TWI511740B - 以破骨細胞關連蛋白質Siglec-15為標的之抗體 - Google Patents
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Description
本發明係關於作為骨代謝異常之治療及/或預防藥之有用物質、作為骨代謝異常之治療及/或預防藥之有用物質之篩選方法、骨代謝異常之檢查方法,以及骨代謝異常之治療或預防方法。
已知骨為一種為了自己之形態變化或維持血中鈣濃度,為經常會進行重複形成與吸收之再構築的動的器官。正常的骨中由骨芽細胞之骨形成與由破骨細胞之骨吸收為平衡關係,而保持骨量為一定。另一方面,若骨形成與骨吸收之平衡關係被破壞,會造成骨質疏鬆症等之骨代謝異常(Endocrinological Review,(1992)13,p66-80,Principles of Bone Biology,Academic Press,New York,(1996)p87-102)。
作為調節骨代謝之因子,已有許多全身性荷爾蒙或局部性之胞激素被報告,經由此等因子之共同作用進行骨之形成與維持(Endocrinological Review,(1992)13,p66-80,Endocrinological Review),(1996)17,p308-332)。由於年齡增加的骨組織變化,以骨質疏鬆症之發作廣為人知,但此發作機構為性荷爾蒙之分泌降低或其受體異常、骨局部之胞激素表現之變動、老化基因之表現、破骨細胞或骨芽細胞之分化或機能不全等有各種原因,作為因年齡增加的單純生理現象而理解者有困難。原發性骨質疏鬆症大致區別為因雌激素之分泌降低的閉經後骨質疏鬆症與因年齡增加的老人性骨質疏鬆症,但為了此發病機構之解明與治療藥開發,關於骨吸收與骨形成之調節機構之基礎研究之進展為必須。
破骨細胞為來自造血幹細胞之多核之細胞,經由與骨之接著面放出氯離子與氫離子,使細胞與骨之接著面之間隙酸性化同時分泌為酸性蛋白酶的組織蛋白酶K(cathepsin K)等(American Journal of Physiology,(1991)260,C1315-C1324)。此結果,引起磷酸鈣之分解、酸性蛋白酶之活性化與骨基質蛋白質之分解,而進行骨吸收。
已知破骨細胞之前驅細胞受到骨表面之骨芽細胞/基質細胞之細胞膜上表現的RANKL(NF-κB配位體之受體活化劑)的刺激會分化為破骨細胞(Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America,(1998)95,p3597-3602,Cell,(1998)93,p165-176)。已知RANKL為骨芽細胞/基質細胞所産生的膜蛋白質,其表現係經由骨吸收因子調節,及RANKL誘導自破骨細胞前驅細胞向多核破骨細胞之分化(Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America,(1998)95,p3597-3602,Journal of Bone and Mineral Research,(1998)23,S222)。再者,發現剔除RANKL之小鼠會發生大理石骨病樣之病態,證明RANKL為生理性破骨細胞分化誘導因子(Nature,(1999)397,p315-323)。
作為謀求骨代謝疾病之治療或治療期間之縮短的醫藥品,使用雙膦酸酯、活性型維生素D3
、抑鈣素(calcitonin)及其衍生物、雌二醇等之荷爾蒙製劑、SERMs(選擇性雌激素受體調節劑)、依普黃酮(Ipriflavone)、維生素K2
(四烯甲萘醌(Menatetrenone))、PTH製劑及鈣製劑等。然而,此等藥劑未必可滿足治療結果,而冀望更高治療效果之藥劑之開發。
免疫系細胞之細胞膜上被唾液酸(sialic acie)等多樣糖鏈高度覆蓋,而被各式各樣糖鏈結合蛋白質辨識。唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素(Sialic-acid binding immunoglobulin-like lectins),以下稱為「Siglecs」)為辨識含有唾液酸之糖鏈而結合的I型膜蛋白質家族。Siglecs於免疫系細胞之細胞膜上大量表現,辨識相同免疫系細胞之細胞膜上所存在的唾液酸而調節細胞間相互作用或細胞機能,被認為參與免疫反應(Nature Reviews Immunology,(2007)7,p255-266),但仍有許多生理上機能並不清楚的Siglecs分子。Siglec-15(唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素15)與稱為屬於Siglecs之新報告的分子(Glycobiology,(2007)17,p838-846)CD33L3(CD33
molecule-like 3)的分子相同。此分子自魚類到人類之進化保存度高,已知於人類脾臟及淋巴結,在樹狀細胞/巨噬細胞系之細胞大量表現。又使用唾液酸探針之結合試驗之結果,亦得知人類Siglec-15與Neu5Acα2-6GalNAc結合,又小鼠Siglec-15與Neu5Acα2-3Galβ1-4Glc結合等(Glycobiology,(2007)17,p838-846)。迄今為止,Siglec-15之生理功用並未明瞭,但已報告伴隨破骨細胞之分化、成熟,Siglec-15之表現會亢進,經由RNA干涉降低Siglec-15表現而抑制破骨細胞之分化(國際公開小冊WO2007/093042)。然而,抗Siglec-15抗體對破骨細胞分化之作用迄今尚未明瞭。
本發明之目的係提供一種抑制於骨質疏鬆症、關節類風濕、癌之骨轉移等所見之骨破壞等各種骨代謝異常時特異性表現的基因、破骨細胞之分化成熟與活性的物質、篩選骨代謝異常之預防或治療劑用之新穎方法、及抑制破骨細胞之分化成熟與活性之物質、骨代謝異常之預防劑及/或治療劑。
本發明者們以探索具有骨代謝異常之治療及/或預防效果之物質為目的,以破骨細胞之分化、成熟及活性化之機構(機制)之解明為目標進行研究的結果,發現伴隨破骨細胞之分化、成熟而Siglec-15基因之表現上昇,且發現經由與Siglec-15專一性結合的抗體,抑制破骨細胞之分化,而完成本發明。
即,本發明包含以下之發明。
(1)一種抗體或該抗體之機能性片段,其專一性辨識以下(a)至(g)記載之胺基酸序列之任一或二者以上的序列,而抑制破骨細胞之形成、及經由破骨細胞之骨吸收之兩者或任一者:
(a)序列表之序列編號2所示胺基酸序列;
(b)序列表之序列編號2所示胺基酸序列之1號至260號之胺基酸殘基所構成的序列;
(c)序列表之序列編號2所示胺基酸序列之21號至260號胺基酸殘基所構成的序列;
(d)序列表之序列編號4所示胺基酸序列;
(e)序列表之序列編號4所示胺基酸序列之1號至258號胺基酸殘基所構成的序列;
(f)序列表之序列編號4所示胺基酸序列之21號至258號之胺基酸殘基所構成的序列;
(g)(a)至(f)記載之序列中伴隨1至數個胺基酸殘基之取代、刪除或添加的序列。
(2)如(1)記載之抗體或該抗體之機能性片段,其抑制破骨細胞細胞融合之過程。
(3)如(1)或(2)記載之抗體或該抗體之機能性片段,其抑制由TNFα所誘導的破骨細胞形成。
(4)如(1)至(3)項中任一項記載之抗體或該抗體之機能性片段,於30μg/ml以下之濃度抑制活體外之破骨細胞之形成。
(5)如(4)項記載之抗體或該抗體之機能性片段,於3μg/ml以下之濃度抑制活體外之破骨細胞形成。
(6)如(5)項記載之抗體或該抗體之機能性片段,於1μg/ml以下之濃度抑制活體外之破骨細胞形成。
(7)如(6)項記載之抗體或該抗體之機能性片段,於63ng/ml至1μg/ml之濃度抑制活體外之破骨細胞形成。
(8)如(1)至(3)項中任一項記載之抗體或該抗體之機能性片段,其經由破骨細胞抑制骨吸收。
(9)如(8)項記載之抗體或該抗體之機能性片段,於3μg/ml以下之濃度,於活體外抑制經由破骨細胞之骨吸收。
(10)如(9)項記載之抗體或該抗體之機能性片段,於0.3μg/ml至3μg/ml之濃度,於活體外抑制經由破骨細胞之骨吸收。
(11)如(1)至(10)項中任一項記載之抗體或該抗體之機能性片段,其經由包含以下步驟1)及2)之方法所獲得:
1)製作專一性辨識以下之(a)至(g)記載之胺基酸序列之任一者或二者以上序列之抗體的步驟:
(a)序列表之序列編號2所示胺基酸序列;
(b)序列表之序列編號2所示胺基酸序列之1號至260號之胺基酸殘基而成之序列;
(c)序列表之序列編號2所示胺基酸序列之21號至260號之胺基酸殘基而成之序列;
(d)序列表之序列編號4所示胺基酸序列;
(e)序列表之序列編號4所示胺基酸序列之1號至258號之胺基酸殘基而成之序列;
(f)序列表之序列編號4所示胺基酸序列之21號至258號之胺基酸殘基而成之序列;
(g)於(a)至(f)記載之序列中伴隨1至數個胺基酸殘基之取代、刪除或添加之序列;
2)選擇顯示破骨細胞形成抑制活性及/或骨吸收抑制活性之抗體的步驟。
(12)如(1)至(11)項中任一項記載之抗體或該抗體之機能性片段,其為單株抗體。
(13)如(12)項記載之抗體或該抗體之機能性片段,其具有與融合瘤#32A1(FERM BP-10999、BCRC960381)所産生的抗體相同的抗原決定位專一性。
(14)如(12)項記載之抗體或該抗體之機能性片段,其與融合瘤#32A1(FERM BP-10999、BCRC960381)所産生的抗體競爭。
(15)如(12)項記載之抗體或該抗體之機能性片段,其為融合瘤#32A1(FERM BP-10999、BCRC960381)所産生之抗體。
(16)如(12)項記載之抗體或該抗體之機能性片段,其具有與融合瘤#41B1(FERM BP-11000、BCRC960382)所産生的抗體相同的抗原決定位專一性。
(17)如(12)項記載之抗體或該抗體之機能性片段,其與融合瘤#41B1(FERM BP-11000、BCRC960382)所産生的抗體競爭。
(18)如(12)項記載之抗體或該抗體之機能性片段,其為融合瘤#41B1(FERM BP-11000、BCRC960382)所産生之抗體。
(19)如(1)至(18)項中任一項記載之抗體或該抗體之機能性片段,其為嵌合抗體。
(20)如(1)至(19)項中任一項記載之抗體或該抗體之機能性片段,其經人化。
(21)如(1)至(14)、(16)、或(17)項中任一項記載之抗體或該抗體之機能性片段,其為人類抗體。
(22)如(1)至(21)項中任一項記載之抗體或該抗體之機能性片段,其為IgG抗體。
(23)如(1)至(22)項中任一項記載之抗體或該抗體之機能性片段,其選自Fab、F(ab’)2、Fab’及Fv組成之群。
(24)如(1)至(14)、(16)、或(17)項中任一項記載之抗體或該抗體之機能性片段,其為scFv。
(25)一種醫藥組成物,其特徵為含有至少任一種之(1)至(24)項中任一項記載之抗體或該抗體之機能性片段。
(26)如(25)項記載之抗體或該抗體之機能性片段,其為骨代謝異常之治療劑。
(27)一種骨代謝異常之治療用醫藥組成物,其含有(1)至(24)項中任一項記載之抗體或該抗體之機能性片段之至少任一者,以及選自雙膦酸酯、活性型維生素D3
、抑鈣素及其衍生物、雌二醇等之荷爾蒙製劑、SERMs(選擇性雌激素受體調節劑)、依普黃酮、維生素K2
(四烯甲萘醌)、鈣製劑、PTH(副甲狀腺荷爾蒙)製劑、非類固醇性抗炎症劑、可溶性TNF受體製劑、抗TNFα抗體或該抗體之機能性片段、抗PTHrP(副甲狀腺荷爾蒙-相關蛋白質)抗體或該抗體之機能性片段、IL-1受體拮抗劑、抗IL-6受體抗體或該抗體之機能性片段、抗RANKL抗體或該抗體之機能性片段及OCIF(破骨細胞生成抑制因子(osteoclastogenesis inhibitory factor))組成之群之至少任一者。
(28)如(26)或(27)記載之醫藥組成物,其中骨代謝異常為選自骨質疏鬆症、伴隨關節類風濕之骨破壞、癌性高鈣血症、伴隨多發性骨髓瘤或癌之骨轉移之骨破壞、巨細胞瘤、由齒根膜炎而來之齒喪失、人工關節周圍之骨融解、慢性骨髓炎之骨破壞、骨貝西氏病(Behet disease)、腎性骨異營養症、及骨形成不全症組成之群。
(29)如(28)記載之醫藥組成物,骨代謝異常為骨質疏鬆症、伴隨關節類風濕之骨破壞、或伴隨癌之骨轉移之骨破壞。
(30)如(29)記載之醫藥組成物,其中骨質疏鬆症為閉經後骨質疏鬆症、老人性骨質疏鬆症、因使用類固醇或免疫抑制劑等之治療用藥劑之續發性骨質疏鬆症、或伴隨關節類風濕之骨質疏鬆症。
(31)一種融合瘤#32A1(FERM BP-10999、BCRC960381)。
(32)一種融合瘤#41B1(FERM BP-11000、BCRC960382)。
依據本發明,可獲得以破骨細胞之分化成熟及活性之抑制為作用機制之骨代謝異常之預防劑及/或治療劑。
本說明書中,所謂「基因」之用語,不僅指DNA,亦包含mRNA、cDNA及cRNA。
本說明書中,所謂「多核苷酸」之用語以相同於核酸之意義使用,亦包含DNA、RNA、探針、寡核苷酸、及引子。
本明細中,「多胜肽」及「蛋白質」未區別地使用。
本說明書中,所謂「RNA劃分」係指含RNA之劃分。
本說明書中,「細胞」為動物個體內之細胞,亦包含培養細胞。
本說明書中,「Siglec-15」以相同於Siglec-15蛋白質之意義使用。
本說明書中,「破骨細胞之形成」以相同於「破骨細胞之分化」或「破骨細胞之成熟」的意義使用。
本說明書中之「抗體之機能性片段」意指具有與抗原結合活性的抗體之部分片段,包含Fab、F(ab’)2、scFv等。又,將F(ab’)2於還原條件下處理的抗體之可變區的一價片段的Fab’亦包含於抗體之機能性片段中。惟,只要具有與抗原之結合能力則不限於此等分子。又,此等機能性片段不僅包含以適當酵素處理抗體蛋白質之全長分子,亦包含使用基因工程改變的抗體基因而於適當宿主細胞所産生的蛋白質。
本說明書中所謂「抗原決定位」係指特定抗Siglec-15抗體之結合的Siglec-15之部分胜肽。為前述Siglec-15之部分胜肽的抗原決定位可由免疫試驗法等該業者熟知之方法決定,例如可由以下方法進行獲得。製作Siglec-15之各種部分構造。於部分構造之製作,可使用眾知之寡胜肽合成技術。例如,使用本項業者眾知之基因重組技術自Siglec-15之C末端或N末端的適當長度依序縮短連續多胜肽而製造後,檢討對此等的抗體之反應性,粗略決定認識部位後,又經由合成短胜肽而檢討與此等胜肽之反應性,決定抗原決定位而得。第一抗Siglec-15抗體之結合的部分胜肽上若結合第二抗Siglec-15抗體,可判定第一抗體與第二抗體具有共通的抗原決定位。又,經由確認對第一抗Siglec-15抗體對Siglec-15之結合而第二抗Siglec-15抗體會競爭(即,第二抗體妨礙第一抗體與Siglec-15之結合),即便未決定具體的抗原決定位之序列,可判定第一抗體與第二抗體具有共通的抗原決定位。又,第一抗體與第二抗體結合共通的抗原決定位,且第一抗體具有抗原之中和活性等的特殊效果的場合,可期待第二抗體亦具有同樣的活性。
本發明中所謂「嚴格條件下雜交」係指於市售雜交溶液ExpressHyb Hybridization Solution(Clontech公司製)中,於68℃雜交,或使用固定DNA的濾膜而於0.7~1.0M之NaCl存在下於68℃進行雜交後,使用0.1~2倍濃度之SCC溶液(1倍濃度SCC係由150mM NaCl、15mM檸檬酸鈉組成)於68℃洗淨而可鑑定的條件或與此等同等之條件雜交。
經由本發明者們發現Siglec-15基因於巨細胞瘤中特異性地表現。又,經由本發明者們亦發現Siglec-15基因於來自單核球之細胞株分化為破骨細胞時表現量會增加。
本發明使用的Siglec-15為可自人類、非人類哺乳動物(例如,豚鼠、大鼠、小鼠、兔、豬、綿羊、牛、猴等)或雞之單核球細胞或骨髓細胞直接純化而使用,或調製上述細胞之細胞膜劃分而使用,又,可於活體外合成Siglec-15,或經由基因操作於宿主細胞産生而獲得。基因操作,具體而言,將Siglec-15 cDNA併入可表現的載體後,於含有轉錄及轉譯必要的酵素、基質及能量物質的溶液中合成,由其他原核生物、或真核生物之宿主細胞轉形而使Siglec-15表現,可獲得該蛋白質。
人類Siglec-15之cDNA之核苷酸序列登錄於Genbank目錄編號:NM_213602,亦示於序列表之序列編號1,其胺基酸序列示於序列表之序列編號2。小鼠Siglec-15之cDNA之核苷酸序列登錄於Genbank之目錄編號:XM_884636,亦示於序列表之序列編號3,其胺基酸序列示於序列表之序列編號4。除去訊號序列的成熟人類Siglec-15相當於序列編號2所示胺基酸序列之21號至328號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列。又,除去訊號序列的小鼠Siglec-15相當於序列編號4所示胺基酸序列之21號至341號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列。又,Siglec-15稱為類CD33抗原3、類CD33分子3或CD33L3,此等全指相同分子。
Siglec-15之cDNA,例如,將表現Siglec-15之cDNA的cDNA庫作為模板,使用專一性增幅Siglec-15之cDNA的引子進行聚合酶鏈反應(以下稱為「PCR」)(Saiki,R. K. et al.,Science,(1988)239,487-49),可由所謂PCR法取得。
又,自序列表之序列編號1及3選擇的至少任一者所示核苷酸序列與互補的核苷酸序列所構成的多核苷酸於嚴格條件下雜交,且編碼具有與Siglec-15相同生物活性的蛋白質之多核苷酸亦包含於Siglec-15之cDNA。再者,自人類或小鼠Siglec-15基因座轉錄的接合變異體或此等於嚴格條件雜交的多核苷酸,且編碼具有與Siglec-15相同生物活性的蛋白質之多核苷酸亦包含於Siglec-15之cDNA。
又,自序列表之序列編號2及4選擇的至少任一者所示胺基酸序列、或自此等之序列除去訊號序列的胺基酸序列中,1或數個胺基酸被取代、刪除、或添加的胺基酸序列而成,且與Siglec-15具有相同生物活性的蛋白質亦包含於Siglec-15。再者,自人類或Siglec-15基因座轉錄的接合變異體所編碼的胺基酸序列或該胺基酸序列中,1或數個胺基酸被取代、刪除、或添加的胺基酸序列而成,且與Siglec-15具有相同生物活性的蛋白質亦包含於Siglec-15。
Siglec-15基因,當進行人類各種骨組織檢體群基因之表現量的解析時,發現破骨細胞樣之多核巨細胞為多數出現的骨腫瘤作為臨床上所見骨溶解性之骨破壞為特徵(Bullough et al.,Atlas of Orthopedic Pathology 2nd
edition,pp17.6-17.8,Lippincott Williams & Wilkins Publishers(1992))的巨細胞瘤(Giant Cell tumor;GCT)有意義地表現量增加。又,亦發現Siglec-15基因於來自單核球之細胞株分化為破骨細胞時表現量會增加。
因此,Siglec-15被認為參與如GCT的骨吸收為亢進的人類病態。即,測定Siglec-15基因及/或Siglec-15於各細胞、及/或各組織之表現量可判定伴隨Siglec-15之過度表現的骨代謝異常之狀態。又,本說明書中之骨代謝異常可列舉骨質疏鬆症(閉經後骨質疏鬆症、老人性骨質疏鬆症、經使用類固醇或免疫抑制劑等之治療用藥劑之繼發性骨質疏鬆症、伴隨關節類風濕之骨質疏鬆症)、伴隨關節類風濕之骨破壞、癌性高鈣血症、多發性骨髓瘤或伴隨癌之骨轉移之骨破壞、經齒根膜炎的齒喪失、人工關節周圍之骨融解、慢性骨髓炎之骨破壞、骨貝西氏病、腎性骨異營養症、骨形成不全症等,但未限於此等。
又,作為調查本發明之Siglec-15基因及/或Siglec-15之表現量的對象之「檢體」意指自被驗者或臨床檢體等獲得之骨髓、骨、前列腺、精巢、陰莖、膀胱、腎臟、口腔、咽頭、口唇、舌、齒肉、鼻咽頭、食道、胃、小腸、大腸、結腸、肝臟、胆嚢、胰臟、鼻、肺、軟部組織、皮膚、乳房、子宮、卵巢、腦、甲狀腺、淋巴結、肌肉、脂肪組織等之組織、血液、體液或排泄物等之試料,於本發明其較佳為血液或骨髓。
本發明之一態樣可列舉經由測定Siglec-15基因及/或、Siglec-15之表現量,而篩選破骨細胞之分化抑制物質之方法。
本發明之一態樣可列舉經由鑑定抑制Siglec-15具有的向成熟破骨細胞之分化誘導活性的物質,而篩選具有骨代謝異常之治療效果及/或預防效果的物質之方法。
又,「被驗物質」係指以本發明之篩選方法調查向破骨細胞之分化抑制活性為對象的物質。作為被驗物質,可列舉化合物、微生物之代謝產物、植物或動物組織之萃取物、此等之衍生物或此等之混合物等。又,使Siglec-15之表現量降低的方式所設計的核酸或其衍生物(含反義寡核苷酸、核醣核酸酶(ribozyme)、dsRNA、siRNA等)亦可作為被驗物質使用。適宜設定被驗物質之投與量或濃度,或例如亦可設定複數種投與量製作稀釋系列等,可以固體、液體等適當狀態投與,溶解於適當緩衝液,或亦可添加安定化劑等。於使用培養細胞之篩選方法之場合,可添加於培養基而培養。添加於培養基之場合,可自培養開始時添加,亦可於培養中途添加,又,添加之次數未限於1次。於被驗物質存在下可適宜設定培養期間,較佳為30分鐘至2週,更佳為30分鐘至72小時。投與被驗物質於哺乳動物個體之場合,依被驗物質之物性等分別使用經口投與、靜脈注射、腹腔內注射、經皮投與、皮下注射等之投與形態。又自被驗物質之投與,至獲得檢體之時間可適當選擇。
本發明之篩選方法中所使用的培養細胞,於表現Siglec-15之哺乳動物細胞的範圍內,可為正常細胞,亦可為建立的細胞株、癌細胞等之顯示異常增殖的細胞,例如,可列舉正常人類破骨前驅細胞(Normal Human Natural Osteoclast Precursor Cells,可購自三光純藥,目錄編號2T-110)、來自小鼠單核球之細胞RAW264.7(ATCC Cat. No. TIB-71)、RAW264細胞(ECACC Cat. No. 85062803)、來自小鼠骨髓之初代培養細胞等,但不限定於此等。作為培養細胞之動物種類,以人類、小鼠或其他哺乳動物(豚鼠、大鼠、兔、豬、綿羊、牛、猴等)、及雞等為較佳,但未限定於此等。又,作為培養細胞以使用過度表現Siglec-15的哺乳動物細胞為更佳,例如可列舉將Siglec-15基因與其啟動子區域一起導入而過度表現Siglec-15之RAW264.7細胞、RAW264細胞、293細胞、CHO細胞、COS7細胞等。
本發明之篩選方法亦包含未使用培養細胞,投與被驗物質至哺乳動物個體,而之後自該動物個體摘出其臟器或組織細胞之檢測Siglec-15基因之表現的方法。成為基因表現檢測對象的臟器或組織,只要為表現Siglec-15者即可,較佳為與骨代謝異常有關的組織,更佳為骨組織及骨髓。作為哺乳動物種類可使用非人類哺乳動物,小鼠、大鼠或倉鼠為較佳,小鼠或大鼠為更佳。又,作為呈現骨代謝異常的動物模式,可使用卵巢摘除動物、精巢摘除動物、將腫瘤細胞移植於皮下、皮內、左心室、骨髓、靜脈或腹腔等之載癌動物、坐骨神經切除動物、佐劑關節炎模式動物、膠原蛋白誘發性關節炎模式動物、糖皮質類固醇誘發性骨質疏鬆症模式動物、老化促進小鼠(SAMP6小鼠,Matsushita et al.,AM. J. Pathol. 125,276-283(1986))、甲狀腺‧副甲狀腺摘除動物、副甲狀腺荷爾蒙關連胜肽(PTHrP)持續注入動物、破骨細胞形成抑制因子(OCIF)剔除小鼠(Mizuno et al.,Biochem. Biophys. Res. Commun.,(1998)247,610-615)、可溶型RANKL投與動物等。再者,亦可使用因牙周病造成齒喪失的模式動物、或過度表現Siglec-15之動物。將進一步篩選所選擇的被檢物質投與上述動物模式,經由測定骨組織之成熟破骨細胞之數目、骨密度、骨強度、骨形態計測可取得的各參數、血中及尿中之骨代謝參數(CTx、NTx等)、或血中Ca濃度等、依骨代謝異常而變動的參數,可評價該被檢物質對骨代謝異常之治療效果及/或預防效果。
本發明之方法所用的培養細胞,只要於未添加被驗物質的場合可表現Siglec-15的條件下,可於任一種條件下培養。例如,關於該培養細胞之公知培養條件為已知,於該條件下該細胞表現Siglec-15的場合,可以該條件培養。又,自哺乳動物個體摘出的臟器或組織中檢測Siglec-15之表現的場合中,只要該動物之飼育條件、未添加被驗物質之場合可表現Siglec-15之條件亦可。
又,為調查被驗物質對Siglec-15之表現的影響,有測定Siglec-15基因表現量之方法,及測定為Siglec-15基因之轉譯産物之Siglec-15表現量之方法。抑制Siglec-15基因及/或Siglec-15表現的被驗物質被認為對骨代謝異常具有治療效果及/或預防效果之物質,較佳為對骨質疏鬆症、關節類風濕及/或伴隨癌之骨轉移之骨破壞具有治療效果及/或預防效果之物質。
關於培養細胞中Siglec-15基因之表現量之測定、Siglec-15之表現量之測定,可經北方氏解析、定量的PCR法、ELISA法等進行。又,使用來自哺乳動物之培養細胞的場合,視必要於培養基一起適量添加被驗物質與RANKL、TNF-α、M-CSF或活性型維生素D3
等,於未添加被驗物質之對照組亦添加適當量RANKL、TNF-α、M-CSF或活性型維生素D3
等。
又,構築測定對S iglec-15之內在性配位體之結合量的實驗系統,經由被驗物質之添加而評價是否抑制該內在性配位體對Siglec-15之結合而可進行向破骨細胞分化抑制物質之篩選。
描述關於以下(1)至(3)之各篩選法。
作為本發明之篩選方法,例如,關於使用來自哺乳動物之培養細胞之方法、及使用哺乳動物個體之方法各自如以下所述。
