TWI673063B - 抗蛋白ｃ抗體之出血性疾病的治療 - Google Patents

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Abstract

本發明人等發現藉由投予蛋白C的活性化阻礙物質而獲得優異之抗血液凝固阻礙作用，因而完成本發明。

Description

抗蛋白C抗體之出血性疾病的治療
本發明係有關含有阻礙蛋白C之活性化的物質之用以治療出血性疾病之組成物。詳言之，係有關含有阻礙蛋白C之活性化之抗蛋白C抗體作為有效成分之組成物。
血友病A係起因於血液凝固第VIII因子(FVIII)或血液凝固第IX因子(FIX)之先天缺損或功能不全之出血性疾病。前者稱為血友病A，後者稱為血友病B。兩者均係基因存在於X染色體上，由於基因異常係因伴性隱性遺傳(sex-linked recessive inheritance)而繁衍，因此發病患者之99%以上為男性。罹病率大約每出生1萬人有1人罹病，已知血友病A與血友病B之比率大約為5：1。
作為主要之出血部位，舉例為關節內、肌肉內、皮下、口腔內、頭蓋內、消化道、鼻腔內等。其中於關節內之反覆出血伴隨關節障礙、步行困難而進展至血友病性關節症，最終有時亦有必要進行關節置換手術，因此 成為使血友病患者之QOL降低之最大要因。
血友病之重症度係由血液中之FVIII活性或 FIX活性所規定，活性未達1%之患者分類為重症、1%以上且未達5%之患者分類為中症，5%以上且未達40%之患者分類為輕症。血友病患者之佔約60%之重症患者中，呈現每月數次之出血症狀，其與中症患者及輕症患者相比現住為高頻度。因此，認為重症血友病患者中，若將血液中之FVIII活性或FIX活性維持為1%以上，可有效阻止出血症狀之展現(非專利文獻1)。
至於相關之出血異常症，除了血友病、後天 性血友病以外，已知有起因於vWF之功能異常或缺損之溫偉伯氏疾病(Von Willebrand disease)。溫偉伯氏因子(vWF)不僅係使血小板正常黏著於血管壁之損傷部位之內皮下組織所必要，亦是與FVIII形成複合體、使血漿中FVIII程度保持正常所必要。溫偉伯氏病患中，該等功能降低，而導致止血功能異常。
血友病患者之出血預防及/或治療主要係使用自血漿純化或利用基因重組技術所製作之血液凝固因子。
血液凝固因子之持續性不足(半衰期為數小時至數十小時)，例如FVIII製劑及FIX製劑之血中半衰期分別為12小時及24小時左右。因此，為了持續性預防，FVIII製劑有必要每週投予3次左右或FIX製劑有必要每週投予2次左右。此相當於維持FVIII活性或FIX活性之大約1%以上。已有報導藉由該預防投予，可預先防 範因多次關節內出血引起之血友病性關節障礙，結果大有助於血友病A患者之QOL提高。
且，關於出血時之補充療法，除了出血為輕 度之情況以外，為了防止再出血、進行完全止血，亦有必要於一定期間定期追加投予FVIII製劑或FIX製劑。
再者，血液凝固因子具有必須以靜脈內投予 之缺點。FVIII製劑及FIX製劑進行靜脈內投予技術上存在困難。尤其對於年輕患者投予時，因用於投予之靜脈較細，故更加困難。
前述之預防投予或出血時之緊急投予中，大多情況係使用家庭療法/自己注射。於須數次投予之必要性時，投予時之技術困難在投予時不僅為患者帶來痛苦，而且成為阻礙家庭療法/自己注射普及之要因。
因此，與既有之凝固因子製劑相比，強烈要求能擴大投予間隔之藥劑或投予簡單之藥劑。
再者，血友病患者尤其是重症血友病患者會有發生稱為阻礙劑(inhibitor)之對於FVIII或FIX之抗體之情況。發生阻礙劑時，凝固因子製劑之效果會受到阻礙劑之妨礙。結果，實施使用大量之凝固因子製劑之中和療法或使用複合體製劑(complex concentrate)或活性化血液凝固第VII因子(FVIIa製劑)之迂迴療法。但任一方法均無法確立定期補充預防，對於患者之止血管理非常困難。
因此，強烈要求不會受到阻礙劑存在之左右的藥劑。
不過，抗體由於在血中之安定性高、可皮下投予、抗原性亦低，故作為醫藥品受到矚目且已被應用。抗體由於(i)投予間隔大、(ii)投予簡單、(iii)不受阻礙劑存在之左右，故認為在醫藥品之創製中有用。抗體之血中半衰期通常較長，為數日至數週之間。且，已知抗體於皮下投予後會移行至血中。再者，與FVIII或FIX具有大不相同之構造，抗原性亦低。亦即，抗體醫藥品滿足上述之(i)、(ii)、(iii)。
另一方面，蛋白C(PC)係在血液凝固中以負反饋機構作用之因子之一。鍵結於血管內皮所發現之內皮細胞蛋白C受體(endothelial Protein C receptor，EPCR)而藉凝血酶(thrombin)/凝血酶調節素(thrombomodulin)複合體而活性化時，成為活性化蛋白C(APC)。APC與其輔因子蛋白S一起使活性化血液凝固第VIII因子(FVIIIa)及活性化血液凝固第V因子(FVa)不活化(非專利文獻2)。因此，可容易地推測藉由阻礙PC能對凝固之促進發揮作用。實際上，均質接合體先天性PC欠缺症病患中，自出生後即呈現出血栓性之電擊性紫斑病。進而，已有報導重症血友病A患者中，具有對於血液凝固第V因子(FV)賦予APC抵抗性之基因變異(FV Leiden)之患者，凝固基因製劑使用量少。該等報導支持該推測(非專利文獻3)。於動物實驗中，Schlachterman等人亦教示於FVIII或FIX缺損小鼠導入FV Leiden變異時，因特定刺激引起之微小循環促進了凝 固(非專利文獻4)。Butenas等人教示創製對於APC之阻礙物質之合成凝固蛋白質組模型中，其會使因FVIII缺乏引起之凝血酶生成降低部份地恢復(非專利文獻5)。
且，阻礙APC活性之抗體顯示血液凝固效果，亦已報導可利用於血友病之治療之可能性(專利文獻1)。
然而，APC活性於活體內被阻礙時之血液凝固效果並未被確認。再者，前述Schlachterman等人之論文中顯示關於FVIII缺損小鼠中並無FV Leiden之止血效果，但於FXI缺損小鼠中則有FV Leiden之止血效果之正反兩種結果。
又，與本申請案之發明相關聯之先前技術文獻資訊顯示如下。
〔先前技術文獻〕 〔非專利文獻〕
非專利文獻1：Astermark J. Haemophilia. 2003 9 (Suppl. 1) 32
非專利文獻2：Castellino FJ and Ploplis VA, J Thromb and Haemost, 2009 7 (Suppl. 1) 140
非專利文獻3：van Dijk K et al. J. Thromb and Haemost, 2004 92 305
非專利文獻4：Schlachterman A et al. J Thromb Haemost 2005 3 2730
非專利文獻5：Butenas S et al. J Thromb Haemost 2006 4 2411
〔專利文獻〕
專利文獻1：日本特表2011-500843
本發明目的在於提供具有優異血液凝固效果之新穎出血性疾病治療用組成物、抗凝固作用阻礙用組成物或止血作用促進用組成物。
本發明人等為解決上述課題而積極研究之結果，發現藉由阻礙蛋白C之活性化能獲得高的止血效果，因而完成本發明。
亦即，更具體而言，本發明係提供以下之[1]~[14]者。
[1]一種用以治療出血性疾病之醫藥組成物，其含有蛋白C之活性化阻礙物質。
[2]如[1]之組成物，其中出血性疾病係選自血友病、後天性血友病及起因於vWF之功能異常或缺損之溫韋伯疾病(von Willebrand disease)或後天性溫韋伯疾病之疾病。
[3]如[1]之組成物，其中出血性疾病係血友病A。
[4]一種用以促進止血作用之醫藥組成物，其含有蛋白C之活性化阻礙物質。
[5]如[4]之組成物，其中止血作用係對於選自血友病、後天性血友病及起因於vWF之功能異常或缺損之溫韋伯疾病或後天性溫韋伯疾病之疾病的出血症狀之作用。
[6]如[4]之組成物，其中止血作用係對於血友病A的出血症狀之作用。
[7]一種用以阻礙抗血液凝固作用之醫藥組成物，其含有蛋白C之活性化阻礙物質。
[8]如[7]之組成物，其中抗血液凝固作用係活性化蛋白C之抗血液凝固作用。
[9]如[1]至[8]中任一項之組成物，其中蛋白C之活性化阻礙物質係進一步阻礙活性化蛋白C之活性。
[10]如[1]至[9]中任一項之組成物，其中醫藥組成物係與活性化蛋白C之活性阻礙物質組合使用之組成物。
[11]如[1]至[10]中任一項之組成物，其中蛋白C之活性化阻礙物質係抗蛋白C抗體。
[12]如[11]之組成物，其中抗蛋白C抗體係結合於蛋白C之重鏈的抗體。
[13]一種抗蛋白C抗體，其係結合於蛋白C之重鏈，且具有阻礙蛋白C轉化成活性化蛋白C之作用。
[14]如[13]之抗體，其中抗蛋白C抗體進一步具有阻礙活性化蛋白C之活性的作用。
[15]一種用以治療出血性疾病之方法，其包含投予 蛋白C之活性化阻礙物質之步驟。
