CN114236137A - 一种转化生长因子β的体外检测试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞因子检测领域，尤其涉及一种转化生长因子β的体外检测试剂盒及其应用。本发明将TGF‑β信号通路的下游响应元件(CAGA)12和荧光报告基因EGFP构建到pGL3‑basic载体中得到了pGL3(CAGA)12‑EGFP报告基因质粒，然后将所述报告基因质粒稳定转染至Expi293F细胞后筛选获得了(CAGA)12‑EGFP单克隆报告基因细胞系。进一步的，以该单克隆报告基因细胞系为基础，本发明中同时建立了标准化的检测参数指标和检测流程，为活性TGF‑β含量的体外检测及其相关的疾病和药物研究提供了一种高灵敏度、高特异性、低成本同时操作更加简便、信号更加稳定的新型检测方法。

Description

一种转化生长因子β的体外检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及细胞因子检测领域，尤其涉及一种转化生长因子β的体外检测试剂盒及其应用。
背景技术
转化生长因子-β(Transforming Growth Factor Beta，TGF-β)是一种在体内广泛表达的、具有多种重要生理功能的细胞因子。它们在细胞的增殖、分化、发育和凋亡以及机体的免疫调节、组织稳态平衡中都具有非常重要的作用，其与癌症、纤维化疾病、心血管疾病以及免疫疾病等多种疾病都密切相关。人体血清和组织中TGF-β的水平是肿瘤、纤维化以及多种自身免疫疾病的临床检测、诊断以及治疗预后监测的重要标志物。另外，TGF-β信号通路也是各种疾病治疗的重要药物靶点，近些年，TGF-β与PD-L1/PD-1的双特异性抗体以及单克隆抗体药物的联合用药成为了当下免疫治疗领域的重点研究方向之一。因此，在疾病的临床诊断以及预后评估、相关药物的筛选以及药效评估研究中，能够精准测量样本中活性TGF-β的含量以及评估TGFβ拮抗剂的效力就尤为重要。
哺乳动物体内有三种TGF-β亚型：TGF-β1、β2和β3，它们在体内都以前体肽(pro-peptide)的形式合成，后经Furin蛋白酶切割后被分泌到胞外，被不同的锚定蛋白(如GARP/LRRC33/LTBP等)呈递到细胞表面或储存在细胞外基质中，然后在一定条件下(如由整合素特异性介导)被激活并释放成熟的TGF-β生长因子二聚体，进而与TGF-β受体结合后开启下游信号通路。成熟的TGF-β生长因子结合细胞表面的II型受体(TGF-βtypeⅡreceptor，TβRⅡ)二聚体之后再结合细胞表面Ⅰ型受体(TGF-βtypeⅠreceptor，TβRⅠ)二聚体形成四聚体受体复合物，Ⅰ型受体被Ⅱ型受体磷酸化后激活SMAD以及非SMAD信号通路(PI3K、MAPK等)从而调控多种下游基因的表达。
在TGFβ-SMAD信号通路中，SMAD蛋白在信号从细胞外传递至细胞内的过程中起到关键性作用。具体的，TGF-β受体复合物磷酸化SMAD2、3后，SMAD4与磷酸化的SMAD2/3(pSMAD2/3)形成复合物后进入细胞核，与被调控基因上游的SMAD反应元件(SMAD-responsive element，SRE)结合并且调控下游相关基因的表达，而现有的TGF-β的检测方法也是基于此设计的：
(1)水貂肺上皮细胞(Mink lung epithelial cell，MLEC)荧光素酶报告基因系统。人血纤维溶酶蛋白原激活抑制剂1(human plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)是一个能够严格被TGF-β调控的蛋白，因此，有实验室将PAI-1的启动子融合在荧光素酶报告基因的上游从而构建了荧光素酶报告基因质粒，稳定转染了该质粒的水貂的肺上皮细胞(MLEC)就可以检测出待测样本中活性TGF-β的含量。具体的，待测样本中的TGF-β激活SMAD信号通路后就会启动下游荧光素酶报告基因的表达，进而使反应体系中的底物荧光素被荧光素酶氧化而发出荧光，可以通过酶标仪检测其强度进而反映出待测样品中活性TGF-β的含量。
