KR20210058811A - 고친화도, 이소형-선택적 TGFβ1 억제제 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

고효력으로 TGFβ1을 선택적으로 억제할 수 있는 모노클로날 항체 및 그의 항원-결합 단편이 본원에 개시된다. 관련 조성물, 방법 및 치료 용도가 또한 개시된다.

Description

고친화도, 이소형-선택적 TGFβ1 억제제 및 그의 용도

관련 출원

본 출원은 각각 발명의 명칭이 "고친화도, 콘텍스트-비의존성 TGFβ1 억제제 및 그의 용도"인 2018년 7월 11일에 출원된 미국 가출원 62/696,752; 2018년 8월 13일에 출원된 62/718,196; 2018년 9월 27일에 출원된 62/737,534; 2018년 11월 9일에 출원된 62/758,180; 2019년 2월 25일에 출원된 62/810,263, 및 2019년 4월 1일에 출원된 62/827,552를 우선권 주장하며, 이들 각각의 내용은 명백하게 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

서열 목록

본원은 ASCII 포맷으로 전자 제출된 서열 목록을 함유하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 2019년 7월 11일에 생성된 상기 ASCII 카피는 127036-03520_SL.txt로 명명되고, 261,252 바이트 크기이다.

형질전환 성장 인자 베타 1 (TGFβ1)은 2종의 다른 구조적으로 관련된 이소형, 즉 각각 별개의 유전자에 의해 코딩되는 TGFβ2 및 TGFβ3과 함께, 성장 인자의 TGFβ 슈퍼패밀리의 구성원이다. 이들 TGFβ 이소형은 항상성 및 질환 콘텍스트 둘 다에서 세포 증식, 분화, 면역조정 (예를 들어, 적응 면역 반응), 및 다른 다양한 생물학적 과정을 조절하는 다면발현성 시토카인으로서 기능한다. 3종의 TGFβ 이소형은 동일한 세포-표면 수용체를 통해 신호를 전달하고, SMAD2/3 경로를 포함하는 유사한 정규 하류 신호 전달 사건을 촉발한다. 그러나, 마우스에서의 유전자 녹아웃 연구는 다양한 표현형을 나타내며, 이는 각각의 이소형이 생체내에서 별개의 역할을 한다는 것을 시사한다. 이는 부분적으로 3종의 이소형의 차등 발현 패턴에 의해 달성될 수 있다.

면역계 내에서, T 세포는 TGFβ에 대한 주요 직접 표적으로서 인식된다. TGFβ 신호전달은 이펙터 세포 증식, 뿐만 아니라 이펙터 및 조절 T 세포 분화의 조절에 중요하다. 예를 들어, TGFβ는 Th1 및 Th2 이펙터 T 세포의 강력한 억제자이다. 세포독성 T 세포의 이펙터 기능은 또한 다중 메카니즘을 통해 TGFβ에 의해 억제되는 것으로 제시된 바 있다. 더욱이, 증거는 면역계의 다른 세포 유형, 예컨대 수지상 세포, 예컨대 랑게르한스 세포, 및 자연 킬러 (NK) 세포가 또한 TGFβ 신호전달 경로에 의해 조절된다는 것을 나타낸다. TGFβ 조절이상은 다수의 질환 상태, 예컨대 암, 섬유증 및 면역 장애와 연관되었다.

세포외 매트릭스가 소정의 역할을 하는 많은 생물학적 과정은 TGFβ 신호전달과 연관된다. 몇몇을 들자면, TGFβ는 상처 치유, 종양 침습 및 전이, 뿐만 아니라 섬유증 진행에 연루되었다.

이들 및 다른 이유로, TGFβ는 면역 장애, 다양한 증식성 장애 및 섬유화 상태의 치료를 위한 매력적인 치료 표적이었다. 그러나, 래트 및 개에서의 경우를 포함한 전임상 연구로부터의 관찰은 생체내 TGFβ의 전신 억제와 연관된 심각한 독성을 밝혀냈다. 더욱이, 여러 TGFβ 억제제가 지금까지 개발되었지만, TGFβ를 표적화하는 대부분의 임상 프로그램은 심각한 부작용의 위험으로 인해 중단되었다 (예를 들어, WO 2017/156500에 요약됨). 따라서, 암 및 섬유증과 같은 질환의 진행에서의 TGFβ 신호전달의 관여를 가리키는 일련의 직접 및 간접 증거에도 불구하고, 안전하고 효과적인 것으로 여겨지는 시판 입수가능한 TGFβ 치료제는 지금까지 존재하지 않는다.

이전에, 본 출원인은 성장 인자 신호전달을 조정하는 신규 작용 메카니즘으로 기능하는 모노클로날 항체의 부류를 기재하였다 (예를 들어, WO 2014/182676 참조). 이들 항체는, TGFβ1이 프로도메인 및 성장 인자로 구성된 잠복 전구-단백질 복합체로서 발현되며, 이는 잠복 복합체로부터 성장 인자를 방출하는 활성화 단계를 필요로 한다는 사실을 활용하도록 설계되었다. 신규 부류의 억제 항체는, 활성화 후 성숙 성장 인자 자체를 직접 표적화하는 전통적인 접근법 (예컨대 중화 항체)을 취하기 보다는, 불활성 전구-전구단백질 복합체 자체를 특이적으로 표적화하여 리간드-수용체 상호작용의 상류인 활성화 단계를 선제적으로 차단한다. 이러한 독특한 작용 메카니즘은 이들이 공급원에서 작용한다는, 즉 활성화가 일어나기 전 질환 미세환경 내에서 잠복 프로TGFβ1 복합체를 표적화함으로써 작용한다는 점에서 공간적 및 시간적 이익 둘 다를 달성하기 위한 이점을 제공할 것으로 추론되었다.

이러한 접근법을 사용하여, TGFβ1에 이소형-선택적 방식으로 특이적으로 결합하고 그의 활성화 단계 (즉, 잠복 복합체로부터의 성숙 성장 인자의 방출)를 억제하는 모노클로날 항체를 생성하였다 (WO 2017/156500 참조). 그 안에 제시된 데이터는 TGFβ의 이소형-특이적 억제 (범-억제와 대조적으로)가 생체내 TGFβ를 길항하는 개선된 안전성 프로파일을 제공할 수 있다는 개념을 지지한다. 이를 고려하여, 본 출원인은 이어서 i) 이소형-특이적이고; ii) 상이한 제시 분자와 연관된 다중 TGFβ1 신호전달 복합체를 광범위하게 표적화할 수 있는 것 둘 다인 TGFβ1 억제제를 다면적 TGFβ1 효과 및 그의 조절이상에 의해 구동되는 상태를 위한 치료제로서 개발하고자 하였다.

이러한 항체는 후속적으로 PCT/US2018/012601 (2018년 1월 5일에 출원됨)에 기재되었다. 실제로, 그 안에 기재된 이소형-특이적 억제제는 ECM-연관 TGFβ1 및 면역 세포-연관 TGFβ1 둘 다를 표적화하여, 이소형-특이성을 유지하면서 다중 생물학적 콘텍스트에서 TGFβ1의 다중 공급원을 차단할 수 있었다. 이소형-선택적 TGFβ1 활성화 억제제의 효능 및 안전성을 제시하는 다수의 생체내 모델로부터의 데이터가 개시되었으며, 이는 이러한 억제제가 생체내에서 ECM-연관 TGFβ1 및 면역 세포-연관 TGFβ1 둘 다의 조절이상을 수반하는 질환의 치료에 유용하다는 것을 입증한다.

상기 언급된 이전의 연구는 각각의 공지된 프로TGFβ1 복합체 및 억제 활성을 표적화할 수 있는 항체의 유용성을 입증하였지만, 훨씬 더 높은 생체내 효력을 갖는 개선된 이소형-선택적 TGFβ1 억제제가 바람직하다.

본 개시내용은 고효력으로 TGFβ1 활성화를 억제할 수 있는 신규 부류의 고친화도, 이소형-선택적 항체를 제공한다. 이들은 고친화도로 다중 제시 분자-프로TGFβ1 복합체 ("대형 잠복 복합체" 또는 "LLC"로 지칭됨)를 표적화할 수 있는 항체 (이뮤노글로불린 및 그의 항원-결합 단편 또는 부분, 및 이러한 단편이 혼입된 조작된 분자 포함)를 포함한다. 이들 항체는 정교한 선택성 및 안전성 프로파일을 보유하고, 인간 상태에 대해 번역가능한 다수의 전임상 모델에서 개선된 생체내 효능을 달성하는 것으로 밝혀졌다. TGFβ1 억제제의 이들 속성은 TGFβ1 조절이상을 수반하는 질환의 치료를 위한 안전하고 효과적인 TGFβ1 치료제를 개발할 기회를 열어준다.

하기 선택 기준이 본 개시내용의 프로TGFβ1 항체를 생성하는데 고려되었다: 1) 이소형 선택성; 2) 인간 LLC, 예를 들어 LTBP1-프로TGFβ1, LTBP3-프로TGFβ1, GARP-프로TGFβ1 및 LRRC33-프로TGFβ1에 대한 고친화도; 3) 강건한 억제 효력; 4) 유리한 생체내 안전성/독성학 프로파일; 및 5) 인간 질환을 재현하는 전임상 모델에서의 생체내 효능. 추가적으로, 조합 요법 (예를 들어, 부가 요법)으로서 사용되는 TGFβ1 억제제의 유효성을 평가하는데 있어서, 상승작용적 효과를 달성하는 능력 (단순 상가적 효과와는 대조적으로)이 가늠되어야 한다. 이들 기준에 기초하여, 본 개시내용의 발명자들은 프로TGFβ1 복합체를 특이적으로 표적화하고 TGFβ1 활성화를 강력하게 차단할 수 있는 고친화도 모노클로날 항체 및 그의 단편의 부류를 확인하였다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 신규 항체는 모든 표적 LLC에 걸쳐 고친화도 (예를 들어, 나노몰 내지 나노몰 미만 범위의 KD)를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, 이러한 항체는 항체가 모든 표적 복합체에 대해 등가의 친화도를 갖도록 상이한 프로TGFβ1 복합체들에 걸쳐 비편향된다. 관련 조성물, 치료 용도, 제제, 제형, 과정 및 방법이 본 발명에 포괄된다.

따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명은 용액 평형 적정에 의해 측정시 ≤ 10 nM의 KD로 각각의 하기 인간 LLC 복합체에 결합할 수 있는 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다: LTBP1-프로TGFβ1, LTBP3-프로TGFβ1, GARP-프로TGFβ1 및 LRRC33-프로TGFβ1. 일부 실시양태에서, 항체는 ≤ 1 nM의 KD로 각각의 인간 LTBP1-프로TGFβ1 및 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 바람직하게는, 항체는 각각의 4종의 인간 LLC에 대해 ≤ 1 nM의 KD를 갖는다.

일부 실시양태에서, 항체 또는 단편은 프로TGFβ1의 잠복성 라쏘(Latency Lasso) 또는 그의 부분에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 단편은 성장 인자 도메인의 부분(들), 예컨대 핑거-1 및 핑거-2에 추가로 결합한다. 예를 들어, 항체 또는 단편은 잠복성 라쏘의 1개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프에 결합할 수 있다. 임의로, 에피토프는 성장 인자 도메인의 1개 이상의 아미노산 잔기를 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 이러한 에피토프는 조합 에피토프일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 프로TGFβ1 복합체와 회합되지 않은 유리 TGFβ1 성장 인자에 결합하지 않는다.

본 발명의 TGFβ1 억제제는 TGFβ1에 대한 억제 활성을 갖는다는 점에서 기능적 항체이다. 이러한 항체의 효력은 적합한 시험관내 효력 검정, 예컨대 본원에 기재된 세포-기반 리포터 검정에 의해 측정시 이소형-특이적이다. 따라서, 항체는 TGFβ2 또는 TGFβ3 대응물에 결합하거나 이를 억제하지 않는다.

본 발명의 TGFβ1 억제제는 잠복 LLC 복합체로부터의 성숙 성장 인자의 방출을 차단할 수 있다. 일부 실시양태에서, TGFβ1 억제제는 TGFβ1의 인테그린-의존성 활성화 및/또는 TGFβ1의 프로테아제-의존성 활성화를 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 칼리크레인, 플라스민 또는 MMP 프로테아제이다. 일부 실시양태에서, TGFβ1 억제제는 LLC에 대한 인테그린 결합을 차단하지 않으면서 인테그린-의존성 TGFβ1 활성화를 차단한다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 TGFβ1 억제제는 세포-연관 LLC (예를 들어, GARP-프로TGFβ1 및 LRRC33-프로TGFβ1)에 대한 이중 억제 작용 방식을 통해 기능할 수 있다. 한 메카니즘에서, 이러한 억제제는 막-앵커링된 GARP 및/또는 LRRC33과 연관된 TGFβ1의 활성화 단계를 차단한다. 제2 메카니즘에서, 이러한 억제제는 표적 결속시에 세포 표면으로부터의 LLC의 항체-의존성 내재화 (따라서 제거)를 유도하여, 함요에서 TGFβ1 신호전달을 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 항체가 산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높은 친화도로 프로TGFβ1 복합체에 결합하는 것을 특징으로 하는 pH-감수성 항체이다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 TGFβ1 억제제는 질환-연관 유전자, 예컨대 TGFB1, Acta2, Col1a1, Col3a1, Fn1, Itga11, Lox, Loxl2, CCL2 및 Mmp2의 발현을 감소시키는데 효과적이다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 TGFβ1 억제제는 생체내 하류 이펙터 SMAD2/3의 인산화를 감소시키는데 효과적이다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 TGFβ1 억제제는 TGFβ1-관련 적응증을 치료하는데 효과적이다. 이러한 적응증은 비정상적 유전자 발현을 수반하는 질환, ECM 조절이상을 수반하는 질환, 증가된 면역억제 세포 (예를 들어, Treg, MDSC 및/또는 M2 대식세포)를 특징으로 하는 질환, 중간엽 이행을 수반하는 질환, 프로테아제를 수반하는 질환, 비정상적 줄기 세포 증식 및/또는 분화와 관련된 질환 등을 포함하며, 이들 질환의 카테고리는 상호 배타적인 것으로 의도되지 않는다. 일부 실시양태에서, TGFβ1-관련 적응증은 증식성 장애, 예컨대 골수증식성 장애 및 고형 종양을 갖는 암이다. 일부 실시양태에서, TGFβ1-관련 적응증은 섬유화 장애, 예컨대 기관 섬유증이다. 암은 국부 진행성 종양/암 및 전이성 암을 포함하는 진행성 암일 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 TGFβ1 억제제는 질환 부위, 예컨대 종양 미세환경 및 섬유화 미세환경에서 면역억제 세포 집단의 수를 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역억제 세포 집단은 M2-분극화된 대식세포 및/또는 MDSC를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 TGFβ1 억제제는 종양 제어 (예를 들어, 부분 반응 및 완전 반응)를 달성하는데 효과적이며, 여기서 종양은 임의로 면역억제 (예를 들어, 면역-배제된) 표현형이다. 일부 실시양태에서, TGFβ1 억제제는 암 요법, 예컨대 체크포인트 차단 요법, 화학요법 및 방사선 요법과 함께 사용되는 경우에 상승작용적 항종양 효과를 달성할 수 있다. 체크포인트 차단 요법은, 예를 들어 항-PD-(L)1 항체(들)를 포함할 수 있다. 이러한 조합 요법에서, TGFβ1 억제제는 치료 저항성 (예를 들어, 1차 저항성)을 극복하여, 암을 암 요법에 보다 감수성이게 할 수 있다. 따라서, TGFβ1 억제제는 대상체에서 면역억제 종양을 포함하는 암의 치료에 사용될 수 있다. 대상체는 i) 암 요법, 예컨대 체크포인트 억제제에 대한 1차 비-반응자일 수 있거나; 또는 ii) 적어도 1종의 체크포인트 억제제가 요법으로서 규제 기관에 의해 승인되어 있는 암으로 진단된 자일 수 있다. 적어도 1종의 체크포인트 억제제가 승인되어 있는 암에 대한 반응률 (요법을 받은 자들 중 부분 반응자와 완전 반응자의 합)은 100% 미만이다. 전형적으로, 반응률은 약 10-60%이다. TGFβ1 억제제는 환자 집단 사이의 반응률을 증가시킬 수 있다. 추가로, 1차 반응자 중 부분 반응군 내에서, TGFβ1 억제제는 개선된 임상 이익을 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 1차 반응자 군 중에서, TGFβ1 억제제는 암 요법에 대한 획득 저항성의 비율을 감소시킬 수 있다. 면역억제 종양은 국부 진행성 암/종양 또는 전이성 암일 수 있다. 일부 실시양태에서, 암 요법은, 예를 들어 체크포인트 억제제 요법, 화학요법 및/또는 방사선 요법을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 TGFβ1 억제제는 고형 종양을 갖는 대상체에서 생존 이익을 달성하는데 효과적이며, 여기서 고형 종양은 임의로 국부 진행성 또는 전이성 암이다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 TGFβ1 억제제는 T 세포 기억 기능을 유도함으로써 지속적인 항종양 효과를 달성하는데 효과적이다. 따라서, TGFβ1 억제제는 질환의 재발생을 감소시키거나 지연시킬 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 TGFβ1 억제제는 TGFB1 및/또는 TGFb3을 우세하게 발현하는 종양에서 항종양 효과를 달성하는데 효과적이다. 일부 실시양태에서, TGFβ1 및 TGFβ3을 공동-발현하는 종양은 암종이다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 TGFβ1 억제제는 암 요법에 대한 종양의 1차 저항성을 극복할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 종양은 면역억제 세포 유형, 예컨대 조절 T 세포, M2-유형 대식세포 및/또는 골수-유래 억제 세포 (MDSC)에 의해 침윤된다. 치료시, 종양-연관 면역억제 세포 수의 감소 및 상응하는 항종양 이펙터 T 세포 수의 증가가 존재한다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 TGFβ1 억제제는 종양 내로의 이펙터 세포 침윤을 촉진한다. 일부 실시양태에서, 이펙터 세포는 종양의 혈관계를 통해 종양에 진입할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 TGFβ1 억제제는 이펙터 세포 확장 (예를 들어, 증식)을 촉진한다. 이는 적어도 부분적으로 GARP-양성 조절 T 세포의 억제에 의해 매개될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 TGFβ1 억제제는 골수섬유증을 치료하는데 효과적이다. 일부 실시양태에서, TGFβ1 억제제는 골수섬유증을 갖는 대상체의 골수의 항섬유화 효과를 달성한다. 일부 실시양태에서, TGFβ1 억제제는 특정 혈액 파라미터를 정규화하는데 효과적이다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 TGFβ1 억제제는 생체내 항섬유화 효과를 달성하는데 효과적이다. 항섬유화 효과는 확립된 섬유증의 역전을 포함할 수 있으며, 이는 부분적 역전 또는 완전한 역전일 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 TGFβ1 억제제는 전임상 안전성/독성학 연구에서 적어도 4주 동안 매주 투여되는 경우에 최대 100, 200 또는 300 mg/kg의 용량에서 내약성이 우수하다. 이러한 연구는 TGFβ 억제에 감수성인 것으로 공지된 동물 모델, 예컨대 래트 및 비-인간 영장류에서 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 TGFβ1 억제제는 TGFβ의 범-억제와 연관된 관찰가능한 독성, 예컨대 심혈관 독성 (예를 들어, 판막증) 및 상피 증식증 및 관련 기술분야에 공지된 다른 독성을 유발하지 않는다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 TGFβ1 억제제는 생체내 효능 연구에 의해 제시된 억제제의 유효량이 관찰가능한 독성을 유발하는 양 또는 농도보다 훨씬 낮다는 점 (예컨대 적어도 3배, 적어도 6배 또는 적어도 10배)에서 충분한 치료 범위를 달성한다. 일부 실시양태에서, 억제제의 치료 유효량은 1주에 약 1 mg/kg 내지 약 30 mg/kg이다.

도 1은 LN229 검정에서의 LTBP1-프로TGFβ 활성화의 억제를 보여주는 그래프이다.
도 2는 LN229 검정에서의 프로TGFβ1 복합체 활성화의 억제를 보여주는 그래프이다.
도 3은 SW480β6 검정에서의 GARP-프로TGFβ1 활성화의 억제를 보여주는 그래프이다.
도 4는 SW480β6 검정에서의 LRRC33-프로TGFβ1 활성화의 억제를 보여주는 그래프이다.
도 5a는 시험관내 TGFβ1의 칼리크레인-유도된 활성화에 대한 Ab3 및 Ab6의 억제 효과를 보여준다.
도 5b는 시험관내 TGFβ1의 플라스민-유도된 활성화에 대한 Ab3 및 Ab6의 억제 효과를 보여준다.
도 6은 LRRC33 및 프로TGFβ1로 형질감염된 이종 세포에서 Ab6 결합시에 LRRC33-프로TGFb1의 신속한 내재화를 보여주는 그래프를 제공한다.
도 7은 UUO 마우스에서 콜라겐 유전자 (Col1a1 및 Col3a1)의 발현에 대한 Ab6 또는 Ab3의 효과를 보여주는 2개의 그래프를 제공한다. 마우스를 3, 10 또는 30 mg/kg/주의 Ab3, 또는 3 또는 10 mg/kg/주의 Ab6으로 처리하였다. IgG 단독을 대조군으로서 사용하였다.
도 8은 UUO 마우스에서 Fn1 및 Loxl2 유전자의 발현에 대한 Ab3 또는 Ab6의 효과를 보여주는 2개의 그래프를 제공한다. 마우스를 3, 10 또는 30 mg/kg/주의 Ab3, 또는 3 또는 10 mg/kg/주의 Ab6으로 처리하였다. IgG 단독을 대조군으로서 사용하였다.
도 9는 UUO 모델에서의 처리 후 유전자 발현의 변화 (UUO + IgG 대비)의 통계적 유의성을 요약한다.
도 10은 클라우드만(Cloudman) S91 흑색종 모델에서, 항-PD-1과 조합된 30 mg/kg 또는 10 mg/kg의 Ab3의 투여 후, 시간 경과 (일)에 따른 퍼센트 생존을 보여주는 그래프이다. 항-PD-1 단독, 항-SR-AB3을 대조군으로서 사용하였다.
도 11a는 클라우드만 S91 흑색종 모델에서, 각각 항-PD-1과 조합된 30 mg/kg 또는 10 mg/kg의 Ab3 또는 Ab6의 투여 후, 시간 경과 (일)에 따라 측정된, 중앙값 종양 진행으로서 표현된 종양 성장의 변화 (종양 부피 mm³)를 보여주는 5개의 그래프를 제공한다. 항-PD-1 단독을 대조군으로서 사용하였다. 파선은 종양 궤양화로 인해 2000 mm³ 종점 기준에 도달하기 전에 희생시켜야 하는 동물을 나타낸다.
도 11b는 항-PD-1과 조합된 30 mg/kg 또는 10 mg/kg의 Ab3 (좌측) 또는 Ab6 (우측)의 투여 후 시간의 함수로서의 클라우드만 S91 중앙값 종양 부피를 보여주는 2개의 그래프를 제공한다. 항-PD-1 단독, Ab3 단독, Ab6 단독 및 IgG 단독을 대조군으로서 사용하였다.
도 11c는 (1) 대조군 IgG; (2) Ab6 단독; (3) 항-PD1 단독; (4) 항-PD1/Ab6 (3 mg/kg); (5) 항-PD1/Ab6 (10 mg/kg); 및 (6) 항-PD1/Ab6 (30 mg/kg)으로 처리된 마우스에서 시간의 함수로서의 S91 종양 부피의 변화를 보여주는 6개의 그래프를 제공한다. 2,000 mm³의 종점 종양 부피는 상부 점선으로 표시되어 있고; 500 mm³의 25% 한계값 부피는 하부 점선으로 제시되어 있다. 반응자는 종점 부피의 25% 미만의 종양 크기를 달성한 자로 정의되었다.
도 11d는 3개의 투여량 수준 (3, 10 및 30 mg/kg)의 Ab6과 항-PD-1의 조합으로 처리된 마우스에서 시간의 함수로서의 S91 종양 부피의 변화를 보여주는 3개의 그래프를 제공한다. 처리 후 지속적인 항종양 효과가 제시된다.
도 11e는 도 11c로부터의 중앙값 종양 부피로서 표현된 데이터를 요약한 그래프를 제공한다.
도 11f는 도 11c로부터의 시간 경과에 따른 각각의 처리군에서의 동물의 생존을 보여주는 그래프를 제공한다.
도 12는 MBT2 방광암 모델에서 인산화-대-총 SMAD2/3 비 (pSMAD/SMAD)를 보여주는 그래프이다. 동물을 하기와 같이 처리하였다: (1) 항-PD-1 항체 단독; (2) 항-PD-1 항체와 조합된 Ab5 (3 mg/kg); (3) 항-PD-1 항체와 조합된 Ab5 (10 mg/kg); (4) 항-PD-1 항체와 조합된 Ab3 (10 mg/kg); (5) 항-PD-1 항체와 조합된 Ab3 (30 mg/kg).
도 13a 및 13b는 항-PD-1과 조합된 30 mg/kg 또는 10 mg/kg의 Ab3 또는 3 mg/kg 또는 10 mg/kg의 Ab6의 투여 후 시간 경과 (일)에 따라 측정된 MBT2 종양 성장의 변화 (종양 부피 mm³)를 보여주는 5개의 그래프의 2개 세트를 제공한다. 항-PD-1 단독을 대조군으로서 사용하였다. 시간의 함수로서의 종양 부피의 변화가 로그 스케일 (도 13a) 및 선형 스케일 (도 13b)로 나타나 있다. 파선은 종양 궤양화로 인해 1200 mm³ 종점 기준에 도달하기 전에 희생시켜야 하는 동물을 나타낸다.
도 13c는 MBT2 동계 방광암 모델에서 항-PD-1과 조합된 30 mg/kg 또는 10 mg/kg의 Ab3 (좌측 상단) 또는 10 mg/kg 또는 3 mg/kg의 Ab6 (우측 상단)의 투여 후 시간의 함수로서의 중앙값 종양 부피를 보여주는 그래프를 제공한다. 항-PD-1 단독, Ab3 단독, Ab6 단독 및 IgG 단독을 대조군으로서 사용하였다. 제15일에서의 중앙값 종양 부피가 하부 그래프에 요약되어 있다.
도 13d는 MBT2 동계 방광암 모델에서 항-PD-1과 조합된 Ab6의 효과를 보여주는 5개의 그래프를 제공한다. 반응자는 연구 종료시에 종점 부피의 25% 미만의 종양 크기를 달성한 자로 정의된다.
도 14는 MBT2 동계 방광암 모델에서 항-PD-1과 조합된 10 mg/kg의 Ab3 또는 3 mg/kg 또는 10 mg/kg의 Ab6의 투여 후 시간 경과 (일)에 따른 퍼센트 생존을 보여주는 그래프이다. 항-PD-1 단독을 대조군으로서 사용하였다.
도 15는 종양 리-챌린지 연구에서 시간 경과 (일)에 따라 측정된 종양 성장의 변화 (종양 부피 mm³)를 보여주는 그래프의 세트를 제공한다. 이전에 항-PD-1/Ab3 또는 항-PD-1/Ab6으로 처리하여 종양이 제거된 동물 (완전 퇴행을 달성한 완전 반응자)을 MBT2 종양 세포로 리-챌린지하였다. 나이브, 비처리 동물을 대조군으로서 사용하였다. 파선은 종양 궤양화로 인해 1200 mm³ 종점 기준에 도달하기 전에 희생시켜야 하는 동물을 나타낸다.
도 16은 Ab5 Fab 결합이 프로TGFβ1의 영역 (영역 1 및 영역 2)에서 HDX 보호를 발생시킨다는 것을 보여주는 히트 맵이다.
도 17은 Ab5 결합시, HDX에 의해 측정시 용매 교환으로부터 보호된 프로TGFβ1 복합체의 영역을 예시한다 (도 16 참조).
도 18a는 프로TGFβ1 (C4S)에 대한 Ab6 Fab 결합의 보호 효과를 보여주는 히트 맵이다. 항체-항원 상호작용에 의해 영향을 받는 영역은 적색 박스 (1, 2a, 2b, 2c, 3, 4, 5a, 5b, 6a 및 6b)로 표시된다.
도 18b는 TGFβ1의 결정 구조에 오버레이된 HDX 데이터를 제공한다. 도 18a에서 확인된 영역이 제시된다.
도 19a는 통계적 분석 후 3개의 결합 영역 (영역 1, 영역 2 & 영역 3)의 확인을 예시한다. 영역 1은 프로TGFβ1의 프로도메인 내의 소위 "잠복성 라쏘"와 중첩되는 한편, 영역 2 및 3은 성장 인자 도메인 내에 있다.
도 19b는 Ab6 결합에 수반되는 3개의 결합 영역에 대한 프로TGFβ1의 다양한 도메인 및 모티프를 도시한다. 3종의 이소형 사이의 서열 정렬이 또한 제공된다.
도 20a-20d는 다양한 조직 및 세포에서의 TGFβ 이소형의 상대 RNA 발현을 보여준다. 도 20a는 다양한 인간 암 조직 대 정상 비교자에서의 TGFβ 이소형 발현 (암 유형별)을 보여준다. 도 20b는 33종 종양 유형의 10,000개 초과의 샘플로부터의 분석에 기초한 인간 암 유형별 TGFβ 이소형 발현의 빈도를 보여준다. 도 20c는 암 유형별 개별 종양 샘플에서의 TGFβ 이소형 발현을 보여준다. 도 20d는 마우스 동계 암 세포주 모델에서의 TGFβ 이소형 발현을 보여준다.
도 20e는 모든 제시 분자 (LTBP1, LTBP3, GARP 및 LRRC33)가 대부분의 인간 암 유형에서 고도로 발현된다는 것을 보여주는 4개의 유전자 발현 패널을 제공한다.
도 20f는 동계 마우스 종양 모델인 클라우드만 S91, MBT-2 및 EMT-6으로부터의 TGFβ 및 관련 신호전달 경로 유전자의 발현 분석을 제공한다.
도 20g는 클라우드만 S91, MBT-2 및 EMT-6 종양 모델에서 3종의 TGFβ 이소형의 ELISA에 의해 단백질 발현을 비교하는 3개의 그래프를 제공한다.
도 20h는 클라우드만 S91, MBT-2 및 EMT-6 종양 모델에서 제시 분자의 전체 종양 용해물 qPCR에 의해 RNA 발현 수준을 비교하는 그래프를 제공한다.
도 21a는 1-주 독성학 연구로부터의 범-TGFβ 항체로부터의 현미경적 심장 소견을 도시한다. 도 21b는 4-주 래트 독성학 연구로부터의 ALK5 억제제 또는 범-TGFβ 항체와 비교한 Ab3으로부터의 현미경적 심장 소견을 도시한다. 도 21c는 4-주 래트 독성학 연구로부터의 ALK5 억제제 또는 범-TGFβ 항체와 비교한 Ab6으로부터의 현미경적 소견을 도시한다.
도 22는 시간의 함수로서의 S91 중앙값 종양 부피를 보여주는 그래프를 제공한다. 조합 부문은 각각 항-PD-1 처리와 조합된 2가지 용량 수준의 4종의 상이한 이소형-선택적, 콘텍스트 비의존성 TGFβ1 억제제를 나타낸다.
도 23a-23b는 CD8+ 세포 마커로 염색된, S91 종양의 대표적인 면역조직화학 절편을 제공한다. 도 23a는 항-PD-1 단독으로 처리된 동물로부터의 종양 절편이다. 도 23b는 항-PD-1 및 대표적인 콘텍스트-비의존성 TGFβ1 억제제 둘 다로 처리된 동물로부터의 종양 절편이다.
도 24a-24d는 대식세포 마커로 염색된, S91 종양의 대표적인 면역조직화학 절편을 제공한다. 도 24a는 항-PD-1 단독으로 처리된 동물로부터의 종양 절편이다. 도 24b는 항-PD-1 및 대표적인 콘텍스트-비의존성 TGFβ1 억제제 둘 다로 처리된 동물로부터의 종양 절편이다. 도 24c는 대식세포 마커로서 항-F4/80을 사용하여 항-PD-1 및 Ab3 (30 mg/kg)으로 처리된 동물로부터의 종양 절편이다. 도 24d는 M2 대식세포 마커로서 항-CD163을 사용하는 절편이며, 이는 대부분의 세포가 CD163-음성이라는 것을 보여준다.
도 25는 항-PD-1 단독 처리된 동물과 비교하여, MBT2 종양에서 항-PD-1/Ab3으로의 1-주 처리 후 CD8+ T 림프구 유전자 (CD8α, 퍼포린 및 그랜자임 B)의 log2 배수 변화를 보여주는 그래프이다.
도 26a는 말초 인간 조절 T 세포에서의 GARP의 CD3/CD28-유도된 상향조절을 보여주는 FACS 데이터를 제공한다.
도 26b는 Teff 증식의 Treg-매개 억제에 대한 Ab3 또는 Ab6의 효과를 보여주는 그래프이다. IgG를 대조군으로서 사용하였다.
도 27a는 MBT2 종양에서 T 세포 하위집단을 분류하기 위한 게이팅 전략을 보여준다.
도 27b는 CD45+ 세포의 퍼센트로서 표현된, 제13일에서의 T 세포 하위집단을 보여주는 그래프의 세트를 제공한다.
도 28a는 MBT2 종양에서 골수 하위집단을 분류하기 위한 게이팅 전략을 제공한다.
도 28b는 제13일에서의 골수 세포 하위집단을 보여주는 그래프의 세트를 제공한다.
도 28c는 MBT-2에서의 종양-연관 대식세포가 세포 표면 LRRC33을 발현한다는 것을 보여주는 FACS 데이터를 제공한다.
도 28d는 MBT-2 종양-침윤 MDSC가 세포 표면 LRRC33을 발현한다는 것을 보여준다.
도 29a-29c는 MBT2 종양에서 Ab6 및 항-PD-1 처리의 효과를 보여주는 추가의 FACS 데이터 분석을 제공한다.
도 30a-30d는 종양내 CD8-양성 T 세포를 보여주는 대표적인 MBT2 종양 절편의 IHC 영상을 제공한다.
도 30e는 각각의 처리군에서 CD8-양성 세포의 분율로서 표현된, 도 30a 내지 도 30d로부터의 IHC 데이터의 정량화를 제공한다. 절편의 괴사 영역은 분석으로부터 배제하였다.
도 30f는 MBT2 종양에서 Ab6 및 항-PD-1 처리의 효과의 면역조직화학적 분석을 제공한다. 제시된 바와 같은 3개의 처리군으로부터의 동물에서 포스포-SMAD3 (상부 패널) 또는 CD8 및 CD31 (하부 패널)에 대해 종양 절편을 가시화하였다.
도 30g는 조합된 Ab6 및 항-PD-1이 CD8+ T 세포 동원 및 CD31+ 혈관으로부터의 MBT2 종양 내로의 침윤을 촉발하는 것으로 보인다는 것을 입증하는 데이터를 제공한다.
도 31a-31d는 제시된 바와 같은 4개의 처리군으로부터의 MBT2 종양으로부터 수집된 면역 반응 마커인 Ptprc (도 31a); CD8a (도 31b); CD4 (도 31c) 및 Foxp3 (도 31d)의 유전자 발현을 제공한다.
도 32a-32c는 표시된 바와 같은 제10일 및/또는 제13일에서의 이펙터 기능 마커인 Ifng (도 32a); Gzmb (도 32b); 및 Prf1 (도 32c)의 유전자 발현을 제공한다.
도 32d는 제10일에 MBT2 종양 샘플에서 qPCR에 의해 측정시 4종의 유전자 마커 (그랜자임 B, 퍼포린, IFNγ 및 Klrk1)의 발현을 보여주는 그래프의 세트를 제공한다. 각각의 그래프는 다음 3개의 처리군에서의 발현의 배수 변화를 제공한다: 항-PD-1 단독 (좌측); Ab6 단독 (중앙); 및 항-PD-1 및 Ab6의 조합 (우측).
도 33a는 용액 평형 적정-기반 검정 (MSD-SET)에 의해 측정시, 제시된 바와 같은 4종의 대형 잠복 복합체에 대한 Ab6의 시험관내 결합을 보여준다. 측정된 K_D 값 (피코몰 단위)은 우측에 제시되어 있다.
도 33b는 LN229 세포-기반 효력 검정을 예시하고, 표시된 바와 같은 4종의 대형 잠복 복합체에 대한 Ab6의 농도-의존성 효력을 보여주는 그래프를 제공한다. 또한, Ab6은 프로TGFβ3을 억제하지 않는다는 것을 보여준다.
도 34a는 EMT6에서 시간 경과에 따른 종양 성장/퇴행에 대한 항-PD1 및/또는 항-TGFβ3과 조합된 또는 조합되지 않은 Ab6의 효과를 보여주는 9개의 그래프의 세트를 제공한다 (연구 1). 각각의 그래프 내의 상부 점선은 2000 mm³의 종점 종양 부피를 나타내며, 각각의 그래프 내의 하부 점선은 종점 부피의 25% (즉, 500 mm³)를 나타낸다.
도 34b는 EMT6에서 시간 경과 (처리 개시 후 일수)에 따른 퍼센트 생존을 보여주는 그래프를 제공한다 (연구 1). 항-PD-1 및 Ab6 둘 다를 포함한 처리군은 항-PD-1 단독과 비교하여 유의한 생존 이익을 나타냈다.
도 34c는 EMT6에서 시간 경과 (처리 개시 후 일수)에 따른 퍼센트 생존을 보여주는 데이터를 제공한다 (연구 2). 항-PD-1 및 Ab6 둘 다를 포함하는 처리군은 항-PD-1 단독과 비교하여 유의한 생존 이익을 나타냈고, 항종양 효과는 치료 종료 후에 지속적이다.
도 34d는 EMT6 유방암 모델에서의 생존에 대한 항-PD-1 및 Ab6 조합의 효과를 제공한다.
도 35는 mRNA 수준 (좌측) 및 단백질 수준 (우측)에서 측정된, EMT6 종양에서의 3종의 TGFβ 이소형의 상대 발현을 보여주는 2개의 그래프를 제공한다.
도 36a는 뮤린 골수증식성 장애 모델에서 골수의 섬유화 표현형의 마커로서의 레티쿨린의 은 염색을 보여주는 조직학 영상의 세트를 제공한다.
도 36b는 2개의 별개의 반복 연구로부터의 높은 질환 부담을 갖는 MPL^W515L 마우스에서의 골수 섬유증의 조직병리학적 분석 및 TGFβ1 억제의 효과를 보여주는 2개의 그래프를 제공한다.
도 36c는 Ab6 또는 대조군 IgG로 처리된 MPL^W515L 마우스에서의 혈액 파라미터를 보여주는 그래프의 세트를 제공한다.
도 36d는 Ab6 또는 대조군 IgG로 처리된 MPL^W515L 마우스에서의 추가의 혈액 파라미터를 보여주는 그래프의 세트를 제공한다.
도 37a는 TGFβ 이소형 발현과 IPRES 진세트 사이의 상관관계를 보여주는 유전자 세트 변이 분석 (GSVA)을 제공한다.
도 37b는 TGFβ 이소형 발현과 플라사리(Plasari) 진세트 사이의 상관관계를 보여주는 유전자 세트 변이 분석 (GSVA)을 제공한다. TGFb1 이소형 발현은 TGFβ 경로 활성화와 상관관계가 있다. TGFβ-반응성 유전자의 플라사리 진세트는 많은 TCGA 주석달린 종양 유형에 걸친 TGFb1 RNA 이소형 발현과 유의한 및 강한 상관관계가 있다. TGFB1 mRNA와 TGFβ 신호전달 시그너쳐와의 상관관계

정의

본 개시내용이 보다 용이하게 이해될 수 있도록, 특정 용어가 먼저 정의된다. 이들 정의는 본 개시내용의 나머지에 비추어 및 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이 해석되어야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 추가의 정의는 상세한 설명 전반에 걸쳐 제시된다.

진행성 암, 진행성 악성종양: 본원에 사용된 용어 "진행성 암" 또는 "진행성 악성종양"은 관련 기술분야에서 이해되는, 예를 들어 암을 갖는 대상체/환자를 진단 또는 치료하는 것과 관련하여 종양학자에 의해 이해되는 의미를 갖는다. 고형 종양을 갖는 진행성 악성종양은 국부 진행성 또는 전이성일 수 있다. 용어 "국부 진행성 암"은 그가 시작된 기관 밖에서 성장하였지만 아직 신체의 원위 부분으로는 확산되지 않은 암 (예를 들어, 종양)을 기재하는 것으로 사용된다. 따라서, 상기 용어는 그가 시작된 위치로부터 근처 조직 또는 림프절로 확산된 암을 포함한다. 대조적으로, "전이성 암"은 그가 시작된 신체의 부분 (1차 부위)으로부터 신체의 다른 부분 (예를 들어, 원위 부분)으로 확산된 암이다.

친화도: 친화도는 분자 (예컨대 항체)의 그의 리간드 (예컨대 항원)에 대한 결합 강도이다. 이는 전형적으로 평형 해리 상수 (K_D)에 의해 측정되고 보고된다. 항체-항원 상호작용과 관련하여, K_D는 항체가 그의 항원으로부터 얼마나 신속하게 해리되는지인 항체 해리율 ("오프 레이트" 또는 K_off) 대 항체가 그의 항원에 얼마나 신속하게 결합하는지인 항체의 항체 회합률 ("온 레이트" 또는 K_on)의 비이다. 예를 들어, ≤ 5 nM의 친화도를 갖는 항체는 적합한 시험관내 결합 검정에 의해 결정된 5 nM 이하의 K_D 값 (즉, 5 nM 이상의 친화도)을 갖는다. 적합한 시험관내 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI) 및 용액 평형 적정 (예를 들어, MSD-SET)을 사용하여 항체의 그의 항원에 대한 KD 값을 측정할 수 있다.

항체: 용어 "항체"는 본원의 다른 곳에 추가로 기재된 바와 같은 임의의 자연-발생, 재조합, 변형된 또는 조작된 이뮤노글로불린 또는 이뮤노글로불린-유사 구조 또는 그의 항원-결합 단편 또는 부분 또는 그의 유도체를 포괄한다. 따라서, 상기 용어는 표적 항원에 특이적으로 결합하는 이뮤노글로불린 분자를 지칭하고, 예를 들어 키메라, 인간화, 완전 인간 및 이중특이적 항체를 포함한다. 무손상 항체는 일반적으로 적어도 2개의 전장 중쇄 및 2개의 전장 경쇄를 포함할 것이지만, 일부 경우에 단지 중쇄만을 포함할 수 있는 낙타류의 자연 발생 항체와 같이 보다 적은 쇄를 포함할 수 있다. 항체는 오로지 단일 공급원으로부터 유래될 수 있거나, 또는 "키메라"일 수 있으며, 즉 항체의 상이한 부분이 2종의 상이한 항체로부터 유래될 수 있다. 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 하이브리도마에서, 재조합 DNA 기술에 의해, 또는 무손상 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생산될 수 있다. 본원에 사용된 용어 항체는 각각 모노클로날 항체, 이중특이적 항체, 미니바디, 도메인 항체, 합성 항체 (때때로 본원에서 "항체 모방체"로 지칭됨), 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 항체 융합체 (때때로 본원에서 "항체 접합체"로 지칭됨)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 용어는 또한 펩티바디를 포괄한다.

항원: 용어 "항원"은 항체 또는 단편이 특이적으로 결합하는 결합 영역(들) 내에 항원 결정기를 포함하는 임의의 분자를 광범위하게 포함한다. 항원은 단일-단위 분자 (예컨대 단백질 단량체 또는 단편) 또는 다중 성분으로 구성된 복합체일 수 있다. 항원은 선택적 결합제, 예컨대 항원 결합 단백질 (예를 들어 항체 포함)에 의해 결합될 수 있는 에피토프, 예를 들어 분자 또는 분자의 한 부분 또는 분자의 복합체 또는 분자의 부분들을 제공한다. 따라서, 선택적 결합제는 복합체 중 2종 이상의 성분에 의해 형성되는 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원은 그 항원에 결합할 수 있는 항체를 생산하기 위해 동물에 사용될 수 있다. 항원은 상이한 항원 결합 단백질, 예를 들어 항체와 상호작용할 수 있는 1개 이상의 에피토프를 보유할 수 있다. 본 개시내용과 관련하여, 적합한 항원은 제시 분자와 회합된 프로TGF 이량체를 함유하는 복합체 (예를 들어, 회합된 다중 성분으로 구성된 다량체 복합체)이다. 프로TGF 이량체의 각각의 단량체는 푸린 절단 서열에 의해 분리되어 있는, 프로도메인 및 성장 인자 도메인을 포함한다. 2개의 이러한 단량체는 프로TGF 이량체 복합체를 형성한다 (도 19 참조). 이는 차례로 각각의 프로TGF 단량체의 N-말단 근처에 존재하는 시스테인 잔기를 수반하는 디술피드 결합을 통해 제시 분자와 공유 회합된다. 제시 분자에 결합된 프로TGF 이량체에 의해 형성된 이러한 다중-복합체는 일반적으로 대형 잠복 복합체로 지칭된다. 항체 또는 항원-결합 단편을 스크리닝하는데 적합한 항원 복합체는, 예를 들어 대형 잠복 복합체의 제시 분자 성분을 포함한다. 이러한 제시 분자 성분은 전장 제시 분자 또는 그의 단편(들)일 수 있다. 최소한 요구되는 제시 분자의 부분은 전형적으로, 프로TGFβ1 이량체와 공유 결합을 형성할 수 있는 2개의 시스테인 잔기를 포함하는, 제시 분자 폴리펩티드의 적어도 50개의 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 100개의 아미노산을 함유한다.

항원-결합 부분/단편: 본원에 사용된 용어 항체의 "항원-결합 부분" 또는 "항원-결합 단편"은 항원 (예를 들어, TGFβ1)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 1개 이상의 단편을 지칭한다. 항원 결합 부분은 항원에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는 임의의 자연 발생, 효소적으로 수득가능한, 합성 또는 유전자 조작된 폴리펩티드 또는 당단백질을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 항체의 항원-결합 부분은, 예를 들어 임의의 적합한 표준 기술, 예컨대 단백질분해적 소화, 또는 항체 가변 및 임의로 불변 도메인을 코딩하는 DNA의 조작 및 발현을 수반하는 재조합 유전자 조작 기술을 사용하여 전체 항체 분자로부터 유래될 수 있다. 항원-결합 부분의 비제한적 예는 다음을 포함한다: (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (v) 단일쇄 Fv (scFv) 분자 (예를 들어, 문헌 [Bird et al. (1988) SCIENCE 242:423-426; 및 Huston et al. (1988) PROC. NAT'L. ACAD. SCI. USA 85:5879-5883] 참조); (vi) dAb 단편 (예를 들어, 문헌 [Ward et al. (1989) NATURE 341: 544-546] 참조); 및 (vii) 항체의 초가변 영역을 모방하는 아미노산 잔기로 이루어진 최소 인식 단위 (예를 들어, 단리된 상보성 결정 영역 (CDR)). 다른 형태의 단일 쇄 항체, 예컨대 디아바디가 또한 포괄된다. 용어 항체의 항원 결합 부분은 항체 중쇄 가변 도메인 (VH), 항체 불변 도메인 1 (CH1), 항체 경쇄 가변 도메인 (VL), 항체 경쇄 불변 도메인 (CL) 및 링커를 포함하는, 달리 "scFab"로 공지된 "단일 쇄 Fab 단편"을 포함하며, 여기서 상기 항체 도메인 및 상기 링커는 N-말단에서 C-말단 방향으로 하기 순서 중 하나를 갖고: a) VH-CH1-링커-VL-CL, b) VL-CL-링커-VH-CH1, c) VH-CL-링커-VL-CH1 또는 d) VL-CH1-링커-VH-CL; 및 여기서 상기 링커는 적어도 30개의 아미노산, 바람직하게는 32 내지 50개의 아미노산의 폴리펩티드이다.

편향: 본 개시내용과 관련하여, 용어 "편향"은 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 항원의 하위세트를 향한 또는 그에 대한 편중된 또는 고르지 않은 친화도를 지칭한다. 예를 들어, 항체는 하나의 항원 복합체에 대한 친화도 및 또 다른 항원 복합체에 대한 친화도가 등가이지 않을 때 편향을 갖는 것으로 언급된다. 본 개시내용에 따른 콘텍스트-비의존성 항체는 이러한 항원 복합체에 대한 등가의 친화도 (즉, 비편향)를 갖는다.

결합 영역: 본원에 사용된 바와 같이, "결합 영역"은 항체 또는 그의 단편에 결합할 때 항체-항원 상호작용의 계면을 형성할 수 있는 항원의 부분이다. 항체 결합시, 결합 영역은 표면 노출로부터 보호되며, 이는 적합한 기술, 예컨대 HDX-MS에 의해 검출될 수 있다. 항체-항원 상호작용은 다수 (예를 들어, 2개 이상)의 결합 영역을 통해 매개될 수 있다. 결합 영역은 항원 결정기 또는 에피토프를 포함할 수 있다.

생물층 간섭측정법 (BLI): BLI는, 예를 들어 바이오센서 팁 표면 상에 고정화된 리간드와 용액 중의 분석물 사이의 생체분자 상호작용을 광학적으로 측정하기 위한 무표지 기술이다. BLI는 결합 특이성, 회합률 및 해리율 또는 농도를 정밀하고 정확하게 모니터링하는 능력을 제공한다. BLI 플랫폼 기기는, 예를 들어 포르테바이오(ForteBio)로부터 상업적으로 입수가능하고, 통상적으로 옥테트(Octet)® 시스템으로 지칭된다.

암: 본원에 사용된 용어 "암"은 전형적으로 비조절된 세포 증식 및 악성종양을 특징으로 하는 다세포 진핵생물에서의 생리학적 상태를 지칭한다. 상기 용어는 종양, 혈액암 (예를 들어, 백혈병, 림프종 및 골수종), 뿐만 아니라 골수섬유증을 포함한 고형 및 액상 악성종양을 광범위하게 포괄한다.

세포-연관 프로TGFβ1: 상기 용어는 막-결합된 (예를 들어, 세포 표면에 테더링된) TGFβ1 또는 그의 신호전달 복합체 (예를 들어, 프로/잠복 TGFβ1)를 지칭한다. 전형적으로, 이러한 세포는 면역 세포이다. GARP 또는 LRRC33에 의해 제시되는 TGFβ1은 세포-연관 TGFβ1이다. GARP 및 LRRC33은 특정 세포의 세포 표면 상에서 발현되는 막횡단 제시 분자이다. GARP-프로TGFβ1 및 LRRC33-은 세포 프로TGFβ1-연관 (예를 들어, 면역 세포-연관) TGFβ1 활성화/신호전달을 매개하는 "세포-연관" (또는 "세포-표면") 프로TGFβ1 복합체로 집합적으로 지칭될 수 있다. 상기 용어는 또한 세포 막에 물리적으로 부착되어 있지 않는, 용액 중의 (예를 들어, 시험관내 검정에서의) 재조합, 정제된 GARP-프로TGFβ1 및 LRRC33-프로TGFβ1 복합체를 포함한다. GARP-프로TGFβ1 복합체 및 LRRC33-프로TGFβ1 복합체에 대한 항체 (또는 그의 단편)의 평균 KD 값은 집합적으로 세포-연관 (예를 들어, 면역 세포-연관) 프로TGFβ1 복합체에 대한 친화도를 나타내도록 계산될 수 있다. 예를 들어, 표 8, 칼럼 (G)를 참조한다. 제시 분자 또는 제시 분자 복합체의 인간 대응물은 단백질 또는 단백질 복합체 앞의 "h", 예를 들어 "hGARP", "hGARP-프로TGFβ1", "hLRRC33" 및 "hLRRC33-프로TGFβ1"에 의해 표시될 수 있다. 세포-테더링된 복합체로부터의 활성 TGFβ1 성장 인자의 방출을 차단하는 것에 추가로, 세포-연관 프로TGFβ1은 이러한 세포 표면 복합체를 발현하는 표적 세포의 내재화 (예를 들어, 세포내이입) 및/또는 세포 사멸, 예컨대 ADCC, ADCP 또는 ADC-매개 고갈을 위한 표적일 수 있다.

체크포인트 억제제: 본 개시내용과 관련하여, 체크포인트 억제제는 면역 체크포인트 억제제를 지칭하고, 관련 기술분야에서 이해되는 바와 같은 의미를 보유한다. 전형적으로, 표적은 T 세포 또는 NK 세포 상의 수용체 분자, 또는 항원-제시 세포 (APC) 또는 종양 세포 상의 상응하는 세포 표면 리간드이다. 면역 체크포인트는 면역 세포에서 활성화되어 염증성 면역이 "자기"에 대해 발생하는 것을 방지한다. 따라서, 체크포인트 억제를 통해 면역계의 균형을 변화시키는 것은 면역계가 암을 검출 및 제거하도록 완전히 활성화되게 할 것이다. 면역 반응의 제어에 연루된 가장 널리 공지된 억제 수용체는 세포독성 T-림프구 항원-4 (CTLA-4), 프로그램화된 세포 사멸 단백질 1 (PD-1), PD-L1, T-세포 이뮤노글로불린 도메인 및 뮤신 도메인-3 (TIM3), 림프구-활성화 유전자 3 (LAG3), 킬러 세포 이뮤노글로불린-유사 수용체 (KIR), 글루코코르티코이드-유도된 종양 괴사 인자 수용체 (GITR) 및 T-세포 활성화의 V-도메인 이뮤노글로불린 (Ig)-함유 억제자 (VISTA)이다. 체크포인트 억제제의 비제한적 예는 다음을 포함한다: 니볼루맙, 펨브롤리주맙, BMS-936559, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 두르발루맙, 이필리무맙, 트레멜리무맙, IMP-321, BMS-986016, 및 리릴루맙. 키트루다®는 PD-1 억제제의 한 예이다. 면역 체크포인트 억제제 중 1종 이상을 사용하는 요법은 체크포인트 차단 요법 (CBT)으로 지칭될 수 있다.

임상 이익: 본원에 사용된 용어 "임상 이익"은 요법의 효능 및 안전성 둘 다를 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, 바람직한 임상 이익을 달성하는 치유적 치료는 효과적이고 (예를 들어, 치료상 유익한 효과를 달성함), 안전한 것 (예를 들어, 내약성 있거나 또는 허용되는 수준의 독성 또는 유해 사건을 가짐) 둘 다이다.

조합 요법: "조합 요법"은 2종 이상의 치료제를 포함하는 임상 적응증에 대한 치료 요법을 지칭한다. 따라서, 상기 용어는 제1 조성물 (예를 들어, 활성 성분)을 포함하는 제1 요법이 동일하거나 중첩되는 질환 또는 임상 상태를 치료하도록 의도된 제2 조성물 (활성 성분)을 포함하는 제2 요법과 함께 환자에게 투여되는 치료 요법을 지칭한다. 제1 및 제2 조성물은 동일한 세포 표적 또는 별개의 세포 표적 둘 다에 작용할 수 있다. 조합 요법과 관련하여 어구 "와 함께"는, 조합 요법을 받는 대상체에서 제1 요법의 치료 효과가 제2 요법의 치료 효과와 시간적으로 및/또는 공간적으로 중첩된다는 것을 의미한다. 따라서, 조합 요법은 요법의 공동 투여를 위한 단일 제제로서 또는 순차적 투여를 위한 개별 제제로서 제제화될 수 있다. 질환을 치료하기 위해 제1 요법으로 치료된 대상체에게 동일한 질환을 치료하기 위해 제2 요법이 투여된 경우에, 제2 요법은 부가 요법 또는 보조 요법으로 지칭될 수 있다.

조합 또는 조합 에피토프: 조합 에피토프는 항원의 성분 또는 성분들의 비-인접 부분에 의해 형성된 부위 (즉, 항원 결정기)에서 조합 항체에 의해 인식되고 결합되는 에피토프이며, 이는 3차원 구조에서 함께 매우 근접하게 회합되어 에피토프를 형성한다. 따라서, 본 발명의 항체는 프로/잠복 TGFβ1 복합체의 2종 이상의 성분 (예를 들어, 부분 또는 절편)에 의해 형성된 에피토프에 결합할 수 있다. 조합 에피토프는 복합체의 제1 성분으로부터의 아미노산 잔기(들) 및 복합체의 제2 성분으로부터의 아미노산 잔기(들) 등을 포함할 수 있다. 각각의 성분은 단일 단백질의 것 또는 항원 복합체의 2종 이상의 단백질의 것일 수 있다. 조합 에피토프는 항원 또는 항원 복합체의 2종 이상의 성분 (예를 들어, 부분 또는 절편, 예컨대 아미노산 잔기)으로부터의 구조적 기여에 의해 형성된다.

경쟁 또는 교차-경쟁; 교차-차단: 용어 "경쟁"은 동일한 에피토프에 대해 경쟁하는 항원 결합 단백질 (예를 들어, 항체 또는 그의 항원 결합 부분)과 관련하여 사용될 때, 시험되는 항원 결합 단백질이 공통 항원 (예를 들어, TGFβ1 또는 그의 단편)에 대한 참조 항원 결합 단백질의 특이적 결합을 방지하거나 억제하는 (예를 들어, 감소시키는), 검정에 의해 결정된 항원 결합 단백질 사이의 경쟁을 의미한다. 하나의 항원 결합 단백질이 또 다른 것과 경쟁하는지를 결정하기 위해 수많은 유형의 경쟁적 결합 검정, 예를 들어: 고체상 직접 또는 간접 방사선면역검정 (RIA), 고체상 직접 또는 간접 효소 면역검정 (EIA), 샌드위치 경쟁 검정; 고체상 직접 비오틴-아비딘 EIA; 고체상 직접 표지된 검정, 및 고체상 직접 표지된 샌드위치 검정이 사용될 수 있다. 통상적으로, 경쟁 항원 결합 단백질이 과량으로 존재하는 경우에, 이는 공통 항원에 대한 참조 항원 결합 단백질의 특이적 결합을 적어도 40-45%, 45-50%, 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% 또는 75% 이상만큼 억제할 (예를 들어, 감소시킬) 것이다. 일부 경우에, 결합은 적어도 80-85%, 85-90%, 90-95%, 95-97% 또는 97% 이상만큼 억제된다.

일부 실시양태에서, 제1 항체 또는 그의 항원-결합 부분 및 제2 항체 또는 그의 항원-결합 부분은, 예를 들어 비아코어 또는 옥테트®에 의해 표준 시험 조건을 사용하여, 예를 들어 제조업체의 지침에 따라 검정시 (예를 들어, 실온, ~20-25℃에서 결합 검정함), 동일한 항원에 대해 서로 "교차-차단"한다. 일부 실시양태에서, 제1 항체 또는 그의 단편 및 제2 항체 또는 그의 단편은 동일한 에피토프를 가질 수 있다. 다른 실시양태에서, 제1 항체 또는 그의 단편 및 제2 항체 또는 그의 단편은 동일하지 않지만 중첩되는 에피토프를 가질 수 있다. 추가 실시양태에서, 제1 항체 또는 그의 단편 및 제2 항체 또는 그의 단편은 항체 결합이 입체 장애를 통해 교차-차단되도록 3차원 공간에서 매우 근접한 별개의 (상이한) 에피토프를 가질 수 있다. "교차-차단"은 항원에 대한 제1 항체의 결합이 동일한 항원에 대한 제2 항체의 결합을 방지하고, 유사하게, 항원에 대한 제2 항체의 결합이 동일한 항원에 대한 제1 항체의 결합을 방지한다는 것을 의미한다.

항체 비닝 (때때로 에피토프 비닝 또는 에피토프 맵핑으로 지칭됨)은 표적 단백질 또는 단백질 복합체 (즉, 항원)에 대해 제조된 모노클로날 항체의 세트 (예를 들어, "라이브러리")를 특징화하고 분류하기 위해 수행될 수 있다. 동일한 표적에 대한 이러한 항체를 라이브러리 내의 모든 다른 항체에 대해 쌍별 방식으로 시험하여 항체가 항원에 대한 서로의 결합을 차단하는지를 평가한다. 밀접하게 관련된 비닝 프로파일은 항체가 동일하거나 밀접하게 관련된 (예를 들어, 중첩되는) 에피토프를 갖고 함께 "비닝된" 것을 나타낸다. 비닝은 항체의 그의 표적에 대한 결합에 의해 유발되는 생물학적 활성 (예를 들어, 개입; 효력)이 동일한 빈에서 또 다른 항체에 전달될 가능성이 있기 때문에 동일한 항원 내의 유사한 결합 영역을 공유하는 항체의 유용한 구조-기능 프로파일을 제공한다. 따라서, 동일한 에피토프 빈 내의 항체 중에서, 더 높은 친화도 (더 낮은 KD)를 갖는 항체는 전형적으로 더 큰 효력을 갖는다.

상보성 결정 영역: 본원에 사용된 용어 "CDR"은 항체 가변 서열 내의 상보성 결정 영역을 지칭한다. 중쇄 및 경쇄의 각각의 가변 영역에 3개의 CDR이 있으며, 이는 각각의 가변 영역에서 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 지정된다. 본원에 사용된 용어 "CDR 세트"는 항원에 결합할 수 있는 단일 가변 영역에서 발생하는 3개의 CDR의 군을 지칭한다. 이들 CDR의 정확한 경계는 상이한 시스템에 따라 상이하게 정의되었다. 카바트에 의해 기재된 시스템 (Kabat et al. (1987; 1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md.)은 항체의 임의의 가변 영역에 적용가능한 명백한 잔기 넘버링 시스템을 제공할 뿐만 아니라, 3개의 CDR을 정의하는 정확한 잔기 경계를 제공한다. 이들 CDR은 카바트 CDR로 지칭될 수 있다. 코티아 및 동료들 (Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917; 및 Chothia et al. (1989) Nature 342: 877-883)은 카바트 CDR 내의 특정 하위-부분이 아미노산 서열의 수준에서 큰 다양성을 가짐에도 불구하고 거의 동일한 펩티드 백본 입체형태를 채택한다는 것을 발견하였다. 이들 하위-부분은 L1, L2 및 L3 또는 H1, H2 및 H3, 또는 L-CDR1, L-CDR2 및 L-CDR3 또는 H-CDR1, H-CDR2 및 H-CDR3으로 지정되었으며, 여기서 "L" 및 "H"는 각각 경쇄 및 중쇄 영역을 지정한다. 이들 영역은 코티아 CDR로 지칭될 수 있으며, 이는 카바트 CDR과 중첩되는 경계를 갖는다. 카바트 CDR과 중첩되는 CDR을 정의하는 다른 경계는 문헌 [Padlan (1995) FASEB J. 9: 133-139 및 MacCallum (1996) J. Mol. Biol. 262(5): 732-45]에 의해 기재되었다. 또 다른 CDR 경계 정의는 본원의 시스템 중 하나를 엄격히 따르지 않을 수 있지만, 그럼에도 불구하고 카바트 CDR과 중첩될 것이며, 이들은 특정한 잔기 또는 잔기의 군 또는 심지어 전체 CDR이 항원 결합에 유의하게 영향을 미치지 않는다는 예측 또는 실험적 소견에 비추어 단축되거나 연장될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Lu X et al., MAbs. 2019 Jan;11(1):45-57] 참조). 본원에 사용된 방법은, 특정 실시양태가 카바트 또는 코티아 정의된 CDR을 사용하지만, 이들 시스템 중 임의의 것에 따라 정의된 CDR을 이용할 수 있다.

입체형태적 에피토프: 입체형태적 에피토프는 3차원 입체형태의 입체형태적 항체에 의해 인식되고 결합되지만, 동일한 아미노산 서열의 언폴딩된 펩티드에서는 인식되고 결합되지 않는 에피토프이다. 입체형태적 에피토프는 입체형태-특이적 에피토프, 입체형태-의존성 에피토프, 또는 입체형태-감수성 에피토프로 지칭될 수 있다. 이러한 에피토프에 특이적으로 결합하는 상응하는 항체 또는 그의 단편은 입체형태-특이적 항체, 입체형태-선택적 항체, 또는 입체형태-의존성 항체로 지칭될 수 있다. 입체형태적 에피토프에 대한 항원의 결합은 항원 또는 항원 복합체의 3차원 구조 (입체형태)에 좌우된다.

불변 영역: 이뮤노글로불린 불변 도메인은 중쇄 또는 경쇄 불변 도메인을 지칭한다. 인간 IgG 중쇄 및 경쇄 불변 도메인 아미노산 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있다.

콘텍스트-편향: 본원에 사용된 "콘텍스트-편향 항체"는 항원이 상호작용 단백질 또는 그의 단편과 회합되는 (즉, 그에 결합되거나 또는 그에 부착되는) 경우에 차등 친화도로 항원에 결합하는 입체형태적 항체의 유형을 지칭한다. 따라서, 프로TGFβ1 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 콘텍스트-편향 항체는 상이한 친화도로 LTBP1-프로TGFβ1, LTBP3-프로TGFβ1, GARP-프로TGFβ1 및 LRRC33-프로TGFβ1에 결합할 수 있다. 예를 들어, 항체는 세포-연관 프로TGFβ1 복합체 (예를 들어, GARP-프로TGFβ1 및 LRRC33-프로TGFβ1)보다 매트릭스-연관 프로TGFβ1 복합체 (예를 들어, LTBP1-프로TGFβ1 및 LTBP3-프로TGFβ1)에 대한 더 높은 친화도를 갖는 경우에 "매트릭스-편향된" 것으로 언급된다. [매트릭스-연관 복합체] : [세포-연관 복합체]의 상대 친화도는 본원에 예시된 바와 같이, 전자의 평균 K_D 값을 취하고, 후자의 평균 K_D 값을 취하고, 둘의 비를 계산함으로써 수득될 수 있다.

콘텍스트-비의존성: 본 개시내용에 따르면, 프로TGFβ1에 결합하는 "콘텍스트-비의존성 항체"는 4종의 공지된 제시 분자-프로TGFβ1 복합체, 즉 LTBP1-프로TGFβ1, LTBP3-프로TGFβ1, GARP-프로TGFβ1 및 LRRC33-프로TGFβ1에 걸쳐 등가의 친화도를 갖는다. 본 출원에 개시된 콘텍스트-비의존성 항체는 또한 비편향으로서 특징화될 수 있다. 전형적으로, 콘텍스트-비의존성 항체는 매트릭스-연관 복합체와 세포-연관 복합체 사이에 측정된 KD 값의 상대 비가 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 표면 플라즈몬 공명, 생물층 간섭측정법 (BLI) 및/또는 용액 평형 적정 (예를 들어, MSD-SET)에 의해 측정시 5 이하이도록 등가의 친화도 (즉, 친화도에서의 5배 이하의 편향)를 나타낸다.

ECM-연관 TGFβ1/프로TGFβ1: 상기 용어는 세포외 매트릭스의 (예를 들어, 그 내로 침착된) 성분인 TGFβ1 또는 그의 신호전달 복합체 (예를 들어, 프로/잠복 TGFβ1)를 지칭한다. LTBP1 또는 LTBP3에 의해 제시되는 TGFβ1은 ECM-연관 TGFβ1, 즉 각각 LTBP1-프로TGFβ1 및 LTBP3-프로TGFβ1이다. LTBP는 ECM에서 TGFβ의 정확한 침착 및 후속 생체이용률에 중요하며, 여기서 피브릴린 (Fbn) 및 피브로넥틴 (FN)은 LTBP와 ECM의 회합을 담당하는 주요 매트릭스 단백질인 것으로 여겨진다. 이러한 매트릭스-연관 잠복 복합체는 결합 조직, 뿐만 아니라 특정 질환-연관 조직, 예컨대 종양 기질 및 섬유화 조직에서 풍부화된다. 제시 분자 또는 제시 분자 복합체의 인간 대응물은 단백질 또는 단백질 복합체의 앞의 "h", 예를 들어 "hLTBP1", "hLTBP1-프로TGFβ1", "hLTBP3" 및 "hLTBP3-프로TGFβ1"에 의해 표시될 수 있다.

유효량: "유효량" (또는 치료 유효량 또는 치료 용량)은 환자 집단에서 통계적으로 유의한 임상 이익 (예를 들어, 효능)을 달성하는 투여량 또는 투여 요법이다. 예를 들어, Ab6은 전임상 모델에서 낮게는 3 mg/kg 및 높게는 30 mg/kg의 용량에서 효과적인 것으로 나타났다. 따라서, Ab6에 대한 유효량은 약 3-30 mg/kg인 것으로 언급될 수 있다.

유효 종양 제어: 용어 "유효 종양 제어"는 치료에 반응하여 달성되는 종양 퇴행의 정도를 지칭하는데 사용될 수 있으며, 여기서, 예를 들어 종양은 종점 종양 부피의 정의된 분율 (예컨대 <25%)만큼 퇴행된다. 예를 들어, 특정한 모델에서, 종점 종양 부피를 2,000 mm³으로 설정하는 경우에, <25%의 한계값을 가정하였을 때 종양이 500 mm³ 미만으로 감소되는 경우에 유효 종양 제어가 달성된다. 따라서, 유효 종양 제어는 완전 퇴행을 포괄한다. 임상적으로, 유효 종양 제어는 관련 기술분야에서 인식되는 기준, 예컨대 RECIST 1.1 및 상응하는 iRECIST에 기초한 부분 반응 (PR) 및 완전 반응 (CR)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 임상 세팅에서의 유효 종양 제어는 또한 안정 질환을 포함하며, 여기서 전형적으로 특정 속도로 성장할 것으로 예상되는 종양은, 수축이 달성되지는 않더라도, 치료에 의해 이러한 성장으로부터 방지된다.

이펙터 T 세포: 본원에 사용된 이펙터 T 세포는 자극, 예컨대 공동-자극에 즉시 능동적으로 반응하는 T 림프구이고, CD4+ T 세포 (T 헬퍼 또는 Th 세포로도 지칭됨) 및 CD8+ T 세포 (세포독성 T 세포로도 지칭됨)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. Th 세포는 B 세포의 형질 세포 및 기억 B 세포로의 성숙 및 세포독성 T 세포 및 대식세포의 활성화를 포함한 면역학적 과정에서 다른 백혈구를 보조한다. 이들 세포는 그의 표면 상에 CD4 당단백질을 발현하기 때문에 CD4+ T 세포로도 공지되어 있다. 헬퍼 T 세포는 항원-제시 세포 (APC)의 표면 상에서 발현되는 MHC 부류 II 분자에 의해 펩티드 항원과 함께 제시될 때 활성화되게 된다. 일단 활성화되면, 이들은 신속하게 분열하여, 능동 면역 반응을 조절하거나 보조하는 시토카인이라 불리는 소형 단백질을 분비한다. 이들 세포는 상이한 유형의 면역 반응을 용이하게 하기 위해 상이한 시토카인을 분비하는 Th1, Th2, Th3, Th17, Th9 또는 TFh를 포함한 여러 하위유형 중 하나로 분화될 수 있다. APC로부터의 신호전달은 T 세포를 특정한 하위유형으로 지시한다. 세포독성 (킬러). 세포독성 T 세포 (TC 세포, CTL, T-킬러 세포, 킬러 T 세포)는, 다른 한편으로는, 바이러스-감염된 세포 및 암 세포를 파괴하고, 또한 이식 거부에 연루된다. 이들 세포는 그의 표면에서 CD8 당단백질을 발현하기 때문에 CD8+ T 세포로도 공지되어 있다. 이들 세포는 모든 유핵 세포의 표면 상에 존재하는 MHC 부류 I 분자와 회합된 항원에 결합함으로써 그의 표적을 인식한다. 세포독성 이펙터 세포 (예를 들어, CD8+ 세포)는, 예를 들어 퍼포린 및 그랜자임 B를 포함한다.

에피토프: 용어 "에피토프"는 또한 항원 결정기로 지칭될 수 있고, 결합제, 이뮤노글로불린 또는 T-세포 수용체에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 분자 결정기 (예를 들어, 폴리펩티드 결정기)이다. 에피토프 결정기는 화학적으로 활성인 표면 분자 군, 예컨대 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 또는 술포닐을 포함하고, 특정 실시양태에서는, 특정 3차원 구조 특징 및/또는 특정 전하 특징을 가질 수 있다. 항체 또는 항체의 항원-결합 단편에 의해 인식되는 에피토프는 항체 또는 단편의 CDR (예를 들어, 상보적 부위)과 상호작용하는 항원의 구조적 요소이다. 에피토프는 항체의 CDR과 상호작용하여 특이성을 생성하는 여러 아미노산 잔기로부터의 기여에 의해 형성될 수 있다. 항원 단편은 1개 초과의 에피토프를 함유할 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체가 단백질 및/또는 거대분자의 복합체 혼합물 중 그의 표적 항원을 인식하는 경우에 항체는 항원에 특이적으로 결합한다. 예를 들어, 항체가 교차-경쟁하는 경우 (하나가 다른 것의 결합 또는 조정 효과를 방지하는 경우)에 항체는 "동일한 에피토프에 결합한다"고 언급된다.

등가의 친화도: 본 개시내용과 관련하여, 용어 "등가의 친화도/친화도들"은 다음을 의미하는 것으로 의도된다: i) 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 용액 평형 적정 (예컨대 MSD-SET), 생물층 간섭측정법 (예컨대 옥테트®) 또는 표면 플라즈몬 공명 (예컨대 비아코어 시스템)에 의해 측정시, 친화도에서의 5배 미만의 편향으로 매트릭스-연관 프로TGFb1 복합체 및 세포-연관 프로TGFb1 복합체에 결합함; 및/또는 ii) 4종의 복합체에 대한 항체의 상대 친화도는 4종의 항원 복합체 중에서 항체가 나타내는 최저 친화도 (최고 KD 수치 값)가 나머지 3종의 친화도로부터 계산된 평균 값보다 5배 이하로 더 작거나; 또는 4종의 항원 복합체 중에서 항체가 나타내는 최고 친화도 (최저 KD 수치 값)가 나머지 3종의 친화도로부터 계산된 평균보다 5배 이하로 더 크다는 점에서 균일함. 등가의 친화도를 갖는 항체는 프로TGFβ1 복합체와 연관된 특정한 제시 분자에 상관없이 (따라서 "콘텍스트-비의존성"), 보다 균일한 억제 효과를 달성할 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 매트릭스-연관 복합체와 세포-연관 복합체 사이의 평균 친화도에서 관찰되는 편향은 3배 이하이다.

연장된 잠복성 라쏘: 본원에 사용된 용어 "연장된 잠복성 라쏘"는 잠복성 라쏘 및 알파-2 헬릭스를 포함하는 프로도메인의 부분, 예를 들어 LASPPSQGEVPPGPLPEAVLALYNSTR (서열식별번호: 154)을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 연장된 잠복성 라쏘는 알파-1 헬릭스의 부분, 예를 들어 LVKRKRIEA (서열식별번호: 159) 또는 그의 부분을 추가로 포함한다.

섬유증: 용어 "섬유증" 또는 "섬유화 상태/장애"는 조직 또는 기관 내의 세포외 매트릭스 (ECM) 성분, 예컨대 콜라겐의 병리학적 축적을 특징으로 하는 과정 또는 징후를 지칭한다.

섬유화 미세환경: 용어 "섬유화 미세환경"은 생체내에서 섬유증이 발생하는, 조직 내의 국부 질환 함요를 지칭한다. 섬유화 미세환경은 질환-연관 분자 시그너쳐 (케모카인, 시토카인 등의 세트), 질환-연관 세포 집단 (예컨대 활성화된 대식세포, MDSC 등), 뿐만 아니라 질환-연관 ECM 환경 (ECM 성분 및/또는 구조에서의 변경)을 포함할 수 있다. 섬유화 미세환경은 TGFβ-의존성 방식으로 섬유모세포에서 α-평활근 액틴-양성 근섬유모세포로의 전이를 지지하는 것으로 생각된다. 섬유화 미세환경은 특정 면역 세포 (예컨대 대식세포 및 MDSC)의 침윤을 추가로 특징으로 할 수 있다.

핑거-1 (TGFβ1 성장 인자의): 본원에 사용된 "핑거-1"은 TGFβ1 성장 인자 도메인 내의 도메인이다. 그의 비돌연변이된 형태에서, 인간 프로TGFβ1의 핑거-1은 하기 아미노산 서열을 함유한다: CVRQLYIDFRKDLGWKWIHEPKGYHANFC (서열식별번호: 151). 3D 구조에서, 핑거-1 도메인 (부분이 도 18 및 19에서 영역 "5a"로 제시됨)은 잠복성 라쏘에 매우 근접하게 있다.

핑거-2 (TGFβ1 성장 인자의): 본원에 사용된 "핑거-2"는 TGFβ1 성장 인자 도메인 내의 도메인이다. 그의 비돌연변이된 형태에서, 인간 프로TGFβ1의 핑거-2는 하기 아미노산 서열을 함유한다: CVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQLSNMIVRSCKCS (서열식별번호: 152). 핑거-2는 공간적으로 잠복성 라쏘에 매우 근접하게 놓인, 도 18 및 19에 도시된 "결합 영역(6)" (즉, "6a" 및 "6b")을 포함한다.

GARP-프로TGFβ1 복합체: 본원에 사용된 용어 "GARP-TGFβ1 복합체"는 전구-단백질 형태 또는 잠복 형태의 형질전환 성장 인자-β1 (TGFβ1) 단백질 및 당단백질-A 반복 우세 단백질 (GARP) 또는 그의 단편 또는 변이체를 포함하는 단백질 복합체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, TGFβ1 단백질의 전구-단백질 형태 또는 잠복 형태는 "프로/잠복 TGFβ1 단백질"로 지칭될 수 있다. 일부 실시양태에서, GARP-TGFβ1 복합체는 1개 이상의 디술피드 결합을 통해 프로/잠복 TGFβ1과 공유 연결된 GARP를 포함한다. 실제로, 이러한 공유 결합은 프로TGFβ1 이량체 복합체의 N-말단 (예를 들어, 아미노산 위치 4) 근처에 존재하는 시스테인 잔기와 함께 형성된다. 다른 실시양태에서, GARP-TGFβ1 복합체는 프로/잠복 TGFβ1과 비-공유 연결된 GARP를 포함한다. 일부 실시양태에서, GARP-TGFβ1 복합체는 자연-발생 복합체, 예를 들어 세포 내의 GARP-TGFβ1 복합체이다. 용어 "hGARP"는 인간 GARP를 나타낸다.

고친화도: 본원에 사용된 용어 "고친화도 프로TGFβ1 항체"에서와 같은 "고친화도"는 ≤ 5 nM, 보다 바람직하게는 ≤ 1 nM의 K_D 값을 갖는 시험관내 결합 활성을 지칭한다. 따라서, 본원의 발명에 의해 포괄되는 고친화도, 콘텍스트-비의존성 프로TGFβ1 항체는 각각의 하기 항원 복합체에 대해 ≤ 5 nM, 보다 바람직하게는 ≤ 1 nM의 K_D 값을 갖는다: LTBP1-프로TGFβ1, LTBP3-프로TGFβ1, GARP-프로TGFβ1 및 LRRC33-프로TGFβ1.

인간 항체: 본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 본 개시내용의 인간 항체는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이), 예를 들어 CDR 및 특히 CDR3을 포함할 수 있다. 그러나, 본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 또 다른 포유동물 종, 예컨대 마우스의 배선으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상에 그라프트된 항체를 포함하는 것으로 의도되지는 않는다.

인간화 항체: 용어 "인간화 항체"는 비-인간 종 (예를 들어, 마우스)으로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하지만, VH 및/또는 VL 서열의 적어도 한 부분이 보다 "인간-유사"하도록, 즉 인간 배선 가변 서열과 보다 유사하도록 변경된 항체를 지칭한다. 인간화 항체의 한 유형은 인간 CDR 서열이 상응하는 비인간 CDR 서열을 대체하기 위해 비-인간 VH 및 VL 서열 내로 도입된 CDR-그라프트된 항체이다. 또한 "인간화 항체"는 관심 항원에 면역특이적으로 결합하고 실질적으로 인간 항체의 아미노산 서열을 갖는 FR 영역 및 실질적으로 비-인간 항체의 아미노산 서열을 갖는 CDR 영역을 포함하는 항체 또는 그의 변이체, 유도체, 유사체 또는 단편이다. CDR과 관련하여 본원에 사용된 용어 "실질적으로"는 비-인간 항체 CDR의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR을 지칭한다. 인간화 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역이 비-인간 이뮤노글로불린 (즉, 공여자 항체)의 것에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역이 인간 이뮤노글로불린 컨센서스 서열의 것인 실질적으로 모든 적어도 1개 및 전형적으로 2개의 가변 도메인 (Fab, Fab', F(ab')2, FabC, Fv)을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간화 항체는 또한 이뮤노글로불린 Fc 영역, 전형적으로 인간 이뮤노글로불린의 것의 적어도 한 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 경쇄뿐만 아니라 적어도 중쇄의 가변 도메인을 함유한다. 항체는 또한 중쇄의 CH1, 힌지, CH2, CH3 및 CH4 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 인간화 경쇄만을 함유한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 인간화 중쇄만을 함유한다. 구체적 실시양태에서, 인간화 항체는 경쇄의 인간화 가변 도메인 및/또는 인간화 중쇄만을 함유한다.

수소/중수소 교환 질량 분광측정법 (HDX-MS): HDX-MS는 용매 접근성의 정도를 측정함으로써 용액 중 단백질 확인 및 단백질-단백질 상호작용을 조사하기 위해 사용되는 널리 공지된 기술이다. 예를 들어, 문헌 [Wei et al., (2014) Drug Discov Today 19(1): 95-102. "Hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry for probing higher order structure of protein therapeutics: methodology and applications"]을 참조한다. HDX-MS 기술을 사용하여 항체에 의해 결합된 항원의 영역 또는 영역들 (즉, "결합 영역(들)")을 결정할 수 있다. 따라서, 이러한 결합 영역(들)은 에피토프를 함유하거나 형성할 수 있다.

면역-배제된 또는 면역-배제된 종양: 본원에 사용된 "면역 배제"로서 특징화된 종양은 종양내 항종양 림프구가 없거나 또는 실질적으로 없다. 예를 들어, 불량하게 침윤된 T 세포를 갖는 종양은 종양을 둘러싸는, 예를 들어 종양 덩어리의 외부 주변 및/또는 종양의 혈관계 근처 부근 ("혈관주위")에 T 세포를 가질 수 있으며, 그럼에도 불구하고 암 세포에 대해 세포독성 기능을 발휘하기 위해 종양 내로 효과적으로 유주되지 못한다. 다른 상황에서, 종양은 강한 면역 반응을 유발하지 못하여 (소위 "콜드" 또는 "면역 사막(desert)" 종양), 종양 환경 근처에 및 종양 환경에 T 세포가 거의 존재하지 않는다. 면역-배제된 종양과 대조적으로, 항종양 림프구가 침윤된 종양은 때때로 "핫" 또는 "염증발생" 종양으로 특징화되며; 이러한 종양은 면역 체크포인트 차단 요법 ("CBT")에 대해 보다 반응성인 경향이 있고, 따라서 그의 표적이다. 그러나, 전형적으로는, 종양이 CBT에 대해 저항성을 갖게 되는 면역 배제로 인해 환자의 단지 일부만이 CBT에 반응한다.

면역억제, 면역억제성: 이 용어는 면역 세포, 예컨대 T 세포, NK 세포 및 B 세포를 억제하는 능력을 지칭한다. 면역억제 기능을 평가하기 위한 최적 표준은 항원-특이적 억제 및 비-특이적 억제를 포함할 수 있는 T 세포 활성의 억제이다. 조절 T 세포 (Treg) 및 MDSC는 면역억제 세포로 간주될 수 있다. M2-분극화된 대식세포 (예를 들어, 질환-국재화된 대식세포, 예컨대 TAM 및 FAM)는 또한 면역억제성으로 특징화될 수 있다.

면역학적 기억: 면역학적 기억은 신체가 이전에 마주쳤던 항원을 신속하고 특이적으로 인식하여 상응하는 면역 반응을 개시하는 면역계의 능력을 지칭한다. 일반적으로, 이들은 동일한 항원에 대한 2차, 3차 및 다른 후속 면역 반응이다. 면역학적 기억은 면역계의 적응 성분, 특수 T 및 B 세포 - 소위 기억 T 및 B 세포를 담당한다. 항원-나이브 T 세포는 전문 항원 제시 세포 (예를 들어 수지상 세포)의 표면 상의 MHC 분자의 콘텍스트 내에서 그의 동족 항원과 마주친 후에 기억 및 이펙터 T 세포로 확장 및 분화된다. 모든 기억 T 세포 하위유형에 대한 단일 통합 주제는, 이들이 수명이 길고, 그의 동족 항원에 대한 재-노출시에 다수의 이펙터 T 세포로 신속하게 확장될 수 있다는 것이다. 이러한 메카니즘에 의해, 이들은 이전에 마주친 병원체에 대한 "기억"을 면역계에 제공한다. 기억 T 세포는 CD4+ 또는 CD8+일 수 있고, 통상적으로 CD45RO를 발현한다. 전임상 세팅에서, 면역학적 기억은 종양 리챌린지 패러다임에서 시험될 수 있다.

이소형-특이적: 용어 "이소형 특이성"은 다른 구조적으로 관련된 이소형에 비해 하나의 이소형을 구별하는 작용제의 능력 (즉, 선택성)을 지칭한다. 이소형-특이적 TGFβ 억제제는 TGFβ의 하나의 이소형에 대해 그의 억제 활성을 발휘하지만, 주어진 농도의 TGFβ의 다른 이소형에 대해서는 그렇지 않다. 예를 들어, 이소형-특이적 TGFβ1 항체는 TGFβ1에 선택적으로 결합한다. TGFβ1-특이적 억제제 (항체)는 실질적으로 더 큰 친화도로 TGFβ2 또는 TGFβ3에 비해 TGFβ1 이소형을 우선적으로 표적화한다 (결합하여 억제한다). 예를 들어, 이와 관련하여 선택성은 시험관내 결합 검정, 예컨대 옥테트® 및 비아코어에 의해 측정된 각각의 친화도에서의 적어도 500-1000배 차이를 지칭할 수 있다. 일부 실시양태에서, 선택성은 억제제가 생체내에서 TGFβ1을 억제하는데 효과적인 투여량으로 사용되는 경우에 TGFβ2 및 TGFβ3을 억제하지 않도록 하는 것이다. 이러한 억제제가 치료제로서 유용하기 위해, 바람직한 효과를 달성하기 위한 투여량 (예를 들어, 치료 유효량)은 억제제가 TGFβ2 또는 TGFβ3을 억제하지 않으면서 TGFβ1 이소형을 효과적으로 억제할 수 있는 범위 내에 속해야 한다.

단리된: 본원에 사용된 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 단리된 항체는 다른 의도되지 않은 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없다.

대형 잠복 복합체: 본 개시내용과 관련하여 용어 "대형 잠복 복합체" ("LLC")는 소위 제시 분자에 결합된 프로TGFβ1 이량체로 구성된 복합체를 지칭한다. 따라서, 대형 잠복 복합체는 제시 분자-프로TGFβ1 복합체, 예컨대 LTBP1-프로TGFβ1, LTBP3-프로TGFβ1, GARP-프로TGFβ1 및 LRRC33-프로TGFβ1이다. 이러한 복합체는 복합체를 형성할 수 있는 재조합, 정제된 성분을 사용하여 시험관내에서 형성될 수 있다. 스크리닝 목적을 위해, 이러한 LLC를 형성하는데 사용되는 제시 분자는 전장 폴리펩티드일 필요는 없지만; 그러나, 그의 N-말단 영역 부근의 시스테인 잔기를 통해 프로TGFβ1 이량체 복합체와 디술피드 결합을 형성할 수 있는 단백질의 부분이 전형적으로 요구된다.

잠복성 연관 펩티드 (LAP): LAP는 프로TGFβ1의 소위 "프로도메인"이다. 본원에 보다 상세하게 기재된 바와 같이, LAP는 "직쇄형 재킷" 도메인 및 "아암" 도메인으로 구성된다. 직쇄형 재킷 자체는 알파-1 헬릭스 및 잠복성 라쏘 도메인으로 추가로 나누어진다.

잠복성 라쏘: 본원에 사용된 바와 같이, 때때로 잠복성 루프로도 지칭되는 "잠복성 라쏘"는 알파-1 헬릭스 및 프로TGFβ1의 프로도메인 내의 아암이 플랭킹된 도메인이다. 그의 비돌연변이된 형태에서, 인간 프로TGFβ1의 잠복성 라쏘는 다음 아미노산 서열: LASPPSQGEVPPGPL (서열식별번호: 153)을 포함하며, 실질적으로 도 18a에 제시된 영역 "2a" 및 "2b"에 상응하고, 도 19a에서 확인된 영역 1이 관통된다. 본원에 사용된 용어 "연장된 잠복성 라쏘 영역"은 프로도메인의 알파-2 헬릭스 (α2-헬릭스)로 지칭되는 그의 바로 옆 C-말단 모티프와 함께 잠복성 라쏘 영역을 지칭한다. 잠복성 라쏘의 C-말단에 있는 프롤린 잔기는 라쏘 루프를 α2-헬릭스에 연결하는 "엘보"와 같은 수직 "턴"을 제공한다. 연장된 잠복성 라쏘는 도 18 및 19에서 "2a", "2b" 및 "2c"로 제시된 영역을 포함한다. 특정 고친화도 TGFβ1 활성화 억제제는 적어도 부분적으로 잠복성 라쏘 또는 그의 부분에 결합하여 억제 효력 (예를 들어, 활성화를 차단하는 능력)을 부여하며, 여기서 임의로 잠복성 라쏘의 부분은 ASPPSQGEVPPGPL (서열식별번호: 266)이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 ASPPSQGEVPPGPL (서열식별번호: 266)의 프로TGFβ1 복합체 또는 그의 부분에 결합한다. 특정 고친화도 TGFβ1 활성화 억제제는 연장 잠복성 라쏘 또는 그의 부분에 적어도 부분적으로 결합하여 억제 효력 (예를 들어, 활성화를 차단하는 능력)을 부여하며, 여기서 임의로 연장된 잠복성 라쏘의 부분은 KLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVL (서열식별번호: 169)이다.

국재화된: 본 개시내용과 관련하여, 용어 "국재화된" ("국재화된 종양", "질환-국재화된" 등에서와 같음)은 전신 질환과는 대조적으로 해부학적으로 단리되거나 단리가능한 이상, 예컨대 고형 악성종양을 지칭한다. 예를 들어, 특정 백혈병은 질환에 대해 국재화된 성분 (예를 들어 골수) 및 전신 성분 (예를 들어 순환 혈액 세포) 둘 다를 가질 수 있다.

LRRC33-프로TGFβ1 복합체: 본원에 사용된 용어 "LRRC33-TGFβ1 복합체"는 전구-단백질 형태 또는 잠복 형태의 형질전환 성장 인자-β1 (TGFβ1) 단백질과 류신-풍부 반복부-함유 단백질 33 (LRRC33; 반응성 산소 종의 음성 조절제 또는 NRROS로도 공지됨) 또는 그의 단편 또는 변이체 사이의 복합체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, LRRC33-TGFβ1 복합체는 1개 이상의 디술피드 결합을 통해 프로/잠복 TGFβ1과 공유 연결된 LRRC33을 포함한다. 실제로, 이러한 공유 결합은 프로TGFβ1 이량체 복합체의 N-말단 (예를 들어, 아미노산 위치 4) 근처에 존재하는 시스테인 잔기와 함께 형성된다. 다른 실시양태에서, LRRC33-TGFβ1 복합체는 프로/잠복 TGFβ1과 비-공유 연결된 LRRC33을 포함한다. 일부 실시양태에서, LRRC33-TGFβ1 복합체는 자연-발생 복합체, 예를 들어 세포 내의 LRRC33-TGFβ1 복합체이다. 용어 "hLRRC33"은 인간 LRRC33을 나타낸다. 생체내에서, 세포 표면 상의 LRRC33 및 LRRC33-함유 복합체는 내재화될 수 있다. LRRC33은 M2-분극화된 대식세포 (예컨대 TAM) 및 MDSC를 포함한 골수 세포의 하위세트 상에서 발현된다.

LTBP1-프로TGFβ1 복합체: 본원에 사용된 용어 "LTBP1-TGFβ1 복합체"는 전구-단백질 형태 또는 잠복 형태의 형질전환 성장 인자-β1 (TGFβ1) 단백질 및 잠복 TGF-베타 결합 단백질 1 (LTBP1) 또는 그의 단편 또는 변이체를 포함하는 단백질 복합체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, LTBP1-TGFβ1 복합체는 1개 이상의 디술피드 결합을 통해 프로/잠복 TGFβ1과 공유 연결된 LTBP1을 포함한다. 실제로, 이러한 공유 결합은 프로TGFβ1 이량체 복합체의 N-말단 (예를 들어, 아미노산 위치 4) 근처에 존재하는 시스테인 잔기와 함께 형성된다. 다른 실시양태에서, LTBP1-TGFβ1 복합체는 프로/잠복 TGFβ1과 비-공유 연결된 LTBP1을 포함한다. 일부 실시양태에서, LTBP1-TGFβ1 복합체는 자연-발생 복합체, 예를 들어 세포 내의 LTBP1-TGFβ1 복합체이다. 용어 "hLTBP1"은 인간 LTBP1을 나타낸다.

LTBP3-프로TGFβ1 복합체: 본원에 사용된 용어 "LTBP3-TGFβ1 복합체"는 전구-단백질 형태 또는 잠복 형태의 형질전환 성장 인자-β1 (TGFβ1) 단백질 및 잠복 TGF-베타 결합 단백질 3 (LTBP3) 또는 그의 단편 또는 변이체를 포함하는 단백질 복합체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, LTBP3-TGFβ1 복합체는 1개 이상의 디술피드 결합을 통해 프로/잠복 TGFβ1과 공유 연결된 LTBP3을 포함한다. 실제로, 이러한 공유 결합은 프로TGFβ1 이량체 복합체의 N-말단 (예를 들어, 아미노산 위치 4) 근처에 존재하는 시스테인 잔기와 함께 형성된다. 다른 실시양태에서, LTBP3-TGFβ1 복합체는 프로/잠복 TGFβ1과 비-공유 연결된 LTBP1을 포함한다. 일부 실시양태에서, LTBP3-TGFβ1 복합체는 자연-발생 복합체, 예를 들어 세포 내의 LTBP3-TGFβ1 복합체이다. 용어 "hLTBP3"은 인간 LTBP3을 나타낸다.

M2 또는 M2-유사 대식세포: M2 대식세포는 활성화된 또는 분극화된 대식세포의 하위세트를 나타내고, 섬유화 및 종양 미세환경 둘 다에서의 질환-연관 대식세포를 포함한다. M2-분극화된 대식세포에 대한 세포-표면 마커는 전형적으로 CD206 및 CD163 (즉, CD206+/CD163+)을 포함한다. M2-분극화된 대식세포는 또한 세포-표면 LRRC33을 발현할 수 있다. M2 대식세포의 활성화는 주로 IL-4, IL-13, IL-10 및 TGFβ에 의해 촉진되며; 이들은 이들을 활성화시키는 동일한 시토카인 (IL-4, IL-13, IL-10 및 TGFβ)을 분비한다. 이들 세포는 높은 식세포 능력을 갖고, ECM 성분, 혈관신생 및 화학주성 인자를 생산한다. 대식세포에 의한 TGFβ의 방출은 질환 조직, 예컨대 섬유화 조직 및 종양 기질에서 근섬유모세포 활성화, EMT 및 EndMT 유도를 영속화시킬 수 있다. 예를 들어, M2 대식세포는 TGFβ-구동된 폐 섬유증에 필수적이고, 또한 다수의 종양에서 풍부화된다.

매트릭스-연관 프로TGFβ1: LTBP1 및 LTBP3은 세포외 매트릭스 (ECM)의 성분인 제시 분자이다. LTBP1-프로TGFβ1 및 LTBP3-프로TGFβ1은 ECM-연관 TGFβ1 활성화/신호전달을 매개하는 "ECM-연관" (또는 "매트릭스-연관") 프로TGFβ1 복합체로 집합적으로 지칭될 수 있다. 상기 용어는 또한 매트릭스 또는 기질에 물리적으로 부착되어 있지 않는, 용액 중의 (예를 들어, 시험관내 검정에서의) 재조합, 정제된 LTBP1-프로TGFβ1 및 LTBP3-프로TGFβ1 복합체를 포함한다.

최대 허용 용량 (MTD): 용어 MTD는 일반적으로 안전성/독성학 고려사항과 관련하여, 무관찰 유해 효과 수준 (NOAEL)으로 평가된 시험 물품 (예컨대 TGFβ1 억제제)의 가장 높은 양을 지칭한다. 예를 들어, 래트에서 Ab6에 대한 NOAEL은 평가된 최고 용량 (100 mg/kg)이었으며, 이는 4-주 독성학 연구에 기초하여 Ab6에 대한 MTD가 >100 mg/kg이라는 것을 시사한다. 비-인간 영장류에서 Ab6에 대한 NOAEL은 평가된 최고 용량 (300 mg/kg)이었으며, 이는 4-주 독성학 연구에 기초하여 비-인간 영장류에서 Ab6에 대한 MTD가 >300 mg/kg이라는 것을 시사한다.

메소-스케일 디스커버리: "메소-스케일 디스커버리" 또는 "MSD"는 검출 기술로서 전기화학발광 (ECL)을 사용하는 면역검정의 유형이다. 전형적으로, 고 결합 탄소 전극이 단백질 (예를 들어, 항체)을 포획하는데 사용된다. 항체는 특정한 항원과 함께 인큐베이션될 수 있으며, 결합은 전기화학발광 표지에 접합된 2차 항체로 검출될 수 있다. 전기적 신호시, 광 강도를 측정하여 샘플 내의 분석물을 정량화할 수 있다.

골수섬유증: 골골수섬유증으로도 공지된 "골수섬유증"은 골수증식성 장애로 불리는 질환의 군에 속하는 비교적 드문 골수 증식성 장애 (예를 들어 암)이다. 골수섬유증은 골수증식성 신생물의 필라델피아 염색체-음성 (-) 분지로 분류된다. 골수섬유증은, 골수 및 다른 부위에서의 조혈 줄기 세포의 비정상적 클론의 증식으로 인해 섬유증이 유발되는 것, 또는 골수가 반흔 조직으로 대체되는 것을 특징으로 한다. 용어 골수섬유증은 만성 특발성 골수섬유증 (cIMF)으로도 지칭되는 원발성 골수섬유증 (PMF) (용어 특발성 및 원발성은 이들 경우에 질환이 미지의 또는 자발적 기원의 것임을 의미함), 뿐만 아니라 속발성 유형의 골수섬유증, 예컨대 진성 다혈구혈증 (PV) 또는 본태성 혈소판혈증 (ET)에 속발성으로 발생하는 골수섬유증을 포괄한다. 골수섬유증은 골수 화생의 형태이며, 이는 골수의 혈액-형성 조직 내의 세포 유형에서의 변화를 지칭하고, 종종 2개의 용어는 동의어로 사용된다. 용어 원인불명 골수 화생 및 골수 화생 동반 골수섬유증 (MMM)은 또한 원발성 골수섬유증을 지칭하는 것으로 사용된다. 골수섬유증은 하류 JAK 경로의 상향조절 또는 과다활성화를 유발하는 돌연변이를 특징으로 한다.

골수 세포: 조혈에서, 골수 세포는 B 세포 및 T 세포를 발생시키는 공통 림프성 전구 세포로부터 유래하는 림프성 세포, 즉 림프구와 구별되게, 과립구, 단핵구, 적혈구 또는 혈소판에 대한 전구 세포 (공통 골수 전구 세포, 즉 CMP 또는 CFU-GEMM)로부터, 또는 또한 종종 사용되는 보다 좁은 의미에서, 구체적으로 골수모세포의 계통 (골수 세포, 단핵구 및 그의 딸세포 유형)으로부터 발생하는 혈액 세포이다. 특정 골수 세포 유형, 그의 일반적 형태, 전형적인 세포 표면 마커, 및 마우스 및 인간 둘 다에서의 그의 면역-억제 능력이 하기에 요약되어 있다.

골수-유래 억제 세포: 골수-유래 억제 세포 (MDSC)는 다양한 병리학적 상태 동안 생성되고 단핵구 및 비교적 미성숙 호중구의 활성화의 병리학적 상태를 나타내는 것으로 생각되는 이종 세포 집단이다. MDSC는 i) 호중구와 표현형적으로 및 형태학적으로 유사한 "과립구" (G-MDSC) 또는 다형핵 (PMN-MDSC); 및 ii) 단핵구와 표현형적으로 및 형태학적으로 유사한 단핵구 (M-MDSC)로 명명되는 적어도 2종의 카테고리의 세포를 포함한다. MDSC는 별개의 세트의 게놈 및 생화학적 특색을 특징으로 하고, 특이적 표면 분자에 의해 구별될 수 있다. 예를 들어, 인간 G-MDSC/PMN-MDSC는 전형적으로 세포-표면 마커 CD11b, CD33, CD15 및 CD66을 발현한다. 추가로, 인간 G-MDSC/PMN-MDSC는 또한 HLA-DR 및/또는 아르기나제를 발현할 수 있다. 비교로, 인간 M-MDSC는 전형적으로 세포 표면 마커 CD11b, CD33 및 CD14를 발현한다. 추가로, 인간 M-MDSC는 또한 HLA-DR을 발현할 수 있다. 이러한 세포-표면 마커에 추가로, MDSC는 면역 세포, 예컨대 T 세포, NK 세포 및 B 세포를 억제하는 능력을 특징으로 한다. MDSC의 면역 억제 기능은 항원-비-특이적 기능의 억제 및 항원-특이적 기능의 억제를 포함할 수 있다. MDSC는 세포 표면 LRRC33 및/또는 LRRC33-프로TGFβ1을 발현할 수 있다.

근섬유모세포: 근섬유모세포는 섬유모세포 및 평활근 세포의 특정 표현형을 갖는 세포이고, 일반적으로 비멘틴, 알파-평활근 액틴 (α-SMA; 인간 유전자 ACTA2) 및 팔라딘을 발현한다. 세포외 매트릭스 조절이상 (예컨대 증가된 매트릭스 강성)을 수반하는 많은 질환 상태에서, 정상 섬유모세포 세포는 TGFβ-의존성 방식으로 근섬유모세포로 탈분화된다. TGFβ의 이상 과다발현은 근섬유모세포-구동된 병리상태 중에서 공통적이다. TGFβ는 근섬유모세포 분화, 세포 증식 및 매트릭스 생산을 촉진하는 것으로 공지되어 있다. 섬유화 미세환경 내의 근섬유모세포 또는 근섬유모세포-유사 세포는 섬유증-연관 섬유모세포 (또는 "FAF")로 지칭될 수 있고, 종양 미세환경 내의 근섬유모세포 또는 근섬유모세포-유사 세포는 암-연관 섬유모세포 (또는 "CAF")로 지칭될 수 있다.

범-TGFβ 억제제/TGFβ의 범-억제: 용어 "범-TGFβ 억제제"는 TGFβ의 모든 3종의 이소형을 억제하거나 길항할 수 있는 임의의 작용제를 지칭한다. 이러한 억제제는 TGFβ 이소형의 소분자 억제제, 예컨대 관련 기술분야에 공지된 것일 수 있다. 상기 용어는 각각의 TGFβ 이소형, 즉 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3에 결합할 수 있는 임의의 항체를 지칭하는 범-TGFβ 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 범-TGFβ 항체는 모든 3종의 이소형, 즉 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3에 결합하여 그의 활성을 중화시킨다. 항체 1D11 (또는 인간 유사체 프레솔리무맙 (GC1008))은 TGFβ의 모든 3종의 이소형을 중화시키는 범-TGFβ 항체의 널리 공지된 예이다. 소분자 범-TGFβ 억제제의 예는 모든 3종의 TGFβ 이소형의 신호전달을 매개하는 TGFβ 수용체 I 키나제/ALK5에 대한 길항제인 갈루니세르팁 (LY2157299 1수화물)을 포함한다.

혈관주위 (침윤): 접두어 "주위-"는 "주변", "둘레" 또는 "근처"를 의미하며, 따라서 "혈관주위"는 문자 그대로 혈관의 주변으로 해석된다. 종양 세포 침윤물과 관련하여 본원에 사용된 용어 "혈관주위 침윤"은 고형 종양의 혈관계를 통한 종양-침윤 면역 세포 (예를 들어, 림프구)에 대한 진입 방식을 지칭한다.

효력: 본원에 사용된 용어 "효력"은 정의된 효과를 생성하기 위한 약물의 농도 또는 양에 관한 약물, 예컨대 억제 활성을 갖는 억제 항체 (또는 단편)의 활성을 지칭한다. 예를 들어, 주어진 투여량에서 특정 효과를 생성할 수 있는 항체는 등가의 효과를 생성하기 위해 2배의 양 (투여량)을 필요로 하는 또 다른 항체보다 더 효력이 있다. 효력은 세포-기반 검정, 예컨대 TGFβ 활성화/억제 검정에서 측정될 수 있고, 이에 의해 TGFβ 활성화, 예컨대 인테그린 결합에 의해 촉발되는 활성화의 정도는 세포-기반 시스템에서 시험 물품 (예를 들어, 억제 항체)의 존재 또는 부재 하에 측정될 수 있다. 전형적으로, 항원의 동일한 또는 중첩되는 결합 영역에 결합할 수 있는 항체 (예를 들어, 교차-차단 항체) 중에서, 더 높은 친화도 (더 낮은 K_D 값)를 갖는 항체는 더 낮은 친화도 (더 큰 K_D 값)를 갖는 항체보다 더 높은 효력을 나타내는 경향이 있다.

제시 분자: 본 개시내용과 관련하여 제시 분자는 잠복 전구-단백질 (예를 들어, 프로TGFβ1)과 공유 결합을 형성하고 세포외 함요 (예컨대, ECM 또는 면역 세포 표면)에 불활성 복합체를 테더링 ("제시")하여 활성화 사건이 발생할 때까지 그의 잠복성을 유지하는 단백질을 지칭한다. 프로TGFβ1에 대한 공지된 제시 분자는 다음을 포함한다: 각각 제시 분자-프로TGFβ1 복합체 (즉, LLC), 즉 각각 LTBP1-프로TGFβ1, LTBP3-프로TGFβ1, GARP-프로TGFβ1 및 LRRC33-프로TGFβ1을 형성할 수 있는 LTBP1, LTBP3, GARP 및 LRRC33. 사실상, LTBP1 및 LTBP3은 세포외 매트릭스 (ECM)의 성분이고; 따라서, LTBP1-프로TGFβ1 및 LTBP3-프로TGFβ1은 ECM-연관 TGFβ1 신호전달/활성을 매개하는 "ECM-연관" (또는 "매트릭스-연관") 프로TGFβ1 복합체로 집합적으로 지칭될 수 있다. GARP 및 LRRC33은, 다른 한편으로는, 특정 세포의 세포 표면 상에서 발현된 막횡단 단백질이고; 따라서, GARP-프로TGFβ1 및 LRRC33-프로TGFβ1은 세포-연관 (예를 들어, 면역 세포-연관) TGFβ1 신호전달/활성을 매개하는 "세포-연관" (또는 "세포-표면") 프로TGFβ1 복합체로 집합적으로 지칭될 수 있다.

보호 (용매 노출로부터): 단백질-단백질 상호작용, 예컨대 항체-항원 결합의 HDX-MS-기반 평가와 관련하여, 단백질 (예를 들어, 에피토프를 함유하는 단백질의 영역)이 용매에 노출되어, 양성자 교환이 일어나도록 하는 정도는 결합/상호작용의 정도와 역의 상관관계가 있다. 따라서, 본원에 기재된 항체가 항원의 영역에 결합할 때, 단백질-단백질 상호작용이 결합 영역을 주위 용매에 의해 접근가능하지 못하게 하기 때문에 결합 영역은 용매에 대한 노출로부터 "보호된다". 따라서, 보호된 영역은 상호작용 부위를 나타낸다. 전형적으로, 적합한 용매는 생리학적 완충제이다.

프로TGFβ1: 본원에 사용된 용어 "프로TGFβ1"은 복합체 내에 TGFβ1의 프로도메인 서열을 포함하는 불활성 TGFβ1 복합체의 전구체 형태를 포괄하는 것으로 의도된다. 따라서, 상기 용어는 TGFβ1의 잠복-형태뿐만 아니라 프로-형태를 포함할 수 있다. 표현 "프로/잠복 TGFβ1"은 상호교환가능하게 사용될 수 있다. TGFβ1의 "프로" 형태는 푸린 부위에서의 단백질분해적 절단 전에 존재한다. 일단 절단되면, 생성된 형태는 TGFβ1의 "잠복" 형태인 것으로 언급된다. "잠복" 복합체는 추가의 활성화 촉발, 예컨대 인테그린-구동된 활성화 사건까지 비-공유 회합된 채로 유지된다. 프로TGFβ1 복합체는 디술피드 결합과 연결된 이량체 TGFβ1 전구-단백질 폴리펩티드로 구성된다. 잠복 이량체 복합체는 각각의 프로TGFβ1 폴리펩티드의 위치 4의 시스테인 잔기 (Cys4)를 통해 단일 제시 분자에 공유 연결된다. 형용사 "잠복"은 일반적으로/광범위하게 인테그린-매개 또는 다른 활성화 사건 전에 TGFβ1의 "불활성" 상태를 기재하는 것으로 사용될 수 있다. 프로TGFβ1 폴리펩티드는 프로도메인 (LAP) 및 성장 인자 도메인 (서열식별번호: 146)을 함유한다.

퇴행 (종양 퇴행): 종양 퇴행 또는 종양 성장이 생체내 효능 척도로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 전임상 세팅에서, 중앙값 종양 부피 (MTV) 및 퇴행 반응에 대한 기준의 치료 효능은 마지막 날에 연구에 남아있는 동물의 종양 부피로부터 결정될 수 있다. 치료 효능은 또한 연구 동안 관찰된 퇴행 반응의 발생률 및 크기로부터 결정될 수 있다. 치료는 동물에서 종양의 부분 퇴행 (PR) 또는 완전 퇴행 (CR)을 유발할 수 있다. 요법 (예를 들어, 약물의 투여)에 반응하여 달성되는 완전 퇴행이 "완전 반응"으로 지칭될 수 있고, 완전 반응을 달성하는 대상체는 "완전 반응자"로 지칭될 수 있다. 따라서, 완전 반응은 자발적 완전 퇴행을 배제한다. 전임상 종양 모델의 일부 실시양태에서, PR 반응은 연구 과정 동안 3회 연속 측정에 대해 그의 제1일 부피의 50% 이하이고 이들 3회 측정 중 1회 이상에 대해 13.5 mm³ 이상인 종양 부피로서 정의된다. 일부 실시양태에서, CR 반응은 연구 과정 동안 3회 연속 측정에 대해 13.5 mm³ 미만인 종양 부피로서 정의된다. 전임상 모델에서, 연구 종료시에 CR 반응을 갖는 동물은 추가적으로 무종양 생존자 (TFS)로서 분류될 수 있다. 용어 "유효 종양 제어"는 치료에 반응하여 달성되는 종양 퇴행의 정도를 지칭하는 것으로 사용될 수 있으며, 여기서, 예를 들어 종양 부피는 치료에 반응하여 종점 종양 부피의 <25%로 감소된다. 예를 들어, 특정한 모델에서, 종점 종양 부피가 2,000 mm³인 경우에, 종양이 500 mm³ 미만으로 감소되는 경우 유효 종양 제어가 달성된다. 따라서, 유효 종양 제어는 완전 퇴행, 뿐만 아니라 한계값 감소에 도달하는 부분 퇴행을 포괄한다.

조절 T 세포: "조절 T 세포" 또는 Treg는 바이오마커 CD4, FOXP3 및 CD25의 발현을 특징으로 하는 면역 세포의 유형이다. Treg는 때때로 억제 T 세포로서 지칭되며, 면역계를 조정하고, 자기-항원에 대한 관용을 유지하고, 자가면역 질환을 예방하는 T 세포의 하위집단을 나타낸다. Treg는 면역억제성이고, 일반적으로 이펙터 T (Teff) 세포의 유도 및 증식을 억제하거나 하향조절한다. Treg는 흉선에서 발생할 수 있거나 (소위 CD4+ Foxp3+ "자연" Treg), 예를 들어 TGFβ 또는 레티노산에 대한 노출 후에 말초에서 나이브 CD4+ T 세포로부터 분화될 수 있다. Treg는 세포 표면 GARP-프로TGFβ1을 발현할 수 있다.

저항성 (요법에 대한): 특정한 요법 (예컨대 CBT)에 대한 저항성은 암과 같은 질환의 선천성 특징 ("1차 저항성")에 기인하거나, 또는 치료 후 시간 경과에 따라 발생하는 후천성 표현형 ("획득 저항성")에 기인할 수 있다. 요법에 대한 치료 반응을 나타내지 않는 환자 (예를 들어, 비-반응자이거나 또는 요법에 불량하게 반응성인 환자)는 요법에 대해 1차 저항성을 갖는 것으로 언급된다. 초기에 요법에 대한 치료 반응을 나타내지만 나중에 효과를 상실하는 (예를 들어, 계속된 요법에도 불구하고 진행 또는 재발생) 환자는 요법에 대한 획득 저항성을 갖는 것으로 언급된다.

고형 종양의 반응 평가 기준 (RECIST) 및 iRECIST: RECIST는 암 환자에서의 종양이 치료 동안 개선되거나 ("반응"), 동일하게 유지되거나 ("안정화"), 악화되는 ("진행") 때를 정의하는 공개된 규칙 세트이다. 이 기준은 유럽 암 연구 및 치료 기구 (EORTC), 미국 국립 암 연구소 및 캐나다 국립 암 연구소 임상 시험 그룹을 포함한 국제 협력에 의해 2000년 2월에 공개되었다. 후속적으로, RECIST 가이드라인의 개정 버전 (RECIST v 1.1)이 널리 적합화되었다 (문헌 [Eisenhauera et al. (2009), "New response evaluation criteria in solid tumours: Revised RECIST guideline (version 1.1)" Eur J Cancer 45: 228-247] (본원에 포함됨) 참조).

반응 기준은 하기와 같다: 완전 반응 (CR): 모든 표적 병변의 소멸; 부분 반응 (PR): 기준선 합계 LD를 참조로 하여 표적 병변의 LD의 합계의 적어도 30% 감소; 안정 질환 (SD): 치료를 시작한 이후 최소 합계 LD를 참조로 하여 PR에 대한 자격을 갖기에 충분한 수축도 없고 PD에 대한 자격을 갖기에 충분한 증가도 없음; 진행성 질환 (PD): 치료를 시작한 이후 기록된 최소 합계 LD를 참조로 하여 표적 병변의 LD의 합계의 적어도 20% 증가 또는 1개 이상의 새로운 병변의 출현.

다른 한편으로는, iRECIST는 면역-관련 반응을 고려하는 변형된 기준 세트를 제공한다 (www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5648544/ (이의 내용은 본원에 참조로 포함됨) 참조). RECIST 및 iRECIST 기준은 표준화되어 있고, 보다 많은 데이터가 이용가능해짐에 따라 때때로 개정될 수 있으며, 관련 기술분야에서 널리 이해된다.

고형 종양: 용어 "고형 종양"은 통상적으로 낭 또는 액체 영역을 함유하지 않는 조직의 비정상적 성장 또는 덩어리를 생성하는 증식성 장애를 지칭한다. 고형 종양은 양성 (비-암성) 또는 악성 (암성)일 수 있다. 고형 종양은 진행성 악성종양의 종양, 예컨대 국부 진행성 고형 종양 및 전이성 암을 포함한다. 고형 종양은 전형적으로 암성 (악성) 세포, 기질 세포, 예컨대 CAF, 및 침윤 백혈구, 예컨대 대식세포, MDSC 및 림프구를 비제한적으로 포함하는 다중 세포 유형으로 구성된다. 본원에 기재된 것과 같은 TGFβ1의 이소형-선택적 억제제로 치료될 고형 종양은 전형적으로 TGFβ1을 생산하는 다중 세포 유형을 포함할 수 있는 TGFβ1-양성 (TGFβ1+) 종양이다. 특정 실시양태에서, TGFβ1+ 종양은 또한 TGFβ3 (즉, TGFβ3-양성)을 공동-발현할 수 있다. 예를 들어, 특정 종양은 TGFβ1/3-공동-우성이다. 일부 실시양태에서, 이러한 종양은 상피 세포의 암, 예를 들어 암종에 의해 유발된다.

용액 평형 적정 (SET): SET는 2종의 분자 (예컨대 항원 및 항원에 결합하는 항체) 사이의 결합이 용액 중 평형상태에서 측정될 수 있는 검정이다. 예를 들어, 메소-스케일 디스커버리 ("MSD")-기반 SET 또는 MSD-SET는 평형상태에서 특히 고친화도 단백질-단백질 상호작용, 예컨대 항원에 결합하는 피코몰-친화도 항체에 대한 해리 상수를 결정하는 유용한 방식이다 (예를 들어, 문헌 [Ducata et al. (2015) J Biomolecular Screening 20(10): 1256-1267] 참조). SET-기반 검정은 나노몰 미만 (예를 들어, 피코몰) 친화도를 갖는 항체의 K_D 값을 결정하는데 특히 유용하다.