[16]如[15]之方法，其中出血性疾病係選自血友病、後天性血友病及起因於vWF之功能異常或缺損之溫韋伯疾病或後天性溫韋伯疾病之疾病。
[17]如[15]之方法，其中出血性疾病係血友病A。
[18]一種用以促進止血作用之方法，其包含投予蛋白C之活性化阻礙物質之步驟。
[19]如[18]之方法，其中止血作用係對於選自血友病、後天性血友病及起因於vWF之功能異常或缺損之溫韋伯疾病或後天性溫韋伯疾病之疾病的出血症狀之作用。
[20]如[18]之方法，其中止血作用係對於血友病A的出血症狀之作用。
[21]一種用以阻礙抗血液凝固作用之方法，其包含投予蛋白C之活性化阻礙物質之步驟。
[22]如[21]之方法，其中抗血液凝固作用係活性化蛋白C之抗血液凝固作用。
[23]如[15]至[22]中任一項之方法，其中蛋白C之活性化阻礙物質係進一步阻礙活性化蛋白C之活性。
[24]如[15]至[23]中任一項之方法，其中與活性化蛋白C之活性阻礙物質組合投予。
[25]如[15]至[24]中任一項之方法，其中蛋白C之活性化阻礙物質係抗蛋白C抗體。
[26]如[25]之方法，其中抗蛋白C抗體係結合於蛋白C之重鏈的抗體。
[27]一種蛋白C之活性化阻礙物質之用途，其係用以製造供治療出血性疾病之藥劑。
[28]如[27]之用途，其中出血性疾病係選自血友病、後天性血友病及起因於vWF之功能異常或缺損之溫韋伯疾病或後天性溫韋伯疾病之疾病。
[29]如[27]之用途，其中出血性疾病係血友病A。
[30]一種蛋白C之活性化阻礙物質之用途，其係用以製造供促進止血作用之藥劑。
[31]如[30]之用途，其中止血作用係對於選自血友病、後天性血友病及起因於vWF之功能異常或缺損之溫韋伯疾病或後天性溫韋伯疾病之疾病的出血症狀之作用。
[32]如[30]之用途，其中止血作用係對於血友病A的出血症狀之作用。
[33]一種蛋白C之活性化阻礙物質之用途，其係用以製造供阻礙抗血液凝固作用之藥劑。
[34]如[33]之用途，其中抗血液凝固作用係活性化蛋白C之抗血液凝固作用。
[35]如[27]至[34]中任一項之用途，其中蛋白C之活性化阻礙物質係進一步阻礙活性化蛋白C之活性。
[36]如[27]至[35]中任一項之用途，其中藥劑進一步含有活性化蛋白C之活性阻礙物質。
[37]如[27]至[35]中任一項之用途，其中蛋白C之活性化阻礙物質係抗蛋白C抗體。
[38]如[37]之用途，其中抗蛋白C抗體係結合於蛋 白C之重鏈的抗體。
[39]一種蛋白C之活性化阻礙物質，其係使用於治療出血性疾病。
[40]如[39]之物質，其中出血性疾病係選自血友病、後天性血友病及起因於vWF之功能異常或缺損之溫韋伯疾病或後天性溫韋伯疾病之疾病。
[41]如[39]之物質，其中出血性疾病係血友病A。
[42]一種蛋白C之活性化阻礙物質，其係用於促進止血作用。
[43]如[42]之物質，其中止血作用係對於選自血友病、後天性血友病及起因於vWF之功能異常或缺損之溫韋伯疾病或後天性溫韋伯疾病之疾病的出血症狀之作用。
[44]如[42]之物質，其中止血作用係對於血友病A的出血症狀之作用。
[45]一種蛋白C之活性化阻礙物質，其係使用於阻礙抗血液凝固作用。
[46]如[45]之物質，其中抗血液凝固作用係活性化蛋白C之抗血液凝固作用。
[47]如[39]至[46]中任一項之物質，其中蛋白C之活性化阻礙物質係進一步阻礙活性化蛋白C之活性。
[48]如[39]至[47]中任一項之物質，其係與活性化蛋白C之活性阻礙物質組合使用之物質。
[49]如[39]至[48]中任一項之物質，其中蛋白C之活性化阻礙物質係抗蛋白C抗體。
[50]如[49]之物質，其中抗蛋白C抗體係結合於蛋白C之重鏈的抗體。
圖1係顯示利用小鼠活性化蛋白C所得之對於FVa不活性化之抗小鼠蛋白C抗體之效果的圖。Y軸之吸光度表示所生成之凝血酶活性，殘存之FVa越多表示越高的吸光度。未添加小鼠活性化蛋白C及未添加抗體之群表示為APC(-)、Ab(-)，其以外表示小鼠活性化蛋白C添加群。實驗結果，藉由添加MP35及MP51，相較於未添加抗體，吸光度上升，因此顯示MP35及MP51使殘存FVa增加亦即對於因活性化蛋白C引起之FVa不活性化具有阻礙活性。
圖2係顯示對於因凝血酶/凝血酶調節素引起之小鼠蛋白C活性化之抗蛋白C抗體之效果的圖。小鼠蛋白C活性化反應中之抗體濃度為30μg/mL。Y軸之吸光度值表示所生成之小鼠活性化蛋白C之活性。對於因凝血酶/凝血酶調節素引起之小鼠蛋白C活性化之阻礙活性強。實驗結果，相較於未添加抗體，因MP51之添加而使吸光度降低，因此顯示MP51對於因凝血酶/凝血酶調節素引起之小鼠蛋白C活性化具有阻礙活性。另一方面，相較於未添加抗體，即使添加MP35亦未使吸光度降低，因此顯示MP35對於因凝血酶/凝血酶調節素引起之小鼠蛋白C活性 化不具有阻礙活性。
圖3係顯示對於添加蛋白C活性化物質之正常小鼠血漿(A)或FVIII缺損小鼠血漿(B)之凝血酶生成之抗小鼠蛋白C抗體之效果的圖。藉由添加蛋白C活性物質的Protac而生成之活性化蛋白C之抗凝固作用強度以延遲時間及波峰高度表示。添加之抗體溶液濃度為0、0.18、0.6、1.8、6、18、60及180μg/mL。虛線為未添加蛋白C活性化物質(Protac)及未添加抗體之血漿之數據。相較於未添加抗體群(0μg/mL)，縱軸之延遲時間越縮短，或波峰高度越上升，則對於活性化C之抗凝血作用之阻礙活性越強。結果，正常小鼠血漿或FVIII缺損小鼠血漿中，MP35(△)及MP51(●)均與濃度有關地縮短蛋白C活化劑添加時之延遲時間，增加蛋白C活化劑添加時之波峰高度，故而顯示MP35及MP51具有阻礙活性化蛋白C之抗凝固作用之活性。
圖4係顯示對於使用血友病A小鼠之穿刺出血模型中之出血症狀的抗小鼠蛋白C抗體之效果的圖。因穿刺之出血症狀強度以出血痕總面積(Total bleeding area)表示，故數據表示各群之平均值。相較於媒劑群(0μg/mL)，縱軸之出血痕總面積越縮小，對於因穿刺之出血症狀之止血作用越強。結果，藉由投予MP51使出血痕總面積縮小，因而顯示MP51具有止血作用。MP35未顯示出血作用。
圖5係顯示抗小鼠蛋白C抗體對於小鼠活性化蛋白C引起之FVa不活化之效果的圖。Y軸之吸光度表示所生成 之凝血酶活性，殘存FVa越多表示越高的吸光度。未添加小鼠活性化蛋白C及未添加抗體之群表示為APC(-)、Ab(-)，其以外表示小鼠活性化蛋白C添加群。抗體濃度為15或50μg/mL。實驗結果，藉由添加L2及L12，相較於未添加抗體，吸光度上升，因此顯示L2及L12使殘存FVa增加亦即對於因活性化蛋白C引起之FVa不活性化具有阻礙活性。
圖6係顯示對於因凝血酶/凝血酶調節素引起之小鼠蛋白C活性化之抗蛋白C抗體之效果的圖。小鼠蛋白C活性化反應中之抗體濃度為30μg/mL。Y軸之吸光度值表示所生成之小鼠活性化蛋白C之活性。對於因凝血酶/凝血酶調節素引起之小鼠蛋白C活性化之阻礙活性強。實驗結果，相較於未添加抗體，因L12之添加而使吸光度降低，因此顯示L12對於因凝血酶/凝血酶調節素引起之小鼠蛋白C活性化具有阻礙活性。另一方面，相較於未添加抗體，即使添加L2亦未使吸光度降低，因此顯示L2對於因凝血酶/凝血酶調節素引起之小鼠蛋白C活性化不具有阻礙活性。
本發明提供含有蛋白C之活性化阻礙物質之用以治療出血性疾病之醫藥組成物。
本發明中所謂「蛋白C之活性化阻礙」、「阻礙蛋白C之活性化」或「阻礙蛋白C轉化成活性化 蛋白C」意指藉由與凝血酶調節素形成複合體而阻礙蛋白C分解。至於阻礙蛋白C之活性化的物質，舉例為例如阻礙蛋白C與凝血酶結合之物質。具體舉例為例如抗蛋白C抗體、抗凝血酶抗體、抗凝血酶調節素抗體、蛋白C部分胜肽、凝血酶部分胜肽、凝血酶調節素部分胜肽、顯示與該等同樣活性之低分子化合物等。
作為蛋白C之活性化阻礙劑之較佳樣態可舉例為抗蛋白C抗體。
本說明書中，所謂抗體意指天然者或部分或完全由合成所製造之免疫球蛋白(globulin)。抗體可自其天然存在之血漿或血清等之天然資源或產生抗體之融合瘤細胞之培養上清液單離而得，或藉由使用基因重組等方法而部分或完全合成而得。作為抗體之例，較好舉例為免疫球蛋白之等型(isotype)及該等之等型之亞族。作為人類之免疫球蛋白，已知有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgM之9種類別(等型)。本發明之抗體中，該等等型中以IgG1、IgG2、IgG3、IgG4較佳。
製作具有期望結合活性之抗體之方法為本技藝者所熟知。例如例示藉由蛋白C結合之抗體之方法，但方法不限於此。
抗蛋白C抗體可使用習知手段以多株或單株抗體取得。作為抗體，源自哺乳動物之單株抗體可較好地製作。源自哺乳動物之單株抗體包含藉由融合瘤產生者， 及藉由基因工程方法由以包含抗體基因之表現載體轉形之宿主細胞所產生者。又，本發明之單株抗體包含「人類抗體」或「嵌合抗體(chimeric antibody)」。
