DE69229477T2

DE69229477T2 - Methoden zur Herstellung humanisierter Antikörper

Info

Publication number: DE69229477T2
Application number: DE69229477T
Authority: DE
Inventors: Michael Baier; Hendricus Hoogenboom; Laurent Jespers; Gregory Winter
Original assignee: Medical Research Council; Cambridge Antibody Technology Ltd
Current assignee: Medical Research Council; MedImmune Ltd
Priority date: 1991-09-23
Filing date: 1992-09-23
Publication date: 1999-12-09
Anticipated expiration: 2012-09-24
Also published as: EP0605522A1; JPH06510671A; CA2119930A1; AU2593392A; DK0605522T3; ATE181571T1; WO1993006213A1; DE69229477D1; AU665025B2; JP3540315B2; EP0605522B1; CA2119930C

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von Antikörpern. Genauer gesagt betrifft sie die Herstellung von Antikörpern mit verstärkten menschlichen Eigenschaften gegenüber einem Ausgangsantikörper, der für das gleiche Antigen spezifisch ist.
Viele monoklonale Antikörper von Nagetieren wurden unter Anwendung von Hybridom-Technologie isoliert und beim Menschen für therapeutische und diagnostische in vivo-Zwecke verwendet. Beispielsweise war eine frühe Anwendung dieser monoklonalen Mäuse-Antikörper das Abzielen von Mitteln, um Tumore abzutöten oder abzubilden (F. H. Deland und D. M. Goldenberg, "Radionuclide Imaging", 289-97 (1982), D. E. Kuhl (Hrsg.), Pergamon, Paris; R. Levy und R. A. Miller, Ann. Rev. Med. 34, 107-116 (1983)). Die Verwendung solcher Antikörper in vivo kann aber zu Problemen führen. Die fremden Immunglobuline können eine Anti-Globulin-Reaktion hervorrufen (als menschliche Antimäuse-Antikörper-[HAMA-]Reaktion bekannt), welche die Therapie beeinträchtigen (R. A. Miller et al., Blood 62, 988-995 (1983)) oder allergische oder Immunkomplex-Hypersensitivität hervorrufen kann (B. Ratner, "Allergy Anaphylaxis and Immunotherapy", Williams und Wilkins, Baltimore, 1943).
Um diese Probleme zu lösen, entwickelten Winter et al. (GB 2.188.638B) ein Verfahren zum Humanisieren oder "Umformen" solcher Antikörper. Die Komplementaritäts-Bestimmungsbereiche (CDRs) des Mäuse-Antikörpers, welche die Antigen-Kombinationsstelle umfassen, werden in menschliche Rahmenbereiche eingefügt, wodurch Antikörper erzeugt werden, in denen nur die CDR-Sequenzen aus dem ursprünglichen Mäuse-Antikörper stammen. Dieses Verfahren wird als "CDR-Transplantation" oder "CDR- Imprimierung" bezeichnet. Ein solcher umgeformter Antikörper, DAMPATH-1 (L. Riechmann et al., Nature 322, 323-327 (1988)), wurde in der Behandlung von B-Zellenlymphom (G. Hale et al., Lancet 2, 1394-1399 (1988)) und Vaskulitis (P. W. Mathieson et al., New Engl. J. Med. 323, 250-254 (1990)) und rheumatoider Arthritis (V. Kyle et al., J. Rheumatol. 18, 1737-1738 (1991)) erfolgreich eingesetzt. Dies führte zur Humanisierung einer großen Anzahl an Antikörpern, die aus therapeutischen Gründen gegen Krebsmarker gerichtet werden, z. B. Interleukin 2-Rezeptor (C. Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)); epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor (C. A. Kettleborough et al., Prot. Eng. 4,773-783 (1991); P. Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4285-4289 (1992)) und karzinoembryonisches Antigen (K. Bosslet et al., Brit. J. Cancer 65, 234-238(1992)). Einige Antikörper gegen infektiöse Viren wurden ebenfalls humanisiert, z. B. Antikörper gegen das respirative Synnzytiumvirus (P. R. Tempest et al., Bio/Technology 9, 266-271 (1991)); Herpes simplex-Virus (M. S. Co et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2869-2873 (1991)) und menschliches Immunschwächevirus (H. Maeda et al., Human Antibodies and Hybridomas 2,124-134 (1991)). Humanisierte Antikörper wurden auch zur Abbildung von Tumoren nach Markierung mit Radioisotopen verwendet (V. Hird et al., Brit. J. Cancer 64, 911-914 (1991)).
Die erfolgreiche Umformung hängt von den Nagetier- und menschlichen Rahmenbereichen ab, die strukturell konserviert sind - sowohl in der Ausrichtung der β-Faltblätter jeder Domäne als auch in der gemeinsamen Packung von Schwer- und Leichtketten; die hypervariablen Schleifen stellen die Mehrzahl an Kontakten mit dem Antigen dar und werden in ähnlicher Weise durch den darunterliegenden β-Faltblattrahmen getragen. Obwohl diese Bedingungen wahrscheinlich für einige Antikörper gelten, erwies sich die Wiederherstellung von Schlüsselkontakten zwischen den Schleifen und dem Rahmen in anderen als notwendig und wurde durch molekulare Modellierung (Riechmann et al., 1988, s. o.; Tempest et al., 1991, s. o.) und systematisches Übereinstimmen von Nagetier- und menschlichen Rahmenbereichen unterstützt, um Unterschiede in Primärsequenzen zu minimieren (Queen et al., 1989, s. o.; Gorman et ab, 1991, s. o., Maeda et al., s. o.). Untersuchungen zeigten, daß es einige Reste in der "Vernier"-Zone gibt, die den CDRs der variablen Domänen der Schwer- und Leichtkette zugrundeliegen, welche die CDR-Struktur anpassen und mittels Feineinstellung an das Antigen angleichen können und so einen starken Einfluß auf Affinität und Spezifität ausüben (J. Foote und G. Winter, J. Mol. Biol. 224, 487-499 (1992)). Eine Variation dieses Ansatzes ist die Übertragung der Mäuse-CDRs auf einen heterozygoten Human/Mäuse-Rahmen, worin die verdeckten Aminosäurereste aus dem Mäuse-Antikörper und die freiliegenden Amino säuren aus homologen menschlichen Rahmen stammen (E. A. Padlan et al., Mol. Immunol. 28, 485-498 (1991)).
Das Verfahren der CDR-Transplantation umfaßt die Übertragung der Antigen-Bindungsstelle von einem nicht-menschlichen (tierischen) Antikörper auf den menschlichen Antikörper. In den meisten Fällen wurden alle drei CDRs aus Schwer- und Leichtketten vom tierischen Antikörper auf einen einzelnen menschlichen Rahmen transplantiert. Man kann davon ausgehen, daß es nicht immer erforderlich ist, alle CDRs zu transplantieren, da einige CDRs möglicherweise nicht an der Bindung an Antigen beteiligt sind und CDRs mit unterschiedlichen Sequenzen (und der gleichen Länge) die gleiche Faltung aufweisen können (weshalb Kontakt vom Antigen zu den Hauptkettenkontakten trotz der unterschiedlichen Sequenzen beibehalten werden können). Einzelne Domänen (Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989)) oder sogar einzelne CDRs (R. Taub et al., J. Biol. Chem. 264, 259-265 (1989)) können alleine Antigen-Bindungsaktivitäten aufweisen. Ob nun alle oder nur einige der CDRs transplantiert werden, das Ziel der CDR- Transplatation besteht jedenfalls darin, die gleiche oder nahezu die gleiche Antigen-Bindungsstelle von tierischen auf menschliche Antikörper zu transplantieren.
Strukturell umfaßt der einfachste Antikörper (IgG) vier Polypeptidketten, zwei schwere (H) und zwei leichte (L) Ketten, die über Disulfidbindungen miteinander verbunden sind (siehe Fig. 1). Die Leichtketten liegen in zwei voneinander verschiedenen Formen namens kappa (κ) und lambda (λ) vor. Jede Kette besitzt einen konstanten Bereich (C) und einen variablen Bereich (V). Jede Kette ist in eine Reihe von Domänen unterteilt. Die Schwerketten besitzen vier Domänen: eine, die mit dem V-Bereich übereinstimmt, und drei Domänen (1, 2 und 3) im C-Bereich. Der Antikörper weist zwei Arme auf (jeder Arm ist ein Fab-Bereich), von denen jeder einen mit dem anderen assoziierten VL- und VH-Bereich besitzt. Dieses Paar von V-Vereichen (VL und VH) unterscheidet einen Antikörper vom anderen (aufgrund von Aminosäuresequenz-Variationen); zusammen ist dieses Paar für die Erkennung des Antigens und Bereitstellung einer Antigen-Bindungsstelle (ABS) verantwortlich. Noch ausführlicher ausgedrückt besteht jeder V-Bereich aus drei Komplementaritäts-Bestimmungsbereichen (CDRs), die durch vier Rahmenbereiche (FR) getrennt sind. Die CDRs sind der variabelste Teil der variablen Bereiche und erfüllen entscheidende Antigen-Bindungsfunktionen. Die CDR-Bereiche werden über ein komplexes Verfahren, das Rekombination, Mutation und Selektion umfaßt, aus vielen potentiellen Keimliniensequenzen abgeleitet.
Es stellte sich heraus, daß die Funktion der Antigenbindung von Fragmenten eines vollständigen Antikörpers erfüllt werden kann. Beispiele für Bindungsfragmente sind (i) das Fab-Fragment, bestehend aus den VL-, CH-, CL- und CH1-Domänen; (ii) das Fd-Fragment, bestehend aus den CH- und CH1-Domänen; (iii) das Fv-Fragment, bestehend aus den VL- und VH-Domänen eines einzelnen Arms eines Antikörpers; (iv) das dAb-Fragment (Ward, E. S. et al., Nature 341, 544-546 (1989)), bestehend aus einer VH-Domäne; (v) isolierte CDR-Bereiche; und (vi) F(ab')&sub2;-Fragmente, ein zweiwertiges Fragment, das zwei Fab-Fragmente umfaßt, die über eine Disulfidbrücke im Hingebereich verbunden sind.
Obwohl unterschiedliche Gene für die zwei Domänen des Fv-Fragments kodieren, erwies es sich als möglich, einen synthetischen Linker zu erzeugen; mit dem sie nach Rekombinations-Verfahren als einzelne Proteinkette ausgebildet werden können (als Einzelketten-Fv bekannt (scFv); Bird, R. E. et al., Science 242, 423-426 (1988); Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879-5883 (1988)).
Die Erfahrung mit der Humanisierung monoklonaler Antikörper zeigte, daß diese Moleküle großen therapeutischen und diagnostischen Nutzen haben. Es ist jedoch erforderlich, eine Anzahl humanisierter Antikörper-Derivatmoleküle zu überwachen, um eines zu erhalten, das die ursprünglichen Eigenschaften der monoklonalen Mäuse-Antikörper beibehält oder verbessert. Außerdem besteht die Notwendigkeit, solche Moleküle durch ein rasches und zweckmäßiges Verfahren zu erzeugen.

Terminologie

Ein Großteil der in diesem Abschnitt besprochenen Terminologie wurde im Text an der geeigneten Stelle besprochen.

Replizierbares Gen-Freilegungspaket ("replicable genetic display package", RGDP)

Dieses beschreibt ein biologisches Teilchen, das genetische Information besitzt, die dem Teilchen Replikation ermöglicht. Das Teilchen kann auf seiner Oberfläche zumindest einen Teil eines Polypeptids freilegen. Für das Polypeptid kann genetische Information kodieren, die für das Teilchen nativ ist und/oder künstlich in das Teilchen oder einen Vorläufer davon eingepflanz wurde. Das freigelegte Polypeptid kann ein beliebiger Teil eines spezifischen Bindungspaars sein, z. B. Domänen der Schwer- und Leichtkette auf der Basis eines Immunglobulinmoleküls, eines Enzyms oder eines Rezeptors usw.
Das Teilchen kann ein Virus sein, z. B. ein Bakteriophage wie etwa fd oder M13.

Paket

Damit ist ein replizierbares Gen-Freilegungspaket gemeint, in dem das Teilchen ein Element eines spezifischen Bindungspaars auf seiner Oberfläche freilegt. Das Paket kann ein Bakteriophage sein, der eine Antigen-Bindungsdomäne auf seiner Oberfläche freilegt. Diese Art von Paket wird als Phagenantikörper (pAb) bezeichnet.

Antikörper

Damit ist ein natürliches oder teilweise oder zur Gänze synthetisch produziertes Immunglobulin gemeint. Diese Proteine können aus natürlichen Quellen stammen oder teilweise oder zur Gänze synthetisch erzeugt sein.
Beispiele für Antikörper sind die Immunglobulin-Isotypen und die Fab-, F(ab¹)&sub2;-, scFv-, Fv-, dAb- und Fd-Fragmente

Antikörper-Polypeptid-Dimer

Ein Antikörper-Polypeptid-Dimer ist eine Assoziation von zwei Polypeptidketten-Komponenten eines Antikörpers mit der Fähigkeit, ein Antigen zu binden. Es kann somit ein Arm eines Antikörpers (bestehend aus einer Schwer- und einer Leichtkette), ein Fab- Fragment, das aus VL-, VH-, CL- und CH1-Antikörperdomänen besteht, ein Fv-Fragment, das aus einer VL-Domäne und einer VH-Domäne besteht, oder ein scFv ("Einzelketten- Fv") Fragment sein, das aus einer VL-Domäne besteht, die über einen synthetischen Linker mit einer VH-Domäne verbunden ist. Ein scFv-Fragment ist eine einzelne Polypeptidkette, die unter die Definition eines "Antikörper-Polypeptid-Dimers" fällt, da sie aus zwei Polypeptidketten-Komponenten eines Antikörpers besteht (über den synthetischen Linker verbunden) und zur Bindung eines Antigens fähig ist.

Immunglobulin-Überfamilie

Damit ist eine Familie von Polypeptiden gemeint, deren Mitglieder zumindest eine Domäne mit einer Struktur besitzen, die mit jener der variablen oder konstanten Domäne von Immunglobulin-Molekülen verwandt ist. Die Domäne enthält zwei β-Faltblätter und üblicherweise eine konservierte Disulfidbindung (siehe A. F. Williams und A. N. Barclay, Ann. Rev. Immunol. 6, 381-405 (1988)).
Beispiele für Mitglieder einer Immunglobulin-Überfamilie sind CD4, blutplättchenabgeleiteter Wachstumsfaktor-Rezeptor (PDGFR), interzelluläres Adhäsionsmolekül (ICAM). Sofern es der Kontext nicht anders erfordert, umfassen Bezugnahmen auf Immunglobuline und Immunglobulin-Homologe hierin Mitglieder der Immunglobulin-Überfamilie und deren Homologe.

Homologe

Dieser Ausdruck steht für Polypeptide mit den gleichen oder konservierten Resten an einer korrespondierenden Position in ihrer Primär-, Sekundär- oder Tertiärstruktur. Der Ausdruck umfaßt auch zwei oder mehr Nukleotidsequenzen, die für die homologen Polypeptide kodieren.
Beispiele für homologe Peptide sind die Immunglobulin-Isotypen.

Genetisch vielfältige Population

In Zusammenhang mit Antikörpern oder deren Polypeptidkomponenten bezieht sich dieser Terminus nicht nur auf die Diversität in der natürlichen Population von Zellen oder Organismen, sondern auch auf die Diversität, die durch künstliche Mutation in vitro oder in vivo hervorgerufen werden kann.
In vitro-Mutation etwa umfaßt statistische Mutagenese unter Verwendung von Oligonukleotiden mit statistischen Mutationen der zu variierenden Sequenz. In vivo-Mutagenese kann z. B. Mutatorstämme von Wirtsmikroorganismen verwenden, um die DNA aufzunehmen (siehe Beispiel 38 der WO 92/01047). Der Ausdruck "einzigartige Population" kann dazu verwendet werden, eine Vielzahl von z. B. Polypeptidketten zu beschreiben, die nicht genetisch vielfältig sind, d. h., die alle gleich sind. Eine eingeschränkte Population ist eine, die vielfältig ist, aber in geringerem Ausmaß als das volle Repertoire eines Tieres. Die Vielfältigkeit kann durch vorherige Selektion eingeschränkt werden, z. B. unter Verwendung von Antigen-Bindungsspezifität.

Domäne

Eine Domäne ist ein Teil eines Proteins, der in sich selbst und unabhängig von anderen Teilen des gleichen Proteins und unabhängig von einem komplementären Bindungselement gefaltet ist.

Gefaltete Einheit

Dies ist eine spezifische Kombination einer α-Helix und/oder eines β-Strangs und/oder einer β-Windungsstruktur. Domänen und gefaltete Einheiten enthalten Strukturen, die Aminosäuren zusammenbringen, die in der Primärstruktur nicht benachbart sind.

Freie Form

Dies ist der Zustand eines Polypeptids, das nicht von einem replizierbaren Gen-Freilegungspaket freigelegt wird.

Bedingt defektiv

Dieser Terminus beschreibt ein Gen, das ein bestimmtes Polypeptid unter bestimmten Bedingungen nicht exprimiert, es jedoch unter anderen bestimmten Bedingungen exprimiert. Ein Beispiel dafür ist ein Gen, das eine Bernsteinmutation enthält, die in nichtsuppressiven bzw. suppressiven Wirten exprimiert wird.
Alternativ dazu kann ein Gen ein Protein exprimieren, das unter bestimmten Bedingungen defektiv ist, unter anderen bestimmten Bedingungen jedoch nicht defektiv ist. Ein Beispiel dafür ist ein Gen mit einer temperaturempfindlichen Mutation.

Unterdrückbares Translations-Stoppcodon

Dieser Ausdruck beschreibt ein Codon, das die Translation von Nukleotidsequenzen stromab vom Codon unter bestimmten Bedingungen ermöglicht, die Translation am Codon unter anderen bestimmten Bedingungen jedoch abbricht. Ein Beispiel für unterdrückbare Translations-Stoppcodons sind die Bernstein-, Ocker- und Opalcodons.

Mutatorstamm

Dies ist eine Wirtszelle, die einen genetischen Defekt aufweist, der dafür sorgt, daß darin replizierte DNA hinsichtlich ihrer Ursprungs-DNA mutiert wird. Beispiele für Mutatorstämme sind NR9046mutD5 und NR9046mutT1 (siehe Bsp. 38 von WO 92/01047).

Helferphage

Dies ist ein Phage, der dazu dient, Zellen zu infizieren, die ein defektives Phagengenom enthalten, und zum Komplementieren des Defekts verwendet wird. Dieses defektive Phagengenom kann ein Phagemid oder ein Phage mit einer bestimmten Funktion sein, die für entfernte Gensequenzen kodiert. Beispiele für Helferphagen sind M13K07, M13K07 Gen III Nr. 3 und ein Phage, der ein mit einem Capsidprotein fusioniertes Bindungsprotein freilegt oder für dieses kodiert.

Vektor

Dies ist ein DNA-Molekül, das zur Replikation in einem Wirtsorganismus fähig ist, in den ein Gen insertiert ist, um ein rekombinantes DNA-Molekül zu konstruieren.

Phagenvektor

Dies ist ein Vektor, der durch Modifikation eines Phagengenoms entsteht, umfassend einen Replikationsursprung für einen Bakteriophagen, jedoch nicht für ein Plasmid.

Phagemidvektor

Dies ist ein Vektor, der durch Modifikation eines Plasmidgenoms entsteht, umfassend einen Replikationsursprung für einen Bakteriophagen sowie den Plasmid-Replikationsursprung.

Sekretiert

Dieser Terminus beschreibt ein RGDP oder Molekül, das mit dem auf dem RGDP freigelegten Polypeptid assoziiert, worin das Polypeptid und/oder das Molekül gefaltet und das Paket außerhalb des Zell-Zytosols zusammengesetzt wurden.

Repertoire umgeordneter Immunglobulin-Gene

Eine Reihe natürlich vorkommender Nukleotide, z. B. DNA-Sequenzen, die für exprimierte Immunglobulin-Gene in einem Tier kodierten. Die Sequenzen werden durch die in vivo-Umordnung von beispielsweise V-, D- und J-Segmenten für H-Ketten und beispielsweise V- und J-Segmenten für L-Ketten erzeugt. Alternativ dazu können die Sequenzen aus einer in vitro immunisierten Zellinie erzeugt werden, worin die Umordnung als Reaktion auf die Immunisierung intrazellulär erfolgt. Der Ausdruck "Repertoire" bezieht sich auf genetische Diversität.

Sammlung

Eine Sammlung von Nukleotiden, z. B. DNA, Sequenzen innerhalb von Klonen; oder eine genetisch vielfältige Sammlung von Polypeptiden, spezifischen Bindungspaarelementen oder Polypeptide oder sbp-Elementen, die auf RDDPs freigelegt sind (mit der Fähigkeit der Selektion oder des Screening, um ein individuelles Polypeptid oder sbp- Elemente oder eine gemischte Population von Polypeptiden oder sbp-Elementen bereitzustellen).

Repertoire künstlich umgeordneter Immunglobulin-Gene

Eine Sammlung von Nukleotiden, z. B. DNA, Sequenzen, die zur Gänze oder teilweise aus einer anderen Quelle als den umgeordneten Immunglobulin-Sequenzen aus einem Tier abgeleitet sind. Dazu zählen z. B. DNA-Sequenzen, die für VH-Domänen kodieren, indem nicht umgeordneten V-Segmente mit D- und J-Segmenten kombiniert werden, und DNA-Sequenzen, die für VL-Domänen kodieren, indem V- und J-Segmente kombiniert werden.
Ein Teil der oder alle DNA-Sequenzen können durch Oligonukleotid-Synthese erhalten werden.

Sekretionsleaderpeptid

Dies ist eine Sequenz von Aminosäuren, die am N-terminalen Ende eines Polypeptids angefügt sind und die Bewegung des Polypeptids aus dem Zytosol heraus lenken.

Eluens

Dies ist eine Lösung zum Zerschlagen der Verbindung zwischen zwei Molekülen. Die Verbindung kann eine oder mehrere nicht-kovalente oder kovalente Bindungen sein. Die zwei Moleküle können Elemente eines sbp sein.