(2)(CAGA)12-Luc荧光素酶报告基因体系。在上述MLEC报告基因系统中，由于其他生长因子例如血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)也能够诱导PAI-1驱动下游荧光素酶基因的表达，所以基于PAI-1启动子的MLEC荧光素酶报告基因检测方法特异性较低；后续有研究人员在PAI-1基因的启动子区域中鉴定出一段短的重复序列可以与SMAD3直接相互作用从而实现对其下游基因的调控，这个重复序列被命名为CAGA盒(CAGA box)，即(CAGA)12。有实验室以pGL3-Basic质粒(Promega)为基础，同样以荧光素酶作为报告基因，将(CAGA)12作为TGF-β信号通路的特异性响应元件插入到启动子上游，待测样本中的TGF-β启动SMAD信号通路进而启动下游荧光素酶报告基因的表达，同样也可以通过酶标仪检测系统中的发光强度来反映出待测样品中活性TGF-β的含量。
以上两种是目前基于TGFβ/SMAD信号通路检测样品中TGFβ含量主要使用的方法，但是，这两种方法仍有如下诸多缺点：①背景程度较高。两种荧光素酶报告基因体系在培养细胞时都需要使用含有血清的细胞培养基，而血清中含有的包括TGF-β在内的各种生长因子以及其他干扰成分会给实验数据带来较高的背景，极大地降低了实验的灵敏度和数据的准确性。同时，血清是天然成分制备而成的，不同品牌的血清中成分有一定程度上的区别，甚至同种品牌不同批次的血清成分也有一定差别，这就严重影响了实验数据的稳定性和可重复性。虽然有文献报道在进行检测前24小时将含有10％胎牛血清(FBS)的培养基换成含有0.5％FBS的培养基，或者用0.1％的BSA替代FBS处理细胞，但实验数据的背景依然较高，而且细胞的生长状态会因此受到影响，也会影响数据的准确性。②数据内涵较低。因为荧光素酶是胞质蛋白，所以，如果将荧光素酶氧化荧光素后发出的荧光强度作为活性TGF-β含量的测定依据，那么就需要实验中将细胞裂解释放出荧光素酶才可以催化荧光素发光。因此该方法只能检测到裂解细胞这个单一时间点的数据，不能充分反映TGF-β下游信号通路的激活程度随时间的动态变化，数据内涵较低。③实验操作步骤复杂繁琐、结果可重复性较差。本实验中由于需要裂解细胞才能使荧光素酶与底物发生反应，所以实验步骤复杂而繁琐，实验结果也因此会受到细胞的培养状态、细胞的裂解效率、实验操作的精度等一系列因素的影响，同时也很容易因为这些因素而导致实验数据的误差较大、准确性和可重复性都较低。同时，由于荧光素酶的半衰期较短(一般约为30min)，而且检测时的工作液在每次实验时需要现配现用而且配置后不能长期保存，所以在实验中就要求实验人员加完底物后必须在较短时间内完成全部的检测流程，这就对实验人员的操作熟练程度也提出了较高要求，对实验的顺利完成带来一定限制。④实验成本较高。在荧光素酶报告基因系统中，由于每次实验需要设置不同浓度梯度，而且每种浓度至少3个重复，以96孔板为单位进行检测时说明书要求96孔板中底物的体积至少在100ul，所以单次实验的底物成本平均在>200元/96孔板，实验成本较高。