產生單株抗體之融合瘤可藉由使用習知技術 由例如以下製作。亦即，使用蛋白C蛋白質作為敏化抗原，依據通常之免疫方法使哺乳動物免疫。所得免疫細胞藉由通常之細胞融合法與公知之母細胞融合。接著，利用通常之篩選法，篩選與蛋白C分子中之抗原決定基結合之單株抗體產生細胞，可選擇產生抗蛋白C抗體之融合瘤。
單株抗體之製作係例如如下所示進行。首 先，將編碼蛋白C之基因序列插入習知之表現載體(vector)中而使適當宿主細胞進行轉形。以習知方法自該宿主細胞中或培養上清液純化所期望之蛋白C蛋白質。
作為對哺乳動物免疫所使用之敏化抗原可使 用該純化蛋白C蛋白質。可使用作為蛋白C之部分胜肽或敏化抗原。此時，該部分胜肽亦可藉由蛋白C之胺基酸序列進行化學合成而取得。且，亦可藉由將蛋白C基因之一部分組入表現載體中予以表現而取得。再者亦可使用蛋白質分解酶使蛋白C蛋白質分解而取得，但作為部分胜肽使用之蛋白C胜肽之區域及大小並未限定於特別樣態。
抗蛋白C抗體之用以阻礙蛋白C之活性化之 較佳結合區域舉例為蛋白C之重鏈。尤其，較佳為參與與凝血酶結合之部分，具體而言較好為重鏈內之活性胜肽或存在於其附近之抗原決定基。此處所謂存在於附近之抗原 決定基，於抗蛋白C抗體與蛋白C結合時，意指位在可立體構造地阻礙凝血酶與蛋白C結合之範圍內。此種抗體可阻礙蛋白C轉化成活性化蛋白C。因此，本發明中，自相當於蛋白C之重鏈之胺基酸序列選擇任意序列並作為敏化抗原使用。構成成為敏化抗原之胜肽之胺基酸數較好至少為5以上，例如6以上或7以上。更具體而言，可使用8~50，較好10~30殘基之胜肽作為敏化抗原。
且，可利用與蛋白C蛋白質之期望部分聚胜肽或胜肽不同之聚胜肽融合之融合蛋白質作為敏化抗原。用以製造作為敏化抗原使用之融合蛋白質時，例如可較好地使用抗體之Fc片段或胜肽標籤(peptide tag)等。表現融合蛋白質之載體可藉由如下製作：使期望之兩種類或其以上之編碼聚胜肽片段之基因以框架內(in frame)予以融合，將該融合基因插入如前述之表現載體中。融合蛋白質之製作方法記載於Molecular Cloning 2nd ed.(Sambrook,J et al.,Molecular Cloning 2nd ed.,9.47-9.58(1989)Cold Spring Harbor Lab.press)。
能以該敏化抗原免疫之哺乳動物並未限定於特定動物，但較好考慮與使用於細胞融合之母細胞之適合性予以選擇。一般可較好地使用嚙齒類動物(例如小鼠、大鼠、天竺鼠)、或兔子、猴子等。
依據習知方法以敏化抗原使上述動物免疫。例如，作為一般方法，係藉由哺乳動物之腹腔內或皮下注射投予敏化抗原而實施免疫。具體而言，以PBS(磷酸鹽 緩衝之生理食鹽水)或生理食鹽水等以適當稀釋倍率予以稀釋之敏化抗原與視需要之通常之佐劑例如Freund完全佐劑混合並乳化後，對哺乳動物每隔4~21日投予數次之該敏化抗原。且，於敏化抗原之免疫時可使用適當擔體。 尤其使用分子量小之部分胜肽作為敏化抗原時，亦有時期望使與白蛋白、鑰孔戚血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin)等之擔體蛋白質結合之該敏化抗原胜肽進行免疫。
且，產生期望抗體之融合瘤亦可使用DNA免 疫如下述般製作而獲得。所謂免疫DNA係投予可於免疫動物中使編碼抗原蛋白質之基因表現之樣態所構築之載體DNA之該免疫動物中，使敏化抗原於該免疫動物之生體內表現而給予免疫刺激之免疫方法。與對免疫動物投予蛋白質抗原之一般免疫方法相比，DNA免疫期待具有如下之優異性。
-可維持蛋白質之構造並給予免疫刺激
-無純化免疫抗原之必要。
為了利用DNA免疫獲得本發明之單株抗體，首先對免疫動物投予表現蛋白C蛋白質之DNA。編碼蛋白C之DNA可藉由PCR等之習知方法合成。將所得DNA插入適當表現之載體中並投予至免疫動物。作為表現載體，可較好地利用例如pcDNA3.1等之市售表現載體。作為對生體投予載體之方法，可利用一般使用之方法。例如將吸附有表現載體之金粒子以基因槍(gene gun)導入免疫動物個體之細胞內，藉此進行DNA免疫。
如此使哺乳動物免疫，確認血清中之與蛋白 C結合之抗體力價上升後，自哺乳動物採取免疫細胞，供於細胞融合。作為較佳之免疫細胞尤其可使用脾細胞。
作為與前述免疫細胞融合之細胞，係使用哺 乳動物之骨髓瘤細胞。骨髓瘤細胞較好具備用於選殖之適當選擇標記基因(marker)。所謂選擇標記基因係指在特定培養條件下可生存(或無法生存)之形質(character)。選擇標記基因中，次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核苷轉移酶(hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase)缺損(以下簡稱為HGPRT缺損)或胸苷激酶(thymidine kinase)缺損(以下簡稱為TK缺損)等為已知。具有HGPRT或TK缺損之細胞具有次黃嘌呤-胺基喋呤-胸苷感受性(以下簡稱為HAT感受性)。HAT感受性之細胞無法於HAT選擇培養基中進行DNA合成而會死亡，但由於若與正常細胞融合則可利用正常細胞之補救合成路徑(salvage pathway)而繼續DNA之合成，故於HAT選擇培養基中仍可增殖。
HGPRT缺損或TK缺損之細胞可於分別包含 6-硫鳥嘌呤、8-氮鳥嘌呤或5’-溴去氧尿苷之培養基選擇。該等嘧啶類似物納入DNA中而使正常細胞死亡。另一方面，未取入該等嘧啶類似物且缺損該等酶之細胞可在選擇培養基中生存。其他稱為G418耐性之選擇標記基因藉由新黴素耐性基因而賦予對2-去氧鏈霉胺係抗生物質 (慶大黴素(gentamycin)類似物)之耐性。適於細胞融合之各種骨髓瘤細胞為已知。
作為此等骨髓瘤細胞可較好地使用例如P3(P3x63Ag8.653)(J.Immunol.(1979)123(4),1548-1550)、P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81,1-7)、NS-1(C.Eur.J.Immunol.(1976)6(7),511-519)、MPC-11(Cell(1976)8(3),405-415)、SP2/0(Nature(1978)276(5685),269-270)、F0(J.Immunol.Methods(1980)35(1-2),1-21)、S194/5.XX0.BU.1(J.Exp.Med.(1978)148(1),313-323)、R210(Nature(1979)277(5692),131-133)等。
基本上之習知方法係依據例如Köhler與Milstein等人之方法(Methods Enzymol.(1981)73,3-46)等，進行前述免疫細胞與骨髓瘤細胞之細胞融合。
更具體而言，例如可在細胞融合促進劑存在下於通常之營養培養液中實施前述細胞融合。作為融合促進劑，係使用例如聚乙二醇(PEG)、仙台(Sendai)病毒(HVJ)等，進而為了提高融合效率，則依據需要添加二甲基亞碸等之輔助劑而使用。
免疫細胞與骨髓瘤細胞之使用比例可任意設定。例如較好對於骨髓細胞，免疫細胞為1至10倍。前述細胞融合中使用之培養液係使用例如適用於前述骨髓瘤細胞株之增殖之RPMI1640培養液、MEM培養液，其他可使用該種細胞培養中所用之通常之培養液，再者，可適 當地添加胎牛血清(FCS)等之血清補液。
細胞融合係將特定量之前述免疫細胞與骨髓 瘤細胞於前述培養液中充分混合，且通常以30至60%(w/v)之濃度添加預先加溫至37℃之PEG溶液(例如平均分子量1000至6000左右)。藉由使混合液緩慢混合而形成所需之融合細胞(融合瘤)。接著，重複進行逐次添加上述舉例之適當培養液，並離心去除上清液之操作而去除對於融合瘤之生長較不好的細胞融合劑等。
如此所得之融合瘤係藉由以通常之選擇培養 液例如HAT培養液(含次黃嘌呤、胺基喋呤及胸苷之培養液)培養而選擇。至所期望之融合瘤以外之細胞(非融合細胞)死亡之充分時間(通常該充分時間為數天至數週)，可使用上述HAT培養液繼續培養。接著，藉由通常之有限稀釋法，可實施產生所需抗體之融合瘤之篩選及單一選殖。
如此所得之融合瘤可藉由利用對應於細胞融 合所用之骨髓瘤所具有之選擇標記基因之選擇培養液而選擇。例如具有HGPRT或TK缺損之細胞可藉由以HAT培養液(含次黃嘌呤、胺基喋呤及胸苷之培養液)培養而選擇。亦即，細胞融合中使用HAT感受性之骨髓瘤細胞時，於HAT培養液中，可選擇與正常細胞成功細胞融合之細胞並增殖。至所期望之融合瘤以外之細胞(非融合細胞)死亡之充分時間，可使用上述HAT培養液繼續培養。具體而言，一般可藉由數日至數週之培養，選擇期望 之融合瘤。接著，藉由通常之有限稀釋法，可實施產生所需抗體之融合瘤之篩選及單一選殖。