Derivat

Dies ist eine aus einem Polypeptid abgeleitete Substanz, für das die DNA innerhalb eines selektierten RGDP kodiert. Das Derivat-Polypeptid kann sich vom kodierten Polypeptid durch Addition, Deletion, Substitution oder Insertion von Aminosäuren oder durch die Verbindung anderer Moleküle mit dem kodierten Polypeptid unterscheiden. Diese Veränderungen können auf Nukleotid- oder Proteinebene vorgenommen werden. Beispielsweise kann das kodierte Polypeptid ein Fab-Fragment sein, das dann mit einem Fc-Schwanz einer anderen Quelle verknüpft wird. Alternativ dazu können Marker, wie z. B. Enzyme, Fluoresceine usw., z. B. mit Fab- oder scFv-Fragmenten verbunden sein.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von Antikörper- Polypeptid-Dimeren bereitgestellt, die für ein Antigen von Interesse spezifisch sind, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:
(i) Bereitstellung von Nukleinsäure-Expressionsvektoren, die unter Verwendung einer Komponente eines replizierbaren Gen-Freilegungspakets ("replicable genetic display package", RGDP) zu Paketen zusammengefaßt werden können,
(ii) Kombination (a) eines genetisch vielfältigen Repertoires von Nukleinsäuresequenzen, die jeweils für eine erste Teilkomponente einer Antigen-Bindungsstelle eines menschlichen Antikörpers kodieren mit (b) Nukleinsäure, die für eine einzigartige oder genetisch vielfältige Population einer zweiten Teilkomponente einer Antigen-Bindungsstelle eines nicht-menschlichen Antikörpers kodiert, der bekanntermaßen das Antigen von Interesse bindet, um eine Sammlung von Nukleinsäuresequenzen auf den Expressionsvektoren zu bilden, die für Antikörper-Polypeptid-Dimere von scFv-Fragmenten kodieren, wobei die Dimere oder scFv-Fragmente jeweils aus einer ersten Polypeptidketten-Komponente und einer zweiten Polypeptidketten-Komponente bestehen, wobei eine erste Antigen-Bindungsstellen-Teilkomponente und eine zweite Antigen-Bindungsstellen-Teilkomponente in Kombination eine Antigen-Bindungsstelle eines Antikörper- Polypeptid-Dimers oder scFv-Fragments bilden;
(iii) von den Vektoren ausgehendes Exprimieren der Sammlung in rekombinanten Wirtsorganismuszellen, wobei jede der ersten Polypeptidketten-Komponenten als Fusion mit einer Komponente eines RGDPs exprimiert wird, wodurch die erste Polypeptidketten-Komponente an der Oberfläche der RGDPs freigelegt wird;
(iv) Selektieren einer einzigartigen oder eingeschränkten Population der Antikörper-Polypeptid-Dimere oder scFv-Fragmente, die Bindungsspezifität für das Antigen von Interesse aufweisen, aus der exprimierten Sammlung durch Bindung an Antigen, wobei jedes selektierte Antikörper-Polypeptid-Dimer oder scFv-Fragment in seinem jeweiligen RGDP mit Nukleinsäure verbunden ist, die für eine erste Teilkomponente seiner Antigen-Bindungsstelle kodiert.
Antikörper-Polypeptid-Dimere sind hierin an anderer Stelle definiert. Der Terminus ist umfassend genug, um Fab-, Fv- und scFv-Fragmente von Antikörpern sowie einen vollständigen Arm eines Antikörpers einzuschließen.
Eine "Teilkomponente einer Antikörper-Antigen-Bindungsstelle" kann eine Polypeptid- Kettenkomponente sein oder dieser entsprechen, z. B. eine VH- oder eine VL-Domäne. Sie kann aber auch ein CDR oder eine VL-Sequenz plus CDR einer VH, eine VH- Sequenz plus CDR einer VL, eine VH plus VL-Sequenz nur ohne einen CDR usw. sein. Die Voraussetzung ist, daß die erste und zweite Teilkomponente einer Antigen-Bindungsstelle eines Antikörpers in Kombination (gemeinsam) eine Antigen-Bindungsstelle bilden muß. Wenn somit die zweite Teilkomponente einer Antigen-Bindungsstelle eines nicht-menschlichen Antikörpers, der für ein Antigen von Interesse spezifisch ist, ein CDR ist, umfaßt die erste Teilkomponente einer Antigen-Bindungsstelle eines menschlichen Antikörpers den Rest eines VH- und VL-Bereichs, der erforderlich ist, um eine Antigen-Bindungsstelle zu bilden (mit oder ohne assoziierte konstante Antikörperdomänen (in einem Fab-Format) oder mit oder ohne eine Linker-Peptidsequenz (in einem Fv-For mat)). (In einem scFv-Format verknüpft ein Linkerpeptid eine Leichtketten-Domäne mit einer Schwerketten-Domäne.) Die zweite Teilkomponente einer Antigen-Bindungsstelle eines nicht-menschlichen Antikörpers kann eine VL-Domäne plus einen Teil einer VH- Domäne umfassen, wobei dieser Teil eine oder mehrere CDRs umfaßt, z. B. CDR3. In einem solchen Fall würde die erste Teilkomponente einer Antigen-Bindungsstelle eines menschlichen Antikörpers den Rest einer VH-Sequenz umfassen, der in Kombination mit der zweiten Teilkomponente eine Antigen-Bindungsstelle bildet. Natürlich gilt auch das Gegenteil, und für Fachleute auf dem Gebiet sind andere Kombinationen erster und zweiter Teilkomponenten, die gemeinsam eine Antigen-Bindungsstelle bilden, offenkundig.
Es kann ein zusätzlicher Schritt (v) erfolgen, worin die in Schritt (iv) selektierten Antikörper-Polypeptid-Dimere modifiziert werden, um nicht-menschliche Eigenschaften zu eliminieren oder zu reduzieren. Diese Modifikation kann durch genetisches Verändern der Dimere oder einer ihrer Komponenten erfolgen. Diese genetische Veränderung kann eine Mutation, Punktmutation, Insertion oder Deletion sein, um spezifisch nicht- menschliche Reste zu entfernen oder zu maskieren, insbesondere jene Reste, die eine anti-idiotypische Immunreaktion bei Verabreichung der nicht-menschlichen/menschlichen Hybrid-Antikörper-Polypeptid-Dimere an einen Menschen hervorrufen.
Die Modifikation aus Schritt (v) kann folgendes umfassen:
(a) Kombinieren einer einzigartigen oder eingeschränkten Population von Nukleinsäure, die für die in Schritt (iv) selektierten ersten Antigen-Bindungsstellen-Teilkomponenten kodiert, mit einem genetisch vielfältigen Repertoire von Nukleinsäuresequenzen, die jeweils für eine zweite Teilkomponente einer Antigen-Bindungsstelle eines menschlichen Antikörpers kodieren, um eine zweite Sammlung von Nukleinsäuresequenzen zu bilden, die für Antikörper-Polypeptid-Dimere oder scFv-Fragmente kodieren, wobei jedes Antikörper-Polypeptid-Dimer oder scFv-Fragment eine zweite Antikörper-Polypeptidketten-Komponente umfaßt, die aus Nukleinsäure exprimiert wird, die unter Verwendung einer Komponente eines RGDPs zu einem Paket zusammengefaßt werden kann, wobei die zweite Ketten-Komponente als Fusion mit einer Komponente eines RGDPs exprimiert wird, wodurch sie an der RGDP-Oberfläche freiliegt, so daß Antikörper-Polypeptid-Dimere oder scFv-Fragmente, die für das Antigen von Interesse spezifisch sind, aus der zweiten Sammlung durch Bindung an das Antigen von Interesse selektierbar sind, wobei jedes Antikörper-Polypeptid-Dimer oder scFv-Fragment in seinem RGDP mit Nukleinsäure verbunden ist, die für seine zweite Polypeptid-Komponente kodiert.
Selektierte Antikörper-Polypeptid-Dimere können als lösliche Polypeptide oder in freier Form exprimiert werden.
Wie bereits erwähnt, kann die zweite Teilkomponente einer Antigen-Bindungsstelle eines nicht-menschlichen Antikörpers ein Antikörperbereich sein, der Kontakt mit Antigen herstellt, wobei dieser Bereich möglicherweise ein CDR ist.
Die zweite Teilkomponente einer Antigen-Bindungsstelle eines nicht-menschlichen Antikörpers kann eine zweite Polypeptid-Kettenkomponente eines Antikörpers sein.
Die Sequenz, die für die zweite Teilkomponente von nicht-menschlichem Antikörper kodiert, kann genetisch verändert sein, um ihre Homologie zu einer zweiten Teilkomponente eines menschlichen Antikörpers vor der Kombination in Schritt (ii) des Verfahrens zu erhöhen.
Jedes Antikörper-Polypeptid-Dimer der Sammlungen von Antikörper-Polypeptid-Dimeren kann als einzelne Polypeptidkette exprimiert werden, z. B. ein ScFv-Fragment (bevorzugt). Ein scFv-Fragment erfüllt die Bedingungen der Definition eines Antikörper- Polypeptid-Dimers.
Andererseits kann jedes Antikörper-Polypeptid-Dimer beliebiger Sammlungen von Antikörper-Polypeptid-Dimeren in Form von zwei Polypeptidketten exprimiert werden, vor zugsweise als Fv- oder Fab-Fragment, doch möglicherweise auch in Form von Polypeptiden mit zusätzlichen Nicht-Antikörper-Domänen, die entweder kovalent oder nichtkovalent in Wechselwirkung treten, um die variablen Domänen in einer Konformation zu halten, die es ihnen ermöglicht, eine Antigen-Bindungsstelle zu bilden.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von menschlichen Antikörper-Polypeptid-Dimeren bereitgestellt, die für ein Antigen von Interesse spezifisch sind, folgendes umfassend:
(i) Kombination einer vielfältigen Population (Population A) von Polypeptiden, die jeweils eine variable Domäne einer ersten Polypeptidkette eines menschlichen Antikörpers umfassen, mit einer einzigartigen oder eingeschränkten Population (Population B) von Polypeptiden, die jeweils eine variable Domäne einer zweiten Polypeptidkette eines nicht-menschlichen Antikörpers umfassen, der für das Antigen spezifisch ist, wodurch eine Sammlung von Antikörper-Polypeptid-Dimeren oder scFv-Fragmenten gebildet wird, die jeweils aus einem Polypeptid, das eine variable Domäne einer ersten Polypeptidkette eines menschlichen Antikörpers umfaßt, und einem Polypeptid, das eine variable Domäne einer zweiten Polypeptidkette eines nicht-menschlichen Antikörpers umfaßt, bestehen;
(ii) Selektion einer einzigartigen oder eingeschränkten Population (Population C) der Antikörper-Polypeptid-Dimere oder scFv-Fragmente, die Bindungsspezifität für das Antigen aufweisen, aus der Sammlung;
(iii) Kombination einer einzigartigen oder eingeschränkten Population (Population D) von Polypeptiden, die von den in Schritt (ii) selektierten Polypeptid-Dimeren oder scFv-Fragmenten herrühren, die jeweils eine menschliche erste Polypeptidkette umfassen, mit einer vielfältigen Population (Population E) von Polypeptiden, die jeweils eine variable Domäne einer zweiten Polypeptidkette eines menschlichen Antikörpers umfassen, wodurch eine Sammlung von menschlichen Antikörper-Polypeptid-Dimeren oder scFv-Fragmenten gebildet wird, aus denen eine einzigartige oder eingeschränkte Population (Population F) von menschlichen Antikörper-Polypeptid-Dimeren oder scFv- Fragmenten selektierbar ist, die für das Antigen spezifisch sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts ist folgendes gegeben:
(a) die Polypeptide von Population A werden jeweils ausgehend von einem Vektor (X) in rekombinanten Wirtsorganismuszellen als Fusion mit einer Komponente eines replizierbaren Gen-Freilegungspakets (RGDPs) exprimiert, wodurch das Polypeptid an der Oberfläche der RGDPs in einer ersten RGDP-Population freigelegt wird;
(b) Nukleinsäure von Vektor (X) kann unter Verwendung der RGDP-Komponente zu einem Paket zusammengefaßt werden, wodurch das genetische Material jedes RGDPs für ein solches Polypeptid von Population A kodiert, so daß die Antikörper-Polypeptid-Dimere oder scFv-Fragmente von Population C in ihren jeweiligen RGDPs jeweils mit Nukleinsäure verbunden werden, die für ein Polypeptid kodiert, das eine variable Domäne einer ersten Polypeptidkette eines menschlichen Antikörpers umfaßt;
(c) die Polypeptide von Population E werden jeweils ausgehend von einem Vektor (Y) in rekombinanten Wirtsorganismuszellen als Fusion mit einer Komponente eines RGDPs exprimiert, wodurch sie an der Oberfläche von RGDPs in einer zweiten RGDP- Population freigelegt werden;
(d) Nukleinsäure des Vektors (Y) kann unter Verwendung der RGDP-Komponente zu einem Paket zusammengefaßt werden, wodurch das genetische Material jedes RGDPs in der zweiten RGDP-Population für ein solches. Polypeptid von Population E kodiert.
Die Population A kann ausgehend vom gleichen Vektor wie Population B exprimiert werden, oder diese Populationen können auch nicht ausgehend vom gleichen Vektor exprimiert werden. Population D kann ausgehend vom gleichen Vektor wie Population E exprimiert werden, oder die Populationen D und E können auch nicht ausgehend vom gleichen Vektor exprimiert werden. Anders ausgedrückt kann das Verfahren im Zweifach-Kombinationsformat ablaufen oder nicht oder möglicherweise ein hierarchisches Format aufweisen usw., was an anderer Stelle besprochen wird.
Jedes Antikörper-Polypeptid-Dimer beliebiger der vorliegenden Sammlungen von Antikörper-Polypeptid-Dimeren kann als einzelne Polypetpidkette exprimiert werden, die ein scFv-Fragment sein kann.
Jedes Antikörper-Polypeptid-Dimer jeder der Sammlungen von Antikörper-Polypeptid- Dimeren kann in Form von zwei Polypeptidketten, vorzugsweise als Fv- oder Fab-Fragment, exprimiert werden, was weiter oben in Zusammenhang mit einem anderen Aspekt der Erfindung besprochen wurde.
Polypeptide der Population B können heterozygot sein, jeweils umfassend eine konstante Domäne von menschlichem Antikörper (zusammen mit einer nicht-menschlichen, z. B. aus einem Nagetier stammenden, variablen Domäne).
Die Polypeptide der Population E können jeweils einen Bereich eines nicht-menschlichen Antikörpers umfassen, der für das Antigen spezifisch ist, wobei der Bereich Kontakt mit Antigen herstellt, z. B. ein CDR, insbesondere CDR3.
Die erste Polypeptidkette kann eine Antikörper-Leichtkette sein, die zweite Polypeptidkette eine Antikörper-Schwerkette oder umgekehrt.
Es kann ein zusätzlicher Schritt des Selektierens der Population F von menschlichen Antikörper-Polypeptid-Dimeren, die für das Antigen spezifisch sind, erfolgen.
Beliebige der Populationen C und F können durch Bindung an das Antigen selektiert werden.
Die Erfindung umfaßt auch Sets von Vektoren und Reagenzien zur Verwendung in beliebigen der Verfahren. Weiters erstreckt sie sich auf Sammlungen und Antikörper oder Antikörper-Fragmente, die durch beliebige der Verfahren produziert werden. Ferner umfaßt die Erfindung ein Verfahren, in dem Nukleinsäure, die für selektierte Polypeptid- Komponenten eines Antikörper-Polypeptid-Dimers oder für ein selektiertes Antikörper- Polypeptid-Dimer kodiert, dazu dient, die Polypeptid-Komponente oder das Polypeptid- Dimer oder ein Derivat davon in einem rekombinanten Wirtsorganismus zu exprimieren. Jedes Polypeptid oder Dimer aus einer Sammlung, die unter Anwendung eines Verfahrens der Erfindung erstellt wird, kann modifiziert werden, um ein Derivat zu erzeugen, oder zur Herstellung eines therapeutischen oder prophylaktischen Medikaments oder eines diagnostischen Produkts herangezogen werden.
Es sind hierin Verfahren zur Herstellung von Antikörpern geoffenbart, indem Sequenzen aus der Antigen-Bindungsstelle eines Antikörpers oder Population von Antikörpern gegen ein Antigen von Interesse verwendet werden. Dies bietet eine andere Möglichkeit, tierische Antikörper mit definierten Antigen-Bindungsaktivitäten zu humanisieren. Im Fall eines einzelnen Nagetier-Antikörpers können somit Sequenzen, die einen Teil der Antigen-Bindungsstelle des Antikörpers umfassen, mit verschiedenen Repertoires von Sequenzen menschlicher Antikörper kombiniert werden, die gemeinsam eine vollständige Antigen-Bindungsstelle erzeugen. Die ursprünglichen Nagetier- (und menschlichen) Sequenzen könnten ganze Ketten oder Kettenteile umfassen. Beispielsweise könnte die Leichtkette eines Nagetier-Antikörpers mit einem Repertoire von menschlichen variablen Domänen der Schwerkette kombiniert sein; oder der dritte CDR der Schwerkette eines Nagetier-Antikörpers könnte mit einem Repertoire menschlicher Schwerketten, die für den Rest der variablen Domänen der schweren Kette kodieren, und einem Repertoire menschlicher variabler Domänen der Leichtkette kombiniert sein. Die Antigen-Bindungsstellen, welche diese Sequenzen umfassen, werden dann hinsichtlich Bindung an das Antigen selektiert.
Die eine Teilkomponente der Antigen-Bindungsstelle umfassenden Sequenzen könnten ein Teil der Primärsequenz sein, von der man allgemein annimmt, daß sie an der Antigen-Bindung beteiligt ist, z. B. ein oder mehrere CDRs oder die Reste an der Spitze der Schleife aus einem oder mehreren CDRs. Alternativ dazu könnten die Sequenzen Sequenzen des Antikörpers sein, die bekanntermaßen das Antigen kontaktieren, was z. B. anhand der Struktur eines Komplexes von Antigen und Antikörper (aufgelöst durch Röntgenkristallographie oder NMR) oder mittels stellengerichteter Mutagenese des Antikörpers bestimmt wird.
Die durch dieses Verfahren geschaffenen Antigen-Bindestellen unterscheiden sich insofern von den durch CDR-Transplantation erzeugten, als nur der Teil der Sequenz des ursprünglichen Nagetier-Antikörpers wahrscheinlich ähnliche Kontakte mit Antigen herstellt. Die selektierten menschlichen Sequenzen unterscheiden sich wahrscheinlich hinsichtlich der Sequenz und stellen andere Kontakte mit dem Antigen als die ursprüngliche Bindungsstelle her. Die Zwänge, die sich durch die Bindung des Abschnitts der ursprünglichen Sequenz an Antigen und die Formen des Antigens und seiner Antigen-Bindungsstellen ergeben, sorgen jedoch wahrscheinlich dafür, daß die neuen Kontakte der menschlichen Sequenzen zum gleichen Bereich oder Epitop des Antigens gedrängt werden. Deshalb bezeichneten die Anmelder das Verfahren als "epitop-imprimierte Selektion" (EIS).
Ausgehend von einem tierischen Antikörper führt ein Verfahren zur Selektion von Antikörpern, die teilweise menschliche Antikörper sind. Solche Antikörper können hinsichtlich ihrer Sequenz menschlichen Antikörpern ausreichend ähnlich sein, um direkt in der Therapie oder nach Änderung einiger Schlüsselreste verwendet zu werden. Beispielsweise zeigen Antikörper, die mit menschlichen variablen Domänen der Schwer- und Leichtkette gebildet werden, die auch den VH-DCR3-Bereich aus einem Nagetier-Antikörper umfassen, eine starke Ähnlichkeit mit echten menschlichen Antikörpern, da der CDR3-Bereich sowohl menschlicher als auch aus Nagetieren stammender Antikörper hochvariabel ist. Die Leichtketten einiger Nagetier-Antikörper weisen hinsichtlich ihrer Sequenz eine große Ähnlichkeit mit den Leichtketten menschlicher Antikörper auf. Somit können Antikörper aus diesen Nagetier-Leichtketten in Kombination mit einem Repertoire menschlicher Schwerketten menschlichen Antikörpern stark ähneln. Sequenzdifferenzen zwischen der Nagetierkomponente des selektierten Antikörpers mit menschlichen Sequenzen könnten minimiert werden, indem sich unterscheidende Reste durch die Reste menschlicher Sequenzen ersetzt werden, beispielsweise durch stellengerichtete Mutagenese einzelner Reste oder durch CDR-Transplantation ganzer Schleifen. Anstatt mit einem tierischen Antikörper zu beginnen, sollte es auch möglich sein, mit einem gentechnisch erzeugten Antikörper aus einem tierischen Antikörper zu beginnen. Der gentechnisch hergestellte Anfangsantikörper könnte z. B. ein CDR-transplantierter Antikörper mit menschlichen Rahmenbereichen und Mäuse-Komplementaritätsbereichen sein (siehe z. B. GB-2.188.638B). Alternativ dazu könnte der gentechnisch erzeugte Anfangsantikörper Schwer- und Leichtketten umfassen, in denen Reste geändert wurden, um die Sequenzhomologie zu menschlichen Antikörpern zu maximieren.
Die Erfindung kommt aber auch bei der Bildung von Antikörpern mit gänzlich menschlichen Sequenzen zur Anwendung. Beispielsweise könnte ausgehend von einem teilweise menschlichen Antikörper mit menschlicher Schwerkette und nicht-menschlicher, z. B. Mäuse-, Leichtkette die nicht-menschliche Leichtkette durch Repertoires menschlicher Leichtketten ersetzt werden. Auf diese Weise werden die Sequenzen der selektierten Antikörper zur Gänze menschlich, aber trotzdem sollte die Antigen-Bindungsstelle auf das gleiche Epitop des Antigens gerichtet sein. EIS bietet somit ein Verfahren zur Erzeugung teilweise oder zur Gänze menschlicher Antikörper, die sich an das gleiche Epitop binden wie tierische bzw. teilweise menschliche Antikörper.
Bei der CDR-Transplantation wird die gesamte Antigen-Bindungsstelle transplantiert, und es ist üblicherweise notwendig, nur einen oder einige wenige Antikörper auf Bindung an Antigen zu testen. EIS kann aber auch nur einen Teil der Antigen-Bindungsstelle in Kombination mit einem eventuell sehr großen Repertoire menschlicher Sequenzen verwenden, wenn die Notwendigkeit des Screenens einer viel größeren Zahl an Antikörpern besteht. In einer bevorzugten Ausführungsform sind Repertoires von Antikörper- Fragmenten auf der Oberfläche von faserförmigem Phage freigelegt und die Gene, die für Fragmente mit Antigen-Bindungsaktivitäten kodieren, durch Bindung des Phagen an Antigen selektiert. Es wurde in der WO 92/01047 geoffenbart, daß Antikörper-Fragmente auf Phage freigelegt werden können, daß sie Antigen binden und daß sie selektiert werden können. Die Fähigkeit, bereitgestellte Antikörper anhand der Freilegung auf Phagen zu selektieren (siehe WO 92/01047), ermöglicht das rasche Screenen großer Anzahlen humanisierter Antikörperderivate, die mittels Insertion von CDRs an Restriktionsstellen, durch in vitro-Mutageneseverfahren (Riechmann et al., 1988, s. o.; GB- 2.188.638B) oder mittels PCR-Technologie (B. L. Daugherty et al., Nucl. Acids Res. 19, 2471-2476 (1991)) erzeugt werden. In WO 92/01047 wurde die Erzeugung hierarchischer Sammlungen beschrieben, worin eine variable Antikörperdomäne der Schwer- oder Leichtkette konstant gehalten und auf Phagen freigelegt wurde (mit einer Sammlung der variablen Domäne der Komplementaritätskette für die Selektion von Partnern, die sich an Antigen binden). Ein solcher Ansatz erzeugt einen sehr vielfältigen Pool variabler Domänenkombinationen der Schwer- und Leichtkette, aus denen Antikörper- Spezifitäten selektiert werden können. Ketten-Shuffling wurde z. B. angewandt, um weitere Leicht- und Schwerkettenpartner für die komplementäre Kette eines haptenbindenden Antikörpers zu erhalten (Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)) und menschliche Antikörper hoher Affinität zu bilden (J. D. Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783 (1992)). In diesen Fällen waren die neuen Partnerketten hinsichtlich Sequenz mit jenen Ketten, die in der ursprünglichen Kombination vorhanden waren, eng verwandt.
In diesen Beispielen wurden keine Ketten unterschiedlicher Spezies kombiniert. Es gibt jedoch einen Bericht über einen Versuch, die Schwerketten eines Mäuse-Antikörpers gegen ein Hapten mit einem Repertoire menschlicher Leichtketten (und auch mit einem Repertoire von Mäuse-Leichtketten) zu vermischen, und über das Screenen auf Bindung einzelner Klone an Antigen unter Verwendung von Nitrocellulose-Filtern. Es wurden jedoch keine Bindemittel detektiert, und auch das Verfahren wurde nicht als Mittel vorgeschlagen, Mäuse-Antikörper zu "humanisieren" (A. S. Kang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 11120-11123 (1991)). Die Autoren zogen den Schluß, daß die "Umgestaltung von Antikörpern durch Rekombination einer somatisch mutierten Kette mit einem nativen Partner ein schwieriges Verfahren sein könnte". Die Verwendung von EIS (dargestellt durch Ketten-Shuffling unter Verwendung von Ketten unterschiedlicher Spezies) scheint daher ein neuartiges Konzept zu sein. Angesichts des Beispiels von Kang et al., 1991, s. o., ist es überraschend, daß Antigen-Bindungskombinationen durch Kombinieren der Ketten aus einem Mäuse-Antikörper mit Repertoires von Ketten aus nicht-immunisierten menschlichen produziert werden können (wie in Beispiel 1 weiter unten beschrieben).
Es gibt eine Vielzahl an Formaten zur Anwendung von Verfahren der Erfindung. Dazu zählen:
(1) Die Verwendung von Fv-, Einzelketten-Fv- und Fab-Fragmenten wird zur Expression von Bakterien oder Freilegung auf fadenförmigem Phagen bevorzugt (für Fab-Fragmente siehe Beispiele 1 und 2; für scFv siehe Beispiele 3 und 4). Am bevorzugtesten werden die Antikörperfragmente auf fadenförmigem Phagen freigelegt und die Phagen direkt hinsichtlich Bindung an Antigen selektiert. Die durch diese Verfahren selektierten Antikörper können direkt eingesetzt oder mit weiteren Kodiersequenzen fusioniert werden, z. B. mit menschlichen konstanten Bereichen zur Erzeugung von Antikörpermolekülen mit menschlichen Effektorfunktionen. Die variablen Domänen können auch mit Sequenzen fusioniert werden, die für ein Enzym oder ein Toxinmolekül kodieren, um antikörpergerichtetes Abzielen von Arzneimitteln oder Toxinen auf bestimmte Zelltypen zu ermöglichen.
(2) Die Repertoires menschlicher Ketten können problemlos aus mehreren möglichen Repertoires an V-Genen bereitgestellt werden, z. B. aus den umgeordneten V-Genen nicht-immunisierter Menschen (Marks et al.,) J. Mol. Biol. 22, 581-587 (1991); und Beispiel 1) oder aus immunisierten Menschen oder synthetischen V-Gen-Repertoires. Beispielsweise können Sammlungen von Schwer- und Leichtketten-V-Genen menschlicher Keimlinien mit synthetischen CDR3-Bereichen erzeugt werden, die menschliche J-Bereiche umfassen, und Antikörper-Spezifitäten isoliert werden (Hoogenboom und Winter, J. Mol. Biol. 227, 381-388 (1992)). Außerdem kann es möglich sein, Repertoires menschlicher V-Gene zu verwenden (beispielsweise synthetisch hergestellt), die hinsichtlich ih rer Sequenz mit jeder Kette eines Mäuse-Antikörpers eng verwandt und möglicherweise die am stärksten homologen sind (siehe Beispiel 5).
(3) Die Schwer- und Leichtketten des ursprünglichen Antikörpers können durch ihre kodierenden V-Gene bereitgestellt werden (isoliert z. B. durch PCR, Orlandi et al., 1989; Beispiele 1, 2 und 3). Es ist jedoch auch möglich, mit einem Repertoire an Mäuseketten zu beginnen, die vorzugsweise durch Immunisierung gebildet werden (Beispiel 4). Beispielsweise könnte ein Repertoire an Mäuse-Schwerketten mit Mäuse-Leichtketten kombiniert und zur Bindung selektiert werden (wie bei Clackson et al., 1991, s. o.): die selektierten Repertoires gepaarter Ketten könnten dann mit Repertoires komplementärer menschlicher Ketten rekombiniert werden, um neue Paarungen zu erzwingen. Alternativ dazu könnte das Repertoire von Mäuseketten aus der mRNA einer immunisierten Maus einfach mit einem Repertoire komplementärer menschlicher Ketten kombiniert werden.
(4) Es ist möglich, die gesamten variablen Domänen der Schwer- und Leichtkette wie bei "Ketten-Shuffling"-Verfahren oder Teilkomponenten der Ketten zu verwenden (wie bei Marks et al., 1991, s. o., beschrieben), indem die Leichtkette und CDR3 der Schwerkette eines Antikörpers beibehalten werden (und durch Vermischen dieser Sequenz mit einem Repertoire an Ketten, die den Rest der variablen Schwerketten-Domänen-CDRs 1 und 2 umfassen). Eine durch die Beispiele 2 und 3 veranschaulichte Ausführungsform der Erfindung umfaßt das Beibehalten zumindest eines Bereichs aus dem ursprünglichen nicht-menschlichen Stammantikörper, wobei der Bereich Antigen kontaktiert, wenn das Vermischen mit menschlichen Ketten oder Teilkomponenten von menschlicher Antikörper-Antigen-Bindungsstelle stattfindet. Dieser Bereich kann ein CDR sein, in welchem Fall das Verfahren als "CDR-imprimierte Selektion" bezeichnet wird.
In den Beispielen 2 und 3 wurde der CDR3 der ursprünglichen Mäuse-Schwerkette beibehalten und mit einem Repertoire menschlicher variabler Schwerketten-Domänen durch PCR-Amplifikation eines Repertories menschlicher variabler Schwerketten-Domänen mit einem den Mäuse-CDR3 umfassenden Primer kombiniert. Das Beibehalten von Mäuse-VH-CDR3 kann insofern besonders vorteilhaft sein, als CDR3 der Schwerkette oft für die Antigenbindung am wichtigsten ist.
Dieses Prinzip kann auf ein Mäuse-CDR3-Repertoire ausgedehnt werden, indem die umgeordneten Mäuse-VH-Gene mit menschlichen JH-Primern (Vorwärts- bzw. Forward- Primern) und menschlichen VH-Rahmen 3-Primern (Rückwärts- bzw. Backward-Primern) umgeordnet werden. Diese Primer müssen mit Homologie zu Mäuse- und menschlichen V-Genen konstruiert werden. Das amplifizierte DNA-Repertoire an Mäuse-CDR3s könnte dann durch PCR mit einem Repertoire menschlicher Schwerketten- Gene zusammengesetzt werden.
(5) Das Ketten-Shuffling könnte unter Verwendung zweier Replicons durchgeführt werden, z. B. unter Anwendung des Zweifach-Kombinationsverfahrens von Hoogenboom et al., Nucleic Acids Research 19, 4133-3137 (1991), worin die konstant zu haltende Kette in einem Replicon, z. B. einem Phagen, kloniert und dann mit einem Repertoire an Ketten in einem anderen Replicon, z. B. einem Plasmid, kombiniert wird, wie in Beispiel 1 veranschaulicht. Alternative Verfahren, die das Klonieren beider Ketten auf dem gleichen Replicon mit hoher Effizienz ermöglichen, wurden ebenfalls entwickelt. Diese basieren wiederum auf dem Klonieren von Schwer- und Leichtketten-Genen auf getrennten Replicons, doch diesmal mit dem Ziel, Rekombination zwischen zwei Vektoren zu fördern, sodaß beide Ketten auf dem gleichen Replicon positioniert sind. Ein Beispiel für dieses System beruht auf dem Iox P/Cre-Recombinase-System von Coliphage P1 (Hoess und Abremski, "Nucleic Acids and Molecular Biology", Eckstein und Lilley (Hrsg.) Bd. 4, S. 99-109. Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, 1990). Beim Zweifach- Kombinationsverfahren kann der Antikörper als Fv-Fragment oder als Fab-Fragment (wie in Beispiel 1) exprimiert werden. Im Fall eines Fab-Fragments wird der VH1CH1-Abschnitt der Schwerkette auf einem Replicon, z. B. Phagen, und die Leichtkette auf dem anderen, z. B. Plasmid, exprimiert. Die V-Domänen des Fab-Fragments (in Shuffling-Ver fahren als Quelle neuer Spezifitäten zu verwenden) können gegebenenfalls mit klonierten menschlichen Domänen fusioniert werden, z. B. Cγ1- und Ck-Domänen. (Die V-Domänen können auch mit den CH1-, Ck oder Cλ-Domänen durch direktes Amplifizieren aus dem menschlichen Antikörper-mRNA-Repertoire direkt fusioniert werden.)
Alternativ dazu kann die Kettenverscheibung in einem einzigen Replicon mittels eines PCR-Bildungsverfahrens (wie bei Clackson et al., 1991, s. o.) oder durch aufeinanderfolgendes Klonieren von Sammlungen von Restriktionsfragmenten an geeigneten Stellen durchgeführt werden, die in die ursprünglichen Konstrukte eingearbeitet wurden, z. B. in den Linkerbereich einer Einzelketten-Fv.
Die Erfindung umfaßt die Ersetzung beider Ketten durch Shuffling-Schritte und in einer Ausführungsform die Entwicklung eines menschlichen Antikörpers mit ähnlichen oder verbesserten Eigenschaften gegenüber einem nicht-menschlichen Antikörper wie z. B. aus einem Nagetier. In dieser Ausführungsform würde der Stammantikörper (z. B. aus einem Nagetier) in einen "Phagen-Antikörper" umgewandelt. Ein Phagen-Antikörper (pAb) ist als Bakteriophagen-Viruspartikel definiert, das auf seiner Oberfläche einen Antikörper, ein Antikörperderivat oder Fragment, z. B. Fab, Fc, scFc usw., oder eine zu einer Immunglobulin-Domäne homologe Domäne aufweist; siehe WO 92/01047. Eine Kette wird durch ein Repertoire von Ketten aus einem menschlichen Immunglobulin-Repertorie ersetzt, beispielsweise aus einer erwachsenen Lymphozyten-Population oder aus fötalen oder künstlich abgeleiteten Quellen stammend. Diese gemischte Phagen-Population kann durch Bindung an Antigen selektiert werden, um eine Population von Phagen-Antikörpern abzuleiten, die sich an das ursprüngliche Antigen binden, jetzt aber aus einer z. B. Nagetier- und einer menschlichen Antikörperkette bestehen. Die verbleibende Nagetierkette kann durch ein Repertoire ähnlicher Ketten aus einem menschlichen Repertoire ersetzt werden, entweder der gleichen oder einer anderen Quelle als beim ersten Shuffling. Nach der Selektion wird eine Population von Antikörpern erhalten, die nach wie vor Antigen bindet und aus Antikörpern besteht, die zwei menschli che Antikörperketten enthalten. Somit wurde der ursprüngliche Nagetier-Antikörper in einen menschlichen Antikörper umgewandelt, der das gleiche Antigen bindet.
Die Erzeugung einer großen Anzahl humanisierter Antikörper durch Verfahren der Erfindung kann Vorteile haben, die über die Selektion von Antikörpern erwünschter Affinität und Spezifität hinausgehen. Wenn humanisierte Antikörper bei Menschen zu Therapiezwecken eingesetzt werden, ist es möglich, daß anti-idiotypischer Response erfolgt. Die isolierten Antikörper können bei in vivo-Verabreichung auf anti-idiotypischen Response untersucht und jene mit dem schwächsten Response selektiert werden. Alternativ dazu kann ein Antikörper therapeutisch verabreicht werden, bis anti-idiotypischer Response nachgewiesen wird; zu diesem Zeitpunkt wird der eingesetzte Antikörper auf einen zweiten, ebenso wirksamen Antikörper mit einem anderen Idiotyp umgestellt.
Humanisierte Antikörper, die unter Anwendung der Verfahren der Erfindung erhalten werden können, sind wahrscheinlich besser als herkömmliche, CDR-transplantierte, humanisierte Antikörper, da sie weniger wahrscheinlich anti-idiotypischen Response hervorrufen.
Die nach den Verfahren der Erfindung selektierten Antikörper können direkt im Einzelketten-Fv- oder Fab-Format eingesetzt werden. Alternativ dazu können die variablen Domänen mit weiteren Kodiersequenzen fusioniert werden, beispielsweise mit menschlichen konstanten Bereichen, um Antikörpermoleküle z. B. mit menschlichen Effektorfunktionen zu erzeugen. Die variablen Domänen könnten mit Sequenzen fusioniert werden, die für ein Enzym oder ein Toxinmolekül kodieren, damit antikörpergerichtetes Abzielen von Arzneimitteln oder Toxinen auf bestimmte Zelltypen ermöglicht wird (obwohl einige der Vorteile des Humanisierens hinfällig werden, wenn diese Moleküle nicht menschlichen Ursprungs sind).
Obwohl die Isolierung von Antikörpern durch Selektion hinsichtlich Antigen-Bindung mittels Phagen-Freilegung in jedem Stadium erfolgen kann, worin Ketten-Shuffling durch PCR-Anordnung oder Insertion von Restriktionsfragmenten erfolgt, können - insbesondere in reduzierter Zahl - die Antikörper mittels eines Filterassays auf Antigen-Bindung gescreent werden (A. Skerra et al., Anal. Biochem 196, 151-155 (1991); M. L. Dreher et al.,). Immunol. Methods 139, 197-205 (1991); PCT/GB 90/01476). Diese Verfahren eignen sich für eine relativ kleine Anzahl an Klonen im Vergleich zur Anzahl, die mit Phagen-Freilegung zu bewältigen ist.
Es folgt eine Beschreibung von Aspekten und Ausführungsformen der Erfindung anhand der nachstehenden Beispiele, welche die Erfindung veranschaulichen und keinesfalls einschränken. Neben den in der gesamten Beschreibung angeführten Veröffentlichungen sei auf WO 92/01047 verwiesen, in der viele der hierin eingesetzten Materialien und Verfahren beschrieben sind. Die Offenbarung von WO 92/01047 ist hierin durch Verweis aufgenommen. Die Leser der vorliegenden Anmeldung werden auf WO 92/01047 verwiesen, wo die funktionelle Freilegung von Antikörpern und Antikörper- Fragmenten einschließlich von Antikörper-Polypeptid-Dimeren auf der Oberfläche von RGDPs detailliert erläutert ist. Im gesamten Text wird auf die Figuren Bezug genommen, worin:
Fig. 1 das Prinzip der epitop-imprimierten Selektion veranschaulicht;
Fig. 2 den Polylinkerbereich von Vektor pUC19-pelB-myc zeigt (Seq-ID. Nr. 126);
Fig. 3 Ergebnisse von ELISA von Phagen-Freilegungs-Fab-Fragmenten zeigt, wobei eine Kette auf Phagen als g3p-Fusion freigelegt (angegeben durch fd-...) und die andere Kette als sekretierter, löslicher Kettenpartner bereitgestellt wird.
Fig. 4 einen Spezifitäts-ELISA des ursprünglichen Mab32-Antikörpers und einen Bereich von Mäuse- (scFv-Mab32-) und menschlichen (anderen scFv-) Antikörpern darstellt;
Fig. 5 Nukleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenzen der V-Gene von Mab32 zeigt. Die CDR-Bereiche sind fett gekennzeichnet. (Schwerketten-Nukleotide Seq-ID. Nr. 2; Leichtketten-Aminoäsuren Seq-ID. Nr. 3; Leichtketten-Nukleotide Seq-ID. Nr. 4).
Fig. 6 die abgeleiteten Proteinsequenzen von VH- und VL-Antikörpergenen von Antikörper-Fragmenten zeigt, die sich an menschlichen TNF binden.
(Leichtketten: Mab32 Seq-ID. Nr. 110; Vλ1-1-1 Seq-ID. Nr. 111; VλAZ Seq-ID. Nr. 112; VλC4 Seq-ID. Nr. 113; VλD1 Seq-ID. Nr. 114. Schwerketten: Mab32 Seq-ID. Nr. 115; DP-51 Seq-ID. Nr. 116; VHP1 Seq-ID. Nr. 117; VHP2 Seq-ID. Nr. 133; VHP3 Seq-ID. Nr. 134; DP-46 Seq-ID. Nr. 118; VHLM2 Seq-ID. Nr. 135; VHLM8 Seq-ID. Nr. 141).
Fig. 7 die Ergebnisse eines Kompetitions-ELISA zwischen FabMab32 und Einzelketten- Fv-Fragmenten zeigt;
Fig. 8 ein Beispiel für ein Schema zum Humanisieren eines Mäuse-Antikörpers mittels CDR-imprimierter Selektion unter Anwendung eines Zweifach-Kombinationsverfahrens veranschaulicht;
Fig. 9 ein Beispiel für ein Schema zum Humanisieren eines Mäuse-Antikörpers mittels CDR-imprimierter Selektion unter Verwendung kombinatorischer Sammlungen in einem Einzelreplicon-Einzelketten-Fv-Format darstellt;
Fig. 10 relative ELISA-Signale zeigt, die mit scFv-Fragmenten erhalten werden, die mittels CDR-imprimierter Selektion selektiert werden (im Vergleich zum ursprünglichen F58-Einzel ketten-Fv-Fragment);
Fig. 11 die abgeleiteten Aminosäuresequenzen der selektierten Schwerketten Transplantat/27, Translantat/2, Transplantat/H3 und Transplantat/H9 im Vergleich zur ursprünglichen F58-Schwerkette und zu den am engsten verwandten menschlichen Keimlinien- VH-Genen veranschaulicht. (VH6: F58 Seq-ID. Nr. 127; DP-74 Seq-ID. Nr. 128; Transplantat/27 Seq-ID. Nr. 126; Transplantat/2 Seq-ID. Nr. 137; Transplantat/H3 Seq-ID. Nr. 138; Transplantat/H9 Seq-ID. Nr. 139. VH1 : F58 Seq-ID. Nr. 129, DP-2 Seq-ID. Nr. 130; Transplantat/20 Seq-ID. Nr. 140).
Fig. 12 den Vektor pCANTAB3-myc und die DNA und Aminosäuresequenzen im Bereich der Klonierungsstelle darstellt (Seq-ID. Nr. 131).
Fig. 13 den Vektor pCANTAB5-myc und die DNA und Aminosäuresequenz im Bereich der Klonierungsstelle zeigt (Seq-ID. Nr. 132).
Fig. 14 die Anordnung umgeordneter VH-Gene darstellt.
Tabelle 1 listet Oligonukleotid-Primer und Peptide, die im Text erwähnt sind. Der Leser sei auf Tabelle 1 verwiesen, wo Sequenzinformatinen über diese Oligonukleotide und Peptide sowie alle Seq-ID. Nr. der Sequenzen aufgelistet sind. Tabelle 1 - Eingesetzte Oligonukleotide Menschliche VH-Back- (bzw. Rückwärts-)Primer: Menschlicher IgM-Konstantbereichs-Primer: Menschlicher κ-Konstantbereichs-Primer: Menschlicher λ-Konstantbereichs-Primer: Menschliche JH-Forward- (bzw. Vorwärts-)Primer: VH-Rückwärtsprimer mit APA-LI-Stellen: JHSAL-Primer: λ-Rückwärtsprimer mit SFI-Stellen: κ-Rückwärtsprimer mit SFI-Stellen: Menschliche Vκ-Rückwärtsprimer: Menschliche λ-Rückwärtsprimer: λ-Rückwärtsprimer mit APA-LI-Stellen: κ-Rückwärtsprimer mit APA-LI-Stellen: Menschliche VH-Rückwärtsprimer:

Die Beispiele erläutern Ausführungsformen von Verfahren der Erfindung:

In der in Beispiel 1 beschriebenen Arbeit wurde ein gegen ein Epitop von TNF gerichteter Mäuse-Antikörper als Fab-Fragment zur Freilegung auf Phagen kloniert; durch Kombinieren der Schwerkette mit Repertoires menschlicher Leichtketten (oder der Leichtkette mit Repertoires menschlicher Schwerketten) war es möglich, Fab-Fragmente mit einer Mäuse- und einer menschlichen Kette tragende Phagen zu selektieren. Diese Antikörper-Fragmente banden sich an das gleiche Epitop von TNF wie der ursprüngliche Mäu se-Antikörper. Die neue menschliche Kette (schwer oder leicht) wurde dann mit einem Repertoire menschlicher Partnerketten kombiniert, um ein gänzlich menschliches Antikörper-Fab-Fragment zu erzeugen, das sich an das gleiche Epitop von TNF bindet.
Beispiel 2 stellt CDR-imprimierte Selektion in einem Zweifach-Kombinationsformat dar. Ein Anti-HIV gp120-Antikörper wurde durch epitop-imprimierte Selektion unter Beibehaltung des ursprünglichen Mäuse-Schwerketten-CDR3 humanisiert. Die VH- und VL- Domänen des Mäuse-Antikörpers wurden als Fusionen mit Mäuse-CH1- und Ck-Ketten kloniert. Das resultierende Schwerketten-CHCH1-Fragment wurde in Kombination mit einem Repertoire menschlicher Leichtketten (als g3p-Fusion aus Phagenvektor exprimiert) auf Phagen freigelegt. Auf Phagen freigelegte menschliche Leichtketten wurden selektiert und die selektierten Ketten in Phagen in Kombination mit einer Sammlung menschlicher nativer Schwerketten-VHCH1-Fragmente freigelegt, die amplifiziert waren, um den CDR3 der ursprünglichen Mäuse-Schwerkette zu umfassen (als g3p-Fusionen exprimiert). Selektierte Phagen wurden erhalten, die Antikörper-Polypeptid-Dimere freilegen, welche die ursprüngliche Spezifität gegen gp120 beibehalten, jedoch abgesehen von der Beibehaltung des Mäuse-Schwerketten-CDR2 nun vollkommen menschlichen Ursprungs sind.
Beispiel 3 zeigt CDR-imprimierte Selektion in einem Einzelreplicon-Einzelketten-Fv- Format. Ein Anti-HIV gp120-Antikörper wurde durch eptitop-imprimierte Selektion unter Beibehaltung des ursprünglichen Mäuse-Schwerketten-CDR3 humanisiert. Eine Einzelketten-Fv-Sammlung wurde auf Phagen freigelegt, wobei die Fragmente die ursprüngliche Mäuse-Leichtkette und CDR3 der Schwerkette umfassen, der Rest der Leichtkette jedoch menschlichen Ursprungs war (abgeleitet aus einer Sammlung menschlicher nativer Schwerketten). Die variable Schwerketten-Domäne von selektierten Phagen wurde dann mit einem Repertoire menschlicher variabler Leichtketten-Domänen kombiniert, um eine scFv-Sammlung auf Phagen zu erzeugen. Aus dieser Sammlung selektierte Phagen legten SdFv-Fragmente frei, in denen die variablen Domänen bis auf die Beibehaltung des CDR3 der Mäuse-Schwerkette vollkommen menschlichen Ursprungs waren.
Beispiel 4 zeigt die Isolierung menschlicher Antikörper, die aus dem Immunrepertoire einer immunisierten Maus stammen. Ein Repertoire von Schwer- und Leichtketten-Mäuse-V-Genen aus einer mit TNF immunisierten Maus sind als Einzelketten-Fv-Fragmente und hinsichtlich Bindung an TNF selektierte Phagen dargestellt. VH-Gene aus dieser selektierten Mäusepopulation werden dann mit VL-Genen aus einer menschlichen nativen Sammlung als Einzelketten-Fv-Fragmente kombiniert und Phagen selektiert. Selektierte semi-humanisierte Antikörper-Polypeptid-Dimere werden anschließend durch Paaren der menschlichen VLs mit menschlichen VHs aus einer menschlichen nativen Sammlung vollkommen humanisiert. Vollkommen humanisierte, für TNF spezifische Antikörper-Polypeptid-Dimere können danach aus der resultierenden Sammlung selektiert werden.
Beispiel 5 veranschaulicht die Erzeugung einer synthetischen Sammlung.

Beispiel 1

Humanisierung eines Mäuse-Antikörpers

Isolierung menschlicher Antikörper, die gegen ein spezifisches Epitop auf Tumor-Nekrosefaktor-α (TNF-α) gerichtet sind, unter Einsatz von epitop-imprimierter Selektion

Als Zielantikörper zur Humanisierung durch Doppelketten-Shuffling wurde ein monoklonaler Mäuse-Antikörper gewählt, der gegen menschlichen TNF gerichtet ist. Der Antikörper Mab32 (Klasse IgG2b, k) (D. Rathjen et al., Mol. Immunol. 28, 79 (1991); D. Rathjen et al., Brit. J. Cancer 65, 852-856 (1992); Australische Patentanmeldung Nr. 7.676; EP-A-486.526) hemmt die zytolytische Wirkung von TNF nicht (vermutlich, weil er die Bindung von TNF an seine Rezeptoren nicht hemmt), erhöht aber die krebshemmenden und antiviralen Wirkungen des Zytokins in vivo. Die Antikörper-Bindungsstelle befindet sich in einem Bereich des TNF-Trimers, der die ersten 18 Reste von TNF umfaßt. Dieses Beispiel zeigt, daß epitop-imprimierte Selektion eingesetzt werden kann, um menschliche Antikörper zu erzeugen, die das gleiche Epitop auf menschlichem TNF-α spezifisch erkennen.

Experimenteller Teil und Ergebnisse

Die eingesetzten allgemeinen Verfahren sind am Ende dieses Abschnitts angeführt.

1. Klonieren und Freilegen der V-Gene von Mab32 auf Phagen

Klonieren der V-Gene von Mab32:

Die Gene des Mäuse-Mab32-Antikörpers (IgG2b, Kappa) wurden durch PCR im wesent- lichen wie beschrieben bewahrt (Clackson et al., 1991, s. o.; Clackson et al., "PCR: A Practical Approach", Mr. Phenox et al. (Hrsg.), IRL Press Oxford, S. 187-214), wobei die Primer VH1BACk und VH1FOR2 für das VH-Gen sowie VK2BACK und VK4FOR für das VL-Gen und die Polyermase-Kettenreaktion (PCR, R. K. Saiki et al., Science 230, 1350 (1985)) eingesetzt werden. Die Mäuse-VH- und Vk-Gene vurden durch PCR-Assemblierung zur Expression als scFv-Fragmente assembliert (Clackson et al., s. o.), mit VH1BACKSfi und VKFOR4NOT amplifiziert und als gespaltenes SfiI-NotI-Restriktionsfragment in Phagemid pHEN1 ligiert (H. R. Hoogenboom et al., Nuc. Acids. Res. 19, 4133-4137 (1991)) sowie in E.coli HB2151-Zellen elektroporiert. Von 96 mittels ELISA analysierten Klonen (siehe unten) sekretierten 9 lösliche TNF-Bindungs-scFv-Fragmente. Sequenzierung zeigte bei allen Klonen eine Mäuse-VH der Familie IIB und einen Mäuse-Vk der Familie VI (E. A. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U. S. Public Health Services, 1991). Nukleotidmutationen, die vermutlich durch PCR eingeführt wurden, wurden durch Vergleichen der 9 Sequenzen detektiert, und ein Klon mit "Konsens"-Sequenz und Bindungsaktivität (scFv-Mab32), wurde für weitere Klonierungsversuche selektiert (Fig. 5).

Reklonieren der Mab32 V-Gene zur löslichen Expression:

Die Mäuse-V-Gene wurden zur löslichen Expression von Schwer- (Fd, VHCH1) oder Leichtkette rekloniert, indem die Mäuse-V-Gene durch Spleißüberlappungsverlängerung an das menschliche CH1- (vom mu-Isotyp) oder das menschliche Ck-Gen gebunden wurden. Das Mäuse-Vk-Gen wurde aus scFv-Mab32-DNA mit den Oligonukleotiden MOJK1FORNX amplifiziert (bindet sich im Verbindungsbereich des V-Gens; die Sequenzen aller in diesen Beispielen eingesetzten Oligonukleotide werden in Tabelle 1 gezeigt) und MVKBASFI (bindet sich im 5'-Bereich und fügt eine SfiI-Restriktionsstelle hinzu); das menschliche Ck wurde durch PCR von einem heterozygoten Maus/Mensch- Leichtketten-Gen (von NQ10.12.5, beschrieben von Hoogenboom et al., 1991, s. o.), mit den Oligonukleotiden MOVK-HUCK-BACK (bindet sich 5' von menschlichem Ck und ist teilweise komplementär zum Mäuse-Jk 1-Bereich) und HUCKNOT16NOMYC (liegt am 3'-Ende von menschlichem Ck, behält das terminale Cystein bei und hängt sich an eine NotI-Restriktionsstelle), wie von Clackson et al., 1991, unter Einsatz einer Zwei-Fragment-Anordnung erhalten. Zur Verbindung der DNA-Fragmente wurden die beiden PCR-Fragmente mit MVKBÄSFI und HUCKNOT16NOMYC vermischt und amplifiziert. Das heterozygote VkCk-Gen wurde in der Folge als SfiI-NotI-Fragment in pUC19-Derivat kloniert, das die pelB-Signalpeptidsequenz und geeignete Klonierstellen für die lösliche Expression der Leichtkette enthält (pUC19-pelB-myc, Fig. 2). Auf ähnliche Weise wurde das Mäuse-VH-Gen (amplifiziert aus scFv-Mab32 mit LMB3 und VHIFOR-2) wurde durch Spleißen durch Überlappungsverlängerungs-PCR mit der menschlichen u-CH1-Domäne (amplifiziert aus menschlicher IgM-abgeleiteter cDNA; Marks et al., 1991, s. o., WO 92/01047) mit Mo-VH-Hu-CH1 und HCM1FONO kombiniert und zur löslichen Expression einer markierten Kette als SfiI-NotI-Fragment in ein pUC19-pelB-myc kloniert.

