 분간 원심시켜 침전물을 제거하였다. 원심 후의 상청액은 사용할 때까지 -80 ℃ 에서 동결 보존하였다. 이상의 정제 조작 (HisTrap HP 칼럼 크로마토, Resource Q 칼럼 크로마토) 을 2 회 반복 실시하였다.
c) 정제된 마우스 Siglec-15-His 의 검출과 순도 검정
상기의 정제 조작 (HisTrap HP 칼럼 크로마토, Resource Q 칼럼 크로마토) 으로 조제된 샘플을 사용하여 환원 조건하에서 SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동과 은 염색을 실시하였다. 즉 각 정제 단계의 샘플 5 ㎕ 에 동량의 SDS-처리액을 첨가하고, 95 ℃ 에서 10 분간 열처리하였다. 열처리한 각 샘플 0.3 ㎕ 를 SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동에 사용하였다. 전기 영동의 조작은 분자량 마커로서 레인보우 분자량 마커 (아머샴 바이오사이언스사 제조) 를 사용한 것 이외에는, 상기 실시예 6, b) 와 동일한 방법으로 실시하였다. 전기 영동 종료 후에 PhastGel Silver Kit (아머샴 바이오사이언스사 제조) 와 PhastSystem 을 사용하여 은 염색을 실시하고, 그 결과를 도 8 에 나타냈다. Resource Q 칼럼에 흡착되지 않은 단백질 획분에 분자량 약 35 kDa 의 단백질 (마우스 Siglec-15-His) 이 효율적으로 정제 농축되었음이 나타났다.
분자량 마커로서 ECL DualVue Western Blotting Markers (아머샴 바이오사이언스사 제조) 를 사용한 것 이외에는 상기와 동일한 조건에서 전기 영동한 겔 중의 단백질을, PhastTransfer Semi-dry Transfer Kit (아머샴 바이오사이언스사 제조) 와 PhastSystem 을 사용하여 PVDF 막 (Hybond-P, 아머샴 바이오사이언스사 제조) 에 전사 (블롯) 하였다. 이 PVDF 막을 0.1 ％ Tween 20 을 함유하는 블로킹제 (BlockAce, 유키지루시 유업사 제조) 10 ㎖ 중 실온에서 1 시간 천천히 진탕하였다. 이 블로킹 용액에 S-protein HRP (아머샴 바이오사이언스사) 10 ㎕ 와 항 V5-HRP 항체 (Monoclonal Antibody to Pk-TAG-HRP, Acris Antibodies 사 제조) 10 ㎕ 를 첨가하고, 추가로 실온에서 1 시간 천천히 진탕하였다. PVDF 막을 0.01 ％ Tween 20 을 함유하는 인산염 완충 생리 식염수 (PBS) 50 ㎖ 중에서 천천히 진탕하면서 5 분간 4 회 세정하였다. 세정 후 이 PVDF 막을 ECL detection kit (아머샴 바이오사이언스사) 의 프로토콜에 따라 처리하고, 단백질의 밴드 발색을 ECL mini-camera (아머샴 바이오사이언스사) 폴라로이드 필름 (Polapan 3200B, 폴라로이드사) 으로 검출하였다. 결과를 도 9 에 나타냈다. 그 결과로부터도, 항 V5-HRP 항체에 반응하는 분자량 약 35 kDa 의 단백질 (마우스 Siglec-15-His) 이 Resource Q 칼럼에 흡착되지 않은 단백질 획분에 효율적으로 정제 농축되었음을 확인할 수 있었다.
d) 정제된 마우스 Siglec-15-His 의 단백질 농도 측정
정제 마우스 Siglec-15-His (Resource Q 칼럼에 흡착되지 않은 단백질 획분) 에 대해, 소 혈청 알부민을 표준 샘플로서 사용하여, DC-Protein Assay kit (BioRad 사 제조) 로 단백질 농도를 측정하였다. 표 1 에 나타낸 바와 같이, 2 회의 정제 조작으로 합계 1.66 ㎎ 의 정제 마우스 Siglec-15-His 단백질을 얻었다.
Figure 112010014520647-pct00026
실시예 9. 마우스 Siglec-15-Fc 의 정제
a) HiTrap protein A 칼럼 크로마토
실시예 7 에서 조제한 마우스 Siglec-15-Fc 발현 293F 세포의 배양액 1.8 ℓ 를 Sterivex GV 필터 (밀리포어사 제조) 로 여과한 후, 미리 둘베코 PBS (D-PBS, 인비트로젠사 제조) 로 평형화시켜 둔 HiTrap protein A 5 ㎖ 칼럼 (아머샴 바이오사이언스사 제조) 에 유속 5 ㎖/min 으로 넣었다. D-PBS 를 사용하여 유속 5 ㎖/min 으로 칼럼을 세정한 후, 0.1 M 시트르산나트륨 완충액 (pH 3.0) 50 ㎖ 를 사용하여 유속 5 ㎖/min 으로 칼럼에 흡착되어 있는 단백질을 용출시켰다. 용출된 액은, Mini-sorp tube (눙크사 제조) 에 5 ㎖/Fr. 로 분취한 후, 1 M Tris 1.3 ㎖ 를 바로 첨가하여 중화시켰다. 용출된 단백질이 검출된 획분 (Fr.1, 2) 을 원심 막 농축기 Amicon Ultra-15 (밀리포어사 제조) 에 의해 2.5 ㎖ 로 농축시킨 후, 0.01 ％ Tween 20 을 함유하는 오오츠카 주사용 생리 식염수 (TO-SS, 오오츠카 제약사 제조) 로 평형화시켜 둔 PD-10 탈염 칼럼 (아머샴 바이오사이언스사 제조) 에 넣고 TO-SS 로 용출시켜, 용매를 TO-SS 로 치환시킨 샘플 3.5 ㎖ 를 얻었다. 이 샘플은 사용할 때까지 -80 ℃ 에서 동결 보존하였다. 2.9 ℓ 의 293F 세포의 배양액을 사용하여, 동일한 정제 조작을 추가로 1 회 반복 실시하였다.
b) 정제된 마우스 Siglec-15-Fc 의 검출과 순도 검정
상기의 정제 조작으로 조제된 샘플을 사용하여 환원 조건하의 SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동과 은 염색을 실시하였다. 즉 각 정제 단계의 샘플 5 ㎕ 에 동량의 SDS-처리액을 첨가하고, 95 ℃ 에서 10 분간 가열하였다. 열처리한 각 샘플을 1/2 농도의 SDS-처리액으로 1/300 또는 1/900 배 희석시킨 샘플 0.3 ㎕ 를 SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동에 사용하였다. 전기 영동과 은 염색은 실시예 8, c) 에 기재된 마우스 Siglec-15-His 의 순도 검정과 동일한 방법으로 실시하고, 그 결과를 작은 스케일에서의 예비 정제 조건 검토 결과 (어플라이한 배양액의 pH 가 8.9 또는 7.0) 와 함께 도 10 에 나타냈다. HiTrap protein A 칼럼으로부터 용출된 단백질 획분에 분자량 약 55 kDa 의 단백질 (마우스 Siglec-15-Fc) 이 효율적으로 정제 농축되었음이 나타났다.
c) 정제된 마우스 Siglec-15-Fc 의 단백질 농도 측정
정제 마우스 Siglec-15-Fc (PD-10 탈염 칼럼으로부터 용출된 단백질 획분) 에 대해, 소 혈청 알부민을 표준 샘플로서 사용하여 DC-Protein Assay kit (BioRad 사 제조) 로 단백질 농도를 측정하였다. 표 2 에 나타낸 바와 같이, 2 회의 정제 조작으로 합계 92 ㎎ 의 정제 마우스 Siglec-15-Fc 단백질을 얻었다.
Figure 112010014520647-pct00027
실시예 10. 토끼 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체의 제조 (토끼에 대한 면역)
a) 항원의 조제
실시예 9 에서 제조한, 마우스 Siglec-15-Fc 단백질을 100 ㎍/0.5 ㎖ 가 되도록 조제하고, 아쥬반트를 동량 첨가하고 유리 시린지로 에멀션을 제조하였다. 또한 아쥬반트는, 첫 회 면역시에만 Freund's Complete Adjuvant (FCA, 디프코사 제조) 를 사용하고, 2 회째 이후에는 Freund's Incomplete Adjuvant (FICA, 디프코사 제조) 를 사용하였다.
b) 토끼에 대한 면역
토끼 (일본 백색종 암컷 체중 3 ㎏) 3 마리를 면역 동물로서 사용하였다. 또한, 면역 전에 채혈을 실시하여, 면역 전 혈청 1 ㎖/마리를 얻었다. a) 에서 얻어진 에멀션 1 ㎖/마리를 피하 및 피내에 27 G 주사 바늘을 사용하여 주사하였다. 이후 14 일마다 합계 8 회의 면역을 실시하였다. 8 회째의 면역으로부터 7 일 후에 전체 채혈을 실시하여, 1 마리당 76 ∼ 79 ㎖ 의 항혈청을 얻었다. 면역 전 혈청 중 및 항혈청 중의 항체력가 (抗體力價) 를 항원을 고상화시킨 ELISA 법에 의해 확인한 결과, 3 마리의 토끼 어느 것에 있어서도 항혈청 중의 항체가의 상승이 관찰되었다. 항혈청은 사용할 때까지 -20 ℃ 에서 보존하였다.
실시예 11. 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체의 정제
a) HiTrap protein A 칼럼 크로마토
실시예 10 에서 조제한 토끼 항혈청 3 로트의 각각 20 ㎖ 에 둘베코 PBS (D-PBS, 인비트로젠사 제조) 20 ㎖ 를 첨가하여 혼합하고, Sterivex GV 필터 (밀리포어사 제조) 로 여과한 후, 미리 D-PBS 로 평형화시켜 둔 HiTrap protein A 5 ㎖ 칼럼 (아머샴 바이오사이언스사 제조) 에 유속 2 ㎖/min 으로 넣었다. D-PBS 37.5 ㎖ 를 사용하여 유속 2.5 ㎖/min 으로 칼럼을 세정한 후, 0.1 M 시트르산나트륨 완충액 (pH 3.0) 50 ㎖ 를 사용하여 유속 2.5 ㎖/min 으로 칼럼에 흡착되어 있는 단백질을 용출시켰다. 용출된 액은, Mini-sorp tube (눙크사 제조) 에 2.5 ㎖/Fr. 로 분취한 후, 1 M Tris 0.65 ㎖ 를 바로 첨가하여 중화시켰다. 용출된 단백질을 함유하는 획분 약 10 ㎖ (Fr.2 ∼ 5) 를 원심 막 농축기 Amicon Ultra-15 (밀리포어사 제조) 에 의해 2.5 ㎖ 로 농축시킨 후, 0.01 ％ Tween 20 을 함유하는 오오츠카 주사용 생리 식염수 (TO-SS) 로 평형화시켜 둔 PD-10 탈염 칼럼 (아머샴 바이오사이언스사 제조) 에 넣고 TO-SS 로 용출시켜, 용매를 TO-SS 로 치환시킨 샘플 3.5 ㎖ 를 얻었다. 조제된 샘플은 사용할 때까지 -80 ℃ 에서 동결 보존하였다.
b) 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체의 검출과 순도 검정
상기 a) 의 정제 조작으로 조제된 샘플 (No.1, 2, 3 의 3 로트) 을 사용하여 환원 조건하의 SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동과 은 염색을 실시하였다. 즉 각 정제 단계의 샘플 5 ㎕ 에 동량의 SDS-처리액 (1 mM EDTA, 2.5 ％ SDS, 0.1 ％ 브로모페놀 블루, 및 5 ％ 2-메르캅토에탄올을 함유하는 10 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.0)) 을 첨가하고, 95 ℃ 에서 10 분간 가열하였다. 열처리한 각 샘플을 1/2 농도의 SDS-처리액으로 1/100, 1/300 또는 1/900 배 희석시킨 샘플 0.3 ㎕ 를 SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동에 사용하였다. 전기 영동과 은 염색은 실시예 8, c) 에 기재된 마우스 Siglec-15-His 의 순도 검정과 동일한 방법으로 실시하였다. PD-10 탈염 칼럼으로부터 용출된 단백질 획분에, 분자량 약 45 kDa 의 heavy chain 과 분자량 약 21 kDa 의 light chain 으로 이루어지는 IgG 단백질이 효율적으로 정제 농축되었음이 나타났다.
c) 정제된 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체의 단백질 농도 측정
정제된 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체 (PD-10 탈염 칼럼으로부터 용출된 단백질 획분) 에 대해, 소 IgG 를 표준 샘플로서 사용하여 DC-Protein Assay kit (BioRad 사 제조) 로 단백질 농도를 측정하였다. 표 3 에 나타낸 바와 같이, No.1 ∼ 3 의 로트마다 100 ∼ 170 ㎎ 의 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체를 정제할 수 있었다.
Figure 112010014520647-pct00028
d) 정제된 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체의 Siglec-15 세포 외 영역에 대한 반응성 검토
상기 a) 항에서 조제한 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체가 Fc 태그뿐만 아니라 Siglec-15 단백질의 세포 외 영역에도 결합되는 것을 확인하는 시험을 실시하였다. 정제된 마우스 Siglec-15-His 샘플 (실시예 8) 과 Siglec-15-Fc 샘플 (실시예 9) 5 ㎕ 에 동량의 SDS-처리액 (5 ％ 2-메르캅토에탄올 첨가 또는 비첨가) 을 첨가하고, 95 ℃ 에서 10 분간 가열하였다. 열처리한 각 샘플 0.3 ㎕ 를 SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동에 사용하여, 상기 실시예 6, b) 에 기재된 방법과 동일한 방법으로 전기 영동과 PVDF 막에 대한 전사 (블롯) 를 실시하였다. 이 PVDF 막을 0.1 ％ Tween 20 을 함유하는 블로킹제 (BlockAce, 유키지루시 유업사 제조) 8 ㎖ 중 실온에서 1 시간 천천히 진탕하였다. 이 블로킹 용액에 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체 No.1 (표 3) 1.6 ㎕ 를 첨가하고, 추가로 실온에서 1 시간 천천히 진탕하였다. 이 PVDF 막을 0.01 ％ Tween 20 을 함유하는 PBS 50 ㎖ 중에서 천천히 5 분간 진탕하면서 4 회 세정하였다. 세정된 PVDF 막을 Antibody Diluent ECL Advance Blocking Agent (ECL Advance Western Blotting Detection Kit, 아머샴 바이오사이언스사 제조) 8 ㎖ 에 담그고, Anti rabbit IgG-HRP (아머샴 바이오사이언스사 제조) 를 최종 농도 1/200,000 이 되도록 첨가하고, S-protein HRP 용액 (ECL DualVue Western Blotting Markers, 아머샴 바이오사이언스사 제조) 0.8 ㎕ 를 첨가하고, 추가로 실온에서 1 시간 천천히 진탕하였다. 이 PVDF 막을 0.01 ％ Tween 20 을 함유하는 PBS 50 ㎖ 중에서 천천히 5 분간 진탕하면서 4 회 세정하였다. 세정 후, PVDF 막을 ECL Advance Western Blotting Detection Kit (아머샴 바이오사이언스사 제조) 의 프로토콜에 따라 처리하고, 단백질 밴드의 발색을 ECL mini-camera (아머샴 바이오사이언스사 제조) 와 폴라로이드 필름 (Polapan 3200B, 폴라로이드사 제조) 으로 검출하였다. 결과를 도 11 에 나타냈다. 그 결과로부터, 정제된 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체는 마우스 Siglec-15-His 에도 결합됨이 나타났고, 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체는 Fc 태그뿐만 아니라 Siglec-15 단백질의 세포 외 영역에도 결합됨을 확인할 수 있었다. 동일한 시험을 반복 실시하여, 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체 No.2 와 No.3 도 마우스 Siglec-15-His 에 결합됨을 확인하였다.
실시예 12. 면역 전 토끼 IgG 의 정제
실시예 10 에 있어서의 마우스 Siglec-15-Fc 의 면역 개시 전에, 사용된 토끼 3 마리로부터 미리 채혈하여 면역 전의 혈청을 조제해 두었다. 이 혈청 각 0.8 ㎖ 를 혼합한 후에 둘베코 PBS (D-PBS, 인비트로젠사 제조) 2.4 ㎖ 를 첨가하고, Millex GV 필터 (밀리포어사 제조) 로 여과하였다. 이 혈청 샘플을, 미리 D-PBS 로 평형화시켜 둔 HiTrap protein A 5 ㎖ 칼럼 (아머샴 바이오사이언스사 제조) 에 유속 1 ㎖/min 으로 넣었다. D-PBS 50 ㎖ 를 사용하여 유속 2.5 ㎖/min 으로 칼럼을 세정한 후, 0.1 M 시트르산나트륨 완충액 (pH 3.0) 50 ㎖ 를 사용하여 유속 2.5 ㎖/min 으로 칼럼에 흡착되어 있는 단백질을 용출시켰다. 용출된 액은, Mini-sorp tube (눙크사 제조) 에 2.5 ㎖/Fr. 로 분취한 후, 1 M Tris 0.65 ㎖ 를 바로 첨가하여 중화시켰다. 용출된 단백질을 함유하는 획분 (Fr.2 ∼ 4) 을 원심 막 농축기 Amicon Ultra-15 (밀리포어사 제조) 에 의해 2.5 ㎖ 로 농축시킨 후, 0.01 ％ Tween 20 을 함유하는 오오츠카 주사용 생리 식염수 (TO-SS) 로 평형화시켜 둔 PD-10 탈염 칼럼 (아머샴 바이오사이언스사 제조) 에 넣고 TO-SS 로 용출시켜, 용매를 TO-SS 로 치환시킨 샘플 3.5 ㎖ 를 얻었다. 정제된 이 면역 전 토끼 IgG 샘플에 대해, 상기 실시예 8, c) 에 기재된 방법으로 폴리아크릴아미드 전기 영동과 은 염색을 실시하여 IgG 단백질이 충분히 정제되었음을 확인한 후, 단백질 농도를 측정하였다. 정제된 이 샘플은 사용할 때까지 -80 ℃ 에서 동결 보존하였다.