(i)包含以下步驟a)至c):
a)自於添加被驗物質的培養基培養的來自哺乳動物之培養細胞,抽出全RNA之步驟;
b)於來自a)之全RNA與未添加被驗物質下培養的來自哺乳動物培養細胞之全RNA之間,檢測Siglec-15基因之表現量之差異的步驟;
c)解析b)所記載之基因之表現量之差異,判定被驗物質對骨代謝異常之治療、及/或預防效果的步驟。
(ii)包含以下步驟a)至d):
a)自於添加被驗物質的培養基培養的來自哺乳動物之培養細胞,抽出全RNA之步驟;
b)自未添加被驗物質的培養基培養的來自哺乳動物之培養細胞,抽出全RNA之步驟;
c)於來自上述a)之全RNA與來自b)之全RNA中測定Siglec-15基因之表現量的步驟;
d)於來自上述a)之全RNA與來自b)之全RNA之間解析由上述c)測定的基因之表現量之差異,判定被驗物質對骨代謝異常之治療、及/或預防效果的步驟。
(i)包含以下步驟a)至c):
a)自投與被驗物質的哺乳動物個體採取的檢體,抽出全RNA的步驟;
b)於來自a)之全RNA與自未投與被驗物質之動物個體採取的檢體所得全RNA之間,檢測Siglec-15基因之表現量之差異的步驟;
c)解析上述b)記載之基因之表現量的差異,判定被驗物質對骨代謝異常之治療、及/或預防效果的步驟。
(ii)包含以下步驟a)至d):
a)自投與被驗物質的哺乳動物個體採取的檢體,抽出全RNA的步驟;
b)自未投與被驗物質的哺乳動物個體採取的檢體,抽出全RNA的步驟;
c)於來自上述步驟a)之全RNA與來自上述步驟b)之全RNA測定Siglec-15基因之表現量的步驟;
d)解析於c)記載之基因之表現量之差異,判定被驗物質對骨代謝異常之治療及/或預防效果的步驟。
關於利用測定Siglec-15之表現量的篩選方法,使用哺乳動物培養細胞之方法與使用動物個體之方法各包含以下步驟。
(i)包含以下步驟a)及b):
a)於添加被驗物質之培養基培養的來自哺乳動物之培養細胞中測定Siglec-15之表現量的步驟;
b)解析於a)測定的蛋白質之表現量,與未添加被驗物質之培養基培養的來自哺乳動物之培養細胞中該蛋白質之表現量之差異,判定被驗物質對骨代謝異常之治療及/或預防效果的步驟。
(ii)包含以下步驟a)至c):
a)於添加被驗物質的培養基培養的來自哺乳動物之培養細胞中測定Siglec-15之表現量的步驟;
b)於未添加被驗物質之培養基培養的來自哺乳動物之培養細胞中測定上述a)記載之蛋白質之表現量的步驟;
c)檢測上述a)中測定的蛋白質之表現量與上述b)中測定的該蛋白質之表現量之差異,判定被驗物質對骨代謝異常之治療及/或預防效果的步驟。
(iii)包含以下步驟步驟a)至c):
a)固相化自於添加被驗物質的培養基培養的來自哺乳動物之培養細胞所得全蛋白質的步驟;
b)於上述固相化蛋白質測定Siglec-15之表現量的步驟;
c)解析上述b)檢出的Siglec-15之表現量,及自於未添加被驗物質之培養基培養的來自哺乳動物之培養細胞所得全蛋白質之該蛋白質之表現量的差異,判定被驗物質對骨代謝異常之治療及/或預防效果的步驟。
(iv)包含以下步驟步驟a)至e):
a)固相化自於添加被驗物質的培養基培養的來自哺乳動物之培養細胞所得全蛋白質的步驟;
b)固相化自未添加被驗物質之培養基培養的來自哺乳動物之培養細胞所得全蛋白質的步驟;
c)於上述步驟a)記載之固相化蛋白質中,Siglec-15之表現量使用專一性結合該蛋白質之抗體或配位體測定的步驟;
d)於上述步驟b)記載之固相化蛋白質中,Siglec-15之表現量使用專一性結合該蛋白質之抗體或配位體測定的步驟;
e)解析於上述步驟c)測定的蛋白質之表現量,及上述步驟d)測定的蛋白質之表現量之差異,判定被驗物質之對骨代謝異常的治療效果及/或預防效果的步驟。
(i)包含以下步驟步驟a)及b):
a)自投與被驗物質之哺乳動物個體採取的檢體中測定Siglec-15之表現量的步驟;
b)解析上述步驟a)測定的Siglec-15之表現量,與自未投與被驗物質之哺乳動物個體採取的檢體中該蛋白質之表現量的差異,判定被驗物質對骨代謝異常之治療及/或預防效果的步驟。
(ii)包含以下步驟步驟a)至c):
a)於自投與被驗物質之哺乳動物個體採取的檢體,Siglec-15之表現量使用專一性結合該蛋白質之抗體或配位體測定的步驟;
b)自未投與被驗物質之哺乳動物個體採取的檢體測定該蛋白質之表現量的步驟;
c)解析a)測定的Siglec-15之表現量及b)測定的該蛋白質之表現量之差異,判定被驗物質對骨代謝異常之治療及/或預防效果的步驟。
(iii)包含以下步驟a)至c):
a)固相化自投與被驗物質之哺乳動物個體採取的檢體中之全蛋白質的步驟;
b)上述固相化蛋白質中測定Siglec-15之表現量的步驟;
c)解析上述b)檢出的Siglec-15之表現量,與自未投與被驗物質之哺乳動物個體採取的檢體中該蛋白質之表現量之差異,判定被驗物質之對骨代謝異常之治療及/或預防效果的步驟。
(iv)包含以下步驟a)至e):
a)固相化自投與被驗物質之哺乳動物個體採取的檢體中之全蛋白質的步驟;
b)固相化自未投與被驗物質之哺乳動物個體採取的檢體中全蛋白質的步驟;
c)上述步驟a)記載之固相化蛋白質中,使用專一性結合該蛋白質之抗體或配位體檢出Siglec-15之表現量的步驟;
d)上述b)記載之固相化蛋白質中,使用專一性結合該蛋白質之抗體或配位體檢出Siglec-15之表現量的步驟;
e)解析上述c)檢出的蛋白質之表現量,與上述d)檢出的該蛋白質之表現量之差異,判定被驗物質對骨代謝異常之治療及/或預防效果的步驟。
經由被驗物質之添加,觀察是否抑制內在性配位體對Siglec-15之結合亦可進行破骨細胞之分化抑制物質之篩選。具有抗Siglec-15之內在性配位體作用之含有唾液酸之糖鏈,可列舉結合人類及小鼠Siglec-15之Neu5Acα2-6GalNAc及結合小鼠Siglec-15之Neu5Acα2-3Galβ1-4Glc,只要具有對Siglec-15之結合能的範圍內未限定於此等之糖鏈。此等之內在性配位體以試驗與Siglec-15結合的目的,可由適當的標籤、放射性同位素或螢光物質作標誌。例如,所謂結合Neu5Acα2-6GalNAc的含有唾液酸之寡糖的生物素化聚丙烯酸醯胺可作為結合Siglec-15的探針篩選利用。作為結合內在性配位體的Siglec-15,可使用Siglec-15表現細胞或自該細胞調製的膜劃分。又,自Siglec-15表現細胞將Siglec-15單離、純化而亦可供篩選。又,作為Siglec-15表現細胞,可使用表現Siglec-15之培養細胞株、於適當的培養細胞以基因工程使Siglec-15基因暫時或恒常地表現的細胞、或自活體內獲得表現Siglec-15之細胞之任一者。使用此等內在性配位體之篩選法可依以下步驟進行。
(i)包含以下步驟a)至b):
a)將Siglec-15之內在性配位體及被驗物質添加於Siglec-15表現細胞的步驟;
b)經由比較添加與非添加被驗物質時之內在性配位體對Siglec-15表現細胞之結合量,判定被驗物質對骨代謝異常之治療、及/或預防效果的步驟。
(ii)包含以下步驟a)至c):
a)調製Siglec-15表現細胞之細胞膜劃分的步驟;
b)添加Siglec-15之內在性配位體及被驗物質於該細胞膜劃分的步驟;
c)經由比較添加與非添加被驗物質時之內在性配位體對該細胞膜劃分之結合量,判定被驗物質對骨代謝異常之治療、及/或預防效果的步驟。
(iii)包含以下步驟a)至c):
a)調製Siglec-15之步驟;
b)將Siglec-15之內在性配位體及被驗物質添加於a)之Siglec-15之步驟;
c)經由比較添加與非添加被驗物質時之內在性配位體對Siglec-15結合量,判定被驗物質對骨代謝異常之治療、及/或預防效果的步驟。
於適當細胞以基因工程使Siglec-15表現,將其供於純化篩選的場合,成為篩選標的的Siglec-15可自以下(a)至(g)所示胺基酸序列選擇;
(a)序列表之序列編號2所示胺基酸序列;
(b)序列表之序列編號2所示胺基酸序列之1號至260號之胺基酸殘基而成之序列;
(c)序列表之序列編號2所示胺基酸序列之21號至260號之胺基酸殘基而成之序列;
(d)序列表之序列編號4所示胺基酸序列;
(e)序列表之序列編號4所示胺基酸序列之1號至258號之胺基酸殘基而成之序列;
(f)序列表之序列編號4所示胺基酸序列之21號至258號之胺基酸殘基而成之序列;
(g)(a)至(f)記載之序列伴隨1至數個胺基酸殘基之取代、刪除或添加的序列。
又,此等之蛋白質連結適切標籤的胺基酸序列、或與其他可溶性蛋白質融合的蛋白質亦可作為篩選標的使用。又,由序列表之序列編號2記載胺基酸序列之1號至20號之胺基酸殘基而成的胜肽相當於人類Siglec-15蛋白質之訊號胜肽,由21號至260號之胺基酸殘基而成的胜肽相當於人類Siglec-15之成熟蛋白質之細胞外領域。又,序列表之序列編號4記載之胺基酸序列之1號至20號之胺基酸殘基相當於小鼠Siglec-15蛋白質之訊號胜肽,21號至258號之胺基酸殘基而成的胜肽相當於小鼠Siglec-15之成熟蛋白質之細胞外領域。
對於以(1)至(3)之篩選法選擇的破骨細胞之分化抑制物質之候補物質,可以實施例17、19及20所示破骨細胞之酒石酸耐性酸性磷酸酶(Tartrate-Resistant Acid Phosphatase:TRAP)活性之抑制作為指標進行二次評價。又,如實施例19、21、22及35所示,TRAP陽性多核破骨細胞之形成之抑制,即破骨細胞之細胞融合之抑制亦可作為指標,進行二次評價。
於過度表現Siglec-15的哺乳動物個體投與被驗物質的場合與未投與的場合,測定經時之骨代謝異常之發生率、骨代謝異常之程度、及/或生存率等。投與被驗物質之哺乳動物中骨代謝異常之發生率有意義地降低,骨代謝異常之程度有意義地變小,及/或生存率為約10%以上,較佳為約30%以上,更佳為約50%以上上昇的場合,被驗物質可選擇作為具有對骨代謝異常之治療及/或預防效果之化合物。
本發明之抗Siglec-15之抗體,使用常法,以由Siglec-15或Siglec-15之胺基酸序列選擇的任意多胜肽免疫動物,採取活體內產生的抗體,經由純化可獲得。成為抗原的Siglec-15之生物種未限於人類,亦可以來自小鼠、大鼠等之人類以外之動物之Siglec-15免疫動物。此場合,經由試驗結合取得的異種Siglec-15之抗體與人類Siglec-15之交叉性,可選擇可適用於人類疾病之抗體。
又,依公知之方法(例如,Kohler and Milstein,Nature(1975)256,p.495-497;Kennet,R.eD.,Monoclonal Antibodies,p.365-367,Plenum Press,N.Y.(1980)),經由產生抗Siglec-15之抗體的抗體產生細胞與骨髓瘤細胞融合樹立融合瘤,亦可獲得單株抗體。
又,成為抗原之Siglec-15可經由將Siglec-15基因基因操作而於宿主細胞產生而獲得。
具體而言,製作可表現Siglec-15基因之載體,將其導入宿主細胞使該基因表現,亦可純化表現的Siglec-15。以下,具體說明抗Siglec-15之抗體之取得方法。
作為製造抗Siglec-15抗體用之抗原,可列舉Siglec-15或其至少6個連續部分胺基酸序列而成的多胜肽、或此等任意之胺基酸序列或附加載體的衍生物。
Siglec-15可由人類腫瘤組織或腫瘤細胞直接純化使用,又,可於活體外合成Siglec-15,或經基因操作使宿主細胞產生而獲得。
基因操作,具體而言,將Siglec-15之cDNA併入可表現載體後,於含有轉錄與轉譯必要的酵素、基質及能量物質的溶液中合成,或經由使其他原核生物、或真核生物之宿主細胞轉形,經由使Siglec-15表現可獲得抗原。
又,經由使為膜蛋白質之Siglec-15之細胞外區域與抗體之恆定區域連結的融合蛋白質於適切宿主.載體系統中表現,亦可獲得為分泌蛋白質之抗原。
Siglec-15之cDNA,例如,進行Siglec-15之cDNA作為表現cDNA庫之模板,使用專一性表示Siglec-15 cDNA之引子的聚合酶鏈反應(以下稱為「PCR」)(參照Saiki,R. K. et al.,Science(1988)239,p.487-489),經由所謂PCR法可取得。
多胜肽之活體外(in vitro)合成可列舉例如Roche Diagnostic公司製之快速轉譯系統(Rapid Translation System(RTS)),但未限於此。
原核細胞之宿主可列舉例如大腸菌(Escherichia coli)或枯草桿菌(Bacillus subtilis)等。為使於此等宿主細胞內轉形目的基因,於含有與宿主適合之種由來的複製子(即複製起點)及調節序列的質體載體中使宿主細胞轉形。又,作為載體,具有可賦予轉形細胞表現形質(表現型)選擇性的序列者為較佳。
真核細胞之宿主細胞包含脊椎動物、昆蟲、酵母等之細胞,作為脊椎動物細胞經常使用例如為猴細胞的COS細胞(Gluzman,Y.Cell(1981)23,p.175-182,ATCC CRL-1650)、小鼠纖維母細胞NIH3T3(ATCC No.CRL-1658)或中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞,ATCC CCL-61)之二氫葉酸還原酵素缺損株(Urlaub,G. and Chasin,L.A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1980)77,p.4126-4220)等,但未限於此等。
如上述所得轉形體,可依常法培養,自該培養於細胞內、或細胞外產生目的多胜肽。
作為該培養所用培養基,可視採用之宿主細胞適宜選擇慣用的各種培養基,若為大腸菌,例如,視必要於LB培養基添加安比西林等抗生素或IPMG而使用。
經由上述培養,轉形體之細胞內或細胞外産生的重組蛋白質可經由利用該蛋白質之物理性質或化學性質等的各種公知分離操作法而分離‧純化。
作為該方法,具體而言可以例如,由通常之蛋白質沈澱劑處理、超過濾、分子篩層析(凝膠過濾)、吸著層析法、離子交換層析法、親和性層析法等之各種液體層析法、透析法、此等之組合等。
又,經由經表現的重組蛋白質中連繫6個殘基而成的組胺酸,可以鎳親和性管柱有效率地純化。或,經由經表現的重組蛋白質中連繫IgG之Fc區域,以蛋白質A管柱可有效率地純化
經由組合上述方法可容易地以高產率、高純度大量製造目的多胜肽。
作為與Siglec-15專一性結合的抗體之例,可列舉與Siglec-15專一性結合的單株抗體,其取得方法如以下記載。
於製造單株抗體時,一般言而如下述之作業步驟為必要。
即,
(a)作為抗原使用的活體高分子之純化、
(b)經由注射抗原於動物免疫後,採取血液而檢定此抗體力價而決定脾臟摘出之時期後,調製抗體産生細胞的步驟、
(c)骨髓瘤細胞(以下稱為「骨髓瘤」)之調製、
(d)抗體産生細胞與骨髓瘤之細胞融合、
(e)産生目的抗體之融合瘤群之選別、
(f)單一細胞選殖株之分離(選殖)、
(g)依場合,大量製造單株抗體用之融合瘤之培養、或移植融合瘤之動物之飼育、
(h)如此製造的單株抗體之生理活性、及其結合特異性之檢討、或標識試藥之特性之檢定等。
以下,沿上述步驟詳述單株抗體之製作法,但該抗體之製作法未限於此等,例如亦可使用脾細胞以外之抗體産生細胞及骨髓瘤。
作為抗原,可使用如前述方法調製的Siglec-15或其一部分。
又,由Siglec-15表現重組體細胞調製的膜劃分、或Siglec-15表現重組體細胞自身,進而使用本項技藝者周知之方法,亦可將化學合成的本發明蛋白質之部分胜肽作為抗原使用。
將步驟(a)所得抗原與弗氏完全或不完全佐劑、或鉀鋁明礬等助劑混合,作為免疫原免疫實驗動物。於實驗動物使用公知融合瘤製作法可自由地使用動物。具體而言,例如可使用小鼠、大鼠、山羊、綿羊、牛、馬等。惟,由與摘出的抗體產生細胞融合的骨髓瘤細胞之取得容易性等之觀點,較佳以小鼠或大鼠作為被免疫動物。
又,實際使用的小鼠及大鼠之系統並未特別限制,於小鼠之場合,可使用例如各系統A、AKR、BALB/c、BDP、BA、CE、C3H、57BL、C57BL、C57L、DBA、FL、HTH、HT1、LP、NZB、NZW、RF、R III、SJL、SWR、WB、129等,又於大鼠之場合,可使用例如Wistar、Low、Lewis、Sprague、Dawley、ACI、BN、Fischer等。
此等小鼠及大鼠可獲自例如日本CLEA、日本Charles River等實驗動物飼育販賣業者。
其中,若探索與後述骨髓瘤細胞之融合適合性,小鼠中以BALB/c系統,大鼠以Wistar及Low系統作為被免疫動物為特佳。
又,考慮抗原之人類與小鼠之相同性,降低除去自體抗體的活體機構的小鼠,即使用自體免疫疾病小鼠亦較佳。
又,此等小鼠或大鼠之免疫時之週齡較佳為5~12週齡,更佳為6~8週齡。
經由Siglec-15或其重組體免疫動物,可使用詳細記載於例如,Weir,D.M.,Handbook of Experimental Immunology Vol.I.II.III.,Blackwell Scientific Publications,Oxford(1987);Kabat,E.A.and Mayer,M.M.,Experimental Immunochemistry,Charles C Thomas Publisher Springfield,Illinosis(1964)等之公知方法。
此等免疫法中,具體顯示本發明之較佳方法者,例如以下所述者。
即,首先,投與為抗原之膜蛋白質劃分、或表現抗原之細胞於動物之皮內或腹腔內。
惟,為提高免疫效率兩者之併用為較佳,前半段進行皮內投與,後半段或僅最終回進行腹腔內投與,可特別地提高免疫效率。
抗原之投與行程,依被免疫動物之種類、個體差等而異,一般而言,抗原投與次數3~6次、投與間隔2~6週間為較佳,投與次數3~4次、投與間隔2~4週間為更佳。
又,抗原之投與量依動物之種類、個體差等而異,一般而言為0.05~5mg,較佳為0.1~0.5mg左右。
追加免疫如以上之抗原投與1~6週後進行,較佳為2~4週後,更佳為2~3週後。
又,進行追加免疫之際的抗原投與量依動物種類、大小等而異,一般而言,例如於小鼠之場合為0.05~5mg,較佳為0.1~0.5mg,更佳為0.1~0.2mg左右。
自上述追加免疫1~10日後,較佳為2~5日後,更佳為2~3日後,由被免疫動物無菌取出含有抗體産生細胞之脾臟細胞或淋巴球。
又,此時測定抗體力價,若使用抗體力價非常高的動物作為抗體産生細胞之供給源,可提高之後操作的效率。
作為此處使用的抗體力價之測定法,例如,可列舉RIA法或ELISA法,但未限於此等方法。
本發明之抗體力價之測定,例如由ELISA法,可如以下記載順序進行。
首先,將純化或部分純化的抗原吸附於ELISA用96孔平盤等之固相表面,進而未吸附抗原的固相表面覆蓋與抗原無關係的蛋白質,例如牛血清白蛋白(以下稱為「BSA」),洗淨該表面後,與作為第一抗體之階段稀釋的試料(例如小鼠血清)接觸,上述抗原結合試料中之抗體。
又加入作為第二抗體之經酵素標識抗小鼠抗體之抗體而結合小鼠抗體,洗淨後添加該酵素之基質,基於基質分解的發色而測定吸光度之變化等,算出抗體力價。
自此等脾臟細胞或淋巴球分離抗體産生細胞可依公知方法(例如,Kohler et al.,Nature(1975)256,p.495;Kohler et al.,Eur.J.Immnol.(1977)6,p.511;Milstein et al.,Nature(1977),266,p.550,;Walsh,Nature,(1977)266,p.495)進行。
例如,脾臟細胞之場合,可採用細切脾臟以不鏽鋼網過濾細胞後,浮游於Eagle最小必須培養基(MEM)而分離抗體産生細胞的一般方法。
細胞融合所用骨髓瘤細胞未特別限制,可自公知細胞株適宜選擇使用。惟,考慮自融合細胞選擇融合瘤時之便利性,使用確立此選擇手續的HGPRT(次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(Hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase))缺損株為較佳。
即,小鼠由來之X63-Ag8(X63)、NS1-ANS/1(NS1)、P3X63-Ag8.U1、(P3U1)、X63-Ag8.653(X63.653)、SP2/0-Ag14(SP2/0)、MPC11-45.6TG1.7(45.6TG)、FO、S149/5XXO、BU.1等,大鼠由來之210.RSY3.AG.1.2.3(Y3)等,人類由來之U266AR(SKO-007)、GM1500.GTG-A12(GM1500)、UC729-6、LICR-LOW-HMy2(HMy2)、8226AR/NIP4-1(NP41)等。
此等HGPRT缺損株可獲自例如,American Type Culture Collection(ATCC)等。
此等細胞株,於適當培養基、例如於8-氮鳥嘌呤培養基〔於RPMI-1640培養基加入麩醯胺酸、2-巰基乙醇、慶大黴素(gentamycin)、及胎牛血清(以下稱為「FCS」)的培養基中加入8-氮鳥嘌呤的培養基〕、Iscove改變Dulbecco培養基(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium;以下稱為「IMDM」)、或Dulbecco改變Eagle培養基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium;以下稱為「DMEM」)中繼代培養,細胞融合之3至4日前以正常培養基〔例如,含10% FCS之ASF104培養基(味之素(股)公司製)〕繼代培養,融合
當日確保有2×107
以上個細胞數。
抗體產生細胞與骨髓瘤細胞之融合,依公知方法(Weir,D.M.,Handbook of Experimental Immunology Vol.I.II.III,Blackwell Scientific Publications,Oxford(1987);Kabat,E.A.and Mayer,M.M.,Experimental Immunochemistry,Charles C Thomas Publisher Springfield,Illinosis(1964)等),可於未極度降低細胞生存率的程度的條件下適宜實施。
此等方法可使用例如,聚乙二醇等之高濃度聚合物溶液中混合抗體產生細胞及骨髓瘤細胞之化學方法、利用電氣刺激之物理方法等。
其中,顯示上述化學方法之具體例如以下所述。
即,使用作為高濃度聚合物溶液之聚乙二醇的場合,於分子量1500~6000、較佳為2000~4000之聚乙二醇溶液中,在30~40℃、較佳為35~38℃之溫度下混合抗體產生細胞與骨髓瘤細胞1~10分鐘,較佳為5~8分鐘。
由上述細胞融合所得融合瘤之選擇方法並未特別限制,通常使用HAT(次黃嘌呤.胺基喋呤.胸腺嘧啶)選擇法(Kohler et al.,Nature(1975)256,p.495;Milstein et al.,Nature(1977)266,p.550)。
此方法使用於胺基喋呤中無法生存的HGPRT缺損株之骨髓瘤細胞獲得融合瘤的場合為有效的。
即,經由於HAT培養基中培養未融合細胞及融合瘤,使選擇性殘留僅現存對胺基喋呤耐性的融合瘤,並可使其增殖。
作為融合瘤之選殖法,例如可使用甲基纖維素法、軟洋菜膠法、限界稀釋法等之公知方法(例如參照Barbara,B. M. and Stanley,M. S. :Selected Methods in Cellular Immunology,W. H. Freeman and Company,San Francisco(1980))。此等方法中,特別是限界稀釋法為較佳。
以此方法,於微量盤中接種來自大鼠胎兒的纖維母細胞株、或正常小鼠脾臟細胞、胸腺細胞、腹水細胞等供應細胞(feeder)。
另一方面,預先將融合瘤以0.2~0.5個/0.2ml的方式於培養基中稀釋,此經稀釋的融合瘤之游離液於各別孔中每孔放入0.1ml,每隔一定期間(例如每3日)一邊將約1/3培養基以新的培養基交換一邊繼續培養2週左右,可使融合瘤之選殖株增殖。
於被認為有抗體力價之孔,例如經限界稀釋法重複2~4次選殖,選擇安定地被認為有抗體力價者作為抗Siglec-15單株抗體産生融合瘤株。
作為如此選殖的融合瘤株之例,可列舉融合瘤#32A1及融合瘤#41B1。融合瘤#32A1及融合瘤#41B1於2008年8月28日寄存於日本國獨立行政法人産業技術總合研究所特許生物寄存中心(所在地:郵遞區號305-8566日本國茨城縣市東1丁目1番地1中央第6),融合瘤#32A1以抗-Siglec-15融合瘤#32A1之名稱賦與寄存編號FERM BP-10999,融合瘤#41B1以抗-Siglec-15融合瘤#41B1之名稱賦與寄存編號FERM BP-11000。又,本說明書中,融合瘤#32A1所産生的抗體記載為「#32A1抗體」或簡單記載為「#32A1」,融合瘤#41B1産生的抗體記載為「#41B1抗體」或簡單記載為「#41B1」。
如此經選擇的融合瘤,可經由培養,有效率地獲得單株抗體,但培養之前,期望先篩選產生作為目的的單株抗體的融合瘤。
於此篩選可採用其本身既知之方法。
本發明中抗體力價之測定可依據例如上述(b)之項目中説明的ELISA法進行。
依據如以上之方法所獲得的融合瘤,可於液態氟中或-80℃以下之冷凍庫中以凍結狀態保存。
完成選殖之融合瘤,將培養基由HT培養基換成正常培養基培養。
使用大型培養瓶的回轉培養、或旋轉器培養進行大量培養。
此大量培養之上清液,經由使用凝膠過濾等該業者眾所皆知之方法純化,可獲得專一性結合本發明蛋白質之單株抗體。