Freilegen des Mab32-Antikörpers auf Phagen:

Die heterozygote Leichtkette wurde auf Phagen fd durch Reamplifizierung der heterozygoten Maus/Mensch-Kette mit HUCKCYSNOT und MVKBAAPA und Klonieren in fd-tet- DOG1 als ApaLI-NotI-Fragment freigelegt. Zellen, die ein Plasmid mit dem Fd-Schwerketten-Gen beinhalten, wurden in 2xTY, das AMP-GLU enthält (1%), bis zur logarithmi schen Phase (OD&sub6;&sub0;&sub0;: 0,5) gezüchtet und mit einem 20fachen Überschuß an Leichtkette freilegendem Phagen infiziert. Nach 45 min bei 37ºC ohne Rütteln und 45 min bei 37 ºC mit Rütteln im 2xTY Ampicillin (100 ug/ml), 1% Glucose, Medium wurde eine Probe im 50fachen Volumen an vorgewärmtem (37ºC) 2XTY, Ampicillin (100 ug/ml) und Tetracyclin (15 ug/ml) verdünnt, 1 h lang bei 37ºC und dann über Nacht bei 30ºC (unter Rütteln) gezüchtet. Phagenteilchen, die aus dem Überstand einer solchen Kultur erhalten wurden, wiesen TNF-bindende FAB-Fragmente auf, die über die Leichtkette an ihrer Oberfläche verankert waren.
Auf ähnliche Weise wurde die umgekehrte Konfiguration hergestellt. Das Schwerketten- VHCH1-Fragment wurde in fd-tet-DOG1 kloniert (nach Amplifizierung des Fd-Ketten- Gens ausgehend vom heterozygoten Maus/Mensch-Konstrukt mit VH1BACKAPA und HCM1FONO) und Phagen verwendet, um Zellen zu infizieren, die zur Produktion löslicher Leichtkette fähig waren. Phagenteilchen, die aus dem Überstand einer solchen Kultur gewonnen wurden, wiesen TNF-bindende Fab-Fragmente auf, die über das Schwerketten-VHCH1-Fragment an ihrer Oberfläche verankert waren.

Eigenschatten von Mab32-Fragmenten, die auf Phagen freiliegen:

Die V-Gene des Mäuse-Antikörpers Mab32 wurden durch Amplifizieren der Hybridom- V-Gene kloniert, wobei die VH- und Vk-Gene als scFv-Fragmente in Phagemid pHEN1 wie oben kloniert wurden. Antikörper-scFv-Fragmente, die sich an TNF banden, wurden durch ELISA identifiziert (Details siehe unten). Das Mäuse-VH-Gen wurde zur Expression als Mäuse-VH, das an menschliches mu-CH1 gebunden war, in pUC19-pelB-myc (Fig. 2) rekloniert, während die Leichtkette mit der menschlichen Ck-Domäne in Vektor fd-tet-DOG1 als Fusion mit g3p rekloniert wurde. Als Zellen, die das Schwerkettenkonstrukt beinhalteten, mit dem fd-Phagen infiziert wurden, der die Leichtkette trug, traten Phagenteilchen auf, die Leichtketten-g3p trugen, das mit der Fd-Schwerkette assoziiert war. Tatsächlich wurden die Bindung an TNF und das 301-Peptid beibehalten, wie mittels ELISA bestimmt, wobei Phagen das heterozygote Maus/Mensch-Fab-Fragment aufwiesen (Fig. 3). Beim Phagen-ELISA war das Hintergrundsignal von Phagen, welche die Leichtkette trugen, nur etwas stärker als bei Wildtyp-fd-tet-DOG1-Phagen, aber immer schwächer als das Signal, das bei Fab-freiliegenden Phagen erhalten wurde. TNF bindender Phage wurde mit dem Schwerketten-VHCH1-Fragment gebildet, das auf dem Phagen verankert war, und die Leichtkette als lösliches Fragment bereitgestellt. Somit ist Mab32 im Zweifach-Kombinationsformat in beiden Freilegungsausrichtungen funktionell.

2 Ketten-Shuffling durch epitop-imprimierte Selektion (EIS) Konstruktion von Einketten-Sammlungen:

κ,λ-Leichtkette und Mu-spezifische cDNA wurde aus der mRNA hergestellt, die aus den Peripherblut-Lymphozyten von zwei gesunden Spendern im wesentlichen wie von Marks et al., 1991, s. o., beschrieben hergestellt. Die cDNA-Synthese des ersten Strangs wurde mit den Oligonukleotiden HCM1FO, HUCLCYS und HUCKCYS für Mu-spezifische λ- bzw. κ-Sammlungen durchgeführt. Das VH-CH 1-Repertoire wurde aus dieser cDNA mit den Oligonukleotiden HCM1 FO und sechs familienspezifischen VHBACK- Primern amplifiziert (wie bei Marks et al., 1991, s. o.), mit einem NotI-markierten Vorwärts-Primer (HCM1FONO) und ApaLI-markierten VHBACK-Primern reamplifiziert (6 Primer HuVH1BAAPA bis HuVH6BAAPA; Tabelle 1). Auf ähnliche Weise wurden die Leichtketten-Repertoires mit HUCLCYS- oder HUCKCYS-Vorwärtsprimer und HUVλ1- BACK- bis HuVλ6BACK- oder HuVk1BACK- bis HuVk6BACK-Rückwärtsprimer amplifiziert, wie bei Marks et al., 1991, s. o., und PCT/GB 91/01134 (WO 92/01047) beschrieben. In jedem in diesem Abschnitt beschriebenen Fall wurden die λ- und κ-ketten-variablen Repertoires mit ApaLI- und NotI-markierten Versionen dieser Oligonukleotide reamplifiziert (13 Rückwärtsprimer HuVXIBAAPA bis HuVX6BAAPA oder HuVkl BAA- PA bis HuVkBAAPA bzw. zwei Vorwärtsprimer HuCLCYSNOT und HuCKCYSNOT). Alle drei Repertoires wurden in Vektor fd-tet-DOG1 als ApaLI-NotI-Fragmente kloniert und in E.coli MC1061-Zellen elektroporiert, um Sammlungen aus 1,0 · 10&sup7; Klonen für VλCλ, 1,4 · 10&sup7; Klonen für VkCk und 5 · 10&sup6; Klone für IgM-abgeleiteten VHCH1 zu er halten. Das Vorliegen von Insertion wurde überprüft und festgestellt, daß die Häufigkeit von Insertionen in der Sammlung in allen drei Fällen über 95% lag.

Selektion einer menschlichen VL unter Verwendung der Mäuse-VH-Domäne als Docking-Kette:

Bei Ketten-Shuffling unter Einsatz von epitop-imprimierter Selektion gibt es zwei Wege vom Mäuse- zum Menschen-Antikörper - je nachdem, welches Mäuse V-Gen in den ersten Selektionsrunden konstant gehalten wird (siehe Fig. 1). Der Einfluß der Mäuse- Schwer- und Leichtkette bei der Bindung an Antigen und ihr Einfluß auf das Docking menschlicher Partnerketten an das ursprüngliche Epitop kann zwischen Antikörpern beträchtlich variieren - möglicherweise abhängig davon, welche Domäne den Großteil der Antigen-Bindungskontakte bildet.
Fig. 1 zeigt das Prinzip epitop-imprimierter Selektion (EIS) beispielhaft dargestellt, ausgehend von einem Mäuse-Antikörper. Die leeren Rechtecke stellen die ursprünglichen Mäuse-Antikörper-VH- und -VL-Domänen dar. Schraffierte Rechtecke stellen menschliche VH- und VL-Domänen dar. Die links unten gezeigten abgeleiteten menschlichen Antikörper werden durch ein Verfahren hergestellt, das folgendes umfaßt:
(a) (i) Beibehaltung der ursprünglichen Mäuse-VH und Shuffling mit einer Sammlung menschlicher VL-Domänen, gefolgt von der Selektion durch Bindung an Antigen.
(a) (ii) Shuffling dieser selektierten menschlichen VL-Domänen mit einer Sammlung menschlicher VH-Domänen, gefolgt von Selektion durch Bindung an Antigen.
Die rechts unten dargestellten, abgeleiteten menschlichen Antikörper wurden auf dem alternativen Weg abgeleitet, der folgendes umfaßt:
(b) (i) Beibehaltung der ursprünglichen Mäuse-VL und Umordnung mit einer Sammlung menschlicher VH-Domänen, gefolgt von Selektion durch Bindung an Antigen.
(b) (ii) Shuffling dieser selektierten menschlichen VH-Domänen mit einer Sammlung menschlicher VL-Domänen, gefolgt von Selektion durch Bindung an Antikörper.
Die menschlichen Antikörper in der Mitte unten wurden abgeleitet durch:
(c) Shüffling der unter (a) (i) abgeleiteten, selektierten menschlichen VL-Ketten mit den unter (b) (i) abgeleiteten, selektierten menschlichen VH-Ketten und anschließende Selektion durch Bindung an Antigen.
Unter (b) (ii) abgeleitete VH-Ketten können mit unter (a) (ii) abgeleiteten VL-Ketten kombiniert werden und umgekehrt.
Der vorliegende Abschnitt beschreibt Verfahren (a) und die nachfolgenden Abschnitte die Verfahren (b) und (c). Dieses Beispiel beschreibt die Verfahren in einem Zweifach- Replicon-, Zweifach-Kombinationsformat, obwohl die Verfahren auch auf ein Einzel- Replicon-, Einzel-Ketten-Fv-Format anwendbar sind.
Im ersten Kettenshuffling-Versuch wurde die Mäuse-VH (verbunden mit der menschlichen CH1-Domäne), das aus pUC19-pelB-myc exprimiert wurde, als Fab-Fragment mit einer Sammlung aus 10&sup7; verschiedenen menschlichen VλCλ-Domänen gepaart. Phagen, bei denen die Antikörperfragmente frei lagen, wurden Panning-Runden auf TNF-beschichteten Röhrchen unterzogen. Durch Aufzeichnung des Titers der eluierten Phagen kann das Selektionsausmaß überwacht werden. Nach 4 Runden (mit 100facher Zunahme des Titers der eiuierten Phagen) wurde festgestellt, daß sich bei einem ELISA mit Phagen, die Fab-Fragmente eprimieren (alle mit dem Mäuse-VH-Human-CH1), 24 von 28 einzelnen Klonen an TNF binden. Phagen, bei denen nur die selektierten menschlichen VλCλ-Domänen frei lagen, ergaben einen ähnlichen Hintergrund wie Phagen, bei denen nur das heterozygote Mäuse-Vk-Human-Ck freilag. 16 Klone, die nach der ersten Selektionsrunde erhalten wurden, erwiesen sich als negativ.
Unter den 24 Bindungsgruppen wurden nur drei verschiedene BstNI-Fingerprints gefunden, wobei ein Muster dominierte (21/24). Die Leichtketten VλA2, VλC4 und VλD1 wurden mit Häufigkeiten von 21/24, 2/24 bzw. 1/24 festgestellt. Sequenzierung zeigte, daß alle drei Leichtketten vom gleichen Keimlinien-Gen abgeleitet waren, einem menschlichen Vλ1-1-1. Klon VλC4 weist eine, Klon VλD1 zvei und Klon VλA2 sieben Aminosäurerest-Differenzen zur Keimlinie auf (Fig. 6). Bei Klon VλA2 wird jedoch ein Rahmen1-Bereich genutzt, welcher der Keimliniensequenz eines verwandten Vλ1, nämlich hmvl 117, genauer entspricht und daher das Ergebnis von Crossover sein kann. Der Keimlinien-Charakter der Klone ist auch in der CDR3-Sequenz festzustellen, mit minimaler Variation in der Sequenz und ohne Längenvariation zwischen den drei Klonen. Scheinbar entspricht nur eine sehr begrenzte Anzahl von Genen mit sehr ähnlichen Sequenzen den strengen Anforderungen (Kompatibilität mit der Mäuse-VH und Bildung eines Antigen-Bindungspaares). Eine der Überraschungen besteht darin, daß von menschlicher Keimlinie kodierte V-Gene Domänen liefern können, die diesen Bedingungen entsprechen. Das Ausgangsmaterial dieser Sammlung hat sich jedoch in anderen Versuchen als sehr vielfältig erwiesen. Beispielsweise wurden von einer nicht-immunisierten scFv-Sammlung, die aus den gleichen beiden Spendern gebildet wurde, viele verschiedene λ-Ketten mit einem Bereich von Nukleotidmutationen im Vergleich zu bekannten Keimliniengenen abgeleitet (Marks et al., 1991, s. o.). Außerdem wurden Leichtketten-Gene, die von den gleichen Spendern stammten, in einem Ketten-Shufflingversuch zur Affinitätsreifung verwendet, und Leichtketten-Varianten (alle Vλ1) mit zahlreichen Mutationen isoliert (Marks et al., 1992, s. o.).

Selektion einer menschlichen VH unter Einsatz der selektierten menschlichen VL-Domänen als Docking-Ketten:

Die drei selektierten Vλ-Gene wurden in pUC19-pelB-myc zur löslichen Expression als VλCλ-Ketten rekloniert. E.coli-Zellen, welche die drei Leichtketten-Plasmide beinhalten, wurden vermischt, mit einer Phagensammlung menschlicher VHCH1-Gene infiziert, aus der zuvor beschriebenen fd-tet-DOG1-Sammlung exprimiert und die Sammlung Pan ning-Runden auf TNF-beschichteten Immuno-Röhrchen unterzogen. Klone wurden nach 5 Runden herausgegriffen, als der Titer der eluierten Phagen um das 100fache anstieg. Bei 15 von 20 Klonen, die anhand von BstNI-Fingerprint der DNA-Insertion analysiert wurden, kam eines von zwei Mustern (mit etwa gleicher Häufigkeit) zum Einsatz. Die 15 Klone lieferten, wenn ihre Schwerketten-VHCH1-Fragmente mit der VλA2-Leichtkette kombiniert wurden, stärkere Phagen-ELISA-Signale als bei Kombination mit der VλC4- oder VλD1-Leichtkette (Fig. 3). Hintergrundsignale, die bei Phagen erhalten wurde, bei denen das Schwerketten-VHCH1-Fragment freilag, waren nur dem Signal des Mäuse- VH-Human-CH1 ähnlich.
Sequenzierung zeigte, daß die beiden Muster drei einzigartigen menschlichen VH-Sequenzen zugeordnet werden konnten (Klone VHP1/2/3, wobei Klon VHP1 einen BstNI- Fingerprint aufweist, der mit jenem von Klon VHP2 beinahe identisch ist). Wie die selektierten Leichtketten-Gene werden die selektierten Schwerketten-Gene mit minimalen Restdifferenzen vom gleichen Keimlinien-VH-Gen abgeleitet (Keimlinie DP-51 aus der VH&sub3;-Familie, Tomlinson et al.,). Mol. Biol. 227, 776-798 (1992); Fig. 6). Fig. 6 zeigt die abgeleiteten Proteinsequenzen von VH- und VL-Antikörper-Genen von Antikörper-Fragmenten, die sich an menschlichen TNF binden. Die selektierten menschlichen V-Gene wurden nach ihrem nächsten Keimlinien-Homolog ausgerichtet; identische Reste in den selektierten Genen sind durch Bindestriche dargestellt. Rahmen 4 der VH-Gene ist am vierten Rest verkürzt. Klon VHP1 ist am wahrscheinlichsten ein Crossover zwischen DP- 51 und einer verwandten Keimlinie, DP-47. Alle drei selektierten VH-Gene weisen relativ kurze CDR3-Schleifen (8, 9 und 10 Reste) auf, verfügen aber in dieser Sequenz über wenig Homologie. Da VH-CDR3 natürlich der vielfältigeste Bereich aller sechs variablen Antikörper-Schleifen ist, ist die Wahrscheinlichkeit der Selektion von Klonen mit Konsens in diesem Bereich tatsächlich sehr gering.

Spezifität der Bindung der selektierten V-Gen-Paare:

Ein Spezifitäts-ELISA mit Mab32 und löslichen scFv-Fragmenten an einer Anzahl von Antigenen zeigte, daß sich der ursprüngliche Mab32-Antikörper, dessen scFv-Derivat und drei der humanisierten TNF-Bindungsgruppen (als scFv-Fragmente) spezifisch an TNF binden (Fig. 4). Es wurde keine wesentliche Bindung an ELISA-Platten, die mit Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin, Eialbumin, Cytochrom C, Rinderserumalbumin, menschlichem Thyroglobulin oder 2-Phenyloxazol-5-on-BSA beschichtet waren, oder nur an Kunststoff beobachtet. Der Beweis, daß sich die humanisierten Antikörper an das gleiche Epitop binden, kam zuerst von Phagen-ELISA mit peptid-301-beschichteten Platten und Phagen, auf denen die ursprünglichen heterozygoten Maus/Mensch-Fab- oder die humanisierten Fab-Fragmente freiliegen (dieses Assay ist nicht empfindlich genug, um die Detektion löslicher scFv-Fragmente zu ermöglichen) (Fig. 3). Fig. 3 zeigt Ergebnisse von ELISA von Phagen, auf denen Fab-Fragmente freiliegen, wobei eine auf den Phagen als g3p-Fusion freileigende Kette (angegeben durch fd-...) und die andere Kette als sekretierter, löslicher Kettenpartner vorliegt. Klone legen eine Kombination aus den folgenden Ketten frei: fd-DOG1 (kein Antikörper); Leichtketten: Mäuse-MoVL (von Mab32), Human-VλA2 und -VλC4 (selektiert mit Mäuse-VH); Schwerketten: Mäuse- MoVH (von Mab32), Human-VHLM2 und -VHLM8 (selektiert mit Mäuse VL). Vλ-Ketten werden als VL angegeben. Es wurden vollständig humanisierte Klone erhalten, die sich sowohl an Peptid 301 als auch TNF banden.
Um zu zeigen, daß die menschlichen scFv-Fragmente mit dem ursprünglichen Antikörper um Bindung an TNF konkurrieren, wurde außerdem die Bindung der scFv-Konstrukte in einem Kompetitions-ELISA mit dem Fab-Fragment analysiert, das durch proteolytische Spaltung von Mab32 abgeleitet wurde. Einzelketten-Fv-Fragmente wurden auf einer TNF-beschichteten Oberfläche mit zunehmenden Mengen des Fab-Fragmentes inkubiert und das Ausmaß an gebundenem scFv in ELISA detektiert (Fig. 7). Jedes der scFv-Fragmente konkurrierte mit dem FabMab32 um die Bindung an TNF, einschließlich sowohl des ursprünglichen scFv-Mab32- als auch des humansierten scFv-Fragments.
Somit wurde die Feinspezifität von Mab32 für Peptid 301 von TNF beim Humanisierungsverfahren beibehalten.

Affinität der Bindung der selektierten V-Gen-Paare:

Der Mäuse-Mab32-Antikörper und gereinigte monomere Formen des rekombinanten Mäuse-scFv-Mab32 und der menschlichen scFv-Antikörper VHP1-VλA2, VH}P2-VλA2 und VHP3-VλA2 wurden Kompetitions-ELISA unterzogen, um die relative Affinität für TNF zu bestimmen. Antikörper wurden auf einer TNF-beschichteten Oberfläche in Gegenwart zunehmender Megnen an löslichem TNF inkubiert. Alle Klone zeigten etwa ähnliche Abnahme des ELISA-Signals über den gleichen Bereich zunehmender TNF- Konzentrationen (mit einem IC50 im Bereich von 10 nM bis 100 nM). Obwohl berichtet worden ist, daß sich das Ausgangs-Mab32 stärker bindet (Affinitätskonstante für die Bindung an menschlichen TNF: 8,77 · 10&sup9; M&supmin;¹), zeigt das die Bivalenz des gesamten Antikörpermoleküls im Vergleich zur Monovalenz eines scFv-Fragments.
Die Mab32- und VHP3VλA2-Fragmente wurden unter Einsatz des Pharmacia BIAcore ebenfalls bezüglich Bindungseigenschaften analysiert. TNF wurde indirekt auf der Oberfläche immobilisiert und die Bindung von Antikörper überwacht. Die Eigenschaften des ursprünglichen Mäuse-Antikörpers wurden durch Analyse zweier monomerer Formen von Mab32 ermittelt. An der TNF-Oberfläche zeigten das Fab-Frgment von Mab32 durch proteolytische Spaltung und das scFv-Mab32 sehr ähnliche Fast-off-Raten (etwa 10&supmin;²s&supmin;¹). Der menschliche VHP3-VλA2-Antikörper weist eine Off-Rate im gleichen Bereich wie das ursprüngliche scFv-Mab32 auf. On-Raten für Antikörper-Protein-Wechselwirkungen liegen in jenem Bereich, der für die Wechselwirkung zwischen anderen Proteinen und ihren Rezeptoren festzustellen ist, und decken einen 100fachen Bereich zwischen 10&sup4; und 10&sup6; M&supmin;¹s&supmin;¹ ab (D. VV. Mason und A. F. Williams, "Kinetics of Antibody Reactions and the Analysis of Cell Surface Antigens", Blackwell, Oxford, 1986; I. Pecht, "Dynamic Aspects of Antibody Function", M. Sela (Hrsg.), Academic Press Inc., New York, Band 6, S. 1-68, 1992). Unter der Annahme, daß die On-Raten der Antikörper- TNF-Wechselwirkungen typisch für Antikörper-Protein-Wechselwirkungen sind, steht die durch BIACore-Analyse erhaltene Off-Rate mit der Affinität in Einklang, die durch Kompetitions-ELISA angezeigt wird (Kd = 10&supmin;&sup7; bis 10&supmin;&sup8; M).
Somit stehen diese Bestimmungen mit scFvMab32 und dem humanisierten scFv-Klon VHP3-VλA2 in Einklang, der eine ähnliche Affinität aufweist, und somit mit der Beibehaltung von Affinität sowie Spezifität durch epitop-imprimierte Selektion.

Selektion humanisierter Antikörper auf alternativem Weg der epitop-imprimierten Selektion; Selektion menschlicher VH- und dann VL-Ketten:

Um die Frage zu beantworten, ob weitere menschliche Ketten auf dem alternativen Weg selektiert werden könnten, wurde zuerst eine menschliche VH unter Einsatz der Mäuse-VL-Domäne als Imprimierungskette selektiert. Nach vier Panning-Runden dominierten zwei menschliche VH-Domänen die Population (VH-LM2 und VH-LM8). Beide VH-Gene weisen im Vergleich zur Keimlinie (CP-46), die zur VH3-Famlie gehört, minimale Differenzen auf. Im Vergleich zur VHP1, -2 und -3-Sequenz wird bei VH-LM2 und VH-LM8 eine Keimlinie der gleichen (VH3-) Familie eingesetzt, und sie weisen die gleiche kanonische Schleifenstruktur für CDR1 und CDR2 auf (I. M. Tomlinson et al., 1992, s. o.; C. Chothia et al., J. Mol. Biol. 227, 789-817 (1992)). Allerdings wird bei den Klonen VH-LM2 und VH-LM8 im Vergleich zu VH}P1, -2 und -3 (18 und 14 Aminosäurereste, im Vergleich zu 8, 9 bzw. 10 Resten) ein ziemlich langes VH}-CDR3 eingesetzt, und ihre jeweiligen Keimlinien unterscheiden sich in 15 Aminosäureresten. Um die Komplementarität der Ketten zu testen, die an unterschiedlichen (aber komplementären) Moulds selektiert werden, wurde die VH-LM2-Domäne mit der menschlichen VλA2-Domäne entweder als Fab auf Phagen oder in einer scFv-Konfiguration kombiniert. Beide ergaben Bindungskombinationen (Fig. 3 und nicht gezeigte Ergebnisse). Außerdem bildet die Mäuse-VL in Kombination mit dem menschlichen VHP3 eine relativ schwache Bindungsgruppe (als Fab-Fragmente auf Phagen).

Allgemeine Verfahren

Herstellung von Phagen, bei denen Fab-Fragmente an der Oberfläche freigelegt sind, unter Einsatz eines Zwei-Replicon-Systems:

E.coli-Zellen, die Plasmid enthielten, das für die Antikörperkette für lösliche Expression kodiert, wurden bei 37ºC in 10 ml 2 · TY, das 100 ug/ml Ampicillin und 1% Glucose enthielt, bis zu einer OD&sub6;&sub0;&sub0; von 0,5 gezüchtet. Die Zellen wurden entweder mit 10¹¹ Transformationseinheiten (TU), die aus der ursprünglichen Sammlung erhalten wurden (indem Sammlungen bei 37ºC in 2 · TY mit Tetracyclin bei 15 ug/ml gezüchtet und Phagen in zwei Runden PEG-Fällung gesammelt wurden), oder mit 1 ml Eluat (variabler Titer) aus den Panning-Versuchen infiziert, indem bei 37ºC 45 min lang ohne Rütteln und 45 min lang unter Rütteln inkubiert wurde. Daraufhin wurden die Zellen in 500 ml vorgewärmtes Medium mit Ampicillin (100 ug/ml) und Tetracyclin (15 ug/ml) eingeimpft, und nach einstündiger Vermehrung bei 37ºC zum Inkubieren über Nacht in einen Rüttler mit 30ºC übertragen. Phagen wurde durch zwei Runden PEG-NaCl-Fällung präpariert und in Wasser bis etwa 10¹³ TU/ml resuspendiert, bevor Selektion durchgeführt wurde.

Selektion von Bindungsgruppen:

Immuno-Röhrchen (Nunc) wurden über Nacht mit 2 ml eines 50 mM Bicarbonatpuffers (pH 9,6) mit 10 ug TNF pro ml beschichtet. Die Inkubation mit Phagen, Wasch- und Elutionsbedingungen waren wie von Marks et al., 1991, beschrieben. E.coli-Zellen, welche die lösliche komplementäre Kette exprimierten, wurden mit den eluierten Phagen infiziert und in 2 · TY-Medium mit Tetracyclin (ug/ml) zur Amplifizierung der selektierten Phagenpopulation (wie oben beschrieben) vermehrt.