실시예 13. 마우스 Siglec-15-Fc 를 고상화시킨 어피니티 칼럼의 조제
실시예 9 에 기재된 18.5 ㎎/㎖ 정제 마우스 Siglec-15-Fc 용액 0.54 ㎖ (합계 10 ㎎ 단백질) 의 용매를 PD-10 탈염 칼럼에 의해 coupling buffer (0.2 M NaHCO3, 0.5 M NaCl, pH 8.3) 로 치환시킨 후, 원심 막 농축기 Amicon Ultra 4 (밀리포어사 제조) 를 사용하여 1 ㎖ 로 농축시켰다. NHS-activated HiTrap 칼럼 (1 ㎖, 아머샴 바이오사이언스사 제조) 내의 이소프로판올을 1 mM 염산으로 치환시킨 후, 10 ㎎/㎖ 의 마우스 Siglec-15-Fc 를 함유하는 coupling buffer 1 ㎖ 를 시린지로 칼럼에 주입하였다. 실온에서 30 분간 반응시킨 후, 과잉인 활성기를 비활성화시키기 위해, 아머샴 바이오사이언스사의 프로토콜에 따라, 블로킹 버퍼 (0.5 M NaCl 을 함유하는 에탄올아민 완충액, pH 8.3), 세정 버퍼 (0.5 M NaCl 을 함유하는 아세트산나트륨 완충액, pH 4.0), 블로킹 버퍼의 각 6 ㎖ 를 차례대로 주입한 후, 실온에서 30 분간 방치시켰다. 그 후, 세정 버퍼, 블로킹 버퍼, 세정 버퍼의 각 6 ㎖ 를 다시 차례대로 칼럼에 주입하고, 마지막으로 칼럼 내의 완충액을 1 M NaCl 과 0.01 ％ Tween 20 을 함유하는 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.0) 으로 치환시켰다. 이 칼럼은 사용시까지 4 ℃ 에서 보관하였다.
실시예 14. 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체의 어피니티 칼럼에 의한 정제
a) 어피니티 칼럼 크로마토
실시예 11 에서 조제한 정제 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체 No.1, 2, 3 의 각 2 ㎖ 에 Apply Buffer (0.15 M NaCl 을 함유하는 10 mM Tris-HCl 완충액, pH 7.2) 8 ㎖ 를 첨가한 후, 미리 Apply Buffer 로 평형화시켜 둔 어피니티 칼럼 (실시예 13) 에 유속 0.25 ㎖/min 으로 넣었다. Apply Buffer 5 ㎖ 를 사용하여 유속 0.25 ㎖/min 으로 칼럼을 세정한 후, 먼저 0.5 M NaCl 을 함유하는 0.1 M 글리신염산 완충액 (pH 2.7) 5 ㎖ 를 사용하여 유속 0.25 ㎖/min 으로 칼럼에 흡착되어 있는 단백질을 용출시키고, 계속해서 0.5 M NaCl 을 함유하는 0.1 M 시트르산나트륨 완충액 (pH 2.0) 5 ㎖ 를 사용하여 유속 0.25 ㎖/min 으로 칼럼에 흡착되어 있는 단백질을 용출시켰다. 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체 No.3 을 어피니티 칼럼으로 정제한 크로마토그램을 도 12 에 나타냈다. 용출된 액은, Mini-sorp tube (눙크사 제조) 에 0.5 ㎖/Fr. 로 분취한 후, 글리신염산 완충액 용출 획분 0.5 ㎖ 에는 1 M Tris 16 ㎕ 를, 시트르산나트륨 완충액 용출 획분 0.5 ㎖ 에는 1 M Tris 150 ㎕ 를 바로 첨가하여 중화시켰다. 대부분의 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체는 0.5 M NaCl 을 함유하는 0.1 M 글리신염산 완충액 (pH 2.7) 으로 용출되었다. 글리신염산 완충액으로 용출된 IgG 단백질이 검출된 획분 약 2.5 ㎖ (Fr.3 ∼ 7) 의 각각을, 0.01 ％ Tween 20 을 함유하는 오오츠카 주사용 생리 식염수 (TO-SS) 로 평형화시켜 둔 PD-10 탈염 칼럼 (아머샴 바이오사이언스사 제조) 에 넣고 TO-SS 로 용출시켜, 용매를 TO-SS 로 치환시킨 샘플 3.5 ㎖ 를 얻었다. 시트르산나트륨 완충액으로 용출된 IgG 단백질 획분 약 2.5 ㎖ (Fr.16 ∼ 19) 에 대해서는, 3 로트분을 전부 혼합하고 원심 막 농축기 Amicon Ultra-4 (밀리포어사 제조) 를 사용하여 2.5 ㎖ 로 농축시킨 후, TO-SS 로 평형화시켜 둔 PD-10 탈염 칼럼 (아머샴 바이오사이언스사 제조) 에 넣고 TO-SS 로 용출시켜, 용매를 TO-SS 로 치환시킨 샘플 3.5 ㎖ (Citrate-E) 를 얻었다. 조제된 샘플은 사용할 때까지 -80 ℃ 에서 동결 보존하였다.
b) 어피니티 정제된 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체의 단백질 농도 측정
정제된 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체 샘플 (PD-10 탈염 칼럼으로부터 용출된 단백질 획분) 에 대해, 소 IgG 를 표준 샘플로서 사용하여 DC-Protein Assay kit (BioRad 사 제조) 로 단백질 농도를 측정하였다. 단백질 농도를 측정한 샘플에 대해, 항체 농도를 15 또는 50 ㎍/㎖ 로 맞추고, 실시예 11, b) 와 동일한 방법으로 전기 영동과 은 염색을 실시하여 그 결과를 도 13 에 나타냈다. PD-10 칼럼으로부터 용출된 단백질 획분에, 분자량 약 45 kDa 의 heavy chain 과 분자량 약 21 kDa 의 light chain 으로 이루어지는 IgG 단백질이 효율적으로 정제 농축되었음이 나타났다. 표 4 에 나타낸 바와 같이, No.1 ∼ 3 의 로트마다, 또는 Citrate-E 획분으로서, 약 2.3 ∼ 7.4 ㎎ 의 어피니티 정제된 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체를 조제할 수 있었다.
Figure 112010014520647-pct00029
실시예 15. 어피니티 정제된 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체의 겔 여과 칼럼에 의한 정제
a) Superose 6 칼럼 크로마토
실시예 14 에서 조제한 어피니티 정제·항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체로부터 엔도톡신이나 저분자의 불순물을 완전히 제거하기 위해 겔 여과 칼럼으로 추가로 정제를 실시하였다. 어피니티 정제된 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체 No.2, 3 의 각 1 ㎖ 를, 미리 파이로젠 제거제·PyroCLEAN (ALerCHEK 사 제조) 으로 처리하고 0.01 ％ Tween 20 을 함유하는 둘베코 PBS (D-PBS, 인비트로젠사 제조) 로 평형화시켜 둔 Superose 6 HR 10/30 칼럼 (아머샴 바이오사이언스사 제조) 에 어플라이하고, 0.01 ％ Tween 20 을 함유하는 D-PBS 를 사용하여 유속 0.4 ㎖/min 으로 용출시켰다. 크로마토그램을 도 14 에 나타냈다. 용출된 액은, Mini-sorp tube (눙크사 제조) 에 0.5 ㎖/Fr. 로 분취하여, 겔 여과·항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체 샘플 2.0 ㎖ (Frs.28 ∼ 31) 를 얻었다. 조제된 샘플은 사용할 때까지 -80 ℃ 에서 동결 보존하였다.
b) 겔 여과 칼럼으로 정제한 토끼 IgG 의 단백질 농도 측정
겔 여과 정제·항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체 샘플 (Superose 6 칼럼으로부터 용출된 단백질 획분) 에 대해서도, 단백질 농도를 측정하였다. 표 5 에 나타낸 바와 같이, No.2, 3 의 로트마다 2.25 ㎎ 또는 3.34 ㎎ 의 겔 여과 정제·항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체를 조제할 수 있었다.
Figure 112010014520647-pct00030
실시예 16. 마우스 골수 비부착 세포의 조제
5 ∼ 8 주령의 수컷 ddY 마우스로부터 대퇴골과 경골을 적출하고, 연조직을 제거하였다. 이 대퇴골 또는 경골의 양단을 잘라내고, 25 게이지의 주사 바늘을 갖는 시린지에 의해 D-PBS 를 주입하여 골수 세포를 압출시키고, 원심 튜브에 회수하였다. 실온에서 100 g, 5 분간 원심시켜 상청을 버린 후, 세포의 펠릿에 Hemolytic Buffer 1 ㎖ (RED BLOOD CELL LYSING BUFFER, 시그마사 제조) 를 첨가하여 현탁하고, 실온에서 5 분간 방치시켰다. 20 ㎖ 의 D-PBS 를 첨가하고 실온에서 100 g, 5 분간 원심시켜, 상청을 버린 후에 세포의 펠릿에 5 ng/㎖ M-CSF (R ＆ D Systems 사 제조), 10 ％ 소 태아 혈청 (FBS) 을 함유하는 MEM-
Figure 112010014520647-pct00031
배지 (인비트로젠사 제조) 10 ㎖ 를 첨가하여 현탁하고, 셀 스트레이너 (40 ㎛ Nylon, BD 파르콘사 제조) 를 통과시켜 응집물을 제거하였다. 이 세포를 75 ㎠-T 플라스크 (부착 세포용) 로 옮기고, CO2 인큐베이터 중에서 하룻밤 배양하였다. 하룻밤 배양 후, T-플라스크에 부착되어 있지 않는 세포를 회수하여, 마우스 골수 비부착 세포로서 사용하였다.
실시예 17. 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체 첨가에 의한, 마우스 골수 비부착 세포의 파골 세포 분화에 대한 영향 (RANKL 자극)
실시예 14, 15 에 있어서 제조한 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체를 사용하여 마우스 골수 비부착 세포의 파골 세포 분화에 대한 영향을 검토하였다. 상기 실시예 16 의 방법으로 조제한 마우스 골수 비부착 세포를 10 ％ FBS 와 10 ng/㎖ M-CSF (R ＆ D Systems 사 제조) 를 함유하는
Figure 112010014520647-pct00032
-MEM 배지에서 1.5 × 105 세포/㎖ 로 조제한 것을 96 웰 플레이트의 각 웰에 200 ㎕ 파종하고, CO2 인큐베이터 중에서 2 일간 배양하였다. 96 웰 플레이트 중의 오래된 배양액을 제거하고, 인간 RANKL (RANKL, 페프로테크사 제조) 을 최종 농도 20 ng/㎖, M-CSF 를 10 ng/㎖ 가 되도록 첨가한 10 ％ FBS 함유 MEM-
Figure 112010014520647-pct00033
배지 100 ㎕ 를 첨가하였다. 이 세포 배양액에, 실시예 12, 14, 15 에서 제조한 어피니티 정제 No.3 항체, Citrate E 항체, 겔 여과 정제 No.2 항체, 겔 여과 정제 No.3 항체, 면역 전 토끼 IgG (Pre-immune IgG), 및 시판되는 토끼 컨트롤 IgG (Non-immune Rabbit IgG CLRB00, CEDARLANE LABORATORIES 사 제조) 를 30 ∼ 1,000 ng/㎖ 의 농도가 되도록 첨가하고, 추가로 3 일간 CO2 인큐베이터 중에서 배양하였다. 배양 종료 후, 형성된 파골 세포의 타르타르산 내성 산성 포스파타아제 (TRAP) 활성을 이하의 조작으로 측정하였다. 96 웰 플레이트의 각 웰의 배양액을 흡인 제거하고, 1 ％ Triton X-100 을 함유하는 50 mM 시트르산나트륨 완충액 (pH 6.1) 50 ㎕ 를 각 웰에 첨가하고, 플레이트 진탕기로 5 분간 진탕하여 세포를 가용화시켰다. 이들 각 웰에 기질 용액 (5 ㎎/㎖ p-nitrophenyl phosphate 및 0.46 ％ 타르타르산나트륨을 함유하는 50 mM 시트르산나트륨 완충액 (pH 6.1)) 50 ㎕ 를 첨가하고 실온에서 5 분간 인큐베이트하였다. 인큐베이트 후에 96 웰 플레이트의 각 웰에 1 N 수산화나트륨 용액 50 ㎕ 를 첨가하여 효소 반응을 정지시켰다. 효소 반응 정지 후에 각 웰의 405 ㎚ 의 흡광도를 측정하여 TRAP 활성의 지표로 하였다. 결과를 도 15, 16 에 나타냈다. 면역 전 토끼 IgG, 및 시판되는 토끼 컨트롤 IgG 에서는 현저한 TRAP 활성 억제는 관찰되지 않았다. 그 한편으로 어피니티 정제 No.3 항체에서는 30 ng/㎖ 로부터, Citrate E 항체에서는 약 130 ng/㎖ 로부터 현저한 TRAP 활성 억제가 관찰되었다 (도 15). 겔 여과 정제 No.3 항체에서도 30 ng/㎖ 로부터 TRAP 활성의 현저한 억제가 관찰되었고, 게다가 겔 여과 정제 No.2 항체보다 겔 여과 정제 No.3 항체의 쪽에 강한 억제 활성이 관찰되었다 (도 16). 겔 여과 정제 항체에서도 파골 세포 형성 억제 활성이 관찰된 점에서, 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체에 관찰된 파골 세포 형성 억제 활성은, 항체 샘플 중에 함유되어 있는 엔도톡신이나 저분자 불순물에 의한 것이 아니라, 항체 분자 자체의 작용임이 나타났다. 이상의 결과로부터, 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체에는 파골 세포 형성 (파골 세포의 분화와 성숙) 을 억제하는 강한 작용이 있음이 나타났다.
실시예 18. 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체의 첨가에 의한 마우스 골수 비부착 세포의 파골 세포 분화 억제 항원에 의한 중화 (RANKL 자극)
항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체에 미리 항원을 첨가하고 면역 침강시켜, 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체의 작용이 그 항원과의 결합에 의존하고 있음을 확인하였다. 실시예 14 에서 제조한 어피니티 정제 No.3 항체 10 ㎍/㎖ 에 실시예 8, 9 에서 조제한 마우스 Siglec-15-His 또는 Siglec-15-Fc 를 10, 30, 100, 300 ㎍/㎖ 의 농도가 되도록 첨가하고, 37 ℃ 에서 2 시간 인큐베이트하였다. 인큐베이트 후에 Chibitan 으로 5 분간 원심시킨 상청을 Millex GV 필터 (밀리포어사 제조) 로 여과하여 멸균시켰다. 실시예 16 의 방법으로 마우스 골수 비부착 세포를 96 웰 플레이트에 200 ㎕/웰 파종하고, CO2 인큐베이터 중에서 2 일간 배양하였다. 96 웰 플레이트 중의 오래된 배양액을 제거하고, 인간 RANKL (RANKL, 페프로테크사 제조) 을 최종 농도 20 ng/㎖, M-CSF 를 10 ng/㎖ 가 되도록 첨가한 10 ％ FBS 함유 MEM-
Figure 112010014520647-pct00034
배지 100 ㎕ 를 첨가하였다. 이 세포 배양액에, 상기에서 제조한 피검 샘플을 1/200 (v/v) 이 되도록 첨가하고, 추가로 3 일간 CO2 인큐베이터 중에서 배양하였다. 배양 종료 후, 형성된 파골 세포의 타르타르산 내성 산성 포스파타아제 (TRAP) 활성을 실시예 17 에 기재된 방법으로 측정하였다. 결과를 도 17 에 나타냈다. Siglec-15-His 로 항체를 중화시킨 경우와 Siglec-15-Fc 로 항체를 중화시킨 경우의 어느 경우에서도 항체의 작용이 중화되어 소실되고, 그 결과로부터 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체의 파골 세포 형성 억제 작용은 Siglec-15 단백질과의 결합과 그 기능의 블록에 의한 것임이 증명되었다.
실시예 19. 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체의 첨가에 의한, 마우스 골수 비부착 세포의 파골 세포 분화에 대한 영향 (TNF 자극)
항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체를 사용하여 마우스 골수 비부착 세포의 TNF 자극에 의한 파골 세포 분화에 대한 영향을 검토하였다. 실시예 16 의 방법으로 조제한 마우스 골수 비부착 세포를, 10 ％ 소 태아 혈청 (FBS), 10 ng/㎖ M-CSF, 및 2 ng/㎖ TGF-β (R ＆ D 시스템즈사 제조) 를 함유하는
Figure 112010014520647-pct00035
-MEM 배지에서 1.5 × 105 세포/㎖ 로 조제한 것을 96 웰 플레이트의 각 웰에 200 ㎕ 파종하고, CO2 인큐베이터 중에서 2 일간 배양하였다. 96 웰 플레이트 중의 오래된 배양액을 제거하고, 인간 유전자 재조합형 TNF
Figure 112010014520647-pct00036
(R ＆ D 시스템즈사 제조) 를 최종 농도 30 ng/㎖, M-CSF 를 10 ng/㎖ 가 되도록 첨가한 10 ％ FBS 함유 MEM-
Figure 112010014520647-pct00037
배지 100 ㎕ 를 첨가하였다. 이 세포 배양액에, 실시예 12, 15 에서 제조한 면역 전 IgG, 겔 여과 정제·항마우스 Siglec-15 No.3 항체를 30 ∼ 1,000 ng/㎖ 의 농도가 되도록 첨가하고 추가로 3 일간 CO2 인큐베이터 중에서 배양하였다. 동시에 특허 WO96/26217호의 명세서에 기재된 방법으로 조제한 인간 유전자 재조합형 OCIF/OPG 를 3 ∼ 100 ng/㎖ 의 농도가 되도록 첨가하여 배양한 웰도 준비하였다. 배양 종료 후, 형성된 파골 세포의 타르타르산 내성 산성 포스파타아제 (TRAP) 활성을 실시예 17 에 기재된 방법으로 측정하였다. 결과를 도 18 에 나타냈다. 면역 전 IgG, 및 OCIF/OPG 에서는 현저한 TRAP 활성 억제는 관찰되지 않았다. 그 한편으로, 겔 여과 정제·항마우스 Siglec-15 No.3 항체에서는 250 ng/㎖ 이상의 농도로부터 약 50 ％ 의 TRAP 활성 억제가 관찰되었다. 그 결과로부터, OCIF/OPG 에서는 억제할 수 없는 TNF 유도성의 파골 세포 형성 (파골 세포의 분화와 성숙) 도 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체로 억제할 수 있음이 나타났다.
상기와 동일한 방법으로 배양하여 조제한 96 웰 플레이트의 각 웰에 대해, Leukocyte Acid Phosphatase kit (시그마사 제조) 를 사용하고, 키트에 첨부된 프로토콜에 따라 TRAP 염색을 실시하여, TRAP 양성 다핵 파골 세포의 형성을 관찰하였다. 그 결과, 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체의 첨가에 의해 TRAP 양성에서 거대한 다핵 파골 세포의 형성이 억제되었다 (도 19). 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체를 첨가한 경우에도 단핵 파골 세포는 형성되었으므로, 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체는 TNF 로 유도되는 파골 세포의 분화 성숙에 있어서의 세포 융합 과정을 강하게 억제함이 나타났다.