(3)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒。此类试剂盒一般用于体外定量检测血清、血浆、组织、细胞上清以及相关体液样本中活性TGF-β的含量，其有效检测范围在3pg/ml-2000pg/ml之间不等。目前应用较为广泛的是用双抗夹心法测定样本中活性TGF-β的含量，其检测原理是将特异性抗体包被在96孔板中，通过酶标仪检测二抗的发光强度从而确定待检测样本中TGF-β的浓度，该试剂盒存在以下几点不足：①特异性有待提高。该试剂盒对于TGF-β生长因子，以及无活性的TGF-β前体复合物存在交叉反应性，那么在某些特定的待检测样品，如血清和血浆中TGF-β多数以前体的形式存在，因此交叉反应会导致样本中活性TGF-β含量测量的不准确性。②实验成本较高。由于特异性抗体制备成本较高，同样以96孔板为单位进行检测，每个96孔的ELISA平板的价格在1000-3000元之间，不适合应用于高通量大规模的检测，例如TGF-β相关抗体药物的大规模筛选；而且试剂盒有保质期限，不适宜长时间存储。
发明内容
本发明的目的就在于克服现有技术的不足，提供一种更加简便、稳定、低成本的转化生长因子β的体外检测方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：提供一种单克隆报告基因细胞系，为了构建所述细胞系，首先我们将TGF-β信号通路的下游响应元件(CAGA)12和荧光报告基因EGFP构建到pGL3-basic质粒中得到了pGL3(CAGA)12-EGFP报告基因质粒，然后将所述报告基因质粒转染至Expi293F细胞后筛选得到了稳定转染的(CAGA)12-EGFP单克隆报告基因细胞系。
本发明同时提供一种用于检测活性TGF-β含量的体外检测试剂盒，所述试剂盒中包括所述的单克隆稳转细胞系以及相应的标准化实验参数和操作流程说明书。
本发明同时提供一种体外检测活性TGF-β含量的方法，所述方法为利用所述的单克隆报告基因细胞系或所述的体外检测试剂盒对TGF-β进行含量检测的方法。
作为本发明所述体外检测方法的优选实施方式，所述体外检测方法中全程使用无血清、固定化学成分的Freestyle培养基进行接种和测试，而且最佳细胞接种数为2万个细胞每孔。
作为本发明所述体外检测方法的优选实施方式，所述体外检测方法的线性检测范围为0.01ng/ml～1.5ng/ml。
作为本发明所述体外检测方法的优选实施方式，所述体外检测方法具体参数为：酶标仪检测，荧光强度；检测类型：终点/动力学；光学元件类型：单色器；激发：480nm；发射：507nm；光学元件位置：底部；增益：100。
本发明同时提供所述单克隆报告基因细胞或所述的体外检测试剂盒在制备癌症、纤维化疾病、自身免疫病、炎症性疾病、骨骼肌肉疾病、心血管疾病、神经系统疾病、代谢功能障碍、发育障碍以及与TGFβ信号通路相关的疾病的临床诊断或预后监测的试剂盒中的应用。
本发明同时提供所述单克隆报告基因细胞或所述的体外检测试剂盒在筛选以TGF-β为靶标的药物筛选以及药物的药效评估试剂盒中的应用。
本发明还提供所述单克隆报告基因细胞或所述的体外检测试剂盒在研究TGF-β相关的基础科学研究中的应用。
本发明的有益效果：
本发明以Expi293F细胞为基础，利用TGF-β信号通路的响应元件(CAGA)12和EGFP报告基因构建了一个无需血清培养的、稳定转染的单克隆报告基因细胞系，并且形成了标准化的操作流程和参数指标，检测体系成熟稳定且重复性高，为活性TGF-β含量的体外检测提供了一种高灵敏性、高特异性、低成本同时更加简捷、更加稳定的新型检测方法。本发明具有以下优点：
(1)避免了实验过程中因使用血清而带来的对实验背景和实验数据的干扰Expi-293F细胞系可以全程在无血清的培养基中生长并且长势良好，所以我们利用Expi-293F细胞系构建的报告基因检测体系在使用时可以彻底避免血清中包括TGF-β在内的各种生长因子以及不确定成分的干扰，同时也避免了各种不同品牌的血清甚至是同一品牌不同批次的血清在实验中带来的误差，最大程度上降低了实验过程中因使用血清而带来的对实验背景和实验数据的干扰，极大地提高了该检测体系的灵敏度和准确度。