Screenen von Klonen auf Bindung:

Einzelne Klone wurden in Phagen-ELISA auf Bindung getestet, indem Einketten-Phagen- Stammlösungen hergestellt wurden und diese Phagen verwendet wurde, um Zellen zu infizieren, die ein Gen beinhalteten, das für eine Partnerkette kodiert (jene, die eingesetzt wurde(n), um die Klone zu selektieren). Phagen, bei denen Fab-Fragmente freiliegen, die aus solchen Kulturen über Nacht (2 ml) wie oben beschrieben erhalten wurden, wurden durch PEG-Fällung 10fach konzentriert Und 50 ul davon einem ELISA- Assay unterzogen. Rekombinanter menschlicher TNF-α (produziert in Hefe, spezifische Aktivität 3,2 · 10&supmin; Einheiten/mg, Peptide Technology) wurde auf Kunststoff-Mikrotiterplatten mit Flachboden (Falcon 3912) mit 10 ug/ml in 50 mM Bicarbonatpuffer (pH 9,6) oder PBS mit 50 ul/Napfüber Nacht bei Raumtemperatur aufgebracht. Nach dem VVaschen mit PBS und Blockieren für 2 h mit 2% Trockenmagermilchpulver ("Dried Skimmed Milk Powder"; Marvel) wurden 50 ul Phagen pro Napfzu 50 ul 4 Wo Marvel zugegeben, woraufhin das ELISA (mit Anti-Phagen-Antiserum) fortgesetzt wurde wie beschrieben (Marks et al., 1991, s. o., und PCT/GB91/01134). Zur Detektion der Bindung an Mab32-Epitop wurde das 301-Peptid (von Peptide Technology zur Verfügung gestellt, Sequenz: H-VRSSSRTPSDKPVAHVVA-OH Seq.-ID. Nr. 119) durch Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur mit 100 ul pro Napf von 10 ug/ml Peptid in PBS beschichtet. Die Näpfe wurden 2 h lang mit 3% BSA blockiert und das ELISA wie oben fortgesetzt (wobei Inkubationen mit Marvel eingesetzt wurden).
Alternativ dazu wurden lösliche Antikörper-Fragmente durch Reklonierung der selektierten Ketten in einem Plasmid (entweder als scFv-Fragmente), Induktion von Expression im entsprechenden Stamm und Detektion gebundener Antikörper-Fragmente im Überstand der E.coli-Kulturen mit dem Anti-myc-Markierungs-Antikörper erzeugt. Gereinigte monomere scFv-Fragmente (Reinigung siehe unten) wurden für Kompetitions-ELISA-Versuche und zur Überprüfung der Bindungsspezifität eingesetzt. Für das Spezifitäts-ELISA wurden Platten mit verschiedenen Proteinen beschichtet, wie beschrieben (Marks et al., 1991, s. o., und WO 92/01047). In allen Fällen, wo lösliche Fragmente in ELISA getestet wurden, wurde Marvel durch BSA ersetzt.
Für Kompetitions-ELISA wurde Fab-Fragment, das durch proteolytische Spaltung von Mab32 (von Peptide Technology zur Verfügung gestellt) abgeleitet worden war, und entweder das 9E10-Protein A-gereinigte Mäuse-ScFv-Mab32- oder das Protein A-gereinigte menschliche scFv-Fragment (VHP1/2/3-Vλ2) eingesetzt. Auf eine TNF-beschichtete Platte (blockiert mit 3% BSA in PBS) wurde ein Gemisch aus jedem der vier scFv-Fragmente und zunehmende Mengen des Mäuse-Fab-Fragments (in 100 ul Gesamtvolumen, 1,2 ml, 4 ul und 10 ul einer 1 mg/ml-Lösung) aufgebracht. Nach 2-stündigem Inkubieren wurde die Platte gewaschen und gebundener scFv mit dem Antikörper 9E10 (der die Cterminale myc-Markierung der scFv-Fragmente erkennt; Munro und Pelham, Cell 46, 291-300 (1986)) und peroxidase-markiertem Ziegen-Anti-Mäuse-Antikörper (Fc-spezifisch) detektiert. Als negativer Vergleich wurden die gleichen Antikörper verwendet, um zunehmende Mengen an Fab-Fragment alleine zu detekieren (das Anti-Mäuse (Fc- spezifisch) zeigt schwache Kreuzreaktion mit dem Mäuse-Fab). Versuche wurden mit einem Konzentrationsbereich von scFv-Fragmenten (bis zu 250 ug/ml) durchgeführt, um die detektierbare Minimalmenge an scFv festzustellen, wo Kompetition sichtbar war (wenn ein scFv-Überschuß eingesetzt wurde, war keine Kompetition erkennbar).

DNA-Fingerprinting und Sequenzierung von Klonen:

Die V-Gen-DNA von bei TNF-ELISA positiven Phagen-Klonen wurde durch DNA-Fingerprinting analysiert (wie von Clackson et al., 1991, s. o., beschrieben). Kurz zusammengefaßt wurden die Gene mit fd-CPR-BACL und fd-SEQ1 (für Schwerketten) oder HULAMBDASEQ (für Leichtketten) für 25 Zyklen (94ºC, 1 min. 50ºC, 1 min und 72 ºC, 2 min) amplifiziert und die DNA mit BstNI gespalten. Analyse der Spaltlösung mittels Agarosegelelektrophorese ermöglichte es dann, beträchtliche Unterschiede zwischen den positiven Klonen zu identifizieren. Die Nukleinsäuresequenzen selektierter V-Bereiche wurden nach dem Didesoxykettenterminationsverfahren bestimmt (F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 (1997)), wobei ein Sequenase-Set (USB) und geeignete Sequenzierungsprimer eingesetzt wurden. In pHEN1 klonierte Mäuse-V-Gene wurden mit pHEN-SEQ und LINKSEQ kloniert; menschliche VH-Gene wurden mit einem Primer sequenziert, der im menschlichen CH1(mu)-Bereich angeordnet war (Hu-MCH1FORSEQ2), während bei menschlichen Vλ-Genen HULAMBDASEQ eingesetzt wurde.

Reklonierung selektierter Ketten zur löslichen Expression:

Selektierte Leichtketten wurden mit SfiI-markierten Rückwärts- und NotI-markierten Vorwärtsprimern zur Klonierung in pUC19-pelB-myc amplifiziert. Die menschlichen Leichtketten VλA2, VλD1 und VλC4 wurden mit HuVL1BACKSFI und HuCL1FORAMBNOT aus fd amplifiziert und in pUC19-pelB-myc (als SfiI-NotI-Fragmente) zur löslichen Expression als markierungsfreie Leichtketten (in Nicht-Suppressor-Stämmen) amplifiziert.
Alternativ dazu wurden selektierte V-Gene im wesentlichen wie beschrieben (Clackson et al., 1991, s.o., Marks et al., 1991, s. o. und WO 92/01047) unter Einsatz von bei Marks et al. (1991, s. o., und WO 92/01047) beschriebenen Oligonukleotiden als lösliche scFv-Fragmente mit einer C-terminalen myc-Markierung zur Expression in HB2151- E.coli-Zellen in pHEN1 (Hoogenboom et al., 1.991, s.o.) kloniert.

Reinigung von scFv-Fragmenten:

Das ursprüngliche Mäuse-scFv-Mab32-c14-Fragment mit der C-terminalen myc-Markierung wurde unter Einsatz einer Affinitäts-9E10-Protein A-Säule aus E. coli-Überstand gereinigt (wie von Clackson et al., 1991, s. o., beschrieben). Die menschlichen scEv-Fragmente (alle mit VH3-Genen) wurden auf Protein A-Sepharose Säulen gereinigt (H. R. Hoogenboom und G. Winter, J. Mol. Biol. 227, 381-388 (1992)). Alle Proteine wurden unter Einsatz von Gelfiltration (Superdex-75, Pharmacia) weiter gereinigt und die Monomer-Fraktion zur BIAcore-Analyse genommen.

Standard-Polymerasekettenreaktion

Das Ständard-Reaktionsgemisch für die Polymerasekettenreatkion war: 5 ul Templat- DNA: 20 pmol Rückwärtsprimer; 20 umol Vorwärtsprimer; 10 mM KCl; 10 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;; 20 mM Tris-HCl (pH8,8); 2 mM MgCl&sub2;; 100 ug BSA/ml und 1 Einheit Taq- DNA-Polymerase (Perkin Elmer Cetus). Das Reaktionsgemisch wurde mit Mineralöl überschichtet und 30 Amplifizierungszyklen unterzogen, wobei ein Techne Thermocycler (Duxfor, England) eingesetzt wurde. Der Zyklusbestand aus 94ºC für 1 min (Denaturierung), 55ºC für 1 min (Annelieren) und 72ºC für 1,5 min (Verlängerung). Andere PCR-Bedingungen sind im Text oder den Literaturstellen angegeben.

Reinigung von DNA-Produkten

Die Produkte wurden nach der Agarosegelelektrophorese unter Einsatz von Geneclean (Bio101) oder durch Elektroelution und Ethanol-Fällung gereinigt ( J. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.).

Restriktionsenzym-Spaltungen

Wurden nach den Angaben der Hersteller durchgeführt (New England Biolabs, CP Labs, Bishops Stortford, Herts.). Ligationen wurden nach Sambrook et al. (1989, s. o.) durchgeführt.

Schlußfolgerung

Es wurde gezeigt, daß ein Mäuse-Antikörper durch das Verfahren der epitop-imprimierten Selektion (EIS) in einen menschlichen Antikörper mit der gleichen Spezifität umgebaut werden kann.
Eine Sammlung menschlicher Leichtketten wurde mit einer Mäuse-VH-Domäne Shuffling unterzogen, Bindungskombinationen selektiert und dann in einem zweiten Shuffling als "Dockingdomänen" für eine Sammlung menschlicher VH-Gene eingesetzt. Gänzlich menschliche Antikörper wurden aus einer solchen "echten" menschlichen Sammlung isoliert. Es wurde gezeigt, daß sich die Antikörper unter Beibehaltung von Bindungsspezifität binden. Alternativ dazu wurde die Mäuse-VL als Dockingkette für die Selektion menschlicher VH-Partner eingesetzt. Solche VH-Domänen können eingesetzt werden, um menschliche VL-Gene zu finden, oder alternativ dazu mit menschlichen VL-Domänen kombiniert werden, die mit der Mäuse-VH-Domäne selektiert werden. Tatsächlich wurde Bindungsaktivität erzielt, indem zwei unabhängig voneinander selektierte V-Gene kombiniert wurden, was auf die potentielle Additivität des EIS-Prozesses hinweist.
Der EIS-Ansatz kann dazu dienen, Antikörper rascher zu humanisieren als durch CDR- Transplantation (Riechmann et al., 1988, s. o.), und dieses Verfahren erfordert sehr oft detailliertes Wissen über die 3-D-Struktur des Antikörpers. Das EIS-Verfahren kann jedoch beispielsweise auf Antikörper-Repertoires ausgedehnt werden, die durch Phagen selektion von immunisierten Nagetieren erhalten werden. Nach der Immunisierung mit Antigen kann ein Repertoire von V-Genen mit hoher Affinität und Spezifität selektiert und dann für epitop-imprimierte Selektion eingesetzt werden (siehe Beispiel 4), um einen Bereich humanisierter Antikörper mit hoher Affinität zu erzeugen, die an der gewünschten Spezifität angereichert sind.

Beispiel 2

Humanisierung von Nagetier-Antikörpern unter Einsatz polykombinatorischer Sammlungen und CDR-Imprimierung

Im allgemeinen ist festzustellen, daß CDR3 der Schwerkette der variabelste aller CDRs ist, was sowohl Länge als auch Sequenz betrifft, und wichtige Kontakte mit Antigen herstellen kann (G. Winter und C. Milstein., "Man-made Antibodies", Nature 349, 293-299 (1991)). Das ist bei der Humanisierung eine wichtige Überlegung, gleichgültig, ob mittels CDR-Transplantation (GB 2.188.638B) oder, wie in der vorliegenden Anmeldung beschrieben, unter Einsatz von Ketten-Shuffling. Es kann vorteilhaft sein, den polykombinatorischen Ansatz auf die Humanisierung durch ein Ketten-Shufflingverfahren anzuwenden, bei dem die VHCDR3-Sequenz des Nagetier-Antikörpers auf die menschlichen VH-Segmente imprimiert wird.
Beim polykombinatorischen Ansatz wird ein Fragment, z. B. VHCH1, auf Phagen als Fusion ausgehend von einem Phagenvektor freigelegt, und die andere, z. B. die Leichtkette, wird als lösliches Fragment beispielsweise aus einem Plasmid exprimiert. Super-Infektion mit Phagen wird eingesetzt, um beide Fragmente auf Phagen als Fab-Fragment freizulegen.
In diesem Beispiel wurde ein monoklonaler Mäuse-Anti-HIVgp120-Antikörper humanisiert. Die VH-Domäne dieses Mäuse-Antikörpers wurde an die menschliche Cγ1-Domäne fusioniert und in pUC19Sfi/Not/polymyc kloniert.
Ein Repertoire nativer menschlicher Leichtketten, die als g3-Fusionen in fd-DOG-1 kloniert wurden (in der WO 92/01047 auch als fd-CAT-2 bezeichnet), wurde dann in die Zellen infiziert, welche die heterozygote Schwerkette trugen, und Phagen auf Antigen selektiert. Diese Phagen weisen sowohl Schwer- als auch Leichtketten an ihrer Oberfläche auf, obwohl das Phagengenom nur für die Leichtkette kodiert; das stellt kein Problem dar, da die einzige Schwerkette die bereitgestellte ist.
Auf diese Weise selektierte Leichtketten wurden dann mit einer Sammlung nativer menschlicher VH-domänen gepaart, die auf solche Weise PCR amplifiziert wurden, daß CDR3 der menschlichen Antikörper durch jene der ursprünglichen Mäuse-Schwerkette ersetzt wurden.
Abschnitt (a) beschäftigt sich mit der Konstruktion eines heterozygoten Fab-Fragments, bei dem die Mäuse-F58-VH- und VL-Domänen an menschliche CH1- und CK-Sequenzen fusioniert sind. Dieser Klon wurde zur frühen Charakterisierung des Antikörpers verwendet und diente als Templat für die nachfolgende PCR-Amplifizierung der Schwerkette, die dann als PstI-Not I-Fragment in pUC19 Sfi-Notpolymyc kloniert wurde (Abschnitt (b)). Abschnitt (c) beschreibt die Konstruktion eines menschlichen Leichtketten-Repertoires in fdDOG, das dann in Zellen infiziert wurde, welche die heterozygote Schwerkette auf pUC19 enthalten (Abschnitt (d)). Die resultierenden Phagen wurden Panning gegen das Peptid unterzogen (Abschnitt (e)) und dann selektierte Leichtketten PCR-amplifiziert und als AscI-Not I-Fragmente entlang der heterozygoten Schwerkette kloniert (Abschnitt (f)) und einem ELISA-Assay auf ihre Fähigkeit unterzogen, Antigen zu binden (Abschnitt (g)). Selektierte Leichtketten wurden in pUC rekloniert (Abschnitt (h)) und native menschliche VH-Domänen mit einem mutagenen Primer amplifiziert, wodurch den Domänen die F58 CDR3-Sequenz auferlegt wurde, und die resultierenden Fragmente in Phagen kloniert (Abschnitt (i)). Dieses Repertoire an imprimierten Schwerketten-Phagen wurde dann verwendet, um Zellen zu infizieren, welche die selektierten Leichtketten auf pUC trugen, und die resultierenden Phagen auf Antigen Panning unterzogen.
Schließlich wurden die selektierten Schwer- und Leichtketten miteinander auf dem gleichen Replicon kloniert und auf Bindung an Antigen untersucht (Abschnitt (j)).

(a) Klonieren von heterozygoter F58-Schwerkette

(i) cDNA-Synthese und primäre PCR

5 ml kultivierte Hybridomzellen (etwa 2 · 10&sup6; Zellen) wurden in PBS gewaschen, pelletiert, in 20 ul 0,1% Diethylpyrocarbonat in Wasser resuspendiert und sofort 5 min lang abgekocht. Nach dem Zentrifugieren wurden 68 ul des Überstandes nach dem Kochen einem 28 ul-Reaktionsgemisch zugegeben, was ein 96 ul-Reaktionsgemisch ergab, das 140 mM KCl, 50 mM Tris. HCl (pH 8,1, 42ºC), 8 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 500 pM Desoxythymidintriphsophat-, 500 uM Desoxycytidintriphosphat-, 500 uM Desoxyadenintriphosphat- und 500 uM Desoxyguanintriphosphat als Nukleotidtriphosphate (500 uM dNTPs), 160 Einheiten menschlicher Plazenta-RNAse-Inhibitor und 10 umol Vorwärtsprimer enthielt. 4 ul (100 Einheiten) reverse Transkriptase von Vogel-Myeloblastosevirus (AMV) wurden zugegeben, das Reaktionsgemisch bei 42ºC 1 h lang inkubiert, 3 min lang auf 100ºC erhitzt, auf Eis gequencht und 5 min lang zentrifugiert. Der Überstand wurde dann sofort für PCR eingesetzt.
Für die Schwer- und Leichtketten wurden getrennte PCR-Amplifizierung durchgeführt. Es wurden 50 ul-Reaktionsgemische hergestellt, die 5 ul des Überstands aus der cDNA- Synthese, 250 uM dNTPs, 50 mM KCl, 100 mM Tris.HCl (pH 8,3), 1,5 mM MgCl&sub2;, 175 ug/ml BSA, jeweils 20 umol der geeigneten Gemische aus Vorwärts- und Rückwärtsprimern (T. Clackson et al., 1991, s. o.) und 1 ul (5 Einheiten) Thermus aqaticus-(Taq-) DNA-Polymerase (Cetus, Emeryville, CA, USA) enthielten. Das Reaktionsgemisch wurde mit Paraffinöl überschichtet und unter Einsatz eines Techne Thermocyclers PHC-2-30 Amplifizierungszyklen unterzogen. Ein Zyklus bestand aus 94ºC für 1 min (Denaturierung), 55ºC für 1 min (Annelieren) und 72ºC für 1 min (Verlängerung). Das Produkt wurde analysiert, indem 5 ul auf einem 2% Agarosegel laufen gelassen wurden. Der Rest wurde zweimal mit Ether, einmal mit Phenol/Chloroform extrahiert, ethanolgefällt und in 50 ul Wasser resuspendiert.

(ii) Klonierung und Sequenzierung von amplifizierter VH- und Vk-DNA

Die amplifizierte VH-DNA wurde mit PstI und BstEII gespalten, auf einem niedrigschmelzenden 2%igen Agarosegel gereinigt und in M13VHPCR1 ligiert, das mit PstI und BstEII gespalten worden war (R. Orlandi, D. H. Gussow, P. T. Jones und G. Winter, "Cloning immunoglobulin variable domains For expression by the polymerase chain reaction", Proc. Natl. Acad. Sci., USA 86(10); 3833-7 (1989)). Die amplifizierte VK-DNA wurde mit PvuII und Bgl II gespalten und in M13VKPCR1 ligiert, das mit Pvu II und Bcl I gespalten worden war. Die Ligationsgemische wurden eingesetzt, um kompetente TG1- Zellen zu transformieren. Zwei Klone aus getrennten Amplifizierungen wurden für jede VH- und Vk-Kette unter Einsatz des Didesoxynukleotid-Kettenterminationsverfahrens sequenziert.

(iii) Erzeugung eines Fab-Konstruktes zur Expression in E.coli

Ein heterozygotes Fab, das die variablen F58-Domänen und die menschlichen IgG1- CH1- und Ck-Domänen enthielt, wurden durch Ligieren der F58-V-Domänen in einen Vektor konstruiert, der die konstanten Domänen enthielt. M13VHPCR1, das die F58-VH enthielt, wurde mit PstI und BstEII gespalten. Das resultierende F58VH-Fragment wurde dann auf 1,5% Agarosegel gereinigt, aus dem Gel mit Geneclean isoliert und in pJM- 1 FabD1.3 (PCT/GB 91/01134) ligiert, das mit PstI und BstEII gespalten worden war. Das Ligationsgemisch wurde dann verwendet, um kompetente E.coli N4830-1-Zellen zu transformieren (M. E. Gottesman, S. Adhya, und A. Das, J. Mol. Biol. 140, 57-75 (1980)), und Klone, die das F58-VH enthielten, durch Restriktionsanalyse von RF-DNA identifiziert. Die F58-Vk wurde durch PCR mit den Primern Vk2BACK und Vk3FOR2 amplifiziert (T. Clackson et al., 1991, s.o.), wobei M13VkPCR eingesetzt wurde, das die F58- Vk als Templat enthielt. Das PCR-Produkt wurde mit SacI und XhoI gespalten, auf 1,5% Agarosegel gereinigt, mit Geneclean aus dem Gel isoliert und in pJM1-Fab-Vektor ligiert, der die F58 VH, mit SacI und XhoI gespalten, enthielt. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um kompetente E.coli N4830-1-Zellen zu transformieren, und Klone, die F58-Vk enthielten, mittels Restriktionsanalyse von RF-DNA identifiziert.

(b) PCR und Klonierung von heterozygoter F58-Schwerkette

Die oben abgeleitete heterozygote F58-Kette wurde von F58-Fab-Klon-DNA PCR-amplifiziert, wobei die Primer VH1BACKSFI15 und HUCH1FORASCNOT eingesetzt wurden (Tabelle 1). Das resultierende Fragment mit etwa 700 bp wurde mit Pst I und Not I gespalten und unter Einsatz von Standardverfahren in mit Pst I und Not I gespaltenes pUC19Sfi/Not/polymyc-Plasmid kloniert (J. Sambrook, et al. 1989, s. o. und Beispiel 1).

(c) Konstruktion eines Leichtketten-Repertoires

κ- und λ-Ketten-Gene wurden getrennt unter Einsatz eines äquimolaren Gemisches aus Rückwärts- und Vorwärtsprimern auf Basis der geeigneten Familie amplifiziert (Tabelle 1). κ-Ketten-Gene wurden aus der cDNA-Synthese unter Einsatz von HUCKFOR-Primern amplifiziert, wobei ein äquimolares Gemisch der 6 HUVKBACK 1a-6a- Primer in Verbindung mit dem HUCKFORSER-Primer eingesetzt wurde. λ-Ketten-Gene wurden aus der cDNA-Synthese unter Einsatz des HUCLFOR-Primers amplifiziert und unter Einsatz eines äquimolaren Gemisches der 7 HULBACK 1-6-Primer in Verbindung mit dem HUCLFORSER-Primer amplifiziert. In jedem Fall wurden 50 ul-Reaktionsgemische hergestellt, die 5 ul des Überstandes aus der entsprechenden cDNA-Synthese, 20 umol Gesamtkonzentration der Rückwärtsprimer, 20 umol Gesamtkonzentration der Vorwärtsprimer, 250 uM dNTPs, 10 mM KCl, 10 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 20 mM Tris.HCl (pH 8, 8), 2,0 mM MgCl&sub2;, 100 mg/ml BSA und 1 ul (1 Einheit) Vent-DNA-Polymerase (New England Biolabs) enthielten. Das Reaktionsgemisch wurde mit Mineral-(Paraffin-)Öl überschichtet, und 30 Amplifizierungszyklen unter Einsatz eines Techne Thermocyclers unterzogen. Ein Zyklus bestand aus 94ºC für 1 min (Denaturierung), 57ºC für 1 min (Annelieren) und 72ºC für 2,5 min (Verlängerung). Die Produkte wurden auf 2% Agarosegel gereinigt, aus dem Gel mittels Geneclean (Bio-101) isoliert und in 25 ul H&sub2;O resuspendiert.
Nun wurden an jedem der beiden Leichtkettenpräparate zwei verschiedene Pullthrough- Reaktionen durchgeführt. κ-Ketten-Gene wurden in zwei Reaktionen amplifiziert, wobei ein äquimolares Gemisch der 6 HUVKBAAPA-Primer in Verbindung mit HUCKFORSER NOT eingesetzt wurde. λ-Ketten-Gene wurden ebenfalls in zwei Reaktionen amplifiziert, wobei ein äquimolares Gemisch der 7 HUVLBAAPA-Primer in Verbindung mit HUCLFORSERNOT eingesetzt wurde. Die Pulthrough-Bedingungen wurden wie für die obigen Leichtketten-PCRs erstellt, mit der Ausnahme, daß 25 Amplifizierungszyklen eingesetzt wurden.
PCR-Produkte wurden mit Apa LI und Not I unter Einsatz des Standardformates gespalten und in mit Apa LI und Not I gespaltenes fd-DOG kloniert, wie in Beispiel 1 beschrieben. Phagen wurden aus den Sammlungsklonen erhalten wie in Beispiel 1 beschrieben und verwendet, um Zellen zu infizieren, welche die Schwerkette enthielten (siehe unten).

(d) Produktion von Shuffling unterzogenen Fab-Phagen

Zellen, welche die heterozygote F58-Schwerkette enthielten, wurden über Nacht bei 37 ºC in 2YTAG gezüchtet und 500 ul zu 50 ml frischem 2YTAmp-Medium, auf 37ºC vorgewärmt, in einem Spitzkolben zugegeben. Die Zellen wurden unter Rütteln bis zu einer OD&sub6;&sub0;&sub0; von etwa 0,5 gezüchtet, bevor insgesamt 10¹¹ Phagen aus dem Leichtketten- Repertoire zugegeben wurden. Die Kultur wurde 45 min lang ohne Rütteln bei 37ºC stehengelassen, dann bei 37ºC weitere 45 min lang heftig gerüttelt, bevor Tetracyclin bis zu 15 ug/ml zugegeben und über Nacht gerüttelt wurde.
Phagen wurden durch PEG-Fällung des Kulturüberstandes geerntet, wie zuvor beschrieben, (Beispiel 1) und für Selektionsversuche eingesetzt.

