CN101182535A - 一种与TGF-β信号通路相关药物的筛选模型及其专用载体 - Google Patents

一种与TGF-β信号通路相关药物的筛选模型及其专用载体 Download PDF

Info

Publication number
CN101182535A
CN101182535A CNA2007101778265A CN200710177826A CN101182535A CN 101182535 A CN101182535 A CN 101182535A CN A2007101778265 A CNA2007101778265 A CN A2007101778265A CN 200710177826 A CN200710177826 A CN 200710177826A CN 101182535 A CN101182535 A CN 101182535A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sequence
tgf
caga
signal path
report carrier
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA2007101778265A
Other languages
English (en)
Inventor
陈晔光
王强
宁元亨
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tsinghua University
Original Assignee
Tsinghua University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tsinghua University filed Critical Tsinghua University
Priority to CNA2007101778265A priority Critical patent/CN101182535A/zh
Publication of CN101182535A publication Critical patent/CN101182535A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明涉及一种药物筛选模型及其专用质粒，特别是涉及一种与TGF－β信号通路相关药物的筛选模型及其专用质粒。本发明所提供的报告质粒，是将12个CAGA－box组成的串联序列、腺病毒主要晚期启动子序列及报告蛋白编码基因序列插入哺乳动物细胞表达载体的多克隆位点得到的重组表达载体。本发明所提供的TGF－β信号通路相关药物的筛选模型，是含有所述报告质粒的人肝癌细胞系。本发明的与TGF－β信号通路相关药物的药物筛选模型可靠稳定，而且操作简便，大大提高了筛选效率，降低了筛选成本，缩短了筛选周期，减少受试化合物用量，减少放射性污染。因此，将本发明的药物筛选模型应用于相关药物开发中，将会降低开发费用，加快开发进程，有着广阔的应用前景。