특이적 결합: 본원에 사용된 용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합한다"는 항체 또는 그의 항원 결합 부분과 항원의 상호작용이 특정한 구조 (예를 들어, 항원 결정기 또는 에피토프)의 존재에 의존한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 일반적인 단백질보다는 특이적 단백질에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 항체가 표적, 예를 들어 TGFβ1에 대해 적어도 약 10^-8 M, 10^-9 M, 10^-10 M, 10^-11 M, 10^-12 M 또는 그 미만의 K_D를 갖는 경우에, 표적에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 본원에 사용된 용어 "프로TGFβ1의 에피토프에 대한 특이적 결합", "프로TGFβ1의 에피토프에 특이적으로 결합한다", "프로TGFβ1에 대한 특이적 결합", 또는 "프로TGFβ1에 특이적으로 결합한다"는, 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 표면 플라즈몬 공명 및 생물층 간섭측정법 (BLI)에 의해 결정시 1.0 x 10^-8 M 이하의 해리 상수 (K_D)를 갖는, 프로TGFβ1에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 지칭한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 프로TGFβ1의 인간 및 비-인간 (예를 들어, 마우스) 오르토로그 둘 다에 특이적으로 결합할 수 있다.

대상체: 치료 용도와 관련하여 용어 "대상체"는 임상 관리 또는 개입, 예컨대 치료, 진단 등을 받는 개체를 지칭한다. 적합한 대상체는 포유동물 (예를 들어, 인간 및 비-인간 포유동물)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 척추동물을 포함한다. 대상체가 인간 대상체인 경우에, 용어 "환자"는 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 임상 상황에서, 용어 "환자 집단" 또는 "환자 하위집단"은 일련의 기준, 예컨대 임상 기준 (예를 들어, 질환 제시, 질환 병기, 특정 상태에 대한 감수성, 요법에 대한 반응성 등), 병력, 건강 상태, 성별, 연령 군, 유전적 기준 (예를 들어, 특정 돌연변이의 보유자, 다형성, 유전자 중복, DNA 서열 반복 등) 및 생활방식 인자 (예를 들어, 흡연, 알콜 소비, 운동 등) 내에 속하는 개체의 군을 지칭하는 것으로 사용된다.

표면 플라즈몬 공명 (SPR): 표면 플라즈몬 공명은 비표지된 상호작용물의 검출을 실시간으로 가능하게 하는 광학 현상이다. SPR-기반 바이오센서, 예컨대 비아코어로부터 상업적으로 입수가능한 것을 사용하여 단백질-단백질 상호작용, 예컨대 항원-항체 결합을 포함한 생체분자 상호작용을 측정할 수 있다. 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 파라미터, 예컨대 결합 친화도, 동역학적 속도 상수 및 열역학의 결정에 유용하다.

TGFβ1-관련 적응증: "TGFβ1-관련 적응증"은 TGFβ1-연관 장애이고, 발병기전 및/또는 진행의 적어도 일부가 TGFβ1 신호전달 또는 그의 조절이상에 기인하는 임의의 질환 또는 장애 및/또는 상태를 의미한다. 특정 TGFβ1-연관 장애는 TGFβ1 이소형에 의해 우세하게 구동된다. TGFβ1-관련 적응증을 갖는 대상체는 TGFβ1의 활성 및/또는 수준의 억제로부터 이익을 얻을 수 있다. 특정 TGFβ1-관련 적응증은 TGFβ1 이소형에 의해 우세하게 구동된다. TGFβ1-관련 적응증은 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 섬유화 상태 (예컨대 기관 섬유증 및 만성 염증을 수반하는 조직의 섬유증), 증식성 장애 (예컨대 암, 예를 들어 고형 종양 및 골수섬유증), ECM 조절이상과 연관된 질환 (예컨대 매트릭스 강성화 및 재형성을 수반하는 상태), 중간엽 이행을 수반하는 질환 (예를 들어, EndMT 및/또는 EMT), 프로테아제를 수반하는 질환, 본원에 기재된 특정 마커의 이상 유전자 발현을 갖는 질환. 이들 질환 카테고리는 상호 배타적인 것으로 의도되지 않는다.

TGFβ 억제제: 용어 "TGFβ 억제제"는 TGFβ 성장 인자 (예를 들어, TGFβ1, TGFβ2 및/또는 TGFβ3)의 생물학적 활성, 신호전달 또는 기능을 길항할 수 있는 임의의 작용제를 지칭한다. 상기 용어는 그의 작용 메카니즘을 제한하는 것으로 의도되지 않으며, 예를 들어 TGFβ의 중화 억제제, 수용체 길항제, 가용성 리간드 트랩 및 활성화 억제제를 포함한다. TGFβ 억제제는 또한, 예를 들어 항체-의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC) 및/또는 항체-의존성 세포성 식세포작용 (ADPC)을 유도함으로써 함요에서 활성화될 수 있는 잠복 프로TGFβ의 이용가능성을 감소시킬 수 있는 항체, 뿐만 아니라 잠복 프로TGFβ를 포함하는 세포-표면 복합체의 내재화를 유발하여 세포 자체를 고갈시키지 않으면서 형질 막으로부터 전구체를 제거하는 항체를 포함한다. 내재화는 세포 표면 상에 LRRC33-함유 단백질 복합체 (예컨대 인간 LRRC33-프로TGFβ1)를 발현하는 세포의 감소된 수준을 유발하는 LRRC33-함유 단백질 복합체에 대한 적합한 작용 메카니즘일 수 있다.

"TGFβ 패밀리"는 TGFβ 슈퍼패밀리 내의 부류이고, 인간에서 구조적으로 유사한 3종의 구성원: TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3을 함유한다. 3종의 성장 인자는 동일한 수용체를 통해 신호전달하는 것으로 공지되어 있다.

TGFβ1-양성 암/종양: 본원에 사용된 용어는 이상 TGFβ1 발현 (과다발현)을 갖는 암/종양을 지칭한다. 많은 인간 암/종양 유형은 TGFβ1 ("TGFB"는 때때로 단백질이 아닌 유전자를 지칭하는데 사용된다는 것에 주목함) 이소형의 우세한 발현을 나타낸다. 일부 경우에, 이러한 암/종양은 또 다른 이소형, 예컨대 TGFβ3의 공동-우성 발현을 나타낼 수 있다. 다수의 상피암 (예를 들어, 암종)은 TGFβ1 및 TGFβ3을 공동-발현할 수 있다. TGFβ1-양성 종양의 종양 환경 내에서, TGFβ1은, 예를 들어 암 세포, 종양-연관 대식세포 (TAM), 암-연관 섬유모세포 (CAF), 조절 T 세포 (Treg), 골수-유래 억제 세포 (MDSC) 및 주위 세포외 매트릭스 (ECM)를 포함한 다중 공급원으로부터 발생할 수 있다. 본 개시내용과 관련하여, 인간 상태를 재현하는 전임상 암/종양 모델은 TGFβ1-양성 암/종양이다.

치료 범위: 용어 "치료 범위"는 대상체에서 유의한/관찰가능한/허용되지 않는 유해 효과를 유발하지 않으면서 (예를 들어, 허용되는 또는 용인되는 유해 효과 내에서) 치료 반응을 생성하는 투여량 범위를 지칭한다. 치료 범위는 최소 유효 농도 (MEC) 대 최소 독성 농도 (MTC) 사이의 비로서 계산될 수 있다. 예시하자면, 10 mg/kg 투여량에서 생체내 효능을 달성하고 100 mg/kg에서 내약성 또는 허용되는 독성을 나타내는 TGFβ1 억제제는 적어도 10배 (예를 들어, 10x) 치료 범위를 제공한다. 대조적으로, 10 mg/kg에서 효과적이지만 유효 용량 미만에서 유해 효과를 유발하는 TGFβ의 범-억제제는 "용량-제한 독성"을 갖는 것으로 언급된다. 일반적으로, 최대 허용 용량 (MTD)은 치료 범위의 상한을 설정할 수 있다.

예를 들어, Ab6은 약 3-30 mg/kg/주 범위의 투여량에서 효과적인 것으로 나타났고, 또한 래트 또는 비-인간 영장류에서 4주 동안 적어도 100 또는 300 mg/kg/주의 투여량에서 TGFβ의 범-억제와 연관된 관찰가능한 독성이 없는 것으로 나타났다. 이에 기초하여, Ab6은 최소 3.3배 내지 최대 100배 치료 범위를 나타낸다.

독성: 본원에 사용된 용어 "독성" 또는 "독성들"은 대상체 (예를 들어, 환자)에게 투여되는 요법과 연관된 대상체 (예를 들어, 환자)에서의 원치않는 생체내 효과, 예컨대 바람직하지 않은 부작용 및 유해 사건을 지칭한다. "내약성"은 독성으로 인해 요법을 중단하지 않으면서, 환자에 의해 합리적으로 허용될 수 있는, 요법 또는 치료 요법과 연관된 독성의 수준을 지칭한다. 전형적으로, 독성/독성학 연구는 약물 후보 (예를 들어, 모노클로날 항체 요법)의 안전성 프로파일을 평가하기 위해 임상 개발 전에 1종 이상의 전임상 모델에서 수행된다. 독성/독성학 연구는 시험 물품의 "무관찰 유해 효과 수준 (NOAEL)" 및 "최대 허용 용량 (MTD)"을 결정하는 것을 도울 수 있으며, 이에 기초하여 치료 범위가 추론될 수 있다. 바람직하게는, 특정한 개입에 감수성인 것으로 나타난 종이 안전성/독성 연구가 수행될 전임상 동물 모델로서 선택되어야 한다. TGFβ 억제의 경우에, 적합한 종은 래트, 개 및 시노를 포함한다. 특정 연구가 마우스에서 TGFβ의 범-억제로 관찰된 독성을 보고하고 있긴 하지만, 마우스는 TGFβ의 약리학적 억제에 덜 감수성인 것으로 보고되어 있고, 인간을 포함한 다른 종에서 잠재적으로 위험한 독성을 나타내지 않을 수 있다. 본 개시내용과 관련하여 예시하자면, 래트에서 Ab6에 대한 NOAEL은 평가된 최고 용량 (100 mg/kg)이었으며, 이는 MTD가 4-주 독성학 연구에 기초하여 >100 mg/kg이라는 것을 시사한다. 비-인간 영장류에서 Ab6의 MTD는 4-주 독성학 연구에 기초하여 >300 mg/kg이다.

NOAEL 및 MTD를 결정하기 위해, 바람직하게는, 특정한 개입에 감수성인 것으로 나타난 종이 안전성/독성학 연구가 수행될 전임상 동물 모델로서 선택되어야 한다. TGFβ 억제의 경우에, 적합한 종은 래트, 개 및 시노를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 마우스는 TGFβ의 약리학적 억제에 대해 덜 감수성인 것으로 보고되어 있고, 인간을 포함한 다른 종에서 잠재적으로 심각하거나 위험한 독성을 나타내지 않을 수 있다.

번역가능성: 약물 발견 및 임상 개발과 관련하여, 용어 "번역가능성" 또는 "번역가능한"은 인간 상태를 재현하는 전임상 모델 또는 데이터의 특정 품질 또는 특성을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, TGFβ1 적응증을 재현하는 전임상 모델은 전형적으로 TGFB2 (또는 TGFβ2) 및 TGFB3 (또는 TGFβ3)에 비해 TGFB1 (또는 TGFβ1)의 우세한 발현을 나타낸다. 예를 들어, 조합 요법 패러다임에서, 번역가능성은 활성제의 조합이 모델에서 발효될 것을 목표로 하는 동일한 기저 작용 메카니즘을 필요로 할 수 있다. 예로서, 많은 인간 종양은 면역 배제되며, 체크포인트 차단 요법 (CBT)에 대한 1차 저항성을 나타내는 TGFβ1-양성 종양이다. 제2 요법 (예컨대 TGFβ1 억제제)은 CBT에 대한 저항성을 극복하기 위해 조합되어 사용될 수 있다. 이러한 시나리오에서, 적합한 번역가능한 전임상 모델은 체크포인트 차단 요법 (CBT)에 대한 1차 저항성을 나타내는 TGFβ1-양성 종양을 포함한다.

치료하다/치료: 용어 "치료하다" 또는 "치료"는 대상체에서 장애 또는 다른 위험 인자가 발생할 위험를 감소시키는 치유적 치료, 예방적 치료 및 적용을 포함한다. 따라서, 상기 용어는 광범위하게 다음을 의미하는 것으로 의도된다: 예를 들어 신체의 면역을 증진시키거나 부스팅함으로써 환자에서 치료 이익을 유발하는 것; 면역 억제를 감소시키거나 역전시키는 것; 신체로부터 유해 세포 또는 물질을 감소시키거나, 제거하거나, 근절시키는 것; 질환 부담 (예를 들어, 종양 부담)을 감소시키는 것; 재발생 또는 재발을 예방하는 것; 불응성 기간을 연장시키고/거나 달리 생존을 개선시키는 것. 상기 용어는 대상체에서 장애 또는 다른 위험 인자가 발생할 위험을 감소시키는 치유적 치료, 예방적 치료 및 적용을 포함한다. 치료는 장애의 완전한 치유를 필요로 하지 않고, 증상 또는 기저 위험 인자를 감소시키는 실시양태를 포괄한다. 조합 요법과 관련하여, 상기 용어는 또한 다음을 지칭할 수 있다: i) 부작용을 감소시키고 내약성을 증가시키기 위해 제1 치료제의 유효 투여량을 감소시키는 제2 치료제의 능력; ii) 환자를 제1 요법에 보다 반응성이게 하는 제2 요법의 능력; 및/또는 iii) 상가적 또는 상승작용적 임상 이익을 달성하는 능력.

종양-연관 대식세포 (TAM): TAM은 종양-촉진 표현형을 갖는 분극화/활성화된 대식세포 (M2-유사 대식세포)이다. TAM은 종양 부위에 동원된 골수-유래 단핵구/대식세포 또는 적혈구-골수 전구세포로부터 유래된 조직-상주 대식세포일 수 있다. 단핵구/대식세포의 TAM으로의 분화는 국부 화학적 신호, 예컨대 시토카인, 케모카인, 성장 인자 및 리간드로서 작용하는 다른 분자, 뿐만 아니라 함요 (종양 미세환경)에 존재하는 단핵구/대식세포 사이의 세포-세포 상호작용을 포함한 다수의 인자에 의해 영향을 받는다. 일반적으로, 단핵구/대식세포는 소위 "M1" 또는 "M2" 하위유형으로 분극화될 수 있으며, 후자는 보다 종양-촉진 표현형과 연관된다. 고형 종양에서, 종양 덩어리의 최대 50%는 우선적으로 M2-분극화된 대식세포에 상응할 수 있다. 종양-연관 단핵구 및 골수 세포 집단 중에서, M1 대식세포는 전형적으로 세포 표면 HLA-DR, CD68 및 CD86을 발현하는 반면, M2 대식세포는 전형적으로 세포 표면 HLA-DR, CD68, CD163 및 CD206을 발현한다. 종양-연관 M2-유사 대식세포 (예컨대 M2c 및 M2d 하위유형)는 세포 표면 LRRC33 및/또는 LRRC33-프로TGFβ1을 발현할 수 있다.

종양 미세환경: 용어 "종양 미세환경 (TME) "은 종양 (예를 들어, 고형 종양)이 생체내에서 존재하는 국부 질환 함요를 지칭한다. TME는 질환-연관 분자 시그너쳐 (일련의 케모카인, 시토카인 등), 질환-연관 세포 집단 (예컨대 TAM, CAF, MDSC 등) 뿐만 아니라 질환-연관 ECM 환경 (ECM 성분 및/또는 구조의 변경)을 포함할 수 있다.

가변 영역: 용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 전형적으로 중쇄에 대략 아미노-말단 120 내지 130개의 아미노산 및 경쇄에 약 100 내지 110개 아미노 말단 아미노산을 포함하는 항체의 경쇄 및/또는 중쇄의 부분을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 상이한 항체의 가변 영역은 동일한 종의 항체들 사이에서도 아미노산 서열이 광범하게 상이하다. 항체의 가변 영역은 전형적으로 특정한 항체의 그의 표적에 대한 특이성을 결정한다.

작업 실시예 이외에, 또는 달리 나타낸 경우에, 본원에 사용된 성분 또는 반응 조건의 양을 표현하는 모든 숫자는 모든 경우에 용어 "약"에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 백분율과 관련하여 사용되는 경우에 용어 "약"은 ± 1%를 의미할 수 있다.

본원 명세서 및 청구범위에서 사용된 단수형은, 달리 명백하게 나타내지 않는 한, "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.

본원 명세서 및 청구범위에서 사용된 어구 "및/또는"은 그렇게 결합된 요소 중 "어느 하나 또는 둘 다", 즉 일부 경우에는 결합되어 존재하고 다른 경우에는 분리되어 존재하는 요소를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 다른 요소는, 달리 명백하게 나타내지 않는 한, 구체적으로 확인된 요소에 관련되든 관련되지 않든, "및/또는" 어구에 의해 구체적으로 확인된 요소 이외에도 임의로 존재할 수 있다. 따라서, 비제한적 예로서, "포함하는"과 같은 개방형 언어와 함께 사용되는 경우에, "A 및/또는 B"에 대한 언급은, 한 실시양태에서, B가 없는 A (임의로 B 이외의 요소 포함); 또 다른 실시양태에서, A가 없는 B (임의로 A 이외의 요소 포함); 또 다른 실시양태에서, A 및 B 둘 다 (임의로 다른 요소 포함); 등을 지칭할 수 있다.

본원 명세서 및 청구범위에서 사용된 바와 같이, 하나 이상의 요소의 목록과 관련하여 어구 "적어도 하나"는 요소의 목록의 요소 중 어느 하나 이상의 요소로부터 선택된 적어도 하나의 요소를 의미하지만, 요소의 목록 내에 구체적으로 열거된 각각의 및 모든 요소 중 적어도 하나를 반드시 포함하는 것은 아니며, 요소의 목록에서 요소의 임의의 조합을 배제하는 것이 아님이 이해되어야 한다. 이러한 정의는 또한 어구 "적어도 하나"가 언급하는 요소의 목록 내에서 구체적으로 확인된 요소 이외의 요소가, 그러한 구체적으로 확인된 요소에 관련되든 관련되지 않든, 임의로 존재할 수 있다는 것을 허용한다. 따라서, 비제한적 예로서, "A 및 B 중 적어도 하나" (또는 동등하게, "A 또는 B 중 적어도 하나" 또는 동등하게 "A 및/또는 B 중 적어도 하나")는, 한 실시양태에서, B가 존재하지 않는, 임의로 하나 초과를 포함하는 적어도 하나의 A (및 임의로 B 이외의 요소를 포함함); 또 다른 실시양태에서, A가 존재하지 않는, 임의로 하나 초과를 포함하는 적어도 하나의 B (및 임의로 A 이외의 요소를 포함함); 또 다른 실시양태에서, 임의로 하나 초과를 포함하는 적어도 하나의 A, 및 임의로 하나 초과를 포함하는 적어도 하나의 B (및 임의로 다른 요소를 포함함) 등을 지칭할 수 있다.

청구범위에서 "제1", "제2", "제3" 등과 같은 서수 용어를 사용하여 청구항 요소를 수식하는 것은 그 자체에 의해 한 청구항 요소의 또 다른 청구항 요소에 대한 임의의 우선순위, 우위 또는 순서, 또는 방법을 수행하는 행위의 시간적 순서를 내포하는 것이 아니라, 특정 명칭을 갖는 한 청구항 요소를 (서수 용어 사용을 제외하고는) 동일한 명칭을 갖는 또 다른 요소와 구별하여 청구항 요소를 구별하기 위한 라벨로만 사용된다.

본원에 제공된 범위는 그 범위 내의 모든 값의 약칭인 것으로 이해된다. 예를 들어, 1 내지 50의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50으로 이루어진 군으로부터의 임의의 숫자, 숫자의 조합 또는 하위-범위, 예를 들어 10-20, 1-10, 30-40 등을 포함하는 것으로 이해된다.

형질전환 성장 인자-베타 (TGFβ)

형질전환 성장 인자-베타 (TGFβ) 활성 및 후속하여 가용성 성장 인자의 부분 정제는 1970년대 말에서 1980년대 초에 처음 기재되었으며, 이에 의해 TGFβ 분야는 대략 40년 전에 시작되었다. 지금까지, 대형 TGFβ 슈퍼패밀리를 구성하는 33종의 유전자 생성물이 확인되었다. TGFβ 슈퍼패밀리는 구조적 유사성에 의해 다음 적어도 3종의 하위부류로 카테고리화될 수 있다: TGFβ, 성장-분화 인자 (GDF) 및 골-형태발생 단백질 (BMP). TGFβ 하위부류는 3종의 고도로 보존된 이소형, 즉 인간에서 3종의 개별 유전자에 의해 코딩되는 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3으로 구성된다.

TGFβ는 다양한 과정, 예컨대 세포 증식의 억제, 세포외 매트릭스 (ECM) 재형성 및 면역 항상성에서 주요 역할을 하는 것으로 생각된다. T 세포 항상성에 대한 TGFβ1의 중요성은 TGFβ1-/- 마우스가 대규모 면역 활성화로 인한 다중-기관 부전에 굴복하여 단지 3-4주만 생존한다는 관찰에 의해 입증된다 (Kulkarni, A.B., et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 1993. 90(2): p. 770-4; Shull, M.M., et al., Nature, 1992. 359(6397): p. 693-9). TGFβ2 및 TGFβ3의 역할은 덜 명확하다. 3종의 TGFβ 이소형은 별개의 시간적 및 공간적 발현 패턴을 갖지만, 이들은 동일한 수용체, TGFβRI 및 TGFβRII를 통해 신호전달하고, 일부 경우에는, 예를 들어 TGFβ2 신호전달의 경우에는, 유형 III 수용체, 예컨대 베타글리칸이 또한 요구된다 (Feng, X.H. and R. Derynck, Annu Rev Cell Dev Biol, 2005. 21: p. 659-93; Massague, J., Annu Rev Biochem, 1998. 67: p. 753-91). TGFβRI/II의 리간드-유도된 올리고머화는 SMAD 전사 인자의 인산화를 촉발하여, 표적 유전자, 예컨대 Col1a1, Col3a1, ACTA2 및 SERPINE1의 전사를 유발한다 (Massague, J., J. Seoane, and D. Wotton, Genes Dev, 2005. 19(23): p. 2783-810). SMAD-비의존성 TGFβ 신호전달 경로가 또한, 예를 들어 암에서 또는 마르팡(Marfan) 마우스의 대동맥 병변에서 기재되었다 (Derynck, R. and Y.E. Zhang, Nature, 2003. 425(6958): p. 577-84; Holm, T.M., et al., Science, 2011. 332(6027): p. 358-61).

인간에서의 TGFβ 경로의 생물학적 중요성은 유전 질환에 의해 검증되었다. 카무라티-엥겔만 질환은 TGFB1 유전자에서의 상염색체 우성 돌연변이로 인해 골 이형성증을 유발하여, TGFβ1 신호전달의 구성적 활성화로 이어진다 (Janssens, K., et al., J Med Genet, 2006. 43(1): p. 1-11). 로이스/디에츠 증후군을 갖는 환자는 TGFβ 신호전달 경로의 성분에서 상염색체 우성 돌연변이를 보유하며, 이는 대동맥류, 양안과다격리증 및 이분구개수를 유발한다 (Van Laer, L., H. Dietz, and B. Loeys, Adv Exp Med Biol, 2014. 802: p. 95-105). TGFβ 경로 조절이상이 다수의 질환에 연루됨에 따라, TGFβ 경로를 표적화하는 여러 약물이 개발되고 환자에서 시험되었으나, 성공은 제한적이었다.

TGFβ 신호전달의 조절이상은 광범위한 인간 질환과 연관되었다. 실제로, 다수의 질환 상태에서, 이러한 조절이상은 TGFβ 기능의 다중 면을 수반할 수 있다. 이환 조직, 예컨대 섬유화 및/또는 염증발생 조직 및 종양은 TGFβ 활성화가 질환의 악화 또는 진행을 유발할 수 있는 국부 환경을 생성할 수 있으며, 이는 특정한 질환 세팅에서 소정의 역할을 하는 다수의 다른 시토카인, 케모카인 및 성장 인자와 함께 자가분비 및/또는 주변분비 방식으로 활성화되는 다수의 TGFβ-반응성 세포들 사이의 상호작용에 의해 적어도 부분적으로 매개될 수 있다.

예를 들어, 종양 미세환경 (TME)은 TGFβ1을 발현하는 다중 세포 유형, 예컨대 암 (즉, 악성) 세포 이외에도, 활성화된 근섬유모세포-유사 섬유모세포, 기질 세포, 침윤 대식세포, MDSC 및 다른 면역 세포를 함유한다. 따라서, TME는 함요 내에서 TGFβ1을 발현하고/거나 그에 반응성이지만 1종 초과의 유형의 제시 분자, 예를 들어 LTBP1, LTBP3, LRRC33 및 GARP와 회합된 이종 세포 집단을 나타낸다.

면역요법에서의 진보는 점점 더 많은 수의 암 환자에 대한 유효 치료 풍경을 변환시켰다. 가장 현저한 것은 체크포인트 차단 요법 (CBT)이며, 이는 현재 증가하는 수의 암에 대한 표준 관리 요법의 일부가 되었다. CBT에 대한 현저하고 지속적인 반응이 점점 더 많은 수의 암 유형에 걸쳐 관찰되었지만, 유의한 분율의 종양은 심지어 치료 개시시에도 CBT에 불응성인 것으로 보이며, 따라서 많은 환자의 면역계가 종양 세포를 표적화하고 제거하는 것을 가능하게 하기 위한 주요 도전으로서 1차 저항성을 지목한다는 것이 현재 명확하다. CBT에 대한 1차 저항성을 부여하는 기저 메카니즘을 이해하고 다루기 위한 노력이 보다 많은 수의 환자에 대한 치료 효능을 확장시키기 위해 착수되었다. 그러나, 이러한 열정은 CBT를 동일한 종양 유형에 영향을 미치거나 면역계의 외견상 관련된 성분을 조정하는 것으로 공지된 작용제와 조합하는 경우에 모호한 임상 시험 결과 및 실패에 의해 방해되었다. 가능성 있는 이유는, 주어진 조합에 대한 명확한 기계론적 근거가 종종 임상-유래 데이터에 근거하지 않고, 따라서 승인된 단일-작용제 요법을 증진시키도록 의도된 시험에서 불확실한 혼동스런 결과를 초래하였기 때문이다. 조합 면역요법의 설계는 기저 종양 및 면역계 생물학에 대한 관련성의 과학적 증거에 근거를 두어야 한다는 것이 명확해졌다.

최근에, "면역 배제"로 지칭되는 현상은 항종양 이펙터 T 세포 (예를 들어, CD8+ T 세포)가 면역억제 국부 신호에 떨어져 있는 (따라서 "배제된") 종양 환경을 설명하기 위해 만들어졌다. 보다 최근에, 임상-유래된 종양의 다수의 후향 분석은 CBT에 대한 1차 저항성을 매개하는데 TGFβ 경로 활성화를 연루시켰다. 예를 들어, 전처리 흑색종 생검의 전사 프로파일링 및 분석은 항-PD-1 CBT에 비-반응성인 종양에서 TGFβ-연관 경로 및 생물학적 과정의 풍부화를 밝혀냈다. 면역-배제된 종양에서, 달리 세포-표면 종양 항원을 인식함으로써 암 세포를 공격할 수 있을 이펙터 세포는 암 세포의 부위에 대한 접근을 획득하지 못하게 된다. 이러한 방식으로, 암 세포는 이러한 면역을 활용하고 그에 의존하는 숙주 면역 및 면역-종양학적 치료제, 예컨대 체크포인트 억제제를 회피한다. 실제로, 이러한 종양은 아마도 표적 T 세포가 종양에 진입하는 것이 차단되어 항암 효과를 발휘하지 못하기 때문에, 체크포인트 억제, 예컨대 항-PD-1 및 항-PD-L1 항체에 대한 저항성을 나타낸다.

임상-유래된 종양의 다수의 후향 분석은 CBT에 대한 1차 저항성을 매개하는데 TGFβ 경로 활성화를 지목한다. 예를 들어, 전처리 흑색종 생검의 전사 프로파일링 및 분석은 항-PD-1 CBT에 비-반응성인 종양에서 TGFβ-연관 경로 및 생물학적 과정의 풍부화를 밝혀냈다. 보다 최근에, 전이성 요로상피암 환자로부터의 종양의 유사한 분석은 아테졸리주맙에 의한 PD-L1 차단에 대한 반응의 결여가, 특히 CD8+ T 세포가 종양 내로의 진입으로부터 배제되는 것으로 보이는 종양에서 TGFβ 신호전달의 전사 시그너쳐과 연관된다는 것을 밝혀냈다. 항-PD-(L)1 저항성을 유발하는 면역 배제를 매개하는데 있어서의 TGFβ 신호전달의 중요한 역할이 유방암의 EMT-6 동계 마우스 모델에서 검증되었다. EMT-6 종양은 항-PD-L1 항체를 사용한 치료에 약하게 반응성인 한편, 이러한 체크포인트 억제제를 모든 TGFβ 이소형의 활성을 차단하는 항체인 1D11과 조합한 것은 개별 억제제를 사용한 치료와 비교하였을 때 완전 반응의 빈도의 현저한 증가를 가져왔다. 상승작용적 항종양 활성은, 암-연관 섬유모세포 (CAF) 표현형에서의 변화 및 면역 배제 표현형의 파괴로 인해, 활성화된 CD8+ T 세포가 종양 내로 침윤되는 것으로 제안된다. 유사한 결과가 유형 I TGFβ 수용체 ALK5 키나제의 소분자 억제제인 갈루니세르팁과 항-PD-L1 항체의 조합을 사용하여 결장직장암 및 전이의 뮤린 모델에서 발견되었다. 종합하면, 이들 발견은 CBT-저항성 종양에서 TGFβ 경로를 억제하는 것이 CBT에 대한 임상 반응의 수를 개선 또는 증가시키는 유망한 접근법일 수 있다는 것을 시사한다. 최근의 연구가 TGFβ 경로 활성화와 1차 CBT 저항성 사이의 관계를 연루시켰지만, TGFβ 신호전달은 오랫동안 암 발병기전의 특색과 연관되었다. 강력한 면역억제 인자로서, TGFβ는 항종양 T 세포 활성을 방지하고 면역억제 대식세포를 촉진한다. 악성 세포는 종종 그의 성장 및 종양-억제 효과를 회피하는 메카니즘으로서 TGFβ 신호전달에 대해 저항성을 갖게 된다. TGFβ는 CAF를 활성화시켜, 세포외 매트릭스 생산 및 종양 진행의 촉진을 유도한다. 최종적으로, TGFβ는 EMT를 유도하여, 조직 침습 및 종양 전이를 지지한다.

포유동물은 3종의 TGFβ 성장 인자, TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3을 코딩하고 발현하는 별개의 유전자를 가지며, 이들 모두는 동일한 이형체 TGFβ 수용체 복합체를 통해 신호전달한다. 공통 신호전달 경로에도 불구하고, 비-중첩 TGFβ 녹아웃 마우스 표현형에 의해 입증된 바와 같이, 각각의 TGFβ 이소형은 별개의 생물학적 기능을 갖는 것으로 보인다. 모든 3종의 TGFβ 이소형은 불활성 프로도메인-성장 인자 복합체로서 발현되며, 여기서 잠복성-연관 펩티드 (LAP)로도 불리는 TGFβ 프로도메인은 그의 성장 인자 주위를 감싸고 이를 잠복, 비-신호전달 상태로 유지한다. 추가로, 잠복 TGFβ는 잠복 TGFβ-결합 단백질과 공동-발현되고, 디술피드 연결을 통해 대형 잠복 복합체 (LLC)를 형성한다. 잠복 TGFβ와 잠복 TGFβ 결합 단백질-1 (LTBP1) 또는 LTBP3의 회합은 세포외 매트릭스에 대한 테더링을 가능하게 하는 반면에, 막횡단 단백질 GARP 또는 LRRC33에 대한 회합은 각각 Treg 또는 대식세포의 표면 상의 정교화를 가능하게 한다. 생체내에서, 잠복 TGFβ1 및 잠복 TGFβ3은 LAP 상의 컨센서스 RGD 서열에 결합하는 αV 인테그린의 하위세트에 의해 활성화되어, 입체형태적 변화를 촉발함으로써 성장 인자를 방출한다. 잠복 TGFβ2가 활성화되는 메카니즘은 컨센서스 RGD 모티프가 결여되어 있기 때문에 덜 명확하다. LAP의 단백질분해적 절단에 의한 TGFβ1 방출이 또한 활성화 메카니즘으로서 연루되었지만, 그의 생물학적 관련성은 덜 명확하다.

TGFβ 활성화의 병원성 역할이 여러 질환 상태에서 명확하지만, TGFβ 경로의 치료적 표적화가 광범위하고 지속적인 경로 억제로부터 초래되는 다면발현성 효과로 인해 어렵다는 것 또한 동등하게 명확하다. 예를 들어, 다수의 연구는 TGFβ 유형 I 수용체 키나제 ALK5 (TGFΒR1)의 소분자-매개 억제 또는 고친화도 항체에 의한 모든 3종의 고도로 관련된 TGFβ 성장 인자의 차단이 마우스, 래트 및 개에서 중증 심장 판막증을 유발한다는 것을 제시하였다. 따라서, 모든 TGFβ 신호전달을 차단하는 이들 "범"-TGFβ 접근법은 매우 좁은 치료 범위를 가지며, 이는 매우 높은 미충족 의료 필요를 갖는 다수의 질환-관련 과정의 치료에 대한 장애물인 것으로 입증되었다. TGFβ-표적화 요법은 지금까지 승인되지 않았고, 이러한 양식에 의한 임상 시험 결과는 아마도 안전성 우려를 수용하기 위해 요구되는 비효과적인 투여 요법인 것으로 입증된 것의 사용으로 인해 대부분 실망스러웠다.

다중 질환 과정에서의 이러한 경로의 중요한 역할에 대한 유력한 증거와 함께, 광범위한 TGFβ 억제에 따라오는 안전성 우려는, 질환 병리상태에서 1종 이상의 TGFβ 패밀리 구성원에 의해 수행되는 특정 역할의 보다 우수한 이해가 치료적 개입을 위한 실행가능한 방안으로 이어질 수 있다는 것을 시사한다. TGFβ 및 CBT에 대한 반응과 관련하여, 본 발명자들은 많은 인간 종양에서 TGFβ1의 보편적인 발현을 관찰하였으며, 이는 이러한 패밀리 구성원이 1차 저항성에 대한 이러한 경로의 기여의 주요 구동인자일 수 있다는 것을 시사한다.

상기 언급된 바와 같이, 증가하는 증거는 TGFβ가 면역-배제된 종양 환경을 포함한 질환 조직에서 면역억제를 생성 및/또는 유지하는데 있어서 1차 역할자일 수 있다는 것을 시사한다. 따라서, TGFβ 억제는 면역억제를 차단하지 않을 수 있고, 이펙터 T 세포 (특히 세포독성 CD8+ T 세포)가 표적 암 세포에 접근하여 이를 사멸시키는 것을 가능하게 할 수 있다. 종양 침윤에 추가로, TGFβ 억제는 또한 CD8+ T 세포 확장을 촉진할 수 있다. 이러한 확장은 림프절 및/또는 종양에서 (종양내로) 발생할 수 있다. 이러한 과정의 정확한 기저 메카니즘은 아직 규명되지 않았지만, 면역억제는 적어도 부분적으로 조절 T 세포 및 활성화된 대식세포를 수반하는 면역 세포-연관 TGFβ1 활성화에 의해 매개되는 것으로 고려된다. TGFβ는 CD4+ T 세포에서 Foxp3 발현을 직접적으로 촉진함으로써, 이들을 조절 (면역억제) 표현형 (즉, Treg)으로 전환시키는 것으로 보고되었다. 더욱이, Treg는 이펙터 T 세포 증식을 억제함으로써 (예를 들어, 도 26b 참조), 면역 반응을 감소시킨다. 이러한 과정은 TGFβ1-의존성인 것으로 제시되고, GARP-연관 TGFβ1 신호전달을 수반할 가능성이 있다. 인간 및 동물 모델 둘 다에서의 관찰은 TME에서의 Treg의 증가가 다수의 유형의 암에서의 불량한 예후와 연관된다는 것을 나타냈다. 추가로, 본 출원인은 종양-유래 인자, 예컨대 M-CSF에 노출된 M2-분극화된 대식세포가 TGFβ1에 대한 제시 분자인 LRRC33의 세포-표면 발현을 극적으로 상향조절한다는 것을 이전에 제시하였다 (예를 들어, PCT/US2018/031759 참조). 이들 소위 종양-연관 대식세포 (또는 TAM)는 TME에서 관찰된 TGFβ1-의존성 면역억제에 기여하고 종양 성장을 촉진하는 것으로 생각된다.

다수의 고형 종양은 근섬유모세포 또는 근섬유모세포-유사 세포가 풍부한 종양 기질을 갖는 것을 특징으로 한다. 이들 세포는 종양을 둘러싸거나 감싸는 콜라겐성 매트릭스를 생산하며 (예컨대 결합조직형성), 이는 적어도 부분적으로 과다활성 TGFβ1 신호전달에 의해 유발될 수 있다. TGFβ1 활성화는 종양 기질 내의 ECM-연관 제시 분자, 예를 들어 LTBP1 및 LTBP3을 통해 매개되는 것으로 고려된다.

본 출원인은 시험관내 및 생체내 둘 다에서 유망한 효과를 나타낸 많은 이들 생물학적 콘텍스트에서 TGFβ1 활성화를 억제할 수 있는 항체를 이전에 개시하였다 (예를 들어, PCT/US2018/012601 참조). 그러나, i) 질환-연관 TGFβ1이 존재하는 상이한 생물학적 콘텍스트 또는 함요에 걸쳐 균일한 억제 효과를 보장하기 위해 다양한 항원 복합체에 대한 친화도에 있어서 보다 적은 편향을 나타내는 개선된 항체를 개발하고/거나, ii) 이전에 기재된 대응물보다 훨씬 더 큰 효력을 제공하는 이러한 항체를 개발하기 위한 도전과제가 남아있다.

본원에 제시된 연구에 대해, 개선된 항체는 하기 특색 모두 또는 대부분을 구현할 것으로 고려되었다: 1) TGFβ1에 대한 선택성은 범-억제와 연관된 원치않는 독성을 최소화하기 위해 유지되어야 함 ("이소형-선택성") (예를 들어, PCT/US2017/021972 참조); 2) 다양한 생물학적 콘텍스트 또는 매트릭스-연관 및 세포-연관 카테고리 둘 다에 걸쳐 광범위한 결합 활성을 나타내어야 함 ("콘텍스트-비의존성"); 3) 다중 항원 복합체에 걸쳐 보다 균등한 또는 비편향된 친화도를 달성해야 함 ("균일성"); 4) 각각의 항원 복합체에 대한 강한 결합 활성을 나타내야 함 ("고친화도"); 및 5) 각각의 콘텍스트에 대해 강건한 억제 활성을 가져야 함 ("효력"). 추가로, 바람직한 작용 메카니즘은 가용성/유리 성장 인자를 직접적으로 표적화하기 보다는, 활성화 단계를 억제하여 억제제가 조직-테더링된, 잠복 TGFβ1 복합체를 표적화할 수 있도록 함으로써, 하류 활성화 사건을 선제적으로 방지하여 지속적인 효과를 달성한다 ("지속성"). 본원에 추가로 상세하게 개시된 바와 같이, 본 개시내용의 신규 개선된 TGFβ1 억제제는 잠복 TGFβ1 활성화의 고도로 강력하고 고도로 선택적 억제제이다. 본원에 제시된 데이터는, 특히, 이소형-특이적 억제의 이러한 메카니즘이 인간 암에서 발견되는 CBT에 대한 1차 저항성의 특색 중 일부를 밀접하게 재현하는 동계 마우스 모델에서 항-PD-1에 대한 1차 저항성을 극복하기에 충분하다는 것을 입증한다. "범"-TGFβ 억제제와 비교하여 이러한 항체의 개선된 전임상 안전성 프로파일과 함께, 이들 효능 데이터는 암 면역요법에서의 체크포인트 차단에 대한 임상 반응을 확장 및 증진시키기 위해, 뿐만 아니라 다수의 추가의 TGFβ1-관련 적응증을 치료하기 위해, 선택적 TGFβ1 억제제의 치료 용도를 탐구하기 위한 근거를 제공한다.

프로TGFβ1의 신규, 고친화도, 이소형-선택적 항체

일반적 특색

TGFβ1의 고친화도, 개선된 억제제가 본원에 개시되며, 이들 항체는 초기 개시내용의 TGFβ1-선택적 억제제와 비교하여 증진된 결합 특성, 증가된 억제 효력을 갖고, 바람직한 안전성 프로파일 및 이소형 선택성을 유지하는 것을 특징으로 한다. 본 개시내용의 이들 TGFβ1-선택적 억제제는 잠복 프로TGFβ1 복합체의 프로도메인 (때때로 "LAP"로 지칭됨)의 적어도 한 부분에 특이적으로 결합하고 TGFβ1에 대한 이소형-선택적 억제 활성을 갖는 모노클로날 항체 (예를 들어, 이뮤노글로불린, 조작된 이뮤노글로불린-유사 분자, 항원-결합 단편 또는 그의 부분)이다 (표 1의 "핵심 특성" 참조).

본 개시내용에 따른 항체의 증진된 결합 특성은 평형상태에서 측정시 증가된 친화도를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 MSD-SET에 의해 측정시, 인간 LLC 복합체(hLTBP1-프로TGFβ1, hLTBP3-프로TGFβ1, hGARP-프로TGFβ1 및/또는 hLRRC33-프로TGFβ1) 중 적어도 1종에 대해 ≤ 1 nM의 KD를 갖는다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 MSD-SET에 의해 측정시, 하기로부터 선택된 인간 LLC 복합체 중 2종에 대해 ≤ 1 nM의 KD를 갖는다: hLTBP1-프로TGFβ1, hLTBP3-프로TGFβ1, hGARP-프로TGFβ1 및 hLRRC33-프로TGFβ1. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 MSD-SET에 의해 측정시, 하기로부터 선택된 인간 LLC 복합체 중 3종에 대해 ≤ 1 nM의 KD를 갖는다: hLTBP1-프로TGFβ1, hLTBP3-프로TGFβ1, hGARP-프로TGFβ1 및 hLRRC33-프로TGFβ1. 바람직한 실시양태에서, 이러한 항체는 MSD-SET에 의해 측정시, 하기 각각의 인간 LLC 복합체에 대해 ≤ 1 nM의 KD를 갖는다: hLTBP1-프로TGFβ1, hLTBP3-프로TGFβ1, hGARP-프로TGFβ1 및 hLRRC33-프로TGFβ1. 본 개시내용에 따르면, 고친화도 항체는 평형상태에서 1 nM 이하, 예를 들어 ≤ 1 nM, ≤ 0.5 nM, ≤ 400 pM, ≤ 300 pM, ≤ 200 pM 및 ≤ 100 pM인 특정한 항원 (예를 들어, 항원 복합체)에 대한 KD 값을 가질 수 있다.

본 발명은 또한 평형상태에서, 예컨대 MSD-SET에서 측정시, ≤ 10 nM (예를 들어, ≤ 10 nM, ≤ 9 nM, ≤ 8 nM, ≤ 7 nM, ≤ 6 nM, ≤ 5 nM, ≤ 4 nM, ≤ 3 nM, ≤ 2 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.5 nM 및 ≤ 0.1 nM)의 KD로 각각의 인간 LLC 복합체 (hLTBP1-프로TGFβ1, hLTBP3-프로TGFβ1, hGARP-프로TGFβ1 및 hLRRC33-프로TGFβ1)에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 용액 평형 적정-기반 방법에 의해 측정시, ≤ 5 nM의 KD로 각각의 상기 언급된 LLC 복합체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체는 용액 평형 적정-기반 방법에 의해 측정시, ≤ 1 nM의 KD로 각각의 상기 언급된 LLC 복합체에 결합한다.

세포외 매트릭스의 조절이상 및 면역 성분의 조절이상을 둘 다 수반하는 TGFβ1-관련 적응증을 치료하기 위한 치료 용도를 위해, ECM-연관 프로TGFβ1 복합체 (hLTBP1-프로TGFβ1 및/또는 hLTBP3-프로TGFβ1) 중 적어도 1종 및 추가적으로 세포-연관 프로TGFβ1 복합체 (hGARP-프로TGFβ1 및/또는 hLRRC33-프로TGFβ1) 중 적어도 1종에 대해 고친화도 (예를 들어, ≤ 1 nM의 KD)를 갖는 항체를 선택하여, 둘 다의 콘텍스트에 대해 (예를 들어, ECM에서 및 면역 세포에 관해서) 억제 효과를 발휘하는 것이 유리하다. 일부 실시양태에서, 항체는 hLTBP1-프로TGFβ1 및 hLTBP3-프로TGFβ1 둘 다 및 추가적으로 세포-연관 프로TGFβ1 복합체(hGARP-프로TGFβ1 또는 hLRRC33-프로TGFβ1) 중 적어도 1종에 대해 고친화도 (예를 들어, ≤ 1 nM의 KD)를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 각각의 상기 언급된 복합체 (hLTBP1-프로TGFβ1, hLTBP3-프로TGFβ1, hGARP-프로TGFβ1 및 hLRRC33-프로TGFβ1)에 대해 고친화도 (예를 들어, ≤ 1 nM의 KD)를 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 이러한 항체는 용액 평형 적정-기반 방법, 예컨대 MSD-SET에 의해 측정시, 각각의 인간 복합체에 대해 ≤ 200 pM, 예를 들어 ≤ 100 pM의 KD를 갖는다.

본 개시내용의 실시양태는 고친화도 콘텍스트-비의존성 항체를 포함한다. 이러한 항체는 4종의 공지된 제시 분자-프로TGFβ1 복합체, 즉 LTBP1-프로TGFβ1, LTBP3-프로TGFβ1, GARP-프로TGFβ1 및 LRRC33-프로TGFβ1에 대해 등가의 친화도로 결합할 수 있다. 등가의 친화도는 4종의 항원 복합체 중에서 항체가 나타내는 최저 친화도 (최고 KD 수치 값)가 나머지 3종의 친화도로부터 계산된 평균 값보다 5배 이하로 더 작거나; 또는 4종의 항원 복합체 중에서 항체가 나타내는 최고 친화도 (최저 KD 수치 값)가 나머지 3종의 친화도로부터 계산된 평균 값보다 5배 이하로 더 크다는 것을 의미할 수 있다. 일부 실시양태에서, 2종의 ECM-연관 복합체의 평균 KD 값 및 2종의 세포-연관 복합체의 평균 KD 값의 비가 3배 이하인 경우에, 이러한 항체는 등가의 친화도를 갖는 것으로 언급될 수 있다.

등가의 친화도를 갖는 항체는 프로TGFβ1 복합체와 연관된 특정한 제시 분자에 상관없이 (따라서 "콘텍스트-비의존성"), 보다 균일한 (예를 들어, 비편향된) 억제 효과를 달성할 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 항체는 용액 평형 적정-기반 방법에 의해 측정시 4종의 인간 LLC 각각에 대한 친화도가 1 nM 이하 (예를 들어, 200 pM 이하)이고, 항체가 상기 논의된 4종의 인간 LLC 모두에 대해 등가의 친화도를 갖는다는 점에서, 고친화도, 콘텍스트-비의존성 항체이다. 예를 들어, 매트릭스-연관 복합체와 세포-연관 복합체 사이의 평균 친화도에서 관찰된 편향은 3배 이하이다.

일부 실시양태에서, 이러한 항체는 용액 평형 적정-기반 방법, 예컨대 MSD-SET에 의해 측정시, ≤ 10 nM (예를 들어, ≤ 10 nM, ≤ 9 nM, ≤ 8 nM, ≤ 7 nM, ≤ 6 nM, ≤ 5 nM, ≤ 4 nM, ≤ 3 nM, ≤ 2 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.5 nM 및 ≤ 0.1 nM)의 KD로 각각의 상기 언급된 복합체 (hLTBP1-프로TGFβ1, hLTBP3-프로TGFβ1, hGARP-프로TGFβ1 및 hLRRC33-프로TGFβ1)에 특이적으로 결합한다.

본원에 포괄된 억제 항체 중 어느 하나는 프로TGFβ1 복합체의 프로도메인 내에 잠복성 라쏘의 적어도 한 부분을 포함하는 결합 영역(들)에서 각각의 상기 언급된 대형 잠복 복합체 (hLTBP1-프로TGFβ1, hLTBP3-프로TGFβ1, hGARP-프로TGFβ1 및 hLRRC33-프로TGFβ1)에 결합할 수 있다. 이러한 결합 영역은 성장 인자 도메인의 적어도 한 부분을 추가로 포함할 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 이러한 항체는 잠복성 라쏘의 적어도 한 부분 및 성장 인자 도메인의 적어도 한 부분을 포함하는 LLC 복합체 내의 결합 영역에서 ≤ 200 pM (예컨대 ≤ 150 pM 및 ≤ 100 pM)의 K_D 값으로 각각의 LTBP1-프로TGFβ1, LTBP3-프로TGFβ1, GARP-프로TGFβ1 및 LRRC33-프로TGFβ1 복합체에 결합한다.

일부 실시양태에서, TGFβ1을 선택적으로 억제할 수 있는 고친화도, 콘텍스트-비의존성 항체는 활성화 방식과 무관하게 활성화된 TGFβ1을 억제할 수 있다. 예를 들어, 특정 인테그린은 LLC의 프로도메인 내의 RGD 모티프에 직접 결합하고, 케이지-유사 프로도메인 구조를 기계적으로 "풀 오픈" 하여, TGFβ1 성장 인자가 잠복 복합체로부터 촉발되도록 하는 것으로 공지되어 있다. 별개로, 세포외 환경에 존재하는 특정 프로테아제는 인테그린-비의존성 방식으로 TGFβ1을 활성화시키는 것으로 제시되었다. RGD 모티프를 직접 표적화함으로써 인테그린 결합을 방해하는 항체는 TGFβ1의 프로테아제-의존성 활성화를 억제하지 않을 수 있다. 반대로, 프로테아제 인식 또는 절단 부위 중 1종 이상을 직접 표적화하는 항체는 TGFβ1의 인테그린-의존성 활성화를 억제하지 않을 수 있다. 대조적으로, 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 고친화도, 콘텍스트-비의존성 항체는 TGFβ1의 인테그린-의존성 활성화 및 TGFβ1의 프로테아제-의존성 활성화를 억제할 수 있다.

표적 인간 단백질에 대한 고친화도 결합이 항체 치료제에 본질적인 특색이지만, 추가의 종 대응물과 또한 교차-반응하는 능력이 유리하다. 특히, 대부분의 전임상 약리학 모델이 설치류에서라는 것을 고려하면, 뮤린/래트 단백질에 대한 종 교차-반응성은 전임상 연구를 위한 대용 항체로서 편리한 도구를 제공한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 고친화도 항체는 유리하게는 다른 포유동물 대응물, 예컨대 마우스, 래트 및/또는 비-인간 영장류와 교차-반응한다.

본 개시내용에 의해 포괄되는 신규 항체 중에서, 특히 바람직한 부류의 항체 및 그의 특색이 하기에 카테고리화되고 논의된다.

바람직한 특색

일부 실시양태에서, 핵심 특성 특색에 추가로, 본원에 개시된 바람직한 항체는 본원의 표 1에 제시된 바와 같은 카테고리 1-5 중 1종 이상의 항체 기준을 추가로 충족한다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 항체의 추가의 요구되는 기준은 그의 결합 특성, 예를 들어 항원에 대한 항체의 친화도에 의해 정의된다. 이와 관련하여, "항원"은 적어도 4종의 단백질 복합체, 즉 hLTBP1-프로TGFβ1, hLTBP3-프로TGFβ1, hGARP-프로TGFβ1 및 hLRRC33-프로TGFβ1 복합체로 지칭되는 TGFβ1의 인간 대형 잠복 복합체 (LLC)를 포함한다. 본 개시내용의 발명에 따르면, 항체는 전형적으로 K_D 값으로서 측정된 특정 친화도에서 이들 복합체 각각에 결합할 수 있다. 카테고리 1 및 카테고리 2 항체는 이들 실시양태 내에 속한다. 결합 특성에 기초하여 기준을 정의하기 위한 목적으로 (예를 들어, 카테고리 1 및 2), 항체의 친화도는 동역학적 검정 (예컨대 BLI)에 의해서 보다는 평형상태에서 결정된다.

추가적으로 또는 대안적으로, 본 발명의 항체의 추가의 요구되는 기준은 그의 아미노산 서열에 의해 정의된다. 카테고리 3 및 카테고리 4 항체는 항체의 CDR 서열에 의해 정의되고, 한편 카테고리 5 항체는 그의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 서열에 의해 정의된다.

표 1. 본 발명의 신규, 고친화도, TGFβ1-선택적 억제제의 바람직한 특색

각각의 카테고리의 비제한적 실시양태가 하기에 제공된다.

카테고리 1 항체

본원에 개시된 항체는 TGFβ1의 인간 잠복 대형 복합체를 특이적으로 표적화할 수 있는 고친화도, 이소형-선택적 항체이다.

한 측면에서, 본 발명은 ≤ 200 pM의 KD로 각각의 하기 인간 LLC: hLTBP1-프로TGFβ1, hLTBP3-프로TGFβ1, hGARP-프로TGFβ1 및 hLRRC33-프로TGFβ1 복합체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 친화도는 용액 평형 적정-기반 검정과 같은 적합한 검정을 사용하여 평형상태에서 측정된다.

이러한 항체 또는 단편은 용액 평형 적정에 의해 측정시 ≤ 150 pM의 KD로 hLTBP1-프로TGFβ1, hLTBP3-프로TGFβ1, hGARP-프로TGFβ1 및 hLRRC33-프로TGFβ1 복합체 각각에 결합할 수 있다. 보다 바람직하게는, 이러한 항체 또는 단편은 용액 평형 적정에 의해 측정시 ≤ 100 pM의 KD로 hLTBP1-프로TGFβ1, hLTBP3-프로TGFβ1, hGARP-프로TGFβ1 및 hLRRC33-프로TGFβ1 복합체 각각에 결합할 수 있다. 평형상태에서 항체의 KD 값을 결정할 수 있는 임의의 적합한 시험관내 친화도 검정, 예를 들어 MSD-SET가 사용될 수 있으며, 이는 본원의 다른 곳에 보다 상세하게 기재된다. 카테고리 1의 바람직한 항체의 항체 기준을 충족하는 본원에 개시된 항체의 비제한적 예는 다음을 포함한다: Ab6, Ab22, Ab24, Ab26, Ab29, Ab30, Ab31, Ab32 및 Ab33.

항체는 또한 높은 특이성 및 높은 친화도로 추가의 종의 상응하는 LLC에 결합할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 뮤린 대응물에 대한 종 교차-반응성을 나타낸다.

카테고리 2 항체

본원에 개시된 항체는 TGFβ1의 인간 잠복 대형 복합체를 특이적으로 표적화할 수 있는 고친화도, 이소형-선택적 항체이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 ≤ 1 nM의 KD로 각각의 하기 인간 LLC: hLTBP1-프로TGFβ1, hLTBP3-프로TGFβ1, hGARP-프로TGFβ1 및 hLRRC33-프로TGFβ1 복합체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 친화도는 용액 평형 적정-기반 검정과 같은 적합한 검정을 사용하여 평형상태에서 측정되고, 여기서 항체 또는 단편은 잠복성 라쏘의 적어도 한 부분을 포함하는 결합 영역에서 인간 LLC에 결합한다. 잠복성 라쏘는 프로도메인의 소위 "직쇄형 재킷"의 일부를 형성하는 단백질 도메인이다. 그의 천연 형태에서, 인간 프로TGFβ1 폴리펩티드의 잠복성 라쏘는 아미노산 서열 LASPPSQGEVPPGPL (서열식별번호: 153)을 갖는다. 임의의 적합한 기술을 사용하여 항체가 잠복성 라쏘의 적어도 한 부분을 포함하는 영역에서 인간 TGFβ1 LLC에 결합하는지 여부를 결정할 수 있다. 예를 들어, 상응하는 폴리펩티드를 이용하는 경쟁 검정이 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 결합 영역은 HD-X 또는 X-선 결정학에 의해 결정될 수 있다.

일부 실시양태에서, 이러한 항체 또는 단편은 용액 평형 적정에 의해 측정시 ≤ 500 pM (임의로 ≤ 400 pM, ≤ 300 pM, ≤ 200 pM 또는 ≤ 100 pM)의 KD로 hLTBP1-프로TGFβ1, hLTBP3-프로TGFβ1, hGARP-프로TGFβ1 및 hLRRC33-프로TGFβ1 복합체 각각에 결합할 수 있으며, 여기서 항체 또는 단편은 잠복성 라쏘의 적어도 한 부분을 포함하는 결합 영역에서 인간 LLC에 결합한다. 카테고리 2의 바람직한 항체의 항체 기준을 충족하는 본원에 개시된 항체의 비제한적 예는 다음을 포함한다: Ab5 및 Ab6.

일부 실시양태에서, 이러한 항체는 프로TGFβ1 복합체 내의 성장 인자 도메인의 적어도 한 부분을 포함하는 추가의 결합 영역(들)에서 인간 LLC에 추가로 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 추가의 결합은 잠복성 복합체와 관련하여서만 발생하여, 항체가 프로도메인 복합체와 회합되어 있지 않는 유리 성장 인자에는 특이적으로 결합하지 않는다. LLC의 성장 인자 도메인 내의 추가의 결합 영역(들)은 "핑거-1" 및/또는 "핑거-2"로 지칭되는 단백질 도메인의 적어도 한 부분을 포함할 수 있다. 따라서, 이러한 항체는 잠복성 라쏘의 적어도 1개의 아미노산 잔기 및 성장 인자 도메인의 적어도 1개의 아미노산 잔기를 포함하는 조합 에피토프에 결합할 수 있다.

항체는 또한 높은 특이성 및 높은 친화도로 추가의 종의 상응하는 LLC에 결합할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 뮤린 대응물에 대한 종 교차-반응성을 나타낸다.

카테고리 3 항체

본원에 개시된 항체는 TGFβ1의 인간 잠복 대형 복합체를 특이적으로 표적화할 수 있는 고친화도, 이소형-선택적 항체이다.

추가 측면에서, 본 발명은 H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2 및 L-CDR3을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 CDR-H1은 FTF(X₁)(X₂)(X₃)(X₄)M(X₅)에 의해 나타내어지는 아미노산 서열 (서열식별번호: 143)을 갖는다. 일부 실시양태에서, 임의의 조합으로, X₁은 S, G 또는 A일 수 있고/거나; X₂는 S 또는 F일 수 있고/거나; X₃은 F 또는 Y일 수 있고/거나; X₄는 S 또는 A일 수 있고/거나; X₅는 D, N 또는 Y일 수 있다. H-CDR1이 적어도 1개의 아미노산 치환을 함유하는 일부 실시양태에서, 위치 X1은 S로 대체될 수 있고/거나; 위치 X2는 S로 대체될 수 있고/거나; 위치 X3은 F로 대체될 수 있고/거나; 위치 X4는 S로 대체될 수 있고/거나; 위치 X5는 D로 대체될 수 있다.

항체의 CDR-H2는 YI(X₁)(X₂)(X₃)A(X₄)TIYYA(X₅)SVKG에 의해 나타내어지는 아미노산 서열 (서열식별번호: 144)을 갖는다. 일부 실시양태에서, 임의의 조합으로, X₁은 S 또는 H일 수 있고/거나; X₂는 P 또는 S일 수 있고/거나; X₃은 S 또는 D일 수 있고/거나; X₄는 D 또는 S일 수 있고/거나; X₅는 D 또는 G일 수 있다. H-CDR2가 적어도 1개의 아미노산 치환을 함유하는 일부 실시양태에서, 위치 X1은 S로 대체될 수 있고/거나; 위치 X2는 P로 대체될 수 있고/거나; 위치 X3은 D로 대체될 수 있고/거나; 위치 X4는 S로 대체될 수 있고/거나; 위치 X5는 D로 대체될 수 있다.

항체의 CDR-H3은 (X₁)R(X₂)(X₃)(X₄)D(X₅)GDML(X₆)P에 의해 나타내어지는 아미노산 서열 (서열식별번호: 145)을 갖는다. 일부 실시양태에서, 임의의 조합으로, X₁은 A 또는 V일 수 있고/거나; X₂는 G 또는 A일 수 있고/거나; X₃은 V 또는 T일 수 있고/거나; X₄는 L 또는 W일 수 있고/거나; X₅는 Y 또는 M일 수 있고/거나; X₆은 M 또는 D일 수 있다. H-CDR3이 적어도 1개의 아미노산 치환을 함유하는 일부 실시양태에서, 위치 X1은 A로 대체될 수 있고/거나; 위치 X2는 G로 대체될 수 있고/거나; 위치 X3은 V로 대체될 수 있고/거나; 위치 X4는 L로 대체될 수 있고/거나; 위치 X5는 Y로 대체될 수 있고/거나; 위치 X6은 D로 대체될 수 있다.

CDR-L1은 임의로 1 또는 2개의 아미노산 변화를 갖는 아미노산 서열 QASQDITNYLN (서열식별번호: 105)을 갖는다.

CDR-L2는 임의로 1 또는 2개의 아미노산 변화를 갖는 아미노산 서열 DASNLET (서열식별번호: 106)를 갖는다.

CDR-L3은 임의로 1 또는 2개의 아미노산 변화를 갖는 아미노산 서열 QQADNHPPWT (서열식별번호: 12)를 갖는다.

카테고리 3의 바람직한 항체의 항체 기준을 충족하는 본원에 개시된 항체의 비제한적 예는 다음을 포함한다: Ab5, Ab6, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24, Ab25, Ab26, Ab27, Ab28, Ab29, Ab30, Ab31, Ab32 및 Ab34.

하기 표 2는 카테고리 3 항체의 CDR 컨센서스 서열을 요약한다. 일부 실시양태에서, 각각의 CDR 서열은 하기 제시된 아미노산 치환 중 1개 이상을 임의로 함유할 수 있다.

표 2. 중쇄 및 경쇄 컨센서스 CDR 서열 및 바람직한 아미노산 치환

일부 실시양태에서, 카테고리 3 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 ≤ 1 nM의 KD로 각각의 하기 인간 LLC: hLTBP1-프로TGFβ1, hLTBP3-프로TGFβ1, hGARP-프로TGFβ1 및 hLRRC33-프로TGFβ1 복합체에 특이적으로 결합하며, 여기서 친화도는 용액 평형 적정-기반 검정과 같은 적합한 검정을 사용하여 평형상태에서 측정된다.

일부 실시양태에서, 항체 또는 단편은 잠복성 라쏘의 적어도 한 부분을 포함하는 결합 영역에서 인간 LLC에 결합한다. 잠복성 라쏘는 프로도메인의 소위 "직쇄형 재킷"의 일부를 형성하는 단백질 도메인이다. 그의 천연 형태에서, 인간 프로TGFβ1 폴리펩티드의 잠복성 라쏘는 아미노산 서열 LASPPSQGEVPPGPL (서열식별번호: 153)을 갖는다. 임의의 적합한 기술을 사용하여 항체가 잠복성 라쏘의 적어도 한 부분을 포함하는 영역에서 인간 TGFβ1 LLC에 결합하는지 여부를 결정할 수 있다. 예를 들어, 상응하는 폴리펩티드를 이용하는 경쟁 검정이 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 결합 영역은 HD-X 또는 X-선 결정학에 의해 결정될 수 있다.

일부 실시양태에서, 이러한 항체 또는 단편은 용액 평형 적정에 의해 측정시 ≤ 500 pM (임의로 ≤ 400 pM, ≤ 300 pM, ≤ 200 pM 또는 ≤ 100 pM)의 KD로 hLTBP1-프로TGFβ1, hLTBP3-프로TGFβ1, hGARP-프로TGFβ1 및 hLRRC33-프로TGFβ1 복합체 각각에 결합할 수 있으며, 여기서 항체 또는 단편은 잠복성 라쏘의 적어도 한 부분을 포함하는 결합 영역에서 인간 LLC에 결합한다.

일부 실시양태에서, 이러한 항체는 프로TGFβ1 복합체 내의 성장 인자 도메인의 적어도 한 부분을 포함하는 추가의 결합 영역(들)에서 인간 LLC에 추가로 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 추가의 결합은 잠복성 복합체와 관련하여서만 발생하여, 항체가 프로도메인 복합체와 회합되어 있지 않는 유리 성장 인자에는 특이적으로 결합하지 않는다. LLC의 성장 인자 도메인 내의 추가의 결합 영역(들)은 "핑거-1" 및/또는 "핑거-2"로 지칭되는 단백질 도메인의 적어도 한 부분을 포함할 수 있다. 따라서, 이러한 항체는 잠복성 라쏘의 적어도 1개의 아미노산 잔기 및 성장 인자 도메인의 적어도 1개의 아미노산 잔기를 포함하는 조합 에피토프에 결합할 수 있다.

항체는 또한 높은 특이성 및 높은 친화도로 추가의 종의 상응하는 LLC에 결합할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 뮤린 대응물에 대한 종 교차-반응성을 나타낸다.

교차-차단 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 본원에 포함된다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 카테고리 3 항체 중 하나를 교차-차단하거나 또는 그와 교차-경쟁하며, 여기서 항체는 MSD-SET에 의해 측정시 인간 LLC 복합체 (hLTBP1-프로TGFβ1, hLTBP3-프로TGFβ1, hGARP-프로TGFβ1 및/또는 hLRRC33-프로TGFβ1) 중 적어도 1종에 대해 ≤ 1 nM의 KD를 갖는다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 MSD-SET에 의해 측정시, 하기로부터 선택된 인간 LLC 복합체 중 2종에 대해 ≤ 1 nM의 KD를 갖는다: hLTBP1-프로TGFβ1, hLTBP3-프로TGFβ1, hGARP-프로TGFβ1 및 hLRRC33-프로TGFβ1. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 MSD-SET에 의해 측정시, 하기로부터 선택된 인간 LLC 복합체 중 3종에 대해 ≤ 1 nM의 KD를 갖는다: hLTBP1-프로TGFβ1, hLTBP3-프로TGFβ1, hGARP-프로TGFβ1 및 hLRRC33-프로TGFβ1. 바람직한 실시양태에서, 이러한 항체는 MSD-SET에 의해 측정시, 하기 각각의 인간 LLC 복합체에 대해 ≤ 1 nM의 KD를 갖는다: hLTBP1-프로TGFβ1, hLTBP3-프로TGFβ1, hGARP-프로TGFβ1 및 hLRRC33-프로TGFβ1. 본 개시내용에 따르면, 고친화도 항체는 평형상태에서 1 nM 이하, 예를 들어 ≤ 1 nM, ≤ 0.5 nM, ≤ 400 pM, ≤ 300 pM, ≤ 200 pM 및 ≤ 100 pM인 특정한 항원 (예를 들어, 항원 복합체)에 대한 KD 값을 가질 수 있다.

카테고리 4 항체

본원에 개시된 항체는 TGFβ1의 인간 잠복 대형 복합체를 특이적으로 표적화할 수 있는 고친화도, 이소형-선택적 항체이다.

추가 측면에서, 본 발명은 H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2 및 L-CDR3을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 H-CDR1은 FTFSSFSMD (서열식별번호: 107) 또는 FTFSSFSMN (서열식별번호: 114)을 포함하고, 여기서 임의로 각각은 4개 이하의 아미노산 변화 (임의로 4개 이하, 3개 이하, 2 또는 1개 이하의 아미노산 변화)를 함유할 수 있고; H-CDR2는 YISPDASTIYYADSVKG (서열식별번호: 111)를 포함하며, 여기서 임의로 H-CDR2는 4개 이하의 아미노산 변화 (임의로 4개 이하, 3개 이하, 2 또는 1개 이하의 아미노산 변화)를 함유할 수 있고, H-CDR3은 ARGVLDYGDMLDP (서열식별번호: 110)를 포함하며, 여기서 임의로 H-CDR3은 3개 이하의 아미노산 변화 (임의로 3개 이하, 2 또는 1개 이하의 아미노산 변화)를 함유할 수 있고; L-CDR1은 임의로 1 또는 2개의 아미노산 변화를 갖는 QASQDITNYLN (서열식별번호: 105)을 포함하고; L-CDR2는 임의로 1 또는 2개의 아미노산 변화를 갖는 DASNLET (서열식별번호: 106)를 포함하고; L-CDR3은 임의로 1 또는 2개의 아미노산 변화를 갖는 QQADNHPPWT (서열식별번호: 12)를 포함한다.

카테고리 4의 바람직한 항체의 항체 기준을 충족하는 본원에 개시된 항체의 비제한적 예는 다음을 포함한다: Ab4, Ab5, Ab6, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24, Ab25, Ab26, Ab27, Ab28, Ab29, Ab30, Ab31, Ab32, Ab33 및 Ab34.

하기 표 3은 카테고리 4 항체의 CDR 서열을 요약한다. 일부 실시양태에서, 각각의 CDR 서열은 하기 제시된 아미노산 치환 중 1개 이상을 임의로 함유할 수 있다.

표 3. CDR 서열 및 변이체

일부 실시양태에서, 카테고리 4 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 ≤ 1 nM의 KD로 각각의 하기 인간 LLC: hLTBP1-프로TGFβ1, hLTBP3-프로TGFβ1, hGARP-프로TGFβ1 및 hLRRC33-프로TGFβ1 복합체에 특이적으로 결합하며, 여기서 친화도는 용액 평형 적정-기반 검정과 같은 적합한 검정을 사용하여 평형상태에서 측정된다.

일부 실시양태에서, 항체 또는 단편은 잠복성 라쏘의 적어도 한 부분을 포함하는 결합 영역에서 인간 LLC에 결합한다. 잠복성 라쏘는 프로도메인의 소위 "직쇄형 재킷"의 일부를 형성하는 단백질 도메인이다. 그의 천연 형태에서, 인간 프로TGFβ1 폴리펩티드의 잠복성 라쏘는 아미노산 서열 LASPPSQGEVPPGPL (서열식별번호: 153)을 갖는다. 임의의 적합한 기술을 사용하여 항체가 잠복성 라쏘의 적어도 한 부분을 포함하는 영역에서 인간 TGFβ1 LLC에 결합하는지 여부를 결정할 수 있다. 예를 들어, 상응하는 폴리펩티드를 이용하는 경쟁 검정이 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 결합 영역은 HD-X 또는 X-선 결정학에 의해 결정될 수 있다.

일부 실시양태에서, 이러한 항체 또는 단편은 용액 평형 적정에 의해 측정시 ≤ 500 pM (임의로 ≤ 400 pM, ≤ 300 pM, ≤ 200 pM 또는 ≤ 100 pM)의 KD로 hLTBP1-프로TGFβ1, hLTBP3-프로TGFβ1, hGARP-프로TGFβ1 및 hLRRC33-프로TGFβ1 복합체 각각에 결합할 수 있으며, 여기서 항체 또는 단편은 잠복성 라쏘의 적어도 한 부분을 포함하는 결합 영역에서 인간 LLC에 결합한다.

일부 실시양태에서, 이러한 항체는 프로TGFβ1 복합체 내의 성장 인자 도메인의 적어도 한 부분을 포함하는 추가의 결합 영역(들)에서 인간 LLC에 추가로 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 추가의 결합은 잠복성 복합체와 관련하여서만 발생하여, 항체가 프로도메인 복합체와 회합되어 있지 않는 유리 성장 인자에는 특이적으로 결합하지 않는다. LLC의 성장 인자 도메인 내의 추가의 결합 영역(들)은 "핑거-1" 및/또는 "핑거-2"로 지칭되는 단백질 도메인의 적어도 한 부분을 포함할 수 있다. 따라서, 이러한 항체는 잠복성 라쏘의 적어도 1개의 아미노산 잔기 및 성장 인자 도메인의 적어도 1개의 아미노산 잔기를 포함하는 조합 에피토프에 결합할 수 있다.

항체는 또한 높은 특이성 및 높은 친화도로 추가의 종의 상응하는 LLC에 결합할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 뮤린 대응물에 대한 종 교차-반응성을 나타낸다.

교차-차단 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 본원에 포함된다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 카테고리 4 항체 중 하나를 교차-차단하거나 또는 그와 교차-경쟁하며, 여기서 항체는 MSD-SET에 의해 측정시 인간 LLC 복합체 (hLTBP1-프로TGFβ1, hLTBP3-프로TGFβ1, hGARP-프로TGFβ1 및/또는 hLRRC33-프로TGFβ1) 중 적어도 1종에 대해 ≤ 1 nM의 KD를 갖는다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 MSD-SET에 의해 측정시, 하기로부터 선택된 인간 LLC 복합체 중 2종에 대해 ≤ 1 nM의 KD를 갖는다: hLTBP1-프로TGFβ1, hLTBP3-프로TGFβ1, hGARP-프로TGFβ1 및 hLRRC33-프로TGFβ1. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 MSD-SET에 의해 측정시, 하기로부터 선택된 인간 LLC 복합체 중 3종에 대해 ≤ 1 nM의 KD를 갖는다: hLTBP1-프로TGFβ1, hLTBP3-프로TGFβ1, hGARP-프로TGFβ1 및 hLRRC33-프로TGFβ1. 바람직한 실시양태에서, 이러한 항체는 MSD-SET에 의해 측정시, 하기 각각의 인간 LLC 복합체에 대해 ≤ 1 nM의 KD를 갖는다: hLTBP1-프로TGFβ1, hLTBP3-프로TGFβ1, hGARP-프로TGFβ1 및 hLRRC33-프로TGFβ1. 본 개시내용에 따르면, 고친화도 항체는 평형상태에서 1 nM 이하, 예를 들어 ≤ 1 nM, ≤ 0.5 nM, ≤ 400 pM, ≤ 300 pM, ≤ 200 pM 및 ≤ 100 pM인 특정한 항원 (예를 들어, 항원 복합체)에 대한 KD 값을 가질 수 있다.

카테고리 5 항체

본원에 개시된 항체는 TGFβ1의 인간 잠복 대형 복합체를 특이적으로 표적화할 수 있는 고친화도, 이소형-선택적 항체이다.

추가 측면에서, 본 발명은 하기에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (V_H): EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFSSFSMDWVRQAPGKGLEWVSYISPSADTIYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGVLDYGDMLMPWGQGTLVTVSS (서열식별번호: 13); 및 하기에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (V_L): DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDITNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQADNHPPWTFGGGTKVEIK (서열식별번호: 15)을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.

일부 실시양태에서, 항체의 중쇄 가변 도메인은 서열식별번호: 13에 제시된 VH 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다.

일부 실시양태에서, 항체의 중쇄 가변 도메인은 상기 VH 서열에 대해 적어도 95% 동일하다.

일부 실시양태에서, 항체의 중쇄 가변 도메인은 서열식별번호: 15에 제시된 VL 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다.

일부 실시양태에서, 항체의 경쇄 가변 도메인은 상기 VL 서열에 대해 적어도 95% 동일하다.

카테고리 5의 바람직한 항체의 항체 기준을 충족하는 본원에 개시된 항체의 비제한적 예는 다음을 포함한다: Ab4, Ab5, Ab6, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24, Ab25, Ab26, Ab27, Ab28, Ab29, Ab30, Ab31, Ab32, Ab33 및 Ab34.

일부 실시양태에서, 카테고리 5 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 ≤ 1 nM의 KD로 각각의 하기 인간 LLC: hLTBP1-프로TGFβ1, hLTBP3-프로TGFβ1, hGARP-프로TGFβ1 및 hLRRC33-프로TGFβ1 복합체에 특이적으로 결합하며, 여기서 친화도는 용액 평형 적정-기반 검정과 같은 적합한 검정을 사용하여 평형상태에서 측정된다.

일부 실시양태에서, 항체 또는 단편은 잠복성 라쏘의 적어도 한 부분을 포함하는 결합 영역에서 인간 LLC에 결합한다. 잠복성 라쏘는 프로도메인의 소위 "직쇄형 재킷"의 일부를 형성하는 단백질 도메인이다. 그의 천연 형태에서, 인간 프로TGFβ1 폴리펩티드의 잠복성 라쏘는 아미노산 서열 LASPPSQGEVPPGPL (서열식별번호: 153)을 갖는다. 임의의 적합한 기술을 사용하여 항체가 잠복성 라쏘의 적어도 한 부분을 포함하는 영역에서 인간 TGFβ1 LLC에 결합하는지 여부를 결정할 수 있다. 예를 들어, 상응하는 폴리펩티드를 이용하는 경쟁 검정이 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 결합 영역은 HD-X 또는 X-선 결정학에 의해 결정될 수 있다.

일부 실시양태에서, 이러한 항체 또는 단편은 용액 평형 적정에 의해 측정시 ≤ 500 pM (임의로 ≤ 400 pM, ≤ 300 pM, ≤ 200 pM 또는 ≤ 100 pM)의 KD로 hLTBP1-프로TGFβ1, hLTBP3-프로TGFβ1, hGARP-프로TGFβ1 및 hLRRC33-프로TGFβ1 복합체 각각에 결합할 수 있으며, 여기서 항체 또는 단편은 잠복성 라쏘의 적어도 한 부분을 포함하는 결합 영역에서 인간 LLC에 결합한다.

일부 실시양태에서, 이러한 항체는 프로TGFβ1 복합체 내의 성장 인자 도메인의 적어도 한 부분을 포함하는 추가의 결합 영역(들)에서 인간 LLC에 추가로 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 추가의 결합은 잠복성 복합체와 관련하여서만 발생하여, 항체가 프로도메인 복합체와 회합되어 있지 않는 유리 성장 인자에는 특이적으로 결합하지 않는다. LLC의 성장 인자 도메인 내의 추가의 결합 영역(들)은 "핑거-1" 및/또는 "핑거-2"로 지칭되는 단백질 도메인의 적어도 한 부분을 포함할 수 있다. 따라서, 이러한 항체는 잠복성 라쏘의 적어도 1개의 아미노산 잔기 및 성장 인자 도메인의 적어도 1개의 아미노산 잔기를 포함하는 조합 에피토프에 결합할 수 있다.

항체는 또한 높은 특이성 및 높은 친화도로 추가의 종의 상응하는 LLC에 결합할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 뮤린 대응물에 대한 종 교차-반응성을 나타낸다.

교차-차단 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 본원에 포함된다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 카테고리 5 항체 중 하나를 교차-차단하거나 또는 그와 교차-경쟁하며, 여기서 항체는 MSD-SET에 의해 측정시 인간 LLC 복합체 (hLTBP1-프로TGFβ1, hLTBP3-프로TGFβ1, hGARP-프로TGFβ1 및/또는 hLRRC33-프로TGFβ1) 중 적어도 1종에 대해 ≤ 1 nM의 KD를 갖는다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 MSD-SET에 의해 측정시, 하기로부터 선택된 인간 LLC 복합체 중 2종에 대해 ≤ 1 nM의 KD를 갖는다: hLTBP1-프로TGFβ1, hLTBP3-프로TGFβ1, hGARP-프로TGFβ1 및 hLRRC33-프로TGFβ1. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 MSD-SET에 의해 측정시, 하기로부터 선택된 인간 LLC 복합체 중 3종에 대해 ≤ 1 nM의 KD를 갖는다: hLTBP1-프로TGFβ1, hLTBP3-프로TGFβ1, hGARP-프로TGFβ1 및 hLRRC33-프로TGFβ1. 바람직한 실시양태에서, 이러한 항체는 MSD-SET에 의해 측정시, 하기 각각의 인간 LLC 복합체에 대해 ≤ 1 nM의 KD를 갖는다: hLTBP1-프로TGFβ1, hLTBP3-프로TGFβ1, hGARP-프로TGFβ1 및 hLRRC33-프로TGFβ1. 본 개시내용에 따르면, 고친화도 항체는 평형상태에서 1 nM 이하, 예를 들어 ≤ 1 nM, ≤ 0.5 nM, ≤ 400 pM, ≤ 300 pM, ≤ 200 pM 및 ≤ 100 pM인 특정한 항원 (예를 들어, 항원 복합체)에 대한 KD 값을 가질 수 있다.

본 발명의 예시적인 항체

본 발명을 수행하는데 유용한 이러한 항체를 코딩하는 예시적인 항체 및 상응하는 핵산 서열은 표 4 및 5에 제시된 CDR 아미노산 서열 중 1개 이상을 포함한다. 표 5에 열거된 H-CDR (H-CDR1, H-CDR2 및 H-CDR3)의 각각의 세트는 표 5에 제공된 L-CDR (L-CDR1, L-CDR2 및 L-CDR3)과 조합될 수 있다.

따라서, 본 발명은 6개의 CDR (예를 들어, H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2 및 L-CDR3)을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 H-CDR1, H-CDR2 및 H-CDR3은 표 4에 열거된 항체의 H-CDR 세트로부터 선택되고, 여기서 L-CDR1은 QASQDITNYLN (서열식별번호: 105)을 포함하고, L-CDR2는 DASNLET (서열식별번호: 106)를 포함하고, L-CDR3은 QQADNHPPWT (서열식별번호: 12)를 포함하고, 여기서 임의로 H-CDR1은 FTFSSFSMD (서열식별번호: 107)를 포함할 수 있고/거나; H-CDR2는 YISPSADTIYYADSVKG (서열식별번호: 103)를 포함할 수 있고/거나; H-CDR3은 ARGVLDYGDMLMP (서열식별번호: 6)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 단편은 아미노산 서열 FTFSSFSMD (서열식별번호: 107)를 갖는 H-CDR1, 아미노산 서열 YISPSADTIYYADSVKG (서열식별번호: 103)를 갖는 H-CDR2, 및 아미노산 서열 ARGVLDYGDMLMP (서열식별번호: 6)를 갖는 H-CDR-3; 아미노산 서열 QASQDITNYLN (서열식별번호: 105)을 갖는 L-CDR1, 아미노산 서열 DASNLET (서열식별번호: 106)를 갖는 L-CDR2, 및 아미노산 서열 QQADNHPPWT (서열식별번호: 12)를 갖는 L-CDR3을 포함한다.

표 4. 루(Lu) 등에 기재된 넘버링 스킴을 사용하여 결정된 바와 같은, 예시적인 항체의 중쇄의 상보성 결정 영역.

표 5. 카바트 넘버링 스킴 또는 루 등의 넘버링 시스템을 사용하여 결정된 바와 같은, 예시적인 항체의 경쇄의 상보성 결정 영역.

항체 내의 CDR 서열의 결정은 사용되는 특정한 넘버링 스킴에 좌우된다. 통상적으로 사용되는 시스템은 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 카바트 넘버링 시스템, IMTG 넘버링 시스템, 코티아 넘버링 시스템, 및 기타, 예컨대 루 등에 의해 기재된 넘버링 스킴 (Lu X et al., MAbs. 2019 Jan;11(1):45-57). 예시하자면, 4종의 상이한 넘버링 시스템에 의해 정의된 바와 같은 Ab6의 6개의 CDR 서열이 하기에서 예시된다. 임의의 관련 기술분야에서 인식되는 CDR 넘버링 시스템이 본 개시내용의 항체의 CDR 서열을 정의하는데 사용될 수 있다.

표 6. 4종의 넘버링 스킴에 기초한 예시적인 항체 (Ab6)의 6개의 CDR

본 개시내용의 예시적인 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열이 표 7에 제공된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 고친화도, 이소형-선택적 TGFβ1 억제제는 중쇄 가변 도 메인(V_H) 및 경쇄 가변 도메인 (V_L)을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편일 수 있으며, 여기서 V_H 및 V_L 서열은 하기 표 7에 열거된 V_H 및 V_L 서열 세트 중 어느 하나로부터 선택된다.

표 7. 예시적인 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인

따라서, 본 발명은 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 중쇄 가변 도메인은 Ab4, Ab5, Ab6, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24, Ab25, Ab26, Ab27, Ab28, Ab29, Ab30, Ab31, Ab32, Ab33 및 Ab34로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 중 어느 하나와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 99% 및 100%) 서열 동일성을 갖고; 여기서 경쇄 가변 도메인은 Ab4, Ab5, Ab6, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24, Ab25, Ab26, Ab27, Ab28, Ab29, Ab30, Ab31, Ab32, Ab33 및 Ab34로부터 선택된 서열 중 어느 하나와 적어도 90% 동일성을 갖고, 여기서 임의로 중쇄 가변 도메인은 임의로 적어도 95% 서열 동일성을 가질 수 있고/거나, 경쇄 가변 도메인은 적어도 95% (예를 들어, 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 99% 및 100%) 서열 동일성을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 단편의 중쇄 가변 도메인은 서열식별번호: 13과 적어도 90% 서열 동일성을 가지며, 여기서 임의로 항체 또는 단편의 경쇄 가변 도메인은 서열식별번호: 15와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 단편의 중쇄 가변 도메인은 서열식별번호: 13과 적어도 95% 서열 동일성을 가지며, 여기서 임의로 항체 또는 단편의 경쇄 가변 도메인은 서열식별번호: 15와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 단편의 중쇄 가변 도메인은 서열식별번호: 13과 적어도 98% 서열 동일성을 가지며, 여기서 임의로 항체 또는 단편의 경쇄 가변 도메인은 서열식별번호: 15와 적어도 98% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 단편의 중쇄 가변 도메인은 서열식별번호: 13과 100% 서열 동일성을 가지며, 여기서 임의로 항체 또는 단편의 경쇄 가변 도메인은 서열식별번호: 15와 100% 서열 동일성을 갖는다.

일부 실시양태에서, GARP-TGFβ1 복합체, LTBP1-TGFβ1 복합체, LTBP3-TGFβ1 복합체 및/또는 LRRC33-TGFβ1 복합체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 서열식별번호: 14에 제시된 핵산 서열에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩되는 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열, 및 서열식별번호: 16에 제시된 핵산 서열에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩되는 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 서열식별번호: 14에 제시된 핵산 서열에 의해 코딩되는 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열 및 서열식별번호: 16에 제시된 핵산 서열에 의해 코딩되는 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함한다.

일부 예에서, GARP-TGFβ1 복합체, LTBP1-TGFβ1 복합체, LTBP3-TGFβ1 복합체 및/또는 LRRC33-TGFβ1 복합체에 특이적으로 결합하는 본 개시내용의 임의의 항체는 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및/또는 CDRL3과 실질적으로 유사한 1개 이상의 CDR (예를 들어, CDRH 또는 CDRL) 서열을 갖는 임의의 항체 (그의 항원 결합 부분 포함)를 포함한다. 예를 들어, 항체는 서열식별번호: 6, 12, 103, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 및 126 중 어느 하나에서의 상응하는 CDR 영역과 비교하여 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 잔기 변형을 함유하는, 표 4에 제시된 바와 같은 1개 이상의 CDR 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 6개의 CDR 서열 중 1개 이상은 표 4에 제공된 서열과 비교하여 3개 이하의 아미노산 변화를 함유한다. CDR당 3개 이하의 아미노산 변화를 포함하는 이러한 항체 변이체는 본 발명에 포괄된다. 일부 실시양태에서, 이러한 변이체 항체는 최적화 과정, 예컨대 친화도 성숙에 의해 생성된다. 표 7에 열거된 항체 (예를 들어, Ab6)의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역에 대한 완전한 아미노산 서열, 뿐만 아니라 특정 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열이 하기에 제공된다:

일부 실시양태에서, 2개의 아미노산 서열의 "퍼센트 동일성"은 문헌 [Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993]에서와 같이 변형된, 문헌 [Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990]의 알고리즘을 사용하여 결정된다. 이러한 알고리즘은 문헌 [Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (버전 2.0) 내로 혼입된다. XBLAST 프로그램, 스코어=50, 워드 길이=3으로 BLAST 단백질 검색을 수행하여, 관심 단백질 분자에 대해 상동인 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 2개의 서열 사이에 갭이 존재하는 경우에, 갭드(Gapped) BLAST가 문헌 [Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997]에 기재된 바와 같이 이용될 수 있다. BLAST 및 갭드 BLAST 프로그램을 이용하는 경우에, 각각의 프로그램 (예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다.

본원에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편 중 임의의 것에서, 1개 이상의 보존적 돌연변이는 잔기가 항체-항원 상호작용에 수반될 가능성이 없는 위치에서 CDR 또는 프레임워크 서열 내로 도입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 보존적 돌연변이(들)는 잔기가 결정 구조에 기초하여 결정시 GARP-TGFβ1 복합체, LTBP1-TGFβ1 복합체, LTBP3-TGFβ1 복합체 및 LRRC33-TGFβ1 복합체와 상호작용하는데 수반될 가능성이 없는 위치(들)에서 CDR 또는 프레임워크 서열 내로 도입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 가능성 있는 계면 (예를 들어, 항원-항체 상호작용에 수반되는 잔기)은 구조적 유사성을 공유하는 또 다른 항원에 대한 공지된 구조적 정보로부터 추론될 수 있다.

본원에 사용된 "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 치환이 이루어지는 단백질의 상대 전하 또는 크기 특징을 변경시키지 않는 아미노산 치환을 지칭한다. 변이체는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 폴리펩티드 서열을 변경시키는 방법에 따라 제조될 수 있으며, 예컨대 이는 이러한 방법을 컴파일링하는 참고문헌, 예를 들어 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, 또는 Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New York]에서 확인된다. 아미노산의 보존적 치환은 하기 군 내의 아미노산 중에서 이루어진 치환을 포함한다: (a) M, I, L, V; (b) F, Y, W; (c) K, R, H; (d) A, G; (e) S, T; (f) Q, N; 및 (g) E, D.

일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 바람직한 특성을 항체에 부여하는 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 천연 IgG4 mAb에서 발생하는 것으로 공지된 Fab-아암 교환으로 인한 잠재적 합병증을 피하기 위해, 본원에 제공된 항체는 안정화 'Adair' 돌연변이를 포함할 수 있으며 (Angal et al., "A single amino acid substitution abolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human (IgG4) antibody," Mol Immunol 30, 105-108; 1993), 여기서 세린 228 (EU 넘버링; 잔기 241 카바트 넘버링)이 프롤린으로 전환되어 IgG1-유사 (CPPCP (서열식별번호: 54)) 힌지 서열을 생성한다. 따라서, 임의의 항체는 안정화 'Adair' 돌연변이 또는 아미노산 서열 CPPCP (서열식별번호: 54)를 포함할 수 있다.

본 개시내용의 TGFβ1의 이소형-특이적, 콘텍스트-비의존성 억제제는 임의로 항체 불변 영역 또는 그의 일부를 포함할 수 있다. 예를 들어, VL 도메인은 그의 C-말단 단부에서 경쇄 불변 도메인, 예컨대 Cκ 또는 Cλ에 부착될 수 있다. 유사하게, VH 도메인 또는 그의 부분은 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM, 및 임의의 이소형 하위부류와 같은 중쇄의 모두 또는 일부에 부착될 수 있다. 항체는 적합한 불변 영역을 포함할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, No. 91-3242, National Institutes of Health Publications, Bethesda, Md. (1991)] 참조). 따라서, 본 개시내용의 범주 내의 항체는 임의의 적합한 불변 영역과 조합된 VH 및 VL 도메인 또는 그의 항원 결합 부분을 포함할 수 있다.

추가적으로 또는 대안적으로, 이러한 항체는 서열식별번호: 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142 및 15의 항체의 프레임워크 영역을 포함할 수 있거나 또는 포함하지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, GARP-TGFβ1 복합체, LTBP1-TGFβ1 복합체, LTBP3-TGFβ1 복합체 및 LRRC33-TGFβ1 복합체에 특이적으로 결합하는 항체는 뮤린 항체이고, 뮤린 프레임워크 영역 서열을 포함한다.

일부 실시양태에서, 이러한 항체는 GARP-TGFβ1 복합체, LTBP1-TGFβ1 복합체, LTBP3-TGFβ1 복합체 및 LRRC33-TGFβ1 복합체에 비교적 높은 친화도, 예를 들어 10^-9 M, 10^-10 M, 10^-11 M 또는 그 미만보다 더 적은 KD로 결합한다. 예를 들어, 이러한 항체는 GARP-TGFβ1 복합체, LTBP1-TGFβ1 복합체, LTBP3-TGFβ1 복합체 및/또는 LRRC33-TGFβ1 복합체에 5 pM 내지 1 nM, 예를 들어 10 pM 내지 1 nM, 예를 들어 10 pM 내지 100 pM의 친화도로 결합할 수 있다. 본 개시내용은 또한 GARP-TGFβ1 복합체, LTBP1-TGFβ1 복합체, LTBP3-TGFβ1 복합체 및/또는 LRRC33-TGFβ1 복합체에의 결합에 대해 본원에 기재된 임의의 항체와 경쟁하고, 1 nM 이하 (예를 들어, 1 nM 이하, 500 pM 이하, 100 pM 이하)의 KD 값을 갖는 항체 또는 항원 결합 단편을 포함한다. GARP-TGFβ1 복합체, LTBP1-TGFβ1 복합체, LTBP3-TGFβ1 복합체 및/또는 LRRC33-TGFβ1 복합체에 특이적으로 결합하는 항체의 친화도 및 결합 동역학은 바이오센서-기반 기술 (예를 들어, 옥테트® 또는 비아코어) 및 용액 평형 적정-기반 기술 (예를 들어, MSD-SET)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 적합한 방법을 사용하여 시험될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 세포-연관 TGFβ1 (예를 들어, GARP-제시된 TGFβ1 및 LRRC33-제시된 TGFβ1)의 억제제는 이러한 복합체 (예를 들어, GARP-프로/잠복 TGFβ1 및 LRRC33-프로/잠복 TGFβ1)에 특이적으로 결합하고 복합체의 내재화를 촉발하는 항체 또는 그의 단편을 포함한다. 이러한 작용 방식은 세포 표면 (예를 들어, Treg, 대식세포 등)으로부터의 불활성 TGFβ1 복합체 (예를 들어, GARP-프로TGFβ1 및 LRRC33-프로TGFβ1)의 제거 또는 고갈을 유발하여, 활성화에 이용가능한 TGFβ1을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체 또는 그의 단편은, 결합이 중성 또는 생리학적 pH에서 일어나지만 항체가 산성 pH에서 그의 항원으로부터 해리되도록 하는 pH-의존성 방식으로 표적 복합체에 결합하거나; 또는 해리율은 중성 pH에서보다 산성 pH에서 더 높다. 이러한 항체 또는 그의 단편은 재순환 항체로서 기능할 수 있다.

TGFβ1의 고친화도, 이소형-특이적 억제 항체와 경쟁하는 항체

본 개시내용의 측면은 본원에 제공된 임의의 항체와 경쟁 또는 교차-경쟁하는 항체에 관한 것이다. 항체와 관련하여 본원에 사용된 용어 "경쟁하다"는, 제1 항체와 그의 에피토프의 결합의 결과가 제2 항체의 부재 하의 제1 항체의 결합과 비교하여 제2 항체의 존재 하에 검출가능하게 감소되도록 제2 항체의 결합과 충분히 유사하거나 또는 그와 중첩되는 방식으로, 제1 항체가 에피토프 (예를 들어, GARP-프로TGFβ1 복합체, LTBP1-프로TGFβ1 복합체, LTBP3-프로TGFβ1 복합체 및 LRRC33-프로TGFβ1 복합체의 에피토프)에 결합하는 것을 의미한다. 제2 항체와 그의 에피토프와의 결합이 또한 제1 항체의 존재 하에 검출가능하게 감소되는 또 다른 방식도 이에 해당될 수 있지만, 반드시 그렇지는 않다. 즉, 제2 항체는 제1 항체가 그의 각각의 에피토프에 결합하는 것을 억제하지 않으면서 제1 항체는 제2 항체가 그의 에피토프에 결합하는 것을 억제할 수 있다. 그러나, 각각의 항체가 다른 항체와 그의 에피토프 또는 리간드의 결합을 동일하거나, 더 크거나 또는 더 적은 정도로 검출가능하게 억제하는 경우에, 항체는 이들 각각의 에피토프(들)의 결합에 대해 서로 "교차-경쟁"하는 것으로 언 급된다. 경쟁 및 교차-경쟁 항체 둘 다는 본 개시내용의 범주 내에 있다. 이러한 경쟁 또는 교차-경쟁이 발생하는 메카니즘 (예를 들어, 입체 장애, 입체형태적 변화, 또는 공통 에피토프 또는 그의 부분에 대한 결합)과 관계없이, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이러한 경쟁 및/또는 교차-경쟁 항체가 포괄되고 본원에 제공된 방법 및/또는 조성물에 유용할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 용어 "교차-차단"은 상호교환가능하게 사용될 수 있다.

동일한 항원에 결합하는 2종의 상이한 모노클로날 항체 (또는 항원-결합 단편)는 각각의 결합이 다른 결합을 방해하지 않도록 결합 부위가 3차원 공간에서 충분히 더 떨어져 있는 경우에 항원에 동시에 결합할 수 있다. 대조적으로, 2종의 상이한 모노클로날 항체는 동일하거나 중첩되는 항원의 결합 영역을 가질 수 있으며, 이러한 경우에, 제1 항체의 결합은 제2 항체가 항원에 결합할 수 있는 것을 방지할 수 있거나 또는 그 반대이다. 후자의 경우에, 2종의 항체는 동일한 항원과 관련하여 서로 "교차-차단"하는 것으로 언급된다.

항체 "비닝" 실험은 상대 교차-차단 활성에 기초하여 동일한 항원에 대해 이루어진 다중 항체를 다양한 "빈"으로 분류하는데 유용하다. 따라서, 각각의 "빈"은 항원의 별개의 결합 영역(들)을 나타낸다. 정의에 의해 동일한 빈 내에 있는 항체는 서로 교차-차단한다. 비닝은 표준 시험관내 결합 검정, 예컨대 비아코어 또는 옥테트®에 의해 표준 시험 조건을 사용하여, 예를 들어 제조업체의 지침 (예를 들어, 실온, ~20-25℃에서 결합 검정함)에 따라 조사될 수 있다.

본 개시내용의 측면은 본원에 제공된 바와 같은 특이적 항체 또는 그의 항원 결합 부분 중 임의의 것과 경쟁 또는 교차-경쟁하는 항체에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 본원에 제공된 임의의 항체와 동일한 에피토프에서 또는 그 근처에서 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 그것이 에피토프의 15개 이하 아미노산 잔기 내에서 결합하는 경우에 에피토프 근처에서 결합한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 바와 같은 항체 또는 그의 항원 결합 부분 중 임의의 것은 본원에 제공된 임의의 항체에 의해 결합된 에피토프의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 아미노산 잔기 내에서 결합한다.

또 다른 실시양태에서, 항체와 단백질 사이의 평형 해리 상수 K_D 10^-8 M 미만으로의 본원에 제공된 항원 (예를 들어, GARP-TGFβ1 복합체, LTBP1-TGFβ1 복합체, LTBP3-TGFβ1 복합체 및/또는 LRRC33-TGFβ1 복합체) 중 임의의 것에의 결합에 대해 경쟁 또는 교차-경쟁하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분이 본원에 제공된다. 다른 실시양태에서, 항체는 10^-12 M 내지 10^-9 M 범위의 K_D로의 본원에 제공된 임의의 항원에의 결합에 대해 경쟁하거나 또는 교차-경쟁한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합 부분과 결합에 대해 경쟁하는 항-TGFβ1 항체 또는 그의 항원 결합 부분이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합 부분과 동일한 에피토프에 결합하는 항-TGFβ1 항체 또는 그의 항원 결합 부분이 본원에 제공된다.

본원에 제공된 임의의 항체는 임의의 적합한 방법을 사용하여 특징화될 수 있다. 예를 들어, 한 방법은 항원이 결합하는 에피토프를 확인하는 것 또는 "에피토프 맵핑"이다. 예를 들어 문헌 [Harlow and Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1999]의 챕터 11에 기재된 바와 같이, 항체-항원 복합체의 결정 구조의 해석, 경쟁 검정, 유전자 단편 발현 검정 및 합성 펩티드-기반 검정을 포함한, 단백질 상의 에피토프의 위치를 맵핑 및 특징화하기 위한 많은 적합한 방법이 존재한다. 추가의 예에서, 에피토프 맵핑을 사용하여 항체가 결합하는 서열을 결정할 수 있다. 에피토프는 선형 에피토프일 수 있고, 즉 아미노산의 단일 스트레치 내에 함유될 수 있거나, 또는 반드시 단일 스트레치 (1차 구조 선형 서열) 내에 함유될 필요는 없을 수 있는, 아미노산의 3차원 상호작용에 의해 형성된 입체형태적 에피토프일 수 있다. 일부 실시양태에서, TGFβ1이 GARP-TGFβ1 복합체, LTBP1-TGFβ1 복합체, LTBP3-TGFβ1 복합체 및/또는 LRRC33-TGFβ1 복합체에 존재하는 경우에, 에피토프는 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합 부분에 의한 결합에만 이용가능한 TGFβ1 에피토프이다. 다양한 길이 (예를 들어, 적어도 4-6개 아미노산 길이)의 펩티드를 단리 또는 합성하고 (예를 들어, 재조합적으로), 항체와의 결합 검정에 사용할 수 있다. 또 다른 예에서, 항체가 결합하는 에피토프는 표적 항원 서열로부터 유래된 중첩 펩티드를 사용하고 항체에 의한 결합을 결정함으로써 체계적인 스크린에서 결정할 수 있다. 유전자 단편 발현 검정에 따르면, 표적 항원을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 무작위로 또는 특이적 유전자 구축에 의해 단편화하고, 발현된 항원 단편과 시험될 항체와의 반응성을 결정한다. 유전자 단편을, 예를 들어 PCR에 의해 생성한 다음, 방사성 아미노산의 존재 하에 시험관내에서 단백질로 전사 및 번역시킬 수 있다. 이어서, 방사성 표지된 항원 단편에 대한 항체의 결합을 면역침전 및 겔 전기영동에 의해 결정한다. 파지 입자의 표면 상에 디스플레이된 무작위 펩티드 서열의 대형 라이브러리 (파지 라이브러리)를 사용하여 특정 에피토프를 확인할 수도 있다. 대안적으로, 중첩 펩티드 단편의 정의된 라이브러리를 간단한 결합 검정에서 시험 항체에의 결합에 대해 시험할 수 있다. 추가의 예에서, 항원 결합 도메인의 돌연변이유발, 도메인 스와핑 실험 및 알라닌 스캐닝 돌연변이유발을 수행하여, 에피토프 결합에 요구되고/거나 충분하고/거나 필요한 잔기를 확인할 수 있다. 예를 들어, GARP-프로TGFβ1 복합체, LTBP1-프로TGFβ1 복합체, LTBP3-프로TGFβ1 복합체 및/또는 프로LRRC33-TGFβ1 복합체의 다양한 단편이 밀접하게 관련되지만 항원적으로 별개인 단백질로부터의 서열, 예컨대 TGFβ 단백질 패밀리의 또 다른 구성원 (예를 들어, GDF11)으로 대체 (스와핑)된 표적 항원의 돌연변이체를 사용하여 도메인 스와핑 실험을 수행할 수 있다.

대안적으로, 동일한 항원에 결합하는 것으로 공지된 다른 항체를 사용하여 항체가 상기 다른 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지 여부를 결정하기 위해 경쟁 검정을 수행할 수 있다. 경쟁 검정은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 카테고리 1, 카테고리 2, 카테고리 3, 카테고리 4 및/또는 카테고리 5의 항체 중 어느 하나와 교차-차단 (교차-경쟁)하는 항체 (예를 들어, 이뮤노글로불린, 항원-결합 단편 등)를 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 다음 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다: 카테고리 1 항체와 교차-경쟁하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 선택하는 단계; 및 항체를 제약 조성물로 제제화하는 단계.

일부 실시양태에서, 제약 조성물은 다음 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다: 카테고리 2 항체와 교차-경쟁하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 선택하는 단계; 및 항체를 제약 조성물로 제제화하는 단계.

일부 실시양태에서, 제약 조성물은 다음 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다: 카테고리 3 항체와 교차-경쟁하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 선택하는 단계; 및 항체를 제약 조성물로 제제화하는 단계.

일부 실시양태에서, 제약 조성물은 다음 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다: 카테고리 4 항체와 교차-경쟁하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 선택하는 단계; 및 항체를 제약 조성물로 제제화하는 단계.

일부 실시양태에서, 제약 조성물은 다음 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다: 카테고리 5 항체와 교차-경쟁하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 선택하는 단계; 및 항체를 제약 조성물로 제제화하는 단계.

일부 실시양태에서, 제약 조성물은 다음 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다: Ab4, Ab5, Ab6, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24, Ab25, Ab26, Ab27, Ab28, Ab29, Ab30, Ab31, Ab32, Ab33 및 Ab34로 이루어진 군으로부터 선택된 항체와 교차-경쟁하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 선택하는 단계; 및 제약 조성물로 제제화하는 단계.

바람직하게는, 방법에 의해 선택된 항체는 항체 또는 항원-결합 단편이 용액 평형 적정에 의해 측정시 ≤ 5 nM의 KD로 각각의 인간 LLC (예를 들어, hLTBP1-프로TGFβ1, hLTBP3-프로TGFβ1, hGARP-프로TGFβ1 및 hLRRC33-프로TGFβ1)에 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 고친화도 결합제이다. 일부 실시양태에서, 항체는 카테고리 1, 카테고리 2, 카테고리 3, 카테고리 4 및 카테고리 5 중 1종 이상의 기준을 충족한다. 이러한 교차-경쟁 항체는 본 개시내용에 따라 대상체의 TGFβ1-관련 적응증의 치료에 사용될 수 있다.

항체의 다양한 변형 및 변형

본 개시내용에 의해 포괄되는 임의의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 비제한적 변경, 변형 및 특색은 하기에 간략하게 논의된다. 관련 분석 방법의 실시양태가 또한 제공된다.

자연-발생 항체 구조 단위는 전형적으로 사량체를 포함한다. 각각의 이러한 사량체는 전형적으로 2개의 동일한 쌍의 폴리펩티드 쇄로 구성되며, 각각의 쌍은 1개의 전장 "경쇄" (특정 실시양태에서, 약 25 kDa) 및 1개의 전장 "중쇄" (특정 실시양태에서, 약 50-70 kDa)를 갖는다. 각각의 쇄의 아미노-말단 부분은 전형적으로 항원 인식을 담당하는, 전형적으로 약 100 내지 110개 또는 그 초과의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 각각의 쇄의 카르복시-말단 부분은 전형적으로 이펙터 기능을 담당할 수 있는 불변 영역을 정의한다. 인간 항체 경쇄는 전형적으로 카파 및 람다 경쇄로 분류된다. 중쇄는 전형적으로 뮤, 델타, 감마, 알파 또는 엡실론으로 분류되고, 항체의 이소형을 정의한다. 항체는 임의의 유형 (예를 들어, IgM, IgD, IgG, IgA, IgY 및 IgE) 및 부류 (예를 들어, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgM₁, IgM₂, IgA₁ 및 IgA₂) 일 수 있다. 전장 경쇄 및 중쇄 내에서, 전형적으로, 가변 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 연결되고, 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)) (그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조). 각각의 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은 전형적으로 항원 결합 부위를 형성한다.

가변 영역은 전형적으로 상보성 결정 영역 또는 CDR로도 불리는 3개의 초가변 영역에 의해 연결되는 비교적 보존된 프레임워크 영역 (FR)의 동일한 일반적 구조를 나타낸다. 각각의 쌍의 2개의 쇄로부터의 CDR은 전형적으로 프레임워크 영역에 의해 정렬되며, 이는 특정 에피토프에 결합하는 것을 가능하게 할 수 있다. N-말단에서 C-말단으로, 경쇄 및 중쇄 가변 영역 둘 다는 전형적으로 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 각각의 도메인에 대한 아미노산의 배정은 전형적으로 문헌 [Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991)), 또는 Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917; Chothia et al. (1989) Nature 342: 878-883]의 정의에 따른다. 경쇄의 CDR은 또한 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3으로 지칭될 수 있고, 중쇄의 CDR은 또한 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3으로 지칭될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 중쇄(들)의 카르복시 말단으로부터의 소수의 아미노산 결실을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 중쇄의 카르복시 말단에서 1-5개의 아미노산 결실을 갖는 중쇄를 포함한다. 특정 실시양태에서, CDR의 확정적 설명 및 항체의 결합 부위를 포함하는 잔기의 확인은 이러한 항체의 구조를 해석하고/거나 항체-리간드 복합체의 구조를 해석함으로써 달성된다. 특정 실시양태에서, 이는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 다양한 기술, 예컨대 X-선 결정학에 의해 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 다양한 분석 방법이 CDR 영역을 확인하거나 근사화하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법의 예는 카바트 정의, 코티아 정의, AbM 정의, 루 등에 기재된 정의 (상기 참조) 및 접촉 정의를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

"친화도 성숙" 항체는 그의 1개 이상의 CDR에서 1개 이상의 변경을 갖는 항체이며, 이는 이들 변경(들)을 보유하지 않는 모 항체와 비교하여 항원에 대한 항체의 친화도를 개선시킨다. 예시적인 친화도 성숙 항체는 표적 항원에 대해 나노몰 또는 심지어 피코몰의 친화도 (예를 들어, ~10^-9 M-10^-12 M 범위의 K_D)를 가질 것이다. 친화도 성숙 항체는 관련 기술분야에 공지된 절차에 의해 생산된다. 문헌 [Marks et al. (1992) Bio/Technology 10: 779-783]은 VH 및 VL 도메인 셔플링에 의한 친화도 성숙을 설명한다. CDR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이는 문헌 [Barbas, et al. (1994) Proc Nat. Acad. Sci. USA 91: 3809-3813; Schier et al. (1995) Gene 169: 147- 155; Yelton et al., (1995) J. Immunol. 155: 1994-2004; Jackson et al. (1995) J. Immunol. 154(7): 3310-9; 및 Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226: 889-896]에 기재되어 있고; 선택적 돌연변이 위치에서의 선택적 돌연변이, 접촉 위치 또는 활성 증진 아미노산 잔기를 갖는 과다돌연변이 위치는 미국 특허 번호 6,914,128에 기재되어 있다. 전형적으로, 모 항체 및 그의 친화도-성숙 자손 (예를 들어, 유도체)은 항원 내에 동일한 결합 영역을 보유하지만, 분자 수준에서의 특정 상호작용은 친화도 성숙에 의해 도입된 아미노산 잔기 변경(들)으로 인해 변경될 수 있다.

용어 "CDR-그라프트된 항체"는 한 종으로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하지만 VH 및/또는 VL의 CDR 영역 중 1개 이상의 서열이 또 다른 종의 CDR 서열로 대체된 항체, 예컨대 뮤린 CDR 중 1개 이상 (예를 들어, CDR3)이 인간 CDR 서열로 대체된 뮤린 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 항체를 지칭한다.

용어 "키메라 항체"는 한 종으로부터 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열 및 또 다른 종으로부터 불변 영역 서열을 포함하는 항체, 예컨대 인간 불변 영역에 연결된 뮤린 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 항체를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "프레임워크" 또는 "프레임워크 서열"은 CDR을 제외한 가변 영역의 나머지 서열을 지칭한다. CDR 서열의 정확한 정의는 상이한 시스템에 의해 결정될 수 있기 때문에, 프레임워크 서열의 의미는 상응하는 상이한 해석에 따른다. 6개의 CDR (경쇄의 CDR-L1, -L2 및 -L3 및 중쇄의 CDR-H1, -H2 및 -H3)은 또한 경쇄 및 중쇄 상의 프레임워크 영역을 각각의 쇄 상에서 4개의 하위-영역 (FR1, FR2, FR3 및 FR4)으로 분류하며, 여기서 CDR1은 FR1과 FR2 사이에, CDR2는 FR2와 FR3 사이에, CDR3은 FR3과 FR4 사이에 위치한다. 특정한 하위-영역을 FR1, FR2, FR3 또는 FR4로서 특정하지 않으면서, 다른 것으로 지칭되는 프레임워크 영역은 단일 자연 발생 이뮤노글로불린 쇄의 가변 영역 내의 조합된 FR을 나타낸다. 본원에 사용된 FR은 4개의 하위-영역 중 1개를 나타내고, FR은 프레임워크 영역을 구성하는 4개의 하위-영역 중 2개 이상을 나타낸다.

일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 임의로 1, 2 또는 3개의 아미노산 변화를 갖는 하기 아미노산 서열을 갖는 중쇄 프레임워크 영역 1 (H-FR1)을 포함한다: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG (서열식별번호: 174). 예를 들어, 위치 16에서의 Gly 잔기는 Arg (R)로 대체될 수 있고/거나; 위치 23에서의 Ala 잔기는 Thr (T)로 대체될 수 있다.

일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 임의로 1, 2 또는 3개의 아미노산 변화를 갖는 하기 아미노산 서열을 갖는 중쇄 프레임워크 영역 2 (H-FR2)를 포함한다: WVRQAPGKGLEWVS (서열식별번호: 175).

일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 임의로 1, 2 또는 3개의 아미노산 변화를 갖는 하기 아미노산 서열을 갖는 중쇄 프레임워크 영역 3 (H-FR3)을 포함한다: RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC (서열식별번호: 176). 예를 들어, 위치 12에서의 Ser 잔기는 Thr (T)로 대체될 수 있다.

일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 임의로 1, 2 또는 3개의 아미노산 변화를 갖는 하기 아미노산 서열을 갖는 중쇄 프레임워크 영역 4 (H-FR4)를 포함한다: WGQGTLVTVSS (서열식별번호: 177).

일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 임의로 1, 2 또는 3개의 아미노산 변화를 갖는 하기 아미노산 서열을 갖는 경쇄 프레임워크 영역 1 (L-FR1)을 포함한다: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열식별번호: 178).

일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 임의로 1, 2 또는 3개의 아미노산 변화를 갖는 하기 아미노산 서열을 갖는 경쇄 프레임워크 영역 2 (L-FR2)를 포함한다: WYQQKPGKAPKLLIY (서열식별번호: 179).

일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 임의로 1, 2 또는 3개의 아미노산 변화를 갖는 하기 아미노산 서열을 갖는 경쇄 프레임워크 영역 3 (L-FR3)을 포함한다: GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC (서열식별번호: 180).

일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 임의로 1, 2 또는 3개의 아미노산 변화를 갖는 하기 아미노산 서열을 갖는 경쇄 프레임워크 영역 4 (L-FR4)를 포함한다: FGGGTKVEIK (서열식별번호: 181).

일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 인간 IgM 불변 도메인, 인간 IgG 불변 도메인, 인간 IgG1 불변 도메인, 인간 IgG2 불변 도메인, 인간 IgG2A 불변 도메인, 인간 IgG2B 불변 도메인, 인간 IgG2 불변 도메인, 인간 IgG3 불변 도메인, 인간 IgG3 불변 도메인, 인간 IgG4 불변 도메인, 인간 IgA 불변 도메인, 인간 IgA1 불변 도메인, 인간 IgA2 불변 도메인, 인간 IgD 불변 도메인 또는 인간 IgE 불변 도메인의 중쇄 이뮤노글로불린 불변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 인간 IgG1 불변 도메인 또는 인간 IgG4 불변 도메인의 중쇄 이뮤노글로불린 불변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 인간 IgG4 불변 도메인의 중쇄 이뮤노글로불린 불변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 IgG1-유사 힌지를 생성하고 쇄간 디술피드 결합의 형성을 허용하는 Ser에서 Pro로의 백본 치환을 갖는 인간 IgG4 불변 도메인의 중쇄 이뮤노글로불린 불변 도메인을 포함한다.

일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 인간 Ig 람다 불변 도메인 또는 인간 Ig 카파 불변 도메인을 포함하는 경쇄 이뮤노글로불린 불변 도메인을 추가로 포함한다.

일부 실시양태에서, 항체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄인 4개의 폴리펩티드 쇄를 갖는 IgG이다.

일부 실시양태에서, 항체는 인간화 항체, 디아바디 또는 키메라 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간화 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 배선 아미노산 서열을 갖는 프레임워크를 포함한다.

일부 실시양태에서, 항원 결합 부분은 Fab 단편, F(ab')2 단편, scFab 단편 또는 scFv 단편이다.

본원에 사용된 용어 "배선 항체 유전자" 또는 "유전자 단편"은 특정한 이뮤노글로불린의 발현을 위한 유전자 재배열 및 돌연변이를 일으키는 성숙 과정을 겪지 않은 비-림프성 세포에 의해 코딩된 이뮤노글로불린 서열을 지칭한다 (예를 들어, 문헌 [Shapiro et al. (2002) Crit. Rev. Immunol. 22(3): 183-200; Marchalonis et al. (2001) Adv. Exp. Med. Biol. 484: 13-30] 참조). 본 개시내용의 다양한 실시양태에 의해 제공되는 이점 중 하나는 배선 항체 유전자가 성숙 항체 유전자보다 종 내의 개체에 특징적인 필수 아미노산 서열 구조를 보존할 가능성이 더 크며, 따라서 그 종에서 치료적으로 사용되는 경우에 외래 공급원로부터의 것으로 인식될 가능성이 더 적다는 인식에서 비롯된다.

본원에 사용된 용어 "중화"는 결합 단백질이 항원 (예를 들어, 표적 단백질)에 특이적으로 결합할 때 항원의 생물학적 활성을 상쇄시키는 것을 지칭한다. 한 실시양태에서, 중화 결합 단백질은 항원/표적, 예를 들어 시토카인, 키나제, 성장 인자, 세포 표면 단백질, 가용성 단백질, 포스파타제 또는 수용체 리간드에 결합하고, 그의 생물학적 활성을 적어도 약 20%, 40%, 60%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과만큼 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 성장 인자에 대한 중화 항체는 잠복 복합체로부터 방출된 성숙한 가용성 성장 인자에 특이적으로 결합함으로써, 그가 그의 수용체에 결합하여 하류 신호전달을 도출할 수 있는 것을 방지한다. 일부 실시양태에서, 성숙 성장 인자는 TGFβ1 또는 TGFβ3이다.