所需抗體之篩選及單一選殖可較好地藉由基 於習知抗原抗體反應之篩選方法而實施。例如對於標記化之蛋白C蛋白質之抗體結合活性可基於ELISA原理進行評價。例如，於ELISA板之孔中使蛋白C蛋白質固定化。使融合瘤之培養上清液與孔內之固定化蛋白質接觸，檢測出與固定化蛋白質結合之抗體。於單株抗體係源自小鼠時，與細胞結合之抗體可藉由抗小鼠免疫球蛋白抗體而檢測出。藉由該等篩選而選擇之能產生對抗原具有結合能之期望抗體之融合瘤可藉由有限稀釋法進行選殖。
如此製作之能產生單株抗體之融合瘤可於通 常之培養液中進行繼代培養。且，該融合瘤可於液態氮中長期保存。
依據通常方法培養該融合瘤，可自其培養上 清液取得所需之單株抗體。或者將融合瘤投予至與該融合瘤具有適合性之哺乳動物並增殖，可自其腹水取得單株抗體。前者方法係獲得高純度抗體之較佳方法。
亦可較好地利用藉由自該融合瘤等之抗體產 生細胞選殖之抗體基因編碼之抗體。藉由將所選殖之抗體基因組入適當載體並導入至宿主，而使由該基因編碼之抗體表現。抗體基因之單離與對載體之導入以及用以使宿主細胞之轉形之方法已由例如Vandamme等人確立(Eur.J.Biochem.(1990)192(3),767-775)。如下述之重組抗體之 製造方法亦為習知。
例如自能產生抗蛋白C抗體之融合瘤細胞，取得編碼抗蛋白C抗體之可變區域(V區域)之cDNA。因此，通常首先自融合瘤抽出全RNA。作為用以自細胞抽出mRNA之方法可利用例如如下方法。
-胍超離心法(Biochemistry(1979)18(24),5294-5299)
-AGPC法(Anal.Biochem.(1987)162(1),156-159)
所抽出之mRNA可使用mRNA純化套組(GE Healthcare Bioscience製)等純化。或者如QuickPrep mRNA純化套組(GE Healthcare Bioscience製)等之用以自細胞直接抽出全部mRNA之套組亦有市售。使用此種套組可自融合瘤取得mRNA。使用反轉錄酶可自所得mRNA合成編碼抗體V區域之cDNA。cDNA可藉由AMV逆轉錄酶第一股cDNA合成套組(生化學工業公司製)等而合成。且為了cDNA之合成及擴增，可適當地利用使用SMART RACE cDNA擴增套組(Clontech製)及PCR之5’-RACE法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85(23),8998-9002,Nucleic Acids Res.(1989)17(8),2919-2932)。進而於此cDNA合成過程中可於cDNA兩末端導入後述之適當限制酶部位。
自所得PCR產物純化目的之cDNA片段，接著與載體-DNA連結。如此製作重組載體，並導入大腸桿菌等選擇克隆後，自形成該克隆之大腸桿菌可調製期望之 重組載體。接著關於該重組載體是否具有目的之cDNA鹼基序列，係藉由習知方法例如雙去氧核糖核酸鏈終止法(dideoxynucleotide chain termination method)等確認。
用以取得編碼可變區域之基因時，利用使用可變區域基因擴增用之引子之5’-RACE法為簡便方法。首先以自融合瘤細胞抽出之RNA作為模板合成cDNA，獲得5’-RACE cDNA庫。5’-RACE cDNA庫之合成係適當使用SMART RACE cDNA擴增套組等之市售套組。
以所得5’-RACE cDNA庫作為模板，利用PCR法使抗體基因擴增。可設計以習知抗體基因序列為主之小鼠抗體基因擴增用之引子。該等引子係每免疫球蛋白之子集(subclass)不同之鹼基序列。因此子集宜預先使用Iso Strip小鼠單株抗體等型套組(Roche Diagnostic)等之市售套組預先決定。
具體而言，於例如以取得編碼小鼠IgG之基因為目的時，可利用可使編碼γ1、γ2a、γ2b、γ3作為重鏈、編碼κ鏈及λ鏈作為輕鏈之基因擴增之引子。為了擴增IgG之可變區域基因時，一般於3’側之引子係利用復性(annealing)至相當於接近可變區域之恆定區域之部分的引子。另一方面，於5’側之引子係利用附屬於5’RACE cDNA庫製作套組之引子。
利用如此擴增之PCR產物，可再構成由重鏈與輕鏈組合而成之免疫球蛋白。以再構成之免疫球蛋白之對於蛋白C之結合活性為指標，可篩選期望抗體。以取得 對於蛋白C之抗體為目的時，更好抗體對於蛋白C之結合具特異性。結合至蛋白C之抗體可藉由例如如下般進行篩選；(1)使包含藉由融合瘤所得之cDNA編碼之V區域之抗體與蛋白C接觸之步驟，(2)檢測蛋白C與抗體結合之步驟，及(3)選擇結合至蛋白C之抗體之步驟。
檢測蛋白C與抗體結合之之方法為已知。具體而言，藉由先前所述之ELISA等方法，可檢測抗體與蛋白C之結合。用以評價抗體之結合活性時，可適當利用蛋白C之固定標本。
作為以結合活性為指標之抗體之篩選方法，亦可較好地使用利用嗜菌體載體之淘洗(panning)法。由多株抗體表現細胞群取得抗體基因作為重鏈與輕鏈之子集之庫時，利用嗜菌體之篩選方法為有利。編碼重鏈與輕鏈之可變區域之基因藉由以適當連結子序列連結可形成單鏈Fv(scFv)。藉由將編碼scFv之基因插入嗜菌體載體，可取得於表面表現scFv之嗜菌體。該嗜菌體與所需抗原接觸後，回收與抗原結合之嗜菌體，可回收編碼具有目的結合活性之scFv之DNA。依據需要重複該操作，可濃縮具有期望結合活性之scFv。
獲得編碼成為目的之抗蛋白C抗體之V區域之cDNA後，利用辨識插入該cDNA兩末端之限制酶部位之限制酶而消化該cDNA。較佳之限制酶係辨識構成抗體 基因之鹼基序列中出現頻度低之鹼基序列並進行消化。進而為了將1複製之消化片段於正方向插入載體，較好插入賦予附著末端之限制酶。藉由將編碼如上述消化之抗蛋白C抗體之V區域之cDNA插入適當之表現載體中，可取得抗體表現載體。此時，若以框架內使編碼抗體恆定區域(C區域)之基因與編碼前述V區域之基因融合，則取得嵌合體抗體。此處所謂「嵌合體抗體」意指恆定區域與可變區域之來源不同之抗體。因此，除了小鼠-人類等之異種嵌合體抗體以外，人類-人類同種嵌合體抗體亦包含於本發明之嵌合體抗體。藉由預先對具有恆定區域之表現載體插入前述V區域基因，可構築嵌合體抗體表現載體。具體而言，例如可於表持有編碼期望抗體恆定區域(C區域)之DNA之表現載體之5’側適當配置能消化前述V區域基因之限制酶之限制酶辨識序列。藉由以相同組合之限制酶消化之兩者以框架內進行融合，而構築嵌合體抗體表現載體。
抗體之等型係由抗體恆定區域之構造決定。 IgG1、IgG2、IgG3及IgG4之各等型之抗體恆定區域分別稱為Cγ1、Cγ2、Cγ3及Cγ4。且輕鏈之抗體恆定區域係適當使用λ及κ鏈之恆定區域。
用以製造結合至蛋白C之單株抗體時，係使 抗體基因在表現控制區域之控制下表現之方式組入表現載體中。所謂用以表現抗體之表現控制區域包含例如增強子(enhancer)及啟動子(promoter)。且，可以使表現之 抗體分泌至細胞外之方式，將適當之訊號序列附加至胺基末端。經表現之聚胜肽於上述序列之羧基末端部分被切斷，所切斷之聚胜肽可作為成熟聚胜肽分泌至細胞外。接著，藉由該表現載體使適當宿主細胞進行轉化，藉此可取得使編碼抗蛋白C抗體之DNA表現之重組細胞。
於抗體基因之表現時，將編碼抗體重鏈(H 鏈)及輕鏈(L鏈)之DNA組入個別之表現載體中。藉由組入H鏈及L鏈之載體，使相同宿主細胞同時進行轉化(共轉染(co-transfect))，可使具備H鏈及L鏈之抗體分子表現。或者藉由將編碼H鏈及L鏈之DNA組入單一之表現載體中，可使宿主細胞轉化(參考WO1994/011523)。
用以藉由將單離之抗體基因導入適當宿主而 製作抗體之宿主細胞與表現載體之多種組合為習知。該等表現系均可應用於單離本發明之抗原結合區域。使用真核細胞作為宿主細胞時，可適當使用動物細胞、植物細胞或真菌細胞。具體而言，作為動物細胞可例示如下之細胞。
(1)哺乳類細胞：CHO、COS、骨髓瘤、BHK(baby hamster kidney，幼倉鼠腎)、Hela、Vero、HEK(human embryonic kidney，人類胚腎)293等
(2)兩棲類細胞：非洲爪蟾卵母細胞等
(3)昆蟲細胞：sf9、sf21、Tn5等
或者作為植物細胞，利用源自菸草(Nicotiana tabacum)等之菸草(Nicotiana)屬之細胞之抗體基因之 表現系為習知。於植物細胞之轉化中，可適當利用愈創組織培養之細胞。
進而作為真菌細胞，可利用如下之細胞。
-酵母：釀酒酵母(Saccharomyces serevisiae)等之酵母(Saccharomyces)屬、甲醇同化酵母(畢赤酵母(Pichia pastoris))等之畢赤(Pichia)屬
-絲狀菌：黑麴黴(Aspergillus niger)等之麴黴(Aspergillus)屬
且利用原核細胞之抗體基因之表現系亦為習知。例如使用細菌細胞時，可適當利用大腸桿菌(E.coli)、枯草桿菌等之細菌細胞。於該等細胞中，藉由使包含成為目的之抗體基因之表現載體予以轉化而導入。經轉化之細胞在體外培養，可自該轉化細胞之培養物取得期望抗體。