(e) Panning von Shuffling unterzogenen Fab-Phagen

Dies erfolgte auf Maxisorb-Platten, wie zuvor beschrieben ( J. Marks et al., 1991, s. o.), mit der Ausnahme, daß die Röhrchen mit env-gp120-V3-Schleifen-Peptid von HIV-1-Isolat IIIB, gelöst mit 10 ug/ml in Wasser, beschichtet wurden. Dieses Peptid wurde vom "AIDS-directed Program" (Depotbezugsnr.: ADP737) erhalten und hat die Sequenz: CTRPNNNTRRSIRIQRGPGRAFVTIGKIGNMRQAHCN (Seq.-ID. Nr. 120)
Die von den Röhrchen eluierten Phagen wurden verwendet, um frische Zellen zu reinfizieren, welche die heterozygote F58-Schwerkette enthielten, und der Panning/Reinfektions-Vorgang weitere dreimal wiederholt.

(f) Reklonierung selektierter Leichtketten

Selektierte Leichtketten wurden aus fd-DOG-Leichtketten-DNA unter Einsatz der Primer G3LASCGTGBACK und HUCLFORSERNOT oder HUCKFORSERNOT PCR amplifiziert. Der G3LASCGTGBACK-Primer anneliert stromauf vom Translationsstart des gIII-Signals in fd und führt eine AscI-Stelle und eine Ribosombindungsstelle (RBS) ein. Diese Fragmente wurden mit Asc I und Not I gespalten und in mit Asc I und Not I gespaltenes pUC19F58-Plasmid kloniert (wie in Fig. 8 gezeigt), um ein Cistron zu erzeugen, das die Produktion von löslichem Fab ermöglicht. Dieses wurde in ELISA auf Peptidbindung analysiert und gebundener Antikörper anhand des myc-Markierungspeptids am Ende der Leichtkette detektiert:

(g) ELISA

Selbiges wurde wie nachstehend beschrieben durchgeführt.

1. Einimpfen von 100 ul 2 · TY, 100 ug/ml Ampicillin, 1% Glucose in 96-Napf-Platten ("cell\tab wells", Nuclon) und Züchten unter Rütteln (300 U/min) über Nacht bei 37ºC.

2. Verwendung einer 96-Napf-Übertragungsvorrichtung, um kleine Inocula aus dieser Platte auf eine zweite 96-Napf-Platte zu übertragen, die 200 ul frisches 2 · TY, 100 ug/ml Ampicillin, 0,1 % Glucose pro Napf, enthielt. Vermehrung bei 37ºC, Rütteln, bis die OD bei 600 nm etwa 0,9 beträgt (etwa 3 h). Zugabe von 25 ul 60% Glycerin pro Napf in die Näpfe der ersten Platte und Lagerung bei -70ºC.
3. Zugabe von 25 ul 2 · TY, 100 ug/ml Ampicillin, 9 mM IPTG (Endkonzentration 1 mM IPTG). Rütteln bei 30ºC für weitere 16 bis 26 h.
4. Zentrifugieren mit 4.000 U/min für 10 min und Verwendung von 100 ul Überstand im ELISA.
5. Beschichtung der Platte (Falcon 3912) mit 50 ul pro Napf Peptid mit 10 ug/ml in Wasser. Stehenlassen über Nacht bei Raumtemperatur.
6. Spülung der Näpfe 3x mit PBS und Blockierung mit 200 ul 1% BSA/PBS pro Napf für 1 h bei 37ºC.
7. Spülung der Näpfe 3x mit PBS, dann Zugabe von 25 ul 6% BSA/PBS zu allen Näpfen.
8. Zugabe von 100 ul Kulturüberstand, der lösliches Fab enthält, zu den entsprechenden Näpfen. Mischen, Stehenlassen für 1,5 h bei Raumtemperatur.
9. Verwerfen der Testlösung und Auswaschen der Näpfe dreimal mit PBS, 0,05% Tween 20 und dreimal mit PBS. Einpipettieren von 100 ul von 4 ug/ml gereinigter 9E10- Antikörper in 2% Marvel/PBS in jeden Napf. Inkubation bei Raumtemperatur für 1,5 h.
10. Verwerfen des 9E10-Antikörpers und Auswaschen der Näpfe dreimal mit PBS, 0,05 Tween 20, und dreimal mit PBS. Einpipettieren von 100 ul 1 : 500 verdünnten Anti- Mäuse-Antikörper (peroxidase-konjugierte Anti-Mäuse-Immunglobuline, Dakopats/ICN, oder peroxidase-konjugierten Anti-Mäuse-IgG, Fc-spezifisch, Sigma A-2554). Inkubation bei Raumtemperatur für 1,5 h.
11. Verwerfen des zweiten Antikörpers und Waschen der Näpfe dreimal mit PBS, 0,05 % Tween 20, und dreimal mit PBS.
12. Zugabe einer 10 mg ABTS- (2,2-Azino-bis-(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure)-diammoniumsalz-) Tablette zu 20 ml 50 mM Citratpuffer, pH 4,5. (50 mM Citratpuffer, pH 4,5 wird hergestellt, indem gleiche Volumina an 50 mM Trinatriumcitrat und 50 mM Citronensäure vermischt werden).
13. Zugabe von 2 ul 30 %-Wasserstoffperoxid zur obigen Lösung unmittelbar vor dem Ablassen.
14. Zugabe von 100 ul der obigen Lösung zu jedem Napf. Stehenlassen für 20 bis 30 min bei Raumtemperatur.
15. Quenchen durch Zugabe von 50 ul 3,2 mg/ml Natriumfluorid. Ablesung bei 405 nm.
Anmerkung 1: Alternatives Einimpfen der Klone von Transformationsplatten in 100 ul 2 x TY, 100 ug/ml Ampicillin, 0,1 % Glucose in 96-Napf-Platten ("cell wells", Nuclon) und Vermehrung unter Rütteln (300 U/min) bei 37ºC, Rütteln, bis die OD bei 600 nm etwa 0,9 beträgt (etwa 6 h). Fortfahren mit Schritt 3.
Anmerkung 2: Dieses Verfahren basiert auf dem von D. DeBellis und I. Schwartz, Nucl. Acids Res. 18, 1311 (1990), und den geringen Glucosemengen, die im Ausgangsmedium vorhanden sind, das metabolisiert wird, sobald der Inducer (IPTG) zugegeben wird.
Anmerkung 3: "Marvel" ist getrocknetes Milchpulver. PBS ist 5,84 g NaCl, 4,72 g Na&sub2;HPO&sub4; und 2,64 g NaH&sub2;PO&sub4;·2H&sub2;O, pH 7,2, pro Liter. BSA ist Rinderserumalbumin.

(g) Subklonierung selektierter Leichtketten

Leichtketten wurden von DNA selektierter Klone unter Einsatz eines äquimolaren Gemisches der 7 HUVLBAS FI-Primer in Verbindung mit HUCLFORSERASCNOT oder eines äquimolaren Gemisches der 6 HUVKBASFI-Primer in Verbindung mit HUCKFORSER ASCNOT PCR amplifiziert. Die Reaktionsbedingungen waren wie für die obigen primären PCR-Reaktionen beschrieben, mit der Ausnahme, daß 25 Amplifizierungszyklen eingesetzt wurden. PCR-Fragmente wurden mit Sfi I und Not I gespalten und in mit Sfi I und Not I gespaltenes pUC19Sfi/Not/polym yc kloniert, dann in TG1 transformiert.
Das oben beschriebene Panning/Infektions-Verfahren wird im wesentlichen nochmals wiederholt, wobei diesmal die Position der Schwer- und der Leichtkette vertauscht ist.

(i) CDR-imprimierende VH

VH-Domänen wurden aus dem gepoolten primären PCR-Material amplifiziert, das wie oben beschrieben hergestellt worden war.
Es wurden zwei Präparate PCR-amplifizierter VH-Gene hergestellt. Bei beiden Präparaten wurde ein äquimolares Gemisch der HUJHFOR-Primer eingesetzt (Tabelle 1); bei einem der Präparate wurden 6 getrennte PCR-Amplifizierungen mit jedem der HUVH BACK-Primer einzeln durchgeführt (Tabelle 1), und beim anderen wurde eine einzelne PCR-Reaktion mit einem äquimolaren Gemisch aller 6 HUVHBACK-Primer durchgeführt. Für alle sieben PCRs wurden 50 ul Reaktionsgemische hergestellt, die 5 ul des Überstands aus der cDNA-Synthese unter Verwendung des HUIGMFOR-Primers enthielten, 20 umol Gesamtkonzentration der Rückwärtsprimer, 20 umol Gesamtkonzentation der Vorwärtsprimer, 250 uM dNTPs, 10 mM KCl, 10 mM (NH&sub4;)SO&sub4;, 20 mM Tris.HCl (pH 8,8), 2,0 mM MgCl&sub2;, 100 mg/ml BSA und 1 ul (1 Einheit) Vent-DNA-Polymerase (New England Biolabs) enthielten. Das Reaktionsgemisch wurde mit Mineral-(Paraffin-) Öl überschichtet und 30 Amplifizierungszyklen unter Einsatz eines Techne PHC-2-Thermocyclers unterzogen. Ein Zyklus bestand aus 94ºC für 1 min (Denaturierung), 57ºC für 1 min (Annelieren) und 72ºC für 1 min (Verlängerung). Die Produkte wurden auf 1,5% Agarosegel gereinigt, aus dem Gel durch Geneclean (Bio-101) isoliert und in 25 ul H&sub2;O resuspendiert. Die sieben Produkte wurden dann gepoolt und Pullthrough-PCR- Reaktionen durchgeführt.
Sechs getrennte Pullthrough-Reaktionen wurden mit dem mutagenen F58GRAFTJH4 SAL-Primer und jedem der HUVHBAAPA1-6-Primer getrennt durchgeführt.
Pullthrough-Reaktionen wurden mit dem Primern HUVHBAAPA (äquimolares Gemisch aller 6 Primer) und HUJHFORSAL (äquimolares Gemisch aller 4 Primer) durchgeführt. 50 ul Reaktionsgemische davon, die 5 ul der gepoolten PCR-Produkte aus dem vorherigen Schritt enthielten, wurden unter Einsatz der gleichen Bedingungen wie für die primäre PCR amplifiziert, mit der Ausnahme, daß 25 Amplifizierungszyklen eingesetzt wurden und die Annelierungstemperatur 45ºC betrug.
Die resultierenden VH-Fragmente wurden gepoolt und mit Apa LI und Sal I gespalten, wobei Standardbedingungen zum Einsatz kamen, und unter Einsatz von Standard-Vorschriften in mit Apa LI und XhO 1 gespaltenes fd-DOG-GICH1 kloniert (Sal1- und XhO erzeugen kompatible CTAG-Überhänge). Phagen wurden aus dieser Sammlung wie oben beschrieben erhalten, wobei diesmal der Schwerkettenphage eingesetzt wurde, um Zellen zu infizieren, welche die selektierten, in pUC19Sfi(Not/polymyc exprimierten Leichtketten tragen.

(j) Screenen abschließender Schwer-Leicht-Kombinationen

Das Endergebnis dieses Verfahrens ist ein Pool selektierter Schwerketten und ein Pool selektierter Leichtketten. Diese werden nun statistisch kombiniert. Schwerkettenklone werden nun unter Einsatz eines äquimolaren Gemisches aller 6 HUVHBACKSFI-Primer in Verbindung mit HUCH1FORA SCNOT unter Einsatz des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens PCR amplifiziert. Diese Fragmente werden mit Sfi I und Asc I gespalten und unter Einsatz von Standardverfahren gelgereinigt (Beispiel 1), dann an äquimolare Mengen von in obigem Schritt f) erzeugten mit Asc I und Not I gespaltenen Leichtketten und ebenfalls früher erzeugtem, mit Sfi I und Not I gespaltenem pUC19Sfi/Nodpolymyc- Vektor ligiert. Alternativ dazu ersetzen diese Sfi I-Asc I-Fragmente die F58-Schwerkette in den in Fig. 8(A), unten, gezeigten Konstrukten. Diese Konstrukte wurden dann in Tg1 transformiert und mittels ELISA, wie oben beschrieben, auf Peptidbindungsaktivität analysiert.
Die Endprodukte sind vollständig menschliche Fab-Fragmente mit der gleichen oder ähnlichen Antigen-Spezifität wie der Ausgangs-Nagetier-Antikörper.

Beispiel 3

Humanisierung von Nagetier-Antikörpern unter Einsatz von statistischen kombinatorischen Phagen-Freilegungssammlungen und CDR-Transplantation (CDR-imprimierter Selektion)

In der in diesem Beispiel beschriebenen Arbeit wurde der monoklonale Mäuse-Anti- HIV-1-gp120-Antikörper F58 humanisiert, wie schematisch in Fig. 9 gezeigt. Es wurde ein Vektor (pHENMBF58VL) konstruiert, der die F58-Vk-Domäne, den Einzelketten-Fv- Linker und die ersten Reste eines menschlichen VH-Rahmens 4 mit einer XhoI-Restriktionsstelle trägt. Dieser Vektor ermöglicht das Klonieren von VH-Repertoires als Nco I/Sal I-Fragmente, was vollständige scFvs ergibt. Ein menschliches Repertoire von VHs wurde durch PCR auf solche Weise amplifiziert, daß jede schwere Kette das CDR3 des ursprünglichen Mäuse-mab-F58 und einen menschlichen Rahmen 4 enthielt und wurde schließlich in pHENMBF58VL kloniert. Die scFv-Sammlung wurde zur Bindung an ein HIV-1 gp120-abgeleitetes Peptid selektiert. Variable Schwerkettendomänen von selektierten ScFvs wurden dann durch PCR-Assemblierung mit einem Repertoire variabler menschlicher Leichtketten-Domänen kombiniert, was vollständig humansierte scFvs ergab, und wiederum nach Antigenbindung selektiert. Das hier dargestellte Verfahren ist daher ein Synthese aus CDR-Transplantation und kombinatorischen Phagen-Freilegungs- Sammlungen.

1. PCR-Amplifizierung, Klonieren und Sequenzieren der variablen F58-Domänen

wurden in Beispiel 2 beschrieben. Standard-PCR-Bedingungen sind wie in Beispiel 1 angegeben.

2. Konstruktion des F58-scFv

Die oben charakterisierten VH- und VL-Domänen vurden im wesentlichen wie von Clackson et al., 1991, s. o., beschrieben assembliert, um scFv-Fragmente zu bilden.
Sequenzen der in Abschnitt 2,1 beschriebenen Primer werden bei Clackson et al. (1991, s. o.) angeführt, mit Ausnahme von VHIBACKSfi, das von Hoogenboom et al., s. o., beschrieben wird.

2.1 PCR-Amplifizierung der F58-VH und -VL und das PCR-Assemblierungsverfahren

Etwa 1 ng M13VHPCR1 (Orlandi et al., 1989, s. o.), das die F58-VH und 1 ng M13Vk- PCR enthält (Orlandi et al., 1989, s. o.), das die F58-Vk enthielt, wurde als Templat in zwei getrennten, aber was die Zyklisierungsbedingungen betrifft identischen PCR-Amplifizierungen eingesetzt: Es wurden zwei 50 ul-Reaktionsgemische hergestellt, die 1 ng eines der obengenannten Template, 20 umol VH1BACK und 20 umol VH1FOR-1 (20 pmol VK2BACK und 20 umol VK4FOR zum Amplifizieren der VU, 250 uM dNTPs, 5 ul 10xVent-Polymerase-Reaktionspuffer (wie vom Zulieferer New England Biolabs erhalten) und 2 Einheiten Vent-DNA-Polymerase enthielten. Die Amplifizierungen wurden mit 25 Zyklen PCR (94ºC für 1 min. 55ºC für 1 min. 72ºC für 2 min) durchgeführt.
Die Linker-DNA wurde auf ähnliche Weise aus etwa 1 ng Templat-DNA pSW2scD1.3 amplifiziert (McCafferty et al., Nature 348, 552-554 (1990)), wobei die Primer LINK- BACK und LINKFOR eingesetzt wurden (Clackson et al., 1991, s. o.).
Nach Gelreinigung wurden jeweils 1 ug des VH- und des Vk-Produktes mit 300 ng Linker in einem 25 ul PCR-Gemisch ohne Primer vermischt und siebenmal zyklisiert (94 ºC, 2 min. 72ºC, 4 min), um die Fragmente zu verbinden, dann in 20 Zyklen amplifi ziert (94ºC, 1,5 min. 72ºC, 2,3 min), wobei jeweils 25 umol VH1BACK und VK4FOR- Primer eingesetzt wurden. Schließlich wurde das assemblierte Produkt gelgereinigt und mit den Primern VH1BACK-SfiI und VK4FOR-NotI reamplifiziert, um Restriktionsstellen anzuhängen. (Es ist anzumerken, daß VK4FOR und VK4FOR-NotI ein äquimolares Gemisch aus 4 verschiedenen Primern ist.) Das F58-scFv wurde dann mit SfiI und NotI gespalten und in den in ähnlicher Weise gespaltenen Vektor pUC119Sfi-Notpolymyc kloniert. Rekombinationen wurden daraufhin durch DNA-Sequenzierung verifiziert.

3. Konstruktion des Vektors pHENMBF58VL

10 ng gereinigte pUC119F5BscFv-DNA vom oben isolierten Klon wurde als Templat bei einer Standard-PCR-Amplifizierung mit den Primern HuVHLBACK-XhoI und VK4FOR- NotI eingesetzt. Das PCR-Produkt wurde gereinigt, mit XhoI und Not1 gespalten und in den ähnlich gespaltenen Vektor pHEN1 kloniert, um den neuen Vektor pHENMBF58VL zu erzeugen.

4. Amplifizierung und Klonieren des menschlichen Schwerketten-Repertoires

4.1. Erzeugung des cDNA-Templats

Das Verfahren war genau das gleiche wie in Beispiel 2(a)(i) beschrieben, wobei die von Marks et al., 1991, s. o., und in der WO 92/01047 beschriebenen IgM-Konstantbereich- Vorwärtsprimer eingesetzt wurden.

4.2. PCR von variablen Schwerkettendomänen

Die 6 getrennten Reaktionen zum Amplifizieren der variablen Schwerketten-Domänen enthielten jeweils 2 ul aus der cDNA-Synthese von oben, 20 umol der einzelnen HUVHBACKSfi-Primer und 20 umol des Primers F58GRAFTSAL im ansonsten herkömmlichen PCR-Gemisch. Da der Primer F58GRAFTSAL keine Annelierung an die Rahmen-3-Bereiche der 6 menschlichen VH-Familien aufwies, wurde die Annelierungstemperatur für die PCR-Zyklisierung auf 45ºC gesenkt. Die PCR wurde 25 Zyklen lang durchgeführt (94ºC, 1 min. 45ºC, 1 min. 72ºC, 1 min), woraufhin die Produkte gelgereinigt wurden. Um mehr Material für die nachfolgenden Klonierungsschritte zu erhal ten, wurde Sekundär-PCR unter Einsatz der gleichen Reihe von HuVHBACKSfi-Primern und des Primers HuJH4FORSalI durchgeführt; die Bedingungen waren wie oben, mit der Ausnahme, daß ein Annelierungsschritt bei 52ºC anstelle von 45ºC erfolgte.

5. Erzeugung der scFv-Sammlung

Jeweils gleiche Mengen der PCR-Produkte von oben wurden gepoolt und mit NcoI und SalI gespalten. 1 ug dieses Materials wurde in 3 ug NcoI/SalI-gespaltenen Vektor pHEN- MBF58VL ligiert. Das Ligationsgemisch wurde aufgearbeitet und zur Transformation von TG1-Zellen eingesetzt, wie von Hoogenboom et al., s. o., und in der WO 92/01047 beschrieben.

6. Selektion der scFv-Sammlung nach Antigen-Bindungsgruppen

Die Infektion der Sammlung in TG1 mit Helferphage VCSM13 und die Verarbeitung der Phagen für die nachfolgenden Selektionsrunden erfolgten wie beschrieben (Hoogenboom et al., 1991, s. o., und WO 92/01047). Für jede Selektion wurden 8 Näpfe einer Maxisorp-Platte (NUNC) mit einer 50 ul-Lösung 3 ug/ml Peptid in Wasser beimpft. Die Näpfe wurden über Nacht vollständig trocknen gelassen, mit 1% BSA in PBS 30 min lang bei Raumtemperatur blockiert und schließlich zweimal mit PBS gewaschen. In jeden Napf wurden 50 ul Phagen und 150 ul Tris-HCl, pH 8,3, 0,5 M NaCl, 4% BSA, gefüllt: Nach 2 h wurden die Näpfe dreimal mit Tris-HCl, pH 8,3, 0,1 M NaCl, und dreimal mit Tris-HCl, pH 8,3, 0,5 m NaCl, gewaschen. Elution der gebundenen Phagen und Infektions-TG1-Zellen erfolgte wie beschrieben (WO 92/01047). Kurz: Phagen wurden mit 50 ul 100 mM Triethylamin pro Napf 10 min lang eluiert. Das eluierte Material wurde dann sofort mit ¹/&sub2; Volumen 1 M Tris-HCl, pH 7,4, neutralisiert und zum Infizieren von TG1-Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase eingesetzt.
Das Peptid-Antigen entspricht der gp120-V3-Schleife des HIV-1-Isolats IIIB und wurde aus dem AIDS-directed Program der MRC (Depot-Bezugsnummer ADP737) erhalten.
Die Sequenz lautet:
YCTRPNNNTRRSIRIQRGPGRAFVTIGKIGNMRQAHCY (Seq.-ID. Nr. 121)

7. Analyse selektierter scFvs

Nach drei Selektionsrunden wurde ein Aliquot der eluierten Phagen verwendet, um HB2151-Zellen zu infizieren, um die Expression löslicher scFvs zu ermöglichen. Die Identifizierung einzelner bindender Klone mittels Peptid-ELISA wurde durchgeführt, wie zuvor in Beispiel 2 beschrieben, mit der Ausnahme, daß scFv-Fragmente und nicht Fab- Fragmente erzeugt wurden.
Etwa 15 St der analysierten Klone erwiesen sich in diesem Stadium als positiv, was ELISA-Signale von 50% bis 150% des Signals ergab, das mit dem ursprünglichen F58- scFv erhalten wurde, das als Vergleich auf derselben Platte laufen gelassen wurde (siehe Fig. 10). Keines der positiven scFvs reagierte mit Kunststoff, Hühner-Eiweiß-Lysozym oder menschlichem Thyroglobulin.
Nukleotidsequenzanalyse zeigte, daß die positiven Klone somatisch mutierte menschliche VH-Gene enthielten, die von Keimliniengenen der VH-Familien 1 und 6 abgeleitet waren (siehe Fig. 11).

8. Ersetzen der variablen F58-Leichtkettendomäne durch ein Repertoire variabler menschlicher Leichtkettendomänen

Etwa 10 ng der gepoolten Klone, von denen im Peptid-ELISA gezeigt wurde, daß sie aktiv sind, wurden als Templat in einer 50 ul-Standard-PCR-Amplifikation verwendet, um die selektierten variablen Schwerketten-Domänen zu erhalten. Als Primer wurden jeweils 20 umol LMB3 und HuJH4FORASSXhoI eingesetzt. Die menschlichen variablen Leichtkettendomänen wurden aus einer IgG-scFv-Sammlung (WO 92/01047, Beispiel 42) unter Verwendung von 50 ng DNA als Templat mit den Primern fdSEQ1 und HuVHLBACK mittels Standard-PCR-Amplifizierung amplifiziert. Die Produkte sowohl der Schwer- als auch der Leichtkettenamplifizierung wurden gelgereinigt und in einer PCR-Assemblierung (jeweils 1 ug) mit 7 Zyklen im wesentlichen wie oben beschrieben eingesetzt. Die Zyklisierungsbedingungen waren 94ºC für 1 min. 55ºC für 1 min und 72ºC für 2 min. Nach dem Abschluß der Assemblierungsreaktion wurden die Primer LMB3 und fdSEQ1 zugegeben (jeweils 20 umol) und die PCR wurde für weitere 20 Zyklen fortgesetzt. Die assemblierten Produkte wurden gelgereinigt und mit NcoI und NotI gespalten. Schließlich wurden 1 ug gespaltene scFvs in 3 ug des NcoI/NotI-gespaltenen Vektors pHEN1 ligiert. Das resultierende Sammlungs-scEv wurde selektiert, wie oben beschrieben (Schritt 6). Schließlich wurden einzelne Klone auf die Bindung an das V3- Schleifenpeptid gescreent, wie zuvor erwähnt (Schritt 7).
Die Endprodukte sind komplementäre menschliche scFv-Fragmente mit der gleichen oder einer sehr ähnlichen Spezifität wie der Mäuse-Ausgangs-Antikörper F58, d. h sie binden sich an gp120-V3-Schleife, nicht aber an heterologe Proteine.