본원에 사용된 용어 "결합 단백질"은 항체 또는 그의 항원 결합 부분, DVD-IgTM, TVD-Ig, RAb-Ig, 이중특이적 항체 및 이중 특이적 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 항원에 특이적으로 결합하는 임의의 폴리펩티드 (예를 들어, TGFβ1)를 포함한다.

용어 "모노클로날 항체" 또는 "mAb"는 그를 포함하는 조성물과 관련하여 사용되는 경우에 실질적으로 동종인 항체 집단, 즉 집단을 구성하는 개별 항체가 미량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일한 집단으로부터 수득된 항체 제제를 지칭할 수 있다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이고, 단일 항원에 대하여 지시된다. 게다가, 전형적으로 상이한 결정기 (에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 달리, 각각의 mAb는 항원 상의 단일 결정기에 대해 지시된다. 수식어 "모노클로날"은 임의의 특정한 방법에 의한 항체 생산을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안된다.

본원에 사용된 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 인간 항체, 예컨대 숙주 세포 내로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체 (하기 섹션 II C에 추가로 기재됨), 재조합 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 (문헌 [Hoogenboom, H.R. (1997) TIB Tech. 15: 62-70; Azzazy, H. and Highsmith, W.E. (2002) Clin. Biochem. 35: 425-445; Gavilondo, J.V. and Larrick, J.W. (2002) BioTechniques 29: 128-145; Hoogenboom, H. and Chames, P. (2000) Immunol. Today 21: 371-378], 본원에 참조로 포함됨), 인간 이뮤노글로불린 유전자에 대해 트랜스제닉인 동물 (예를 들어, 마우스)로부터 단리된 항체 (문헌 [Taylor, L. D. et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20: 6287-6295; Kellermann, S-A. and Green, L.L. (2002) Cur. Opin. in Biotechnol. 13: 593-597; Little, M. et al. (2000) Immunol. Today 21: 364-370] 참조) 또는 인간 이뮤노글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열로 스플라이싱하는 것을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 재조합 인간 항체는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는다. 그러나, 특정 실시양태에서, 이러한 재조합 인간 항체는 시험관내 돌연변이유발 (또는 인간 Ig 서열에 대해 트랜스제닉인 동물이 사용되는 경우에, 생체내 체세포 돌연변이유발)에 적용될 수 있고, 따라서 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 인간 배선 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 그와 관련되지만, 생체내 인간 항체 배선 레퍼토리 내에 자연적으로 존재할 수 없는 서열이다.

본원에 사용된 "이중 가변 도메인 이뮤노글로불린" 또는 "DVD-IgTM" 등은 쌍형성된 중쇄 DVD 폴리펩티드 및 경쇄 DVD 폴리펩티드를 포함하며 각각의 쌍형성된 중쇄 및 경쇄가 2개의 항원 결합 부위를 제공하는 결합 단백질을 포함한다. 각각의 결합 부위는 항원 결합 부위당 항원 결합에 수반되는 총 6개의 CDR을 포함한다. DVD-IgTM은 전형적으로 적어도 부분적으로 CH3 도메인의 이량체화에 의해 서로 결합된 2개의 아암을 가지며, DVD의 각각의 아암은 이중특이적이므로, 4개의 결합 부위를 갖는 이뮤노글로불린을 제공한다. DVD-IgTM은 미국 특허 공개 번호 2010/0260668 및 2009/0304693에 제공되어 있으며, 이들 각각은 서열 목록을 포함하여 본원에 참조로 포함된다.

본원에 사용된 "삼중 가변 도메인 이뮤노글로불린" 또는 "TVD-Ig" 등은 쌍형성된 중쇄 TVD 결합 단백질 폴리펩티드 및 경쇄 TVD 결합 단백질 폴리펩티드를 포함하며 각각의 쌍형성된 중쇄 및 경쇄가 3개의 항원 결합 부위를 제공하는 결합 단백질이다. 각각의 결합 부위는 항원 결합 부위당 항원 결합에 수반되는 총 6개의 CDR을 포함한다. TVD 결합 단백질은 적어도 부분적으로 CH3 도메인의 이량체화에 의해 서로 결합된 2개의 아암을 가질 수 있으며, TVD 결합 단백질의 각각의 아암은 삼중특이적이므로, 6개의 결합 부위를 갖는 결합 단백질을 제공한다.

본원에 사용된 "수용체-항체 이뮤노글로불린" 또는 "RAb-Ig" 등은 함께 총 3개의 항원 결합 부위를 형성하는 중쇄 RAb 폴리펩티드 및 경쇄 RAb 폴리펩티드를 포함하는 결합 단백질이다. 1개의 항원 결합 부위는 각각의 중쇄 RAb 폴리펩티드 및 경쇄 RAb 폴리펩티드에 존재하는 중쇄 및 경쇄 항체 가변 도메인의 쌍형성에 의해 형성되어 제1 항원 결합 부위를 제공하는 총 6개의 CDR을 갖는 단일 결합 부위를 형성한다. 각각의 중쇄 RAb 폴리펩티드 및 경쇄 RAb 폴리펩티드는 독립적으로 제2 및 제3 "항원" 결합 부위를 제공하는 리간드에 결합하는 수용체 서열을 포함한다. RAb-Ig는 전형적으로 적어도 부분적으로 CH3 도메인의 이량체화에 의해 서로 결합된 2개의 아암을 가지며, RAb-Ig의 각각의 아암은 삼중특이적이므로, 6개의 결합 부위를 갖는 이뮤노글로불린을 제공한다. RAb-Ig는 미국 특허 출원 공개 번호 2002/0127231에 기재되어 있으며, 이의 전체 내용은 서열 목록을 포함하여 본원에 참조로 포함된다.

본원에 사용되고 "이중특이적 절반-Ig 결합 단백질" 또는 "이중특이적 (절반-Ig) 결합 단백질"과 구별되는 용어 "이중특이적 항체"는, 쿼드로마 기술 (문헌 [Milstein, C. and Cuello, A.C. (1983) Nature 305(5934): p. 537-540] 참조)에 의해, 2종의 상이한 모노클로날 항체의 화학적 접합 (문헌 [Staerz, U.D. et al. (1985) Nature 314(6012): 628-631] 참조)에 의해, 또는 CH3-CH3 이량체화를 억제하지 않는 돌연변이를 Fc 영역 내에 도입하는 노브-인투-홀 또는 유사한 접근법 (문헌 [Holliger, P. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90(14): 6444-6448] 참조)에 의해 생성되는 (단지 1종만이 기능적 이중특이적 항체인 다수의 상이한 이뮤노글로불린 종이 생성됨) 전장 항체를 지칭한다. 분자 기능에 의해, 이중특이적 항체는 그의 2개의 결합 아암 (한 쌍의 HC/LC) 중 1개 상의 1종의 항원 (또는 에피토프)에 결합하고, 그의 제2 아암 (상이한 쌍의 HC/LC) 상의 상이한 항원 (또는 에피토프)에 결합한다. 이러한 정의에 의해, 이중특이적 항체는 (특이성 및 CDR 서열 둘 다에 있어서) 2개의 구분되는 항원 결합 아암을 갖고, 그가 결합하는 각각의 항원에 대해 1가이다.

본원에 사용되고 이중특이적 절반-Ig 결합 단백질 또는 이중특이적 결합 단백질과 구별되는 용어 "이중-특이적 항체"는 그의 2개의 결합 아암 (한 쌍의 HC/LC) 각각에서 2종의 상이한 항원 (또는 에피토프)에 결합할 수 있는 전장 항체를 지칭한다 (PCT 공개 번호 WO 02/02773 참조). 따라서, 이중-특이적 결합 단백질은 동일한 특이성 및 동일한 CDR 서열을 갖는 2개의 동일한 항원 결합 아암을 갖고, 그가 결합하는 각 항원에 대해 2가이다.

본원에 사용된 용어 "Kon"은, 예를 들어 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 항체/항원 복합체를 형성하기 위한 항원에 대한 결합 단백질 (예를 들어, 항체)의 회합에 대한 온 레이트 상수를 지칭하는 것으로 의도된다. "Kon"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되는 용어 "회합률 상수" 또는 "ka"로도 공지되어 있다. 항체의 그의 표적 항원에 대한 결합률 또는 항체와 항원 사이의 복합체 형성 속도를 나타내는 이 값은 또한 하기 방정식에 의해 제시된다: 항체 ("Ab") + 항원 ("Ag")→Ab-Ag.

본원에 사용된 용어 "Koff"는, 예를 들어 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 항체/항원 복합체로부터의 결합 단백질 (예를 들어, 항체)의 해리에 대한 오프 레이트 상수를 지칭하는 것으로 의도된다. "Koff"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되는 용어 "해리율 상수" 또는 "kd"로도 공지되어 있다. 이 값은 하기 방정식에 의해 제시된 바와 같이, 항체의 그의 표적 항원으로부터의 해리율, 또는 시간 경과에 따른 Ab-Ag 복합체의 유리 항체 및 항원으로의 분리를 나타낸다: Ab + Ag←Ab-Ag.

본원에서 상호교환가능하게 사용된 용어 "평형 해리 상수" 또는 "K_D"는 평형상태에서 적정 측정시, 또는 해리율 상수 (koff)를 회합률 상수 (kon)로 나눔으로써 수득된 값을 지칭한다. 회합률 상수, 해리율 상수 및 평형 해리 상수는 항원에 대한 결합 단백질, 예를 들어 항체의 결합 친화도를 나타내는데 사용된다. 회합 및 해리율 상수를 결정하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 형광-기반 기술을 사용하는 것은 평형상태의 생리학적 완충제 중에서 샘플을 조사하기 위한 높은 감수성 및 능력을 제공한다. 다른 실험 접근법 및 기기, 예컨대 비아코어® (생체분자 상호작용 분석) 검정이 사용될 수 있다 (예를 들어, 비아코어 인터내셔널 아베(BIAcore International AB), 지이 헬스케어 캄파니(GE Healthcare company) (스웨덴 웁살라)로부터 입수가능한 기기). 추가적으로, 사피다인 인스트루먼츠(Sapidyne Instruments) (아이다호주 보이스)로부터 입수가능한 키넥사(KinExA)® (동역학적 배제 검정) 검정이 또한 사용될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "결정" 및 "결정화된"은 결정의 형태로 존재하는 결합 단백질 (예를 들어, 항체) 또는 그의 항원 결합 부분을 지칭한다. 결정은 물질의 고체 상태의 한 형태이며, 다른 형태, 예컨대 무정형 고체 상태 또는 액정질 상태와 구분된다. 결정은 원자, 이온, 분자 (예를 들어, 단백질, 예컨대 항체), 또는 분자 조립체 (예를 들어, 항원/항체 복합체)의 규칙적인, 반복, 3차원 어레이로 구성된다. 이들 3차원 어레이는 그 분야에서 널리 이해되는 특정 수학적 관계에 따라 배열된다. 결정에서 반복되는 기본 단위 또는 빌딩 블록은 비대칭 단위로 불린다. 주어진, 널리 정의된 결정학적 대칭에 따른 배열에서의 비대칭 단위의 반복은 결정의 "단위 셀"을 제공한다. 모든 3차원에서의 규칙적 번역에 의한 단위 셀의 반복은 결정을 제공한다. 문헌 [Giege, R. and Ducruix, A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2nd ea., pp. 201-16, Oxford University Press, New York, New York, (1999)]을 참조한다. 용어 "링커"는 펩티드 결합에 의해 연결된 2개 이상의 아미노산 잔기를 포함하며 1개 이상의 항원 결합 부분을 연결하는데 사용되는 폴리펩티드를 나타내는는 것으로 사용된다. 이러한 링커 폴리펩티드는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Holliger, P. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R.J. et al. (1994) Structure 2:1121-1123)] 참조). 예시적인 링커는 ASTKGPSVFPLAP (서열식별번호: 55), ASTKGP (서열식별번호: 56); TVAAPSVFIFPP (서열식별번호: 57); TVAAP (서열식별번호: 58); AKTTPKLEEGEFSEAR (서열식별번호: 59); AKTTPKLEEGEFSEARV (서열식별번호: 60); AKTTPKLGG (서열식별번호: 61); SAKTTPKLGG (서열식별번호: 62); SAKTTP (서열식별번호: 63); RADAAP (서열식별번호: 64); RADAAPTVS (서열식별번호: 65); RADAAAAGGPGS (서열식별번호: 66); RADAAAA(G4S)4 (서열식별번호: 67); SAKTTPKLEEGEFSEARV (서열식별번호: 68); ADAAP (서열식별번호: 69); ADAAPTVSIFPP (서열식별번호: 70); QPKAAP (서열식별번호: 71); QPKAAPSVTLFPP (서열식별번호: 72); AKTTPP (서열식별번호: 73); AKTTPPSVTPLAP (서열식별번호: 74); AKTTAP (서열식별번호: 75); AKTTAPSVYPLAP (서열식별번호: 76); GGGGSGGGGSGGGGS (서열식별번호: 77); GENKVEYAPALMALS (서열식별번호: 78); GPAKELTPLKEAKVS (서열식별번호: 79); GHEAAAVMQVQYPAS (서열식별번호: 80); TVAAPSVFIFPPTVAAPSVFIFPP (서열식별번호: 81); 및 ASTKGPSVFPLAPASTKGPSVFPLAP (서열식별번호: 82)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

"표지" 및 "검출가능한 표지" 또는 "검출가능한 모이어티"는, 예를 들어 특정 결합 쌍의 구성원들, 예컨대 항체와 분석물 사이의 반응을 검출가능하게 하기 위한, 특정 결합 파트너, 예컨대 항체 또는 분석물에 부착된 모이어티를 의미하고, 그와 같이 표지된 특정 결합 파트너, 예를 들어 항체 또는 분석물은 "검출가능하게 표지된"으로 지칭된다. 따라서, 본원에 사용된 용어 "표지된 결합 단백질"은 결합 단백질의 확인을 제공하는 혼입된 표지를 갖는 단백질을 지칭한다. 한 실시양태에서, 표지는 시각적 또는 기구 수단, 예를 들어 방사성표지된 아미노산의 혼입 또는 마킹된 아비딘에 의해 검출될 수 있는 비오티닐 모이어티의 폴리펩티드에 대한 부착 (예를 들어, 광학 또는 비색 방법에 의해 검출될 수 있는 형광 마커 또는 효소 활성을 함유하는 스트렙타비딘)에 의해 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 검출가능한 마커이다. 폴리펩티드에 대한 표지의 예는 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 방사성동위원소 또는 방사성핵종 (예를 들어, ¹⁸F, ¹¹C, ¹³N, ¹⁵O, ⁶⁸Ga, ¹⁸F, ⁸⁹Zr, ³H, ¹⁴C, ³⁵S, ⁹⁰Y, ⁹⁹Tc, ¹¹¹In, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁷⁷Lu, ¹⁶⁶Ho 및 ¹⁵³Sm); 발색원; 형광 표지 (예를 들어, FITC, 로다민 및 란타나이드 인광체); 효소 표지 (예를 들어, 양고추냉이 퍼옥시다제, 루시페라제 및 알칼리성 포스파타제); 화학발광 마커; 비오티닐 기; 2차 리포터에 의해 인식되는 미리 결정된 폴리펩티드 에피토프 (예를 들어, 류신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인 및 에피토프 태그); 및 자성 작용제, 예컨대 가돌리늄 킬레이트. 면역검정에 통상적으로 사용되는 표지의 대표적인 예는 광을 생성하는 모이어티, 예를 들어 아크리디늄 화합물, 및 형광을 생성하는 모이어티, 예를 들어 플루오레세인을 포함한다. 다른 표지가 본원에 기재된다. 이와 관련하여, 모이어티는 그 자체가 검출가능하게 표지되지 않을 수 있지만, 또 다른 모이어티와의 반응시에 검출가능해질 수 있다. "검출가능하게 표지된"의 사용은 검출가능한 표지의 후자 유형을 포괄하는 것으로 의도된다.

일부 실시양태에서, 항원 (예를 들어, 단백질 복합체), 예컨대 제시 분자-프로TGFβ1 복합체에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 부분의 결합 친화도는 옥테트 검정을 사용하여 결정된다. 일부 실시양태에서, 옥테트 검정은 항체와 항원 사이의 결합을 나타내는 1종 이상의 동역학적 파라미터를 결정하는 검정이다. 일부 실시양태에서, 옥테트® 시스템 (포르테바이오, 캘리포니아주 멘로 파크)을 사용하여 제시 분자-프로TGFβ1 복합체에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 부분의 결합 친화도를 결정한다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도는 생물층 간섭측정법을 이용하는 포르테바이오 옥테트 QKe 딥 앤드 리드 무표지 검정 시스템을 사용하여 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원은 바이오센서 (예를 들어, 스트렙타비딘-코팅된 바이오센서)에 고정화되고, 항체 및 복합체 (예를 들어, 비오티닐화 제시 분자-프로TGFβ1 복합체)는 결합 상호작용을 측정하기 위해 고농도 (50 μg/mL)로 용액 중에 제시된다. 일부 실시양태에서, 제시 분자-프로TGFβ1 복합체에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 부분의 결합 친화도는 본원에 약술된 프로토콜을 사용하여 결정된다.

프로TGFβ1의 신규, 고친화도, 콘텍스트-비의존성 항체의 특징화

결합 프로파일

본원에 개시된 항체는 증진된 결합 활성을 갖는다. TGFβ1 활성화를 선택적으로 억제할 수 있는 고친화도, 콘텍스트-비의존성 항체의 부류가 포함된다. 용어 "콘텍스트 비의존성"은 이전의 보다 일반적인 용법과 비교하여 더 큰 엄격도로 본원에 사용된다는 것을 주목한다. 본 개시내용에 따르면, 상기 용어는 항체가 상이한 항원 복합체에 대해 발휘할 수 있는 상대 친화도 (즉, 비편향)에 소정 수준의 균일성을 부여한다. 따라서, 본 발명의 콘텍스트-비의존성 항체는 다수의 유형의 TGFβ1 전구체 복합체 (예를 들어, 제시 분자-프로TGFβ1 복합체)를 표적화할 수 있고, 예를 들어 MSD-SET에 의해 측정시, 10 nM 미만, 바람직하게는 5 nM 미만, 보다 바람직하게는 1 nM 미만, 보다 더 바람직하게는 100 pM 미만의 K_D 값으로 등가의 친화도 (즉, 복합체에 걸쳐 상대 친화도의 3배 이하의 차이)로 각각의 이러한 복합체에 결합할 수 있다. 하기 제시된 바와 같이, 본 발명에 포괄되는 많은 항체는 나노몰 미만 범위의 K_D 값을 갖는다.

따라서, 항체는 각각의 인간 제시 분자-프로TGFβ1 복합체 (때때로 단일 제시 분자에 커플링된 프로TGFβ1 이량체로 구성된 3원 복합체인 "대형 잠복성 복합체"로 지칭됨), 즉 LTBP1-프로TGFβ1, LTBP3-프로TGFβ1, GARP-프로TGFβ1 및 LRRC33-프로TGFβ1에 특이적으로 결합할 수 있다. 전형적으로, 재조합적으로 생산된, 정제된 단백질 복합체는 적합한 시험관내 결합 검정에서 항원 복합체에 결합하는 항체의 능력을 평가 또는 확인하기 위해 항원 (예를 들어, 항원 복합체)으로서 사용된다. 이러한 검정은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 생물층 간섭측정법 (BLI)-기반 검정 (예컨대 옥테트®) 및 용액 평형 적정-기반 검정 (예컨대 MSD-SET)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

BLI-기반 결합 검정은 항원에 대한 항체의 친화도 및 동역학을 측정하기 위해 관련 기술분야에서 널리 사용된다. 이는 생체분자 상호작용을 광학적 간섭에 기초하여 분석하는 무표지 기술이다. 단백질 중 하나, 예를 들어 시험되는 항체는 바이오센서 팁 상에 고정화될 수 있다. 용액 중 다른 단백질, 예를 들어 항원이 고정화된 항체에 결합하게 되는 경우에, 이는 간섭 패턴의 이동을 유발하며, 이는 실시간으로 측정될 수 있다. 이는 결합 특이성, 회합률 및 해리율, 뿐만 아니라 농도 의존성의 모니터링을 가능하게 한다. 따라서, BLI는 시스템의 역학을 나타내는 동역학적 척도이다. 사용 용이성 및 신속한 결과로 인해, BLI-기반 검정, 예컨대 옥테트® 시스템 (캘리포니아주 프레몬트 소재 포르테바이오/몰레큘라 디바이시즈(Molecular Devices)로부터 입수가능함)은 스크리닝 과정에서 "비-결합제" 또는 "약한 결합제"의 풀로부터 "결합제"의 풀을 확인 및 분리하기 위한 초기 스크리닝 방법으로서 사용되는 경우에 특히 편리하다.

BLI-기반 결합 검정은 결합 친화도가 옥테트®에 의해 측정될 때 신규 항체가 "콘텍스트-균형/콘텍스트-비의존성" 항체로서 특징화된다는 것을 밝혀냈다. 항체의 비제한적 예의 BLI-기반 결합 프로파일을 요약한 표 8에서 알 수 있는 바와 같이, 이들 항체는 4종의 표적 복합체에 걸쳐 나노몰 미만 범위의 비교적 균일한 KD 값을 나타내며, 비교적 낮은 매트릭스-대-세포 차이 (5배 이하의 편향)가 존재한다 (칼럼 (H) 참조). 이는 세포-연관 복합체에 비해 매트릭스-연관 복합체에 대한 유의하게 더 높은 상대 친화도 (27+ 배수 편향)를 나타내는 참조 항체로서 제공된 이전에 확인된 항체 Ab3과 대조될 수 있다.

하기 표 8은 본 발명에 의해 포괄되는 고친화도, 콘텍스트-비의존성 프로TGFβ1 항체의 비제한적 예를 제공한다. 표는 옥테트®에 의해 측정된 시험관내 결합 검정으로부터의 대표적인 결과를 제공한다. 유사한 결과가 또한 SPR-기반 기술 (비아코어 시스템)에 의해 수득된다.

표의 칼럼 (A)는 별개의 아미노산 서열을 갖는 모노클로날 항체를 열거한다. Ab3 (볼드체로 제시됨)은 이전에 확인된 참조 항체이며, 이는 세포-기반 검정에서 강력하고; 다양한 동물 모델에서 효과적이며; 청정한 독성학 프로파일을 갖는 것으로 밝혀졌다 (PCT/US2018/012601에 개시됨). 칼럼 (B), (D), (E) 및 (F)는 K_D로 측정된, 각각의 열거된 항체의 친화도를 제공한다. 칼럼 (B)는 재조합 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 대한 친화도를 나타내고; 칼럼 (C)는 재조합 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 대한 친화도를 나타내고; (E)는 재조합 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체에 대한 친화도를 나타내고; (F)는 각각의 항체의 재조합 인간 LRRC33-프로TGFβ1 복합체에 대한 친화도를 나타낸다. (B) 및 (C)의 평균 K_D 값은 상응하는 칼럼 (D)에 제시되며, 이는 ECM- 또는 매트릭스-연관 프로TGFβ1 복합체에 대한 항체의 친화도를 집합적으로 나타낸다. 유사하게, (E) 및 (F)의 평균 K_D 값이 상응하는 칼럼 (G)에 제시되며, 이는 세포-표면 또는 세포-연관 프로TGFβ1 복합체에 대한 항체의 친화도를 집합적으로 나타낸다. 마지막으로, 칼럼 (D) 및 (G)로부터의 평균 K_D 값들 사이의 상대 비는 칼럼 (H)에서 "배수 편향"으로 표현된다. 따라서, 매트릭스-연관 복합체 및 세포-표면 복합체에 대한 항체의 결합 선호도를 비교할 때, 칼럼 (H)의 수가 클수록 특정한 항체에 대해 보다 큰 편향이 존재한다. 이는 항체의 그의 표적 복합체에 대한 고유한 편향을 정량적으로 나타내고 비교하는 하나의 방식이다. 이러한 분석은 특정한 치료 용도를 위한 후보 항체에 대한 선택 과정을 안내하는데 유용할 수 있다.

표 8. 콘텍스트-비의존성 TGFβ1 항체 및 BLI에 의해 측정된 K_D 값의 비제한적 예

본 발명은 각각의 4종의 공지된 제시 분자-프로TGFβ1 복합체, 즉 LTBP1-프로TGFβ1, LTBP3-프로TGFβ1, GARP-프로TGFβ1 및 LRRC33-프로TGFβ1에 대해 등가의 친화도로 각각 결합할 수 있는 고친화도, 콘텍스트-비의존성 항체의 부류를 제공한다. 일부 실시양태에서, 항체는 이전에 기재된 참조 항체인 Ab3과 비교하여 등가이거나 더 높은 친화도로 각각의 제시 분자-프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 본 발명에 따르면, 이러한 항체는 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 및 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정시 ≤ 5 nM의 친화도 (K_D에 의해 결정됨)로 각각의 상기 언급된 복합체에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 단편은 ≤ 5 nM, ≤ 4 nM, ≤ 3 nM, ≤ 2 nM, ≤ 1 nM, ≤ 5 nM 또는 ≤ 0.5 nM의 친화도로 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 단편은 ≤ 5 nM, ≤ 4 nM, ≤ 3 nM, ≤ 2 nM, ≤ 1 nM, ≤ 5 nM 또는 ≤ 0.5 nM의 친화도로 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 단편은 ≤ 5 nM, ≤ 4 nM, ≤ 3 nM, ≤ 2 nM, ≤ 1 nM, ≤ 5 nM 또는 ≤ 0.5 nM의 친화도로 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 단편은 ≤ 5 nM, ≤ 4 nM, ≤ 3 nM, ≤ 2 nM, ≤ 1 nM 또는 ≤ 0.5 nM의 친화도로 인간 LRRC33-프로TGFβ1 복합체에 결합한다.

바람직한 실시양태에서, 이러한 항체는 인간- 및 뮤린-교차-반응성이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 항체 또는 단편은 ≤ 5 nM, ≤ 4 nM, ≤ 3 nM, ≤ 2 nM, ≤ 1 nM, ≤ 5 nM 또는 ≤ 0.5 nM의 친화도로 뮤린 LTBP1-프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 단편은 ≤ 5 nM, ≤ 4 nM, ≤ 3 nM, ≤ 2 nM, ≤ 1 nM 또는 ≤ 0.5 nM의 친화도로 뮤린 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 단편은 ≤ 5 nM, ≤ 4 nM, ≤ 3 nM, ≤ 2 nM, ≤ 1 nM 또는 ≤ 0.5 nM의 친화도로 뮤린 GARP-프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 단편은 ≤ 5 nM, ≤ 4 nM, ≤ 3 nM, ≤ 2 nM, ≤ 1 nM 또는 ≤ 0.5 nM의 친화도로 뮤린 LRRC33-프로TGFβ1 복합체에 결합한다.

제시된 바와 같이, 본 개시내용의 프로TGFβ1 항체는 매트릭스-연관 프로TGFβ1 복합체에 대해 특히 높은 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 매트릭스-연관 복합체 (즉, LTBP1-프로TGFβ1 및 LTBP3-프로TGFβ1)의 평균 K_D 값은 ≤ 1 nM 또는 ≤ 0.5 nM이다.

제시된 바와 같이, 본 개시내용의 프로TGFβ1 항체는 세포-연관 프로TGFβ1 복합체에 대해 높은 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 세포-연관 복합체 (즉, GARP-프로TGFβ1 및 LRRC33-프로TGFβ1)의 평균 K_D 값은 ≤ 2 nM 또는 ≤ 1 nM이다.

본 개시내용의 고친화도 프로TGFβ1 항체는 모든 4종의 항원 복합체에 대한 그의 균일한 (비편향된) 친화도를 특징으로 한다 (예를 들어, Ab3과 비교). 본원에 기재된 4종의 공지된 제시 분자-프로TGFβ1 복합체 중에서 어떠한 단일 항원 복합체도 K_D에서 유의하게 벗어나지 않는다. 다시 말해서, 각각의 이러한 항체가 4종의 항원 복합체에 걸쳐 등가의 친화도를 나타낸다는 점에서 이전에 기재된 프로TGFβ1 항체 (Ab3 포함)에 비해 본 개시내용에 의해 더 균일한 결합 활성이 달성되었다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 단편은 4종의 프로TGFβ1 항원 복합체에 걸친 항체 또는 단편의 친화도의 차이 (또는 범위)가 최저 및 최고 K_D 값 사이에 5배 이하인 것을 특징으로 하는, 비편향된 또는 균일한 결합 프로파일을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 친화도의 상대 차이 (또는 범위)는 3배 이하이다.

"균일성" 또는 편향 결여의 개념은 표 8에 추가로 예시된다. 2개의 매트릭스-연관 및 세포-연관 복합체 사이의 평균 K_D 값은 각각 계산된다 (칼럼 (D) 및 (G) 참조). 이어서, 이들 평균 K_D 값은 매트릭스와 연관된 복합체 대 세포 표면 (예를 들어, 면역 세포)과 연관된 복합체 사이에 결합 활성에서의 편향이 존재하는지 여부를 묻는데 사용될 수 있다. 편향은 표 8에 예시된 바와 같이 평균 K_D 값에서 "배수-차이"로 표현될 수 있다. 이전에 기재된 항체 Ab3과 비교하여, 본 개시내용에 의해 포괄되는 고친화도, 콘텍스트-비의존성 프로TGFβ1 항체는 다수가 매트릭스- 및 세포-연관 복합체 사이에 평균 K_D 값의 3배 이하의 차이를 나타낸다는 점에서 현저하게 비편향된다 (Ab3에서의 25+ 배수 편향과 비교하여).

따라서, 콘텍스트-비의존성 모노클로날 항체 또는 단편의 부류가 제공되며, 이들 각각은 생물층 간섭측정법 또는 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정시 ≤ 1 nM의 친화도로 각각의 하기 제시 분자-프로TGFβ1 복합체에 등가의 친화도로 결합할 수 있다: LTBP1-프로TGFβ1, LTBP3-프로TGFβ1, GARP-프로TGFβ1 및 LRRC33-프로TGFβ1. 이러한 항체는 생물층 간섭측정법 또는 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정시 ≤ 5 nM의 친화도로 각각의 상기 언급된 복합체에 특이적으로 결합하며, 여기서 모노클로날 항체 또는 단편은 다른 복합체에 비해 상기 복합체 중 어느 하나에 대해 친화도에 있어서 3배 이하의 편향을 나타내고, 여기서 모노클로날 항체 또는 단편은 각각의 프로TGFβ1 복합체로부터의 성숙 TGFβ1 성장 인자의 방출을 억제하지만, 프로TGFβ2 또는 프로TGFβ3 복합체로부터의 것은 그렇지 않다.

BLI-기반 검정으로부터 수득가능한 결합 프로파일의 동역학 (예를 들어, "온" 및 "오프" 레이트)은 유용한 정보를 제공하지만, 본 개시내용의 출원인은 본원에 개시된 활성화 억제제, 즉 테더링된 (예를 들어, 조직-국재화된) 불활성 (예를 들어, 잠복) 표적에 결합하여 이를 활성화시키지 못하게 함으로써 작용하는 항체의 작용 메카니즘에 기초하여, 평형상태에서 측정된 결합 특성이 그의 생체내 거동 및 효력을 보다 정확하게 반영할 수 있다는 것을 고려한다. 이를 고려하면, 예로서, BLI에 의해 수득된 결합 측정값에서 반영될 빠른 "온" 레이트 ("K_on)를 갖는 항체는 중화 항체 (예를 들어, 활성 가용성 성장 인자 자체를 직접 표적화하고 신속하게 격리시켜 이들이 효과적인 억제제로서 기능하도록 해야만 하는 항체)를 평가하기 위한 관련 파라미터를 제공할 수 있다. 그러나, 이는 본원에 개시된 것과 같은 활성화 억제제로서 기능하는 항체에 반드시 적용되지는 않을 수 있다. 기재된 바와 같이, 본 발명의 신규 TGFβ1 억제제의 작용 메카니즘은, 가용성의 활성화 후 성장 인자의 격리와 대조적으로, 조직/세포-테더링된 잠복 복합체를 표적화함으로써 달성되는 활성화 단계의 억제제를 통한 것이다. 이는 TGFβ1의 활성화 억제제가 각각의 조직에 국재화된 (예를 들어, ECM, 면역 세포 표면 등 내의) 불활성 전구체를 표적화함으로써 성숙 성장 인자가 복합체로부터 방출되는 것을 선제적으로 방지하기 때문이다. 이러한 작용 메카니즘은, 통상적인 중화 억제제에 의해 요구되는 바와 같이 내인성 수용체에 대해 일시적 성장 인자 분자와 신속하게 경쟁할 필요 없이, 억제제가 생체내에서 표적 포화 (예를 들어, 평형)를 달성할 수 있게 하는 것으로 생각된다.

작용 메카니즘에서의 이러한 차이를 고려하여, 평형상태에서 친화도의 결정을 가능하게 하는 시험관내 결합 검정의 또 다른 방식을 사용하여 결합 특성의 추가의 평가를 수행하였다.

이를 고려하여, 평형상태에서 이러한 항체의 결합 친화도를 측정하는 검정은 생체내에서 표적 결속의 방식을 보다 정확하게 나타낼 수 있는 것으로 고려된다. 따라서, MSD-SET-기반 결합 검정 (또는 다른 적합한 검정)은 하기 표 9에 예시된 바와 같이 수행될 수 있다.

용액 평형 적정 ("SET")은 2종의 분자 (예컨대 항원 및 항원에 결합하는 항체) 사이의 결합이 용액 중 평형상태에서 측정될 수 있는 검정이다. 예를 들어, 메소-스케일 디스커버리 ("MSD")-기반 SET 또는 MSD-SET는 평형상태에서 특히 고친화도 단백질-단백질 상호작용에 대한 해리 상수를 결정하는 유용한 방식이다 (예를 들어, 문헌 [Ducata et al. (2015) J Biomolecular Screening 20(10): 1256-1267] 참조). SET-기반 검정은 나노몰 미만 (예를 들어, 피코몰) 친화도를 갖는 항체의 KD 값을 결정하는데 특히 유용하다.

표 9. MSD-SET에 의해 측정된 고친화도 콘텍스트-비의존성 TGFβ1 항체 (hIgG4) 및 K_D 값의 비제한적 예 ("h"는 인간 복합체를 나타냄)

표 9는 또한 참조 항체로서 3종의 이전에 기재된 TGFβ1-선택적 항체(C1, C2 및 Ab3)를 포함한다. C1 및 C2는 WO 2017/156500으로서 공개된 PCT/US2017/021972에 처음 개시되었고, Ab3은 WO 2018/129329로서 공개된 PCT/US2018/012601에 기재되었다.

표 9에 제공된 친화도 데이터로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 개시내용에 따른 신규 항체의 결합 활성은 이전에 확인된 참조 항체보다 유의하게 더 높다. 더욱이, 신규 TGFβ1 항체는 이들이 등가의 친화도 (예를 들어, ~ 나노몰 미만 범위, 예를 들어 < 1 nM의 KD)로 각각의 인간 LLC 복합체에 결합한다는 점에서 "콘텍스트-비의존성"이다. 고친화도, 콘텍스트-비의존성 결합 프로파일은 이들 항체가 ECM-관련 및 면역 성분 둘 다의 조절이상을 수반하는 TGFβ1-관련 적응증, 예컨대 암의 치료에 사용하기에 유리할 수 있다는 것을 시사한다.

용액 평형 적정-기반 결합 검정을 위해, 상기 제시된 것과 같은 제시 분자 중 하나를 포함하는 단백질 복합체가 항원 (제시 분자-TGFβ1 복합체 또는 LLC)으로서 사용될 수 있다. 시험 항체를 용액 중에서 항원-항체 복합체를 형성하도록 한다. 항원-항체 반응 혼합물을 인큐베이션하여 평형에 도달되도록 하고; 검정 반응에 존재하는 항원-항체 복합체의 양을 관련 기술분야에 널리 공지된 적합한 수단에 의해 측정할 수 있다. BLI-기반 검정과 비교하여, SET-기반 검정은 항원-항체 복합체의 온/오프 레이트에 의해 덜 영향을 받으며, 이는 매우 높은 친화도 상호작용의 민감한 검출을 가능하게 한다. 표 9에 제시된 바와 같이, 본 개시내용에서, TGFβ1의 바람직한 고친화도 억제제는 SET-기반 검정에 의해 결정시, 시험된 모든 대형 잠복 복합체에 걸쳐 나노몰 미만 (예를 들어, 피코몰) 범위의 친화도를 나타낸다.

따라서, 용액 평형 적정 검정, 예컨대 MSD-SET에 의해 측정시 ≤ 1 nM의 K_D로 각각의 하기 인간 제시 분자-프로TGFβ1 복합체: hLTBP1-프로TGFβ1, hLTBP3-프로TGFβ1, hGARP-프로TGFβ1 및 hLRRC33-프로TGFβ1에 등가의 친화도로 각각 결합할 수 있는 콘텍스트-비의존성 모노클로날 항체 또는 단편의 부류가 제공된다. 각 이러한 항체는 MSD-SET에 의해 측정시 ≤ 1 nM의 K_D로 각각의 상기 언급된 복합체에 특이적으로 결합하며, 여기서 모노클로날 항체 또는 단편은 각각의 프로TGFβ1 복합체로부터의 성숙 TGFβ1 성장 인자의 방출을 억제하지만, 프로TGFβ2 또는 프로TGFβ3 복합체로부터의 것은 그렇지 않다. 바람직한 실시양태에서, 이러한 항체 또는 단편은 각각의 상기 언급된 복합체에 500 pM 이하 (즉, ≤ 500 pM), 250 pM 이하 (즉, ≤ 250 pM) 또는 200 pM 이하 (즉, ≤ 200 pM)의 K_D로 결합한다. 보다 더 바람직하게는, 이러한 항체 또는 단편은 각각의 상기 언급된 복합체에 100 pM 이하 (즉, ≤ 100 pM)의 K_D로 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 단편은 프로도메인 복합체와 회합되지 않은 유리 TGFβ1 성장 인자에는 결합하지 않는다. 이는 관련 기술분야에 공지된 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법에 의해 시험되거나 확인될 수 있다.

추가의 바람직한 실시양태에서, 이러한 항체 또는 단편은 또한 뮤린 (예를 들어, 래트 및/또는 마우스) 및/또는 비-인간 영장류 (예를 들어, 시노) 대응물과 교차-반응성이다. 하나의 예를 들자면, Ab6은 하기 표 10 및 실시예 9에 예시된 바와 같이, 인간, 뮤린, 래트 및 시노몰구스 원숭이를 포함한 다중 종의 각각의 대형 잠복 복합체에 고친화도로 결합할 수 있다:

표 10. MSD-SET에 의해 측정된 바와 같은 교차-종 반응성을 갖는 고친화도 콘텍스트-비의존성 TGFβ1 항체의 비제한적 예 ("h"는 인간을 나타내고; "m"은 뮤린을 나타냄)

효력

본원에 개시된 항체는 TGFβ1 신호전달을 억제하는 그의 능력에 대해 "기능적 항체"로서 광범위하게 특징화될 수 있다. 본원에 사용된 "기능적 항체"는 그의 기능을 조정하는 방식으로 표적 단백질 (예를 들어, 항원)에 결합하는 그의 능력에 의해 1종 이상의 생물학적 활성을 부여한다. 따라서, 기능적 항체는 표적 분자 (즉, 항원)의 활성/기능을 조정할 수 있는 항체를 광범위하게 포함한다. 이러한 조정 항체는 억제 항체 (또는 억제성 항체) 및 활성화 항체를 포함한다. 본 개시내용은 TGFβ1의 다중 콘텍스트와 연관된 TGFβ1 신호전달에 의해 매개되는 생물학적 과정을 억제할 수 있는 항체에 관한 것이다. 본 발명을 수행하는데 사용되는 억제제, 예컨대 본원에 기재된 항체는 치료 유효 용량 (허용되는 독성 수준 내에서 충분한 효능이 달성되는 용량)으로 투여되는 경우에 TGFβ1-선택적이고 TGFβ2 및 TGFβ3을 표적화하거나 방해하지 않는 것으로 의도된다. 본 개시내용의 신규 항체는 TGFβ1의 이전에 확인된 활성화 억제제와 비교하여 증진된 억제 활성 (효력)을 갖는다.

일부 실시양태에서, 억제 항체의 효력은 적합한 세포-기반 검정, 예컨대 본원에 기재된 CAGA 리포터 세포 검정에서 측정될 수 있다. 일반적으로, 배양된 세포, 예컨대 이종 세포 및 1차 세포가 세포-기반 효력 검정을 수행하는데 사용될 수 있다. 내인성 TGFβ1 및/또는 관심 제시 분자, 예컨대 LTBP1, LTBP3, GARP 및 LRRC33을 발현하는 세포가 사용될 수 있다. 대안적으로, 관심 단백질(들), 예컨대 TGFβ1 및/또는 관심 제시 분자, 예컨대 LTBP1, LTBP3, GARP 및 LRRC33을 코딩하는 외인성 핵산은 발현을 위해, 예를 들어 형질감염 (예를 들어, 안정한 형질감염 또는 일시적 형질감염)에 의해 또는 바이러스 벡터-기반 감염에 의해 이러한 세포 내로 도입될 수 있다. 일부 실시양태에서, LN229 세포는 이러한 검정에 사용된다. TGFβ1을 발현하는 세포 및 관심 제시 분자 (예를 들어, LTBP1, LTBP3, GARP 또는 LRRC33)는 배양물 중에서 성장되며, 이는 세포 표면 상에 대형 잠복 복합체를 "제시"하거나 (GARP 또는 LRRC33과 연관된 경우에) 또는 ECM 내로 침착된다 (LTBP와 연관된 경우에). TGFβ1의 활성화는 인테그린에 의해 촉발되어 또 다른 세포 표면 상에서 발현될 수 있다. 인테그린-발현 세포는 대형 잠복 복합체를 공동-발현하는 동일한 세포 또는 별개의 세포 유형일 수 있다. 리포터 세포가 TGFβ-반응성 요소를 포함하는 검정 시스템에 첨가된다. 이러한 방식으로, TGFβ 활성화의 정도는 TGFβ 활성화시에 리포터 세포 (예를 들어, TGFβ-반응성 리포터 유전자, 예컨대 TGFβ-반응성 프로모터 요소에 커플링된 루시페라제)로부터의 신호를 검출함으로써 측정될 수 있다. 이러한 세포-기반 검정 시스템을 사용하여, 항체의 억제 활성은 시험 항체의 존재 또는 부재 하에 리포터 신호의 변화 (감소) 또는 차이 (예를 들어, 형광 판독치에 의해 측정된 바와 같은 루시페라제 활성)를 측정함으로써 결정될 수 있다. 이러한 검정은 본원의 실시예 2에 예시된다.

따라서, 일부 실시양태에서, TGFβ1 활성화를 측정하기 위한 세포-기반 리포터 검정 (예컨대 본원의 다른 곳에 기재된 LN229 세포 검정)에 기초하여 계산된 본 개시내용의 신규 항체의 억제 효력 (IC₅₀)은, 각각의 hLTBP1-프로TGFβ1, hLTBP3-프로TGFβ1, hGARP-프로TGFβ1 및 hLRRC33-프로TGFβ1 복합체에 대해 측정된 5 nM 이하일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 각각의 LLC에 대해 측정된 2 nM 이하 (즉, ≤ 2 nM)의 IC₅₀을 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 각각의 LLC 복합체에 대해 측정된 항체의 IC₅₀은 1nM 이하이다. 일부 실시양태에서, 항체는 각각의 hLTBP1-프로TGFβ1, hLTBP3-프로TGFβ1, hGARP-프로TGFβ1 및 hLRRC33-프로TGFβ1 복합체에 대해 1 nM 미만의 IC₅₀을 갖는다.

표 11. 리포터 세포 검정에 의해 측정된 바와 같은 선택 항체의 억제 효력 (IC₅₀ 단위)

TGFβ1의 활성화는 인테그린-의존성 메카니즘 또는 프로테아제-의존성 메카니즘에 의해 촉발될 수 있다. 본 개시내용에 따른 항체의 억제 활성 (예를 들어, 효력)은 활성화 방식 중 하나 또는 둘 다에 의해 유도된 TGFβ1 활성화를 차단하는 능력에 대해 평가될 수 있다. 상기 기재된 리포터 세포 검정은 TGFβ1 활성화의 인테그린-의존성 활성화를 차단 또는 억제하는 항체의 능력을 측정하도록 설계된다. 억제 효력은 또한 TGFβ1의 프로테아제-유도된 활성화를 차단하는 항체의 능력을 측정함으로써 평가될 수 있다. 본 개시내용의 실시예 3은 이러한 검정의 비제한적 실시양태를 제공한다. 결과가 도 5a 및 5b에 요약되어 있다. 따라서, 본 발명의 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 이소형-선택적 억제제는 TGFβ1의 인테그린-의존성 활성화 및 TGFβ1의 프로테아제-의존성 활성화를 억제할 수 있다. 이러한 억제제는 프로테아제 활성을 수반하는 EDM 조절이상을 특징으로 하는 TGFβ1-관련 적응증을 치료하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 TGFβ1-관련 적응증은 상승된 근섬유모세포, ECM의 증가된 강성, 과도한 또는 비정상적 콜라겐 침착, 또는 그의 임의의 조합과 연관될 수 있다. 이러한 상태는, 예를 들어 섬유화 장애 및 고형 종양 (예컨대 전이성 암종)을 포함하는 암 또는 골수섬유증을 포함한다.

일부 실시양태에서, 효력은 효능 및/또는 약역학 효과의 척도로서 적합한 생체내 모델에서 평가될 수 있다. 예를 들어, 제1 항체가 생체내 모델에서 특정 농도에서 효과적이고, 제2 항체가 동일한 생체내 모델에서 제1 항체보다 더 낮은 농도에서 동등하게 효과적인 경우에, 제2 항체는 제1 항체보다 더 효력이 있는 것으로 언급될 수 있다. 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 질환 모델, 예를 들어 암 모델 및 섬유증 모델은 관심있는 특정한 적응증에 따라 TGFβ1 억제제의 상대 효력을 평가하는데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 다중 용량 또는 농도의 각각의 시험 항체가 이러한 연구에 포함된다.

유사하게, 억제 항체의 상대 효력을 결정하기 위해 약역학 (PD) 효과가 측정될 수 있다. TGFβ 신호전달 경로에 대해 통상적으로 사용되는 PD 척도는, 비제한적으로, SMAD2/3의 인산화, 및 전사가 TGFβ 활성화에 감수성인 하류 이펙터 유전자, 예컨대 TGFβ-반응성 프로모터 요소 (예를 들어, Smad-결합 요소)를 갖는 것의 발현을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 전임상 섬유증 모델에서 동물에게 3 mg/kg 이하의 용량으로 투여되는 경우에 질환-유도된 SMAD2/3 인산화를 완전히 차단할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 신장 섬유증의 UUO 모델에서 동물에게 10 mg/kg 이하의 용량으로 투여되는 경우에 Acta2, Col1a1, Col3a1, Fn1, Itga11, Lox, Loxl2를 포함한 마커 유전자의 패널의 섬유증-유도된 발현을 유의하게 억제할 수 있다.

일부 실시양태에서, 치료 용도를 위한 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 선택 과정은 충분한 억제 효력을 나타내는 항체 또는 단편을 확인하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 선택 과정은 1종 이상의 시험 항체 또는 그의 단편의 효력 (예를 들어, IC₅₀)을 측정하기 위해 세포-기반 TGFβ1 활성화 검정을 수행하는 단계, 및 바람직한 효력을 나타내는 후보 항체 또는 그의 단편을 선택하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 각각의 인간 LLC에 대한 IC₅₀은 5 nM 이하이다. 이어서, 선택된 항체 또는 단편은 본원에 기재된 TGFβ1-관련 적응증의 치료에 사용될 수 있다.

결합 영역

본 개시내용과 관련하여, 항원의 "결합 영역(들)"은 항체-항원 상호작용을 위한 구조적 기초를 제공한다. 본원에 사용된 "결합 영역"은 생리학적 용액 중 프로TGFβ1 복합체 ("항원")에 결합되는 경우에, 항체 또는 단편이 적합한 기술, 예컨대 수소-중수소 교환 질량 분광측정법 (HDX-MS)에 의해 결정시 용매 노출로부터 결합 영역을 보호하도록 하는, 항체와 항원 사이의 계면 영역을 지칭한다. 결합 영역의 확인은 항원-항체 상호작용 및 특정한 항체에 대한 작용 메카니즘에 대한 통찰을 얻는데 유용하다. 유사하거나 중첩되는 결합 영역을 갖는 추가의 항체의 확인은 에피토프 비닝을 가능하게 하는 교차-차단 실험에 의해 용이해질 수 있다. 임의로, X-선 결정학이 항원-항체 상호작용을 매개하는 에피토프의 정확한 아미노산 잔기를 확인하는데 사용될 수 있다.

관련 기술분야는 용액 중 단백질 입체형태 또는 단백질-단백질 상호작용을 탐구하기 위해 널리 사용되는 기술인 HDX-MS에 친숙하다. 이 방법은 단백질 백본 아미드 중의 수소를 용액에 존재하는 중수소로 교환하는 것에 의존한다. 수소-중수소 교환율을 측정함으로써, 단백질 역학 및 입체형태에 대한 정보를 수득할 수 있다 (문헌 [Wei et al. (2014) "Hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry for probing higher order structure of protein therapeutics: methodology and applications." Drug Disco Today. 19(1): 95-102] (본원에 참조로 포함됨)에서 검토됨). 이러한 기술의 적용은 항체-항원 복합체가 형성될 때, 결합 파트너 사이의 계면이 용매를 차단함으로써, 용매의 입체 배제로 인한 교환 속도를 감소시키거나 방지할 수 있다는 전제에 기초한다.

본 개시내용은 잠복성 라쏘 또는 그의 부분을 포함하는 영역 ("결합 영역")에서 인간 LLC에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다. 잠복성 라쏘는 프로도메인 내의 단백질 모듈이다. 많은 강력한 활성화 억제제는 항체 결합이 성장 인자를 "잠금"하여 그의 방출을 방지하는 방식으로 프로TGFβ1 복합체의 이러한 영역에 결합할 수 있는 것으로 고려된다. 흥미롭게도, 이는 성장 인자의 버터플라이-유사 신장된 영역 (예를 들어, 핑거-1 및 핑거-2에 상응함)이 프로도메인의 케이지-유사 구조와 밀접하게 상호작용하는 복합체의 절편이다.

도 18b에 제시된 바와 같이, 잠복성 라쏘는 2a로 표지된 영역 및 2b의 일부를 포함하며, 이들은 프로도메인의 일부이다. 잠복성 라쏘에 바로 인접한, 5a로 표지된 영역은 성장 인자 도메인 내의 소위 핑거-1에 상응하고, 반대쪽 측면 주위의 6b로 표지된 영역은 성장 인자 도메인 내의 핑거-2의 일부임을 주목한다. 이에 기초하여, 이들 영역 주위를 치밀하게 랩핑하는 항체는 프로TGFβ1 복합체가 분리되는 것을 효과적으로 방지하여 활성화를 차단할 수 있다는 것을 고려하는 것은 어렵지 않다.

HDX-MS 기술을 사용하여, 프로TGFβ1의 결합 영역이 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 단편에 결합하는데 중요한 것으로 확인된 프로TGFβ1 상의 부분은 프로도메인의 적어도 한 부분 및 성장 인자 도메인의 적어도 한 부분을 포함한다. 잠복성 라쏘의 적어도 한 부분을 포함하는 제1 결합 영역 (도 19a에서 "영역 1")에 결합하는 항체 또는 단편이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 이러한 항체 또는 단편은 성장 인자 도메인의 핑거-1에서 성장 인자 도메인의 적어도 한 부분을 포함하는 제2 결합 영역 (도 19a에서 "영역 2")에 추가로 결합한다. 이러한 항체 또는 단편은 성장 인자 도메인의 핑거-2의 적어도 한 부분을 포함하는 제3 결합 영역 (도 19a의 "영역 3")에 추가로 결합할 수 있다.

프로TGFβ1 내의 추가의 영역은 또한 본원에 개시된 이들 항체의 고친화도 상호작용에 직접적으로 또는 간접적으로 기여할 수 있다. 프로TGFβ1 복합체에 대한 항체의 고친화도 결합을 매개하는데 중요한 것으로 간주되는 영역 (도 18a 참조)은 다음을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다: LVKRKRIEA (서열식별번호: 159); LASPPSQGEVP (서열식별번호: 160); PGPLPEAV (서열식별번호: 161); LALYNSTR (서열식별번호: 162); REAVPEPVL (서열식별번호: 163); YQKYSNNSWR (서열식별번호: 164); RKDLGWKWIHEPKGYHANF (서열식별번호: 165); LGPCPYIWS (서열식별번호: 166); ALEPLPIV (서열식별번호: 167); 및 VGRKPKVEQL (서열식별번호: 168) (인간 프로TGFβ1의 천연 서열에 기초함).

항체-항원 상호작용에 기여할 수 있는 영역 중에서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 고친화도 항체는 아미노산 서열 KLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVL ("영역 1") (서열식별번호: 169)의 적어도 1개의 잔기를 포함하는 에피토프에 결합할 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용의 고친화도 항체는 아미노산 서열 RKDLGWKWIHEPKGYHANF ("영역 2") (서열식별번호: 165)의 적어도 1개의 잔기를 포함하는 에피토프에 결합할 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용의 고친화도 항체는 아미노산 서열 VGRKPKVEQL ("영역 3") (서열식별번호: 168)의 적어도 1개의 잔기를 포함하는 에피토프에 결합할 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용의 고친화도 항체는 아미노산 서열 KLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVL ("영역 1") (서열식별번호: 169)의 적어도 1개의 잔기 및 아미노산 서열 RKDLGWKWIHEPKGYHANF ("영역 2") (서열식별번호: 165)의 적어도 1개의 잔기를 포함하는 에피토프에 결합할 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용의 고친화도 항체는 아미노산 서열 KLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVL ("영역 1") (서열식별번호: 169)의 적어도 1개의 잔기 및 아미노산 서열 VGRKPKVEQL ("영역 3") (서열식별번호: 168)의 적어도 1개의 잔기를 포함하는 에피토프에 결합할 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용의 고친화도 항체는 아미노산 서열 KLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVL ("영역 1") (서열식별번호: 169)의 적어도 1개의 잔기, 아미노산 서열 RKDLGWKWIHEPKGYHANF ("영역 2") (서열식별번호: 165)의 적어도 1개의 잔기 및 아미노산 서열 VGRKPKVEQL ("영역 3") (서열식별번호: 168)의 적어도 1개의 잔기를 포함하는 에피토프에 결합할 수 있다.

영역 1, 2 및/또는 3으로부터의 기여에 추가로, 이러한 에피토프는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열로부터의 적어도 1개의 아미노산 잔기를 추가로 포함할 수 있다: LVKRKRIEA (서열식별번호: 159); LASPPSQGEVP (서열식별번호: 160); PGPLPEAV (서열식별번호: 161); LALYNSTR (서열식별번호: 162); REAVPEPVL (서열식별번호: 163); YQKYSNNSWR (서열식별번호: 164); RKDLGWKWIHEPKGYHANF (서열식별번호: 165); LGPCPYIWS (서열식별번호: 166); ALEPLPIV (서열식별번호: 167); 및 VGRKPKVEQL (서열식별번호: 168).

특히, 4개의 대표적인 이소형-선택적 TGFβ1 항체를 사용하는 구조적 연구에서 확인된 결합 영역 중 다수는 중첩되어, 프로TGFβ1 복합체의 잠복성을 유지하는데 특히 중요할 수 있는 프로TGFβ1 복합체 내의 특정 영역을 가리키는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 유리하게는, 항체 또는 그의 단편은 적어도 부분적으로 본원에 기재된 다중 억제제에 걸쳐 확인된 중첩 부분을 포함하는 그의 결합 영역(들)에 기초하여 선택될 수 있다. 결합 영역의 이들 중첩 부분은, 예를 들어 SPPSQGEVPPGPLPEAVL (서열식별번호: 201), WKWIHEPKGYHANF (서열식별번호: 202) 및 PGPLPEAVL (서열식별번호: 203)을 포함한다. 따라서, 본 개시내용에 따른 고친화도, 이소형-선택적 TGFβ1 억제제는 SPPSQGEVPPGPLPEAVL (서열식별번호: 201), WKWIHEPKGYHANF (서열식별번호: 202) 및/또는 PGPLPEAVL (서열식별번호: 203)의 1개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프에서 프로TGFβ1 복합체 (예를 들어, 인간 LLC)에 결합할 수 있다.

따라서, 본 개시내용에 의해 포괄되는 임의의 항체 또는 항원-결합 단편, 예컨대 본원에 개시된 카테고리 1 내지 5의 항체 또는 단편은 본원에서 확인된 결합 영역 중 1종 이상에 결합할 수 있다. 이러한 항체는 본원에 기재된 바와 같은 대상체에서의 TGFβ1 적응증의 치료에 사용될 수 있다. 따라서, 본 개시내용에 따른 치료 용도에 적합한 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 선택은 SPPSQGEVPPGPLPEAVL (서열식별번호: 201), WKWIHEPKGYHANF (서열식별번호: 202), PGPLPEAVL (서열식별번호: 203) 또는 그의 임의의 부분(들)에 결합하는 항체 또는 그의 단편을 확인 또는 선택하는 것을 포함할 수 있다.

이전에 기재된 바와 같은 (WO 2014/182676) 인간 프로TGFβ1의 단백질 도메인 또는 모티프의 비제한적 예가 표 12에 제공된다.

표 12. 인간 TGFβ1-관련 폴리펩티드의 선택 단백질 도메인/모티프

안전성/독성학

다수의 이소형을 길항할 수 있는 TGFβ의 통상적인 범-억제제는, 예를 들어 개 및 래트를 포함한 다중 종에 걸쳐 보고된 심혈관 독성 (심장 병변, 가장 특히 판막증)을 포함한 다수의 독성을 유발하는 것으로 공지되어 있다. 이들은 대동맥 판막, 우측 AV 판막, 및 좌측 AV 판막에서의 증식증; 대동맥 판막, 좌측 AV 판막 및 상행 대동맥에서의 염증; 상행 대동맥, 대동맥 판막 및 좌측 AV 판막에서의 출혈; 상행 대동맥에서의 결합 조직 변성을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Strauber et al. (2014) "Nonclinical safety evaluation of a Transforming Growth Factor β receptor I kinase inhibitor in Fischer 344 rats and beagle dogs" J. Clin. Pract 4(3): 1000196] 참조). 또한 도 21a를 참조한다.

추가로, 모든 3종의 TGFβ 이소형에 결합하는 중화 항체는 다중 종에 걸쳐 관찰된 특정 상피 독성과 연관되었고, 이들 중 일부는 하기에 요약되어 있다.

표 13. TGFβ의 범-억제제와 연관된 상피 독성

통상적인 TGFβ 길항제의 이소형-특이성의 결여가 TGFβ 억제와 연관된 독성 공급원의 기저를 이룰 수 있다는 본 개시내용의 출원인에 의한 초기 인식 (PCT/US2017/021972 참조)에 기초하여, 본 발명자들은 이소형-선택적 억제제의 안전성/내약성 측면을 유지하면서, 다면적 TGFβ1 조절이상을 나타내는 다양한 질환을 치료하기 위한 광범위한-스펙트럼 TGFβ1 억제를 추가로 달성하고자 하였다.

임상 세팅에서, 치료 이익은 약물 (예를 들어, 모노클로날 항체)의 최소 유효 농도 (MEC)가 약물의 최소 독성 농도 (MTC) 미만인 경우에만 달성된다. 이는 전부는 아니더라도 대부분의 TGFβ의 통상적인 범-억제제로 달성되지 않았으며, 이는 실제로 용량-제한 독성을 유발하는 것으로 보였다. 본 출원인의 이전 연구는 통상적인 범-억제제, 예컨대 소분자 수용체 길항제 및 중화 항체와 비교하여 현저하게 개선된 안전성 프로파일을 나타낸 TGFβ1의 이소형-선택적 억제제를 기재하였다. WO 2017/156500은 TGFβ1 활성화의 이소형-선택적 억제제를 개시하였으며, 이는, 래트에서 4주 동안 주당 100 mg/kg 이하의 용량이 투여되는 경우에, 시험 물품-관련 독성이 관찰되지 않아, 항체에 대한 NOAEL을 시험된 최고 용량, 즉 100 mg/kg로서 확립하였다. 본 출원인의 후속 연구는 또한 증진된 기능을 갖는 항체가 또한 등가의 안전성 프로파일을 나타낸다는 것을 제시하였다. 여기서, 목적 중 하나는 훨씬 더 높은 친화도 및 효력을 갖지만 적어도 동일하거나 등가의 수준의 안전성을 갖는 항체를 확인하는 것이었다.

4주 래트 독성학 연구로부터의 결과가 도 21b 및 21c에 제공된다. 2종의 이소형-선택적 TGFβ1 억제제 (Ab3 및 Ab6)를 소분자 ALK5 억제제 및 대조군으로서 모노클로날 중화 항체와 함께 개별 연구에서 시험하였다. 이소형-선택적 항체 중 어느 것에서도 시험 물품-관련 독성은 나타나지 않은 반면, 예상된 바와 같은 비-선택적 억제제는 공개된 연구와 일치하는 다양한 유해 사건을 유발하였다. 더욱이, Ab6은 시노몰구스 원숭이에서 4주 동안 매주 투여되었을 때 300 mg/kg만큼 높은 용량 수준에서 안전한 것으로 나타났다 (예를 들어, 유해 사건이 관찰되지 않음). Ab6은 다수의 생체내 모델에서 3 mg/kg만큼 낮은 용량에서 효과적인 것으로 나타났기 때문에, 이는 최대 100배의 치료 범위를 제공한다. 중요하게는, 이는 고효력이 보다 큰 독성 위험을 의미할 필요는 없다는 것을 입증한다. 특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 본원에 개시된 항체의 고도로 선택적인 성질이 관찰된 독성 결여를 설명할 가능성이 있는 것으로 고려된다.

따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 신규 항체는 적어도 4주 동안 매주 투여되는 경우에 >100 mg/kg의 최대 허용 용량 (MTD)을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 신규 항체는 적어도 4주 동안 매주 투여되는 경우에 100 mg/kg 이하의 무관찰 유해 효과 수준 (NOAEL)을 갖는다. TGFβ 억제제 및 TGFβ1 억제제에 대한 안전성/독성학 연구를 수행하는데 사용되는 적합한 동물 모델은 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 래트, 개, 시노 및 마우스. 바람직한 실시양태에서, 적합한 전임상 효능 연구에 기초한 항체의 최소 유효량은 NOAEL 미만이다. 보다 바람직하게는, 항체의 최소 유효량은 NOAEL의 약 1/3 이하이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 항체의 최소 유효량은 NOAEL의 약 1/6 이하이다. 일부 실시양태에서, 항체의 최소 유효량은 NOAEL의 약 1/10 이하이다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 대상체에게 투여되는 경우에 TGFβ1-관련 적응증을 치료하는데 효과적인 용량에서 심혈관 또는 기지의 상피 독성을 유발하지 않는, TGFβ1 신호전달을 억제할 수 있는 이소형-선택적 항체를 포괄한다. 일부 실시양태에서, 항체는 매주, 격주 또는 매월 투여되는 약 3-10 mg/kg의 최소 유효량을 갖는다. 바람직하게는, 항체는 최소 유효량의 적어도 6배인 용량 (예를 들어, 6배 치료 범위)에서 독성을 전혀 유발하지 않거나 최소의 독성을 유발한다. 보다 바람직하게는, 항체는 최소 유효량의 적어도 10배인 용량 (예를 들어, 10배 치료 범위)에서 독성을 전혀 유발하지 않거나 최소의 독성을 유발한다. 보다 더 바람직하게는, 항체는 최소 유효량의 적어도 15배인 용량 (예를 들어, 15배 치료 범위)에서 독성을 전혀 유발하지 않거나 최소의 독성을 유발한다.

따라서, 치료 용도를 위한 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 선택은 다음을 포함할 수 있다: 본원에 기재된 카테고리 1-5 중 1종 이상의 기준을 충족시키는 항체 또는 항원-결합 단편을 선택하는 것; 항체 또는 단편의 유효량을 결정하기 위해 적합한 전임상 모델에서 생체내 효능 연구를 수행하는 것; 안전하거나 독성인 항체의 양 (예를 들어, MTD, NOAEL, 또는 안전성/독성을 평가하기 위한 임의의 관련 기술분야에서 인식된 파라미터)을 결정하기 위해 적합한 모델에서 생체내 안전성/독성학 연구를 수행하는 것; 및 적어도 3배 치료 범위 (바람직하게는 6배, 보다 바람직하게는 10배 치료 범위, 보다 더 바람직하게는 15배 치료 범위)를 제공하는 항체 또는 단편을 선택하는 것. 바람직한 실시양태에서, 생체내 효능 연구는 인간 상태를 재현하는 2종 이상의 적합한 전임상 모델에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 이러한 전임상 모델은 TGFβ1-양성 암을 포함하며, 이는 임의로 면역억제 종양을 포함할 수 있다. 면역억제 종양은 암 요법, 예컨대 CBT, 화학요법 및 방사선 요법에 대해 저항성을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 전임상 모델은 MBT-2, 클라우드만 S91 및 EMT6 종양 모델로부터 선택된다.

선택된 항체 또는 단편은 항체 또는 단편을 포함하는 제약 조성물의 제조에 사용될 수 있다. 이러한 제약 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 대상체에서의 TGFβ1 적응증의 치료에 사용될 수 있다. 예를 들어, TGFβ1 적응증은 증식성 장애 및/또는 섬유화 장애일 수 있다.

작용 메카니즘

치료제로서 유용한 본 발명의 항체는 TGFβ1의 억제 항체이다. 추가로, 항체는 활성화 억제제이고, 즉 항체는 이미 활성화된 성장 인자를 직접적으로 뒤쫓기 보다는 TGFβ1의 활성화 단계를 차단한다.

넓은 의미에서, 용어 "억제 항체"는 표적 기능, 예를 들어 성장 인자 활성을 길항하거나 중화시키는 항체를 지칭한다. 유리하게는, 본 개시내용의 바람직한 억제 항체는 잠복 복합체로부터의 성숙 성장 인자 방출을 억제함으로써, 성장 인자 신호전달을 감소시킬 수 있다. 억제 항체는 이러한 항체와 회합된 경우에 성장 인자 방출 또는 활성을 감소시키는 임의의 에피토프를 표적화하는 항체를 포함한다. 이러한 에피토프는 TGFβ 단백질 (예를 들어 TGFβ1), 성장 인자, 또는 항체에 의해 결합되는 경우에 성장 인자 활성을 감소시키는 다른 에피토프의 프로도메인 상에 놓일 수 있다. 본 발명의 억제 항체는 TGFβ1-억제 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 억제 항체는 조합 에피토프, 즉 항원 또는 항원 복합체의 2개 이상의 성분/부분에 의해 형성된 에피토프에 특이적으로 결합한다. 예를 들어, 조합 에피토프는 단일 단백질의 다중 부분, 즉 동일한 단백질의 1개 초과의 비-인접 절편로부터의 아미노산 잔기로부터의 기여에 의해 형성될 수 있다. 대안적으로, 조합 에피토프는 항원 복합체의 다중 단백질 성분으로부터의 기여에 의해 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 억제 항체는 입체형태적 에피토프 (또는 입체형태-특이적 에피토프), 예를 들어 항원 또는 항원 복합체의 3차원 구조 (즉, 입체형태)에 감수성인 에피토프에 특이적으로 결합한다.

TGFβ 신호전달을 길항하는 전통적인 접근법은 i) 수용체 결합에 이용가능한 유리 리간드 (예를 들어, 그의 잠복 전구체 복합체로부터 방출됨)를 고갈시키도록 이미 활성이 된 후에 성숙 성장 인자를 직접 중화시키는 것; ii) 유리 리간드를 격리시킬 수 있는 가용성 수용체 단편 (예를 들어, 소위 리간드 트랩)을 사용하는 것; 또는 iii) 그의 세포-표면 수용체(들)를 표적화하여 리간드-수용체 상호작용을 차단하는 것이었다. 이들 통상적인 접근법은 각각 길항제가 내인성 대응물과 경쟁할 것을 필요로 한다. 더욱이, 상기 처음 2종의 접근법 (i 및 ii)은 일시적 종인 활성 리간드를 표적화한다. 따라서, 이러한 길항제는 짧은 시간적 범위 동안 내인성 수용체를 동역학적으로 능가할 수 있어야 한다. 제3 접근법은 비교시 더 지속적인 효과를 제공할 수 있지만, 많은 성장 인자 (예를 들어, 최대 ~20종)가 동일한 수용체(들)를 통해 신호전달하기 때문에 의도치 않게 원치않는 억제 효과 (따라서 가능한 독성)를 초래한다.

이들 결점에 대한 해결책을 제공하기 위해, 및 보다 큰 선택성 및 국재화된 작용을 추가로 가능하게 하기 위해, 억제 항체, 예컨대 본원에 기재된 항체의 기저를 이루는 바람직한 작용 메카니즘은 TGFβ1 활성화 및 리간드-수용체 상호작용의 상류에서 작용한다. 따라서, 본 발명을 수행하는데 적합한 TGFβ1의 고친화도, 이소형-특이적, 콘텍스트-비의존성 억제제는 바람직하게는 그의 공급원에서 (예컨대 질환 미세환경, 예를 들어 TME에서) 활성화 단계를 차단하기 위해, 그의 활성화 전에 불활성 (예를 들어, 잠복) 전구체 TGFβ1 복합체 (예를 들어, 프로/잠복 TGFβ1을 포함하는 복합체)를 표적화하여야 하는 것으로 고려된다. 본 발명의 바람직한 실시양태에 따르면, 이러한 억제제는 수용체 결합에 일시적으로 이용가능한 유리 리간드보다는 ECM-연관 및 세포 표면-테더링된 프로/잠복 TGFβ1 복합체 둘 다를 등가의 친화도로 표적화한다.

가용성 활성 종 (즉, 공급원로부터 방출된 후의 성숙 성장 인자)과 대조적으로, 공급원에서 조직/세포-테더링된 복합체를 국부로 표적화하는 것의 이점은 최근 연구에 의해 추가로 지지된다. 문헌 [Ishihara et al. (Sci. Transl. Med. 11, eaau3259 (2019) "Targeted antibody and cytokine cancer immunotherapies through collagen affinity")]은 전신 투여된 약물이 콜라겐-결합 모이어티와 접합함으로써 종양 부위에 표적화되는 경우에, 이들이 비-표적화 대응물과 비교하여 항종양 면역을 증진시키고 치료-관련 독성을 감소시킬 수 있음을 보고하였다.

본 개시내용의 항체에 의해 달성되는 작용 메카니즘은 효과의 증진된 지속성, 뿐만 아니라 전체적으로 보다 큰 효력 및 안전성에 추가로 기여할 수 있다.

흥미롭게도, 이들 항체는 세포-연관 TGFβ1 (LRRC33-프로TGFβ1 및 GARP-프로TGFβ1)에 대해 추가의 억제 활성을 발휘할 수 있다. 본 출원인은 LRRC33-결합 항체가 세포-표면 LRRC33에 결합시 내재화되는 경향이 있다는 것을 발견하였다. 내재화가 항체 결합에 의해 능동적으로 유도되는지 여부, 또는 대안적으로, 이러한 현상이 대식세포의 자연 (예를 들어, 수동) 세포내이입 활성으로부터 발생하는지 여부는 불명확하다. 그러나, 고친화도, 이소형-선택적 TGFβ1 억제제인 Ab6은 LRRC33 및 프로TGFβ1로 형질감염된 세포에서 신속하게 내재화될 수 있고, Ab6으로 달성된 내재화의 비율은 세포-표면 LRRC33을 인식하는 참조 항체로의 것보다 유의하게 더 높다 (도 6). 유사한 결과가 1차 인간 대식세포로부터 수득된다. 이들 관찰은 Ab6이 그의 표적인 LRRC33-프로TGFβ1에 결합시 내재화를 유도하여, LRRC33-함유 복합체를 세포 표면으로부터 제거할 수 있다는 가능성을 상승시킨다. 질환 유전자좌에서, 이는 활성화가능한 잠복 LRRC33-프로TGFβ1 수준의 이용가능성을 감소시킬 수 있다. 따라서, 이소형-선택적 TGFβ1 억제제는 하기 2종의 병행 작용 메카니즘을 통해 TGFβ1의 LRRC33 아암을 억제할 수 있다: i) 잠복 복합체로부터의 성숙 성장 인자의 방출을 차단하는 작용; 및 ii) 내재화를 통해 세포-표면으로부터 LRRC33-프로TGFβ1 복합체를 제거하는 작용. 유사한 억제 작용 메카니즘이 GARP-프로TGFβ1에 적용될 수 있는 것이 가능하다.

일부 실시양태에서, 항체는 산성 pH (예컨대 약 5의 pH)에서보다 중성 pH (예컨대 약 7의 pH)에서 더 높은 친화도로 그의 항원에 결합하는 pH-감수성 항체이다. 이러한 항체는 중성 또는 생리학적 조건보다 산성 조건에서 더 높은 해리율을 가질 수 있다. 예를 들어, 산성 pH에서 측정된 해리율과 중성 pH에서 측정된 해리율 사이의 비 (예를 들어, pH 7에서의 K_off에 비해 pH 5에서의 K_off)는 적어도 1.2일 수 있다. 선택적으로, 비는 적어도 1.5이다. 일부 실시양태에서, 비는 적어도 2이다. 이러한 pH-감수성 항체는 재순환 항체로서 유용할 수 있다. 세포 표면 상의 표적 결속시, 항체는 막-결합된 프로TGFβ1 복합체(LRRC33 또는 GARP와 회합됨)의 항체-의존성 내재화 (따라서 그의 제거)를 촉발할 수 있다. 후속적으로, 리소솜과 같은 산성 세포내 구획에서, 항체-항원 복합체는 해리되고, 유리 항체는 세포외 도메인으로 다시 수송될 수 있다.

따라서, 일부 실시양태에서, 치료 용도를 위한 항체 또는 항원-결합 단편의 선택은 부분적으로 항체의 항체-의존성 내재화 및/또는 pH-의존성을 유도하는 능력에 기초할 수 있다.

항원 복합체 및 그의 성분

본 개시내용의 신규 항체는 각각의 4종의 공지된 인간 대형 잠복성 복합체 (예를 들어, hLTBP1-프로TGFβ1, hLTBP3-프로TGFβ1, hGARP-프로TGFβ1 및 hLRRC33-프로TGFβ1)에 특이적으로 결합하고, TGFβ1 활성화를 선택적으로 억제한다. 바람직한 항체는 표 1로 제시된 카테고리 1-5 중 1종 이상의 기준을 추가로 충족시킨다.

이러한 항체의 스크리닝 (예를 들어, 확인 및 선택)은 전형적으로 재조합적으로 생산되는 적합한 항원 복합체의 사용을 수반한다. TGFβ 이소형 및 관련 폴리펩티드, 단편 및 변이체, 제시 분자 (예를 들어, LTBP, GARP, LRRC33) 및 관련 폴리펩티드, 단편 및 변이체를 포함한, 이러한 항원 복합체를 포함할 수 있는 유용한 단백질 성분이 제공된다. 이들 성분은 발현되고, 정제되고, 단백질 복합체 (예컨대 대형 잠복 복합체)를 형성하도록 허용될 수 있으며, 이는 항체 스크리닝의 과정에 사용될 수 있다. 스크리닝은 바람직한 결합제가 결합제 및 비-결합제의 풀 또는 라이브러리로부터 선택되는 양성 선택, 및 바람직하지 않은 결합제가 풀로부터 제거되는 음성 선택을 포함할 수 있다. 전형적으로, 적어도 1종의 매트릭스-연관 복합체 (예를 들어, LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 LTBP1-프로TGFβ1) 및 적어도 1종의 세포-연관 복합체 (예를 들어, GARP-프로TGFβ1 및/또는 LRRC33-프로TGFβ1)가 양성 스크리닝을 위해 포함되어 선택되는 결합제가 이러한 생물학적 콘텍스트 둘 다에 대한 친화도를 갖는 것을 보장한다.

일부 실시양태에서, TGFβ1은 자연 발생 포유동물 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, TGFβ1은 자연 발생 인간 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, TGFβ1은 인간, 원숭이, 래트 또는 마우스 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 TGFβ2에 특이적으로 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 TGFβ3에 특이적으로 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 TGFβ2 또는 TGFβ3에 특이적으로 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 서열식별번호: 34에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 TGFβ1에 특이적으로 결합한다. TGFβ2의 아미노산 서열 및 TGFβ3 아미노산 서열은 각각 서열식별번호: 38 및 32에 제시된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 비-자연-발생 아미노산 서열을 포함하는 TGFβ1 (달리 본원에서 비-자연-발생 TGFβ1로 지칭됨)에 특이적으로 결합한다. 예를 들어, 비-자연-발생 TGFβ1은 자연-발생 TGFβ1 아미노산 서열에 비해 1개 이상의 재조합적으로 생성된 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, TGFβ1, TGFβ2 또는 TGFβ3 아미노산 서열은 표 14에 제시된 바와 같이, 서열식별번호: 24-35에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, TGFβ1, TGFβ2 또는 TGFβ3 아미노산 서열은 표 15에 제시된 바와 같이, 서열식별번호: 36-43에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.

표 14. 예시적인 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3 아미노산 서열

표 15. 예시적인 비-인간 아미노산 서열

일부 실시양태에서, 항원성 단백질 복합체 (예를 들어, LTBP-TGFβ1 복합체)는 1종 이상의 제시 분자, 예컨대 LTBP 단백질 (예를 들어, LTBP1, LTBP2, LTBP3 및 LTBP4), GARP 단백질, LRRC33 단백질 또는 그의 단편(들)을 포함할 수 있다. 전형적으로, 본원에 개시된 실시양태를 수행하는데 적합한 최소로 요구되는 단편은 프로TGFβ1 복합체와 디술피드 결합을 형성할 수 있는 적어도 2개의 시스테인 잔기를 포함하는 제시 분자 단백질의 적어도 50개의 아미노산, 바람직하게는 적어도 100개의 아미노산을 포함한다. 구체적으로, 이들 Cys 잔기는 프로TGFβ1 복합체의 각각의 단량체의 N-말단 근처에 존재하는 시스테인과 공유 결합을 형성한다. 프로TGFβ1 이량체 복합체의 3차원 구조에서, 각각의 단량체의 N-말단 소위 "알파-1 헬릭스"는 서로 매우 근접하고 (예를 들어, 도 18b 참조, 구조의 바닥 근처의 2개의 헬릭스는 회색으로 표시됨), 제시 분자에 존재하는 시스테인의 상응하는 쌍과 생산적 공유 결합을 형성하는데 요구되는 2개의 시스테인 잔기 (각각의 헬릭스로부터 1개) 사이의 거리를 설정한다 (예를 들어, 문헌 [Cuende et al. (2015) Sci. Trans. Med. 7: 284ra56] 참조). 따라서, 제시 분자의 단편이 스크리닝 과정 (예를 들어, 면역화, 라이브러리 스크리닝, 확인 및 선택)에서 LLC를 형성하는데 사용되는 경우에, 이러한 단편은 생성된 LLC의 정확한 입체형태를 보존하기 위해 프로TGFβ1 복합체와의 적절한 디술피드 결합 형성을 가능하게 할, 적절한 거리에 의해 분리된 시스테인 잔기를 포함해야 한다. LTBP (예를 들어, LTBP1, LTBP3 및 LTBP4)는, 예를 들어 프로TGFβ1과의 공유 상호작용을 매개하는 "시스테인-풍부 도메인"을 함유할 수 있다.

본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 LTBP1-TGFβ1 복합체에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, LTBP1 단백질은 자연-발생 단백질 또는 그의 단편이다. 일부 실시양태에서, LTBP1 단백질은 비-자연 발생 단백질 또는 그의 단편이다. 일부 실시양태에서, LTBP1 단백질은 재조합 단백질이다. 이러한 재조합 LTBP1 단백질은 LTBP1, 대안적으로 그의 스플라이싱된 변이체 및/또는 그의 단편을 포함할 수 있다. 재조합 LTBP1 단백질은 또한 1종 이상의 검출가능한 표지를 포함하도록 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, LTBP1 단백질은 리더 서열 (예를 들어, 천연 또는 비-천연 리더 서열)을 포함한다. 일부 실시양태에서, LTBP1 단백질은 리더 서열을 포함하지 않는다 (즉, 리더 서열이 프로세싱되거나 절단되었음). 이러한 검출가능한 표지는 비오틴 표지, 폴리히스티딘 태그, myc 태그, HA 태그 및/또는 형광 태그를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, LTBP1 단백질은 포유동물 LTBP1 단백질이다. 일부 실시양태에서, LTBP1 단백질은 인간, 원숭이, 마우스 또는 래트 LTBP1 단백질이다. 일부 실시양태에서, LTBP1 단백질은 표 15의 서열식별번호: 46 및 47에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, LTBP1 단백질은 표 17의 서열식별번호: 50에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.

본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 LTBP3-TGFβ1 복합체에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, LTBP3 단백질은 자연-발생 단백질 또는 그의 단편이다. 일부 실시양태에서, LTBP3 단백질은 비-자연 발생 단백질 또는 그의 단편이다. 일부 실시양태에서, LTBP3 단백질은 재조합 단백질이다. 이러한 재조합 LTBP3 단백질은 LTBP3, 대안적으로 그의 스플라이싱된 변이체 및/또는 그의 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, LTBP3 단백질은 리더 서열 (예를 들어, 천연 또는 비-천연 리더 서열)을 포함한다. 일부 실시양태에서, LTBP3 단백질은 리더 서열을 포함하지 않는다 (즉, 리더 서열은 프로세싱되거나 절단되었음). 재조합 LTBP3 단백질은 또한 1종 이상의 검출가능한 표지를 포함하도록 변형될 수 있다. 이러한 검출가능한 표지는 비오틴 표지, 폴리히스티딘 태그, myc 태그, HA 태그 및/또는 형광 태그를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, LTBP3 단백질은 포유동물 LTBP3 단백질이다. 일부 실시양태에서, LTBP3 단백질은 인간, 원숭이, 마우스 또는 래트 LTBP3 단백질이다. 일부 실시양태에서, LTBP3 단백질은 표 15의 서열식별번호: 44 및 45에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, LTBP1 단백질은 표 17의 서열식별번호: 51에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.

본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 GARP-TGFβ1 복합체에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, GARP 단백질은 자연-발생 단백질 또는 그의 단편이다. 일부 실시양태에서, GARP 단백질은 비-자연 발생 단백질 또는 그의 단편이다. 일부 실시양태에서, GARP 단백질은 재조합 단백질이다. 이러한 GARP는 재조합일 수 있으며, 본원에서 재조합 GARP로 지칭된다. 일부 재조합 GARP는 야생형 GARP와 비교하여 1개 이상의 변형, 말단절단 및/또는 돌연변이를 포함할 수 있다. 재조합 GARP는 가용성이도록 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, GARP 단백질은 리더 서열 (예를 들어, 천연 또는 비-천연 리더 서열)을 포함한다. 일부 실시양태에서, GARP 단백질은 리더 서열을 포함하지 않는다 (즉, 리더 서열은 프로세싱되거나 절단되었음). 다른 실시양태에서, 재조합 GARP는 1종 이상의 검출가능한 표지를 포함하도록 변형된다. 추가 실시양태에서, 이러한 검출가능한 표지는 비오틴 표지, 폴리히스티딘 태그, flag 태그, myc 태그, HA 태그 및/또는 형광 태그를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, GARP 단백질은 포유동물 GARP 단백질이다. 일부 실시양태에서, GARP 단백질은 인간, 원숭이, 마우스 또는 래트 GARP 단백질이다. 일부 실시양태에서, GARP 단백질은 표 15의 서열식별번호: 48-49에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, GARP 단백질은 표 18의 서열식별번호: 52 및 53에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 TGFβ1에 콘텍스트-의존성 방식으로 결합하는 것이 아니며, 예를 들어 TGFβ1에 대한 결합이 TGFβ1 분자가 특정 제시 분자, 예컨대 GARP와 복합체화된 경우에만 발생하게 되는 방식으로 결합하는 것이 아니다. 대신에, 항체 및 그의 항원-결합 부분은 TGFβ1에 콘텍스트-비의존성 방식으로 결합한다. 다시 말해서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 다음 임의의 제시 분자에 결합되는 경우에 TGFβ1에 결합한다: GARP, LTBP1, LTBP3 및/또는 LRCC33.

본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 LRRC33-TGFβ1 복합체에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, LRRC33 단백질은 자연-발생 단백질 또는 그의 단편이다. 일부 실시양태에서, LRRC33 단백질은 비-자연 발생 단백질 또는 그의 단편이다. 일부 실시양태에서, LRRC33 단백질은 재조합 단백질이다. 이러한 LRRC33은 재조합일 수 있으며, 본원에서 재조합 LRRC33으로 지칭된다. 일부 재조합 LRRC33 단백질은 야생형 LRRC33과 비교하여 1개 이상의 변형, 말단절단 및/또는 돌연변이를 포함할 수 있다. 재조합 LRRC33 단백질은 가용성이도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, LRRC33의 엑토도메인은 가용성 LRRC33 단백질 (sLRRC33; 예를 들어, 서열식별번호: 84 참조)을 발현하기 위해 C-말단 His-태그와 함께 발현될 수 있다. 일부 실시양태에서, LRRC33 단백질은 리더 서열 (예를 들어, 천연 또는 비-천연 리더 서열)을 포함한다. 일부 실시양태에서, LRRC33 단백질은 리더 서열을 포함하지 않는다 (즉, 리더 서열은 프로세싱되거나 절단되었음). 다른 실시양태에서, 재조합 LRRC33 단백질은 1종 이상의 검출가능한 표지를 포함하도록 변형된다. 추가 실시양태에서, 이러한 검출가능한 표지는 비오틴 표지, 폴리히스티딘 태그, flag 태그, myc 태그, HA 태그 및/또는 형광 태그를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, LRRC33 단백질은 포유동물 LRRC33 단백질이다. 일부 실시양태에서, LRRC33 단백질은 인간, 원숭이, 마우스 또는 래트 LRRC33 단백질이다. 일부 실시양태에서, LRRC33 단백질은 표 18의 서열식별번호: 83, 84 및 101에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.

표 17. 예시적인 LTBP 아미노산 서열

표 18. 예시적인 GARP 및 LRRC33 아미노산 서열

제약 조성물 및 제제

본 발명은 인간 및 비-인간 대상체에서의 투여에 적합한 의약으로서 사용되는 제약 조성물을 추가로 제공한다. 본 발명에 의해 포괄되는 1종 이상의 고친화도, 콘텍스트-비의존성 항체는 제약 조성물을 형성하기 위해, 예를 들어 완충제를 포함한 제약상 허용되는 담체 (부형제)와 함께 제제화되거나 혼합될 수 있다. 이러한 제제는 TGFβ 신호전달을 수반하는 질환 또는 장애의 치료에 사용될 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 이러한 제제는 면역-종양학 적용을 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 제약 조성물은 TGFβ-관련 적응증 (예를 들어, 섬유증, 면역 장애 및/또는 암)을 완화시키기 위해 환자에게 투여될 수 있다. "허용되는"은 담체가 조성물의 활성 성분과 상용성이고 (및 바람직하게는, 활성 성분을 안정화시킬 수 있음), 치료될 대상체에게 해롭지 않음을 의미한다. 완충제를 포함한 제약상 허용되는 부형제 (담체)의 예는 통상의 기술자에게 분명할 것이고, 이전에 기재되었다. 예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover]을 참조한다. 한 예에서, 본원에 기재된 제약 조성물은 GARP-프로TGFβ1 복합체, LTBP1-프로TGFβ1 복합체, LTBP3-프로TGFβ1 복합체 및 LRRC33-프로TGFβ1 복합체에 특이적으로 결합하는 1종 초과의 항체를 함유하며, 여기서 항체는 복합체의 상이한 에피토프/잔기를 인식한다.

본 방법에 사용될 제약 조성물은 동결건조 제제 또는 수용액 형태의 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함할 수 있다 (문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover] 참조). 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기 산; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드 및 다른 탄수화물, 예컨대 글루코스, 만노스 또는 덱스트란; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 트윈(TWEEN)™, 플루로닉스(PLURONICS)™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함할 수 있다. 제약상 허용되는 부형제가 본원에 추가로 기재되어 있다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 항체 또는 그의 단편 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 포함한다.

따라서, 항체 또는 이러한 항체의 항원-결합 단편을 포함하는 분자는 인간 투여에 적합한 제약 조성물로 제제화될 수 있다.

제약 제제는 1종 이상의 부형제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 부형제(들)는 하기에 제공된 목록으로부터 선택될 수 있다: https://www.accessdata.fda.gov/scripts/cder/iig/index.Cfm?event=browseByLetter.page&Letter=A

제약 조성물은 전형적으로 활성 생물제제 (예를 들어, 모노클로날 항체, 항원-결합 단편을 포함하는 조작된 결합 분자 등)의 최종 농도가 약 2 mg/mL 내지 약 200 mg/mL이 되도록 제제화된다. 예를 들어, 제제의 최종 농도 (wt/vol)는 약 2-200, 2-180, 2-160, 2-150, 2-120, 2-100, 2-80, 2-70, 2-60, 2-50, 2-40, 5-200, 5-180, 5-160, 5-150, 5-120, 5-100, 5-80, 5-70, 5-60, 5-50, 5-40, 10-200, 10-180, 10-160, 10-150, 10-120, 10-100, 10-80, 10-70, 10-60, 10-50, 10-40, 20-200, 20-180, 20-160, 20-150, 20-120, 20-100, 20-80, 20-70, 20-60, 20-50, 20-40, 30-200, 30-180, 30-160, 30-150, 30-120, 30-100, 30-80, 30-70, 30-60, 30-50, 30-40, 40-200, 40-180, 40-160, 40-150, 40-120, 40-100, 40-80, 40-70, 40-60, 40-50, 50-200, 50-180, 50-160, 50-150, 50-120, 50-100, 50-80, 50-70, 50-60, 60-200, 60-180, 60-160, 60-150, 60-120, 60-100, 60-80, 60-70, 70-200, 70-180, 70-160, 70-150, 70-120, 70-100, 70-80 mg/mL의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 제제 중 생물제제의 최종 농도는 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 200 mg/mL이다.

본 발명의 제약 조성물은 바람직하게는 적합한 완충제와 함께 제제화된다. 적합한 완충제는 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 포스페이트 완충제, 시트르산 완충제 및 히스티딘 완충제.

제제의 최종 pH는 전형적으로 pH 5.0 내지 8.0이다. 예를 들어, 제약 조성물의 pH는 약 5.0, 5.2, 5.5, 6.0, 6.2, 6.5, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4, 7.5, 7.6 또는 7.8일 수 있다.

본 개시내용의 제약 조성물은 제약 제제에 사용하기 위해 승인된 계면활성제, 예컨대 비이온성 세제를 포함할 수 있다. 이러한 계면활성제는, 예를 들어 폴리소르베이트, 예컨대 폴리소르베이트 20 (트윈-20), 폴리소르베이트 80 (트윈-80) 및 NP-40을 포함한다.

본 개시내용의 제약 조성물은 안정화제를 포함할 수 있다. 액체-단백질 제제의 경우, 안정성은 pH-완충 염의 선택에 의해 증진될 수 있고, 종종 아미노산이 또한 사용될 수 있다. 이는 종종 단백질의 흡착 및 언폴딩 후에 응집을 일으키는 액체/공기 계면 또는 액체/고체 계면 (패키징에 의함)에서의 상호작용이다. 적합한 안정화제는 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 수크로스, 말토스, 소르비톨, 뿐만 아니라 특정 아미노산, 예컨대 히스티딘, 글리신, 메티오닌 및 아르기닌.

본 개시내용의 제약 조성물은 하기 부형제 중 1종 또는 임의의 조합을 함유할 수 있다: 인산나트륨, 아르기닌, 수크로스, 염화나트륨, 트로메타민, 만니톨, 벤질 알콜, 히스티딘, 수크로스, 폴리소르베이트 80, 시트르산나트륨, 글리신, 폴리소르베이트 20, 트레할로스, 폴록사머 188, 메티오닌, 트레할로스, rh히알루로니다제, 숙신산나트륨, 인산칼륨, 에데트산이나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 말토스, 히스티딘 아세테이트, 소르비톨, 펜테트산, 인간 혈청 알부민, 펜테트산.

일부 실시양태에서, 본 개시내용의 제약 조성물은 보존제를 함유할 수 있다.

본 개시내용의 제약 조성물은 전형적으로 액체 또는 동결건조 형태로 제공된다. 전형적으로, 생성물은 바이알 (예를 들어, 유리 바이알)에 제공될 수 있다. 시린지, 펜 또는 자가주사기에 이용가능한 생성물은 이들 용기/폐쇄 시스템에서 사전-충전된 액체로 제공될 수 있다.

일부 예에서, 본원에 기재된 제약 조성물은 GARP-프로TGFβ1 복합체, LTBP1-프로TGFβ1 복합체, LTBP3-프로TGFβ1 복합체 및 LRRC33-프로TGFβ1 복합체에 특이적으로 결합하는 항체를 함유하는 리포솜을 포함하며, 이는 예컨대 문헌 [Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985)]; 문헌 [Hwang et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030 (1980)]; 및 미국 특허 번호 4,485,045 및 4,544,545에 기재된 임의의 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다. 순환 시간이 증진된 리포솜이 미국 특허 번호 5,013,556에 개시되어 있다. 특히 유용한 리포솜은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용한 역상 증발 방법에 의해 생성될 수 있다. 리포솜은 규정된 세공 크기의 필터를 통해 압출되어 목적하는 직경을 갖는 리포솜을 생성한다.

일부 실시양태에서, 표적화 특성을 갖는 리포솜은 제약 조성물을 특정 조직 또는 세포 유형에 우선적으로 전달 또는 국재화하도록 선택된다. 예를 들어, 골수-표적화 특성을 갖는 특정 나노입자-기재 담체, 예를 들어 지질-기재 나노입자 또는 리포솜이 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Sou (2012) "Advanced drug carriers targeting bone marrow", ResearchGate publication 232725109]을 참조한다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 아주반트를 포함할 수 있거나 또는 그와 함께 사용될 수 있다. 특정 아주반트는, 예를 들어 종양 항원에 대한 대상체의 면역 반응을 부스팅하고, T이펙터 기능, 단핵구로부터의 DC 분화, 증진된 항원 흡수 및 APC에 의한 제시 등을 용이하게 할 수 있는 것으로 고려된다. 적합한 아주반트는 레티노산-기재 아주반트 및 그의 유도체, 수중유 에멀젼-기재 아주반트, 예컨대 MF59 및 다른 스쿠알렌-함유 아주반트, 톨-유사 수용체(TRL) 리간드 (예를 들어, CpG), α-토코페롤 (비타민 E) 및 그의 유도체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

본원에 기재된 항체는 또한, 예를 들어 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 중에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로구체, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 중에, 또는 마크로에멀젼 중에 포함될 수 있다. 예시적인 기술은 이전에 기재되었으며, 예를 들어, 문헌 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000)]을 참조한다.

다른 예에서, 본원에 기재된 제약 조성물은 지속-방출 포맷으로 제제화될 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하며, 이 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지속-방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 번호 3,773,919), L-글루탐산 및 7 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 루프론 데포(LUPRON DEPOT)™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능한 마이크로구체), 수크로스 아세테이트 이소부티레이트, 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다.

생체내 투여에 사용될 제약 조성물은 멸균이어야 한다. 이는, 예를 들어 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다. 치료 항체 조성물은 일반적으로 멸균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들어 피하 주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알 내에 놓인다.

본원에 기재된 제약 조성물은 경구, 비경구 또는 직장 투여, 또는 흡입 또는 취입에 의한 투여를 위한 단위 투여 형태, 예컨대 정제, 환제, 캡슐, 분말, 과립, 용액 또는 현탁액, 또는 좌제로 존재할 수 있다.

적합한 표면-활성제는, 특히 비-이온성 작용제, 예컨대 폴리옥시에틸렌소르비탄 (예를 들어, 트윈™ 20, 40, 60, 80 또는 85) 및 다른 소르비탄 (예를 들어, 스팬(Span)™ 20, 40, 60, 80 또는 85)을 포함한다. 표면-활성제를 갖는 조성물은 편리하게는 0.05 내지 5% 표면-활성제를 포함할 것이고, 0.1 내지 2.5%일 수 있다. 필요하다면, 다른 성분, 예를 들어 만니톨 또는 다른 제약상 허용되는 비히클이 첨가될 수 있다는 것이 인지될 것이다.

적합한 에멀젼은 상업적으로 입수가능한 지방 에멀젼, 예컨대 인트라리피드(Intralipid)™, 리포신(Liposyn)™, 인포누트롤(Infonutrol)™, 리포푼딘(Lipofundin)™ 및 리피피산(Lipiphysan)™을 사용하여 제조될 수 있다. 활성 성분은 사전-혼합된 에멀젼 조성물 중에 용해될 수 있거나, 또는 대안적으로 오일 (예를 들어 대두 오일, 홍화 오일, 목화씨 오일, 참깨 오일, 옥수수 오일 또는 아몬드 오일) 및 인지질 (예를 들어 난 인지질, 대두 인지질 또는 대두 레시틴) 및 물과 혼합시 형성된 에멀젼 중에 용해될 수 있다. 에멀젼의 장성을 조정하기 위해 다른 성분, 예를 들어 글리세롤 또는 글루코스가 첨가될 수 있다는 것이 인지될 것이다. 적합한 에멀젼은 전형적으로 최대 20%의 오일, 예를 들어 5 내지 20%의 오일을 함유할 것이다.

에멀젼 조성물은 본 발명의 항체를 인트라리피드™ 또는 그의 성분 (대두 오일, 난 인지질, 글리세롤 및 물)과 혼합함으로써 제조된 것일 수 있다.

TGFβ-관련 적응증의 검출, 모니터링 또는 완화에 사용하기 위한 키트

본 개시내용은 또한 TGFβ-관련 적응증과 연관된 질환/장애를 완화시키는데 사용하기 위한 키트를 제공한다. 이러한 키트는 GARP-TGFβ1 복합체, LTBP1-TGFβ1 복합체, LTBP3-TGFβ1 복합체 및/또는 LRRC33-TGFβ1 복합체, 예를 들어 본원에 기재된 것 중 임의의 것에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 1개 이상의 용기를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된 방법 중 임의의 것에 따른 사용에 대한 지침서를 포함할 수 있다. 포함된 지침서는 본원에 기재된 것과 같은 표적 질환을 치료하거나, 그의 발병을 지연시키거나 또는 그를 완화시키기 위해 GARP-TGFβ1 복합체, LTBP1-TGFβ1 복합체, LTBP3-TGFβ1 복합체 및/또는 LRRC33-TGFβ1 복합체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 투여하는 것의 설명을 포함한다. 키트는 개체가 표적 질환을 갖는지 여부를 확인하는 것에 기초하여 치료에 적합한 개체를 선택하는 것의 설명을 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 지침서는 표적 질환의 위험이 있는 개체에게 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 투여하는 것의 설명을 포함한다.

GARP-TGFβ1 복합체, LTBP1-TGFβ1 복합체, LTBP3-TGFβ1 복합체 및/또는 LRRC33-TGFβ1 복합체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분의 사용에 관한 지침서는 일반적으로 의도된 치료를 위한 투여량, 투여 스케줄 및 투여 경로에 관한 정보를 포함한다. 용기는 단위 용량, 벌크 패키지 (예를 들어, 다중-용량 패키지) 또는 하위-단위 용량일 수 있다. 본 개시내용의 키트에 공급된 지침서는 전형적으로 라벨 또는 패키지 삽입물 (예를 들어, 키트에 포함되어 있는 종이 시트) 상의 서면 지침서이지만, 기계-판독식 지침서 (예를 들어, 자기 또는 광학 저장 디스크에 저장된 지침서)가 또한 허용된다.

라벨 또는 패키지 삽입물은 조성물이 TGFβ-관련 적응증과 연관된 질환 또는 장애를 치료하고/거나, 그의 발병을 지연시키고/거나, 그를 완화시키는 데 사용되는 것을 나타낸다. 지침서는 본원에 기재된 임의의 방법을 실시하기 위해 제공될 수 있다.

본 개시내용의 키트는 적합한 패키징으로 제공된다. 적합한 패키징은 바이알, 병, 단지, 가요성 패키징 (예를 들어, 밀봉된 마일라 또는 플라스틱 백) 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 장치, 예컨대 흡입기, 비강 투여 장치 (예를 들어, 아토마이저) 또는 주입 장치, 예컨대 미니펌프와 조합하여 사용하기 위한 패키지가 또한 고려된다. 키트는 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 용기는 또한 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 조성물 중의 적어도 1종의 활성제는 본원에 기재된 것과 같은 GARP-TGFβ1 복합체, LTBP1-TGFβ1 복합체, LTBP3-TGFβ1 복합체 및/또는 LRRC33-TGFβ1 복합체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분이다.

키트는 임의로 추가의 성분, 예컨대 완충제 및 해석 정보를 제공할 수 있다. 통상적으로, 키트는 용기, 및 용기 상에 있거나 용기와 회합된 라벨 또는 패키지 삽입물(들)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 상기 기재된 키트의 내용물을 포함하는 제조 물품을 제공한다.

TGFβ1의 고친화도, 이소형-특이적 억제제의 스크리닝, 확인 및 제조 방법

본 발명은 다음 각각에 결합할 수 있는 항체 또는 그의 단편의 스크리닝/선택 방법, 생산 방법 및 제조 방법을 포함한다: 등가의 친화도를 갖는 GARP-프로TGFβ1 복합체, LTBP1-프로TGFβ1 복합체, LTBP3-프로TGFβ1 복합체 및 LRRC33-프로TGFβ1 복합체, 및 그를 포함하는 제약 조성물 및 관련 키트. 스크리닝 목적을 위해, LTBP1-프로TGFβ1 및 LTBP3-프로TGFβ1 복합체 중 적어도 1종 및 GARP-프로TGFβ1 및 LRRC33-프로TGFβ1 복합체 중 적어도 1종은 ECM-연관 복합체 및 세포-연관 복합체 둘 다에 대해 광범위한 결합 특이성을 갖는 바람직한 항체를 확인할 기회를 최대화하도록 포함되는 것이 바람직하다. 스크리닝 과정에서 확인된 항체 또는 그의 단편은 바람직하게는 각각의 관심 LLC에 고친화도로 결합하는 그의 능력을 확인하기 위해 추가로 시험된다.

본 개시내용의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 수득하는데 수많은 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체는 재조합 DNA 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 모노클로날 항체는 또한 공지된 방법에 따라 하이브리도마의 생성에 의해 생산될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Kohler and Milstein (1975) Nature, 256: 495-499] 참조). 이어서, 이러한 방식으로 형성된 하이브리도마를 표준 방법, 예컨대 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA) 및 표면 플라즈몬 공명 (예를 들어, 옥테트® 또는 비아코어) 분석을 사용하여 스크리닝하여, 특정된 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 1종 이상의 하이브리도마를 확인한다. 임의의 형태의 특정된 항원, 예를 들어 재조합 항원, 자연 발생 형태, 그의 임의의 변이체 또는 단편, 뿐만 아니라 그의 항원성 펩티드 (예를 들어, 선형 에피토프로서의 또는 입체형태적 에피토프로서의 스캐폴드 내의 본원에 기재된 임의의 에피토프)가 면역원으로서 사용될 수 있다. 항체를 제조하는 한 예시적인 방법은 항체 또는 그의 단편 (예를 들어, scFv)을 발현하는 단백질 발현 라이브러리, 예를 들어 파지, 리보솜 디스플레이 라이브러리를 스크리닝하는 것을 포함한다. 파지 디스플레이는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,223,409 (Ladner et al.); [Smith (1985) Science 228:1315-1317; Clackson et al. (1991) Nature, 352:624-628; Marks et al. (1991) J. Mol. Biol., 222:581-597]; WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; 및 WO 90/02809에 기재되어 있다.

디스플레이 라이브러리의 사용에 추가로, 특정된 항원 (예를 들어, 제시 분자-TGFβ1 복합체)은 비-인간 숙주, 예를 들어 토끼, 기니 피그, 래트, 마우스, 햄스터, 양, 염소, 닭, 낙타류, 뿐만 아니라 비-포유동물 숙주, 예컨대 상어를 면역화하는데 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 비-인간 동물은 마우스이다.

비-인간 숙주의 면역화는 그에 회합된 제시 분자 (또는 그의 단편)의 존재 또는 부재 하에 면역원, 예컨대 프로TGFβ1로서의 정제된 재조합 단백질 복합체의 사용으로 수행될 수 있다. 이들은 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: LTBP1-프로TGFβ1, LTBP3-프로TGFβ1, GARP-프로TGFβ1 및 LRRC33-프로TGFβ1. 연관된 제시 분자는 전장 대응물일 필요는 없지만, 바람직하게는 프로TGFβ1 이량체 복합체와 공유 결합을 형성하는 2개의 시스테인 잔기를 포함한다.

대안적으로, 비-인간 숙주의 면역화는 세포-기반 항원을 사용하여 수행될 수 있다. 용어 세포-기반 항원은 프로TGFβ1 단백질 복합체를 발현하는 세포 (예를 들어, 이종 세포)를 지칭한다. 이는 프로TGFβ1의 과다발현에 의해, 임의로 바람직한 제시 분자의 공동-발현과 함께 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 내인성 대응물(들)은 세포-기반 항원으로서 이용될 수 있다. 프로TGFβ1-함유 단백질 복합체를 형성하는 단백질의 세포-표면 발현은 널리 공지된 방법, 예컨대 FACS에 의해 확인될 수 있다. 숙주를 이러한 세포 (세포-기반 항원)로 면역화시키면, 숙주에서 항원에 대한 면역 반응이 도출되어, 항체 생산 및 후속 스크리닝이 가능해진다. 일부 실시양태에서, 적합한 녹아웃 동물이 사용되어 항원에 대한 보다 강한 면역 반응을 용이하게 한다. 대안적으로, 상이한 종 사이의 구조적 차이는 숙주에서 항체 생산을 촉발하기에 충분할 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 모노클로날 항체는 비-인간 동물로부터 수득된 다음, 적합한 재조합 DNA 기술을 사용하여, 예를 들어 키메라로 변형된다. 키메라 항체를 제조하는 다양한 접근법이 기재되었다. 예를 들어, 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851, 1985; Takeda et al., Nature 314:452, 1985], 미국 특허 번호 4,816,567 (Cabilly et al.); 미국 특허 번호 4,816,397 (Boss et al.); 유럽 특허 공개 EP171496 (Tanaguchi et al.); 유럽 특허 공개 0173494, 영국 특허 GB 2177096B를 참조한다.

추가의 항체 생산 기술에 대해, 문헌 [Antibodies: A Laboratory Manual, eds. Harlow et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]을 참조한다. 본 개시내용은 항체의 임의의 특정한 공급원, 생산 방법, 또는 다른 특수한 특징에 반드시 제한될 필요는 없다.

본 개시내용의 일부 측면은 폴리뉴클레오티드 또는 벡터로 형질전환된 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 숙주 세포 내에 존재하는 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있거나 또는 염색체외에서 유지될 수 있다. 숙주 세포는 임의의 원핵 또는 진핵 세포, 예컨대 박테리아, 곤충, 진균류, 식물, 동물 또는 인간 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 진균 세포는, 예를 들어 사카로마이에스(Saccharomyces) 속의 것, 특히 에스. 세레비시아에(S. cerevisiae) 종의 것이다. 용어 "원핵"은 항체 또는 상응하는 이뮤노글로불린 쇄의 발현을 위한 DNA 또는 RNA 분자로 형질전환 또는 형질감염될 수 있는 모든 박테리아를 포함한다. 원핵 숙주는 그람 음성, 뿐만 아니라 그람 양성 박테리아, 예컨대, 예를 들어 이. 콜라이(E. coli), 에스. 티피무리움(S. typhimurium), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens) 및 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 포함할 수 있다. 용어 "진핵"은 효모, 고등 식물, 곤충 및 척추동물 세포, 예를 들어 포유동물 세포, 예컨대 NSO 및 CHO 세포를 포함한다. 재조합 생산 절차에 사용되는 숙주에 따라, 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 항체 또는 이뮤노글로불린 쇄는 글리코실화될 수 있거나 또는 비-글리코실화될 수 있다. 항체 또는 상응하는 이뮤노글로불린 쇄는 또한 초기 메티오닌 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 벡터가 적절한 숙주 내로 혼입되면, 숙주는 뉴클레오티드 서열의 고수준 발현에 적합한 조건 하에 유지될 수 있고, 원하는 경우에, 이뮤노글로불린 경쇄, 중쇄, 경쇄/중쇄 이량체 또는 무손상 항체, 항원 결합 단편 또는 다른 이뮤노글로불린 형태의 수집 및 정제가 이어질 수 있으며; 문헌 [Beychok, Cells of Immunoglobulin Synthesis, Academic Press, N.Y., (1979)]을 참조한다. 따라서, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터가 세포 내로 도입되며, 이는 차례로 항체 또는 항원 결합 단편을 생산한다. 추가로, 상기 언급된 숙주 세포를 포함하는 트랜스제닉 동물, 바람직하게는 포유동물이 항체 또는 항체 단편의 대규모 생산에 사용될 수 있다.

형질전환된 숙주 세포는 최적 세포 성장을 달성하기 위한 임의의 적합한 기술을 사용하여 발효기에서 성장되고 배양될 수 있다. 발현되면, 전체 항체, 그의 이량체, 개별 경쇄 및 중쇄, 다른 이뮤노글로불린 형태, 또는 항원 결합 단편은 황산암모늄 침전, 친화도 칼럼, 칼럼 크로마토그래피, 겔 전기영동 등을 포함한 관련 기술분야의 표준 절차에 따라 정제될 수 있으며; 문헌 [Scopes, "Protein Purification", Springer Verlag, N.Y. (1982)]을 참조한다. 이어서, 항체 또는 항원 결합 단편은 성장 배지, 세포 용해물 또는 세포 막 분획으로부터 단리될 수 있다. 예를 들어, 미생물 발현된 항체 또는 항원 결합 단편의 단리 및 정제는 임의의 통상적인 수단, 예컨대, 예를 들어, 정제용 크로마토그래피 분리 및 면역학적 분리 예컨대, 예를 들어 항체의 불변 영역에 대해 지시된 모노클로날 또는 폴리클로날 항체의 사용을 수반하는 것에 의할 수 있다.

본 개시내용의 측면은 모노클로날 항체의 무기한 연장된 공급원를 제공하는 하이브리도마에 관한 것이다. 하이브리도마의 배양물로부터 직접적으로 이뮤노글로불린을 수득하는 것에 대한 대안으로서, 불멸화 하이브리도마 세포가 후속 발현 및/또는 유전자 조작을 위한 재배열된 중쇄 및 경쇄 유전자좌의 공급원로서 사용될 수 있다. 재배열된 항체 유전자는 적절한 mRNA로부터 역전사되어 cDNA를 생산할 수 있다. 일부 실시양태에서, 중쇄 불변 영역은 상이한 이소형의 것으로 교환될 수 있거나 또는 전적으로 제거될 수 있다. 가변 영역은 단일 쇄 Fv 영역을 코딩하도록 연결될 수 있다. 다수의 Fv 영역이 연결되어 1개 초과의 표적에 대한 결합 능력을 부여할 수 있거나, 또는 키메라 중쇄 및 경쇄 조합이 사용될 수 있다. 임의의 적절한 방법이 항체 가변 영역의 클로닝 및 재조합 항체의 생성에 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 적절한 핵산이 수득되어, 표준 재조합 숙주 세포 내로 형질감염될 수 있는 발현 벡터 내로 삽입된다. 다양한 이러한 숙주 세포가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 포유동물 숙주 세포는 효율적인 처리 및 생산에 유리할 수 있다. 이러한 목적에 유용한 전형적인 포유동물 세포주는 CHO 세포, 293 세포 또는 NSO 세포를 포함한다. 변형된 재조합 숙주를 숙주 세포의 성장 및 코딩 서열의 발현에 적절한 배양 조건 하에 배양함으로써 항체 또는 항원 결합 단편의 생산이 착수될 수 있다. 항체 또는 항원 결합 단편은 이들을 배양물로부터 단리함으로써 회수될 수 있다. 발현 시스템은 생성된 항체가 배지 내로 분비되도록 하는 신호 펩티드를 포함하도록 설계될 수 있지만; 세포내 생산도 또한 가능하다.

본 개시내용은 또한 본원에 기재된 항체의 이뮤노글로불린 쇄의 적어도 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 가변 영역은 상기 기재된 하이브리도마 중 어느 하나에 의해 생성된 항체의 가변 영역의 V_H 및/또는 V_L의 적어도 1개의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다.

항체 또는 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 DNA, cDNA, RNA 또는 합성적으로 생산된 DNA 또는 RNA, 또는 이들 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것을 단독으로 또는 조합하여 포함하는 재조합적으로 생산된 키메라 핵산 분자일 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 벡터의 일부이다. 이러한 벡터는 추가 유전자, 예컨대 적합한 숙주 세포에서 적합한 조건 하에 벡터의 선택을 가능하게 하는 마커 유전자를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 원핵 또는 진핵 세포에서의 발현을 가능하게 하는 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된다. 폴리뉴클레오티드의 발현은 폴리뉴클레오티드의 번역가능한 mRNA로의 전사를 포함한다. 진핵 세포, 바람직하게는 포유동물 세포에서의 발현을 보장하는 조절 요소는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 이들은 전사의 개시를 용이하게 하는 조절 서열, 및 임의로 전사의 종결 및 전사체의 안정화를 용이하게 하는 폴리-A 신호를 포함할 수 있다. 추가의 조절 요소는 전사뿐만 아니라 번역 인핸서, 및/또는 자연적으로 회합된 또는 이종의 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 원핵 숙주 세포에서의 발현을 허용하는 가능한 조절 요소는, 예를 들어 이. 콜라이에서의 PL, Lac, Trp 또는 Tac 프로모터를 포함하고, 진핵 숙주 세포에서의 발현을 허용하는 조절 요소의 예는 효모에서의 AOX1 또는 GAL1 프로모터 또는 포유동물 및 다른 동물 세포에서의 CMV-프로모터, SV40-프로모터, RSV-프로모터 (라우스 육종 바이러스), CMV-인핸서, SV40-인핸서 또는 글로빈 인트론이다.

전사 개시를 담당하는 요소 이외에, 이러한 조절 요소는 또한 폴리뉴클레오티드의 하류의 전사 종결 신호, 예컨대 SV40-폴리-A 부위 또는 tk-폴리-A 부위를 포함할 수 있다. 추가로, 사용되는 발현 시스템에 따라, 폴리펩티드를 세포 구획으로 지시하거나 또는 이를 배지 내로 분비할 수 있는 리더 서열이 폴리뉴클레오티드의 코딩 서열에 부가될 수 있고, 이전에 기재되었다. 리더 서열(들)은 적절한 단계에서 번역, 개시 및 종결 서열과 조립되고, 바람직하게는 리더 서열은 번역된 단백질 또는 그의 부분의, 예를 들어 세포외 배지 내로의 분비를 지시할 수 있다. 임의로, 목적하는 특징, 예를 들어 발현된 재조합 생성물의 안정화 또는 단순화된 정제를 부여하는 C- 또는 N-말단 확인 펩티드를 포함한 융합 단백질을 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드 서열이 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 경쇄 및/또는 중쇄의 적어도 가변 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 이뮤노글로불린 쇄 둘 다 또는 단지 하나의 가변 도메인을 코딩할 수 있다. 마찬가지로, 폴리뉴클레오티드는 동일한 프로모터의 제어 하에 있을 수 있거나, 또는 발현에 대해 개별적으로 제어될 수 있다. 추가로, 일부 측면은 항체 또는 항원 결합 단편의 한 이뮤노글로불린 쇄의 가변 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고; 임의로 항체의 다른 이뮤노글로불린 쇄의 가변 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 조합되는, 유전자 조작에서 통상적으로 사용되는 벡터, 특히 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지에 관한 것이다.

일부 실시양태에서, 발현 제어 서열이 진핵 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시킬 수 있는 벡터 내의 진핵 프로모터 시스템으로서 제공되지만, 원핵 숙주에 대한 제어 서열이 또한 사용될 수 있다. 바이러스, 예컨대 레트로바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노-연관 바이러스, 포진 바이러스 또는 소 유두종 바이러스로부터 유래된 발현 벡터는 (예를 들어, 항체 또는 항원 결합 단편을 발현하도록 세포를 조작하기 위해) 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 표적화된 세포 집단 내로 전달하는데 사용될 수 있다. 다양한 적절한 방법이 재조합 바이러스 벡터를 구축하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 및 벡터는 표적 세포로의 전달을 위해 리포솜 내로 재구성될 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터 (예를 들어, 서열 및 발현 제어 서열을 코딩하는 이뮤노글로불린 쇄의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인(들))는 세포 숙주의 유형에 따라 달라지는 적합한 방법에 의해 숙주 세포 내로 전달될 수 있다.