重組抗體之產生，除了上述宿主細胞以外，亦可利用基因轉殖動物。亦即自導入有編碼期望抗體之基因之動物可獲得該抗體。例如抗體基因可藉由於編碼在乳汁中固有產生之蛋白質之基因內部以框架內插入而作為融合基因予以構築。乳汁中分泌之蛋白質可利用例如山羊β酪蛋白等。將包含插入有抗體基因之融合基因之DNA片段朝山羊胚胎中注入，將該注入之胚胎導入雌山羊中。由接受胚胎之山羊所生之基因轉殖山羊(或其子孫)產生之乳汁，所需抗體可作為與乳汁蛋白質之融合蛋白質而取得。且，為了增加由基因轉殖山羊產生之含所需抗體之乳 汁量，可對基因轉殖山羊投予激素(Bio/Technology(1994),12(7),699-702)。
對人類投予本說明中記載之抗LAMP5抗體 時，作為該抗體中之抗原結合區域，以降低對人類之異種抗原性為目的，可適當採用源自人為改變之基因重組型抗體之抗原結合區域。基因重組型抗體中包含例如人類化(Humanized)抗體等。該等改變抗體可使用習知方法適宜製造。
本發明之抗蛋白C抗體中之抗原結合區域之 製作所用之抗體之可變區域通常以夾於4個骨架(framework)區域(FR)之3個互補性決定區域(complementarity-determining region；CDR)構成。CDR實質上係決定抗體之結合特異性之區域。CDR之胺基酸序列富有多樣性。另一方面，構成FR之胺基酸序列於具有不同結合特異性之抗體間大多亦顯示高的同一性。因此，一般，藉由CDR之移植，可使某種抗體之結合特異性移植至其他抗體。
人類化抗體亦稱為再構成(reshaped)人類抗 體。具體而言，將人類以外之動物例如小鼠抗體之CDR移植至人類抗體之人類化抗體等為習知。用以獲得人類化抗體之一般基因重組方法亦為已知。具體而言，用以將小鼠之抗體之CDR移植至人類之FR之方法，例如重複伸長PCR(Overlap Extension PCR)為已知。重複伸長PCR中，於用以合成人類抗體之FR之引子中，附加有編碼經 移植之小鼠抗體之CDR之鹼基序列。引子係針對4個FR個別準備。一般，小鼠CDR對人類FR之移植中，係選擇與小鼠之FR同一性高的人類FR，其對維持CDR之功能有利。亦即一般較好利用與應移植之小鼠CDR鄰接之FR之胺基酸序列同一性高的氨基酸序列所構成之人類FR。
且所連結之鹼基序列係以相互以框架內連接 之方式設計。藉由個引子個別合成人類FR。其結果，獲得對各FR附加編碼小鼠CDR之DNA之產物。編碼各產物之小鼠CDR之鹼基序列係以相互重疊之方式設計。接著，以人類抗體基因作為模板所合成之產物之重疊CDR部分相互復性進行互補鏈合成反應。藉由該反應，使人類FR透過小鼠CDR之序列連結。
最終連結3個CDR及4個FR之V區域基 因，藉由於其5’末端與3’末端附加復性之適當限制酶辨識序列之引子使其全長擴增。如上述所得之DNA與編碼人類抗體C區域之DNA以框架內融合之方式插入表現載體中，可作成人類型抗體表現用載體。
將該組入之載體導入宿主樹立重組細胞後，培養該重組細胞，藉由使編碼該人類化抗體之DNA表現，而於該培養細胞之培養物中產生該人類化抗體(參考歐洲專利公開EP239400、國際公開WO1996/002576)。
如上述製作之人類化抗體對於抗原之結合活性進行定性或定量測定並進行評價，藉此可以透過CDR連結時該CDR形成良好抗原結合部位之方式較好地選擇 人類抗體之FR。依據必要，亦可以再構成人類抗體之CDR形成適當抗原結合部位之方式，置換FR之胺基酸殘基。例如，應用小鼠CDR對人類FR之移植所用之PCR法，可對FR導入胺基酸序列之變異。具體而言，可於以FR復性之引子導入部分的鹼基序列變異。藉由此種引子合成之FR中導入鹼基序列之變異。胺基酸經置換之變異型抗體對於抗原之結合活性以上述方法測定並評價，藉此可選擇具有所需性質之變異FR序列(Cancer Res.,(1993)53,851-856)。
且，將具有人類抗體基因全部之庫之基因轉 殖動物(參考國際公開WO1993/012227、WO1992/003918、WO1994/002602、WO1994/025585、WO1996/034096、WO1996/033735)作為免疫動物，藉由DNA免疫可取得所需之人類抗體。
再者，使用人類抗體庫，藉由淘洗取得人類 抗體之技術亦為已知。例如以人類抗體之V區域作為單鏈抗體(scFv)藉由嗜菌體展示法(phage display method)於嗜菌體表面表現。可選擇表現結合至抗原之scFv之嗜菌體。藉由解析所選擇之嗜菌體之基因，可決定編碼結合至抗原之人類抗體之V區域之DNA序列。決定結合至抗原之scFv之DNA序列後，藉由將該V區域序列以框架內與所需之人類抗體C區域之序列融合後，插入適當表現之載體中，可製得表現載體。該表現載體導入如上述列舉之較佳表現細胞中，藉由使編碼該人類抗體之基因表現而取 得該人類抗體。該等方法既為已知(參考國際公開WO1992/001047、WO1992/020791、WO1993/006213、WO1993/011236、WO1993/019172、WO1995/001438、WO1995/015388)。
且作為取得抗體基因之方法，除上述以外， 亦可適當使用如Bernasconi等人(Science(2002)298,2199-2202)或WO2008/081008中記載之B細胞選殖(用於個別抗體之編碼序列之鑑定及選殖、其單離及個別抗體(尤其是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)之製作所用之用於表現載體構築之使用等)之方法。
是否阻礙蛋白C之活性化可依據習知方法確 認。例如使阻礙蛋白C之活性化之候補物質與蛋白C接觸後，添加凝血酶及凝血酶調節素，開始凝血酶之蛋白C活性化反應。隨後，停止蛋白C之活性化反應。測定因凝血酶而活性化之蛋白C之活性，可確認該候補物質是否能阻礙蛋白C之活性化。具體如實施例4所記載。
由上述方法所得之蛋白C之活性化阻礙物質可依據常用方法製劑化作成醫藥組成物。
本發明之醫藥組成物中，進而亦可與阻礙活性化蛋白C之活性之物質組合使用，且蛋白C之活性化阻礙物質亦可同時具有阻礙活性化蛋白C之活性化之活性。
本發明中所謂「活性化蛋白C之活性阻礙」或「阻礙活性化蛋白C之活性」意指阻礙因活性化蛋白C 引起之活性化凝固第V因子或活性化凝固第VIII因子之不活性化。至於阻礙活性化蛋白C之活性的物質，舉例有例如阻礙活性化蛋白C與活性化凝固第V因子或活性化凝固第VIII因子之結合之物質。具體舉例為例如抗活性化蛋白C抗體、抗活性化凝固第V因子抗體、抗活性化凝固第VIII因子抗體、活性化蛋白C部分胜肽、活性化凝固第V因子之部分胜肽、活性化凝固第VIII因子之部分胜肽、與該等顯示同樣活性之低分子化合物等。
本發明中所謂「與阻礙活性化蛋白C之活性 之物質組合使用」意指使阻礙蛋白C之活性化之物質與阻礙活性化蛋白C之活性之物質，同時、分別或依序投予所用之組合。阻礙蛋白C之活性化之物質與阻礙活性化蛋白C之活性之物質可包含於一個醫藥組成物中，亦可包含於不同醫藥組成物中。再者，亦可為以包含阻礙蛋白C之活性化的物質之醫藥組成物與包含阻礙活性化蛋白C之活性的物質之醫藥組成物所構成而包含之套組。
且，阻礙蛋白C之活性化的物質同時作為阻礙活性化蛋白C之活性之物質，舉例為例如抗體。具體可舉例為例如上述之抗蛋白C抗體中進而具有阻礙活性化蛋白C之活性的作用之抗體作為較佳之抗體。更具體舉例為與蛋白C及活性化蛋白C結合之抗體。
是否阻礙活性化蛋白C之活性可依據習知方法確認。例如使阻礙活性化蛋白C之活性之候補物質與活性化蛋白C接觸後，添加活性化凝固第V因子，開始活 性化蛋白C之活性化凝固第V因子之不活性化反應。隨後，藉由添加活性化血液凝固第X因子及凝血酶原(prothrombin)而開始活性化凝固第V因子依存性之凝血酶生成，測定生成之凝血酶活性，可確認該候補物質是否能阻礙活性化蛋白C之不活性化。具體如實施例3所記載。
本發明中之醫藥組成物由於所含有之阻礙蛋 白C之活性化的物質具有阻礙因活性化蛋白C引起之抗血液凝固作用、促進血液凝固之作用，故可利用於阻礙因活性化蛋白C引起之抗血液凝固作用，或者促進止血作用。且藉由促進該血液凝固之作用，可利用於因血液凝固功能降低引起之出血性疾病之治療。作為此種疾病可舉例為例如出血、伴隨出血之疾病、或因出血引起之疾病等。 具體舉例為血友病、後天性血友病、溫偉伯氏因子(vWF)之功能異常或缺損所引起之溫偉伯氏疾病、後天性溫偉伯氏疾病等。
因此，本發明提供含有蛋白C之活性化阻礙 物質之用以阻礙抗血液凝固作用之醫藥組成物、用以促進止血作用之醫藥組成物、或用以治療出血性疾病之醫藥組成物。
本發明之醫藥組成物可藉由經口、非經口投 予之任一種對病患投予。較佳為非經口投予。作為該投予方法具體舉例為注射投予、經鼻投予、經肺投予、經皮投予等。作為注射投予之例舉例為例如藉由靜脈內注射、肌 肉內注射、腹腔內注射、皮下注射等將本發明之醫藥組成物進行全身性或局部投予。且，可根據患者年齡、症狀而選擇適當投予方法。作為投予量可選擇例如關於一次投予體重每1kg自0.0001mg至1000mg之範圍之投予量。或者，例如可選擇每患者自0.001至100000mg/個體之範圍之投予量。然而，本發明之醫藥組成物不限制於該等投予量。