Description

一种与TGF-β信号通路相关药物的筛选模型及其专用载体
技术领域
本发明涉及一种药物筛选模型及其专用质粒，特别是涉及一种与TGF-β信号通路相关药物的筛选模型及其专用载体。
背景技术
目前，高通量药物筛选是发现新药的重要手段，高通量药物筛选平台是由化合物库、靶体选择、靶体和化合物反应的测试方法的建立、靶体作用物的高通量筛选和数据的信息处理系统这几大部分组成。筛选模型的建立，是高通量药物筛选平台的核心。
TGF-β在调节细胞生长和分化、各胚层的发育、器官的形成、上皮组织的增生、细胞外基质的合成、免疫反应等广泛的生物学过程中起着重要作用。TGF-β信号转导失控会引起多种疾病的产生，如肿瘤发生和转移、组织纤维化、遗传性骨结合、软骨发育异常、出血性毛细血管扩张以及肺动脉高血压等(Massague等，2000，Cell103：295)。
转化生长因子β(transforming growth factor，TGF-β)的信号传导中，TGF-β与TGF-βI型受体ALK5和II型受体TβRII结合形成三元复合物。TβRII磷酸化ALK5并激活其丝氨酸和苏氨酸激酶活性，激活的ALK5结合并磷酸化受体特异的Smad(R-Smad)。R-Smad与公用Smad(Co-Smad)结合进而由胞质转入核内，与其他辅助因子相互作用共同调节基因的转录(Massague等，1998，Annu Rev Biochem67：753；Feng等，2005，Annu Rev Cell Dev Biol 21：659)。
TGF-β信号通路中的重要组份，都是潜在的药物靶点。SB-431542和SB-505124是迄今为止发现的两种特异性小分子化合物，可做为TGF-βI型受体ALK5的ATP结合位点竞争性抑制剂，抑制ALK5的激酶活性(Inman等，2001，Mol Pharmacol62：65；DaCosta Byfield等，2004，Mol Pharmacol 65：744)。其中SB-431542已被证明可以抑制TGF-β引起的人类骨肉瘤细胞的增殖和恶性神经胶质瘤细胞的增殖、成瘤及转移。然而，对于鉴定在TGF-β信号通路中起重要作用的小分子化合物及其作用靶点，当前并没有稳定、简单、直观、高效的筛选平台。
纤溶酶原激活剂抑制物-1(plasminogen activator inhibitor-1，)基因是TGF-β的靶基因之一，对TGF-β有非常好的响应性(Inagaki等，1994，J.Biol.Chem.269：14828)。1998年，Dennler等发现在PAI-1的启动子区有Smad3/Smad4的结合序列“5’-AGCCAGACA-3’”，被称为“CAGA-box”。“CAGA-box”可以响应TGF-β和activin，但不能响应BMP(Dennler等，1998，Embo J 17：3091)。
发明内容
本发明的目的是提供一种能响应TGF-β的报告载体。
本发明所提供的报告载体，是将12个CAGA-box组成的串联序列、腺病毒主要晚期启动子序列及报告蛋白编码基因插入哺乳动物细胞表达载体的多克隆位点得到的重组表达载体。
所述12个CAGA-box组成的串联序列及腺病毒主要晚期启动子序列连在一起，其核苷酸序列为序列表中序列1中自5′末端第16-218位脱氧核糖核苷酸。
为了便于插入表达载体，所述12个CAGA-box组成的串联序列及腺病毒主要晚期启动子序列的两端还连接有限制性内切酶识别位点，如MluI和HindIII，如序列表中序列1所示。
在上述报告载体的实际应用中，一般将上述报告载体转入可响应TGF-β信号的哺乳动物细胞，得到一种药物筛选模型，此筛选模型在没有TGF-β刺激情况下，完全不表达报告蛋白，经TGF-β刺激，所述12个CAGA-box组成的串联序列可响应TGF-β，促使报告蛋白基因表达，可通过检测表达的报告蛋白的强弱变化，判定被筛选药物是否能够影响TGF-β信号通路。因此，报告载体中的所述报告蛋白可为现有的不存在于哺乳动物细胞的报告蛋白，如增强绿色荧光蛋白、半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、荧光素酶等常用报告蛋白中的任一种。
为了便于检测报告蛋白的表达情况，所述报告蛋白优选为增强绿色荧光蛋白(EGFP)，在荧光显微镜下即可检测EGFP的表达情况。
所述哺乳动物细胞表达载体具体可为pcDNA3.1(+)。
本发明的另一个目的是提供一种与TGF-β信号通路相关药物的筛选模型。
本发明所提供的与TGF-β信号通路相关药物的筛选模型，是转入上述任一种报告载体的、且本身存在TGF-β信号通路的哺乳动物细胞系。
所述哺乳动物细胞系具体可为Hep3B、HepG2、HEK293或K562等哺乳动物细胞系。
本发明所提供的与TGF-β信号通路相关药物的筛选模型，在含新霉素的MEM培养基中培养，其他培养条件与普通Hep3B细胞的培养条件相同。
本发明的药物筛选模型适合于筛选与TGF-β信号通路相关药物，特别适合于自动化筛选多靶点高通量小分子药物。实验结果表明本发明的与TGF-β信号通路相关药物的筛选模型可靠稳定，而且操作简便，与传统药物筛选模型相比，大大提高了筛选效率，降低了筛选成本，缩短了筛选周期，与现有高通量药物筛选模型相比，减少受试化合物用量，减少放射性污染。因此，将本发明的药物筛选模型应用于相关药物开发中，将会降低开发费用，加快开发进程，有着广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明的TGF-β信号通路相关药物筛选模型对SB-431542的筛选效果，以及筛选小分子化合物A的结果。
具体实施方式
实施例1、构建与TGF-β信号通路相关药物的筛选模型
1、构建CAGA-EGFP报告质粒
(1)12个串联在一起的“CAGA-box”序列及含有“TATA box”的腺病毒主要晚期启动子(the adenovirus major late promoter，MLP)序列的获得