스크리닝 방법은 항체 또는 그의 단편의 목적하는 활성을 평가 또는 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단계는 표적 기능을 억제하는 능력, 예를 들어 잠복 복합체로부터의 성숙/가용성 성장 인자 (예를 들어, TGFβ1)의 방출의 억제에 대해 선택하는 것을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 이러한 단계는 프로TGFβ 복합체가 세포 표면 상에서 발현되는 경우인 활성화시에 배지 (예를 들어, 검정 용액)에서 방출되는 성장 인자의 수준을 측정함으로써 시험 항체 또는 항체들의 억제 활성을 검정하는 세포-기반 효력 검정을 포함한다. 배지/용액 내로 방출된 성장 인자의 수준은, 예를 들어 TGFβ 활성을 측정함으로써 검정될 수 있다. 유용한 세포-기반 효력 검정의 비제한적 예는 본원 실시예 2에 기재되어 있다.

일부 실시양태에서, 바람직한 항체 또는 단편을 스크리닝하는 단계는 세포 표면으로부터 항체-항원 복합체의 내재화 및 후속 제거를 촉진하는 항체 또는 그의 단편에 대해 선택하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단계는 ADCC를 유도하는 항체 또는 그의 단편에 대해 선택하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단계는 생체내에서 목적하는 부위(들) (예를 들어, 세포 유형, 조직 또는 기관)에 축적되는 항체 또는 그의 단편에 대해 선택하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단계는 혈액 뇌 장벽을 가로지르는 능력을 갖는 항체 또는 그의 단편에 대해 선택하는 것을 포함한다. 방법은 안정성, 결합 친화도, 기능성 (예를 들어, 억제 활성, Fc 기능 등), 면역원성, pH 감수성 및 전개가능성 (예를 들어, 높은 용해도, 낮은 자기-회합 등)과 같은 기준에 의해 결정된 바람직한 프로파일을 보유하는 변이체 대응물을 제공하도록 1종 이상의 항체 또는 그의 단편을 최적화하는 단계를 임의로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 항체 또는 단편을 포함하는 조성물을 제조하는 방법은 바람직한 결합 및 기능적 (예를 들어, 억제) 특성을 보유하는 것으로 확인된 항체 또는 항체들의 최적화를 포함할 수 있다. 최적화는 항체 또는 그의 단편의 친화도 성숙을 포함할 수 있다. 추가의 최적화 단계를 수행하여 치료 조성물에 유리한 물리화학적 특성을 제공할 수 있다. 이러한 단계는 개선된 용해도, 자기-응집의 결여, 안정성, pH 감수성, Fc 기능 등을 제공하기 위한 돌연변이유발 또는 조작을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 생성된 최적화된 항체는 바람직하게는 인간 투여에 적합한 완전 인간 항체 또는 인간화 항체이다.

이러한 항체 또는 그의 단편을 포함하는 제약 조성물의 제조 방법은 정제, 제제화, 멸균 여과, 패키징 등의 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어 특정 단계, 예컨대 멸균 여과는 관련 규제 기관, 예컨대 FDA에 의해 제시된 가이드라인에 따라 수행된다. 이러한 조성물은 단일-사용 용기, 예컨대 사전-충전 시린지, 또는 다회-투여량 용기, 예컨대 바이알의 형태로 이용가능하게 될 수 있다.

변형

본 개시내용의 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 효소, 보결분자단, 형광 물질, 발광 물질, 생물발광 물질, 방사성 물질, 양전자 방출 금속, 비방사성 상자성 금속 이온을 포함하나 이에 제한되지는 않는 검출가능한 표지 또는 검출가능한 모이어티, 및 GARP-프로TGFβ1 복합체, LTBP1-프로TGFβ1 복합체, LTBP3-프로TGFβ1 복합체 및/또는 LRRC33-프로TGFβ1 복합체의 검출 및 단리를 위한 친화성 표지로 변형될 수 있다. 검출가능한 물질 또는 모이어티는 본 개시내용의 폴리펩티드에 직접적으로 또는 중간체 (예컨대, 예를 들어, 링커 (예를 들어, 절단가능한 링커))를 통해 간접적으로 적합한 기술을 사용하여 커플링되거나 접합될 수 있다. 적합한 효소의 비제한적 예는 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코스 옥시다제 또는 아세틸콜린에스테라제를 포함하고; 적합한 보결분자단 복합체의 비제한적 예는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴을 포함하고; 적합한 형광 물질의 비제한적 예는 비오틴, 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린을 포함하고; 발광 물질의 예는 루미놀을 포함하고; 생물발광 물질의 비제한적 예는 루시페라제, 루시페린 및 에쿼린을 포함하고; 또한 적합한 방사성 물질의 예는 방사성 금속 이온, 예를 들어 알파-방출체 또는 다른 방사성동위원소, 예컨대, 예를 들어 아이오딘 (131I, 125I, 123I, 121I), 탄소 (14C), 황 (35S), 삼중수소 (3H), 인듐 (115mIn, 113mIn, 112In, 111In), 및 테크네튬 (99Tc, 99mTc), 탈륨 (201Ti), 갈륨 (68Ga, 67Ga), 팔라듐 (103Pd), 몰리브데넘 (99Mo), 크세논 (133Xe), 플루오린 (18F), 153Sm, Lu (177Lu), 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 86R, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 지르코늄 (⁸⁹Zr) 및 주석 (113Sn, 117Sn)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방사성 표지는 ¹¹C, ¹³N, ¹⁵O, ⁶⁸Ga, ¹⁷⁷Lu, ¹⁸F 및 ⁸⁹Zr로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 유용한 표지는 양전자-방출 동위원소이며, 이는 양전자-방출 단층촬영에 의해 검출될 수 있다. 검출가능한 물질은 GARP-프로TGFβ1 복합체, LTBP1-프로TGFβ1 복합체, LTBP3-프로TGFβ1 복합체 및/또는 LRRC33-프로TGFβ1 복합체에 특이적으로 결합하는 본 개시내용의 항체에 직접적으로, 또는 중간체 (예컨대, 예를 들어, 링커)를 통해 간접적으로, 적합한 기술을 사용하여 커플링되거나 접합될 수 있다. 검출가능한 물질에 접합된 본원에 제공된 임의의 항체는 본원에 기재된 것과 같은 임의의 적합한 진단 검정에 사용될 수 있다.

추가로, 본 개시내용의 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 또한 약물로 변형될 수 있다. 약물은 본 개시내용의 폴리펩티드에 직접적으로, 또는 중간체 (예컨대, 예를 들어, 링커 (예를 들어, 절단가능한 링커))를 통해 간접적으로, 적합한 기술을 사용하여 커플링되거나 접합될 수 있다.

표적화제

일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 GARP-프로TGFβ1 복합체, LTBP1-프로TGFβ1 복합체, LTBP3-프로TGFβ1 복합체 및/또는 LRRC33-프로TGFβ1 복합체로부터의 성숙 TGFβ 방출을 조정할 목적으로 대상체 내의 특정한 부위에 본원에 개시된 바와 같은 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 표적화하는 1종 이상의 표적화제의 사용을 포함한다. 예를 들어, LTBP1-프로TGFβ1 및 LTBP3-프로TGFβ1 복합체는 전형적으로 세포외 매트릭스에 국재화된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 항체는 항체를 LTBP-연관 TGFβ1 복합체가 존재하는 부위에 국재화시키기 위한 목적으로 세포외 매트릭스 표적화제에 접합될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 항체의 선택적 표적화는 LTBP1-프로TGFβ1 및 LTBP3-프로TGFβ1 복합체의 선택적 조정으로 이어진다. 일부 실시양태에서, 세포외 매트릭스 표적화제는 헤파린 결합제, 매트릭스 메탈로프로테이나제 결합제, 리실 옥시다제 결합 도메인, 피브릴린-결합제, 히알루론산 결합제 등을 포함한다.

유사하게, GARP-프로TGFβ1 및 LRRC33-프로TGFβ1 복합체는 전형적으로 세포의 표면에 국재화되고 앵커링된다. 전자는 활성화된 FOXP3+ 조절 T 세포 (Treg) 상에서 발현되는 반면, 후자는 특정 골수 세포 및 일부 암 세포, 예컨대 AML 상에서 발현된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 항체는 이들 세포-연관 프로TGFβ1 복합체가 존재하는 부위에 항체를 국재화시키기 위한 목적으로 면역 세포 (예를 들어, Treg 세포, 활성화된 대식세포 등) 결합제에 접합될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 항체의 선택적 표적화는 세포 연관-프로TGFβ1 복합체의 선택적 억제 (예를 들어, 면역 조정의 목적으로, 예를 들어 암의 치료에서의 성숙 TGFβ1의 방출의 선택적 억제)로 이어진다. 이러한 실시양태에서, 면역 세포 표적화제는, 예를 들어 CCL22 및 CXCL12 단백질 또는 그의 단편을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 프로TGFβ1 복합체에 선택적으로 결합하는 제1 부분 및 표적 부위의 성분, 예를 들어 ECM의 성분 (예를 들어, 피브릴린) 또는 Treg 세포의 성분 (예를 들어, CTLA-4)에 선택적으로 결합하는 제2 부분을 갖는 이중특이적 항체가 사용될 수 있다.

본원에 추가로 상술된 바와 같이, 본 발명은 본원에 기재된 것과 같은 이소형-선택적 TGFβ1 억제제가 골수에서 조혈을 촉진하거나 회복시키는데 사용될 수 있다는 것을 고려한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 이러한 억제제 (예를 들어, TGFβ1의 고친화도, 이소형-선택적 억제제)를 포함하는 조성물은 골수에 대해 표적화될 수 있다. 골수 표적화를 달성하는 하나의 방식은 골수 국재화 또는 축적을 우선적으로 표적화하는 특정 담체의 사용이다. 예를 들어, 골수-표적화 특성을 갖는 특정 나노입자-기재 담체, 예를 들어 지질-기재 나노입자 또는 리포솜이 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Sou (2012) "Advanced drug carriers targeting bone marrow", ResearchGate publication 232725109]을 참조한다.

일부 실시양태에서, 표적화제는 면역-강화제, 예컨대 스쿠알렌 및/또는 α-토코페롤을 포함하는 아주반트 및 TLR 리간드/효능제 (예컨대 TLR3 리간드/효능제)를 포함하는 아주반트를 포함한다. 예를 들어, 스쿠알렌-함유 아주반트는 숙주 면역을 부스팅하기 위해 프라이밍, 항원 프로세싱 및/또는 면역 세포 분화를 강화하도록 특정 면역 세포, 예컨대 단핵구, 대식세포 및 항원-제시 세포를 우선적으로 표적화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 아주반트는 T 세포 활성화를 위해 네오-에피토프에 대한 숙주 면역 반응을 자극할 수 있다.

치료 표적 및 생체내 작용 메카니즘

따라서, 본원에 개시된 고친화도, 이소형-선택적 TGFβ1 억제제는 임의의 적합한 생물학적 시스템, 예컨대 시험관내, 생체외 및/또는 생체내 시스템에서 TGFβ1을 억제하는데 사용될 수 있다. 관련 방법은 생물학적 시스템을 TGFβ1 억제제와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 생물학적 시스템은 검정 시스템, 생물학적 샘플, 세포 배양물 등일 수 있다. 일부 경우에, 이들 방법은 생물학적 시스템에서 유리 성장 인자의 수준을 조절하는 것을 포함한다.

따라서, 이러한 제약 조성물 및 제제는 생체내에서 억제제에 의해 접근가능한 TGFβ-함유 잠복 복합체를 표적화하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체는 잠복 복합체에 선제적으로 결합하여 성장 인자가 방출되는 것을 방지하는 질환 부위 (예를 들어, TME)에서 하기 복합체를 표적화하는 것을 목표로 한다: i) GARP에 의해 제시된 프로TGFβ1; ii) LRRC33에 의해 제시된 프로TGFβ1; iii) LTBP1에 의해 제시된 프로TGFβ1; 및 iv) LTBP3에 의해 제시된 프로TGFβ1. 전형적으로, 상기 복합체 (i) 및 (ii)는 GARP 및 LRRC33 둘 다가 LRRC33을 발현하는 세포의 세포외 면 상에 잠복 프로TGFβ1을 앵커링 또는 테더링할 수 있는 막횡단 단백질이기 때문에 세포 표면 상에 존재하며, 한편 복합체 (iii) 및 (iv)는 세포외 매트릭스의 성분이다. 이러한 방식으로, 본원에 구현된 억제제는 억제 효과를 발휘하기 위해 내인성 고친화도 수용체와의 완전한 결합을 필요로 하지 않는다. 더욱이, 리간드/수용체 상호작용의 상류를 표적화하는 것은 이러한 표적 접근성의 범위가 잠복 복합체로부터 방출된 후에만 일시적인 가용성 성장 인자를 표적화하는 통상적인 억제제보다 더 길고 관련 조직에 더 국재화되기 때문에 보다 지속적인 효과를 가능하게 할 수 있다. 따라서, 특정 함요에 테더링된 잠복 복합체를 표적화하는 것은, 가용성 (유리) 성장 인자로서 그의 짧은 반감기 동안, 예를 들어 잠복 복합체로부터 방출되었을 때 ~2분 동안 내인성 수용체와 경쟁 결합해야 하는 통상적인 중화 항체와 비교하여, 생체내에서 개선된 표적 결속을 용이하게 할 수 있다.

다수의 연구가 TGFβ1 활성화의 메카니즘을 밝혀냈다. 3종의 인테그린인 αVβ6, αVβ8 및 αVβ1이 잠복 TGFβ1의 주요 활성화제인 것으로 입증되었다 (Reed, N.I., et al., Sci Transl Med, 2015. 7(288): p. 288ra79; Travis, M.A. and D. Sheppard, Annu Rev Immunol, 2014. 32: p. 51-82; Munger, J.S., et al., Cell, 1999. 96(3): p. 319-28). αV 인테그린은 TGFβ1 및 TGFβ1 LAP에 존재하는 RGD 서열에 고친화도로 결합한다 (Dong, X., et al., Nat Struct Mol Biol, 2014. 21(12): p. 1091-6). 인테그린 결합을 방지하지만 분비는 방지하지 않는 TGFβ1 RGD 부위 내의 돌연변이를 갖는 트랜스제닉 마우스는 TGFβ1-/- 마우스로 표현형모사된다 (Yang, Z., et al., J Cell Biol, 2007. 176(6): p. 787-93). β6 및 β8 인테그린 둘 다가 결여된 마우스는 다기관 염증 및 구개열을 포함한, TGFβ1 및 TGFβ3 녹아웃 마우스의 모든 본질적인 표현형을 재현하여, 발생 및 항상성에서 TGFβ1 활성화에 대한 이들 2종의 인테그린의 본질적인 역할을 확인시켜 준다 (Aluwihare, P., et al., J Cell Sci, 2009. 122(Pt 2): p. 227-32). 잠복 TGFβ1의 인테그린-의존성 활성화에 대한 핵심은 제시 분자에 대한 공유 테더이고; 돌연변이유발에 의한 GARP와 TGFβ1 LAP 사이의 디술피드 결합의 파괴는 복합체 형성을 손상시키지 않지만, αVβ6에 의한 TGFβ1 활성화를 완전히 폐지한다 (Wang, R., et al., Mol Biol Cell, 2012. 23(6): p. 1129-39). 잠복 TGFβ1의 최근 구조 연구는 인테그린이 어떻게 잠복 복합체로부터의 활성 TGFβ1의 방출을 가능하게 하는지를 조명한다: 잠복 TGFβ1의 그의 제시 분자에 대한 공유 연결은 잠복 TGFβ1을, LTBP를 통해 ECM에, 또는 GARP 또는 LRRC33을 통해 세포골격에 앵커링시킨다. RGD 서열에 대한 인테그린 결합은 LAP 구조의 힘-의존성 변화를 유발하여, 활성 TGFβ1이 방출되고 근처 수용체에 결합하도록 한다 (Shi, M., et al., Nature, 2011. 474(7351): p. 343-9). 질환에서의 인테그린-의존성 TGFβ1 활성화의 중요성이 또한 잘 검증되었다. αVβ1의 소분자 억제제는 블레오마이신-유도된 폐 섬유증 및 사염화탄소-유도된 간 섬유증에 대해 보호하고 (Reed, N.I., et al., Sci Transl Med, 2015. 7(288): p. 288ra79), 항체에 의한 αVβ6 차단 또는 인테그린β6 발현의 상실은 블레오마이신-유도된 폐 섬유증 및 방사선-유도된 섬유증을 억제한다 (Munger, J.S., et al., Cell, 1999. 96(3): p. 319-28); Horan, G.S., et al., Am J Respir Crit Care Med, 2008. 177(1): p. 56-65).

인테그린에 추가로, 트롬보스폰딘-1, 및 프로테아제, 예컨대 플라스민, 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMP, 예를 들어 MMP2, MMP9 및 MMP12), 카텝신 D, 칼리크레인, 및 아연 프로테아제의 ADAM 패밀리 (예를 들어, ADAM10, ADAM12 및 ADAM17)에 의한 활성화를 포함한, TGFβ1 활성화의 다른 메카니즘이 연루되었다. 트롬보스폰딘-1의 녹아웃은 일부 조직에서 TGFβ1-/- 표현형의 일부 측면을 재현하지만, TGFβ-의존성인 것으로 공지되어 있는 블레오마이신-유도된 폐 섬유증에서는 보호성이지 않다 (Ezzie, M.E., et al., Am J Respir Cell Mol Biol, 2011. 44(4): p. 556-61). 추가적으로, 후보 프로테아제의 녹아웃은 TGFβ1 표현형을 유발하지 않았다 (Worthington, J.J., J.E. Klementowicz, and M.A. Travis, Trends Biochem Sci, 2011. 36(1): p. 47-54). 이는 중복에 의해 또는 발생 및 항상성보다는 특정 질환에서 중요한 이들 메카니즘에 의해 설명될 수 있다.

따라서, 본원에 기재된 TGFβ1의 고친화도, 이소형-특이적 억제제는 TGFβ1 활성화의 단계를 방지함으로써 작용하는 억제제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 억제제는 TGFβ1의 인테그린-의존성 (예를 들어, 기계적 또는 힘-구동) 활성화를 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 억제제는 TGFβ1의 프로테아제-의존성 또는 프로테아제-유도된 활성화를 억제할 수 있다. 후자는 인테그린-비의존성 방식으로 TGFβ1 활성화 단계를 억제하는 억제제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 억제제는 활성화 방식과 무관하게 TGFβ1 활성화를 억제할 수 있고, 예를 들어 TGFβ1의 인테그린-의존성 활성화 및 프로테아제-의존성 활성화 둘 다를 억제할 수 있다. TGFβ1을 활성화시킬 수 있는 프로테아제의 비제한적 예는 세린 프로테아제, 예컨대 칼리크레인, 케모트립신, 트립신, 엘라스타제, 플라스민, 뿐만 아니라 아연 메탈로프로테아제 (MMP 패밀리), 예컨대 MMP-2, MMP-9 및 MMP-13을 포함한다. 칼리크레인은 혈장-칼리크레인 및 조직 칼리크레인, 예컨대 KLK1, KLK2, KLK3, KLK4, KLK5, KLK6, KLK7, KLK8, KLK9, KLK10, KLK11, KLK12, KLK13, KLK14 및 KLK15를 포함한다. 본원에 제시된 데이터는 시험관내에서 TGFβ1의 칼리크레인-의존성 활성화를 억제할 수 있는 이소형-특이적 TGFβ1 억제제의 예를 입증한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 억제제는 잠복 복합체로부터의 활성 (성숙) TGFβ1 성장 인자의 방출 또는 해리를 방지한다. 일부 실시양태에서, 이러한 억제제는 복합체의 불활성 (예를 들어, 잠복) 입체형태를 안정화시킴으로써 작용할 수 있다. 데이터는 고친화도, 콘텍스트-비의존성 TGFβ1 억제제 (Ab6)가 또한 플라스민-의존성 TGFβ1 활성화를 억제할 수 있다는 것을 추가로 입증한다. 그러나, 놀랍게도, 콘텍스트-편향 TGFβ1 억제제 (Ab3)는 이 과정을 억제하지 못했다. Ab3 및 Ab6 둘 다는 매트릭스-연관 프로TGFβ1 복합체에 대한 유사한 친화도를 갖는다. 그러나, Ab3은 세포-연관 프로TGFβ1 복합체에 대해 유의하게 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 두 카테고리 사이의 상대 차이는 20배 초과이다 ("편향"). 비교하면, Ab6은 항원 복합체의 두 카테고리에 대해 등가의 고친화도를 나타낸다. 하나의 가능한 설명은 관찰된 기능적 차이가 Ab3의 편향 특색으로부터 비롯될 수 있다는 것이다. 또 다른 가능한 설명은 그것이 에피토프 또는 결합 영역의 차이에 의해 매개된다는 것이다.

본 발명은 TGFβ1 기능의 단일 콘텍스트에 제한되지 않는 TGFβ1 신호전달의 다중 생물학적 역할과 연관된 특정 질환에 대한 치료 용도에 특히 유용하다. 이러한 상황에서, 다중 콘텍스트에 걸친 TGFβ1 효과를 억제하는 것이 유익할 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 콘텍스트-특이적 방식보다는 이소형-특이적 방식으로 TGFβ1을 표적화하고 억제하는 방법을 제공한다. 이러한 작용제는 "이소형-특이적, 콘텍스트-비의존성" TGFβ1 조정제로 지칭될 수 있다.

일련의 증거는 많은 질환이 TGFβ 기능의 상이한 효과를 부여하는 이종 세포 유형의 참여를 수반할 가능성이 있는 TGFβ 신호전달의 복잡한 교란을 나타내며, 이는 소위 제시 분자와의 그의 상호작용에 의해 매개된다는 개념을 지지한다. 적어도 4종의 이러한 제시 분자가 확인되었으며, 이는 국부 자극에 반응하여 그의 활성화를 가능하게 하기 위해 다양한 세포외 함요에 TGFβ를 "제시" 할 수 있다. 한 카테고리에서, TGFβ는 ECM-연관 TGFβ 활성을 매개하는 ECM-연관 제시 분자, 예컨대 LTBP1 및 LTBP3과 회합되어 ECM 내로 침착된다. 또 다른 카테고리에서, TGFβ는 특정 면역 기능을 매개하는 제시 분자, 예컨대 GARP 및 LRRC33을 통해 면역 세포의 표면 상에 테더링된다. 이들 제시 분자는 상이한 조직 및 세포 유형에서 차등 발현, 국재화 및/또는 기능을 나타내며, 이는 TGFβ 활성화의 촉발 사건 및 결과가 미세환경에 따라 달라질 것임을 나타낸다. 많은 TGFβ 효과가 상호작용하여 질환 진행에 기여할 수 있다는 개념에 기초하여, TGFβ 기능의 다중 면에 길항할 수 있는 치료제는 보다 큰 효능을 제공할 수 있다.

특정 질환 (본원에 추가로 상세하게 기재된 바와 같음)을 치료하기 위한 치료제로서 TGFβ1의 콘텍스트-편향 억제제에 비해 TGFβ1의 콘텍스트-비의존성 억제제의 유리한 사용에 대한 근거는 하기를 포함한다:

본원에 개시된 연구는 질환 환경에서의 이종 TGFβ1 복합체의 관여를 확인하고, 기저 메카니즘의 이해를 확장시켜, 다수의 질환에 대한 개선된 치료 접근법에 대한 통찰을 제공한다.

다양한 질환은 질환의 발병기전 및/또는 진행에 집합적으로 기여하는 TGFβ1의 공급원로서 세포의 이종 집단을 수반하는 것으로 인식되었다. 1종 초과의 유형의 TGFβ1-함유 복합체 ("콘텍스트")는 동일한 질환 미세환경 내에 공존할 가능성이 있다. 특히, 이러한 질환은 TGFβ1 신호전달의 ECM (또는 "매트릭스") 성분 및 TGFβ1 신호전달의 면역 성분 둘 다를 수반할 수 있다. 이러한 상황에서, 단지 단일 TGFβ1 콘텍스트 (예를 들어, 하나의 특정한 유형의 제시 분자와 연관된 TGFβ1)만을 선택적으로 표적화하는 것은 제한된 완화를 제공할 수 있다. 따라서, 광범위 억제 TGFβ1 길항제가 치료 용도에 바람직하다. TGFβ1의 다중 잠복 복합체를 광범위하게 표적화하는 이전에 기재된 억제 항체는 표적 복합체 중에서 편중된 결합 프로파일을 나타냈다. 따라서, 본 발명자들은 그에 연결된 특정한 제시 분자에 상관없이, TGFβ1 활성화를 선택적으로 억제하는 보다 균일한 억제 항체를 확인하는 것을 제시한다. 특히 면역-종양학 적용을 위해, 매트릭스-연관 TGFβ1 및 면역 세포-연관 TGFβ1 둘 다를 강력하게 억제하는 것이 유리한 것으로 추론되었다.

둘째로, 조직/세포 특징에서의 현저한 유사성이 종양 기질과 섬유화 조직 사이에서 관찰되며, 이는 다양한 적응증의 기저를 이루는 공통 메카니즘을 강조한다. i) TGFβ1-의존성 섬유화유발 표현형; ii) TGFβ1-의존성 종양-촉진 표현형; 및 iii) TGFβ-의존성 면역억제 표현형 사이의 및 이들 중에서의 교류를 나타내는 것이 다수의 병리학적 상태에서 관찰되었다. 따라서, 등가의 효력을 갖는 많은 이들 구성성분에 광범위하게 작용하는 콘텍스트-비의존성 억제제의 사용은 다양한 유형의 질환 상태에 걸쳐 최적의 치료 효과를 제공할 수 있다. 예를 들어, 원발성 골수섬유증의 임상 징후는 특정 세포 집단의 비정상적 증식 및 골수에서의 섬유증을 포함한다.

셋째로, 일련의 증거는 TGFβ1이 많은 유형의 암 (암 환자)에서 관찰되는 항암 요법 (예컨대 면역 체크포인트 억제제, 암 백신, 조작된 면역 세포 요법, 화학요법, 방사선 요법 등)에 대한 약물 저항성을 적어도 부분적으로 담당할 수 있다는 가능성을 상승시켰다. 일부 경우에, 이러한 저항성은 환자의 배경에 대해 특정한 암/종양-유형에 고유하게 보인다 (전형적으로 선천성 저항성, 1차 저항성, 고유 저항성 또는 내재 저항성으로 지칭되고; 이들 용어는 본원에서 상호교환가능하게 사용됨). 이러한 저항성은 암 요법, 예컨대 면역 체크포인트 억제제에 불량하게 반응성인 환자의 하위세트에서 나타날 수 있고, 가능하게는 면역-배제된 환경을 반영할 수 있다. 이는 적어도 부분적으로 TGFβ1-의존성 경로에 의해 매개될 가능성이 있다. 따라서, 본원에 기재된 이소형-선택적 억제제는 저항성 암을 이러한 요법에 대해 보다 반응성이게 할 수 있다. 특히, 요법에 대한 저항성이 질환 부위 (예컨대 종양)에서의 면역 배제와 연관된 상황에서, TGFβ1 억제는 면역억제를 비차단하고 이펙터 세포가 그의 표적 (예를 들어, 암 세포)에 접근하도록 할 수 있다. 동일한 작용 메카니즘이 다수의 치료 패러다임에서 적용가능하며, 여기서 요법의 효과는 치료될 질환 또는 손상 조직과 접촉해야 한다. 본 발명의 고친화도, 콘텍스트-비의존성 TGFβ1 억제제는 TGFβ1 기능의 다중 아암, 예를 들어 Treg의 억제, 대식세포의 조정 및 ECM의 조절을 통해 작용함으로써 이러한 과정을 용이하게 하여 약물 저항성을 극복하는 것으로 생각된다.

대안적으로, 저항성은 치료에 대한 물질 임상 반응성을 나타내는 환자가 시간 경과에 따라 불량하게 반응성이 되도록 시간 경과에 따라 발생할 수 있다 (즉, 적응 또는 획득 저항성). 예를 들어, PD-1 요법은 다른 T 세포 항원 (예를 들어, TCR 성분)의 상향조절과 상관관계가 있는 적응 저항성으로 이어질 수 있는 것으로 보고되었으며, 이는 암 세포가 또 다른 메카니즘을 통한 PD-1 차단을 회피하기 위해 진화한다는 것을 시사한다. 후속적으로, 상이한 T 세포 수용체 성분, 예컨대 TIM3을 표적화하는 제2 체크포인트 억제제는 면역요법에 대한 반응성을 회복시킬 수 있다. 이들 관찰은 암 세포의 적응 반응에 대항하는 다중 경로의 차단이 숙주 면역을 회피하는 암 세포의 능력의 가능성을 감소시킬 수 있다는 것을 시사한다. 다중 TGFβ1 콘텍스트를 표적화할 수 있는 TGFβ1의 억제제는 유리하게는 TGFβ1 기능의 다중 지점에서 차단을 제공함으로써 획득 약물 저항성을 피할 수 있다.

그리고 마지막으로, 다양한 제시 분자의 발현이 시간 경과에 따라, 예를 들어 국부 신호 (예를 들어, 시토카인, 케모카인, ECM 환경 등)에 반응하여 및/또는 질환 미세환경의 변화에 의해 달라질 수 있다는 개념에 기초하여, 본원에 기재된 것과 같은 TGFβ1의 이소형-선택적 억제제가 이러한 가소성을 견디는데 사용될 수 있고, 제시 분자의 발현에서 비정상적 변화가 발생할 때에도 광범위하고 지속적인 억제 효과를 제공할 수 있는 것으로 추론된다.

이들 시나리오 중 임의의 것에서, TGFβ1의 콘텍스트-비의존성 억제제는 유리하게는 다양한 제시 분자와 회합된 TGFβ1의 프로/잠복 형태 (이들 모두 또는 이들의 상이한 조합은 질환 미세환경(들)에 존재함)를 표적화하는 것을 목표로 한다. 보다 구체적으로, 한 양식에서, 억제제는 ECM-연관 TGFβ1 (LTBP1/3-TGFβ1 복합체)을 표적화한다. 또 다른 양식에서, 억제제는 면역 세포-연관 TGFβ1을 표적화한다. 이는 GARP-제시된 TGFβ1, 예컨대 Treg 세포 상에서 발현된 GARP-TGFβ1 복합체 및 대식세포 및 다른 골수/림프성 세포 상에서 발현된 LRRC33-TGFβ1 복합체, 뿐만 아니라 특정 암 세포를 포함한다.

이러한 항체는 항체가 다수의 유형의 제시 분자와 연관된 TGFβ1의 활성화 (또는 방출)를 억제할 수 있도록, 콘텍스트-비의존성 방식으로 프로/잠복 TGFβ1 복합체로부터의 성숙 TGFβ1 성장 인자에 결합하고 그의 활성화 (또는 방출)를 방지하는 TGFβ1의 이소형-특이적 억제제를 포함한다. 특히, 본 발명은 ECM-연관 TGFβ1 (LTBP-제시된 및 LTBP3-제시된 복합체) 및 세포-연관 TGFβ1 (GARP-제시된 및 LRRC33-제시된 복합체)을 차단할 수 있는 항체를 제공한다.

다양한 질환 상태가 기여 인자로서 TGFβ 신호전달의 조절이상을 수반하는 것으로 시사되었다. 실제로, 특정 인간 상태의 발병기전 및/또는 진행은 TGFβ1 활성에 의해 주로 구동되거나 그에 의존적인 것으로 보인다. 특히, 많은 이러한 질환 및 장애는 TGFβ1 기능의 ECM 성분 및 면역 성분 둘 다를 수반하며, 이는 다중 콘텍스트에서의 TGFβ1 활성화 (예를 들어, 1종 초과의 유형의 제시 분자에 의해 매개됨)가 수반된다는 것을 시사한다. 더욱이, TGFβ1-반응성 세포 사이에 교류가 존재하는 것으로 고려된다. 일부 경우에, TGFβ1 축의 다면적 활성 사이의 상호작용은 질환 진행, 악화, 및/또는 질환을 퇴치하는 숙주의 능력의 억제로 이어지는 사건의 캐스케이드를 촉발할 수 있다. 예를 들어, 특정 질환 미세환경, 예컨대 종양 미세환경 (TME) 및 섬유화 미세환경 (FME)은 다중의 상이한 제시 분자, 예를 들어 LTBP1-프로TGFβ1, LTBP3-프로TGFβ1, GARP-프로TGFβ1, LRRC33-프로TGFβ1 및 그의 임의의 조합에 의해 제시된 TGFβ1과 연관될 수 있다. 한 콘텍스트의 TGFβ1 활성은 차례로 또 다른 콘텍스트의 TGFβ1 활성을 조절하거나 또는 그에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 조절이상 시에 질환 상태의 악화를 유발할 수 있는 가능성을 상승시킨다. 따라서, TGFβ1 이소형의 억제 효과를 선택적으로 제한하면서 TGFβ1 기능의 다중 모드 (즉, 다중 콘텍스트)에 걸쳐 광범위하게 억제하는 것이 바람직하다. 목표는 상처 치유에서 중요한 역할을 하는 TGFβ3을 포함한 다른 이소형에 의해 매개되는 항상성 TGFβ 신호전달을 교란시키지 않는 것이다.

TGFβ1 활성의 면역 성분은 주로 세포-연관 TGFβ1 (예를 들어, GARP-프로TGFβ1 및 LRRC33-프로TGFβ1)에 의해 매개된다. TGFβ1 기능의 GARP- 및 LRRC33-아암 둘 다는 많은 질환의 진행에 기여하는 면역억제 특색과 연관된다. 따라서, 고친화도, 이소형-선택적 TGFβ1 억제제는 면역억제 세포와 연관된 TGFβ1을 억제하는데 사용될 수 있다. 면역억제 세포는 조절 T-세포 (Treg), M2 대식세포 및 MDSC를 포함한다. 따라서, TGFβ1 억제제는 생체내 질환 부위, 예를 들어 TME 및 FME에서의 면역억제 표현형을 억제하거나 역전시킬 수 있다.

일부 실시양태에서, TGFβ1 억제제는 GARP-TGFβ1 복합체 또는 LRRC33-TGFβ1 복합체를 발현하는 세포와 연관된 TGFβ1을 억제하며, 여기서 임의로 세포는 T-세포, 섬유모세포, 근섬유모세포, 대식세포, 단핵구, 수지상 세포, 항원 제시 세포, 호중구, 골수-유래 억제 세포 (MDSC), 림프구, 비만 세포 또는 소교세포일 수 있다. T-세포는 조절 T 세포 (예를 들어, 면역억제 T 세포)일 수 있다. 호중구는 활성화된 호중구일 수 있다. 대식세포는 섬유화유발 및/또는 종양-연관 대식세포 (TAM), 예를 들어 M2c 하위유형 및 M2d 하위유형 대식세포를 포함한 활성화된 (예를 들어, 분극화된) 대식세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 대식세포는 대식세포에서 암-유도된 표현형을 추가로 유도할 수 있는 종양-유래 인자 (예를 들어, 시토카인, 성장 인자 등)에 노출된다. 일부 실시양태에서, 이러한 종양-유래 인자는 CSF-1/M-CSF이다.

일부 실시양태에서, GARP-TGFβ1 복합체 또는 LRRC33-TGFβ1 복합체를 발현하는 세포는 암 세포, 예를 들어 순환 암 세포 및 종양 세포이다.

표적으로서의 GARP-프로TGFβ1

조절 T 세포 (Treg)는 CD4-양성 T 림프구의 작은 하위세트를 나타내고, 항상성을 유지하기 위해 면역 반응을 약화시키는데 "파괴"로서 작용하는 중요한 역할을 한다. 질환 상태 (예컨대 암)에서, 상승된 수준의 Treg가 보고되고, 이는 보다 불량한 예후와 연관된다. 공여자의 말초 혈액 세포로부터 단리된 인간 Treg는 CD3/CD28 자극에 의해 활성화될 수 있다. Treg 활성화는 GARP-프로TGFβ1 세포 표면 발현의 현저한 증가를 유도하는 것으로 제시된다 (도 26a). 이전에 보고된 바와 같이, Treg는 이펙터 T 세포 (Teff) 증식의 강력한 억제를 포함하는 면역 억제 활성을 발휘한다. 본원에 제시된 바와 같이 (도 26b), 대부분의 Teff가 세포 분열을 겪은 표준 실험 조건 하에, 공동-배양된 Treg는 이를 단순 분획으로 감소시킨다. 그리고 Teff 증식의 이러한 Treg 억제는 Teff와 Treg의 공동-배양물을 TGFβ1의 이소형-선택적 억제제로 처리함으로써 효과적으로 극복될 수 있으며 (즉, 탈억제), 이는 본원에 개시된 이소형-선택적 TGFβ1이 TGFβ1 기능의 GARP-아암을 억제하는데 효과적임을 입증한다. 질환 환경 (예컨대 종양 미세환경 및 섬유화 환경)에서, 이는 Treg-매개 면역억제를 차단하는 이들 억제제의 능력으로 해석될 것이다. 이는 차례로 면역을 부스팅하는 이펙터 T 세포의 증진된 증식으로 이어질 것이다. TGFβ1의 이소형-선택적 억제제의 GARP-아암은 TGFβ1 기능의 이러한 면을 표적화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 조절 T 세포 (Treg)의 억제 활성을 감소시킬 수 있다.

표적으로서의 LRRC33-프로TGFβ1

LRRC33은 선택적 세포 유형, 특히 단핵구 및 대식세포를 포함한 골수 계통의 것에서 발현된다. 단핵구는 골수에서의 전구세포로부터 기원하고 혈류에서 순환하며 말초 조직에 도달한다. 이어서, 순환 단핵구는 시토카인 및 케모카인과 같은 다양한 인자의 패널을 포함하는 국부 환경 (예를 들어, 조직-특이적, 질환-연관 등)에 노출되는 조직 내로 이동하여 단핵구의 대식세포, 수지상 세포 등으로의 분화를 촉발할 수 있다. 이들은, 예를 들어 폐 내의 폐포 대식세포, 골수 내의 파골세포, CNS 내의 소교세포, 결합 조직 내의 조직구, 간 내의 쿠퍼 세포 및 갈색 지방 조직 내의 갈색 지방 조직 대식세포를 포함한다. 고형 종양에서, 침윤된 대식세포는 종양-연관 대식세포 (TAM), 종양-연관 호중구 (TAN) 및 골수-유래 억제 세포 (MDSC) 등일 수 있다. 이러한 대식세포는 활성화된 섬유모세포, 예컨대 암종-연관 (또는 암-연관) 섬유모세포 (CAF) 및/또는 기질을 활성화시키고/거나 그와 연관될 수 있다. 따라서, LRRC33-함유 복합체로부터의 성숙 TGFβ1의 방출을 억제하는 본원에 기재된 TGFβ1 활성화의 억제제는 세포 표면 상에 LRRC33-프로TGFβ1을 발현하는 이들 세포 중 임의의 것을 표적화할 수 있다. 섬유화 미세환경에서, LRRC33-발현 세포는 M2 대식세포, 조직 상주 대식세포 및/또는 MDSC를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, LRRC33-TGFβ1 복합체는 섬유화유발 (M2-유사) 대식세포의 외부 표면에 존재한다. 일부 실시양태에서, 섬유화유발 (M2-유사) 대식세포는 섬유화 미세환경에 존재한다. 일부 실시양태에서, 섬유화유발 (M2-유사) 대식세포의 외부 표면에 있는 LRRC33-TGFβ1 복합체를 표적화하는 것은 오로지 LTBP1-TGFβ1 및/또는 LTBP1-TGFβ1 복합체를 표적화하는 것과 비교하여 우수한 효과를 제공한다. 일부 실시양태에서, M2-유사 대식세포는 차등 표현형을 갖는 다중 하위유형, 예컨대 M2c 및 M2d TAM-유사 대식세포로 추가로 분극화된다. 일부 실시양태에서, 대식세포는 TGFβ1, CCL2 (MCP-1), CCL22, SDF-1/CXCL12, M-CSF(CSF-1), IL-6, IL-8, IL-10, IL-11, CXCR4, VEGF, PDGF, 프로스타글란딘-조정제, 예컨대 아라키돈산 및 시클로옥시게나제-2 (COX-2), 부갑상선 호르몬-관련 단백질 (PTHrP), RUNX2, HIF1α 및 메탈로프로테이나제를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 종양 미세환경에 존재하는 다양한 인자 (예를 들어, 성장 인자, 케모카인, 시토카인 및 ECM-재형성 분자)에 의해 활성화될 수 있다. 이러한 인자 중 1종 이상에 대한 노출은 단핵구/대식세포를 종양-촉진 표현형으로 추가로 유도할 수 있다. 하나의 예를 들자면, 종양에서의 CCL2 및 VEGF 공동-발현은 증가된 TAM 및 불량한 진단과 상관관계가 있는 것으로 밝혀졌다. 차례로, 활성화된 종양-연관 세포는 또한 다른 세포의 종양-촉진 세포, 예를 들어 CAF, TAN, MDSC 등으로의 동원 및/또는 분화를 용이하게 할 수 있다. 기질 세포는 또한 대식세포 활성화에 반응하고 ECM 재형성, 및 궁극적으로 혈관화, 침습 및 전이에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, CCL2는 단핵구 유인제로서 기능할 뿐만 아니라, 활성화된 내피에서 발현되는 ICAM-1에 대한 수용체인 MAC-1을 상향조절함으로써 세포 부착을 촉진한다. 이는 CCL2-의존성 동맥신생 및 암 진행으로 이어질 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 TGFβ1 억제제는 CCL2 신호전달 축을 방해함으로써 동맥신생을 억제하는 방법에 사용될 수 있다.

골수 세포의 하위세트는 M2-분극화된 대식세포 및 골수-유래 억제 세포 (MDSC)를 포함한 세포 표면 LRRC33을 발현하며, 이들 둘 다는 면역억제 표현형을 갖고, 질환 환경 (예를 들어, TME 및 FME)에서 풍부화된다. 골수-유래 순환 단핵구는 세포 표면 LRRC33을 발현하는 것으로 보이지 않는다. LRRC33의 제한적 발현은 이를 특히 매력적인 치료 표적으로 만든다. 문헌에서 이용가능한 대다수의 연구는 암에서 이펙터 T 세포 생물학 (예를 들어, CD8+ 세포독성 세포)에 초점을 맞추었지만, 증가하는 증거 (예컨대 본원에 제시된 데이터)는 질환에서 억제성 골수 세포 집단의 중요한 역할을 지적한다. 중요하게는, 본원에 개시된 고도로 선택적인 TGFβ1 억제 항체는 생체내에서 TGFβ1 기능의 이러한 아암을 표적화할 수 있다. 보다 구체적으로, 본원에 제시된 데이터는 종양-연관 M2 대식세포 및 MDSC가 세포-표면 LRRC33을 발현하며, 질환 진행에 대한 강한 상관관계를 갖는다는 것을 제시한다. 본원에 개시된 고친화도, TGFβ1-선택적 항체는 다중 약리학적 모델에서 종양의 체크포인트 차단 요법 (CBT)에 대한 1차 저항성을 극복할 수 있다. 실제로, 항종양 효능은 종양-연관 대식세포 및 MDSC 수준의 유의한 감소와 일치하며, 이는 TGFβ1 기능의 이러한 면을 표적화하는 것이 치료상 유익한 효과에 기여할 수 있다는 것을 시사한다. 이는 이들 면역억제 세포가 풍부화되어 있는 다른 질환에 적용될 가능성이 있다. 다수의 섬유화 상태는 또한 이들 세포 집단의 상승된 국부 빈도와 연관된다. 따라서, 고친화도, TGFβ1-선택적 항체는 이러한 적응증에서 유사한 생체내 효과를 발휘할 것으로 예상된다.

표적으로서의 LTBP1/3-프로TGFβ1

세포외 매트릭스는 세포, 조직, 기관 및 전신 수준에서의 복잡한 신호전달 사건이 조직화되어 있는 부위이다. ECM의 조절이상은 다수의 병리상태에서 관찰된다. TGFβ1 성장 인자의 저장소는 잠복 프로TGFβ1 복합체의 형태로 ECM에 존재한다. 잠복 프로TGFβ1 복합체는 ECM 성분, LTBP1 및/또는 LTBP3과의 공유 상호작용을 통해 매트릭스에 앵커링된다. 다른 ECM 단백질, 예컨대 피브로넥틴 및 피브릴린 (예를 들어, 피브릴린-1)은 LTBP의 ECM 침착 및 국재화를 매개하는데 중요한 것으로 여겨진다. ECM에 대한 LLC의 표적화는 TGFβ1 활성화 과정에서 필수적인 단계이다. 전부는 아니더라도 대부분의 TGFβ1-관련 적응증은 TGFβ1-의존성인 ECM 기능의 일부 측면을 수반할 가능성이 있기 때문에, 치료제로 고려되는 TGFβ 억제제가 TGFβ1 신호전달의 이러한 풀을 표적화할 수 있어야 한다는 것은 긴요한 것이다. 실제로, 본 개시내용에 따른 TGFβ1의 고친화도, 이소형-선택적 억제제는 인간 LTBP1/3-프로TGFβ1 복합체에 대해 현저하게 높은 친화도 및 효력을 나타낸다. 이들 항체는 그의 활성화-전 상태에서 ECM-국재화된 복합체를 직접적으로 표적화하기 때문에, 이러한 작용 메카니즘은 리간드 결합에 대해 내인성 고친화도 수용체와 경쟁할 필요가 없게 될 것이다. 추가로, 이들 항체의 억제 활성은 증가된 TGFβ1 활성화와 연관된 질환 부위 (예를 들어, ECM 내의 조절이상 함요)에 국재화되기 때문에, 이들 항체는 부작용을 제한하면서 증진된 효능을 달성해야 하는 것으로 고려된다.

일부 실시양태에서, LTBP1-TGFβ1 복합체 또는 LTBP3-TGFβ1 복합체는 세포외 매트릭스의 성분이다. LTBP의 N-말단은 이소펩티드 결합을 통해 ECM에 공유 결합될 수 있으며, 이의 형성은 트랜스글루타미나제에 의해 촉매될 수 있다. ECM의 구조적 완전성은 LTBP-연관 TGFβ1 활성을 매개하는데 중요한 것으로 여겨진다. 예를 들어, 매트릭스의 강성은 TGFβ1 활성화에 유의하게 영향을 미칠 수 있다. 추가로, 피브로넥틴 및/또는 피브릴린을 스캐폴드에 혼입하는 것은 LTBP-매개 TGFβ1 활성화를 유의하게 증가시킬 수 있다. 유사하게, LTBP 검정 (예를 들어, 세포-기반 효력 검정)에서 피브로넥틴 및/또는 피브릴린의 존재는 검정 범위를 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포외 매트릭스는 피브릴린 및/또는 피브로넥틴을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포외 매트릭스는 RGD 모티프를 포함하는 단백질을 포함한다.

따라서, 본원에 제공된 TGFβ1의 고친화도, 이소형-선택적 억제제는 TGFβ1 기능의 각각의 생물학적 콘텍스트, 즉 GARP-아암, LRRC33-아암 및 LTBP1/3-아암의 강력한 억제를 가능하게 한다.

TGFβ1-선택적, 고친화도, 광범위-억제제를 포함하는 요법에 반응할 가능성이 있는 치료 적응증 및/또는 대상체의 선택

본원에 기재된 것과 같은 TGFβ1의 고친화도, 이소형-특이적 억제제가 유리한 치료 이익을 가질 가능성이 있는 적합한 적응증 및/또는 환자 집단의 확인/스크리닝/선택에 관한 다음 3가지 문의가 이루어질 수 있다: i) 질환이 인간에서 다른 이소형에 비해 주로 TGFβ1 이소형에 의해 구동되거나 그에 의존하는지 여부 (또는 적어도 공동-우성인지); ii) 상태 (또는 이환 조직)가 면역억제 표현형과 연관되는지 여부; 및 iii) 질환이 매트릭스-연관 및 세포-연관 TGFβ1 기능 둘 다를 수반하는지 여부.

3종의 공지된 TGFβ 이소형, 즉 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3의 차등 발현은 정상 (건강한; 항상성)뿐만 아니라 다양한 조직에서의 질환 상태 하에 관찰되었다. 그럼에도 불구하고, 이소형 선택성의 개념은 다중 이소형에 걸친 TGFβ의 범-억제를 선호하는 통상적인 접근법에 의해 완전히 활용되거나 또는 강건하게 달성되지 않았다. 더욱이, 이소형의 발현 패턴은 정상 (항상성) 대 비정상 (병리학적) 상태에서뿐만 아니라 환자의 상이한 하위집단에서 차등 조절될 수 있다. 대부분의 전임상 연구는 인간 상태를 재현할 수 있거나 또는 재현하지 않을 수 있는 제한된 수의 동물 모델에서 수행되기 때문에, 이러한 모델을 사용하여 수득된 데이터는 편향되어, 치료제 개발 목적을 위한 번역가능성에 관하여 데이터의 오해석 또는 오해의 결론을 초래할 수 있다.

따라서, 본 발명은 전임상 동물 모델에서의 TGFβ 이소형의 차등 발현이 특정한 약물 후보 (예를 들어, TGFβ1 억제제)의 유효성을 예측하는데, 뿐만 아니라 인간 상태로의 번역가능성에 관하여 전임상 데이터를 해석하는데 고려되어야 한다는 인식을 포함한다.

인간 종양 샘플의 이전 분석은 다양한 유형의 악성종양에 대한 체크포인트 차단 요법 ("CBT")을 포함한 질환 진행 및 치료 반응에 대한 1차 저항성에 대한 중요한 기여자로서 TGFβ 신호전달을 연루시켰다. 문헌에 보고된 연구는 TGFB 유전자 발현이 특히 치료 저항성과 관련될 수 있음을 밝혀내며, 이는 이러한 이소형의 활성이 이들 질환에서 TGFβ 신호전달을 구동시킬 수 있음을 시사한다. 실시예 11에 상술된 바와 같이, 더 캔서 게놈 아틀라스 (TCGA)에서 프로파일링된 대대수의 인간 종양 유형에 걸쳐, TGFB1 발현이 가장 우세한 것으로 보이며, 이는 TGFβ 이소형의 인간 질환 발현 패턴을 보다 밀접하게 재현하는 전임상 모델의 선택이 유익할 수 있다는 것을 시사한다.

본원에 예시된 바와 같이, TGFβ1 및 TGFβ3은 전임상 연구에서 널리 사용되는 특정 뮤린 동계 암 모델 (예를 들어, EMT-6 및 4T1)에서 공동-우성 (유사한 수준으로 공동-발현됨)이다 (도 20d 참조). 대조적으로, 수많은 다른 암 모델 (예를 들어, S91, B16 및 MBT-2)은 많은 인간 종양에서 관찰된 것과 유사하게, 거의 독점적으로 TGFβ1을 발현하며, 여기서 TGFβ1은 TGFβ2/3에 비해 더 빈번하게 우성 이소형인 것으로 보인다 (도 20b 및 20c 참조). 추가로, 항상성 조건 하에 우세하게 발현되는 TGFβ 이소형(들)은 질환-연관 이소형(들)이 아닐 수 있다. 예를 들어, 건강한 래트의 정상 폐 조직에서, 긴장성 TGFβ 신호전달은 주로 TGFβ3에 의해 매개되는 것으로 보인다. 그러나, TGFβ1은 질환 상태, 예컨대 폐 섬유증에서 현저하게 상향조절되는 것으로 보인다. 종합하면, 전제조건은 아니지만, 환자가 반응할 가능성이 있는 적합한 치료제를 선택하기 위해 임상 샘플에서 TGFβ 이소형의 상대 발현을 시험 또는 확인하는 것이 유익할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상대 이소형 발현의 결정은 치료-후 이루어질 수 있다. 이러한 상황에서, TGFβ1 억제 요법에 반응하는 환자의 반응성 (예를 들어, 임상 반응/이익)은 TGFβ 이소형의 상대 발현 수준과 상관관계가 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 사후에 제시된 TGFβ1 이소형의 과다발현은 치료에 대한 보다 큰 반응성과 상관관계가 있다.

본원에 기재된 바와 같이, 이소형-선택적 TGFβ1 억제제는 TGFβ1 이소형이 다른 이소형 (예를 들어, TGFβ1-우성으로 지칭됨)에 비해 우세하게 발현되는 질환의 치료에 특히 유리하다. 예로서, TGFB1 (좌측), TGFB2 (중앙) 및 TGFB3 (우측)의 상대 발현 수준을 갖는 인간 암 임상 샘플의 비제한적 목록이 도 20b 및 20c에 제공된다. 3종의 이소형을 가로지르는 각각의 수평선은 단일 환자를 나타낸다. 알 수 있는 바와 같이, 전체 TGFβ1 발현 (TGFB1)은 많은 종양/암 유형에 걸쳐 대부분의 이들 인간 종양/암에서 다른 2종의 이소형보다 유의하게 더 높으며, 이는 TGFβ1-선택적 억제가 이들 질환 유형에서 유익할 수 있다는 것을 시사한다. 종합하면, 이들 일련의 증거는 TGFβ1 활성의 선택적 억제가 CBT에 대한 1차 저항성을 극복할 수 있다는 개념을 지지한다. 고도로 선택적인 TGFβ1 억제제의 생성은 또한 이러한 접근법이 범-TGFβ 억제에서 관찰되는 주요 안전성 문제를 해결할 것인지 여부의 평가를 가능하게 할 것이며, 이는 그의 치료 유용성의 평가에 중요할 것이다.

그러나, 특정 예외가 주지되어야 한다. 첫째로, 이러한 경향은 질환 유형 내의 특정 개별 환자에서 항상 적용가능한 것은 아니다. 즉, 심지어 전체 TGFβ2/3에 비해 거의 균일하게 TGFβ1 우세를 나타내는 암의 유형에서도, 도 20c에 나타내어진 바와 같이, 이러한 일반적 규칙을 따르지 않는 몇몇 개체가 존재한다. 따라서 소수 하위집단 내에 속하는 환자는 대다수의 환자에 대해 작용하는 방식으로 TGFβ1 이소형-특이적 억제제 요법에 반응하지 않을 수 있다. 둘째로, TGFβ1이 또 다른 이소형과 공동-우성이거나 또는 TGFβ2 및/또는 TGFβ3 발현이 TGFβ1보다 유의하게 더 큰 몇 가지 암 유형이 존재한다. 이들 상황에서, 본원에 기재된 것과 같은 TGFβ1-선택적 억제제는 단독으로 유효하게 사용될 가능성이 없다. 오히려, 다른 이소형(들)을 표적화하는 적합한 추가의 억제제(들)가 함께 사용될 수 있다 (예를 들어, WO 2016/201282 참조). 그러나, 잠재적으로 심각한 독성을 관리하기 위해, 범-TGFβ 억제제, 뿐만 아니라 TGFβ2 및 TGFβ3 둘 다를 길항하는 억제제는 회피되어야 한다.

예를 들어, TGFβ1이 TGFβ3과 공동-우성인 (예를 들어, 유사한 수준으로 공동-발현되는) 질환 (예컨대 특정 유형의 암종 및 육종) 또는 개별 환자에서 (예를 들어, 생검 분석에 의해 제시된 바와 같음), 적합한 치료 요법은 TGFβ1 억제제 및 TGFβ3 억제제 둘 다를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 각각의 억제제는 모든 TGFβ 이소형의 범-억제와 연관된 원치않는 부작용 또는 독성을 회피하기 위해 이소형-선택적 억제제이다. 일부 실시양태에서, 이소형-선택적 억제제 중 하나 또는 둘 다는 TGFβ 이소형 (예를 들어, TGFβ1 및/또는 TGFβ3)의 활성화 단계를 억제한다. 바람직한 실시양태에서, 이소형-선택적 TGFβ1 억제제는 본원에 기재된 것과 같은 고친화도, 콘텍스트-비의존성 활성화 억제제이다. 일부 실시양태에서, 이소형-선택적 TGFβ3 억제제는 프로TGFβ3 복합체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편을 선택하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, TGFβ3의 콘텍스트-비의존성 활성화 억제제이다. 전형적으로, 이러한 방법은 다중 항원 복합체, 예를 들어 LTBP1-프로TGFβ3, LTBP3-프로TGFβ3, GARP-프로TGFβ3 및/또는 LRRC33-프로TGFβ3에 결합하는 능력에 대한 항체 또는 단편의 선택 또는 확인을 추가로 포함한다. 바람직하게는, 이러한 방법은 잠복 복합체로부터의 성장 인자 (TGFβ3)의 방출을 억제하는 능력 (즉, 활성화 억제)에 대한 항체 또는 단편의 선택 또는 확인을 추가로 포함한다.

적합한 치료 요법이 2종의 이소형-선택적 TGFβ 억제제, 예컨대 TGFβ1 및 TGFβ3 (상기 예에서와 같음)을 포함하는 경우에, 이러한 요법은 TGFβ1 및 TGFβ3 억제제 둘 다를 포함하는 단일 제제를 포함할 수 있다. 이러한 제제는, 예를 들어 10-50 mg/mL의 각각의 억제제 및 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제를 함유할 수 있다.

대안적으로, 이러한 요법은 환자 또는 환자 집단에게 투여하기 위한 단일 억제제를 각각 포함하는 2개의 개별 제제의 사용을 포함할 수 있다. 이는 환자 또는 환자 집단으로부터 수집된 1종 이상의 생물학적 샘플에 존재하는 것으로 제시된 2종의 TGFβ 이소형의 상대 발현 수준 (건강한 수준 초과)에 따라 (및 이에 맞추어), 환자 또는 환자 집단에게 투여될 2종의 억제제 투여량의 비를 조정하는데 있어서 추가의 유연성을 제공한다. 예를 들어, TGFβ1-양성, TGFβ3-양성 암/종양 (예컨대 유방암)의 치료에 사용하기 위해, 전자가 후자에 비해 우세한 질환-연관 이소형인 경우에, TGFβ1 억제제는 치료 요법의 일부로서 더 높은 용량 및/또는 더 긴 지속기간으로 사용될 수 있다.

따라서, 개별 환자로부터 수집된 임상 샘플에서 3종의 TGFβ 이소형 (즉, TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3)의 상대 발현 수준을 시험 또는 확인하는 것이 유익하다. 이러한 정보는 개별 환자 또는 환자 집단에서의 특정한 요법의 유효성에 관하여 보다 우수한 예측을 제공할 수 있으며, 이는 임상 반응의 가능성을 증가시키기 위해 적절한 치료 요법 (예를 들어, 개별화/개인화 치료)의 선택을 보장하는 것을 도울 수 있다.

보다 최근에, 본 출원의 발명자들은 체크포인트 억제제 (예를 들어, 항-PD-1 항체)와 함께 사용되는 고친화도, TGFβ1-선택적 억제제 (예를 들어, Ab6)가 유사한 수준에서 TGFβ1 및 TGFβ3 둘 다를 발현하는 것으로 공지된 EMT-6 모델에서 유의한 종양 퇴행을 유발할 수 있다는 예상외의 발견을 하였다. 공동-우성은 RNA 측정 및 ELISA 검정 둘 다에 의해 확인되었다 (도 35 참조). 이러한 관찰은 체크포인트 차단 콘텍스트에서 TGFβ1-양성, TGFβ3-양성 종양에서의 물질 효능을 달성하기 위해 공동-우성 이소형 둘 다가 특이적으로 억제되어야 할 것으로 이전에 가정되었기 때문에 놀라운 것이다. 그러나, 예상외로, TGFβ3-선택적 억제제 없이 TGFβ1-선택적 억제제 단독은 (항-PD-1과 함께) CBT에 대한 1차 저항성을 극복하며 종양 부피를 감소시키고 생존 이익을 증진시키는데 있어서의 생체내 효능을 달성하기에 충분하다 (실시예 18 참조). 특정한 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 이는 TGF3이 종양에서 공동-발현되더라도 TGFβ1이 진정한 질환-구동된 이소형인 것에 기인할 수 있다. 또 다른 가능성은 TGFβ1의 억제가 TGFβ3 하류의 하향조절을 유발한다는 것이다. 또한, 2종의 이소형은 차등 시간적 및/또는 공간적 조절을 받을 수도 있다. 예를 들어, 2종의 이소형은 별개의 세포 또는 조직 구획에 국재화될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 체크포인트 억제제와 함께 사용된 TGFβ1의 강력한 억제제가 면역억제 한계값를 극복하기에 충분할 수 있다는 것이 여전히 가능하다. 따라서, 본 발명은 종양이 TGFβ1+/TGFβ3+인, 종양 퇴행을 촉진하기 위한 TGFβ1 억제제의 용도를 포함한다. 이러한 종양은, 예를 들어 상피 기원의 암, 즉 암종 (예를 들어, 기저 세포 암종, 편평 세포 암종, 신세포 암종, 관 상피내 암종 (DCIS), 침습성 관 암종 및 선암종)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, TGFβ1은 우세하게 질환-연관 이소형인 반면, TGFβ3은 조직, 예컨대 상피에서의 항상성 기능을 지지한다.

특정 종양, 예컨대 다양한 암종은 낮은 돌연변이 부담 종양 (MBT)으로서 특징화될 수 있다. 이러한 종양은 종종 불량하게 면역원성이고, 충분한 T 세포 반응을 도출하지 못한다. 화학요법, 방사선 요법, 암 백신 및/또는 종양용해 바이러스를 포함하는 암 요법은 이러한 종양에서 T 세포 면역을 도출하는데 도움이 될 수 있다. 따라서, 본원에 상술된 TGFβ1 억제 요법은 항종양 효과를 증가시키기 위해 이들 암 요법 중 1종 이상과 함께 사용될 수 있다. 본질적으로, 이러한 조합 요법은 신생-항원을 촉진하고 이펙터 세포가 종양을 공격하는 것을 용이하게 함으로써 "콜드" 종양 (예를 들어, 불량하게 면역원성인 종양)을 "핫" 종양으로 전환시키는 것을 목표로 한다. 이러한 종양의 예는 유방암, 난소암 및 췌장암, 예를 들어 췌장관 선암종 (PDAC)을 포함한다. 따라서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 단편 중 어느 하나 이상은 T 세포 면역을 촉진하는 것을 목표로 하는 암 요법에 의해 감작되는 불량하게 면역원성인 종양 ("콜드 종양")을 치료하는데 사용될 수 있다.

이펙터 T 세포가 종양 부위로부터 떨어져 있는 (따라서 "배제된") 면역-배제된 종양에서, 면역억제 종양 환경은 TGFβ1-의존성 방식으로 매개될 수 있다. 이들은 전형적으로 면역원성인 종양이지만; T 세포는 면역-억제 환경으로 인해 그의 세포독성 효과를 충분히 침윤, 증식 및 도출할 수 없다. 전형적으로, 이러한 종양은 암 요법, 예컨대 CBT에 불량하게 반응성이다. 본원에 제공된 데이터가 시사하는 바와 같이, TGFβ1 억제제를 포함하는 보조 요법은 면역억제 표현형을 극복하여 T 세포 침윤, 증식 및 항종양 기능을 가능하게 함으로써, 이러한 종양을 암 요법, 예컨대 CBT에 보다 반응성이게 할 수 있다.

따라서, 제2 문의는 TGFβ1 억제제 요법으로부터 이익을 얻을 가능성이 있는 면역억제 종양(들)을 갖는 환자의 확인 또는 선택에 관한 것이다. 종양에서의 이펙터 T 세포의 존재 또는 빈도의 정도는 항종양 면역을 나타낸다. 따라서, 종양에서 항종양 세포, 예컨대 CD8+ 세포를 검출하는 것은 환자가 CBT 및/또는 TGFβ1 억제제 요법으로부터 이익을 얻을 수 있는지 여부를 평가하는데 유용한 정보를 제공한다.

검출은 공지된 방법, 예컨대 종양 생검 샘플의 면역조직화학적 분석에 의해 수행될 수 있다. 보다 최근에는, 생체내에서 관심 세포 (예를 들어, 세포독성 T 세포)의 검출을 가능하게 할 비-침습적 영상화 방법이 개발되고 있다. 예를 들어, http://www.imaginab.com/technology/; 문헌 [Tavare et al. (2014) PNAS, 111(3): 1108-1113; Tavare et al. (2015) J Nucl Med 56(8): 1258-1264; Rashidian et al. (2017) J Exp Med 214(8): 2243-2255; Beckford Vera et al. (2018) PLoS ONE 13(3): e0193832; 및 Tavare et al. (2015) Cancer Res 76(1): 73-82]을 참조하며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다. 전형적으로, 검출 모이어티 (예를 들어, 방사성표지)로 조작된 항체 또는 항체-유사 분자는 환자 내로 주입될 수 있고, 이는 이어서 특정한 마커 (예를 들어 CD8+)의 부위로 분포 및 국재화될 것이다. 이러한 방식으로, 종양이 면역-배제된 표현형을 갖는지 여부를 결정하는 것이 가능하다. 종양이 면역-배제된 표현형을 갖는 것으로 결정되는 경우에, 암 요법 (예컨대 CBT) 단독은 종양이 종양 환경 내에서 충분한 세포독성 세포가 결여되기 때문에 효과적이지 않을 수 있다. 본원에 기재된 것과 같은 TGFβ1 억제제를 사용한 부가 요법은 면역-억제를 감소시켜 암 요법-저항성 종양을 암 요법에 보다 반응성이게 할 수 있다.

비-침습적 생체내 영상화 기술은 환자를 진단하고/거나; TGFβ1 억제제 요법으로부터 이익을 얻을 가능성이 있는 환자를 선택 또는 확인하고/거나; 치료시 치료 반응에 대해 환자를 모니터링하는 것을 목적으로 하는 다양한 적합한 방법에 적용될 수 있다. 공지된 세포-표면 마커를 갖는 임의의 세포는 세포 마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 유사한 분자를 사용함으로써 검출/국재화될 수 있다. 전형적으로, 이러한 기술의 사용에 의해 검출될 세포는 면역 세포, 예컨대 세포독성 T 림프구, 조절 T 세포, MDSC, 종양-연관 대식세포, NK 세포, 수지상 세포 및 호중구이다. 이러한 마커를 인식하는 항체 또는 조작된 항체-유사 분자는 검출 모이어티에 커플링될 수 있다.

적합한 면역 세포 마커의 비제한적 예는 단핵구 마커, 대식세포 마커 (예를 들어, M1 및/또는 M2 대식세포 마커), CTL 마커, 억제성 면역 세포 마커, MDSC 마커 (예를 들어, G- 및/또는 M-MDSC에 대한 마커), 예컨대 비제한적으로: CD8, CD3, CD4, CD11b, CD163, CD206, CD68, CD14, CD15, CD66, CD34, CD25 및 CD47를 포함한다.

일부 실시양태에서, 생체내 영상화는 T 세포 추적, 예컨대 세포독성 CD8-양성 T 세포를 포함한다. 따라서, 본 개시내용의 TGFβ1의 고친화도, 이소형-선택적 억제제 중 어느 하나는 고형 종양을 갖는 대상체에서의 암의 치료에 사용될 수 있으며, 여기서 치료는 i) 대상체에서 T 세포를 검출하기 위해 생체내 영상화 분석을 수행하는 것을 포함하고, 여기서 임의로 T 세포는 CD8+ T 세포이고, 고형 종양이 단계 (i)의 생체내 영상화 분석에 기초하여 면역-배제된 고형 종양인 것으로 결정된 경우에, 대상체에게 치료 유효량의 TGFβ1의 고친화도, 이소형-선택적 억제제를 투여한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 CBT를 받으며, 여기서 임의로 고형 종양은 CBT에 대해 저항성이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 조합 요법으로서 TGFβ1 억제제와 함께 CBT를 투여받는다. 조합은 체크포인트 억제제 및 TGFβ1 억제제 둘 다를 포함하는 단일 제제의 투여를 포함할 수 있다. 대안적으로, 조합 요법은 체크포인트 억제제를 포함하는 제1 제제 및 TGFβ1 억제제를 포함하는 제2 제제의 투여를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 생체내 영상화는 MDSC 추적, 예컨대 G-MDSC (PMN-MDSC로도 공지됨) 및 M-MDSC를 포함한다. 예를 들어, MDSC는 기준선에서 질환 부위 (예컨대 섬유화 조직 및 고형 종양)에서 풍부화될 수 있다. 요법 (예를 들어, TGFβ1 억제제 요법)시, 표지 (예컨대 방사성동위원소 및 형광)의 감소된 강도에 의해 측정시, 보다 적은 MDSC가 관찰될 수 있으며, 이는 치료 효과를 나타낸다.

일부 실시양태에서, 생체내 영상화는 LRRC33-양성 세포의 추적 또는 국재화를 포함한다. LRRC33-양성 세포는, 예를 들어 MDSC 및 활성화된 M2-유사 대식세포 (예를 들어, 섬유화 조직과 연관된 TAM 및 활성화된 대식세포)를 포함한다. 예를 들어, LRRC33-양성 세포는 기준선에서 질환 부위 (예컨대 섬유화 조직 및 고형 종양)에서 풍부화될 수 있다. 요법 (예를 들어, TGFβ1 억제제 요법) 시, 표지 (예컨대 방사성동위원소 및 형광)의 감소된 강도에 의해 측정시, 세포 표면 LRRC33을 발현하는 보다 적은 세포가 관찰될 수 있으며, 이는 치료 효과를 나타낸다.

일부 실시양태에서, 생체내 영상화는 관심 표적 (예를 들어, 표지된 시약에 의해 결합될 수 있는 분자 또는 실체, 예컨대 적절한 마커(들)를 발현하는 세포 및 조직)을 검출하기 위해 PET-SPECT, MRI 및/또는 광학 형광/생물발광의 사용을 포함한다.

일부 실시양태에서, 항체 또는 항체-유사 분자를 검출 모이어티로 표지하는 것은 직접 표지 또는 간접 표지를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 검출 모이어티는 추적자일 수 있다. 일부 실시양태에서, 추적자는 방사성동위원소일 수 있으며, 여기서 임의로 방사성동위원소는 양전자-방출 동위원소일 수 있다. 일부 실시양태에서, 방사성동위원소는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: ¹⁸F, ¹¹C, ¹³N, ¹⁵O, ⁶⁸Ga, ¹⁷⁷Lu, ¹⁸F 및 ⁸⁹Zr.

따라서, 이러한 방법은 면역-PET에서 표지된 항체를 사용하여 생체내 영상화를 수행하는데 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 이러한 생체내 영상화는 대상체에서 TGFβ1 억제 요법에 대한 치료 반응을 모니터링하기 위해 수행된다. 예를 들어, 치료 반응은 면역 배제 종양의 염증발생 종양으로의 전환을 포함할 수 있으며, 이는 종양 내로의 증가된 면역 세포 침윤과 상관관계가 있다. 이는 증가된 종양내 면역 세포 빈도 또는 검출 신호의 정도, 예컨대 방사성표지 및 형광에 의해 가시화될 수 있다.

따라서, 본 발명은 하기 단계를 포함할 수 있는, 암을 치료하는 방법을 포함한다: i) 고형 종양을 포함하는 암으로 진단된 환자를 선택하는 단계이며, 여기서 고형 종양은 면역 배제된 종양이거나 또는 면역 배제된 종양인 것으로 의심되는 것인 단계; 및 ii) 환자에게 본원에 포괄된 항체 또는 단편을 암을 치료하는데 효과적인 양으로 투여하는 단계. 일부 실시양태에서, 환자는 암 요법, 예컨대 면역 체크포인트 억제 요법 (예를 들어, PD-(L)1 항체), 화학요법, 방사선 요법, 조작된 면역 세포 요법 및 암 백신 요법을 받았거나 또는 받기 위한 후보이다. 일부 실시양태에서, 선택 단계 (i)은 면역 세포 또는 그의 1종 이상의 마커의 검출을 포함하며, 여기서 임의로 검출은 종양 생검 분석, 혈청 마커 분석 및/또는 생체내 영상화를 포함한다.

일부 실시양태에서, 환자는 CBT가 승인된 암으로 진단되며, 여기서 임의로 특정한 암을 갖는 통계적으로 유사한 환자 집단은 승인된 CBT에 대해, 예를 들어 25% 미만의 비교적 낮은 반응률을 나타낸다. 예를 들어, CBT에 대한 반응률은 약 10-25%, 예를 들어 약 10-15%일 수 있다. 이러한 암은, 예를 들어 난소암, 위암 및 삼중-음성 유방암을 포함할 수 있다. 본 개시내용의 고친화도, 이소형-선택적 TGFβ1 억제제는 대상체가 아직 CBT를 받지 않은 이러한 암의 치료에 사용될 수 있다. TGFβ1 억제제는 CBT와 조합되어 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 추가의 암 요법, 예컨대 화학요법 및 방사선 요법을 받을 수 있거나 또는 받았을 수 있다.

상기 기재된 생체내 영상화 기술은 TGFβ1-연관 질환, 예컨대 암 및 섬유증으로 진단된 환자에서 특정 MDSC를 검출, 국재화 및/또는 추적하는데 사용될 수 있다. 건강한 개체는 순환에서 MDSC를 전혀 갖지 않거나 낮은 빈도로 갖는다. 이러한 질환의 발병 또는 진행으로, 순환 및/또는 질환-국재화된 MDSC의 상승된 수준이 검출될 수 있다. 예를 들어, CCR2-양성 M-MDSC는 염증을 갖는 조직에 축적되는 것으로 보고되었고, 조직에서의 섬유증 (예컨대 폐 섬유증)의 진행을 유발할 수 있으며, 이는 TGFβ1 발현과 상관관계가 있는 것으로 제시된다. 유사하게, MDSC는 다수의 고형 종양 (삼중-음성 유방암 포함)이 풍부화되어 있고, 부분적으로 TME의 면역억제 표현형에 기여한다. 따라서, 본 개시내용에 따른 TGFβ1 억제 요법에 대한 치료 반응은 MDSC를 국재화하거나 추적함으로써 모니터링될 수 있다. 검출가능한 MDSC의 감소 또는 낮은 빈도는 전형적으로 치료 이익 또는 보다 우수한 예후를 나타낸다.

따라서, TGFβ1 활성화의 고친화도, 콘텍스트-비의존성 억제제가 대상체에서의 암의 치료에 사용될 수 있으며, 여기서 암은 면역 억제를 특징으로 하고, 여기서 암은 임의로 TGFβ1-양성 및 TGFβ3-양성인 고형 종양을 포함한다. 이러한 대상체는 암종으로 진단될 수 있다. 일부 실시양태에서, 암종은 유방 암종이며, 여기서 임의로 유방 암종은 삼중-음성 유방암 (TNBC)이다. 이러한 치료는 비제한적으로 화학요법, 방사선 요법, 암 백신, 조작된 면역 세포 요법 (예컨대 CAR-T), 및 면역 체크포인트 차단 요법, 예컨대 항-PD(L)-1 항체를 포함한 암 요법을 추가로 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 소수의 이펙터 세포가 존재하거나 또는 불량하게 면역원성인 것을 특징으로 하는 암 유형인 것으로 공지된 콜드 종양이 확인된다. 이러한 종양을 갖는 대상체/환자는 종양 항원 (예를 들어, 신생-항원)에 대한 보다 강한 T 세포 반응을 도출하기 위해 면역-감작 암 요법, 예컨대 화학요법, 방사선 요법, 종양용해 바이러스 요법 및 암 백신으로 치료된다. 이 단계는 콜드 종양을 "면역 배제" 종양으로 전환시킬 수 있다. 대상체는 임의로 CBT, 예컨대 항-PD-(L)1을 추가로 받는다. 대상체는 TGFβ1 억제제, 예컨대 본원에 개시된 항체로 추가로 치료된다. 이는 콜드 또는 면역 배제 종양을 "염증발생" 또는 "핫" 종양으로 전환시킬 수 있으며, 이는 면역요법에 대한 반응성을 부여한다. 불량하게 면역원성인 암의 비제한적 예는 유방암 (예컨대 TNBC), 전립선암 (예컨대 거세 저항성 전립선암 (CRPC)) 및 췌장암 (예컨대 췌장 선암종 (PDAC))을 포함한다.

도 5b에 제시된 바와 같이, 본 발명의 TGFβ1의 고친화도, 이소형-선택적 억제제, 예컨대 Ab6은 TGFβ1의 플라스민-유도된 활성화를 억제할 수 있다. 플라스민-플라스미노겐 축은 다양한 암 유형, 특히 암종, 예컨대 유방암의 특정 종양발생, 침습 및/또는 전이에 연루되었다. 따라서, 본원에 기재된 것과 같은 TGFβ1의 고친화도, 이소형-선택적 억제제는 상피를 침범하는 종양 또는 종양 모델, 예컨대 EMT6에서 이러한 메카니즘을 통해 억제 효과를 발휘할 수 있는 것이 가능하다. 실제로, 상피의 플라스민-의존성 파괴 또는 재형성은 상피 손상 및 암종의 침습/전파를 수반하는 상태의 발병기전에 기여할 수 있다. 후자는 상피-중간엽 이행 ("EMT")에 의해 촉발될 수 있다. 플라스미노겐 활성화 및 플라스미노겐-의존성 침습은 상피-유사 세포에서 보다 현저하였고, 부분적으로 S100A10 및 PAI-1의 발현에 의해 좌우된 것으로 보고되었다 (Bydoun et al. (2018) Scientific Reports, 8:14091).

본 발명은 이소형-특이적, 콘텍스트-비의존성 TGFβ1 억제제를 포함하는 요법에 반응할 가능성이 있는 환자 집단 또는 대상체를 선택하는 방법을 포함한다. 이러한 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다: 대상체로부터 수집된 생물학적 샘플 (예를 들어, 임상 샘플)을 제공하는 단계, 샘플 내의 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3의 상대 수준을 결정 (예를 들어, 측정 또는 검정) 하는 단계, 및 TGFβ1이 TGFβ2 및 TGFβ3에 비해 우세한 이소형인 경우에; 및/또는 TGFβ1이 대조군과 비교하여 유의하게 과다발현되거나 상향조절되는 경우에, 대상체에게 이소형-특이적, 콘텍스트-비의존성 TGFβ1 억제제를 포함하는 조성물을 투여하는 단계. 일부 실시양태에서, 이러한 방법은 하기 단계를 포함한다: 이전에 결정된 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3의 상대 발현 수준에 대한 정보를 수득하는 단계; TGFβ1-양성, 바람직하게는 TGFβ1-우성 질환을 갖는 대상체를 확인하는 단계; 및 대상체에게 이소형-특이적, 콘텍스트-비의존성 TGFβ1 억제제를 포함하는 조성물을 투여하는 단계. 일부 실시양태에서, 이러한 대상체는 요법 (예컨대 암 요법)에 대 해 저항성이 있는 질환 (예컨대 암)을 갖는다. 일부 실시양태에서, 이러한 대상체는 요법에 대해 불내성을 나타내고, 따라서 요법을 중단하거나 중단할 가능성이 있다. 치료 요법에 대한 TGFβ1 억제제의 부가는 제1 요법의 투여량을 감소시키도록 할 수 있고, 여전히 조합된 임상 이익을 달성할 수 있다. 일부 실시양태에서, TGFβ1 억제제는 수술에 대한 필요를 지연시키거나 감소시킬 수 있다.

이소형의 상대 수준은 관련 기술분야에 널리 공지된 RNA-기반 검정 및/또는 단백질-기반 검정에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여 단계는 또한 또 다른 요법, 예컨대 면역 체크포인트 억제제 또는 본원의 다른 곳에 제공된 다른 작용제를 포함할 수 있다. 이러한 방법은 임의로 2개 이상의 시점에서 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3의 상대 수준의 변화를 모니터링함으로써 치료 반응을 평가하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 임상 샘플 (예컨대 생검)은 투여 전 및 후 둘 다에 수집된다. 일부 실시양태에서, 임상 샘플 (예컨대 생검)은 시간 경과에 따른 생체내 효과를 평가하기 위해 치료 후 다수회 수집된다.

상기 문의에 추가로, 제3 문의는 특정한 질환에 수반되는 TGFβ1 기능의 폭을 조사한다. 이는 TGFβ1 콘텍스트의 수, 즉 제시 분자(들)가 질환-연관 TGFβ1 기능을 매개하는 것의 수에 의해 나타내어질 수 있다. TGFβ1-특이적, 넓은-콘텍스트 억제제, 예컨대 콘텍스트-비의존성 억제제는 TGFβ1 기능의 ECM 성분 및 면역 성분 둘 다를 수반하는 질환의 치료에 유리하다. 이러한 질환은 ECM에서의 조절이상뿐만 아니라 면역 세포 기능 또는 면역 반응의 교란과 연관될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 TGFβ1 억제제는 ECM-연관 TGFβ1(예를 들어, LTBP1 또는 LTBP3에 의해 제시됨)뿐만 아니라 면역 세포-연관 TGFβ1 (예를 들어, GARP 또는 LRRC33에 의해 제시됨)을 표적화할 수 있다. 이러한 억제제는 치료 표적 (예를 들어, "콘텍스트-비의존성" 억제제): GARP-연관 프로/잠복 TGFβ1; LRRC33-연관 프로/잠복 TGFβ1; LTBP1-연관 프로/잠복 TGFβ1; 및 LTBP3-연관 프로/잠복 TGFβ1 모든 4종을 억제하여 이들 콘텍스트에서 TGFβ1 기능을 광범위하게 억제한다.

환자의 특정한 상태가 TGFβ1 기능의 다중 측면을 수반하는지 또는 그에 의해 구동되는지 여부는 환자로부터 수집된 임상 샘플에서 제시 분자의 발현 프로파일을 평가함으로써 평가될 수 있다. 발현 프로파일을 수득하기 위해 수행될 수 있는 RNA-기반 검정 및 단백질-기반 검정을 포함한 다양한 검정이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 샘플(들) 내의 LTBP1, LTBP3, GARP 및 LRRC33의 상대 발현 수준 (및/또는 그의 변화/변경)은 상태와 연관된 TGFβ1 활성의 공급원 및/또는 콘텍스트를 나타낼 수 있다. 예를 들어, 고형 종양으로부터 취해진 생검 샘플은 모든 4종의 제시 분자의 높은 발현을 나타낼 수 있다. 예를 들어, LTBP1 및 LTBP3은 종양 기질 내의 CAF에서 고도로 발현될 수 있는 반면, GARP 및 LRRC33은 종양-연관 면역 세포, 예컨대 각각 Treg 및 백혈구 침윤물에 의해 고도로 발현될 수 있다.

따라서, 본 발명은 질환에서 TGFβ2 및 TGFβ3에 비해 TGFβ1의 관여를 결정 (예를 들어, 시험 또는 확인)하는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 하기 단계를 추가로 포함한다: 질환-연관 TGFβ1의 공급원 (또는 콘텍스트)를 확인하는 단계. 일부 실시양태에서, 공급원/콘텍스트는 환자로부터 취해진 임상 샘플에서 TGFβ 제시 분자, 예를 들어 LTBP1, LTBP3, GARP 및 LRRC33의 발현을 결정함으로써 평가된다. 일부 실시양태에서, 이러한 방법은 사후에 수행된다.

LRRC33-양성 세포와 관련하여, 본 개시내용의 출원인은 LRRC33의 RNA 발현과 단백질 발현 사이에 유의차가 있을 수 있다는 것을 인식하였다. 특히, 선택된 세포 유형이 RNA 수준에서 LRRC33을 발현하는 것으로 보이지만, 단지 이러한 세포의 하위세트만이 세포-표면 상에 LRRC33 단백질을 발현한다. LRRC33 발현은, 예를 들어 형질 막 삽입 및 신속한 내재화의 관점에서 단백질 트래픽킹/국재화를 통해 고도로 조절될 수 있는 것으로 고려된다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, LRRC33 단백질 발현은, 예를 들어 활성화된/M2-유사 대식세포 및 MDSC가 풍부화된 이환 조직 (예컨대 종양 및 섬유화 조직)과 연관된 마커로서 사용될 수 있다.

TGFβ1-관련 적응증

TGFβ1-관련 적응증의 일반적 특색

본원에 기재된 것과 같은 이소형-선택적 TGFβ1 억제제는 인간 대상체에서 TGFβ1 조절이상과 연관된 매우 다양한 질환, 장애 및/또는 상태 (즉, "TGFβ1-관련 적응증")를 치료하는데 사용될 수 있다. 본원에 사용된 "TGFβ1 조절이상과 연관된 질환 (장애 또는 상태)" 또는 "TGFβ1-관련 적응증"은 TGFβ1의 발현, 활성 및/또는 대사와 관련된 임의의 질환, 장애 및/또는 상태, 또는 TGFβ1의 활성 및/또는 수준의 억제로부터 이익을 얻을 수 있는 임의의 질환, 장애 및/또는 상태를 의미한다.

따라서, 본 발명은 인간 대상체에서 TGFβ1-관련 적응증을 치료하는 방법에서의 이소형-특이적, 콘텍스트-비의존성 TGFβ1 억제제의 용도를 포함한다. 이러한 억제제는 전형적으로 제약상 허용되는 부형제를 추가로 포함하는 제약 조성물로 제제화된다. 유리하게는, 억제제는 생체내에서 ECM-연관 TGFβ1 및 면역 세포-연관 TGFβ1 둘 다를 표적화하지만 TGFβ2 또는 TGFβ3을 표적화하지는 않는다. 일부 실시양태에서, 억제제는 TGFβ1의 활성화 단계를 억제한다. 질환은 하기 속성 중 적어도 2종에서의 조절이상 또는 장애를 특징으로 할 수 있다: a) 조절 T 세포 (Treg); b) 이펙터 T 세포 (Teff) 증식 또는 기능; c) 골수 세포 증식 또는 분화; d) 단핵구 동원 또는 분화; e) 대식세포 기능; f) 상피-중간엽 이행 (EMT) 및/또는 내피-중간엽 이행 (EndMT); g) 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 마커 유전자에서의 유전자 발현: PAI-1, ACTA2, CCL2, Col1a1, Col3a1, FN-1, CTGF 및 TGFB1; h) ECM 성분 또는 기능; i) 섬유모세포 분화. 이러한 억제제의 치료 유효량은 질환을 앓고 있거나 질환으로 진단된 대상체에게 투여된다.

일부 실시양태에서, 질환은 증가된 콜라겐 I 침착을 나타내는 ECM 성분 또는 기능의 조절이상 또는 장애를 수반한다. 일부 실시양태에서, ECM의 조절이상은 매트릭스의 증가된 강성을 포함한다. 일부 실시양태에서, ECM의 조절이상은 피브로넥틴 및/또는 피브릴린을 수반한다.

일부 실시양태에서, 섬유모세포 분화의 조절이상 또는 장애는 증가된 근섬유모세포 또는 근섬유모세포-유사 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 근섬유모세포 또는 근섬유모세포-유사 세포는 암-연관 섬유모세포 (CAF)이다. 일부 실시양태에서, CAF는 종양 기질과 연관되고, CCL2/MCP-1 및/또는 CXCL12/SDF-1을 생산할 수 있다. 일부 실시양태에서, 근섬유모세포 또는 근섬유모세포-유사 세포는 섬유화 조직에 국재화된다.

일부 실시양태에서, 조절 T 세포의 조절이상 또는 장애는 증가된 Treg 활성을 포함한다.

일부 실시양태에서, 이펙터 T 세포 (Teff) 증식 또는 기능의 조절이상 또는 장애는 억제된 CD4+/CD8+ 세포 증식을 포함한다.

일부 실시양태에서, 골수 세포 증식 또는 분화의 조절이상 또는 장애는 골수 전구 세포의 증가된 증식을 포함한다. 골수 세포의 증가된 증식은 골수에서 발생할 수 있다.

일부 실시양태에서, 단핵구 분화의 조절이상 또는 장애는 질환 부위, 예컨대 섬유화 조직 및/또는 고형 종양에서 골수-유래 및/또는 조직 상주 단핵구의 대식세포로의 증가된 분화를 포함한다.

일부 실시양태에서, 단핵구 동원의 조절이상 또는 장애는 질환 부위, 예컨대 TME 내로의 증가된 골수-유래 단핵구 동원을 포함하며, 이는 증가된 대식세포 분화 및 M2 분극화, 이어서 증가된 TAM으로 이어진다.

일부 실시양태에서, 대식세포 기능의 조절이상 또는 장애는 대식세포의 M2 표현형으로의 증가된 분극화를 포함한다.

일부 실시양태에서, 골수 세포 증식 또는 분화의 조절이상 또는 장애는 증가된 수의 Treg, MDSC 및/또는 TAN을 포함한다.

TGFβ-관련 적응증은 부분적으로 이펙터 면역 세포 (예를 들어, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포)를 배제함으로써 신체의 정상 방어 메카니즘/면역을 억제하는 면역-배제된 질환 미세환경, 예컨대 종양 또는 암성 조직을 포함하는 상태를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 면역-배제 상태는 치료 (예를 들어, 암 요법)에 대한 불량한 반응성과 연관된다. 환자가 불량하게 반응성인 암 요법의 비제한적 예는 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 체크포인트 억제제 요법, 암 백신, 화학요법 및 방사선 요법. 특정한 이론에 얽매이는 것을 의도하지는 않지만, 본원에 기재된 것과 같은 TGFβ 억제제는 T 세포 확장 및/또는 종양 내로의 침윤을 촉진하여 면역 세포 접근, 예를 들어 T 세포 (예를 들어, CD8+ 세포) 및 대식세포 (예를 들어, F4/80+ 세포, M1-분극화된 대식세포) 접근을 회복시킴으로써 항암 면역을 회피 또는 배제하는 종양의 능력에 대응하는 것을 도울 수 있는 것으로 고려된다.

따라서, TGFβ 억제는 이펙터 T 세포 접근 및 세포독성 이펙터 기능을 비차단 및 회복시킴으로써 면역-배제된 질환 환경 (예컨대 TME)에서 치료 저항성 (예를 들어, 면역 체크포인트 저항성, 암 백신 저항성, CAR-T 저항성, 화학요법 저항성, 방사선 요법 저항성 등)을 극복할 수 있다. TGFβ 억제의 이러한 효과는, 예를 들어 CD8+ T 세포에 의해 매개되는 오래 지속되는 면역학적 기억을 추가로 제공할 수 있다.

일부 실시양태에서, 종양은 불량하게 면역원성이다 (예를 들어, "데저트" 또는 "콜드" 종양). 환자는 신생-항원을 촉발하거나 면역 반응을 촉진하는 암 요법으로부터 이익을 얻을 수 있다. 이러한 요법은 화학요법, 방사선 요법, 종양용해 바이러스 요법, 종양용해 펩티드, 티로신 키나제 억제제, 네오-에피토프 백신, 항-CTLA4, 불안정성 유도제, DDR 작용제, NK 세포 활성화제, 및 다양한 아주반트, 예컨대 TLR 리간드/효능제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본원에 기재된 것과 같은 TGFβ1 억제제는 암 요법의 효과를 부스팅하기 위해 함께 사용될 수 있다. TGFβ1 억제제에 대한 하나의 작용 방식은 MHC 발현을 정상화 또는 회복시킴으로써 T 세포 면역을 촉진하는 것일 수 있다.

TGFβ-관련 적응증의 비제한적 예는 다음을 포함한다: 기관 섬유증 (예를 들어, 신장 섬유증, 간 섬유증, 심장/심혈관 섬유증, 근육 섬유증, 피부 섬유증, 자궁 섬유증/자궁내막증 및 폐 섬유증)을 포함한 섬유증, 경피증, 알포트 증후군, 암 (다음을 포함하나 이에 제한되지는 않음: 혈액암, 예컨대 백혈병, 골수섬유증, 다발성 골수종, 결장암, 신암, 유방암, 악성 흑색종, 교모세포종), 고형 종양과 연관된 섬유증 (예를 들어, 암 결합조직형성, 예컨대 결합조직형성 흑색종, 췌장암-연관 결합조직형성 및 유방 암종 결합조직형성), 기질 섬유증 (예를 들어, 유방의 기질 섬유증), 방사선-유도된 섬유증 (예를 들어, 방사선 섬유증 증후군), 화학요법 후 급속 조혈의 촉진, 골 치유, 상처 치유, 치매, 골수섬유증, 골수이형성증 (예를 들어, 골수이형성 증후군 또는 MDS), 신질환 (예를 들어, 말기 신질환 또는 ESRD), 일측성 요관 폐쇄 (UUO), 치아 손실 및/또는 변성, 내피 증식 증후군, 천식 및 알레르기, 위장 장애, 노화 빈혈, 대동맥류, 고아 적응증 (예컨대 마르팡 증후군 및 카무라티-엥겔만 질환), 비만, 당뇨병, 관절염, 다발성 경화증, 근육 이영양증, 골 장애, 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 파킨슨병, 골다공증, 골관절염, 골감소증, 대사 증후군, 영양 장애, 기관 위축, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 및 식욕부진.

증거는 엑토뉴클레오티다제 CD39 및 CD73이 질환 상태에서 아데노신의 상승된 수준에 적어도 부분적으로 기여할 수 있다는 것을 시사한다. 특히, CD39/CD73-TGFβ 축은 Treg 및 MDSC를 포함한 TGFβ 신호전달에 연루된 면역 세포를 조정하는데 있어서 소정 역할을 할 수 있다. 조절 T 세포 (Treg) 및 골수-유래 억제 세포 (MDSC) 둘 다는 일반적으로 면역억제 표현형을 나타낸다. 많은 병리학적 상태 (예를 들어, 암, 섬유증)에서, 이들 세포는 질환 부위에서 풍부하고, 면역억제 환경을 생성 및/또는 유지하는데 기여할 수 있다. 이는 적어도 부분적으로, ATP의 뉴클레오시드 아데노신으로의 분해에 함께 참여하는 엑토뉴클레오티다제 CD39 및 CD73에 의해 매개되어, 질환 환경, 예컨대 종양 미세환경 및 섬유화 환경에서 아데노신의 국부 농도를 상승시킬 수 있다. 아데노신은 표적 세포, 예컨대 T 세포 및 NK 세포 상에서 발현되는 그의 수용체에 결합할 수 있으며, 이는 차례로 이들 표적 세포의 항종양 기능을 억제한다.

이상 유전자 발현을 갖는 질환; 바이오마커

다양한 질환 상태에서 TGFβ1 신호 전달 경로의 비정상적 활성화는 다수의 마커의 변경된 유전자 발현과 연관된 것으로 관찰되었다. 이들 유전자 발현 마커 (예를 들어, mRNA에 의해 측정시)는 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 세르핀 1 (PAI-1을 코딩함), MCP-1 (CCL2로도 공지됨), Col1a1, Col3a1, FN1, TGFB1, CTGF, ACTA2 (α-SMA를 코딩함), SNAI1 (E-카드헤린 (Cdh1)을 하향조절함으로써 섬유증 및 전이에서 EMT를 구동함), MMP2 (EMT와 연관된 매트릭스 메탈로프로테아제), MMP9 (EMT와 연관된 매트릭스 메탈로프로테아제), TIMP1 (EMT와 연관된 매트릭스 메탈로프로테아제), FOXP3 (Treg 유도의 마커), CDH1 (TGFβ에 의해 하향조절되는 E 카드헤린 (상피 세포의 마커)) 및 CDH2 (TGFβ에 의해 상향조절되는 N 카드헤린 (중간엽 세포의 마커)). 흥미롭게도, 이들 유전자 중 다수는 다양한 유형의 기관 섬유증을 포함한 다양한 세트의 질환 상태, 뿐만 아니라 골수섬유증을 포함한 많은 암에서 소정 역할을 하는데 연루된다. 실제로, 섬유화 상태와 비정상적 세포 증식, 종양발생 및 전이 사이의 병리생리학적 연관성이 시사되었다. 예를 들어, 문헌 [Cox and Erler (2014) Clinical Cancer Research 20(14): 3637-43 "Molecular pathways: connecting fibrosis and solid tumor metastasis"; Shiga et al. (2015) Cancers 7:2443-2458 "Cancer-associated fibroblasts: their characteristics and their roles in tumor growth"; Wynn and Barron (2010) Semin. Liver Dis. 30(3): 245-257 "Macrophages: master regulators of inflammation and fibrosis"]을 참조하며, 이들의 내용은 본원에 참조로 포함된다. 특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 본 개시내용의 발명자들은 TGFβ1 신호전달 경로가 실제로 이들 광범위한 병리상태 사이의 주요 연결일 수 있다는 것을 고려한다.

손상 또는 질환 조직으로의 백혈구 동원 (예를 들어, 단핵구/대식세포)을 매개하는 화학주성 시토카인 (또는 케모카인)의 능력은 질환 진행에서 결정적인 결과를 갖는다. C-C 케모카인 패밀리의 구성원, 예컨대 CCL2로도 공지된 단핵구 화학유인물질 단백질 1(MCP-1), CCL3으로도 공지된 대식세포 염증성 단백질 1-알파(MIP-1α), 및 CCL4로도 공지된 MIP-1β, 및 CXCL2로도 공지된 MIP-2α가 이러한 과정에 연루되었다.

예를 들어, MCP-1/CCL2는 섬유증 및 암 둘 다에서 소정 역할을 하는 것으로 생각된다. MCP-1/CCL2는 섬유화유발 케모카인으로서 특징화되고, 단핵구 화학유인물질이며, 증거는 암의 개시 및 진행 둘 다에 수반될 수 있다는 것을 시사한다. 섬유증에서, MCP-1/CCL2는 섬유증의 염증 단계에서 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, MCP-1의 중화는 사구체 초승달형 형성 및 유형 I 콜라겐의 침착의 극적인 감소를 유발하였다. 유사하게, 항-MCP-1 또는 항-MIP-1 알파 항체를 사용한 수동 면역요법은 블레오마이신-챌린지된 마우스에서 단핵 식세포 축적을 유의하게 감소시키는 것으로 제시되며, 이는 MIP-1 알파 및 MCP-1이 폐 염증 반응 동안 백혈구의 동원에 기여한다는 것을 시사한다 (Smith, Biol Signals. 1996 Jul-Aug;5(4):223-31, "Chemotactic cytokines mediate leukocyte recruitment in fibrotic lung disease"). 낭성 섬유증 및 다발성 골수종을 갖는 환자에서의 상승된 수준의 MIP-1알파가 보고되었으며 (예를 들어, 문헌 [Mrugacz et al., J Interferon Cytokine Res. 2007 Jun;27(6):491-5] 참조), 이는 MIP-1α가 국재화된 또는 전신 염증 반응과 연관된다는 개념을 지지한다.

일련의 증거는 종양 진행/전이에서의 C-C 케모카인의 관여를 지적한다. 예를 들어, 종양-유래 MCP-1/CCL2는 대식세포에서 "암-촉진" 표현형을 촉진할 수 있다. 예를 들어, 폐암에서, MCP-1/CCL2는 기질 세포에 의해 생산되고 전이를 촉진하는 것으로 밝혀졌다. 인간 췌장암에서, 종양은 CCL2를 분비하고, 면역억제 CCR2-양성 대식세포는 이들 종양에 침윤한다. 높은 CCL2 발현/낮은 CD8 T-세포 침윤을 나타내는 종양을 갖는 환자는 유의하게 감소된 생존을 갖는다. 특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 손상 또는 이환 조직 환경에 동원되는 단핵구는 후속적으로 국부 신호에 반응하여 (예컨대 종양-유래 시토카인에 반응하여) 분극화되어, 질환 진행에 추가로 기여할 수 있는 것으로 고려된다. 이들 M2-유사 대식세포는 이펙터 세포, 예컨대 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 억제함으로써 면역 회피에 기여할 가능성이 있다. 일부 실시양태에서, 이 과정은 부분적으로 활성화된 대식세포에 의해 발현된 LRRC33-TGFβ1에 의해 매개된다. 일부 실시양태에서, 과정은 부분적으로 Treg에 의해 발현된 GARP-TGFβ1에 의해 매개된다.

유사하게, 특정 암종, 예컨대 유방암 (예를 들어, 삼중 음성 유방암)에서, MDSC의 CXCL2/CCL22-매개 동원은 혈관신생 및 전이를 촉진하는 것으로 밝혀졌다 (예를 들어, 문헌 [Kumar et al. (2018) J Clin Invest 128(11): 5095-5109] 참조). 따라서, 이 과정은 적어도 부분적으로 TGFβ1, 예컨대 LRRC33-TGFβ1에 의해 매개되는 것으로 고려된다. 더욱이, 프로테아제, 예컨대 MMP9가 종양 침습 및 전이에 기여하는 매트릭스 재형성 과정에 연루되기 때문에, 동일하거나 중첩되는 신호전달 경로가 또한 섬유증에서 소정 역할을 할 수 있다.

PAI-1/세르핀1의 관여는 다양한 섬유화 상태, 암, 혈관신생, 염증, 뿐만 아니라 신경변성 질환 (예를 들어, 알츠하이머병)에 연루되었다. 종양 및/또는 혈청에서 PAI-1의 상승된 발현은 다양한 암, 예컨대 유방암 및 방광암 (예를 들어, 이행 세포 암종)뿐만 아니라 골수섬유증에서 불량한 예후 (예를 들어, 보다 짧은 생존, 증가된 전이)와 상관관계가 있다. 섬유화 상태와 관련하여, PAI-1은 TGFβ1-유도된 섬유증의 중요한 하류 이펙터로서 인식되었고, 증가된 PAI-1 발현은 폐 섬유증 (예컨대 IPF), 신장 섬유증, 간 섬유증 및 경피증을 포함한 다양한 형태의 조직 섬유증에서 관찰되었다. 일부 실시양태에서, 과정은 부분적으로 ECM-연관 TGFβ1에 의해, 예를 들어 LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 LTBP3-프로TGFβ1을 통해 매개된다.

일부 실시양태에서, TGFβ1 억제제 요법의 생체내 효과는 적합한 유전자 마커의 발현 수준에서의 변화를 측정함으로써 평가될 수 있다. 적합한 마커는 TGFβ (예를 들어, TGFB1, TGFB2 및 TGFB3)를 포함한다. 적합한 마커는 또한 TGFβ (예를 들어, TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3)에 대한 1종 이상의 제시 분자, 예컨대 LTBP1, LTBP3, GARP (또는 LRRC32) 및 LRRC33을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 적합한 마커는 중간엽 이행 유전자 (예를 들어, AXL, ROR2, WNT5A, LOXL2, TWIST2, TAGLN 및/또는 FAP), 면역억제 유전자 (예를 들어, IL10, VEGFA, VEGFC), 단핵구 및 대식세포 화학주성 유전자 (예를 들어, CCL2, CCL3, CCL4, CCL7, CCL8, CCL13 및 CCL22) 및/또는 본원에 논의된 다양한 섬유화 마커를 포함한다. 바람직한 마커는 혈장/혈청 마커이다.

본원의 실시예에 제시된 바와 같이, 본원에 기재된 TGFβ1의 이소형-특이적, 콘텍스트-비의존성 억제제는 TGFβ1-의존성인 것으로 제시된 기계론적 동물 모델, 예컨대 UUO를 포함한 적합한 전임상 모델에서 많은 이들 마커의 발현 수준을 감소시키는데 사용될 수 있다. 따라서, 이러한 억제제는 질환의 유전자 발현 마커 중 1종 이상의 비정상적 발현 (예를 들어, 과다발현/상향조절 또는 과소발현/하향조절)을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 치료하는데 사용될 수 있다.

따라서, 일부 실시양태에서, TGFβ1의 이소형-특이적, 콘텍스트-비의존성 억제제는 하기: PAI-1 (세르핀1에 의해 코딩됨), MCP-1 (또한 CCL2로도 공지됨), Col1a1, Col3a1, FN1, TGFB1, CTGF, α-SMA, ITGA11 및 ACTA2 중 1종 이상의 과다발현과 연관된 질환의 치료에 사용되며, 여기서 치료는 질환을 앓고 있는 대상체에게 억제제를 질환 치료에 효과적인 양으로 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 억제제는 PAI-1, MCP-1/CCL2, CTGF 및/또는 α-SMA의 과다발현과 연관된 질환을 치료하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 질환은 골수섬유증이다. 일부 실시양태에서, 질환은 암, 예를 들어 고형 종양을 포함하는 암이다. 일부 실시양태에서, 질환은 기관 섬유증, 예를 들어 간 (예를 들어, NASH와 연관됨), 신장, 폐, 근육, 피부 및/또는 심장 또는 심혈관 조직의 섬유증이다.

ECM 및 면역 성분 둘 다의 주요 면을 제어하는데 있어서 TGFβ1 경로의 관여는 현저한 수의 조절이상 유전자가 광범위한 병리상태, 예컨대 증식성 장애 및 섬유화 장애에 걸쳐 공유된다는 관찰을 설명할 수 있다. 이는 TGFβ1 신호전달을 수반하는 유전자에서의 이상 발현 패턴이 일반화가능한 현상일 가능성이 있다는 개념을 지지한다. 이들 마커 유전자는 다음과 같은 여러 카테고리로 분류될 수 있다: 중간엽 이행에 수반되는 유전자 (예를 들어, EndMT 및 EMT); 혈관신생에 수반되는 유전자; 저산소증에 수반되는 유전자; 상처 치유에 수반되는 유전자; 및 조직 손상-촉발된 염증 반응에 수반되는 유전자.

문헌 [Hugo et al. (Cell, 165(1): 35-44)]에 의해 수행된 포괄적 연구는 전이성 흑색종에서 이들 부류의 마커의 차등 유전자 발현 패턴과 체크포인트 차단 요법 (CBT)에 대한 반응성 사이의 상관관계를 명백하게 입증하였다. 저자들은 유전자 세트의 공동-풍부화가 흑색종뿐만 아니라 분석된 모든 주요 공통 인간 악성종양 내에서 전사체 하위세트를 정의하는 "IPRES 시그너쳐"을 만든다는 것을 발견하였다. 실제로, 연구는 종양 세포 표현형 가소성 (즉, 중간엽 이행) 및 이로 인한 미세환경에 대한 영향 (예를 들어, ECM 재형성, 세포 부착, 및 면역 억제 상처 치유의 혈관신생 특색)을 CBT 저항성에 연관시킨다.

각각의 이들 IPRES 유전자 카테고리가 TGFβ 조절이상을 수반하는 질환에 연루되었다는 것을 인식하여, 본 출원인은 TGFβ1 이소형이 특히 질환 상태에서 이들 과정을 매개할 수 있다는 것을 이전에 고려하였다 (예를 들어, WO 2017/156500 참조). 본원에 개시된 연구는 이러한 개념을 추가로 지지하며 (예를 들어, 실시예 11; 도 37a), 이는 TGFβ1을 선택적으로 표적화하는 요법 (비-선택적 대체 요법과 대조적으로)이 효능 및 안전성 둘 다와 관련하여 이점을 제공할 수 있다는 것을 추가로 확인시켜 준다.

따라서, 본 개시내용은 TGFβ1 억제 요법에 반응할 가능성이 있는 후보 환자 또는 환자 집단을 선택 또는 확인하는 단계 및 환자(들)에게 유효량의 TGFβ1의 고친화도, 이소형-선택적 억제제를 투여하는 단계의 방법/과정을 포함한다. 환자의 CBT에 대한 반응성 결여 (예를 들어, 저항성)의 관찰은 환자가 본원에 기재된 TGFβ1 억제 요법에 대한 후보라는 것을 나타낼 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 것과 같은 TGFβ1의 고친화도, 이소형-선택적 억제제는 대상체에서의 암의 치료에 사용될 수 있으며, 여기서 대상체는 CBT에 불량하게 반응성이다. 대상체는 진행성 암, 예컨대 국부 진행성 고형 종양 또는 전이성 암을 가질 수 있다. 환자는 특정한 요법의 유의미한 치료 효과를 나타내기에 충분할 것으로 예상되는 지속기간 후에 의미있는 치료 효과가 전혀 또는 거의 달성되지 않는 경우에 (예를 들어, 표준 가이드라인, 예컨대 RECIST 및 iRECIST에 기초하여 부분 반응 또는 완전 반응의 기준을 충족시키지 않는 경우에), "불량하게 반응성인" 것으로 언급된다. 전형적으로, CBT에 대한 이러한 지속기간은 추가의 요법, 예컨대 화학요법의 존재 또는 부재 하에 적어도 약 3개월의 치료이다. 이러한 환자는 "비-반응자"로 지칭될 수 있다. 이러한 환자가 초기 CBT에 불량하게 반응성인 경우에, 환자는 "1차 비-반응자"로 지칭될 수 있다. 이러한 카테고리에서의 암 (또는 이러한 암을 갖는 환자)은 CBT에 대한 "1차 저항성"을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 적어도 약 3개월의 CBT 치료를 받은 후, 여기서 임의로는, 적어도 약 4개월의 CBT 치료를 받은 후의 1차 비-반응자이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 또한 CBT와 조합된 추가의 요법, 예컨대 화학요법을 받았다.

대상체가 CBT의 비-반응자로서 확인되면, TGFβ1의 고친화도, 이소형-선택적 억제제는 대상체가 반응하지 못한 제1 CBT와 동일한 체크포인트 억제제를 포함할 수 있거나 또는 포함하지 않을 수 있는 CBT와 함께 대상체에게 투여될 수 있다. 임의의 적합한 면역 체크포인트 억제제, 예를 들어 승인된 체크포인트 억제제가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, TGFβ1의 고친화도, 이소형-선택적 억제제는 항-PD-1 항체 또는 항-PD-L1 항체를 포함하는 CBT와 함께 대상체에게 투여된다. TGFβ1의 고친화도, 이소형-선택적 억제제는 암을 CBT에 보다 감수성이게 함으로써 저항성을 극복하는 것을 목표로 한다.

TGFβ1 억제 요법에 반응할 가능성이 있는 후보 환자 또는 환자 집단을 선택 또는 확인하는 방법은 환자 (또는 환자 집단)로부터 수집된 생물학적 샘플, 예컨대 생검 샘플을 본원에 논의된 마커 중 1종 이상의 발현에 대해 시험하는 단계를 포함할 수 있다. 유사하게, 이러한 유전자 마커(들)는 요법에 대한 환자의 반응성을 모니터링하기 위한 목적으로 사용될 수 있다. 모니터링은 환자로부터 수집된 2개 이상의 생물학적 샘플을, 예를 들어 요법의 투여 전 및 후에, 및 시간 경과에 따른 치료 요법의 과정 동안 시험하여, 치료 반응 또는 유효성을 나타내는 마커 중 1종 이상의 유전자 발현 수준의 변화를 평가하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 액체 생검이 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, TGFβ1 억제 요법에 반응할 가능성이 있는 후보 환자 또는 환자 집단을 선택하는 방법은 이상 발현을 나타낸 본원에 기재된 것과 같은 유전자 마커(들)에 대해 이전에 시험된 환자 또는 환자 집단을 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 이들 동일한 방법은 또한 요법에 대한 환자의 반응을 추후 확인 또는 상호관련시키는데 적용가능하다.

일부 실시양태에서, 이상 마커 발현은 하기 중 적어도 1종의 상승된 수준을 포함한다: TGFβ1, LRRC33, GARP, LTBP1, LTBP3, CCL2, CCL3, PAI-1/세르핀1. 일부 실시양태에서, 환자 또는 환자 집단 (예를 들어, 그로부터 수집된 생물학적 샘플)은 상승된 TGFβ1 활성화, 포스포-Smad2/3 또는 그의 조합을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 환자 또는 환자 집단 (예를 들어, 그로부터 수집된 생물학적 샘플)은 상승된 MDSC를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 이러한 환자 또는 환자 집단은 TGFβ1-양성인 고형 종양을 포함할 수 있는 암을 갖는다. 고형 종양은 TGFβ1이 다른 이소형에 비해 종양에서 발현되는 우세한 이소형인 TGFβ1-우성 종양일 수 있다. 일부 실시양태에서, 고형 종양은 TGFβ1-공동-우성 종양일 수 있으며, 여기서 TGFβ1은 종양에서 발현되는 공동-우성 이소형, 예를 들어 TGFβ1+/TGFβ3+이다. 일부 실시양태에서, 이러한 환자 또는 환자 집단은 암 요법, 예컨대 화학요법, 방사선 요법 및/또는 면역 체크포인트 요법, 예를 들어 항-PD-1 (예를 들어, 펨브롤리주맙 및 니볼루맙), 항-PD-L1 (예를 들어, 아테졸리주맙), 항-CTLA4 (예를 들어, 이필리무맙), 조작된 면역 세포 요법 (예를 들어, CAR-T), 및 암 백신 등에 대해 저항성을 나타낸다. 본 발명에 따르면, 본원에 개시된 것과 같은 고친화도, 콘텍스트-비의존성 TGFβ1 억제제는 면역억제를 비차단함으로써 저항성을 극복하여 이펙터 세포가 암 세포에 접근하게 함으로써 항종양 효과를 달성한다. 따라서, TGFβ1 억제제 요법은 종양에서의 이펙터 세포 침윤 및/또는 확장을 촉진할 수 있다. 추가적으로, TGFβ1 억제제 요법은 종양에서의 면역억제 면역 세포, 예컨대 Treg 및 MDSC의 빈도를 감소시킬 수 있다.

일부 실시양태에서, 이상 마커 발현은 하기 유전자의 1종 이상의 패널을 포함한다: 중간엽 이행 마커 (예를 들어, AXL, ROR2, WNT5A, LOXL2, TWIST2, TAGLN, FAP); 면역억제 유전자 (예를 들어, IL10, VEGFA, VEGFC); 단핵구 및 대식세포 화학주성 유전자 (예를 들어, CCL2, CCL7, CCL8, CCL13); 혈관신생 및 상처 치유에 수반되는 유전자 (예를 들어, T 세포 억제); 세포 부착 마커; ECM 재형성; 골격계 및 골 발생 마커; 및 조직 손상-촉발된 염증 반응에 수반되는 유전자.

일부 실시양태에서, MHC 발현 (예컨대 MHC 부류 1)의 결여 또는 하향조절은 본 개시내용에 의해 포괄되는 항체 또는 항원-결합 단편이 요법으로서 사용될 수 있는 TGFβ1-연관 상태에 대한 바이오마커로서의 역할을 할 수 있다. 감소된 MHC 수준은 면역 회피를 신호전달할 수 있고, 이는 CBT와 같은 면역-요법에 대한 환자의 불량한 반응성과 상관관계가 있을 수 있다. 따라서 TGFβ1의 선택적 억제는 적어도 부분적으로 이펙터 세포 기능을 회복시킬 수 있다.

중간엽 이행을 수반하는 질환

중간엽 이행은 상피 세포 및 내피 세포와 같은 세포의 중간엽 표현형 (예컨대 근섬유모세포)으로의 표현형 이동 과정이다. 중간엽 이행을 나타내는 유전자 마커의 예는 AXL, ROR2, WNT5, LOXL2, TWIST2, TAGLN 및 FAP를 포함한다. 암에서, 예를 들어, 중간엽 이행 (예를 들어, 증가된 EndMT 및 EMT 시그너쳐)은 종양 세포 표현형 가소성을 나타낸다. 따라서, 본원에 기재된 것과 같은 TGFβ1의 고친화도, 이소형-특이적 억제제는 중간엽 이행에 의해 개시 또는 구동되는 질환, 예컨대 EMT 및 EndMT를 치료하는데 사용될 수 있다.

EMT (상피-중간엽 이행)는 치밀 접합부를 갖는 상피 세포가 중간엽 특성 (표현형), 예컨대 느슨한 세포-세포 접촉으로 전환되는 과정이다. 과정은 배발생, 상처 치유, 암 전이 및 섬유증을 포함한 다수의 정상 생물학적 과정뿐만 아니라 병리학적 상황에서 관찰된다 (예를 들어, 문헌 [Shiga et al. (2015) "Cancer-Associated Fibroblasts: Their Characteristics and Their Roles in Tumor Growth." Cancers, 7: 2443-2458]에서 검토됨). 일반적으로, EMT 신호는 주로 TGFβ에 의해 유도되는 것으로 여겨진다. 많은 유형의 암은, 예를 들어 보다 불량한 예후와 상관관계가 있는 중간엽 표현형 (예컨대 근섬유모세포 및 CAF)으로의 세포의 전환분화를 수반하는 것으로 보인다. 따라서, 본원에 기재된 것과 같은 TGFβ1의 이소형-특이적, 콘텍스트-비의존성 억제제는 EMT에 의해 개시 또는 구동되는 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 실제로, 본원에 예시된 데이터 (예를 들어, 도 7-9)는 이러한 억제제가 생체내에서 근섬유모세포/CAF 마커, 예컨대 α-SMA, LOXL2, Col1 (유형 I 콜라겐) 및 FN (피브로넥틴)의 발현을 억제하는 능력을 갖는다는 것을 제시한다. 따라서, 본원에 기재된 것과 같은 TGFβ1의 고친화도, 이소형-특이적 억제제는 EMT를 특징으로 하는 질환의 치료에 사용될 수 있다. 억제제의 치료 유효량은 마커, 예컨대 α-SMA/ACTA2, LOXL2Col1(유형 I 콜라겐) 및 FN (피브로넥틴)의 발현을 감소시키기에 충분한 양일 수 있다. 일부 실시양태에서, 질환은 섬유화 장애이다. 일부 실시양태에서, 질환은 증식성 장애, 예컨대 암이다.

유사하게, TGFβ는 또한 정상 발생, 예컨대 심장 형성에서 관찰되는 내피-중간엽 이행 (EndMT)의 주요 조절제이다. 그러나, 동일하거나 유사한 현상이 또한 많은 질환-연관 조직, 예컨대 암 기질 및 섬유화 부위에서 관찰된다. 일부 질환 과정에서, 내피 마커, 예컨대 CD31은 TGFβ1 노출시 하향조절되고, 대신에 중간엽 마커, 예컨대 FSP-1, α-SMA/ACTA2 및 피브로넥틴의 발현이 유도된다. 실제로, 기질 CAF는 혈관 내피 세포로부터 유래될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 것과 같은 TGFβ1의 고친화도, 이소형-특이적 억제제는 EndMT를 특징으로 하는 질환의 치료에 사용될 수 있다. 억제제의 치료 유효량은 마커, 예컨대 FSP-1, α-SMA/ACTA2 및 피브로넥틴의 발현을 감소시키기에 충분한 양일 수 있다. 일부 실시양태에서, 질환은 섬유화 장애이다. 일부 실시양태에서, 질환은 증식성 장애, 예컨대 암이다.