(2)增加了实验操作的简便性和测量结果的稳定性
本发明在该体系中选用了增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescentprotein，EGFP)作为报告基因，其原因如下。首先，使用EGFP作为报告基因可以实现荧光显微镜的可视化观察，更加简单直观；其次，由于EGFP较为稳定(半衰期长)且信号较强(在同等条件下的信噪比比普通的绿色荧光蛋白GFP能够提高5倍以上)，我们也可以实现通过酶标仪进行精准量化检测。另外，相比于荧光素酶试剂盒，EGFP荧光的检测不需要添加底物，极大地降低了实验操作的复杂程度，使实验流程更加简单、方便。我们对该检测体系进行了严格的条件优化，形成了标准化的操作流程及参数指标，也更加增加了实验的可重复性和结果的稳定性。
(3)能够获得高内涵的动态检测数据
EGFP对细胞无毒性且较稳定，不需裂解细胞即可观察到荧光信号并且可以通过酶标仪等通用设备量化荧光信号，因此可以对TGF-β激活下游信号通路的整个过程进行持续的观察与量化，而不是在某单个时间点裂解细胞后获得单点数据。通过增加数据的时间维度，首次实现了对活性TGF-β含量检测的时间特性的记录，极大地提高了数据的内涵和实验数据的准确性。
(4)降低实验成本
本发明中不需要进行细胞裂解以及添加显色底物，极大地降低了实验成本，每96孔板检测的成本约为40元左右。
附图说明
图1为pGL3(CAGA)12-EGFP报告基因系统构建原理及检测流程的示意图。
图2为经过四轮流式分选富集EGFP阳性细胞群。
图3为Expi293F-(CAGA)12-EGFP单克隆诱导效率的检验(左：第一代；右：第十代)。
图4为pGL3(CAGA)12-EGFP报告基因系统最佳接种细胞数的测定；其中，A：不同接种密度下使用不同浓度TGF-β1刺激荧光强度随时间变化的曲线图；B：不同接种密度下，A中不同浓度TGF-β1刺激荧光-时间的曲线在单一时间点的曲线下面积与浓度拟合的标准曲线；C：1万/组和2万/组的灵敏度测试(对TGF-β1的刺激产生响应的最低TGF-β1浓度)
图5为pGL3(CAGA)12-EGFP报告基因系统有效检测区间范围的测定结果图。
图6为pGL3(CAGA)12-EGFP报告基因系统特异性的测定结果图。
图7为传统(CAGA)12-Luc荧光素酶报告基因系统测定不同品牌血清对标准曲线的影响结果图。
图8为pGL3(CAGA)12-EGFP报告基因系统在前体激活机制研究中的应用示例。
具体实施方式
为更清楚地表述本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步说明，但不能用于限制本发明，此仅是本发明的部分实施例。
本发明中建立了一种用于体外活性TGF-β含量检测的高灵敏性、高特异性、低成本同时更加简捷、更加稳定的新型报告基因细胞系，该细胞系不仅能够为TGF-β含量的体外检测提供一个直观的、稳定的检测方法，实验操作更加简单、实验数据更加可靠，同时也能在最大程度上减少了现有技术因为细胞培养中需要加入血清带来的对实验背景的干扰。