실시예 20. 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체 첨가에 의한 마우스 골수 유래 초대 배양 세포의 파골 세포 분화에 대한 영향 (TRAP 활성)
7 주령 웅성 ddY 마우스를 에테르 마취하에서 경추 탈구로 안락사시키고, 대퇴골 및 경골을 적출하였다. 연조직을 제거한 후, 대퇴골 또는 경골의 양단을 잘라내고, 25 게이지의 주사 바늘을 갖는 주사통을 사용하여 10 ％ 소 태아 혈청을 함유하는
Figure 112010014520647-pct00038
-MEM 배지를 골수 중에 주입하고, 골수 세포를 채취하였다. 세포수를 계측한 후, 10 ％ 소 태아 혈청을 함유하는
Figure 112010014520647-pct00039
-MEM 배지에서 5 × 106 세포/㎖ 로 조제한 것을 96 웰 플레이트에 100 ㎕/웰 뿌리고, 활성형 비타민 D3 (시그마사 제조) 을 최종 농도 2 × 10-8 M 이 되도록 첨가하였다. 이 세포 배양 상청에, 실시예 14 에 있어서 제조한 어피니티 정제·항마우스 Siglec-15 No.3 항체 및 실시예 12 에 있어서 제조한 면역 전 토끼 IgG 를 최종 농도 4.57, 13.7, 41.2, 123, 370, 1,111, 3,333, 10,000 ng/㎖ 가 되도록 첨가하고 CO2 인큐베이터 중에서 8 일간 배양하였다. 또한, 배지 교환 및 검체의 첨가는 3 일째 및 6 일째에 실시하였다. 배양 8 일째에 배양 상청을 제거하고, 10 ％ 중성 포르말린을 첨가하여 세포를 고정시켰다. 세포 고정 후, 증류수로 2 회 세정하고, TRAP 기질액 (15 mM p-니트로페닐인산, 50 mM 타르타르산나트륨, 0.1 M 아세트산나트륨 완충액 (pH 5.0)) 을 100 ㎕/웰 첨가하고, 실온에서 30 분 반응시켰다. 1 N NaOH 를 50 ㎕/웰 첨가하여 반응을 정지시키고, 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 405 ㎚ 에 있어서의 흡광도를 측정함으로써 세포 내의 TRAP 활성을 평가하였다. 그 결과, 첨가된 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체의 용량 의존적으로 TRAP 활성이 억제되었다 (도 20-A). 한편, 면역 전 IgG 를 첨가한 경우에서는, TRAP 활성 저하는 관찰되지 않았다 (도 20-B). 이와 같이, Siglec-15 와 특이적으로 결합되는 항체에 의해, 활성형 비타민 D3 에 의해 유도되는 마우스 골수 세포로부터의 TRAP 양성 파골 세포 형성이 억제됨이 밝혀졌다.
실시예 21. 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체 첨가에 의한 마우스 골수 유래 초대 배양 세포의 파골 세포 융합에 대한 영향 (TRAP 염색)
7 주령 웅성 ddY 마우스를 에테르 마취하에서 경추 탈구로 안락사시키고, 대퇴골 및 경골을 적출하였다. 연조직을 제거한 후, 대퇴골 또는 경골의 양단을 잘라내고, 25 게이지의 주사 바늘을 갖는 주사통을 사용하여 10 ％ 소 태아 혈청을 함유하는
Figure 112010014520647-pct00040
-MEM 배지를 골수 중에 주입하고, 골수 세포를 채취하였다. 세포수를 계측한 후, 10 ％ 소 태아 혈청을 함유하는
Figure 112010014520647-pct00041
-MEM 배지에서 5 × 106 세포/㎖ 로 조제한 것을 96 웰 플레이트에 100 ㎕/웰 파종하였다. 이 배양 상청에, 파골 세포의 분화 유도 인자로서, 활성형 비타민 D3 (시그마사 제조) 을 최종 농도 2 × 10-8 M 이 되도록 첨가한 것과, 인간 RANKL (페프로테크사 제조) 을 최종 농도 80 ng/㎖ 가 되도록 첨가한 것을 준비하였다. 이들 세포 배양 상청에, 실시예 14 에 있어서 제조한 어피니티 정제·항마우스 Siglec-15 No.3 항체를 최종 농도 370, 3,333 ng/㎖ 가 되도록, 또한 실시예 12 에 있어서 제조한 면역 전 토끼 IgG 를 최종 농도 3,333 ng/㎖ 가 되도록 첨가하였다. 활성형 비타민 D3 으로 파골 세포 분화를 유도하는 배양계에서는, CO2 인큐베이터 중에서 8 일간 배양하고, 인간 RANKL 로 분화 유도하는 계에서는 CO2 인큐베이터 중에서 6 일간 배양하였다. 또한, 배지 교환 및 검체의 첨가는 3 일째 및 6 일째에 실시하였다. 배양 후 상청을 제거하고, 10 ％ 중성 포르말린을 첨가하여 세포를 고정시켰다. 세포 고정 후, 증류수로 2 회 세정하고, TRAP 염색액 (0.27 mM 나프톨 AS-MX 인산 (시그마사 제조), 1.6 mM Fast red violet LB salt (시그마사 제조), 1 ％ 디메틸포름아미드, 50 mM 타르타르산나트륨, 0.1 M 아세트산나트륨 완충액 (pH 5.0)) 을 100 ㎕/웰 첨가하고, 실온에서 5 분 반응시켰다. 증류수로 2 회 세정하고, 현미경하에서 세포를 관찰하였다. 그 결과, 활성형 비타민 D3 (도 21), 인간 RANKL (도 22) 어느 시약으로 파골 세포를 유도한 경우에도, 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체 첨가에 의해 파골 세포의 융합이 억제되어 거대한 파골 세포 형성은 관찰되지 않았다. 한편, 면역 전 IgG 를 첨가한 경우에서는, 이와 같은 파골 세포 융합 억제는 관찰되지 않았다. 이와 같이, 활성형 비타민 D3 또는 인간 RANKL 에 의해 유도되는 마우스 골수 세포로부터의 TRAP 양성 파골 세포의 다핵화·세포 융합이, Siglec-15 와 특이적으로 결합되는 항체에 의해 억제됨이 밝혀졌다.
실시예 22. 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체 첨가에 의한 RAW264.7 세포의 파골 세포 융합에 대한 영향 (TRAP 염색)
a) 항원 단백질로 흡수시킨 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체의 제조
실시예 14 에 있어서 제조한 어피니티 정제·항마우스 Siglec-15 No.3 항체, 실시예 8, 9 에 있어서 제조한 마우스 Siglec-15-His 단백질 및 마우스 Siglec-15-Fc 단백질을, 0.01 ％ Tween 20 을 함유하는 D-PBS (인비트로젠사 제조) 를 사용하여 각각의 농도가 표 6 에 기재된 농도가 되도록 5 개의 혼합액 (A ∼ E) 을 조제하였다. 이들 혼합액을 37 ℃ 에서 2 시간 인큐베이션한 후, 20,000 × g 으로 10 분 원심시켜, 얻어진 상청을 20 배 농도의 시험 샘플로 하였다.
Figure 112010014520647-pct00042
b) RAW264.7 을 사용한 TRAP 염색에 의한 평가
RAW264.7 을 10 ％ 소 태아 혈청을 함유하는
Figure 112010014520647-pct00043
-MEM 배지에서 2.25 × 104 세포/㎖ 로 조제한 것을 96 웰 플레이트에 200 ㎕/웰 뿌리고, 인간 RANKL (페프로테크사 제조) 을 최종 농도 40 ng/㎖ 가 되도록 첨가하였다. 이 세포 배양 상청에, a) 에 있어서 제조한 A ∼ E 의 시험 샘플을 최종 농도로 1/20 이 되도록 첨가하고 CO2 인큐베이터 중에서 3 일간 배양하였다. 배양 후 상청을 제거하고, 10 ％ 중성 포르말린을 첨가하여 세포를 고정시켰다. 세포 고정 후, 증류수로 2 회 세정하고, TRAP 염색액 (0.27 mM 나프톨 AS-MX 인산 (시그마사 제조), 1.6 mM Fast red violet LB salt (시그마사 제조), 1 ％ 디메틸포름아미드, 50 mM 타르타르산나트륨, 0.1 M 아세트산나트륨 완충액 (pH 5.0)) 을 100 ㎕/웰 첨가하고, 실온에서 5 분 반응시켰다. 증류수로 2 회 세정하고, 현미경하에서 세포를 관찰하였다. 그 결과, 시험 샘플을 첨가하지 않은 컨트롤 (도23-0) 과 비교하여, 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체를 첨가함으로써 파골 세포의 융합이 현저하게 억제되었다 (도 23-A). 그러나, 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체를, 면역 항원으로서 사용한 마우스 Siglec-15-Fc 단백질로 흡수시킴으로써, 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체에 의한 파골 세포 융합의 억제 작용은 해제되었다 (도 23-B, C). 또한, 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체를, 마우스 Siglec-15-His 단백질로 흡수시킴으로써도, 동일하게 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체에 의한 파골 세포 융합의 억제 작용은 해제되었다 (도 23-D, E). 이들 결과로부터, Siglec-15 와 특이적으로 결합되는 항체에 의해, 인간 RANKL 에 의해 유도되는 RAW264.7 세포로부터의 TRAP 양성 파골 세포의 다핵화·세포 융합이 억제됨이 밝혀졌다. 또한, 도 23 에 있어서의 A 내지 E 의 기호로 나타내는 결과는, 각각 표 6 에 있어서의 A 내지 E 의 시험 샘플과 대응하고 있다.
실시예 23. 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로널 항체 생성 하이브리도마의 수립
a) 항원의 조제
실시예 8 에서 제조한, 마우스 Siglec-15-His 단백질을 100 ㎍/0.5 ㎖ 가 되도록 조제하고, 아쥬반트를 동량 첨가하고 유리 시린지로 에멀션을 제조하였다. 또한 아쥬반트는, 첫 회 면역시에만 Freund's Complete Adjuvant (FCA, 디프코사 제조) 를 사용하고, 2 회째 이후에는 Freund's Incomplete Adjuvant (FICA, 디프코사 제조) 를 사용하였다.
b) 래트에 대한 면역
래트 (Wistar, 암컷, 6 주령, 일본 쿠레아사로부터 구입) 4 마리를 면역 동물로서 사용하였다. a) 에서 얻어진 에멀션을, 항원량이 50 ㎍/래트가 되도록 피하 및 피내에 27 G 주사 바늘을 사용하여 주사하였다. 이후 7 일마다 합계 4 회의 면역을 실시하였다. 4 번째의 면역으로부터 7 일 후에 꼬리 정맥으로부터 소량 (200 ㎕) 채혈하여, 항혈청을 조제하였다. 항혈청의 항체력가를 확인하기 위해, 항원으로서 사용한 마우스 Siglec-15-His 단백질, 실시예 9 에서 제조한 마우스 Siglec-15-Fc 단백질, 또는 소 혈청 알부민 (BSA) 을 고상화시킨 ELISA 를 실시하였다. 그 결과, 4 마리의 래트 (래트 No.1 ∼ 4) 중 어느 것에 있어서도 마우스 Siglec-15-His 단백질 및 마우스 Siglec-15-Fc 단백질에 대한 반응성이 관찰되었다. 한편, BSA 에 대한 반응성은 관찰되지 않았다. 이상으로부터, 면역된 래트의 혈청 중 항체력가가 상승한 것이 확인되었기 때문에, 항체가가 가장 높았던 No.2 래트에 대해 세포 융합 조작으로 진행시켰다.
c) 세포 융합
세포 융합은, 일반적인 마우스 (래트) 비장 세포와 미엘로마 세포의 융합법에 따라 실시하였다. 래트를 에테르 마취하에서 심장으로부터 전체 채혈하여 안락사시키고, 그 후 비장을 적출하였다. 채취한 비장 세포와 마우스 미엘로마 세포인 P3X63Ag8.653 세포 (ATCC CRL 1580) 를, 폴리에틸렌글리콜 (PEC) 을 사용하여 세포 융합시켰다. 96 웰 플레이트에 세포를 파종하고, hypoxanthine (H), aminopterin (A), thymidine (T) 을 함유한 배지 (HAT 선택 배지) 를 첨가하고 7 ∼ 10 일간 배양하였다. 세포 융합된 하이브리도마의 생존이 확인된 61 웰의 배양 상청을 채취하고, 항원으로서 사용한 마우스 Siglec-15-His 단백질, 실시예 9 에서 제조한 마우스 Siglec-15-Fc 단백질, 또는 BSA 를 고상화시킨 ELISA 로 항체가를 평가하고, 항마우스 Siglec-15 모노클로널 항체 생성 하이브리도마를 스크리닝하였다. 스크리닝의 결과로부터, 항체가가 높은 12 웰을 선발하고, 그 중의 하이브리도마를 클로닝 조작으로 진행시켰다.
d) 하이브리도마의 클로닝
선발된 하이브리도마에 대해, 한계 희석법에 의해 1 차 클로닝하였다. 한계 희석 후의 배양은 2 주일 실시하고, 배양 상청 중의 항체가 확인을, 실시예 9 에서 제조한 마우스 Siglec-15-Fc 단백질 또는 BSA 를 고상화시킨 ELISA 로 실시하였다. 양성 클론으로 확인된 11 클론에 대해, 추가로 2 차 클로닝을 실시 (1 차 클로닝과 동일한 작업) 함으로써, 최종적으로 항마우스 Siglec-15 모노클로널 항체 생성 하이브리도마를 10 클론 (#1A1, #3A1, #8A1, #24A1, #32A1, #34A1, #39A1, #40A1, #41B1, #61A1) 수립하였다. 또한, 하이브리도마 #32A1 및 하이브리도마 #41B1 은, 일본 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터 (소재지 : 우편번호 305-8566 일본 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1 쵸메 1 반치 1 츄오우 다이 6) 에 2008년 8월 28일자로 기탁되고, 하이브리도마 #32A1 은 anti-Siglec-15 Hybridoma 32A1 의 명칭으로 기탁 번호 FERM BP-10999 가 부여되고, 하이브리도마 #41B1 은 anti-Siglec-15 Hybridoma #41B1 의 명칭으로 기탁 번호 FERM BP-11000 이 부여되어 있다.
실시예 24. 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로널 항체의 조제
a) 누드 마우스 복수의 조제
실시예 23 에서 수립한 하이브리도마를, 10 ％ FCS 함유 TIL Media Ⅰ ((주) 면역 생물 연구소 제조) 배지를 사용하여 배양하였다. 또한 세포의 계대는 5 × 105 세포/㎖ 정도로 증식된 시점을 기준으로 4 분의 1 정도로 희석시키는 작업을, 2 ∼ 3 일에 1 번 실시하였다. 프리스탄을 복강 내에 전 (前) 투여 (0.2 ㎖/마우스) 한 누드 마우스에, 배양한 하이브리도마를 1 × 107 세포/마우스가 되도록 복강 내에 이식하였다. 이식에는, 10 클론의 하이브리도마 각각에 대해 각 3 마리의 누드 마우스를 사용하였다. 이식 후, 복수의 축적이 충분히 관찰된 시점에서 복수를 채취하고, 각 하이브리도마 3 마리분을 1 개로 합쳐 채취량을 측정한 후, 항체의 정제까지 동결 보존하였다. 각 하이브리도마에 대해, 복수의 채취량을 표 7 에 정리하였다.
Figure 112010014520647-pct00044
b) 항체의 정제
채취한 복수의 전체량을, 20 ㎖ 의 Protein G 칼럼 (GE Healthcare 사 제조) 을 사용한 IgG 의 정제에 제공하였다. 정제된 IgG 는 겔 여과 분석 (Superdex 200 칼럼 크로마토) 에 의해 순도 검정을 실시하고, 일부를 원심 막 농축시켰다. 즉, 정제된 항마우스 Siglec-15 모노클로널 항체 중, #24A1 항체를 제외한 9 종류의 항체를, 원심 막 농축기 Amicon Ultra-15 (밀리포어사 제조) 를 사용하여 3000 r.p.m., 4 ℃ 에서 30 ∼ 60 분간 원심시킴으로써 약 6 배 ∼ 8 배 농축시켰다. 계속해서, #24A1 항체 및 농축된 기타 9 종류의 항체에 대해, 소 혈청 알부민 (BSA) 을 표준 샘플로서 사용하여 DC-Protein Assay Kit (BioRad 사 제조) 로 단백질 농도를 측정하였다. 이상의 조작에 의해, 항마우스 Siglec-15 모노클로널 항체를 조제하였다.
실시예 25. 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로널 항체의 마우스 Siglec-15 단백질에 대한 결합성 평가
래트 항마우스 Siglec-15 모노클로널 항체의 마우스 Siglec-15 단백질에 대한 결합성을 ELISA 법에 의해 평가하였다. 실시예 9 에서 제조한 마우스 Siglec-15-Fc 단백질을 5 ㎍/㎖ 가 되도록 0.1 M 탄산나트륨 버퍼 (pH 9.5) 로 희석시키고, 96 웰 플레이트 (나르제눙크사 제조, 카탈로그 번호 : 430341) 에 100 ㎕/웰 첨가하였다. 실온에서 1 시간 방치시킨 후에 용액을 제거하고, 300 ㎕/웰의 세정 버퍼 (0.05 ％ Tween 20 함유 인산염 완충 생리 식염수) 를 첨가하여 제거하였다. 이 세정 작업을 추가로 1 회 실시한 후, 25 ％ 블록 에이스 (다이닛폰 스미토모 제약사 제조) 를 함유하는 인산염 완충 생리 식염수를 200 ㎕/웰 첨가하고, 실온에서 1 시간 방치시킴으로써 블로킹을 실시하였다. 액을 제거하고 300 ㎕/웰의 세정 버퍼로 2 회 세정한 후, 실시예 24 에서 조제한 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로널 항체 또는 래트 컨트롤 IgG (R ＆ D 시스템즈사 제조) 를, ELISA 버퍼 (12.5 ％ 블록 에이스, 0.05 ％ Tween 20 을 함유하는 인산염 완충 생리 식염수) 를 사용하여 최종 농도가 1.28 ∼ 20,000 ng/㎖ (5 배 희석 계열) 가 되도록 희석시키고, 100 ㎕/웰 첨가하였다. 실온에서 1 시간 방치시킨 후에 액을 제거하고, 300 ㎕/웰의 세정 버퍼로 3 회 세정하였다. 계속해서 ELISA 버퍼를 사용하여 1,000 배 희석시킨 HRP (서양 고추냉이 페록시다아제) 표지 염소 항래트 IgG 항체 (베크맨코르타사 제조) 를 100 ㎕/웰 첨가하고, 실온에서 1 시간 방치시켰다. 액을 제거하고, 300 ㎕/웰의 세정 버퍼로 3 회 세정한 후, 페록시다아제용 발색 키트 (스미토모 베이클라이트사 제조) 를 사용하여, 키트에 첨부된 설명서에 따라 발색시켰다. 발색 후, 마이크로 플레이트 리더 (니혼 몰레큘러 디바이스사 제조) 를 사용하여 492 ㎚ 에서의 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 검토한 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로널 항체 10 검체 전부에 있어서, 항체의 농도에 의존한 마우스 Siglec-15 단백질에 대한 결합이 확인되었다 (도 24). 한편 래트 컨트롤 IgG 에서는, 마우스 Siglec-15 단백질에 대한 결합이 관찰되지 않았다.