又,同系統之小鼠(例如上述之BALB/c)、或Nu/Nu小鼠之腹腔內注射融合瘤,經由使該融合瘤增殖,可獲得含大量本發明單株抗體的腹水。
腹腔內投與時,事前(3~7日前)投與2,6,10,14-四甲基十五烷(2,6,10,14-tetramethyl pentadecane)(降植烷(PRISTANE))等之礦物油,可獲得較多量腹水。
例如,融合瘤與同系統之小鼠之腹腔內預先注射免疫抑制劑,使T細胞不活性化後,於20日後將106~107個融合瘤。選殖株細胞於不含血清的培養基中使游離(0.5ml)而投與至腹腔內,通常腹部會膨脹,以積存腹水的程度自小鼠採取腹水。
依據此方法,獲得與培養液中相比約100倍以上濃度之單株抗體。
由上述方法獲得的單株抗體,可例如以記載於Weir,D.M.:Handbook of Experimental Immunology,Vol.I,II,III,Blackwell Scientific Publications,Oxford(1978)之方法純化。
即,硫銨鹽析法、凝膠過濾法、離子交換層析法、親和性層析法等。
作為純化之簡便方法,亦可利用市售單株抗體純化套組(例如,MAbTrap GII套組;Pharmacia公司製)。
如此所得單株抗體具有對Siglec-15之高抗原專一性。
如此所得單株抗體之異型及亞群之決定可如以下進行。
首先,可列舉奧克特洛尼平板雙向擴散法(Ouchterlony)法、ELISA法、或RIA法作為鑑定法。
奧克特洛尼平板雙向擴散法雖為簡便,但單株抗體之濃度為低的場合有濃縮操作的必要。
另一方面,使用ELISA法或RIA法的場合,使培養上清液以原樣與抗原吸附固相反應,進一步經由使用作為第二次抗體的對應各種免疫球蛋白異型、亞群的抗體,可鑑定單株抗體之異型、亞群。
又,作為更簡便的方法,亦可利用市售鑑定用套組(例如,小鼠typer套組;Bio-Rad公司製)等。
又,蛋白質之定量,可依據Folin-Lowry法,及由280nm之吸光度[1.4(OD280)=免疫球蛋白1mg/ml]算出的方法進行。
本發明之抗體,除了上述抗siglec-15之單株抗體外,亦包含以抗人類之異種抗原性降低等為目的之人為改變的基因重組型抗體,例如,嵌合(Chimeric)抗體、人化(Humanized)抗體、人類抗體等。此等抗體可使用既知方法製造。
作為嵌合抗體,可列舉抗體可變區與恆定區互為異種的抗體,例如,可列舉小鼠由來抗體之可變區接合人類由來之恆定區的嵌合抗體(參照Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,81,6851-6855,(1984))。
作為人化抗體,僅互補性決定區(CDR;complementarity determining region)組合人類由來之抗體的抗體(參照Nature (1986) 321,p.522-525),可列舉依據CDR移植法,除CDR之序列外亦有一部份框架區之胺基酸殘基移植人類抗體的抗體(國際公開小冊WO90/07861)。
又,可舉例人類抗體。抗Siglec-15人類抗體意指具有只有人類染色體由來的抗體的基因序列的人類抗體。抗Siglec-15人類抗體可經由使用具有含人類抗體H鏈與L鏈基因的人類染色體片段的人類抗體產生小鼠的方法(參照Tomizuka,K.et al.,Nature Genetics(1997)16,p.133-143;Kuroiwa,Y.et.al.,Nucl.Acids Res.(1998)26,p.3447-3448;Yoshida,H.et.al.,Animal Cell Technology:Basic and Applied Aspects vol.10,p.69-73(Kitagawa,Y.,Matsuda,T.and Iijima,S.eds.),Kluwer Academic Publishers,1999;Tomizuka,K.et.al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)97,p.722-727)而取得。
此等轉基因動物,具體而言,將非人類哺乳動物之內在性免疫球蛋白重鏈及輕鏈的基因座被破壞,替代性地將藉由酵母人工染色體(Yeast artificial chromosome,YAC)載體等導入人類免疫球蛋白重鏈及輕鏈的基因座的基因重組動物,經由基因剔除動物及轉基因動物之製作、及此等動物彼此雜交可製作得到。
又,經由基因重組技術,編碼此等人化抗體之重鏈及輕鏈之個別的cDNA,較佳為經由含該cDNA的載體將真核細胞轉形,經由培養產生基因重組人類單株抗體的轉形細胞,亦可自培養上清液中獲得此抗體。
其中,作為宿主,可使用例如真核細胞,較佳為CHO
細胞、淋巴球或骨髓瘤等哺乳動物細胞。
又,亦已知取得由人類抗體庫選別的噬菌體表現(phage display)由來之人類抗體的方法(參照Wormstone,I.M.et.al,Investigative Ophthalmology & Visual Science.(2002)43(7),p.2301-2308;Carmen,S.et.al.,Briefings in Functional Genomics and Proteomics(2002),1(2),p.189-203;Siriwardena,D.et.al.,Ophthalmology(2002)109(3),p.427-431)。
例如,可使用將人類抗體之可變區作為一單鏈抗體(scFv)於噬菌體表面上表現,選擇結合抗原的噬菌體的噬菌體表現法(Nature Biotechnology(2005),23,(9),p.1105-1116)。
經由解析以結合抗原所選擇的噬菌體之基因,可決定編碼結合抗原的人類抗體之可變區的DNA序列。
若已知結合抗原的scFv之DNA序列,製作具有該序列的表現載體,且經由導入適當宿主使其表現可取得人類抗體(WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438、WO95/15388、Annu.Rev.Immunol(1994)12,p.433-455,Nature Biotechnology(2005)23(9),p.1105-1116)。
一旦單離抗體基因後,導入適當宿主而製作抗體時,可使用適當宿主與表現載體之組合。
使用真核細胞作為宿主時,可使用動物細胞、植物細胞、真核微生物。
作為動物細胞,可列舉哺乳類細胞,例如為猴細胞的COS細胞(Gluzman,Y.Cell(1981)23,p.175-182,ATCC CRL-1650)、小鼠纖維母細胞NIH3T3(ATCC No. CRL-1658)或中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞、ATCC CCL-61)之二氫葉酸還原酵素缺損株(Urlaub,G. and Chasin,L. A. Proc. Natl. Acad. sci. U. S. A. (1980)77,p. 4126-4220)。
使用原核細胞時,可列舉例如大腸菌、枯草桿菌。
於此等細胞,經由轉形導入作為目的的抗體基因,於試管內培養經轉形細胞而獲得抗體。
本發明之抗體之異型無限制,例如可列舉IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA(IgA1、IgA2)、IgD或IgE等,較佳為IgG或IgM。
又本發明之抗體可具有抗體之抗原結合部的抗體之機能性片段或其。以木瓜酵素、胃蛋白酶等蛋白質分解酵素處理抗體,或經由基因工程技術將抗體基因改變的適當培養細胞中使其表現,可獲得該抗體之片段。此等抗體片段中,保持具有抗體全長分子機能之全部或一部分的片段可稱為抗體之機能性片段。作為抗體之機能,一般而言可列舉抗原結合活性、中和抗原活性之活性、增強抗原活性之活性、抗體依存性細胞抑制活性、補體依存性細胞傷害活性及補體依存性細胞性細胞傷害活性。本發明之抗體之機能性片段所保持的機能,較佳為抑制破骨細胞形成之活性,更佳為抑制破骨細胞之細胞融合之過程的活性。
例如,作為抗體之片段,可列舉Fab、F(ab’)2、Fv、或以適當連結物連結重鏈及輕鏈之Fv之單鏈Fv(scFv)、雙功能抗體(diabodies)、線狀抗體、及抗體片段所形成的多專一性抗體等。又,於還原F(ab’)2之條件處理的抗體之可變區之一價片段的Fab’亦包含於抗體之片段。
再者,本發明抗體亦可為對至少2種類相異抗原具有專一性的多專一性抗體。
通常此等分子為結合2個抗原者(即,雙專一性抗體(bispecific antibody)),本發明之「多專一性抗體」為包含對此等以上(例如,3種類)抗原具有專一性的抗體者。
本發明之抗體亦可為多專一性抗體由全長構成的抗體、或此等抗體之片段(例如,F(ab’)2雙專一性抗體)。雙專一性抗體亦可為結合2種類抗體之重鏈與輕鏈(HL對)而製作者,亦可經由使產生相異單株抗體的融合瘤融合而製作出雙專一性抗體產生融合細胞,製作本發明之抗體(Millstein et al.,Nature(1983)305,p.537-539)。
本發明之抗體可為單鏈抗體(亦記載為scFv)。單鏈抗體可經由以多胜肽連結物連結抗體之重鏈V區與輕鏈V區而得(Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,113(Rosenberg及Moore編,Springer Verlag,New York,p.269-315(1994);Nature Biotechnology(2005),23,p.1126-1136)。又,2個scFv以胜肽連結物結合而製作的BiscFv片段亦可作為二重專一性抗體使用。
製作單鏈抗體之方法為該技術領域中眾所皆知(例如,參照美國專利第4,946,778號、美國專利第5,260,203號、美國專利第5,091,513號、美國專利第5,455,030號等)。此scFv中,重鏈V區與輕鏈V區為不作成共軛物的方式的連結物,較佳為藉由多胜肽連結物連結(Huston,J. S. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.(1988),85,p.5879-5883)。scFv之重鏈V區及輕鏈V區可來自同一抗體,亦可來自別的抗體。
作為連結V區的胜肽連結物,例如使用12~19個殘基所構成的任意一條鏈胜肽。
編碼scFv的DNA可由下述方式獲得,於編碼前述抗體之重鏈或重鏈V區的DNA、及編碼輕鏈或輕鏈V區的DNA中以編碼此等序列中之全部或所冀望之胺基酸序列的DNA部分為模板,經由使用規定此兩端的引子對的PCR法增幅,其次,又經由組合編碼胜肽連結物部分的DNA、及其兩端各別連結重鏈、輕鏈的方式規定的引子對增幅而被獲得。
又,一旦編碼scFv的DNA被製作,含有此等的表現載體、及經該表現載體轉形的宿主可依據通常方法獲得,又,經由使用此宿主,可依通常方法獲得scFv。
此等抗體片段可與前述相同樣地取得基因使其表現,而由宿主産生。
本發明之抗體可為多株而對抗原提高親和性者。作為多株抗體,可為1種類抗體,亦可為認識相同抗原之複數個抗原決定位的複數個抗體。作為多株抗體之方法,可列舉IgGCH3功能域與2個scFv之結合、與鏈黴抗生物素之結合、helix turn.helix motif之導入等。
本發明之抗體可為胺基酸序列為相異的複數種類之抗siglec-15抗體之混合物,亦可為多株抗體。作為多株抗體之一例,可列舉CDR為相異的複數種類之抗體之混合物。作為此等多株抗體,培養產生相異抗體的細胞之混合物,使用自該培養物純化的抗體而完成(參照WO2004/061104號)
作為抗體之修飾物,亦可使用與聚乙二醇(PEG)等各種分子結合的抗體。
本發明之抗體,亦可進一步將此等抗體與其他藥劑形成共軛物(Immunoconjugate)。作為此等抗體之例,可列舉該抗體為與具有放射性物質或藥理作用的化合物結合之物(Nature Biotechnology(2005)23,p.1137-1146)。
所得抗體可純化至均一。抗體之分離、純化可使用通常蛋白質使用的分離、純化方法。
例如可適宜選擇層析管柱、過濾器、超過濾、鹽析、透析、調製用聚丙烯醯胺凝膠電泳、等電點電泳等,並組合此等,將抗體分離、純化(Strategies for Protein Purification and Characterization:A Laboratory Course Manual,Daniel R.Marshak et al.eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996);Antibodies:A Laboratory Manual.Ed Harlow and David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)),但未限於此等。
作為層析,可列舉親和性層析、離子交換層析、疏水性層析、凝膠過濾、逆相層析、吸附層析等。
此等之層析可使用HPLC或FPLC等液相層析進行。
作為親和性層析所用的管柱,可列舉蛋白質A管柱、蛋白質G管柱。
例如使用蛋白質A作為管柱,可列舉Hyper D、POROS、Sepharose F. F.(Pharmacia)等。
又使用固定化抗原的載劑,利用對抗原的結合性亦可純化抗體。
於上述之「4.抗siglec-15抗體之製造」項目中記載之方法所得抗siglec-15抗體中,可獲得中和siglec-15之生物活性的抗體。此等中和siglec-15之生物活性的抗體,由抑制活體內之siglec-15之生物活性,即抑制破骨細胞之分化及/或成熟,可使用作為醫藥,作為對破骨細胞之分化及/或成熟異常所造成之骨代謝異常的治療劑。骨代謝異常可為任一特徵賦予由實質骨喪失(骨減少症或骨溶解症)的障礙。一般而言,以抗siglec-15抗體治療,適用於抑制骨吸收為必要的場合。作為以抗siglec-15抗體可治療的骨代謝異常,可列舉骨質疏鬆症(閉經後骨質疏鬆症、老人性骨質疏鬆症、類固醇或免疫抑制劑等治療用藥劑之使用而之續發性骨質疏鬆症、伴隨關節類風濕之骨質疏鬆症)、伴隨關節類風濕之骨破壞、癌性高鈣血症、多發性骨髓瘤或伴隨癌之骨轉移之骨破壞、巨細胞瘤、由齒根膜造成的齒喪失、人工關節周圍之骨融解、慢性骨髓炎之骨破壞、骨貝西氏病、腎性骨異營養症、骨形成不全症等,但只要是伴隨破骨細胞之實質骨喪失的疾病即可,未限於此等。作為上述醫藥之抗siglec-15抗體之例,可列舉自#32A1抗體或#41B1抗體之4.(3)「其他抗體」所記載之方法而製作的嵌合抗體或人化抗體。又,具有與#32A1抗體或#41B1抗體相同抗原決定位的嵌合抗體、人化抗體及人類抗體亦可作為醫藥使用。有的抗Siglec-15抗體,具有與#32A1抗體或#41B1抗體相同的抗原決定位者指對於Siglec-15之特定部分胜肽,可經由觀察此等抗體是否共通地結合而確認。又,有的抗Siglec-15抗體若於與Siglec-15之結合而與#32A1抗體或#41B1抗體競爭,合此等抗體可判定具有共通的抗原決定位。
經由活體外之抗Siglec-15抗體之Siglec-15的生物活性之中和活性,例如,可對過度表現Siglec-15之細胞測定破骨細胞分化之抑制活性。例如,來自小鼠單核球之細胞株RAW264.7細胞或RAW264細胞中添加各種濃度之抗Siglec-15抗體,經由RANKL或TNF-α刺激,可測定對破骨細胞之分化之抑制活性。又,骨髓由來之初代培養細胞添加各種濃度之抗Siglec-15抗體,由RANKL、TNF-α或活性型維生素D3
刺激,可測定對破骨細胞分化之抑制活性。又,於正常人類破骨前驅細胞(Normal Human Natural Osteoclast Precursor Cells,可購自三光純藥,目錄編號2T-110)添加各種濃度之抗Siglec-15抗體,經由RANKL及M-CSF刺激,可測定分化至破骨細胞之抑制活性。此等破骨細胞之分化抑制效果,可以實施例17、19、20及26所示破骨細胞之酒石酸耐性酸性磷酸酶(TRAP)活性之抑制作為指標測定。又,如實施例19、21、22及35所示,TRAP陽性多核破骨細胞之形成之抑制,即破骨細胞之細胞融合之抑制作為指標,可測定破骨細胞之分化抑制效果。對於上述破骨細胞分化之試驗系統,本發明之抗體以30μg/ml以下之濃度顯示細胞融合之抑制效果,幾個抗體為3μg/ml以下、或即使1μg/ml以下之濃度亦顯示抑制效果。又於低濃度側試驗效果的場合,即使於63ng/ml至1μg/ml之範圍亦於複數個抗體觀察到破骨細胞之分化抑制效果。又,於使用大腿骨及/或脛骨由來之細胞的凹洞形成分析法(Takada et al., Bone and Mineral,(1992)17, 347-359)實驗,大腿骨及/或脛骨由來之細胞中添加各種濃度之抗siglec-15抗體於象牙切片上觀察凹洞形成,可於活體外測定經由破骨細胞之骨吸收之抑制活性。作為活體外中由於破骨細胞之骨吸收的抑制活性的測定系統,如實施例37所示,亦可使用塗布結合銪的人類膠原蛋白的平盤。經由上述之破骨細胞的骨吸收之試驗系統中,本發明之抗體為3μg/ml以下之濃度,即於0.3μg/ml至3μg/ml之範圍內抑制骨吸收。利用活體內之實驗動物抗siglec-15抗體對骨代謝異常之治療效果,例如,於骨質疏鬆症模式動物或過度表現siglec-15之轉基因動物投與抗siglec-15抗體,可測定破骨細胞之變化而確認。
如此所得中和siglec-15生物活性之抗體,作為醫藥,特別是作為骨質疏鬆症、伴隨關節類風濕之骨破壞、伴隨癌之骨轉移之骨破壞等之骨代謝異常之治療為目的醫藥組成物,或此等疾病之免疫學的診斷用之抗體為有用的。
於關節類風濕(RA)之治療,伴隨疾病發作而發生的骨喪失成為大課題。關於伴隨RA之骨喪失,已報告破骨細胞為中心作用的結果。認為是作為RA之破骨細胞之誘導(分化、成熟)、活性化、及骨破壞之原因最重要的胞激素為RANKL與TNF-α(Romas E et al.,Bone 30,p340-346,2002)。亦如本說明書之實施例19所示,為RANKL之誘騙受體的OCIF/OPG以RANKL誘導的破骨細胞形成可抑制,但以TNF-α誘導的破骨細胞形成未被抑制。另一方面,依據本發明之抗siglec-15抗體,以RANKL誘導的破骨細胞形成與以TNF-α誘導的破骨細胞形成兩者皆被有效果地抑制。因此,依據本發明之抗siglec-15抗體,於RA等經TNF-α誘導的骨喪失與骨破壞破壞可為RANKL阻斷劑(OCIF/OPG、抗RANKL抗體等)以上強力地抑制被期待。
抗siglec-15抗體,其一例為對骨代謝異常之治療可以該抗體單獨或至少一個與骨有關疾病之治療劑一起投與。又其一例為抗siglec-15抗體可與治療上有效量之抗骨代謝異常治療藥劑一起投與。可與抗siglec-15抗體一起投與的治療劑可列舉雙膦酸酯、活性型維生素D3
、抑鈣素及其衍生物、雌二醇等之荷爾蒙製劑、SERMs(選擇性雌激素受體調節劑)、PTH製劑、依普黃酮、維生素K2
(四烯甲萘醌)、鈣製劑及抗RANKL抗體等但未限於此。針對骨代謝異常之狀態或何種程度之治療,亦可投與2、3或以上種類之藥劑,經由將此等藥劑封入相同製劑中可一起供給。經由將此等藥劑與抗siglec-15抗體封入相同製劑中亦可一起供給。又,此等藥劑亦可經由封入治療用套組一起供給。又,此等藥劑與抗siglec-15抗體分別供給亦可。基因治療中投與的場合,蛋白質性之骨疾病治療劑之基因與抗siglec-15抗體之基因,可插入各別或相同啟動子區域下游,可導入各別或相同載體。
經由使骨疾病治療劑結合抗siglec-15抗體、或其片段,可製造M. C. Garnet「Targeted Drug conjugates:principlesand progress」,Advanced Drug Delivery Reviews,(2001)53,171-216記載之標的型藥物複合體。於此目的,抗體分子方面只要破骨細胞之認識性未完全消失,任一抗體片段亦可適用,例如,可舉Fab、F(ab’)2、Fv等片段為例,於本發明亦同樣地,可使用抗體及該片段。抗siglec-15抗體或該抗體之片段與骨疾病治療劑之結合樣式,M. C. Garnet「Targeted Drug conjugates:principles and progress」,Advanced Drug Delivery Reviews,(2001)53,171-216、G. T. Hermanson 「Bioconjugate Techniques」Academic Press,California (1996)、Putnam and J.Kopecek「Polymer Conjugates with Anticancer Activity」Advances in Polymer science(1995)122,55-123等記載之各種形態。即,可列舉抗siglec-15抗體與骨疾病治療劑以化學性直接或隔著寡胜肽等間隔物結合的樣式,或隔著適當藥物載劑結合的樣式。作為藥物載劑之例,可列舉微脂體(liposome)或水溶性高分子。作為隔著此等藥物載劑的樣式,更具體而言,可舉抗體與骨疾病治療劑包含於微脂體,該微脂體與抗體結合的樣式、及骨疾病治療劑與水溶性高分子(分子量1000至10萬左右之化合物)化學性直接或隔著寡胜肽等間隔物結合,該水溶性高分子結合抗體的樣式為例。抗體(或該片段)與骨疾病治療劑、微脂體及水溶性高分子等之藥物載劑之結合可經由G.T.Hermanson「Bioconjugate Techniques」Academic Press,CaliforniA(1996)、Putnam and J.Kopecek「Polymer Conjugates with Anticancer Activity」Advances in Polymer Science(1995)122,55-123記載之方法等本項業者周知之方法實施。將骨疾病治療劑包含於微脂體者可經由D.D.Lasic「Liposomes:From Physics to Applications」,Elsevier Science Publishers B.V.,Amsterdam(1993)等記載之方法等本項業者周知之方法實施。骨疾病治療劑之結合水溶性高分子者,可經由D.Putnam and J Kopecek「Polymer Conjugates with anticancer Activity」Advances in Polymer Science(1995)122,55-123記載之方法等本項業者周知之方法可實施。抗體(或該片段)與蛋白質性之骨疾病治療劑(或該片段)之複合體,於上述方法者,可經由基因工程之本項業者周知之方法製作。
本發明亦提供包含治療上有效量之抗Siglec-15抗體與藥學上容許的稀釋劑、載劑、可溶化劑、乳化劑、保存劑及/或補助劑之醫藥組成物。
本發明亦提供包含治療上有效量之抗Siglec-15抗體與治療上有效量之至少一種骨疾病治療劑與藥學上容許的稀釋劑、載劑、可溶化劑、乳化劑、保存劑及/或補助劑。作為骨疾病治療劑,可列舉雙膦酸酯、活性型維生素D3、抑鈣素及其衍生物、雌二醇等之荷爾蒙製劑、SERMs(selective estrogen receptor modulators)、依普黃酮、維生素K2(四烯甲萘醌)、鈣製劑、PTH(副甲狀腺荷爾蒙)製劑、非類固醇性抗炎症劑、抗TNFα抗體、抗PTHrP(副甲狀腺荷爾蒙相關蛋白質)抗體、IL-1受體拮抗劑、抗RANKL抗體及OCIF(osteoclastogenesis inhibitory factor)等,但未限於此等。
本發明之醫藥組成物中作為容許製劑使用之物質較佳為於投與量或投與濃度中對投與醫藥組成物者為非毒性者為較佳。
本發明之醫藥組成物可包含用以將pH、浸透壓、黏度、透明度、顏色、等張性、顏色、無菌性、安定性、溶解率、徐放率、吸收率、浸透率改變,或保持用之製劑用物質。製劑用物質可列舉以下之物,但未限於此等:甘胺酸、丙胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、精胺酸或離胺酸等之胺基酸類、抗菌劑、抗壞血酸、硫酸鈉或亞硫酸氫鈉等之抗氧化劑、磷酸、檸檬酸、硼酸緩衝液、碳酸氫鹽、Tris-鹽酸(Tris-Hcl)溶液等之緩衝劑、甘露糖醇或甘胺酸等之填充劑、乙二胺四乙酸(EDTA)等之螯合劑、咖啡因、聚乙烯吡咯啶、β-環糊精或羥基丙基-β-環糊精等錯化劑、葡萄糖、甘露糖或糊精等增量劑、單糖類、二糖類或葡萄糖、甘露糖或糊精等其他烴、著色劑、香味劑、稀釋劑、乳化劑或聚乙烯吡咯啶等親水聚合物、低分子量多胜肽、鹽形成對離子、氯化苄烷銨、苯甲酸、柳酸、硫柳汞、苯乙醇、對羥苯甲酸甲酯、對羥苯甲酸丙酯、醋酸氯己啶(Chlorhexidine)、山梨酸或過氧化氫等防腐劑、甘油、丙二醇或聚乙二醇等溶劑、甘露糖醇或山梨糖醇等糖醇、懸浮劑、PEG、山梨糖醇酐酯、聚山梨酸酯20或聚山梨酸酯80等聚山梨酸酯、三硝基甲苯(triton)、胺基丁三醇(tromethamine)、卵磷脂或膽固醇等界面活性劑、蔗糖或山梨糖醇等安定化增強劑、氯化鈉、氯化鉀或甘露糖醇.山梨糖醇等彈性增強劑、輸送劑、稀釋劑、賦形劑、及/或藥學上之補助劑。此等之製劑用物質之添加量以對抗Siglec-15抗體之重量為0.01~100倍,尤其以0.1~10倍添加較佳。製劑中適宜醫藥組成物之組成可由業者依適用疾病、適用投與路徑等適宜決定。
醫藥組成物中之賦形劑或載劑可為液體亦可為固體。適當賦形劑或載劑可為注射用之水或生理食鹽液、人工腦脊髓液或非經口投與通常用之其他物質。亦可使用含有中性之生理食鹽液或血清蛋白素之生理食鹽液為載劑。於醫藥組成物亦可含有pH7.0-8.5之Tris緩衝液或pH4.0-5.5之乙酸緩衝液或於此等中含有山梨糖醇或其他化合物者。本發明之醫藥組成物可列舉含有抗Siglec-15抗體之醫藥組成物以及含有Siglec-15抗體及至少一種骨疾病治療劑之醫藥組成物。本發明之醫藥組成物以經選擇的組成以必要純度作為適當藥劑,準備成凍乾品或液體。含抗Siglec-15抗體之醫藥組成物以及含抗Siglec-15抗體及至少一種骨代謝異常治療藥劑之醫藥組成物亦可使用蔗糖等適當賦形劑成型為凍乾品。