매트릭스 강성화 및 재형성을 수반하는 질환

다양한 TGFβ1-관련 적응증, 예컨대 섬유화 상태 및 암의 진행은 ECM 내로 침착된 매트릭스 성분의 증가된 수준 및/또는 ECM의 유지/재형성을 수반한다. ECM 성분, 예컨대 콜라겐의 증가된 침착은 ECM의 기계물리적 특성 (예를 들어, 매트릭스/기질의 강성)을 변경시킬 수 있고, 이러한 현상은 TGFβ1 신호전달과 연관된 것으로 보고되었다. 본 출원인은 이전에 프로TGFβ1 및 LTBP1로 형질감염되고 규정된 강성 (예를 들어, 5 kPa, 15 kPa 또는 100 kPa)을 갖는 규소-기반 기질 상에서 성장한 1차 섬유모세포를 사용하여, TGFβ의 인테그린-의존성 활성화에 대한 매트릭스 강성의 역할을 입증하였다. WO 2018/129329에 개시된 바와 같이, 보다 큰 강성을 갖는 매트릭스는 TGFβ1 활성화를 증진시키고, 이는 TGFβ1의 이소형-특이적 억제제에 의해 억제될 수 있다. 이들 관찰은 TGFβ1이 ECM 특성 (예컨대 강성)에 영향을 미치고, 이는 차례로 TGFβ1 활성화를 추가로 유도할 수 있으며, 이는 질환 진행을 반영한다는 것을 시사한다.

따라서, 본원에 기재된 것과 같은 TGFβ1의 고친화도, 이소형-특이적 억제제는 ECM 변경을 수반하는 질환 진행, 예컨대 섬유증, 종양 성장, 침습, 전이 및 결합조직형성에 대응하는 이러한 과정을 차단하는데 사용될 수 있다. 이러한 억제제의 LTBP-아암은 LTBP1 및/또는 LTBP3에 의해 제시되는 ECM-연관 프로/잠복 TGFβ1 복합체를 직접적으로 차단하여, 질환 함요에서 복합체로부터의 성장 인자의 활성화/방출을 방지할 수 있다. 일부 실시양태에서, 고친화도, 이소형-특이적 TGFβ1 억제제는 인테그린-의존성 신호전달을 수반하는 질환을 치료하기 위해 ECM 강성을 정상화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 인테그린은 α11 쇄, β1 쇄, 또는 둘 다를 포함한다. ECM의 구조, 예를 들어 ECM 성분 및 조직화는 또한 매트릭스-연관 프로테아제에 의해 변경될 수 있다.

문헌 [Lampi and Reinhart-King (Science Translational Medicine, 10(422): eaao0475, "Targeting extracellular matrix stiffness to attenuate disease: From molecular mechanisms to clinical trials")]에서 검토된 바와 같이, 조직 ECM의 증가된 강성은 암, 섬유증 및 심혈관 질환의 병리학적 진행 동안 발생한다. 과정과 연관된 기계적 특성은 표현형적으로 전환된 근섬유모세포, TGFβ 및 매트릭스 가교를 수반한다. 암 및 섬유화 질환 동안 증가된 ECM 강성의 주요 원인은 근섬유모세포 (예를 들어, CAF 및 FAF)로 탈분화된 활성화된 섬유모세포에 의한 조절이상 매트릭스 합성 및 재형성이다. 종양 기질 및 기관 섬유증의 재형성은, 병리학적 상태에서 반응이 지속되는 것을 제외하고는, 상처 치유 반응과 현저한 유사성을 나타낸다. 근섬유모세포는 다수의 세포 공급원, 예컨대 골수-유래 및 조직 상주 세포로부터 기원하는 병리상태-특이적 전구체 세포를 갖는 이종 세포 집단이다. 통상적으로 사용되는 근섬유모세포 마커는 알파-평활근 액틴 (α-SMA)을 포함한다. 본원에 제시된 바와 같이, 고친화도, 이소형-특이적 TGFβ1 억제제는 생체내 연구에서 ACTA2 발현 (α-SMA를 코딩함), 콜라겐, 뿐만 아니라 FN (피브로넥틴)을 감소시킬 수 있다. 피브로넥틴은 LTBP-연관 프로TGFβ1 복합체의 매트릭스 구조 상으로의 앵커링에 중요하다.

ECM 조절에서의 TGFβ 경로의 중요성은 잘 확립되어 있다. TGFβ1 (및 TGFβ3)은 특정 인테그린 (예를 들어, αv 인테그린)에 의해 기계적으로 활성화될 수 있기 때문에, 인테그린-TGFβ1 상호작용은 치료 표적이 되었다. 예를 들어, αvβ6에 대한 모노클로날 항체는 특발성 폐 섬유증에 대해 연구되고 있다. 그러나, 이러한 접근법은 또한 동일한 인테그린-결합 모티프인 RGD를 공유하는 TGFβ3 신호전달을 방해할 수 있고, 추가로, 이러한 항체는 다른 방식, 예컨대 프로테아제-유도된 활성화를 통해 활성화된 TGFβ1을 차단하는데 효과적이지 않을 것이다. 비교하면, 고친화도, 이소형-특이적 TGFβ1 억제제는 TGFβ1의 프로테아제-의존성 활성화 (도 5a 및 5b), 뿐만 아니라 TGFβ1의 인테그린-의존성 활성화를 차단할 수 있다 (도 1-4 및 33b). 따라서, TGFβ1의 고친화도, 이소형-선택적 억제제는 우수한 속성을 제공할 수 있다. 본원에 제시된 데이터는, 본 출원인의 이전 연구와 함께, TGFβ1의 고친화도, 이소형-선택적 억제제가 ECM 강성화와 연관된 질환을 치료하는데 효과적일 수 있다는 것을 지지한다.

따라서, 본 발명은 대상체에서 매트릭스 강성화와 연관된 질환의 치료에서의 또는 매트릭스 강성을 감소시키는 방법에서의 TGFβ1의 고친화도, 이소형-선택적 억제제의 치료 용도를 포함한다. 이러한 용도는 치료 유효량의 TGFβ1의 고친화도, 이소형-선택적 억제제의 투여를 포함한다.

프로테아제를 수반하는 질환

TGFβ의 그의 잠복 복합체로부터의 활성화는 인테그린에 의해 힘-의존성 방식으로 및/또는 프로테아제에 의해 촉발될 수 있다. 증거는 Ser/Thr 프로테아제, 예컨대 칼리크레인, 케모트립신, 엘라스타제, 플라스민, 뿐만 아니라 MMP 패밀리의 아연 메탈로프로테아제, 예컨대 MMP-2, MMP-9 및 MMP-13, 및 프로테아제의 아담 패밀리, 예컨대 아담10 및 아담17을 포함하나 이에 제한되지는 않는 특정 부류의 프로테아제가 과정에 수반될 수 있다는 것을 시사한다. MMP-2는 기저막의 가장 풍부한 성분인 콜라겐 IV를 분해하여, ECM-연관 TGFβ1 조절에서 소정 역할을 할 수 있는 가능성을 상승시킨다. MMP-9는 암종, 예컨대 유방암을 포함한 종양 진행, 혈관신생, 기질 재형성 및 전이에서 중추적 역할을 하는 것으로 연루되었다. 따라서, ECM에서 TGFβ1의 프로테아제-의존성 활성화는 암을 치료하는데 중요할 수 있다.

칼리크레인 (KLK)은 혈장 칼리크레인 및 조직 칼리크레인을 포함하는 트립신- 또는 키모트립신-유사 세린 프로테아제이다. ECM은 악성 성장을 억제하기 위한 구조적 및 신호전달 스캐폴드 및 장벽으로서 작용하는, 조직 항상성에서의 소정 역할을 한다. KLK는 종양 확장 및 침습을 용이하게 할 수 있는 ECM 단백질 및 다른 성분을 분해하는 역할을 할 수 있다. 예를 들어, KLK1은 특정 유방암에서 고도로 상향조절되고, 프로-MMP-2 및 프로-MMP-9를 활성화시킬 수 있다. KLK2는 잠복 TGFβ1을 활성화시켜, 섬유모세포에 인접한 전립선암이 암 성장을 허용하게 한다. KLK3은 전립선암 (PSA)에 대한 진단 마커로서 널리 연구되었다. KLK3은 플라스미노겐을 플라스민으로 프로세싱함으로써 TGFβ1을 직접적으로 활성화시킬 수 있으며, 이는 LAP를 단백질분해적으로 절단하여, TGFβ1 성장 인자가 잠복 복합체로부터 방출되게 한다. KLK6은 알츠하이머병에 대한 잠재적 마커일 수 있다.

더욱이, 실시예 8에 제공된 데이터는 이러한 프로테아제가 칼리크레인일 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 본 발명은 칼리크레인 또는 칼리크레인-유사 프로테아제와 연관된 질환을 치료하는 방법에서의 TGFβ1의 이소형-특이적, 콘텍스트-비의존성 억제제의 용도를 포괄한다. 일부 실시양태에서, TGFβ1 억제제는 Ab3, Ab6 또는 그의 유도체이다.

TGFβ1의 공지된 활성화제, 예컨대 플라스민, TSP-1 및 αVβ6 인테그린은 모두 LAP와 직접적으로 상호작용한다. LAP의 단백질분해적 절단은 LAP-TGFβ 상호작용을 탈안정화시켜 활성 TGFβ1을 방출할 수 있는 것으로 상정된다. 54-LSKLRL-59를 함유하는 영역은 TGFβ1 잠복성을 유지하는데 중요한 것으로 시사되었다. 따라서, 상호작용을 안정화시키거나 또는 LAP의 단백질분해적 절단을 차단하는 작용제 (예를 들어, 항체)는 TGFβ1 활성화를 방지할 수 있다.

병리학적 상태 (예를 들어, 암)와 연관된 이들 프로테아제 중 다수는 별개의 작용 메카니즘을 통해 기능한다. 따라서, 특정한 프로테아제 또는 프로테아제의 조합의 표적화된 억제는 프로테아제-TGFβ 축을 수반하는 상태의 치료를 위한 치료 이익을 제공할 수 있다. 따라서, TGFβ1의 프로테아제-유도된 활성화를 선택적으로 억제하는 억제제 (예를 들어, TGFβ1 항체)가 이러한 질환 (예를 들어, 암)의 치료에 유리할 수 있는 것으로 고려된다. 유사하게, 치료될 상태에 따라, 또 다른 프로테아제에 비해 1종의 프로테아제에 의한 TGFβ1 활성화의 선택적 억제가 또한 바람직할 수 있다.

플라스민은 플라스미노겐으로 불리는 전구체 형태로서 생산된 세린 프로테아제이다. 방출시에, 플라스민은 순환에 진입하고, 따라서 혈청에서 검출된다. 상승된 수준의 혈청 플라스민은, 가능하게는 종양 세포 운동성, 침습 및 전이를 용이하게 하는 세포외 매트릭스 (예를 들어, 기저막 및 기질 장벽)의 파괴를 수반하는 메카니즘을 통해, 암 진행과 상관관계가 있는 것으로 보인다. 플라스민은 또한 부착, 증식, 아폽토시스, 암 영양, 산소 공급, 혈관의 형성 및 VEGF의 활성화에 영향을 미칠 수 있다 (Didiasova et al., Int. J. Mol. Sci, 2014, 15, 21229-21252). 추가로, 플라스민은 대식세포의 종양 미세환경으로의 이동을 촉진할 수 있다 (Philips et al., Cancer Res. 2011 Nov 1;71(21):6676-83 및 Choong et al., Clin. Orthop. Relat. Res. 2003, 415S, S46-S58). 실제로, 종양-연관 대식세포 (TAM)는 종양 성장, 침습, 전이 및 혈관신생을 촉진하는 그의 능력을 통해 종양발생의 구동인자로 잘 특징화되어 있다.

플라스민 활성은 주로 ECM의 파괴와 관련이 있었다. 그러나, 플라스민이 또한 하류 MMP 및 TGFβ 활성화를 조절한다는 증거가 증가하고 있다. 구체적으로, 플라스민은 TGFβ 유전자 생성물의 N-말단 영역으로부터 유래된 잠복성 연관 펩티드 (LAP)의 단백질분해적 절단을 통해 TGFβ의 활성화를 유발하여 (Horiguchi et al., J Biochem. 2012 Oct; 152(4):321-9, 활성 성장 인자의 방출을 발생시키는 것으로 시사되었다. TGFβ1은 암 진행을 촉진할 수 있기 때문에, 이는 TGFβ의 플라스민-유도된 활성화가 적어도 부분적으로 이 과정을 매개할 수 있는 가능성을 상승시킨다.

TGFβ1은 또한 플라스미노겐의 플라스민으로의 전환에서 중요한 역할자인 uPA의 발현을 조절하는 것에 제시되었다 (Santibanez, Juan F., ISRN Dermatology, 2013: 597927). uPA는 독립적으로 그의 세포 표면 수용체 (uPAR)에 결합하고 플라스미노겐의 플라스민으로의 전환을 촉진함으로써 암 진행 (예를 들어, 부착, 증식 및 이동)을 촉진하는 것으로 밝혀졌다. 더욱이, 연구는 uPA 및/또는 플라스미노겐 활성화제 억제제-1 (PAI-1)의 발현이 결장직장암 (D. Q. Seetoo, et al., Journal of Surgical Oncology, vol. 82, no. 3, pp. 184-193, 2003), 유방암 (N. Harbeck et al., Clinical Breast Cancer, vol. 5, no. 5, pp. 348-352, 2004) 및 피부암 (Santibanez, Juan F., ISRN Dermatology, 2013: 597927)에서의 불량한 예후의 예측인자라는 것을 제시하였다. 따라서, 특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 플라스민, TGFβ1 및 uPA 사이의 상호작용은 암 진행을 촉진하는 것에 대한 양성 피드백 루프를 생성할 수 있다. 따라서, 플라스민-의존성 TGFβ1 활성화를 선택적으로 억제하는 억제제는 플라스민/TGFβ1 신호전달 축에 의존하는 암의 치료에 특히 적합할 수 있다.

본 발명의 한 측면에서, 본원에 기재된 TGFβ1의 이소형-특이적 억제제는 TGFβ1의 프로테아제-의존성 활성화를 억제할 수 있는 억제제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 억제제는 인테그린-비의존성 방식으로 프로테아제-의존성 TGFβ1 활성화를 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 억제제는 활성화 방식과 무관하게 TGFβ1 활성화를 억제할 수 있고, 예를 들어 TGFβ1의 인테그린-의존성 활성화 및 프로테아제-의존성 활성화 둘 다를 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 세린 프로테아제, 예컨대 칼리크레인, 케모트립신, 트립신, 엘라스타제, 플라스민, 뿐만 아니라 아연 메탈로프로테아제 (MMP 패밀리), 예컨대 MMP-2, MMP-9 및 MMP-13.

일부 실시양태에서, 억제제는 TGFβ1의 플라스민-유도된 활성화를 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 억제제는 플라스민- 및 인테그린-유도된 TGFβ1 활성화를 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 프로TGFβ1에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 잠복 프로TGFβ1에 결합하여 잠복 복합체로부터의 성숙 성장 인자의 방출을 억제한다. 일부 실시양태에서, TGFβ1의 플라스민-의존성 활성화를 억제하는 방법에서 사용하기에 적합한 TGFβ1 활성화의 고친화도, 콘텍스트-비의존성 억제제는 Ab6 또는 그의 유도체 또는 변이체이다.

일부 실시양태에서, 억제제 (예를 들어, TGFβ1 항체)는 암 세포 이동을 억제한다. 일부 실시양태에서, 억제제는 대식세포 이동을 억제한다. 일부 실시양태에서, 억제제는 TAM의 축적을 억제한다.

또 다른 측면에서, 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 TGFβ1 억제제 (예를 들어, TGFβ1 항체)를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 억제제는 TGFβ1의 프로테아제-유도된 활성화 (예를 들어, 플라스민)를 억제하고, 이에 의해 대상체에서 암을 치료하는 것인, 상기 대상체에서 암을 치료하는 방법이 본원에 제공된다.

또 다른 측면에서, 종양 성장의 감소를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 TGFβ1 억제제 (예를 들어, TGFβ1 항체)를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 억제제는 TGFβ1의 프로테아제-유도된 활성화 (예를 들어, 플라스민)를 억제하고, 이에 의해 대상체에서 종양 성장을 감소시키는 것인, 상기 대상체에서 종양 성장을 감소시키는 방법이 본원에 제공된다.

암 / 악성종양

다양한 암은 TGFβ1 활성을 수반하고, 본 개시내용의 항체 및/또는 조성물로 치료될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "암"은 TGFβ1-양성 세포와 연관된 임의의 다양한 악성 신생물을 지칭한다. 이러한 악성 신생물은 주위 조직을 침습하고 새로운 신체 부위로 전이되는 경향이 있는 역형성 세포의 증식을 특징으로 하며, 또한 이러한 악성 신생물 성장을 특징으로 하는 병리학적 상태를 지칭한다. TGFβ1의 공급원은 달라질 수 있고, 악성 (암) 세포 자체, 뿐만 아니라 그의 주위 또는 지지 세포/조직, 예를 들어 세포외 매트릭스, 다양한 면역 세포 및 그의 임의의 조합을 포함할 수 있다.

암을 "TGFβ1-양성"으로 단정적으로 확인하는 것은 본원에 기재된 치료 방법을 수행하는데 요구되지 않는다. 전형적으로, 특정 암 유형은 신뢰할 만한 증거에 기초하여 TGFβ1 신호전달과 연관된 것으로 공지되거나 의심된다.

암은 국재화된 암 (예를 들어, 고형 종양) 또는 전신 암일 수 있다. 본 개시내용과 관련하여, 용어 "국재화된" ("국재화된 종양"에서와 같음)은 전신 질환 (예를 들어, 소위 액상 종양 또는 혈액암)과 대조적으로, 해부학적으로 단리되거나 단리가능한 이상/병변, 예컨대 고형 악성종양을 지칭한다. 특정 암, 예컨대 특정 유형의 백혈병 (예를 들어, 골수섬유증) 및 다발성 골수종은, 예를 들어 질환에 대해 국재화된 성분 (예를 들어 골수) 및 전신 성분 (예를 들어 순환 혈액 세포) 둘 다를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 암은 전신 암, 예컨대 혈액 악성종양일 수 있다. 본 개시내용에 따라 치료될 수 있는 암은 TGFβ1-양성이고, 모든 유형의 림프종/백혈병, 암종 및 육종, 예컨대 항문, 방광, 담관, 골, 뇌, 유방, 자궁경부, 결장/직장, 자궁내막, 식도, 눈, 담낭, 두경부, 간, 신장, 후두, 폐, 종격 (흉부), 구강, 난소, 췌장, 음경, 전립선, 피부, 소장, 위, 척수, 꼬리뼈, 고환, 갑상선 및 자궁에서 발견되는 암 또는 종양을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 암은 진행성 암, 예컨대 국부 진행성 고형 종양 및 전이성 암일 수 있다.

본 개시내용에 의해 포괄되는 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 비제한적으로 다음을 포함한 암의 치료에 사용될 수 있다: 골수섬유증, 흑색종, 아주반트 흑색종, 신세포 암종 (RCC), 방광암, 결장직장암 (CRC), 결장암, 직장암, 항문암, 유방암, 삼중-음성 유방암 (TNBC), HER2-음성 유방암, BRCA-돌연변이된 유방암,혈액 악성종양, 비소세포 암종, 비소세포 폐암 (NSCLC), 소세포 폐암 (SCLC), 확장-병기 소세포 폐암 (ES-SCLC), 림프종 (전형적 호지킨 및 비-호지킨), 원발성 종격 대 B-세포 림프종 (PMBCL), T-세포 림프종, 미만성 대 B-세포 림프종, 조직구성 육종, 여포성 수지상 세포 육종, 지상감입 수지상 세포 육종, 골수종, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 소림프구성 림프종 (SLL), 두경부암, 요로상피암, 메르켈 세포 암종, 메르켈 세포 피부암, 높은 미소위성체 불안정성을 갖는 암 (MSI-H), 미스매치 복구 결핍을 갖는 암 (dMMR), 중피종, 위암, 위식도 접합부 암 (GEJ), 위 선암종, 신경내분비 종양, 위장 기질 종양 (GIST), 위 분문부 선암종, 신암, 담도암, 담관암종, 췌장암, 전립선암, 선암종, 편평 세포 암종, 비-편평 세포 암종, 피부 편평 세포 암종 (CSCC), 난소암, 자궁내막암, 난관암, 자궁경부암, 복막암, 위암, 뇌암, 악성 신경교종, 교모세포종, 신경교육종, 신경모세포종, 갑상선암, 부신피질 암종, 경구 상피내 신생물, 식도암, 비강 및 부비동 편평 세포 암종, 비인두 암종, 타액선암, 간암, 및 간세포성암 (HCC). 그러나, 예를 들어 생검에 의해 결정된 바와 같이 TGFβ1이 과다발현되거나 또는 적어도 우세한 이소형인 임의의 암 (예를 들어, 이러한 암을 갖는 환자)은 본 개시내용에 따라 TGFβ1의 이소형-선택적 억제제로 치료될 수 있다.

암에서, TGFβ (예를 들어, TGFβ1)는 성장 촉진 또는 성장 억제성일 수 있다. 예로서, 췌장암에서, SMAD4 야생형 종양은 TGFβ에 반응하여 억제된 성장을 경험할 수 있지만, 질환이 진행됨에 따라, 구성적으로 활성화된 유형 II 수용체가 전형적으로 존재한다. 추가적으로, SMAD4-널 췌장암이 존재한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체, 그의 항원 결합 부분 및/또는 조성물은 암의 1종 이상의 형태에서 고유하게 기능하는 TGFβ 신호전달 경로의 성분을 선택적으로 표적화하도록 설계된다. 백혈병, 또는 백혈 세포, 즉 백혈구의 비정상적 증식을 특징으로 하는 혈액 또는 골수의 암은 4종의 주요 분류로 나뉠 수 있으며, 이는 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 급성 골수 백혈병 또는 급성 골수성 백혈병 (AML) (염색체 10 및 11 [t(10, 11)], 염색체 8 및 21 [t(8;21)], 염색체 15 및 17 [t(15;17)] 사이의 전위, 및 염색체 16 [inv(16)]에서의 역위를 갖는 AML; 선행 골수이형성 증후군 (MDS) 또는 AML로 변형된 골수증식성 질환을 갖는 환자를 포함하는, 다계열 이형성증을 동반한 AML; 요법-관련 AML 및 골수이형성 증후군 (MDS) (이 카테고리는 선행 화학요법 및/또는 방사선을 받았으며 후속적으로 AML 또는 MDS가 발생하는 환자를 포함함); d) 상기 카테고리에 속하지 않는 AML의 하위유형을 포함하는, 달리 카테고리화되지 않는 AML; e) 백혈병성 세포가 골수성 또는 림프성 세포로서 분류될 수 없는 경우, 또는 세포 유형 둘 다가 존재하는 경우에 발생하는, 모호한 계통의 급성 백혈병); 및 만성 골수 백혈병 (CML)을 포함한다.

일부 실시양태에서, 상기 언급된 TGFβ1-양성 암 중 어느 하나는 또한 TGFβ3-양성일 수 있다. 일부 실시양태에서, TGFβ1-양성 및 TGFβ3-양성 둘 다인 종양은 TGFβ1/TGFβ3 공동-우성일 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 암은 고형 종양을 포함하는 암종이다. 일부 실시양태에서, 이러한 종양은 유방 암종이다. 일부 실시양태에서, 유방 암종은 삼중-음성 유전자형 (삼중-음성 유방암)의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, TGFβ1-양성 암을 갖는 대상체는 상승된 수준의 MDSC를 갖는다. 예를 들어, 이러한 종양은 종양 부위에 동원된 MDSC를 포함하여 증가된 수의 MDSC 침윤물을 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 유방암을 갖는 대상체는 재발생 및 불량한 예후와 연관된 염증 마커인 C-반응성 단백질 (CRP)의 상승된 수준을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 유방암을 갖는 대상체는 상승된 수준의 IL-6을 나타낸다.

본 발명의 이소형-선택적 TGFβ1 억제제는 BCR/ABL 종양단백질이 신생물 세포의 비정상적 성장 및 축적에 필수적인 것으로 간주되는 줄기 세포 질환인 만성 골수성 백혈병을 앓고 있는 환자를 치료하는데 사용될 수 있다. 이마티닙은 이러한 상태를 치료하기 위한 승인된 요법이지만; 그러나, 유의한 분율의 골수성 백혈병 환자는 이매티닙-저항성을 나타낸다. 본원에 기재된 것과 같은 억제제에 의해 달성된 TGFβ1 억제는 BCR/ABL-구동된 비정상적 성장 및 신생물 세포의 축적에 대항하는 재증식/확장을 강화하여, 임상 이익을 제공할 수 있다.

본원에 기재된 것과 같은 TGFβ1의 이소형-특이적 억제제는 다발성 골수종을 치료하는데 사용될 수 있다. 다발성 골수종은 골수에서 발생하고 확장되어 파괴성 골 병변 (즉, 골용해성 병변)을 유발하는 B 림프구 (예를 들어, 형질 세포, 형질모세포, 기억 B 세포)의 암이다. 전형적으로, 질환은 부분적으로 골용해성 병변, 골감소증, 골다공증, 고칼슘혈증, 뿐만 아니라 형질세포종, 혈소판감소증, 호중구감소증 및 신경병증을 특징으로 하는, 증진된 파골세포 골 재흡수, 억제된 골모세포 분화 (예를 들어, 분화 저지) 및 손상된 골 형성을 나타낸다. 본원에 기재된 TGFβ1-선택적, 콘텍스트-비의존성 억제제 요법은 환자에서 1종 이상의 이러한 임상 징후 또는 증상을 호전시키는데 효과적일 수 있다. TGFβ1 억제제는 본원의 다른 곳에 열거된 것을 포함한 다발성 골수종을 치료하기 위한 추가의 요법 또는 요법들을 받는 환자에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 다발성 골수종은 미오스타틴 억제제 또는 IL-6 억제제와 조합된 TGFβ1 억제제 (예컨대 이소형-특이적 콘텍스트-비의존성 억제제)로 치료될 수 있다. 일부 실시양태에서, TGFβ1 억제제는 전통적인 다발성 골수종 요법, 예컨대 보르테조밉, 레날리도미드, 카르필조밉, 포말리도미드, 탈리도미드, 독소루비신, 코르티코스테로이드 (예를 들어, 덱사메타손 및 프레드니손), 화학요법 (예를 들어, 멜팔란), 방사선 요법, 줄기 세포 이식, 플리티뎁신, 엘로투주맙, 익사조밉, 마시티닙 및/또는 파노비노스타트와 함께 사용될 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있는 암종의 유형은 유두종/암종, 융모막암종, 내배엽동 종양, 기형종, 선종/선암종, 흑색종, 섬유종, 지방종, 평활근종, 횡문근종, 중피종, 혈관종, 골종, 연골종, 신경교종, 림프종/백혈병, 편평 세포 암종, 소세포 암종, 대세포 미분화 암종, 기저 세포 암종 및 부비동비강 미분화 암종을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

육종의 유형은 연부 조직 육종, 예컨대 폐포 연부 육종, 혈관육종, 피부섬유육종, 데스모이드 종양, 결합조직형성 원형 소세포 종양, 골격외 연골육종, 골격외 골육종, 섬유육종, 혈관주위세포종, 혈관육종, 카포시 육종, 평활근육종, 지방육종, 림프관육종, 림프육종, 악성 섬유성 조직구종, 신경섬유육종, 횡문근육종, 활막 육종 및 아스킨 종양, 유잉 육종 (원시 신경외배엽 종양), 악성 혈관내피종, 악성 슈반세포종, 골육종 및 연골육종을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

본원에 기재된 것과 같은 TGFβ1 활성화의 이소형-선택적, 콘텍스트-비의존성 억제제는 신경 능선 기원의 세포를 수반하는 악성종양을 치료하는데 적합할 수 있다. 신경 능선 계통의 암 (즉, 신경 능선-유래 종양)에는 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 흑색종 (멜라닌세포의 암), 신경모세포종 (교감신경부신 전구체의 암), 신경절신경종 (말초 신경계 신경절의 암), 수질성 갑상선 암종 (갑상선 C 세포의 암), 크롬친화세포종 (부신 수질의 크로마핀 세포의 암), 및 MPNST(슈반 세포의 암). 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체 및 방법은 결장암, 신암, 유방암, 악성 흑색종 및 교모세포종을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는 암 또는 암-관련 상태의 1종 이상의 유형을 치료하는데 사용될 수 있다 (Schlingensiepen et al., 2008; Ouhtit et al., 2013).

정상 조건 하에, 조절 T 세포 (Treg)는 전체 CD4-양성 림프구 집단의 작은 하위세트를 나타내고, 면역계를 항상성으로 유지하는데 주요 역할을 한다. 그러나, 거의 모든 암에서, Treg의 수는 현저하게 증가된다. Treg가 건강한 개체에서 면역 반응을 약화시키는데 중요한 역할을 하는 한편, 암에서 상승된 수의 Treg는 불량한 예후와 연관되었다. 암에서 상승된 Treg는 숙주의 항암 면역을 약화시킬 수 있고, 종양 진행, 전이, 종양 재발생 및/또는 치료 저항성에 기여할 수 있다. 예를 들어, 인간 난소암 복수는 Foxp3+ GARP+ Treg로 침윤된다 (Downs-Canner et al., Nat Commun. 2017, 8: 14649). 유사하게, Treg는 진행성 간세포성 암종에서 보다 면역억제성이고 보다 공격적인 표현형과 양의 상관관계가 있다 (Kalathil et al., Cancer Res. 2013, 73(8): 2435-44). Treg는 이펙터 T 세포의 증식을 억제할 수 있다 (도 26b). 추가로, Treg는 TGFβ1의 생산을 통해 면역 세포 (예를 들어, 나이브 CD4+ T 세포)의 접촉-의존성 억제를 발휘한다 (예를 들어, 도 26a 참조). 따라서, 종양을 퇴치하기 위해, 충분한 이펙터 T 세포가 항종양 효과를 발휘하는데 이용가능할 수 있도록 Treg를 억제하는 것이 유리하다.

증가하는 일련의 증거는 종양/암 진행에서의 대식세포의 역할을 시사한다. 본 발명은 이것이 부분적으로 질환 환경, 예컨대 TME에서의 TGFβ1 활성화에 의해 매개된다는 개념을 포괄한다. 골수-유래 단핵구 (예를 들어, CD11b+)는 종양-유래 시토카인/케모카인 (예컨대 CCL2, CCL3 및 CCL4)에 반응하여 종양 부위로 동원되며, 여기서 단핵구는 분화 및 분극화를 거쳐 암-촉진 표현형 (예를 들어, M2-편향 또는 M2-유사 대식세포, TAM)을 획득한다. 이전에 입증된 바와 같이 (WO 2018/129329), 인간 PBMC로부터 단리된 단핵구는 대식세포의 상이한 하위유형, 예를 들어 M1 (섬유화유발, 항암) 및 M2 (암-촉진)로 분극화되도록 유도될 수 있다. 많은 종양에서 대다수의 TAM은 M2-편향된다. M2-유사 대식세포 중에서, M1이 아니라 M2c 및 M2d 하위유형은 세포 표면 상에 상승된 LRRC33을 발현하는 것으로 밝혀졌다. 더욱이, 대식세포는 특정 시토카인 노출, 예컨대 M-CSF에 의해 추가로 편중되거나 활성화되어, LRRC33 발현의 현저한 증가를 유발할 수 있으며, 이는 TGFβ1 발현과 일치한다. 골수증식성 질환 (예를 들어, 골수섬유증)을 갖는 환자에서 순환 M-CSF (즉, 혈청 M-CSF 농도)의 증가된 수준이 또한 관찰되었다. 일반적으로, 높은 대식세포 (TAM) 및/또는 MDSC 침윤물을 갖는 종양은 불량한 예후와 연관된다. 유사하게, M-CSF의 상승된 수준은 또한 불량한 예후를 나타낸다. 따라서, 고친화도, 이소형-선택적 TGFβ1 억제제, 예컨대 본원에 포괄된 것은 상승된 수준의 암-촉진 대식세포 및/또는 MDSC를 특징으로 하는 암의 치료에 사용될 수 있다. 억제제의 LRRC33-아암은 적어도 부분적으로 질환-연관 면역억제 골수 세포, 예를 들어 M2-대식세포 및 MDSC에 대한 그의 억제 효과를 매개할 수 있다.

종양-연관 M2-유사 대식세포의 높은 유병률은 본원에 기재된 뮤린 동계 종양 모델에서 재현된다. MBT-2 종양에서, 예를 들어 확립된 종양으로부터 단리된 CD45-양성 세포의 거의 40%는 M2 대식세포이다 (도 28b). 이는 고친화도, 이소형-선택적 TGFβ1 및 항-PD-1의 조합으로 처리된 동물에서 절반만큼 감소된다. 비교하면, 동일한 동물에서 종양-연관 M1 대식세포 수의 유의한 변화는 관찰되지 않는다. M2 대식세포와 유사하게, 종양-연관 MDSC는 또한 확립된 종양에서 상승되고 (CD45+ 세포의 약 10-12%), 처리된 동물에서 PD-1 및 TGFβ1 둘 다를 억제함으로써 현저하게 감소된다 (무시할만한 수준으로) (도 28b). 본원에 개시된 바와 같이, 대다수의 종양-침윤 M2 대식세포 및 MDSC는 세포-표면 LRRC33 및/또는 LRRC33-프로TGFβ1 복합체를 발현한다 (도 28c 및 도 28d). 흥미롭게도, LRRC33 (또는 LRRC33-프로TGFβ1 복합체)의 세포-표면 발현은 고도로 조절되는 것으로 보인다. 고친화도, 이소형-선택적 TGFβ1 억제제인 Ab6은 LRRC33 및 프로TGFβ1을 발현하는 세포에서 신속하게 내재화될 수 있고, Ab6으로 달성된 내재화의 비율은 세포-표면 LRRC33을 인식하는 참조 항체로의 것보다 유의하게 더 높다 (도 6). 유사한 결과가 1차 인간 대식세포로부터 수득된다. 이들 관찰은 Ab6이 그의 표적인 LRRC33-프로TGFβ1에 결합시 내재화를 촉진하여, LRRC33-함유 복합체를 세포 표면으로부터 제거할 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 고친화도, 이소형-선택적 TGFβ1 억제제 (예컨대 Ab6)에 의한 표적 결속은 표적 단백질 (예를 들어, 세포-연관 프로TGFβ1 복합체)의 항체-의존성 하향조절을 유도할 수 있다. 질환 유전자좌에서, 이는 활성화가능한 잠복 LRRC33-프로TGFβ1 수준의 이용가능성을 감소시킬 수 있다. 따라서, 이소형-선택적 TGFβ1 억제제는 하기 이중 작용 메카니즘을 통해 TGFβ1의 LRRC33 아암을 억제할 수 있다: i) 잠복 복합체로부터의 성숙 성장 인자의 방출을 차단하는 작용; 및 ii) 내재화를 통해 세포-표면으로부터 LRRC33-프로TGFβ1 복합체를 제거하는 작용. 종양 미세환경에서, 항체는 세포-연관 잠복 프로TGFβ1 복합체를 표적화하여, 표적 세포, 예컨대 M2 대식세포 (예를 들어, TAM), MDSC 및 Treg에 대한 억제 효과를 증대시킬 수 있다. 표현형적으로, 이들은 적어도 부분적으로 TGFβ1 경로에 의해 매개되는 면역억제 종양 미세환경에 기여하는 면역억제 세포이다. 많은 종양에 이들 세포가 풍부화되어 있다는 것을 고려하면, TGFβ1 기능의 다중 아암을 표적화할 수 있는 항체는 기능적 이점을 제공할 것이다.

많은 인간 암은 건강한 대조군과 비교하여 환자에서 상승된 수준의 MDSC를 유발하는 것으로 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Elliott et al. (2017) "Human tumor-infiltrating myeloid cells: phenotypic and functional diversity" Frontiers in Immunology, Vol. 8, Article 86]에서 검토됨). 이들 인간 암은 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 방광암, 결장직장암, 전립선암, 유방암, 교모세포종, 간세포성 암종, 두경부 편평 세포 암종, 폐암, 흑색종, NSCL, 난소암, 췌장암 및 신세포 암종. 상승된 수준의 MDSC가 생물학적 샘플, 예컨대 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 조직 샘플 (예를 들어, 종양 생검)에서 검출될 수 있다. 예를 들어, MDSC의 빈도 또는 수의 변화는 적합한 세포 표면 마커 (표현형)를 사용하여 다음과 같이 측정될 수 있다: 총 PBMC의 퍼센트 (%), CD14+ 세포의 퍼센트 (%), CD45+ 세포의 퍼센트 (%); 단핵 세포의 퍼센트 (%), 총 세포의 퍼센트 (%), CD11b+ 세포의 퍼센트 (%), 단핵구의 퍼센트 (%), 비-림프구성 MNC의 퍼센트 (%), KLA-DR 세포의 퍼센트 (%).

다른 한편으로, 종양 내로의 대식세포 침윤은 또한 요법의 유효성을 나타낼 수 있다. 도 23, 도 24 및 도 27b에 예시된 바와 같이, 종양은 체크포인트 억제제 및 콘텍스트-비의존성 TGFβ1 억제제의 조합으로의 치료 후 이펙터 T 세포 (예를 들어, CD8+ T 세포)에 의해 효과적으로 침투된다. 종양내 이펙터 T 세포는 세포 파편을 청소하는 식세포 단핵구/대식세포의 동원으로 이어질 수 있다.

도 23으로부터 명확한 바와 같이, 항-PD-1 및 TGFβ1 억제제의 조합은 항-PD-1 치료 단독과 비교하여 종양 전반에 걸쳐 강건한 CD8 T 세포 유입/확장을 유발하였다. 상응하게, CD8 이펙터 유전자의 강건한 증가는 조합 치료에 의해 달성될 수 있다. 따라서, 본 발명의 TGFβ1 억제제는 종양 내로의 이펙터 T-세포 침윤을 촉진하는데 사용될 수 있다.

추가로, F4/80-양성 대식세포에 의한 종양의 광범위한 침윤/확장이 관찰된다 (도 24 참조). 이는 세포독성 세포에 의해 생성된 암 세포 파편을 제거하는 M1 (항종양) 대식세포를 나타낼 수 있고, 아마도 TGFβ1 억제의 직접적인 결과일 것이다. 본원의 실시예에 추가로 상세하게 기재된 바와 같이, 이들 종양-침윤 대식세포는 CD163 발현의 결여에 대해 비-M2 대식세포로서 우세하게 확인되며, 이는 순환 단핵구가 체크포인트 억제제 및 TGFβ1 억제제 치료시 종양 부위로 동원되고, M1 대식세포로 분화하며, 이러한 관찰은 종양 부위 내로의 CD8+ T 세포의 현저한 유입을 동반한다는 것을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 TGFβ1 억제제는 종양과 연관된 비-M2 대식세포를 증가시키는데 사용될 수 있다.

최근에, 체크포인트 차단 요법 (CBT)은 다수의 암 유형을 치료하기 위한 표준 관리가 되었다 (예를 들어, 도 20b 참조). 암 면역요법에서의 현저한 진보에도 불구하고, CBT에 대한 1차 저항성은 환자에 대한 주요 미충족 필요성으로 남아있으며; 대다수의 환자의 암은 여전히 PD-(L)1 억제에 반응하지 못한다. 요로상피암 및 흑색종 종양의 후향적 분석은 최근에 1차 저항성의 잠재적 구동인자로서 TGFβ 활성화를 연루시켰으며, 이는 아마도 종양으로부터의 세포독성 T 세포의 배제뿐만 아니라 종양 미세환경 내에서의 그의 확장을 포함한 다중 메카니즘을 통해서일 것이다 (면역 배제). 이들 관찰 및 후속 전임상 검증은 CBT에 대한 1차 저항성을 극복하기 위한 유망한 수단으로서 TGFβ 경로 억제를 지목하였다. 그러나, TGFβ 경로의 치료적 표적화는, 가장 가능성 있게는 1종 이상의 TGFβ 이소형으로부터의 신호전달의 억제로 인해, 용량-제한 전임상 심장독성에 의해 방해되었다.

많은 종양은 CBT에 대한 1차 반응이 결여되어 있다. 이러한 시나리오에서, CD8+ T 세포는 통상적으로 종양 실질로부터 배제되며, 이는 종양이 면역억제 미세환경을 생성하기 위해 TGFβ 신호전달의 면역조정 기능을 공동-채택할 수 있다는 것을 시사한다. 후향적 임상 종양 샘플 분석으로부터의 이들 통찰은 CBT에 대한 1차 저항성에서의 TGFβ 신호전달의 역할을 조사하기 위한 근거를 제공하였다.

본 연구로부터의 결과에 기초하여 여러 주요 결론을 도출할 수 있다. 첫째로, TCGA 데이터의 유전자 발현 분석은 TGFβ1이 대부분의 인간 종양 유형에서 가장 보편적인 이소형이고, 따라서 TGFβ 신호전달의 가장 가능성 있는 구동인자이며, 따라서 이들 종양에서 CBT에 대한 1차 저항성을 유도하는 면역억제 원인이라는 것을 나타낸다.

둘째로, TGFβ1 활성화의 선택적 억제는 CBT에 대한 1차 저항성을 극복하기에 충분한 것으로 보인다. 잠복 TGFβ1의 프로도메인을 표적화함으로써, TGFβ1의 고친화도, 이소형-선택적 억제제는 정교한 이소형 특이성을 달성하고, 모든 공지된 분자 콘텍스트에서 잠복 TGFβ1 활성화를 억제한다. 동계 종양 모델에서 하나의 이러한 항체의 약리학적 평가는 이 항체로의 치료가 항-PD-1-저항성 종양을 체크포인트 차단 요법에 감수성이도록 하기에 충분하다는 것을 입증하였다. 중요하게는, TGFβ1이 종양에 존재하는 유일한 TGFβ 이소형이 아닌 하나의 모델을 포함한 3종의 상이한 종양 유형에서 항-PD-1/TGFβ1 억제제 조합의 항종양 효능이 밝혀졌다. 이는 종양 미세환경 내에서 TGFβ1이 면역조정 역할을 하도록 위치할 가능성이 있는 반면, 다른 이소형은 이러한 생물학에 관련되지 않을 수 있다는 것을 시사한다. 이러한 관찰은 선택적 TGFβ1 억제가 다른 TGFβ 이소형의 발현과 무관하게 광범위한 스펙트럼의 암에 걸쳐 CBT에 대한 1차 저항성을 극복하는데 치료 잠재력을 가질 수 있다는 가능성을 열어준다.

셋째로, TGFβ1-구동된 경로 활성의 선택적 억제는 모든 이소형 활성의 광범위한 억제에 비해 유의하게 개선된 전임상 안전성을 유발한다. 광범위한 TGFβ 경로 억제와 연관된 다면발현성 효과는 TGFβ 경로의 치료적 표적화를 방해하였다. 지금까지 대부분의 실험 치료제 (예를 들어, 갈루니세르팁, LY3200882, 프레솔리무맙)는 단일 TGFβ 이소형에 대한 선택성이 결여되어 있으며, 이는 비임상 및 임상 연구에서 관찰된 용량-제한 독성에 잠재적으로 기여한다. TGFβ2 또는 TGFβ3 유전자에서의 녹아웃 마우스 및 인간 기능 상실 돌연변이로부터의 유전자 데이터는 비특이적 TGFβ 억제제로 관찰된 심장 독성이 TGFβ2 또는 TGFβ3의 억제에 기인할 수 있다는 것을 시사한다. 본 개시내용은 이러한 항체로의 TGFβ1 활성화의 선택적 억제가 개선된 안전성 프로파일을 갖고, PD-1 차단과 조합된 경우에 강건한 항종양 반응을 도출하기에 충분하여, 임상적으로 추적가능한 용량 수준에서의 TGFβ1 억제제 효능의 평가를 가능하게 한다는 것을 교시한다.

TGFβ1 억제제/항-PD-1 조합 치료 동안 항종양 면역과 연관된 면역학적 과정을 분석하기 위해, MBT-2 방광암 모델에서의 반응의 보다 상세한 분석을 수행하였다. PD-1 및 TGFβ1 활성의 동시 차단은 주로 CD8+ T 세포의 10배 증가에 의해 구동되는 종양내 면역 콘텍스쳐의 현저한 변화를 유도하였다. 핵심 세포용해 유전자인 퍼포린 및 그랜자임 B가 또한 조합 치료에 의해 종양에서 상향조절되었기 때문에, 이들 CD8+ T 세포는 종양 세포 사멸에 관여할 가능성이 있었다. 특히, 항-PD-1/TGFβ1 억제제로의 조합 치료에 의한 Treg 세포의 유의한 풍부화는 말초 Treg 유지를 위한 TGFβ 신호전달의 중요성을 고려하면, 다소 예상외의 것이었다. 그러나, Treg 세포가 염증 부위로 동원되기 때문에, 그의 수치 증가는 강건한 면역 반응에 대한 마커로서 해석될 수 있다. 그럼에도 불구하고, CD8+ T 세포는 활성화된 표현형을 채택하고, Treg 세포 수의 증가에도 불구하고 강한 항종양 반응을 도출할 수 있었다. 가능성 있는 설명은 Treg 세포가 면역억제 MBT-2 종양 미세환경에 유의하게 기여하지 않는다는 것 및 다른 억제 면역 세포 집단, 예를 들어 골수 세포가 보다 중요한 역할을 한다는 것일 수 있다. 대안적으로, 이러한 가능성에 상호 배타적이지는 않지만, TGFβ1이 Treg-구동된 면역억제의 주요 매개자라는 것을 고려하면, TGFβ1 억제제의 존재는 또한 Treg 수의 증가에도 불구하고 이러한 활성을 폐지할 수 있다.

본원에 제공된 놀라운 발견은 CD8+ T 세포와 CD31+ 종양 혈관계의 밀접한 연관성의 조직학적 관찰을 포함한다. 이러한 풍부화 패턴은 종양 내로의 T 세포 진입의 주요 경로가 종양 혈관계를 통한 것이고 세포가 종양 혈관으로부터 삼출되면 종양 내로 방사상 외부로 이동하기 시작한다는 가설을 지지한다. 마리아타산(Mariathasan) 등은 CD8+ T 세포가 EMT-6 유방암 모델에서 종양의 전연부에서 콜라겐성 매트릭스 및 섬유모세포-풍부 층을 따라 축적되는 것으로 보였으며, 이는 이러한 매트릭스가 T 세포 배제에 기여한다는 추측으로 이어진다는 것을 발견하였다. 이러한 관찰과는 대조적으로, MBT-2 종양의 전연부 근처에서 조밀한 섬유모세포 영역을 일관되게 검출하는 것은 가능하지 않았다. 혈관계에 근접한 T 세포 풍부화 (예를 들어, 혈관주위 풍부화)에 대한 본 출원인의 관찰은, 암-연관 섬유모세포 층 이외에도, 면역 배제가 또한 TGFβ1-반응성 혈관 내피 세포에 의해 또는 내피에 매우 근접한 다른 세포에 의해 부여될 수 있다는 것을 시사한다. TGFβ1 신호전달이 내피 기능에 영향을 미칠 수 있다는 가능성과 일치하게, 본 출원인의 관찰은 대조군 종양에서의 포스포-SMAD3 염색이 종양 혈관 내피 세포인 것으로 보이는 것 내 핵에서 가장 강력하였다는 것을 포함한다. 이 염색은 선택적 TGFβ1 억제에 감수성이었으며, 이는 이들 세포가 TGFβ1에 반응하고 있고, 아마도 혈관 장벽 완전성의 성능을 조절하는 것을 통해 T 세포 혈관외유출에 영향을 미침으로써 면역 배제를 시행하는데 핵심적일 수 있다는 것을 시사한다. 추가로, 종양-연관 대식세포는 또한 종양 혈관계에 매우 근접한 것으로 기재되었고, TGFβ1의 활성화에 의해 또는 혈관계에서 또는 그 근처에서 다른 면역억제 표면 단백질 또는 분비된 인자를 방출함으로써 면역-배제된 종양 미세환경을 생성하는데 수반될 수 있다. T 세포가 종양 내로 진입하기 위한 다중 경로가 실행 중이고, 이들 메카니즘의 보다 우수한 이해는 신규 치료 표적의 확인을 보조하거나 또는 가능한 종양 저항성 메카니즘을 알릴 것이다.

종양 내의 세포독성 T 세포의 배치에 대한 예상된 및 관찰된 영향에 추가로, TGFβ1 억제제/항-PD-1 조합 치료는 또한 면역억제 골수 구획에 유익하게 영향을 미친다. CD11b+ 골수 세포는 비치료 MBT-2 종양에서 면역 침윤물의 거의 80%를 차지하였지만, 그의 표현은 조합 치료시 40% 미만으로 감소되었다. 이는 M2-유사 면역억제 대식세포의 상실 및 MDSC의 훨씬 더 현저한 감소에 의해 전체적으로 구동되었으며, 염증유발 M1-유사 대식세포 집단은 표현에서 변화되지 않은 채로 유지되었다. 조합 치료가 면역억제 골수 세포의 특이적 감소를 구동하는 메카니즘은 불명확하며, 종양 미세환경에서 이들 세포의 동원, 발생 또는 유지에서의 TGFβ1 신호전달의 역할도 그러하다. TGFβ 신호전달은 다른 인자들 중에서도 대식세포를 M2-유사로 분극시키는 것으로 공지되어 있다. 추가적으로, TGFβ가 부분적으로 MDSC 발생 및 억제 기능의 획득을 담당한다는 것을 시사하는 증거가 존재한다. 추가로, 변경된 종양 미세환경과 쌍을 이룬 IFNγ-분비 T 세포의 유입은 재분극 및 면역억제 골수 세포의 트래픽킹의 감소 둘 다에 기여할 가능성이 있다. 기저 메카니즘에 무관하게, 종양내 면역억제 골수 세포의 감소는 종양 면역요법 접근법의 일부로서 고도로 바람직할 것이며, 이는 이러한 세포 집단의 존재가 불량한 환자 예후 및 체크포인트 차단 요법에 대한 저항성과 상관관계가 있기 때문이다. 따라서, 이들 중요한 면역억제 세포 유형의 표적화를 포함하는 치료 전략은 종양 미세환경에서 단일 면역억제 세포 유형 (즉, 단지 Treg 세포만)을 표적화하는 것보다 더 큰 효과를 가질 수 있다. 따라서, 본 발명의 TGFβ1 억제제는 종양-연관 면역억제 세포, 예컨대 M2 대식세포 및 MDSC를 감소시키는데 사용될 수 있다.

이전에 언급된 바와 같이, TGFβ1은 Treg 세포, 억제성 골수 세포, 섬유모세포뿐만 아니라 종양 세포를 포함한, 종양 미세환경에서의 다중 세포 유형에 의해 발현될 가능성이 있음을 주목하는 것이 중요하다. 각각의 이들 세포 공급원은 상이한 LLC에서 TGFβ1을 생산하고: 활성화된 Treg 세포는 그의 표면 상에 GARP LLC를 발현하고; 억제성 골수 세포는 그의 표면 상에 LRRC33 LLC를 발현하고; 섬유모세포는 주위 세포외 매트릭스 내로 LTBP LLC를 발현하여 침착될 가능성이 있다. "활성화가능한" TGFβ1의 이들 공급원 각각은 종양에서 면역 배제 및 면역 억제를 촉진하는데 소정 역할을 할 수 있고, 각각의 공급원의 상대 기여는 상이한 종양 유형에 걸쳐 달라질 수 있을 가능성이 있다. 흥미롭게도, 이들 연구에 사용된 MBT-2 및 EMT6 종양의 mRNA 프로파일링은 LRRC33 및 LTBP1이 가장 고도로 발현된 LLC 성분이고, 클라우드만 S91 종양이 LRRC33을 독점적으로 발현하는 것으로 보인다는 것을 나타냈다 (도 20h). 따라서, 이들 모델에서 TGFβ1-선택적 억제제/항-PD-1 조합의 현저한 항종양 효과는, 모든 공지된 LLC 콘텍스트에서 TGFβ1 활성화를 강력하게 차단하는 본원에 개시된 TGFβ1 억제제의 입증된 능력과 함께, 특정 LLC (예를 들어, Treg 세포 상의 GARP)의 선택적 억제가 일부 종양에서 최대 항종양 반응을 생성하기에 충분하지 않을 수 있다는 것을 강하게 시사한다.

따라서, 본원에 제시된 전임상 연구 및 결과에 의해 TGFβ1 활성화의 고도로 특이적인 억제는 숙주 면역계가 임상 적용에 대한 주요 제한인 보다 광범위한 TGFβ 억제의 이전에 인식된 독성을 피하면서 체크포인트 차단 요법에 대한 1차 저항성의 주요 메카니즘을 극복할 수 있게 한다는 것이 입증된다. 본원에 개시된 결과는 고친화도 TGFβ1 억제제로의 치료가 체크포인트 차단 요법으로부터 이익을 얻을 수 있는 환자의 수를 의미있게 확장시킬 수 있다는 것을 시사한다.

따라서, 본원의 실시예에서 입증되는 바와 같이, TGFβ1의 고친화도, 이소형-선택적 억제제는 CBT에 대한 1차 저항성에 대항하여, 종양/암을 CBT에 보다 감수성이게 하는데 사용될 수 있다. 이러한 효과는 암/종양이 TGFβ1-양성인 넓은 스펙트럼의 악성종양 유형을 치료하는데 적용가능할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 종양/암은 추가의 이소형, 예컨대 TGFβ3을 추가로 발현할 수 있다. 후자의 비제한적 예는 특정 유형의 암종, 예컨대 유방암을 포함할 수 있다.

따라서, 본 발명은 TGFβ1의 고친화도, 콘텍스트-비의존성 억제제가 임상 이익을 달성할 가능성이 있는 환자 또는 환자 집단/하위집단을 확인 또는 선택하기 위한 바람직한 선택 기준을 제공한다. 일부 실시양태에서, 인간 종양의 적합한 표현형은 다음을 포함한다: i) 하위세트(들)는 CBT에 반응성인 것으로 제시됨 (예를 들어, PD-(L)1 축 차단); ii) 면역 배제의 증거; 및/또는 iii) TGFB1 발현 및/또는 TGFβ 신호전달의 증거. 예를 들어 흑색종 및 방광암을 포함한 다양한 암 유형이 프로파일에 피팅된다.

상기 언급된 바와 같이, TGFβ1 활성화의 콘텍스트-비의존성 억제제가 흑색종의 치료에 사용될 수 있다. 이러한 억제제로 치료될 수 있는 흑색종의 유형은 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 악성 흑색점; 악성 흑자 흑색종; 표재 확산성 흑색종; 말단 흑자 흑색종; 점막 흑색종; 결절성 흑색종; 폴립양 흑색종 및 결합조직형성 흑색종. 일부 실시양태에서, 흑색종은 전이성 흑색종이다.

보다 최근에는, 면역 체크포인트 억제제를 사용하여 진행성 흑색종 환자를 효과적으로 치료하였다. 특히, 항-프로그램화된 사멸 (PD)-1 항체 (예를 들어, 니볼루맙 및 펨브롤리주맙)는 현재 특정 유형의 암, 예컨대 진행성 흑색종에 대한 표준 관리가 되었으며, 이는 관리가능한 독성 프로파일과 함께 유의한 활성 및 지속적인 반응을 입증하였다. 그러나, PD-1 길항제의 효과적인 임상 적용은 높은 비율의 선천성 저항성 (~60-70%)에 의해 방해되며 (문헌 [Hugo et al. (2016) Cell 165: 35-44] 참조), 이는 진행중인 난제가 환자 선택 및 반응과 저항성의 예측인자뿐만 아니라 조합 전략의 최적화에 대한 의문을 계속해서 포함할 것임을 예시한다 (Perrot et al. (2013) Ann Dermatol 25(2): 135-144). 더욱이, 연구는 초기에 항-PD-1 요법에 반응한 흑색종 환자의 대략 25%에서 결국 획득 저항성이 발생하였다는 것을 시사하였다 (Ribas et al. (2016) JAMA 315: 1600-9).

PD-1 및/또는 CTLA-4를 발현하는 종양-침윤 CD8+ T 세포의 수는 체크포인트 억제로의 성공의 주요 지표인 것으로 보이고, PD-1 및 CTLA-4 차단 둘 다는 침윤 T 세포를 증가시킬 수 있다. 그러나, 종양-연관 대식세포가 더 많이 존재하는 환자에서, CD8 세포의 항암 효과는 억제될 수 있다.

LRRC33-발현 세포, 예컨대 골수 세포, 예를 들어 골수 전구체, MDSC 및 TAM은 특정 환자 집단에서 관찰된 항-PD-1 저항성을 적어도 부분적으로 강조할 수 있는 T 세포 (예를 들어, T 세포 고갈), 예컨대 CD4 및/또는 CD8 T 세포를 억제함으로써 면역억제 환경 (예컨대 TME 및 골수섬유화 골수)을 생성하거나 지지할 수 있는 것으로 고려된다. 실제로, 증거는 항-PD-1 단독요법에 대한 저항성이 CD8+ 세포독성 T 세포의 축적 실패 및 감소된 Teff/Treg 비에 의해 표시되었다는 것을 시사한다. 특히, 본 발명자들은 LRRC33 발현 수준에 관하여 특정 암 환자, 예컨대 흑색종 환자 집단 사이에 다음과 같은 분기가 있다는 것을 인식하였다: 하나의 군은 높은 LRRC33 발현 (LRRC33^고)을 나타내는 한편, 다른 군은 비교적 낮은 LRRC33 발현 (LRRC33^저)을 나타낸다. 따라서, 본 발명은 LRRC33^고 환자 집단이 면역 체크포인트 억제제 요법에 불량하게 반응성이거나 또는 그에 대해 저항성을 갖게 된 자를 나타낼 수 있다는 개념을 포함한다. 따라서, 본원에 기재된 것과 같은 LRRC33을 억제하는 작용제는 체크포인트 억제제 요법 (예를 들어, 항-PD-1)에 대해 저항성이 있는 암, 예컨대 흑색종, 림프종 및 골수증식성 장애의 치료에 특히 유익할 수 있다.

일부 실시양태에서, 암/종양은 면역 체크포인트 억제제에 대해 고유 저항성이 있거나 또는 그에 비반응성이다 (예를 들어, 1차 저항성). 하나의 예를 들자면, 특정 림프종은 면역 체크포인트 억제, 예컨대 항-PD-1 요법에 불량하게 반응성인 것으로 보인다. 유사하게, 흑색종 환자 집단의 하위세트는 면역 체크포인트 억제제에 대해 저항성을 나타내는 것으로 공지되어 있다. 특정한 이론에 얽매이는 것을 의도하지는 않지만, 본 개시내용의 발명자들은 이것이 적어도 부분적으로 체크포인트 억제제가 그의 효과를 발휘하지 못하는 면역억제 미세환경을 생성할 수 있는 TGFβ1 신호전달 경로의 상향조절로 인한 것일 수 있다는 것을 고려한다. TGFβ1 억제는 이러한 암을 체크포인트 억제제 요법에 대해 보다 반응성이게 할 수 있다. 면역 체크포인트 억제제 및 TGFβ1 억제제의 조합으로부터 이익을 얻을 수 있는 암 유형의 비제한적 예는 다음을 포함한다: 골수섬유증, 흑색종, 신세포 암종, 방광암, 결장암, 혈액 악성종양, 비소세포 암종, 비소세포 폐암 (NSCLC), 림프종 (전형적 호지킨 및 비-호지킨), 두경부암, 요로상피암, 높은 미소위성체 불안정성을 갖는 암, 미스매치 복구 결핍을 갖는 암, 위암, 신암 및 간세포성암. 그러나, 예를 들어 생검에 의해 결정시 TGFβ1이 과다발현되거나 또는 TGFβ2/3보다 우세한 이소형인 임의의 암 (예를 들어, 이러한 암을 갖는 환자)은 본 개시내용에 따라 TGFβ1의 이소형-선택적 억제제로 치료될 수 있다.

일부 실시양태에서, 암/종양은 시간 경과에 따라 저항성을 갖게 된다. 이러한 현상은 획득 저항성으로 지칭된다. 1차 저항성과 유사하게, 일부 실시양태에서, 획득 저항성은 적어도 부분적으로 TGFβ1-의존성 경로에 의해 매개되며, 본원에 기재된 이소형-특이적 TGFβ1 억제제는 이들 경우에 항암 면역을 회복시키는데 효과적일 수 있다. 본 발명의 TGFβ1 억제제는 종양의 재발생을 감소시키는데 사용될 수 있다. 본 발명의 TGFβ1 억제제는 암 요법, 예컨대 CBT의 지속성을 증진시키는데 사용될 수 있다. 요법과 관련하여 사용된 용어 "지속성"은 임상 효과 (예를 들어, 종양 제어)와 종양 재성장 (예를 들어, 재발생) 사이의 시간을 지칭한다. 아마도, 지속성 및 재발생은 2차 또는 획득 저항성과 상관관계가 있을 수 있으며, 여기서 환자가 초기에 반응한 요법은 작용을 정지한다. 따라서, 본 발명의 TGFβ1 억제제는 암 요법이 효과적인 상태로 유지되는 지속기간을 증가시키는데 사용될 수 있다. 본 발명의 TGFβ1 억제제는 요법의 반응자 중에서 획득 저항성이 발생할 확률을 감소시키는데 사용될 수 있다. 본 발명의 TGFβ1 억제제는 환자에서 무진행 생존을 증진시키는데 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 TGFβ1 억제제는 암 요법의 반응자 중에서 완전 반응 대 부분 반응의 비율 또는 비를 개선시키는데 사용될 수 있다. 전형적으로, 암 요법 (예컨대 CBT)에 대한 반응률이 비교적 높은 (예를 들어, ≥ 35%) 암 유형에서도, CR률은 매우 낮다. 따라서, 본 발명의 TGFβ1 억제제는 반응자 집단 내의 완전 반응자의 분율을 증가시키는데 사용된다.

추가로, 억제제는 또한 부분 반응자 중에서 부분 반응의 정도를 증진 또는 증대시키는데 효과적일 수 있다.

일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제 및 LRRC33 억제제 (예컨대 본원에 기재된 것)를 포함하는 조합 요법은 이러한 암을 치료하는데 효과적일 수 있다. 추가로, 종양에서의 높은 LRRC33-양성 세포 침윤물 또는 달리 비정상적 세포 증식을 갖는 부위/조직은 숙주 면역억제 및 면역 체크포인트 저항성에 대한 바이오마커로서의 역할을 할 수 있다. 유사하게, 이펙터 T 세포는 암을 퇴치하는 신체의 능력을 제한하는 면역억제 함요로부터 배제될 수 있다. 더욱이, 하기 실시예 섹션에서 입증된 바와 같이, GARP-제시된 TGFβ1을 발현하는 Treg는 이펙터 T 세포 증식을 억제한다. 종합하면, TGFβ1은 면역 억제 질환 미세환경 (예컨대 TME)의 생성 및 유지에서의 주요 구동인자이고, 다중 TGFβ1 제시 콘텍스트가 종양에 관련된다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 보다 유리한 Teff/Treg 비를 달성할 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 GARP-TGFβ1 복합체, LTBP1-TGFβ1 복합체, LTBP3-TGFβ1 복합체 및/또는 LRRC33-TGFβ1 복합체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법에 사용될 수 있으며, 상기 방법은 대상체에게 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 투여하여 암이 치료되도록 하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 암은 결장암이다. 특정 실시양태에서, 암은 흑색종이다. 특정 실시양태에서, 암은 방광암이다. 일부 실시양태에서, 암은 두경부암이다. 특정 실시양태에서, 암은 폐암이다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 GARP-TGFβ1 복합체, LTBP1-TGFβ1 복합체, LTBP3-TGFβ1 복합체 및/또는 LRRC33-TGFβ1 복합체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 고형 종양을 치료하는 방법에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 고형 종양은 전형적으로 치료 분자가 침투하기에 조밀하고 단단한 결합조직형성 종양일 수 있다. 이러한 종양의 ECM 성분을 표적화함으로써, 이러한 항체는 조밀한 종양 조직이 붕괴되도록 "느슨하게 하여", 그의 항암 효과를 발휘하기 위한 치료적 접근을 용이하게 할 수 있다. 따라서, 추가의 치료제, 예컨대 임의의 공지된 항종양 약물이 조합되어 사용될 수 있다.

추가적으로 또는 대안적으로, 본원에 개시된 것과 같은 TGFβ1 활성화를 억제할 수 있는 이소형-특이적, 콘텍스트-비의존성 항체 또는 그의 단편은 세포-기반 면역요법, 예컨대 암을 퇴치하기 위한 암 면역요법으로서의 키메라 항원 수용체 T-세포 ("CAR-T") 기술과 함께 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 GARP-TGFβ1 복합체, LTBP1-TGFβ1 복합체, LTBP3-TGFβ1 복합체 및/또는 LRRC33-TGFβ1 복합체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 고형 종양을 갖는 대상체에서 고형 종양 성장을 억제하거나 감소시키는 방법에 사용될 수 있으며, 상기 방법은 대상체에게 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 투여하여 고형 종양 성장이 억제 또는 감소되도록 하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 고형 종양은 결장 암종 종양이다. 일부 실시양태에서, 암을 치료하는데 유용한 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 TGFβ1 활성화의 이소형-특이적, 콘텍스트-비의존성 억제제이다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 GARP-TGFβ1 복합체, LTBP1-TGFβ1 복합체, LTBP3-TGFβ1 복합체 및 LRRC33-TGFβ1 복합체를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 GARP-TGFβ1 복합체, LTBP1-TGFβ1 복합체 및 LTBP3-TGFβ1 복합체를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 LTBP1-TGFβ1 복합체, LTBP3-TGFβ1 복합체 및 LRRC33-TGFβ1 복합체를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 GARP-TGFβ1 복합체 및 LRRC33-TGFβ1 복합체를 표적화한다.

본 발명은 대상체에서 고형 종양을 포함하는 암의 치료에서의 TGFβ1의 콘텍스트-비의존성 이소형-특이적 억제제의 용도를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 콘텍스트-비의존성 이소형-특이적 억제제는 TGFβ1의 활성화를 억제할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 이러한 활성화 억제제는 프로TGFβ1 복합체에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분이다. 결합은 복합체가 제시 분자, 예를 들어 LTBP1, LTBP3, GARP 또는 LRRC33 중 어느 하나와 회합되어, 복합체로부터의 성숙 TGFβ1 성장 인자의 방출을 억제하는 경우에 발생할 수 있다. 일부 실시양태에서, 고형 종양은 CAF 및 콜라겐 섬유와 직접 접촉하는 CD8+ T 세포가 풍부화된 기질을 갖는 것을 특징으로 한다. 이러한 종양은 항종양 면역 세포 (예를 들어, 이펙터 T 세포)가 종양을 효과적으로 침윤하는 것을 방지하는 면역-억제 환경을 생성하여, 암과 싸우는 신체의 능력을 제한할 수 있다. 대신에, 이러한 세포는 종양 기질 내에 또는 그 근처에 축적될 수 있다. 이들 특색은 이러한 종양을 면역 체크포인트 억제제 요법에 불량하게 반응성이게 할 수 있다. 하기에 보다 상세하게 논의된 바와 같이, 본원에 개시된 TGFβ1 억제제는, 예를 들어 면역 체크포인트 억제제와 함께 사용되어, 억제를 비차단하여 이펙터 세포가 암 세포에 도달하고 그를 사멸시키도록 할 수 있다.

TGFβ1은 종양 성장, 숙주 면역 억제, 악성 세포 증식, 혈관분포, 혈관신생, 이동, 침습, 전이 및 화학-저항성을 포함한 종양 미세환경에서 다면적 역할을 하는 것으로 고려된다. 따라서, 이러한 환경에서의 TGFβ1 제시의 각각의 "콘텍스트"는 질환 진행의 조절 (또는 조절이상)에 참여할 수 있다. 예를 들어, GARP 축은 암 세포를 퇴치하기 위한 숙주 면역 반응을 매개하기 위해 이펙터 T 세포 반응을 조절하는 Treg 반응에서 특히 중요하다. LTBP1/3 축은 기질을 포함한 ECM을 조절할 수 있으며, 여기서 암-연관 섬유모세포 (CAF)는 암의 발병기전 및 진행에서 소정 역할을 한다. LRRC33 축은 순환 단핵구의 종양 미세환경으로의 동원, 종양-연관 대식세포 (TAM)로의 후속 분화, 종양 조직 내로의 침윤 및 질환의 악화에서 중요한 역할을 할 수 있다.

일부 실시양태에서, TGFβ1-발현 세포는 종양에 침윤되어, 면역억제 국부 환경을 생성하거나 그에 기여한다. 이러한 침윤이 관찰되는 정도는 보다 악화된 예후와 상관관계가 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 보다 높은 침윤은 또 다른 암 요법, 예컨대 면역 체크포인트 억제제에 대한 보다 불량한 치료 반응을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 종양 미세환경에서의 TGFβ1-발현 세포는 면역억제 면역 세포, 예컨대 Treg 및/또는 골수 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 골수 세포는 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 대식세포, 단핵구 (조직 상주 또는 골수-유래), 및 MDSC.

일부 실시양태에서, TME에서의 LRRC33-발현 세포는 골수-유래 억제 세포 (MDSC)이다. MDSC 침윤 (예를 들어, 고형 종양 침윤)은 숙주의 항종양 면역 세포가 배제되는 면역억제 함요를 생성함으로써 적어도 하나의 면역 회피 메카니즘을 강조할 수 있다. 증거는 MDSC가 염증-연관 신호, 예컨대 종양-연관 염증 인자에 의해 동원되고, 동원시, MDSC가 질환-퇴치 세포, 예컨대 CD8+ T 세포 및 NK 세포를 손상시킴으로써 면역억제 효과에 영향을 미칠 수 있다는 것을 시사한다. 추가로, MDSC는 TGFβ 및 IL-10을 분비하고, 면역억제 효과에 추가로 부가됨으로써 Treg의 분화를 유도할 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 것과 같은 이소형-특이적 TGFβ1 억제제는 면역 회피 (예를 들어, 손상된 면역 감시)를 갖는 환자에게 투여되어 질환 (예컨대 종양)과 싸우는 신체의 능력을 회복시키거나 부스팅할 수 있다. 본원에 보다 상세하게 기재된 바와 같이, 이는 또 다른 요법, 예컨대 암 요법에 대한 신체의 반응성 또는 감수성을 추가로 증진시킬 수 있다 (예를 들어, 회복시키거나 강화시킬 수 있음).

일부 실시양태에서, 환자에서 순환 MDSC의 상승된 빈도 (예를 들어, 수)는 체크포인트 차단 요법, 예컨대 PD-1 길항제 및 PD-L1 길항제에 대한 불량한 반응성을 예측한다. 예를 들어, 바이오마커 연구는 순환 치료전 HLA-DR lo/CD14+/CD11b+ 골수-유래 억제 세포 (MDSC)가 진행 및 보다 불량한 OS와 연관되었음을 나타냈다 (p = 0.0001 및 0.0009). 추가로, 염증발생 두경부 암종 (HNC)에서의 PD-1 체크포인트 차단에 대한 저항성은 GM-CSF 및 골수 유래 억제 세포 (MDSC) 마커의 발현과 연관된다. 이러한 관찰은 MDSC를 고갈시키는 전략, 예컨대 화학요법이 항-PD-1과 조합하여 또는 순차적으로 고려되어야 한다는 것을 시사하였다. LRRC33 또는 LRRC33-TGFβ 복합체는 면역억제 골수 세포 상에서의 선택적 발현으로 인해 암 면역요법을 위한 신규 표적을 나타낸다. 따라서, 특정한 이론에 얽매이는 것을 의도하지는 않지만, 이러한 복합체를 표적화하는 것은 환자 집단에서 표준 관리 체크포인트 억제제 요법의 유효성을 증진시킬 수 있다.

따라서, 본 발명은 고형 종양을 포함하는 암의 치료를 위한 본원에 기재된 고친화도 이소형-특이적 TGFβ1 억제제의 용도를 제공한다. 이러한 치료는 적어도 1종의 국재화된 종양 (고형 종양)을 포함하는 암으로 진단된 대상체에게 TGFβ1 억제제를 암을 치료하는데 효과적인 양으로 투여하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 대상체는 암 요법, 예컨대 CBT, 화학요법 및/또는 방사선 요법으로 추가로 치료된다. 일부 실시양태에서, TGFβ1 억제제는 암 요법에 대한 1차 반응자 환자 집단의 비율/분율을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, TGFβ1 억제제는 암 요법에 대한 1차 반응자의 반응성의 정도를 증가시킨다. 일부 실시양태에서, TGFβ1 억제제는 암 요법에 대한 완전 반응자 대 부분 반응자의 비를 증가시킨다. 일부 실시양태에서, TGFβ1 억제제는 재발생 전 및/또는 암 요법이 비효과적이 되기 전의 지속기간이 연장되도록 암 요법의 지속성을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, TGFβ1 억제제는 1차 반응자 중에서 암 요법에 대한 획득 저항성의 발생 또는 확률을 감소시킨다.

증거는 암 진행 (예를 들어, 종양 증식/성장, 침습, 혈관신생 및 전이)이 적어도 부분적으로 종양-기질 상호작용에 의해 구동될 수 있다는 것을 시사한다. 특히, CAF는 다양한 시토카인 및 성장 인자의 분비 및 ECM 재형성에 의해 이러한 과정에 기여할 수 있다. 과정에 수반되는 인자는 기질-세포-유래 인자 1 (SCD-1), MMP2, MMP9, MMP3, MMP-13, TNF-α, TGFβ1, VEGF, IL-6, M-CSF를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 추가로, CAF는 종양 부위로 CCL2/MCP-1 및 SDF-1/CXCL12와 같은 인자를 분비함으로써 TAM을 동원할 수 있고; 후속적으로, TAM이 우선적으로 부착된 프로-TAM 함요 (예를 들어, 히알루로난-풍부화 기질 영역)가 생성된다. TGFβ1은 정상 섬유모세포의 근섬유모세포-유사 CAF로의 활성화를 촉진하는 것으로 시사되었기 때문에, 본원에 기재된 것과 같은 이소형-특이적, 콘텍스트-비의존성 TGFβ1 억제제의 투여는 CAF의 암-촉진 활성에 대항하는데 효과적일 수 있다. 실제로, 본원에 제시된 데이터는 TGFβ1의 활성화를 차단하는 이소형-특이적 콘텍스트-비의존성 항체가 마커 유전자, 예컨대 CCL2/MCP-1, α-SMA, FN1 및 Col1 (이들은 또한 많은 암에 연루됨)의 UUO-유도된 상향조절을 억제할 수 있다는 것을 시사한다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 GARP-TGFβ1 복합체, LTBP1-TGFβ1 복합체, LTBP3-TGFβ1 복합체 및/또는 LRRC33-TGFβ1 복합체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 암 또는 종양을 갖는 대상체에게 단독으로 또는 추가의 작용제, 예를 들어 항-PD-1 항체 (예를 들어, 항-PD-1 길항제)와 조합되어 투여된다. 본 발명에 포함되는 다른 조합 요법은 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합 부분과 방사선 (방사선 요법) 또는 화학요법제 (화학요법)의 투여이다. 예시적인 추가의 작용제는 PD-1 길항제, PDL1 길항제, PD-L1 또는 PDL2 융합 단백질, CTLA4 길항제, GITR 효능제, 항-ICOS 항체, 항-ICOSL 항체, 항-B7H3 항체, 항-B7H4 항체, 항-TIM3 항체, 항-LAG3 항체, 항-OX40 항체 (OX40 효능제), 항-CD27 항체, 항-CD70 항체, 항-CD47 항체, 항-41BB 항체, 항-PD-1 항체, 항-CD20 항체, CDK 억제제, 종양용해 바이러스 및 PARP 억제제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 유용한 종양용해 바이러스의 예는 아데노바이러스, 레오바이러스, 홍역, 단순 포진, 뉴캐슬병 바이러스, 세네카바이러스, 엔테로바이러스 및 백시니아를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 종양용해 바이러스는 종양 선택성을 위해 조작된다.

일부 실시양태에서, 특정한 암 유형 또는 환자 집단에 적합한 조합 요법을 위한 치료 접근법의 결정 또는 선택은 하기를 수반할 수 있다: a) 표준 관리 요법이 이용가능한 암 유형 (예를 들어, 면역요법-승인된 적응증)에 관한 고려; b) 치료-저항성 하위집단 (예를 들어, 면역 배제된/콜드 종양)에 관한 고려; 및 c) "TGFβ1 경로-활성"이거나 또는 달리 적어도 부분적으로 TGFβ1-의존성 (예를 들어, TGFβ1 억제-감수성)인 것으로 의심되거나 또는 일반적으로 의심되는 암/종양에 관한 고려. 예를 들어, 많은 암 샘플은 TGFβ1이, 예를 들어 TCGA RNAseq 분석에 의해 우세한 이소형임을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 각각의 종양 유형으로부터의 샘플의 50% 초과 (예를 들어, 50%, 60%, 70%, 80% 및 90% 초과)는 TGFβ1 이소형 발현에 대해 양성이다. 일부 실시양태에서, "TGFβ1 경로-활성"이거나 또는 달리 적어도 부분적으로 TGFβ1-의존성 (예를 들어, TGFβ1 억제-감수성)인 암/종양은 적어도 1개의 Ras 돌연변이, 예컨대 K-ras, N-ras 및/또는 H-ras에서의 돌연변이를 함유한다. 일부 실시양태에서, 암/종양은 적어도 1개의 K-ras 돌연변이를 포함한다.

환자로부터 수집된 임상 샘플 (예컨대 생검 샘플)에서의 TGFβ1 발현의 확인은 TGFβ1 억제 요법에 대한 전제조건이 아니며, 여기서 특정 상태는 일반적으로 TGFβ 경로를 수반하는 것으로 공지되거나 의심되었다.

일부 실시양태에서, 이소형-특이적, 콘텍스트-비의존성 TGFβ1 억제제는 1종 이상의 체크포인트 억제제 요법이 승인되거나 효과적인 것으로 제시된 암으로 진단된 환자에게 체크포인트 억제 요법과 함께 투여된다. 이들은 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 방광 요로상피 암종, 편평 세포 암종 (예컨대 두경부), 신장 투명 세포 암종, 신장 유두상 세포 암종, 간 간세포성 암종, 폐 선암종, 피부 흑색종 및 위 선암종을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 이러한 환자는 체크포인트 억제제 요법에 불량하게 반응성이거나 또는 비-반응성이다. 일부 실시양태에서, 불량한 반응성은 1차 저항성으로 인한 것이다. 일부 실시양태에서, 체크포인트 차단에 대해 저항성이 있는 암은 TCF7 발현의 하향조절을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 체크포인트 억제-저항성 종양에서의 TCF7 하향조절은 낮은 수의 종양내 CD8+ T 세포와 상관관계가 있을 수 있다.

이소형-특이적, 콘텍스트-비의존성 TGFβ1 억제제는 화학요법- 또는 방사선요법-저항성 암의 치료에 사용될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 이소형-특이적, 콘텍스트-비의존성 TGFβ1 억제제는 화학요법 및/또는 방사선 요법을 받거나 받은 암으로 진단된 환자에게 투여된다. 특히, TGFβ1 억제제의 사용은 암 (환자)이 이러한 요법에 대해 저항성이 있는 경우에 유리하다. 일부 실시양태에서, 이러한 암은 정지 종양 증식 암 세포 (TPC)를 포함하며, 여기서 TGFβ 신호전달은 화학요법 또는 방사선 요법으로부터 TPC를 보호하는 성장 정지된 상태로의 그의 가역적 진입을 제어한다. TGFβ1의 약리학적 억제시, 손상된 TPC는 정지기에 진입하지 못하고, 따라서 화학요법 및/또는 방사선 요법에 감수성이 되는 것으로 고려된다. 이러한 암은 다양한 암종, 예를 들어 편평 세포 암종을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Brown et al. (2017) "TGF-β-Induced Quiescence Mediates Chemoresistance of Tumor-Propagating Cells in Squamous Cell Carcinoma." Cell Stem Cell. 21(5):650-664]을 참조한다.

일부 실시양태에서, TGFβ1 억제제로 치료될 TGFβ1-양성 암은 또한 질환 조직 (예를 들어, 종양)이 이소형 둘 다를 공동-발현하는 것을 특징으로 하는 TGFβ3-양성 (즉, TGFβ1+/TGFβ3+ 암)이다. 일부 실시양태에서, 이러한 종양은 TGFβ1 및 TGFβ3 이소형 둘 다와 공동-우성이다. 따라서, 본 발명은 이러한 상태의 치료에서의 이소형-선택적 TGFβ3 억제제와 함께 이소형-선택적 TGFβ1 억제제의 용도를 포함한다. TGFβ1+/TGFβ3+ 암의 비제한적 예는 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 유방 암종 (예를 들어, 유방 침습성 암종), 담관암종, 다형성 교모세포종, 두경부 편평 세포 암종, 신장 투명 세포 암종, 폐 편평 세포 암종, 중피종, 췌장 선암종, 전립선 선암종, 육종, 흉선종 및 자궁 암육종.

골수증식성 장애 / 골수섬유증

본 개시내용은 골수증식성 장애의 치료에서의 본원에 개시된 것과 같은 TGFβ1의 고친화도, 이소형-선택적 억제제의 치료 용도를 제공한다. 이들은, 예를 들어 골수이형성 증후군 (MDS) 및 골수섬유증 (예를 들어, 원발성 골수섬유증 및 속발성 골수섬유증)을 포함한다.

골골수섬유증으로도 공지된 골수섬유증은 골수증식성 장애로 불리는 질환의 군에 속하는 비교적 드문 골수 증식성 장애 (암)이다. 골수섬유증은 골수증식성 신생물의 필라델피아 염색체-음성 (-) 분지로 분류된다. 골수섬유증은 클론 골수증식, 이상 시토카인 생산, 골수외 조혈 및 골수 섬유증을 특징으로 한다. 골수 및 다른 부위에서의 조혈 줄기 세포의 비정상적 클론의 증식은 섬유증 또는 골수의 반흔 조직으로의 대체를 유발한다. 용어 골수섬유증은, 달리 명시되지 않는 한, 원발성 골수섬유증 (PMF)을 지칭한다. 이는 또한 만성 특발성 골수섬유증 (cIMF) (용어 특발성 및 원발성은 이들 경우에 질환이 미지의 또는 자발적 기원의 것임을 의미함)으로 지칭될 수 있다. 이는 진성 다혈구혈증 또는 본태성 혈소판혈증에 속발성으로 발생하는 골수섬유증과 대조적이다. 골수섬유증은 골수 화생의 형태이며, 이는 골수의 혈액-형성 조직 내의 세포 유형에서의 변화를 지칭하고, 종종 2개의 용어는 동의어로 사용된다. 용어 원인불명 골수 화생 및 골수 화생 동반 골수섬유증 (MMM)은 또한 원발성 골수섬유증을 지칭하는 것으로 사용된다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 따라 치료될 수 있는 혈액 증식성 장애는 골수증식성 장애, 예컨대 골수섬유증을 포함한다. BCR-ABL (Ph) 음성 만성 골수증식성 장애의 소위 "전형적" 군은 본태성 혈소판혈증 (ET), 진성 다혈구혈증 (PV) 및 원발성 골수섬유증 (PMF)을 포함한다.

골수섬유증은 신체의 혈액 세포 정상 생산을 방해한다. 결과는 골수에서의 광범위한 반흔형성이며, 이는 중증 빈혈, 약화, 피로 및 종종 비대 비장으로 이어진다. 비정상적 조혈 세포 클론에 의한 (특히 거핵구에 의한) 시토카인, 예컨대 섬유모세포 성장 인자의 생산은 콜라겐 섬유증을 통해 골수의 조혈 조직을 결합 조직으로 대체하도록 한다. 조혈 조직의 감소는 새로운 혈액 세포를 생성하는 환자의 능력을 손상시켜, 모든 혈액 세포 유형이 부족해지는 진행성 범혈구감소증을 유발한다. 그러나, 섬유모세포의 증식 및 콜라겐의 침착은 2차 현상인 것으로 생각되고, 섬유모세포 자체는 비정상적 세포 클론의 일부가 아닐 수 있다.

골수섬유증은 골수에서의 비정상적 혈액 줄기 세포에 의해 유발될 수 있다. 비정상적 줄기 세포는 빠르게 성장하고 골수를 차지하는 성숙 및 불량하게 분화된 세포를 생산하여, 섬유증 (반흔 조직 형성) 및 만성 염증 둘 다를 유발한다.

원발성 골수섬유증은 야누스 키나제 2 (JAK2), 트롬보포이에틴 수용체 (MPL) 및 칼레티쿨린 (CALR)에서의 돌연변이와 연관되며, 이는 JAK-STAT 경로의 구성적 활성화로 이어질 수 있고, 골수의 진행성 반흔형성 또는 섬유증이 발생한다. 조혈 세포가 다른 영역, 특히 간 및 비장으로 이동하도록 강제되므로, 환자는 골수외 조혈, 즉 골수 이외의 부위에서 발생하는 혈액 세포 형성을 발생시킬 수 있다. 이는 이들 기관의 비대를 유발한다. 간에서, 비정상적 크기는 간비대로 불린다. 비장의 비대는 비장비대로 불리며, 이는 또한 범혈구감소증, 특히 혈소판감소증 및 빈혈을 유발하는데 기여한다. 골수외 조혈의 또 다른 합병증은 변형적혈구증가증 또는 비정상적 형상의 적혈구의 존재이다.

골수섬유증에서의 골수외 조혈의 주요 부위는 비장이며, 이는 통상적으로 골수섬유증을 앓고 있는 환자에서 현저하게 비대해진다. 비장의 대규모 비대의 결과로서, 다중 피막하 경색이 종종 비장에서 발생하며, 이는 비장으로의 중단된 산소 공급으로 인해 부분적 또는 완전한 조직 사멸이 발생한다는 것을 의미한다. 세포 수준에서, 비장은 적혈구 전구체, 과립구 전구체 및 거핵구를 함유하며, 거핵구는 그의 수 및 그의 비정상적 형상에 있어서 현저하다. 거핵구는 이러한 상태에서 관찰되는 속발성 섬유증을 유발하는데 수반될 수 있다.

TGFβ가 골수섬유증의 발병기전의 섬유화 측면에 수반될 수 있다는 것이 시사되었다 (예를 들어, 문헌 [Agarwal et al., "Bone marrow fibrosis in primary myelofibrosis: pathogenic mechanisms and the role of TGFβ" (2016) Stem Cell Investig 3:5] 참조). 원발성 골수섬유증에서의 골수 병리상태는 섬유증, 신혈관신생 및 골경화증을 특징으로 하고, 섬유증은 ECM에 침착되는 콜라겐의 생산의 증가와 연관된다.

다수의 바이오마커가 기재되었으며, 그의 대안은 질환을 나타내거나 또는 그와 상관관계가 있다. 일부 실시양태에서, 바이오마커는 세포 마커이다. 이러한 질환-연관 바이오마커는 질환 진행의 진단 및/또는 모니터링뿐만 아니라 요법의 유효성 (예를 들어, 요법에 대한 환자의 반응성)에 유용하다. 이들 바이오마커는 다수의 섬유화 마커, 뿐만 아니라 세포 마커를 포함한다. 폐암에서, 예를 들어 기관지폐포 세척 (BAL) 액 중 TGFβ1 농도는 양성 질환을 갖는 환자와 비교하여 폐암을 갖는 환자에서 유의하게 더 높은 것으로 보고되었으며 (~2+배 증가), 이는 또한 폐암의 진행 또는 치료 효과를 진단 및/또는 모니터링하기 위한 바이오마커로서의 역할을 할 수 있다.

골수섬유증이 비정상적 거핵구 발생과 연관되기 때문에, 거핵구뿐만 아니라 줄기 세포 계통의 그의 전구세포의 특정 세포 마커는 질환 진행뿐만 아니라 요법의 유효성을 진단 및/또는 모니터링하기 위한 마커로서의 역할을 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 유용한 마커는 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 분화된 거핵구의 세포 마커 (예를 들어, CD41, CD42 및 Tpo R), 거핵구-적혈구 전구 세포의 세포 마커 (예를 들어, CD34, CD38 및 CD45RA-), 통상의 골수 전구 세포의 세포 마커 (예를 들어, IL-3α/CD127, CD34, SCF R/c-kit 및 Flt-3/Flk-2) 및 조혈 줄기 세포의 세포 마커 (예를 들어, CD34, CD38-, Flt-3/Flk-2). 일부 실시양태에서, 유용한 바이오마커는 섬유화 마커를 포함한다. 이들은 비제한적으로 다음을 포함한다: TGFβ1/TGFB1, PAI-1 (세르핀1로도 공지됨), MCP-1 (CCL2로도 공지됨), Col1a1, Col3a1, FN1, CTGF, α-SMA, ACTA2, Timp1, Mmp8 및 Mmp9. 일부 실시양태에서, 유용한 바이오마커는 혈청 마커 (예를 들어, 혈청 샘플에서 발견 및 검출되는 단백질 또는 단편)이다.

TGFβ가 백혈병성 골수 함요의 성분이라는 발견에 기초하여, TGFβ 억제제로 골수 미세환경을 표적화하는 것이 이환 조직에서의 국부 TGFβ 이용가능성을 조절하는 제시 분자를 발현하는 백혈병성 세포를 감소시키기 위한 유망한 접근법일 수 있는 것으로 고려된다.

실제로, (용어 "골수섬유증" 그 자체가 시사하는 바와 같이) 골수-증식성 및 섬유화 측면 둘 다에서 TGFβ-의존성 조절이상을 나타내는 병리상태의 다면적 성질로 인해, 본원에 기재된 것과 같은 TGFβ1의 이소형-특이적, 콘텍스트-비의존성 억제제는 골수섬유증을 앓고 있는 환자에 대해 특히 유리한 치료 효과를 제공할 수 있다. 이러한 억제제의 LTBP-아암은 골수에서 ECM-연관 TGFβ1 복합체를 표적화할 수 있으며, 억제제의 LRRC33-아암은 골수 세포-연관 TGFβ1을 차단할 수 있는 것으로 고려된다. 추가로, 골수섬유증과 연관된 비정상적 거핵구 생물학은 GARP- 및 LTBP-매개 TGFβ1 활성 둘 다를 수반할 수 있다. TGFβ1의 이소형-특이적, 콘텍스트-비의존성 억제제는 이러한 복합체를 표적화하여 함요에서 활성 TGFβ1의 방출을 억제할 수 있다.

따라서, 이러한 TGFβ1 억제제는 다른 (또는 표준 관리) 치료, 예컨대 히드록시우레아 및 JAK 억제제에 대한 부적절한 반응을 갖거나 또는 그에 대해 불내성인, 원발성 및 속발성 골수섬유증을 갖는 환자의 치료에 유용하다. 이러한 억제제는 또한 중간 또는 고위험 골수섬유증 (MF), 예컨대 원발성 MF, 진성 다혈구혈증-후 MF 및 본태성 혈소판혈증-후 MF를 갖는 환자의 치료에 유용하다.

따라서, 본 발명의 한 측면은 원발성 골수섬유증을 치료하는 방법에 관한 것이다. 방법은 원발성 골수섬유증을 앓고 있는 환자에게 감소된 TGFβ 이용가능성을 유발하는 TGFβ 억제제를 포함하는 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, TGFβ1 활성화의 이소형-특이적, 콘텍스트-비의존성 모노클로날 항체 억제제가 골수섬유증을 갖는 환자에게 투여된다. 이러한 항체는 0.1 내지 100 mg/kg, 예컨대 1 내지 30 mg 범위의 투여량, 예를 들어 1 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 30 mg/kg 등으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 적합한 투여 요법은 매주 투여되는 1-30 mg/kg을 포함한다. 일부 실시양태에서, TGFβ1 억제제는 1주에 약 10 mg/kg으로 투여된다. 임의로, 투여 빈도는 초기 단계 후에, 예를 들어 1주 약 1회 (초기 단계 동안)에서 1개월 1회 (유지 단계 동안)로 조정될 수 있다.

항체를 포함하는 제약 조성물의 바람직한 투여 경로는 정맥내 또는 피하 투여이다. 조성물이 정맥내로 투여되는 경우에, 환자는 치료당 적합한 지속기간, 예를 들어 대략 30-120분 (예를 들어, 30분, 60분, 75분, 90분 및 120분)에 걸쳐 치료제를 제공받을 수 있고, 이어서 이를 총 여러 주기, 예를 들어 4주기, 6주기, 8주기, 10주기, 12주기 등 동안 수주, 예를 들어 3주, 4주, 6주 등마다 반복할 수 있다. 일부 실시양태에서, 환자는 6주기 또는 12주기 동안 28일 (4주)마다 정맥내 투여를 통해 1-10 mg/kg (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 mg/kg)의 용량 수준의 억제 항체를 포함하는 조성물로 치료된다. 일부 실시양태에서, 이러한 치료는 일련의 횟수의 투여 주기 후에 중단되는 것 대신에 만성 (장기) 요법 (예를 들어, 유익한 것으로 간주되는 한, 무기한으로 계속됨)으로서 투여된다.

골수섬유증은 백혈병의 유형으로 간주될 수 있지만, 또한 섬유증의 징후를 특징으로 한다. TGFβ가 ECM 항상성 (이의 조절이상은 조직 섬유증으로 이어질 수 있음)의 측면을 조절하는 것으로 공지되어 있기 때문에, ECM과 연관된 TGFβ 활성을 억제하는 것이 바람직하다. 따라서, LTBP (예컨대 LTBP1 및 LTBP3)에 의해 제시된 프로TGFβ에 결합하고 그를 억제하는 항체 또는 그의 단편이 본 발명에 의해 포괄된다. 일부 실시양태에서, 골수섬유증을 치료하기에 적합한 항체 또는 그의 단편은 이들이 프로TGFβ 복합체, 예컨대 LRRC33, GARP, LTBP1, LTBP3 또는 그의 임의의 조합과 연관된 것의 다중 콘텍스트에 결합할 수 있다는 점에서 "콘텍스트-비의존성"이다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 TGFβ 활성화의 콘텍스트-비의존성 억제제이며, 항체가 하기 잠복 복합체 중 임의의 것에 결합하고 그를 억제할 수 있는 것을 특징으로 한다: LTBP1-프로TGFβ, LTBP3-프로TGFβ, GARP-프로TGFβ 및 LRRC33-프로TGFβ. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 TGFβ의 하나의 이소형만을 포함하고 다른 이소형은 포함하지 않는 이러한 잠복 복합체에 결합하고 그를 억제하는 이소형-특이적 항체이다. 이들은, 예를 들어 LTBP1-프로TGFβ1, LTBP3-프로TGFβ1, GARP-프로TGFβ1 및 LRRC33-프로TGFβ1을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 고친화도로 우선적으로 결합하고 TGFβ1 신호전달을 억제하는 이소형-선택적 항체이다.

초기 생체내 데이터는 본원에 기재된 것과 같은 TGFβ1의 이소형-선택적 콘텍스트-비의존성 억제제가 원발성 골수섬유증의 번역가능한 뮤린 모델에서 골수섬유증을 치료하는데 사용될 수 있다는 것을 나타낸다. 단지 증후성 완화만을 제공하며 임상 또는 생존 이익은 제공하지 않는 현행 표준 관리 JAK2 억제제와 달리, TGFβ1의 이소형-선택적 콘텍스트-비의존성 억제제는 이환 마우스의 골수에서 유의한 항섬유화 효과를 달성하고, 또한 생존을 연장시킬 수 있으며, 이는 TGFβ1 억제제가 인간 환자에서 골수증식성 장애를 치료하는데 효과적일 수 있다는 개념을 지지한다.

본원에 기재된 조성물 및 방법으로 치료될 수 있는 골수증식성 신생물의 적합한 환자 집단은 다음을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다: a) 필라델피아 (+)인 환자 집단; b) 필라델피아 (-)인 환자 집단; c) "전형적"인 것으로 카테고리화된 환자 집단 (PV, ET 및 PMF); d) 돌연변이 JAK2V617F(+)를 보유하는 환자 집단; e) JAK2V617F(-)를 보유하는 환자 집단; f) JAK2 엑손 12(+)를 갖는 환자 집단; g) MPL(+)을 갖는 환자 집단; 및 h) CALR(+)을 갖는 환자 집단.

일부 실시양태에서, 환자 집단은 중간-2 또는 고위험 골수섬유증을 갖는 환자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 환자 집단은 이용가능한 요법에 불응성이거나 또는 그에 대한 후보가 아닌 골수섬유증을 갖는 대상체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 100-200 x 10⁹개/L의 혈소판 수를 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 치료를 받기 전에 > 200 x 10⁹개/L의 혈소판 수를 갖는다.

일부 실시양태에서, 이소형-특이적, 콘텍스트-비의존성 TGFβ1 억제제 요법을 받은 (및 그를 받아서 이익을 얻을 수 있는) 대상체는 중간-1 또는 더 높은 원발성 골수섬유증 (PMF) 또는 진성 다혈구혈증/본태성 혈소판혈증-후 골수섬유증 (PV/ET-후 MF)으로 진단된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 치료 전에 골수 섬유증으로 기록되었다. 일부 실시양태에서, 대상체는 치료 전에 유럽 컨센서스 등급화 점수에 의해 평가시 MF-2 이상 및 변형된 바우어마이스터 척도에 의해 평가시 등급 3 이상을 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 치료 전에 1의 ECOG 성능 상태를 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 치료 전에 5 내지 120 범위의 백혈구 수 (10⁹개/L)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 10-100% 범위인 JAK2V617F 대립유전자 부담을 갖는다.

일부 실시양태에서, 이소형-특이적, 콘텍스트-비의존성 TGFβ1 억제제 요법을 받은 (및 그를 받아 이익을 얻을 수 있는) 대상체는 (치료 전에) 수혈-의존성이며, 이는 대상체가 지난달에 임상적으로 명백한 출혈과 연관된 8.5 g/dL 미만의 헤모글로빈 수준으로 적어도 2 단위의 적혈구 수혈의 병력을 갖는 것을 특징으로 한다.

일부 실시양태에서, 이소형-특이적, 콘텍스트-비의존성 TGFβ1 억제제 요법을 받은 (및 그를 받아 이익을 얻을 수 있는) 대상체는 이전에 골수섬유증을 치료하기 위한 요법을 받았다. 일부 실시양태에서, 대상체는 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는 요법 중 1종 이상으로 치료를 받았다: AZD1480, 파노비노스타트, EPO, IFNα, 히드록시우레아, PEG화 인터페론, 탈리도미드, 프레드니손 및 JAK2 억제제 (예를 들어, 레스타우르티닙, CEP-701).

일부 실시양태에서, 환자는 골수외 조혈을 갖는다. 일부 실시양태에서, 골수외 조혈은 간, 폐, 비장 및/또는 림프절에 존재한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 질환 징후의 국재화된 부위 중 1개 이상에 국부로 투여된다.

이소형-특이적, 콘텍스트-비의존성 TGFβ1 억제제는 골수섬유증을 치료하는데 효과적인 양으로 환자에게 투여된다. 치료 유효량은 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 환자에서 골수섬유증의 1종 이상의 증상 및/또는 합병증을 완화시키기에 충분한 양이다: 골수 기질 내의 ECM의 과도한 침착 (골수의 섬유증), 신혈관신생, 골경화증, 비장비대, 간비대, 빈혈, 출혈, 골통 및 다른 골-관련 이환율, 골수외 조혈, 혈소판증가증, 백혈구감소증, 악액질, 감염, 혈전증 및 사망. 따라서, 본 개시내용의 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 TGFβ1 억제 요법은 특히 항섬유화 효과 및/또는 혈액 세포 수의 정상화를 포함하는 임상 이익을 달성할 수 있다. 이러한 요법은 생존을 연장시키고/거나 골수 이식에 대한 필요를 감소시킬 수 있다.

일부 실시양태에서, 양은 환자에서 (예컨대 거핵구성 세포의) TGFβ1 발현 및/또는 분비를 감소시키는데 효과적이다. 따라서 이러한 억제제는 치료된 환자에서 TGFβ1 mRNA 수준을 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 억제제는 골수에서, 예컨대 단핵 세포에서 TGFβ1 mRNA 수준을 감소시킨다. PMF 환자는 전형적으로 ~2,500 pg/mL 초과, 예를 들어 3,000, 3,500, 4,000, 4,500, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000 및 10,000 pg/mL 초과 (ELISA에 의해 측정시 ~600-2,000 pg/mL의 정상 범위와 대조)의 상승된 혈장 TGFβ1 수준을 나타낸다 (예를 들어, 문헌 [Mascaremhas et al. (Leukemia & Lymphoma, 2014, 55(2): 450-452)] 참조). 문헌 [Zingariello (Blood, 2013, 121(17): 3345-3363)]에서는 PMF 환자 및 대조군 개체의 혈장에서의 생물활성 및 총 TGFβ1 함량을 정량화하였다. 이 참고문헌에 따르면, PMF 환자에서의 중앙값 생물활성 TGFβ1은 43 ng/mL (4-218 ng/mL 범위)이고, 총 TGFβ1은 153 ng/mL (32-1000 ng/mL)이었으며, 대조군 대응물에서 값은 각각 18 (0.05-144) 및 52 (8-860)이었다. 따라서, 이들 보고에 기초하여, PMF 환자에서의 혈장 TGFβ1 함량은 대조군 또는 건강한 혈장 샘플과 비교하여 수배, 예를 들어 2배, 3배, 4배, 5배 등만큼 상승된다. 본원에 기재된, 예를 들어 4-12 투여 주기 (예를 들어, 2, 4, 6, 8, 10, 12 주기) 또는 예를 들어 4주마다의 만성 또는 장기 치료에 따라 0.1-100 mg/kg, 예를 들어 1-30 mg/kg 모노클로날 항체의 투여량의 억제제로 치료하는 것은 상응하는 기준선 (치료전)에 비해 적어도 10%, 예를 들어 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 및 50%만큼 혈장 TGFβ1 수준을 감소시킬 수 있다.

치료 효과 중 일부는 치료의 시작 후, 예를 들어 1주, 2주, 3주, 4주, 5주 또는 6주 후에 비교적 급속하게 관찰될 수 있다. 예를 들어, 억제제는 1-8주 내에 억제제로 치료된 환자의 골수 내의 줄기 세포 및/또는 전구체 세포의 수를 효과적으로 증가시킬 수 있다. 이들은 조혈 줄기 세포 및 혈액 전구체 세포를 포함한다. 골수 생검은 골수 세포의 빈도/수의 변화를 평가하기 위해 수행될 수 있다. 상응하게, 환자는 개선된 증상, 예컨대 골통 및 피로를 나타낼 수 있다.

골수증식성 장애 (예를 들어, 골수섬유증)를 앓고 있는 대상체는 상승된 수준의 백혈구 수 (예를 들어, 백혈병)를 나타낼 수 있다. 일부 실시양태에서, TGFβ1 억제제의 치료 유효량은 혈액 세포 수를 정상화하는데 효과적인 양이다. 일부 실시양태에서, 양은 치료전과 비교하여 대상체에서 총 백혈구 수를 감소시키는데 효과적이다. 일부 실시양태에서, 양은 치료전과 비교하여 대상체에서 총 혈소판 수를 감소시키는데 효과적이다. 일부 실시양태에서, 양은 치료전과 비교하여 대상체에서 헤모글로빈 수준을 증가 (예를 들어, 정상화 또는 회복)시키는데 효과적이다. 일부 실시양태에서, 양은 치료전과 비교하여 대상체에서 적혈구용적률 수준을 증가 (예를 들어, 정상화 또는 회복)시키는데 효과적이다.

골수섬유증의 형태학적 특징 중 하나는 골수 (예를 들어, 골수 기질)에서의 섬유증이며, 이는 부분적으로 이상 ECM을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 양은, 예를 들어 중간엽 기질 세포에 의한 과도한 콜라겐 침착을 특징으로 하는 섬유증을 감소시키는데 효과적이다. 일부 실시양태에서, 억제제는 치료를 받지 않은 대조군 대상체와 비교하여, 치료된 대상체에서 CD41-양성 세포, 예를 들어 거핵구의 수를 감소시키는데 효과적이다. 일부 실시양태에서, 무작위로 선택된 섹션에 의해 결정시 PMF 골수에서의 거핵구의 기준선 빈도는 제곱 밀리미터 (mm²)당 200-700개 세포 범위이고, PMF 비장에서는 제곱-밀리미터 (mm²)당 40-300개 거핵구 범위일 수 있다. 대조적으로, 정상 공여자의 골수 및 비장에서의 거핵구 빈도는 각각 140 미만 및 10 미만이다. 억제제로의 치료는 골수 및/또는 비장에서의 거핵구의 수 (예를 들어, 빈도)를 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 억제제로의 치료는 하류 이펙터 신호전달, 예컨대 SMAD2/3의 인산화의 감소된 수준을 유발할 수 있다. 일부 실시양태에서, 억제제는 본원에 기재된 것과 같은 섬유증 마커의 발현 수준을 감소시키는데 효과적이다.

골수섬유증을 갖는 환자는 비대 비장을 앓고 있을 수 있다. 따라서, 치료제의 임상 효과는 비장 크기의 변화를 모니터링함으로써 평가될 수 있다. 비장 크기는 공지된 기술, 예컨대 촉진에 의한 비장 길이의 평가 및/또는 초음파에 의한 비장 부피의 평가에 의해 조사될 수 있다. 일부 실시양태에서, TGFβ1의 이소형-특이적, 콘텍스트-비의존성 억제제로 치료될 대상체는 촉진에 의해 평가시 (치료 전에) 5 cm 이상, 예를 들어 5 내지 30 cm 범위의 기준선 비장 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, TGFβ1의 이소형-특이적, 콘텍스트-비의존성 억제제로 치료될 대상체는 초음파에 의해 평가시 (치료 전에) 300 mL 이상, 예를 들어 300-1500 mL 범위의 기준선 비장 부피를 갖는다. 본원에 기재된, 예를 들어 4-12 투여 주기 (예를 들어, 2, 4, 6, 8, 10, 12 주기) 후, 예를 들어 4주마다, 0.1-30 mg/kg 모노클로날 항체의 투여량의 억제제로 치료하는 것은 대상체에서 비장 크기를 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 억제제의 유효량은 억제제 치료를 받는 환자 집단에서의 비장 크기를 상응하는 기준선 값에 비해 적어도 10%, 20%, 30%, 35%, 40%, 50% 및 60%만큼 감소시키기에 충분하다. 예를 들어, 치료는 위약 대조군과 비교하여, MRI 또는 CT 스캔에 의해 측정시 12-24주 내에 기준선으로부터 비장 부피의 ≥35% 감소를 달성하는데 효과적이다. 일부 실시양태에서, 치료는 가장 잘 이용가능한 요법 대조군과 비교하여, MRI 또는 CT 스캔에 의해 측정시 24-48주 내에 기준선으로부터 비장 부피의 ≥35% 감소를 달성하는데 효과적이다. 가장 잘 이용가능한 요법은 히드록시우레아, 글루코코르티코이드, 뿐만 아니라 의약 없음, 아나그렐리드, 에포에틴 알파, 탈리도미드, 레날리도미드, 메르캅토퓨린, 티오구아닌, 다나졸, 페그인터페론 알파-2a, 인터페론-α, 멜팔란, 아세틸살리실산, 시타라빈 및 콜키신을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 것과 같은 이소형-특이적, 콘텍스트-비의존성 TGFβ1 억제제로 치료된 환자 집단은, 예를 들어 국제 골수섬유증 조사 및 치료 연구 그룹 (IWG-MRT) 기준에 의해 평가한 치료 반응, 치료 (예를 들어, 4, 6, 8 또는 12 주기) 후 변형된 바우어마이스터 척도 및 유럽 컨센서스 등급화 시스템에 의해 측정한 골수 섬유증 등급의 변화 정도, 골수증식성 신생물 증상 평가 형태 (MPN-SAF)를 사용한 증상 반응이 통계적으로 개선되었음을 나타낸다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 것과 같은 이소형-특이적, 콘텍스트-비의존성 TGFβ1 억제제로의 치료는, 예를 들어 0 내지 10의 척도 (여기서 0은 부재한다는 것이고 10은 상상할 수 있는 가장 불량한 것임)을 사용하여 골수섬유증의 쇠약 증상 (복부 불편감, 빠른 포만감, 왼쪽 갈비뼈 밑의 통증, 소양증, 야간 발한 및 골통/근육 통증)을 포착하는 1일 다이어리인 변형된 골수섬유증 증상 평가 형태 (MFSAF) 툴 (예컨대 v2.0)에 의해 증상을 측정하는 MFSAF에 의해 평가시, 통계적으로 개선된 치료 반응을 달성한다. 일부 실시양태에서, 치료는, 예를 들어 12-24주 내에 기준선으로부터 총 MFSAF 점수의 50%≥ 감소를 달성하는데 효과적이다. 일부 실시양태에서, 요법을 받은 환자의 유의한 분율이 위약을 받은 환자와 비교하여 총 증상 점수에서 ≥50% 개선을 달성한다. 예를 들어, ≥50% 개선을 달성한 환자 풀의 분율은 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% 또는 80% 초과일 수 있다.

일부 실시양태에서, 억제제의 치료 유효량은 빈혈 반응에 의해 평가시 임상 개선을 달성하기에 충분한 양이다. 예를 들어, 개선된 빈혈 반응은 4-12 주기, 예를 들어 6 주기의 치료 후에, 보다 긴 수혈-비의존성 지속기간, 예를 들어 8주 이상을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 억제제의 치료 유효량은 지속기간, 예를 들어 6주, 8주, 12주, 6개월 등 동안 안정 질환을 유지하기에 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 질환의 진행은 전체 골수 세포충실성의 변화, 레티쿨린 또는 콜라겐 섬유증의 정도, 및/또는 JAK2V617F 대립유전자 부담의 변화에 의해 평가될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 것과 같은 이소형-특이적, 콘텍스트-비의존성 TGFβ1 억제제로 치료된 환자 집단은 치료를 받지 않은 대조군 집단과 비교하여 통계적으로 개선된 (연장된) 생존을 나타낸다. 예를 들어, 대조군에서, PMF 환자의 중앙값 생존은 대략 6년 (고위험 환자에서는 대략 16개월)이고, 환자 중 20% 미만이 진단후 10년 이상 생존할 것으로 예상된다. 본원에 기재된 것과 같은 이소형-특이적, 콘텍스트-비의존성 TGFβ1 억제제로의 치료는 적어도 6개월, 12개월, 18개월, 24개월, 30개월, 36개월 또는 48개월만큼 생존 시간을 연장시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료는 위약을 받은 환자와 비교하여, 26주, 52주, 78주, 104주, 130주, 144주 또는 156주의 개선된 전체 생존을 달성하는데 효과적이다.

상기 예시된 것과 같은 요법의 임상 이익은 새로운 발병 빈혈을 갖거나 갖지 않는 환자에서 관찰될 수 있다.

이소형-특이적, 콘텍스트-비의존성 TGFβ1 억제제의 유리한 특색 중 하나는 선택성이 결여된 통상적인 TGFβ 길항제와 비교하여, 이소형 선택성에 의해 가능해진 개선된 안전성 프로파일을 유지한다는 것이다. 따라서, 본원에 기재된 것과 같은 이소형-특이적, 콘텍스트-비의존성 억제제는 통상적인 TGFβ 길항제로 치료된 동등한 환자 집단과 비교하여, 환자 집단에서의 유해 사건을 이러한 사건의 빈도 및/또는 중증도에 관하여 감소시킬 수 있는 것으로 예측된다. 따라서, 이소형-특이적, 콘텍스트-비의존성 TGFβ1 억제제는 치료의 투여량 및/또는 지속기간에 관하여 보다 큰 치료 범위를 제공할 수 있다.

유해 사건은 관련 기술분야에서 인식된 적합한 방법, 예컨대 유해 사건에 대한 통상 용어 기준 (CTCAE) 버전 4에 의해 등급화될 수 있다. 이전에 TGFβ 길항제, 예컨대 GC1008을 받은 인간 환자에서의 보고된 유해 사건은 다음을 포함한다: 백혈구증가증 (등급 3), 피로 (등급 3), 저산소증 (등급 3), 심장무수축 (등급 5), 백혈구감소증 (등급 1), 재발성, 일시적, 경도 홍반성, 결절성 피부 병변, 화농성 피부염, 및 대상 포진.

이소형-특이적, 콘텍스트-비의존성 TGFβ1 억제제 요법은, 예를 들어 빈혈, 혈소판감소증, 호중구감소증, 고콜레스테롤혈증, 상승된 알라닌 트랜스아미나제 (ALT), 상승된 아스파르테이트 트랜스아미나제 (AST), 타박상, 어지럼증 및 두통에 관하여, 골수섬유증 환자에서 JAK 억제제 요법과 비교하여 덜 빈번하고/거나 덜 심각한 유해 사건 (부작용)을 유발할 수 있으므로, 이에 따라 더 안전한 치료 옵션을 제공한다.

TGFβ1 신호전달의 억제제는 조합 (예를 들어, 부가) 요법으로서 골수섬유증의 치료를 위해 1종 이상의 치료제와 함께 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 TGFβ1 활성화의 억제제는 JAK1 억제제, JAK2 억제제 또는 JAK1/JAK2 억제제를 받았거나 또는 받을 후보인, 골수섬유증을 앓고 있는 환자에게 투여된다. 일부 실시양태에서는 이러한 환자가 JAK1 억제제, JAK2 억제제 또는 JAK1/JAK2 억제제 억제제 요법에 반응성이지만, 다른 실시양태에서는 이러한 환자가 JAK1 억제제, JAK2 억제제 또는 JAK1/JAK2 억제제 요법에 불량하게 반응성이거나 반응성이지 않다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 TGFβ1의 이소형-특이적 억제제의 사용은 JAK1 억제제, JAK2 억제제 또는 JAK1/JAK2 억제제 요법에 불량하게 반응성이거나 또는 반응성이지 않은 자를 보다 반응성이게 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 TGFβ1의 이소형-특이적 억제제의 사용은 여전히 환자에서 등가의 또는 의미있는 임상 효능 또는 이익을 생성하지만 더 적거나 더 낮은 정도의 약물-관련 독성 또는 유해 사건 (예컨대 상기 열거된 것)을 생성하는 감소된 투여량의 JAK1 억제제, JAK2 억제제 또는 JAK1/JAK2 억제제를 가능하게 할 수 있다. 일부 실시양태에서, JAK1 억제제, JAK2 억제제 또는 JAK1/JAK2 억제제 억제제 요법과 함께 사용되는 본원에 기재된 TGFβ1 활성화의 억제제로의 치료는 환자에서 상승작용적 또는 상가적 치료 효과를 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 TGFβ1 활성화의 억제제로의 치료는 JAK1 억제제, JAK2 억제제 또는 JAK1/JAK2 억제제 또는 골수섬유증을 치료하기 위해 제공되는 다른 요법의 이익을 부스팅할 수 있다. 일부 실시양태에서, 환자는 골수섬유증과 연관된 빈혈을 다루기 위한 치료제를 추가적으로 받을 수 있다.

섬유화 상태

물리적 손상/외상, 독성 물질 및/또는 감염으로 인한 조직 손상에 반응하여, 섬유모세포, 여러 상이한 유형의 면역 세포, 및 상주 상피 및 내피 세포를 포함한 여러 세포 유형을 수반하는 자연 복구 과정이 시작된다. 그러나, 점검되지 않고 방치되면, 이러한 과정은 세포외 매트릭스 (ECM) 및 섬유증의 과도한 축적으로 이어질 수 있으며, 이는 차례로 조직 기능 및 기관 부전의 점진적 상실을 일으킬 수 있다 (Caja et al., Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 1294).

섬유증은 폐, 신장, 간, 심장 및 피부를 포함한 다수의 기관에서 발생할 수 있다. 기관과 독립적으로, 섬유화 반응은 염증, 변경된 상피-중간엽 상호작용 및 섬유모세포의 증식을 특징으로 한다. 섬유증의 특징 중 하나는 섬유모세포에서 근섬유모세포로의 분화이며, 이는 ECM의 조절이상에 크게 기여한다. 그러나, 근섬유모세포는 또한 다른 세포 공급원 (예를 들어, 내피 세포, 상피 세포 및 중간엽 줄기 세포)으로부터 유래하는 것으로 제안되었다 (Kim, K.K. et al., Cold Spring Harb. Perspect. Biol., 2017; Okabe, H. Histol. Histophathol., 2016, 31, 141-148; 및 Li, C et al., Nat Commun., 2016, 7, 11455). 더욱이, 면역 세포는 근섬유모세포의 분화를 촉진하고, ECM 침착을 자극하고, 추가의 면역 세포를 손상된 조직으로 동원하는 시토카인 및 케모카인을 분비함으로써 이러한 과정에서 중요한 역할을 한다 (Caja et al., Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 1294).