人工合成12个串联在一起的“CAGA-box”双链DNA序列和腺病毒主要晚期启动子(MLP)序列，并且使MLP序列连接在12个CAGA-box序列后，其核苷酸序列如序列表中序列1所示。
5’-CACACGCGTCTCGAG
Figure S2007101778265D00031
AAA
Figure S2007101778265D00032
TTT
Figure S2007101778265D00033
CTCGAG
Figure S2007101778265D00034
AAA
Figure S2007101778265D00035
TTT
Figure S2007101778265D00036
CTCGAG
Figure S2007101778265D00037
AAA
Figure S2007101778265D00038
TTT
Figure S2007101778265D00039
CTCGAG
Figure S2007101778265D000310
Figure S2007101778265D000311
AAA
Figure S2007101778265D000312
TTT
Figure S2007101778265D000313
C
Figure S2007101778265D000315
AAGCTTAGC-3’
(2)增强型绿色荧光蛋白(EGFP)编码基因的获得
用限制性内切酶HindIII和NotI酶切pEGFP-N1(BD Biosciences Clontech，Catalog#6085-1)，回收大小为776bp的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)编码基因片段。
(3)将(1)的12个串联在一起的“CAGA-box”序列、MLP序列，连同(2)的EGFP的cDNA序列插入pcDNA3.1(+)质粒
用限制性内切酶MluI和HindIII将pcDNA3.1(+)质粒(Invitrogen)本身的CMV启动子去除；将(1)合成的12个串联在一起的“CAGA-box”及MLP序列(即序列表中序列1所示序列)用MluI和HindIII酶切，然后连入上述得到的线性载体中，得到重组载体pcDNA3-CAGA-MLP；用限制性内切酶HindIII和NotI酶切重组载体pcDNA3-CAGA-MLP，然后将步骤(2)获得的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)编码基因插入pcDNA3-CAGA-MLP的HindIII和NotI位点，得到CAGA-EGFP报告质粒。
2、转入CAGA-EGFP报告质粒的细胞系的获得
(1)转染
将CAGA-EGFP报告质粒用脂质体Lipofectamine(Invitrogen)转染到Hep3B细胞系(购自ATCC)，再将其接入含10％(体积百分含量)Hyclone胎牛血清的MEM培养基中，在37℃培养48小时后，加400ug/ml新霉素筛选，待两周后挑取单克隆，继续培养。
(2)筛选
向每个单克隆培养孔中加入终浓度为50pM的人TGF-β1(R&D Systems)进行刺激，24小时后，用荧光显微镜观察细胞是否发出绿色荧光。将在TGF-β1刺激下能发出均一绿色荧光的单克隆进行传代培养并冻存。所有能发出均一绿色荧光的单克隆，在没有TGF-β1刺激的情况下，均完全没有荧光(图1a)，经50pM TGF-β1刺激24小时，均可以稳定表达亮度均一的绿色荧光蛋白(图1b)。这些克隆即为CAGA-EGFP报告基因Hep3B稳定细胞系，也就是与TGF-β信号通路相关药物的筛选模型。
实施例2、用实施例1获得的筛选模型筛选已知的能抑制TGF-β信号通路药物SB-431542和未知药物A
本药物筛选模型的应用方法为：将实施例1获得的筛选模型均匀培养在分别包被有各种适量小分子化合物的96孔板中，培养一段时间后，加TGF-β1刺激，24小时后观察绿色荧光的变化情况。如果绿色荧光减弱或消失，表明在小分子化合物的干扰下，TGF-β通路上的信号转导分子表达受到抑制；如果绿色荧光增强，表明在小分子化合物的干扰下，TGF-β信号通路的一些抑制因子的表达受到影响。
下面举例说明本药物筛选模型的应用方法：
将CAGA-EGFP报告基因Hep3B稳定细胞株均匀培养在分别包被有浓度为10uM的SB-431542(筛选系统的阳性对照)(Sigma)和未知小分子化合物A的96孔板中，每种小分子化合物包被3孔，用MEM培养基在37℃培养24小时后，向每孔加入50pMTGF-β1，24小时后观察绿色荧光的变化情况。
结果表明：向包被有SB-431542的实验孔加入TGF-β1进行刺激，没有观察到绿色荧光(图1c)，表明此筛选模型能筛选与TGF-β信号通路相关药物；在含有小分子化合物(命名为A)的实验孔中加入TGF-β1进行刺激，24小时后没有观察到绿色荧光(图1d)，表明小分子A能抑制TGF-β通路。
序列表
<160>1
<210>1
<211>227
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
cacacgcgtc tcgagagcca gacaaaaagc cagacattta gccagacact cgagagccag     60
acaaaaagcc agacatttag ccagacactc gagagccaga caaaaagcca gacatttagc    120
cagacactcg agagccagac aaaaagccag acatttagcc agacactgaa ggggggctat    180
aaaagggggt gggggcgcgt tcgtcctcac tctcttccaa gcttagc                  227