本发明构建了pGL3(CAGA)12-EGFP报告基因系统，该报告基因系统的具体构建原理及检测流程如下图1所示：本发明中我们将TGF-β信号通路的下游响应元件(CAGA)12和荧光报告基因EGFP构建到pGL3-basic质粒中得到了pGL3(CAGA)12-EGFP报告基因质粒，然后将构建好的pGL3(CAGA)12-EGFP报告基因质粒转染至Expi293F细胞，最终获得稳定转染的单克隆(CAGA)12-EGFP报告基因细胞系。这样，待测样品中的TGF-β就可以通过TGFβ-SMAD信号通路结合激活SMAD结合元件(CAGA)12后激活启动子下游EGFP报告基因的表达，因为EGFP的半衰期长、较为稳定，而且实验中既不需要裂解细胞也无须加入额外的底物，所以，表达了EGFP的细胞不仅可以利用荧光显微镜实现较长时间(0-72h)的实时动态观测，还能直接通过多功能酶标仪实现数据的记录以及定量分析。
相比荧光素酶报告系统，本发明建立的pGL3(CAGA)12-EGFP报告基因系统不仅为活性TGF-β的体外检测提供了一种更加简便、精准的检测方法，也能使检测数据获得更高的内涵，极大地方便了数据的获得和分析。另外，在本发明中使用的Expi293F细胞是一种来源于人类HEK293细胞的可以适应高密度、无血清、悬浮生长的细胞系。所以，利用Expi293F细胞构建的(CAGA)12-EGFP报告基因细胞系可以最大程度地避免现有检测方法中因为使用血清而给实验数据带来的干扰，在极大地降低了实验背景的同时也最大程度提高了实验数据的灵敏性、稳定性和可靠性。
总之，本发明构建的pGL3(CAGA)12-EGFP报告基因系统不仅为基础科研也为临床检测提供了一种更加简便的、精准的、灵敏的、稳定的以及高内涵的TGF-β动态定量检测方法。
实施例1稳定转染单克隆细胞系的筛选与鉴定
(1)我们以pGL3-basic质粒为基础，在BglII和XbaI酶切位点中间插入了(CAGA)12重复序列和EGFP基因，从而得到了pGL3-(CAGA)12-EGFP报告基因质粒。
(2)载体构建完成后，通过阳离子聚合物转染试剂聚乙烯亚胺(Polyethylenimine，PEI)将构建好的质粒瞬时转染到人的Expi-293F细胞系中，全程使用完全确定化学成分的Freestyle培养基进行培养。然后，通过流式分选的方法富集表达了EGFP的细胞群。具体的，对瞬时转染约10天后的细胞进行TGF-β1(2ng/ml)的给药刺激，在刺激48h后利用EGFP的荧光进行流式分选(FITC通道，488nm激发)。将此次分选富集到的成功表达EGFP的细胞继续培养扩增，在扩增至10cm细胞培养盘后分别用同样的方法进行了第二轮、第三轮和第四轮的流式分选，第四轮流式分选时EGFP阳性细胞群比率已经达到39.6％(如图2)。
(3)用96孔板极限稀释法得到(CAGA)12-EGFP稳定转染单克隆细胞株，并通过流式细胞仪对这些单克隆细胞株进行诱导效率的鉴定以及传代稳定性的检测。具体的，将第四轮分选富集的(CAGA)12-EGFP多克隆细胞收集并扩增培养，通过极限稀释法稀释至96孔板后，经过连续3周的观察、培养与筛选，将96孔板中得到的单克隆(16个)逐步扩增至12孔板后用流式细胞仪分别检验其第一代和第十代在加入TGF-β1(2ng/ml)刺激后的信噪比(其中8个单克隆的检验结果如图3)，即通过计算阳性组(用2ng/ml TGF-β1处理48h)与阴性组(未处理)细胞群总体平均荧光强度的比值，挑选出响应最强、背景最低且灵敏度最好的稳转3号单克隆，传代10次后3号单克隆细胞依然是信噪比最高的细胞株，所以下一步将3号单克隆扩增并冻存用于后续的实验。
实施例2新型(CAGA)12-EGFP报告基因系统的参数优化和方法建立
(1)(CAGA)12-EGFP报告基因系统最佳接种细胞数的优化
在得到3号单克隆细胞系(以下称为(CAGA)12-EGFP稳转单克隆细胞系)后，为了确定检测TGF-β含量时的最优细胞接种密度，我们利用得到的稳转单克隆细胞系测试了不同接种密度对TGF-β含量检测的影响。