本發明之醫藥組成物可調製成非經口投與用,亦可調製成經口之消化道吸收用。製劑之組成及濃度可依投與方法來決定,本發明之醫藥組成物所含抗Siglec-15抗體對Siglec-15之親和性,即相對於Siglec-15之解離常數(Kd值),親和性越高(Kd值低),對人之投與量越少而可發揮藥效,故可基於此結果而決定本發明之醫藥組成物對人之投與量。投與量為將人類型抗Siglec-15抗體投與人之時,以約0.1~100mg/kg於1~180日投與1次為宜。
作為本發明之醫藥組成物之形態,可列舉包括點滴之注射劑、栓劑、經鼻劑、舌下劑、經皮吸收劑等。
作為本發明之其他之一態樣,以獲得抑Ssiglec-15之活動等物質為目的,包含基於該蛋白質之立體構造的藥物設計(drug design)之手法。如此手法,利用於已知合理藥物設計法(Rational Drug Design),酵素活性等、配位體、共同因子、或對DNA之結合等有效率地抑制或使活性化的化合物之探索。作為此例,已經上市的抗HIV劑的蛋白酶抑制劑較廣為人知。本發明之Siglec-15之三次元構造解析中,可利用X射線結晶解析或核磁共振法之一般較廣為人知的手法。又,抑制Siglec-15之機能的物質之探索中,亦可活用電腦藥物設計(CADD)之設計。作為此例,期待關節類風濕治療之新基因體新藥之抑制AP-1作用的低分子化合物(國際專利申請公開WO99/58515號)等為已知。由如此方法,直接結合siglec-15,或抑制Siglec-15與其他因子之相互作用,可獲得抑制siglec-15之機能等物質。
又,其他之一態樣係關於本發明之siglec-15會合的多胜肽,即關於siglec-15之配體蛋白質(partner protein)。即,本發明係關於調節siglec-15之活性的配體蛋白質之篩選方法。
此篩選方法之一態樣包含使Siglec-15與被驗蛋白質試料接觸,選擇結合Siglec-15之蛋白質的步驟。作為此等方法,例如,可列舉使用純化的Siglec-15,進行結合此等蛋白質之親和性純化的方法。顯示具體方法之一例,製作Siglec-15融合6個組胺酸而成的序列作為親和性標籤之物,將此細胞抽出液(預先注入鎳-瓊脂糖管柱,通過管柱之劃分)於4℃下培育12小時,其次,此混合物添加另外的鎳-瓊脂糖載劑於4℃下培育1小時。鎳-瓊脂糖載劑以洗淨緩衝液充分洗淨後,添加100mM咪唑,使與Siglec-15專一性結合的細胞抽出液中之蛋白質溶出而純化,而決定其構造。如此,經由與Siglec-15直接結合的蛋白質、及不具有與Siglec-15之結合活性,作為次單位之Siglec-15直接結合的蛋白質形成複合體,可純化間接結合Siglec-15的蛋白質。作為別的方法,亦可由遠端西方墨點法(Far Western blot technique)或使用酵母或哺乳類動物細胞之二雜交系統法選殖,但未限定於此等方法。
如此,若獲得與Siglec-15直接或間接相互作用的配體蛋白質之cDNA,可利用於機能性篩選抑制Siglec-15與該配體蛋白質之相互作用的物質。具體而言,例如,調製Siglec-15與麩胱甘肽S-轉移酶之融合蛋白質,以抗麩胱甘肽S-轉移酶抗體覆蓋的微平盤結合後,使生物素化該配體蛋白質與此融合蛋白質接觸,該融合蛋白質之結合以鏈黴抗生物素化鹼性磷酸酶檢出。生物素化該配體蛋白質添加之際,亦添加被驗物質,選擇促進或抑制融合蛋白質與該配體蛋白質之結合的物質。以此方法獲得對融合蛋白質直接作用的物質或對該配體蛋白質直接作用的物質。
融合蛋白質與該配體蛋白質之結合為間接,而隔著任何其他因子等場合,例如於含該因子的細胞抽出液存在下,同樣地進行上述試驗。此場合中,亦有可選擇對該因子作用等物質的可能性。
又,所得配體蛋白質具有促進Siglec-15機能之活性的場合,依據已記載之應用Siglec-15基因表現載體之試驗方法,可進行骨代謝異常治療劑,例如,作為骨質疏鬆症之治療劑為有用候補物質之篩選。又,所得配體蛋白質具有抑制Siglec-15機能的活性的場合,具有編碼此等抑制因子的核苷酸序列之多核苷酸可用於骨代謝異常之基因治療。
此等多核苷酸可經由下列獲得,例如解析經鑑定的抑制因子之胺基酸序列,合成編碼該胺基酸序列的核苷酸序列而成的寡核苷酸探針而進行cDNA庫或基因體庫之篩選。又,具有Siglec-15之機能之抑制活性的胜肽為隨機合成的人工胜肽庫由來時,化學合成編碼該胜肽之胺基酸序列的核苷酸序列而成的DNA。
基因治療中,將編碼如此所得抑制因子的基因併入例如病毒載體,將具有該重組病毒載體的病毒病毒(無毒化者)感染患者。於患者體內産生抗骨破壞因子,因具有破骨細胞之分化抑制機能,而使骨代謝異常之治療成為可能。
作為導入基因治療劑於細胞內之方法,亦可適用利用病毒載體之基因導入方法、或非病毒性之基因導入方法之任一方法。
作為經由病毒載體之基因導入方法,例如可列舉於反轉錄病毒、腺病毒、腺關連病毒、皰疹病毒、牛痘病毒、痘病毒、脊髓灰質炎病毒、辛德畢斯病毒(Sindbis virus)等DNA病毒或RNA病毒重組編碼Siglec-15之抑制因子或其變異體之DNA而導入的方法。其中,使用反轉錄病毒、腺病毒、腺關連病毒、牛痘病毒的方法為特佳。作為非病毒性之基因導入方法,可列舉直接肌肉內投與表現質體之方法(DNA疫苗法)、微脂體法、陽離子脂質體(Lipofectin)法、微注射法、磷酸鈣法、電氣穿孔法等,尤以DNA疫苗法、微脂體法為較佳。
又將基因治療劑實際作為醫藥而作用時,直接導入DNA於體內的活體內(in vivo)法及自人類取出某種細胞而於體外將DNA導入該細胞,再將此細胞放回體內之體外(ex vivo)法。
例如,該基因治療劑以活體內法投與時,視疾病、症狀等經由靜脈、動脈、皮下、皮內、肌肉內等之適當投與路徑投與。又以活體內法投與時,該基因治療劑為一般視為注射劑者,視必要亦可添加慣用載劑。又,為微脂體或膜融合微脂體(仙台病毒(Sendai virus)-微脂體等)之形態的場合,可作成懸濁劑、凍結劑、離心分離濃縮凍結劑等之微脂體製劑。
序列表之序列編號1或3所示核苷酸序列中互補核苷酸序列或該序列之部分序列中之互補苷酸序列可用於所謂的反義治療。反義分子可使用作為互補於選自序列表之序列編號1或3所示核苷酸序列的核苷酸序列之一部份之通常為15至30mer而成的DNA,或其硫代磷酸酯、膦酸甲酯或嗎啉衍生物等安定的DNA衍生物、2’-O-烷基RNA等之安定的RNA衍生物。此等反義分子經由微量注入、微脂體膠囊化,或利用具有反義序列的載體而使其表現等,以本發明技術領域中周知之方法,可導入細胞。此等反義療法,有用於由被過度增加序列表之序列編號1或3所示核苷酸序列編碼的蛋白質之活性所造成的疾病之治療。
又,亦可列舉使用二條鏈之短鏈RNA(siRNA)之方法(「Genes and Developments)」)、2001年1月15日、第15卷、第2號、p.188-200)。例如,經由製作抗Siglec-15之基因,依文獻記載之方法導入,可作為伴隨Siglec-15之過度表現的骨代謝性疾病之治療劑。
以下,本發明依實施例具體說明,但本發明並未限於此等實施例。又,下述實施例中與基因操作有關的各操作只要未特別指明,則依「分子選殖(Molecular Cloning)」(Sambrook,J.,FritSch,E.F.及Maniatis,T.著,Cold Spring Harbor Laboratory Press於1989年發刊)記載之方法進行,或使用市售試藥或套組時依市售品之指示書使用。
巨細胞瘤(Giant Cell tumor;GCT)特徵為組織學上大多出現破骨細胞樣之多核巨細胞的骨腫瘤,骨溶解性之骨破壞為臨床上所見(Bullough et al.,Atlas of Orthopedic Pathology 2nd edition,17.6-17.8,Lippincott Williams & Wilkins Publishers(1992))。關於具有與人類Siglec-15基因部分重複的核苷酸序列的EST探針(Affymetrix Genechip HG-U133探針215856_at:Affymetrix公司製),使用Genelogic公司製之資料庫(Genesis 2006 Release 3.0)進行GCT組織中之表現輪廓解析。又,於破骨細胞分化上扮演重要角色的RANK(Affymetrix Genechip HG-U133探針207037_at:Affymetrix公司製)及RANKL(Affymetrix Genechip HG-U133探針210643_at:Affymetrix公司製),又於為破骨細胞分化標記的組織蛋白酶K(Affymetrix Genechip HG-U133探針202450_s_at:Affymetrix公司製)及TKAP(Affymetrix Genechip HG-U133探針204638_at:Affymetrix公司製)之EST探針亦同樣地進行GCT組織中的表現輪廓解析。
於13例正常骨組織、12例GCT組織、16例GCT以外之骨腫瘤組織比較表現量之場合,已知與正常組織相比下GCT組織中RANK及RANKL之轉錄會特異性亢進(第1圖-A)。另一方面,認為骨吸收之亢進未必會發生的GCT以外之骨腫瘤組織中,因為與GCT相比下RANK及RANKL之轉錄低,暗示於GCT為破骨細胞之形成及活性化被促進的環境。又,比較組織蛋白酶K及TRAP之基因表現量時,於GCT被高轉錄(第1圖-B),暗示具有骨吸收活性的破骨細胞為多數出現。同樣地比較Siglec-15基因之轉錄量時,得知如同RANK、RANKL、組織蛋白酶K及TRAP之各基因,GCT被特異性地高轉錄(第2圖)。據此,GCT等之骨吸收為亢進的人類之病態中,暗示siglec-15參與。
a)於每1個75cm2
燒瓶接種10ml之來自小鼠單核球之細胞RAW264.7(ATCC Cat.No.TIB-71)(以含10%胎牛血清的α-MEM培養基調製為4.5×104
細胞/ml),人類RANKL(PeproTech公司製)以終濃度成為40ng/ml的方式添加,於CO2
培養箱中培養3日。又未添加人類RANKL之培養亦同樣地進行。
培養終了後,全RNA抽出用試藥(ISOGEN:Nippon Gene公司製)經由依試藥所添付的指示書使用,自於各自條件下培養的RAW264.7抽出全RNA。回收的全RNA於-80℃保存。
b)當將來自小鼠骨髓之初代培養細胞於活性型維生素D3
存在下培養時,會出現許多TRAP陽性多核破骨細胞(Takahashi et al.,Endocrinology,(1988)122,1373-1382)。
將8週齡雄性DDY小鼠於乙醚麻醉下頸椎脫臼而安樂死,摘出大腿骨及脛骨。除去軟組織後,切除大腿骨或脛骨兩端,使用具有25口徑注射針之注射筒將含10%胎牛血清的α-MEM培養基注入骨髓中,採取骨髓細胞。計測細胞數後,以含10%胎牛血清的α-MEM培養基調製為5×106
細胞/ml者於96孔平盤中分成100μl/孔×60孔接種,活性型維生素D3
(sigma公司製)以終濃度2×10-8
M之方式添加,於CO2
培養箱中培養8日。亦同樣地進行未添加活性型維生素D3
之培養。又,培養基交換及活性型維生素D3
之添加於第3及6日實施。
其次,全RNA抽出用試藥(ISOGEN:Nippon Gene公司製)經由依據試藥所添付之指示書使用,自於各自條件下培養的細胞抽出全RNA。回收的全RNA保存於-80℃至使用時。
實施例2之a)所製作的全RNA 1μg中加入1μl之1U/μl DNaseI、1μl之10×DNaseI緩衝液(Invitrogen公司製)以H2
O作成10μl,於室溫反應15分鐘後,添加1μl 25mM EDTA而於65℃加熱10分鐘。自此溶液分取8μl,添加1μl 50μM oligo(dT)20
引子及1μl 10mM dNTPs,於65℃下加熱5分鐘後,於冰中保溫。於此溶液中添加2μl 10×RT緩衝液(Invitrogen公司製)、4μl 25mM MgCl2
、2μl 0.1M二硫蘇糖醇、1μl RNase抑制劑(RNaseOUT、40U/μl,Invitrogen公司製)、1μl SuperScriptIII反轉錄酶(200U/μl,Invitrogen公司製)作成為全量20μl,於50℃反應50分鐘後,於85℃下加熱5分鐘,於冰中保溫1分鐘後,保存於-20℃。
具有作為以PCR增幅小鼠Siglec-15之ORF cDNA用之引子
5’-agaattccac cATGGAGGGG TCCCTCCAAC TC-3’(mSiglec-15-EcoRI kozak-F:序列表之序列編號5)
及5’-cgccgctcga gTTATTTCTC ATGGTGAATG AC-3’(mSiglec-15-XhoI-R:序列表之序列編號6)、之序列的寡核苷酸依常法合成。使用此引子之組合及a)製作的cDNA,使用High fidelity polymerase(Invitrogen公司製)依常法進行PCR。溫度循環器之設定條件為於94℃加熱2分鐘後,重複「94℃ 0.5分鐘、55℃ 0.5分鐘、68℃ 1.5分鐘」之溫度循環35次後,於68℃下加熱5分鐘,於4℃保溫。
將b)所得PCR反應液及pcDNA3.1(+)載體(Invitrogen公司製)以限制酶處理(EcoRI、XhoI),管柱純化後,依常法進行結合酶(ligase)反應。進行對大腸菌DH5α-T1之轉形,接種於含有安比西林的平盤。自如此所得大腸菌選殖株,單離保有小鼠Siglec-15/pcDNA3.1(+)質體的轉形大腸菌。
於所得質體插入的ORF cDNA之全核苷酸序列使用DNA定序機解析的結果,確認為序列表之序列編號3所示序列。此核苷酸序列與登錄於NCBI GenBank資料庫「小鼠CD33L3」(登錄編號:XM_884636)的預測序列之ORF編碼區相同,又,該核苷酸序列所編碼的胺基酸序列(序列表之序列編號4)與小鼠CD33L3之預測胺基酸序列100%一致。
a)於實施例2之a)及b)製作的全RNA 1μg中添加1μl 1U/μl DNaseI、1μl 10×DNaseI緩衝液(Invitrogen公司製)以H2
O作成10μl,於室溫反應15分鐘後,添加1μl 25mM EDTA而於65℃下加熱10分鐘。自此溶液分取8μl,添加1μl 50μM oligo(dT)20
引子及1μl 10mM dNTPs,於65℃下加熱5分鐘後、於冰中保溫。於此溶液中添加2μl 10×RT緩衝液(Invitrogen公司製)、4μl 25mM MgCl2
、2μl 0.1M二硫蘇糖醇、1μl RNase抑制劑(RNaseOUT、40U/μl,Invitrogen公司製)、1μl SuperScriptIII反轉錄酶(200U/μl,Invitrogen公司製)作成為全量20μl,於50℃反應50分鐘後,於85℃下加熱5分鐘,於冰中保溫。
使用如此製作的單鏈cDNA,以下列之引子及螢光標識探針(TaqMan探針,Applied Biosystems公司製)之組合實施即時PCR。
即時PCR條件:小鼠Siglec-15增幅用引子:5’-tcaggctcag gagtccaatt at-3’(TgM-mSiglec-15-F:序列表之序列編號7)及5’-ggtctagcct ggtactgtcc ttt-3’(TgM-mSiglec-15-R:序列表之序列編號8)、小鼠Siglec-15檢出用TaqMan探針:5’-Fam-atttgagcca gatgagtcct ccaggcca-TAMRA-3’(TgM-mSiglec-15-探針:序列表之序列編號9)、
小鼠L32核糖體蛋白質增幅用引子:
5’-aagaagttca tcaggcacca gt-3’(TgM-mL32-F:序列表之序列編號10)
及
5’-cttgacattg tggaccagga ac-3’(TgM-mL32-R:序列表之序列編號11)
小鼠L32核糖體蛋白質檢出用TaqMan探針:
5’-Fam-aaacccagag gcattgacaa cagggtgc-TA M RA-3’(TgM-mL32-探針:序列表之序列編號12)
使用即時PCR系統(ABI PRISM7700序列偵測器、(股)Perkin Elmer Japan. Applied Biosystems事業部製)以下列條件進行即時PCR解析。又於反應時,使用TaqMan Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems公司製)。首先各添加25pmol之引子、8ng之單鏈cDNA及10pmol之TaqMan探針於蒸餾水作成25μl,添加25μlTaqMan Universal PCR Master Mix調製50μl之反應液。此反應液於50℃加熱2分鐘後於95℃加熱10分鐘,重複40次「95℃ 0.25分鐘、60℃ 1分鐘」之溫度循環而實施即時PCR解析。又,小鼠Siglec-15之mRNA表現量以L32核糖體蛋白質之mRNA表現量補正。
由此結果,Siglec-15基因之表現量,於RAW264.7添加RANKL而誘導破骨細胞的場合,或來自小鼠骨髓之初代培養細胞中添加活性型維生素D3
而誘導破骨細胞的場合之任一者皆顯著提升表現量(第3圖)。
b)將RAW264.7以含10%胎牛血清之α-MEM培養基調製為4.5×104
細胞/ml,於每1個75cm2
燒瓶中接種10ml,以人類RANKL(PeproTech公司製)終濃度為40ng/ml的方式添加,於CO2
培養箱中培養0、1、2、3日。又亦同樣進行未添加人類RANKL之培養。
培養終了後,全RNA抽出用試藥(ISOGEN:Nippon Gene公司製)經由依據試藥所添付之指示書使用,自於各自條件下培養的RAW264.7抽出全RNA。回收的全RNA保存於-80℃。
於經回收的全RNA 1μg中,添加1μl 1U/μl DNaseI、1μl 10×DNaseI緩衝液(Invitrogen公司製)以H2
O作成10μ
l,於室溫使反應15分鐘後,添加1μl 25mM EDTA於65℃加熱10分鐘。自此溶液分取8μl,添加1μl 50μM oligo(dT)20
引子及1μl 10mM dNTPs,於65℃下加熱5分鐘後,於冰中保溫。此溶液中添加2μl 10×RT緩衝液(Invitrogen公司製)、4μl 25mM MgCl2
、2μl 0.1M二硫蘇糖醇、1μl RNase抑制劑(RNaseOUT,40U/μl,Invitrogen公司製)、1μl SuperScriptIII反轉錄酶(200U/μl,Invitrogen公司製)作成全量為20μ
l,50℃下反應50分鐘後,於85℃加熱5分鐘,於冰中保溫。
使用如此製作的單鏈cDNA,以下列引子及螢光標識探針(TaqMan探針,Applied Biosystems公司製)之組合實施即時PCR。
即時PCR條件:小鼠組織蛋白酶K增幅用引子:5’-ggcatctttc cagttttaca gc-3’(TgM-mcatK-F:序列表之序列編號13)
及
5’-gttgttctta ttccgagcca ag-3’(TgM-mcatK-R:序列表之序列編號14)、
小鼠組織蛋白酶K檢出用TaqMan探針:
5’-Fam-atgtgaacca tgcagtgttg gtggtggg-TAMRA-3’(TgM-mcatK-探針:序列表之序列編號15)、
小鼠TRAP增幅用引子:
5’-gaacttcccc agcccttact ac-3’(TgM-mTRAP-F:序列表之序列編號16)
及
5’-aactgctttt tgagccagga c-3’(TgM-mTRAP-R:序列表之序列編號17)
小鼠TRAP檢出用TaqMan探針:
5’-Fam-ttgccagtca gcagcccaaa atgcct-TAMRA-3’(TgM-mTRAP-探針:序列表之序列編號18)、
小鼠siglec-15增幅用引子:
5’-tcaggctcag gagtccaatt at-3’(TgM-msiglec-15-F:序列表之序列編號7)
及
5’-ggtctagcct ggtactgtcc ttt-3’(TgM-msiglec-15-R:序列表之序列編號8)、
小鼠siglec-15檢出用TaqMan探針:
5’-Fam-atttgagcca gatgagtcct ccaggcca-TAMRA-3’(TgM-mSiglec-15-探針:序列表之序列編號9)、
小鼠L32核糖體蛋白質增幅用引子:
5’-aagaagttca tcaggcacca gt-3’(TgM-mL32-F:序列表之序列編號10)
及
5’-cttgacattg tggaccagga ac-3’(TgM-mL32-R:序列表之序列編號11)
小鼠L32核糖體蛋白質檢出用TaqMan探針:
5’-Fam-aaacccagag gcattgacaa cagggtgc-TAMRA-3’(TgM-mL32-探針:序列表之序列編號12)
使用即時PCR系統(ABI PRISM7700序列偵測器、(股)Perkin Elmer Japan.Applied Biosystems事業部製)以下列條件進行即時PCR解析。又於反應時,使用TaqMan Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems公司製)。首先各添加25pmol之引子、8ng之單鏈cDNA及10pmol之TaqMan探針於蒸餾水作成25μl,添加25μl TaqMan Universal PCR Master Mix調製50μl之反應液。此反應液於50℃加熱2分鐘後於95℃加熱10分鐘,重複40次「995℃ 0.25分鐘、60℃ 1分鐘」之溫度循環而實施即時PCR解析。又,各基因之mRNA表現量以L32核糖體蛋白質之mRNA表現量補正。
此結果,已知作為破骨細胞之標記分子的組織蛋白酶K及TRAP基因於添加RANKL後第2~3日顯著提升表現量(第4圖-A、B)。同樣地,Siglec-15基因亦於添加RANKL後第2~3日顯著提升表現量(第5圖)。據此,可知Siglec-15基因伴隨破骨細胞分化表現上昇,尤其是分化後期強烈表現。
編碼小鼠Siglec-15蛋白質細胞外領域部分之核酸序列為序列表之序列編號19,胺基酸序列為序列表之序列編號20。經由利用此等部分序列,於動物細胞等培養上清中可產生可溶型小鼠Siglec-15蛋白質。
具有作為小鼠Siglec-15之細胞外領域cDNA於PCR增幅用之引子
5’-ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt caccATGGAG GGGTCCCTCC AACTC-3’(mSiglec-15-ECD-F:序列表之序列編號21)及5’-ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc TCCGGGGGCG CCGTGGAAGC GGAAC-3’(mSiglec-15-ECD-R:序列表之序列編號22)、之序列的寡核苷酸依常法合成。又,此等引子以作為Gateway Entry選殖株製作用增幅用引子,於mSiglec-15-ECD-F附加attB1序列,於mSiglec-15-ECD-R附加attB2序列的方式設計。此引子之組合,使用實施例3所製作的小鼠Siglec-15/pcDNA3.1(+)質體作為模板,依常法進行PCR。溫度循環器之設定條件為,於94℃加熱5分鐘後,重複「94℃ 0.5分鐘、55℃ 0.5分鐘、68℃ 1.5分鐘」之溫度循環15次後,於68℃下加熱5分鐘,於4℃保溫。
由應用λ噬菌體之部位特異性重組系統的Gateway Technology(Invitrogen公司),以下列方法製作組合小鼠Siglec-15細胞外領域之cDNA的Entry選殖株。首先,a)所製作之於attB序列兩端具有的PCR産物,與具有attP序列的供予者載體的pDNOR221(Invitrogen公司製)之間,進行使用BP Clonase的BP反應。使用此反應液轉形大腸菌DH10B,對藥劑耐性選殖株進行菌落PCR(clony PCR),確認插入物大小。於確認插入物大小為正確的選殖株,實施插入物之全DNA序列之序列解析的結果,獲得與編碼作為目的之小鼠Siglec-15蛋白質之細胞外領域的核酸序列(序列表之序列編號19)完全一致的Entry選殖株。
由應用λ噬菌體之部位特異性重組系統的Gateway Technology(Invitrogen公司),以下列方法製作組合小鼠Siglec-15細胞外領域之cDNA的表現選殖株。b)製作的Entry選殖株於插入物之兩端具有attL序列。此Entry選殖株,與具有attR序列的2種類目的載體之間進行使用LR Clonase之LR反應。又目的載體,使用以插入物之C末側附加V5抗原決定位及6×His標籤的方式設計的pDONM、及插入物之C末側附加人類Fc標籤的方式設計的phIgFc之2種類。使用由LR反應所得反應液轉形大腸菌DH10B,對所得藥劑耐性選殖株進行菌落PCR,確認插入物大小。於確認插入物大小為正確的選殖株,進行由插入物側之載體側兩末端之序列解析。
定序用引子序列:
5’-tgcgtgaagg tgcagggcag-3’(mSiglec-15-ECD-seq-upstm:序列表之序列編號23)
及
5’-cctcgcctgg tcgggtc-3’(msiglec-15-ECD-seq-dnstm:序列表之序列編號24)