섬유화 조직과 유사하게, 암-연관 섬유모세포의 활성화는 종양 환경에서 발생할 수 있으며, 이는 과량의 ECM을 생산한다. ECM은 다른 세포 (예를 들어, 종양발생-촉진 면역 세포)의 침윤을 위한 스캐폴드 및 세포 이동을 위한 기질을 제공한다. 다른 경우에, 과량의 ECM은 항-종양발생 면역 세포에 대한 장벽으로서 작용할 수 있다.

TGFβ는 섬유화 반응의 중앙 조정자로서 인식된다. TGFβ는 근섬유모세포 분화를 촉진하고, 면역 세포를 동원하고, 상피 및 내피 세포 분화에 영향을 미칠 수 있다. 특히, TGFβ는 ECM 및 기저막 단백질, 예컨대 피브로넥틴, 콜라겐, 라미닌, 오스테오폰틴, 테나신, 엘라스틴, 데코린의 생산을 상향조절한다. TGFβ-유도된 근섬유모세포 분화는 ECM 단백질의 추가의 침착, 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMP)의 분비 및 근섬유모세포 증식으로 이어질 수 있다 (Fabregat et al., FEBS J. 2016, 283, 2219-2232; Meng et al., Nat. Rev. Nephrol. 2016, 12, 325-338; 및 Kulkarni et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 2016, 54, 751-760). 추가적으로, TGFβ는 혈관 평활근 세포 (VSCM)에서 수축 단백질 및 콜라겐 I에 영향을 미치는 표현형 변화를 매개하고, 근섬유모세포 및 다른 기질 세포를 활성화시켜 콜라겐 가교 단백질, 예컨대 리실 옥시다제 (LOX) 패밀리의 매트릭스-재형성 효소의 합성을 증진시킬 수 있다 (Busnadiego et al., Mol. Cell. Biol. 2013, 33, 2388-2401). 더욱이, TGFβ는 섬유화유발 세포 유형, 예컨대 근섬유모세포 및 CAF의 분화에 기여하는 EMT 및 EndMT 둘 다를 조절하는 것으로 밝혀졌다. 더욱이, TGFβ는 다른 조직 중에서도 폐 및 간 섬유증을 촉진할 수 있는 상피 아폽토시스를 유도하는 것으로 밝혀졌다 (Barbas-Filho et al., J. Clin. Pathol. 2001, 54, 132-138; 및 Wang et al., Dev. Dyn. 2017, 247, 492-508).

선천성이든 또는 동원되든, 대식세포는 조직 손상 및 복구에 반응하는데 중요한 역할을 한다. 그러나, 특정 신호시에 이들은 섬유화유발 상태가 될 수 있다. 다른 시토카인 중에서도, TGFβ는 또한 염증유발성인 M2 대식세포를 활성화시키는 것으로 밝혀졌다. 활성화시에, 이들 대식세포는 TGFβ, ECM 성분, 혈관신생 인자 및 화학주성 인자를 포함한 그 자신의 시토카인을 분비한다. M2 대식세포는 TGFβ-구동된 폐 섬유증에 필수적인 것으로 밝혀졌다 (Murray et al., Int. J. Biochem. Cell Biol. 2011, 43, 154-162).

따라서, 본 발명에 따르면, 본원에 기재된 것과 같은 TGFβ1의 이소형-특이적 억제제는 대상체에서의 섬유증 (예를 들어, 섬유화 적응증, 섬유화 상태)의 치료에 사용된다. 본 발명을 수행하는데 적합한 억제제는 섬유증을 변경시키거나 호전시키는데 유용할 수 있는 본 개시내용에 따른 항체 및/또는 조성물을 포함한다. 보다 구체적으로, 이러한 항체 및/또는 조성물은 다양한 유형의 제시 분자에 의해 제시된 TGFβ1을 표적화할 수 있는 TGFβ1의 선택적 길항제이다.

TGFβ를 표적화하는 항체는 수많은 전임상 모델에서 섬유증을 감소시킨다. 이러한 항체 및/또는 항체-기반 화합물은 LY2382770 (일라이 릴리(Eli Lilly), 인디애나주 인디애나폴리스)을 포함한다. 미국 특허 번호 US 6,492,497, US 7,151,169, US 7,723,486 및 미국 출원 공개 번호 2011/0008364 (이들 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 것이 또한 포함된다. 선행 기술 TGFβ 길항제는, 예를 들어 TGFβ의 인테그린-의존성 활성화를 표적화하고 차단하는 작용제를 포함한다.

그러나, 증거는 이러한 선행 기술 작용제가 이소형-특이적 억제를 매개하지 않을 수 있고 TGFβ2 및/또는 TGFβ3의 정상 기능을 의도치 않게 차단함으로써 원치않는 효과를 유발할 수 있다는 것을 시사한다. 실제로, 본 출원인은 정상 (비이환) 폐 조직이 비교적 낮지만 측정가능한 수준의 TGFβ2 및 TGFβ3을 함유하지만 TGFβ1은 현저히 더 적게 함유한다는 것을 이전에 주목하였다. 비교하면, 섬유증과 같은 특정 질환 상태에서, TGFβ1은 다른 이소형에 비해 우선적으로 상향조절된다 (WO 2018/129329). 바람직하게는, 이러한 상태의 치료에 사용하기 위한 TGFβ 길항제는 조직에서 긴장성 신호전달을 매개하도록 정상적으로 발현되는 다른 이소형의 기능을 보존하면서, 단지 질환-유도 또는 질환-연관 이소형에 대해서만 그의 억제 활성을 발휘한다. 선행 기술 억제제 (LY2109761, 소분자 TGFβ 수용체 길항제, 및 αVβ6 인테그린을 표적화하는 모노클로날 항체) 둘 다는 비-이환 래트 BAL에서 TGFβ 하류 긴장성 신호전달을 억제하여, 이들 억제제가 원치않는 부작용을 유발할 수 있는 가능성을 상승시키는 것으로 밝혀졌다. 대안적으로 또는 추가적으로, TGFβ의 인테그린-의존성 활성화를 표적화하고 차단하는 작용제는, 다양한 세포 유형에 의해 발현되고 발병기전에서 소정 역할을 하는 수많은 인테그린 유형 중에서, 질환-연관 TGFβ1 활성화를 담당하는 인테그린의 하위세트만을 차단할 수 있다. 추가로, 이러한 길항제가 TGFβ1 이소형의 인테그린-매개 활성화를 선택적으로 차단할 수 있는 경우에도, 이는 다른 방식, 예컨대 프로테아제-의존성 활성화에 의해 촉발되는 TGFβ1 활성화를 차단하는데 비효과적일 수 있다. 대조적으로, 본원에 기재된 것과 같은 TGFβ1의 이소형-특이적 억제제는 이소형 선택성을 유지하면서, 특정한 활성화 방식과 무관하게 TGFβ1의 활성화 단계를 방지하는 것을 목표로 한다.

이소형-특이적 TGFβ3 억제제는 특정한 질환 상태에서 치료 이익을 제공할 수 있는 것으로 추가로 고려된다. 예를 들어, TGFβ1 억제제로 치료될 특정 섬유화 질환은 또한 질환 조직 (예를 들어, 섬유화 조직)이 둘 다의 이소형을 발현하는 것을 특징으로 하는 TGFβ3-양성 (즉, TGFβ1+/TGFβ3+ 섬유화 조직)일 수 있다. 따라서, 본 발명은 이러한 상태의 치료에서의 이소형-선택적 TGFβ3 억제제와 함께 이소형-선택적 TGFβ1 억제제의 용도를 포함한다. 이러한 TGFβ3 억제제는 콘텍스트-비의존성 또는 콘텍스트-편향일 수 있다.

본 개시내용의 항체 및/또는 조성물이 치료적으로 사용될 수 있는 섬유화 적응증은 폐 적응증 (예를 들어, 특발성 폐 섬유증 (IPF), 만성 폐쇄성 폐 장애 (COPD), 알레르기성 천식, 급성 폐 손상, 호산구성 식도염, 폐동맥 고혈압 및 화학적 기체-손상), 신장 적응증 (예를 들어, 당뇨병성 사구체경화증, 초점성 분절성 사구체경화증 (FSGS), 만성 신장 질환 (CKD), 신장 이식 및 만성 거부와 연관된 섬유증, IgA 신병증 및 용혈성 요독성 증후군), 간 섬유증 (예를 들어, 비-알콜성 지방간염 (NASH), 만성 바이러스성 간염, 기생충혈증, 대사의 선천성 이상, 독소-매개 섬유증, 예컨대 알콜 섬유증, 비-알콜성 지방간염-간세포성 암종 (NASH-HCC), 원발성 담즙성 간경변증 및 경화성 담관염과 연관되거나 이에 의해 유발된 것), 심혈관 섬유증 (예를 들어, 심근병증, 비대성 심근병증, 아테롬성동맥경화증 및 재협착), 전신 경화증, 피부 섬유증 (예를 들어, 전신 경화증, 미만성 전신 피부 경화증, 경피증, 병리학적 피부 반흔형성, 켈로이드, 수술후 반흔형성, 반흔 교정 수술, 방사선-유도된 반흔형성 및 만성 상처에서의 피부 섬유증), 눈 관련 상태, 예컨대 망막하 섬유증, 포도막염 증후군, 특발성 복막후 섬유증과 연관된 포도막염, 외안근 섬유증, 주요 조직적합성 복합체 (MHC 부류 I) 또는 조직적합성 항원과 연관된 눈 질환, 황반 변성 (예를 들어, 연령-관련 황반 변성)에서의 망막하 섬유증, 및 암 또는 속발성 섬유증 (예를 들어, 골수섬유증, 두경부암, M7 급성 거핵모구성 백혈병 및 점막염)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본 개시내용의 화합물 및/또는 조성물을 사용하여 치료될 수 있는 섬유증 (변성 장애 포함)과 관련된 다른 질환, 장애 또는 상태는 자궁선근증, 자궁내막증, 마르팡 증후군, 강직 피부 증후군, 경피증, 류마티스 관절염, 골수 섬유증, 크론병, 궤양성 결장염, 전신 홍반성 루푸스, 근육 이영양증 (예컨대 DMD), 파킨슨병, ALS, 듀피트렌 구축, 카무라티-엥겔만 질환, 신경 반흔형성, 치매, 증식성 유리체망막병증, 각막 손상, 녹내장 배액 수술 후 합병증, 및 다발성 경화증 (MS)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

많은 섬유화 적응증은 또한 이환 조직(들)의 염증과 연관되며, 이는 면역 성분의 관여를 나타낸다. 이러한 염증은 이상 면역 세포 집단, 예컨대 증가된 수의 Th17 세포, 감소된 수의 Treg 세포 및/또는 둘 다가 동반될 수 있다. 각각의 경우에, 이환 환자는 증가된 Th17/Treg 세포 비를 나타낼 수 있다. 이소형-선택적 항체의 GARP- 및/또는 LRRC33-표적화 활성은 이들 콘텍스트에 대한 억제 효과를 제공할 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및/또는 방법으로 치료될 수 있는 섬유화 적응증은 기관 섬유증, 예컨대 폐의 섬유증 (예를 들어, IPF), 신장의 섬유증 (예를 들어, CKD와 연관된 섬유증), 간의 섬유증 (예를 들어, NASH와 연관되거나 이로 인한 것), 심장 또는 심장 조직의 섬유증, 피부의 섬유증 (예를 들어, 경피증), 자궁 (예를 들어, 자궁내막, 자궁근층)의 섬유증, 근육 (예를 들어, 골격근)의 섬유증, 및 골수의 섬유증을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 요법은 환자에서 기관 이식에 대한 필요를 감소시키거나 지연시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 요법은 환자의 생존을 연장시킬 수 있다.

IPF를 치료하기 위해, 치료로부터 이익을 얻을 수 있는 환자는 가족성 IPF를 갖는 자 및 산발성 IPF를 갖는 자를 포함한다. 치료 유효량의 TGFβ1의 이소형-특이적 억제제의 투여는 폐 조직에서의 근섬유모세포 축적을 감소시키고, 콜라겐 침착을 감소시키고, IPF 증상을 감소시키고, 폐 기능을 개선시키거나 유지하고, 생존을 연장시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 억제제는 IPF의 섬유화 환경 내에서의 ECM-연관 TGFβ1 (예를 들어, LTBP1/3에 의해 제시된 프로/잠복 TGFβ1)의 활성화를 차단한다. 억제제는 대식세포-연관 TGFβ1 (예를 들어, LRRC33에 의해 제시된 프로/잠복 TGFβ1)의 활성화를 임의로 추가로 차단할 수 있다 (예를 들어, 폐포 대식세포). 그 결과, 억제제는 피브로넥틴 방출 및 다른 섬유증-연관 인자를 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 억제제는 간 성상 세포 활성화를 차단한다.

간 성상 세포 (HSC)의 활성화는 간 손상에서 섬유증의 주요 구동인자라는 것은 잘 확립되어 있다. 이러한 과정에서, 정지 비타민-A-저장 세포는 증식성 섬유발생 근섬유모세포 (세포외 매트릭스 (ECM) 단백질 축적의 주요 공급원)로 전환분화된다. 그러나, 이러한 과정은 자가포식, 내형질 세망 스트레스, 산화성 스트레스, 레티놀 및 콜레스테롤 대사, 후성학 및 수용체-매개 신호를 포함한 많은 상이한 경로에 의해 매개되는 것으로 밝혀졌다. 더욱이, 대식세포, 간세포, 간 동모양혈관 내피 세포, 자연 킬러 세포, 자연 킬러 T 세포, 혈소판 및 B 세포를 포함한 염증 세포가 또한 HSC 활성화를 조정하는 것으로 밝혀졌다 (Tsuchida and Friedman, Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology volume 14, pages 397-411 (2017)). 단지 하나의 특정한 예에서, 세키(Seki) 등은 TLR4 (박테리아에 의해 제시된 LPS를 인식함) 활성화가 케모카인 분비의 상향조절로 이어지고, 쿠퍼 세포의 화학주성을 유도하며, 또한 HSC를 TGFβ-유도된 신호에 감작화시키고, 쿠퍼 세포의 비제한된 활성화를 가능하게 한다는 것을 입증하였다 (Seki et al. Nature Medicine volume 13, pages 1324-1332 (2007)).

염증이 간 섬유증 발생 및 진행에서 중요한 역할을 한다는 것은 널리 공지되어 있다. 구체적으로, 간 손상은 TGFβ를 포함한 섬유화유발 인자를 생산하는 염증 및 단핵구/대식세포 (뿐만 아니라 림프구, 호산구 및 형질 세포)의 동원으로 이어진다. 더욱이, 연구는 간 조직-상주 대식세포 (쿠퍼 세포) 및 골수-유래 동원된 대식세포 둘 다가 간 섬유증의 진행에서 중요한 역할을 하고, TGFβ 경로가 간 섬유증 동안 대식세포의 분극화 및 섬유화유발 기능을 촉진할 수 있다는 것을 나타낸다. 실제로, 쿠퍼 세포 및 동원된 대식세포 둘 다는 HSC를 활성화시키고, TGFβ를 포함한 주변분비 메카니즘에 의해 이들의 근섬유모세포로의 전환분화를 유도할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 근섬유모세포는 차례로 ECM 성분을 생산하고 침착시키며, 이는 섬유증으로 이어진다 (Fabregat and Caballero-Diaz, Front Oncol. 2018; 8: 357).

그러나, 근섬유모세포는 또한 문맥 및 상주 섬유모세포, 골수-유래 섬유세포, EMT를 겪은 간 상피 세포, EndMT를 겪은 내피 세포, 및 혈관 평활근 세포 및 혈관주위세포를 포함한 다른 공급원으로부터 기원할 수 있다. 실제로, TGFβ는 또한 증가된 근섬유모세포를 유발하여 간 섬유증을 구동하는 EndMT 및 EMT 둘 다를 조절하는 것으로 밝혀졌다 (Pardali et al., Int J Mol Sci. 2017 Oct; 18(10): 2157). 따라서, TGFβ를 표적화하는 것은 섬유화 상태의 치료를 위한 매력적인 치료 표적이었다.

TGFβ는 간 섬유증 및 질환 진행에서 많은 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, TGFβ는 HSC에서 근섬유모세포로의 활성화를 담당하는 것으로 밝혀졌다. TGFβ는 또한 근섬유모세포 집단의 증가에 기여할 수 있는 간세포에서의 상피-중간엽 이행 (EMT)을 매개하는 것으로 밝혀졌다. 더욱이, TGFβ는 종양 세포 가소성의 변화를 유도하는 것으로 밝혀졌다 (Fabregat and Caballero-Diaz, Front Oncol. 2018; 8: 357).

TGFβ는 섬유화 및/또는 종양 미세환경에서의 많은 상이한 세포 공급원 상에서 발견될 수 있으며, 따라서 이는 다수의 상이한 제시 분자 (예를 들어, LTBP1, LTBP3, GARP 및/또는 LRRC33)에 의한 TGFb 제시를 시사하지만, 특정 상황에서는 다른 것보다 TGFβ의 특정한 공급원을 표적화하는 것이 유익할 수 있다. 예를 들어, 헨더슨(Henderson) 등은 HSC에서 αv 인테그린을 결실시키는 것이 마우스를 CCL₄-유도된 간 섬유증으로부터 보호하였다는 것을 나타냈다 (Henderson et al., Nat. Med. 2013, 19, 1617-16-24). 인테그린은 LTBP-제시된 TGFβ의 주요 활성화제이기 때문에, 이는 LTBP-제시된 TGFβ를 표적화하는 것이 특정 상황에서 섬유증을 치료하기에 충분할 수 있다는 것을 시사한다. 그러나, 면역 세포는 섬유화 반응에서 중요한 역할을 하기 때문에, 대부분의 또는 모든 제시 분자 TGFβ 복합체에 의해 제시된 TGFβ를 표적화하는 TGFβ 억제제가 유익할 수 있다.

최근 수년간, 간 섬유증의 치료는 전세계적으로 그의 증가하는 유병률로 인해 증가된 관심 분야가 되었다. 예를 들어, 비-알콜성 지방간 질환 (NAFLD)은 대사 이상, 예컨대 비만, 인슐린 저항성, 공복 고혈당증, 이상지혈증 및 변경된 아디포카인 프로파일과 연관된다. NAFLD는 간세포에서의 과도한 지질 축적을 특징으로 하고, 간 지방증 (간세포에서의 지질/지방 액적 축적)에서 비-알콜성 지방간염 (NASH), 간 섬유증 및 결국 가장 중증 경우인 간경변증으로 진행되는 질환의 스펙트럼이다. 섬유증 또는 간경변증을 갖는 NASH는 간세포성 암종 (HCC)이 발생할 위험을 증가시킨다 (Starley BQ, et al. Hepatology 2010; 51: 1820-1832). 지방증에서 NASH로의 진행은 '다중-히트' 모델에 의해 조절되는 것으로 제안되었으며, 여기서 제1 히트는 인슐린 저항성 및 대사 장애이고, 이는 간 지방증에 이어 산화성 스트레스, 염증유발 시토카인-매개 간세포 손상, 유리 지방산에 의해 매개되는 변경된 지질 분할 및 간독성, 비정상적 간내 콜레스테롤 부하, 고인슐린혈증, 고렙틴혈증 및 저아디포넥틴혈증으로 이어진다 (Tilg H, Moschen AR, Hepatology 2010; 52: 1836-1846; 및 Yilmaz Y., Aliment Pharmacol Ther 2012; 36: 815-823).

많은 동물 모델이 간 섬유증을 연구하기 위해 개발되었지만, 임의의 적합한 전임상 모델이 사용될 수 있다. 예를 들어, 마우스에서의 고지방 식이는 인간 NAFLD의 조직병리학 및 발병기전 둘 다를 모방하는 것으로 밝혀졌다. 더욱이, 일부 유전자 모델은 인간 대사 증후군 및 NAFLD의 특색, 예컨대 db/db 및 ob/ob 마우스 모델을 또한 나타낸다. 또한 NASH의 연구를 위한 동물 모델들이 존재하며, 이는 주로 메티오닌 및 콜린-결핍 식이 (MCD), 고-콜레스테롤 식이 (HCD), 콜린-결핍 고 지방 식이 (CDHFD), 콜린-결핍 L-아미노산-결핍 식이, 콜린-결핍 L-아미노산-결핍 식이 + 사염화탄소, 고-지방 식이 + 스트렙토조토신, 고 지방 + 고 콜레스테롤 식이 (HFHC), 고-프룩토스 식이 (HFD) 및 고-프룩토스 고 지방 식이 (HFHF)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 식이-유도된 모델로 이루어진다. NASH의 연구를 위한 유전자 마우스 모델은 foz/foz 마우스, 간세포-특이적 PTEN-결핍 마우스, Db/db 마우스 + 디에틸니트로사민 (DEN) 및 db/db 마우스 + MCD를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 모든 이들 모델 각각의 플러스 및 마이너스를 포함한 세부사항은 문헌 [Jennie Ka Ching Lau et al., J Pathol 2017; 241: 36-44]에 약술되어 있으며; 이의 내용은 본원에 참조로 포함된다.

간 섬유증에서 이소형-특이적 TGFβ 억제제의 효능을 시험하는데 유용한 또 다른 모델은 사염화탄소 (CCL₄) 모델을 포함한다. 간 섬유증에서 이소형-특이적 TGFβ 억제제의 효능을 시험하는데 유용한 또 다른 모델은 담관 결찰 (BDL) 모델을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Tag et al., J Vis Exp. 2015; (96): 52438] 참조).

본원에 제공된 것과 같은 이소형-특이적 TGFβ1 억제제는 간의 섬유화 상태, 예컨대 지방간 (예를 들어, 비-알콜성 지방간 질환 (NAFLD) 및 비-알콜성 지방간염 (NASH))을 치료하는데 사용될 수 있다. 지방간은 염증이 발생할 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 지방간으로 인한 간의 염증 (즉, 지방간염)은 반흔형성 (섬유증)으로 진행될 수 있으며, 이는 이어서 종종 경변증 (간의 구조를 왜곡시키고 그의 기능을 손상시키는 반흔형성)으로 진행된다. 따라서, 억제제는 이러한 상태를 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 억제제는 간의 섬유화 환경 내에서의 ECM-연관 TGFβ1 (예를 들어, LTBP1/3에 의해 제시된 프로/잠복 TGFβ1)의 활성화를 차단한다. 억제제는 대식세포-연관 TGFβ1 (예를 들어, LRRC33에 의해 제시된 프로/잠복 TGFβ1)의 활성화를 임의로 추가로 차단할 수 있다 (예를 들어, 쿠퍼 세포 (성상 대식세포로도 공지됨)뿐만 아니라 침윤 단핵구-유래 대식세포 및 MDSC). 그 결과, 억제제는 섬유증-연관 인자 (예를 들어, 본원에 기재된 섬유화 마커)를 억제할 수 있다. 이러한 상태를 갖는 대상체에서의 억제제의 투여는 억제제로 치료되지 않은 대조군 집단과 비교하여, 1종 이상의 증상을 감소시키고/거나, 질환의 진행을 방지 또는 지연시키고/거나, 간에서의 지방 축적을 감소 또는 안정화시키고/거나, 질환-연관 바이오마커 (예컨대 혈청 콜라겐 단편)를 감소시키고/거나, 간 반흔형성을 감소시키고/거나, 간 강성을 감소시키고/거나, 달리 억제제로 치료된 환자 집단에서 임상적으로 의미있는 결과를 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 유효량의 억제제는 NASH 환자에서 감소된 간 지방 및 감소된 섬유증 (예를 들어, 반흔형성) 둘 다를 달성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 유효량의 억제제는 NASH 환자에서 지방간염을 악화시키지 않으면서 섬유증의 적어도 하나의 병기만큼의 개선을 달성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 유효량의 억제제는 NASH 환자에서 간부전 및/또는 간암의 발생률을 감소시킬 수 있다.

일부 실시양태에서, 유효량의 억제제는 대조군과 비교하여, 요법의 시작 후, 예를 들어 12-36주에 평가시, 다중 염증성 또는 섬유화 혈청 바이오마커의 수준을 정상화시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 염증성 또는 섬유화 바이오마커는 NAFLD의 중증도를 평가하고/거나 (간 지방증의 수준을 측정함으로써), 치료를 위한 환자를 선택하고/거나, 질환 진행 또는 치료 반응을 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 혈액 바이오마커 및 패널은 다음을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다:

i) 지방간 지수 (BMI, 허리 둘레, 혈청 트리글리세리드 및 감마-글루타밀트랜스퍼라제 (GGT));

ii) 간 지방증 지수 (혈청 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 (AST):알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT) 비, BMI, 성별 및 당뇨병의 존재);

i) NAFLD 간 지방 점수 (혈청 ALT, HDL 콜레스테롤, 트리글리세리드, 헤모글로빈 A_1c 및 백혈구 수);

ii) 스테아토테스트(SteatoTest) (바이오프레딕티브(BioPredictive)) (총 빌리루빈, GGT, α2-마크로글로빈, 합토글로빈, ALT, 아포지단백질 AI, 총 콜레스테롤, 트리글리세리드, 글루코스의 혈청 수준 (연령 및 성별에 대해 조정됨) 및 BMI); 및

iii) NAFLD 리지 점수 (ALT, HDL 콜레스테롤, 트리글리세리드, 헤모글로빈 A_1c의 혈청 수준, 백혈구 수 및 동반이환 데이터 (및 고혈압의 존재)).

일부 실시양태에서, 영상화 바이오마커가 간 지방증의 수준을 평가하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 영상화 바이오마커는 다음을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다: 초음파검사, 제어 감쇠 파라미터 (CAP), MRI-추정 양성자 밀도 지방 분획 (MRI-PDFF) 및 자기 공명 분광분석법 (MRS).

간 생검은 NASH 진단을 위한 현행 표준이지만, 병리학자들 사이의 변동성은 이러한 진단 방법의 유효성을 제한한다. 따라서, 지방간 진행 억제 (FLIP) 알고리즘 (조직학적 지방증, 활성 및 섬유증 점수를 포함함)의 사용이 생검에 의한 NASH 진단의 일관성을 개선시키는데 사용될 수 있다. 더욱이, 많은 비침습성 바이오마커가 또한 질환을 진단하고 모니터링하는데 유용할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 염증성 또는 섬유화 바이오마커는 NASH의 중증도를 평가하고/거나, 치료를 위한 환자를 선택하고/거나, 질환 진행 또는 치료 반응을 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 혈액 바이오마커는 다음을 포함할 수 있다:

i) 아폽토시스 마커, 예컨대 CK18 단편, 총 시토케라틴 및 sFAS;

ii) 염증성 마커, 예컨대 CRP, TNF, IL-8 및 CXCL10;

iii) 지질 산화 생성물, 예컨대 11-HETE, 9-HODE, 13-HODE, 12-옥소-ODE, LA-13-HODE (oxNASH 점수) 및 11,12-디HETrE;

iv) 리소솜 효소, 예컨대 카텝신 D; 및

v) 조합 패널, 예컨대 NASH테스트 (바이오프레딕티브) 및 NASH 진단 패널 (당뇨병, 성별, BMI 및 트리글리세리드, CK18 단편 및 총 CK18의 혈청 수준을 포함함).

일부 실시양태에서, 바이오마커 및 관련 패널은 섬유증 및/또는 간경변증의 수준을 진단하고/거나, 치료를 위한 환자를 선택하고/거나, 질환 진행 또는 치료 반응을 모니터링하는데 유용할 수 있다. 예를 들어, 간 섬유증 및 간경변증의 비침습적 시험은 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: AST:ALT 비, AST:혈소판 비 지수, 섬유증-4 지수 (연령, AST, ALT 및 혈소판 수), NAFLD 섬유증 점수 (연령, BMI, 공복 글루코스 장애 및/또는 당뇨병, AST, ALT, 혈소판 수 및 알부민), BARD 점수 (AST, ALT, BMI 및 당뇨병).

특정 섬유증 마커 및 패널이 또한 유용할 수 있고, 이는 다음을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다: 히알루론산; PIIPNP; 프로-C3; TIMP1; 라미닌; 증진된 간 섬유증 (ELF) 패널 (PIINP, 히알루론산, TIMP1); 피브로테스트 (GGT, 총 빌리루빈, α₂m, 아포지단백질 AI 및 합토글로빈); 및 피브로미터 NAFLD (체중, 프로트롬빈 지수, ALT, AST, 페리틴 및 공복 글루코스). 간 섬유증에 대한 영상화 바이오마커는 다음을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다: 피브로스캔 (TE), 점 횡파 탄성측정법 (pSWE) (일명 음향 방사력 임펄스 (ARFI)), 2D-3D SWE, 자기 공명 탄성측정법 (MRE) 및 다중파라미터 MRI.

일부 실시양태에서, 다양한 SNP, 무세포 ncRNA 및 miRNA의 평가를 포함하는 유전자 및 게놈 바이오마커는 NAFLD 위험 및 중증도를 평가하는데 유용할 수 있다. 공지된 유전자 및 게놈 바이오마커, 뿐만 아니라 상기 논의된 혈액 바이오마커, 패널, 영상화 바이오마커 및 시험의 포괄적 검토는 문헌 [VWS Wong et al., Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2018 Aug;15(8):461-478]에 요약되어 있으며; 이의 내용은 본원에 참조로 포함된다.

일부 실시양태에서, NASH 환자에서, 이소형-특이적 TGFβ1 억제제는 미오스타틴 억제제를 포함하나 이에 제한되지는 않는 1종 이상의 추가의 요법을 받은 환자에서 투여될 수 있으며, 이는 일반적으로 NASH 및 NAFLD를 포함한 대사 증후군의 임상 징후를 갖는 환자에서 대사 조절을 증진시킬 수 있다.

일부 실시양태에서, 추가의 요법은 TGFβ3 억제제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, TGFβ3 억제제는 이소형-특이적 TGFβ3 억제제이다. 일부 실시양태에서, TGFβ3 억제제는 콘텍스트-비의존성 또는 콘텍스트-편향 TGFβ3 억제제이다. 일부 실시양태에서, NASH 환자는 TGFβ1-양성 및 TGFβ3-양성 섬유화 조직을 갖는다. 일부 실시양태에서, NASH 환자는 TGFβ1 억제제 요법에 대해 부분적으로 반응성이거나 또는 그러한 것으로 결정되었다.

일부 실시양태에서, NASH 환자에서, 이소형-특이적 TGFβ1 억제제는 아세틸 CoA 카르복실라제 억제제 (ACCi) (예를 들어, 피르소코스타트 (GS-0976) 또는 PF-05221304)를 받은 환자에서 투여될 수 있다. 본원에 기재된 개선된 이소형-특이적 TGFβ1 억제제와 조합되어 유용할 수 있는 다른 치료제는 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: GLP-1 수용체 효능제 또는 유사체 (예를 들어, 세마글루티드), 파르네소이드 X 수용체 (FXR) 효능제 (예를 들어, GS-9674; 일명 실로펙서), ASK1 억제제 (예를 들어, 세론세르팁); 오베티콜산, PPAR 효능제 (예를 들어, GFT505; 일명 엘라피브라노르); 니타족사니드, 케토헥소키나제 (KHK) 억제제 (예를 들어, PF-06835919); 및/또는 디아실글리세롤 O-아실트랜스퍼라제 2 (DGAT2) 억제제 (예를 들어, PF-06865571). 일부 실시양태에서, 상기 언급된 치료제 중 임의의 1종 이상은 본 개시내용의 이소형 특이적 TGFβ1 억제제, 예를 들어 FXR 효능제, ACC 억제제 및/또는 GLP-1 유사체와 조합된 이소형-특이적 TGFβ1 억제제와 조합되어 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이소형-선택적 TGFβ1 억제제는 미오스타틴 억제제, 예컨대 미오스타틴 활성화 억제제 (예를 들어, SRK-015, 예를 들어 WO 2016/073853 및 WO 2017/049011)와 조합되어 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이소형-선택적 TGFβ1 억제제는 GDF11 억제제, 예컨대 GDF11 활성화 억제제 (예를 들어, WO 2017/015622)와 조합되어 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 이소형 특이적 TGFβ1 억제제를 단독으로 또는 1종 이상의 추가의 치료제와 조합하여 사용한 치료는 MRI-PDFF에 의해 측정시 간 지방을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 간 지방의 감소는 적어도 20%, 예를 들어 ≥ 20%, ≥ 25%, ≥ 30%, ≥ 35%, ≥ 40%, ≥ 45% 또는 ≥ 50%이다. 일부 실시양태에서, 이소형 특이적 TGFβ1 억제제를 단독으로 또는 1종 이상의 추가의 치료제와 조합하여 사용한 치료는 혈청 ALT 및/또는 GGT를 적어도 20%, 예를 들어 ≥ 20%, ≥ 25%, ≥ 30%, ≥ 35%, ≥ 40%, ≥ 45% 또는 ≥ 50%만큼 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 이소형 특이적 TGFβ1 억제제를 단독으로 또는 1종 이상의 추가의 치료제와 조합하여 사용하는 치료는 담즙산 합성을 감소시킨다.

일부 실시양태에서, NASH 환자는 진행성 간 섬유증 (F3/F4기)을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 환자는 F3기 진행성 간 섬유증을 갖는다. 일부 실시양태에서, 이러한 환자는 간경변증을 특징으로 하는 F4기 간 섬유증을 갖는다. 일부 실시양태에서, NASH 환자는 간세포성 암종 및/또는 식도 정맥류가 발생하거나 발생할 위험이 있다.

비알콜성 지방간염 임상 연구 네트워크 병리학 위원회에 의해 유래된 분류에 따른 비-알콜성 지방간 질환에서의 섬유증 병기결정이 하기에 제공된다:

요법 동안 다양한 조직학적 특색의 평가를 가능하게 하고 NAFLD의 전체 스펙트럼을 포괄하기 위해, NASH 임상 연구 네트워크 (CRN) 병리학 위원회는 NASH에서 관찰된 상이한 조직학적 특색과 병리학 위원회에 따른 NASH의 진단 사이의 연관성에 대한 완전한 단변량 및 다변량 분석을 수행하였다. 결과는 NASH 활성 (등급) 및 콜라겐 침착 플러스 구조적 재형성 (병기) 둘 다의 점수화 시스템이었다. 등급화 시스템인 NASH 활성 점수 (NAS)는 다음 3종의 조직학적 성분의 비가중 합계였다: 지방증 (0-3), 소엽성 염증 (0-3) 및 풍선화 변성 (0-2). 이는 0 내지 8의 범위였다. NAS는 잠재적으로 가역적인 활성 손상의 특색을 포함한다. 추가적으로, 브룬트(Brunt) 등의 섬유증 병기결정 시스템이 추가로 개발되었다. NASH CRN 시스템에서, 1기에 대한 섬유증 점수는 섬세한 (1A) 및 조밀한 (1B) 동모양혈관주위 섬유증으로 세분된 반면, 1C기는 수반되는 동모양혈관주위 섬유증이 없는 문맥 섬유증으로 정의되었다 (문헌 [Stal, World J Gastroenterol. 2015 Oct 21; 21(39): 11077-11087] (본원에 참조로 포함됨) 참조).

본원에 제공된 것과 같은 이소형-특이적 TGFβ1 억제제는 사구체 및 세관간질에서의 TGFβ의 유의하게 증가된 발현이 관찰된 신장의 섬유화 상태, 예를 들어 세포외 매트릭스 축적을 특징으로 하는 질환 (IgA 신병증, 초점성 및 분절성 사구체경화증, 초승달형 사구체신염, 루푸스 신염 및 당뇨병성 신병증)을 치료하는 데 사용될 수 있다. TGFβ에 의해 유발된 2종의 매트릭스 성분인 피브로넥틴 EDA+ 및 PAI-1의 사구체 및 세관간질성 침착이 매트릭스 축적을 갖는 모든 질환에서 유의하게 상승하였지만, 상관관계 분석은 주로 TGFβ1 이소형과의 밀접한 관계를 밝혀냈다. 따라서, 이소형-특이적 TGFβ1 억제제는 TGFβ가 세포외 매트릭스의 병리학적 축적과 연관되는 인간 사구체 장애의 스펙트럼에 대한 치료제로서 유용하다.

일부 실시양태에서, 신장의 섬유화 상태는 만성 신장 질환 (CKD)과 연관된다. CKD는 주로 고혈압 또는 당뇨병에 의해 유발되고, 매년 백만명 초과의 생명을 앗아 간다. CKD 환자는 엄격한 식이 및 의약에서 투석 및 이식에 이르는 평생의 의료 관리를 필요로 한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 TGFβ1 억제제 요법은 투석 및/또는 이식에 대한 필요를 감소 또는 지연시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 요법은 다른 치료에 대한 필요 (예를 들어, 투여량, 빈도)를 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 이소형-특이적 TGFβ1 억제제는 미오스타틴 억제제를 포함하나 이에 제한되지는 않는 1종 이상의 추가의 요법을 받은 환자에서 투여될 수 있으며, 이는 일반적으로 CKD를 갖는 환자에서의 대사 조절을 증진시킬 수 있다.

본 개시내용의 TGFβ1 억제제로 치료될 수 있는 섬유화 상태는 섬유증 및/또는 만성 염증을 수반하는 상태를 포함한다. 이러한 상태는 뒤시엔느 근육 이영양증 (DMD) 및 다른 유전 장애, 예컨대 다발성 경화증 (MS) 및 낭성 섬유증 (CF)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 신경근육 장애일 수 있다. ECM- 및 면역 세포-연관 TGFβ1 아암 둘 다의 억제를 통해, 본원에 기재된 것과 같은 TGFβ1 억제제는 섬유화 진행을 억제하고 M1/M2 대식세포 분극화를 회복시키는 것으로 생각된다.

CKD 및 신장 섬유증을 연구하는데 유용한 모델은 NZB/W, MRL/lpr　및 BXSB 마우스 계통, 항-GBM 모델, 항-Thy1 모델, 5/6 신절제술, 방사선 신병증, 퓨로마이신 아미노뉴클레오시드 신증 (PAN) 및 아드리아마이신 신병증, 폴산 신병증, CyA 신병증, DOCA-염 신병증, HIV-연관 신병증 (HIVAN) 트랜스제닉 마우스 모델, 자발성 고혈압 래트 (SHR), 버팔로/mna 래트, 뮌헨 위스타 프룀터 (MWF) 래트, 일측성 요관 폐쇄 (UUO), Col4A 녹-아웃 마우스 (알포트 증후군)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다 (문헌 [Yang et al. Drug Discov Today Dis Models. 2010; 7(1-2): 13-19] 참조; 이의 내용은 본원에 참조로 포함됨).

본원에 제공된 방법으로 치료될 수 있는 기관 섬유증은 심장 (예를 들어, 심혈관) 섬유증을 포함한다. 일부 실시양태에서, 심장 섬유증은 심부전, 예를 들어 만성 심부전 (CHF)과 연관된다. 일부 실시양태에서, 심부전은 심근 질환 및/또는 대사 질환과 연관될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이소형-특이적 TGFβ1 억제제는 심장 섬유증 및 대사 장애를 수반하는 심장 기능장애를 갖는 환자에서의 미오스타틴 억제제를 포함하나 이에 제한되지는 않는 1종 이상의 추가의 요법을 받은 환자에서 투여될 수 있다.

심장 섬유증을 연구하는데 유용한 유전자 모델은 심장 근세포-특이적 FAK-KO 마우스, 유전자 변형된 SR-BI / apoE 이중 KO (dKO) 마우스, 신데칸-1 널 마우스, EC-SOD-과다발현 마우스, PKC-δ 녹아웃 마우스를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 심장 섬유증을 연구하는데 유용한 외과적 마우스 모델은 관상 동맥 결찰, 허혈성-재관류 모델 (개방 및 폐쇄 흉부), 만성 허혈 모델, 허혈성 사전조건화 모델에 의한 허혈-재관류, 랑겐도르프 모델, 횡단 대동맥 협착 (TAC), 상행 대동맥 협착, 복부 대동맥 협착, 폐동맥 밴딩, 원위 좌측 전방 관상동맥 결찰에 의한 TAC, 대동정맥루 (ACF) 모델 및 대동맥 기능부전 모델을 포함하나 이에 제한되지는 않는다 (문헌 [Rai et al., Mol Cell Biochem. 2017 Jan; 424(1-2): 123-145] 참조; 이의 내용은 본원에 참조로 포함됨).

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및/또는 방법으로 치료될 수 있는 섬유화 상태는 결합조직형성을 포함한다. 결합조직형성은 신생물 주위에서 발생하여, 종양 주위의 조밀한 섬유증 (예를 들어, 결합조직형성 기질), 또는 복부 수술 후 복부 내의 반흔 조직을 유발할 수 있다. 일부 실시양태에서, 결합조직형성은 악성 종양과 연관된다. 악성종양을 둘러싼 그의 조밀한 형성으로 인해, 통상적인 항암 치료제 (예를 들어, 화학요법)는 임상 효과를 위해 암성 세포에 도달하도록 효과적으로 침투하지 않을 수 있다. 본원에 기재된 것과 같은 TGFβ1의 이소형-특이적 억제제는 섬유화 형성이 느슨해져 항암 요법의 효과를 보조하도록 결합조직형성을 파괴하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, TGFβ1의 이소형-특이적 억제제는 단독요법으로서 사용될 수 있다 (하기 계속).

일부 실시양태에서, 환자는 섬유화 고형 종양 (예를 들어, 결합조직형성)을 갖고 외과적 후보 풀이거나 또는 외과적 후보 풀로부터 배제되어 섬유화 고형 종양이 절제가능하지 않거나 또는 수술가능하지 않은 것으로 간주된다. 이러한 환자는 본 개시내용의 TGFβ1 억제 요법을 받기 위한 후보일 수 있다. 본 발명의 TGFβ1 억제제는 환자가 외과적 절제를 위한 후보가 될 수 있도록 투여 후에 종양이 절제가능해지도록 또는 수술가능해지도록 할 수 있다.

섬유화 상태를 갖는 환자를 치료하기 위해, TGFβ1 이소형-특이적 억제제는 섬유증을 치료하는데 효과적인 양으로 대상체에게 투여된다. 이러한 항체의 유효량은 대상체에서 치료 효능 및 임상 안전성 둘 다를 달성하는데 효과적인 양이다. 일부 실시양태에서, 억제제는 ECM에 국재화된 (예를 들어, 테더링된) LTBP-매개 TGFβ1 및 면역 세포에 국재화된 (예를 들어, 그 상에 테더링된) GARP-매개 TGFβ1의 활성화를 차단할 수 있는 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 ECM에 국재화된 LTBP-매개 TGFβ1 및 단핵구/대식세포에 국재화된 (예를 들어, 그 상에 테더링된) LRRC33-매개 TGFβ1의 활성화를 차단할 수 있는 항체이다. 일부 실시양태에서, LTBP는 LTBP1 및/또는 LTBP3이다. 일부 실시양태에서, 섬유화 미세환경에서의 섬유화유발, M2-유사 대식세포 상의 LRRC33에 의해 제시된 TGFβ1을 표적화 및 억제하는 것이 유익할 수 있다.

섬유증의 변경을 위한 본 개시내용의 항체 및/또는 조성물의 효능을 결정하는데 유용한 검정은 섬유모세포를 계수하기 위한 조직학적 검정 및 관련 기술분야에 공지된 기본적인 면역조직화학적 분석을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

일부 실시양태에서, 순환 LAP 단편(들)은 섬유생성의 혈청 마커로서 사용될 수 있다. 이러한 단편의 절단된 말단을 특이적으로 인식하는 항체는 혈청 샘플로부터 LAP 단편을 검출하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 8,198,412를 참조하며, 이의 내용은 본원에 참조로 포함된다.

당뇨병에서의 TGFβ의 역할

췌장에서의 인슐린-분비 β-세포의 상실은 제2형 당뇨병의 주요 메카니즘이다. 최근 연구는 β-세포 기능 및 글루코스 항상성을 조절하는데 있어서 TGFβ 패밀리 리간드에 대한 역할을 시사한다. 이들 리간드는 성인에서 전구세포로부터의 β-세포 증식 및/또는 새로운 β-세포의 혼입에 영향을 미칠 수 있다. 인슐린 프로모터를 통한 TGF-β의 트랜스제닉 과발현을 유발하는 유전자 조작은 외분비 췌장 및 섬의 감소된 발생을 유발하고, 글루코스 제어를 유지하는 것으로 보고되었다. 유사하게, 글루카곤 프로모터를 통한 TGF-β의 트랜스제닉 과다발현은 B-세포 저형성증, 감소된 인슐린 분비, 글루코스 내성 장애를 유발하는 것으로 보고되었다 (예를 들어, 문헌 [Trends Endocrinol Metab. 2010 Jul; 21(7): 441-448]에서 검토됨). 췌장 베타 세포의 확장 및 재생은 췌장의 정상 발달 및 성인 섬에서의 기능 유지 둘 다에 중요하다. 최근에, 여러 연구는 발생하는 췌장에서의 TGFβ 신호전달에 대한 주요 역할 중 일부를 확인하였다. 구체적으로, TGFβ 신호전달은 전구 세포의 내분비 수임 및 그의 후속 성숙을 촉진한다. TGFβ 유형 II 수용체의 우세한 음성 형태를 과다발현하는 마우스 (Tulachan et al.)는 수용체 수준에서 TGFβ 신호전달을 억제하였고, 내분비 전구체의 수의 증가, 뿐만 아니라 내분비 세포의 증식이 발견되었다. 성인 섬에서, 모든 3종의 TGFβ 이소형은 미만성 패턴으로 내분비 세포에서 발현된다. 그러나, 강도는 인슐린-양성 세포에서 TGFβ2 및 TGFβ3에 대해 더 높았다. 외분비 췌장에서, 대부분의 선방 세포는 TGFβ1에 대해 양성인 반면, 모든 3종의 리간드는 관 세포에서 동등하게 발현되는 것으로 보였다. 성인 베타 세포는 매우 낮은 턴오버 및 낮은 증식률을 갖는다. 본원에 포괄된 것과 같은 이소형-선택적 TGFβ1 억제제는 당뇨병 및/또는 글루코스 불내성의 치료 또는 예방에서 췌장 베타 세포 복제를 촉진하는데 사용될 수 있다. β-세포의 복제는 인슐린 요구의 변화에 반응하여 β-세포괴의 유지 및 확장을 위한 1차 메카니즘이고, 이러한 적응 확장의 실패는 당뇨병을 유발할 수 있기 때문에 (예를 들어, 문헌 [Dhawan et al., Diabetes. 2016 May; 65(5): 1208-1218] 참조), 이소형-선택적 TGFβ1 억제제는 TGFβ 신호전달의 범-억제와 연관된 원치않는 부작용을 유발하지 않으면서 당뇨병을 호전시키는데 유리하게 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이소형-선택적 TGFβ1 억제제는 당뇨병 또는 글루코스 불내성의 치료 또는 예방에 있어서, 예를 들어 PCT/US2015/059468 및 PCT/US2016/052014에 기재된 바와 같이, 미오스타틴-선택적 억제제 (예를 들어, 프로/잠복 미오스타틴/GDH8에 선택적으로 결합하여 미오스타틴의 활성화를 억제하는 항체)와 함께 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 당뇨병은 제2형 당뇨병이다.

당뇨병과 관련된 상태는 당뇨병성 신장 질환으로도 지칭되는 당뇨병성 신병증 (DN)을 포함한다. 당뇨병성 신병증은 제1형 당뇨병 및 제2형 당뇨병의 심각한 신장-관련 합병증이다. 당뇨병을 갖는 사람의 40% 이하에서 결국 신장 질환이 발생한다. 시간이 지남에 따라, DN은 폐 부종, 심혈관 질환 및 말기 신장 단계로 이어질 수 있으며, 이는 결국 생존을 위해 투석 또는 신장 이식을 필요로 한다.

인간 DN의 주요 임상 특색은 알부민뇨, GFR의 점진적 감소 및 고혈압, 및 심혈관 질환에 대한 증가된 위험을 포함한다. DN 발병기전은 사구체 혈관신생 및 과다여과와 연관된다. 추가로, 사구체 기저막의 비후, 혈관간 세포의 확장, 사구체경화증 및 세관간질성 섬유증이 DN을 갖는 환자에서 관찰된다. TGFβ1 및 그의 수용체는 실험 및 인간 당뇨병성 신병증 둘 다에서 상향조절된다. TGFβ1 수용체의 증진된 발현, TGFβ1 생물활성 및 외인성 TGFβ1에 대한 반응성은 사구체 세포에서 높은 글루코스에 반응하여 발생하는 것으로 보고되었고, 세포외 아데노신은 이러한 과정에서 소정 역할을 하는 것으로 연루되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Roa et al., (2009) "Adenosine mediates transforming growth factor-beta 1 release in kidney glomeruli of diabetic rats" FEBS Let 583(19): 3192-3198] 참조). 일부 실시양태에서, DN은 아데노신 생합성 또는 신호전달의 조절이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조절이상은 CD39 및/또는 CD73을 수반한다.

근골격 상태에서의 TGFβ의 역할

골격의 골, 근육, 연골, 건, 인대, 관절, 및 조직 및 기관을 함께 지지하고 이에 결합하는 다른 결합 조직으로 구성된 근골격계에서, TGFβ는 증식 및 분화의 억제, 위축의 유도 및 섬유증의 발생을 포함한 다양한 역할을 한다. TGFβ는 위성 세포 증식을 감소시키고 분화를 방지한다 (MyoD 및 미오게닌의 억제를 통해) (Allen, R.E. and L.K. J Cell Physiol, 1987. 133(3): p. 567-72; Brennan, T.J., et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 1991. 88(9): p. 3822-6; Massague, J., et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 1986. 83(21): p. 8206-10; Olson, E.N., et al., J Cell Biol, 1986. 103(5): p. 1799-805). TGFβ의 이소형 (즉, TGFβ1, 2 또는 3)은 이들 초기 논문에 명시되어 있지 않지만, TGFβ1인 것으로 추정된다. TGFβ는 또한 근육 섬유증에 기여하며; 재조합 TGFβ1의 직접 주사는 골격근 섬유증을 유발하고, 범-TGFβ 억제는 급성 및 만성 손상 근육에서 섬유증을 감소시킨다 (Li, Y., et al., Am J Pathol, 2004. 164(3): p. 1007-19; Mendias, C.L., et al., Muscle Nerve, 2012. 45(1): p. 55-9; Nelson, C.A., et al., Am J Pathol, 2011. 178(6): p. 2611-21). TGFβ1은 골격근 내의 근섬유, 대식세포, 조절 T 세포, 섬유모세포 및 섬유세포에 의해 발현되고 (Li, Y., et al., Am J Pathol, 2004. 164(3): p. 1007-19; Lemos, D.R., et al., Nat Med, 2015. 21(7): p. 786-94; Villalta, S.A., et al., Sci Transl Med, 2014. 6(258): p. 258ra142; Wang, X., et al., J Immunol, 2016. 197(12): p. 4750-4761); 손상시 및 질환에서 발현이 증가된다 (Li, Y., et al., Am J Pathol, 2004. 164(3): p. 1007-19; Nelson, C.A., et al., Am J Pathol, 2011. 178(6): p. 2611-21; Bernasconi, P., et al., J Clin Invest, 1995. 96(2): p. 1137-44; Ishitobi, M., et al., Neuroreport, 2000. 11(18): p. 4033-5). TGFβ2 및 TGFβ3은 또한 mdx 근육에서 (mRNA 수준에서), TGFβ1보다 더 적은 정도이긴 하지만, 상향조절된다 (Nelson, C.A., et al., Am J Pathol, 2011. 178(6): p. 2611-21; Zhou, L., et al., Neuromuscul Disord, 2006. 16(1): p. 32-8). 페시나(Pessina) 등은 최근에 계통 추적 실험을 사용하여 이영양성 근육 내의 다중 기원의 세포가 TGFβ-의존성 경로를 통해 섬유발생 운명을 채택한다는 것을 나타냈다 (Pessina, P., et al., Stem Cell Reports, 2015. 4(6): p. 1046-60).

골은 신체에서 TGFβ의 가장 큰 저장소이다. 실제로, TGFβ 경로는 적어도 부분적으로 골모세포 분화 및/또는 파골세포 골 재흡수를 조절함으로써 골 항상성 및 재형성에서 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다. 이러한 과정은 정상적 및 비정상적 상황 둘 다에 수반되며, 조절이상의 경우에, 질환, 예컨대 골-관련 상태 및 암을 유발하거나 그를 악화시킬 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 것과 같은 TGFβ1-선택적 억제제는 이러한 상태를 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 억제제의 투여는 골 형성-흡수 균형을 회복시키거나 정상화시키는데 효과적이다. 일부 실시양태에서, TGFβ1 억제제는 조합 요법으로서 또 다른 요법, 예컨대 미오스타틴 억제제 및/또는 골-증진제와 함께 대상체에게 투여된다.

골 상태 (예를 들어, 골격 질환)는 골다공증, 이형성증, 골형성 부전증 및 골암을 포함한다. 골에서 기원하는 원발성 골암에 추가로, 많은 악성종양이 골로 전이되는 것으로 공지되어 있고; 이들은 유방암, 폐암 (예를 들어, 편평 세포 암종), 갑상선암, 고환암, 신세포 암종, 전립선암 및 다발성 골수종을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

골-관련 상태 중에서, 골형성 부전증은 통상적으로 콜라겐 유형 I 코딩 유전자에 영향을 미치는 돌연변이에 의해 유발되고 취약한 골이 극도로 쉽게 파괴되도록 하는 유전적 상태이다. 현재, 비스포스포네이트 약물이 표준 관리로 유지되는 치료 옵션은 거의 없다. TGFβ1 활성화를 선택적으로 억제하는 항원 또는 항원-결합 단편은 단독요법으로서 단독으로 또는 질환을 치료하는 것을 목표로 하는 또 다른 요법과 함께 골형성 부전증을 치료하는데 사용될 수 있다.

본원에 기재된 것과 같은 TGFβ1 억제제의 치료 효과는 적합한 바이오마커, 예컨대 골 형성 (알칼리성 포스파타제 활성) 또는 흡수 (타르트레이트-저항성 산 포스파타제)의 혈청 마커를 사용하여 모니터링될 수 있다.

일부 실시양태에서, 이러한 상태는 근육 약화와 연관된다.

일부 실시양태에서, 근골격 상태는 근골격계와 연관된 근형성 및 비-근형성 줄기/전구 세포, 예컨대 위성 세포의 조절이상을 수반한다. 이소형-선택적 TGFβ1 억제제는 근형성 및 비-근형성 줄기/전구 세포의 확장/분화를 촉진하는데 사용될 수 있다.

TGFβ1은 이환 조직의 만성 염증을 동반하는 섬유화 상태, 예컨대 인간 근육 이영양증에서 소정 역할을 할 수 있다. 뒤시엔느 근육 이영양증 (DMD)은 디스트로핀의 부재에 의해 유발된 중증, 진행성 및 궁극적으로 치명적인 질환이다 (Bushby, K., et al., Lancet Neurol, 2010. 9(1): p. 77-93). 디스트로핀의 결여는 수축-유도된 손상에 대한 증가된 감수성을 유발하여, 계속적인 근육 변성을 유발한다 (Petrof, B.J., et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 1993. 90(8): p. 3710-4; Dellorusso, C., et al., J Muscle Res Cell Motil, 2001. 22(5): p. 467-75; Pratt, S.J., et al., Cell Mol Life Sci, 2015. 72(1): p. 153-64). 반복된 라운드의 복구는 만성 염증, 섬유증, 위성 세포 풀의 소진, 결국 이동성의 상실 및 사멸에 기여한다 (Bushby, K., et al., Lancet Neurol, 2010. 9(1): p. 77-93; McDonald, C.M., et al., Muscle Nerve, 2013. 48(3): p. 343-56). TGFβ1의 발현은 DMD를 갖는 환자에서 유의하게 증가되고, 이들 환자에서 관찰된 섬유증의 정도와 상관관계가 있다 (Bernasconi, P., et al., J Clin Invest, 1995. 96(2): p. 1137-44; Chen, Y.W., et al., Neurology, 2005. 65(6): p. 826-34). 과도한 ECM 침착은 근육의 수축 특성에 유해한 영향을 미치고, 근섬유가 그의 혈액 공급으로부터 단리됨에 따라 영양에의 접근을 제한할 수 있다 (Klingler, W., et al., Acta Myol, 2012. 31(3): p. 184-95). 최근에, 추가의 데이터는 근육 이영양증에 TGFβ1을 추가로 연루시켰다. LTBP4의 변이체가 마우스 및 인간에서 질환 중증도를 변형시키는 것으로 밝혀졌다. 마우스에서, LTBP4의 변이체는 디스트로핀 또는 γ-사르코글리칸이 결여된 마우스에서 보호성이다 (Coley, W.D., et al., Hum Mol Genet, 2016. 25(1): p. 130-45; Heydemann, A., et al., J Clin Invest, 2009. 119(12): p. 3703-12). 인간에서, 2개의 군은 독립적으로 LTBP4의 변이체가 DMD에서 보호성이며, 보행 상실을 수년 지연시켰다는 것을 확인하였다 (Flanigan, K.M., et al., Ann Neurol, 2013. 73(4): p. 481-8; van den Bergen, J.C., et al., J Neurol Neurosurg Psychiatry, 2015. 86(10): p. 1060-5). 마우스 및 인간에서의 유전자 변이체의 성질이 상이하지만, 둘 다의 종에서 보호성 변이체는 감소된 TGFβ 신호전달을 유발한다 (Heydemann, A., et al., J Clin Invest, 2009. 119(12): p. 3703-12); Ceco, E., et al., Sci Transl Med, 2014. 6(259): p. 259ra144). 골격근 생물학에서의 TGFβ1의 많은 기능은, 정제된 활성 성장 인자가 동물 내로 주사되거나 배양물 중의 세포에 첨가되는 실험으로부터 추론되었다 (Massague, J., et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 1986. 83(21): p. 8206-10; Li, Y., et al., Am J Pathol, 2004. 164(3): p. 1007-19; Mendias, C.L., et al., Muscle Nerve, 2012. 45(1): p. 55-9). TGFβ1의 특정 기능에 대한 세포 콘텍스트의 중요성을 고려하면 (예를 들어, 문헌 [Hinck et al., Cold Spring Harb. Perspect. Biol, 2016. 8(12)] 참조)에서, 이들 실험에서 관찰된 효과 중 일부는 생체내 시토카인의 내인성 역할(들)을 반영하지 않는 것이 가능하다. 예를 들어, 재조합 TGFβ1, 미오스타틴 또는 GDF11을 사용한 인간 피부 섬유모세포의 치료는 이들 세포에서 유전자 발현의 거의 동일한 변화를 유발하지만, 생체내에서 이들 단백질의 역할은 매우 상이하다 (Tanner, J.W., Khalil, A., Hill, J., Franti, M., MacDonnell, S.M., Growth Differentiation Factor 11 Potentiates Myofibroblast Activation, in Fibrosis: From Basic Mechanisms to Targeted therapies. 2016: Keystone, CO).

다수의 연구자는 생체내 성장 인자의 역할을 명확하게 하기 위해 TGFβ의 억제제를 사용하였다. 범-TGFβ 중화 항체 1D11을 사용한 mdx 마우스의 치료는 명확하게 감소된 섬유증 (조직학 및 히드록시프롤린 함량에 의함), 감소된 근육 손상 (감소된 혈청 크레아틴 키나제 및 보다 큰 근섬유 밀도), 및 개선된 근육 기능 (혈류량측정, 단리된 EDL 근육의 힘 생성 및 증가된 앞다리 그립 강도)을 유발한다 (Nelson, C.A., et al., Am J Pathol, 2011. 178(6): p. 2611-21; Andreetta, F., et al., J Neuroimmunol, 2006. 175(1-2): p. 77-86; Gumucio, J.P., et al., J Appl Physiol (1985), 2013. 115(4): p. 539-45). 추가로, 우성 음성 TGFβ 유형 II 수용체의 근섬유-특이적 발현은 심장독소 손상 후에 및 δ-사르코글리칸-/- 마우스에서 근육 손상에 대해 보호한다 (Accornero, F., et al., Hum Mol Genet, 2014. 23(25): p. 6903-15). 골격근에 풍부하고 TGFβ 활성을 억제하는 프로테오글리칸 데코린은 mdx 마우스에서 및 열상 손상 후에 근육 섬유증을 감소시킨다 (Li, Y., et al., Mol Ther, 2007. 15(9): p. 1616-22; Gosselin, L.E., et al., Muscle Nerve, 2004. 30(5): p. 645-53). TGFβ 억제 활성을 갖는 다른 분자, 예컨대 수라민 (항신생물제) 및 로사르탄 (안지오텐신 수용체 차단제)은 손상, 마르팡 증후군 및 근육 이영양증의 마우스 모델에서 근육 병리상태를 개선시키고 섬유증을 감소시키는데 효과적이었다 (Spurney, C.F., et al., J Cardiovasc Pharmacol Ther, 2011. 16(1): p. 87-95; Taniguti, A.P., et al., Muscle Nerve, 2011. 43(1): p. 82-7; Bedair, H.S., et al., Am J Sports Med, 2008. 36(8): p. 1548-54; Cohn, R.D., et al., Nat Med, 2007. 13(2): p. 204-10). 상기 기재된 치료제 모두가 TGFβ1 또는 그의 신호전달을 억제하지만, 이들 중 어느 것도 TGFβ1 이소형에 대해 특이적이지 않다. 예를 들어, 1D11은 TGFβ1, 2 및 3 이소형에 결합하여 그를 억제한다 (Dasch, J.R., et al., J Immunol, 1989. 142(5): p. 1536-41). 수라민은 TGFβ1에 추가로, PDGF, FGF 및 EGF를 포함한 수용체에 결합하는 다중 성장 인자의 능력을 억제한다 (Hosang, M., J Cell Biochem, 1985. 29(3): p. 265-73; Olivier, S., et al., Eur J Cancer, 1990. 26(8): p. 867-71; Scher, H.I. and W.D. Heston, Cancer Treat Res, 1992. 59: p. 131-51). 데코린은 또한 미오스타틴 억제제인 폴리스타틴의 직접 결합 및 상향조절 둘 다에 의해 미오스타틴 활성을 억제한다 (Miura, T., et al., Biochem Biophys Res Commun, 2006. 340(2): p. 675-80; Brandan, E., C. Cabello-Verrugio, and C. Vial, Matrix Biol, 2008. 27(8): p. 700-8; Zhu, J., et al., J Biol Chem, 2007. 282(35): p. 25852-63). 로사르탄은 IGF-1/AKT/mTOR 경로를 포함한, 레닌-안지오텐신-알도스테론 시스템에 대한 그의 작용을 통해 추가의 신호전달 경로에 영향을 미친다 (Burks, T.N., et al., Sci Transl Med, 2011. 3(82): p. 82ra37; Sabharwal, R. and M.W. Chapleau, Exp Physiol, 2014. 99(4): p. 627-31; McIntyre, M., et al., Pharmacol Ther, 1997. 74(2): p. 181-94). 따라서, 이들 요법 모두는 독성뿐만 아니라, 그의 치료 효과에 기여할 수 있는 추가의 분자를 억제한다.

근육 항상성, 복구 및 재생에서의 TGFβ의 상정된 역할을 고려할 때, TGFβ1 신호전달을 선택적으로 조정하는 작용제, 예컨대 본원에 기재된 모노클로날 항체는 지금까지 개발된 보다 광범위하게 작용하는 TGFβ 억제제와 연관된 독성 없이, 예컨대 만성/유전적 근육 이영양증 및 급성 근육 손상에서와 같은 손상된 근섬유를 치료하는 데 효과적일 수 있다.

따라서, 본 발명은 생체내 TGFβ 효과의 모두는 아니지만 하위세트를 우선적으로 조정하는 작용제를 사용하여 손상된 근섬유를 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 작용제는 TGFβ1 신호전달을 선택적으로 조정할 수 있다 ("이소형-특이적 조정").

만성 근육 질환에서의 근섬유 복구

본 발명은 섬유증을 제한하고 근육 형태 및 기능의 정상화에 기여함으로써, DMD 환자에서 근육 질 및 기능을 개선시키는 방법을 포괄한다. TGFβ1이 또한 근발생을 억제하므로, TGFβ1 차단은 이영양성 근육에서 재생을 촉진하여, 추가의 치료 이익을 부가할 수 있다. TGFβ1 억제제는 디스트로핀 상향조절 요법, 예컨대 엑손디스(Exondys) 51 (에테플러센(Eteplirsen))과 조합되어 사용될 수 있다. 근육 이영양증에서의 TGFβ1 억제의 잠재적 치료 이익을 고려할 때, (1) TGFβ1의 역할(들)을 TGFβ2 및 TGFβ3의 것과 구별하는 것, 및 (2) TGFβ1 억제가 어느 분자 콘텍스트(들)에서 가장 유익할 것인지 명확하게 하는 것이 중요하다. 상기 언급된 바와 같이, 범-TGFβ 억제제는 이들 화합물의 임상 용도를 제한하는 유의한 독성과 연관되었다 (Anderton, M.J., et al., Toxicol Pathol, 2011. 39(6): p. 916-24; Stauber, A., et al., Clinical Toxicology, 2014. 4(3): p. 1-10). TGFβ 이소형(들) 중 어느 것이 이들 독성을 유발하는지 불명확하다. 기재된 독성 중 일부는 면역계에서의 TGFβ1 억제로 인한 것일 수 있다. 예를 들어, 1D11이 횡경막에서 섬유증의 수준을 유의하게 감소시켰지만, 치료는 또한 근육에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 수를 증가시켰으며, 이는 장기간 치료에 유해할 수 있는 범-TGFβ 억제시의 증가된 염증 반응을 시사한다 (Andreetta, F., et al., J Neuroimmunol, 2006. 175(1-2): p. 77-86). 실제로, 근육으로부터의 T 세포의 고갈은 mdx 마우스의 근육 병리상태를 개선시키며, 이는 T-세포 매개된 염증 반응이 이영양성 근육에 유해하다는 것을 시사한다 (Spencer, M.J., et al., Clin Immunol, 2001. 98(2): p. 235-43). 1D11 투여시 T 세포 수의 증가는 조절 T (Treg) 세포에 대한 TGFβ1의 효과로 인한 것일 가능성이 있다. Treg는 GARP를 통해 그의 세포 표면 상에 TGFβ1을 제시하고, 이러한 복합체로부터의 TGFβ1의 방출은 Treg 억제 활성을 증진시켜, T 세포 매개 염증을 제한한다 (Wang, R., et al., Mol Biol Cell, 2012. 23(6): p. 1129-39; Edwards, J.P., A.M. Thornton, and E.M. Shevach, J Immunol, 2014. 193(6): p. 2843-9; Nakamura, K., et al., J Immunol, 2004. 172(2): p. 834-42; Nakamura, K., A. Kitani, and W. Strober, J Exp Med, 2001. 194(5): p. 629-44). 실제로, PC61 항체를 사용한 Treg의 고갈은 mdx 마우스의 횡경막에서 증가된 염증 및 근육 손상을 유발한 반면, Treg 수 및 활성의 증대는 근육 손상을 감소시켰다 (Villalta, S.A., et al., Sci Transl Med, 2014. 6(258): p. 258ra142). 흥미롭게도, 면역억제 T 세포인 Tr1 세포의 추가의 집단이 최근에 확인되었다. 이들 세포는 그의 억제 활성에 필요한 다량의 TGFβ3을 생산한다 (Gagliani, N., et al., Nat Med, 2013. 19(6): p. 739-46; Okamura, T., et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2009. 106(33): p. 13974-9; Okamura, T., et al., Nat Commun, 2015. 6: p. 6329). 골격근에서의 Tr1 세포의 역할은 알려지지 않았으나, 1D11에 의한 TGFβ1 및 TGFβ3 둘 다의 억제가 Treg 및 Tr1 세포 둘 다를 억제함으로써 상가적 염증유발 효과를 가질 수 있다는 가능성이 존재한다.

TGFβ1 잠복성 및 활성화에 관한 상기 기재된 구조적 통찰은 TGFβ1의 활성화를 특이적으로 표적화하는 약물 발견에 대한 신규 접근법을 가능하게 한다 (Shi, M., et al., Nature, 2011. 474(7351): p. 343-9). 3종의 성숙 TGFβ 성장 인자 사이에 공유되는 고도의 서열 동일성은 잠복 복합체에 의해 공유되지 않으며, 이는 프로TGFβ1에 정교하게 특이적인 항체의 발견을 가능하게 한다. 항체 발견에 대한 독점 접근법을 사용하여, 본 발명자들은 프로TGFβ1에 특이적으로 결합하는 항체 (Ab1, Ab2 및 Ab3)를 확인하였다. 시험관내 공동-배양 시스템을 사용하여, 이들 항체가 TGFβ1의 인테그린-매개 방출을 억제하는 것으로 입증되었다. 이 시스템에서, 인간 피부 또는 마우스 골격근으로부터 유래된 섬유모세포는 잠복 TGFβ1의 공급원이고, αVβ6을 발현하는 세포주는 활성 TGFβ1의 방출을 가능하게 하며, 이는 이어서 SMAD2/3 반응성 루시페라제 리포터를 발현하는 제3 세포주를 사용하여 측정된다 (도 12). 이들 항체 중 1종인 Ab1은 생체내에서 시험되었고, 신장 섬유증의 UUO (일측성 요관 폐쇄) 마우스 모델에서 효능을 나타냈다. 이 모델에서, 9 mg/kg/주 Ab1을 사용한 마우스 (n=10)의 치료는 TGFβ1-반응성 유전자의 상향조절을 방지하고, 손상 후 섬유증의 정도를 감소시켰다 (피크로시리우스 레드 염색에 의함). TGFβ1 특이적 요법은 범-TGFβ 억제제와 비교하여 개선된 효능 및 안전성 프로파일을 가질 수 있으며, 이는 DMD 집단에서와 같이 장기간 사용될 치료제에 대한 중요한 측면이다. TGFβ1 억제 항체는 특이적 TGFβ1 억제가 DMD 또는 다른 근육 질환에 대한 치료제로서의 잠재력을 갖는지를 결정하고, 골격근 재생에서의 TGFβ1의 역할을 명확하게 하는데 사용될 수 있다.

만성 대 급성 근섬유 손상 및 최적 치료제의 선택

급성 손상 (예컨대 다른 건강한 근육 또는 운동 뉴런에 대한 외상성 손상) 후에 정상이지만 재생하고 있는 근육에서, 염증성 대식세포의 초기 침윤은 손상된 조직을 제거하고 위성 세포 활성화에 필요한 인자 (예를 들어, 시토카인)를 분비하는데 요구되는 것으로 여겨진다. 후속적으로, 이들 세포는 M2 표현형으로 전환되어 상처 해소를 구동한다.

대조적으로, 만성 상태, 예컨대 DMD를 포함한 질환에서, 염증유발 대식세포가 항상 우세하였고, M2로의 전환은 일어나지 않으며 (또는 적어도 충분히 효율적이지 않게 일어남), 염증유발 대식세포는 계속해서 염증 및 근육 손상을 구동한다. DMD에서, NFkB 경로는 영속적으로 활성이며, 구성적 염증을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 따라서, NFkB 억제제는 만성 염증을 감소시키기 위해 DMD 환자에게 투여될 수 있다.

따라서, 만성 상태, 예컨대 DMD에서, 치료 초점은 근육 재생이 아닌 근육 복구에 있을 수 있다. 이는 DMD 근육 섬유가 결함이 있으나 파괴되지 않기 때문이며 - 이들은 막의 파열, 칼슘 과도의 조절이상 및 대식세포로부터의 ROS 손상에 의해 손상된다. 이에 비교하여, 건강한 근육에 대한 손상의 경우에, 치료 초점은 재생에 있을 수 있다. 예를 들어, 심장독소 모델에서, 근섬유는 사멸되고 재생되어야 한다. 이는 외상성 손상, 예컨대 압궤 손상 후의 회복 과정을 자극한다.

증거는 LRRC33이 M2-유사 표현형을 갖는 티오글리콜레이트-유발된 복막 대식세포에서 발현됨을 시사한다 (높은 수준의 아르기나제를 발현하고, iNOS를 발현하지 않고, 높은 수준의 CD206을 발현하는 것을 특징으로 함).

LRRC33이 주로 M2 세포 상에서 발현되고 그의 TGFβ1 제시 ("콘텍스트")가 이들 세포의 상처 치유유발 효과에 중요한 상황에서, 복구 및/또는 근발생을 촉진하도록 LRRC33-매개 TGFβ1을 활성화하는 것이 유익할 수 있다. 다른 한편으로는, LRRC33이 또한 염증유발 M1 세포 상에서 발현되는 상황에서, 염증이 특히 이영양성 환경, 예컨대 DMD에서 섬유증을 구동하는 것을 고려할 때, LRRC33-매개 TGFβ1을 억제하는 것이 유익할 수 있다. 따라서, 질환-연관 TGFβ1의 공급원/콘텍스트를 확인하는 것은 어느 수준의 선택성이 고려되어야 하는지 알려줄 TGFβ 신호전달의 올바른 조정제를 선택하는 데 중요한 단계일 수 있다 (예를 들어, 이소형-특이적, 콘텍스트-비의존성 TGFβ1 조정제, 또는 콘텍스트-특이적 TGFβ1 조정제; TGFβ1 억제제 또는 활성화제 등).

만성 염증 외에도, DMD의 특징은 과도하고 진행성인 섬유증이다. 진행성 질환에서, 섬유증이 매우 중증이어서 실제로 개별 근섬유를 그의 혈액 공급으로부터 고립시킬 수 있다. 이는 또한 근육의 수축 특성을 변경한다. 인간 환자에서, TGFβ1 상향조절의 정도와 섬유증 사이에 강한 상관관계가 존재하고, 섬유증의 정도와 음성 이동성 결과 사이에 강한 연관이 존재한다. 따라서, 일부 실시양태에서, LTBP-프로TGFβ1 억제제는 섬유증의 예방 및/또는 감소를 위해 이영양성 환자에게 투여되어 질환에서 ECM-연관 TGFβ1 효과를 선택적으로 표적화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 다양한 이소형- 및/또는 콘텍스트-선택적 작용제는 TGFβ1 신호전달의 억제를 달성하는데 사용되어 (예를 들어, GARP 또는 LRRC33을 통해) 면역계에 대해 원치않는 영향을 미치지 않으면서 섬유증을 예방하고 근발생을 촉진할 수 있다.

MHC 하향조절 또는 돌연변이를 수반하는 상태

TGFβ-관련 적응증은 또한 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 부류 I이 결실되거나 결핍된 (예를 들어, 하향조절된) 상태를 포함할 수 있다. 이러한 상태는 MHC-매개 신호전달의 1종 이상의 성분이 손상되는 유전적 장애, 뿐만 아니라 MHC 발현이 다른 인자, 예컨대 암, 감염, 섬유증 및 의약에 의해 변경되는 상태를 포함한다.

예를 들어, 종양에서의 MHC I 하향조절은 면역 감시로부터의 종양 회피와 연관된다. 실제로, 종양 MHC 부류 I 발현의 상실을 포함한 T-세포 인식을 피하는 것을 목표로 하는 면역 회피 전략은 통상적으로 악성 세포에서 발견된다. 종양 면역 회피는 면역 체크포인트 분자를 차단하는 항체를 사용한 치료를 포함한 암 면역요법의 임상 결과에 부정적인 영향을 미치는 것으로 관찰되었다 (예를 들어, 문헌 [Garrido et al. (2017) Curr Opin Immunol 39: 44-51. "The urgent need to recover MHC class I in cancers for effective immunotherapy"] (본원에 참조로 포함됨)에서 검토됨). 따라서, 본 개시내용에 의해 포괄되는 이소형-선택적, 콘텍스트-비의존성 TGFβ1 억제제는 단독요법으로서 또는 또 다른 요법 (예컨대 체크포인트 억제제, 화학요법, 방사선 요법 등)과 함께 투여되어 항암 면역을 촉발 또는 부스팅하고/거나 또 다른 요법에 대한 반응성 또는 그의 유효성을 증진시킬 수 있다.

일부 실시양태에서, MHC 하향조절은 CBT와 같은 암 요법에 대한 획득 저항성과 연관된다. TGFβ1의 고친화도, 이소형-선택적 억제제는 획득 저항성이 발생할 확률을 감소시키기 위해, CBT와 같은 암 요법의 1차 반응자인 환자를 치료하는데 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 따라서, 암 요법의 1차 반응자인, TGFβ1 억제제로 치료된 자 중에서, 시간 경과에 따른 암 요법에 대한 2차 또는 획득 저항성의 발생이 감소될 수 있다.

MHC 부류 I 단백질의 하향조절은 또한 HIV와 같은 바이러스 감염을 포함한 특정 감염성 질환과 연관된다. 예를 들어, 문헌 [Cohen et al. (1999) Immunity 10(6): 661-671. "The selective downregulation of class I major histocompatibility complex proteins by HIV-1 protects HIV-infected cells from NK Cells"] (본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 따라서, 본 개시내용에 의해 포괄되는 이소형-선택적, 콘텍스트-비의존성 TGFβ1 억제제는 단독요법으로서 또는 또 다른 요법 (예컨대 항바이러스 요법, 프로테아제 억제제 요법 등)와 함께 투여되어 숙주 면역을 촉발 또는 부스팅하고/거나 또 다른 요법에 대한 반응성 또는 그의 유효성을 증진시킬 수 있다.

줄기 세포 자기-재생, 조직 재생 및 줄기 세포 재증식을 수반하는 상태

증거는 TGFβ1이 조직 내 다양한 줄기 세포 집단 및 그의 분화/재증식의 항상성을 조절하는데 소정 역할을 한다는 것을 시사한다. 항상성 동안, 조직-특이적 줄기 세포는 우세하게는 정지상태로 유지되지만, 특정 스트레스시 세포 주기에 진입하도록 촉발된다. TGFβ1은 줄기 세포 분화 및 재구성을 엄격히 조절하는 과정 동안 "파괴"로서 기능하는 것으로 생각되고, 세포 주기 진입을 촉발하는 스트레스는 "파괴"를 제거하는 TGFβ1 억제와 동시에 일어난다. 따라서, 본원에 기재된 것과 같은 TGFβ1의 이소형-선택적 억제제는 특정한 조직 내의 줄기 세포/전구 세포의 세포 주기 및 G0 진입 결정을 왜곡하거나 교정하는데 사용될 수 있는 것으로 고려된다.

따라서, 본 개시내용의 발명자들은 하기와 같은 상태에서의 이소형-선택적 TGFβ1 억제제의 용도를 고려한다: i) 줄기 세포/전구 세포 분화/재구성이 질환으로 인해 중단 또는 교란되거나 또는 요법/의약의 부작용으로서 유도됨; ii) 환자가 건강한 세포를 사멸 또는 고갈시키는 요법 또는 의약을 받고 있음; iii) 환자가 증가된 줄기 세포/전구 세포 분화/재구성으로부터 이익을 얻을 수 있음; iv) 질환이 비정상적 줄기 세포 분화 또는 재구성과 연관됨.

자가-재생 조직, 예컨대 골수 (혈액 세포 생산) 및 표피에서, 증식 과정과 분화 과정 사이의 균형은 생애 동안 줄기 세포 집단의 유지를 보장하도록 엄격히 조절된다. 문헌 [D'Arcangel et al. (2017) Int. J Mol Sci. 18(7): 1591]에서 검토되었다. TGFβ1은 부분적으로 시클린-의존성 키나제 억제제인 p15/INK4b, p21 및 p57의 유도를 통해 세포 주기 및 종양 억제자의 강력한 음성 조정제로서 작용한다. 증거는 TGFβ1이 특정 세포 유형에서 성장 정지 및 노화를 매개하기 위해 p16/INK4a 및 p19/ARF의 유도에 기여한다는 것을 시사한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 것과 같은 TGFβ1 활성화의 고친화도, 이소형-선택적 억제제는 다양한 줄기 세포 집단에서 p16/INK4a-의존성 세포 노화 및 줄기 세포 역학을 조절하는데 사용된다.

예를 들어, 중간엽 기질/줄기 세포 (MSC)는 대부분의 성인 결합 조직, 예컨대 골수, 지방 조직 및 제대혈에 존재하는 기질 세포의 작은 집단이다. MSC는 생체내에서 비교적 정지 상태로 유지되지만, 다양한 생리학적 및 병리학적 자극에 반응하여 증식할 수 있고, 이어서 골모세포, 연골세포, 지방세포 또는 평활근 세포 (SMC) 및 심근세포와 같은 다른 중배엽-유형 계통으로 분화될 수 있다. 다중 신호전달 네트워크는 기능적 중간엽 계통으로 분화되는 MSC를 조직화하며, 이 중에서 TGF-β1이 주요 역할자로서 출현하였다 (예를 들어 문헌 [Zhao & Hantash (2011. Vitam Horm 87:127-41]에서 검토됨).

유사하게, 조혈 줄기 세포는 평생 혈액 세포 생산에 요구되며; 소진을 방지하기 위해, 대다수의 조혈 줄기 세포는 정상-상태 조혈 동안 정지상태로 유지된다. 그러나, 혈액학적 스트레스 동안, 이들 세포는 세포 주기 내로 신속하게 동원되고, 증가된 조혈 요구를 충족시키기 위해 광범위한 자가-재생 및 분화를 겪는다. TGFβ1은 정지-재증식 이행/균형을 제어하기 위한 "스위치"로서 작용할 수 있다.

따라서, TGFβ1의 이소형-선택적 억제제는 조혈 줄기 세포 결함 및 골수 부전을 수반하는 상태의 치료에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조혈 줄기 세포 저장소의 고갈 또는 손상은 조혈 부전 또는 혈액 악성종양을 초래한다. 일부 실시양태에서, 이러한 상태는 진행성 골수 부전을 특징으로 하는 DNA 복구 장애이다. 일부 실시양태에서, 이러한 상태는 줄기 및 전구 세포 마멸에 의해 유발된다. 일부 실시양태에서, 이러한 상태는 빈혈과 연관된다. 일부 실시양태에서, 이러한 상태는 판코니 빈혈 (FA)이다. 일부 실시양태에서, 이러한 상태는 DNA 손상시 특정 세포 유형의 생존을 억제하는 과다활성 TGFβ 경로를 특징으로 한다. 따라서, TGFβ1의 이소형-선택적 억제제는 FA를 갖는 대상체에서 FA 조혈 줄기 세포의 증식 결함 및/또는 골수 부전을 구제하는데 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 예를 들어, 문헌 [zhang et al. (2016), Cell Stem Cell, 18: 668-681, "TGF-β inhibition rescues hematopoietic stem cell defects and bone marrow failure in Fanconi Anemia"]을 참조한다.

치료-유도된 조혈 조절이상을 수반하는 상태

다양한 질환 상태를 치료하도록 설계된 특정 약물은 종종 치료될 환자에서 빈혈 (예를 들어, 치료- 또는 약물-유도된 빈혈, 예컨대 화학요법-유도된 빈혈 및 방사선 요법-유도된 빈혈)을 유도 또는 악화시키는 것으로 인식된다. 일부 실시양태에서, 환자는 빈혈을 포함하는 부작용을 유발할 수 있는 골수억제 약물로 치료된다. 이러한 환자는 조혈을 부스팅하기 위해 약리학적 TGFβ1 억제로부터 이익을 얻을 수 있다. 일부 실시양태에서, TGFβ1 억제제는 환자에서 정지 상태로의 진입을 방지함으로써 조혈을 촉진할 수 있다. 일부 실시양태에서, 환자는 G-CSF 요법 (예를 들어, 필그라스팀)을 받을 수 있다.

따라서, 본 발명은 골수억제 요법 (예를 들어, 골수억제 효과를 포함한 부작용을 갖는 요법)을 받은 환자에게 투여될 본원에 개시된 것과 같은 TGFβ1의 이소형-선택적 억제제의 용도를 포함한다. 골수억제 요법의 예는 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 페그인터페론 알파-2a, 인터페론 알파-n3, 페그인터페론 알파-2b, 알데스류킨, 겜투주맙 오조가미신, 인터페론 알파콘-1, 리툭시맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 토시투모맙, 알렘투주맙, 베바시주맙, L-페닐알라닌, 보르테조밉, 클라드리빈, 카르무스틴, 암사크린, 클로람부실, 랄티트렉세드, 미토마이신, 벡사로텐, 빈데신, 플록수리딘, 티오구아닌, 비노렐빈, 덱스라족산, 소라페닙, 스트렙토조신, 겜시타빈, 테니포시드, 에피루비신, 클로람페니콜, 레날리도미드, 알트레타민, 지도부딘, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 시클로포스파미드, 플루오로우라실, 프로필티오우라실, 펜토스타틴, 메토트렉세이트, 카르바마제핀, 빈블라스틴, 리네졸리드, 이마티닙, 클로파라빈, 페메트렉세드, 다우노루비신, 이리노테칸, 메티마졸, 에토포시드, 다카르바진, 테모졸로미드, 타크롤리무스, 시롤리무스, 메클로레타민, 아자시티딘, 카르보플라틴, 닥티노마이신, 시타라빈, 독소루비신, 히드록시우레아, 부술판, 토포테칸, 메르캅토퓨린, 탈리도미드, 멜팔란, 플루다라빈, 플루시토신, 카페시타빈, 프로카르바진, 삼산화비소, 이다루비신, 이포스파미드, 미톡산트론, 로무스틴, 파클리탁셀, 도세탁셀, 다사티닙, 데시타빈, 넬라라빈, 에베롤리무스, 보리노스타트, 티오테파, 익사베필론, 닐로티닙, 벨리노스타트, 트라벡테딘, 트라스투주맙 엠탄신, 템시롤리무스, 보수티닙, 벤다무스틴, 카바지탁셀, 에리불린, 룩솔리티닙, 카르필조밉, 토파시티닙, 포나티닙, 포말리도미드, 오비누투주맙, 테디졸리드 포스페이트, 블리나투모맙, 이브루티닙, 팔보시클립, 올라파립, 디누툭시맙, 및 콜키신.

추가의 TGFβ-관련 적응증은 미국 공개 번호 2013/0122007, 미국 특허 번호 8,415,459 또는 국제 공개 번호 WO 2011/151432 (이들 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 것 중 임의의 것을 포함할 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 본 개시내용의 항체, 그의 항원 결합 부분 및 조성물은 TGFβ1 신호전달과 연관된 매우 다양한 질환, 장애 및/또는 상태를 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 조직/세포는 다른 이소형에 비해 TGFβ1 이소형을 우선적으로 발현한다. 따라서, 본 발명은 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 제약 조성물을 사용하여 TGFβ1 발현과 연관된 이러한 상태 (예를 들어, TGFβ1 신호전달의 조절이상 및/또는 TGFβ1 발현의 상향조절)를 치료하는 방법을 포함한다.

일부 실시양태에서, 질환은 다중 세포 공급원과 연관된 (예를 들어, 그에 제시된 또는 그로부터 침착된) TGFβ1을 수반한다. 일부 실시양태에서, 이러한 질환은 TGFβ1 기능의 면역 성분 및 ECM 성분 둘 상이할 수반한다. 일부 실시양태에서, 이러한 질환은 다음을 수반한다: i) ECM의 조절이상 (예를 들어, ECM 성분, 예컨대 콜라겐 및 프로테아제의 과다생산/침착; ECM 기질의 변경된 강성; 섬유모세포, 예컨대 근섬유모세포, 섬유세포 및 CAF의 비정상적 또는 병리학적 활성화 또는 분화); ii) 증가된 Treg 및/또는 억제된 이펙터 T 세포 (Teff), 예를 들어 Treg/Teff의 상승된 비로 인한 면역 억제; CD4 및/또는 CD8 T 세포의 억제를 유발하는 증가된 백혈구 침윤물 (예를 들어, 대식세포 및 MDSC); 및/또는 iii) 골수 세포, 예컨대 대식세포 (예를 들어, 골수-유래 단핵구/대식세포 및 조직 상주 대식세포), 단핵구, 골수-유래 억제제 세포 (MDSC), 호중구, 수지상 세포 및 NK 세포의 비정상적 또는 병리학적 활성화, 분화 및/또는 동원.

일부 실시양태에서, 상태는 1종 초과의 유형의 제시 분자 (예를 들어, GARP, LRRC33, LTBP1 및/또는 LTBP3 중 2종 이상)에 의해 제시된 TGFβ1을 수반한다. 일부 실시양태에서, 이환 조직/기관/세포는 다중 세포 공급원으로부터의 TGFβ1을 포함한다. 하나의 예를 들자면, 고형 종양 (이는 골수를 수반하는 증식성 질환, 예를 들어 골수섬유증 및 다발성 골수종을 포함할 수 있음)은 상이한 유형의 제시 분자를 수반하는 다중 공급원, 예컨대 암 세포, 기질 세포, 주위 건강한 세포 및/또는 침윤 면역 세포 (예를 들어, CD45+ 백혈구)로부터의 TGFβ1을 포함할 수 있다. 적절한 면역 세포는 골수 세포 및 림프성 세포, 예를 들어 호중구, 호산구, 호염기구, 림프구 (예를 들어, B 세포, T 세포 및 NK 세포) 및 단핵구를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. TGFβ1의 콘텍스트-비의존성 억제제는 이러한 상태를 치료하는데 유용할 수 있다.

TGFβ1의 이소형-특이적 콘텍스트-비의존성 억제제, 예컨대 본원에 기재된 항체 또는 그의 단편으로 치료될 수 있는 상태 또는 장애의 비제한적 예는 하기에 제공된다.

치료 요법, 투여

본원에 개시된 방법을 실시하기 위해, 유효량의 상기 기재된 제약 조성물이 치료를 필요로 하는 대상체 (예를 들어, 인간)에게 적합한 경로, 예컨대 정맥내 투여를 통해, 예를 들어 볼루스로서 또는 일정 기간에 걸친 연속 주입에 의해, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활막내, 척수강내, 경구, 흡입 또는 국소 경로에 의해 투여될 수 있다. 제트 네뷸라이저 및 초음파 네뷸라이저를 포함한 액체 제제를 위한 상업적으로 입수가능한 네뷸라이저가 투여에 유용하다. 액체 제제는 직접 분무될 수 있고, 동결건조 분말은 재구성 후에 분무될 수 있다. 대안적으로, GARP-TGFβ1 복합체, LTBP1-TGFβ1 복합체, LTBP3-TGFβ1 복합체 및/또는 LRRC33-TGFβ1 복합체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 플루오로카본 제제 및 계량 용량 흡입기를 사용하여 에어로졸화되거나 또는 동결건조되고 밀링된 분말로서 흡입될 수 있다.

본원에 기재된 방법에 의해 치료될 대상체는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간일 수 있다. 포유동물은 가축, 스포츠 동물, 애완동물, 영장류, 말, 개, 고양이, 마우스 및 래트를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 치료를 필요로 하는 인간 대상체는 TGFβ-관련 적응증, 예컨대 상기 언급된 것을 갖거나, 그에 대한 위험이 있거나 또는 그를 가질 것으로 의심되는 인간 환자일 수 있다. TGFβ-관련 적응증을 갖는 대상체는 상용 의학적 검사, 예를 들어 실험실 시험, 기관 기능 시험, CT 스캔 또는 초음파에 의해 확인될 수 있다. 이러한 적응증 중 임의의 것을 가질 것으로 의심되는 대상체는 적응증의 1종 이상의 증상을 나타낼 수 있다. 적응증에 대한 위험이 있는 대상체는 그 적응증에 대한 위험 인자 중 1종 이상을 갖는 대상체일 수 있다.

본원에 사용된 용어 "유효량" 및 "유효 용량"은 그의 의도된 목적(들), 즉 허용되는 이익/위험 비로 조직 또는 대상체에서 목적하는 생물학적 또는 의학적 반응을 충족시키기에 충분한 화합물 또는 조성물의 임의의 양 또는 용량을 지칭한다. 예를 들어, 본 발명의 특정 실시양태에서, 의도된 목적은 TGFβ1 억제와 연관된 임상적으로 의미있는 결과를 달성하기 위해, 생체내에서 TGFβ1 활성화를 억제하는 것일 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인식되는 바와 같이, 유효량은 치료되는 특정한 상태, 상태의 중증도, 연령, 신체 상태, 크기, 성별 및 체중을 포함한 개별 환자 파라미터, 치료 지속기간, 공동 요법 (존재하는 경우)의 성질, 구체적 투여 경로, 및 건강 진료의의 지식 및 경험 내의 기타 인자에 따라 달라진다. 이들 인자는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 단지 상용 실험을 사용하여 다루어질 수 있다. 개별 성분 또는 그의 조합의 최대 용량, 즉 타당한 의학적 판단에 따른 가장 높은 안전 용량이 사용되는 것이 일반적으로 바람직하다. 그러나, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 환자가 의학적 이유, 심리적 이유 또는 실질적으로 임의의 다른 이유로 보다 낮은 용량 또는 허용되는 용량을 요구할 수 있음을 이해할 것이다.

실험적 고려사항, 예컨대 반감기가 일반적으로 투여량의 결정에 기여할 것이다. 예를 들어, 항체의 반감기를 연장시키고 항체가 숙주의 면역계에 의해 공격받는 것을 방지하기 위해 인간 면역계에 상용성인 항체, 예컨대 인간화 항체 또는 완전 인간 항체가 사용될 수 있다. 투여 빈도는 요법 과정에 걸쳐 결정 및 조정될 수 있고, 반드시는 아니지만 일반적으로 TGFβ-관련 적응증의 치료 및/또는 억제 및/또는 호전 및/또는 지연에 기초한다. 대안적으로, GARP-TGFβ1 복합체, LTBP1-TGFβ1 복합체, LTBP3-TGFβ1 복합체 및/또는 LRRC33-TGFβ1 복합체에 특이적으로 결합하는 항체의 지속된 연속 방출 제제가 적절할 수 있다. 지속 방출을 달성하기 위한 다양한 제제 및 장치가 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 분명할 것이고, 본 개시내용의 범주 내에 있다.

한 예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체에 대한 투여량은 1회 이상의 항체 투여가 제공된 개체에서 실험적으로 결정될 수 있다. 개체는 증분 투여량의 길항제를 제공받는다. 효능을 평가하기 위해, TGFβ-관련 적응증의 지표를 추적할 수 있다. 예를 들어, 근섬유 손상, 근섬유 복구, 근육에서의 염증 수준 및/또는 근육에서의 섬유증 수준을 측정하는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.

본 발명은 이소형-특이적 방식으로 TGFβ의 활성화 단계를 조정할 수 있는 작용제가 의약으로서 사용되는 경우에 개선된 안전성 프로파일을 제공할 수 있다는 인식을 포괄한다. 따라서, 본 발명은 TGFβ1에 특이적으로 결합하고 그의 활성화를 억제하며 TGFβ2 또는 TGFβ3에는 그렇지 않음으로써, TGFβ2 및/또는 TGFβ3 신호전달에 영향을 미침에 따른 원치않는 부작용을 최소화하면서 생체내 TGFβ1 신호전달의 특이적 억제를 부여하는 항체 및 그의 항원-결합 단편을 포함한다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 대상체에게 투여되는 경우에 독성이 아니다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 TGFβ1 및 TGFβ2 둘 다에 특이적으로 결합하는 항체와 비교하여 대상체에게 투여되는 경우에 감소된 독성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 TGFβ1 및 TGFβ3 둘 다에 특이적으로 결합하는 항체와 비교하여 대상체에게 투여되는 경우에 감소된 독성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3에 특이적으로 결합하는 항체와 비교하여 대상체에게 투여되는 경우에 감소된 독성을 나타낸다.

일반적으로, 본원에 기재된 임의의 항체의 투여의 경우, 초기 후보 투여량은, 예를 들어 매주, 2주마다, 3주마다, 매월 등 투여당 약 1-20 mg/kg일 수 있다. 예를 들어, 환자는 질환 (예를 들어, 암)을 치료하는데 효과적인 양으로 1주에, 2주에, 3주에 또는 4주에 등 약 1-10 mg/kg의 주사를 받을 수 있으며, 여기서 양은 (허용되는 독성 또는 유해 사건 내에서) 내약성이 우수하다.

본 개시내용의 목적상, 전형적인 투여량 (투여, 예컨대 주사 및 주입당)은 상기 언급된 인자에 따라 약 0.1 mg/kg 내지 30 mg/kg의 범위일 수 있다. 수일 또는 그 초과에 걸친 반복 투여의 경우, 상태에 따라, 치료는 목적하는 증상 억제가 발생할 때까지 또는 충분한 치료 수준이 달성되어 TGFβ-관련 적응증 또는 그의 증상이 완화될 때까지 지속된다. 예를 들어, Ab6에 대한 적합한 유효 투여량은 1주 2회, 1주 1회, 2주마다, 4주마다 또는 1개월 1회 투여되는 1 mg/kg 내지 30 mg/kg (예를 들어, 1-10 mg/kg, 1-15 mg/kg, 3-20 mg/kg, 5-30 mg/kg 등)일 수 있다. Ab6에 대한 적합한 유효 용량은, 예를 들어 매주 투여되는 약 1 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 10 mg/kg를 포함한다.

예시적인 투여 요법은 초기 용량, 이어서 유지 용량 중 1종 이상을 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어, 초기 용량은, 예를 들어 1주 1회 또는 1주 2회 약 1 내지 30 mg/kg일 수 있다. 그 후, 유지 용량(들)은, 예를 들어 1주 1회, 격주, 1개월 1회 등, 예를 들어 약 0.1 내지 20 mg/kg을 따를 수 있다. 그러나, 진료의가 달성하고자 하는 약동학적 붕괴 패턴에 따라 다른 투여 요법이 유용할 수 있다. 약동학 실험은 본원에 개시된 항체 (예를 들어, Ab3)의 혈청 농도가 전임상 동물 모델 (예를 들어, 마우스 모델)에 대한 투여 후 적어도 7일 동안 안정하게 유지되었음을 밝혀냈다. 어떠한 특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 이러한 투여-후 안정성은 항체가 투여되는 대상체 (예를 들어, 인간 대상체)에서 임상적으로 효과적인 혈청 농도를 유지하면서 항체가 덜 빈번하게 투여될 수 있으므로 유리할 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여 빈도는 1주마다, 2주마다, 4주마다, 5주마다, 6주마다, 7주마다, 8주마다, 9주마다 또는 10주마다 1회; 또는 1개월마다, 2개월마다 또는 3개월마다 또는 그 초과마다 1회이다. 이러한 요법의 진행은 통상적인 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다. 투여 요법 (사용된 항체 포함)은 시간 경과에 따라 달라질 수 있다.

일부 실시양태에서, 정상 체중의 성인 환자의 경우, 약 0.3 내지 5.00 mg/kg 범위의 용량이 투여될 수 있다. 특정한 투여 요법, 예를 들어 용량, 시기 및 반복은 특정한 개체 및 그 개체의 의료 병력, 뿐만 아니라 개별 작용제의 특성 (예컨대 작용제의 반감기 및 다른 관련 고려사항)에 좌우될 것이다.

본 개시내용에 따른 TGFβ1-관련 적응증을 치료하는데 치료상 유효한 고친화도, 이소형-선택적 항체의 혈청 농도는 적어도 약 10 μg/mL, 예를 들어 약 10 μg/mL 내지 1.0 mg/mL일 수 있다. 일부 실시양태에서, 혈청 농도에 의해 측정된 항체의 유효량은 약 20-400 μg/mL이다. 일부 실시양태에서, 혈청 농도에 의해 측정된 항체의 유효량은 약 100-800 μg/mL이다. 일부 실시양태에서, 혈청 농도에 의해 측정된 항체의 유효량은 적어도 약 20 μg/mL, 예를 들어 적어도 약 50 μg/mL, 100 μg/mL, 150 μg/mL 또는 200 μg/mL이다. 본원의 실시예 12에 상술된 바와 같이, 비-인간 영장류에서는, 적어도 8주 동안 약 2,000-3,000 μg/mL의 혈청 농도 수준을 유지한 후 Ab6과 연관된 독성이 관찰되지 않았다 (예를 들어, 심장독성, 증식증 및 염증, 치과적 및 치은 소견이 없었음). 따라서, 약 10-100배 치료 범위가 달성될 수 있다.

본 개시내용의 목적을 위해, GARP-TGFβ1 복합체, LTBP1-TGFβ1 복합체, LTBP3-TGFβ1 복합체 및/또는 LRRC33-TGFβ1 복합체에 특이적으로 결합하는 항체의 적절한 투여량은 사용되는 특정 항체 (또는 그의 조성물), 적응증의 유형 및 중증도, 항체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 선행 요법, 환자의 임상 병력 및 길항제에 대한 반응 및 담당 의사의 판단에 좌우될 것이다. 일부 실시양태에서, 임상의는 목적하는 결과를 달성하는 투여량에 도달할 때까지, GARP-TGFβ1 복합체, LTBP1-TGFβ1 복합체, LTBP3-TGFβ1 복합체 및/또는 LRRC33-TGFβ1 복합체에 특이적으로 결합하는 항체를 투여할 것이다. GARP-TGFβ1 복합체, LTBP1-TGFβ1 복합체, LTBP3-TGFβ1 복합체 및/또는 LRRC33-TGFβ1 복합체에 특이적으로 결합하는 항체의 투여는, 예를 들어 수용자의 생리학적 상태, 투여 목적이 치료적인지 예방적인지 여부 및 숙련된 진료의에게 공지된 다른 인자에 따라, 연속적 또는 간헐적일 수 있다. GARP-TGFβ1 복합체, LTBP1-TGFβ1 복합체, LTBP3-TGFβ1 복합체 및/또는 LRRC33-TGFβ1 복합체에 특이적으로 결합하는 항체의 투여는 미리 선택된 기간에 걸쳐 본질적으로 연속적일 수 있거나 또는 예를 들어 TGFβ-관련 적응증이 발생하기 전에, 그 동안에 또는 그 후에, 일련의 이격된 용량으로 이루어질 수 있다.

본원에 사용된 용어 "치료하는"은 1종 이상의 활성제를 포함하는 조성물을 TGFβ-관련 적응증, 적응증의 증상 또는 적응증에 대한 소인을 갖는 대상체에게 적응증, 적응증의 증상 또는 적응증에 대한 소인을 치유하거나, 낫게 하거나, 완화시키거나, 경감시키거나, 변경하거나, 해소하거나, 호전시키거나, 개선시키거나, 이에 영향을 미칠 목적으로 적용 또는 투여하는 것을 지칭한다.

GARP-TGFβ1 복합체, LTBP1-TGFβ1 복합체, LTBP3-TGFβ1 복합체 및/또는 LRRC33-TGFβ1 복합체에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 TGFβ-관련 적응증을 완화시키는 것은 적응증의 발생 또는 진행을 지연시키거나 또는 적응증의 중증도를 감소시키는 것을 포함한다. 적응증을 완화시키는 것은 반드시 치유적인 결과를 필요로 하지는 않는다. 본원에 사용된 TGFβ-관련 적응증과 연관된 적응증의 발생을 "지연시키는 것"은 적응증의 진행을 유예, 저해, 저속화, 지체, 안정화 및/또는 연기시키는 것을 의미한다. 이러한 지연은 치료될 적응증 및/또는 개체의 병력에 따라 시간 길이가 다양할 수 있다. 적응증의 발생을 "지연" 또는 완화시키거나 또는 적응증의 발병을 지연시키는 방법은, 방법을 사용하지 않는 것과 비교하여 주어진 시간 프레임에서 적응증의 1종 이상의 증상이 발생할 확률을 감소시키고/거나 주어진 시간 프레임에서 증상의 정도를 감소시키는 방법이다. 이러한 비교는 전형적으로, 통계적으로 유의한 결과를 제공하는데 충분한 다수의 대상체를 사용한 임상 연구에 기초한다.

DBA2/J 마우스는 LTBP4 대립유전자에서 40 bp 결실을 갖는다. 잠복 TGFb1이 회합된 ECM의 조절이상은 Ab1이 결합하는 에피토프를 노출시킬 수 있다. Ab1이 결합하는 에피토프가 노출되는 질환이 존재할 수 있고, 그러한 질환은 TGFb1 억제가 나타나는 경우 Ab1에 대한 치료 기회일 수 있다.

조합 요법

본 개시내용은 생체내 TGFβ 억제로부터 이익을 얻을 수 있는 대상체를 치료하기 위한 조합 요법으로서 사용되는 제약 조성물 및 관련 방법을 추가로 포괄한다. 임의의 이들 실시양태에서, 이러한 대상체는 적어도 1종의 본원에 기재된 TGFβ 억제제, 예를 들어 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 제1 조성물을 동일하거나 중첩된 질환 또는 임상 상태를 치료하도록 의도된 적어도 1종의 추가의 치료제를 포함하는 제2 조성물과 함께 포함하는 조합 요법을 받을 수 있다. 제1 및 제2 조성물은 동일한 세포 표적 또는 별개의 세포 표적 둘 다에 작용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 조성물은 동일하거나 중첩된 세트의 질환 또는 임상 상태의 증상 또는 측면을 치료하거나 완화시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 조성물은 개별 세트의 질환 또는 임상 상태의 증상 또는 측면을 치료하거나 완화시킬 수 있다. 하나의 예를 들자면, 제1 조성물은 TGFβ 신호전달과 연관된 질환 또는 상태를 치료할 수 있는 한편, 제2 조성물은 동일한 질환 등과 연관된 염증 또는 섬유증을 치료할 수 있다. 이러한 조합 요법은 서로 함께 투여될 수 있다. 조합 요법과 관련하여 어구 "와 함께"는, 조합 요법을 받는 대상체에서 제1 요법의 치료 효과가 제2 요법의 치료 효과와 시간적으로 및/또는 공간적으로 중첩된다는 것을 의미한다. 따라서, 조합 요법은 요법의 공동 투여를 위한 단일 제제로서 또는 순차적 투여를 위한 개별 제제로서 제제화될 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 조합 요법은 질환의 치료에서 상승작용적 효과를 생성한다. 용어 "상승작용적"은 응집체에서 각각의 단독요법의 상가적 효과 (예를 들어, 더 큰 효능)보다 더 큰 효과를 지칭한다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 제약 조성물을 포함하는 조합 요법은 또 다른 요법 (예컨대 제2 작용제의 단독요법)에 의해 생성되는 것과 전체적으로 등가의 효능을 생성하지만 제2 작용제의 단독요법과 비교하여 제2 작용제와 연관된 보다 적은 원치않는 유해 효과 또는 덜 심한 독성과 연관된다. 일부 실시양태에서, 이러한 조합 요법은 제2 작용제의 더 낮은 투여량을 가능하게 하지만, 전체 효능을 유지한다. 이러한 조합 요법은 장기간 치료가 보장되고/거나 소아과 환자를 수반하는 환자 집단에 특히 적합할 수 있다.

따라서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 TGFβ1 단백질 활성화의 감소 및 TGFβ1 신호전달과 연관된 질환 또는 상태의 치료 또는 예방을 위한 조합 요법에 사용하기 위한 제약 조성물 및 방법을 제공한다. 따라서, 방법 또는 제약 조성물은 제2 요법을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 요법은 TGFβ1 신호전달과 연관된 질환 또는 상태를 치료 또는 예방하는데 유용할 수 있다. 제2 요법은 표적화된 질환과 연관된 적어도 1종의 증상(들)을 감소시키거나 치료할 수 있다. 제1 및 제2 요법은 유사한 또는 관련되지 않은 작용 메카니즘에 의해 그의 생물학적 효과를 발휘할 수 있거나; 또는 제1 및 제2 요법 중 하나 또는 둘 다는 다수의 작용 메카니즘에 의해 그의 생물학적 효과를 발휘할 수 있다.

본원에 기재된 제약 조성물이 각각의 기재된 실시양태에 대해 제1 및 제2 요법을 동일한 제약상 허용되는 담체 내에 또는 상이한 제약상 허용되는 담체 내에 가질 수 있음이 이해되어야 한다. 제1 및 제2 요법이 기재된 실시양태 내에서 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있음이 추가로 이해되어야 한다.

본 발명의 1종 이상의 항-TGFβ 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 추가의 치료제 중 1종 이상과 조합되어 사용될 수 있다. 본 발명의 항-TGFβ 항체와 함께 사용될 수 있는 추가의 치료제의 예는 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 암 백신, 조작된 면역 세포 요법, 화학요법, 방사선 요법, TGFβ 슈퍼패밀리의 구성원의 조정제, 예컨대 미오스타틴 억제제 및 GDF11 억제제; VEGF 효능제; IGF1 효능제; FXR 효능제; CCR2 억제제; CCR5 억제제; 이중 CCR2/CCR5 억제제; CCR4 억제제, 리실 옥시다제-유사-2 억제제; ASK1 억제제; 아세틸-CoA 카르복실라제 (ACC) 억제제; p38 키나제 억제제; 피르페니돈; 닌테다닙; M-CSF 억제제 (예를 들어, M-CSF 수용체 길항제 및 M-CSF 중화제); MAPK 억제제 (예를 들어, Erk 억제제), 면역 체크포인트 효능제 또는 길항제; IL-11 길항제; 및 IL-6 길항제 등. TGFβ 억제제와 함께 사용될 수 있는 추가의 치료제의 다른 예는 인돌아민 2,3-디옥시게나제 (IDO) 억제제, 아르기나제 억제제, 티로신 키나제 억제제, Ser/Thr 키나제 억제제, 이중-특이적 키나제 억제제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 이러한 작용제는 PI3K 억제제, PKC 억제제 또는 JAK 억제제일 수 있다.

일부 실시양태에서, 추가의 작용제는 체크포인트 억제제이다. 일부 실시양태에서, 추가의 작용제는 PD-1 길항제, PDL1 길항제, PD-L1 또는 PDL2 융합 단백질, CTLA4 길항제, GITR 효능제, 항-ICOS 항체, 항-ICOSL 항체, 항-B7H3 항체, 항-B7H4 항체, 항-TIM3 항체, 항-LAG3 항체, 항-OX40 항체 (OX40 효능제), 항-CD27 항체, 항-CD70 항체, 항-CD47 항체, 항-41BB 항체, 항-PD-1 항체, 종양용해 바이러스 및 PARP 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 TGFβ1 활성화의 고친화도, 콘텍스트-비의존성 억제제는 본원에 열거된 것과 같은 체크포인트 억제 요법의 불량한 반응자 또는 비-반응자인 대상체에서의 암의 치료에 사용된다.

일부 실시양태에서, 추가의 작용제는 T-세포 공동자극 분자, 예컨대 억제 공동자극 분자 및 활성화 공동자극 분자에 결합한다. 일부 실시양태에서, 추가의 작용제는 항-CD40 항체, 항-CD38 항체, 항-KIR 항체, 항-CD33 항체, 항-CD137 항체 및 항-CD74 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 실시양태에서, 추가의 요법은 방사선이다. 일부 실시양태에서, 추가의 작용제는 화학요법제이다. 일부 실시양태에서, 화학요법제는 탁솔이다. 일부 실시양태에서, 추가의 작용제는 항염증제이다. 일부 실시양태에서, 추가의 작용제는 단핵구/대식세포 동원 및/또는 조직 침윤의 과정을 억제한다. 일부 실시양태에서, 추가의 작용제는 간 성상 세포 활성화의 억제제이다. 일부 실시양태에서, 추가의 작용제는 케모카인 수용체 길항제, 예를 들어 CCR2 길항제 및 CCR5 길항제이다. 일부 실시양태에서, 이러한 케모카인 수용체 길항제는 이중 특이적 길항제, 예컨대 CCR2/CCR5 길항제이다. 일부 실시양태에서, 조합 요법으로서 투여될 추가의 작용제는 성장 인자의 TGFβ 슈퍼패밀리의 구성원 또는 그의 조절제이거나 또는 그를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 작용제는 GDF8/미오스타틴 및 GDF11의 조정제 (예를 들어, 억제제 및 활성화제)로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 이러한 작용제는 GDF8/미오스타틴 신호전달의 억제제이다. 일부 실시양태에서, 이러한 작용제는 프로/잠복 미오스타틴 복합체에 특이적으로 결합하고 미오스타틴의 활성화를 차단하는 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, 미오스타틴의 프로/잠복 미오스타틴 복합체에 특이적으로 결합하고 미오스타틴의 활성화를 차단하는 모노클로날 항체는 유리 성숙 미오스타틴에 결합하지 않는다.

일부 실시양태에서, 추가의 요법은 세포 요법, 예컨대 CAR-T 요법을 포함한다.

일부 실시양태에서, 추가의 요법은 암 백신이다. 펩티드-기반 암 백신을 시험한 수많은 임상 시험은 혈액 악성종양 (혈액암), 흑색종 (피부암), 유방암, 두경부암, 위식도암, 폐암, 췌장암, 전립선암, 난소암 및 결장직장암을 표적화하였다. 항원은 HER2, 텔로머라제 (TERT), 서바이빈 (BIRC5) 및 윌름스 종양 1 (WT1)로부터의 펩티드를 포함하였다. 여러 시험은 또한 12-15종의 별개의 펩티드의 "개인맞춤형" 혼합물을 사용하였다. 즉, 이들은 환자가 면역 반응을 나타내는 환자의 종양으로부터의 펩티드의 혼합물을 함유한다. 일부 시험은 고형 종양, 신경교종, 교모세포종, 흑색종 및 유방암, 자궁경부암, 난소암, 결장직장암 및 비소세포 폐암을 표적화하고, MUC1, IDO1 (인돌아민 2,3-디옥시게나제), CTAG1B 및 2종의 VEGF 수용체인 FLT1 및 KDR로부터의 항원을 포함한다. 특히, IDO1 백신은 면역 체크포인트 억제제 이필리무맙 및 BRAF (유전자) 억제제 베무라페닙과 조합되어 흑색종을 갖는 환자에서 시험된다.

암 백신으로서 유용한 종양 항원의 비제한적 예는 다음을 포함한다: NY-ESO-1, HER2, HPV16 E7 (파필로마비리다에#E7), CEA (암배아성 항원), WT1, MART-1, gp100, 티로시나제, URLC10, VEGFR1, VEGFR2, 서바이빈, MUC1 및 MUC2.

그러나, 이러한 암 백신에 의해 프라이밍된 활성화된 면역 세포는 부분적으로 TGFβ1-의존성 메카니즘을 통해 TME로부터 배제될 수 있다. 면역억제를 극복하기 위해, 본 개시내용의 고친화도, 콘텍스트-비의존성 TGFβ1 억제제의 사용은 백신의 잠재력을 촉발하도록 고려될 수 있다.

본원에서 고려되는 조합 요법은 유리하게는 투여된 치료제의 더 낮은 투여량을 이용함으로써, 다양한 단독요법과 연관된 가능한 독성 또는 합병증을 피할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 TGFβ1의 이소형-특이적 억제제의 사용은 요법 (예를 들어 표준 관리)에 불량하게 반응성이거나 반응성이지 않은 자를 보다 반응성이게 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 TGFβ1의 이소형-특이적 억제제의 사용은 여전히 환자에서 동등한 임상 효능을 생성하나 더 적은 또는 더 낮은 정도의 약물-관련 독성 또는 유해 사건을 생성하는 요법 (예를 들어, 표준 관리)의 감소된 투여량을 가능하게 할 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에서 고려되는 TGFβ1의 이소형-선택적 억제제는 TGFβ3의 이소형-선택적 억제제와 함께 (예를 들어, 조합 요법, 부가 요법 등으로) 사용될 수 있다. 이러한 용도는 추가의 요법, 예컨대 암 요법, 예를 들어 면역 체크포인트 억제제, 암 백신, 방사선 요법 및/또는 화학요법을 추가로 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에서 고려되는 TGFβ1의 이소형-선택적 억제제는 미오스타틴의 선택적 억제제 (GDF8)와 함께 (예를 들어, 조합 요법, 부가 요법 등으로) 사용될 수 있다.

진단, 환자 선택, 모니터링

TGFβ1 억제 요법을 포함하는 치료 방법은 TGFβ1 적응증의 진단 및/또는 이러한 요법에 반응할 가능성이 있는 환자의 선택을 포함할 수 있다. 추가적으로, TGFβ1 억제제를 받은 환자는 치료의 치료 효과에 대해 모니터링될 수 있으며, 이는 전형적으로, 상태를 나타내고 치료 전 및 후에 측정 (예를 들어, 검정) 될 수 있는 1종 이상의 적합한 파라미터를 측정하고, 파라미터에서의 치료-관련 변화를 평가하는 것을 수반한다. 예를 들어, 이러한 파라미터는 환자로부터 수집된 생물학적 샘플에 존재하는 바이오마커의 수준을 포함할 수 있다. 바이오마커는 RNA-기반, 단백질-기반, 세포-기반 및/또는 조직-기반일 수 있다. 예를 들어, 특정 질환 상태에서 과다발현되는 유전자는 질환 또는 요법에 대한 반응을 진단 및/또는 모니터링하기 위한 바이오마커로서의 역할을 할 수 있다. 질환-연관 세포 집단의 세포-표면 단백질은 바이오마커로서의 역할을 할 수 있다. 이러한 방법은 특정한 질환의 정도를 나타내는 질환 파라미터, 예컨대 종양 크기/부피의 직접 측정을 포함할 수 있다. 임의의 적합한 샘플링 방법, 예컨대 혈청/혈액 샘플, 생검 및 영상화가 사용될 수 있다. 생검은 조직 생검 (예컨대 종양) 및 액체 생검을 포함할 수 있다.