具体的，先在96孔板中接种了4种不同密度(1/2/3/4万每孔)的(CAGA)12-EGFP稳转单克隆细胞，然后将TGF-β1从2ng/ml开始进行2倍梯度稀释，共稀释8种浓度梯度，将稀释好的不同浓度梯度的TGF-β1对不同密度的细胞进行刺激，刺激后每隔8h用酶标仪检测并记录其荧光强度，连续监测72h，我们通过增加数据的时间维度，首次实现了对活性TGF-β含量检测的时间特性的记录。检测结果如图4A)所示，可以看出，细胞密度过大(3万、4万组)会影响细胞生长状态，使其荧光信号值在24-32h就快速到达平台期；将不同细胞密度组单一时间点的每条浓度曲线的曲线下面积(AUC)与TGF-β1的浓度进行二次拟合后得到各自相应的标准曲线，即图4B)中可以看出细胞加药刺激后的24h内细胞状态不佳，数据稳定性差，所以3/4万组的有效检测窗口期较短，且不便于长时间检测其动态变化。此外，接种密度过小(1万)会降低检测方法的灵敏性，如图4C)所示，将1/2万组每条浓度曲线72h的曲线下面积(AUC)与TGF-β1的浓度进行二次拟合后得到两条标准曲线，从标准曲线上我们就可以看出1万组的检测灵敏度为0.1ng/ml，而2万组的灵敏度则为0.01ng/ml，比前者高出约10倍。所以综上所述，我们选择了2万个细胞作为该报告基因系统的最佳细胞接种数。
其中，检测方法(下同)：酶标仪检测(Synergy H1，BioTek)，荧光强度；检测类型：终点/动力学；光学元件类型：单色器；激发：480nm；发射：507nm；光学元件位置：底部；增益：100。
(2)(CAGA)12-EGFP报告基因系统有效检测区间范围的确定及标准曲线的准确性验证
在确定了报告基因系统的最佳接种细胞数(2万/孔)后，我们进行了有效检测区间范围的测定和标准曲线的准确性验证。
首先，用此密度接种稳转单克隆细胞于96孔板后，用最高浓度为100ng/ml的TGF-β1进行2倍梯度、共计16种浓度梯度的稀释，将稀释好的不同浓度梯度的TGF-β1对细胞进行刺激，并每隔8h分别用酶标仪检测一次其荧光强度，连续监测72h，结果如图5所示。实验结果显示该系统有效的线性检测范围在0.01ng/ml至1.5ng/ml之间，然后将每条浓度曲线的曲线下面积(AUC)与TGF-β1浓度进行二次拟合得到相应的标准曲线。与传统的终点法获得单点数据相比，新型报告基因系统极大地提高了数据内涵。
同时，为了验证标准曲线的准确性，我们在得到标准曲线之后，在有效线性范围内设计了3个曲线外的浓度进行了反向验证，即用1ng/ml、0.5ng/ml、0.048ng/ml的TGF-β1进行刺激，然后得到了三条随时间变化的荧光曲线(见图5中左图面积为深灰色的曲线)，计算出其曲线下面积后，用标准曲线(见图5中右图，其中标注三角形的点为反向验证点)反向拟合计算出相应的浓度，其误差值(％)分别如下表1所示，证明了该检测体系具有较高的准确性。
表1.pGL3(CAGA)12-EGFP报告基因系统标准曲线的准确性验证
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实施例3新型(CAGA)12-EGFP报告基因系统的优势
(1)(CAGA)12-EGFP报告基因系统的特异性检测
在确定了(CAGA)12-EGFP报告基因系统在测定TGF-β含量时的最佳接种细胞数和有效测量区间后，我们对该报告基因系统进行了特异性的检测，即测定该系统对于TGF-β其他亚型以及其他常见细胞因子的刺激是否会产生响应。
将该稳转单克隆细胞以2万/孔接种于96孔板，用TGF-β1/2/3(1ng/ml)、TNF-α(100ng/ml)、EGF(100ng/ml)、IL-6(100ng/ml)、IFN-γ(100ng/ml)分别进行刺激，并在刺激后48h用酶标仪进行检测，检测结果如图6所示，可以看到该细胞系只对TGF-β1及其亚型(TGF-β2/3)具有高度的特异性而对于其他常见的细胞因子无响应，说明该报告基因细胞系对TGF-β具有较高的特异性，可以应用于体外TGF-β含量的检测。