Beispiel 4

Isolierung menschlicher, vom Immunrepertoire einer immunisierten Maus abgeleiteter Antikörper durch epitop-imprimierte Selektion

Dieses Beispiel beschreibt die Erzeugung menschlicher Antikörper, die für TNF-α spezifisch sind, aus Mäuse-Antikörpern, die von einer immunsierten Maus abgeleitet wurden, durch aufeinanderfolgende Ketten-Shuffling-Runden, was eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung veranschaulicht. Das Verfahren basiert auf der Tatsache, daß sich eine VH/VL-Zwischenkombination, wo eine Kette eine Mäusekette und die andere menschlich ist, an das antigene Epitop bindet, auf das die ursprünglichen Mäuse-VH/VL- Paarungen gerichtet sind.
In diesem Beispiel ist es vorzuziehen, die Häufigkeit von Antikörpern gegen das Antigen, hier TNF-α, in der Mäusesammlung zu erhöhen, indem die Mäuse-Sammlung bezüglich der Bindung an das Antigen einer Vorselektion unterzogen wird. Diese Mäuse- Antikörper-Population kann dann durch Ketten-Shuffling humanisiert werden. Die VH- Ketten der selektierten Mäuse-Population werden fixiert gehalten und mit einem Satz menschlicher VL-Ketten aus einer nativen menschlichen Sammlung assembliert. Diese Mäuse-VH/Human-VL-Sammlung wird dann Selektionsrunden nach Bindungsgruppen für das Antigen von Interesse unterzogen. Diese selektierte Population halb-humanisierter Antikörper wird dann vollständig humanisiert, indem diese menschlichen VLs mit menschlichen VHs gepaart werden, die von einer nativen menschlichen Sammlung abgeleitet wurden. Die resultierende Sammlung kann dann auf Bindungsgruppen selektiert werden, die für das Antigen spezifisch sind. Umgekehrt können im ersten Fall Mäuse- VL-Ketten fixiert, mit menschlichen VH-Ketten assembliert und nach der Selektion nach Bindung an Antigen vollständig humanisiert werden, indem die isolierten menschlichen VH-Ketten mit VL von der nativen menschlichen Sammlung gepaart werden.

1. Herstellung einer Einzelketten-Fv-Phagen-Freilegungssammlung von einer immunisierten Maus

RNA wird aus Lymphozyten extrahiert, die aus der Milz einer mit THF-α hyperimmunisierten Maus hergestellt sind. DNA-Sequenzen, die für variable Bereiche der Schwer- und Leichtketten kodieren, werden durch PCR amplifiziert und als Einzelketten-Fv-Fragmente assembliert, wie in der WO 92/01047 beschrieben. In das 3'- und 5'-Ende werden Stellen für die Restriktionsendonukleasen ApaL1 und Not1 eingebaut. Nach Spaltung mit ApaL1 und Not1 wird die assemblierte DNA in ApaL1/Not1-gespaltenes pCANTAB3-myc ligiert (Fig. 12) und in E.coli-TG1-Zellen elektroporiert und auf Ampicillin-Selektionsmedium plattiert (siehe Vorschrift (h), unten).

2. Selektion von Phagen, auf denen TNF-bindende Mäuse-scFv-Fragmente freiliegen

Phagemide werden durch Superinfektion mit M13K07-Helferphagen freigesetzt und unter Einsatz von 1/5 Volumen 20% Polyethylenglykol/2,5 M NaCl gefällt. Eine selektierte Population von TNF-α-bindenden Phagen-Antikörpern wird durch Panning der Phagenantikörper auf TNF-α-beschichtete Immunosorb-Röhrchen (1 ml, 10 ug/ml in PBS) und Eluieren mit 1 ml 100 mM Triethylamin für 5 min. gefolgt von Neutralisation mit 0,5 ml TRIS (1 M, pH 7,4), erzeugt.
Der eluierte Phage wird verwendet, um 10 ml TG1-Zellen in logarithmischer Wachstumsphase für 30 min bei 37ºC zu infizieren, und auf ampicillin-resistente Kolonien plattiert. Die resultierenden Kolonien werden in 2YT-Medium geschabt und mit M13K07 freigesetzt. Phagen-Antikörper werden wieder auf TNF-α-beschichteten Immunosorb-Röhchen selektiert, wie oben. E.coli TG1-Zellen werden mit dem eluierten Phagen infiziert und plattiert, und ampicillin-resistente Kolonien werden in 2YT-Medium geschabt, Glycerin bis 15% zugegeben und bei -70ºC gelagert. Die Häufigkeit der Klonbindung an TNF in der selektierten Population wird in diesem Stadium mittels ELISA überprüft, wie in Beispiel 1 beschrieben.

3. Präparation von DNA als Quelle von Fragmenten zum Ketten-Shuffling Menschliche Schwer- und Leichtketten-DNA

Eine Sammlung, die für seFv-Fragmente kodiert, die von den V-Genen nicht-immunisierter Menschen abgeleitet sind, ist im Vektor pHEN1 konstruiert worden (WO 92/01047, Beispiel 42).

DNA-Präparation

Miniprep-DNA wurde durch alkalische Lyse aus den Kolonien der zweiten Selektionsrunde (Mäuse-DNA) und aus der nativen menschlichen Sammlung (menschliche DNA) hergestellt.
Etwa 5 · 10&sup7; Zellen aus Glycerin-Stammlösungen werden über Nacht bei 30ºC in 10 ml 2YT-Medium gezüchtet, das 100 ug/ml Ampicillin, 2% Glucose, enthält. Die Zellen werden durch Zentrifugieren (2.500 U/min. 15 min) pelletiert und DNA aus dem Zell- Pellet durch alkalische Lyse unter Einsatz eines im Handel erhältlichen Sets (Promega) präpariert.

4. Präparation von DNA- die für scFv-Fragmente mit Shuffling unterzogenen Ketten kodiert

Es werden folgende Primer eingesetzt:
LMB3 5'CAG GAA ACA GCT ATG AC 3' SEQ ID NO: 122
FDTSEQ1 5'GTC GTC TTT CCA GAC GTT AGT 3' SEQ ID NO: 123
PCRHLINK 5'ACC GCC AGA GCC ACC TCC GCC 3' SEQ ID NO: 124
LINKPCRL 5'GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT 3 SEQ ID NO: 125
LMB3 und FDTSEQ1 annelieren 5' bzw. 3' an die Sequenzen, welche die Antikörper- Klonierungsstellen der pCANTAB-Serie von Vektoren flankieren. PCRHLINK und LINKPCRL annelieren mit der Sequenz, die für den (gly4ser3)-Peptidlinker kodiert. Unter Einsatz der Primer in Paaren LMB3/PCRHLINK und FDTSEQ1/LINKPCRL bei PCT-Amplifizierungen werden Schwer- und Leichtkettenfragmente erzeugt, die komplementäre 3'/5'-Enden und Restriktionserkennungsstellen an den 5/3'-Enden aufweisen.
Bei diesem Verfahren wird die von Marks et al., 1991, s. o., beschriebene menschliche Sammlung als Quelle von für variable Schwerketten- und Leichtketten-Domänen kodierender DNA eingesetzt. Für jedes Shuffling kommt die folgende Ketten-Shuffling-Vorschrift zur Anwendung. Sie wird einmal befolgt, beispielsweise zum Shuffling menschlicher variabler nativer Leichtkettendomänen mit den variablen Mäuse-Schwerkettendomänen und dann wieder bei den selektierten variablen menschlichen Leichtkettendomänen mit den variablen menschlichen nativen Schwerkettendomänen. Die durch dieses Verfahren erzeugte DNA, die für umgeordnete scFv-Fragmente kodiert, wird in pCANTQAB3-myc oder pCANTABS-myc insertiert (Fig. 13), je nachdem, ob beim Shuffling Mäuse-VH-Gene oder menschliche HV-Gene eingesetzt wurden. (a) Primär-PCR Herstellung primärer Schwer- und Leichtkettenprdoukte in den folgenden Reaktionen:
Der "Reaktionspuffer" ist 10X PCR-Reaktionspuffer: 0,1 M TRIS pH 8,3, 0,5M KCl, 15 mM MgCl&sub2;, 0,1% Gelatine.
PCR-Bedingngen sind 25 Zyklen von 94ºC für 1 min, 60ºC für 1 min, 72ºC für 2 min mit abschließenden 10 min bei 72ºC.

(b) Produktreinigung

Primäre PCR-Produkte werden auf Agarosegelen gereinigt und unter Einsatz von 5 ul "Glasmilch" (Geneclean Bio 101) mit zwei Elutionen in Wasser mit jeweils 10 ul gereinigt.

(c) Assemblierung mittels PCR

Die Assemblierung wird wie folgt durchgeführt:
gereinigte Schwerkette 2,5 ul
gereinigte Leichtkette 2,5 ul
10X Reaktionspuffer 2 ul
jeweils 5 mM dNTP's 1.0 ul
Taq-Polymerase 0,2 ul
Wasser 37 ul
PCR-Bedingungen sind 25 Zyklen von 94ºC für 1 min und 65ºC für 4 min. gefolgt von abschließenden 10 min bei 72ºC. Die für die primäre PCR angegebenen PCR-Bedingungen sind ebenfalls möglich, aber für die Verbindungsreaktion werden 65ºC bevorzugt.

(d) Sekundär-PCR

Für sekundäre PCRs wird 1 ul des verbundenen Materials aus (c) als Templat eingesetzt. Die Reaktion ist wie folgt durchzuführen:
verbundenes PCR-Produkt 1 ul
LMB3-Primer 10 pmol/ul) 2,5 ul
FDTSEQ1-Primer (10 pmol/ul) 2,5 ul
10X PCR Reaktionspuffer 5.0 ul
jeweils 5 mM dNTP's 2,5 ul
Taq-Polymerase (5 U/ul) 0,3 ul
Wasser 37 ul
Die PCR-Bedingungen sind 25 Zyklen mit 94ºC für 1 min, 60ºC für 1 min, 72ºC für 2 min bei abschließenden 10 min mit 72ºC.

(e) Spaltung des Sekundär-PCR-Produkts (Insert)

Extrahieren des Sekundär-PCR-Produkts mit Phenol : Chloroform und Ethanol-Fällung, um Taq-Polymerase zu entfernen. Lösen des PCR-Produkts in 270 ul Wasser, Zugabe von 30 ul 10X Reaktionspuffer. Zugabe von 50 Einheiten Not1 und Spaltung bei 37ºC für 3 h. Extraktion mit Phenol : Chloroform und Fällung mit Ethanol. Resuspendieren des Pellets in 270 ul Wasser und Zugabe von 30 ul 10X-Reaktionspuffer. Wenn die eingesetzte VH menschlich ist, Verwendung von SfiI (50 Einheiten) und Spaltung über Nacht bei 50ºC, während, wenn die VH von Mäusen stammt, Einsatz von ApaL1 (50 Einheiten) und Spaltung über Nacht bei 37ºC.
10X ApaL1-Puffer: 0,5M Kaliumacetat, 0,2M TRIS-Acetat, 100 mM Magnesiumacetat, 10 mM Dithiothreitol (pH 7,9, bei 25ºC).
10X Not1-Puffer: 1,5 M NaCl, 100 mM TRIS-HCl, 100 mM MgCl&sub2;, 0,1% Triton X-100 (pH 7,9, bei 25ºC).

(f) Reinigung des gespaltenen Produkts

Die Spaltlösung wird mit Phenol : Chloroform behandelt, mit Ethanol gefällt und in 20 ul Wasser gelöst. Das Produkt wird auf 1,5% Agarosegel laufen gelassen, die Bande mit etwa 750 bp wird aus dem Gel herausgeschnitten und unter Einsatz eines Geneclean-Sets gereinigt. Die DNA wird in ein Endvolumen von 10-15 ul Wasser eluiert und ist zum Klonieren bereit.

5. Präparation von Vektor-DNA und Klonierung

Präparation von Vektor-DNA

Plasmid-DNA wird nach dem alkalischen Lyseverfahren erzeugt und durch Cäsiumchlorid-Zentrifugation gereinigt. Die gereinigte DNA wird unter Einsatz einer DNA-Konzentration von 100 ug/ml mit SfiI (für pCANTABS-myc) oder ApaL1 (für pCANTAB3-myc) nach den Anweisungen der Hersteller gespalten (50ºC für Sfi1, über Nacht, falls zweckmäßig), gefolgt von einer 3-stündigen Spaltung mit NotI. Das Spaltprodukt wird direkt auf eine Chromaspin 1000-Säule geladen, um das Stuffer-Fragment zu entfernen, und 3 min lang mit 2.200 U/min in einer Bench-top-Zentrifuge zentrifugiert. Die DNA wurde dann zur weiteren Verwendung mit Phenol : Chloroform extrahiert und in 100 mg/ml gelöst.

Ligation und Transformation

Ligationen werden unter Einsatz eines Amersham Ligationssets wie folgt durchgeführt:
Vektor-DNA 1 ul (100 ng)
Insert-DNA 2 ul (10 bis 50 ng)
10 mM MgCl,
200 mM Tris pH 7,4 3 ul
Puffer A 24 ul
Puffer B 6 ul
Es wird 30 bis 60 min lang bei 16ºC inkubiert. Zur Herstellung der Sammlung wird das Fünffache der oben angegebenen Volumina eingesetzt. Das Ligationsprodukt wird aufkonzentriert und gereinigt, wobei Geneclean eingesetzt wird, und in ein Volumen von 10 bis 15 ul Wasser eluiert. Selbiges wird in elektrokompetente TG1-Zellen eingeführt, wobei typische Transformationseffizienzen folgende sind:
pUC 119 1,6 · 10&sup9; Transformanten/ug
ligierter Vektor mit Insert 1,0 · 10&sup7; Transformanten/ug
ligierter Vektor ohne Insert 2,0 · 20&sup6; Transformanten/ug

6. Selektion von Ketten-Shuffling-Klonen

Nach jedem Ketten-Shuffling-Verfahren werden Klone, die sich an TNF-α binden, nach dem oben unter 2 beschriebenen Verfahren selektiert, um Selektion aus der Mäuse-Antikörpersammlung und Bindung, wie durch ELISA bestimmt, durchzuführen.

7. Weiteres Shuffling

Nach der anfänglichen Umordnung z. B.. einer selektierten Population variabler Mäuse- Schwerketten-Domänen mit menschlichen nativen Leichtkettendomänen werden die selektierten Klone aus dieser ersten Umordnung als Quelle von Miniprep-DNA eingesetzt, um die Ketten-Umordnung und das Klonierungsverfahren zu wiederholen, wie unter 4 und 5 oben beschrieben, z. B. mit dem menschlichen variablen nativen Schwerketten- Domänen der in WO 92/01047, Beispiel 42, abgeleiteten Sammlung. An dieser zweiten Shuffling-Sammlung wird dann Selektion vorgenommen, um vollständig humansierte Antikörper zu isolieren, die sich an TNF-α binden, der durch dieses repertoire-imprimierte Selektionsverfahren abgeleitet wird.

Beispiel 5: Erzeugung einer synthetischen Sammlung

Durch Freilegen von Antikörper-Repertoires an der Oberfläche von filamentösen Phagen und Selektion der Phagen mit Antigen¹ können die Immunselektion imitiert2,3 und menschliche Antikörper aus den neugeordneten V-Genen nicht-immunisierter Spender erzeugt werden. Menschliche Antikörper sind nun durch die Synthese aus definierten V- Gen-Elementen hergestellt worden. Ein Repertoire aus 49 menschlichen Keimlinien-VH- Gensegmenten wurde in vitro umgeordnet, indem an ein synthetisches "D-Segment" fünf zufällige Aminosäurereste und ein J-Segment angefügt wurden, um einen synthetischen dritten Komplementaritätsbestimmungsbereich&sup5; (CDR) aus acht Resten zu erzeu- gen. Die umgeordneten VH-Gene wurden mit einer menschlichen Vλ3-leichtkette als Einzelketten-Fv-Fragmente zur Phagenfreilegung kloniert. Die Sammlung aus 10&sup7; Phagen wurde mit einem Hapten 2-Phenyloxazol-5-on-(phOx-)Konjugat an Rinderserumalbumin (BSA) konjugiert, und Phagen isoliert, die für Fragmente mit spezifischer Bindungsaktivität an phOx-BSA kodierten und Affinität zu phOx-γ-Aminobuttersäure (phOx- GABA) im mikromolekularen Bereich aufwiesen. Vergleich von 21 Klonen mit einzigartigen Sequenzen zeigte, daß "Immunreaktion" in vivo auf das Hapten weitgehend auf das VH-Segment (VH3-Familie)&sup6; mit einem invarianten aromatischen Rest (Tyr, Phe, Trp) an Rest 98 von CDR3 beschränkt war. Die Verwendung von in vitro umgeordneten V- Genen kann die Konstruktion von Antikörper-Sammlungen, die zur Bindung von Antigenen unbekannter Struktur fähig sind, und die Erzeugung therapeutischer menschlicher Antikörper mit reduzierter Immunogenität ermöglichen.
Variable Antikörperdomänen bestehen aus einem β-Faltblatt-Rahmen mit drei Schleifen hypervariabler Sequenz oder CDRs&sup5;. Die Schleifen erzeugen Antigen-Bindungsstellen mit einer Vielzahl von Formen im Bereich von ebenen Flächen&sup7; bis Taschen&sup8;. Bei menschlichen Schwerketten kodiert für die Sequenz-Vielfalt der ersten beiden CDRs ein Repertoire von etwa 50 Keimlinien-VH-Segmenten. (I. M. Tomlinson et al., s. o.). Der dritte CDR wird aus der Rekombination dieser Segmente mit etwa dreißig D- und sechs J-Segmenten erzeugt&sup9;, und obwohl diese Sequenz in hohem Maße variabel ist, umfaßt sie oft eine Salzbrücke von Asp101 der Schleife bis Arg94 des Rahmens¹&sup0;. Die Strukturen und Längen dieser ersten beiden CDRs sind beschränkt10,11, aber jene von CDR3 differieren stark, mit Längen im Bereich von 4 bis 25 Resten&sup7;.
Es wurde eine Sammlung aus umgeordneten VH-Genen mit einem CDR3 aus acht Resten einschließlich von Asp101 erzeugt, in Kombination mit einer einzelnen Vλ-Leichtkette (Lit. 12). 49 Keimlinien-VH-Segmente, die für einen Großteil des menschlichen VH- Repertoires kodieren (Tomlinson et al., s. o.), wurden jeweils unter Einsatz von PCR¹³ und Oligonukleotidprimern, die ein synthetisches D-Segment (aus 15 Basen mit statistischer Sequenz am 3'-Ende des VH-Segments) und ein J-Segment einführen, die gemeinsam für eine CDR3-Schleife aus acht Resten kodieren (Fig. 14), amplifiziert. Die umgeordneten Segmente wurden zur Phagen-Freilegung mit einer menschlichen Vλ3-Leichtkette gepoolt und kloniert, wodurch eine synthetische Sammlung aus 10&sup7; Phagenklonen erzeugt wurde. Wie das Immunsystem kann die synthetische Sammlung aus 10&sup7; Phagenklonen nur einen kleinen Teil der potentiellen Vielfalt ansprechen. Somit liegt die Diversität potentiell bei 49 · 32&sup5; = 1,6 · 10&sup9; verschiedenen Nukleotidsequenzen, oder 49 · 20&sup5; = 1,6 · 10&sup6; verschiedene Aminosäureresequenzen.
Die Sammlung wurde vier Runden Wachstum und Panning auf mit phOx-Rinderserumalbumin (BSA) beschichteten Röhrchen unterzogen, und Klone wurden als lösliche¹&sup4; Einzelketten-Fv-Fragmente15,16 zur Bindungsaktivität an phOx-BSA mittels ELISA&sup4; gescreent. Nach der dritten und der vierten Runde wurden 14/96 bzw. 61/96 Klone mit Bindungsaktivität an phOx-BSa identifiziert, und von diesen (29 getesteten) band sich keiner an andere Proteine (siehe Legende zu Tabelle 4). Weiters konnte ihre Bindung an phOx-BSA-beschichtete Platten mit dem löslichen Hapten in Wettbewerb treten (Tabelle 4).
Sequenzierung zeigte, daß viele (21/29) der phOx-Bindungsgruppen einzigartig waren, mit einem 8-Reste-CDR3, und es wurden entweder ein Segment aus der VH4-Familie oder ein bis drei Segmente aus der VH3-FDamilie eingesetzt (Tabelle 4). Gemeinsam werden bei diesen Segmenten drei der sieben "kanonischen" Faltungen eingesetzt, die für die ersten beiden hypervariablen Schleifen von menschlichen VH-Segmenten zugänglich sind. (C. Chothia et al., s. o.). Der Großteil der einzigartigen Klone (16/21) wurde vom VH26-Segment&sup6; abgeleitet und weist verwandte Sequenzen in der dritten hypervariablen Schleife auf: in dieser Gruppe weist der erste Rest zumeist eine verzweigte aliphatische Seitenkette auf (15/16), der zweite Rest ist zumeist Lysin oder Arginin (11/16), während der vierte Rest immer ein aromatischer Rest ist (am häufigsten Tyrosin).
Die Affinitäten (Kd) von zwei der stärkeren Bindungsgruppen (Ox 13 und Ox-31, Tabelle 4) für phOx-GABA wurde durch Fluoreszenz-Quenchtitration¹&sup7; als 3,1 ± 0,2 uM bzw. 6,7 ± 0,7 uM bestimmt. Obwohl der synthetischen Antikörpersammlung die vielfältigen VH-CDR3-Längen und die verschiedenen Leichtketten von in vivo erzeugten Antikörpern fehlen, sind die Affinitäten für phOx-GABA mit 0,5 pM für einen (Phagen-)Antikörper zu vergleichen, der aus nicht-immunisierten menschlichen Spendern&sup4; erhalten wurde, oder 1 pM für mehrere Hybridome aus einer Mäuse-Primär-Immunreaktion¹&sup8; (siehe jedoch Caveat, Tabelle 3, Legende). Um diese Affinitäten zu verbessern, könnten die vielen verschiedenen selektierten phOx-Antikörper (Tabelle 3) systhematisch abgeändert werden (siehe unten).
Im Prinzip bietet die Verwendung von Phagen-Freilegungssammlungen von V-Genen, die in vitro umgeordnet wurden, eine attraktive Alternative zu den in vivo umgeordneten. Zunächst sind die Rahmenbereiche und die ersten beiden hypervariablen Schleifen von sowohl Schwer- als auch Leichtketten der synthetischen menschlichen Antikörper, die aus der Sammlung erzeugt werden, im wesentlichen Keimlinien. Das steht im Kontrast zu "primären" Phagenantikörpern, die aus in vivo umgeordneten menschlichen V- Genen erhalten wurden, bei denen das Ausmaß der somatischen Mutation stark variierte&sup4;. Abgesehen von Polymorphien sind die VH-Gensegmente bei verschiedenen Individuen identisch, und die synthetischen Antikörper sind potentiell weniger immunogen. Durch Änderung der Längen und Sequenzen der Schwer- und Leichtketten-CDR3- Schleifen oder durch Lokalisierung der minimalen Mutationen in den anderen CDR- Schleifen oder durch Umordnung mit synthetischen "Keimlinien"-Leichtketten19,20 kann es möglich sein, ihre Affinitäten zu verbessern, während ihr Keimliniencharakter beibehalten wird.
Zweitens sind beide Arten von Sammlungen in hohem Maße einseitig. Bei den "natürlichen" Sammlungen liegt die Einseitigkeit außerhalb unserer Kontrolle und ergibt sich beispielsweise durch Allel-Variation, Deletionspolymorphien und Deletion der selbstreaktiven Klone. In der synthetischen Sammlung kann die Einseitigkeit systematisch herbeigeführt werden. Hier wurden beispielsweise alle VH-Gensegmente und dadurch die Faltung der ersten und zweiten hypervariablen Schleifen gewählt: ebenfalls fixiert wurden die Länge und die Vielfalt des VH-CDR3 und der Leichtkette. Obwohl mehrere Wege vorgeschlagen wurden, vielfältige synthetische Sammlungen herzustellen², sollte es auch möglich sein, in die kodierten Strukturen Konstruktionsprinzipien einzubauen. Wenn die Form des Antigens bekannt wäre, könnte eine Hülle aus ungefähr komplementären Bindungsstellen konstruiert und mit definierten V-Gen-Elementen zusammengesetzt werden. Die Verwendung solcher "Konstruktions-"Sammlungen würde die Isolierung von Antikörpern mit höheren Affinitäten begünstigen. Tabelle 3
* Der Einfachheit halber sind die VH-Segmente gemäß der DP-Nomenklatur von Tomlinson et al., s. o., angeführt.

Tabelle 3 - Zusammensetzung der synthetischen Sammlung

49 menschliche VH-Segmente (Tomlinson et al., s. o.) wurden eingesetzt, eines für jene der VH2-, VH5- und VH6-Genfamilie und mehrere Segmente für die anderen drei Familien, und der Familie entsprechend kloniert. Klone der VH-Segmente jeder Familie (siehe Legende Fig. 1) wurden auf das Vorhandensein von Insert überprüft (durchschnittlich 85 %) und in eine einzige große Sammlung gepoolt, wie in Tabelle 4 gezeigt, wobei eine (kontrollierte) Einseitigkeit für bestimmte Genfamilien erzeugt wurde. Die Segmente aus der VH2-, VH5- und VH6-Familie werden dadurch in bezug auf die Segmente aus anderen Familien "überrepräsentiert". Sequenzierung von 35 Klonen aus der unselektierten Sammlung bestätigte, daß VH-Segmente von jeder Familie vorhanden waren und daß die Nukleotide in den erwarteten Anteilen im D-Segment vorhanden waren, aber mit einer leichten Einseitigkeit für C. (An der ersten und zweiten Position eines jeden Codons: A, 21,3%; G, 17,9%; C, 33,7% und T, 27,1%; an der dritten Position G, 42,6% und T, 57,4%). Die Expressionsmengen der Antikörperfragmente wurden ebenfalls überprüft, und HV-Segmente wurden in Klonen mit detektierbaren Expressionsmengen identifiziert, beispielsweise VH1 (DP-7), VH2 (DP-27), VH3 (DP-29,35,38,44,47,51,53), VH4 (DP- 63,69), VH5 (DP-73) und VH6 (DP-74).