序列解析之結果,各自獲得pDONM及phIgFc兩者為正確重組的表現選殖株(可溶型小鼠siglec-15/pDON M及可溶型小鼠siglec-15/phIgFc)。經由將可溶型小鼠siglec-15/pDONM轉染於動物細胞等,具有序列表之序列編號25所記載之鹼基序列的mRNA被轉錄,具有序列表之序列編號26所記載之胺基酸序列的蛋白質(小鼠Siglec-15-His)被轉譯。經由將可溶型小鼠Siglec-15/phIgFc轉染於動物細胞等,具有序列表之序列編號27所記載之鹼基序列的mRNA被轉錄,具有序列表之序列編號28所記載之胺基酸序列的蛋白質(小鼠Siglec-15-Fc)被轉譯。
a)使用293-F細胞之蛋白質表現
實施例5所得2種類之表現質體(可溶型小鼠Siglec-15/pDONM及可溶型小鼠Siglec-15/phIgFc)各自調製約100μg。將各50μg調製的質體與Opti-MEM(Invitrogen公司製)混合,添加為過濾器滅菌後轉染試藥的293fectin(Invitrogen公司製)64μl於室溫培育25分鐘。將此等混和液於FreeStyle293 Expression Media(Invitrogen公司製)中以成為1.0×106
細胞/ml×50ml的方式添加於振盪燒瓶中培養的FreeStyle 293-F細胞(Invitrogen公司製),於8.0%CO2
濃度、37℃下旋轉(125次旋轉/分鐘)培養96小時(4日)。培養液每隔24小時(培養時間:0、24、48、72、96小時)回收少量,離心分離後調製培養上清液。於此等調製的培養上清液中,小鼠Siglec-15之細胞外領域C末側附加V5抗原決定位及6×His
標籤的蛋白質(小鼠Siglec-15-His)及C末側附加人類Fc標籤的蛋白質(小鼠Siglec-15-Fc)被認為各自表現。
b)依小鼠siglec-15-His表現293F細胞之培養時間的表現量變動
使用於a)調製的小鼠Siglec-15-His表現293F細胞之培養液(培養時間:0、24、48、72、96小時)樣品與市售含有His標籤之蛋白質基因重組型人類護骨素(osteoprotegerin)/His(OPG-Fc-His)(R & D Systems公司製),進行由還原條件下之SDS-聚丙烯酸醯胺電泳與西方墨漬法的表現量之解析。即,各培養液以Microcon YM-10(Millipore公司製)20倍濃縮的樣品及OPG-Fc-His溶液5μ1添加同量之SDS-處理液(1mM EDTA、2.5%SDS、0.1%溴酚藍、及含5%2-巰基乙醇的10mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)),於95℃加熱10分鐘。使用熱處理的各樣品0.8μl於SDS-聚丙烯酸醯胺電泳。使用8-25%聚丙烯酸醯胺梯度膠體(Amersham Bioscience公司製)作為電泳凝膠,電泳使用PhastSystem(Amersham Bioscience公司製)來實施。又使用作為分子量標記之ECL DualVue Western Blotting Markers(Amersham Bioscience公司製)。電泳終了後使用PhastTransfer Semi-dry Transfer Kit(Amersham Bioscience公司製)及PhastSystem將凝膠中之蛋白質轉移(墨漬(blot))於PVDF膜(Hybond-P,Amersham Bioscience公司製)。將此PVDF膜移至含0.1% Tween 20之阻斷劑(BlockAce,雪印乳業公司製)10ml中,於室溫緩慢振動1小時。於此阻斷溶液添加S-protein HRP溶液(ECL DualVue Western Blotting Markers,Amersham Bioscience公司製)5μl及抗6His-HRP抗體(PentaHis HRP Conjugate Kit,QIAGEN公司製)2μl,於室溫進一步緩慢振動1小時。此PVDF膜於含0.01% Tween 20之磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)50ml中一邊緩慢振動5分鐘一邊洗淨4次。洗淨後,將PVDF膜依ECL偵測套組(ECL Western blotting detection reagents and analysis system,Amersham Bioscience公司製)之指示書處理而使含有His標籤之蛋白質之帶發色,此發色使用ECL mini-camera(Amersham Bioscience公司製)及Polaroid Film(Polapan 3200B,Polaroid公司)檢出。結果示於第6圖。由此結果,將對抗6His-HRP抗體反應的分子量約35kDa之蛋白質(小鼠Siglec-15-His)選擇96小時作為最高濃度所
生產的293F細胞之培養時間。
使用於a)所調製的小鼠Siglec-15-Fc表現293F細胞之培養液(培養時間:0、24、48、72、96小時)樣品及人類IgG(Sigma公司製),進行於非還原條件下之SDS-聚丙烯酸醯胺電泳及西方墨漬法的表現量之解析。即,各培養液樣品與人類IgG溶液5μl添加同量之SDS-處理液,於95℃加熱10分鐘。使用熱處理的各樣品0.8μl與前述b)記載之方法同樣之方法實施SDS-聚丙烯酸醯胺電泳、對PVDF膜之轉移(墨漬(blotting))、及PVDF膜之阻斷。經阻斷之PVDF膜上添加S-protein HRP溶液(ECL DualVue Western Blotting Markers,Amersham Bioscience公司製)5μl及抗人類IgG Fc-HRP抗體(anti-Human IgG(Fc Specific)Peroxidase Conjugate,Sigma公司製)2μl,於室溫進一步緩慢振動1小時。與前述b)記載之方法同樣洗淨後,檢出含有Fc之蛋白質之帶之發色。結果示於第7圖。由此結果,對抗人類Fc抗體反應的分子量約110kDa之蛋白質(小鼠Siglec-15-Fc)選擇96小時作為最高濃度所生產的293F細胞之培養時間。
將實施例5所得2種類之表現質體(可溶型小鼠Siglec-15/pDONM及可溶型小鼠Siglec-15/phIgFc)各自調製為約5mg。又,自大量培養的大腸菌之質體純化上使用Invitrogen PureLink HiPure Plasmid Gigaprep Kit(Invitrogen公司製)。經調製的質體與Opti-MEM(Invitrogen公司製)混合,過濾器滅菌後轉染試藥的293fectin(Invitrogen公司製)以10ml添加於室溫培育20分鐘。將此混和液於FreeStyle 293 Expression Media(Invitrogen公司製)中以1.1×106
細胞/ml×5L(1L/燒瓶為5瓶)的方式添加於愛倫美氏燒瓶(Erlenmeyer flask)中培養的FreeStyle 293-F細胞(Invitrogen公司製)。於8.0%CO2
濃度、37℃下旋轉培養(125次旋轉/分鐘)96小時(4日)後回收培養液,調製離心分離後培養上清液。於如此調製的培養上清液中,小鼠Siglec-15之細胞外領域C末側附加V5抗原決定位及6×His標籤的蛋白質(小鼠Siglec-15-His)及C末側附加人類Fc標籤的蛋白質(小鼠Siglec-15-Fc)被認為各自表現。
於實施例7調製的小鼠siglec-15-His表現293F細胞之培養液2L中添加225ml之10x緩衝液(500mM TriS,1.5M NaCl,200mM咪唑,pH8.0)充分攪拌後以Sterivex GV過濾器(Millipore公司製)過濾。於預先致熱質除去劑.PyroCLEAN(ALerCHEK公司製)處理的注射用蒸餾水洗淨的HisTrap HP 5ml之3根直列管柱(Amersham Bioscience公司製)中以流速2ml/min注入此培養液。使用60ml含300mM NaCl的50mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)以流速1ml/min洗淨管柱後,使用50ml含有300mM NaCl、500mM咪唑之50mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)以流速1ml/min將吸附管柱的蛋白質溶出。溶出液於預先添加10μl之10% Tween 20的Mini-sorp tube(Nunc公司製)分取為1ml/Fr.。將含溶出的蛋白質的劃分約20ml(Fr.14-20)以離心膜濃縮器Amicon Ultra-15(Millipore公司製)濃縮為2.5ml後,加在以含0.01% Tween 20的磷酸鹽緩衝生理食鹽水(T-PBS)平衡化的PD-10脫鹽管柱(Amersham Bioscience公司製)上,以T-PBS溶出,獲得溶劑置換為T-PBS的樣品3.5ml。
以HisTrap HP層析柱純化的T-PBS置換樣品3.5ml中添加22.5ml含有0.1% CHAPS的50mM Tris-HCl緩衝液(pH7.5)並攪拌後,於4℃以3,000r.p.m.離心30分鐘除去沈澱物。此上清液以Millex GV過濾器(Millipore公司製)過濾後以流速1ml/min加到含有0.1% CHAPS的50mM Tris-HCl緩衝液(pH7.5)預先平衡化的Resource Q 6ml管柱(Amersham Bioscience公司製)中,連續使用此緩衝液以流速1ml/min洗淨管柱,收集未吸附於管柱的蛋白質劃分。吸附於管柱的蛋白質,使用含有0.1% CHAPS,1M NaCl的50mM Tris-HCl緩衝液(pH7.5)以流速1ml/min溶出。將未吸附管柱的劃分26.5ml,以離心膜濃縮器Amicon Ultra-15(Millipore公司製)濃縮為2.0ml後,於4℃以
3,000r.p.m.離心10分鐘而除去沈澱物。離心後之上清液於使用前凍結保存於-80℃。重複2次如上之純化操作(HisTrap HP層析柱、Resource Q層析柱)而實施。
使用於上述之純化操作(HisTrap HP層析柱、Resource Q層析柱)調製的樣品於還原條件下進行SDS-聚丙烯酸醯胺電泳及銀染色。即,於各純化階段之樣品5μl添加同量之SDS-處理液,於95℃熱處理10分鐘。使用經熱處理的各樣品0.3μl於SDS-聚丙烯酸醯胺電泳。除了電泳之操作使用為分子量標記的Rainbow分子量標記(Amersham Bioscience公司製)外,以相同於前述實施例6之b)之方法實施。電泳終了後,使用PhastGel Silver Kit(Amersham Bioscience公司製)及PhastSystem進行銀染色,此結果示於第8圖。顯示未吸附於Resource Q管柱之蛋白質劃分中分子量約35kDa之蛋白質(小鼠Siglec-15-His)被有效率地純化濃縮。
除了使用作為分子量標記之ECL DualVue Western Blotting Markers,Amersham Bioscience公司製)外,將與上述相同條件下電泳的凝膠中之蛋白質,使用PhastTransferSemi-dry Transfer Kit(Amersham Bioscience公司製)並轉移於PVDF膜(Hybond-P,Amersham Bioscience公司製)(墨漬)。此PVDF膜以含0.1% Tween 20的阻斷劑(BlockAce,雪印乳業公司製)10ml中於室溫下緩慢振動1小時。於此阻斷溶液中添加S-protein HRP(Amersham Bioscience公司)10μl及抗V5-HRP抗體(Monoclonal Antibody to PK-TAG-HRP,Acris Antibodies公司製)10μl,進一步於室溫緩慢振動1小時。一邊將PVDF膜於含0.01% Tween 20的磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)50ml中緩慢振動一邊以5分鐘洗淨4次。洗淨後此PVDF膜依ECL detection Kit(A mersham Bioscience公司)之指示書處理,蛋白質之帶之發色以ECL mini-camera(Amersham Bioscience公司)Polaroid Film(Polapan 3200B,Polaroid公司)檢出。結果示於第9圖。由此結果亦可確認對抗V5-HRP抗體反應的分子量約35kDa之蛋白質(小鼠Siglec-15-His)於未吸附於Resource Q管柱之蛋白質劃分中被有效率地純化濃縮。
於純化小鼠Siglec-15-His(未吸附於Resource Q管柱之蛋白質劃分),使用牛血清白蛋白作為標準樣品,以DC-蛋白質試驗套組(BioRad公司製)測定蛋白質濃度。如表1所示,以2次純化操作獲得合計1.66mg之純化小鼠Siglec-15-His蛋白質。
將實施例7所調製的小鼠siglec-15-Fc表現293F細胞之培養液1.8L以sterivex GV過濾器(Millipore公司製)過濾後流速5ml/min加到預先以Dulbecco PBS(D-PBS,Invitrogen公司製)平衡化的HiTrap蛋白質A 5ml管柱(Amersham Bioscience公司製)。使用D-PBS以流速5ml/min洗淨管柱後,使用50ml 0.1M檸檬酸鈉緩衝液(pH3.0)以流速5ml/min將吸附於管柱的蛋白質溶出。溶出液於Mini-sorp tube(Nunc公司製)以5ml/Fr.分取後,直接加入1M Tris1.3m;中和。經溶出的蛋白質被檢出的劃分(Fr.1,2)以離心膜濃縮器Amicon Ultra-15(Millipore公司製)濃縮為2.5ml後,於含0.01%Tween 20的大塚注射用生理食鹽水(TO-SS,大塚製藥公司製)平衡化的PD-10脫鹽管柱(Amersham Bioscience公司製)以TO-SS溶出,獲得將溶劑置換為TO-SS的樣品3.5ml。此樣品於使用前凍結保存於-80℃。使用2.9L之293F細胞培養液,再實施1次重複相同之純化操作。
使用上述純化操作所調製的樣品進行還原條件下之SDS-聚丙烯酸醯胺電泳及銀染色。即,於各純化步驟之樣品5μl添加同量之SDS-處理液,於95℃加熱10分鐘。使用經熱處理的各樣品以1/2濃度之SDS-處理液稀釋1/300或1/900倍的樣品0.3μl於SDS聚丙烯酸醯胺電泳。電泳及銀染色以相同於實施例8之c)記載之小鼠Siglec-15-His之純度檢定的方法實施,此結果與以小規模之預備純化條件檢討之結果(應用的培養液之pH為8.9或7.0)一起示於第10圖。顯示自HiTrap蛋白質A管柱溶出的蛋白質劃分中分子量約55kDa之蛋白質(小鼠Siglec-15-Fc)被有效率地純化濃縮。
於經純化小鼠Siglec-15-Fc(自PD-10脫鹽管柱溶出的蛋白質劃分),使用牛血清白蛋白作為標準樣品,以DC-蛋白質試驗套組(BioRad公司製)測定蛋白質濃度。如表2所示,2次純化操作獲得合計92mg之經純化小鼠Siglec-15-Fc蛋白質。
於實施例9製作的小鼠Siglec-15-Fc蛋白質以成為100μg/0.5ml的方式調製,添加同量佐劑於玻璃注射器而製作成乳劑。又佐劑僅於初次免疫時使用弗式完全佐劑(Freund’s Complete Adjuvant)(FCA,DIFCO公司製),第2次以後使用弗式不完全佐劑(Freund’s Incomplete Adjuvant)(FICA,DIFCO公司製)。
使用3隻兔(日本白色種雌性體重3Kg)作為免疫動物。又,免疫前實施採血,獲得免疫前血清1ml/隻。將於a)所得乳劑1ml/隻使用27G注射針注射於皮下及皮內。14日後每次實施合計8次的免疫。自第8次之免疫7日後實施全採血,每1隻獲得76~79ml之抗血清。免疫前血清中及抗血清中之抗體力價以將抗原固相化的ELISA法確認的結果,確認3隻兔皆提升抗血清中之抗體力價。抗血清迄使用前保存於-20℃。
於實施例10所調製的兔抗血清3批各20ml中添加20ml之Dulbecco PBS(D-PBS,Invitrogen公司製)而混合,以sterivex GV過濾器(Millipore公司製)過濾後,以流速5ml/min注入預先D-PBS平衡化的HiTrap蛋白質A5ml管柱(Amersham Bioscience公司製)。使用37.5ml之D-PBS以流速2.5ml/min洗淨管柱後,使用50ml之0.1M檸檬酸鈉緩衝液(pH3.0)於流速2.5ml/min使吸附於管柱的蛋白質溶出。溶出液於Mini-sorptube(Nunc公司製)分取2.5ml/Fr.後,直接添加1M Tris0.65ml中和。含溶出的蛋白質之劃分約10ml(Fr.2~5)以離心膜濃縮器Amicon Ultra-15(Millipore公司製)濃縮為2.5ml後,以含0.01% Tween20的大塚注射用生理食鹽水(TO-SS)平衡化的PD-10脫鹽管柱(Amersham Bioscience公司製)以TO-SS溶出,獲得將溶劑置換為TO-SS的樣品3.5ml。經調製的樣品迄使用前凍結保存於-80℃。
使用上述a)之純化操作所調製的樣品(No.1、2、3之3批)進行於還原條件下之SDS-聚丙烯酸醯胺電泳及銀染色。即,於各純化步驟之樣品5μ1添加同量之SDS-處理液(含1mM EDTA、2.5%SDS、0.1%溴酚藍、及5%2-巰基乙醇之10mM Tris-HC1緩衝液(pH8.0)),於95℃加熱10分鐘。使用經熱處理的各樣品以1/2濃度之SDS-處理液稀釋為1/100、1/300、或1/900倍的樣品0.3μ1於SDS-聚丙烯酸醯胺電泳。電泳及銀染色以相同於實施例8之c)記載之小鼠Siglec-15-His之純度檢定的方法實施。顯示自PD-10脫鹽管柱溶出的蛋白質劃分有效率地純化濃縮分子量約45kDa之重鏈及分子量約21kDa之輕鏈所構成的IgG蛋白質。
於經純化抗小鼠Siglec-15多株抗體(自PD-10脫鹽管柱溶出的蛋白質劃分),使用牛IgG作為標準樣品,以DC-蛋白質試驗套組(BioRad公司製)測定蛋白質濃度。如表3所示,No.1~3批每次可純化100~170mg之抗小鼠Siglec-15多株抗體。
實施確認上述a)項所調製的抗小鼠Siglec-15多株抗體非僅結合Fc標籤亦結合Siglec-15蛋白質之細胞外領域的試驗。於經純化小鼠Siglec-15-His樣品(實施例8)及Siglec-15-Fc樣品(實施例9)5μl添加同量SDS-處理液(5% 2-巰基乙醇添加或非添加),於95℃加熱10分鐘。將經熱處理的各樣品0.3μl用於SDS-聚丙烯酸醯胺電泳,實施以相同於前述實施例6之b)記載之方法電泳及對PVDF膜之轉移(墨漬)。將此PVDF膜於8ml含0.1% Tween 20的阻斷劑(BlockAce,雪印乳業公司製)中在室溫下緩慢振動1小時。於此阻斷溶液添加抗小鼠Siglec-15多株抗體No.1(表3)1.6μl,進一步於室溫緩慢振動1小時。將此PVDF膜於50ml含0.01% Tween 20的PBS中一邊緩慢振動5分鐘一邊洗淨4次。經洗淨的PVDF膜浸漬於8ml抗體稀釋劑ECL先進阻斷劑(ECL Advance Western Blotting Detection Kit,Amersham Bioscience公司製),以抗兔IgG-HRP(Amersham Bioscience公司製)最終濃度成為1/200,000的方式添加,添加0.8μl之S-protein HRP溶液(ECL DualVue Western Blotting Markers,Amersham Bioscience公司製),進一步於室溫緩慢振動1小時。將此PVDF膜於50ml含0.01% Tween 20的PBS中一邊緩慢振動5分鐘一邊洗淨4次。洗淨後,PVDF膜依ECL Advance Western Blotting Detection Kit(Amersham Bioscience公司製)之指示書處理,蛋白質帶之發色以ECL mini-camera(Amersham Bioscience公司製)及Polaroid Film(Polapan 3200B,Polaroid公司製)檢出。結果示於第11圖。由此結果,顯示經純化抗小鼠Siglec-15多株抗體亦結合小鼠Siglec-15-His,確認抗小鼠Siglec-15多株抗體不僅Fc標籤亦結合Siglec-15蛋白質之細胞外領域。重複實施同樣試驗,確認抗小鼠Siglec-15多株抗體No.2及No.3亦結合小鼠Siglec-15-His。
實施例10之小鼠Siglec-15-Fc之免疫開始前,自使用的3隻兔預先採血調製免疫前之血清。混合此血清各0.8ml後添加Dulbecco PBS(D-PBS,Invitrogen公司製)2.4ml,以Millex GV過濾器(Millipore公司製)過濾。將此血清樣品以流速1ml/min加到預先以D-PBS平衡化的HiTrap蛋白質A 5ml管柱(Amersham Bioscience公司製)。使用50ml之D-PBS以流速2.5ml/min洗淨管柱後,使用50ml之0.1M檸檬酸鈉緩衝液(pH3.0)以流速2.5ml/min溶出吸附於管柱之蛋白質。溶出液於Mini-sorp tube(Nunc公司製)以2.5ml/Fr.分取後,直接添加0.65ml之1M Tris中和。含溶出蛋白質之劃分(Fr.2~4)以離心膜濃縮器Amicon Ultra-15(Millipore公司製)濃縮為2.5ml後,加到以含0.01%Tween 20的大塚注射用生理食鹽水(TO-SS)平衡化的PD-10脫鹽管柱(Amersham Bioscience公司製)而以TO-SS溶出,獲得將溶劑置換為TO-SS之樣品3.5ml。於經純化的此免疫前兔IgG樣品,以前述實施例8之c)記載之方法進行聚丙烯酸醯胺電泳及銀染色而確認IgG蛋白質被充分純化後,測定蛋白質濃度。經純化樣品於使用前凍結保存於-80℃。
將0.54ml實施例9記載之18.5mg/ml經純化小鼠Siglec-15-Fc溶液(合計10mg蛋白質)之溶劑以PD-10脫鹽管柱置換偶合緩衝液(0.2M NAHCO3
,0.5M NaCl,pH8.3)後,使用離心膜濃縮器Amicon Ultra 4(Millipore公司製)濃縮為1ml。NHS-Activated HiTrap管柱(1ml,Amersham Bioscience公司製)內之異丙醇置換為1mM鹽酸後,將含10mg/ml之小鼠siglec-15-Fc的偶合緩衝液1ml注入注射器管柱。於室溫使反應30分鐘後,為了使過剩活性基不活化,依Amersham Bioscience公司之指示書,依序注入各6ml之阻斷緩衝液(含0.5M NaCl的乙醇胺緩衝液,pH8.3)、洗淨緩衝液(含0.5M NaCl之乙酸鈉緩衝液,pH4.0)、阻斷緩衝液後,於室溫放置30分鐘。之後,再度依序注入各6ml之洗淨緩衝液、阻斷緩衝液、洗淨緩衝液於管柱,最後將管柱內之緩衝液置換為含有1M NaCl及0.01% Tween 20的50mM Tris-HCl緩衝液(pH7.0)。此管柱迄使用時保存於4℃。
於各2ml之實施例11所調製的純化抗小鼠siglec-15多株抗體No.1、2、3中添加8ml Apply Buffer(含0.15M NaCl的10mM Tris-HCl緩衝液,pH7.2)後,以流速0.25ml/min注入到預先以Apply Buffer平衡化的親和性管柱(實施例13)。使用5ml Apply Buffer以流速0.25ml/min洗淨管柱後,首先使用5ml含0.5MNaCl的0.1M甘胺酸鹽酸緩衝液(pH2.7)以流速0.25ml/min溶出吸附於管柱的蛋白質,連續以5ml含0.5M NaCl的0.1M檸檬酸鈉緩衝液(pH2.0)以流速0.25ml/min溶出吸附於管柱的蛋白質。抗小鼠siglec-15多株抗體No.3以親和性管柱純化的色譜圖示於第12圖。溶出液於Mini-sorp tube(Nunc公司製)以0.5ml/Fr.分取後,於甘胺酸鹽酸緩衝液溶出劃分0.5ml,直接添加16μl之1MTris中和,於檸檬酸鈉緩衝液溶出劃分0.5ml中直接添加150μl之1M Tris中和。以含0.5M NaCl的0.1M甘胺酸鹽酸緩衝液(pH2.7)將大多數抗小鼠siglec-15多株抗體溶出。將2.5ml(Fr.3~7)以甘胺酸鹽酸緩衝液溶出的IgG蛋白質被檢出的劃分約各別注入以含0.01% Tween 20的大塚注射用生理食鹽水(TO-SS)平衡化的PD-10脫鹽管柱(Amersham Bioscience公司製)而以TO-SS溶出,獲得3.5ml將溶劑置換為TO-SS之樣品。於以檸檬酸鈉緩衝液溶出的IgG蛋白質劃分約2.5ml(Fr.16~19),將3批分全部混合使用離心膜濃縮器Amicon Ultra-4(Millipore公司製)濃縮為2.5ml後,注入以TO-SS平衡化的PD-10脫鹽管柱(AmershamBioscience公司製)而以TO-SS溶出,獲得將溶劑置換為TO-SS之樣品3.5m1(Citrate-E)。調製的樣品於使用前凍結保存於-80℃。
於經純化抗小鼠siglec-15多株抗體樣品(自PD-10脫鹽管柱溶出的蛋白質劃分),使用牛IgG作為標準樣品,以DC-蛋白質試驗套組(BioRad公司製)測定蛋白質濃度。關於測定蛋白質濃度的樣品,抗體濃度15或50μg/m1皆以相同於實施例11之b之方法實施電泳及銀染色的結果示於第13圖。自PD-10管柱溶出的蛋白質劃分顯示有效率地純化濃縮分子量約45kDa之重鏈與分子量約21kDa之輕鏈構成的IgG蛋白質。如表4所示,於No.1~3每批、或Citrate-E劃分,可調製約2.3~7.4mg之親和性純化的抗小鼠siglec-15多株抗體。