(2)(CAGA)12-EGFP报告基因系统与传统(CAGA)12-Luc荧光素酶报告基因系统的比较
传统的(CAGA)12-Luc荧光素酶报告基因系统中所用的MLEC细胞以及HEK293细胞需要在含有血清的条件下培养，然而不同品牌血清甚至同一品牌不同批次的血清成分都会有很大差别，会对检测结果的准确度和重复性造成很大程度的影响。所以，我们测试了7种不同品牌(Vistech,Corning,PAN,Hyclone,Gibco,Cegragen,Biowest)的血清对于(CAGA)12-Luc荧光素酶报告基因系统的影响，结果如图7所示。
实验的具体步骤如下：我们将(CAGA)12-Luc稳定转染细胞系按1.5万个细胞/孔的密度用完全生长培养基(DMEM+10％不同品牌的胎牛血清FBS)接种于96孔板(100ul/孔)，待细胞贴壁约3h后，弃去旧培养基并用200ul PBS清洗一次。同时，TGF-β1从10ng/ml开始进行3倍梯度用无血清培养基(DMEM+0.1％BSA)稀释，共稀释12种浓度梯度后进行给药刺激，在刺激24h后用酶标仪检测不同组别的荧光信号强度。
检测方法：酶标仪检测(Synergy H1,BioTek)，振板：线性-2s，延迟：8s，检测：荧光-发光光计，增益：135。
由此可见，不同血清测得标准曲线的EC50差异较大，实验结果的一致性较差，说明血清确实对传统(CAGA)12-Luc荧光素酶报告基因系统的检测结果影响较大；此外，由于荧光素酶试剂盒的操作步骤繁琐，在实验操作过程中由于细胞裂解效率、加样精度、检测过程等都会对实验结果造成影响，导致最终检测结果的重复性较差，准确性不高(如图7，每个数据点的误差以error bar标示三次重复实验数据的标准差)。相比较而言，本发明pGL3(CAGA)12-EGFP报告基因系统的检测结果(见图5及表1)重复性更好，准确性更高。
实施例4新型的pGL3(CAGA)12-EGFP报告基因系统的应用
癌症的早期诊断和治疗对于疾病的治愈具有非常重要的意义，在各种检测手段中，血清学的检测是最为广泛使用和简便的手段。而相关研究显示TGF-β能够刺激肿瘤血管生成、浸润、转移等，进而促进肿瘤生长加速和肿瘤转移。在很多恶性肿瘤的晚期，如乳腺癌、肺癌、胃癌和胰腺癌等，患者血清和相关组织中TGF-β的含量与肿瘤的发生、发展以及转移紧密相关，即，患者血清中的TGF-β含量的升高对于相关癌症的进程和分期等病程检测，以及治疗后的不良预后密切相关。所以，样本中TGF-β的含量是相关恶性肿瘤诊断、监测、治疗和术后康复程度的重要生物标志物，是血清学重要的诊断标准。
另外，TGF-β在纤维化疾病，如心脏、肺、肝脏和肾脏等纤维化疾病的发生和发展过程中也起到非常重要的作用，本发明中体外检测TGF-β的含量的方法就为相关疾病的发生、发展和预后提供了一种有力的检测手段。
另外，目前PD-L1/PD-1疗法响应率较低，通常只有20％的癌症患者能够响应，而有研究表明同时靶向TGF-β可以更好的激活免疫细胞杀伤癌细胞同时降低癌细胞的免疫逃逸，所以，TGF-β与PD-L1/PD-1的双特异性抗体以及单克隆抗体药物的联合用药也成为了当下免疫治疗领域的重点研究方向之一。而该发明中对于活性TGF-β的含量的测定方法的开发为抗体药物的筛选也提供了一种更加有力的工具。