실시예 26. 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로널 항체의 마우스 파골 세포 형성 시험에서의 생물 활성 평가
실시예 24 에 있어서 제조한 10 검체 전부의 항마우스 Siglec-15 모노클로널 항체를 사용하여 마우스 골수 비부착 세포의 파골 세포 분화에 대한 영향을 검토하였다. 실시예 16 의 방법으로 조제한 마우스 골수 비부착 세포를 10 ％ FBS 와 10 ng/㎖ M-CSF (R ＆ D Systems 사 제조) 를 함유하는
Figure 112010014520647-pct00045
-MEM 배지에서 1.5 × 105 세포/㎖ 로 조제한 것을 96 웰 플레이트의 각 웰에 200 ㎕ 파종하고, CO2 인큐베이터 중에서 2 일간 배양하였다. 96 웰 플레이트 중의 오래된 배양액을 제거하고, 인간 RANKL (RANKL, 페프로테크사 제조) 을 최종 농도 20 ng/㎖, M-CSF 를 10 ng/㎖ 가 되도록 첨가한 10 ％ FBS 함유 MEM-
Figure 112010014520647-pct00046
배지 100 ㎕ 를 첨가하였다. 이 세포 배양액에, 실시예 24 에서 제조한 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로널 항체, 시판되는 래트 컨트롤 IgG (Purified Rat IgG, R ＆ D Systems 사 제조) 로부터 아지화나트륨을 제거한 샘플, 및 실시예 14 에서 제조한 토끼 항마우스 Siglec-15 폴리클로널 항체 (No.3) 를 32 ∼ 1,000 ng/㎖ 의 농도가 되도록 첨가하고, 추가로 3 일간 CO2 인큐베이터 중에서 배양하였다. 배양 종료 후, 형성된 파골 세포의 타르타르산 내성 산성 포스파타아제 (TRAP) 활성을 실시예 17 에 기재된 방법으로 측정하였다. 효소 반응 정지 후에 각 웰의 405 ㎚ 의 흡광도를 측정하여 TRAP 활성의 지표로 하였다. 결과를 도 25 및 26 에 나타냈다. 시판되는 래트 컨트롤 IgG 에서는 현저한 TRAP 활성 억제는 관찰되지 않았다. 그 한편으로, #32A1 항체에서는 32 ng/㎖ 내지 1000 ng/㎖ 의 범위에서, #8A1 항체와 어피니티 정제 토끼 폴리클로널 No.3 항체에서는 63 ng/㎖ 내지 1000 ng/㎖ 의 범위에서, 현저한 TRAP 활성 억제가 관찰되었다. 또한 #3A1 항체, #34A1 항체, #39A1 항체에 있어서도, 500 ng/㎖ 이상의 비교적 고농도에 있어서 TRAP 활성의 용량 의존적인 억제가 관찰되었다. 그 밖의 항체에 의한 마우스 파골 세포 형성 억제는 관찰되지 않았다. 이상의 결과로부터, 조제된 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로널 항체 중에, 마우스의 파골 세포 형성 (파골 세포의 분화와 성숙) 을 강하게 억제하는 항체를 알아냈다. 또한, #3A1 항체, #8A1 항체, #32A1 항체, #34A1 항체, #39A1 항체에 공통된 성질로서, 1000 ng/㎖, 즉 1 ㎍/㎖ 이하의 농도에 있어서 파골 세포 형성을 저해하는 작용을 들 수 있다.
실시예 27. 인간 유래 성숙 파골 세포로부터의 전체 RNA 의 추출
정상 인간 파골 전구 세포 (Normal Human Natural Osteoclast Precursor Cells, 산코 쥰야쿠로부터 구입, 카탈로그 번호 2T-110) 를, 소 태아 혈청 (최종 농도 10 ％), 인간 RANKL 및 인간 M-CSF 등을 함유하는 OPGM 첨가 인자 세트 (산코 쥰야쿠로부터 구입, 카탈로그 번호 PT-9501) 를 첨가한 파골 전구 세포용 기초 배지 (OPBM, 산코 쥰야쿠로부터 구입, 카탈로그 번호 PT-8201) 에서 배양하면, 3 ∼ 7 일 후에 TRAP 양성 다핵 파골 세포가 다수 출현한다. 이 세포 배양 시스템을 키트에 첨부되어 있는 설명서에 따라 사용함으로써, 인간 유래 성숙 파골 세포를 제조하였다.
a) 정상 인간 파골 전구 세포를, 96 웰 플레이트에 1 × 104 세포/웰이 되도록 60 웰분 뿌리고, 인간 RANKL 을 최종 농도 66 ng/㎖ 가 되도록 첨가하고, CO2 인큐베이터 중에서 4 일간 배양하였다. 이어서, 전체 RNA 추출용 시약 (ISOGEN : 닛폰 진사 제조) 을 시약에 첨부된 프로토콜에 따라 사용함으로써, 다핵 파골 세포로부터 전체 RNA 를 추출하였다. 회수된 전체 RNA 는 사용시까지 -80 ℃ 에서 보존하였다.
b) 정상 인간 파골 전구 세포를, 96 웰 플레이트 2 장에 각각 1 × 104 세포/웰이 되도록 84 웰분 뿌리고, 1 장에는 인간 RANKL 을 최종 농도 53.2 ng/㎖ 가 되도록 첨가하고, 다른 1 장에는 인간 RANKL 을 첨가하지 않고 CO2 인큐베이터 중에서 3 일간 배양하였다. 이어서, 전체 RNA 추출용 시약 (ISOGEN : 닛폰 진사 제조) 을 시약에 첨부된 프로토콜에 따라 사용함으로써, 세포로부터 전체 RNA 를 추출하였다. 회수된 전체 RNA 는 사용시까지 -80 ℃ 에서 보존하였다.
실시예 28. 인간 Siglec-15 오픈 리딩 프레임 (ORF) 배열의 취득
a) 퍼스트 스트랜드 cDNA 합성
실시예 27, a) 에서 제조한 전체 RNA 를 주형으로 하고, 올리고 (dT) 프라이머 (인비트로젠사 제조) 를 사용하여 Superscript Ⅲ 역전사 효소 (인비트로젠사 제조) 에 의해 cDNA 합성을 실시하였다. 조작은 효소에 부속된 프로토콜에 따라 실시하였다.
b) PCR 반응
인간 Siglec-15 의 ORF cDNA 를 PCR 로 증폭시키기 위한 프라이머로서
5'-attaagcttc accATGGAAA AGTCCATCTG GCTGC-3' (hSiglec-15-HindⅢkozak-F : 배열표의 배열 번호 29)
및
5'-agtggatccT CACGGTGAGC ACATGGTGGC-3' (hSiglec-15-BamHI-R : 배열표의 배열 번호 30) 의 배열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 통상적인 방법에 따라 합성하였다. 이 프라이머의 조합과 a) 에서 제조한 cDNA 를 사용하여 통상적인 방법에 따라 PCR 을 실시하였다. 얻어진 PCR 반응액은 PureLink PCR Purification Kit (인비트로젠사 제조) 를 사용하여 정제하였다.
c) pcDNA3.1 (＋) 벡터로의 클로닝
b) 에서 얻어진 정제 PCR 반응액 및 pcDNA3.1 (＋) 벡터 (인비트로젠사 제조) 를 제한 효소 처리 (BamHI, HindⅢ) 하고, 겔을 잘라내어 정제한 후, 통상적인 방법에 따라 리가아제 반응을 실시하였다. 대장균 TOP10 을 형질 전환시키고, 얻어진 약제 내성 클론에 대하여 콜로니 PCR 을 실시하였다. 예상 사이즈의 증폭 산물이 얻어진 클론에 대하여, 플라스미드에 삽입되어 있는 ORF cDNA 의 전체 뉴클레오티드 배열을 DNA 시퀀서를 사용하여 해석한 결과, 배열표의 배열 번호 1 에 나타내어지는 배열임이 판명되었다. 이 뉴클레오티드 배열은, NCBI GenBank 데이터베이스에 「인간 Siglec-15」(등록 번호 : NM_213602) 로서 등록되어 있는 배열의 ORF 코드 영역과 동일하고, 또한 그 뉴클레오티드 배열로 코드되는 아미노산 배열 (배열표의 배열 번호 2) 은 인간 Siglec-15 의 아미노산 배열과 100 ％ 일치하였다.
실시예 29. 인간 파골 세포 분화에 수반되는 인간 Siglec-15 의 mRNA 발현 (리얼 타임 PCR 해석)
실시예 27, b) 에서 제조한 전체 RNA 1 ㎍ 에 1 ㎕ 1 U/㎕ DNAseI, 1 ㎕ 10 × DNAseI Buffer (인비트로젠사 제조) 를 첨가하고 H2O 로 10 ㎕ 로 하고, 실온에서 15 분간 반응시킨 후, 1 ㎕ 25 mM EDTA 를 첨가하고 65 ℃ 에서 10 분간 가열하였다. 이 용액으로부터 8 ㎕ 를 분취하고, 1 ㎕ 50 μM oligo(dT)20 프라이머 및 1 ㎕ 10 mM dNTPs를 첨가하고, 65 ℃ 에서 5 분간 가열한 후, 얼음 속에서 보온시켰다. 이 용액에 2 ㎕ 10 × RT Buffer (인비트로젠사 제조), 4 ㎕ 25 mM MgCl2, 2 ㎕ 0.1 M dithiothreitol, 1 ㎕ RNAse inhibitor (RNAseOUT, 40 U/㎕, 인비트로젠사 제조), 1 ㎕ Superscript Ⅲ 역전사 효소 (200 U/㎕, 인비트로젠사 제조) 를 첨가하여 전체량을 20 ㎕ 로 하고, 50 ℃ 에서 50 분간 반응시킨 후, 85 ℃ 에서 5 분간 가열하고, 얼음 속에서 보온시켰다.
이와 같이 하여 제조한 1 개 사슬 cDNA 를 사용하여, 이하의 프라이머 및 형광 표지 프로브 (TaqMan 프로브, 어플라이드 바이오시스템즈사 제조) 의 조합에서 리얼 타임 PCR 을 실시하였다.
리얼 타임 PCR 조건 :
인간 카텝신 K 증폭용 프라이머 :
5'-ccgcagtaat gacacccttt-3' (TqM-hcatK-F : 배열표의 배열 번호 31)
및
5'-aaggcattgg tcatgtagcc-3' (TqM-hcatK-R : 배열표의 배열 번호 32),
인간 카텝신 K 검출용 TaqMan 프로브 :
5'-Fam-tcagggtcag tgtggttcct gttgggct-TAMRA-3' (TqM-hcatK-probe : 배열표의 배열 번호 33),
인간 TRAP 증폭용 프라이머 :
5'-ctgtcctggc tcaagaaaca-3' (TqM-hTRAP-F : 배열표의 배열 번호 34)
및
5'-ccatagtgga agcgcagata-3' (TqM-hTRAP-R : 배열표의 배열 번호 35)
인간 TRAP 검출용 TaqMan 프로브 :
5'-Fam-tgagaatggc gtgggctacg tgctgagt-TAMRA-3' (TqM-hTRAP-probe : 배열표의 배열 번호 36),
인간 Siglec-15 증폭용 프라이머 :
5'-cagccaccaa catccatttc-3' (TqM-hSiglec-15-F : 배열표의 배열 번호 37)
및
5'-cgctcaagct aatgcgtgta-3' (TqM-hSiglec-15-R : 배열표의 배열 번호 38),
인간 Siglec-15 검출용 TaqMan 프로브 :
5'-Fam-aagaacaaag gccagtgcga ggcttggc-TAMRA-3' (TqM-hSiglec-15-probe : 배열표의 배열 번호 39),
인간 L32 리보솜 단백질 증폭용 프라이머 :
5'-gagatcgctc acaatgtttc ct-3' (TqM-hL32-F : 배열표의 배열 번호 40)
및
5'-gatgccagat ggcagttttt ac-3' (TqM-hL32-R : 배열표의 배열 번호 41)
인간 L32 리보솜 단백질 검출용 TaqMan 프로브 :
5'-Fam-accgcaaagc catcgtggaa agagctg-TAMRA-3' (TqM-hL32-probe : 배열표의 배열 번호 42)
리얼 타임 PCR 시스템 (ABI 프리즘 7700 시퀀스 디텍터, (주) 퍼킨엘머 재팬·어플라이드 바이오시스템즈 사업부 제조) 을 사용하여 이하의 조건에서 리얼 타임 PCR 을 해석하였다. 또한 반응시에는 TaqMan Universal PCR Master Mix (어플라이드 바이오시스템즈사 제조) 를 사용하였다. 먼저 각 25 p㏖ 의 프라이머, 8 ng 의 1 개 사슬 cDNA 및 10 p㏖ 의 TaqMan 프로브에 증류수를 첨가하여 25 ㎕ 로 하고, 25 ㎕ TaqMan Universal PCR Master Mix 를 첨가하여 50 ㎕ 의 반응액을 조제하였다. 이 반응액을 50 ℃ 에서 2 분 가열한 후 95 ℃ 에서 10 분 가열하고, 「95 ℃ 에서 0.25 분, 60 ℃ 에서 1 분」의 온도 사이클을 40 회 반복하여 리얼 타임 PCR 해석을 실시하였다. 또한, 각 유전자의 mRNA 발현량은, L32 리보솜 단백질의 mRNA 발현량으로 보정하였다.
그 결과, 파골 세포의 마커 분자로서 알려져 있는 카텝신 K 및 TRAP 유전자와 동일하게, Siglec-15 유전자의 발현량은 RANKL 을 첨가하여 인간 파골 세포 분화를 유도한 경우에 현저하게 상승함이 밝혀졌다 (도 27).
실시예 30. 가용형 인간 Siglec-15 단백질의 발현 컨스트럭트의 제조
인간 Siglec-15 단백질의 세포 외 영역을 코드하는 부분의 핵산 배열은 배열표의 배열 번호 43 이고, 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 44 이다. 이와 같은 부분 배열을 이용함으로써, 동물 세포 등의 배양 상청 중에 가용형 인간 Siglec-15 단백질을 생성시킬 수 있다.
a) 가용형 인간 Siglec-15 유전자의 PCR 에 의한 증폭
인간 Siglec-15 의 세포 외 영역 cDNA 를 PCR 로 증폭시키기 위한 프라이머로서
5'-ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt caccATGGAA AAGTCCATCT GGCTGC-3' (hSiglec-15-ECD-F : 배열표의 배열 번호 45)
및
5'-ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc CCCGCTGGCG CCATGGAAGC GG-3' (hSiglec-15-ECD-R : 배열표의 배열 번호 46) 의 배열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 통상적인 방법에 따라 합성하였다. 또한, 이들 프라이머는, Gateway 엔트리 클론 제조용 증폭용 프라이머로서, hSiglec-15-ECD-F 에는 attB1 배열이, hSiglec-15-ECD-R 에는 attB2 배열이 부가되도록 설계하였다. 이 프라이머의 조합과, 템플릿으로서 실시예 28 에서 제조한 인간 Siglec-15/pcDNA3.1 (＋) 플라스미드를 사용하여 통상적인 방법에 따라 PCR 을 실시하였다. 얻어진 PCR 반응액은 PureLink PCR Purification Kit (인비트로젠사 제조) 를 사용하여 정제하였다.
b) Gateway BP 반응에 의한 엔트리 클론의 제조
λ 파지의 부위 특이적 재조합 시스템을 응용한 Gateway 테크놀로지 (인비트로젠사) 에 의해, 인간 Siglec-15 세포 외 영역의 cDNA 를 삽입한 엔트리 클론을 이하의 방법으로 제조하였다. 먼저 a) 에서 제조한, attB 배열을 양단에 갖는 PCR 산물과, attP 배열을 갖는 도너 벡터인 pDNOR221 (인비트로젠사 제조) 사이에서, BP 클로나아제를 사용한 BP 반응을 실시하였다. 이 반응액을 사용하여 대장균 TOP10 을 형질 전환시키고, 약제 내성 클론에 대하여 콜로니 PCR 을 실시하고, 인서트 사이즈를 확인하였다. 인서트의 사이즈가 올바르게 확인된 클론에 대해, 인서트의 전체 DNA 배열의 시퀀스 해석을 실시한 결과, 목적으로 하는 인간 Siglec-15 단백질의 세포 외 영역을 코드하는 핵산 배열 (배열표의 배열 번호 43) 과 완전히 일치하는 엔트리 클론이 얻어졌다.
c) Gateway LR 반응에 의한 발현 클론의 제조
λ 파지의 부위 특이적 재조합 시스템을 응용한 Gateway 테크놀로지 (인비트로젠사) 에 의해, 인간 Siglec-15 세포 외 영역의 cDNA 를 삽입한 발현 클론을 이하의 방법으로 제조하였다. b) 에서 제조한 엔트리 클론은 인서트의 양단에 attL 배열을 갖고 있다. 이 엔트리 클론과 attR 배열을 갖는 2 종류의 데스티네이션 벡터 사이에서 LR 클로나아제를 사용한 LR 반응을 실시하였다. 또한 데스티네이션 벡터는, 인서트의 C 말단측에 V5 에피토프와 6 × His 태그가 부가되도록 설계된 pDONM, 및 인서트의 C 말단측에 인간 Fc 태그가 부가되도록 설계된 phIgFc 의 2 종류를 사용하였다. LR 반응에 의해 얻어진 반응액을 사용하여 대장균 TOP10 을 형질 전환시키고, 얻어진 약제 내성 클론에 대하여 시퀀스를 해석하여, 재조합이 올바르게 실시되었는지를 확인하였다.