本發明之醫藥組成物可依據常用方法製劑化 (例如Remington’s Pharmaceutical Science,latest edition,Mark Publishing Company,Easton,U.S.A.)，亦可一起含有醫藥上容許之擔體或添加劑。醫藥上容許之擔體及添加劑舉例有例如界面活性劑、賦形劑、著色料、著香料、保存料、安定劑、緩衝劑、懸浮劑、等張化劑、結合劑、崩解劑、滑澤劑、流動性促進劑、矯味劑等。再者不限制於該等，可適當使用其他常用之擔體或添加劑。作為擔體可具體舉例為輕質矽酸酐、乳糖、結晶纖維素、甘露醇、澱粉、羧甲基纖維素鈣、羧甲基纖維素鈉、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚乙烯乙縮醛二甲胺基乙酸酯、聚乙烯吡咯啶酮、明膠、中鏈脂肪酸三酸甘油酯、聚氧乙烯硬化蓖麻油60、白糖、羧甲基纖維素、玉米澱粉、無機鹽類等。
又，根據需要，本發明之抗體可封入微膠囊(羥甲基纖維素、明膠、聚[甲基甲基丙烯酸]等之微膠囊)中，作成膠體藥物輸送系統(微脂體、白蛋白微球、 微乳液、奈米粒子及奈米膠囊等)(參見“Remington’s Pharmaceutical Science 16th edition”,Oslo Ed(1980)等)。再者，將藥劑作成緩釋性藥劑之方法亦為已知，可應用於本發明抗體(Langer et al.,J.Biomed.Mater.Res.15：267-277(1981)；Langer,Chemtech.12：98-105(1982)；美國專利第3,773,919號；歐洲專利申請公開(EP)第58,481號；Sidman et al.,Biopolymers 22：547-556(1983)；EP第133,988號)。
且本發明提供用以預防及/或治療出血、伴隨 出血之疾病或起因於出血之疾病之方法，其包含投予本發明之抗體或組成物。抗體或組成物之投予例如可藉前述方法實施。
再者本發明提供用於上述方法之套組，其至 少包含本發明之抗體或組成物。此外，該套組中，亦可預先封入注射筒、注射針、藥學上容許之媒劑、酒精棉布、絆創膏或記載使用方法之說明書等。
又本發明關於含有本發明之蛋白C之活性化 阻礙物質之醫藥組成物之使用於製造預防及或/治療出血、伴隨出血之疾病或起因於出血之疾病之藥劑之用途。
且本發明亦關於出血、伴隨出血之疾病或起 因於出血之疾病之預防及/或治療用之本發明之多重特異性抗原結合分子或雙重特異性抗體或組成物。
又本說明書中引用之所有先前技術文獻將作為參考併入本說明書中。
〔實施例〕
藉由實施例更詳細說明本發明，但本發明不限於此。各種變更、修飾為本技藝者可進行，該等變更、修飾均包含於本發明。
〔實施例1〕小鼠蛋白C之製作
自小鼠肝臟藉由PCR法擴增涵蓋小鼠蛋白C之全長轉譯區域之cDNA。以此作為模板，進而於C末端賦予FLAG標籤並藉由PCR法擴增基因，對表現載體進行次選殖。將該表現載體轉染至CHO細胞並進行培養。自所得培養上清液依據常用方法純化小鼠蛋白C-Flag蛋白。
〔實施例2〕抗小鼠蛋白C大鼠抗體之製作
將實施例1製作之小鼠蛋白C-Flag蛋白(0.1mg/隻)與Freund’s完全佐劑(FCA，Difco Laboratories，現為Becton Dickinson Co)混合，並接種於SD大鼠(2隻，日本Charles River股份有限公司)之單腳的足跖(footpad)上。接種2週後，由免疫大鼠摘出髂間淋巴結(iliac lymph node)。使用摘出之淋巴結細胞，依據常用方法，製作融合瘤。使用融合瘤之培養上清液，以ELISA測定融合瘤所產生之抗體對於小鼠蛋白C-Flag與Flag蛋白質之結合活性。選擇產生對小鼠蛋白C顯示特異結合活性之抗體之融合瘤。培養所選擇之融合瘤，由培養上清液 依據常用方法純化抗小鼠蛋白C抗體。關於純化抗體，以實施例3、4記載之方法等實施篩選，選擇MP35及MP51作為阻礙小鼠蛋白C之活性化及/或阻礙活性化蛋白C活性之抗體。
〔實施例3〕抗小鼠蛋白C抗體MP35及MP51對於由小鼠活性化蛋白C引起之FVa不活性化之效果 (方法) (1)試藥之調製
‧將抗小鼠蛋白C抗體以含0.1%牛血清白蛋白之TRIS緩衝生理食鹽水(TBSB)調製成15、50μg/mL。
‧水蛭素(hirudin)(Merck KgaA)以TBSB調製成10IU/mL。
‧小鼠蛋白C-Flag、人類α凝血酶(Enzyme Research Laboratories)、兔子凝血酶調節素(American Diagnostica)、人類活性化凝固第X因子(FXa，Enzyme Research Laboratories)、人類活性化凝固第V因子(FVa，Enzyme Research Laboratories)及人類凝血酶原(Enzyme Research Laboratories)以含104μM之磷脂質溶液(10%磷脂絲胺酸/60%磷脂膽鹼/30%磷脂乙醇胺(Avanti Polar Lipids)；依據Okuda,M.& Yamamoto,Y.Clin.Lab.Haem.26,215-223(2004)調製)、8.3mM之CaCl2、1.7mM之MgCl2之TBSB(TBCP)，分別調製成24.8μg/mL、1.48μg/mL、14.8μg/mL、9.66ng/mL、2.25 ng/mL及50μg/mL。
‧小鼠活性化蛋白C係藉由將24.8μg/mL之小鼠蛋白C-Flag、1.48μg/mL之人類α凝血酶、14.8μg/mL之兔子凝血酶調節素各以等量混合，於37℃培育120分鐘後，添加混合溶液之三分之一容量之10U/mL水蛭素而製作。以TBSB將其稀釋至3333倍。
‧S-2238(CHROMOGENIX)以純化水溶解成4mM後，再以純化水稀釋1.6倍。
(2)分析
於96孔盤中，混合(1)所調製之小鼠活性化蛋白C5μL及0.5、1.5、5、15、50、150、500μg/mL之抗小鼠蛋白C抗體5μL，於室溫培育30分鐘。(抗體未添加群係以TBSB 5μL代替抗體溶液而混合。且小鼠活性化蛋白C及抗體未添加群中，替代該等而與TBCP 5μL及TBSB 5μL混合)。
接著，於室溫添加2.25ng/mL之FVa 5μL，開始FVa不活性化反應。15分鐘後，為了評價殘存FVa活性，而添加9.66ng/mL之人類FXa 5μL及50μg/mL之人類凝血酶原5μL，開始FVa濃度依存之凝血酶生成反應。10分鐘後，添加0.5M之EDTA 5μL停止凝血酶生成反應。為了測定所生成之凝血酶活性，而添加顯色基質溶液S-2238 5μL，開始顯色反應。15分鐘顯色反應後，使用SpectraMax 340PC384(Molecular Devices)測定405nm之 吸光度變化。
(結果)
抗小鼠蛋白C抗體MP35或MP51吸光度均上升(圖1)。因此，顯示MP35及MP51均阻礙因小鼠活性化蛋白C引起之FVa不活化。
〔實施例4〕抗小鼠蛋白C抗體MP35及MP51對於因凝血酶/凝血酶調節素複合體引起之小鼠蛋白C活性化之效果 (方法) (1)試藥之調製
‧抗小鼠蛋白C抗體及水蛭素分別以TBSB調製成120μg/mL及75U/mL。
‧小鼠蛋白C-Flag、人類α凝血酶、兔子凝血酶調節素分別以TBCP調製成24.8μg/mL、14.8μg/mL及14.8μg/mL。
‧Spectrozyme aPC(American Diagnostica)以純化水溶解成5mM後，再以純化水稀釋6.25倍。
(2)分析
於96孔盤中，混合120μg/mL之抗小鼠蛋白C抗體5μL及24.8μg/mL之小鼠蛋白C-Flag蛋白溶液5μL，於室溫培育30分鐘。(抗體未添加群係以TBSB 5μL代替抗 體溶液而混合)。
接著，於37℃添加14.8μg/mL之人類α凝血酶5μL及14.8μ/mL之兔子凝血酶調節素5μL，開始小鼠蛋白C活性化反應。120分鐘後，添加75U/mL之水蛭素10μL停止蛋白C活性化反應。為了測定所生成之活性化蛋白C之活性，而添加顯色基質溶液Spectrozyme aPC 10μL，開始顯色反應。45分鐘顯色反應後，使用SpectraMax 340PC384(Molecular Devices)測定405nm之吸光度變化。
(結果)
因添加抗小鼠蛋白C抗體MP51，吸光度降低。另一方面，即使添加MP35，亦未顯示吸光度變化(圖2)。因此，顯示MP51阻礙蛋白C活性化反應，但MP35則未阻礙。又，小鼠蛋白C活性化反應中之抗體濃度為40μg/mL。
〔實施例5〕抗小鼠蛋白C抗體對於添加蛋白C活性化物質之小鼠血漿中之凝血酶生成之效果 (方法) (1)試藥之調製
‧抗小鼠蛋白C抗體以TBSB調製成0.18、0.6、1.8、6、18、60及180μg/mL。