為了自實施例14所調製的親和性純化.抗小鼠Siglec-15多株抗體完全去除內毒素或低分子不純物,於凝膠過濾管柱進一步進行純化。將各1ml之經親和性純化的抗小鼠Siglec-15多株抗體No.2、3以預先致熱質除去劑.PyroCLEAN(ALerCHEK公司製)處理並注入以含0.01% Tween 20的Dulbecco PBS(D-PBS,Invitrogen公司製)平衡化的Superose 6 HR 10/30管柱(Amersham Bioscience公司製),使用含0.01% Tween 20的D-PBS以流速0.4ml/min溶出。色譜圖示於第14圖。溶出液於Mini-sorp tube(Nunc公司製)以0.5ml/Fr.分取,獲得2.0ml凝膠過濾.抗小鼠siglec-15多株抗體樣品(Frs.28~31)。調製樣品迄使用前凍結保存於-80℃。
於凝膠過濾純化.抗小鼠Siglec-15多株抗體樣品(自Superose 6管柱溶出的蛋白質劃分)測定蛋白質濃度。如表5所示,每一No.2、3批可調製2.25mg或3.34mg之凝膠過濾純化.抗小鼠Siglec-15多株抗體。
由5~8週齡雄性ddY小鼠摘出大腿骨及脛骨,除去軟組織。切除此大腿骨或脛骨之兩端,由25孔徑之附注射針的注射器注入D-PSS而將骨髓細胞擠出,於離心管回收。於室溫下100g、5分鐘離心而丟棄上清液後,於細胞小團塊中添加溶血緩衝液1ml(RED BLOOD CELL LYSING緩衝液,Sigma公司製)使懸浮,於室溫放置5分鐘。添加20ml之D-PBS並於室溫下100g,5分鐘離心,丟棄上清液後於細胞小團塊中添加10ml含有5ng/ml M-CSF(R & D Systems公司製)、10%胎牛血清(FBS)的MEM-α培養基(Invitrogen公司製)而使懸浮,通過細胞過濾網(cell strainer)(40μm NyloN,BD Falcon公司製)去除凝集物。將此細胞移至75cm2
-T燒瓶(附著細胞用),於CO2
培養箱中培養1晚。培養1晚後,回收未附著T-燒瓶的細胞,作為小鼠骨髓非附著細胞使用。
使用於實施例14、15所製作的抗小鼠Siglec-15多株抗體,檢討對小鼠骨髓非附著細胞之破骨細胞分化影響。以上述實施例16之方法調製的小鼠骨髓非附著細胞,以含10%FBS及10ng/ml M-CSF(R & D Systems公司製)的α-MEM培養基調製為1.5×105
細胞/ml,將其播種於96孔平盤各孔200μl,於CO2
培養箱中培養2日。去除96孔平盤中之舊培養液,添加將人類RANKL(RANKL,Pepro Tech公司製)以終濃度成為20ng/m1、M-CsF成為10ng/ml的方式添加的含有10%FBS的MEM-α培養基100μl。於此細胞培養液,將以實施例12、14、15製作的親和性純化No.3抗體、Citrate E抗體、凝膠過濾純化No.2抗體、凝膠過濾純化No.3抗體、免疫前兔IgG(Pre-immune IgG)、及市售兔對照IgG(NoN-immune Rabbit IgG CLRB00,CEDARLANE LABORATORIES公司製)以成為30~1,000ng/ml的濃度之方式添加,進一步於CO2
培養箱中培養3日。培養終了後,形成的破骨細胞之酒石酸耐性酸性磷酸酶(TRAP)活性以下列操作測定。吸除96孔平盤之各孔培養液,各孔添加50μl之含有1%Triton X-100的50mM檸檬酸鈉緩衝液(pH6.1),於平盤振動機振盪5分鐘可溶化細胞。於此等各孔中添加50μl基質溶液(含有5mg/mlp-硝基苯基磷酸酯及0.46%酒石酸鈉的50mM檸檬酸鈉緩衝液(pH6.1))並於室溫下培育5分鐘。培育後於96孔平盤各孔中添加50μ1之1N氫氧化鈉溶液而停止酵素反應。酵素反應停止後測定各孔之405n
m吸光度作為TRAP活性之指標。結果示於第15、16圖。於免疫前兔IgG、及市售之兔對照IgG不被認為有顯著TRAP活性之抑制。另一方面於親和性純化No.3抗體30ng/m1、Citrate E抗體為約130ng/m1,被認為有顯著TRAP活性之抑制(第15圖)。即使因凝膠過濾純化No.3抗體30ng/m1被認為TRAP活性顯著抑制,但認為凝膠過濾純化No.3抗體較凝膠過濾純化No.2抗體有更強的抑制活性(第16圖)。即使凝膠過濾純化抗體被認為有破骨細胞形成抑制活性,於抗小鼠Siglec-15多株抗體被承認的破骨細胞形成抑制活性,因未依賴於抗體樣品中所含內毒素或低分子不純物,而顯示只有抗體分子的作用。由以上之結果,抗小鼠siglec-15多株抗體顯示強的破骨細胞形成(破骨細胞之分化及成熟)抑制作用。
於抗小鼠Siglec-15多株抗體預先添加抗原使免疫沈降,確認抗小鼠Siglec-15多株抗體之作用係與此抗原之結合有依存性。於實施例14所製作的親和性純化No.3抗體10μg/ml中添加於實施例8、9所調製的小鼠Siglec-15-His或Siglec-15-Fc使成為10、30、100、300μg/ml之濃度,於37℃下培育2小時。培育後以Chibitan離心5分鐘的上清液以Millex GV過濾器(Millipore公司製)過濾滅菌。以實施例16之方法,以200μl/孔接種小鼠骨髓非附著細胞於96孔平盤,於CO2
培養箱中培養2日。除去96孔平盤中之舊培養液,添加將人類RANKL(RANKL,PeproTech公司製)以終濃度為20ng/ml、M-CSF為10ng/ml的方式加入含有10%FBS之MEM-α培養基100μl。於此細胞培養液,將上述製作的被檢樣品以成為1/200(V/V)的方式添加,進一步於CO2
培養箱中培養3日。培養終了後,形成的破骨細胞之酒石酸耐性酸性磷酸酶(TRAP)活性以實施例17記載之方法測定。結果示於第17圖。以Siglec-15-His中和抗體時及以Siglec-15-Fc中和抗體時任一場合中抗體之作用皆被中和而消失,由此結果證明抗小鼠Siglec-15多株抗體之破骨細胞形成抑制作用係經由與Siglec-15蛋白質之結合及其機能之阻斷。
使用抗小鼠Siglec-15多株抗體,檢討經由小鼠骨髓非附著細胞之TNF刺激的往破骨細胞分化之影響。將實施例16之方法所調製的小鼠骨髓非附著細胞以含10%胎牛血清(FBs)、10ng/ml M-CSF、及2ng/ml TGF-β(R&D Systems公司製)的α-MEM培養基調製為1.5×105
細胞/ml,將其以每孔200μl接種於96孔平盤,於CO2
培養箱中培養2日。除去96孔平盤中之舊培養液,添加100μl之將人類基因重組型TNFα(R&D Systems公司製)以終濃度成為30ng/ml、M-CSF成為10ng/ml的方式加入的含有10%FBS之MEM-α.培養基。於此細胞培養液,將於實施例12、15製作的免疫前IgG、凝膠過濾純化.抗小鼠Siglec-15 No.3抗體以成為30~1,000ng/ml之濃度的方式添加,進一步於CO2
培養箱中培養3日。同時亦準備將專利案WO96/26217說明書所記載之方法調製的人類基因重組型OCIF/OPG以成為3~100ng/ml濃度之方式添加而培養的孔。培養終了後,形成的破骨細胞之酒石酸耐性酸性磷酸酶(TRAP)活性以實施例17記載之方法測定。結果示於第18圖。免疫前IgG、及OCIF/OPG不被認為有顯著TRAP活性之抑制。另一方面,凝膠過濾純化.抗小鼠siglec-15 No.3抗體被認為250ng/ml以上之濃度有約50%之TRAP活性之抑制。由此結果,顯示OCIF/OPG無法抑制的TNF誘導性之破骨細胞形成(破骨細胞之分化與成熟)亦可以抗小鼠siglec-15多株抗體抑制。
以相同於上述之方法培養而調製的96孔平盤之各孔中,使用Leukocyte Acid Phosphatase Kit(sigma公司製),依套組所附加的指示書進行TRAP染色,觀察TRAP陽性多核破骨細胞之形成。由此結果,由抗小鼠siglec-15多株抗體之添加於TRAP陽性下巨大多核破骨細胞之形成被抑制(第19圖)。因即使添加抗小鼠siglec-15多株抗體的場合仍無形成單核破骨細胞,顯示抗小鼠siglec-15多株抗體以TNF誘導的破骨細胞之分化成熟之細胞融合的過程被強烈抑制。
將7週齡雄性ddY小鼠於乙醚麻醉下以頸椎脫臼安樂死,摘出大腿骨及脛骨。除去軟組織後,切除大腿骨或脛骨兩端,使用具25孔徑注射針的注射筒將含10%胎牛血清之α-MEM培養基注入骨髓中,採取骨髓細胞。計測細胞數後,以含10%胎牛血清之α-MEM培養基調製為5×106
細胞/ml,將其以100μl/孔接種於96孔平盤,使活性型維生素D3
(sigma公司製)終濃度成為2×10-8
M的方式添加。此細胞培養上清液中,實施例14所製作的親和性純化.抗小鼠siglec-15 No. 3抗體及實施例12所製作的免疫前兔IgG以終濃度成為4.57、13.7、41.2、123、370、1,111、3,333、10,000ng/ml的方式添加並於CO2
培養箱中培養8日。又,培養基交換及檢體之添加於第3及6日實施。培養第8日去除培養上清液,添加10%中性福馬林進行細胞固定。細胞固定後,以蒸餾水洗淨2次,添加100μl/孔之TRAP基質液(15mM p-硝基苯基磷酸、50mM酒石酸鈉、0.1M乙酸鈉緩衝液(pH5.0)),於室溫反應30分鐘。1N NAOH以50μl/孔添加而停止反應,使用微量平盤讀數機於405nm測定吸光度而評價細胞內之TRAP活性。由此結果,添加的抗小鼠Siglec-15多株抗體之用量依存性地抑制TRAP活性(第20圖-A)。另一方面,於添加免疫前IgG的場合,未認為TRAP活性降低(第20圖-B)。如此得知,經由與Siglec-15專一性結合的抗體,由活性型維生素D3
所誘導的小鼠骨髓細胞之TRAP陽性破骨細胞形成被抑制。
將7週齡雄性ddY小鼠於乙醚麻醉下以頸椎脫臼安樂死,摘出大腿骨及脛骨。除去軟組織後,切除大腿骨或脛骨兩端,使用具有25孔徑注射針之注射筒將含10%胎牛血清之α-MEM培養基注入骨髓中,採取骨髓細胞。計測細胞數後,以含10%胎牛血清之α-MEM培養基調製為5×106
細胞/ml,將其以100μl/孔接種於96孔平盤。於此培養上清液,準備添加作為破骨細胞分化誘導因子之活性型維生素D3
(Sigma公司製),以終濃度成為2×10-8
M的添加、人類RANKL(PeproTech公司製)以終濃度成為80ng/ml的方式添加。於此等細胞培養上清液,實施例14所製作的親和性純化‧抗小鼠Siglec-15 No. 3抗體以終濃度成為370、3、333ng/ml的方式、又實施例12所製作的免疫前兔IgG以終濃度成為3,333ng/ml的方式添加。以活性型維生素D3
誘導破骨細胞分化的培養系統,於CO2
培養箱中培養8日,以人類RANKL分化誘導的系統,於CO2
培養箱中培養6日。又,培養基交換及檢體之添加於第3及6日實施。除去培養後上清液,添加10%中性福馬林進行細胞固定。細胞固定後,以蒸餾水洗淨2次,添加100μl/孔之TRAP染色液(0.27mM萘酚AS-MX磷酸(Sigma公司製)、1.6mM固紅紫LB 鹽(Fast red violet LB salt)(Sigma公司製)、1%二甲基甲醯胺、50mM酒石酸鈉、0.1M乙酸鈉緩衝液(pH5.0)),於室溫反應5分鐘。以蒸餾水洗淨2次,於顯微鏡下觀察細胞。此結果,以活性型維生素D3
(第21圖)、人類RANKL(第22圖)任一試藥誘導破骨細胞的場合,依抗小鼠Siglec-15多株抗體添加而破骨細胞之融合被抑制,不認為有巨大破骨細胞形成。另一方面,添加免疫前IgG的場合,不認為有此等破骨細胞融合之抑制。如此,由活性型維生素D3
或人類RANKL所誘導的小鼠骨髓細胞之TRAP陽性破骨細胞之多核化‧細胞融合,得知經由與Siglec-15專一性結合的抗體而被抑制。
將實施例14中所製作的親和性純化‧抗小鼠Siglec-15No.3抗體、實施例8、9所製作的小鼠Siglec-15-His蛋白質及小鼠Siglec-15-Fc蛋白質使用含0.01% Tween 20的D-PBS(Invitrogen公司製)使各自之濃度成為如表6記載的濃度之方式調製5個混合液(A~E)。將此等混合液於37℃培育2小時後,以20,000×g離心10分鐘,將所得上清液作成20倍濃度之試驗樣品。
將RAW264.7以含10%胎牛血清之α-MEM培養基調製為2.25×104
細胞/ml,以200μ1/孔接種於96孔平盤,使人類RANKL(PeproTech公司製)之終濃度成為40ng/ml的方式添加。於此細胞培養上清液,將a)所製作的A~E試驗樣品以終濃度成為1/20的方式添加並於CO2
培養箱中培養3日。培養後除去上清液,添加10%中性福馬林而進行細胞固定。細胞固定後,以蒸餾水洗淨2次,以100μ1/孔添加TRAP染色液(0.27mM萘酚AS-MX磷酸(Sigma公司製)、1.6mM固紅紫LB鹽(Sigma公司製)、1%二甲基甲醯胺、50mM酒石酸鈉、0.1M乙酸鈉緩衝液(pH5.0)),於室溫反應5分鐘。以蒸餾水洗淨2次、於顯微鏡下觀察細胞。此結果,與未添加試驗樣品的對照組(第23圖-0)作比較,經由添加抗小鼠Siglec-15多株抗體而顯著地抑制破骨細胞之融合(第23圖-A)。然而,將抗小鼠Siglec-15多株抗體以作為免疫抗原使用的小鼠Siglec-15-Fc蛋白質而吸收,由於抗小鼠Siglec-15多株抗體的破骨細胞融合之抑制作用被解除(第23圖-B、C)。又,將抗小鼠Siglec-15多株抗體以小鼠Siglec-15-His蛋白質而吸收,同樣地經由抗小鼠Siglec-15多株抗體的破骨細胞融合之抑制作用被解除(第23圖-D、E)。由此等結果可知,經由與Siglec-15專一性結合的抗體,由人類RANKL所誘導的RAW264.7細胞之TRAP陽性破骨細胞之多核化.細胞融合被抑制。又,第23圖中A至E之記號所示結果,各自對應表6之A至E之試驗樣品。
將實施例8製作之小鼠Siglec-15-His蛋白質以100μg/0.5ml的方式調製,添加等量佐劑於玻璃注射器而製作乳劑。又,佐劑只於初次免疫時使用弗式完全佐劑(FCA、DIFCO公司製),第2次以後使用弗式不完全佐劑(FICA、DIFCO公司製)。
使用4隻大鼠(Wistar,雌性,6週齡,購自日本CLEA公司)作為免疫動物。a)所得乳劑以抗原量為50μg/大鼠的方式使用27G注射針注射於皮下及皮內。以後每7日實施合計4次之免疫。自第4次免疫7日後由尾靜脈採少量(200μl)血,調製抗血清。為確認抗血清之抗體力價,使用小鼠siglec-15-His蛋白質作為抗原,實施將實施例9所製作的小鼠siglec-15-Fc蛋白質、或牛血清白蛋白(BSA)固相化的ELISA。由此結果認為隻大鼠(大鼠No.1~4)任一者皆對小鼠siglec-15-His蛋白質及小鼠siglec-15-Fc蛋白質之反應性。另一方面,不認為對BSA有反應性。由以上結果,因確認經免疫的大鼠血清中之抗體力價上昇,於抗體力價最高的No.2大鼠進行細胞融合操作。
細胞融合一般依據小鼠(大鼠)脾臟細胞與骨髓瘤細胞之融合法實施。大鼠以乙醚麻醉下自心臟全採血而安樂死,之後摘出脾臟。將經採取的脾臟細胞與為小鼠骨髓瘤細胞的P3X63Ag8.653細胞(ATCC CRL 1580)使用聚乙二醇(PEG)使細胞融合。將細胞接種於96孔平盤,添加含有次黃嘌呤(hypoxanthine(H)).胺基喋呤(Aminopterin(A)).胸腺嘧啶(thymidine(T))之培養基(HAT選擇培養基)培養7~10日。採取經細胞融合的融合瘤之生存被確認的61孔培養上清液,使用作為抗原之小鼠siglec-15-His蛋白質、實施例9所製作的小鼠siglec-15-Fc蛋白質、或將BSA固相化的ELISA評價抗體力價,篩選抗小鼠Siglec-15單株抗體産生融合瘤。由篩選結果,選出抗體力價高的12孔,進一步進行其中之融合瘤選殖操作。
於選出的融合瘤,以限界稀釋法1次選殖。限界稀釋後之培養進行2週,培養上清液中之抗體力價之確認以實施例9製作的小鼠siglec-15-Fc蛋白質或固相化BSA之ELISA實施。於認為是陽性選殖株的11選殖株中,經由進一步實施2次選殖(與1次選殖相同的作業),最終建立10個選殖株之抗小鼠siglec-15單株抗體産生融合瘤(#1A1、#3A1、#8A1、#24A1、#32A1、#34A1、#39A1、#40A1、#41B1、#61A1)。又,融合瘤#32A1及融合瘤#41B1已於2008年8月28日寄存於日本國獨立行政法人産業技術總合研究所特許生物寄存中心(所在地:郵遞區號305-8566日本國茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6),融合瘤#32A1以抗-siglec-15融合瘤#32A1之名稱賦予寄存編號FERMBP-10999,融合瘤#41B1以抗-siglec-15融合瘤#41B1之名稱賦予寄存編號FERM BP-11000。
將實施例23建立的融合瘤使用含有10%FCS之TIL培養基I((股)免疫生物研究所製)培養基培養。又,於2~3日實施1次細胞之繼代,以約5×105
細胞/ml時增殖的時點為目標稀釋4分之1左右的作業。於投與降植烷(Pristane)於腹腔內之前(0.2ml/小鼠)的裸鼠,將培養的融合瘤以成為1×107
細胞/小鼠的方式移植到腹腔內。於移植,使用10個選殖株之融合瘤各自接種的各3隻裸鼠。移植後,於腹水蓄積非常明顯的時點採取腹水,收集各融合瘤3種為1個而測定採取量後,凍結保存至抗體之純化。於各融合瘤之腹水採取量摘述於表7。
將採取腹水之全量供給於使用20ml之蛋白質G管柱(GE Healthcare公司製)的IgG之純化。經純化IgG以凝膠過濾分析(Superdex 200層析柱)進行純度檢定,一部份以離心膜濃縮。即,經純化抗小鼠Siglec-15單株抗體中,將除了#24A1抗體外之9種類抗體使用離心膜濃縮器Amicon Ultra-15(Millipore公司製)於3000r.p.m.、4℃下30~60分鐘離心而濃縮為約6倍~8倍。接著,於#24A1抗體及經濃縮的其他9種類抗體,使用牛血清白蛋白(BSA)作為標準樣品,以DC-蛋白質試驗套組(BioRad公司製)測定蛋白質濃度。經由以上操作,調製抗小鼠Siglec-15單株抗體。
大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體對小鼠Siglec-15蛋白質之結合性由ELISA法評價。實施例9所製作的小鼠Siglec-15-Fc蛋白質以成為5μg/ml的方式以0.1M碳酸鈉緩衝液(pH9.5)稀釋,於96孔平盤(NalgeNunc公司製,目錄編號:430341)以100μl/孔添加。於室溫1小時放置後除去溶液,添加300μl/孔之洗淨緩衝液(含有0.05%Tween20之磷酸鹽緩衝生理食鹽水)並除去。此洗淨作業再進行1次後,以200μl/孔添加含有25%Blockace(大日本住友製藥公司製)之磷酸鹽緩衝生理食鹽水,經由於室溫放置1小時進行阻斷。除去液體而以300μ1/孔之洗淨緩衝液2次洗淨後,將實施例24所調製的大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體或大鼠對照組IgG(R&D Systems公司製)使用ELISA緩衝液(含12.5%Blockace、0.05%Tween 20的磷酸鹽緩衝生理食鹽水)將終濃度稀釋為1.28~20,000ng/ml(5倍稀釋系列),以100μl/孔添加。於室溫放置1小時後去除液體,以300μl/孔之洗淨緩衝液洗淨3次。接著使用ELISA緩衝液而以100μl/孔添加經1,000倍稀釋的HRP(西洋山葵過氧化物酶)標識山羊抗大鼠IgG抗體(Beckman Coulter公司製),於室溫放置1小時。去除液體,以300μl/孔之洗淨緩衝液洗淨3次後,使用過氧化物酶用發色套組(住友Bakelite公司製),依套組添附的説明書使其發色。發色後,使用微量平盤讀數機(日本Molecular Devices公司製)於492nm測定吸光度。由此結果,於檢討的大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體10個檢體全部,確認依存於抗體濃度之對小鼠Siglec-15蛋白質之結合(第24圖)。另一方面,於大鼠對照組IgG,不認為有對小鼠Siglec-15蛋白質之結合。
使用實施例24所製作的全部10個檢體之抗小鼠Siglec-15單株抗體,檢討對小鼠骨髓非附著細胞之破骨細胞分化的影響。將實施例16之方法所調製的小鼠骨髓非附著細胞以含有10%FBS及10ng/mlM-CSF(R & D Systems公司製)的α-MEM培養基調製為1.5×105
細胞/m1,並將其以200μl接種於96孔平盤之各孔中,於CO2
培養箱中培養2日。除去96孔平盤中之舊培養液,添加100μl之將人類RANKL(RANKL、PeproTech公司製)以終濃度成為20ng/ml、M-CSF成為10ng/ml的方式添加於含有10%FBS之MEM-α培養基。於此細胞培養液,以成為32~1,000ng/ml之濃度的方式添加實施例24所製作的大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體、自市售之大鼠對照組IgG(Purified RatIgG、R&DSystems公司製)除去疊氮化鈉的樣品、及實施例14所製作的兔抗小鼠siglec-15多株抗體(No.3),CO2
培養箱中另培養3日。培養終了後,形成的破骨細胞之酒石酸耐性酸性磷酸酶(TRAP)活性以實施例17記載之方法測定。酵素反應停止後於各孔測定405nm吸光度作為TRAP活性之指標。結果示於第25及26圖。市售之大鼠對照組IgG未認為有顯著TRAP活性之抑制。另一方面,#32A1抗體於32ng/ml至1000ng/ml之範圍內,#8Al抗體與親和性純化兔多株No.3抗體於63ng/m1自 1000ng/ml之範圍內,認為有顯著TRAP活性之抑制。又於#3A1抗體、#34A1抗體、#39A1抗體,認為於500ng/ml以上之比較高的濃度中TRAP活性之用量依存性的抑制。未認為經由其他抗體有小鼠破骨細胞形成之抑制。由以上之結果,於經調製的大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體之中,發現強烈抑制小鼠之破骨細胞形成(破骨細胞之分化及成熟)的抗體。又,作為#3A1抗體、#8A1抗體、#32A1抗體、#34A1抗體、#39A1抗體共通的性質,可列舉於1000ng/ml,即1μg/ml以下之濃度,抑制破骨細胞形成的作用。
含正常人類破骨前驅細胞(Normal Human Natural Osteoclast Precursor Cells,購自三光純藥,目錄編號2T-110),以添加含有胎牛血清(終濃度10%)、人類RANKL及人類M-CSF等之OPGM添加因子套組(購自三光純藥、目錄編號PT-9501)的破骨前驅細胞用基礎培養基(OPBM、購自三光純藥、目錄編號PT-8201)培養時,3~7日後TRAP陽性多核破骨細胞為多數出現。此細胞培養系統依套組所添附的説明書使用,而製作來自人類的成熟破骨細胞。
a)將正常人類破骨前驅細胞以1×104
細胞/孔的方式接種於96孔平盤之60孔,以終濃度66ng/ml的方式添加人類RANKL,於CO2
培養箱中培養4日。其次,全RNA抽出用試藥(ISOGEN:Nippon Gene公司製)依試藥所添附的指示書使用,自多核破骨細胞抽出全RNA。回收的全RNA保存於-80℃至使用時。
b)將正常人類破骨前驅細胞,於2個96孔平盤,各自以成為1×104
細胞/孔的方式分孔接種於84個孔,於1平盤中以終濃度成為53.2ng/ml的方式添加人類RANKL,於1個平盤未添加人類RANKL而於CO2
培養箱中培養3日。其次,全RNA抽出用試藥(ISOGEN:Nippon Gene公司製)依試藥所添附的指示書使用,自細胞抽出全RNA。回收的全RNA保存於-80℃至使用時。
將實施例27之a)所製作的全RNA作為模板,使用oligo(dT)引子(Invitrogen公司製),由SuperScriptIII反轉錄酶(Invitrogen公司製)進行cDNA合成。操作係依酵素所附屬之指示書實施。
具有作為以PCR增幅人類Siglec-15之ORF cDNA用之引子
5’-attaagcttc accATGGAAA AGTCCATCTG GCTGC-3’(hsiglec-15-HindIII Kozak-F:序列表之序列編號29)
及
5’-agtggatccT CACGGTGAGC ACATGGTGGC-3’(hsiglec-15-BamHI-R:序列表之序列編號30)
之序列的寡核苷酸依常法合成。使用此引子之組合與a)所製作的cDNA,依常法進行PCR。所得PCR反應液使用PureLink PCR Purification Kit(Invitrogen公司製)純化。
b)所得的純化PCR反應液及pcDNA3.1(+)載體(Invitrogen公司製)以限制酶處理(BamHI、HindIII),凝膠切出純化後,依常法進行結合酶反應。轉形大腸菌TOP10,對所得藥劑耐性選殖株進行菌落PCR。對於獲得預定大小的增幅產物的選殖株,由插入質體的ORF cDNA之全核苷酸序列使用DNA定序機解析地結果,得知為序列表之序列編號1所示序列。此核苷酸序列與登錄於NCBI GenBank資料庫之「人類Siglec-15」(登錄編號:NM_213602)的序列之ORF編碼區相同,又,該核苷酸序列所編碼的胺基酸序列(序列表之序列編號2)與人類Siglec-15之胺基酸序列100%一致。
於實施例27之b)所製作的1μg全RNA中添加1μl 1U/μl DNaseI、1μl 10×DNaseI緩衝液(Invitrogen公司製),以H2
O作成10μl,於室溫使反應15分鐘後,添加1μl 25mM EDTA於65℃加熱10分鐘。自此溶液分取8μl,添加1μl 50μM oligo(dT)20