시퀀스 해석의 결과, pDONM 및 phIgFc 의 양방에서 올바르게 재조합된 발현 클론 (가용형 인간 Siglec-15/pDONM 및 가용형 인간 Siglec-15/phIgFc) 이 각각 얻어졌다. 가용형 인간 Siglec-15/pDONM 을 동물 세포 등에 트랜스펙션시킴으로써, 배열표의 배열 번호 47 에 기재된 염기 배열을 갖는 mRNA 가 전사되고, 배열표의 배열 번호 48 에 기재된 아미노산 배열을 갖는 단백질 (인간 Siglec-15-His) 이 번역된다. 가용형 인간 Siglec-15/phIgFc 를 동물 세포 등에 트랜스펙션시킴으로써, 배열표의 배열 번호 49 에 기재된 염기 배열을 갖는 mRNA 가 전사되고, 배열표의 배열 번호 50 에 기재된 아미노산 배열을 갖는 단백질 (인간 Siglec-15-Fc) 이 번역된다.
실시예 31. 293-F 세포를 사용한 가용형 인간 Siglec-15 단백질 함유 배양액의 대량 조제
a) 인간 Siglec-15-His 함유 배양액의 조제
실시예 30 에서 얻어진 가용형 인간 Siglec-15/pDONM 을 약 25 ㎎ 조제하였다. 또한, 대량 배양된 대장균으로부터의 플라스미드 정제에는, 인비트로젠 PureLink HiPure Plasmid Gigaprep Kit (인비트로젠사 제조) 를 사용하였다. 조제된 플라스미드를 Opti-MEM (인비트로젠사 제조) 과 혼합하고, 트랜스펙션 시약인 293 fectin (인비트로젠사 제조) 을 50 ㎖ 첨가하고 실온에서 20 분간 인큐베이션하였다. 이 혼화액을, 1 ％ 페니실린-스트렙트마이신을 함유하는 FreeStyle 293 Expression Media (인비트로젠사 제조) 중에서 1.0 ∼ 3.4 × 106 세포/㎖ 가 되도록 25 ℓ 바이오 프로세스 배양 장치 (WAVE Bioreactor) 를 사용하여 배양한 FreeStyle 293-F 세포 (인비트로젠사 제조) 에 첨가하였다. 6 ∼ 12 ％ CO2 농도, 37 ℃ 에서 96 시간 (4 일간) 교반 배양 (30 회전/분) 한 후에 배양액을 회수하고, 원심 분리하여 배양 상청을 조제하였다. 이와 같이 하여 조제한 배양 상청 중에는, 인간 Siglec-15 의 세포 외 영역 C 말단측에 V5 에피토프와 6 × His 태그가 부가된 단백질 (인간 Siglec-15-His) 이 발현되는 것으로 생각된다.
b) 인간 Siglec-15-Fc 함유 배양액의 조제
실시예 30 에서 얻어진 가용형 인간 Siglec-15/phIgFc 를 약 5 ㎎ 조제하였다. 또한, 대량 배양된 대장균으로부터의 플라스미드 정제에는, 인비트로젠 PureLink HiPure Plasmid Gigaprep Kit (인비트로젠사 제조) 를 사용하였다. 조제된 플라스미드를 Opti-MEM (인비트로젠사 제조) 과 혼합하고, 필터 멸균시킨 후 트랜스펙션 시약인 293 fectin (인비트로젠사 제조) 을 10 ㎖ 첨가하고 실온에서 20 분간 인큐베이션하였다. 이 혼화액을, FreeStyle 293 Expression Media (인비트로젠사 제조) 중에서 1.0 ∼ 3.0 × 106 세포/㎖ × 5 ℓ (1 ℓ/플라스크를 5 개) 가 되도록 에를렌마이어 플라스크 중에서 배양한 FreeStyle 293-F 세포 (인비트로젠사 제조) 에 첨가하였다. 8.0 ％ CO2 농도, 37 ℃ 에서 96 시간 (4 일간) 회전 배양 (125 회전/분) 한 후에 배양액을 회수하고, 원심 분리하여 배양 상청을 조제하였다. 이와 같이 하여 조제한 배양 상청 중에는, 인간 Siglec-15 의 세포 외 영역 C 말단측에 인간 Fc 태그가 부가된 단백질 (인간 Siglec-15-Fc) 이 발현되는 것으로 생각된다.
실시예 32. 가용형 인간 Siglec-15 단백질의 정제
a) 가용형 인간 Siglec-15-His 의 정제
a-ⅰ) HisTrap HP 칼럼 크로마토
실시예 31, a) 에서 조제한 인간 Siglec-15-His 를 발현시킨 293F 세포의 배양액 12 ℓ 에 1350 ㎖ 의 10 x buffer (500 mM Tris, 1.5 M NaCl, 200 mM Imidazole, pH 8.0) 를 첨가하여 잘 교반한 후, MilliPak 60 필터 (밀리포어사 제조) 로 여과하였다. 이 배양액을, 미리 순수 (Milli Q 수) 로 세정해 둔 Ni-Sepharose HP (아머샴 바이오사이언스사 제조) 100 ㎖ 칼럼에 유속 10 ㎖/min 으로 넣었다. 300 mM NaCl 을 함유하는 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.0) 400 ㎖ 를 사용하여 유속 8 ㎖/min 으로 칼럼을 세정한 후, 300 mM NaCl, 500 mM Imidazole 을 함유하는 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.0) 200 ㎖ 를 사용하여 유속 2.5 ㎖/min 으로 칼럼에 흡착되어 있는 단백질을 용출시키고, Mini-sorp tube (눙크사 제조) 에 분취하였다. 용출된 단백질을 함유하는 획분 약 40 ㎖ 에 단백질의 침전을 방지할 목적으로 5 M NaCl 용액 8 ㎖ 를 첨가하여 교반한 후, 원심 막 농축기 Amicon Ultra-15 (밀리포어사 제조) 에 의해 약 20 ㎖ 로 농축시켰다. 농축시에 발생한 불용물을 3000 r.p.m., 4 ℃ 에서 30 분간 원심시켜 제거하고, 그 상청액 2.5 ㎖ 를 미리 1 M NaCl 을 함유하는 인산염 완충 생리 식염수 (N-PBS) 로 평형화시켜 둔 PD-10 탈염 칼럼 (아머샴 바이오사이언스사 제조) 에 넣고 N-PBS 로 용출시켜, 용매를 N-PBS 로 치환시킨 샘플 3.5 ㎖ 를 얻었다. 이 조작을 추가로 7 회 반복 실시하여, 인간 Siglec-15-His 조 (粗) 정제 용액 약 28 ㎖ 를 얻었다.
a-ⅱ) Resource Q 칼럼 크로마토
Ni-Sepharose HP 칼럼 크로마토로 정제한 N-PBS 치환 샘플 12 ㎖ 를 0.1 ％ CHAPS 를 함유하는 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.5) 에 4 ℃ 에서 하룻밤 투석 (1 ℓ, 3 회) 한 후, 4 ℃, 3,000 r.p.m. 으로 30 분간 원심시켜 침전물을 제거하였다. 이 상청액을 Millex GV 필터 (밀리포어사 제조) 로 여과한 후, 0.1 ％ CHAPS 를 함유하는 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.5) 으로 미리 평형화시켜 둔 Resource Q 6 ㎖ 칼럼 (아머샴 바이오사이언스사 제조) 에 유속 1 ㎖/min 으로 넣고, 계속해서 이 완충액을 사용하여 유속 1 ㎖/min 으로 칼럼을 세정하고, 칼럼에 흡착되지 않는 단백질 획분을 모았다. 칼럼에 흡착된 단백질은, 0.1 ％ CHAPS, 1 M NaCl 을 함유하는 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.5) 을 사용하여 유속 1 ㎖/min 으로 용출시켰다. 칼럼에 흡착되지 않은 획분 26.5 ㎖ 를, 원심 막 농축기 Amicon Ultra-15 (밀리포어사 제조) 에 의해 3.0 ㎖ 로 농축시킨 후, 4 ℃, 3,000 r.p.m. 으로 10 분간 원심시켜 침전물을 제거하였다. 그 상청액 2.5 ㎖ 를 미리 50 mM 아르기닌염산염을 함유하는 인산염 완충 생리 식염수 (pH 7.0, A-PBS) 로 평형화시켜 둔 PD-10 탈염 칼럼 (아머샴 바이오사이언스사 제조) 에 넣고 A-PBS 로 용출시켜, 용매를 A-PBS 로 치환시킨 샘플 3.5 ㎖ 를 얻었다. 조제된 샘플의 용매 중의 아르기닌염산염은 가용형 인간 Siglec-15-His 가 침전되는 것을 방지하기 위해 첨가하였다. 원심 후의 상청액은 사용할 때까지 -80 ℃ 에서 동결 보존하였다. 이상의 정제 조작 (Resource Q 칼럼 크로마토) 을 2 회 반복 실시하였다.
a-ⅲ) 정제된 인간 Siglec-15-His 의 검출과 순도 검정
상기의 정제 조작 (Ni-Sepharose HP 칼럼 크로마토, Resource Q 칼럼 크로마토) 으로 조제한 샘플을 사용하여 환원 조건하에서 SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동과 은 염색을 실시하였다. 즉 각 정제 단계의 샘플 5 ㎕ 에 동량의 SDS-처리액을 첨가하고, 95 ℃ 에서 10 분간 열처리하였다. 열처리한 각 샘플 0.3 ㎕ 를 SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동에 사용하였다. 전기 영동의 조작은 분자량 마커로서 레인보우 분자량 마커 (아머샴 바이오사이언스사 제조) 를 사용한 것 이외에는, 실시예 8 과 동일한 방법으로 실시하였다. 전기 영동 종료 후에 PhastGel Silver Kit (아머샴 바이오사이언스사 제조) 와 PhastSystem 을 사용하여 은 염색을 실시하고, 그 결과를 도 28 에 나타냈다. Resource Q 칼럼에 흡착되지 않은 단백질 획분에 분자량 약 35 kDa 의 단백질 (인간 Siglec-15-His) 이 효율적으로 정제 농축되었음이 나타났다.
a-ⅳ) 정제된 인간 Siglec-15-His 의 단백질 농도 측정
정제 인간 Siglec-15-His (Resource Q 칼럼에 흡착되지 않은 단백질 획분) 에 대해, 소 혈청 알부민을 표준 샘플로서 사용하여 DC-Protein Assay kit (BioRad 사 제조) 로 단백질 농도를 측정하였다. 2 회의 정제 조작으로 합계 1.66 ㎎ 의 정제 인간 Siglec-15-His 를 얻었다.
b) 가용형 인간 Siglec-15-Fc 의 정제
b-ⅰ) HiTrap protein A 칼럼 크로마토
실시예 31, b) 에서 조제한 인간 Siglec-15-Fc 를 발현시킨 293F 세포의 배양액 1.5 ℓ 를 Sterivex GV 필터 (밀리포어사 제조) 로 여과한 후, 미리 둘베코 PBS (D-PBS, 인비트로젠사 제조) 로 평형화시켜 둔 HiTrap protein A 5 ㎖ 칼럼 (아머샴 바이오사이언스사 제조) 에 유속 5 ㎖/min 으로 넣었다. D-PBS 70 ㎖ 를 사용하여 유속 5 ㎖/min 으로 칼럼을 세정한 후, 0.1 M 시트르산나트륨 완충액 (pH 3.0) 24 ㎖ 를 사용하여 유속 1.2 ㎖/min 으로 칼럼에 흡착되어 있는 단백질을 용출시켰다. 용출된 액은, Mini-sorp tube (눙크사 제조) 에 1.2 ㎖/Fr. 로 분취한 후, 1 M Tris 0.31 ㎖ 를 바로 첨가하여 중화시켰다. 용출된 단백질의 획분 (Fr.5 ∼ 9) 약 7.5 ㎖ 중의 2.5 ㎖ 를, 50 mM 아르기닌염산염을 함유하는 인산염 완충 생리 식염수 (pH 7.0, A-PBS) 로 평형화시켜 둔 PD-10 탈염 칼럼 (아머샴 바이오사이언스사 제조) 에 넣고 A-PBS 로 용출시켜, 용매를 A-PBS 로 치환시킨 샘플 3.5 ㎖ 를 얻었다. 이 작업을 2 회 반복 실시하였다. 용매 중의 아르기닌염산염은 가용형 인간 Siglec-15-Fc 가 침전되는 것을 방지하기 위해 첨가하였다. 용출된 단백질 획분 (Fr.5 ∼ 9) 중 나머지 2.5 ㎖ 는, 1 M NaCl 을 함유하는 인산염 완충 생리 식염수 (pH 6.7, N-PBS) 로 평형화시켜 둔 PD-10 탈염 칼럼 (아머샴 바이오사이언스사 제조) 에 넣고 N-PBS 로 용출시켜, 용매를 N-PBS 로 치환시킨 샘플 3.5 ㎖ 를 얻었다. 조제된 샘플의 용매 중의 NaCl 은, 아르기닌 등의 아미노기 함유 화합물을 첨가하지 않고, 가용형 인간 Siglec-15-Fc 의 침전을 방지할 목적으로 첨가하였다. 용매를 N-PBS 로 치환시킨 인간 Siglec-15-Fc 샘플은, 이후에 나오는 실시예 34, c) 에 있어서 고정화 칼럼을 조제하였을 때에만 사용하고, 그 이외의 실시예에서는 전부 A-PBS 로 치환시킨 인간 Siglec-15-Fc 를 사용하였다. 이상의 조작으로 조제된 샘플은 사용할 때까지 -80 ℃ 에서 동결 보존하였다.
b-ⅱ) 정제된 인간 Siglec-15-Fc 의 검출과 순도 검정
상기의 정제 조작으로 조제된 샘플을 사용하여 환원 조건하의 SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동과 은 염색을 실시하였다. 즉 각 정제 단계의 샘플 5 ㎕ 에 동량의 SDS-처리액을 첨가하고, 95 ℃ 에서 10 분간 가열하였다. 열처리한 각 샘플을 1/2 농도의 SDS-처리액으로 1/100 또는 1/300 배 희석시킨 샘플 0.3 ㎕ 를 SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동에 사용하였다. 전기 영동과 은 염색은, a-ⅲ) 에 기재된 인간 Siglec-15-His 의 순도 검정과 동일한 방법으로 실시하고, 그 결과를 도 29 에 나타냈다. HiTrap protein A 칼럼으로부터 용출된 단백질 획분에 분자량 약 55 kDa 의 단백질 (인간 Siglec-15-Fc) 이 효율적으로 정제 농축되었음이 나타났다.
b-ⅲ) 정제된 인간 Siglec-15-Fc 의 단백질 농도 측정
정제 인간 Siglec-15-Fc (PD-10 탈염 칼럼으로부터 용출된 단백질 획분) 에 대해, 소 혈청 알부민을 표준 샘플로서 사용하여 DC-Protein Assay kit (BioRad 사 제조) 로 단백질 농도를 측정하였다. 표 8 에 나타낸 바와 같이, 2 회의 정제 조작으로 합계 25.2 ㎎ 의 정제 인간 Siglec-15-Fc 를 얻었다.
Figure 112010014520647-pct00047
실시예 33. 토끼 항인간 Siglec-15 폴리클로널 항체의 제조 (토끼에 대한 면역)
a) 항원의 조제
실시예 32, b) 에서 제조한, 인간 Siglec-15-Fc 단백질을 100 ㎍/0.5 ㎖ 가 되도록 조제하고, 아쥬반트를 동량 첨가하고 유리 시린지로 에멀션을 제조하였다. 또한 아쥬반트는, 첫 회 면역시에만 Freund's Complete Adjuvant (FCA, 디프코사 제조) 를 사용하고, 2 회째 이후에는 Freund's Incomplete Adjuvant (FICA, 디프코사 제조) 를 사용하였다.
b) 토끼에 대한 면역
토끼 (일본 백색종 암컷 체중 3 ㎏) 3 마리를 면역 동물로서 사용하였다. 또한, 면역 전에 채혈을 실시하여, 면역 전 혈청 10 ㎖/마리를 얻었다. a) 에서 얻어진 에멀션을, 항원량이 50 ㎍/마리가 되도록 피하 및 피내에 27 G 주사 바늘을 사용하여 주사하였다. 이후 14 일마다 합계 8 회의 면역을 실시하였다. 8 회째의 면역으로부터 7 일 후에 전체 채혈을 실시하여, 1 마리당 74.4 ∼ 74.9 ㎖ 의 항혈청을 얻었다. 면역 전 혈청 중 및 항혈청 중의 항체력가를 항원을 고상화시킨 ELISA 법에 의해 확인한 결과, 3 마리의 토끼 어느 것에 있어서도 항혈청 중의 항체가의 상승이 관찰되었다. 항혈청은 사용할 때까지 -20 ℃ 에서 보존하였다.