‧蛋白C活性化物質(製品名Protac，American Diagnostica Inc)以純化水溶解(6U/mL)，再以TBS調製成4U/mL。
(2)分析
於螢光測定用96孔盤(Thermo Fisher Scientific,Immulon 2HB“U”型底微滴定盤，3655)之各孔中，混合0.18、0.6、1.8、6、18、60及180μg/mL之抗小鼠蛋白C抗體25μL及小鼠檸檬酸血漿15μL，於室溫靜置15分鐘。(抗體未添加群係以TBSB 5μL代替抗體溶液而混合)。
接著，添加4U/mL之蛋白C活性化物質(製品名Protac，American Diagnostica Inc)40μL及凝固起始試劑的PPP-Reagent LOW(Thrombinoscope BV.)20μL，於37℃在室溫下靜置15分鐘。
又，為了測定蛋白C未以Protac活性化時之凝血酶生成，亦準備代替抗體溶液而添加同容量之TBSB、代替Protac而添加同容量之TBS之樣品。
隨後，將盤設於凝血酶生成螢光系統中，於37℃培育約5分鐘後，開始測定。(測定開始之同時，添加Fluo-基質及Fluo-緩衝液之混合溶液20μL)。
為了將自各樣品所得之螢光強度換算成凝血酶量，在同一盤內液設定於小鼠血漿15μL與TBSB 25μL之混合液中添加凝血酶校正劑(Thrombin Calibrator)(Thrombinoscope BV.)20μL代替凝固起始試藥之孔。
又，凝血酶生成螢光系統專用解析軟體Thrombinoscope software version 3.0.0.29(Thrombinoscope BV.)之設定條件如下。
‧Fluo-基質及Fluo-緩衝液之混合溶液量(設定項目Dispense)：20μL
‧攪拌時間(設定項目Shake)：10秒
‧測定時間(設定項目Totaltime)：60分鐘
‧測定間隔(設定項目Interval)：20秒
‧激發波長(自動設定)：390nm
‧螢光波長(自動設定)：460nm
使用所算出之凝血酶生成起始時間(持續時間(min))及最大凝血酶生成量(波峰高度(nmol/L))，評價小鼠血漿中之抗小鼠蛋白C抗體之活性化蛋白C活性阻礙能。
(結果)
抗小鼠蛋白C抗體對於添加蛋白C活性化物質(Protac)之正常小鼠血漿之凝血酶生成之效果示於圖3A。藉由於正常小鼠血漿中添加Protac，持續時間自2.0分鐘延長至2.4分鐘，波峰高度自53nM減少至22nM，故確認以Protac生成之活性化蛋白C在本血漿中顯示抗凝固作用。抗小鼠蛋白C抗體MP35、MP51均用量依存地縮短Protac添加時之持續時間並增加波峰高度。
同樣地，關於FVIII缺乏小鼠血漿亦進行評價(圖 3B)。藉由於FVIII缺乏小鼠血漿添加Protac，持續時間自2.2分鐘延長至2.5分鐘，波峰高度自33nM減少至15nM，故確認以Protac生成之活性化蛋白C在本血漿中顯示抗凝固作用。MP35、MP51均濃度依存地縮短Protac添加時之持續時間並增加波峰高度。
因此，於正常小鼠血漿或FVIII缺損小鼠血漿中，MP35及MP51藉由阻礙活性化蛋白C之抗凝固作用，而顯示具有促進凝固作用之潛能。
又，關於血漿中之小鼠活性化蛋白C阻礙活性，與MP51相比，MP35顯示具有相等或其以上之活性。
〔實施例6〕FVIII缺損裸毛小鼠之製作
使FVIII缺損小鼠(B6；129S4-F8tmlKaz/Jmice)與裸毛小鼠(Crlj：CD1-Foxnlnu)交配，將無體毛之表現型導入FVIII缺損小鼠中。
〔實施例7〕抗小鼠蛋白C抗體對於使用FVIII缺損裸毛小鼠之穿刺出血模型之出血症狀之效果 (方法)
於血友病A小鼠之尾靜脈內投予媒劑(vehicle)(n=8)、3mg/kg之抗小鼠蛋白C抗體MP51(n=9)或30mg/kg之抗小鼠蛋白C抗體MP35(n=9)。在異氟烷麻醉下，於小鼠左右大腿內側部肌肉以23G注射針穿刺至3mm深度左右各兩處。於穿刺當天設為第0天，於第1天 及第2天測量自體表可目視之出血痕面積。第1天及第2天分別測量之出血痕面積作為對每個小鼠個體測定總和出血痕總面積之出血指標。
(結果)
媒劑群中，因穿刺之出血刺激，隨著時間經過出血痕總面積增加。於阻礙蛋白C活性化及阻礙活性化蛋白C之活性之抗小鼠蛋白C抗體MP51(3mg/kg)投予群，於第1天及第2天出血痕總面積之增加均受到抑制。另一方面，僅阻礙活性化蛋白C之活性之MP35(30mg/kg)投予群，與媒劑群同樣增加出血痕總面積(圖4)。因此，顯示阻礙蛋白C活性化及阻礙活性化蛋白C之活性之抗小鼠蛋白C抗體對於血友病A之出血症狀具有止血效果。
〔實施例8〕抗小鼠蛋白C抗體之抗原結合部位之解析 (方法)
使用西方墨點(WB)檢討MP35及MP51能辨識小鼠PC之輕鏈、重鏈之哪一者。小鼠PC([製品名]重組小鼠凝血因子XIV/蛋白C，[供給源]R&D Systems，[型錄編號]4885-SE)以人類凝血酶([製品名]人類α凝血酶，[供給源]Enzyme research Laboratories，[型錄編號]HT1002a)及兔子凝血酶調節素([製品名]兔子凝血酶調節素，[供給源]Haematologic Technologies，[型錄編 號]RTM-2020)活性化，將結果產生之小鼠活性化PC進行SDS-PAGE後，移至PVDF膜，與MP35或MP51反應。以二次抗體([製品名]HRP-山羊抗大鼠IgG(H+L)，[供給源]Life Technologies，[型錄編號]629520)與基質([製品名]SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate，[供給源]Thermo Fisher Scientific股份有限公司，[型錄編號]34076)檢測與MP35或MP51結合之蛋白。
(結果)
WB之結果，MP35顯示與15及20kDa間之蛋白質結合。該蛋白質由分子量及N末端序列確認為小鼠活性化PC之輕鏈。另一方面，MP51顯示與37及50kDa間之蛋白質結合。該蛋白質由分子量及N末端序列確認為活性化小鼠PC之重鏈。因此，顯示MP35辨識小鼠PC/小鼠活性化PC之輕鏈，MP51辨識其重鏈。
〔實施例9〕抗小鼠蛋白C人類抗體之製作
使用實施例1製作之小鼠蛋白C蛋白，自人源(human naive)抗體庫，藉由嗜菌體展現法，濃縮與小鼠蛋白C結合之展現嗜菌體。選擇對於小鼠蛋白C顯示特異結合活性之展現嗜菌體，自其擴增抗體可變區域基因。依據常用方法，作為基因重組IgG予以表現、純化。關於純化抗體，以實施例3、4記載之方法等實施篩選， 選擇L2及L12作為阻礙小鼠蛋白C之活性化及/或阻礙活性化蛋白C活性之抗體。
〔實施例10〕抗小鼠蛋白C抗體L2及L12對於因小鼠活性化蛋白C引起之FVa不活性化之效果 (方法)
依據實施例3之方法。
(結果)
抗小鼠蛋白C抗體L2或L12吸光度均上升(圖5)。因此顯示L2及L12均可阻礙因小鼠活性化蛋白C引起之FVa不活化。又，小鼠蛋白C活性化反應中之抗體濃度為15或50μg/mL。
〔實施例11〕抗小鼠蛋白C抗體L2及L12對於因凝血酶/凝血酶調節素複合體引起之小鼠蛋白C活性化之效果 (方法)
依據實施例4之方法。
(結果)
因添加抗小鼠蛋白C抗體L12，吸光度降低。另一方面，即使添加L2，亦未顯示吸光度變化(圖6)。因此，顯示L12阻礙蛋白C活性化反應，但L2則未阻礙。又，小鼠蛋白C活性化反應中之抗體濃度為30μg/mL。
〔產業上之可利用性〕
依據本發明，可阻礙或抑制因蛋白C引起之 抗血液凝固作用、促進血液凝固作用．止血作用。因此，依據本發明，可開發對於出血性疾病之新穎治療藥及新穎治療法。

Claims (2)

  1. 一種抗蛋白C抗體在製備用於減少起因於血友病A之出血之醫藥組成物之用途，其中該抗蛋白C抗體阻礙蛋白C轉化成活性化蛋白C，且抑制經活化的蛋白C之對(a)活性化凝固第VIII因子、或(b)活性化凝固第V因子、或(a)及(b)去活性化的能力，其中抗蛋白C抗體係結合於蛋白C之重鏈的抗體。
  2. 一種抗蛋白C抗體在製備用於阻礙起因於活性化蛋白C之抗血液凝固作用之醫藥組成物之用途，其中該抗蛋白C抗體阻礙蛋白C轉化成活性化蛋白C，且抑制經活化的蛋白C之對(a)活性化凝固第VIII因子、或(b)活性化凝固第V因子、或(a)及(b)去活性化的能力，其中抗蛋白C抗體係結合於蛋白C之重鏈的抗體。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019009407A1 (ja) * 2017-07-07 2019-01-10 第一三共株式会社 抗プロテインｃ抗体