생검은 전통적으로 다양한 질환, 예컨대 섬유증 (예를 들어, 기관 섬유증) 및 증식성 장애 (예를 들어, 암)의 진단 및 모니터링을 위한 표준이었지만, 덜 침습적인 대안이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 많은 비-침습적 생체내 영상화 기술을 사용하여 치료를 위한 환자를 진단, 모니터링 및 선택할 수 있다. 따라서, 본 발명은 환자 또는 대상체에서 질환을 진단 및/또는 모니터링하기 위한 생체내 영상화 기술의 용도를 포함한다. 일부 실시양태에서, 환자 또는 대상체는 본원에 기재된 바와 같은 이소형-특이적 TGFβ1 억제제를 받고 있다. 다른 실시양태에서, 생체내 영상화 기술을 사용하여 이소형-특이적 TGFβ1 억제제로의 치료를 위한 환자를 선택할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 기술은 환자가 요법, 예를 들어 TGFβ1 억제 요법에 반응하는지 또는 어떻게 반응하는지를 결정하는데 사용될 수 있다.

방법에 사용되는 예시적인 생체내 영상화 기술은 X-선 방사선촬영, 자기 공명 영상화 (MRI), 의료 초음파검사 또는 초음파, 내시경검사, 탄성측정법, 촉각 영상화, 온도기록법, 의료 사진촬영을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 다른 영상화 기술은 핵의학 기능적 영상화, 예를 들어 양전자 방출 단층촬영 (PET) 및 단일-광자 방출 컴퓨터 단층촬영 (SPECT)을 포함한다. 이들 기술을 수행하고 결과를 분석하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다.

암을 진단 및 모니터링하는데 통상적으로 사용되는 비-침습적 영상화 기술은 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 자기 공명 영상화 (MRI), 컴퓨터 단층촬영 (CT), 초음파, 양전자 방출 단층촬영 (PET), 단일-광자 방출 컴퓨터 단층촬영 (SPECT), 형광 반사 영상화 (FRI) 및 형광 매개 단층촬영 (FMT). 하이브리드 영상화 플랫폼을 또한 사용하여 암을 진단 및 모니터링할 수 있다. 예를 들어, 하이브리드 기술은 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: PET-CT, FMT-CT, FMT-MRI 및 PET-MRI. 동적 조영 증강 MRI (DCE-MRI)는 유방암을 검출하는데 통상적으로 사용되는 또 다른 영상화 기술이다. 이들 기술을 수행하고 결과를 분석하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다.

섬유증을 진단 및 모니터링하는데 통상적으로 사용되는 비-침습적 영상화 기술은 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 초음파 (예를 들어, 통상적 또는 조영-증강 초음파), 초음파 탄성측정법 (예를 들어, 일시적 탄성측정법, 점 횡파 탄성측정법 및 2D-횡파 탄성측정법), CT 스캔 (예를 들어, 통상적 CT 또는 CT 관류 영상화), 자기 공명 영상화 (MRI) (예를 들어, 통상적 MRI, 자기 공명 탄성측정법, 확산 가중 자기 공명 영상화, 가독세트산 이나트륨 및 자기 공명 관류 영상화).

일부 실시양태에서, 비-침습적 영상화 기술을 사용하여 간 섬유증 또는 간 지방증의 수준을 평가한다. 예를 들어, 간 섬유증을 평가하는데 특히 유용한 영상화 기술은 다음을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다: 피브로스캔 (일시적 탄성측정법; TE), 점 횡파 탄성측정법 (pSWE); 일명 음향 방사력 임펄스 (ARFI), 2D-3D SWE, 자기 공명 탄성측정법 (MRE) 및 다중파라미터 MRI. 간 지방증을 평가하는데 특히 유용한 영상화 기술은 다음을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다: 초음파검사, 제어 감쇠 파라미터 (CAP) 탄성측정법, MRI-추정 양성자 밀도 지방 분획 (MRI-PDFF) 및 자기 공명 분광분석법 (MRS). 일부 실시양태에서, 생체내 영상화 기술을 사용하여 간 강성을 평가한다. 일부 실시양태에서, 생체내 영상화 기술을 이용하여 간내 트리글리세리드 수준을 검출 및 평가한다. 일부 실시양태에서, 생체내 영상화 기술을 사용하여 간 표면 결절성 (LSN; 일명 "간 점수"), 간 강성 및/또는 간 절편 부피 비 (LSVR)를 평가하며, 이들은 모두 간 섬유증 및 병기결정-전 간경변증에 유익하다. 이들 기술을 수행하고 결과를 분석하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다.

보다 최근에는, 생체내에서 관심 세포 (예를 들어, 세포독성 T 세포, 대식세포 및 암 세포)의 검출을 가능하게 할 비-침습적 영상화 방법이 개발되고 있다. 예를 들어, www.imaginab.com/technology/; 문헌 [Tavare et al. (2014) PNAS, 111(3): 1108-1113; Tavare et al. (2015) J Nucl Med 56(8): 1258-1264; Rashidian et al. (2017) J Exp Med 214(8): 2243-2255; Beckford Vera et al. (2018) PLoS ONE 13(3): e0193832; 및 Tavare et al. (2015) Cancer Res 76(1): 73-82]을 참조하며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다. 소위 "T-세포 추적"은 생체내에서 항종양 이펙터 T-세포를 검출하고 국재화하는 것을 목표로 한다. 이는 고형 종양의 면역억제 표현형을 이해하는데 유용한 통찰을 제공할 수 있다. 세포독성 T 세포가 잘 침윤된 종양 ("염증발생" 또는 "핫" 종양)은 암 요법, 예컨대 체크포인트 차단 요법 (CBT)에 반응할 가능성이 있다. 다른 한편으로는, 면역억제 표현형을 갖는 종양은 항종양 면역 반응이 존재하는 경우에도 불량한 T-세포 침윤을 갖는 경향이 있다. 이들 소위 "면역 배제된" 종양은 CBT와 같은 암 요법에 반응하지 못할 가능성이 있다. T-세포 추적 기술은 이들 상이한 표현형을 밝혀낼 수 있고, 환자에게 유익할 가능성이 있는 치료 접근법을 안내하기 위한 정보를 제공할 수 있다. 예를 들어, "면역 배제된" 종양을 갖는 환자는 면역억제 표현형을 역전시키는 것을 돕는 TGFβ1 억제제 요법으로부터 이익을 얻을 가능성이 있다. 유사한 기술을 사용하여 다른 질환, 예를 들어 섬유증을 진단 및 모니터링할 수 있는 것으로 고려된다. 전형적으로, 검출 모이어티 (예를 들어, 방사성표지, 형광 등)로 조작된 항체 또는 항체-유사 분자는 환자 내로 주입될 수 있고, 이는 이어서 특정한 마커 (예를 들어 CD8+ 및 M2 대식세포)의 부위로 분포 및 국재화될 것이다.

비-침습적 생체내 영상화 기술은 환자를 진단하고/거나; TGFβ1 억제제 요법으로부터 이익을 얻을 가능성이 있는 환자를 선택 또는 확인하고/거나; 치료시 치료 반응에 대해 환자를 모니터링하는 것을 목적으로 하는 다양한 적합한 방법에 적용될 수 있다. 공지된 세포-표면 마커를 갖는 임의의 세포는 세포 마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 유사한 분자를 사용함으로써 검출/국재화될 수 있다. 전형적으로, 이러한 기술의 사용에 의해 검출될 세포는 면역 세포, 예컨대 세포독성 T 림프구, 조절 T 세포, MDSC, 질환-연관 대식세포 (M2 대식세포, 예컨대 TAM 및 FAM), NK 세포, 수지상 세포 및 호중구이다.

적합한 면역 세포 마커의 비제한적 예는 단핵구 마커, 대식세포 마커 (예를 들어, M1 및/또는 M2 대식세포 마커), CTL 마커, 억제성 면역 세포 마커, MDSC 마커 (예를 들어, G- 및/또는 M-MDSC에 대한 마커), 예컨대 비제한적으로: CD8, CD3, CD4, CD11b, CD163, CD206, CD68, CD14, CD15, CD66, CD34, CD25 및 CD47를 포함한다.

상기 기재된 생체내 영상화 기술은 TGFβ1-연관 질환, 예컨대 암 및 섬유증으로 진단된 환자에서 특정 MDSC를 검출, 국재화 및/또는 추적하는데 사용될 수 있다. 건강한 개체는 순환에서 MDSC를 전혀 갖지 않거나 낮은 빈도로 갖는다. 이러한 질환의 발병 또는 진행으로, 순환 및/또는 질환-연관 MDSC의 상승된 수준이 검출될 수 있다. 예를 들어, CCR2-양성 M-MDSC는 염증을 갖는 조직에 축적되는 것으로 보고되었고, 조직에서의 섬유증 (예컨대 폐 섬유증)의 진행을 유발할 수 있으며, 이는 TGFβ1 발현과 상관관계가 있는 것으로 제시된다. 유사하게, MDSC는 다수의 고형 종양 (삼중-음성 유방암 포함)이 풍부화되어 있고, 부분적으로 TME의 면역억제 표현형에 기여한다. 따라서, 본 개시내용에 따른 TGFβ1 억제 요법에 대한 치료 반응은 MDSC를 국재화하거나 추적함으로써 모니터링될 수 있다. 검출가능한 MDSC의 감소 또는 낮은 빈도는 전형적으로 치료 이익 또는 보다 우수한 예후를 나타낸다.

많은 인간 암은 건강한 대조군과 비교하여 환자에서 상승된 수준의 MDSC를 유발하는 것으로 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Elliott et al. (2017) "Human tumor-infiltrating myeloid cells: phenotypic and functional diversity" Frontiers in Immunology, Vol. 8, Article 86] 참조). 이들 인간 암은 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 방광암, 결장직장암, 전립선암, 유방암, 교모세포종, 간세포성 암종, 두경부 편평 세포 암종, 폐암, 흑색종, NSCL, 난소암, 췌장암 및 신세포 암종. 상승된 수준의 MDSC가 생물학적 샘플, 예컨대 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 조직 샘플 (예를 들어, 종양 생검)에서 검출될 수 있다. 예를 들어, MDSC의 빈도 또는 수의 변화는 적합한 세포 표면 마커 (표현형)를 사용하여 다음과 같이 측정될 수 있다: 총 PBMC의 퍼센트 (%), CD14+ 세포의 퍼센트 (%), CD45+ 세포의 퍼센트 (%); 단핵 세포의 퍼센트 (%), 총 세포의 퍼센트 (%), CD11b+ 세포의 퍼센트 (%), 단핵구의 퍼센트 (%), 비-림프구성 MNC의 퍼센트 (%), KLA-DR 세포의 퍼센트 (%).

추가적으로, 면역 세포 마커를 사용하여, 암의 경우에, 종양이 면역-배제된 표현형을 갖는지 결정하는 것이 가능하다. 종양이 면역-배제된 표현형을 갖는 것으로 결정되는 경우에, 암 요법 (예컨대 CBT) 단독은 종양이 종양 환경 내에서 충분한 세포독성 세포가 결여되기 때문에 효과적이지 않을 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 것과 같은 TGFβ1 억제제를 사용한 부가 요법은 면역-억제를 감소시킴으로써 암 요법-저항성 종양을 암 요법에 보다 반응성이게 할 수 있다. 면역 마커는 또한 섬유화 콘텍스트에서 면역 세포를 추적하고/거나 섬유화 조직의 면역 세포 조성을 결정하는데 (예를 들어, 대식세포 및/또는 근섬유모세포의 존재를 추적하는데) 사용될 수 있는 것으로 고려된다.

따라서, 본 발명은 또한 하기 단계를 포함할 수 있는, TGFβ1-관련 질환 또는 상태를 치료하는 방법을 포함한다: i) TGFβ1-관련 질환 또는 상태로 진단된 환자를 선택하는 단계; 및 ii) 환자에게 본원에 포괄된 항체 또는 단편을 질환 또는 상태를 치료하는데 효과적인 양으로 투여하는 단계. 일부 실시양태에서, 선택 단계 (i)은 질환 마커 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 섬유증 또는 암 마커)의 검출을 포함하며, 여기서 임의로 검출은 생검 분석, 혈청 마커 분석 및/또는 생체내 영상화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 선택 단계 (i)은 본원에 기재된 바와 같은 생체내 영상화 기술을 포함한다.

일부 실시양태에서, TGFβ1-관련 질환 또는 상태는 섬유화 상태이다. 일부 실시양태에서, 선택 단계 (i)은 근섬유모세포 세포 또는 그의 1종 이상의 마커의 검출을 포함한다. 일부 실시양태에서, 선택 단계 (i)은 간 지방증, 간 트리글리세리드, 면역 세포 및/또는 근섬유모세포의 검출을 포함한다. 일부 실시양태에서, 검출은 생검 분석, 혈청 마커 분석 및/또는 생체내 영상화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 생체내 영상화는 초음파, 초음파 탄성측정법, CT 스캔, MRI, PET-SPECT, 광학 형광/생물발광 피브로스캔 (TE), pSWE, 2D-3D SWE, MRE, 초음파검사, CAP, MRI-PDFF 및/또는 MRS를 포함한다. 일부 실시양태에서, 생체내 영상화는 면역 세포의 세포-표면 마커에 결합하는 면역 세포 또는 항체의 직접 또는 간접 표지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 생체내 영상화는 추적자의 사용을 포함한다.

일부 실시양태에서, 생체내 영상화 기술은 간 지방증, 간 트리글리세리드, 면역 세포 (예를 들어, 하기 기재된 바와 같음) 및/또는 근섬유모세포를 측정한다. 일부 실시양태에서, 치료는 이환 조직에서 트리글리세리드, 지방증, 간 표면 결절, 염증 및/또는 대식세포를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 치료는 간내 트리글리세리드 함량을 ≤ 5.5%로 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 치료는 이환 조직에서 MDSC를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 치료는 이환 조직에서 대식세포를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 유효량은 0.1 mg/kg 내지 30 mg/kg, 임의로 3 mg/kg 내지 30 mg/kg이다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체를 본원에 기재된 바와 같은 치료 반응 (예를 들어, 감소된 트리글리세리드, 감소된 지방증, 감소된 간 표면 결절, 감소된 염증, 감소된 대식세포 및/또는 감소된 간 점수)에 대해 모니터링하는 단계를 추가로 포함한다.

본 발명은 또한 하기 단계를 포함할 수 있는, 암을 치료하는 방법을 포함한다: i) 고형 종양을 포함하는 암으로 진단된 환자를 선택하는 단계이며, 여기서 고형 종양은 면역 배제된 종양이거나 또는 면역 배제된 종양인 것으로 의심되는 것인 단계; 및 ii) 환자에게 본원에 포괄된 항체 또는 단편을 암을 치료하는데 효과적인 양으로 투여하는 단계. 바람직하게는, 환자는 암 요법, 예컨대 면역 체크포인트 억제 요법 (예를 들어, PD-(L)1 항체), 화학요법, 방사선 요법, 조작된 면역 세포 요법 및 암 백신 요법을 받았거나 또는 받기 위한 후보이다. 일부 실시양태에서, 선택 단계 (i)은 면역 세포 또는 그의 1종 이상의 마커의 검출을 포함하며, 여기서 임의로 검출은 종양 생검 분석, 혈청 마커 분석 및/또는 생체내 영상화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 선택 단계 (i)은 본원에 기재된 바와 같은 생체내 영상화 기술을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 본원에 기재된 바와 같은 치료 반응에 대해 모니터링하는 단계를 추가로 포함한다.

일부 실시양태에서, 생체내 영상화는 대상체에서 TGFβ1 억제 요법에 대한 치료 반응을 모니터링하기 위해 수행된다. 생체내 영상화는 본원에 기재된 영상화 기술 중 어느 하나를 포함할 수 있고, 본원에 기재된 마커 및/또는 파라미터 중 어느 하나를 측정할 수 있다. 예를 들어, 간 섬유증의 경우에, 치료 반응은 감소된 간 지방증, 감소된 트리글리세리드 함량, 감소된 ECM 침착/섬유증, 감소된 간경변증 및/또는 감소된 질환 진행을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 이소형-특이적 TGFB1 억제제로의 치료는 간내 트리글리세리드 함량을 MRI에 의해 측정시 ≤ 5.5%의 수준으로 감소시킨다. 암의 경우에, 치료 반응은 면역 배제된 종양의 염증발생 종양으로의 전환 (이는 종양 내로의 증가된 면역 세포 침윤과 상관관계가 있음), 감소된 종양 크기 및/또는 감소된 질환 진행을 포함할 수 있다. 증가된 면역 세포 침윤은 증가된 종양내 면역 세포 빈도 또는 검출 신호의 정도, 예컨대 방사성표지 및 형광에 의해 가시화될 수 있다.

일부 실시양태에서, 환자를 진단, 선택, 치료 또는 모니터링하는데 사용되는 생체내 영상화는 MDSC 추적, 예컨대 G-MDSC (PMN-MDSC로도 공지됨) 및 M-MDSC를 포함한다. 예를 들어, MDSC는 기준선에서 질환 부위 (예컨대 섬유화 조직 및 고형 종양)에서 풍부화될 수 있다. 요법 (예를 들어, TGFβ1 억제제 요법)시, 표지 (예컨대 방사성동위원소 및 형광)의 감소된 강도에 의해 측정시, 보다 적은 MDSC가 관찰될 수 있으며, 이는 치료 효과를 나타낸다.

일부 실시양태에서, 생체내 영상화는 LRRC33-양성 세포의 추적 또는 국재화를 포함한다. LRRC33-양성 세포는, 예를 들어 MDSC 및 활성화된 M2-유사 대식세포 (예를 들어, 섬유화 조직과 연관된 TAM 및 활성화된 대식세포)를 포함한다. 예를 들어, LRRC33-양성 세포는 기준선에서 질환 부위 (예컨대 섬유화 조직 및 고형 종양)에서 풍부화될 수 있다. 요법 (예를 들어, TGFβ1 억제제 요법) 시, 표지 (예컨대 방사성동위원소 및 형광)의 감소된 강도에 의해 측정시, 세포 표면 LRRC33을 발현하는 보다 적은 세포가 관찰될 수 있으며, 이는 치료 효과를 나타낸다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 생체내 영상화 기술은 관심 세포를 검출하기 위해 PET-SPECT, MRI 및/또는 광학 형광/생물발광의 사용을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 항체 또는 항체-유사 분자를 검출 모이어티로 표지하는 것은 직접 표지 또는 간접 표지를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 검출 모이어티는 추적자일 수 있다. 일부 실시양태에서, 추적자는 방사성동위원소일 수 있으며, 여기서 임의로 방사성동위원소는 양전자-방출 동위원소일 수 있다. 일부 실시양태에서, 방사성동위원소는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 18F, 11C, 13N, 15O, 68Ga, 177Lu, 18F 및 89Zr.

따라서, 이러한 방법은 면역-PET에서 표지된 항체를 사용하여 생체내 영상화를 수행하는데 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 또한 영상화 기술을 사용하는, 진단, 환자 선택 및/또는 치료 효과의 모니터링 단계를 포함하는, 대상체에서 TGFβ1 적응증을 치료하는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 고친화도, 이소형-선택적 TGFβ1 억제제는 TGFβ1 적응증의 치료에 사용되며, 여기서 치료는 적응증을 치료하기 위한 유효량의 TGFβ1 억제제의 투여를 포함하고, 생체내 영상화에 의해 대상체에서 치료 효과를 모니터링하는 단계를 추가로 포함한다. 임의로, 대상체는 생체내 영상화를 포함하는 진단 또는 선택 단계를 사용하여 TGFβ1 억제제 요법을 받기 위한 후보로서 선택될 수 있다. TGFβ1 적응증은 증식성 장애 (예컨대 고형 종양을 갖는 암 및 골수섬유증) 또는 섬유화 장애 (예컨대 기관 섬유증)일 수 있다.

일부 실시양태에서, 대상체는 암을 가지며, 여기서 방법을 하기 단계를 포함한다: i) 고형 종양을 포함하는 암으로 진단된 환자를 선택하는 단계이며, 여기서 고형 종양은 면역 배제된 종양이거나 또는 면역 배제된 종양인 것으로 의심되는 것인 단계; 및 ii) 환자에게 본원에 포괄된 항체 또는 단편을 암을 치료하는데 효과적인 양으로 투여하는 단계. 바람직하게는, 환자는 암 요법, 예컨대 면역 체크포인트 억제 요법 (예를 들어, PD-(L)1 항체), 화학요법, 방사선 요법, 조작된 면역 세포 요법 및 암 백신 요법을 받았거나 또는 받기 위한 후보이다. 일부 실시양태에서, 선택 단계 (i)은 면역 세포 또는 그의 1종 이상의 마커의 검출을 포함하며, 여기서 임의로 검출은 종양 생검 분석, 혈청 마커 분석 및/또는 생체내 영상화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 선택 단계 (i)은 본원에 기재된 바와 같은 생체내 영상화 기술을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 본원에 기재된 바와 같은 치료 반응에 대해 모니터링하는 단계를 추가로 포함한다.

대형 잠복 복합체 (LLC)를 검출하기 위한 검정

일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 및 조성물은 대상체로부터 수득된 샘플에서 GARP-TGFβ1 복합체, LTBP1-TGFβ1 복합체, LTBP3-TGFβ1 복합체 및/또는 LRRC33-TGFβ1 복합체를 검출하는 방법에 관한 것이다. 본원에 사용된 "대상체"는 개별 유기체, 예를 들어 개별 포유동물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 비-인간 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 비-인간 영장류이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 설치류이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 양, 염소, 소, 가금류, 고양이 또는 개이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 척추동물, 양서류, 파충류, 어류, 곤충, 파리 또는 선충이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 연구용 동물이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 유전자 조작되며, 예를 들어 유전자 조작된 비-인간 대상체이다. 대상체는 어느 한 성별일 수 있고 임의의 발달 단계에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 환자 또는 건강한 지원자이다.

일부 실시양태에서, 대상체로부터 수득된 샘플에서 GARP-TGFβ1 복합체, LTBP1-TGFβ1 복합체, LTBP3-TGFβ1 복합체 및/또는 LRRC33-TGFβ1 복합체를 검출하는 방법은 (a) 항원이 샘플 내에 존재하는 경우, 샘플을 GARP-TGFβ1 복합체, LTBP1-TGFβ1 복합체, LTBP3-TGFβ1 복합체 및/또는 LRRC33-TGFβ1 복합체에 특이적으로 결합하는 항체와 항원에 대한 항체의 결합에 적합한 조건 하에 접촉시킴으로써 결합 복합체를 형성하는 단계; 및 (b) 항원에 결합된 항체의 수준을 결정하는 단계 (예를 들어, 결합 복합체의 수준을 결정하는 단계)를 수반한다.

한 실시양태에서, 표면 상에 고정화된 비오티닐화된 잠복 TGFβ1 복합체를 이용하는 스크리닝 검정은 테더를 제공함으로써 인테그린에 의한 잠복 TGFβ의 활성화를 가능하게 한다. 다른 비-인테그린 활성화제가 또한 그 시스템에서 시험될 수 있다. 리포터 세포 또는 다른 TGFβ-의존성 세포성 반응을 통해 판독될 수 있다.

TGFβ 활성화를 측정하기 위한 세포-기반 검정

TGFβ의 활성화 (및 TGFβ 시험 억제제, 예컨대 항체에 의한 그의 억제)는 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, TGFβ의 인테그린-매개 활성화는 세포-기반 효력 검정, 예컨대 본원에 보다 상세하게 기재된 "CAGA12" 리포터 (예를 들어, 루시페라제) 검정에 이용될 수 있다. 제시된 바와 같이, 이러한 검정 시스템은 하기 성분을 포함할 수 있다: i) TGFβ의 공급원 (재조합, 내인성 또는 형질감염됨); ii) 인테그린과 같은 활성화제의 공급원 (재조합, 내인성 또는 형질감염됨); 및 iii) TGFβ 활성화에 반응하는 리포터 시스템, 예컨대 TGFβ에 반응하고 신호를 판독가능한 산출물로 번역할 수 있는 TGFβ 수용체를 발현하는 세포 (예를 들어, CAGA12 세포 또는 다른 리포터 세포주에서의 루시페라제 활성). 일부 실시양태에서, 리포터 세포주는 TGFβ-반응성 프로모터 (예를 들어, PAI-1 프로모터)의 제어 하의 리포터 유전자 (예를 들어, 루시페라제 유전자)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 감수성을 부여하는 특정 프로모터 요소는 리포터 시스템 내로 혼입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 프로모터 요소는 CAGA12 요소이다. 검정에 사용될 수 있는 리포터 세포주는, 예를 들어 문헌 [Abe et al. (1994) Anal Biochem. 216(2): 276-84] (본원에 참조로 포함됨)에 기재되었다. 일부 실시양태에서, 각각의 상기 언급된 검정 성분은 동일한 공급원 (예를 들어, 동일한 세포)으로부터 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 언급된 검정 성분 중 2종은 동일한 공급원으로부터 제공되고, 제3 검정 성분은 상이한 공급원으로부터 제공된다. 일부 실시양태에서, 모든 3종의 검정 성분은 상이한 공급원으로부터 제공된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 인테그린 및 잠복 TGFβ 복합체 (프로TGFβ 및 제시 분자)는 동일한 공급원 (예를 들어, 동일한 형질감염된 세포주)으로부터 검정을 위해 제공된다. 일부 실시양태에서, 인테그린 및 TGF는 별개의 공급원 (예를 들어, 2종의 상이한 세포주, 정제된 인테그린 및 형질감염된 세포의 조합)으로부터 검정을 위해 제공된다. 세포가 검정 성분 중 1종 이상의 공급원으로서 사용되는 경우에, 검정의 이러한 성분은 세포에 대해 내인성이거나, 세포에서 안정하게 발현되거나, 일시적으로 형질감염되거나 또는 그의 임의의 조합일 수 있다.

관련 기술분야의 통상의 기술자는 다양한 적합한 구성에 이러한 검정을 용이하게 적합화시킬 수 있다. 예를 들어, TGFβ의 다양한 공급원이 고려될 수 있다. 일부 실시양태에서, TGFβ의 공급원은 TGFβ를 발현하고 침착시키는 세포 (예를 들어, 1차 세포, 전파 세포, 불멸화 세포 또는 세포주 등)이다. 일부 실시양태에서, TGFβ의 공급원은 적합한 수단을 사용하여 검정 시스템에 고정화된 정제된 및/또는 재조합 TGFβ이다. 일부 실시양태에서, 검정 시스템에 고정화된 TGFβ는 탈세포화의 존재 또는 부재 하에, 검정 플레이트 상의 세포외 매트릭스 (ECM) 조성물 내에 제시되며, 이는 섬유모세포-유래 TGFβ를 모방한다. 일부 실시양태에서, TGFβ는 검정에 사용되는 세포의 세포 표면 상에 제시된다. 추가적으로, 선택된 제시 분자는 적합한 잠복-TGFβ 복합체를 제공하기 위해 검정 시스템에 포함될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 어느 제시 분자(들)가 특정 세포 또는 세포 유형에 존재하거나 또는 발현될 수 있는지 용이하게 결정할 수 있다. 이러한 검정 시스템을 사용하여, 시험 작용제 (예컨대 항체)의 존재 또는 부재 하의 TGFβ 활성화의 상대 변화는 시험관내 TGFβ 활성화에 대한 시험 작용제의 효과를 평가하기 위해 용이하게 측정될 수 있다. 예시적인 세포-기반 검정으로부터의 데이터가 하기 실시예 섹션에 제공된다.

이러한 세포-기반 검정은 연구되는 TGFβ 이소형, 잠복 복합체 (예를 들어, 제시 분자)의 유형 등에 따라 다수의 방식으로 변형 또는 조정될 수 있다. 일부 실시양태에서, TGFβ를 활성화시킬 수 있는 인테그린을 발현하는 것으로 공지된 세포는 검정에서 인테그린의 공급원으로서 사용될 수 있다. 이러한 세포는 SW480/β6 세포 (예를 들어, 클론 1E7)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인테그린-발현 세포는 관심 제시 분자 (예컨대 GARP, LRRC33, LTBP (예를 들어, LTBP1 또는 LTBP3) 등)를 코딩하는 플라스미드 및 관심 TGFβ 이소형의 프로-형태 (예컨대 프로TGFβ1)를 코딩하는 플라스미드로 공동-형질감염될 수 있다. 형질감염 후에, 세포를 형질감염된 유전자의 발현을 가능하게 하기에 충분한 시간 (예를 들어, 약 24시간) 동안 인큐베이션하고, 세포를 세척하고, 시험 작용제 (예를 들어, 항체)의 연속 희석물과 함께 인큐베이션한다. 이어서, 리포터 세포주 (예를 들어, CAGA12 세포)를 검정 시스템에 첨가한 후, TGFβ 신호전달을 가능하게 하는 적절한 인큐베이션 시간을 거친다. 시험 작용제의 첨가 후 인큐베이션 기간 (예를 들어, 약 18-20시간) 후에, 신호/판독값 (예를 들어, 루시페라제 활성)이 적합한 수단을 사용하여 검출된다 (예를 들어, 루시페라제-발현 리포터 세포주의 경우, 브라이트-글로(Bright-Glo) 시약 (프로메가(Promega))이 사용될 수 있음). 일부 실시양태에서, 루시페라제 형광은 오토게인 세팅 하에 바이오텍(BioTek) (시너지(Synergy) H1) 플레이트 판독기를 사용하여 검출될 수 있다.

데이터는 본 발명의 예시적인 항체가 콘텍스트-비의존성 방식으로 TGFβ1의 활성화를 선택적으로 억제할 수 있다는 것을 입증한다.

핵산

일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체, 그의 항원 결합 부분 및/또는 조성물은 핵산 분자에 의해 코딩될 수 있다. 이러한 핵산 분자는 비제한적으로, DNA 분자, RNA 분자, 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, mRNA 분자, 벡터, 플라스미드 등을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 화합물 및/또는 조성물을 코딩하는 핵산 분자를 발현하기 위해 프로그램화되거나 생성된 세포를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 본 개시내용의 핵산은 코돈-최적화된 핵산을 포함한다. 코돈-최적화된 핵산을 생성하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 미국 특허 번호 5,786,464 및 6,114,148 (이들 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 것을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.

특정 실시양태의 목록

본 개시내용의 비제한적 실시양태는 하기에 열거되어 있다:

1. 용액 평형 적정-기반 검정에 의해 측정시 ≤ 10 nM, 임의로 ≤ 5 nM의 KD로 각각의 하기 항원 복합체에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이며:

i) hLTBP1-프로TGFβ1;

ii) hLTBP3-프로TGFβ1;

iii) hGARP-프로TGFβ1; 및

iv) hLRRC33-프로TGFβ1;

여기서 항체 또는 그의 단편은 완전 인간 또는 인간화 항체 또는 그의 단편인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

2. 실시양태 1에 있어서, 용액 평형 적정-기반 검정에 의해 측정시 ≤ 5 nM의 KD로 각각의 i) hLTBP1-프로TGFβ1 및 ii) hLTBP3-프로TGFβ1 복합체에 결합하며, 여기서 임의로 항체 또는 단편은 용액 평형 적정-기반 검정에 의해 측정시 ≤ 1 nM의 KD로 각각의 복합체에 결합하는 것인 항체 또는 항원-결합 단편.

3. 용액 평형 적정-기반 검정에 의해 측정시 ≤ 200 pM, 임의로 ≤ 100 pM의 KD로 각각의 하기 항원 복합체에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이며:

i) hLTBP1-프로TGFβ1;

ii) hLTBP3-프로TGFβ1;

iii) hGARP-프로TGFβ1; 및

iv) hLRRC33-프로TGFβ1;

여기서 항체 또는 그의 단편은 완전 인간 또는 인간화 항체 또는 그의 단편인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

4. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하며, 여기서

CDR-H1은 FTF(X₁)(X₂)(X₃)(X₄)M(X₅)에 의해 나타내어진 아미노산 서열을 갖고; 여기서 임의로 X₁은 S, G 또는 A이고/거나; X₂는 S 또는 F이고/거나; X₃은 F 또는 Y이고/거나; X₄는 S 또는 A이고/거나; X₅는 D, N 또는 Y이고 (서열식별번호: 143);

CDR-H2는 YI(X₁)(X₂)(X₃)A(X₄)TIYYA(X₅)SVKG에 의해 나타내어진 아미노산 서열을 갖고, 여기서 임의로 X₁은 S 또는 H이고/거나; X₂는 P 또는 S이고/거나; X₃은 S 또는 D이고/거나; X₄는 D 또는 S이고/거나; X₅는 D 또는 G이고 (서열식별번호: 144);

CDR-H3은 (X₁)R(X₂)(X₃)(X₄)D(X₅)GDML(X₆)P에 의해 나타내어진 아미노산 서열을 갖고, 여기서 임의로 X₁은 A 또는 V이고/거나; X₂는 G 또는 A이고/거나; X₃은 V 또는 T이고/거나; X₄는 L 또는 W이고/거나; X₅는 Y 또는 M이고/거나; X₆은 M 또는 D이고 (서열식별번호: 145);

CDR-L1은 임의로 1 또는 2개의 아미노산 변화를 갖는 아미노산 서열 QASQDITNYLN (서열식별번호: 105)을 갖고;

CDR-L2는 임의로 1 또는 2개의 아미노산 변화를 갖는 아미노산 서열 DASNLET (서열식별번호: 106)를 갖고;

CDR-L3은 임의로 1 또는 2개의 아미노산 변화를 갖는 아미노산 서열 QQADNHPPWT (서열식별번호: 12)를 갖는 것인 항체 또는 항원-결합 단편.

5. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하며, 여기서

CDR-H1은 임의로 4개 이하의 아미노산 변화 또는 2개 이하의 아미노산 변화를 갖는 아미노산 서열 FTFSSFSMD (서열식별번호: 107)를 갖고;

CDR-H2는 임의로 4개 이하의 아미노산 변화를 갖는 아미노산 서열 YISPSADTIYYADSVKG (서열식별번호: 103)를 갖고;

CDR-H3은 임의로 3개 이하의 아미노산 변화를 갖는 아미노산 서열 ARGVLDYGDMLMP (서열식별번호: 6)를 갖고;

CDR-L1은 임의로 1 또는 2개의 아미노산 변화를 갖는 아미노산 서열 QASQDITNYLN (서열식별번호: 105)을 갖고;

CDR-L2는 임의로 1 또는 2개의 아미노산 변화를 갖는 아미노산 서열 DASNLET (서열식별번호: 106)를 갖고;

CDR-L3은 임의로 1 또는 2개의 아미노산 변화를 갖는 아미노산 서열 QQADNHPPWT (서열식별번호: 12)를 갖는 것인 항체 또는 항원-결합 단편.

6. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, CDR-H1이 GFTFSSFS (서열식별번호: 2)를 포함하고; CDR-H2가 ISPSADTI (서열식별번호: 4)를 포함하고; CDR-H3이 ARGVLDYGDMLMP (서열식별번호: 6)를 포함하고; CDR-L1은 QDITNY (서열식별번호: 8)를 포함하고; CDR-L2가 DAS (서열식별번호: 10)를 포함하고; CDR-L3은 QQADNHPPWT (서열식별번호: 12)를 포함하는 것인 항체 또는 항원-결합 단편.

7. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 잠복 라쏘의 1개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프에 결합하며, 여기서 임의로 에피토프는 조합 에피토프이고, 여기서 추가로 임의로 조합 에피토프는 성장 인자 도메인의 핑거-1 및/또는 핑거-2의 1개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 것인 항체 또는 항원-결합 단편.

8. 실시양태 7에 있어서, 에피토프가 KLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVL (서열식별번호: 169)의 1개 이상의 아미노산 잔기를 포함하며, 여기서 임의로 에피토프는 RKDLGWKWIHEPKGYHANF (서열식별번호: 165) 및/또는 VGRKPKVEQL (서열식별번호: 168)의 1개 이상의 아미노산 잔기를 추가로 포함하는 것인 항체 또는 항원-결합 단편.

9. 실시양태 8에 있어서, 에피토프가 KLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVL (서열식별번호: 169)의 1개 이상의 아미노산 잔기 및 RKDLGWKWIHEPKGYHANF (서열식별번호: 165)의 1개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 것인 항체 또는 항원-결합 단편.

10. 실시양태 8에 있어서, 에피토프가 KLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVL (서열식별번호: 169)의 1개 이상의 아미노산 잔기 및 VGRKPKVEQL (서열식별번호: 168)의 1개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 것인 항체 또는 항원-결합 단편.

11. 실시양태 7에 있어서, 에피토프가 KLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVL (서열식별번호: 169)의 1개 이상의 아미노산 잔기, RKDLGWKWIHEPKGYHANF (서열식별번호: 165)의 1개 이상의 아미노산 잔기 및 VGRKPKVEQL (서열식별번호: 168)의 1개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 것인 항체 또는 항원-결합 단편.

12. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 완전 인간 또는 인간화 항체 또는 항원-결합 단편인 항체 또는 항원-결합 단편.

13. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 인간 및 마우스 프로TGFβ1 복합체와 교차-반응하는 항체 또는 항원-결합 단편.

14. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 인간 IgG4 또는 IgG1 하위유형인 항체 또는 항원-결합 단편.

15. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, IgG1-유사 힌지를 생성하는 Ser에서 Pro로의 백본 치환을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편.

16. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 세포-기반 리포터 검정에 의해 측정시 각각의 하기 복합체에 대해 ≤ 2 nM의 IC50을 갖는 항체 또는 항원-결합 단편:

i) hLTBP1-프로TGFβ1;

ii) hLTBP3-프로TGFβ1;

iii) hGARP-프로TGFβ1; 및

iv) hLRRC33-proTGFβ1.

17. 생물층 간섭측정법 또는 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정시 ≤ 1 nM 이하의 친화도로 각각의 하기 항원:

a) 인간 LTBP1-프로TGFβ1 복합체;

b) 인간 LTBP3-프로TGFβ1 복합체;

c) 인간 GARP-프로TGFβ1 복합체; 및

d) 인간 LRRC33-프로TGFβ1 복합체

에 특이적으로 결합하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 단편이며,

여기서 모노클로날 항체는 다른 복합체에 비해 상기 복합체 중 어느 하나에 대해 친화도에 있어서 3배 이하의 편향을 나타내고,

여기서 모노클로날 항체는 각각의 프로TGFβ1 복합체로부터의 성숙 TGFβ1 성장 인자의 방출을 억제하지만, 프로TGFβ2 또는 프로TGFβ3 복합체로부터의 것은 그렇지 않은 것인 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 단편.

18. 아미노산 서열 PGPLPEAV (서열식별번호: 161) 또는 그의 부분을 갖는 결합 영역에서 프로TGFβ1 복합체에 특이적으로 결합하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 단편이며,

용액 중 프로TGFβ1 복합체에 결합하는 경우에, 항체 또는 단편은 수소-중수소 교환 질량 분광측정법 (HDX-MS)에 의해 결정시 용매 노출로부터 결합 영역을 보호하는 것을 특징으로 하고;

여기서 항체 또는 단편은 생물층 간섭측정법 또는 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정시 ≤ 5 nM의 친화도로 각각의 하기 복합체: LTBP1-프로TGFβ1, LTBP3-프로TGFβ1, GARP-프로TGFβ1 및 LRRC33-프로TGFβ1에 특이적으로 결합하는 것인 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 단편.

19. 아미노산 서열 LVKRKRIEA (서열식별번호: 159) 또는 그의 부분을 갖는 결합 영역에서 프로TGFβ1 복합체에 특이적으로 결합하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 단편이며,

용액 중 프로TGFβ1 복합체에 결합하는 경우에, 항체 또는 단편은 수소-중수소 교환 질량 분광측정법 (HDX-MS)에 의해 결정시 용매 노출로부터 결합 영역을 보호하는 것을 특징으로 하고;

여기서 항체 또는 단편은 생물층 간섭측정법 또는 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정시 ≤ 5 nM의 친화도로 각각의 하기 복합체: LTBP1-프로TGFβ1, LTBP3-프로TGFβ1, GARP-프로TGFβ1 및 LRRC33-프로TGFβ1에 특이적으로 결합하는 것인 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 단편.

20. i) 잠복성 라쏘 (서열식별번호: 153)의 적어도 한 부분을 포함하는 제1 결합 영역; 및

ii) 핑거-1 (서열식별번호: 151)의 적어도 한 부분을 포함하는 제2 결합 영역

에서 프로TGFβ1 복합체에 특이적으로 결합하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 단편이며,

용액 중 프로TGFβ1 복합체에 결합하는 경우에, 항체 또는 단편은 수소-중수소 교환 질량 분광측정법 (HDX-MS)에 의해 결정시 용매 노출로부터 결합 영역을 보호하는 것을 특징으로 하는 것인 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 단편.

21. 제45항에 있어서, 제1 결합 영역이 PGPLPEAV (서열식별번호: 161) 또는 그의 부분을 포함하고, 제2 결합 영역이 RKDLGWKW (서열식별번호: 170) 또는 그의 부분을 포함하는 것인 항체 또는 단편.

22. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 생물층 간섭측정법 또는 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정시 5배 미만의 친화도 편향으로 매트릭스-연관 프로TGFβ1 복합체 및 세포-연관 프로TGFb1 복합체에 결합하도록 하는 콘텍스트-비의존성 항체인 항체 또는 단편.

23. 제43항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, ≤ 1 nM의 친화도로 각각의 하기 복합체: mLTBP1-프로TGFβ1, mLTBP3-프로TGFβ1, mGARP-프로TGFβ1 및 mLRRC33-프로TGFβ1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 단편.

24. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 하기 결합 영역 또는 그의 부분 중 1개 이상에서 프로TGFβ1 복합체에 결합하는 항체 또는 단편:

LVKRKRIEA (서열식별번호: 159);

LASPPSQGEVPPGPL (서열식별번호: 153);

PGPLPEAV (서열식별번호: 161);

LALYNSTR (서열식별번호: 162);

REAVPEPVL (서열식별번호: 163);

YQKYSNNSWR (서열식별번호: 164);

RKDLGWKWIHE (서열식별번호: 171);

HEPKGYHANF (서열식별번호: 172);

LGPCPYIWS (서열식별번호: 166);

ALEPLPIV (서열식별번호: 167); 및

VGRKPKVEQL (서열식별번호: 168).

25. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR 서열을 갖는 항체 또는 단편.

GFTFSSFS (서열식별번호: 2)

ISPSADTI (서열식별번호: 4)

ARGVLDYGDMLMP (서열식별번호: 6)

QDITNY (서열식별번호: 8)

DAS 및 (서열식별번호: 10)

QQADNHPPWT (서열식별번호: 12).

26. 실시양태 25에 있어서, 모든 CDR을 포함하는 항체.

27. 각각의 하기 항원:

hLTBP1-프로TGFβ1

hLTBP3-프로TGFβ1

hGARP-프로TGFβ1; 및

hLRRC33-프로TGFβ1

에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이며,

여기서 항체 또는 단편은 용액 평형 적정-기반 검정에 의해 측정시 ≤ 1 nM의 KD로 각각의 hLTBP1-프로TGFβ1 및 hLTBP3-프로TGFβ1에 결합하고;

여기서 항체 또는 단편이 LRLASPPSQGEVPPGPLPEAV (서열식별번호: 173)의 1개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프에 결합하고, 임의로 에피토프가 RKDLGWKWIHEPKGYHANF (서열식별번호: 165)의 1개 이상의 아미노산 잔기를 추가로 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

28. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, ≤ 1 nM의 친화도로 각각의 LTBP1-프로TGFβ1 및 LTBP3-프로TGFβ1에 결합하고;

세포-연관 프로TGFβ1 복합체보다 적어도 10배 더 높은 친화도로 매트릭스-연관 프로TGFβ1 복합체에 결합하는 것인 항체 또는 항원-결합 단편.

29. 상기 실시양태에 있어서, IC₅₀이 ≤ 5 nM이고, 임의로 IC₅₀이 ≤ 1 nM인 항체 또는 항원-결합 단편.

30. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, TGFβ1의 인테그린-의존성 활성화를 억제할 수 있는 항체 또는 항원-결합 단편.

31. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, TGFβ1의 프로테아제-의존성 활성화를 억제할 수 있는 항체 또는 항원-결합 단편.

32. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, TGFβ1의 인테그린-의존성 활성화 및 TGFβ1의 프로테아제-의존성 활성화를 억제할 수 있는 항체 또는 항원-결합 단편.

33. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 프로TGFβ2 또는 프로TGFβ3에 특이적으로 결합하지 않는 항체 또는 그의 단편.

34. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 프로TGFβ1 복합체와 회합되지 않은 유리 TGFβ1 성장 인자에 특이적으로 결합하지 않는 항체 또는 그의 단편.

35. 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 항체 또는 단편과 교차-차단하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

36. 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 항체 또는 단편을 포함하는 키트.

37. 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 항체 또는 단편 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 조성물.

38. 실시양태 37에 있어서, 대상체에서의 TGFβ-관련 적응증의 치료 요법에 사용하기 위한 조성물.

39. 실시양태 38에 있어서, TGFβ-관련 적응증이 암, 골수섬유증, 줄기 세포 장애 및/또는 섬유화 장애인 조성물.

40. 실시양태 38에 있어서, TGFβ-관련 적응증이 하기로부터 선택되는 것인 조성물:

i) TGFβ1이 과다발현되거나 또는 TGFβ1 신호전달이 조절이상인 질환;

ii) 비정상적 줄기 세포 분화 또는 재증식과 연관된 질환, 이는 임의로

a) 줄기 세포/전구 세포 분화/재구성이 질환으로 인해 중단 또는 교란되거나 또는 요법/의약의 부작용으로서 유도됨;

b) 환자가 건강한 세포를 사멸 또는 고갈시키는 요법 또는 의약을 받고 있음;

c) 환자가 증가된 줄기 세포/전구 세포 분화/재구성으로부터 이익을 얻을 수 있음;

d) 질환이 비정상적 줄기 세포 분화 또는 재구성과 연관됨;

iii) 조혈 조절이상을 수반하는 상태, 예컨대 치료-유도된 조혈 조절이상;

iv) 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 유전자의 이상 유전자 발현을 갖는 질환:

세르핀 1 (PAI-1 코딩), MCP-1 (CCL2로도 공지됨), CCL3, Col1a1, Col3a1, FN1, TGFB1, CTGF, ACTA2 (α-SMA 코딩), ITGA11, SNAI1, MMP2, MMP9, TIMP1, FOXP3, CDH1 (E 카드헤린) 및 CDH2;

v) 프로테아제를 수반하는 질환;

vi) 중간엽 이행을 수반하는 질환, 예컨대 상피-중간엽 이행 (EMT) 및/또는 내피-중간엽 이행 (EndMT);

vii) 면역억제를 수반하는 질환, 여기서 임의로 면역억제는 질환 부위에서의 증가된 면역억제 세포를 포함하고, 여기서 추가로 임의로 면역억제 세포는 M2 대식세포 및/또는 MDSC임;

viii) 임의로 ECM 강성을 포함하하는, 매트릭스 강성화 및 재형성을 수반하는 질환;

ix) 기관 섬유증, 임의로 진행성 기관 섬유증;

x) 원발성 및 속발성 골수섬유증;

xi) 악성종양/암,

a) 고형 종양, 임의로 진행성 고형 종양 또는 전이성 종양;

b) 혈액암.

41. 실시양태 40에 있어서, 암이 고형 종양을 포함하거나 또는 암이 혈액암인 조성물.

42. 실시양태 41에 있어서, 고형 종양이 암 요법에 불량하게 반응성이며, 여기서 임의로 암 요법은 체크포인트 억제제 요법, 암 백신, 화학요법, 방사선 요법, 종양용해 바이러스 요법, IDO 억제제 요법 및/또는 조작된 면역 세포 요법인 조성물.

43. 실시양태 41에 있어서, 고형 종양이 면역-배제된 종양인 조성물.

44. 실시양태 41에 있어서, 고형 종양이 Treg, 종양내 M2 대식세포 및/또는 MDSC를 포함하는 것인 조성물.

45. 실시양태 41에 있어서, 고형 종양이 CAF 및/또는 근섬유모세포가 풍부화된 기질을 포함하는 것인 조성물.

46. 실시양태 41에 있어서, 대상체가 화학요법, 방사선 요법, CAR-T, 암 백신, 종양용해 바이러스 요법 및 체크포인트 억제제 요법으로 이루어진 군으로부터 선택된 암 요법을 받고 있거나 또는 받기 위한 후보인 조성물.

47. 실시양태 41에 있어서, 암이 암 요법에 대한 획득 저항성 또는 1차 저항성을 특징으로 하는 것인 조성물.

48. 실시양태 38-47 중 어느 하나에 있어서, 암의 치료가 고형 종양의 성장을 감소시키기 위한 조성물의 치료 유효량의 투여를 포함하며, 여기서 임의로 조성물의 투여는 생존을 증가시키는 것인 조성물.

49. 실시양태 38-48 중 어느 하나에 있어서, 치료가 1-30 mg/kg 범위의 용량으로의 조성물의 투여를 포함하는 것인 조성물.

50. 암으로 진단된 대상체를 확인하는 단계이며, 여기서 i) 암은 암 요법에 대한 저항성에 대해 감수성인 것으로 공지된 유형의 암이고/거나, ii) 대상체는 암 요법에 대해 저항성이 있고, 여기서 임의로 대상체는 암 요법에 대한 1차 비-반응자이고; 여기서 임의로 암 요법은 화학요법, 방사선 요법 및/또는 면역 체크포인트 억제 요법인 단계; 및

대상체를 TGFβ1 억제 요법에 대한 후보로서 선택하는 단계

를 포함하는, TGFβ1 억제 요법에 반응할 가능성이 있는 대상체를 선택하는 방법.

51. i) 고형 종양을 포함하는 암으로 진단된 환자를 선택하는 단계이며, 여기서 고형 종양은 면역 배제된 종양이거나 또는 면역 배제된 종양인 것으로 의심되는 것인 단계;

ii) 환자에게 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 단편을 암을 치료하는데 효과적인 양으로 투여하는 단계

를 포함하며, 여기서 (a) 환자는 면역 체크포인트 억제 요법 (CBT), 화학요법, 방사선 요법, 조작된 면역 세포 요법 및 암 백신 요법으로 이루어진 군으로부터 선택된 암 요법을 받았거나 또는 받기 위한 후보이거나; 또는 (b) 환자는 통계적으로 낮은 1차 반응률을 갖는 암을 갖고, 여기서 환자는 CBT를 받지 않은 것인, 암을 치료하는 방법.

52. 제25항에 있어서, 면역 체크포인트 억제제가 PD-1 억제제 또는 PD-L1 억제제인 방법.

53. 제26항에 있어서, 선택 단계 (i)이 면역 세포 또는 그의 1종 이상의 마커의 검출을 포함하는 것인 방법.

54. 제27항에 있어서, 검출이 종양 생검 분석, 혈청 마커 분석 및/또는 생체내 영상화를 포함하는 것인 방법.

55. 제27항 또는 제28항에 있어서, 면역 세포가 세포독성 T 림프구, 조절 T 세포, MDSC, 종양-연관 대식세포, NK 세포, 수지상 세포 및 호중구로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.

56. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포 마커가 CD8, CD3, CD4, CD11b, CD163, CD68, CD14, CD34, CD25, CD47로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.

57. 제28항에 있어서, 생체내 영상화가 T 세포 추적을 포함하는 것인 방법.

58. 제28항 또는 제31항에 있어서, 생체내 영상화가 PET-SPECT, MRI 및/또는 광학 형광/생물발광의 사용을 포함하는 것인 방법.

59. 제31항 또는 제32항에 있어서, 생체내 영상화가 면역 세포 또는 면역 세포의 세포-표면 마커에 결합하는 항체의 직접 또는 간접 표지를 포함하는 것인 방법.

60. 제28항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 생체내 영상화가 추적자의 사용을 포함하는 것인 방법.

61. 제34항에 있어서, 추적자가 방사성동위원소인 방법.

62. 제35항에 있어서, 방사성동위원소가 양전자-방출 동위원소인 방법.

63. 제36항에 있어서, 방사성동위원소가 ¹⁸F, ¹¹C, ¹³N, ¹⁵O, ⁶⁸Ga, ¹⁷⁷Lu, ¹⁸F 및 ⁸⁹Zr 로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.

64. 제28항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 생체내 영상화가 면역-PET에서의 표지된 항체의 사용을 포함하는 것인 방법.

65. 제28항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 생체내 영상화가 대상체에서 TGFβ1 억제 요법에 대한 치료 반응을 모니터링하기 위해 수행되는 것인 방법.

66. 제39항에 있어서, 치료 반응이 면역 배제된 종양을 염증발생 종양으로 전환시키는 것을 포함하는 것인 방법.

67. i) 용액 평형 적정-기반 검정에 의해 측정시 ≤ 10 nM의 KD로 각각 시험관내 hLTBP1-프로TGFβ1; hLTBP3-프로TGFβ1; hGARP-프로TGFβ1; 및 hLRRC33-프로TGFβ1 에 결합할 수 있는 항체 또는 항원-결합 단편의 풀을 선택하는 단계;

ii) 임의로 세포-기반 검정에서 TGFβ 활성화를 억제할 수 있는 항체 또는 항원-결합 단편의 풀을 선택하는 단계;

iii) 단계 i) 및 ii)로부터의 1종 이상의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 생체내 효능 연구에서 시험하는 단계;

iv) 단계 i) - iii)으로부터의 1종 이상의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 생체내 독성학/안전성 연구에서 시험하는 단계; 및

v) 단계 i) - iv)로부터 1종 이상의 항체 또는 항원-결합 단편을 확인하는 단계

를 포함하며, 여기서 항체 또는 단편은 생체내 독성학/안전성 연구에서 결정된 NOAEL 미만인, 생체내 효능 연구에서 결정된 유효 용량을 나타내는 것인, 치료 용도를 위한 TGFβ1 활성화의 이소형-선택적 억제제를 확인하는 방법.

68. TGFβ1 적응증의 치료를 위한 의약의 제조에서의 실시양태 1-35 중 어느 하나에 따른 항체 또는 단편의 용도.

69. 실시양태 68에 있어서, 항체 또는 단편을 포함하는 제제의 멸균 여과 단계를 추가로 포함하는 용도.

70. 실시양태 68 또는 69에 있어서, 바이알 또는 시린지 내에 충전 및/또는 패키징하는 단계를 추가로 포함하는 용도.

71. i) 1 nM 이하의 KD로 각각의 hLTBP1-프로TGFβ1, hLTBP3-프로TGFβ1, hGARP-프로TGFβ1 및 hLRRC33-프로TGFβ1에 결합할 수 있는 항체를 제공하는 단계;

ii) 생체내 효능 연구를 수행하며, 여기서 단계 (i)의 항체를 전임상 모델에 투여하여 유효량을 결정하는 것인 단계;

iii) TGFβ 억제에 감수성인 것으로 공지된 동물 모델을 사용하여 독성학 연구를 수행하여, 바람직하지 않은 독성이 관찰되는 양을 결정하는 단계;

iv) 단계 (ii) 및 (iii)에 기초하여 충분한 치료 범위를 결정하거나 확인하는 단계; 및

v) 항체를 포함하는 제약 조성물을 제조하는 단계

를 포함하는, 이소형-선택적 TGFβ1 억제제를 포함하는 제약 조성물을 제조하는 방법.

72. i) LTBP1, LTBP3, GARP, LRRC33 또는 그의 단편 중 적어도 2종을 임의로 포함하는, 프로TGFβ1 복합체를 포함하는 항원을 제공하는 단계;

ii) 단계 (i)의 항원에 결합하는 능력에 대한 항체 또는 단편의 풀을 선택하는 단계;

iii) 임의로, 바람직하지 않은 결합 프로파일을 나타내는 항체 또는 단편을 풀로부터 제거하는 단계;

iv) TGFβ1을 억제하는 능력에 대한 단계(들) (ii) 및/또는 (iii)으로부터 선택된 항체 또는 단편의 풀을 선택하는 단계;

v) 임의로, 단계 (iv)로부터 선택된 완전 인간 또는 인간화 항체 또는 항체의 단편, 항체들 또는 단편들을 생성하여 인간 또는 인간화 억제제를 제공하는 단계;

vi) 시험관내 결합 검정을 수행하여 LTBP1-프로TGFβ1, LTBP3-프로TGFβ1, GARP-프로TGFβ1 및 LRRC33-프로TGFβ1에 대한 친화도를 결정하는 단계; 및

vii) 기능적 검정을 수행하여 TGFβ1 및 임의로 TGFβ2 및/또는 TGFβ3에 대한 억제제의 활성을 결정 또는 확인하는 단계

를 포함하는, 실시양태 1-35 중 어느 하나에 따른 항체 또는 단편을 제조하는 방법.

73. 실시양태 72에 있어서, 전임상 동물 모델에서의 생체내 효능 연구 및 생체내 독성학 연구에서 후보 항체 또는 그의 단편을 평가함으로써, 효과적이면서 안전하거나 내약성이 있는 것 둘 다로 나타난 유효량을 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.

74. 실시양태 72 또는 73에 있어서, 제약 조성물로 제제화하는 단계를 추가로 포함하는 방법.

75. 실시양태 74에 있어서, 인간 대상체에서의 섬유증 치료의 치료 용도를 위한 조성물.

76. 실시양태 74에 있어서, 인간 대상체에서의 골수섬유증 치료의 치료 용도를 위한 조성물.

77. 실시양태 74에 있어서, 인간 대상체에서의 암 치료의 치료 용도를 위한 조성물.

78. 실시양태 77에 있어서, 암이 고형 종양을 포함하는 것인 조성물.

79. 실시양태 78에 있어서, 고형 종양이 국부 진행성 고형 종양인 조성물.

80. 실시양태 77-79 중 어느 하나에 있어서, 암이 암 요법에 불량하게 반응성이며, 여기서 임의로 암 요법은 체크포인트 억제제 요법, 암 백신, 화학요법, 방사선 요법, IDO 억제제 요법 및/또는 조작된 면역 세포 요법인 조성물.

81. 실시양태 80에 있어서, 암이 획득 저항성 또는 1차 저항성을 특징으로 하는 것인 조성물.

82. 실시양태 81에 있어서, 종양이 면역 배제를 특징으로 하는 것인 조성물.

83. 실시양태 78-82 중 어느 하나에 있어서, 종양이 종양내 M2 대식세포 및/또는 MDSC를 포함하는 것인 조성물.

84. 실시양태 78-82 중 어느 하나에 있어서, 종양이 CAF가 풍부화된 기질을 포함하는 것인 조성물.

85. 실시양태 80에 있어서, 대상체가 화학요법, 방사선 요법, CAR-T, 암 백신, 종양용해 바이러스 요법 및 체크포인트 억제제 요법으로 이루어진 군으로부터 선택된 암 요법을 받고 있거나 또는 받기 위한 후보인 조성물.

86. 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 TGFβ3 억제제로 추가로 치료되는 것인 조성물.

87. 실시양태 70에 있어서, 대상체가 TGFβ1-양성 및 TGFβ3-양성 암을 가지며, 여기서 대상체는 체크포인트 억제제 요법을 받았거나, 받고 있거나 또는 받기 위한 후보인 조성물.

88. 실시양태 77-84 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 종양의 외과적 절제를 받기 위한 후보가 아닌 것인 조성물.

89. 실시양태 37에 있어서, 인간 대상체에서 숙주 면역의 증진에 사용하기 위한 조성물이며,

여기서 대상체는 암을 갖고,

여기서 면역 반응은 항암 면역을 포함하는 것인 조성물.

90. 실시양태 89에 있어서, 숙주 면역의 증진이 종양으로부터의 면역-배제를 감소시키거나 또는 종양 내로의 면역 세포 침윤을 촉진하는 것을 포함하는 것인 조성물.

91. 실시양태 89에 있어서, 숙주 면역의 증진이 TGFβ1의 플라스민-의존성 활성화를 억제하는 것을 포함하는 것인 조성물.

92. 실시양태 37에 있어서, 대상체가 시토카인 스톰이 발병할 위험이 있는 것인 조성물.

93. 실시양태 37에 있어서, 대상체가 조작된 면역 세포 요법을 받고 있거나 또는 받기 위한 후보인 조성물.

94. 실시양태 37에 있어서, 대상체가 암 백신을 받고 있거나 또는 받기 위한 후보인 조성물.

95. 실시양태 76-94 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 면역 체크포인트 억제제 요법을 받고 있거나 또는 받기 위한 후보이며, 여기서 임의로 대상체는 면역 체크포인트 억제제 요법에 불량하게 반응성인 것인 조성물.

96. 실시양태 37에 있어서, 인간 대상체에서 시토카인 방출 증후군 (예를 들어, 시토카인 스톰 또는 패혈증)의 예방에 사용하기 위한 조성물이며, 여기서 임의로 대상체는 감염 또는 MS를 앓고 있는 것인 조성물.

97. 제37항에 있어서, 대상체에서 TGFβ1의 플라스민-의존성 활성화를 억제하는 방법에 사용하기 위한 조성물.

98. 대상체에게 치료 유효량의 이소형-선택적 TGFβ1 억제제를 투여하여 적응증을 치료하는 단계를 포함하며, 여기서 이소형-선택적 TGFβ1 억제제는 용액 평형 적정에 의해 측정시≤ 10 nM의 KD로 각각의 hLTBP1-프로TGFβ1; hLTBP3-프로TGFβ1; hGARP-프로TGFβ1; 및 hLRRC33-프로TGFβ1에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체인, 대상체에서 TGFβ1 적응증을 치료하는 방법.

99. 실시양태 98에 있어서, 항체가 용액 평형 적정에 의해 측정시 ≤ 1 nM의 KD로 각각의 hLTBP1-프로TGFβ1 및 hLTBP3-프로TGFβ1에 결합하며, 여기서 임의로 항체는 ≤ 1 nM의 KD로 각각의 hLTBP1-프로TGFβ1; hLTBP3-프로TGFβ1; hGARP-프로TGFβ1; 및 hLRRC33-프로TGFβ1 복합체에 결합하는 것인 방법.

100. 실시양태 98 또는 99에 있어서, 항체가 잠복성 라쏘 또는 그의 부분에 결합하는 것인 방법.

101. 실시양태 100에 있어서, 항체가 핑거-1, 핑거-2 또는 그의 부분(들)에 추가로 결합하는 것인 방법.

102. 실시양태 98-101 중 어느 하나에 있어서, TGFβ1 적응증이 암 및 골수증식성 장애로부터 선택된 증식성 장애인 방법.

103. 실시양태 102에 있어서, 대상체가 암 요법의 불량한 반응자이며, 여기서 임의로 암 요법은 체크포인트 억제 요법, 화학요법 및/또는 방사선 요법을 포함하는 것인 방법.

104. 실시양태 102에 있어서, 대상체가 이소형-선택적 TGFβ1 억제제와 함께 암 요법에 의해 추가로 치료되는 것인 방법.

본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 제한적인 것으로 해석어서는 안된다.

실시예

실시예 1: 시험관내 결합 프로파일

1) BLI-기반 검정:

인간 프로TGFβ1 세포에 대한 옥테트RegS 검정에 의해 Ab4, Ab5, Ab6 및 Ab3의 친화도를 측정하였고, 한편 CAGA12 리포터 세포에 의해 활성을 측정하여 인간 프로TGFβ1 억제를 시험하였다. 본원에 제공된 복합체에 대한 항체의 친화도를 측정하는데 사용된 프로토콜은 하기 표 19에 요약되어 있고, 본 개시내용의 예시적인 항체의 친화도 프로파일의 요약 목록은 본원의 표 8에 제공되어 있다.

표 19. 옥테트® 결합 검정을 수행하기 위한 예시적인 프로토콜

예로서, 폴리스티렌 96-웰 흑색 절반 면적 플레이트 (그라이너 바이오-원(Greiner Bio-One))를 사용하여 포르테바이오 옥테트 레드384 상에서 생물층 간섭측정법에 의해 TGFβ 항원에 대한 Ab6 결합을 측정하였다. 제조업체의 설명서에 따라 아민-반응성 제2-세대 (AR2G) 시약 키트 (포르테바이오)를 사용하여 항원을 아민 반응성 제2-세대 (AR2G) 바이오센서 (포르테바이오)에 커플링시킨 후에 인간 성숙 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3 성장 인자뿐만 아니라 인간 잠복 TGFβ1에 대한 Ab6의 결합을 수행하였다. AR2G 바이오센서를 먼저 물 중에 오프라인으로 적어도 10분 동안 수화되도록 한 후에 실험을 개시하였다. 실험 개시시에, AR2G 팁을 1분 동안 물에서 평형화시켰다. 이어서, 팁을 새로 제조된 활성화 용액 (18부의 물, 1부의 400 mM EDC (1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 히드로클로라이드) 및 1부의 200 mM 술포-NHS (N-히드록시술포숙신이미드)) 내로 5분 동안 이동시켰다. 재조합 TGFβ 단백질 (10 mM 아세트산나트륨 완충제 pH 5 중 10 ug/mL)을 활성화된 팁에 3분 동안 커플링시킨 후, 에탄올아민 pH 8.5로 15분 동안 켄칭하였다. 2% BSA (시그마(Sigma)), 0.5 M NaCl 및 0.09% 트윈-20 (시그마)이 보충된 EKB 완충제 (키네틱스 완충제 (포르테바이오)) 중에 커플링된 팁을 20분 인큐베이션하여 기준선을 결정하였다. 이어서, 팁이 EKB 중 Ab6의 15 ug/mL 용액에서 10분 동안 회합되도록 한 후, EKB 중에서 10분 동안 해리시켰다. Ab6을 항-인간 Fc 포획 바이오센서 (포르테바이오) (EKB 중 1 ug/mL)의 표면에 5분 동안 고정화시킨 후, 인간 대형 잠복 복합체에 대한 Ab6의 결합을 측정하였다. 이어서, 추가로 1분 기준선을 수행한 후, LTBP1-프로TGFβ1, LTBP1-프로TGFβ2 또는 LTBP1-프로TGFβ3 (EKB 중 100 nM)을 10분 동안 회합시켰다. 최종적으로, 10분 해리를 수행하였다.

2) 용액 평형 적정-기반 검정:

MSD-SET는 용액-상 평형 K_D의 결정에 사용될 수 있는 잘 특징화된 기술이다. 용액-기반 평형 검정, 예컨대 MSD-SET는, 실시간 회합률 및 해리율보다는 평형상태에서의 유리 리간드 결합을 측정하여 친화도를 결정하는 동역학적 배제의 원리에 기초한다.

MSD-SET 검정을 수행하여 평형상태에서의 항체의 친화도를 측정하였다. 간략하게, 각각의 시험 항체를 3-5배 희석하고, 샘플을 48-웰 디쉬에서 비오티닐화 항원과 혼합하였다. SET 샘플을 실온에서 20-24시간 동안 평형화시켰다. 한편, 포획 플레이트를 IgG (20 nM)로 코팅하고, 4℃에서 밤새 또는 실온에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 5% BSA에 의한 차단 단계를 수행하였다. 포획 플레이트를 3회 세척한 후, SET 샘플을 첨가하고, 150초 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 1회 세척하여 미결합 복합체를 제거하였다. 250ng/ml SA-술포태그를 첨가한 다음 3회 세척하였다. 2X 판독 완충제를 첨가하고, 표지된 결합된 복합체로부터의 신호를 퀵플렉스(QuickPlex)™ SQ 120 기기를 사용하여 판독하였다.

MSD-SET에 의해 측정된 본 개시내용의 예시적인 항체의 친화도 프로파일의 요약 목록은 본원의 표 9 및 10에 제공되어 있다.

예로서, MSD 표준 플레이트 (MSD)를 PBS 중 모노클로날 항체의 20 nM 용액으로 실온에서 30분 동안 또는 4℃에서 밤새 코팅하였다. 이어서, 코팅에 사용된 동일한 모노클로날 항체의 농도를 증가시키면서 비오티닐화된 항원 (Ab6에 대한 결합의 경우 50 내지 400 pM; Ab4에 대한 결합의 경우 0.8 내지 1.6 nM)과 진탕시키지 않으면서 실온에서 밤새 혼합하였다. 20-24시간의 평형화 후, 항체-코팅된 플레이트를 실온에서 30분 동안 차단 완충제 A (MSD)로 차단하고, 세척 완충제 (PBS, 0.1% BSA, 0.05% 트윈-20)로 세척한 후, 평형화된 항체-항원 복합체를 플레이트에 정확히 2.5분 동안 첨가하였다. 플레이트를 세척 완충제로 다시 세척한 후, 0.1% BSA를 함유하는 PBS 중 250 ng/ml 술포-태그-표지된 스트렙타비딘 2차 시약 (MSD)을 첨가하였다. 세척 완충제로 세척한 후, 플레이트를 MESO 퀵플렉스 SQ 120 (MSD)을 사용하여 MSD 판독 완충제 (MSD) 중에서 판독하였다. 결합 데이터를 프리즘 7 소프트웨어 (그래프패드)에서 비선형 곡선 피팅에 의해 처리하여 평형 결합 KD 값을 계산하였다.

실시예 2: 잠복 TGFβ1 활성화의 억제를 측정하기 위한 기능적 검정

TGFβ1 활성화의 신규 콘텍스트-의존성 세포-기반 효력 검정의 개발은 WO 2019/023661 (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 이전의 검정 포맷은 내인성 제시 분자에 의해 제시된 프로TGFβ1의 활성화와 외인성 LTBP에 의해 제시된 프로TGFβ1의 활성화 사이를 구별할 수 없었다. 인테그린-발현 세포를 직접 형질감염시킴으로써, WO 2019/023661에 개시되고 본원에 사용된 신규 검정은 내인성 제시자-프로TGFβ1 활성과 외인성 LTBP-프로TGFβ1 활성 사이의 범위를 확립한다. LTBP-프로TGFβ1 복합체가 세포외 매트릭스에 포매되기 때문에, 검정 플레이트 코팅은 또한 검정의 중요한 성분이다. ECM 단백질 피브로넥틴으로 코팅된 고 결합 플레이트의 사용은 LTBP 검정을 보다 강건하게 만들었다.

Ab4, Ab5, Ab6 및 Ab3 항체가 기능적인지 (예를 들어, 억제 효력을 갖는지)를 결정하기 위해, 대형 잠복 복합체 (LLC)로부터의 TGFβ1 성장 인자의 αVβ 인테그린-의존성 방출을 측정하는 세포-기반 검정을 개발하였다. 각각의 검정은 LTBP1, LTBP3, GARP 또는 LRRC33을 포함하는 각각의 LLC에 대해 특이적이다. 검정 개발 및 최적화의 과정을 통해, 피브로넥틴은 LTBP-제시된 프로TGFβ1의 인테그린-의존성 시험관내 활성화에 대한 중요한 ECM 단백질인 것으로 결정되었다.

검정 I. ECM에 침착된 잠복 TGFβ1의 활성화

도 1 및 도 2에 도시된 검정의 경우, 하기 프로토콜을 개발하였다. 이 검정은 ECM-연관 잠복 프로TGFβ1 복합체 (LTBP1-프로TGFβ1 또는 LTBP3-프로TGFβ1)로부터의 TGFβ1의 인테그린-의존성 방출을 측정하는데 최적이다.

물질:

● MvLu1-CAGA12 세포 (클론 4A4)

● SW480/β6 세포 (클론 1E7) (αV 서브유닛은 높은 수준으로 내인성으로 발현됨; β6 서브유닛은 안정하게 과다발현됨)

● LN229 세포주 (높은 수준의 내인성 αVβ8 인테그린)

● 코스타 백색 벽 TC 처리된 96 웰 검정 플레이트 #3903

● 그라이너 바이오-원 고 결합 백색 투명 96 웰 검정 플레이트 #655094

● 인간 피브로넥틴 (코닝 #354008)

● P200 다중채널 피펫

● 각각에 대해 멸균 필터 팁을 갖는 P20, P200 및 P1000 피펫

● 멸균 미세원심분리 튜브 및 랙

● 멸균 시약 저장소

● 0.4% 트립판 블루

● 2ml, 5mL, 10mL 및 25mL 멸균 피펫

● 조직 배양 처리된 100mm 또는 150mm 플레이트

● 70%에탄올

● Opti-MEM 혈청 감소된 배지 (라이프 테크(Life Tech) #31985-070)

● 리포펙타민(Lipofectamine) 3000 (라이프 테크 #L3000015)

● 브라이트-글로 루시페라제 검정 시약 (프로메가 #E2620)

● 0.25% 트립신 + 0.53mM EDTA

● 프로TGFβ1 발현 플라스미드, 인간

● LTBP1S 발현 플라스미드, 인간

● LTBP3 발현 플라스미드, 인간

● LRRC32 (GARP) 발현 플라스미드, 인간

● LRRC33 발현 플라스미드, 인간

장치:

● 바이오텍 시너지 H1 플레이트 판독기

● TC 후드

● 벤치 탑 원심분리

● CO2 인큐베이터 37℃ 5% CO2

● 37℃ 물/비드 배스

● 플랫폼 진탕기

● 현미경

● 혈구계/카운테스

정의:

● CAGA12 4A4 세포: CAGA12 합성 프로모터로 안정하게 형질감염되어 루시페라제 유전자 발현을 구동하는 MvLu1 세포 (밍크 폐 상피 세포)의 유도체

● DMEM-0.1%BSA: 검정 배지; 기본 배지는 DMEM (깁코 Cat# 11995-065)이고, 배지는 또한 0.1% w/v로 희석된 BSA, 페니실린/스트렙토마이신 및 4mM 글루타민을 함유한다.

● D10: DMEM 10% FBS, P/S, 4mM 글루타민, 1% NEAA, 1X 글루타맥스 (깁코 Cat# 35050061)

● SW480/β6 배지: D10 + 1000ug/mL G-418

● CAGA12 (4A4) 배지: D10 + 0.75ug/mL 퓨로마이신

절차:

제0일에, 세포를 형질감염을 위해 시딩하였다. SW480/β6 (클론 1E7) 세포를 트립신으로 탈착시키고, 펠릿화하였다 (200 x g에서 5분 회전). 세포 펠릿을 D10 배지 중에 재현탁시키고, ml당 생존 세포를 계수하였다. 세포를 5.0 x 10⁶개 세포/12ml/100mm 조직 배양 디쉬에 시딩하였다. CAGA12 세포의 경우, 세포를 T75 플라스크당 1.0백만개의 밀도로 계대배양하여 제3일에 검정을 위해 사용하였다. 배양물을 37℃ 및 5% CO₂에서 인큐베이션하였다.

제1일에, 인테그린-발현 세포를 형질감염시켰다. 리포펙타민® 3000 시약으로의 형질감염을 위해 제조업체의 프로토콜을 따랐다. 간략하게, 하기를 OptiMEM™ I 중에 웰당 125 μl로 희석하였다: 7.5 μg DNA (제시 분자) + 7.5 μg DNA (프로TGFβ1), 30ul P3000 및 OptiMEM I로 125 μl까지. DNA를 함께 피펫팅하여 웰을 혼합한 후, OptiMEM을 첨가하였다. P3000을 첨가하고, 모든 것을 피펫팅에 의해 잘 혼합하였다. DNA 믹스에 첨가할 리포펙타민3000의 마스터 믹스를 LTBP1 검정의 경우: 웰당 15 μl 리포펙타민3000, OptiMEM I 중 125μl까지; LTBP3 검정의 경우: 웰당 45 μl 리포펙타민3000, OptiMEM I 중 125ul까지 제조하였다. 희석된 리포펙타민3000을 DNA에 첨가하고, 피펫팅에 의해 잘 혼합하고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 용액을 피펫팅에 의해 수회 혼합한 다음, 디쉬당 250 μl의 DNA:리포펙타민3000 (2 x 125 μl)을 적가하였다. 각각의 디쉬를 부드럽게 스월링하여 혼합하고, 디쉬를 조직 배양 인큐베이터로 ~24시간 동안 복귀시켰다.

제1일-제2일에, 검정 플레이트를 인간 피브로넥틴으로 코팅하였다. 구체적으로, 동결건조된 피브로넥틴을 초순수 증류수 (멸균) 중에 1mg/ml로 희석하였다. 1mg/ml 원액을 PBS (멸균) 중에 19.2 μg/ml로 희석하였다. 50 μl/웰을 검정 플레이트에 첨가하고 (고 결합), 조직 배양 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션하였다 (37℃ 및 5% CO₂). 최종 농도는 3.0 μg/cm²였다.

제2일에, 형질감염된 세포를 검정 및 억제제 첨가를 위해 플레이팅하였다. 먼저, 이미 검정 플레이트 내에 있는 피브로넥틴 용액에 200 μl/웰 PBS를 첨가함으로써 피브로넥틴 코팅을 세척하였다. 세척액을 다중채널 피펫으로 수동으로 제거하였다. 세척을 총 2회 세척에 대해 반복하였다. 플레이트를 세포 첨가 전에 뚜껑을 제거하여 실온에서 건조되도록 하였다. 이어서, 세포를 트립신으로 탈락시켜 플레이팅하고, 펠릿화하였다 (200 x g에서 5분 회전). 펠릿을 검정 배지 중에 재현탁시키고, 생존 세포를 ml당 계수하였다. LTBP1 검정의 경우, 세포를 0.10 x 10⁶개 세포/ml로 희석하고, 웰당 50 μl (웰당 5,000개 세포)로 시딩하였다. LTBP3 검정의 경우, 세포를 0.05 x 10⁶개 세포/ml로 희석하고, 웰당 50 μl (웰당 2,500개 세포)로 시딩하였다. 기능적 항체 희석물을 제조하기 위해, 항체를 비히클 중에 일관된 작업 농도로 사전-희석하였다. 스톡 항체를 비히클에 연속 희석하였다 (PBS가 최적이고, 시트르산나트륨 완충제는 피함). 각각의 포인트의 연속 희석물을 항체의 4X 최종 농도로 검정 배지 중에 희석하였다. 웰당 25 μl의 4X 항체를 첨가하고, 배양물을 37℃ 및 5% CO₂에서 ~24시간 동안 인큐베이션하였다.

제3일에, TGFβ 리포터 세포를 첨가하였다. 검정을 위한 CAGA12 (클론 4A4) 세포를 트립신으로 탈착시키고, 펠릿화하였다 (200 x g에서 5분 회전). 펠릿을 검정 배지 중에 재현탁시키고, ml당 생존 세포를 계수하였다. 세포를 0.4 x 10⁶개 세포/ml로 희석하고, 웰당 50 μl (웰당 20,000개 세포)로 시딩하였다. 세포를 인큐베이터로 복귀시켰다.

제4일에, 검정을 판독하였다 (항체 및/또는 리포터 세포 첨가 16-20시간 후). 판독 전에 브라이트-글로™ 시약 및 시험 플레이트를 실온이 되도록 하였다. 바이오텍® 시너지™ H1 상의 판독 세팅을 TMLC_std 프로토콜을 사용하여 설정하였다 - 이 방법은 자동-획득 세팅을 갖는다. 오토스케일 (높음)을 위해 양성 대조군 웰을 선택하였다. 웰당 100 μl의 브라이트-글로 시약을 첨가하였다. 플레이트를 빛으로부터 보호하면서 실온에서 진탕시키면서 2분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 바이오텍 시너지 H1 상에서 판독하였다.

Ab3, Ab4, Ab5, Ab6 또는 대조군 IgG에 의한 LTBP1-프로TGBβ1 활성화의 억제를 LN229 리포터 검정에서 측정하였다 (도 1).

Ab3, Ab4, Ab5, Ab6 또는 대조군 IgG에 의한 LTBP3-프로TGBβ1 활성화의 억제를 LN229 리포터 검정에서 측정하였다 (도 2).

검정 II. 세포 표면 상에 제시된 잠복 TGFβ1의 활성화

도 3 및 도 4에 도시된 검정의 경우, 하기 프로토콜을 개발하였다. 이러한 검정 또는 "직접-형질감염" 프로토콜은 세포-연관 잠복 프로TGBβ1 복합체 (GARP-프로TGBβ1 또는 LRRC33-프로TGBβ1)로부터의 TGFβ1의 인테그린-의존성 방출 (활성화)을 측정하는데 최적이다.

물질:

● MvLu1-CAGA12 세포 (클론 4A4)

● SW480/β6 세포 (클론 1E7) (αV 서브유닛은 높은 수준으로 내인성으로 발현됨; β6 서브유닛은 안정하게 과다발현됨)

● LN229 세포주 (높은 수준의 내인성 αVβ8 인테그린)

● 코스타 백색 벽 TC 처리된 96 웰 검정 플레이트 #3903

● 그라이너 바이오-원 고 결합 백색 투명 96 웰 검정 플레이트 #655094

● 인간 피브로넥틴 (코닝 #354008)

● P200 다중채널 피펫

● 각각에 대해 멸균 필터 팁을 갖는 P20, P200 및 P1000 피펫

● 멸균 미세원심분리 튜브 및 랙

● 멸균 시약 저장소

● 0.4% 트립판 블루

● 2 mL, 5 mL, 10 mL 및 25 mL 멸균 피펫

● 조직 배양 처리된 100mm 또는 150mm 플레이트

● 70%에탄올

● Opti-MEM 혈청 감소된 배지 (라이프 테크 #31985-070)

● 리포펙타민 3000 (라이프 테크 #L3000015)

● 브라이트-글로 루시페라제 검정 시약 (프로메가 #E2620)

● 0.25% 트립신 + 0.53mM EDTA

● 프로TGFβ1 발현 플라스미드, 인간

● LTBP1S 발현 플라스미드, 인간

● LTBP3 발현 플라스미드, 인간

● LRRC32 (GARP) 발현 플라스미드, 인간

● LRRC33 발현 플라스미드, 인간

장치:

● 바이오텍 시너지 H1 플레이트 판독기

● 조직 배양 후드

● 벤치 탑 원심분리

● CO₂ 인큐베이터, 37℃, 5% CO₂

● 37℃ 물/비드 배스

● 플랫폼 진탕기

● 현미경

● 혈구계/카운테스

정의:

● CAGA12 4A4 세포: CAGA12 합성 프로모터로 안정하게 형질감염되어 루시페라제 유전자 발현을 구동하는 MvLu1 세포 (밍크 폐 상피 세포)의 유도체

● DMEM-0.1%BSA: 검정 배지; 기본 배지는 DMEM (깁코 Cat# 11995-065)이고, 배지는 또한 0.1% w/v로 희석된 BSA, 페니실린/스트렙토마이신 및 4mM 글루타민을 함유한다.

● D10: DMEM 10% FBS, P/S, 4mM 글루타민, 1% NEAA, 1X 글루타맥스 (깁코 Cat# 35050061)

● SW480/β6 배지: D10 + 1000ug/mL G-418

● CAGA12 (4A4) 배지: D10 + 0.75ug/mL 퓨로마이신

방법:

제0일에, 인테그린 발현 세포를 형질감염을 위해 시딩하였다. 세포를 트립신으로 탈착시키고, 펠릿화하였다 (200 x g에서 5분 회전). 세포 펠릿을 D10 배지 중에 재현탁시키고, ml당 생존 세포를 계수하였다. 세포를 0.1e⁶개 세포/ml로 희석하고, 검정 플레이트에 웰당 100ul (웰당 10,000개 세포)로 시딩하였다. CAGA12 세포의 경우, 제2일에서의 검정에 사용하기 위해, T75 플라스크당 1.5백만개의 밀도로 계대배양하였다. 배양물을 37℃ 및 5% CO₂에서 인큐베이션하였다.

제1일에, 세포를 형질감염시켰다. 리포펙타민 3000 시약으로의 형질감염을 위해 제조업체의 프로토콜을 따랐다. 간략하게, 하기를 OptiMEM I 중에 웰당 5ul로 희석하였다: 0.1ug DNA (제시 분자) + 0.1ug DNA (프로TGFβ1), 0.4ul P3000 및 OptiMEM I로 5ul까지. DNA를 함께 피펫팅하여 웰을 혼합한 후, OptiMEM을 첨가하였다. P3000을 첨가하고, 모든 것을 피펫팅에 의해 잘 혼합하였다. DNA 믹스에 첨가하기 위해 리포펙타민3000을 사용하여 다음 마스터 믹스를 제조하였다: 웰당 0.2ul 리포펙타민3000, OptiMEM I 중 5ul까지. 희석된 리포펙타민3000을 DNA에 첨가하고, 피펫팅에 의해 잘 혼합하고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 용액을 피펫팅에 의해 수회 혼합한 다음, 웰당 10ul의 DNA:리포펙타민3000 (2 x 5ul)을 첨가하였다. 세포 플레이트를 조직 배양 인큐베이터로 ~24시간 동안 복귀시켰다.

제2일에, 항체 및 TGFβ 리포터 세포를 첨가하였다. 기능적 항체 희석물을 제조하기 위해, 비히클 (PBS가 최적임) 중 스톡 항체를 연속 희석하였다. 이어서, 각각의 포인트를 항체의 2X 최종 농도로 검정 배지 중에 희석하였다. 항체를 제조한 후, 세포 플레이트를 흡인 (진공 흡인기)에 의해 검정 배지로 2회 세척하고, 이어서 웰당 100ul의 검정 배지를 첨가하였다. 제2 세척 후, 검정 배지를 웰당 50ul의 2X 항체로 대체하였다. 세포 플레이트를 인큐베이터로 ~15-20분 동안 복귀시켰다.

검정을 위한 CAGA12 (클론 4A4) 세포를 제조하기 위해, 세포를 트립신으로 탈착시키고, 펠릿화하였다 (200 x g에서 5분 회전). 펠릿을 검정 배지 중에 재현탁시키고, ml당 생존 세포를 계수하였다. 세포를 0.3e⁶개 세포/ml로 희석하고, 웰당 50ul (웰당 15,000개 세포)로 시딩하였다. 세포를 인큐베이터로 복귀시켰다.

제3일에, 항체 및/또는 리포터 세포 첨가 약 16-20시간 후에 검정을 판독하였다. 판독 전에 브라이트-글로™ 시약 및 시험 플레이트를 실온이 되도록 하였다. 바이오텍® 시너지™ H1 상의 판독 세팅은 TMLC_std 프로토콜을 사용하도록 설정되었다 - 이 방법은 자동-획득 세팅을 갖는다. 오토스케일 (높음)을 위해 양성 대조군 웰을 선택하였다. 웰당 100uL의 브라이트-글로 시약을 첨가하였다. 플레이트를 빛으로부터 보호하면서 실온에서 진탕시키면서 2분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 바이오텍 시너지 H1 상에서 판독하였다.

Ab3, Ab4, Ab5, Ab6 또는 IgG 대조군에 의한 GARP-프로TGFβ1 활성화의 억제를 SW480β6 검정에서 측정하였다 (도 3).

Ab3, Ab4, Ab5, Ab6 또는 IgG 대조군에 의한 LRRC33-프로TGFβ1 활성화의 억제를 SW480β6 검정에서 측정하였다 (도 4).

도 33b에 제공된 시험관내 효력 데이터를 수득하는데 사용된 세포-기반 리포터 검정은 하기와 같다:

검정 2일 전에, 웰당 12,500개의 LN229 세포를 백색-벽 96-웰 조직 배양-처리된 검정 플레이트에 플레이팅하였다. LN229 세포를 다음 날 프로TGFβ1 (LTBP 검정), 프로TGFβ1 플러스 GARP (GARP 검정) 또는 프로TGFβ1 플러스 LRRC33 (리포펙타민 3000을 사용하여 GARP 막횡단 및 세포질 도메인에 융합된 LRRC33 엑토도메인의 키메라 구축물)을 코딩하는 플라스미드로 형질감염시켰다. TGFβ1 이소형 특이성에 대한 대조군으로서, LN229 세포를 프로TGFβ3으로 형질감염시켰으며, 이는 또한 그의 프로도메인 내 RGD 서열의 존재로 인해 αV 인테그린에 의해 활성화된다. 약 24시간 후, Ab6을 연속 희석하고, DMEM+0.1% BSA 중에 현탁된 CAGA12 리포터 세포와 함께 형질감염체에 첨가하였다 (웰당 15,000개 세포). 공동-배양물을 설정한 지 약 16-20시간 후에, 검정을 2분 동안 브라이트글로 시약을 사용하여 전개시키고, 발광을 플레이트 판독기 상에서 판독하였다. 항체 비히클의 존재 하의 루시페라제 활성은 100% 활성으로 결정하였고, 167 nM (25 μg/ml)의 고친화도 범TGFβ 항체 12.7의 존재 하의 신호는 0% 활성으로서 설정하였다.

프리즘 7을 사용하여 용량-반응 활성을 3-파라미터 로그 억제제 대 반응 모델에 비선형적으로 피팅하고, 최적-피팅 IC50 값을 계산하였다.

단백질분해적 TGFβ1 활성화의 억제를 시험하기 위해, CAGA12 리포터 세포를 백색-벽 96-웰 발광 검정 플레이트에 시딩하였다 (웰당 12,500개 세포). 24시간 후, 세포를 검정 배지 (DMEM+0.1% BSA)로 세척하고, Ab6 (2.5 μg/ml) 및 소형 잠복 복합체 프로TGFβ1 C4S (1.5 ng/ml)를 검정 배지 중에서 CAGA 세포에 첨가하였다. 이 혼합물을 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하여 항체 결합을 허용하였다. 이러한 인큐베이션 후에, 재조합 인간 혈장 칼리크레인 프로테아제 (이엠디 밀리포어(EMD Millipore))를 500 ng/ml 최종 농도로 첨가하였다. 검정 혼합물을 CAGA 세포와 함께 대략 18시간 동안 인큐베이션한 후, TGFβ1 활성화를 상기 기재된 바와 같이 생물발광에 의해 판독하였다.

실시예 3: 시험관내 TGFβ1의 프로테아제-유도된 활성화에 대한 TGFβ1-특이적, 콘텍스트-비의존성 항체의 효과

이전에, 본 출원인은 Ab3 (이소형-선택적, 콘텍스트-편향 TGFβ1 억제제)이 시험관내 및 세포-기반/CAGA 검정에서 TGFβ1의 인테그린-의존성 및 칼리크레인-의존성 활성화 둘 다를 억제할 수 있다는 것을 제시하였다.

TGFβ1의 프로테아제-의존성 활성화를 억제하는 Ab6 (이소형-선택적, 고친화도, 콘텍스트-비의존성 TGFβ1 억제제)의 능력을 시험하고, Ab3 및 Ab6의 효과를 추가로 비교하기 위해, 다음 2종의 세포-기반/CAGA 검정을 확립하였다: i) 칼리크레인-의존성 TGFβ1 활성화 및 Ab3 및 Ab6의 효과; 및 ii) Ab3 및 Ab6의 플라스민-의존성 TGFβ1 활성화 및 효과.

간략하게, CAGA 리포터 세포를 검정 시작 24시간 전에 시딩하였다. 프로TGFβ1-C4S를 CAGA 세포 상에 적정하였다. 프로테아제 (혈장-KLK 또는 플라스민)를 나타낸 바와 같은 고정 농도로 첨가하였다. 검정 혼합물을 대략 18시간 동안 인큐베이션하였다. TGFβ 활성화를 루시페라제 검정에 의해 측정하였다.

제1 연구에서, KLK의 존재 하에, 프로TGFβ1을 활성화시켰다 (양성 대조군). 이러한 TGFβ 활성화는 Ab3의 첨가에 의해 효과적으로 억제되었으며, 이는 이전의 결과를 확인시켜 준다. 유사하게, Ab6은 또한 TGFβ1의 칼리크레인-유도된 활성화를 억제하였다. 이들 결과는 TGFβ1의 인테그린-의존성 활성화에 추가로, 이소형-특이적, 콘텍스트-비의존성 억제 항체 (편향 및 비편향 둘 다)가 시험관내에서 TGFβ1의 KLK-의존성 활성화를 차단할 수 있다는 것을 나타낸다 (도 5a).

제2 연구에서, 재조합 인간 플라스민의 존재 하에, 프로TGFβ1을 활성화시켰다 (양성 대조군). 놀랍게도, 이러한 TGFβ 활성화는 AB6에 의해서만 효과적으로 억제되었으며, Ab3에 의해서는 그렇지 않았다. 이들 결과는 콘텍스트-편향 억제제 (Ab3)와 콘텍스트-비편향 억제제 (Ab6) 사이의 예상외의 기능적 차이를 밝혀낸다 (도 5b).

실시예 4: 급성 신장 섬유증의 일측성 요관 폐쇄 (UUO) 모델에서의 항-TGFβ1 항체 Ab3 및 Ab6에 의한 급성 섬유증의 억제

급성 신장 섬유증의 일측성 요관 폐쇄 (UUO) 모델에서 항-TGFβ1 항체에 의한 급성 섬유증의 억제를 시험하였다. 이 모델에서, 연구 제0일에 수컷 마우스에서 좌측 요관의 영구적 외과적 결찰에 의해 섬유증을 유도하였다. 수술을 받았지만 그의 요관이 폐쇄되지는 않은 모의-처리된 마우스를 이들 실험에 건강한 대조군으로서 포함시켰다.

대조군 (IgG) 또는 시험 항체 (Ab3, Ab6)를 연구 제1일 및 제4일에 마우스에게 복강내 (i.p.) 주사에 의해 투여하였다. 수술 후 제5일에 연구 종료시에 신장을 수집하고, 이들 조직으로부터 RNA를 수거하였다. 후속적으로 콜라겐 I (Col1a1), 콜라겐 III (Col3a1), 피브로넥틴 1 (Fn1), 리실 옥시다제 (Lox), 리실 옥시다제-유사 2 (Loxl2), 평활근 액틴 (Acta2), 매트릭스 메탈로프로테아제 (Mmp2) 및 인테그린 알파 11 (Itga11) (Rolfe, Irvine, Grobbelaar, & Linge, 2007)(Tamaki et al., 1994)(Bansal et al., 2017)(Leaf & Duffield, 2016)을 포함한 섬유증-연관 유전자의 패널에 대한 정량적 폴리머라제 연쇄 반응 (qPCR)에 의해 섬유증 유도의 정도를 평가하였다.

콜라겐 유전자 발현에 대한 Ab3 또는 Ab6 처리의 효과

Col1a1 및 Col3a1은 섬유증의 주요 구동인자이다. Col1a1은 폐쇄된 신장에서 10- 내지 40배 유도되고, Col3a1은 5- 내지 25배 상향조절된다 (P < 0.005, 모의 + IgG 처리된 마우스를 UUO + IgG 군과 비교함). 도 7에 제시된 바와 같이, 3, 10 또는 30 mg/kg/주의 Ab3으로 처리된 UUO 마우스는 UUO + IgG와 비교하여 둘 다의 콜라겐 유전자의 감소된 발현을 나타낸다 (P < 0.05). 3 또는 10 mg/kg/주의 Ab6으로의 처리는 또한 UUO에 의한 섬유화 유전자 유도를 억제하였다 (UUO + IgG와 비교하여 P < 0.05). 종합하면, 이들 데이터는 Ab3 또는 Ab6으로의 TGFβ1 억제가 UUO와 연관된 콜라겐 유도를 강력하게 호전시킨다는 것을 시사한다.

피브로넥틴 및 리실 옥시다제-유사 2 유전자 발현에 대한 Ab3 또는 Ab6 처리의 효과

Fn1 및 Loxl2는 섬유증에서 세포외 매트릭스의 침착 및 강성에 소정 역할을 하는 단백질을 코딩한다. 도 8에 제시된 바와 같이, 둘 다의 유전자는 UUO + IgG 군으로부터의 샘플에서 상향조절되지만 (P < 0.005, 모의 + IgG 대비), 둘 다의 유전자에 대한, 그러나 특히 Loxl2에 대한 유전자 발현의 배수 증가는 콜라겐 유전자에 대한 것보다 더 작다. 3, 10 또는 30 mg/kg/주의 Ab3으로 처리된 샘플에서, 본 발명자들은 감소된 Fn1 및 Loxl2 (UUO + IgG 대비)로의 경향을 주목하지만, 이러한 처리 효과는 단지 Loxl2 발현에 대해서만 및 단지 3 mg/kg/주 용량에서만 통계적으로 유의하다 (10 mg/kg/주 용량에서의 Fn1은 통계적 유의성에 근접하며, P = 0.07임). 그러나, 3 또는 10 mg/kg/주 Ab6으로의 처리는 Fn1 및 Loxl2 둘 다의 억제를 유도한다 (P < 0.05, UUO + IgG 대비).

도 9는 UUO 모델에서의 처리 후 유전자 발현의 변화 (UUO + IgG 대비)의 통계적 유의성을 요약한다. Ab3은 시험된 모든 용량에서 Col1a1 및 Col3a1의 감소를 나타냈다. 통계적으로 유의한 변화가 또한 Itga11 및 Loxl2에서 관찰되었지만 (둘 다의 수준은 UUO + IgG에 비해 감소되었음), 단지 3 mg/kg/주 용량에서만 관찰되었다. 대조적으로, Acta2를 제외한 조사된 모든 유전자는 10 mg/kg/주 Ab6으로의 처리 후에 통계적으로 유의한 발현 변화를 나타냈다 (모든 수준은 UUO + IgG에 비해 감소됨). 추가로, Acta2 및 Lox를 제외한 조사된 모든 유전자는 또한 3 mg/kg/주 Ab6으로 처리된 마우스에서 통계적으로 유의한 감소를 나타냈다.

실시예 5: 클라우드만 S91 흑색종 모델에서 종양 진행에 대한 항-PD-1 항체와 조합된 Ab3 및 Ab6의 효과

많은 인간 종양이 다음 표현형: i) 하위세트는 PD-(L)1 축 차단에 대해 반응성임; ii) 면역 배제의 증거; 및 iii) TGFB1 발현 및 TGFβ 신호전달의 증거에 의해 특징화된다는 인식에 기초하여, 및 추가로 통상적으로 사용되는 동계 면역-종양학 마우스 모델이 TGFβ1 편향 또는 항-PD-(L)1 저항성을 재현하지 않는다는 관찰에 기초하여, 본 발명자들은 개선된 번역가능성을 위해 인간 종양과 유사한 프로파일을 나타내는 생체내 전임상 모델을 특이적으로 선택하고자 하였다 (실시예 11 참조). 이들 인자를 고려하여, 효능 연구를 수행하기 위해 이들 연구에 기재된 클라우드만 S91 흑색종 모델을 포함한 적합한 생체내 모델을 선택하였다.

흑색종 종양 진행을 감소시키기 위한 항-PD-1 항체와 조합된 Ab3 및 Ab6의 효과를 평가하기 위해, 클라우드만 S91 마우스 흑색종 모델을 사용하였다.

종양 세포 배양

클론 M3 [클라우드만 S91 흑색종] (ATCC® CCL-53.1™) 세포를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)으로부터 입수하고, CR 디스커버리 서비시즈에서 2.5% 소 태아 혈청, 15% 말 혈청, 2 mM 글루타민, 100 단위/mL 페니실린 G 나트륨, 100 μg/mL 스트렙토마이신 술페이트 및 25 μg/mL 겐타미신이 보충된 카인 변형 햄 F12 배지 중에 지수적으로 성장하는 현탁 배양물로서 유지하였다. 종양 세포를 5% CO₂ 및 95% 공기의 분위기 하에 37℃에서 가습 인큐베이터 내 조직 배양 플라스크에서 성장시켰다.

생체내 이식 및 종양 성장

종양 이식 당일에, 각각의 암컷 DBA/2 시험 마우스에 50% 마트리겔 중 5 x 10⁶개 클라우드만 S91 세포를 측복부에 피하로 주사하고, 종양 성장을 모니터링하였다. 종양이 125-175 mm³의 부피에 도달하였을 때, 마우스를 동일한 평균 종양 부피를 갖는 12마리의 군으로 무작위화하고, 투여를 시작하였다. 캘리퍼를 사용하여 종양을 2차원으로 측정하고, 하기 식을 사용하여 부피를 계산하였다:

종양 부피 (mm³) = w² x l / 2

여기서 w = 종양의 폭 및 l = 종양의 길이 (mm). 종양 중량은 1 mg이 종양 부피 1 mm³와 등가라는 가정 하에 추정될 수 있다.

처리

간략하게, 제1일에 피하 C91 종양 (125-175 mm³)을 보유하는 마우스 (n=12)에게 60일 동안 1주 1회 10 mL/kg의 투여 부피 중 10 mg/kg의 Ab3; 10 mL/kg의 투여 부피 중 30 mg/kg의 Ab3; 10 mL/kg의 투여 부피 중 3 mg/kg의 Ab6; 또는 10 mL/kg의 투여 부피 중 10 mg/kg의 Ab6을 복강내로 (i.p.) 투여하였다. 래트 항 마우스 PD-1 항체 (RMP1-14-rIgG2a, 바이오엑셀(BioXCel))를 60일 동안 1주 2회 10 mL/kg의 투여 부피 중 10 mg/kg으로 i.p. 투여하였다.

군 1은 단지 항-PD-1 항체만을 받았다. 군 2는 Ab3 (10 mg/kg)을 항-PD-1 항체와 조합하여 받았다. 군 3은 Ab3 (30 mg/kg)을 항-PD-1 항체와 조합하여 받았다. 군 4는 Ab6 (10 mg/kg)을 항-PD-1 항체와 조합하여 받았다. 군 5는 Ab6 (30 mg/kg)을 항-PD-1 항체와 조합하여 받았다. 비처리 대조군을 사용하였으며, 데이터는 제시되지 않았다.

종점 및 종양 성장 지연 (TGD) 분석

종양을 1주에 2회 캘리퍼를 사용하여 측정하고, 각각의 동물을 그의 종양이 2,000 mm³의 종점 부피에 도달하였을 때 또는 연구 종료시 (제60일) 중 더 일찍 일어난 시점에 안락사시켰다. 종양 부피 종점에 도달하여 연구를 마친 마우스는 종양 진행 (TP)으로 인해 안락사된 것으로 안락사 날짜와 함께 기록하였다. 분석을 위한 종점까지의 시간 (TTE)을 WO 2018/129329에 기재된 방법에 따라 각각의 마우스에 대해 계산하였다.

퍼센트 종양 성장 지연 (%TGD)은 대조군의 종점까지의 시간 중앙값 (TTE)의 백분율로서 표현된, 비처리 대조군과 비교하여 처리군에서의 종점까지의 시간 중앙값의 증가로서 정의된다:

T=처리군에 대한 중앙값 TTE

C=대조군에 대한 중앙값 TTE

%TGD = ((T-C)/C)*100

항-PD1 처리는 이소형 대조군 처리와 비교하여 25% TGD를 유발하였다. 10 mg/kg의 항-PD1/Ab3은 14% TGD를 갖는 반면, 30 mg/kg의 항-PD1/Ab3은 92% TGD를 가졌다. 30mg/kg의 항-PD1/Ab3에 대한 종점까지의 시간 중앙값은 항-PD1 처리 단독에서의 29.8일과 비교하여 45.8일이었다.

제2 클라우드만 S91 연구에서, 항-PD-1 처리는 이소형 대조군 처리와 비교하여 48% TGD를 유발하였다. 10 mg/kg의 항-PD-1/Ab3은 122% TGD를 가졌고, 반면 30 mg/kg의 항-PD-1/Ab3은 217% TGD를 가졌다. 10 mg/kg 및 30 mg/kg 둘 다의 항-PD-1/Ab6은 217% TGD를 가졌다. 항-PD-1에 대한 종점까지의 시간 중앙값은 34.6일이었고, 10 mg/kg의 항-PD-1/Ab3은 51.7일이었고, 30 mg/kg은 74일의 연구 종료시까지였다. 10 mg/kg 및 30 mg/kg의 항-PD-1/Ab6 둘 다는 74일의 연구 종료시에 중앙 생존에 도달하지 않았다.

연구로부터의 결과는 30 mg/kg의 Ab3을 항-PD-1과 조합하여 투여하는 것이 처리된 마우스에서 생존을 연장시켰다는 것을 나타낸다. 도 10에 제시된 바와 같이, 50% 생존에 도달하기 위해, 30 mg/kg의 항-PD-1/Ab3으로 처리된 마우스는 약 45일이 소요된 반면, 10mg/kg의 Ab3 및 PD-1 단독으로 처리된 마우스는 약 30일 미만 내에 50% 생존에 도달하였으며, 이는 PD-1 및 TGFβ1의 공동 억제가 생존 이익을 유발하였다는 것을 나타낸다.

도 11a에 제시된 바와 같이, 10 mg/kg 및 30 mg/kg의 Ab3 또는 Ab6을 항-PD1과 조합하여 투여하는 것은 종양 성장을 지연시켰다. PD-1 단독으로 처리된 8마리의 마우스는 2000 mm³의 종양 부피에 도달한 반면 (점선에 의해 표시된 바와 같음), 단지 10mg/kg의 항-PD-1 및 Ab3으로 처리된 6마리의 마우스 및 30 mg/kg의 항-PD-1 및 Ab3으로 처리된 4마리의 마우스만이 2000 mm³의 종양 부피에 도달하였다. 단지 10mg/kg의 항-PD-1 및 Ab6으로 처리된 3마리의 마우스 및 30 mg/kg의 항-PD-1 및 Ab6으로 처리된 5마리의 마우스만이 2000 mm³의 종양 부피에 도달하였다. 도 11b는 항-PD-1 항체와 조합된 Ab3 또는 Ab6으로의 처리 후의 중앙값 종양 진행을 보여준다.

별개의 S91 연구를 수행하여 항-PD-1 항체 및 Ab6의 조합 (3, 10 및 30 mg/kg)에 의해 달성된 유효 종양 제어를 평가하였다. 항종양 반응을 정량화하기 위해, 처리에 반응한 "유효 종양 제어"를 연구 종료시에 2,000 mm³ 생존 한계값 (예를 들어, 종점 종양 부피)의 25% 미만의 종양 부피를 달성한 각각의 시험군 내의 동물의 백분율로서 정의하였다. 결과는 하기에 요약되어 있다 (도 11c, 11e & 11f 참조).

표 20. 클라우드만 S91 효능 요약

도 11c에 제시된 바와 같이, 모든 3가지 용량으로 조합 치료를 받은 대부분의 동물 (각각 83%, 78% 및 73%)은, 클라우드만 S91 모델이 단독요법으로서의 PD-1 차단에 불량하게 반응성인 것으로 인식되더라도, 유효 종양 제어를 달성하였으며 (예를 들어, 종양 부피가 500 mm³ 이하로 감소됨), 이는 Ab6의 강건한 상승작용적 효과를 입증한다. 따라서, 체크포인트 차단 요법 (예컨대 항-PD-(L)1)에 대한 인간 1차 저항성을 반영하는 동계 마우스 종양 모델에서, Ab6으로의 처리는 클라우드만 S91 (흑색종) 종양을 항-PD1 요법에 취약하게 만들었다. Ab6 (낮게는 1주에 3 mg/kg) 및 항-PD1 항체를 사용한 조합 처리는 유의한 종양 퇴행 또는 유효 종양 제어를 가져왔다. 여기서 달성된 상승작용적 종양 성장 지연은 이소형-선택적 TGFβ1 억제제가 체크포인트 억제에 대해 저항성인 TGFβ1-양성 종양을 갖는 대상체의 치료를 위해 체크포인트 차단 요법과 함께 사용될 수 있다는 것을 나타낸다. 조합 처리군에서, 항-PD-1과 함께, 시험된 모든 용량의 Ab6 (담청색의 3 mg/kg; 암청색의 10 mg/kg 및 자주색의 30 mg/kg)은 유의한 종양 제어를 달성하였다 (각각 12마리 중 9마리, 9마리 중 4마리, 및 11마리 중 8마리). 종합하면, 이들 동물의 65% 초과가 종점 종양 부피의 25% 미만인 종양 부피 감소를 달성하였다. 결과는 또한 중앙값 종양 부피로서 제시되었다 (도 11e). 모든 조합 처리군 (3, 10 또는 30 mg/kg의 Ab6)은 시험된 용량에서 유사한 항종양 효과를 나타냈으며, 이는 이러한 모델에서 Ab6이 3 mg/kg만큼 낮은 경우에도 효과적이라는 것을 시사한다. 이는 또한 생존 이익에도 반영된다 (도 11f 참조).

상기 기재된 효능 연구의 종료시에 처리를 중지하고, 유의한 종양 제어를 달성한 동물에서의 종양 부피의 변화를 모니터링하는 것으로 확장함으로써, TGFβ1 및 PD-1의 조합된 억제의 지속적인 항종양 효과를 조사하였다. 도 11c로부터의 클라우드만S91 종양-경험 반응자를 투여 없이 6주 동안 추적하였다 (회색 박스). 도 11d에 제시된 바와 같이, Ab6/항-PD-1 조합을 사용하여 장기간 종양 제어가 달성되었다. 보고된 수는 연구 종료시에 제어된 종양을 갖는 동물의 수이다.

추가로, 항-PD1로 처리된 동물에서 Ab6 (용량당 3 mgk, 10 mgk 또는 30 mgk)이 평가되고 있는 S91 종양 모델의 진행중인 연구에서, 조합 처리는 도 11f에 제시된 바와 같이 유의한 생존 이익으로 이어진다. 제38일에, 항-PD1/Ab6 (30 mgk) 조합을 받은 모든 동물은 생존하였고 (예를 들어, 제38일에 30 mgk 용량 군에서 100% 생존), 조합군 (3, 10 및 30 mgk) 내의 어떠한 동물도 중앙 생존에 도달하지 않았다 (연구 진행). 연구 종료시에, 조합 처리군 내의 동물의 90%가 생존하였다. 이들 데이터는 이소형-선택적 억제제 TGFβ1, 예컨대 Ab6이 생존 이익을 달성하기 위해 체크포인트 차단 요법을 받은 대상체에서 체크포인트 억제-저항성 종양을 치료하는데 사용될 수 있다는 것을 나타낸다. 도 11c-11f의 경우: 녹색 = IgG 대조군 (30 mg/kg 매주); 오렌지색 = Ab6 (30 mg/kg 매주); 적색 = 항-PD1 (5 mg/kg 매주 2회); 담청색 = 항-PD1 + Ab6 (3 mg/kg); 암청색 = 항-PD1 + Ab6 (10 mg/kg); 자주색 = 항-PD1 + Ab6 (30 mg/kg).

실시예 6: MBT2 동계 방광암 모델에서 항-PD-1과 조합된 Ab3 및 Ab5에 의한 TGFβ 포스포-SMAD2/3 경로의 억제

체크포인트 억제제와 조합된 TGFβ1-특이적 억제를 시험하기 위해 TGFβ1-우세 종양으로서 MBT-2 요로상피암 모델을 선택하였다. 약역학 연구에서, 하류 TGFβ 신호전달에 대한 항-PD1과 조합된 Ab3 또는 Ab5의 효과를 MBT-2 모델에서 평가하였다. ELISA (셀 시그널링 테크놀로지스(Cell Signaling Technologies))에 의해 제조업체의 지침서에 따라 포스포-SMAD2/3 검정을 수행하였다.

생체내 이식 및 종양 성장

종양 이식 당일에, 각각의 암컷 C3H/HeN 시험 마우스에 5x10⁵개 MBT2 종양 세포를 측복부에 피하로 주사하고, 종양 성장을 모니터링하였다. 종양이 40-80 mm³의 부피에 도달하였을 때, 마우스를 동일한 평균 종양 부피를 갖는 10마리의 군으로 무작위화하고, 투여를 시작하였다. 캘리퍼를 사용하여 종양을 2차원으로 측정하고, 하기 식을 사용하여 부피를 계산하였다:

종양 부피 (mm³) = w² x l / 2

여기서 w = 종양의 폭 및 l = 종양의 길이 (mm). 종양 중량은 1 mg이 종양 부피 1 mm³와 등가라는 가정 하에 추정될 수 있다.

처리

간략하게, 제1일에 피하 MBT2 종양 (40 내지 80mm³)을 보유하는 마우스 (n=10)에게 제1일 및 제8일에 10 mL/kg의 투여 부피 중 3 mg/kg의 Ab5, 10 mL/kg의 투여 부피 중 10 mg/kg의 Ab5, 10 mL/kg의 투여 부피 중 10 mg/kg의 Ab3, 또는 10 mL/kg의 투여 부피 중 30 mg/kg의 Ab3을 복강내로 (i.p.) 투여하였다. 래트 항 마우스 PD-1 항체 (RMP1-14-rIgG2a, 바이오엑셀)를 제1일, 제4일 및 제8일에 10 mL/kg의 투여 부피 중 10 mg/kg으로 i.p. 투여하였다.

군 1은 단지 항-PD-1 항체만을 받았다. 군 2는 Ab5 (3 mg/kg)를 항-PD-1 항체와 조합하여 받았다. 군 3은 Ab5 (10 mg/kg)를 항-PD-1 항체와 조합하여 받았다. 군 4는 Ab3 (10 mg/kg)을 항-PD-1 항체와 조합하여 받았다. 군 5는 Ab3 (30 mg/kg)을 항-PD-1 항체와 조합하여 받았다. 제시되지는 않았지만, 비처리 대조군을 사용하였다.

SMAD 2/3 신호전달의 억제

동물을 희생시키고, 제8일에 마지막 투여 8시간 후에 종양을 제거하고, 급속 동결시켰다. 종양을 드라이 아이스 상에서 분쇄하고, 스파이킹된 포스파타제 억제제를 첨가하여 단백질 용해물을 생성하였다.

인산화-대-총 SMAD2/3 비에 의해 결과를 평가하였다. 도 12에 제시된 바와 같이, 긴장성 SMAD2/3 신호전달은 항-PD-1과 조합하여 Ab3 또는 Ab5 둘 다로 처리된 동물에서 유의하게 억제되었으며, Ab5 (10 mg/kg)가 가장 유의한 억제를 나타냈다. 이들 데이터는 TGFβ1 활성화 억제제의 효과적인 표적 결속으로, 하류 신호전달의 억제가 유발되었다는 것을 입증한다.

실시예 7: MBT2 동계 방광암 마우스 모델에서의 종양 진행에 대한 항-PD-1 항체와 조합된 Ab3 및 Ab6의 효과

방광 암종 종양 진행을 감소시키는 항-PD-1 항체와 조합된 Ab3 및 Ab6의 능력을 평가하기 위해, MBT2 동계 방광암 마우스 모델을 사용하였다. 이는 매우 공격적이고 빠르게 성장하는 종양 모델이어서, 약물 처리로 종양 진행을 극복하기가 매우 어렵다.

종양 세포 배양

MBT2는 암컷 C3H/He 마우스에서의 이식가능한 N-[4-(5-니트로-2-푸릴)-2-티아졸릴] 포름아미드-유도된 방광암으로부터 유래된 불량하게 분화된 뮤린 방광암 세포주이다. 세포를 5% CO₂ 분위기 하에 37℃에서 10% 소 태아 혈청 및 100 μg/ml 스트렙토마이신을 함유하는 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트 (RPMI)-1600 배지에서 배양하였다. 배양 배지를 격일로 교체하고, 세포 전면생장률이 90%에 도달하였을 때 계대배양을 수행하였다. 세포를 전면생장률 미만의 배양물로부터 트립신처리에 의해 수거하고, 무혈청 배지에서 세척하였다. >90% 세포 생존율을 갖는 단일 세포 현탁액을 트리판 블루 배제에 의해 결정하였다. 세포를 포스페이트-완충 염수 (PBS) 중에 재현탁시킨 후, 주사하였다.

생체내 이식 및 종양 성장

이식에 사용되는 MBT2 세포를 대수기 성장 동안 수거하고, 포스페이트 완충 염수 (PBS) 중에 재현탁시켰다. 종양 이식 당일에, 각각의 시험 마우스에 5 x 10⁵개 세포 (0.1 mL 세포 현탁액)를 측복부에 피하로 주사하고, 종양 성장을 모니터링하였다. 종양이 평균 40-80 mm³에 도달하였을 때, 마우스를 15마리의 군으로 무작위화하였다.

캘리퍼를 사용하여 종양을 2차원으로 측정하고, 하기 식을 사용하여 부피를 계산하였다:

종양 부피 (mm³) = w² x l / 2

여기서 w = 종양의 폭 및 l = 종양의 길이 (mm). 종양 중량은 1 mg이 종양 부피 1 mm³와 등가라는 가정 하에 추정될 수 있다.

처리

간략하게, 제1일에 피하 MBT2 종양 (40 내지 80 mm³)을 보유하는 마우스 (n=15)에게 29일 동안 1주 1회 10 mL/kg의 투여 부피 중 10 mg/kg의 Ab3, 10 mL/kg의 투여 부피 중 30 mg/kg의 Ab3, 10 mL/kg의 투여 부피 중 3 mg/kg의 Ab6, 또는 10 mL/kg의 투여 부피 중 10 mg/kg의 Ab6을 복강내로 (i.p.) 투여하였다. 래트 항 마우스 PD-1 항체 (RMP1-14-rIgG2a, 바이오엑셀)를 29일 동안 1주 2회 10 mL/kg의 투여 부피 중 10 mg/kg으로 i.p. 투여하였다.

군 1은 단지 항-PD-1 항체만을 받았다. 군 2는 Ab3 (10 mg/kg)을 항-PD-1 항체와 조합하여 받았다. 군 3은 Ab3 (30 mg/kg)을 항-PD-1 항체와 조합하여 받았다. 군 4는 Ab6 (3 mg/kg)을 항-PD-1 항체와 조합하여 받았다. 군 5는 Ab6 (10 mg/kg)을 항-PD-1 항체와 조합하여 받았다. 제시되지는 않았지만, 비처리 대조군을 사용하였다.

종점 및 종양 성장 지연 (TGD) 분석

종양을 1주에 2회 캘리퍼를 사용하여 측정하고, 각각의 동물을 그의 종양이 1,200 mm³의 종점 부피에 도달하였을 때 또는 연구 종료시에 안락사시켰다. 종양 부피 종점에 도달하여 연구를 마친 마우스는 종양 진행 (TP)으로 인해 안락사된 것으로 안락사 날짜와 함께 기록하였다. 분석을 위한 종점까지의 시간 (TTE)을 WO 2018/129329에 기재된 방법에 따라 각각의 마우스에 대해 계산하였다.