실시예 34. 토끼 항인간 Siglec-15 폴리클로널 항체의 정제
a) HiTrap protein A 칼럼 크로마토
실시예 33, b) 에서 조제한 토끼 항혈청 3 로트의 각각 40 ㎖ 에 둘베코 PBS (D-PBS, 인비트로젠사 제조) 40 ㎖ 를 첨가하여 혼합하고, Sterivex GV 필터 (밀리포어사 제조) 로 여과한 후, 미리 D-PBS 로 평형화시켜 둔 HiTrap protein A 5 ㎖ x 2 칼럼 (2 개의 칼럼을 직렬로 연결, 아머샴 바이오사이언스사 제조) 에 유속 2 ㎖/min 으로 넣었다. D-PBS 35 ㎖ 를 사용하여 유속 1 ㎖/min 으로 칼럼을 세정한 후, 0.1 M 시트르산나트륨 완충액 (pH 3.0) 50 ㎖ 를 사용하여 유속 1 ㎖/min 으로 칼럼에 흡착되어 있는 단백질을 용출시켰다. 용출된 액은, Mini-sorp tube (눙크사 제조) 에 2.5 ㎖/Fr. 로 분취한 후, 1 M Tris 0.6 ㎖ 를 바로 첨가하여 중화시켰다. 용출된 단백질을 함유하는 획분 약 15.5 ㎖ (Fr.3 ∼ 7) 를 원심 막 농축기 Amicon Ultra-15 (밀리포어사 제조) 에 의해 5 ㎖ 로 농축시킨 후, 그 중 2.5 ㎖ 를 0.01 ％ Tween 20 을 함유하는 오오츠카 주사용 생리 식염수 (TO-SS) 로 평형화시켜 둔 PD-10 탈염 칼럼 (아머샴 바이오사이언스사 제조) 에 넣고 TO-SS 로 용출시켜, 용매를 TO-SS 로 치환시킨 샘플 3.5 ㎖ 를 얻었다. 이 조작을 2 회 반복 실시하였다. 조제된 샘플은 사용할 때까지 -80 ℃ 에서 동결 보존하였다.
b) 면역 전 토끼 IgG 의 정제
실시예 33 에 있어서의 인간 Siglec-15-Fc 의 면역 개시 전에, 사용 예정의 토끼 3 마리로부터 미리 채혈하여 면역 전의 혈청을 조제해 두었다. 이 혈청 각 5 ㎖ 를 혼합한 후에 D-PBS 15 ㎖ 를 첨가하고, Millex GV 필터 (밀리포어사 제조) 로 여과하였다. 이 혈청 샘플을, 미리 D-PBS 로 평형화시켜 둔 HiTrap protein A 5 ㎖ x 2 칼럼 (아머샴 바이오사이언스사 제조) 에 유속 1 ㎖/min 으로 넣었다. D-PBS 35 ㎖ 를 사용하여 유속 1 ㎖/min 으로 칼럼을 세정한 후, 0.1 M 시트르산나트륨 완충액 (pH 3.0) 50 ㎖ 를 사용하여 유속 1 ㎖/min 으로 칼럼에 흡착되어 있는 단백질을 용출시켰다. 용출된 액은, Mini-sorp tube (눙크사 제조) 에 2.5 ㎖/Fr. 로 분취한 후, 1 M Tris 0.6 ㎖ 를 바로 첨가하여 중화시켰다. 용출된 단백질을 함유하는 획분 (Fr.4 ∼ 6) 을 원심 막 농축기 Amicon Ultra-15 (밀리포어사 제조) 에 의해 2.5 ㎖ 로 농축시킨 후, 0.01 ％ Tween 20 을 함유하는 오오츠카 주사용 생리 식염수 (TO-SS) 로 평형화시켜 둔 PD-10 탈염 칼럼 (아머샴 바이오사이언스사 제조) 에 넣고 TO-SS 로 용출시켜, 용매를 TO-SS 로 치환시킨 샘플 3.5 ㎖ 를 얻었다. 정제된 이 면역 전 토끼 IgG 샘플에 대해, 실시예 8 에 기재된 방법으로 폴리아크릴아미드 전기 영동과 은 염색을 실시하여 IgG 단백질이 충분히 정제되어 있음을 확인한 후, 단백질 농도를 측정하였다. 정제된 이 면역 전 토끼 IgG 샘플은 사용할 때까지 -80 ℃ 에서 동결 보존하였다.
c) 인간 Siglec-15-Fc 를 고상화시킨 어피니티 칼럼의 조제
실시예 32, b) 에서 제조한 N-PBS 로 용매 치환된 정제 인간 Siglec-15-Fc 3 ㎖ (합계 7.8 ㎎ 단백질) 를 원심 막 농축기 Amicon Ultra 4 (밀리포어사 제조) 를 사용하여 2 ㎖ 로 농축시켰다. 농축액에 coupling buffer (0.2 M NaHCO3, 0.5 M NaCl, pH 8.3) 를 첨가하여 2.5 ㎖ 로 한 후, 그 용매를 PD-10 탈염 칼럼에 의해 3.5 ㎖ 의 coupling buffer 로 치환시켰다. NHS-activated HiTrap 칼럼 (1 ㎖, 아머샴 바이오사이언스사 제조) 내의 이소프로판올을 1 mM 염산으로 치환시킨 후, 조제된 인간 Siglec-15-Fc 3 ㎖ 를 시린지로 칼럼에 주입하고, 칼럼의 출구에 접속된 다른 1 개의 시린지를 사용하여 액을 교대로 주입함으로써 커플링 반응을 실시하였다. 실온에서 30 분간 반응시킨 후, 과잉인 활성기를 비활성화시키기 위해, 아머샴 바이오사이언스사의 프로토콜에 따라, 블로킹 버퍼 (0.5 M NaCl 을 함유하는 에탄올아민 완충액, pH 8.3), 세정 버퍼 (0.5 M NaCl 을 함유하는 아세트산나트륨 완충액, pH 4.0), 블로킹 버퍼의 각 6 ㎖ 를 차례대로 주입한 후, 실온에서 30 분간 방치시켰다. 그 후, 세정 버퍼, 블로킹 버퍼, 세정 버퍼의 각 6 ㎖ 를 다시 차례대로 칼럼에 주입하고, 마지막으로 칼럼 내의 완충액을 0.15 M NaCl 을 함유하는 10 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.2) 으로 치환시켰다. 이 칼럼은 사용시까지 4 ℃ 에서 보관하였다.
d) 토끼 항인간 Siglec-15 폴리클로널 항체의 어피니티 칼럼에 의한 정제
d-ⅰ) 어피니티 칼럼 크로마토
a) 에서 조제한 정제 항인간 Siglec-15 폴리클로널 항체 (No.1, 2, 3) 각 7 ㎖ 를, Millex GV 필터 (밀리포어사 제조) 로 여과한 후, c) 에서 제조하여, 미리 Apply Buffer 로 평형화시켜 둔 인간 Siglec-15-Fc 고상화 칼럼에 유속 0.25 ㎖/min 으로 넣었다. Apply Buffer 5 ㎖ 를 사용하여 유속 0.25 ㎖/min 으로 칼럼을 세정한 후, 0.5 M NaCl 을 함유하는 0.1 M 글리신염산 완충액 (pH 2.7) 5 ㎖ 를 사용하여 유속 0.25 ㎖/min 으로 칼럼에 흡착되어 있는 단백질을 용출시켰다. 항인간 Siglec-15 폴리클로널 항체 (No.1, 2, 3) 를 어피니티 칼럼으로 정제한 크로마토그램을 도 30 에 나타냈다. 용출된 액은, Mini-sorp tube (눙크사 제조) 에 0.5 ㎖/Fr. 로 분취한 후, 1 M Tris 16 ㎕ 를 바로 첨가하여 중화시켰다. 글리신염산 완충액으로 용출된 IgG 단백질 획분 약 2.5 ㎖ (Fr.3 ∼ 7) 의 각각을, 0.01 ％ Tween 20 을 함유하는 인산염 완충 생리 식염수 (T-PBS) 로 평형화시켜 둔 PD-10 탈염 칼럼 (아머샴 바이오사이언스사 제조) 에 넣고 T-PBS 로 용출시켜, 용매를 T-PBS 로 치환시킨 샘플 3.5 ㎖ 를 얻었다. 조제된 샘플은 사용할 때까지 -80 ℃ 에서 동결 보존하였다.
d-ⅱ) 어피니티 정제된 토끼 항인간 Siglec-15 폴리클로널 항체의 단백질 농도 측정
정제된 토끼 항인간 Siglec-15 폴리클로널 항체 샘플 (PD-10 탈염 칼럼으로부터 용출된 단백질 획분) 에 대해, 소 IgG 를 표준 샘플로서 사용하여 DC-Protein Assay kit (BioRad 사 제조) 로 단백질 농도를 측정하였다. 표 9 에 나타낸 바와 같이, No.1 ∼ 3 의 로트마다 약 9.1 ∼ 11.9 ㎎ 의 어피니티 정제된 항인간 Siglec-15 폴리클로널 항체를 조제할 수 있었다.
Figure 112010014520647-pct00048
실시예 35. 토끼 항인간 Siglec-15 폴리클로널 항체 첨가에 의한 정상 인간 파골 전구 세포의 세포 융합에 대한 영향 (TRAP 염색)
정상 인간 파골 전구 세포 (Normal Human Natural Osteoclast Precursor Cells, 산코 쥰야쿠로부터 구입, 카탈로그 번호 2T-110) 를, 세포에 첨부된 프로토콜에 따라 96 웰 플레이트에 1 × 104 세포/웰이 되도록 파종하였다. 또한 배지는 소 태아 혈청 (최종 농도 10 ％), 인간 RANKL (최종 농도 69 ng/㎖) 및 인간 M-CSF (최종 농도 33 ng/㎖) 등을 함유하는 OPGM 첨가 인자 세트 (산코 쥰야쿠로부터 구입, 카탈로그 번호 PT-9501) 를 첨가한 파골 전구 세포용 기초 배지 (OPBM, 산코 쥰야쿠로부터 구입, 카탈로그 번호 PT-8201) 를 사용하였다. 이 배양 상청 중에, 실시예 34, d) 에 있어서 제조한 어피니티 정제·항인간 Siglec-15 No.2 항체를 최종 농도 3, 30 ㎍/㎖ 가 되도록, 또한 실시예 34, b) 에 있어서 제조한 면역 전 토끼 IgG 를 최종 농도 30 ㎍/㎖ 가 되도록 첨가하고, CO2 인큐베이터 중에서 5 일간 배양하였다. 배양 후 상청을 제거하고, 10 ％ 중성 포르말린을 첨가하여 세포를 고정시켰다. 세포 고정 후, 증류수로 2 회 세정하고, TRAP 염색액 (0.27 mM 나프톨 AS-MX 인산 (시그마사 제조), 1.6 mM Fast red violet LB salt (시그마사 제조), 1 ％ 디메틸포름아미드, 50 mM 타르타르산나트륨, 0.1 M 아세트산나트륨 완충액 (pH 5.0)) 을 100 ㎕/웰 첨가하고, 실온에서 5 분 반응시켰다. 증류수로 2 회 세정하고, 현미경하에서 세포를 관찰하였다 (도 31). 그 결과, 고도로 세포 융합된 거대 파골 세포의 형성이 항인간 Siglec-15 폴리클로널 항체 첨가에 의해 현저하게 억제되었다. 한편, 면역 전 IgG 를 첨가한 경우에서는, 이와 같은 파골 세포 융합 억제는 관찰되지 않았다. 이들의 고정, 염색된 웰에 대해, 핵수가 5 개 이상인 TRAP 양성 다핵 세포수를 도립 현미경하에서 계수하였다 (도 32). 그 결과, 어피니티 정제·항인간 Siglec-15 No.2 항체를 최종 농도 30 ㎍/㎖ 첨가한 웰에 있어서, 다핵 파골 세포 형성의 현저한 억제가 관찰되었다. 면역 전 IgG 를 30 ㎍/㎖ 첨가한 경우에도 다핵 파골 세포 형성의 억제 경향이 보였지만, 이들 웰과 비교한 경우에도, 항인간 Siglec-15 No.2 항체의 첨가에 의해 다핵 파골 세포의 형성이 현저하게 억제됨이 나타났다. 이와 같이, 정상 인간 파골 전구 세포로부터의 TRAP 양성 파골 세포의 다핵화·세포 융합이, Siglec-15 와 특이적으로 결합되는 항체에 의해 억제됨이 밝혀졌다.
실시예 36. 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로널 항체의 인간 Siglec-15 단백질에 대한 결합성 평가
래트 항마우스 Siglec-15 모노클로널 항체의 인간 Siglec-15 단백질에 대한 결합성을 ELISA 법에 의해 평가하였다. 실시예 32, b) 에서 제조한 인간 Siglec-15-Fc 단백질을 5 ㎍/㎖ 가 되도록 0.1 M 탄산나트륨 버퍼 (pH 9.5) 로 희석시키고, 96 웰 플레이트 (나르제눙크사 제조, 카탈로그 번호 : 430341) 에 100 ㎕/웰 첨가하였다. 실온에서 1 시간 방치시킨 후에 용액을 제거하고, 300 ㎕/웰의 세정 버퍼 (0.05 ％ Tween 20 함유 인산염 완충 생리 식염수) 를 첨가, 제거하였다. 이 세정 작업을 추가로 1 회 실시한 후, 25 ％ 블록 에이스 (다이닛폰 스미토모 제약사 제조) 를 함유하는 인산염 완충 생리 식염수를 200 ㎕/웰 첨가하고, 실온에서 1 시간 방치시킴으로써 블로킹을 실시하였다. 액을 제거하고 300 ㎕/웰의 세정 버퍼로 2 회 세정한 후, 실시예 24 에서 조제한 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로널 항체 또는 래트 컨트롤 IgG (R ＆ D 시스템즈사 제조) 를, ELISA 버퍼 (12.5 ％ 블록 에이스, 0.05 ％ Tween 20 을 함유하는 인산염 완충 생리 식염수) 를 사용하여 최종 농도가 1.28 ∼ 20,000 ng/㎖ (5 배 희석 계열) 가 되도록 희석시키고, 100 ㎕/웰 첨가하였다. 실온에서 1 시간 방치시킨 후에 액을 제거하고, 300 ㎕/웰의 세정 버퍼로 3 회 세정하였다. 계속해서 ELISA 버퍼를 사용하여 1,000 배 희석시킨 HRP (서양 고추냉이 페록시다아제) 표지 염소 항래트 IgG 항체 (베크맨코르타사 제조) 를 100 ㎕/웰 첨가하고, 실온에서 1 시간 방치시켰다. 액을 제거하고, 300 ㎕/웰의 세정 버퍼로 3 회 세정한 후, 페록시다아제용 발색 키트 (스미토모 베이클라이트사 제조) 를 사용하여, 키트에 첨부된 설명서에 따라 발색시켰다. 발색 후, 마이크로 플레이트 리더 (니혼 몰레큘러 디바이스사 제조) 를 사용하여 492 ㎚ 에서의 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 검토한 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로널 항체 10 검체 전부에 있어서, 항체의 농도에 의존한 인간 Siglec-15 단백질에 대한 결합이 확인되었다 (도 33). 특히 결합 활성이 강했던 것은 #1A1, #3A1, #24A1, #32A1, #61A1 의 5 검체였고, #8A1, #34A1, #39A1 의 3 검체는 비교적 결합 활성이 약했다. 한편 래트 컨트롤 IgG 는 인간 Siglec-15 단백질에 대한 결합이 관찰되지 않았다. 이상의 결과로부터, 실시예 24 에서 조제한 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로널 항체는, 마우스 Siglec-15 뿐만 아니라 인간 Siglec-15 에도 결합됨이 나타났고, 게다가 일부의 항체는 인간 Siglec-15 에 강하게 결합됨이 판명되었다.
실시예 37. 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로널 항체 첨가에 의한 정상 인간 파골 전구 세포의 세포 융합, 및 골흡수 활성에 대한 영향 (in vitro 생물 활성 평가)
실시예 36 에 있어서, 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로널 항체가 인간 Siglec-15 에도 결합되는 것이 확인되었으므로, 이들 항체의 인간 파골 세포 형성 및 골흡수 활성에 대한 효과를 검토하였다.
a) 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로널 항체 첨가에 의한 정상 인간 파골 전구 세포의 파골 세포 융합에 대한 영향 (TRAP 염색)
정상 인간 파골 전구 세포 (Normal Human Natural Osteoclast Precursor Cells, 산코 쥰야쿠로부터 구입, 카탈로그 번호 2T-110) 를, 세포에 첨부된 프로토콜에 따라 96 웰 플레이트에 1 × 104 세포/웰이 되도록 파종하였다. 또한 배지는, 소 태아 혈청 (최종 농도 10 ％), 인간 RANKL (최종 농도 66 ng/㎖) 및 인간 M-CSF (최종 농도 33 ng/㎖) 등을 함유하는 OPGM 첨가 인자 세트 (산코 쥰야쿠로부터 구입, 카탈로그 번호 PT-9501) 를 첨가한 파골 전구 세포용 기초 배지 (OPBM, 산코 쥰야쿠로부터 구입, 카탈로그 번호 PT-8201) 를 사용하였다. 이 배양 상청 중에, 실시예 24 에서 조제한 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로널 항체 및 래트 컨트롤 IgG (R ＆ D 시스템즈사 제조) 를 최종 농도 30 ㎍/㎖ 가 되도록 첨가하고, CO2 인큐베이터 중에서 4 일간 배양하였다. 배양 후 상청을 제거하고, 10 ％ 중성 포르말린을 첨가하여 세포를 고정시켰다. 세포 고정 후, 증류수로 2 회 세정하고, TRAP 염색액 (0.27 mM 나프톨 AS-MX 인산 (시그마사 제조), 1.6 mM Fast red violet LB salt (시그마사 제조), 1 ％ 디메틸포름아미드, 50 mM 타르타르산나트륨, 0.1 M 아세트산나트륨 완충액 (pH 5.0)) 을 100 ㎕/웰 첨가하고, 실온에서 5 분 반응시켰다. 증류수로 2 회 세정하고, 현미경하에서 세포를 관찰하였다 (도 34). 그 결과, #32A1 항체 첨가에 의해, 고도로 세포 융합된 거대 파골 세포의 형성이 거의 완전히 억제되었다. 또한, #41B1 항체에서도, 고도로 세포 융합된 거대 파골 세포의 형성이 현저하게 억제되었다. 한편, 그 이외의 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로널 항체 (#1A1 항체 외) 및 래트 컨트롤 IgG 에서는, 이와 같은 파골 세포 융합의 현저한 억제는 관찰되지 않았다. 이와 같이, 정상 인간 파골 전구 세포로부터의 TRAP 양성 파골 세포의 다핵화·세포 융합이, Siglec-15 단백질과 특이적으로 결합되는 모노클로널 항체에 의해 억제됨이 밝혀졌다.
b) 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로널 항체 (#32A1) 첨가에 의한 정상 인간 파골 전구 세포의 파골 세포 융합에 대한 영향 (TRAP 염색)
정상 인간 파골 전구 세포 (Normal Human Natural Osteoclast Precursor Cells, 산코 쥰야쿠로부터 구입, 카탈로그 번호 2T-110) 를, 세포에 첨부된 프로토콜에 따라 96 웰 플레이트에 1 × 104 세포/웰이 되도록 파종하였다. 또한 배지는, 소 태아 혈청 (최종 농도 10 ％), 인간 RANKL (최종 농도 68.4 ng/㎖) 및 인간 M-CSF (최종 농도 33 ng/㎖) 등을 함유하는 OPGM 첨가 인자 세트 (산코 쥰야쿠로부터 구입, 카탈로그 번호 PT-9501) 를 첨가한 파골 전구 세포용 기초 배지 (OPBM, 산코 쥰야쿠로부터 구입, 카탈로그 번호 PT-8201) 를 사용하였다. 이 배양 상청 중에, 실시예 24 에서 조제한 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로널 항체 (#32A1 항체) 를 최종 농도 0.1, 0.3, 1, 3 ㎍/㎖ 가 되도록 첨가하고, CO2 인큐베이터 중에서 3 일간 배양하였다. 배양 후 상청을 제거하고, 10 ％ 중성 포르말린을 첨가하여 세포를 고정시켰다. 세포 고정 후, 증류수로 2 회 세정하고, TRAP 염색액 (0.27 mM 나프톨 AS-MX 인산 (시그마사 제조), 1.6 mM Fast red violet LB salt (시그마사 제조), 1 ％ 디메틸포름아미드, 50 mM 타르타르산나트륨, 0.1 M 아세트산나트륨 완충액 (pH 5.0)) 을 100 ㎕/웰 첨가하고, 실온에서 5 분 반응시켰다. 증류수로 2 회 세정하고, 현미경하에서 세포를 관찰하였다 (도 35). 그 결과, TRAP 양성 다핵 파골 세포 형성이 #32A1 항체 0.3 ㎍/㎖ 내지 3 ㎍/㎖ 의 범위에서 농도 의존적으로 억제되었다.
c) 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로널 항체 (#32A1) 첨가에 의한 정상 인간 파골 전구 세포의 골흡수 활성에 대한 영향 (콜라겐 코트 플레이트를 사용한 평가)
파골 세포는 카텝신 K 등의 프로테아제를 방출함으로써, 골조직의 구성 성분인 I 형 콜라겐을 분해하는 것이 알려져 있다. OsteoLyse Assay Kit (Lonza 사 제조, 카탈로그 번호 PA-1500) 는, 유로퓸이 결합된 인간 콜라겐을 코팅한 96 웰 플레이트 (96-well OsteoLyse cell culture plate) 를 제공하고 있고, 동일 플레이트 상에서 파골 세포를 배양하였을 때에 상청에 유리 (遊離) 되는 형광 콜라겐 단편량을 측정함으로써, 파골 세포의 골흡수 활성을 in vitro 로 평가할 수 있다.