另外，在体内TGF-β都是以前体形式被合成和分泌，pro-TGFβ在特定时间地点下的特异性激活是开启成熟的TGF-β结合受体并开启下游信号通路的关键。所以体激活机制的研究能够为研究不同亚型的TGF-β提供了很重要的研究思路。同样，在治疗层面上，针对TGF-β不同亚型上游信号通路，即以pro-TGFβ1、2、3为靶标的药物设计也将会极大地增加针对TGF-β的疾病治疗方法的特异性和有效性。所以，本发明也极大地方便了在科研上对于TGF-β前体的研究，我们也在本发明中通过共培养实现了对TGF-β1前体—pro-TGFβ1的激活机制的一些研究，也证实了本发明为前体研究提供了一种重要工具，具体做法如下：
将Expi293F-(CAGA)12-EGFP的稳转3号单克隆细胞以2万/孔的密度铺入96孔板，将其与共转染pro-TGFβ胞外定位蛋白GARP(glycoprotein A repetitions predominant)和TGF-β1前体的Expi293F细胞(5000/孔)，以及转染整合素αvβ6或αvβ8(被GARP定为在胞外的TGF-β1前体能够被整合素αvβ6或αvβ8激活)的Expi293F细胞(5000/孔)进行共培养。共培养后每间隔8h检测荧光强度的变化，连续监测72h。根据计算曲线下面积，可以从标准曲线计算出TGFβ1-αvβ6和TGFβ1-αvβ8组中活性TGF-β1的浓度分别为0.43ng/ml和0.23ng/ml(如图8)，可应用于TGF-β前体激活的基础研究。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (9)

1.一种单克隆报告基因细胞系，其特征在于，将TGF-β信号通路的下游响应元件(CAGA)12和荧光报告基因EGFP构建到pGL3-basic载体中得到了pGL3(CAGA)12-EGFP报告基因质粒，然后将所述报告基因质粒转染至Expi293F细胞后筛选得到了稳定转染的(CAGA)12-EGFP单克隆报告基因细胞系。
2.一种用于检测活性TGF-β含量的体外检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括权利要求1所述的单克隆稳转细胞系以及相应的标准化实验参数指标和检测操作流程说明书。
3.一种用于体外检测活性TGF-β含量的方法，其特征在于，利用权利要求1所述的单克隆报告基因细胞系或权利要求2所述的体外检测试剂盒对TGF-β进行含量检测的方法。
4.根据权利要求3所述用于体外检测活性TGF-β含量的方法，其特征在于，所述方法中全程使用无血清、固定化学成分的Freestyle培养基进行接种和测试，而且最佳细胞接种数为2万个细胞每孔。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法的线性检测范围为0.01ng/ml～1.5ng/ml。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法具体参数为：酶标仪检测，荧光强度；检测类型：终点/动力学；光学元件类型：单色器；激发：480nm；发射：507nm；光学元件位置：底部；增益：100。
7.根据权利要求1所述单克隆报告基因细胞或权利要求2所述的体外检测试剂盒在制备癌症、纤维化疾病、自身免疫病、炎症性疾病、骨骼肌肉疾病、心血管疾病、神经系统疾病、代谢功能障碍、发育障碍以及与TGFβ信号通路相关的疾病的临床诊断或预后监测的试剂盒中的应用。
8.根据权利要求1所述单克隆报告基因细胞或权利要求2所述的体外检测试剂盒在筛选以TGF-β信号通路为靶标的药物筛选以及药物的药效评估试剂盒中的应用。
9.根据权利要求1所述单克隆报告基因细胞或权利要求2所述的体外检测试剂盒在研究TGF-β信号通路相关的基础科学研究中的应用。
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