10mg/kg의 항-PD1/Ab3은 191% TGD를 가졌고, 30mg/kg은 196% TGD였다. 3 mg/kg의 항-PD1/Ab6은 68% TGD였고, 10mg/mk에서는 196% TGD였다. 처리로 인한 부분 반응 (PR)은, 종양 부피가 연구 과정 동안 3회 연속 측정에 대해 그의 제1일 부피의 50% 이하이고, 이들 3회 측정 중 1회 이상에 대해 13.5 mm³ 이상인 것으로 정의된다. 완전 반응 (CR)에서, 종양 부피는 연구 과정 동안 3회 연속 측정에 대해 13.5 mm³ 미만이었다. 10 mg/kg의 항-PD-1/Ab3은 연구 종료시에 0개의 PR 및 4개의 CR을 가졌다. 30 mg/kg의 항-PD-1/Ab3은 연구 종료시에 1개의 PR 및 1개의 CR을 가졌다. 3 mg/kg의 항-PD-1/Ab6은 0개의 PR 및 3개의 CR을 가졌다. 10 mg/kg의 항-PD-1/Ab6은 0개의 PR 및 5개의 CR을 가졌다.

도 13a 및 13b에 제시된 바와 같이, 항-PD-1과 조합된 10 mg/kg 및 30 mg/kg 용량 둘 다의 Ab3의 투여는 종양 성장을 지연시켰다. 일부 동물은 종양의 완전 퇴행을 나타냈다. 또한, 항-PD-1과 조합된 3 mg/kg 및 10 mg/kg 용량 둘 다의 Ab6의 투여는 종양 성장을 지연시켰다. 일부 동물은 종양의 완전 퇴행을 나타냈다. PD-1 단독으로 처리된 마우스의 대부분은 약 제8일 내지 제14일에 1024 mm³의 종양 부피에 도달한 반면 (점선에 의해 표시된 바와 같음), 10mg/kg의 Ab3, 30 mg/kg의 Ab3, 3 mg/kg의 Ab6 또는 10 mg/kg의 Ab6으로 처리된 마우스는 1024 mm³의 종양 부피에 도달하는데 최대 28일이 걸렸다. 도 13c는 항-PD-1 항체와 조합된 Ab3 (상부 좌측) 또는 Ab6 (상부 우측)으로의 처리 후 중앙값 종양 진행을 보여준다. 하부 그래프는 항-PD-1과 조합하여 Ab3 또는 Ab6이 투여된 마우스에서 제15일의 중앙값 종양 부피 (mm³)를 요약한다. 항-PD-1과 조합하여 Ab3 (10 mg/kg), Ab3 (30 mg/kg) 또는 Ab6 (10 mg/kg)으로 처리된 마우스에서 제15일의 중앙값 종양 부피는 약 500 mm³ 이하인 반면, 항-PD-1 단독으로 처리된 마우스에서 제15일의 중앙값 종양 부피는 1000 mm³ 이상이었다 (하부 그래프).

도 13d는 MBT2에서의 Ab6의 효능을 강조한다. 5개의 처리군으로부터의 마우스에서의 종양 진행이 제시된다. 대조군 IgG, Ab6 단독 또는 항-PD-1 단독을 받은 어떠한 동물도 종점 부피의 25% 이하로 감소된 종양 부피로서 정의되는 유효 종양 제어를 달성하지 못했다 (각각 하부 및 상부 점선으로 제시됨). 대조적으로, Ab6/항-PD-1 조합 처리를 받은 28마리의 동물 중 조합 12마리 (~43%)는 유효 종양 제어를 달성하였으며, 이는 PD-1 및 TGFβ1 경로의 공동 억제가 종양 성장을 유의하게 감소 (예를 들어, 지연 또는 퇴행)시킬 수 있다는 것을 나타낸다.

더욱이, 조합 처리는 항-PD-1 단독과 비교하여 모든 3개의 처리군에서 생존을 연장시키는데 효과적이었다. 도 14에 제시된 바와 같이, 50% 생존에 도달하는데, 10 mg/kg의 Ab3 또는 10 mg/kg의 Ab6으로 처리된 마우스는 28일이 걸린 반면, PD-1 단독으로 처리된 마우스는 약 16일 내에 50% 생존에 도달하였다. 종합하면, 이들 결과는 조합 요법의 생존 이익을 입증한다.

결과의 요약 및 논의

종양 성장에 대한 Ab6-항-PD-1의 상승작용적 효과: Ab6의 발견은 TGFβ1 활성화의 선택적 억제가 CBT에 대한 종양 1차 저항성을 극복하기에 충분할 것이라는 가설의 직접 평가를 가능하게 한다. 전임상 시험을 위해, 본 발명자들은 CBT에 대한 1차 저항성을 나타내는 인간 종양의 핵심 특색 중 일부를 재현하는 뮤린 동계 종양 모델을 확인하고자 하였다. 모델 선택을 위한 기준은 1) 다른 동계 종양 모델에서 효과적인 것으로 나타난 용량에서의 항-PD-(L)1 단일-작용제 처리에 대한 반응이 거의 내지 전혀 없음, 2) 침윤 CD3+ T 세포의 사멸에 의한 면역 배제에 대한 증거, 3) 활성 TGFβ 신호전달의 증거, 및 4) TGFβ1 이소형 발현의 증거를 포함하였다.

전체 종양-유래 RNA의 공중 이용가능한 RNAseq 데이터세트를 포함한, 종양 반응 및 종양 프로파일링 데이터의 탐구로 이들 기준을 충족시키는 다음 3종의 종양 모델을 선택하였다: MBT-2 방광암 모델 (MBT-2), 클라우드만S91 (S91) 흑색종 모델 및 EMT-6 유방암 모델 (EMT-6). 전체 종양 RNAseq 데이터의 분석은 TGFβ 경로 활성화를 나타내는 TGFβ 반응 유전자의 상향조절 및 면역 배제된 표현형과 일치하는 이펙터 T 세포 유전자의 낮은 발현을 입증하였다 (도 20f). 총 TGFβ 이소형 단백질 발현을 프로빙하는 ELISA에 의한 전체 종양 용해물의 분석은 TGFβ1 성장 인자가 모든 3종의 모델에서 우세하다는 것을 발견하였다.

마우스 동계 모델에서 Ab6을 평가하기 위해, 본 발명자들은 면역원성을 최소화하도록 Ab6의 인간 V 도메인이 마우스 IgG1/카파 불변 도메인에 융합된 키메라 항체로서 Ab6을 발현시켰다. Ab6-mIgG1은 완전 인간 Ab6과 유사한 억제 활성을 갖는다. 본 발명자들은 MBT-2 종양-보유 동물이 치료 수준으로 투여되었을 때의 항-PD-1 (RMP1-14)에 대해서뿐만 아니라 Ab6-mIgG1 단독에 대해 저항성이 있다는 것을 확인하였다. 그러나, 조합한 항-PD-1 및 Ab6-mIgG1을 1주에 3 mg/kg 또는 1주에 10 mg/kg으로 투여하였을 때에는, 종양 부담의 유의한 감소, 예컨대 각각 21% 및 36% 무종양 생존자, 뿐만 아니라 각각의 연구의 지속기간에 걸친 유의한 생존 이익이 유발되었다 (도 13d 및 14). 항-PD-1 단독을 받은 0/13마리와 비교하여, 총, 4/14마리의 동물은 항-PD-1/Ab6-mIgG1 (1주에 3 mg/kg)에 반응하였고, 8/14마리는 항-PD-1/Ab6-mIgG (1주에 10 mg/kg)에 반응하였다. 본 발명자들은 약하게 항-PD-1-반응성인 클라우드만S91 흑색종 모델에서 유사한 반응을 관찰하였다. 다시, 항-PD-1/Ab6-mIgG1 조합 처리는 최대 75% 반응률로 현저한 종양 억제 및 모든 용량 수준에서 유의한 생존 이점을 유발하였다 (실시예 5 참조).

본 발명자들은 다음으로 MBT-2 무종양 생존자에서 항종양 반응의 지속성을 평가하였다. 처리를 중단하고, 동물을 7주 동안 추적하였다. 본 발명자들은 어떠한 동물에서도 검출가능한 종양 재발생을 관찰하지 않았다 (실시예 8 참조).

TGFβ 신호전달이 CBT 효능의 손상에 대한 면역 배제를 구동한다는 임상적으로-유도된 가설, 뿐만 아니라 범-TGFβ 억제가 면역계로 하여금 이러한 저항성 메카니즘을 극복하게 하고 CBT 효능을 촉진하게 할 수 있다는 이전에 보고된 전임상 입증은, 부분적으로 본 발명자들이, 본 발명의 항체로 관찰된 유의한 종양 반응 및 생존 이익이 종양 면역 콘텍스쳐에서의 관련 변화에 상응할 수 있는지 여부를 조사하도록 촉구하였다.

단일 작용제로서의 또는 조합된 항-PD-1 또는 AB6-mIgG1 처리의 면역 효과를 연구하기 위해, MBT-2 종양을 처리 개시 10일 후에 마우스로부터 수거한 다음, 선택 면역 세포 마커의 면역조직화학적 및 유동 세포측정 분석에 적용하였다. 유동 세포측정 분석은 CD45+ 면역 구획의 전체 백분율이 처리에 따라 변화하지 않았음을 밝혀냈지만, 항-PD-1 및 Ab6-mIgG1의 조합은 이소형 대조군 항체 처리에 비해 이 구획 내에서 CD8+ T 세포 발현의 10배 증가를 유발하였다 (각각 평균 34% 대 3.5%) (도 27b). 주목할 만하게, 항-PD-1로의 단일-작용제 처리는 CD8+ 세포 제시의 보통의 증가를 가져오는 것으로 보이지만, 관찰된 증가는 본 연구에서 유의성에 도달하지 않았다. 추가적으로, 이들 종양으로부터 유래된 RNA의 분석은 CD8+ 세포 수의 증가와 일치하고 이들 세포의 활성 이펙터 기능을 나타내는 세포독성 T 세포 활성화의 마커의 증가를 나타냈다 (도 32d). CD4+FoxP3+ Treg 세포의 표현의 유의한 증가도 또한 조합 처리에 의해 관찰되었다는 것이 주목할 만하다. Treg 세포의 이러한 증가의 관련성은 조합 처리에 의해 관찰된 유의한 항종양 효과를 고려하면 불명확하다. 그러나, Treg:CD8의 비는 조합 처리에 반응하여 변경되지 않았다. 흥미롭게도, 항-PD-1/Ab6-mIgG1 조합 처리는 또한 MBT-2 종양 내의 전체 CD11b+ 세포 표현의 유의한 감소를 유도하였다. 이는 각각 면역억제 M2-유사 대식세포 및 골수-유래 억제 세포 (MDSC)에 상응하는 CD11b+CD206+ 및 CD11b+Gr1+ 하위집단의 선택적 감소에 기인하는 것으로 보인다. 종합하면, 이들 2종의 세포 집단의 표현은 조합 처리 후 CD45+ 세포 집단의 평균 47%에서 14%로 감소된다 (도 28b). M1-유사 대식세포 하위집단 (CD11b+CD206-)은 처리에 따라 변화하는 것으로 보이지 않았으며, 이는 PD-1/TGFβ1 차단이 종양 내의 면역억제 환경에 대해 선택적이지만 광범위한 영향을 가져, 림프성 및 골수성 구획 둘 다에 유익하게 영향을 미친다는 것을 나타낸다.

조합된 PD-1 및 TGFβ1 억제가 종양 미세환경 내로의 유의한 CD8+ T 세포 진입 및/또는 확장을 유발하는 특이적 메카니즘은 명확하지 않다. 따라서, 본 발명자들은 TGFβ 경로 활성과 면역 배제 사이의 관계에 대한 추가의 통찰을 얻기 위해 보다 상세한 조직학적 분석을 착수하였다. 먼저, 본 발명자들은 면역조직화학 분석에 의해 대조군 MBT-2 종양 전반에 걸쳐 CD8+ 염색의 유의한 증가를 확인하였으며, 이는 유동 세포측정법 데이터와 일치하였다 (도 30). 다음으로, 본 발명자들은 종양 미세환경에서의 세포가 활성화된 TGFβ1에 반응할 수 있는지를 결정하기 위한 시도로, TGFβ-반응성 유전자의 활성화를 매개하는 전사 인자인 포스포-Smad3 (pSmad3)의 면역조직화학적 분석을 수행하였다.

놀랍게도, 항-PD-1 처리군 및 대조군 마우스로부터의 종양에서 pSmad3 염색은 종양 혈관 내피의 핵에 주로 국한된 것으로 보이고, 이러한 신호는 Ab6-mIgG로의 처리시 훨씬 감소되었다 (도 30f).

혈관주위 TGFβ 신호전달의 관련성을 추가로 탐구하기 위해, 본 발명자들은 CD8+ T 세포 및 CD31+ 혈관 내피를 공동-염색하였다. CD8+ T 세포는 CD31+ 종양 혈관에 인접한 영역에서 풍부화되어 있는 것으로 보인다 (도 30f & 30g). 이러한 관찰은 종양 혈관계가 T 세포 진입의 경로로서의 역할을 할 수 있는 가능성을 상승시킨다. 다른 자들은 TGFβ 신호전달이 종양 내로의 T 세포 진입에 대한 장벽을 형성하는 섬유모세포-풍부 종양주위 기질의 존재와 연관된다는 것을 보고하였지만, 본 발명자들의 예비 관찰은 추가의 TGFβ1-의존성 혈관 장벽이 또한 종양 내로의 CD8+ T 세포 진입의 방지에 현저한 역할을 할 수 있다는 것을 시사한다.

실시예 8: MBT-2, 클라우드만 S91 및 EMT-6 종양에서 항-PD1/Ab3 및 항-PD1/Ab6 완전 반응자에서의 지속적인 항종양 적응 면역 기억 반응의 발생

1. MBT-2 종양에서의 항종양 기억

이전에 MBT2 종양을 제거한 완전 반응자에서 강력하고 지속적인 적응 면역 반응이 생성되었는지를 확인하기 위해, 종양 리-챌린지 실험을 수행하였다.

방법

8-12주령 암컷 C3H/HeN 마우스에게 5x10⁵개 MBT2 종양 세포를 측복부에 피하로 이식하였다. 종양이 40-80 mm³의 평균 크기에 도달하였을 때 동물을 처리군으로 무작위화하여 처리를 시작하였다. 출발 평균 종양 부피는 군들 간에 동일하였다. 항-PD1 (RMP1-14)을 10 mg/kg으로 1주 2회 i.p. 투여하고; Ab3을 10 mg/kg 또는 30 mg/kg으로 1주 1회 투여하고, Ab6을 5주 동안 3 mg/kg 또는 10 mg/kg으로 투여하였다. 5주 후에, 적어도 3회 연속 측정에 대해 13.5 mm³ 미만의 종양 부피를 갖는 모든 항-PD1/Ab3 및 항-PD1/Ab6의 동물을 "완전 반응자 (CR)"로 간주하였다. 1주에 2회 측정을 수행하였다. 항-PD1 단독을 받은 마우스에서는 이러한 완전한 반응자가 없었다. 리-챌린지 실험을 위해, 완전 반응자 동물은 어떠한 측정가능한 종양 (예를 들어, 0 mm³)도 갖지 않았다. 이들 완전 반응자를 투여 없이 7주 동안 추적하여 (예를 들어, "휴지시켜") ("휴약" 기간), 이전에 투여된 화합물의 휴약을 가능하게 하였다. 7주의 종료시에, 완전 반응자 및 연령-매칭 나이브 대조군 동물에게 5x10⁵개 MBT2 종양 세포를 반대측 측복부에 피하로 주사하였다. 동물을 25일 동안 또는 종양 부피가 1200 mm³을 초과할 때 중 먼저 도래하는 시점까지 추적하였다. 종점은 1200 mm³의 종양 부피로서 정의하였다. 종점에 도달하면, 동물을 희생시켰다.

결과

효능 연구로부터의 완전 반응자에게 추가 처리 없이, 원래 이식한 쪽의 반대쪽 측복부에 MBT-2 세포를 피하로 재이식하였을 때, 완전 반응자 마우스 중 어느 마우스에서도 검출가능한 종양 성장이 관찰되지 않은 반면, 마우스의 대조군, 연령-매칭, 종양-나이브 군의 모든 마우스는 이식 3주 이내에 측정가능한 종양이 발생하였다 (도 15).

보다 구체적으로, 종양 리-챌린지 모델은 전이 또는 종양 재발생에 대한 면역학적 기억 및 감시를 입증하는 수단이다. 이들 경우에, 완전 반응자 (처리에 반응하여 완전 종양 퇴행을 달성한 동물)에게 종양 세포를 재이식하고, 성장을 연령-매칭 나이브 마우스와 비교하였다. 나이브 동물에서의 종양의 출현은 제25일까지 100% (12/12마리) (도 15)였으며, 다수의 동물이 종점 기준에 도달하였다. 상기 기재된 바와 같이 MBT2 세포로 리-챌린지된 도 13a 및 13b에서의 연구로부터의 완전 반응자는 연구의 종료까지 검출가능한 종양을 갖지 않았으며 (합한 완전 반응자 0/9마리), 이는 완전 반응자의 100%가 MBT2 종양 리챌린지에 대한 강건한 면역 기억을 보유한다는 것을 나타낸다. 이들 결과는, 종양 항원에 대한 지속적이고 강력한 기억 반응이 종양-경험 동물에서 생성되었음을 나타내고, 초기 노출에서의 종양-제거가 적응 면역 반응과 관련되었음을 시사한다. 이러한 적응 면역 반응은 종양 세포를 파괴하고, 종양 확립을 방지하는데 충분하며, 이들 동물에서 전이 또는 종양 재발생의 계속된 억제를 시사할 것이다. 추가로, 1차 면역 반응 동안의 TGFβ1 억제가 기억 림프구 집단의 발생을 방해하지 않는다는 것을 입증한다.

MBT-2 종양 모델로부터의 이들 리-챌린지 결과는 TGFβ1 및 PD-1의 조합된 억제가 이들 동물에서 지속적이고 강력한 항종양 면역학적 기억을 확립하는데 충분하다는 것을 나타낸다.

2. 클라우드만S91에서의 지속적인 항종양 효과

특히, 항-PD-1/Ab6 조합군 내의 여러 클라우드만S91 종양-보유 마우스가 완전 반응을 경험하였지만, 일부 동물은 나머지 처리 기간에 걸쳐 작지만 안정한 잔류 종양 덩어리를 지지하였다. 본 발명자들은 MBT-2에서와 같이 상기 모델에서 종양 리챌린지 데이터를 재현하고자 하였다. 그러나, 종양 이식률은 이 모델에서 가변적이어서, 이 분석을 더 어렵게 한다. 대신에, 본 발명자들은 처리를 중단하고 수주 동안 동물을 추적하도록 선택하였다.

처리 중지 6주 후에, 처리 중지시 측정가능한 종양이 없는 마우스는 무종양 상태로 남아있었다. 투여 중지시 측정가능한 종양은 다수가 제거되었지만 몇개는 안정하거나 성장하는 상태로 남아있는 혼합 반응을 가졌다 (도 11d). 이들 데이터는 완전한 종양 제거가 달성될 때까지 처리를 유지하는 것의 중요성을 강조한다 (또한 실시예 5 참조).

3. EMT-6에서의 지속적인 항종양 효과

놀랍게도, 본 발명자들은 EMT-6 유방 암종 모델에서 항-PD-1/Ab6-mIgG1 조합에 대한 유사한 반응을 관찰하였으며, 조합 처리 후 50% 완전 반응률 및 항-PD-1에 비해 유의한 생존 이점을 가졌다 (도 34a & 34c). TGFβ1이 우세하게 발현된 이소형인 MBT-2 및 클라우드만S91과 대조적으로, EMT6은 RNA 및 단백질 수준 둘 다에서 유사한 수준의 TGFβ1 및 TGFβ3을 발현한다. 이러한 처리 조합은 항-PD-1/범-TGFβ 억제보다 더 효과적이었으며, 이는 심지어 다중 TGFβ 이소형의 존재 하에서도, TGFβ1이 면역 배제 및 이에 따라 1차 저항성의 주요 구동인자임을 시사한다. 이 모델에서, 본 발명자들은 처리를 중단하였고, 다시 투여 중지 6주 후에 완전한 반응자가 무종양 상태로 남아있었다는 것을 관찰하였으며, 이는 다시 반응의 지속성을 입증한다 (도 34c, 우측).

실시예 9: 항체 스크리닝, 선택 방법론 및 특징화

성숙 TGFβ1 성장 인자와 그의 밀접하게 관련된 패밀리 구성원인 TGFβ2 및 TGFβ3 사이의 높은 서열 및 구조적 유사성을 고려하여, 본 발명자들은 이러한 활성 형태의 TGFβ1 성장 인자를 표적화하는 선택적이고 충분히 높은 친화도 항체-기반 억제제의 생성이 어렵다고 판명될 것으로 추론하였다. 잠복 TGFβ1 구조 및 특정 인테그린과의 상호작용을 통한 그의 활성화의 기계적 측면에 대한 최근에 보고된 통찰은 작용 메카니즘으로서 잠복 복합체 활성화를 방지하는 것을 목표로 하는 잠복 TGFβ1 복합체 내의 프로도메인의 표적화의 가능성을 지적하였다.

결합 및 활성화 억제 둘 다에서의 이소형 선택성의 달성은 각각의 성장 인자 동종이량체를 국한시키고 불활성으로 만드는 패밀리 구성원 프로도메인들 사이의 보다 낮은 서열 유사성을 이용할 것이다. TGFβ1 활성화의 선택적 억제제의 확인을 위한 추가의 핵심 고려사항은 잠복 TGFβ1가 세포외 매트릭스 상으로의 불활성 성장 인자 복합체의 침착 또는 세포 표면 상에서의 그의 정교화를 가능하게 하는 디술피드-연결된 대형 잠복 복합체 (LLC)로 조립된다는 사실이다. 다중 TGFβ1 LLC가 종양 미세환경에서 발현될 수 있다는 타당성을 고려하여, TCGA로부터의 RNAseq 데이터를 분석하였다. 본질적으로 모든 종양 유형은 4종의 프로TGFβ1-제시 분자 LTBP1, LTBP3, GARP 및 LRRC33의 발현의 증거를 나타낸다 (도 20e). 따라서, 본 발명자들은 모든 이들 국부 콘텍스트에서 잠복 TGFβ1에 결합하고 그의 활성화를 억제할 특이적 항체를 확인하고자 하였다.

각각의 TGFβ1 LLC의 가용성 뮤린 및 인간 형태를 설계하고, 발현시키고, 정제하고, 특징화하고, 효모-기반 나이브 인간 항체 디스플레이 라이브러리의 주의깊게 설계된 스크린에서 양성 선택 단계에 사용하였다. 선택적 잠복 TGFβ1 결합제의 확인을 보장하기 위해, 비-복합체화된 LLC-제시 분자를 또한 음성 선택 단계에 사용하였다.

양성 선택 항원으로서 인간 및 뮤린 형태의 TGFβ1 LLC(LTBP1-프로TGFβ1, LTBP3-프로TGFβ1 및 GARP-프로TGFβ1)를 사용하고, 인간 및 뮤린 LLC-제시 분자 (LTBP1, LTBP3 및 GARP) 상에서 역-선택을 사용하여, 효모-기반 나이브 완전 인간 IgG 항체 라이브러리의 선택을 통해 모 항체를 확인하였다. 선택은 2 라운드의 자기 비드 보조 세포 분류 (MACS) 및 여러 후속 라운드의 형광 활성화 세포 분류 (FACS)를 포함한 다중-라운드 과정이었다. MACS 라운드는 사전-제거 (비-특이적 결합제를 제거하기 위함), 비오티닐화 항원과의 인큐베이션, 세척, 용리 및 효모 증폭을 포함하였다. FACS 선택 라운드는 비오티닐화 항원과의 인큐베이션, 유동 세포측정법에 의한 결합 (양성 선택의 경우) 또는 비-결합 (음성 또는 탈-선택의 경우) 집단의 세척 및 선택, 이어서 적절한 효모 성장 배지에서의 성장에 의한 선택된 효모의 증폭을 포함하였다. 모든 선택을 용액 상에서 수행하였다.

수백개의 고유한 항체를 전장 인간 IgG1agly (비-글리코실화 Fc) 모노클로날 항체로서 발현시켰다. 이어서, 이들 항체를 생물층 간섭측정법에 의해 특징화하여 인간 및 뮤린 LTBP1-프로TGFβ1, LTBP3-프로TGFβ1 및 GARP-프로TGFβ1에 결합하는 그의 능력을 결정하였다. 이들 TGFβ1 LLC에 결합된 항체를 세포-기반 효력 스크리닝 검정 (LTBP-프로TGFβ1, GARP-프로TGFβ1 및 LRRC33-프로TGFβ1 검정)에서 시험하고 순위화하였다. 인간 IgG4sdk Fc (S228P 돌연변이에 의해 안정화된 힌지; Angal, 1993)를 사용하여 억제 항체를 재조합적으로 발현시키고, 인테그린-매개 TGFβ1 활성화 검정 (LTBP-프로TGFβ1, GARP-프로TGFβ1 및 LRRC33-프로TGFβ1 검정; 실시예 2 참조)에서 그의 억제 활성을 시험하였다. 여러 항체는 리포터 세포 검정에서 프로TGFβ1을 유의하게 억제할 수 있었다. 인간 및 마우스 프로TGFβ1 복합체에 결합하고 모든 인간 및 마우스 프로TGFβ1 LLC의 인테그린-매개 활성화를 억제하는 그의 능력에 기초하여 친화도 성숙을 위한 리드 항체로서 항체 Ab4를 선택하였다.

2종의 상이한 항체 조작 전략을 사용하여 2 단계로 Ab4의 친화도 성숙을 수행하였다. 제1 단계에서, CDRH1 및 CDRH2 변이체 (H1/H2 셔플)를 갖는 사전 제조된 항체 라이브러리와 모 CDRH3을 조합한 항체 분자의 라이브러리를 생성하였다. 이 라이브러리를 인간 및 마우스 프로TGFβ1 복합체에의 결합에 대해 선택하였다. 이어서, 친화도 성숙 캠페인의 이 단계로부터의 가장 강한 결합제를 친화도 성숙의 제2 단계로 이동시키고, 여기서 모 분자의 중쇄 CDR3을 프라이머 이량체 워킹 접근법을 사용하여 돌연변이유발에 적용하고 (H3 올리고 돌연변이), 생성된 변이체의 라이브러리를 인간 및 마우스 프로TGFβ1 복합체에 대한 결합을 위해 선택하였다.

두 친화도 성숙 단계로부터의 리드 항체 Ab4의 친화도-최적화 자손을 나타내는 총 14종의 항체를 항원 결합 및 잠복 TGFβ1 LLC의 억제에 대해 다시 시험하였다. 모든 4종의 잠복 TGFβ1 LLC에 대한 높은 친화도, 마우스, 래트 및 시노몰구스 원숭이 단백질에 대한 교차반응성, 및 세포-기반 검정에서의 증가된 효력으로 인해 Ab6을 선택하였다.

Ab6의 결합 특성을 추가로 특징화하기 위해, 시험관내 결합 활성을 MSD-SET 검정에서 측정하였다. Ab6은 잠복 TGFβ1 복합체에 대해 선택적인 것으로 확인되었으며 (도 33a 참조); 잠복 TGFβ2 또는 잠복 TGFβ3 복합체에 대한 의미있는 결합은 검출되지 않았다. 유사하게, 프로도메인과 회합되지 않은 활성 (성숙) TGFβ1 성장 인자 자체에 대한 결합은 검출되지 않았다. 하기 제시된 바와 같이, Ab6은 모든 대형 잠복 TGFβ1 복합체 (즉, 제시 분자 + 프로TGFβ1)에 고친화도로 결합한다. 추가로, Ab6은 바람직한 종 교차-반응성을 갖는 것으로 나타났으며; 이는 래트 및 시노몰구스 대응물을 인식하고 그에 높은 친화도로 결합한다.

표 21. Ab6 교차-종 특이성

인테그린에 의한 잠복 TGFβ1 활성화를 억제하는 Ab6의 능력을 시험하기 위해, TGFβ1 제시 및 활성화를 가능하게 하는 각각의 LLC 콘텍스트에 상응하는 일련의 세포-기반 활성화 검정을 개발하였다. 인간 LN229 교모세포종 세포는 잠복 TGFβ1 복합체를 활성화시킬 수 있는 αVβ8 인테그린을 발현한다. 이들 세포는 또한 LTBP1 및 LTBP3을 내인성으로 발현하며 (qPCR에 의해 측정됨), 이는 TGFβ1-코딩 플라스미드로 형질감염되는 경우에, 이들 TGFβ1 LLC (LTBP1-프로TGFβ1 및 LTBP3-프로TGFβ1)의 세포외 매트릭스 내로의 생산 및 침착을 가능하게 한다. 세포-연관 GARP-또는 LRRC33-함유 TGFβ1 LLC (GARP-프로TGFβ1 및 LRRC33-프로TGFβ1)를 생산하기 위해, LN229 세포 (qPCR시, 이들 유전자를 발현하지 않음)를 TGFβ1 발현 구축물과 함께 이들 제시 분자 중 하나를 코딩하는 발현 구축물로 공동-형질감염시켰다. 세포외 매트릭스 내에 침착되거나 또는 LN229 세포의 세포 표면 상에서 정교화되면, TGFβ1 LLC는 이어서 동일한 세포에 의해 발현된 αVβ8 인테그린에 의해 활성화될 수 있다. 이어서, 인테그린 활성화에 의해 잠복 복합체로부터 방출되는 성숙 (활성) TGFβ1 성장 인자는 성장 인자 활성의 측정을 가능하게 하는 CAGA12-루시페라제 프로모터-리포터로 조작된 공동-배양된 세포 상에서의 그의 동족 수용체에 자유롭게 결속된다.

모든 TGFβ1 LLC는 상기 언급된 검정 조건 하에 용이하게 활성화되었다. 잠복 TGFβ1을 발현하는 LN229 세포 내로 GARP 또는 LRRC33을 공동-형질감염시키는 것은 유의하게 더 높은 TGFβ 신호를 생성하였으며, 이는 세포 표면 상의 TGFβ1 LLC의 형성 및 활성화 및 이를 능가하는 내인성 LTBP와 일치한다. Ab6은 1.15 내지 1.42 nM의 IC50 값으로 농도-의존성 방식으로 모든 복합체의 활성화를 억제하였다. 마우스 TGFβ1 복합체에 대한 억제 효력은 Ab6의 종 교차반응성과 일치하게 유사하였다. LTBP1-TGFβ3 복합체에 대한 Ab6의 유의한 결합의 결여와 일치하게, 동일하게 설계된 검정에서 인테그린-매개 LTBP-TGFβ3 LLC 활성화 복합체의 억제는 거의 내지 전혀 관찰되지 않았으며, 따라서 이는 TGFβ1 활성화의 억제에 대한 선택성을 입증한다 (도 33b).

특히, Ab6은 또한 인간 혈장 칼리크레인 및 플라스민에 의한 잠복 TGFβ1의 활성화를 억제하였으며 (도 5a & 5b 참조), 이는 활성화의 다중 추정 메카니즘이 이러한 항체에 의해 억제될 수 있다는 것을 나타낸다.

TGFβ1 활성화의 생물학적 관련 결과를 억제하는 Ab6의 능력을 추가로 평가하기 위해, 본 발명자들은 1차 인간 Treg 세포의 주요 억제 활성을 억제하는 이러한 항체의 능력을 평가하였다. 분류된 CD4+CD25^hiCD127^lo Treg 세포는 T 세포 수용체 자극시 TGFβ1-GARP LLC의 표면 발현을 상향조절한다 (도 26a). 이들 활성화된 Treg 세포는 자가 이펙터 CD4 T 세포의 증식을 억제하고, Ab6은 1 μg/ml만큼 낮은 농도에서도 이러한 억제 Treg 활성을 차단하였다 (도 26b). 이들 결과는 Treg 세포가 T 세포를 억제하기 위해 TGFβ 신호전달을 이용한다는 이전의 관찰과 일치한다.

실시예 10. 프로TGFβ 복합체 Ab5, Ab6 및 Ab3 내의 어디가 결합하는지 결정하기 위한 에피토프 맵핑

TGFβ1 활성화의 이소형-선택적 억제제에 대한 억제 작용 메카니즘에 대한 초기 통찰을 얻기 위해, 본 발명자들은 수소-중수소 교환 질량 분광측정법 (H/DX-MS) 분석을 수행하여 항체와의 잠복 TGFβ1 상호작용의 가능한 부위를 확인하였다. 수소/중수소 교환 질량 분광측정법 (HDX-MS)은 용액 중의 단백질 입체형태를 탐구하기 위해 널리 사용되는 기술이다. HDX-MS 방법론은 문헌 [Wei et al., Drug Discov Today. 2014 January; 19(1): 95-102]에 기재되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 간략하게, HDX-MS는 용액 중에서 단백질 백본 아미드 수소를 중수소로 교환하는 것에 의존한다. 약한 수소 결합에 관여하거나 단백질의 표면에 위치하는 백본 아미드 수소는 신속하게 교환될 수 있는 반면, 내부에 매몰되거나 수소 결합을 안정화시키는 데 관여하는 것은 더 느리게 교환된다. 백본 아미드 수소의 HDX 비율을 측정함으로써, 단백질 역학 및 입체형태에 대한 정보를 얻을 수 있다.

잠복 TGFβ1 (15 μM) 및 프로TGFβ1/Ab Fab (1:3 몰비)를 샘플 완충제 (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.5) 중에서 제조하였다. 비-중수소화 실험에서, 각각의 샘플을 실온에서 샘플 완충제 (1:15, v/v)와 혼합한 다음, 1:1 (v/v) 켄칭 완충제 (100 mM 인산나트륨, 4 M 구아니딘 HCl, 0.5 M TCEP)와 0℃에서 혼합하였다. 켄칭된 샘플을 즉시 온-칼럼 펩신 소화를 위해 HDX 기술을 사용하여 나노액퀴티(nanoACQUITY) UPLC™ 시스템 (워터스 코포레이션(Waters Corp.), 미국 매사추세츠주 밀포드) 내로 주입하였다. 용리액을 MSE 모드의 분석을 위해 시냅트(SYNAPT)® G2 HDMS 질량 분광계 (워터스 코포레이션, 미국 매사추세츠주 밀포드) 내로 보냈다. H/D 교환 실험을 위해, 각각의 샘플을 표지 완충제 (산화중수소 중 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pD 7.5) (1:15, v/v)와 혼합하여 25℃에서 표지 반응을 시작하였다. 각각의 샘플의 5개 분획을 다양한 시간 간격: 10초, 1분, 10분, 1시간 및 2시간으로 표지하였다. 각각의 표지 시점의 종료시에, 반응물을 1:1(v/v) 켄칭 완충제를 첨가함으로써 켄칭하고, 켄칭된 샘플을 분석을 위해 워터스 H/DX-MS 시스템 내로 주입하였다. 각각의 샘플 실행 사이에, 펩신 세척 완충제 (1.5 M 구아니딘 HCl, 4% 아세토니트릴, 0.8% 포름산)를 H/DX-MS 시스템 내로 주입함으로써 깨끗한 블랭크를 실행시켰다.

데이터-독립적 획득 모드 (MSE) 및 프로테인링스 글로벌 서버 (PLGS) 3.0 소프트웨어 (워터스 코포레이션, 매사추세츠주 밀포드)에서의 정확한 질량 및 충돌-유도된 해리를 사용하여, H/DX-MS 실험에 사용된 동일한 UPLC-ESI-QToF 시스템 상에서 분석된 비중수소화 단백질 샘플 내의 펩신 펩티드를 결정하였다. PLGS로부터 생성된 펩신 펩티드를 ≥1000의 MS1 신호 강도의 펩티드 품질 한계값 및 1 ppm의 최대 질량 오차를 갖는 디남엑스(DynamX) 3.0 (워터스 코포레이션, 매사추세츠주 밀포드) 내로 유입시켰다. 자동화 결과를 수동으로 검사하여 다양한 전하 상태에서의 상응하는 m/z 및 동위원소 분포가 적절한 펩신 펩티드에 적절하게 배정되도록 보장하였다. 디남엑스 3.0을 사용하여 각각의 펩신 펩티드에 대한 상대 중수소 혼입 플롯 및 H/DX 히트 맵을 생성하였다. 각각의 표지 시점에서 중수소-표지된 샘플의 동위원소 분포의 중량-평균 중심 질량으로부터 비중수소화 대조군 샘플의 동위원소 분포의 중량-평균 중심 질량을 차감하여 각각의 펩티드의 상대 중수소 혼입을 결정하였다. 모든 비교를 동일한 실험 조건 하에 수행하였으며, 따라서 중수소 혼입의 결정에서 역 교환 교정의 필요는 없었다. 따라서, H/D 교환 수준은 상대값으로서 보고된다. 각각의 펩신 펩티드의 상대 중수소 흡수를 그의 이론적 최대 흡수로 나누어 상대 중수소 흡수 분율을 계산하였다. 모든 H/DX-MS 실험을 이중으로 수행하고, 평균 상대 중수소 흡수의 불확실성에 대한 98% 신뢰 한계를 기재된 바와 같이 계산하였다. 0.5 Da를 초과하는 미결합 및 Fab-결합 잠복 TGFβ1 사이의 중수소 흡수의 차이를 유의한 것으로 간주하였다.

HDX-MS를 수행하여 프로TGFβ 복합체 Ab5 및 Ab6 내의 어디가 결합하였는지를 결정하였다. HDX-MS에서, 항체에 의해 치밀하게 결합되는 항원의 영역은 단백질-단백질 상호작용으로 인해 양성자 교환으로부터 보호되는 반면, 용매에 노출되는 영역은 용이하게 양성자 교환을 겪을 수 있다. 이에 기초하여, 항원의 결합 영역을 확인하였다.

히트 맵은 Ab5 Fab 결합이 프로TGFβ1의 영역 (영역 1 및 영역 2)에서 HDX 보호를 유발한다는 것을 보여준다 (도 16). 도 17은 Ab5에 의해 결합된 HDX-보호된 영역과 오버레이된 프로TGFβ1 복합체의 구조를 도시한다. 특히, HDX-MS는 Ab5가 프로TGFβ1의 LAP/성장 인자 영역 내의 고유한 에피토프에 잠재적으로 결합한다는 것을 보여주었다.

유사한 HDX 연구를 수행하여 프로TGFβ1에 대한 Ab6 결합에 수반되는 결합 영역을 확인하였다. ~90%의 탁월한 펩티드 커버리지가 달성되었다. 분석은 Ab6 Fab 결합에 의해 중수소 교환으로부터 보호된 잠복 TGFβ1 상의 3개의 영역을 밝혀냈다. 도 18a에 제공된 히트 맵은 Ab6과 항원의 상호작용에 의해 영향을 받은 프로TGFβ1의 특정 영역을 보여준다. 이들 항원 영역은 도면에 제시된 적색 박스에 의해 나타나 있다. 도 18b는 프로TGFβ1 복합체의 구조를 보여주고, 이에 따라 도 18a에서 확인된 영역은 프로TGFβ1 복합체 내의 이들 영역의 공간적 관계를 보여주기 위해 표시되었다.

도 18a에 제시된 바와 같이, 별표 (*)로 표시된 보호된 영역은 Ab5에 대해 확인된 영역 1과 동일한 것으로 밝혀졌다. 이중 별표 (**)로 표시된 보호된 영역은 Ab5에 대해 확인된 영역 2의 하위세트인 것으로 밝혀졌다. 이들 데이터는 유리한 억제 활성을 나타내는 바람직한 항체가 잠복 복합체의 잠복성 라쏘 (잠복성 루프)의 부분을 포함하는 에피토프에 결합할 수 있다는 것을 시사한다. 데이터는 또한 이러한 에피토프가 잠금 상태에서 성장 인자를 효과적으로 "클램핑"하여 그의 방출을 방지할 수 있는, 잠복성 라쏘의 부분 및 성장 인자 도메인의 부분에 의해 형성된 조합 에피토프일 수 있다는 것을 시사한다.

통계적 분석은 Ab6 Fab 결합에 의해 중수소 교환으로부터 강하게 보호된 프로TGFβ1 상의 3개의 결합 영역을 밝혀냈다 (도 19a). 영역 1은 잠복 TGFβ1 프로도메인 내에 있는 반면, 영역 2 및 3은 TGFβ1 성장 인자에 맵핑된다. 흥미롭게도, 영역 1은 주로 잠복성 라쏘에 걸쳐 있으며, 플라스민 및 칼리크레인 프로테아제 둘 다에 대한 단백질분해적 절단 부위를 함유하고; 이러한 영역의 보호는 Ab6이 잠복 TGFβ1의 칼리크레인- 및 플라스민-매개 활성화를 억제한다는 본 발명자들의 관찰과 일치한다 (도 5a & 5b). Ab6이 유리 형태 (예를 들어, 프로도메인과 회합되지 않음)의 3종의 TGFβ 성장 인자 이량체 중 어느 것에도 결합하지 않는다는 것을 반복하는 것이 또한 중요하며, 이는 성장 인자 도메인 상의 부위와의 임의의 잠재적 상호작용이 프로도메인 상호작용에 의존성이라는 것을 암시한다. 더욱이, Ab6 및 인테그린 αVβ6은 잠복 TGFβ1에 동시에 결합할 수 있다. 이러한 관찰은, 항체 결합 영역이 인테그린 인식 부위 (RGD; 도 19b)를 보유하는 TGFβ1 프로도메인 내의 트리거 루프에 대해 원위에 있기 때문에, 인테그린-의존성 TGFβ1 활성화의 알로스테릭 억제 메카니즘을 시사한다. 추가로, 추정 에피토프 영역 1-3 (예를 들어 영역 1 & 2)의 서열 정렬은 3종의 TGFβ 이소형에 걸친 유의한 서열 분기를 밝혀냈으며, 이는 프로TGFβ2 및 프로TGFβ3 복합체 대비 프로TGFβ1에 대한 Ab6의 관찰된 선택성을 설명해줄 가능성이 있다 (도 19b).

실시예 11: TGFB1, TGFB2 및 TGFB3의 상대 발현의 생물정보학적 분석

인간 종양 샘플의 이전 분석은 CBT에 대한 1차 저항성에 대한 중요한 기여자로서 TGFβ 신호전달을 연루시켰다 (Hugo et al. 2016). 이들 연구 중 하나는 요로상피암에서의 TGFΒ1 유전자 발현이 항-PD-L1 처리 비-반응자와 연관된 상위-점수의 TGFβ 경로 유전자 중 하나였다는 것을 밝혀냈으며, 이는 이러한 이소형의 활성이 TGFβ 신호전달을 구동할 수 있다는 것을 시사한다.

암성 종양에서 TGFβ 이소형의 발현을 평가하기 위해, 공중 이용가능한 데이터세트로부터의 유전자 발현 (RNAseq) 데이터를 조사하였다. 더 캔서 게놈 아틀라스 (TCGA)에서 TGFβ 이소형 (TGFB1, TGFB2 및 TGFB3)의 발현을 조사하기 위한 공중 이용가능한 온라인 인터페이스 툴 (파이어브라우즈(Firebrowse))을 사용하여, 정상 및 암성 조직 둘 다에서의 TGFβ 이소형을 코딩하는 RNA의 차등 발현을 먼저 조사하였다. TGFΒ1, TGFΒ2 및 TGFΒ3 mRNA 발현을 인간 암 유형의 집단에 걸쳐서뿐만 아니라 개별 종양 내에서 평가하였다. 정상 조직 비교자가 존재하는 TCGA 데이터베이스에서 모든 종양 RNAseq 데이터세트를 선택하고, TGFB1, TGFB2 및 TGFB3 유전자의 발현을 조사하였다 (도 20a). 파이어브라우즈 인터페이스로부터의 데이터는 백만 킬로염기당 판독물 (RPKM)의 log2로서 나타낸다.

이들 데이터는 대부분의 종양 유형 (회색)에서, TGFB1이 TGFβ 이소형의 가장 풍부하게 발현된 전사체이며, log2 (RPKM) 값은 일반적으로 TGFB2의 경우 0-2 및 TGFB3의 경우 2-4에 비해 4-6의 범위라는 것을 시사한다. 본 발명자들은 또한 여러 종양 유형에서 TGFB1 및 TGFB3 발현 둘 다의 평균 수준이 정상 비교자 샘플 (흑색)에 비해 상승된다는 것을 주목하며, 이는 이들 TGFβ 이소형의 증가된 발현이 암성 세포와 연관될 수 있다는 것을 시사한다. 암 미세환경에서 숙주 면역계를 억제하는데 있어서의 TGFβ 신호전달의 잠재적 역할 때문에, 본 발명자들은 항-PD-1 또는 항-PDL1 요법이 승인되어 있는 암 유형에서 TGFB1 전사체가 상승되었음을 주목하는데 관심이 있었다 - 이들 적응증은 도 20a에서 회색으로 표지되어 있다.

RPKM > 1은 일반적으로 생물학적으로 관련된 유전자 발현과 연관된 최소 값으로 간주된다는 것을 주목하지만 (Hebenstreit et al., 2011; Wagner et al., 2013), 그러나 후속 분석에서, 가양성을 피하기 위해 RPKM (또는 관련 척도 FPKM (문헌 [Conesa et al., 2016] 참조)) > 10 또는 > 30의 보다 엄격한 컷오프를 사용하였다. 비교를 위해, 이들 한계값 3개 모두가 도 20a에 표시되어 있다.

도 20a에서의 큰 사분위간 범위는 개별 환자 중에서의 TGFβ 이소형 발현의 유의한 변동성을 나타낸다. 적어도 환자 집단의 하위세트가 TGFβ1 이소형을 차등 발현하는 종양을 가지고 있는 암을 확인하기 위해, TCGA 데이터세트에서 개별 종양 샘플로부터의 RNAseq 데이터를 분석하여, 백만 킬로염기당 단편 (FPKM)의 수를 계산하였다. RPKM 및 FPKM은 거의 등가이지만, FPKM이 동일한 전사체의 대향 말단에서의 이중-계수 판독물을 교정한다 (Conesa et al., 2016). 전사체의 FPKM 값이 >30인 경우에 종양 샘플을 TGFβ1, TGFβ2 또는 TGFβ3 발현에 대해 양성인 것으로 점수화하고, 각각의 TGFβ 이소형을 발현하는 각각의 암 유형의 환자의 분율 (%로서 표현됨)을 계산하였다 (도 20b).

더 캔서 게놈 아틀라스 (TCGA)로부터의 RNAseq 데이터의 비교 분석은, 3종의 패밀리 구성원 중에서, TGFB1 발현이 대다수의 종양 유형에 걸쳐 가장 우세한 것으로 보였다는 것을 밝혀냈다. 주목할 만한 예외는 유방암, 중피종 및 전립선암이며, 여기서 다른 패밀리 구성원, 특히 TGFΒ3의 발현은 TGFΒ1과 비교하여 적어도 동등하게 우세하다. 도 20b에 제시된 바와 같이, 대다수의 종양 유형은 TGFβ1 양성인 개별 샘플의 유의한 백분율을 제시하며, 급성 골수성 백혈병, 미만성 대 B-세포 림프종 및 두경부 편평 세포 암종을 포함한 일부 암 유형은 모든 종양 샘플의 80% 초과에서 TGFβ1을 발현한다. 도 20a에서의 데이터와 일치하게, 유방 침습성 암종, 중피종 및 육종을 포함한 여러 암이 동등하거나 더 큰 백분율의 TGFβ3 양성인 종양 샘플을 나타내긴 하지만, 소수의 암 유형이 TGFβ2 또는 TGFβ3에 대해 양성이다. 이들 데이터는 암 유형이 TGFβ 이소형 발현에 대해 계층화될 수 있고, 이러한 계층화가 TGFβ 이소형-특이적 억제제로의 치료를 위한 후보인 환자를 확인하는데 유용할 수 있다는 것을 시사한다.

이러한 가설을 추가로 연구하기 위해, 개별 종양 샘플의 하위세트로부터의 log2(FPKM) RNAseq 데이터를 분석하고, FPKM > 30을 반영하는 색상 한계값을 TGFβ 이소형-양성으로 점수화할 최소 전사체 수준으로서 설정하는 히트 맵에 플롯팅하였다 (도 20c). 7종의 CBT-승인된 종양 유형 중에서 개별 종양 샘플에서의 TGFB1 mRNA 발현을 순위화하여 TGFΒ2 및 TGFΒ3과 비교하여 TGFΒ1 mRNA의 더 높고 더 빈번한 발현을 확인하였으며, 다시 주목할 만하게 유방 암종은 제외되었다. 요로상피암에서 이들 및 이전에 공개된 관찰은 TGFβ 경로 활성이 대부분의 인간 종양에서 TGFβ1 활성화에 의해 구동될 가능성이 있다는 것을 시사한다.

각각의 샘플은 히트 맵에서 단일 행으로서 나타내어지고, 샘플은 TGFβ1 발현의 수준에 의해 배열된다 (상단에 가장 높은 발현 수준). 도 20b에서의 분석과 일치하게, 각각의 암 유형에서의 유의한 수의 샘플은 TGFB1 발현에 대해 양성이다. 그러나, 이러한 표현은 또한 많은 종양이, 특히 식도 암종, 방광 요로상피, 폐 선암종 및 피부 흑색종 암 유형에서 TGFB1 전사체만을 발현한다는 사실을 강조한다. 흥미롭게도, 유방 침습성 암종으로부터의 샘플은 TGFB1 양성인 샘플보다 TGFB3-양성인 샘플의 수가 훨씬 더 많은 것으로 나타나기 때문에, 이러한 TGFB1 편중이 모든 암의 특색은 아니다. 그럼에도 불구하고, 이러한 분석은 β1 이소형이 다수의 암 환자로부터의 종양에 존재하는 우세한, 대부분의 경우에 유일한 TGFβ 패밀리 구성원이라는 것을 나타낸다. TGFβ 신호전달이 암 미세환경에서 면역억제에 유의한 역할을 한다는 것을 시사하는 데이터와 함께 종합하면, 이들 발견은 또한 이들 종양의 치료에서의 TGFβ1-특이적 억제의 유용성을 가리킨다.

암 치료제로서 TGFβ1-특이적 억제의 효능을 시험하기 위한 마우스 모델을 확인하기 위해, 마우스 동계 종양 모델에 사용된 다양한 세포주로부터의 RNAseq 데이터에서의 TGFβ 이소형 발현을 분석하였다. 이러한 분석을 위해, 2종의 데이터 표현을 생성하였다. 먼저, 본 발명자들은 각각의 세포주로부터 유래된 종양에 대한 log2(FPKM) 값의 히트 맵을 생성하였다 (도 20d, 좌측). 이러한 분석은 인간 종양 (주로 TGFB1)을 재현할 동계 모델을 확인하기 위해 수행되었기 때문에, 본 발명자들은 주로 가음성을 피하는 것에 관심이 있었고, 본 발명자들은 본 발명자들의 "양성" 한계값을 FPKM>1로, 도 20b 및 도 20c의 표현에서의 것보다 훨씬 낮게 설정하였다.

도 20d에서의 데이터 표현 (좌측)이 명확할수록, MC-38, 4T-1 및 EMT6을 포함한 다수의 동계 종양은 통상적으로 유의한 수준의 TGFβ1 및 TGFβ3 둘 다를 발현한다. 대조적으로, A20 및 EL4 모델은 거의 독점적으로 TGFβ1을 발현하고, S91 및 P815 종양은 TGFB1 발현에 대해 강한 편향을 나타낸다.

TGFB1 대 TGFB2 및/또는 TGFB3의 차등 발현을 추가로 평가하기 위해, log2(FPKM_TGFB1) - log2(FPKM_TGFB2) 또는 log2(FPKM_TGFB1) - log2(FPKM_TGFB3)의 보다 작은 값으로 정의되는 minΔTGFB1을 계산하였다. 각각의 모델에 대한 minΔTGFB1은 도 20d (우측)에 히트 맵으로서 제시되고, 도 20d (좌측)의 결론으로부터 A20, EL4, S91 및/또는 P815 세포주로부터의 동계 종양이 TGFβ1-특이적 억제제의 효능을 시험하기 위한 탁월한 모델을 나타낼 수 있다는 것을 강조한다.

TGFβ2 또는 TGFβ3에 비해 TGFβ1 발현의 CBT에 대한 1차 저항성과의 연관성을 추가로 확인하기 위해, 본 발명자들은 이소형 발현을 선천성 항-PD-1 저항성 시그너쳐 ("IPRES")와 상관시켰다 (Hugo et al., Cell. 2016 Mar 24;165(1):35-44). 간략하게, IPRES는 26종의 트랜스크립톰 시그너쳐의 집합이며, 이는 집합적으로 항-PD-1 요법에 대한 종양 저항성을 나타낸다. IPRES 시그너쳐는 중간엽 이행, 세포 부착, ECM 재형성, 혈관신생 및 상처 치유의 조절에 수반되는 유전자의 상향발현을 나타낸다. 7종의 CBT-승인된 종양 유형에 걸쳐, 본 발명자들은 다른 2종의 TGFβ 이소형의 mRNA 발현보다 TGFB1 mRNA 수준과 IPRES 점수 사이의 양성 및 유의한 상관관계를 더 일관되게 발견하였다 (도 37a). 종합하면, 이들 데이터는 TGFβ1 활성의 선택적 억제가 CBT에 대한 1차 저항성을 극복할 수 있다는 것을 시사한다.

CBT-승인된 요법에 의한 TCGA-정의된 종양 유형에 걸친 IPRES (선천성 항-PD-1 저항성) 전사 시그너쳐의 진세트 변이 분석 (GSVA)은 TGFβ1 RNA 존재비와 가장 강한 및 유의한 상관관계가 있으며 (피어슨 계수), 발현의 존재에 대해 컷-오프는 FPKM ≥ 30이다. 종합하면, 이들 데이터는 TGFβ1 활성의 선택적 억제가 CBT에 대한 1차 저항성을 극복할 수 있다는 것을 시사한다.

CBT-승인된 요법에 의한 TCGA-정의된 종양 유형에 걸친 IPRES (선천성 항-PD-1 저항성) 전사 시그너쳐의 진세트 변이 분석 (GSVA)은 TGFβ1 RNA 존재비와 가장 강한 및 유의한 상관관계가 있으며 (피어슨 계수), 발현의 존재에 대해 컷-오프는 FPKM ≥ 30이다.

TGFβ1 발현과 CBT에 대한 저항성의 상관관계를 추가로 평가하기 위해, TGFβ1 RNA 존재비를 CDT-승인된 요법에 의한 TCGA-정의된 종양 유형에 걸친 플라사리 TGFβ 경로 (선천성 항-PD-1 저항성) 전사 시그너쳐의 유전자 변이 분석 (GSVA)과 비교하였다. 플라사리 진세트를 mSigDB 웹 포털 (http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/index.jsp)로부터 입수하고, 진 세트 점수 계산을 R의 GSVA 패키지를 사용하여 결정하였다 (Hanzelmann et al., BMC Bioinformatics 201314:7, 2013; 및 Liberzon et al., Bioinformatics. 2011 Jun 15; 27(12): 1739??1740). 도 37b에 제시된 바와 같이, GSVA는 TGFβ1 RNA 존재비와 가장 강한 및 유의한 상관관계가 있었으며 (피어슨 계수), 발현의 존재에 대해 컷-오프는 FPKM ≥ 30이었다.

이들 데이터는 TGFβ 경로 활성이 대부분의 인간 종양에서 TGFβ1 활성화에 의해 구동될 가능성이 있다는 것을 시사한다.

하기 자료를 상기 기재된 생물정보학 분석에 사용하였다:

TGF베타 이소형 TCGA 발현 데이터를 UCSC 크세나 브라우저 데이터세트 자료 (https://xenabrowser.net/datapages/)로부터 다운로드하였다. TGF베타 이소형 데이터의 FPKM 값의 분포를 조사함으로써 높은 발현을 결정하기 위한 발현 컷오프를 확인하였다. 그래프패드 프리즘을 사용하여 히트맵 및 산란 플롯을 생성하였다. 플라사리 진세트를 mSigDB 웹 포털 (http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/index.jsp)로부터 입수하고, 진 세트 점수 계산을 R의 GSVA 패키지를 사용하여 결정하였다.

실시예 12: TGFβ1-선택적 억제제는 안전성/독성학 연구에서 ALK5 키나제 억제제 LY2109761 및 범-TGFβ 항체와 비교하여 감소된 독성을 나타낸다.

소분자 TGF-β 유형 I 수용체 (ALK5) 키나제 억제제 LY2109761 및 범-TGFβ 항체 (hIgG4; 중화)와 비교하여 Ab3 및 Ab6의 잠재적 생체내 독성을 평가하기 위해, 안전성/독성학 연구를 래트에서 수행하였다. 이러한 안전성 연구를 위한 종의 선택으로서 래트를 선택하였으며, 이는 래트가 마우스와 비교하여 TGFβ 억제에 대해 더 감수성이라는 이전의 보고서에 기초하였다. 래트에서 관찰된 유사한 독성이 또한 다른 포유동물 종, 예컨대 개, 비-인간 영장류, 뿐만 아니라 인간에서 관찰되었다.

간략하게, 암컷 피셔344 래트 (도 21a 및 21b) 또는 스프라그 돌리 래트 (도 21c)에게 Ab3을 3 mg/kg (1개 군, n=5), 30 mg/kg (1개 군, n=5) 또는 100 mg/kg (1개 군, n=5)으로 투여하거나; Ab6을 10 mg/kg (1개 군, n=5), 30 mg/kg (1개 군, n=5) 또는 100 mg/kg (1개 군, n=5)으로 투여하거나; 범-TGFβ 항체를 3 mg/kg (1개 군, n=5), 30 mg/kg (1개 군, n=5) 또는 100 mg/kg (1개 군, n=5)으로 투여하거나; LY2109761을 200 mg/kg (1개 군, n=5) 또는 300 mg/kg (1개 군, n=5)으로 투여하거나; 또는 PBS (pH 7.4) 비히클 대조군 (1개 군, n=5)을 투여하였다.

범-TGFβ 항체를 받은 동물에게 10 mL/kg의 부피로 1회 정맥내로 (제1일에) 투여하고, 제8일에 희생시키고, 부검을 수행하였다. Ab3 또는 Ab6을 받은 동물에게 10 mL/kg의 부피로 4주 동안 매주 1회 (제1일, 제8일, 제15일 및 제22일에) i.v. 투여하였다. LY2109761을 받은 동물에게 5일 또는 7일 동안 1일 1회 경구 위관영양에 의해 투여하였다. 동물을 제29일에 희생시키고, 부검을 수행하였다.

동물의 일반적 임상 관찰을 1일 2회 수행하고, 투여 후 케이지사이드 관찰을 수행하여 급성 독성을 평가하였다. 수행된 다른 관찰은 음식물 소비의 평가 및 매주 1회 체중의 측정을 포함하였다. 이들은 또한 임상 병리상태 (혈액학, 혈청 화학 및 응고) 및 해부학적 병리상태 (육안 및 현미경) 평가를 포함하였다. 현미경 평가를 위해 부검시에 종합적인 조직 세트를 수집하였다. 조직을 10% 중성 완충 포르말린 중에 보존하고, 트리밍하고, 상용적으로 처리하고, 파라핀에 포매시켰다. 파라핀 블록을 마이크로톰처리하고, 절편을 헤마톡실린 및 에오신 (H&E)으로 염색하였다. 특히, 폐동맥의 평면에 수직인 평면을 따라 종방향으로 양분하여 우방실, 좌방실 및 대동맥 판막을 노출시킴으로써 심장을 트리밍하였다. 두 절반을 포매에 제공하였다. 각각의 심장 반절편을 절단 표면이 아래를 향하게 하여 파라핀에 포매시켰다. 블록을 절편화하여 적어도 3개의 심장 판막을 수득하였다. 조직 절편을 미국 수의학 병리학자 학회 (ACVP)의 공인 구성원에 의해 광 현미경검사로 조사하였다.

표 20 및 도 21에 제시된 바와 같이, ≥3 mg/kg의 범-TGFβ 항체가 투여된 동물은 LY2109761이 투여된 동물에서 기재된 것과 유사한 심장 판막 소견 (즉, 판막증)을 나타냈다. ≥30 mg/kg의 범-TGFβ 항체가 투여된 동물은 LY2109761이 투여된 동물과 유사한 심방 소견을 나타냈다. 100 mg/kg의 범-TGFβ 항체가 투여된 동물은 LY2109761이 투여된 동물에서 기재된 것과 유사한 심근 소견을 나타냈고, 30 mg/kg의 범-TGFβ 항체가 투여된 동물은 심근에서 출혈을 가졌다. 100 mg/kg의 범-TGFβ 항체가 투여된 1마리의 동물은 관상 동맥에서 출혈을 동반한 중등도 벽내 괴사를 가졌으며, 이는 경미한 혈관주위 혼합 염증 세포 침윤과 연관되었다. 범-TGFβ 항체 및 LY2109761이 투여된 동물에서의 골 소견은 육안으로 보이는 비정상적으로 형상화된 흉골 및 현미경으로 보이는 흉골의 종판 및 대퇴골 및 경골의 성장판 내 비대성 구역의 증가된 두께로 이루어졌으며; 이들 소견은 범-TGFβ 항체와 비교하여 LY2109761이 투여된 동물에서 더 높은 발생률 및/또는 중증도를 가졌다.

표 22. 범-TGFβ 항체를 받은 동물에서의 현미경적 심장 소견

도 21a에 제시된 바와 같이, 범-TGFβ 항체가 투여된 동물은 PCT/US2018/012601 (이는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 제시된 바와 같이 LY2109761이 투여된 동물에서 기재된 것과 유사한 독성을 나타냈다. 구체적으로, ≥3 mg/kg의 범-TGFβ 항체가 투여된 동물은 LY2109761이 투여된 동물에서 기재된 것과 유사한 심장 판막 소견 (예를 들어, 판막증)을 나타냈다. ≥30 mg/kg의 범-TGFβ 항체가 투여된 동물은 LY2109761이 투여된 동물에서 기재된 것과 유사한 심방 소견을 나타냈다. 100 mg/kg의 범-TGFβ 항체가 투여된 동물은 LY2109761이 투여된 동물에서 기재된 것과 유사한 심근 소견을 나타냈고, 30 mg/kg의 범-TGFβ 항체가 투여된 동물은 심근에서 출혈을 가졌다. 100 mg/kg의 범-TGFβ 항체가 투여된 1마리의 동물은 관상 동맥에서 출혈을 동반한 중등도 벽내 괴사를 가졌으며, 이는 경미한 혈관주위 혼합 염증 세포 침윤과 연관되었다. 범-TGFβ 항체 및 LY2109761이 투여된 동물에서의 골 소견은 육안으로 보이는 비정상적으로 형상화된 흉골 및 현미경으로 보이는 흉골의 종판 및 대퇴골 및 경골의 성장판 내 비대성 구역의 증가된 두께로 이루어졌다. 도 21b 및 21c에 제시된 바와 같은 LY2109761 및 범-TGFβ를 사용한 후속 연구는 또한 유사한 독성을 입증하였다. 출혈, 내피 증식증, 혼합 염증 세포 침윤 및/또는 기질 증식증으로 인한 심장 판막 비후를 특징으로 하는, TGFβ의 범-억제제로 처리된 동물에서의 관찰된 심장 판막증은, 이전에 보고된 소견과 일치한다.

대조적으로, 범-TGFβ 항체 또는 LY2109761-처리된 동물과 달리, TGFβ1-선택적 억제제, 즉 Ab3 또는 Ab6이 투여된 래트는 이들 연구에서 Ab6 및 Ab3 둘 다의 무관찰 유해 효과 수준 (NOAEL)이 시험된 최고 용량인 100 mg/kg 매주 용량이었다. 도 21b에 제시된 바와 같이, 단지 최소 또는 약간의 심장 판막 소견만이 Ab3으로 처리된 소수의 동물에서 발생하였으며, 이들 소견은 낮은 발생률 (동물 및 동물 내의 심장 판막의 수), 용량 반응의 결여 또는 그에 대한 상관관계 및/또는 공동 골 소견의 결여로 인해 시험 물품-관련 가능성이 없는 것으로 간주되었다. 추가적으로, Ab6으로 처리된 동물에서는 어떠한 소견도 발생하지 않았다 (도 21c).

약동학 분석은 Ab6의 혈청 농도가 4주 동안 100 mg/kg으로 투여된 동물에서 2,300 μg/ml에 도달하였음을 나타냈다. 연구 종결시에 (제29일에) 평균 Ab6 혈청 농도는 100 mg/kg의 최고 평가 용량에 대해 2.3 mg/ml에 도달하였다. 이들 결과는 TGFβ1 활성화의 선택적 억제가 다중 생체내 모델에서 관찰된 치료 효과에 요구되는 것보다 훨씬 더 높은 용량에서 주요 용량-제한 독성을 피하는 것으로 보인다는 것을 시사한다.

요약하면, 래트 (TGFβ 억제에 감수성인 것으로 공지된 종)에서 4주의 기간에 걸쳐 시험된 모든 용량 (3 mg/kg, 30 mg/kg 또는 100 mg/kg)에서의 Ab3 또는 Ab6으로 처리된 동물은 하기 파라미터 중 어느 것에서도 배경에 비해 독성 효과를 나타내지 않았다: 심근변성 또는 괴사, 심방 출혈, 심근 출혈, 판막 출혈, 판막 내피 증식증, 판막 기질 증식증, 심장 판막 내 혼합 염증 세포 침윤, 무기질화, 관상 동맥 내 출혈을 동반한 괴사, 대동맥 근부 내 염증을 동반한 괴사, 심근세포 내 괴사 또는 염증 세포 침윤, 및 판막증. 따라서, TGFβ1 활성화의 이소형-특이적 억제제로의 치료는 놀랍게도 범-TGFβ 억제제 처리 (예를 들어, ALK5 키나제 억제제 LY2109761 또는 범-TGFβ 항체)와 비교하여 유의하게 개선된 안전성 프로파일, 예를 들어 감소된 사망률, 감소된 심장독성 및 감소된 골 소견을 유발하였다.

GLP 독성학 연구를 또한 비-인간 영장류 (시노몰구스 원숭이)에서 수행하여 고친화도, TGFβ1-선택적 억제제인 Ab6의 안전성 프로파일을 평가하였다. 프로토콜은 1주에 30, 100 및 300 mg/kg의 4주 반복 투여, 이어서 4주 회복을 포함하였다.

Ab6은 30, 100 및 300 mg/kg/주에서 내약성이 우수하였다. 주요 및 회복 코호트 둘 다에서 유해한 Ab6-관련 소견은 나타나지 않았다. 범-TGFβ 억제제에서 관찰된 독성 부위인 표적 기관에서 Ab6-관련 소견은 나타나지 않았다 (예를 들어: 심장독성, 증식증 및 염증, 치과적 및 치은 소견 없음).

Ab6 혈청 농도는 300 mg/kg의 5회의 매주 용량 후에 15,600 μg/mL에 도달하였다. 회복 시간의 종료시에, Ab6 혈청 농도 수준은 약 ~2,000 - 3,000 μg/mL로 높게 유지되었다.

이들 데이터에 기초하여, 시노몰구스 원숭이에서의 Ab6에 대한 NOAEL은 300 mg/kg/주이며, 이는 시험된 최고 용량이다.

실시예 13: 종양내 면역 세포에 대한 항-PD-1/Ab3 조합의 효과

이전의 보고는 전임상 동물 모델에서 면역억제된 종양으로부터의 이펙터 T 세포의 배제를 조사하였다.

그러나, 이들 보고서는 대식세포에 대한 통찰은 제공하지 않았다. 면역억제된 동계 종양 모델에서의 대식세포 침윤과 콘텍스트에서의 TGFβ1 억제의 효과의 관계를 평가하기 위해, 상기 실시예 7로부터 30 mg/kg의 항-PD1 및 Ab3으로 처리된 클라우드만S91 종양 샘플에 대해 면역조직화학을 수행하였다 (도 24a-24d 참조).

항-PD1/Ab3 조합을 받지 않은 동물로부터의 대조군 종양 절편에서, 일부 F4/80-양성 세포가 검출되었으며, 이는 종양이 M2-유형일 가능성이 있는 일부 대식세포, 소위 종양-연관 대식세포 또는 TAM을 함유한다는 것을 나타낸다. 비교하면, 항-PD1/Ab3 조합으로 처리된 동물로부터 제조된 절편에서, F4/80-양성 세포 수의 현저한 증가가 종양 내에서 관찰되었다 (도 24a-24c 참조). 항-PD1 단독과 비교하여 항-PD-1/Ab3-처리된 동물에서 F4/80-양성 대식세포에 의한 이러한 광범위한 종양 침윤은 항-PD1 단독이 아닌 조합 처리가 아마도 종양을 침윤한 순환 단핵구의 동원으로 인해 세포의 큰 유입을 유도하였다는 것을 시사한다. 이들 대식세포의 표현형을 확인하기 위해, 항-CD163을 M2 대식세포 마커로서 사용하였다. 도 24d에 제시된 바와 같이, 이들 세포의 대부분은 CD163-음성인 것으로 제시되었으며, 이는 항-PD1/Ab3 조합 처리에 반응하여 종양 내로 동원된 대식세포가 M1-유형이고, 따라서 항종양 하위유형일 것임을 시사한다. 이는 세포독성 세포에 의해 생성된 암 세포 파편을 제거하는 대식세포를 나타낼 수 있고, 아마도 TGFβ1 억제의 직접적인 결과일 것이다.

실시예 14. MBT2 종양에서의 세포독성 세포에 대한 TGFβ1 억제제의 효과

과립 세포외이입은 세포독성 T 세포가 상주 종양 세포에 결속하고 이를 사멸시키는 하나의 메카니즘이다. 활성화시, 과립은 형질 막과 융합되고, 세포독소, 예컨대 퍼포린 및 그랜자임 B를 포함한 그의 내용물을 방출하며, 이는 종양 세포 제거를 유발한다. 추가적으로, CD8 항원 (CD8a)은 T-세포 수용체와의 공동수용체로서 작용하는, 대부분의 세포독성 T 세포 상에서 발견되는 세포 표면 당단백질이다. 따라서, 이펙터 T 세포 활성을 평가하기 위해, 각각 항-PD-1과 조합된 Ab3 또는 Ab6으로 처리된 종양에서 CD8a, 퍼포린 및 그랜자임 B 수준을 측정하였다.

방법

8-12주령 C3H/HeN 암컷 마우스의 측복부에 5x10⁵개 MBT2 종양 세포를 이식하였다. 동물을 처리 개시 전에 40-80mm³의 평균 종양 크기를 갖는 투여 군으로 무작위화하였다. 항-PD1 (RMP1-14)을 10 mg/kg으로 1주 2회 투여하였다. Ab3을 30 mg/kg으로 1주 1회 투여하였다. 투여 8일 후에, 최종 용량 (항-PD1의 3회 총 용량, Ab3의 2회 총 용량) 8시간 후, 동물을 희생시키고, 종양을 절제하였다. Ab6의 경우, 면역 콘텍스쳐를 처리 후 제10일 또는 제13일에 분석하였다. 항-PD-1을 10 mkg으로 매주 2회 투여하였다. Ab6을 10 mkg으로 매주 투여하였다. 종양을 액체 질소 중에서 급속 동결시키고, 크리오프렙(cryoPREP) 임팩터를 사용하여 코바리스 백에서 분쇄하고, RNA를 트리졸/클로로포름을 사용하여 추출하였다. cDNA를 택맨 패스트 어드밴스드 마스터 믹스를 사용하여 생성하고, CDNA를 관심 유전자에 대해 지시된 프라이머 및 프로브와 함께 맞춤 택맨 어레이 카드 내로 로딩하였다. qPCR을 Viia7 써모사이클러 상에서 실행시켰다. CTL 유전자에 대한 발현을 각각의 샘플당 HPRT에 대해 정규화하고, 배수 변화를 항-PD1/Ab3 또는 항-PD1/Ab6 대 항-PD1 단독으로 표현하였다.

결과

항-PD1/Ab3의 조합은 종양 내에서 항-PD1 단독에 비해 항종양 반응과 연관된 CTL 유전자의 강력한 상향조절을 유도하였다 (도 25 참조). MBT2 종양 모델에서, 항-PD1 단독은 종양 성장 및 항종양 면역의 매우 적은 억제를 제공하였다. 따라서, 이들 결과는 항-TGFβ 항체의 첨가가 이펙터 CD8 T 세포의 완전한 활성화 및 침윤을 가능하게 한다는 것을 나타낸다.

실시예 15: 시험관내 Treg 활성에 대한 Ab3 및 Ab6의 효과

방법

피콜을 사용하여 건강한 공여자 버피코트로부터 인간 PBMC를 단리하였다. CD4 세포를 자기 선택을 통해 선택한 다음, CD25⁺CD127^lo Treg를 분류하고, 바이오라드(Biorad) S3E를 사용하여 클론 BC96 (써모피셔(ThermoFisher))을 CD25hi에 사용하고, 클론 HIL 7Rm21 (비디 바이오사이언스(BD Bioscience))을 CD127lo에 사용하였다. 분류된 Treg를 텍스맥스(TexMacs) 배지 (밀테니(Miltenyi))에서 플레이트-결합된 항-CD3 (클론 OKT3, 바이오레전드(Biolegend)) 및 가용성 항-CD28 (클론 28.2, 바이오레전드)로 1주 자극하였다. 일부 연구에서, IL2를 추가적으로 첨가하여 GARP 및 프로-TGFβ 발현을 상향조절하였다. Treg를 셀 트레이스 바이올렛 9 (인비트로젠(invitrogen))으로 염색된 자가 CD4 T 세포와 1:1 공동-배양하고, 다시 5일 동안 항-CD3/항-CD28로 자극하였다. 5일 후, 세포 분열을 유동 세포측정법 (애튠 유동 세포측정기, 써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific))에 의해 측정하고, 셀 트레이스 바이올렛 염료의 희석에 대해 게이팅하고, 플로우조 (비디 바이오사이언스)로 분석하였다.

결과

배양물에서 5일에 걸쳐, 이펙터 CD4 T 세포 (Teff)의 80%가 분열하였다. Treg 1:1의 첨가는 Teff 분열을 거의 15%로 억제하였고, 10 ug/ml의 Ab3의 추가의 첨가는 T-이펙터 분열의 Treg-매개 억제를 완전히 억제하였다 (도 26a 참조). 1 μg/ml Ab3은 Treg 억제를 덜 강력하게 억제하였다. 1 μg/ml 및 10 μg/ml Ab6 둘 다는 Treg-유래 TGFβ를 동등하게 억제하였다. 따라서, Ab6은 Treg 상에서의 GARP-프로TGFβ1 복합체의 TGFβ1 활성화의 보다 강력한 억제제인 것으로 보인다.

실시예 16: MBT2 종양에서 종양내 면역 세포 집단/콘텍스쳐에 대한 Ab6/항-PD-1 조합 처리의 효과

항-PD-1 및 Ab6의 조합으로 처리된 마우스에서 관찰된 종양 퇴행 효과를 매개할 수 있는 다양한 면역 세포 집단의 설명을 시작하기 위해, MBT2 종양 모델을 FACS 연구에 사용하였다. 연구 설계를 하기에 요약한다.

표 23. MBT2 종양 면역 콘텍스쳐 연구 설계

각각의 연구 군은 본원에 기재된 바와 같은 MBT2 종양을 갖는 12마리의 마우스를 함유하였다. Ab6-처리군에게는 항체를 매주 제1일 및 제8일에 10 mg/kg으로 투여하였다. 항-PD1 처리군을 1주에 총 20 mg/kg으로, 제1일, 제4일, 제8일 및 제11일에 주사당 10 mg/kg으로 격주로 처리하였다. 항-PD1 및 Ab6의 IgG 하위유형에 매칭되도록 이에 따라 각각의 대조군 IgG 군을 처리하였다. 제13일에, 종양을 상기 제시된 바와 같이 마우스로부터 수집하였다.

유동 세포측정 분석: 종양-연관 면역 세포 하위세트를 또한 MBT-2 종양에서 종양 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. 간략하게, 종양을 절제하고, 칭량 후에 젠틀MACS의 종양 해리 키트 (밀테니)를 사용하여 해리시켰다. 샘플을 70 μm 세포 스트레이너를 통해 여과하여 임의의 응집체를 제거하였다. 생존 단일 세포를 FACS 완충제로 세척한 후에 다음을 함유하는 염색 칵테일을 적용하였다: 무트루스테인(MuTruStain) FCX (바이오레전드), 항-FcyRIV (바이오레전드), 라이브/데드 (써모피셔), CD45-AF700 클론 30-F11 (바이오레전드), CD3-PE 클론 17A2 (바이오레전드), CD4-BUV395 클론 GK1.5 (비디 바이오사이언시스), CD8-APC-H7 클론 53-6.7 (비디 바이오사이언시스), CD11b-PerCP-Cy5.5 클론 M1/70 (바이오레전드), GR-1-FITC 클론 RB6-8C5 (바이오레전드), FoxP3-APC 클론 FJK-16s (써모피셔), F4/80-PE-대즐 클론 BM8 (바이오레전드), CD206-BV421 클론 C068C2 (바이오레전드). 유동 세포측정법을 애튠 NxT (써모피셔) 상에서 수행하고, 플로우조 (비디 바이오사이언스)로 분석하였다.

MBT2 종양에서의 T 세포 하위집단을 설명하기 위한 게이팅 전략이 도 27a에 제공된다. 처리 시작후 제13일에 수집된 종양에서 측정된 결과가 도 27b에 요약되어 있다. 입증된 바와 같이, 항-PD1과 함께 사용된 Ab6은 종양에서 CD8+ T 세포의 침윤 및 확장을 가능하게 함으로써 면역 배제를 극복할 수 있었다. 구체적으로, 항-PD1/Ab6 조합은 종양내 CD8+ T 세포의 수 (빈도)의 유의한 증가를 유도한 반면, 총 생존 세포의 %CD45+ 세포의 변화는 처리군에 걸쳐 관찰되지 않았다. 항-PD1/Ab6 조합은 Treg의 유의한 증가를 유발하였지만; 그러나, CD8+:Treg 비는 항-PD1 처리에 비해 유의하게 변화되지 않는다.

골수 세포 하위집단을 설명하기 위한 게이팅 전략이 도 28a에 제공된다. 처리 시작후 제13일에 수집된 종양에서 측정된 결과가 도 28b에 요약되어 있다. 제13일 골수 침윤물은 총 면역 세포 (예를 들어, CD45+)의 수가 처리군에 걸쳐 안정하게 유지됨을 나타낸다. 총 골수 세포 (예를 들어, CD11b+, F4/80 ^lo-hi)의 수는 항-PD1/Ab6 처리에 의해 유의하게 변경되었다. 구체적으로, 대조군에서, 골수 분획은 종양에서 대식세포 집단의 거의 75%를 구성하였다. 이러한 분획은 조합-처리군에서 절반 미만으로 감소되었으며, 이는 M2-유형 종양-촉진 대식세포의 수 (빈도)의 현저한 감소, 뿐만 아니라 이 군에서 MDSC 분획의 거의 완전한 제거와 일치하였으며, M1-유형 대식세포는 비교적 변화없이 유지되었다.

골수성 세포 하위집단 중에서, MBT-2 종양-연관 M2 대식세포는 LRRC33의 높은 세포 표면 발현을 나타냈다 (도 28c). MDSC 하위집단은 또한 강한 LRRC33 발현을 나타냈다. MBT-2 종양으로부터 단리된 G-MDSC 하위유형의 대부분 (67.8%)이 세포 표면 LRRC를 발현하였고, 한편 MBT-2 종양으로부터 단리된 M-MDSC 하위유형의 약 1/3이 세포 표면 LRRC33을 발현하였다 (도 28d).

추가로, 항-PD1/Ab6 처리군에서 관찰된 CD8+ T 세포:M2 대식세포의 비의 극적인 증가가 있었다 (도 29c 참조). 종합하면, 데이터는 TGFβ1의 이소형-선택적 억제제가 체크포인트 차단 요법과 함께 사용되는 경우에 종양 면역 배제를 극복하는데 사용될 수 있다는 것을 입증한다. 이는 적어도 부분적으로 종양 환경에서 종양-촉진 대식세포 (M2) 및 면역억제 MDSC를 감소시키면서 CD8+ T 세포 침윤 및 확장을 촉진함으로써 매개될 수 있다. 이들 효과는 각각 TGFβ1의 GARP 아암 및 LRRC33 아암에 의해 매개될 수 있다는 것이 가능하다.

면역조직화학적 분석을 위해, 6마리의 동물로부터의 종양을 절반으로 절단하고 고정하였다. IHC를 위해 절편을 제조하고, 다양한 면역 세포 마커로 염색하였다. 도 30은 제10일 또는 제13일에서의 대표적인 영상을 제공한다. 제시된 바와 같이, 종양 내의 CD8+ T 세포의 빈도의 현저한 증가가 항-PD1/Ab6 조합-처리군에서 관찰되었다 (도 30d). 데이터는 Ab6이 세포독성 T 세포의 침윤 및 확장을 유도함으로써 면역 배제를 극복하기 위해 체크포인트 차단 요법과 함께 사용될 수 있다는 것을 나타낸다. 도 30e는 총 핵의 CD8-양성 세포의 %로서 제시된 IHC 데이터의 정량화를 제공한다. 이 종양 모델에서, 기준선 CD8+ 세포는 거의 존재하지 않았다 (예를 들어, "콜드" 종양). Ab6 단독 또는 항-PD-1 단독으로 처리된 군에서, CD8+의 백분율의 약간의 증가가 관찰되었다 (각각 ~10%). 대조적으로, 조합-처리군에서, 종양 내의 CD8+ 세포의 빈도의 현저한 증가가 달성되었으며, 이는 체크포인트 억제와 조합된 TGFβ1 억제가 면역 배제를 극복함으로써 항종양 효과를 상승작용적으로 도출할 수 있다는 것을 나타낸다. 데이터는 조합이 "면역 배제된" 종양을 "염증발생/핫" 종양으로 효과적으로 전환시킬 수 있다는 것을 시사한다.

MBT2 종양에서 관찰된 면역 반응과 상관관계가 있는 유전자 발현 변화를 확인하기 위해, RNA 발현 분석을 수행하였다. 제13일 MBT2 종양으로부터의 RNA 제제를 qPCR-기반 유전자 발현 분석에 적용하였다. 군당 5-6마리의 동물로부터 제조된 RNA를 연구에 사용하였다. 분석은 나타낸 마커로서 사용된 하기 유전자의 발현 수준을 포함하였다: Ptprc (CD45); Cd8a (CD8 T 세포); Cd8b1 (CD8 T 세포); Cd4 (CD4 T 세포); Cd3e (T 세포); Foxp3 (Treg); Ifng (Th1 면역); Prf1 (CTL 단백질); Gzmb (CTL 단백질); Gzma (CTL 단백질); Klrk1 (NK/CTL); Adgre1 (F4/80 대식세포); Mrc1 (M2 대식세포); Cd163 (M2 대식세포); Cd80 (APC 공동-자극/M1 대식세포); Ptger2 (종양 혈관신생); Nrros (LRRC33); Tgfb1 (면역 관용); 18S (하우스키퍼); 및 Ppib (하우스키퍼).

도 31a-31d는 각각 Ptprc, CD8a, CD4 및 Foxp3의 면역 반응 유전자 발현의 변화를 제공한다. 항-PD1/Ab6 조합 처리는 MBT2 종양에서 이들 전사체의 수준의 유의한 증가를 유도하였다. 이들 관찰은 항-PD1/Ab6 처리가 세포독성 이펙터 단백질, 예컨대 퍼포린 및 그랜자임을 갖춘 CD8+ T 세포의 대규모 유입을 도출한다는 것을 확인시켜 준다.

도 32는 제10일 또는 제13일에 면역 마커 Ifng, Gzmb, Prf1 및 Klrk1의 유전자 발현 변화를 제공한다. 제시된 바와 같이, 이들 마커 유전자의 pPCR 분석은 항-PD-1 및 TGFβ1 억제제의 조합 처리가 종양에서 세포용해 단백질 (그랜자임 B 및 퍼포린), Th1 면역 (IFNγ) 및 CTL/NK 세포 마커 (Klrk1)의 마커의 유전자 발현을 유도한다는 것을 입증한다. 이들 데이터는 항종양 효과를 매개하는 체크포인트 억제 및 TGFβ1 억제의 상승작용적 효과를 지지하는 추가의 증거를 제공한다.

요약하면, 이들 결과는 집합적으로 체크포인트 차단 및 TGFβ1 억제에 의해 도출된 항종양 면역의 강건한 동원을 나타낸다. 구체적으로, 전체 종양-침윤 면역 세포 분획은 처리군에 걸쳐 일정하게 유지되지만, 항-PD-1/Ab6 조합은 a) 종양내 CD8+ T 세포의 유의한 증가 (* P<0.05, 항-PD-1 군 대비 양측 T 검정); b) Treg의 유의한 증가 (* P<0.05), 그러나 CD8+:Treg 비는 변화되지 않음 (n.s., 항-PD-1 대비 유의하지 않음); 및 c) 면역억제 M2 대식세포 및 골수-유래 억제 세포 (MDSC) 집단의 감소에 의해 구동된, 임의의 다른 군과 비교하여 골수 세포의 유의한 감소 (* P<0.05, 항-PD-1 군 대비 양측 T 검정)를 유발한다. 전체 종양 용해물의 정량적 PCR 분석은 CD8 이펙터 유전자의 강건한 증가를 확인시켜 준다. 유사하게, 항-PD-1 및 Ab6의 조합은 종양 덩어리 내의 CD8+ T 세포의 빈도의 현저한 증가를 유도하여, 면역 배제를 극복한다.

TGFβ1 하류 신호전달에 대한 효과를 확인하기 위해, 추가의 면역조직화학적 분석을 수행하여 MBT2 종양에서의 인산화된 SMAD3을 검출하고 국재화하였다. 도 30f에 제시된 바와 같이, 포스포SMAD3은 항-PD-1-처리된 종양 내 혈관 내피 근처에서 풍부화되는 것으로 밝혀졌다. Ab6으로의 처리는 이러한 신호를 폐지하며, 이는 TGFβ1 억제가 종양내 면역 세포 침윤을 촉진할 수 있고, 그에 의해 면역 배제된 종양을 체크포인트 차단에 반응성인 염증발생 종양으로 전환시킬 수 있다는 개념을 지지한다.

항-PD-1-처리된 동물은 종양 혈관계 (CD31 염색; 내피 마커)와 밀접하게 연관된 일부 침윤 CD8+ T 세포를 나타낸다. 조합 처리는 추가의 T 세포 침윤을 지지한다. 혈관 내피에 대한 CD8+ T 세포의 근접성은 T 세포가 종양내 혈관계로부터 종양에 침윤할 수 있다는 것을 시사한다. 종양의 CD8-양성 영역과 CD31-양성 혈관계로부터의 거리 사이의 관계가 도 30g에 제시된다. 히스토그램은 조합 처리 (TGFβ1 억제 및 체크포인트 차단)가 특히 혈관으로부터 떨어진 영역에서 CD8+ 면적의 분율을 증가시킨다는 것을 입증하며, 이는 TGFβ1 억제가 혈관계를 통한 종양 내로의 CD8+ 세포 침윤을 촉진하여, 면역억제를 효과적으로 극복하거나 역전시킨다는 것을 시사한다.

실시예 17: 골수증식성 장애의 MPL 모델에 대한 이소형-선택적 콘텍스트 비의존성 TGFβ1 억제제의 효과

골수섬유증의 전임상 MPLW515L 모델은 이전에 기재되었다 (예를 들어, 문헌 [Wen et al., Nature Medicine volume 21, pages 1473??1480 (2015)] 참조). 간략하게, 수용자 마우스를 치사성으로 방사선조사하고, 후속적으로 W515L에서의 구성적 활성화 돌연변이를 갖는 인간 트롬보포이에틴 수용체 MPL(MPLW515L)이 형질도입된 공여자 골수 세포를 이식한다. 이 모델에서의 수용자 마우스는 2-3주 내에 백혈구증가증, 다혈구혈증 및 혈소판증가증이 발생할 것이다.

골수섬유증의 뮤린 모델에서의 TGFβ1-선택적 억제의 효과를 평가하기 위해, TGFβ1의 고친화도, 이소형-특이적, 콘텍스트-비의존성 억제제 (Ab6)를 MPL^W515L 모델에서 시험하였다. 간략하게, 50만 MPL+ ckit+ 세포를 8-10주령 암컷 BALB/c 마우스 내로 이식하였다. 3주 후, 수용자 마우스에게 10 또는 30 mg/kg/주의 Ab6의 매주 i.p. 주사, 또는 4주 동안 (총 5회 용량) 음성 대조군 IgG (30 mg/kg/주)를 제공하였다. 마우스를 마지막 투여 24시간 후에 희생시켰다.

레티쿨린 염색에 의해 평가된 바와 같이, Ab6의 항섬유화 효과를 평가하기 위해 골수의 조직병리학을 수행하였다. 예비 데이터는 Ab6으로 처리된 동물로부터 취해진 골수 절편이 항섬유화 효과를 보여주었다는 것을 나타낸다. 대표적인 골수 절편의 레티쿨린 염색으로부터 수집된 영상이 도 36a에 제공된다. 레티쿨린 섬유 (대부분 콜라겐 III)의 분명한 감소가 매주 10 및 30 mg/kg의 Ab6을 받은 마우스에서 관찰되었다. 시험된 제2 TGFβ1-선택적 억제제 항체에서 유사하지만 더 적은 정도의 항섬유화 효과가 또한 관찰되었다 (데이터는 제시되지 않음).

병리학자에 의해 수행되는 골수 절편의 섬유증 점수화에 기초한 정량적 분석을 위해, WHO (Thiele J, Kvasnicka HM, Tefferi A et al. Primary myelofibrosis In: Swerdlow SH, Campo E, Harris NL, et al (eds). WHO Classifications of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues 4th edn. IARC Press: Lyon, France, 2008, pp 44-47)에 의해 공개된 분류 시스템을 사용하여 레티쿨린 염색을 점수화하였다. 간략하게, 조직학적 절편을 4-단 시스템 (MF-0, MF-1, MF-2 및 MF-3)을 사용하여 점수화하였다. MF-0의 점수는 정상 골수에 상응하는, 교차점 (크로스오버)이 없는 산재된 선형 레티쿨린을 나타낸다. MF-1의 점수는 특히 혈관주위 영역에서 많은 교차점을 갖는 레티쿨린의 느슨한 네트워크를 나타낸다. MF-2의 점수는 때때로 초점성 콜라겐 다발 및/또는 초점성 골경화증을 갖는, 광범위한 교차점을 갖는 레티쿨린의 미만성 및 조밀한 증가를 나타낸다. MF-3의 점수는 종종 골경화증과 연관된, 광범위한 교차점 및 거친 콜라겐 다발을 갖는 미만성 및 조밀한 레티쿨린을 나타낸다.

섬유증 점수는 도 36b에 제공되며, 이는 대조군 IgG를 받은 동물과 비교하여 Ab6의 용량-의존성 항섬유화 효과를 나타낸다. 좌측 그래프는 제시된 바와 같이 처리 시작시에 높은 질환 부담 (> 50%)을 갖는 동물이 Ab6 또는 대조군 IgG로 처리된 제1 연구 (연구 1)로부터의 섬유증 점수를 나타낸다. 연구를 반복하였다 (연구 2). 상응하는 코호트로부터의 데이터를 합하고, 우측 그래프에 제시하였다 (연구 1 + 2). 30 mg/kg Ab6의 매주 투여는 섬유증을 유의하게 감소시켰다.

동물을 또한 표준 기술을 사용하여 다양한 혈액 파라미터, 예를 들어 골수 이식 후의 전혈구 수 (CBC) (백혈구 (WBC), 혈소판 (Plt), 헤모글로빈 (HB) 및 적혈구용적률 (HCT) 포함)에 대해 평가하였다 (도 36c & 36d). 놀랍지 않게도, 처리 개시 4주 후에, IgG 대조군으로 처리된 MPL 마우스는 WBC 및 Plt의 증가된 수준을 포함한, 골수섬유증의 특징적인 혈액 이상을 나타내는 것으로 보인다. Ab6으로 처리된 동물은 대조군 IgG 동물과 비교하여 WBC, Plt 및 HB 농도의 정상화뿐만 아니라 기준선 대비 변화에 대한 용량-의존성 경향을 나타냈다. 추가로, Ab6-처리된 동물은 대조군 IgG 동물과 비교하여 HCT 농도의 통계적으로 유의한 정상화뿐만 아니라 기준선 대비 변화를 나타냈으며, 여기서 Hct 수준은 4주까지 기준선으로 회복된 것으로 보였다.

실시예 18: EMT-6 동계 유방 암종 모델에 대한 고친화도 TGFβ1 억제제의 효과

유방암은 미국 여성에서 가장 흔한 암이고, 암 사망의 네 번째 주요 원인이다. 도 20d (좌측) 및 도 35에 제시된 바와 같이, EMT6 종양은 TGFβ1을 우세하게 발현하는 많은 종양과는 달리, 유의한 수준의 TGFβ1 및 TGFβ3 둘 다를 발현한다 (예를 들어, TGFβ1 및 TGFβ3이 공동-우성). 면역 배제 및 CBT 저항성에 대한 이들 종양에서의 TGFβ3의 기여는 불명확하였다.

이전에, Ab3 (TGFβ1의 이소형-선택적, 콘텍스트-편향 억제제)은 WO 2018/129329에 기재된 바와 같이, 이 모델에서 종양 성장 및 생존에 대해 부분적 효과를 나타내는 것으로 제시되었다.

이들 연구에서, 이소형-선택적 TGFβ1 억제제 및 이소형-선택적 TGFβ3 억제제의 조합의 효과를 면역 체크포인트 억제제와 함께 EMT6 모델에서 평가하였다. 이 종양은 TGFβ1 및 TGFβ3 이소형 둘 다가 공동-우성이기 때문에, 이러한 조합 요법은 종양 퇴행에서 효능을 나타낼 수 있는 것으로 추론되었지만, 체크포인트 억제제와 함께 이소형-선택적 억제제 단독 (TGFβ1 또는 TGFβ3) 중 어느 하나는 종양 성장을 억제하는데 있어서 부분적 효과를 가져올 것으로 가정되었다.

EMT6 종양을 피하로 이식하였다. EMT6 종양이 30-80 mm³에 도달하였을 때 처리를 시작하였다. 항-PD-1을 10 mkg으로 매주 2회 투여하였다. Ab6을 10 mkg으로 매주 1회 투여하였다. 항-TGFβ3 중화 항체를 30 mkg으로 매주 1회 투여하였다.

반응자는 연구 종료시에 종점 부피의 < 25%의 종양 크기를 달성하는 것으로 정의된다.

놀랍게도, 항-PD-1 항체와 조합되어 사용되는 TGFβ1의 고친화도, 이소형-선택적 억제제인 Ab6이 EMT6에서 체크포인트 억제 저항성을 극복하는데 충분하였다. 도 34a는 종양 성장에 대한 Ab6 및/또는 항-PD-1의 효과를 보여준다. 어느 항체도 단독으로 사용되었을 때 유의한 종양 퇴행을 달성하지 못했다. 그러나, 조합하였을 때에는, 처리된 동물의 50% (10마리 중 5마리)가 유의한 종양 퇴행을 달성하였다 (종점 종양 부피의 25% 이하로의 감소). 이들 데이터는 조합 요법 군에서 완전 반응자 또는 종양 성장 지연에 의해 입증된 바와 같이, 상승작용적 항종양 효능을 나타낸다. 예상외로, TGFβ3의 이소형-선택적 억제제의 첨가는 부가 효과를 가져오지 않았다. Ab6에 의한 TGFβ1 이소형의 억제가 종양내 TGFβ3의 존재 하에서도 항-PD-1에 대해 종양을 감작화시키는데 충분하였다는 관찰은 TGFβ1이 질환-연관 TGFβ 신호전달, 면역 배제 및 CBT에 대한 1차 저항성을 구동하는 이소형이라는 가설을 지지한다.

상응하게, 조합 요법 (TGFβ1 + 항-PD-1)은 항-PD-1 단독과 비교하여 처리된 동물에서 유의한 생존 이익을 달성하였다 (***, P<0.001 로그 순위 검정) (도 34b 참조). 처리 개시 56일 후에, 동물의 60%이 조합군에서 생존한 반면, 다른 처리군에서는 모든 동물이 사멸하였거나 또는 제28일까지 안락사시킬 필요가 있었다.

별개의 연구 (연구 2)는 또한 Ab6 및 항-PD-1의 조합으로 처리된 TGFβ1/3-양성 EMT6 종양을 갖는 동물에서는 생존의 유의한 개선을 나타냈지만, 항체 단독을 사용한 동물에서는 그렇지 않았다 (도 34c). 이 모델에서, 본 발명자들은 처리를 중지하고, EMT-6 무종양 생존자를 투여 없이 6주 동안 추적하였다 (회색 박스). 투여 중지 6주 후에, 완전 반응자는 무종양 상태로 남아있었으며, 이는 다시 반응의 지속성을 입증한다 (도 34c, 우측). 보고된 수는 연구 종료시에 측정가능한 종양이 없는 동물의 수이다. 항-PD-1 단독으로 처리된 동물과 비교하여 조합 처리 (Ab6 + 항-PD-1)의 유의한 생존 이익이 관찰되었다 (도 34d).

실시예 19: 재조합 단백질 발현

관심 cDNA를 함유하는 pTT5 플라스미드 (NRC 캐나다)로 일시적으로 형질감염된 Expi293F™ 세포 (써모 피셔)에서 재조합 단백질을 발현시켰다. Expi293F™ 세포를 프로TGFβ1, 프로TGFβ2 또는 프로TGFβ3을 코딩하는 플라스미드 및 LLC-제시 단백질을 코딩하는 플라스미드로 공동-형질감염시킴으로써 대형 잠복 TGFβ 복합체를 생성하였다. TGFβ-결합 TB3 도메인 및 플랭킹 EGF-유사 도메인을 함유하는 LTBP 단편을 사용하여, 전장 LTBP에 비해 수율 및 단백질 품질을 개선시켰다 (인간 LTBP1의 경우 E873 내지 I1507; 인간 LTBP3의 경우 D866 내지 E1039). LTBP 단편은 정제를 용이하게 하기 위한 C-말단 His-태그를 가졌다. C-말단 His-태그부착된 GARP 또는 LRRC33 엑토도메인을 발현하는 안정한 Expi293 세포주를 제조하였다. 이들 안정한 세포를 프로TGFβ1을 코딩하는 플라스미드로 일시적으로 형질감염시켜 잠복 TGFβ1과의 GARP 또는 LRRC33 복합체를 생성하였다. 소형 잠복 TGFβ 복합체를 N-말단 His-태그 및 세린으로 돌연변이된 대형 잠복 복합체-형성 시스테인 (TGFβ1에서의 C4S, TGFβ2에서의 C5S, 및 TGFβ3 프로도메인에서의 C7S)으로 발현시켰다. 활성 TGFβ 성장 인자는 알앤디 시스템즈(R&D Systems)로부터 구입하였다. 형질감염체를 Expi293™ 발현 배지 (써모 피셔)에서 5일 동안 배양한 후, 조건화 상청액을 수집하였다. 재조합 단백질을 Ni2 + 친화성 크로마토그래피에 이어서 크기-배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 정제하였다. 단백질 품질 및 디술피드-연결된 복합체의 형성을 SDS PAGE 및 분석적 SEC에 의해 확인하였다. Expi293F™ 세포를 관심 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 pTT5 플라스미드로 공동-형질감염시킴으로써 항체를 발현시켰다. 인간 IgG4 및 마우스 IgG1 항체를 단백질 A 포획에 이어서 SEC에 의해 정제하였다. 동물 모델에 사용된 항체의 정체를 질량 분광측정법에 의해 확인하였다.

실시예 20: 동계 마우스 모델

IACUC에 따라 노스캐롤라이나주 모리스빌 소재의 찰스 리버 디스커버리 랩스에서 뮤린 모델을 수행하였다. MBT-2 모델의 경우, 8-12주령 C3H/HeN (찰스 리버) 암컷 마우스를 이소플루란으로 마취시켜 측복부에 피하로 5x10⁵개 MBT-2 종양 세포를 이식하였다. 동물을 모든 군이 동일한 출발 부피 평균 및 범위를 갖도록 40-80 mm³의 평균 종양 부피의 군으로 분배하였다. 클라우드만S91의 경우, 8-12주령 DBA/2 (찰스 리버) 암컷 마우스를 이소플루란으로 마취시켜 측복부에 피하로 50% 마트리겔 중 5x10⁵개 클라우드만S91 종양 세포를 이식하였다. 동물을 모든 군이 동일한 출발 부피 평균 및 범위를 갖도록 평균 종양 부피가 125-175 mm³에 도달하였을 때 군으로 분배하였다. EMT-6 모델의 경우, 8-12주령 암컷 BALB/c 마우스 (찰스 리버)에게 측복부에 피하로 5x10⁶개 EMT-6 종양 세포를 이식하였다. 동물을 모든 군이 동일한 출발 부피 평균 및 범위를 갖도록 30-60mm³의 평균 출발 부피의 군으로 분배하였다. 대조군 HuNeg- rIgG1 또는 항-PD-1 (RMP1-14; 바이오엑셀)을 10 mg/kg으로 1주 2회 투여하였다. Ab6-mIgG1 또는 대조군 항체 HuNeg-mIgG1을 나타낸 용량 수준으로 1주 1회 투여하였다. 모든 항체를 복강내로 투여하였다. 종양 부피를 1주 2회 측정하고, 종양이 1,200 mm³ (MBT-2, EMT6) 또는 2,000 mm³ (클라우드만S91)에 도달하였을 때 또는 궤양화시 동물을 CO₂ 질식에 의해 희생시켰다. 종양 부피를 mm³ = (w² x l)/2로서 계산하였다. 반응자 또는 반응률은 상기 모델에 대한 종점 부피의 25% 이하의 종양 부피로서 정의하였다. 완전 반응은 3회 이상의 연속 측정에 대해 13.5 mm³ 미만의 종양으로서 분류하였다. 무종양 생존자는 연구 종료시에 촉지성 종양을 갖지 않았다. IACUC에 따라 괴사로 인해 희생시킨 동물은 분석으로부터 완전히 제거하였다.

인간 임상 데이터를 재현하는 전임상 약리학 모델의 선택을 위해 3종의 TGFβ 이소형 및 제시 분자의 상대 발현을 고려하였다. MBT-2, S91 및 EMT6에서의 3종의 이소형의 상대 단백질 발현의 ELISA 분석이 도 20g에 제공된다. MBT-2 및 S91 종양 둘 다에서, TGFβ1은 우성 이소형이며, 대부분의 인간 암을 반영한다. EMT-6은 여전히 우세한 TGFβ1 발현을 나타냈지만, 더 적은 정도일지라도 TGFβ3 또한 공동-발현하였으며, 이는 특정 인간 암종에서 관찰되는 것과 더 유사하다.

모든 4종의 제시 분자 (LTBP1, LTBP3, GARP 및 LRRC33)는 MBT-2, S91 및 EMT-6 종양에서 RNA에 의해 발현된다 (도 20h).

실시예 21: LRRC33-프로TGFβ1의 항체-유도된 내재화

본 발명자들은 LRRC33 RNA를 발현하는 세포 유형 중에서, 하위세트만이 세포 표면 상에 LRRC33 단백질을 발현하는 것으로 보인다는 것을 관찰하였다. 본 발명자들은 LRRC33이 형질 막에서의 단백질 트래픽킹에 의해 조절될 수 있는 것으로 가정하였다. 이러한 가능성을 평가하기 위해, 본 발명자들은 내재화 검정을 설계하였다.

세포-표면 LRRC33-프로TGFβ1을 발현하는 Expi293 세포주를 생성하였다. 인큐사이트 시스템을 사용하여, 세포-표면 LRRC33-프로TGFβ1에 대한 Ab6 결합시 LRRC33의 내재화를 측정하였다. 간략하게, 인큐사이트 시스템은 표적이 산성 pH를 갖는 세포내 구획 (예를 들어, 리소솜) 내로 내재화될 때 검출될 수 있는 pH-감수성 검출 표지를 사용한다. LRRC33 및 프로TGFβ1을 발현하는 세포에서 Ab6-결합시 LRRC33-프로TGFβ1의 신속한 내재화가 관찰되었지만 (도 6), Expi293 모 세포주는 그렇지 않았다 (데이터는 제시되지 않음). 여기서 관찰된 내재화는 1차 인간 대식세포 상의 내재화와 유사하였다.

LRRC33-프로TGFβ1 내재화는 Expi293 세포가 Fc 수용체를 갖지 않기 때문에 FcR-매개되지 않는다 (데이터는 제시되지 않음). 이들 결과는 Ab6 결속이 표적 하향조절을 용이하게 할 수 있다는 것을 나타낸다. 이는 질환 부위, 예컨대 TME 및 FME에서의 이용가능한 프로TGFβ1 수준를 감소시킴으로써 생체내 TGFβ1 억제의 추가의 또는 대안적 메카니즘을 제공할 수 있다.

상기 개별 섹션에서 언급된 본 발명의 다양한 특색 및 실시양태는 적절한 경우 필요한 변경을 가하여 다른 섹션에 적용된다. 결과적으로, 한 섹션에 명시된 특색은 적절한 경우 다른 섹션에 명시된 특색과 조합될 수 있다.

관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 기재된 본 발명의 특정 실시양태들에 대한 다수의 등가물을 인식하거나 또는 상용에 지나지 않는 실험을 사용하여 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구범위에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.

SEQUENCE LISTING <110> SCHOLAR ROCK, INC. <120> HIGH-AFFINITY, ISOFORM-SELECTIVE TGFBETA1 INHIBITORS AND USE THEREOF <130> 127036-03520 <140> <141> <150> 62/827,552 <151> 2019-04-01 <150> 62/810,263 <151> 2019-02-25 <150> 62/758,180 <151> 2018-11-09 <150> 62/737,534 <151> 2018-09-27 <150> 62/718,196 <151> 2018-08-13 <150> 62/696,752 <151> 2018-07-11 <160> 200 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <400> 1 000 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 2 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Ser 1 5 <210> 3 <400> 3 000 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 4 Ile Ser Pro Ser Ala Asp Thr Ile 1 5 <210> 5 <400> 5 000 <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 6 Ala Arg Gly Val Leu Asp Tyr Gly Asp 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Met Phe Phe Asn Thr Ser 50 55 60 Glu Leu Arg Glu Ala Val Pro Glu Pro Val Leu Leu Ser Arg Ala Glu 65 70 75 80 Leu Arg Leu Leu Arg Leu Lys Leu Lys Val Glu Gln His Val Glu Leu 85 90 95 Tyr Gln Lys Tyr Ser Asn Asn Ser Trp Arg Tyr Leu Ser Asn Arg Leu 100 105 110 Leu Ala Pro Ser Asp Ser Pro Glu Trp Leu Ser Phe Asp Val Thr Gly 115 120 125 Val Val Arg Gln Trp Leu Ser Arg Gly Gly Glu Ile Glu Gly Phe Arg 130 135 140 Leu Ser Ala His Cys Ser Cys Asp Ser Arg Asp Asn Thr Leu Gln Val 145 150 155 160 Asp Ile Asn Gly Phe Thr Thr Gly Arg Arg Gly Asp Leu Ala Thr Ile 165 170 175 His Gly Met Asn Arg Pro Phe Leu Leu Leu Met Ala Thr Pro Leu Glu 180 185 190 Arg Ala Gln His Leu Gln Ser Ser Arg His Arg Arg 195 200 <210> 151 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 151 Cys Val Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys Asp Leu Gly Trp Lys 1 5 10 15 Trp Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn Phe Cys 20 25 <210> 152 <211> 35 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 152 Cys Val Pro Gln Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ile Val Tyr Tyr Val Gly 1 5 10 15 Arg Lys Pro Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val Arg Ser Cys 20 25 30 Lys Cys Ser 35 <210> 153 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 153 Leu Ala Ser Pro Pro Ser Gln Gly Glu Val Pro Pro Gly Pro Leu 1 5 10 15 <210> 154 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 154 Leu Ala Ser Pro Pro Ser Gln Gly Glu Val Pro Pro Gly Pro Leu Pro 1 5 10 15 Glu Ala Val Leu Ala Leu Tyr Asn Ser Thr Arg 20 25 <210> 155 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 155 Leu Ser Thr Cys Lys Thr Ile Asp Met Glu Leu Val Lys Arg Lys Arg 1 5 10 15 Ile Glu Ala Ile Arg Gly Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg 20 25 <210> 156 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 156 Ala Val Leu Ala Leu Tyr Asn Ser Thr Arg 1 5 10 <210> 157 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 157 Asn Gly Phe Thr Thr Gly Arg Arg Gly Asp Leu Ala Thr Ile His Gly 1 5 10 15 Met Asn Arg Pro 20 <210> 158 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 158 Cys Ser Cys Asp Ser Arg Asp Asn Thr Leu Gln Val Asp 1 5 10 <210> 159 <211> 9 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as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments" <400> 177 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 178 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> source <223> /note="See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments" <400> 178 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 179 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> source <223> /note="See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments" <400> 179 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 180 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments" <400> 180 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 181 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> source <223> /note="See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments" <400> 181 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 182 <211> 6 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: TGFbeta sequence" <400> 182 Leu Ser Lys Leu Arg Leu 1 5 <210> 183 <211> 367 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 183 His His His His His His Leu Ser Thr Ser Lys Thr Ile 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220 Ala Thr Ile His Gly Met Asn Arg Pro Phe Leu Leu Leu Met Ala Thr 225 230 235 240 Pro Leu Glu Arg Ala Gln His Leu Gln Ser Ser Arg His Arg Arg Ala 245 250 255 Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser Thr Glu Lys Asn Cys Cys Val 260 265 270 Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys Asp Leu Gly Trp Lys Trp Ile 275 280 285 His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro 290 295 300 Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr Gln Tyr Ser Lys Val Leu Ala Leu Tyr 305 310 315 320 Asn Gln His Asn Pro Gly Ala Ser Ala Ala Pro Cys Cys Val Pro Gln 325 330 335 Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ile Val Tyr Tyr Val Gly Arg Lys Pro Lys 340 345 350 Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val Arg Ser Cys Lys Cys Ser 355 360 365 <210> 184 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 184 Ser Pro Pro Ser Gln Gly Glu Val Pro Pro Gly Pro Leu Pro Glu Ala 1 5 10 15 Val Leu Ala Leu Tyr 20 <210> 185 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 185 Ser Pro Pro Glu Asp Tyr Pro Glu Pro Glu Glu Val Pro Pro Glu Val 1 5 10 15 Ile Ser Ile Tyr 20 <210> 186 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 186 Ser Pro Pro Glu Pro Thr Val Met Thr His Val Pro Tyr Gln Val Leu 1 5 10 15 Ala Leu Tyr <210> 187 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 187 Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Ala Ser Pro Pro Ser Gln Gly Glu 1 5 10 15 Val Pro Pro Gly Pro Leu Pro Glu 20 <210> 188 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 188 Asn Cys Cys Val Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys Asp Leu Gly 1 5 10 15 Trp Lys Trp Ile His Glu Pro 20 <210> 189 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 189 Asn Cys Cys Leu Arg Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Lys Arg Asp Leu Gly 1 5 10 15 Trp Lys Trp Ile His Glu Pro 20 <210> 190 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 190 Asn Cys Cys Val Arg Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Gln Asp Leu Gly 1 5 10 15 Trp Lys Trp Val His Glu Pro 20 <210> 191 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 191 Arg Lys Asp Leu Gly Trp Lys Trp 1 5 <210> 192 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 192 Lys Leu Arg Leu Ala Ser Pro Pro Ser Gln Gly Glu Val Pro Pro Gly 1 5 10 15 Pro Leu Pro Glu Ala Val Leu 20 <210> 193 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 193 Lys Leu Lys Leu Thr Ser Pro Pro Glu Asp Tyr Pro Glu Pro Glu Glu 1 5 10 15 Val Pro Pro Glu Val Ile 20 <210> 194 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 194 Lys Leu Arg Leu Thr Ser Pro Pro Glu Pro Thr Val Met Thr His Val 1 5 10 15 Pro Tyr Gln Val Leu 20 <210> 195 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 195 Arg Lys Asp Leu Gly Trp Lys Trp Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His 1 5 10 15 Ala Asn Phe <210> 196 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 196 Lys Arg Asp Leu Gly Trp Lys Trp Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr Asn 1 5 10 15 Ala Asn Phe <210> 197 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 197 Arg Gln Asp Leu Gly Trp Lys Trp Val His Glu Pro Lys Gly Tyr Tyr 1 5 10 15 Ala Asn Phe <210> 198 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 198 Val Gly Arg Lys Pro Lys Val Glu Gln Leu 1 5 10 <210> 199 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 199 Ile Gly Lys Thr Pro Lys Ile Glu Gln Leu 1 5 10 <210> 200 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 200 Val Gly Arg Thr Pro Lys Val Glu Gln Leu 1 5 10 <210> 201 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 201 Ser Pro Pro Ser Gln Gly Glu Val Pro Pro Gly Pro Leu Pro Glu Ala 1 5 10 15 Val Leu <210> 202 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 202 Trp Lys Trp Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn Phe 1 5 10 <210> 203 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 203 Pro Gly Pro Leu Pro Glu Ala Val Leu 1 5 <210> 204 <400> 204 000 <210> 205 <400> 205 000 <210> 206 <400> 206 000 <210> 207 <400> 207 000 <210> 208 <400> 208 000 <210> 209 <400> 209 000 <210> 210 <400> 210 000 <210> 211 <400> 211 000 <210> 212 <400> 212 000 <210> 213 <400> 213 000 <210> 214 <400> 214 000 <210> 215 <400> 215 000 <210> 216 <400> 216 000 <210> 217 <400> 217 000 <210> 218 <400> 218 000 <210> 219 <400> 219 000 <210> 220 <400> 220 000 <210> 221 <400> 221 000 <210> 222 <400> 222 000 <210> 223 <400> 223 000 <210> 224 <400> 224 000 <210> 225 <400> 225 000 <210> 226 <400> 226 000 <210> 227 <400> 227 000 <210> 228 <400> 228 000 <210> 229 <400> 229 000 <210> 230 <400> 230 000 <210> 231 <400> 231 000 <210> 232 <400> 232 000 <210> 233 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 233 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 1 5 <210> 234 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 234 Ser Pro Ser Ala Asp Thr 1 5

Claims (14)

1. 용액 평형 적정-기반 검정에 의해 측정시 ≤ 10 nM의 KD로 각각의 하기 항원 복합체에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이며:
   i) 인간 LTBP1-프로TGFβ1;
   ii) 인간 LTBP3-프로TGFβ1;
   iii) 인간 GARP-프로TGFβ1; 및
   iv) 인간 LRRC33-프로TGFβ1;
   여기서 항체 또는 그의 단편은 완전 인간 또는 인간화 항체 또는 그의 단편이고, 여기서 임의로 항체 또는 단편은 KD ≤ 1 nM로 결합하는 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
2. 제1항에 있어서, 복합체의 잠복성 라쏘에 결합하며, 여기서 임의로 성장 인자 도메인의 부분에 추가로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 인간 IgG4 또는 IgG1 하위유형의 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 부형제를 포함하는 조성물.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 TGFβ1 적응증의 치료에 사용하기 위한 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 조성물.
6. 제5항에 있어서, TGFβ1 적응증이 암인 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 조성물.
7. 제5항에 있어서, TGFβ1 적응증이 골수섬유증인 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 조성물.
8. 제6항에 있어서, 대상체가 암 요법에 불량하게 반응성이며, 여기서 임의로 암 요법은 체크포인트 억제 요법, 화학요법 및/또는 방사선 요법인 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 조성물.
9. 제8항에 있어서, 치료가 체크포인트 억제제, 화학요법 및 방사선 요법 및/또는 암 백신으로 이루어진 군으로부터 선택된 추가의 암 요법과 함께 제4항의 조성물의 투여를 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 조성물.
10. i) KD ≤ 1 nM로 각각의 인간 LTBP1-프로TGFβ1, 인간 LTBP3-프로TGFβ1, 인간 GARP-프로TGFβ1 및 인간 LRRC33-프로TGFβ1 복합체에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하는 단계;
    ii) 생체내 효능 연구를 수행하여 TGFβ1-편향 발현을 포함하는 전임상 모델에서 효능을 달성하는데 효과적인 항체의 양을 결정하는 단계;
    iii) TGFβ 억제에 감수성인 것으로 공지된 전임상 모델에서 독성학 연구를 수행하여 항체의 최대 허용 양 및/또는 최소 독성 양을 결정하는 단계; 및
    iv) 단계 (ii) 및 (iii)에 기초하여, 충분한 치료 범위가 수득되는 경우 항체를 치료 후보로서 선택하는 단계
    를 포함하는, 치료 용도에 적합한 이소형-선택적 TGFβ1 억제제를 스크리닝하는 방법.
11. 제10항에 있어서, 단계 (ii)의 효능을 달성하는데 효과적인 양이 약 1 내지 30 mg/kg인 방법.
12. 제10항에 있어서, 단계 (iii)의 최대 허용 양 또는 최소 독성 양이 적어도 100 mg/kg인 방법.
13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 범위가 적어도 6배인 방법.
14. i) 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 선택된 항체를 제공하는 단계; 및
    ii) 항체를 이소형-선택적 TGFβ1 억제제를 포함하는 제약 조성물로 제제화하는 단계
    를 포함하는, 제약 조성물을 제조하는 방법.

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