정상 인간 파골 전구 세포 (Normal Human Natural Osteoclast Precursor Cells, 산코 쥰야쿠로부터 구입, 카탈로그 번호 2T-110) 를, 세포에 첨부된 프로토콜에 따라 96-well OsteoLyse cell culture plate 에 1 × 104 세포/웰이 되도록 파종하였다. 또한 배지는, 소 태아 혈청 (최종 농도 10 ％), 인간 RANKL (최종 농도 68.4 ng/㎖) 및 인간 M-CSF (최종 농도 33 ng/㎖) 등을 함유하는 OPGM 첨가 인자 세트 (산코 쥰야쿠로부터 구입, 카탈로그 번호 PT-9501) 를 첨가한 파골 전구 세포용 기초 배지 (OPBM, 산코 쥰야쿠로부터 구입, 카탈로그 번호 PT-8201) 를 사용하였다. 이 배양 상청 중에, 실시예 24 에서 조제한 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로널 항체 (#32A1 항체) 를 최종 농도 0.1, 0.3, 1, 3 ㎍/㎖ 가 되도록 첨가하고, CO2 인큐베이터 중에서 3 일간 배양하였다. 배양 상청 10 ㎕ 를 채취하고, OsteoLyse Assay Kit 에 부속된 Fluorophore Releasing Reagent 를 200 ㎕ 첨가하고, 형광 플레이트 리더 (ARVO MX, 퍼킨엘머사 제조) 를 사용하여 형광 강도를 측정 (Excitation : 340 ㎚, Emission : 615 ㎚) 함으로써, 배양 상청 중에 방출된 유리 형광 콜라겐 단편량을 정량하였다 (도 36). 그 결과, RANKL 첨가에 의해 증가한 형광 콜라겐 단편량이, #32A1 항체에 의해 0.3 ㎍/㎖ 내지 3 ㎍/㎖ 의 범위에서 농도 의존적으로 억제되었다. 이 점에서, 인간 파골 세포의 골흡수 활성이 Siglec-15 단백질과 특이적으로 결합되는 모노클로널 항체에 의해 억제됨이 밝혀졌다.
실시예 38. 마우스 항인간 Siglec-15 모노클로널 항체의 제조
항인간 Siglec-15 항체의 제조는 이하에 서술하는 공정에 의해 실시할 수 있다.
(1) 면역
실시예 30 내지 32 에 있어서 취득된 가용성 인간 Siglec-15 단백질을 4 ∼ 10 주령의 BALB/c 마우스 암컷 복강 내에 투여한다. 2 주일 후, 동일한 막 획분 용액을 복강 내에 투여하여 추가 면역시킨다.
(2) 세포 융합
추가 면역 3 일 후의 마우스로부터 비장을 적출하고, 이것을 무혈청 배지에 넣고, 메시 상에서 스패출러를 사용하여 부순다. 메시를 통과한 세포 현탁액을 원심시켜 비장 세포를 침전시킨다.
한편, 미엘로마 세포 NS1 (American Type Culture Collection TIB-18) 을 동일하게 무혈청 배지에서 세정하고, 현탁시킨다.
얻어진 Siglec-15 발현 세포와 미엘로마 세포를 사용하여, 통상적인 방법에 따라 세포 융합을 실시한다.
(3) 선별
항인간 Siglec-15 항체를 생성하는 융합 세포는, 세포 ELISA 를 사용하는 방법과 플로우 사이토미터를 사용하는 방법에 의해 선별할 수 있다.
(4) 클로닝
상기 (3) 에서 선별되는 세포군에 대해, (3) 의 세포 ELISA 를 사용하는 방법과 플로우 사이토미터를 사용하는 방법으로 이루어지는 일련의 공정을 5 회 반복함으로써, 인간 Siglec-15 발현 세포와 결합되지만 도입 전의 세포와 결합되지 않는 단일한 항체를 생성하는 하이브리도마를 수 클론 얻을 수 있다.
(5) 항체의 정제
(1) 내지 (4) 의 공정을 거쳐 제조되는 마우스-마우스 하이브리도마를 배양하고, 상청을 회수한다. 얻어진 상청을 회수하여 투석한 후에 고속 액체 크로마토그래피 장치를 사용하여 항체의 조 (粗) 정제를 실시한다. 크로마토그래피의 각 획분 중의 항인간 Siglec-15 항체가를, 인간 Siglec-15 단백질을 사용한 ELISA 법에 의해 검정한다. 항체가가 높은 획분을 모아, 항체 어피니티 정제용 칼럼에 제공한다. 칼럼 내를 칼럼의 평형화 완충액으로 세정한 후, 칼럼의 용출 완충액으로 항체를 용출시킨다. 각각의 용출액은, 용출 종료 후 바로 원심 관형 한외 여과기의 상부에 넣고 원심시킨다. 여과기 하부에 회수된 여과액을 제거한 후, 상부에 PBS 를 첨가하고, 5 회 세정한다. 여과기 상부에 남은 액을 항인간 Siglec-15 항체 시료로 한다.
실시예 39. 래트 항인간 Siglec-15 모노클로널 항체의 제조
실시예 30 내지 32 에 있어서 취득된 가용성 인간 Siglec-15 단백질을 사용하여 실시예 23 및 24 에 기재된 방법에 의해, 래트 항인간 Siglec-15 모노클로널 항체를 제조할 수 있다.
실시예 40. 항인간 Siglec-15 모노클로널 항체가 나타내는, 파골 세포 분화에 대한 영향
실시예 38 또는 39 에서 얻어진 항인간 Siglec-15 모노클로널 항체를 사용하여, 그 항체가 나타내는 파골 세포 형성에 대한 억제 효과를 시험할 수 있다. 마우스 파골 세포 형성에 대한 효과를 시험하기 위해서는 실시예 17, 19, 20, 21, 22 또는 26 의 방법을 사용할 수 있다. 인간 파골 세포 형성에 대한 억제 효과를 시험하기 위해서는 실시예 35 또는 37 의 방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 항 Siglec-15 항체는 파골 세포의 분화 또는 골흡수 활성 억제능을 가져, 그 항 Siglec-15 항체를 함유하는 의약 조성물은 골대사 이상 질환의 치료 또는 예방제가 될 수 있다.
독립행정법인산업기술종합연구소특허생물기탁센터 FERMBP-11000 20080828 독립행정법인산업기술종합연구소특허생물기탁센터 FERMBP-10999 20080828
SEQUENCE LISTING <110> DAIICHI SANKYO COMPANY, LIMITED <120> Antibodies for the osteoclast related protein Siglec-15 <130> DSPCT-FP0841 <150> JP 2007-265420 <151> 2007-10-11 <160> 50 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 987 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(987) <400> 1 atg gaa aag tcc atc tgg ctg ctg gcc tgc ttg gcg tgg gtt ctc ccg 48 Met Glu Lys Ser Ile Trp Leu Leu Ala Cys Leu Ala Trp Val Leu Pro 1 5 10 15 aca ggc tca ttt gtg aga act aaa ata gat act acg gag aac ttg ctc 96 Thr Gly Ser Phe Val Arg Thr Lys Ile Asp Thr Thr Glu Asn Leu Leu 20 25 30 aac aca gag gtg cac agc tcg cca gcg cag cgc tgg tcc atg cag gtg 144 Asn Thr Glu Val His Ser Ser Pro Ala Gln Arg Trp Ser Met Gln Val 35 40 45 cca ccc gag gtg agc gcg gag gca ggc gac gcg gca gtg ctg ccc tgc 192 Pro Pro Glu Val Ser Ala Glu Ala Gly Asp Ala Ala Val Leu Pro Cys 50 55 60 acc ttc acg cac ccg cac cgc cac tac gac ggg ccg ctg acg gcc atc 240 Thr Phe Thr His Pro His Arg His Tyr Asp Gly Pro Leu Thr Ala Ile 65 70 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tca ttt gtg aga act aaa ata gat act acg gag aac ttg ctc 96 Thr Gly Ser Phe Val Arg Thr Lys Ile Asp Thr Thr Glu Asn Leu Leu 20 25 30 aac aca gag gtg cac agc tcg cca gcg cag cgc tgg tcc atg cag gtg 144 Asn Thr Glu Val His Ser Ser Pro Ala Gln Arg Trp Ser Met Gln Val 35 40 45 cca ccc gag gtg agc gcg gag gca ggc gac gcg gca gtg ctg ccc tgc 192 Pro Pro Glu Val Ser Ala Glu Ala Gly Asp Ala Ala Val Leu Pro Cys 50 55 60 acc ttc acg cac ccg cac cgc cac tac gac ggg ccg ctg acg gcc atc 240 Thr Phe Thr His Pro His Arg His Tyr Asp Gly Pro Leu Thr Ala Ile 65 70 75 80 tgg cgc gcg ggc gag ccc tat gcg ggc ccg cag gtg ttc cgc tgc gct 288 Trp Arg Ala Gly Glu Pro Tyr Ala Gly Pro Gln Val Phe Arg Cys Ala 85 90 95 gcg gcg cgg ggc agc gag ctc tgc cag acg gcg ctg agc ctg cac ggc 336 Ala Ala Arg Gly Ser Glu Leu Cys Gln Thr Ala Leu Ser Leu His Gly 100 105 110 cgc ttc cgg ctg ctg ggc aac ccg cgc cgc aac gac ctc tcg ctg cgc 384 Arg Phe Arg Leu Leu Gly Asn Pro Arg Arg Asn Asp Leu Ser Leu Arg 115 120 125 gtc gag cgc ctc gcc ctg gct gac gac cgc cgc tac ttc tgc cgc gtc 432 Val Glu Arg Leu Ala Leu Ala Asp Asp Arg Arg Tyr Phe Cys Arg Val 130 135 140 gag ttc gcc ggc gac gtc cat gac cgc tac gag agc cgc cac ggc gtc 480 Glu Phe Ala Gly Asp Val His Asp Arg Tyr Glu Ser Arg His Gly Val 145 150 155 160 cgg ctg cac gtg aca gcc gcg ccg cgg atc gtc aac atc tcg gtg ctg 528 Arg Leu His Val Thr Ala Ala Pro Arg Ile Val Asn Ile Ser Val Leu 165 170 175 ccc agt ccg gct cac gcc ttc cgc gcg ctc tgc act gcc gaa ggg gag 576 Pro Ser Pro Ala His Ala Phe Arg Ala Leu Cys Thr Ala Glu Gly Glu 180 185 190 ccg ccg ccc gcc ctc gcc tgg tcc ggc ccg gcc ctg ggc aac agc ttg 624 Pro Pro Pro Ala Leu Ala Trp Ser Gly Pro Ala Leu Gly Asn Ser Leu 195 200 205 gca gcc gtg cgg agc ccg cgt gag ggt cac ggc cac cta gtg acc gcc 672 Ala Ala Val Arg Ser Pro Arg Glu Gly His Gly His Leu Val Thr Ala 210 215 220 gaa ctg ccc gca ctg acc cat gac ggc cgc tac acg tgt acg gcc gcc 720 Glu Leu Pro Ala Leu Thr His Asp Gly Arg Tyr Thr Cys Thr Ala Ala 225 230 235 240 aac agc ctg ggc cgc tcc gag gcc agc gtc tac ctg ttc cgc ttc cat 768 Asn Ser Leu Gly Arg Ser Glu Ala Ser Val Tyr Leu Phe Arg Phe His 245 250 255 ggc gcc agc ggg gac cca gct ttc ttg tac aaa gtg gtt gat atc gaa 816 Gly Ala Ser Gly Asp Pro Ala Phe Leu Tyr Lys Val Val Asp Ile Glu 260 265 270 ggt cgt ggg ggt aag cct atc cct aac cct ctc ctc ggt ctc gat tct 864 Gly Arg Gly Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser 275 280 285 acg cgt acc ggt cat cat cac cat cac cat tga 897 Thr Arg Thr Gly His His His His His His 290 295 <210> 48 <211> 298 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> His-tagged human Siglec-15 peptide <400> 48 Met Glu Lys Ser Ile Trp Leu Leu Ala Cys Leu Ala Trp Val Leu Pro 1 5 10 15 Thr Gly Ser Phe Val Arg Thr Lys Ile Asp Thr Thr Glu Asn Leu Leu 20 25 30 Asn Thr Glu Val His Ser Ser Pro Ala Gln Arg Trp Ser Met Gln Val 35 40 45 Pro Pro Glu Val Ser Ala Glu Ala Gly Asp Ala Ala Val Leu Pro Cys 50 55 60 Thr Phe Thr His Pro His Arg His Tyr Asp Gly Pro Leu Thr Ala Ile 65 70 75 80 Trp Arg Ala Gly Glu Pro Tyr Ala Gly Pro Gln Val Phe Arg Cys Ala 85 90 95 Ala Ala Arg Gly Ser Glu Leu Cys Gln Thr Ala Leu Ser Leu His Gly 100 105 110 Arg Phe Arg Leu Leu Gly Asn Pro Arg Arg Asn Asp Leu Ser Leu Arg 115 120 125 Val Glu Arg Leu Ala Leu Ala Asp Asp Arg Arg Tyr Phe Cys Arg Val 130 135 140 Glu Phe Ala Gly Asp Val His Asp Arg Tyr Glu Ser Arg His Gly Val 145 150 155 160 Arg Leu His Val Thr Ala Ala Pro Arg Ile Val Asn Ile Ser Val Leu 165 170 175 Pro Ser Pro Ala His Ala Phe Arg Ala Leu Cys Thr Ala Glu Gly Glu 180 185 190 Pro Pro Pro Ala Leu Ala Trp Ser Gly Pro Ala Leu Gly Asn Ser Leu 195 200 205 Ala Ala Val Arg Ser Pro Arg Glu Gly His Gly His Leu Val Thr Ala 210 215 220 Glu Leu Pro Ala Leu Thr His Asp Gly Arg Tyr Thr Cys Thr Ala Ala 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Arg Ser Glu Ala Ser Val Tyr Leu Phe Arg Phe His 245 250 255 Gly Ala Ser Gly Asp Pro Ala Phe Leu Tyr Lys Val Val Asp Ile Glu 260 265 270 Gly Arg Gly Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser 275 280 285 Thr Arg Thr Gly His His His His His His 290 295 <210> 49 <211> 1518 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-fused human Siglec-15 cDNA <220> <221> CDS <222> (1)..(1518) <400> 49 atg gaa aag tcc atc tgg ctg ctg gcc tgc ttg gcg tgg gtt ctc ccg 48 Met Glu Lys Ser Ile Trp Leu Leu Ala Cys Leu Ala Trp Val Leu Pro 1 5 10 15 aca ggc tca ttt gtg aga act aaa ata gat act acg gag aac ttg ctc 96 Thr Gly Ser Phe Val Arg Thr Lys Ile Asp Thr Thr Glu Asn Leu Leu 20 25 30 aac aca gag gtg cac agc tcg cca gcg cag cgc tgg tcc atg cag gtg 144 Asn Thr Glu Val His Ser Ser Pro Ala Gln Arg Trp Ser Met Gln Val 35 40 45 cca ccc gag gtg agc gcg gag gca ggc gac gcg gca gtg ctg ccc tgc 192 Pro Pro Glu Val Ser Ala Glu Ala Gly Asp Ala Ala Val Leu Pro Cys 50 55 60 acc ttc acg cac ccg cac cgc cac tac gac ggg ccg ctg acg gcc atc 240 Thr Phe Thr His Pro His Arg His Tyr Asp Gly Pro Leu Thr Ala Ile 65 70 75 80 tgg cgc gcg ggc gag ccc tat gcg ggc ccg cag gtg ttc cgc tgc gct 288 Trp Arg Ala Gly Glu Pro Tyr Ala Gly Pro Gln Val Phe Arg Cys Ala 85 90 95 gcg gcg cgg ggc agc gag ctc tgc cag acg gcg ctg agc ctg cac ggc 336 Ala Ala Arg Gly Ser Glu Leu Cys Gln Thr Ala Leu Ser Leu His Gly 100 105 110 cgc ttc cgg ctg ctg ggc aac ccg cgc cgc aac gac ctc tcg ctg cgc 384 Arg Phe Arg Leu Leu Gly Asn Pro Arg Arg Asn Asp Leu Ser Leu Arg 115 120 125 gtc gag cgc ctc gcc ctg gct gac gac cgc cgc tac ttc tgc cgc gtc 432 Val Glu Arg Leu Ala Leu Ala Asp Asp Arg Arg Tyr Phe Cys Arg Val 130 135 140 gag ttc gcc ggc gac gtc cat gac cgc tac gag agc cgc cac ggc gtc 480 Glu Phe Ala Gly Asp Val His Asp Arg Tyr Glu Ser Arg His Gly Val 145 150 155 160 cgg ctg cac gtg aca gcc gcg ccg cgg atc gtc aac atc tcg gtg ctg 528 Arg Leu His Val Thr Ala Ala Pro Arg Ile Val Asn Ile Ser Val Leu 165 170 175 ccc agt ccg gct cac gcc ttc cgc gcg ctc tgc act gcc gaa ggg gag 576 Pro Ser Pro Ala His Ala Phe Arg Ala Leu Cys Thr Ala Glu Gly Glu 180 185 190 ccg ccg ccc gcc ctc gcc tgg tcc ggc ccg gcc ctg ggc aac agc ttg 624 Pro Pro Pro Ala Leu Ala Trp Ser Gly Pro Ala Leu Gly Asn Ser Leu 195 200 205 gca gcc gtg cgg agc ccg cgt gag ggt cac ggc cac cta gtg acc gcc 672 Ala Ala Val Arg Ser Pro Arg Glu Gly His Gly His Leu Val Thr Ala 210 215 220 gaa ctg ccc gca ctg acc cat gac ggc cgc tac acg tgt acg gcc gcc 720 Glu Leu Pro Ala Leu Thr His Asp Gly Arg Tyr Thr Cys Thr Ala Ala 225 230 235 240 aac agc ctg ggc cgc tcc gag gcc agc gtc tac ctg ttc cgc ttc cat 768 Asn Ser Leu Gly Arg Ser Glu Ala Ser Val Tyr Leu Phe Arg Phe His 245 250 255 ggc gcc agc ggg gac cca gct ttc ttg tac aaa gtg gtt gat atc cag 816 Gly Ala Ser Gly Asp Pro Ala Phe Leu Tyr Lys Val Val Asp Ile Gln 260 265 270 gca gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca 864 Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 275 280 285 gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa 912 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 290 295 300 ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg 960 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 305 310 315 320 gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac 1008 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 325 330 335 gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag 1056 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 340 345 350 cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac 1104 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 355 360 365 cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa 1152 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 370 375 380 gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag 1200 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 385 390 395 400 ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg 1248 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 405 410 415 acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc 1296 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 420 425 430 agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac 1344 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 435 440 445 tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc 1392 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 450 455 460 tat agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc 1440 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 465 470 475 480 ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag 1488 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 485 490 495 aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa taa 1518 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 500 505 <210> 50 <211> 505 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-fused human Siglec-15 peptide <400> 50 Met Glu Lys Ser Ile Trp Leu Leu Ala Cys Leu Ala Trp Val Leu Pro 1 5 10 15 Thr Gly Ser Phe Val Arg Thr Lys Ile Asp Thr Thr Glu Asn Leu Leu 20 25 30 Asn Thr Glu Val His Ser Ser Pro Ala Gln Arg Trp Ser Met Gln Val 35 40 45 Pro Pro Glu Val Ser Ala Glu Ala Gly Asp Ala Ala Val Leu Pro Cys 50 55 60 Thr Phe Thr His Pro His Arg His Tyr Asp Gly Pro Leu Thr Ala Ile 65 70 75 80 Trp Arg Ala Gly Glu Pro Tyr Ala Gly Pro Gln Val Phe Arg Cys Ala 85 90 95 Ala Ala Arg Gly Ser Glu Leu Cys Gln Thr Ala Leu Ser Leu His Gly 100 105 110 Arg Phe Arg Leu Leu Gly Asn Pro Arg Arg Asn Asp Leu Ser Leu Arg 115 120 125 Val Glu Arg Leu Ala Leu Ala Asp Asp Arg Arg Tyr Phe Cys Arg Val 130 135 140 Glu Phe Ala Gly Asp Val His Asp Arg Tyr Glu Ser Arg His Gly Val 145 150 155 160 Arg Leu His Val Thr Ala Ala Pro Arg Ile Val Asn Ile Ser Val Leu 165 170 175 Pro Ser Pro Ala His Ala Phe Arg Ala Leu Cys Thr Ala Glu Gly Glu 180 185 190 Pro Pro Pro Ala Leu Ala Trp Ser Gly Pro Ala Leu Gly Asn Ser Leu 195 200 205 Ala Ala Val Arg Ser Pro Arg Glu Gly His Gly His Leu Val Thr Ala 210 215 220 Glu Leu Pro Ala Leu Thr His Asp Gly Arg Tyr Thr Cys Thr Ala Ala 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Arg Ser Glu Ala Ser Val Tyr Leu Phe Arg Phe His 245 250 255 Gly Ala Ser Gly Asp Pro Ala Phe Leu Tyr Lys Val Val Asp Ile Gln 260 265 270 Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 275 280 285 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 290 295 300 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 305 310 315 320 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 325 330 335 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 340 345 350 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 355 360 365 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 370 375 380 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 385 390 395 400 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 405 410 415 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 420 425 430 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 435 440 445 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 450 455 460 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 465 470 475 480 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 485 490 495 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 500 505

Claims (38)

  1. 이하의 (a) 내지 (h) 중 어느 하나에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 1 개 또는 2 개 이상의 폴리펩티드를 특이적으로 인식하여, 파골 세포의 형성 및/또는 파골 세포에 의한 골흡수를 억제하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편을 포함하는, 골다공증, 관절 류머티즘에 수반되는 골파괴, 암성 고칼슘혈증, 다발성 골수종이나 암의 골전이에 수반되는 골파괴, 거세포종, 치근막염에 의한 치아의 상실, 인공 관절 주위의 골융해, 만성 골수염에 있어서의 골파괴, 골페이젯병, 신성 (腎性) 골이영양증, 및 골형성 부전증으로 이루어지는 군에서 선택되는 골대사 이상의 치료 및/또는 예방용 의약조성물 :
    (a) 배열표의 배열 번호 2 에 나타내어지는 아미노산 배열 ;
    (b) 배열표의 배열 번호 2 에 나타내어지는 아미노산 배열의 21 번째 내지 328 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;
    (c) 배열표의 배열 번호 2 에 나타내어지는 아미노산 배열의 1 번째 내지 260 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;
    (d) 배열표의 배열 번호 2 에 나타내어지는 아미노산 배열의 21 번째 내지 260 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;
    (e) 배열표의 배열 번호 4 에 나타내어지는 아미노산 배열 ;
    (f) 배열표의 배열 번호 4 에 나타내어지는 아미노산 배열의 21 번째 내지 341 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;
    (g) 배열표의 배열 번호 4 에 나타내어지는 아미노산 배열의 1 번째 내지 258 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ; 및
    (h) 배열표의 배열 번호 4 에 나타내어지는 아미노산 배열의 21 번째 내지 258 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열.
  2. 이하의 (j) 내지 (m) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 배열로 코드되는 아미노산 배열로 이루어지는 1 개 또는 2 개 이상의 폴리펩티드를 특이적으로 인식하여, 파골 세포의 형성 및/또는 파골 세포에 의한 골흡수를 억제하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편을 포함하는, 골다공증, 관절 류머티즘에 수반되는 골파괴, 암성 고칼슘혈증, 다발성 골수종이나 암의 골전이에 수반되는 골파괴, 거세포종, 치근막염에 의한 치아의 상실, 인공 관절 주위의 골융해, 만성 골수염에 있어서의 골파괴, 골페이젯병, 신성 (腎性) 골이영양증, 및 골형성 부전증으로 이루어지는 군에서 선택되는 골대사 이상의 치료 및/또는 예방용 의약조성물 :
    (j) 배열 번호 1 에 나타내어지는 뉴클레오티드 배열 ;
    (k) 배열 번호 3 에 나타내어지는 뉴클레오티드 배열 ;
    (l) 배열 번호 19 에 나타내어지는 뉴클레오티드 배열 ; 및
    (m) 배열 번호 43 에 나타내어지는 뉴클레오티드 배열.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    항체 또는 그 항체의 기능성 단편이 파골 세포의 세포 융합 과정을 억제하는 것을 특징으로 하는 의약조성물.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    항체 또는 그 항체의 기능성 단편이 TNF
    Figure 112015018405053-pct00049
    에 의해 유도되는 파골 세포의 형성을 억제하는 것을 특징으로 하는 의약조성물.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    항체 또는 그 항체의 기능성 단편이 30 ㎍/㎖ 이하의 농도에 있어서, in vitro 에서의 파골 세포의 형성을 억제하는 것을 특징으로 하는 의약조성물.
  6. 제 5 항에 있어서,
    항체 또는 그 항체의 기능성 단편이 3 ㎍/㎖ 이하의 농도에 있어서, in vitro 에서의 파골 세포의 형성을 억제하는 것을 특징으로 하는 의약조성물.
  7. 제 6 항에 있어서,
    항체 또는 그 항체의 기능성 단편이 1 ㎍/㎖ 이하의 농도에 있어서, in vitro 에서의 파골 세포의 형성을 억제하는 것을 특징으로 하는 의약조성물.
  8. 제 7 항에 있어서,
    항체 또는 그 항체의 기능성 단편이 63 ng/㎖ 내지 1 ㎍/㎖ 의 농도에 있어서, in vitro 에서의 파골 세포의 형성을 억제하는 것을 특징으로 하는 의약조성물.
  9. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    항체 또는 그 항체의 기능성 단편이 파골 세포에 의한 골흡수를 억제하는 것을 특징으로 하는 의약조성물.
  10. 제 9 항에 있어서,
    항체 또는 그 항체의 기능성 단편이 3 ㎍/㎖ 이하의 농도에 있어서, in vitro 에서의 파골 세포에 의한 골흡수를 억제하는 것을 특징으로 하는 의약조성물.
  11. 제 10 항에 있어서,
    항체 또는 그 항체의 기능성 단편이 0.3 ㎍/㎖ 내지 3 ㎍/㎖ 의 농도에 있어서, in vitro 에서의 파골 세포에 의한 골흡수를 억제하는 것을 특징으로 하는 의약조성물.
  12. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    항체 또는 그 항체의 기능성 단편이 이하의 공정 1) 및 2) 를 포함하는 방법에 의해 얻어지는 것을 특징으로 하는 의약조성물 :
    1) 이하의 (a) 내지 (h) 중 어느 하나에 기재된 아미노산 배열 :
    (a) 배열표의 배열 번호 2 에 나타내어지는 아미노산 배열 ;
    (b) 배열표의 배열 번호 2 에 나타내어지는 아미노산 배열의 21 번째 내지 328 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;
    (c) 배열표의 배열 번호 2 에 나타내어지는 아미노산 배열의 1 번째 내지 260 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;
    (d) 배열표의 배열 번호 2 에 나타내어지는 아미노산 배열의 21 번째 내지 260 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;
    (e) 배열표의 배열 번호 4 에 나타내어지는 아미노산 배열 ;
    (f) 배열표의 배열 번호 4 에 나타내어지는 아미노산 배열의 21 번째 내지 341 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;
    (g) 배열표의 배열 번호 4 에 나타내어지는 아미노산 배열의 1 번째 내지 258 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ; 및
    (h) 배열표의 배열 번호 4 에 나타내어지는 아미노산 배열의 21 번째 내지 258 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;
    로 이루어지는 1 개 또는 2 개 이상의 폴리펩티드를 특이적으로 인식하는 항체를 제조하는 공정 ;
    2) 파골 세포 형성 억제 활성 및/또는 골흡수 억제 활성을 나타내는 항체를 선별하는 공정.
  13. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    항체 또는 그 항체의 기능성 단편이 이하의 공정 1) 및 2) 를 포함하는 방법에 의해 얻어지는 것을 특징으로 하는 의약조성물 :
    1) 이하의 (j) 내지 (m) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 배열로 코드되는 아미노산 배열 :
    (j) 배열 번호 1 에 나타내어지는 뉴클레오티드 배열 ;
    (k) 배열 번호 3 에 나타내어지는 뉴클레오티드 배열 ;
    (l) 배열 번호 19 에 나타내어지는 뉴클레오티드 배열 ; 및
    (m) 배열 번호 43 에 나타내어지는 뉴클레오티드 배열 ;
    로 이루어지는 1 개 또는 2 개 이상의 폴리펩티드를 특이적으로 인식하는 항체를 제조하는 공정 ;
    2) 파골 세포 형성 억제 활성 및/또는 골흡수 억제 활성을 나타내는 항체를 선별하는 공정.
  14. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    항체가 모노클로널 항체인 것을 특징으로 하는 의약조성물.
  15. 제 14 항에 있어서,
    항체 또는 그 항체의 기능성 단편이 하이브리도마 #32A1 (FERM BP-10999) 가 생성하는 항체와 동일한 에피토프 특이성을 갖는 것을 특징으로 하는 의약조성물.
  16. 제 14 항에 있어서,
    항체 또는 그 항체의 기능성 단편이 하이브리도마 #32A1 (FERM BP-10999) 가 생성하는 항체와 경합하는 것을 특징으로 하는 의약조성물.
  17. 이하의 (a) 내지 (h) 중 어느 하나에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 1 개 또는 2 개 이상의 폴리펩티드를 특이적으로 인식하여, 파골 세포의 형성 및/또는 파골 세포에 의한 골흡수를 억제하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편으로서, 상기 항체가 하이브리도마 #32A1 (FERM BP-10999) 에 의해 생성되는 항체인 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편:
    (a) 배열표의 배열 번호 2 에 나타내어지는 아미노산 배열 ;
    (b) 배열표의 배열 번호 2 에 나타내어지는 아미노산 배열의 21 번째 내지 328 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;
    (c) 배열표의 배열 번호 2 에 나타내어지는 아미노산 배열의 1 번째 내지 260 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;
    (d) 배열표의 배열 번호 2 에 나타내어지는 아미노산 배열의 21 번째 내지 260 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;
    (e) 배열표의 배열 번호 4 에 나타내어지는 아미노산 배열 ;
    (f) 배열표의 배열 번호 4 에 나타내어지는 아미노산 배열의 21 번째 내지 341 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;
    (g) 배열표의 배열 번호 4 에 나타내어지는 아미노산 배열의 1 번째 내지 258 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ; 및
    (h) 배열표의 배열 번호 4 에 나타내어지는 아미노산 배열의 21 번째 내지 258 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열.
  18. 이하의 (j) 내지 (m) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 배열로 코드되는 아미노산 배열로 이루어지는 1 개 또는 2 개 이상의 폴리펩티드를 특이적으로 인식하여, 파골 세포의 형성 및/또는 파골 세포에 의한 골흡수를 억제하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편으로서, 상기 항체가 하이브리도마 #32A1 (FERM BP-10999) 에 의해 생성되는 항체인 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편:
    (j) 배열 번호 1 에 나타내어지는 뉴클레오티드 배열 ;
    (k) 배열 번호 3 에 나타내어지는 뉴클레오티드 배열 ;
    (l) 배열 번호 19 에 나타내어지는 뉴클레오티드 배열 ; 및
    (m) 배열 번호 43 에 나타내어지는 뉴클레오티드 배열.
  19. 제 14 항에 있어서,
    항체 또는 그 항체의 기능성 단편이 하이브리도마 #41B1 (FERM BP-11000) 가 생성하는 항체와 동일한 에피토프 특이성을 갖는 것을 특징으로 하는 의약조성물.
  20. 제 14 항에 있어서,
    항체 또는 그 항체의 기능성 단편이 하이브리도마 #41B1 (FERM BP-11000) 가생성하는 항체와 경합하는 것을 특징으로 하는 의약조성물.
  21. 이하의 (a) 내지 (h) 중 어느 하나에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 1 개 또는 2 개 이상의 폴리펩티드를 특이적으로 인식하여, 파골 세포의 형성 및/또는 파골 세포에 의한 골흡수를 억제하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편으로서, 상기 항체가 하이브리도마 #41B1 (FERM BP-11000) 에 의해 생성되는 항체인 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편:
    (a) 배열표의 배열 번호 2 에 나타내어지는 아미노산 배열 ;
    (b) 배열표의 배열 번호 2 에 나타내어지는 아미노산 배열의 21 번째 내지 328 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;
    (c) 배열표의 배열 번호 2 에 나타내어지는 아미노산 배열의 1 번째 내지 260 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;
    (d) 배열표의 배열 번호 2 에 나타내어지는 아미노산 배열의 21 번째 내지 260 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;
    (e) 배열표의 배열 번호 4 에 나타내어지는 아미노산 배열 ;
    (f) 배열표의 배열 번호 4 에 나타내어지는 아미노산 배열의 21 번째 내지 341 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;
    (g) 배열표의 배열 번호 4 에 나타내어지는 아미노산 배열의 1 번째 내지 258 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ; 및
    (h) 배열표의 배열 번호 4 에 나타내어지는 아미노산 배열의 21 번째 내지 258 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열.
  22. 이하의 (j) 내지 (m) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 배열로 코드되는 아미노산 배열로 이루어지는 1 개 또는 2 개 이상의 폴리펩티드를 특이적으로 인식하여, 파골 세포의 형성 및/또는 파골 세포에 의한 골흡수를 억제하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편으로서, 상기 항체가 하이브리도마 #41B1 (FERM BP-11000) 에 의해 생성되는 항체인 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편:
    (j) 배열 번호 1 에 나타내어지는 뉴클레오티드 배열 ;
    (k) 배열 번호 3 에 나타내어지는 뉴클레오티드 배열 ;
    (l) 배열 번호 19 에 나타내어지는 뉴클레오티드 배열 ; 및
    (m) 배열 번호 43 에 나타내어지는 뉴클레오티드 배열.
  23. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    항체가 키메라 항체인 것을 특징으로 하는 의약조성물.
  24. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    항체가 인간화되어 있는 것을 특징으로 하는 의약조성물.
  25. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    항체가 인간 항체인 것을 특징으로 하는 의약조성물.
  26. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    항체가 IgG 항체인 것을 특징으로 하는 의약조성물.
  27. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    항체의 기능성 단편이 Fab, F(ab')2, Fab' 및 Fv 로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 의약조성물.
  28. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    항체가 scFv 인 것을 특징으로 하는 의약조성물.
  29. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    항체 또는 그 항체의 기능성 단편 중 적어도 어느 1 개, 그리고 비스포스포네이트, 활성형 비타민 D3, 칼시토닌, 에스트라디올 등의 호르몬 제제, SERMs (selective estrogen receptor modulators), 이프리플라본, 비타민 K2 (메나테트레논), 칼슘 제제, PTH (parathyroid hormone) 제제, 비스테로이드성 항염증제, 가용성 TNF 리셉터 제제, 항 TNF
    Figure 112015018405053-pct00050
    항체 또는 그 항체의 기능성 단편, 항 PTHrP (parathyroid hormone-related protein) 항체 또는 그 항체의 기능성 단편, IL-1 리셉터 안타고니스트, 항 IL-6 리셉터 항체 또는 그 항체의 기능성 단편, 항 RANKL 항체 또는 그 항체의 기능성 단편 및 OCIF (osteoclastogenesis inhibitory factor) 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 어느 1 개를 함유하는 것을 특징으로 하는 골대사 이상의 치료 및/또는 예방용 의약 조성물.
  30. 삭제
  31. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    골대사 이상이 골다공증, 관절 류머티즘에 수반되는 골파괴, 또는 암의 골전이에 수반되는 골파괴인 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
  32. 제 31 항에 있어서,
    골다공증이 폐경 후 골다공증, 노인성 골다공증, 스테로이드나 면역 억제제 등의 치료용 약제의 사용에 의한 속발성 골다공증, 또는 관절 류머티즘에 수반되는 골다공증인 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. 하이브리도마 #32A1 (FERM BP-10999).
  38. 하이브리도마 #41B1 (FERM BP-11000).
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