引子及1μl 10mM dNTPs,於65℃下加熱5分鐘後,於冰中保溫。於此溶液添加2μl 10×RT緩衝液(Invitrogen公司製)、4μl 25mM MgCl2
、2μl 0.1M二硫蘇糖醇、1μl RNase抑制劑(RNaseOUT、40U/μl,Invitrogen公司製)、1μl SuperScriptIII反轉錄酶(200U/μl,Invitrogen公司製)而作成全量為20pl,50℃下反應50分鐘後,於85℃加熱5分鐘,保溫於冰中。
使用如此製作的單鏈cDNA,組合以下引子及螢光標識探針(TaqMan探針,Applied Biosystems公司製)實施即時PCR。
即時PCR條件:
人類組織蛋白酶K增幅用引子:
5’-ccgcagtaat gacacccttt-3’(TgM-hcatK-F:序列表之序列編號31)
及
5’-aaggcattgg tcatgtagcc-3’(TgM-hcatK-R:序列表之序列編號32)、
人類組織蛋白酶K檢出用TaqMan探針:
5’-Fam-tcagggtcag tgtggttcct gttgggct-TAMRA-3’(TgM-hcatK-探針:序列表之序列編號33)、
人類TRAP增幅用引子:
5’-ctgtcctggc tcaagaaaca-3’(TgM-hTRAP-F:序列表之序列編號34)
及
5’-ccatagtgga agcgcagata-3’(TgM-hTRAP-R:序列表之序列編號35)
人類TRAP檢出用TaqMan探針:
5’-Fam-tgagaatggc gtgggctacg tgctgagt-TAMRA-3’(TgM-hTRAP-探針:序列表之序列編號36)、
人類Siglec-15增幅用引子:
5’-cagccaccaa catccatttc-3’(TgM-hSiglec-15-F:序列表之序列編號37)
及
5’-cgctcaagct aatgcgtgta-3’(TgM-hSiglec-15-R:序列表之序列編號38)、
人類Siglec-15檢出用TaqMan探針:
5’-Fam-aagaacaaag gccagtgcga ggcttggc-TAMRA-3’(TgM-hSiglec-15-探針:序列表之序列編號39)、
人類L32核糖體蛋白質增幅用引子:
5’-gagatcgctc acaatgtttc ct-3’(TgM-hL32-F:序列表之序列編號40)
及
5’-gatgccagat ggcagttttt ac-3’(TgM-hL32-R:序列表之序列編號41)
人類L32核糖體蛋白質檢出用TaqMan探針:
5’-Fam-accgcaaagc catcgtggaa agagctg-TAMRA-3’(TgM-hL32-探針:序列表之序列編號42)
使用即時PCR系統(ABI PRISM7700序列偵測器,(股)Perkin Elmer Japan.Applied Biosystems事業部製)依以下條件進行即時PCR解析。又於反應時,使用TaqMan Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems公司製)。首先添加各25pmol之引子、8ng之單鏈cDNA及10pmol之TaqMan探針於蒸餾水成為25μl,添加25μl TaqManUniversal PCR Master Mix而調製50μl反應液。將此反應液於50℃加熱2分鐘後於95℃加熱10分鐘,重複40次「95℃0.25分鐘、60℃1分鐘」之溫度循環而實施即時PCR解析。又,各基因之mRNA表現量以L32核糖體蛋白質之mRNA表現量補正。
由此結果已知,與作為破骨細胞之標記分子的已知組織蛋白酶K及TRAP基因同樣地,Siglec-15基因之表現量於添加RANKL而誘導人類破骨細胞分化的場合有顯著地提昇(第27圖)。
編碼人類Siglec-15蛋白質之細胞外領域的部分之核酸序列為序列表之序列編號43,胺基酸序列為序列表之序列編號44。經由利用此等部分序列,於動物細胞等之培養上清液中可産生可溶型人類Siglec-15蛋白質。
作為以PCR增幅人類Siglec-15之細胞外領域cDNA用之引子,具有
5’-ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt caccATGGAAAAGTCCATCT GGCTGC-3’(hSiglec-15-ECD-F:序列表之序列編號45)
及
5’-ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc CCCGCTGGCG CCATGGAAGC GG-3’(hSiglec-15-ECD-R:序列表之序列編號46)、
序列的寡核苷酸依常法合成。又,此等引子以作為Gateway Entry選殖株製作用增幅用引子的hSiglec-15-ECD-F附加attB1序列,而hSiglec-15-ECD-R上附加attB2序列的方式設計。組合此引子時,使用實施例28所製作的人類Siglec-15/pcDNA3.1(+)質體作為模板,依常法進行PCR。所得PCR反應液使用PureLink PCR Purification Kit(Invitrogen公司製)純化。
經由應用λ噬菌體之部位特異性重組系統的Gateway Technology(Invitrogen公司),組合人類Siglec-15細胞外領域之cDNA的Entry選殖株依以下方法製作。首先,於a)所製作之兩端具有attB序列的PCR產物,及具有attP序列的供予者載體的pDNOR221(Invitrogen公司製)之間,使用BP Clonase進行BP反應。使用此反應液轉形大腸菌TOP10,對耐藥性選殖株進行菌落PCR,確認插入物大小。於確認插入物之大小為正確的選殖株,實施插入物之全DNA序列之序列解析的結果,獲得與編碼作為目的的人類Siglec-15蛋白質之細胞外領域的核酸序列(序列表之序列編號43)完全一致的Entry選殖株。
經由應用λ噬菌體之部位特異性重組系統的Gateway Technology(Invitrogen公司),組合人類Siglec-15細胞外領域之cDNA的表現選殖株依以下方法製作。b)製作的Entry選殖株於插入物兩端具有attL序列。此Entry選殖株與具有attR序列的2種類之目的載體之間使用LR Clonase進行LR反應。又目的載體使用2種類,為於插入物之C末側附加V5抗原決定位及6×His標籤的方式所設計的pDONM、及於插入物之C末側附加人類Fc標籤的方式所設計的phIgFc。使用由LR反應所得反應液而轉形大腸菌TOP10,對所得耐藥性選殖株進行序列解析,確認重組正確進行。
序列解析之結果各自獲得pDONM及phIgFc兩者為正確重組的表現選殖株(可溶型人類siglec-15/pDOM及可溶型人類siglec-15/phIgFc)。經由將可溶型人類siglec-15/pDONM轉染於動物細胞等,轉錄具有序列表之序列編號47所記載的鹼基序列的mRNA,而具有序列表之序列編號48所記載的胺基酸序列的蛋白質(人類siglec-15-His)被轉譯。經由將可溶型人類siglec-15/phIgFc轉染於動物細胞等,具有序列表之序列編號49所記載的鹼基序列的mRNA被轉錄,具有序列表之序列編號50記載的胺基酸序列的蛋白質(人類siglec-15-Fc)被轉譯。
將實施例30所得可溶型人類siglec-15/pDONM調製為約25mg調製。又,自大量培養的大腸菌之質體純化上使用Invitrogen PureLink HiPure Plasmid Gigaprep Kit(Invitrogen公司製)。將調製的質體與opti-MEM(Invitrogen公司製)混合,添加50m1為轉染試藥的293fectin(Invitrogen公司製),於室溫20分鐘培育。此混和液以含有1%盤尼西林-鏈黴素的Freestyle 293 Expression Media(Invitrogen公司製)中成為1.0~3.4×106
細胞/ml的方式添加於使用25L生物處理(Bioprocess)培養裝置(WAVE BioreActor)培養的FreeStyle 293-F細胞(Invitrogen公司製)。於6~12%CO2
濃度、37℃96小時(4日)攪拌培養(30旋轉/分鐘)後回收培養液,離心分離而調製培養上清液。如此調製的培養上清液中,認為人類Siglec-15之細胞外領域C末側上表現V5抗原決定位及6×His標籤附加的蛋白質(人類Siglec-15-His)。
將實施例30所得可溶型人類Siglec-15/phIgFc調製約5mg。又,自大量培養的大腸菌之質體純化上使用Invitrogen PureLink HiPure Plasmid Gigaprep Kit(Invitrogen公司製)。調製的質體與Opti-MEM(Invitrogen公司製)混合,過濾器滅菌添加10ml後為轉染試藥的293 fectin(Invitrogen公司製)而於室溫培育20分鐘。此混和液於FreeStyle 293 Expression Media(Invitrogen公司製)中以成為1.0~3.0×106
細胞/ml×5L(1L/燒瓶5瓶)的方式添加於愛倫美氏燒瓶中培養的FreeStyle 293-F細胞(Invitrogen公司製)。於8.0%Co2
濃度、37℃下96小時(4日間)旋轉培養(125旋轉/分鐘)後回收培養液,離心分離而調製培養上清液。如此調製的培養上清液中,認為人類Siglec-15之細胞外領域C末側上表現人類Fc標籤附加的蛋白質(人類Siglec-15-Fc)。
於使實施例31之a)所調製的人類Siglec-15-His表現的293F細胞之培養液12L中添加1350ml之10x緩衝液(500mM TriS,1.5M NaCl,200mM咪唑,pH8.0)並充分攪拌後,以MilliPaK 60過濾器(Millipore公司製)過濾。將此培養液以流速10ml/min注加於已以預備純水(Milli Q水)洗淨的Ni-sepharose HP(Amersh am Bioscience公司製)100ml管柱。使用含300mM NaCl的50mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)400ml以流速8ml/min洗淨管柱後,使用含有300mM NaCl,500mM咪唑的50mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)200ml以流速2.5ml/min溶出吸附於管柱的蛋白質,於Mini-sorp tube(Nunc公司製)分取。為防止蛋白質沈澱的目的,於含溶出蛋白質的劃分約40ml中添加5MNaCl溶液8ml而攪拌後,以離心膜濃縮器Amicon Ultra-15(Millipore公司製)濃縮為約20ml。濃縮時發生的不溶物以3000r.p.m.、4℃下30分鐘離心去除,將此上清液2.5ml注加到預先以含1M NaCl的磷酸鹽緩衝生理食鹽水(N-PBS)平衡化的PD-10脫鹽管柱(Amersham Bioscience公司製),以N-PBS溶出,獲得將溶劑置換為N-PBS的樣品3.5ml。此操作進一步重複進行7次,獲得約28ml之人類Siglec-15-His粗純化溶液。
以Ni-sepharose HP層析柱純化的N-PBS置換樣品12ml以含有0.1% CHAPS的50mM Tris-HCl緩衝液(pH7.5)於4℃下透析一晚(1L、3次)後,於4℃、3,000r.p.m.進行30分鐘離心而去除沈澱物。此上清液以Millex GV過濾器(Millipore公司製)過濾後,以流速1ml/min注加於以含有0.1% CHAPS的50mM Tris-HCl緩衝液(pH7.5)預先平衡化的Resource Q 6ml管柱(Amersham Bioscience公司製),持續使用此緩衝液以流速1ml/min洗淨管柱,收集未吸附於管柱的蛋白質劃分。吸附於管柱的蛋白質使用含有0.1% CHAPS、1M NaCl的50mM Tris-HCl緩衝液(pH7.5)以流速1ml/min溶出。將未吸附於管柱的劃分26.5ml以離心膜濃縮器Amicon Ultra-15(Millipore公司製)濃縮為3.0ml後,於4℃、3,000r.p.m.10分鐘離心而去除沈澱物。此上清液2.5ml注加到以預先含50mM精胺酸鹽酸鹽的磷酸鹽緩衝生理食鹽水(pH7.0、A-PBS)平衡化的PD-10脫鹽管柱(Amersham Bioscience公司製),以A-PBS溶出,溶劑置換為A-PBS的樣品3.5ml。所調製樣品之溶劑中之精胺酸鹽酸鹽係為防止可溶型人類Siglec-15-His的沈澱而添加。離心後之上清液迄使用前凍結保存於-80℃。重複以上之純化操作(Resource Q層析柱)2次而實施。
使用上述之純化操作(Ni-Sepharose HP層析柱,Resource Q層析柱)所調製的樣品於還原條件下進行SDS-聚丙烯酸醯胺電泳及銀染色。即,於5μl各純化步驟之樣品添加同量之SDS-處理液,於95℃下熱處理10分鐘。將0.3μl熱處理的各樣品用於SDS-聚丙烯酸醯胺電泳。除了電泳之操作使用作為分子量標記之Rainbow分子量標記(Amersham Bioscience公司製)以外,以相同於實施例之方法實施。電泳終了後使用PhastGel silver Kit(Amersham Bioscience公司製)及PhastSystem進行銀染色,此結果示於第28圖。未吸附於Resource Q管柱的蛋白質劃分中分子量約35kDa之蛋白質(人類Siglec-15-His)被有效率地純化濃縮。
於純化人類Siglec-15-His(未吸附於Resource Q管柱的蛋白質劃分),使用牛血清白蛋白作為標準樣品,以DC-蛋白質試驗套組(BioRad公司製)測定蛋白質濃度。2次純化操作獲得合計1.66mg之純化人類Siglec-15-His。
使實施例31之b)所調製的人類Siglec-15-Fc表現的293F細胞之培養液1.5L以Sterivex GV過濾器(Millipore公司製)過濾後,以流速5ml/min注加到預先Dulbecco PBS(D-PBS,Invitrogen公司製)平衡化的HiTrap蛋白質A 5ml管柱(Amersham Bioscience公司製)。使用D-PBS 70ml於流速5ml/min洗淨管柱後,使用24ml之0.1M檸檬酸鈉緩衝液(pH3.0)於流速1.2ml/min溶出吸附於管柱的蛋白質。溶出液於Mini-sorp tube(Nunc公司製)以1.2ml/Fr.分取後,直接添加1M Tris 0.31ml中和。將溶出的蛋白質劃分(Fr.5~9)約7.5ml中之2.5ml注加到以含50mM精胺酸鹽酸鹽的磷酸鹽緩衝生理食鹽水(pH7.0,A-PBS)平衡化的PD-10脫鹽管柱(Amersham Bioscience公司製)以A-PBS溶出,獲得溶劑置換為A-PBS的樣品3.5ml。實施此作業2次重複。為了防止可溶型人類Siglec-15-Fc沈澱,添加溶劑中之精胺酸鹽酸鹽。將溶出的蛋白質劃分(Fr.5~9)中殘餘的2.5ml注加到以含1M NaCl的磷酸鹽緩衝生理食鹽水(pH6.7,N-PBS)平衡化的PD-10脫鹽管柱(Amersham Bioscience公司製)而以N-PBS溶出,獲得溶劑置換為N-PBS的樣品3.5ml。調製的樣品之溶劑中之NaCl,不添加精胺酸等之含胺基化合物,而以防止可溶型人類Siglec-15-Fc之沈澱的目的添加。溶劑置換為N-PBS的人類Siglec-15-Fc樣品,僅使用於後面的實施例34之c)中調製固定化管柱之時,此以外之實施例全部使用置換為A-PBS的人類Siglec-15-Fc。以上之操作所調製的樣品,迄使用為止凍結保存於-80℃。
使用上述純化操作所調製的樣品於還原條件下進行SDS-聚丙烯酸醯胺電泳及銀染色。即,於5μl各純化步驟之樣品添加同量之SDS-處理液,於95℃下熱處理10分鐘。將熱處理的各樣品以1/2濃度之SDS-處理液稀釋1/100或1/300倍的樣品0.3μl使用於SDS-聚丙烯酸醯胺電泳。電泳及銀染色以相同於a-iii)記載之人類Siglec-15-His之純度檢定的方法實施,此結果示於第29圖。顯示自HiTrap蛋白質A管柱溶出的蛋白質劃分中分子量約55kDa之蛋白質(人類Siglec-15-Fc)被有效率地純化濃縮。
於純化人類Siglec-15-Fc(自PD-10脫鹽管柱溶出的蛋白質劃分),使用牛血清白蛋白作為標準樣品,以DC-蛋白質試驗套組(BioRad公司製)測定蛋白質濃度。如表8所示,以2次純化操作獲得合計25.2mg之純化人類Siglec-15-Fc。
將實施例32之b)所製作之人類Siglec-15-Fc蛋白質以成為100μg/0.5ml的方式調製,添加同量佐劑於玻璃注射器製作乳劑。又,佐劑僅於初次免疫時使用弗氏完全佐劑(FCA,DIFCO公司製),第2次以後使用弗氏不完全佐劑(FICA,DIFCO公司製)。
使用3隻兔(日本白色種雌性體重3Kg)作為免疫動物。又,免疫前實施採血,獲得免疫前血清10ml/隻。將a)所得乳劑,以抗原量為50μg/隻的方式使用27G注射針注射於皮下及皮內。以後每14日實施合計8次之免疫。自第8次之免疫7日後實施全採血,每1隻獲得74.4~74.9ml之抗血清。免疫前血清中及抗血清中之抗體力價以將抗原固相化的ELISA法確認的結果,確認3隻兔皆提升抗血清中之抗體力價。抗血清迄使用前保存於-20℃。
於實施例33之b)調製的兔抗血清3批各40ml中添加Dulbecco PBS(D-PBS,Invitrogen公司製)40ml而混合,以Sterivex GV過濾器(Millipore公司製)過濾後,以流速2ml/min注入預先以D-PBS平衡化的HiTrap蛋白質A 5mlx2管柱(2隻管柱直列連結,Amersham Bioscience公司製)。使用35ml之D-PBS以流速1ml/min洗淨管柱後,使用0.1M檸檬酸鈉緩衝液(pH3.0)50ml以流速1ml/min溶出吸附於管柱的蛋白質。溶出液於Mini-sorp tube(Nunc公司製)以2.5ml/Fr.分取後,直接添加1M Tris 0.6ml中和。含溶出的蛋白質之劃分約15.5ml(Fr.3~7)以離心膜濃縮器Amicon Ultra-15(Millipore公司製)濃縮為5ml後,其中之2.5ml注加到以含0.01% Tween 20的大塚注射用生理食鹽水(TO-SS)平衡化的PD-10脫鹽管柱(Amersham Bioscience公司製)而以TO-SS溶出,獲得將溶劑置換為TO-SS之樣品3.5ml。實施重複此操作2次。調製的樣品迄使用為止凍結保存於-80℃。
實施例33之人類Siglec-15-Fc之免疫開始前,自使用的3隻兔預先採血調製免疫前之血清。混合此血清各5ml後添加D-PBS 15ml,以Millex GV過濾器(Millipore公司製)過濾。將此血清樣品以流速1ml/min注加到預先以D-PBS平衡化的HiTrap蛋白質A 5mlx2管柱(Amersham Bioscience公司製)。使用D-PBS 35ml以流速1ml/min洗淨管柱後,使用0.1M檸檬酸鈉緩衝液(pH3.0)50ml以流速1ml/min溶出吸附於管柱的蛋白質。溶出液於Mini-sorp tube(Nunc公司製)以2.5ml/Fr.分取後,直接添加1M Tris 0.6ml中和。含溶出蛋白質之劃分(Fr.4~6)以離心膜濃縮器Amicon Ultra-15(Millipore公司製)濃縮為2.5ml後,注加到以含0.01% Tween 20的大塚注射用生理食鹽水(TO-SS)平衡化的PD-10脫鹽管柱(Amersham Bioscience公司製)而以TO-SS溶出,獲得將溶劑置換為TO-SS之樣品3.5ml。於純化的此免疫前兔IgG樣品,以實施例8記載之方法進行聚丙烯酸醯胺電泳及銀染色而確認IgG蛋白質被充分純化後,測定蛋白質濃度。純化的此免疫前兔IgG樣品迄使用為止凍結保存於-80℃。
將實施例32之b)製作的N-PBS溶劑置換的純化人類Siglec-15-Fc 3ml(合計7.8mg蛋白質)使用離心膜濃縮器Amicon Ultra 4(Millipore公司製)濃縮為2ml。濃縮液中添加偶合緩衝液(0.2M NAHCO3
,0.5M NaCl,pH8.3)作成2.5ml後,此溶劑以PD-10脫鹽管柱置換3.5ml之偶合緩衝液。NHS-Activated HiTrap管柱(1ml,Amersham Bioscience公司製)中之異丙醇以1mM鹽酸置換後,調製的人類Siglec-15-Fc 3ml以注射器注入管柱,經由管柱之出口上接續使用一個注射器交互注入液體進行偶合反應。於室溫反應30分鐘後,為使過剩活性基不活化,依Amersham Bioscience公司之指示書,依續注入阻斷緩衝液(含0.5M NaCl之乙醇胺緩衝液,pH8.3)、洗淨緩衝液(含0.5M NaCl之乙酸鈉緩衝液,pH4.0)、阻斷緩衝液各6ml後,於室溫放置30分鐘。之後,將洗淨緩衝液、阻斷緩衝液、洗淨緩衝液之各6ml再度依序注入管柱,最後管柱內之緩衝液置換為含有0.15MNaCl之10mM Tris-HCl緩衝液(pH7.2)。此管柱迄使用時於4℃下保管。
將a)所調製的純化抗人類Siglec-15多株抗體(No.1、2、3)各7ml,以Millex GV過濾器(Millipore公司製)過濾後,以c)製作,以流速0.25m1/min注加到預先以ApplyBuffer平衡化的人類Siglec-15-Fc固相化管柱。使用ApplyBuffer 5ml以流速0.25m1/min洗淨管柱後,使用含0.5M NaCl的0.1M甘胺酸鹽酸緩衝液(pH2.7)5ml以流速0.25ml/min溶出吸附於管柱的蛋白質。將抗人類Siglec-15多株抗體(No.1,2、3)以親和性管柱純化的色譜圖示於第30圖。溶出液於Mini-sorp tube(Nunc公司製)以0.5m1/Fr分取後,直接添加1M Tris 16μl中和。以甘胺酸鹽酸緩衝液溶出的IgG蛋白質劃分約2.5ml(Fr.3~7)各別注加到以含0.01% Tween 20的磷酸鹽緩衝Dulbecco平衡鹽類溶液(T-PBS)平衡化的PD-10脫鹽管柱(Amersham Bioscience公司製)而以T-PBS溶出,獲得溶劑置換為T-PBS的樣品3.5ml。調製的樣品迄使用為止凍結保存於-80℃。
於純化兔抗人類Siglec-15多株抗體樣品(自PD-10脫鹽管柱所溶出的蛋白質劃分),使用牛IgG作為標準樣品,以DC-蛋白質試驗套組(BioRad公司製)測定蛋白質濃度。如表9所示,No.1~3批每一者可調製約9.1~11.9mg之親和性純化抗人類Siglec-15多株抗體。
將正常人類破骨前驅細胞(Normal Human Natural Osteoclast Precursor Cells,購自三光純藥,目錄編號2T-110),依細胞添附的指示書以1×104
細胞/孔的方式接種於96孔平盤。又培養基為使用添加含有胎牛血清(終濃度10%)、人類RANKL(終濃度69ng/ml)及人類M-CSF(終濃度33ng/ml)等的OPGM添加因子套組(購自三光純藥,目錄編號PT-9501)的破骨前驅細胞用基礎培養基(OPBM,購自三光純藥,目錄編號PT-8201)。於此培養上清液中,將實施例34之d)所製作的親和性純化.抗人類Siglec-15 No.2抗體以終濃度成為3、30μg/ml的方式,又實施例34之b)中製作的免疫前兔IgG以終濃度成為30μg/ml的方式添加,於CO2
培養箱中培養5日。培養後除去上清液,添加10%中性福馬林進行細胞固定。細胞固定後,以蒸餾水洗淨2次,以100μl/孔添加TRAP染色液(0.27mM萘酚AS-MX磷酸(Sigma公司製)、1.6mM固紅紫LB鹽(Sigma公司製)、1%二甲基甲醯胺、50mM酒石酸鈉、0.1M乙酸鈉緩衝液(pH5.0)),於室溫反應5分鐘。以蒸餾水洗淨2次,於顯微鏡下觀察細胞(第31圖)。此結果顯示高度細胞融合的巨大破骨細胞之形成經由添加抗人類Siglec-15多株抗體而顯著地被抑制。另一方面,添加免疫前IgG的場合,不認為有此等破骨細胞融合之抑制。此等固定、染色孔中,核數為5個以上之TRAP陽性多核細胞數於倒立顯微鏡下計數(第32圖)。此結果觀察到親和性純化.抗人類Siglec-15 No.2抗體於終濃度30μg/ml添加的孔中,多核破骨細胞之形成之顯著抑制。添加30μg/ml免疫前IgG的場合可見多核破骨細胞之形成之抑制傾向,但與此等孔比較的場合,經由抗人類Siglec-15 No.2抗體之添加,顯示多核破骨細胞之形成顯著地被抑制。如此可知,自正常人類破骨前驅細胞之TRAP陽性破骨細胞之多核化‧細胞融合,經由與Siglec-15專一性結合的抗體而被抑制。