Verfahren

Die Klone wurden durch "PCR-Screening"²¹ mit den Oligonukleotiden LMB3 und pHEN-SEQ (Lit. 4) auf das Vorhandensein von Insert überprüft und nach dem Didesoxy- Kettenterminationsverfahren²² mit Oligonukleotid LINKSEQ (5-CGA TCC GCC ACC GCC AGA G-3') aus doppelstrangiger DNA sequenziert. (Die Zahlen in den Tabellen sind bezüglich Insert korrigiert). Die Expression löslicher scFv-Fragmente wurde durch Spotting von 10 ul Überstand aus induzierten Über-Nacht-Kulturen in E.coli HB2151 (Lit. 14) auf ein Nitrocellulosefilter unter Einsatz einer Slot-blot-Vorrichtung (Minifold II, Schleicher und Schuell) und Detektieren der gebundenen peptid-markierten scFv-Fragmente mit 9E10-Antikörper²³ und peroxidase-markierten Anti-Mäuse-Antikörpern (Sigma) überprüft. Tabelle 4
* Tomlinson et al., s. o., Chothia et al., s. o.
φ in uM, gemäß Kompetitions-ELISA mit phOx-GABA.
§ Zeigt V67A-Mutation in FR3.
nicht bestimmt.

Tabelle 4 - aus der synthetischen Sammlung isolierte phOx-Bindungsgruppen

Phagen wurden aus der Sammlung durch Freisetzung mit VCS-M13 erhalten und Panning-Runden in phOx-BSA-beschichteten Röhrchen wie in Lit. 4 unterzogen. Die Se quenzen von 21 sich an phOx bindenden Phagen zeigten vier Keimlinien-VH-Segmente, DP-42,45,47 (VH3-Familie) und DP-67 (VH4-Familie). DP-47 ist identisch mit VH26 (Lit. 6, korrigiert in Lit. 24), während sich DP-42, DP-45 und DP-47 nur in einem oder wenigen Rahmenresten von 8-1B (Lit. 25), 65-2 (Lit. 26) bzw. VH4.22 (Lit. 27) unterschieden. Klone aus der unselektierten Sammlung, bei denen das DP47-VH-Segment eingesetzt wurde und denen das charakteristische Muster von CDR3 fehlte, banden sich nicht an phOx. Von den getesteten 21 phOx-Bindern band sich keiner an BSA, NIP- BSA. Kunststoff, Chymotrypsinogen A, Cytochrom C, Rinder-Thyroglobulin, Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocynanin oder Truthahn-Eiweiß-Lysozym. Vier Klone, die sich an BSA (aber nicht an phOx) banden, erwiesen sich als Verunreinigungen (αBSA3-Klone, aus Lit. 4).

Verfahren

Wie in Lit. 4. Die relativen Affinitäten der scFv-Fragmente wurden durch Inhibitions- ELISA bestimmt²&sup8;. Eine Reihenverdünnung von 4-γ-Aminobuttersäuremethylen-2-phenyloxazol-5-on (phOx-GABA) mit Konzentrationen im Bereich von 6 bis 400 uM wurde in 4% Marvel-PBS durchgeführt und der scFv-Überstand zugegeben. Die Konzentration an phOx-GABA, die zu einer 50%-igen Reduktion des, Signals (150) für die Bindung an phOx-BSA resultierte, wurde ermittelt. Die Affinitäten der Klone Ox-13 und Ox-31 für phOx-GABA wurden durch Fluoreszenz-Quenchtitration unter Einsatz von scFv, gereinigt durch c-myc-Markierung, bestimmt (Lit. 4). Idealerweise wird die Affinität für das phOx-BSA-Konjugat oder jene für phOx-Capronsäure direkt gemessen, hier wurde jedoch phOx-GABA eingesetzt, um den Vergleich mit den Hybridomdaten aus Lit. 18 zu ermöglichen. Es ist wahrscheinlich, daß die Affinitäten der Antikörper für das phOx- Konjugat oder für phOx-Capronsäure besser sind als die für phOx-GABA gemessenen.

Fig. 14- Assemblierung umgeordneter VH-Gene (siehe Text)

Verfahren

Ein synthetisches Oligonukleotid SYNLIB1 5' GCC TCC ACC TCT CGA GAC GGT GAC CAG GGT ACC TTG GCC CCA ATA GTC AAA ([A/C]NN)&sub5; TCT TGC ACA GTA ATA CAC GGC CGT GTC 3' (Seq.-ID. Nr.: 109, siehe Tabelle 1) führte ein D-Segment mit einer statistischen Fünf-Reste-Aminosäuresequenz, ein J-Segment und eine XhoI-Restriktionsstelle in das 3'-Ende jedes von 49 menschlichen VH-Keimliniensegmenten ein (Tomlinson et al., s. o.). Der Primer wurde in der Polymerasekettenreaktion¹³ mit einem Rückwärtsprimer auf VH-Familien-Basis (VHBACK) eingesetzt, der eine NcoI-Stelle&sup4; miteinbezog. Jeder VH-Segmentklon (als einsträngiges Templat in M13-Vektor bereitgestellt) wurde getrennt bei 94ºC 1 min lang, 50ºC 1 min lang und 72ºC 1,5 min lang über 25 Zyklen auf einem PHC-3-Thermocycler (Techne) amplifiziert. Jede Amplifizierung wurde durch Elektrophorese auf Agarosegel überprüft, und ähnliche Mengen an DNA von VH-Segmenten der gleichen Familie wurden gepoolt, mit NcoI und XhoI gespalten und in den Vektor pHEN1 (Lit. 14) kloniert, der eine umgeordnete variable Vλ3-Leichtkettendomäne (IGLV3S1; Lit. 12) trägt, die von einem an BSA bindenden scFv-Fragment stammt.
Wenn anstelle eines statistischen Oligonukleotids ein Oligonukleotid eingesetzt wird, das für einen CDR kodiert, beispielsweise von einem Nagetier, würde dieses den nicht- menschlichen CDR auf dem synthetischen menschlichen Sammlungsprodukt imprimieren.

In Beispiel 5 genannte Literaturverweise

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Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Antikörper-Polypeptid-Dimeren oder scFv-Fragmenten, die für ein Antigen von Interesse spezifisch sind, folgende Schritte umfassend:

(i) das Bereitstellen von Nukleinsäure-Expressionsvektoren, die unter Verwendung einer Komponente eines replizierbaren Gen-Freilegungspakets ("replicable genetic display package", RGDP) zu Paketen zusammengefaßt werden können,

(ii) das Kombinieren (a) eines genetisch vielfältigen Repertoires von Nukleinsäuresequenzen, die jeweils für eine erste Teilkomponente einer Antigen-Bindungsstelle eines menschlichen Antikörpers kodieren mit (b) Nukleinsäure, die für eine einzigartige oder genetisch vielfältige Population einer zweiten Teilkomponente einer Antigen-Bindungsstelle eines nicht-menschlichen Antikörpers kodiert, der bekanntermaßen das Antigen von Interesse bindet, um eine Sammlung von Nukleinsäuresequenzen auf den Expressionsvektoren zu bilden, die für Antikörper-Polypeptid-Dimere von scFv-Fragmenten kodieren, wobei die Dimere oder scFv-Fragmente jeweils aus einer ersten Polypeptidketten-Komponente und einer zweiten Polypeptidketten-Komponente bestehen, wobei eine erste Antigen-Bindungsstellen-Teilkomponente und eine zweite Antigen-Bindungsstellen-Teilkomponente in Kombination eine Antigen-Bindungsstelle eines Antikörper- Polypeptid-Dimers oder scFv-Fragments bilden;

(iii) das von den Vektoren ausgehende Exprimieren der Sammlung in rekombinanten Wirtsorganismuszellen, wobei jede der ersten Polypeptidketten-Komponenten als Fusion mit einer Komponente eines RGDPs exprimiert wird, wodurch die erste Polypeptidketten-Komponente an der Oberfläche der RGDPs freigelegt wird;

(iv) das Selektieren einer einzigartigen oder eingeschränkten Population der Antikörper-Polypeptid-Dimere oder scFv-Fragmente, die Bindungsspezifität für das Antigen von Interesse aufweisen, aus der exprimierten Sammlung durch Bindung an Antigen, wobei jedes selektierte Antikörper-Polypeptid-Dimer oder scFv-Fragment in seinem jeweiligen RGDP mit Nukleinsäure verbunden ist, die für eine erste Teilkomponente seiner Antigen-Bindungsstelle kodiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Antikörper-Polypeptid-Dimere oder scFv- Fragmente nach der Selektion in Schritt (iv) als lösliche Polypeptide exprimiert werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die für jede der zweiten Teilkomponenten eines nicht-menschlichen Antikörpers kodierende Sequenz vor dem Kombinieren in Schritt (ii) genetisch verändert wird, um ihre Homologie zu einer zweiten Teilkomponente eines menschlichen Antikörpers zu erhöhen.

4. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, das einen zusätzlichen Schritt (v) umfaßt, worin in Schritt (iv) selektierte Antikörper-Polypeptid-Dimere oder scFv-Fragmente genetisch verändert werden, um nicht-menschliche Merkmale zu entfernen oder zu verringern.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin Schritt (v) folgendes umfaßt:

(a) das Kombinieren einer einzigartigen oder eingeschränkten Population von Nukleinsäure, die für die in Schritt (iv) selektierten ersten Antigen-Bindungsstellen-Teilkomponenten kodiert, mit einem genetisch vielfältigen Repertoire von Nukleinsäuresequenzen, die jeweils für eine zweite Teilkomponente einer Antigen-Bindungsstelle eines menschlichen Antikörpers kodieren, um eine zweite Sammlung von Nukleinsäuresequenzen zu bilden, die für Antikörper-Polypeptid-Dimere oder scFv-Fragmente kodieren, wobei jedes Antikörper-Polypeptid-Dimer oder scFv-Fragment eine zweite Antikörper-Polypeptidketten-Komponente umfaßt, die aus Nukleinsäure exprimiert wird, die unter Verwendung einer Komponente eines RGDPs zu einem Paket zusammengefaßt werden kann, wobei die zweite Ketten-Komponente als Fusion mit einer Komponente eines RGDPs exprimiert wird, wodurch sie an der RGDP-Oberfläche freiliegt, so daß Antikörper-Polypeptid-Dimere oder scFv-Fragmente, die für das Antigen von Interesse spezifisch sind, aus der zweiten Sammlung durch Bindung an das Antigen von Interesse selektierbar sind, wobei jedes Antikörper-Polypeptid-Dimer oder scFv-Fragment in seinem RGDP mit Nukleinsäure verbunden ist, die für seine zweite Polypeptid-Komponente kodiert.

6. Verfahren nach Anspruch 4, worin Schritt (v) folgendes umfaßt:

a) das Bereitstellen von Nukleinsäure-Expressionsvektoren, die unter Verwendung einer Komponente eines replizierbaren Gen-Freilegungspakets (RGDP) zu Paketen zusammengefaßt werden können;

b) das Kombinieren von Nukleinsäure, die für eine einzigartige oder genetisch vielfältige Population einer ersten Teilkomponente einer Antigen-Bindungsstelle eines nicht-menschlichen Antikörpers kodiert, der bekanntermaßen das Antigen von Interesse bindet, mit einem genetisch vielfältigen Repertoire von Nukleinsäuresequenzen, die jeweils für eine zweite Teilkomponente einer Antigen-Bindungsstelle eines menschlichen Antikörpers kodieren, um eine zweite Sammlung von Nukleinsäuresequenzen auf den Expressionsvektoren zu bilden, die für Antikörper-Polypeptid-Dimere oder scFv-Fragmente kodieren, wobei die Dimere oder scFv-Fragmente jeweils aus einer ersten Polypeptidketten-Komponente und einer zweiten Polypeptidketten-Komponente bestehen, wobei eine erste Antigen-Bindungsstellen-Teilkomponente und eine zweite Antigen- Bindungsstellen-Teilkomponente in Kombination eine Antigen-Bindungsstelle eines Antikörper-Polypeptid-Dimers oder scFv-Fragments bilden;

c) das von den Vektoren ausgehende Exprimieren der zweiten Sammlung in rekombinanten Wirtsorganismuszellen, wobei jede der zweiten Polypeptidketten-Komponenten als Fusion mit einer Komponente eines RGDPs exprimiert wird, wodurch die zweite Polypeptidketten-Komponente an der Oberfläche der RGDPs freigelegt wird;

d) das Selektieren einer einzigartigen oder eingeschränkten Population der Antikörper-Polypeptid-Dimere oder scFv-Fragmente, die Bindungsspezifität für das Antigen von Interesse aufweisen, aus der zweiten exprimierten Sammlung durch Bindung an Antigen, wobei jedes selektierte Antikörper-Polypeptid-Dimer oder scFv-Fragment in seinem jeweiligen RGDP mit Nukleinsäure verbunden ist, die für eine zweite Teilkomponente seiner Antigen-Bindungsstelle kodiert;

e) das Kombinieren einer einzigartigen oder eingeschränkten Population von Nukleinsäure, die für die in Schritt (iv) selektierten ersten Antigen-Bindungsstellen-Teilkomponenten kodiert, mit der einzigartigen oder eingeschränkten Population von Nuk leinsäure, die für die in Schritt (d) selektierten zweiten Antigen-Bindungsstellen-Teilkomponenten kodiert, um eine dritte Sammlung von Nukleinsäuresequenzen zu bilden, die für Antikörper-Polypeptid-Dimere oder scFv-Fragmente kodieren, aus denen eine einzigartige oder eingeschränkte Population menschlicher Polypeptid-Dimere oder scFv- Fragmente selektierbar ist, die für das Antigen spezifisch sind.

7. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die zweite Teilkomponente einer Antigen-Bindungsstelle eines nicht-menschlichen Antikörpers ein Antikörperbereich ist, der Kontakt mit Antigen herstellt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin der Bereich ein Komplementarität bestimmender Bereich (CDR) ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin die zweite Teilkomponente einer Antigen-Bindungsstelle eines nicht-menschlichen Antikörpers eine zweite Polypeptidketten-Komponente eines Antikörpers ist.

10. Verfahren zur Herstellung von menschlichen Antikörper-Polypeptid-Dimeren oder scFv-Fragmenten, die für ein Antigen von Interesse spezifisch sind, umfassend:

(i) das Kombinieren einer vielfältigen Population (Population A) von Polypeptiden, die jeweils eine variable Domäne einer ersten Polypeptidkette eines menschlichen Antikörpers umfassen, mit einer einzigartigen oder eingeschränkten Population (Population B) von Polypeptiden, die jeweils eine variable Domäne einer zweiten Polypeptidkette eines nicht-menschlichen Antikörpers umfassen, der für das Antigen spezifisch ist, wodurch eine Sammlung von Antikörper-Polypeptid-Dimeren oder scFv-Fragmenten gebildet wird, die jeweils aus einem Polypeptid, das eine variable Domäne einer ersten Polypeptidkette eines menschlichen Antikörpers umfaßt, und einem Polypeptid, das eine variable Domäne einer zweiten Polypeptidkette eines nicht-menschlichen Antikörpers umfaßt, bestehen;

(ii) das Selektieren einer einzigartigen oder eingeschränkten Population (Population C) der Antikörper-Polypeptid-Dimere oder scFv-Fragmente, die Bindungsspezifität für das Antigen aufweisen, aus der Sammlung;

(iii) das Kombinieren einer einzigartigen oder eingeschränkten Population (Population D) von Polypeptiden, die von den in Schritt (ii) selektierten Polypeptid-Dimeren oder scFv-Fragmenten herrühren, die jeweils eine menschliche erste Polypeptidkette umfassen, mit einer vielfältigen Population (Population E) von Polypeptiden, die jeweils eine variable Domäne einer zweiten Polypeptidkette eines menschlichen Antikörpers umfassen, wodurch eine Sammlung von menschlichen Antikörper-Polypeptid-Dimeren oder scFv-Fragmenten gebildet wird, aus denen eine einzigartige oder eingeschränkte Population (Population F) von menschlichen Antikörper-Polypeptid-Dimeren oder scFv- Fragmente selektierbar ist, die für das Antigen spezifisch sind.

11. Verfahren nach Anspruch 10, worin:

(a) die Polypeptide von Population A jeweils ausgehend von einem Vektor (X) in rekombinanten Wirtsorganismuszellen als Fusion mit einer Komponente eines replizierbaren Gen-Freilegungspakets (RGDPs) exprimiert weden, wodurch das Polypeptid an der Oberfläche der RGDPs in einer ersten RGDP-Population freigelegt wird;

(b) Nukleinsäure von Vektor (X) unter Verwendung der RGDP-Komponente zu einem Paket zusammengefaßt werden kann, wodurch das genetische Material jedes RGDPs für ein solches Polypeptid von Population A kodiert, so daß die Antikörper-Polypeptid-Dimere oder scFv-Fragmente von Population C in ihren jeweiligen RGDPs jeweils mit Nukleinsäure verbunden werden, die für ein Polypeptid kodiert, das eine variable Domäne einer ersten Polypeptidkette eines menschlichen Antikörpers umfaßt;

(c) die Polypeptide von Population E jeweils ausgehend von einem Vektor (Y) in rekombinanten Wirtsorganismuszellen als Fusion mit einer Komponente eines RGDPs exprimiert werden, wodurch sie an der Oberfläche von RGDPs in einer zweiten RGDP- Population freigelegt werden;

(d) Nukleinsäure des Vektors (Y) unter Verwendung der RGDP-Komponente zu einem Paket zusammengefaßt werden kann, wodurch das genetische Material jedes RGDPs in der zweiten RGDP-Population für ein solches Polypeptid von Population E kodiert.

12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, worin die Population A nicht ausgehend von demselben Vektor exprimiert wird wie Population B; und Population D nicht ausgehend von demselben Vektor exprimiert wird wie Population E.

13. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, worin Population A ausgehend von demselben Vektor exprimiert wird wie Population B; und Population D ausgehend von demselben Vektor exprimiert wird wie Population E.

14. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, worin Polypeptide der Population B heterozygot sind und jeweils eine konstante Domäne eines menschlichen Antikörpers umfassen.

15. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, worin die Polypeptide von Population E jeweils einen Bereich eines für das Antigen spezifischen nicht-menschlichen Antikörpers umfassen, wobei der Bereich einer ist, der Kontakt mit dem Antigen herstellt.

16. Verfahren nach Anspruch 15, worin der Bereich ein Komplementarität bestimmender Bereich (CDR) ist.

17. Verfahren nach Anspruch 16, worin der CDR CDR3 ist.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 17, worin die erste Polypeptidkette eine Antikörper-Leichtkette und die zweite Polypeptidkette eine Antikörper-Schwerkette ist.

19. Verfahren zur Herstellung von menschlichen Antikörper-Polypeptid-Dimeren oder scFv-Fragmenten, die für ein Antigen von Interesse spezifisch sind, umfassend:

i) das Kombinieren einer vielfältigen Population (Population A) von Polypeptiden, die jeweils eine variable Domäne einer ersten Polypeptidkette eines menschlichen Antikörpers umfassen, mit einer einzigartigen oder eingeschränkten Population (Population B) von Polypeptiden, die jeweils eine variable Domäne einer zweiten Polypeptidkette eines nicht-menschlichen Antikörpers umfassen, der für das Antigen spezifisch ist, wodurch eine Sammlung von Antikörper-Polypeptiden-Dimeren oder ScFv-Fragmenten gebildet wird, die jeweils aus einem Polypeptid, das eine variable Domäne einer ersten Polypeptidkette eines menschlichen Antikörpers umfaßt, und einem Polypeptid, das eine variable Domäne einer zweiten Polypeptidkette eines nicht-menschlichen Antikörpers umfaßt, bestehen;

(iii) das Kombinieren einer einzigartigen oder eingeschränkten Population (Population H) von Polypeptiden, die jeweils eine variable Domäne einer ersten Polypeptidkette eines nicht-menschlichen Antikörpers umfassen, der für das Antigen spezifisch ist, mit einer vielfältigen Population (Population I) von Polypeptiden, die jeweils eine variable Domäne einer zweiten Polypeptidkette eines menschlichen Antikörpers umfassen, wodurch eine zweite Sammlung von Antikörper-Polypeptid-Dimeren oder scFv- Fragmenten gebildet wird, die jeweils aus einem Polypeptid, das eine variable Domäne einer ersten Polypeptidkette eines nicht-menschlichen Antikörpers umfaßt, und einem Polypeptid, das eine variable Domäne einer zweiten Polypeptidkette eines menschlichen Antikörpers umfaßt, bestehen;

iv) das Selektieren einer einzigartigen oder eingeschränkten Population (Population J) der Antikörper-Polypeptid-Dimere oder scFv-Fragmente, die Bindungsspezifität für das Antigen aufweisen;

v) das Kombinieren einer einzigartigen oder eingeschränkten Population (Population K) von Polypeptiden, die von in Schritt (ii) selektierten Polypeptid-Dimeren oder scFv-Fragmenten herrühren, die jeweils eine menschliche erste Polypeptidkette umfassen, mit einer einzigartigen oder eingeschränkten Population (Population L) von Poly peptiden, die von in Schritt (iv) selektierten Polypeptid-Dimeren oder scFv-Fragmenten herrühren, die jeweils eine menschliche zweite Polypeptidkette umfassen, wodurch eine Sammlung von menschlichen Antikörper-Polypeptidketten-Dimeren oder scFv-Fragmenten gebildet wird, aus denen eine einzigartige oder eingeschränkte Population (Population F) von menschlichen Polypeptid-Dimeren oder scFv-Fragmenten selektierbar ist, die für das Antigen spezifisch sind.

20. Verfahren nach Anspruch 19, worin:

(a) die Polypeptide von Population A jeweils ausgehend von einem Vektor (X) in rekombinanten Wirtsorganismuszellen als Fusion mit einer Komponente eines replizierbaren Gen-Freilegungspakets (RGDP) exprimiert werden, wodurch das Polypeptid an der Oberfläche der RGDPs in einer ersten RGDP-Population freigelegt wird;

(c) die Polypeptide von Population I jeweils ausgehend von einem Vektor (Z) in rekombinanten Wirtsorganismuszellen als Fusion mit einer Komponente eines RGDPs exprimiert werden, wodurch sie an der Oberfläche von RGDPs in einer zweiten RGDP- Population freigelegt werden;

(d) Nukleinsäure des Vektors (Z) unter Verwendung der RGDP-Komponente zu einem Paket zusammengefaßt werden kann, wodurch das genetische Material jedes RGDPs in der zweiten RGDP-Population für ein solches Polypeptid von Population I kodiert.

21. Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, worin die Population A nicht ausgehend von demselben Vektor exprimiert wird wie Population B; und Population H nicht ausgehend von demselben Vektor exprimiert wird wie Population I.

22. Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, worin Population A ausgehend von demselben Vektor exprimiert wird wie Population B; und Population H ausgehend von demselben Vektor exprimiert wird wie Population I.

23. Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, worin Polypeptide jeder der Populationen B und H heterozygot sind, und jeweils eine konstante Domäne eines menschlichen Antikörpers umfassen.

24. Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, worin die Polypeptide von Population I jeweils einen Bereich eines nicht-menschlichen Antikörpers umfassen, der für das Antigen spezifisch ist, wobei der Bereich einer ist, der Kontakt mit dem Antigen herstellt.

25. Verfahren nach Anspruch 24, worin der Bereich ein Komplementarität bestimmender Bereich (CDR) ist.

26. Verfahren nach Anspruch 25, worin der CDR CDR3 ist.

27. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 26, worin die erste Polypeptidkette eine Antikörper-Leichtkette ist und die zweite Polypeptidkette eine Antikörper-Schwerkette ist.

28. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 27, umfassend einen zusätzlichen Schritt des Selektierens der Population F von menschlichen Antikörper-Polypeptid-Dimeren oder scFv-Fragmenten, die für das Antigen spezifisch sind.

29. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 28, worin jede der Populationen C und F durch Bindung an das Antigen selektiert wird.

30. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 29, worin Population I durch Bindung an das Antigen selektiert wird.

31. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin jedes Antikörper- Polypeptid-Dimer jeder Sammlung von Antikörper-Polypeptid-Dimeren als Fv- oder Fab- Fragment exprimiert wird.

32. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin Nukleinsäure, die für ein selektiertes Antikörper-Polypeptid-Dimer oder scFv-Fragment kodiert, oder eine Teilkomponente eines zugehörigen RGDPs dazu verwendet wird, das Antikörper-Polypeptid-Dimer oder scFv-Fragment, für das kodiert wird, oder eine solche Teilkomponente zu exprimieren, oder durch Addition, Deletion, Substitution oder Insertion von Aminosäuren oder Bindung an ein anderes Molekül modifiziert und dazu verwendet wird, ein Derivat des Antikörper-Polypeptid-Dimers oder scFv-Fragments, für das kodiert wird, oder eine solche Teilkomponente zu exprimieren.

33. Verfahren nach Anspruch 32, worin das exprimierte Antikörper-Polypeptid-Dimer oder scFv-Fragment oder Derivat davon zur Herstellung eines Medikaments verwendet wird.

34. Verfahren nach Anspruch 28, worin ein menschliches Antikörper-Polypeptid-Dimer oder scFv-Fragment, das für das aus der Population F selektierte Antigen spezifisch ist, zur Herstellung eines Medikaments verwendet wird.