US20210355231A1 (en) * 2018-09-06 2021-11-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Treatment and prevention of hemophilic arthropathy with an antibody against endothelial cell protein c receptor (epcr)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995034652A1 (en) * 1994-06-10 1995-12-21 Oklahoma Medical Research Foundation Calcium binding recombinant antibody against protein c

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
GB8327860D0 (en) * 1983-10-18 1983-11-16 Fujisawa Pharmaceutical Co Monoclonal antiprotein c antibody
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
CA2006684C (en) * 1988-12-30 1996-12-17 Charles T. Esmon Monoclonal antibody against protein c
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
WO1992020791A1 (en) 1990-07-10 1992-11-26 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
ES2108048T3 (es) 1990-08-29 1997-12-16 Genpharm Int Produccion y utilizacion de animales inferiores transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
DK0605522T3 (da) 1991-09-23 2000-01-17 Medical Res Council Fremgangsmåde til fremstilling af humaniserede antistoffer
WO1993009804A1 (en) * 1991-11-18 1993-05-27 The Scripps Research Institute Serine protease derived-polypeptides and anti-peptide antibodies, systems and therapeutic methods for inhibiting coagulation
ES2227512T3 (es) 1991-12-02 2005-04-01 Medical Research Council Produccion de anticuerpos contra auto-antigenos a partir de repertorios de segmentos de anticuerpos fijados en un fago.
CA2124967C (en) 1991-12-17 2008-04-08 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
JP3507073B2 (ja) 1992-03-24 2004-03-15 ケンブリッジ アンティボディー テクノロジー リミティド 特異的結合対の成員の製造方法
AU4784693A (en) * 1992-07-24 1994-02-14 Oklahoma Medical Research Foundation Blockade of protein c activation reduces microvascular surgical blood loss
CA2140638C (en) 1992-07-24 2010-05-04 Raju Kucherlapati Generation of xenogeneic antibodies
US5648267A (en) 1992-11-13 1997-07-15 Idec Pharmaceuticals Corporation Impaired dominant selectable marker sequence and intronic insertion strategies for enhancement of expression of gene product and expression vector systems comprising same
CA2161351C (en) 1993-04-26 2010-12-21 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
GB9313509D0 (en) 1993-06-30 1993-08-11 Medical Res Council Chemisynthetic libraries
EP0731842A1 (en) 1993-12-03 1996-09-18 Medical Research Council Recombinant binding proteins and peptides
EP0770628B9 (en) 1994-07-13 2007-02-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Reconstituted human antibody against human interleukin-8
CA2219361C (en) 1995-04-27 2012-02-28 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
EP0823941A4 (en) 1995-04-28 2001-09-19 Abgenix Inc HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES
TW200407335A (en) * 2002-07-22 2004-05-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Non-neutralizing antibody to inhibit the inactivation of activated protein C
CN103408661B (zh) 2007-01-05 2016-04-06 苏黎世大学 提供疾患特异性结合分子和靶的方法
AU2008316661B2 (en) 2007-10-26 2013-05-23 Oklahoma Medical Research Foundation Monoclonal antibodies against activated and unactivated protein C

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995034652A1 (en) * 1994-06-10 1995-12-21 Oklahoma Medical Research Foundation Calcium binding recombinant antibody against protein c

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
F.B.Taylor,Jr. et al.;"Protein C Prevents the Coagulopathic and Lethal Effects of Escherichia coli Infusion in the Baboon";Journal of Clinical Investiga,1987,vol.79,no.3,pages 918~925. *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2015041310A1 (ja) 2015-03-26
US20160229922A1 (en) 2016-08-11
EP3047857A1 (en) 2016-07-27
JP6445440B2 (ja) 2018-12-26
EP3047857A4 (en) 2017-08-09
TW201609131A (zh) 2016-03-16
JPWO2015041310A1 (ja) 2017-03-02
US20190248921A1 (en) 2019-08-15

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