大鼠抗小鼠siglec-15單株抗體對人類siglec-15蛋白質的結合性依ELISA法評價。實施例32之b)所製作的人類siglec-15-Fc蛋白質以成為5μg/ml的方式以0.1M碳酸鈉緩衝液(pH9.5)稀釋,以100μl/孔添加於96孔平盤(NalgeNunc公司製、目錄編號:430341)。於室溫1小時放置後除去溶液,添加300μl/孔之洗淨緩衝液(含有0.05% Tween 20磷酸鹽緩衝生理食鹽水)、除去。此洗淨作業再進行1次後,200μl/孔添加含有25%Blockace(大日本住友製藥公司製)的磷酸鹽緩衝生理食鹽水,經由於室溫1小時放置而進行阻斷。除去液體以300μl/孔之洗淨緩衝液2次洗淨後,將實施例24調製的大鼠抗小鼠siglec-15單株抗體或大鼠對照組IgG(R&D systems公司製),使用ELISA緩衝液(含12.5%Blockace、0.05% Tween 20之磷酸鹽緩衝生理食鹽水)將終濃度稀釋為1.28~20,000ng/ml(5倍稀釋系列),以100μ1/孔添加。於室溫放置1小時後去除液體,以300μl/孔之洗淨緩衝液洗淨3次。接著,使用ELISA緩衝液,100μl/孔添加1,000倍稀釋的HRP(西洋山癸過氧化物酶)標識山羊抗大鼠IgG抗體(Beckman Coulter公司製),於室溫放置1小時。去除液體,以300μl/孔之洗淨緩衝液洗淨3次後,使用過氧化物酶用發色套組(住友Bakelite公司製),依套組中添附的説明書使發色。發色後,使用微量平盤讀數機(日本Molecular Devices公司製)於492nm測定吸光度。此結果,檢討的大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體10個檢體全部中,確認依存抗體濃度的對人類Siglec-15蛋白質之結合(第33圖)。尤其結合活性強者為#1A1、#3A1、#24A1、#32A1、#61A1之5檢體,#8A1、#34A1、#39A1之3檢體為比較上結合活性為弱的。另一方面,大鼠對照組IgG未認為有對人類Siglec-15蛋白質之結合。由以上結果得知,於實施例24調製的大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體,顯示不僅結合小鼠Siglec-15亦結合人類Siglec-15,而且一部份抗體對人類Siglec-15為強烈結合。
於實施例36,因確認大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體亦結合人類Siglec-15,檢討此等抗體對人類破骨細胞形成及骨吸收活性的效果。
a)由大鼠抗小鼠Sig1ec-15單株抗體添加對正常人類破骨前驅細胞之破骨細胞融合的影響(TRAP染色)
將正常人類破骨前驅細胞(Normal Human Natura1Osteoclast Precursor Cells,購自三光純藥,目錄編號2T-110),依細胞添附之指示書以1×104
細胞/孔的方式接種於96孔平盤。又,培養基使用添加含有胎牛血清(終濃度10%)、人類RANKL(終濃度66ng/ml)及人類M-CSF(終濃度33ng/ml)等的OPGM添加因子套組(購自三光純藥,目錄編號PT-9501)的破骨前驅細胞用基礎培養基(OPBM、購自三光純藥、目錄編號PT-8201)。於此培養上清液中,實施例24所調製的大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體及大鼠對照組IgG(R&D systems公司製)以終濃度30μg/ml的方式添加,於CO2
培養箱中培養4日。培養後除去上清液,添加10%中性福馬林進行細胞固定。細胞固定後,以蒸餾水洗淨2次,100μl/孔添加TRAP染色液(0.27mM萘酚AS-MX磷酸(Sigma公司製)、1.6mM固紅紫LB鹽(sigma公司製)、1%二甲基甲醯胺、50mM酒石酸鈉、0.1M乙酸鈉緩衝液(pH5.0)),於室溫反應5分鐘。以蒸餾水洗淨2次,於顯微鏡下觀察細胞(第34圖)。此結果顯示,經由#32A1抗體添加,高度細胞融合的巨大破骨細胞之形成幾乎完全被抑制。又,#41B1抗體,亦顯示顯著抑制高度細胞融合的巨大破骨細胞之形成。另一方面,此以外之大鼠抗小鼠siglec-15單株抗體(#1A1抗體他)及大鼠對照組IgG,末認為有此等破骨細胞融合之顯著抑制。如此可知,自正常人類破骨前驅細胞之TRAP陽性破骨細胞之多核化.細胞融合,經由與siglec-15蛋白質專一性結合的單株抗體而被抑制。
b)由大鼠抗小鼠siglec-15單株抗體(#32A1)添加對正常人類破骨前驅細胞之破骨細胞融合的影響(TRAP染色)
將正常人類破骨前驅細胞(Normal Human Natural Osteoclast Precursor Cells,購自三光純藥,目錄編號2T-110),依細胞所添附之指示書以1×104
細胞/孔的方式接種於96孔平盤。又培養基使用添加含有胎牛血清(終濃度10%)、人類RANKL(終濃度68.4ng/ml)及人類M-CSF(終濃度33ng/ml)等的OPGM添加因子套組(購自三光純藥,目錄編號PT-9501)的破骨前驅細胞用基礎培養基(OPBM、購自三光純藥,目錄編號PT-8201)。於此培養上清液中,將實施例24所調製的大鼠抗小鼠siglec-15單株抗體(#32A1抗體)以終濃度0.1、0.3、1、3μg/ml的方式添加,於CO2
培養箱中培養3日。培養後除去上清液,添加10%中性福馬林進行細胞固定。細胞固定後,以蒸餾水洗淨2次,100μl/孔添加TRAP染色液(0.27mM萘酚AS-MX磷酸(Sigma公司製)、1.6mM固紅紫LB鹽(Sigma公司製)、1%二甲基甲醯胺、50mM酒石酸鈉、0.1M乙酸鈉緩衝液(pH5.0)),於室溫反應5分鐘。以蒸餾水洗淨2次,於顯微鏡下觀察細胞(第35圖)。此結果顯示,TRAP陽性多核破骨細胞形成於#32A1抗體為0.3μg/ml至3μg/ml之範圍下係濃度依存性被抑制。
c)由大鼠抗小鼠siglec-15單株抗體(#32A1)添加對正常人類破骨前驅細胞之骨吸收活性的影響(使用塗布膠原蛋白的平盤之評價)
已知破骨細胞經由放出組織蛋白酶K等蛋白酶,分解骨組織之構成成分的I型膠原蛋白。Osteolyse Assay Kit(Lonza 公司製,目錄編號PA-1500)提供塗布結合銪的人類膠原蛋白的96孔平盤(96-well Osteolyse Cell culture plate),於同一平盤上培養破骨細胞時,經由測定上清液中游離的螢光膠原蛋白片段量,可於活體外評價破骨細胞之骨吸收活性。
將正常人類破骨前驅細胞(Normal Human Natural Osteoclast Precursor Cells,購自三光純藥,目錄編號2T-110),依細胞添附之指示書以1×104
細胞/孔之方式接種於96孔破骨細胞培養盤。又培養基使用添加含有胎牛血清(終濃度10%)、人類RANKL(終濃度68.4ng/ml)及人類M-CSF(終濃度33ng/ml)等的OPGM添加因子套組(購自三光純藥,目錄編號PT-9501)的破骨前驅細胞用基礎培養基(OPBM,購自三光純藥,目錄編號PT-8201)。此培養上清液中,將實施例24所調製的大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體(# 32A1抗體)以終濃度成為0.1、0.3、1、3μg/ml的方式添加,於CO2
培養箱中培養3日。採取培養上清液10μl中,添加200μl Osteolyse Assay Kit所附之螢光釋放試劑(Fluorophore Releasing Reagent),經由使用螢光平盤讀數機(ARVO MX,PerkinElmer公司製)測定螢光強度(激發:340nm、放射:615nm),定量培養上清液中放出的游離螢光膠原蛋白片段量(第36圖)。由此結果得知,經由RANKL添加所增加的螢光膠原蛋白片段量,由# 32A1抗體於0.3μg/ml至3μg/ml之範圍內濃度依存性被抑制。據此得知,人類破骨細胞之骨吸收活性,經由與Siglec-15蛋白質專一性結合的單株抗體而被抑制。
抗人類Siglec-15抗體之製作可依下述步驟進行。
將於實施例30至32所取得的可溶性人類Siglec-15蛋白質投與雌性4~10週齡之BALB/c小鼠腹腔內。2週後,將相同膜劃分溶液投與腹腔內而追加免疫。
自追加免疫3日後之小鼠摘出脾臟,將其放入無血清培養基中,於網孔上使用藥匙將其壓碎。將通過網孔之細胞懸濁液離心使脾臟細胞沈澱。
另一方面,骨髓瘤細胞NS1(American Type Culture Collection TIB-18)同樣地以無血清培養基洗淨,使懸濁。
使用所得Siglec-15表現細胞及骨髓瘤細胞,依常法進行細胞融合。
産生抗人類Siglec-15抗體的融合細胞可使用細胞ELISA的方法及使用流式細胞儀的方法而選別。
於上述(3)所選別的細胞群,經由重複5次由使用(3)之細胞ELISA的方法及使用流動細胞儀的方法的一連串步驟,可獲得數個選殖株之産生與人類Siglec-15表現細胞結合但與導入前之細胞未結合的單一抗體的融合瘤。
培養經(1)至(4)個步驟作出的小鼠-小鼠融合瘤,回收上清液。回收所得上清液並透析後使用高速液體層析裝置進行抗體之粗純化。層析之各劃分中之抗人類Siglec-15抗體力價,由使用人類Siglec-15蛋白質的ELISA法檢定。收集抗體力價高的劃分,供與至抗體親和性純化用管柱。管柱內以管柱平衡化緩衝液洗淨後,以管柱之溶出緩衝液溶出抗體。各自溶出液於溶出終了後立刻放入離心管型超過濾器之上部而離心。除去於過濾器下部回收的濾液後,上部中添加pBs,洗淨5次。於過濾器上部所殘餘的液體作為抗人類siglec-15抗體試料。
使用於實施例30至32所取得的可溶性人類siglec-15蛋白質,依實施例23及24記載之方法,可製作大鼠抗人類siglec-15單株抗體。
使用實施例38或39所得抗人類siglec-15單株抗體,可試驗對該抗體所示破骨細胞形成的抑制效果。為試驗對小鼠破骨細胞形成的效果,可使用實施例17、19、20、21、22、
或26之方法。為試驗對人類破骨細胞形成之抑制效果,可使用實施例35或37之方法。
本發明之抗siglec-15抗體具有破骨細胞之分化或骨吸收活性之抑制能,含有該抗siglec-15抗體之醫藥組成物可作為骨代謝異常疾病之治療劑。
序列編號5-人工序列之説明:小鼠Siglec-15之cDNA增幅用引子
序列編號6-人工序列之説明:小鼠Siglec-15之cDNA增幅用引子
序列編號7-人工序列之説明:小鼠Siglec-15之cDNA增幅用引子
序列編號8-人工序列之説明:小鼠Siglec-15之cDNA增幅用引子
序列編號9-人工序列之説明:小鼠Siglec-15之cDNA之檢出用探針
序列編號10-人工序列之説明:小鼠L32核糖體蛋白質之cDNA增幅用引子
序列編號11-人工序列之説明:小鼠L32核糖體蛋白質之cDNA增幅用引子
序列編號12-人工序列之説明:小鼠L32核糖體蛋白質之cDNA之檢出用探針
序列編號13-人工序列之説明:小鼠組織蛋白酶K之cDNA增幅用引子
序列編號14-人工序列之説明:小鼠組織蛋白酶K之cDNA增幅用引子
序列編號15-人工序列之説明:小鼠組織蛋白酶K之cDNA之檢出用探針序列編號16-人工序列之説明:小鼠TRAP之cDNA增幅用引子
序列編號17-人工序列之説明:小鼠TRAP之cDNA增幅用引子
序列編號18-人工序列之説明:小鼠TRAP之cDNA之檢出用探針
序列編號21-人工序列之説明:可溶型小鼠siglec-15之cDNA增幅用引子
序列編號22-人工序列之説明:可溶型小鼠siglec-15之cDNA增幅用引子
序列編號23-人工序列之説明:可溶型小鼠siglec-15之cDNA鹼基序列決定用引子
序列編號24-人工序列之説明:可溶型小鼠siglec-15之cDNA鹼基序列決定用引子
序列編號25-人工序列之説明:小鼠siglec-15-His之cDNA鹼基序列
序列編號26-人工序列之説明:小鼠siglec-15-His之胺基酸序列
序列編號27-人工序列之説明:小鼠siglec-15-Fc之cDNA鹼基序列
序列編號28-人工序列之説明:小鼠siglec-15-Fc之胺基酸序列
序列編號29-人工序列之説明:人類siglec-15之cDNA增幅用引子
序列編號30-人工序列之説明:人類siglec-15之cDNA增幅用引子
序列編號31-人工序列之説明:人類組織蛋白酶K之cDNA增幅用引子
序列編號32-人工序列之説明:人類組織蛋白酶K之cDNA增幅用引子
序列編號33-人工序列之説明:人類組織蛋白酶K之cDNA之檢出用探針
序列編號34-人工序列之説明:人類TRAP之cDNA增幅用引子
序列編號35-人工序列之説明:人類TRAP之cDNA增幅用引子
序列編號36-人工序列之説明:人類TRAP之cDNA之檢出用探針
序列編號37-人工序列之説明:人類Siglec-15之cDNA增幅用引子
序列編號38-人工序列之説明:人類Siglec-15之cDNA增幅用引子
序列編號39-人工序列之説明:人類Siglec-15之cDNA之檢出用探針
序列編號40-人工序列之説明:人類L32核糖體蛋白質之cDNA增幅用引子
序列編號41-人工序列之説明:人類L32核糖體蛋白質之cDNA增幅用引子序列編號42-人工序列之説明:人類L32核糖體蛋白質之cDNA檢出用探針
序列編號45-人工序列之説明:可溶型人類Siglec-15之cDNA增幅用引子
序列編號46-人工序列之説明:可溶型人類Siglec-15之cDNA增幅用引子
序列編號47-人工序列之説明:人類Siglec-15-His之cDNA鹼基序列
序列編號48-人工序列之説明:人類Siglec-15-His之胺基酸序列
序列編號49-人工序列之説明:人類Siglec-15-Fc之cDNA鹼基序列
序列編號50-人工序列之説明:人類Siglec-15-Fc之胺基酸序列
第1圖為顯示人類巨細胞瘤組織中RANK、RANKL、組織蛋白酶K及TRAP基因之表現輪廓解析之圖。
第2圖為顯示人類巨細胞瘤組織中siglec-15基因之表現輪廓解析之圖。
第3圖為顯示自RAW264.7或小鼠骨髓細胞誘導破骨細胞分化時Siglec-15基因表現量之變化之圖。
第4圖為顯示伴隨RAW264.7細胞之破骨細胞分化時組織蛋白酶K及TRAP基因之表現之圖。
第5圖為顯示伴隨RAW264.7細胞之破骨細胞分化之Siglec-15基因之表現之圖。
第6圖由293F細胞之小鼠Siglec-15-His之表現的培養時間的變動,使用SDS-聚丙烯酸醯胺電泳與抗6 His-HRP抗體的西方墨漬法檢測的結果。
第7圖由293F細胞之小鼠Siglec-15-Fc之表現的培養時間的變動,使用SDS-聚丙烯酸醯胺電泳與抗人類IgG Fc-HRP抗體的西方墨漬法檢測的結果。
第8圖以HisTrap HP層析柱及Resource Q層析柱所純化的小鼠Siglec-15-His之純度以SDS-聚丙烯酸醯胺電泳及銀染色評價的結果。
第9圖以HisTrap HP層析柱及Resource Q層析柱所純化的小鼠Siglec-15-His之舉動,以使用SDS-聚丙烯酸醯胺電泳及抗V5-HRP抗體的西方墨漬法檢測的結果。
第10圖以HiTrap蛋白質A層析柱所純化的小鼠Siglec-15-Fc之純度以SDS-聚丙烯酸醯胺電泳及銀染色評價的結果。
第11圖經純化抗小鼠Siglec-15多株抗體不僅結合Siglec-15-Fc亦結合Siglec-15-His,以使用SDS-聚丙烯酸醯胺電泳及抗小鼠Siglec-15多株抗體及抗兔IgG-HRP抗體之西方墨漬法確認的結果。
第12圖抗小鼠Siglec-15多株抗體以將小鼠Siglec-15-Fc固相化的親和性管柱純化的色譜圖。
第13圖小鼠Siglec-15-Fc固相化親和性層析柱純化的小鼠Siglec-15-Fc之純度以SDS-聚丙烯酸醯胺電泳及銀染色評價的結果。
第14圖抗小鼠Siglec-15多株抗體以Superose 6‧凝膠過濾管柱純化的色譜圖。
第15圖經由親和性純化的抗小鼠Siglec-15多株抗體之添加,試驗小鼠骨髓非附著細胞向破骨細胞分化(RANKL刺激)之影響的結果(N=3)。
第16圖經由凝膠過濾純化的抗小鼠Siglec-15多株抗體之添加,以TRAP酵素活性試驗小鼠骨髓非附著細胞向破骨細胞分化(RANKL刺激)之影響的結果(N=3)。
第17圖經由抗小鼠Siglec-15多株抗體之添加,經由小鼠骨髓非附著細胞之破骨細胞分化(RANKL刺激)之抑制之抗原以TRAP酵素活性中和試驗的結果(N=3)。
第18圖經由抗小鼠Siglec-15多株抗體之添加,對小鼠骨髓非附著細胞之破骨細胞分化(TNFα刺激)之影響以TRAP酵素活性試驗的結果(N=3)。
第19圖經由抗小鼠Siglec-15多株抗體之添加,對小鼠骨髓非附著細胞之破骨細胞分化(TNFα刺激)之影響以TRAP染色評價的顯微鏡照相。
第20圖經由抗小鼠Siglec-15多株抗體之添加,自小鼠骨髓細胞之破骨細胞分化(活性型維生素D3
刺激)之抑制以TRAP酵素活性所示的圖(N=6)。
第21圖經由抗小鼠Siglec-15多株抗體之添加,自小鼠骨髓細胞之巨大破骨細胞形成(活性型維生素D3
刺激)之抑制以TRAP染色所示的顯微鏡照相。
第22圖經由抗小鼠Siglec-15多株抗體之添加,自小鼠骨髓細胞之巨大破骨細胞形成(人類RANKL刺激)之抑制以TRAP染色所示的顯微鏡照相。
第23圖經由抗小鼠Siglec-15多株抗體之添加,自RAW264.7細胞之巨大破骨細胞形成(人類RANKL刺激)之抑制及經由可溶型Siglec-15之該抑制作用之解除以TRAP染色所示的顯微鏡照相。
第24圖對小鼠Siglec-15-Fc固相化平盤之大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體之結合以ELISA法試驗的結果。
第25圖經由抗小鼠Siglec-15單株抗體之添加,試驗對小鼠骨髓非附著細胞之破骨細胞分化(RANKL刺激)之影響的結果。
第26圖經由抗小鼠Siglec-15單株抗體之添加,試驗對小鼠骨髓非附著細胞之破骨細胞分化(RANKL刺激)之影響的結果。
第27圖自正常人類破骨前驅細胞誘導破骨細胞分化時顯示組織蛋白酶K、TRAP及Siglec-15基因之表現變化的圖。
第28圖以HisTrap HP層析柱及Resource Q層析柱所純化的人類Siglec-15-His之純度以SDS-聚丙烯酸醯胺電泳檢討的結果。
第29圖以蛋白質A層析柱純化的人類Siglec-15-Fc之純度以SDS-聚丙烯酸醯胺電泳檢討的結果。
第30圖將抗人類Siglec-15多株抗體以經固相化人類siglec-15-Fc的親和性管柱純化的色譜圖。
第31圖經由抗人類Siglec-15多株抗體之添加,自正常人類破骨前驅細胞之巨大破骨細胞形成之抑制以TRAP染色所示的顯微鏡照相。
第32圖經由抗人類Siglec-15多株抗體之添加,對自正常人類破骨前驅細胞之多核破骨細胞之形成的影響,以倒立顯微鏡計數具有5個以上之核的TRAP陽性細胞作評價的結果。
第33圖對人類Siglec-15-Fc固相化平盤之大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體之結合以ELISA法試驗的結果。
第34圖經由大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體之添加,自正常人類破骨前驅細胞之巨大破骨細胞形成之抑制以TRAP染色顯示的顯微鏡照相。
第35圖經由大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體(#32A1抗體)之添加,自正常人類破骨前驅細胞之巨大破骨細胞形成之抑制以TRAP染色所示的顯微鏡照相。
第36圖經由大鼠抗小鼠Siglec-15單株抗體(#32A1抗體)之添加,顯示自正常人類破骨細胞之骨吸收活性之抑制的圖(N=6)。
Claims (32)
- 一種抗體或具有與抗原結合活性之該抗體的部分片段,其專一性辨識以下(a)及(d)記載之胺基酸序列之任一者或以上的序列,而抑制破骨細胞之形成、及經由破骨細胞之骨吸收之兩者或任一者:(a)序列表之序列編號2所示胺基酸序列;(c)序列表之序列編號2所示胺基酸序列之21號至260號胺基酸殘基所構成的序列;(d)序列表之序列編號4所示胺基酸序列;(f)序列表之序列編號4所示胺基酸序列之21號至258號之胺基酸殘基所構成的序列。
- 如申請專利範圍第1項之抗體或具有與抗原結合活性之該抗體的部分片段,其抑制破骨細胞細胞融合之過程。
- 如申請專利範圍第1項之抗體或具有與抗原結合活性之該抗體的部分片段,其抑制由TNFα所誘導的破骨細胞形成。
- 如申請專利範圍第1項之抗體或具有與抗原結合活性之該抗體的部分片段,於30μg/ml以下之濃度抑制活體外之破骨細胞形成。
- 如申請專利範圍第4項之抗體或具有與抗原結合活性之該抗體的部分片段,於3μg/ml以下之濃度抑制活體外之破骨細胞形成。
- 如申請專利範圍第5項之抗體或具有與抗原結合活性之 該抗體的部分片段,於1μg/ml以下之濃度抑制活體外之破骨細胞形成。
- 如申請專利範圍第6項之抗體或具有與抗原結合活性之該抗體的部分片段,於63ng/ml至1μg/ml之濃度抑制活體外之破骨細胞形成。
- 如申請專利範圍第1項之抗體或具有與抗原結合活性之該抗體的部分片段,其經由破骨細胞抑制骨吸收。
- 如申請專利範圍第8項之抗體或具有與抗原結合活性之該抗體的部分片段,於3μg/ml以下之濃度,於活體外抑制經由破骨細胞之骨吸收。
- 如申請專利範圍第9項之抗體或具有與抗原結合活性之該抗體的部分片段,於0.3μg/ml至3μg/ml之濃度,於活體外抑制經由破骨細胞之骨吸收。
- 如申請專利範圍第1項之抗體或具有與抗原結合活性之該抗體的部分片段,其經由包含以下步驟1)及2)之方法所獲得:1)製作專一性辨識以下之(a)及(d)記載之胺基酸序列之任一者或以上序列之抗體的步驟:(a)序列表之序列編號2所示胺基酸序列;(c)序列表之序列編號2所示胺基酸序列之21號至260號之胺基酸殘基而成之序列;(d)序列表之序列編號4所示胺基酸序列;(f)序列表之序列編號4所示胺基酸序列之21號至258 號之胺基酸殘基而成之序列;2)選別顯示破骨細胞形成抑制活性及/或骨吸收抑制活性之抗體的步驟。
- 如申請專利範圍第1項之抗體或具有與抗原結合活性之該抗體的部分片段,其為單株抗體。
- 如申請專利範圍第12項之抗體或具有與抗原結合活性之該抗體的部分片段,其具有與融合瘤#32A1(FERM BP-10999、BCRC960381)所產生的抗體相同的抗原決定位專一性。
- 如申請專利範圍第12項之抗體或具有與抗原結合活性之該抗體的部分片段,其與融合瘤#32A1(FERM BP-10999、BCRC960381)所產生的抗體競爭。
- 如申請專利範圍第12項之抗體或具有與抗原結合活性之該抗體的部分片段,其為融合瘤#32A1(FERM BP-10999、BCRC960381)所產生之抗體。
- 如申請專利範圍第12項之抗體或具有與抗原結合活性之該抗體的部分片段,其具有與融合瘤#41B1(FERM BP-11000、BCRC960382)所產生的抗體相同的抗原決定位專一性。
- 如申請專利範圍第12項之抗體或具有與抗原結合活性之該抗體的部分片段,其與融合瘤#41B1(FERM BP-11000、BCRC960382)所產生的抗體競爭。
- 如申請專利範圍第12項之抗體或具有與抗原結合活性 之該抗體的部分片段,其為融合瘤#41B1(FERM BP-11000、BCRC960382)所產生之抗體。
- 如申請專利範圍第1至18項中任一項之抗體或具有與抗原結合活性之該抗體的部分片段,其為嵌合抗體。
- 如申請專利範圍第19項之抗體或具有與抗原結合活性之該抗體的部分片段,其經人化。
- 如申請專利範圍第1至14、16或17項中任一項之抗體或具有與抗原結合活性之該抗體的部分片段,其為人類抗體。
- 如申請專利範圍第1至18項中任一項之抗體或具有與抗原結合活性之該抗體的部分片段,其為IgG抗體。
- 如申請專利範圍第1至18項中任一項之抗體或具有與抗原結合活性之該抗體的部分片段,其選自Fab、F(ab’)2、Fab’及Fv組成之群。
- 如申請專利範圍第1至14、16或17項中任一項之抗體或具有與抗原結合活性之該抗體的部分片段,其為scFv。
- 一種醫藥組成物,其特徵為含有至少任一種之申請專利範圍第1至24項之抗體或具有與抗原結合活性之該抗體的部分片段。
- 如申請專利範圍第25項之醫藥組成物,其為骨代謝異常之治療劑。
- 一種骨代謝異常之治療用醫藥組成物,其含有申請專利範圍第1至24項之抗體或具有與抗原結合活性之該抗體 的部分片段之至少任一者,以及選自雙膦酸酯、活性型維生素D3 、抑鈣素(calcitonin)及其衍生物、雌二醇等之荷爾蒙製劑、SERMs(選擇性雌激素受體調節劑)、依普黃酮(ipriflavone)、維生素K2 (四烯甲萘醌(menatetrenone))、鈣製劑、PTH(副甲狀腺荷爾蒙)製劑、非類固醇性抗炎症劑、可溶性TNF受體製劑、抗TNFα抗體或具有與抗原結合活性之該抗體的部分片段、抗PTHrP(副甲狀腺荷爾蒙-相關蛋白質)抗體或具有與抗原結合活性之該抗體的部分片段、IL-1受體拮抗劑、抗IL-6受體抗體或具有與抗原結合活性之該抗體的部分片段、抗RANKL抗體或具有與抗原結合活性之該抗體的部分片段及OCIF(破骨細胞生成抑制因子(osteoclastogenesis inhibitory factor))組成之群之至少任一者。
- 如申請專利範圍第26或27項之醫藥組成物,其中骨代謝異常為選自骨質疏鬆症、伴隨關節類風濕之骨破壞、癌性高鈣血症、伴隨多發性骨髓瘤或癌之骨轉移之骨破壞、巨細胞瘤、由齒根膜炎而來之齒喪失、人工關節周圍之骨融解、慢性骨髓炎之骨破壞、骨貝西氏病(Behçet disease)、腎性骨異營養症、及骨形成不全症組成之群。
- 如申請專利範圍第28項之醫藥組成物,其中骨代謝異常為骨質疏鬆症、伴隨關節類風濕之骨破壞、或伴隨癌之骨轉移之骨破壞。
- 如申請專利範圍第29項之醫藥組成物,其中骨質疏鬆 症為閉經後骨質疏鬆症、老人性骨質疏鬆症、因使用類固醇或免疫抑制劑等之治療用藥劑之續發性骨質疏鬆症、或伴隨關節類風濕之骨質疏鬆症。
- 一種融合瘤#32A1(FERM BP-10999、BCRC960381)。
- 一種融合瘤#41B1(FERM BP-11000、BCRC960382)。
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