Claims (8)

1.一种报告载体，是将12个CAGA-box组成的串联序列、腺病毒主要晚期启动子序列及报告蛋白编码基因插入哺乳动物细胞表达载体的多克隆位点得到的重组表达载体。
2.根据权利要求1所述的报告载体，其特征在于：所述12个CAGA-box组成的串联序列及腺病毒主要晚期启动子序列连在一起，其脱氧核糖核苷酸序列为序列表中序列1中自5′末端第16-218位脱氧核糖核苷酸。
3.根据权利要求1或2所述的报告载体，其特征在于：所述12个CAGA-box组成的串联序列及腺病毒主要晚期启动子序列连在一起，其脱氧核糖核苷酸序列如序列表中的序列1所示。
4.根据权利要求1或2所述的报告载体，其特征在于：所述报告蛋白为不存在于哺乳动物细胞的报告蛋白。
5.根据权利要求4所述的报告载体，其特征在于：所述报告蛋白为增强绿色荧光蛋白。
6.根据权利要求1-5中任一所述的报告载体，其特征在于：所述哺乳动物细胞表达载体为pcDNA3.1(+)。
7.一种与TGF-β信号通路相关药物的筛选模型，是转入权利要求1至6中任一所述的报告载体的且存在TGF-β信号通路的哺乳动物细胞系。
8.根据权利要求7所述的筛选模型，其特征在于：所述哺乳动物细胞系为Hep3B、HepG2、HEK293或K562细胞系。
CNA2007101778265A 2007-11-21 2007-11-21 一种与TGF-β信号通路相关药物的筛选模型及其专用载体 Pending CN101182535A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNA2007101778265A CN101182535A (zh) 2007-11-21 2007-11-21 一种与TGF-β信号通路相关药物的筛选模型及其专用载体

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNA2007101778265A CN101182535A (zh) 2007-11-21 2007-11-21 一种与TGF-β信号通路相关药物的筛选模型及其专用载体

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101182535A true CN101182535A (zh) 2008-05-21

Family

ID=39447958

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2007101778265A Pending CN101182535A (zh) 2007-11-21 2007-11-21 一种与TGF-β信号通路相关药物的筛选模型及其专用载体

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN101182535A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109658984A (zh) * 2018-12-18 2019-04-19 北京深度制耀科技有限公司 一种信息推荐和信息推荐模型训练方法、相关装置
CN114236137A (zh) * 2021-12-17 2022-03-25 中山大学·深圳 一种转化生长因子β的体外检测试剂盒及其应用

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109658984A (zh) * 2018-12-18 2019-04-19 北京深度制耀科技有限公司 一种信息推荐和信息推荐模型训练方法、相关装置
CN114236137A (zh) * 2021-12-17 2022-03-25 中山大学·深圳 一种转化生长因子β的体外检测试剂盒及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Gao et al. Pioneering function of Isl1 in the epigenetic control of cardiomyocyte cell fate
Besse et al. Translational control of localized mRNAs: restricting protein synthesis in space and time
Henry et al. TGF-β signals and a prepattern in Xenopus laevis endodermal development
Birge et al. Crk and CrkL adaptor proteins: networks for physiological and pathological signaling
Zhou et al. GATA2 is required for the generation of V2 interneurons
Reiss et al. IGF-I receptor signaling in a prostatic cancer cell line with a PTEN mutation
Liu et al. A dual genetic tracing system identifies diverse and dynamic origins of cardiac valve mesenchyme
Rabadán et al. Delamination of neural crest cells requires transient and reversible Wnt inhibition mediated by Dact1/2
CN101443460B (zh) 利用降低亲和力酶互补报告分子系统检测分子间相互作用
Angel et al. The FOS and JUN families of transcription factors
Susor et al. Translational regulation in the mammalian oocyte
EP3333257B1 (en) Screening and use of piperidino pyrazolopyrimidine compound
Shaaya et al. Light-regulated allosteric switch enables temporal and subcellular control of enzyme activity
Richardson et al. Cardiomyocyte regeneration in the mdx mouse model of nonischemic cardiomyopathy
EP1115734A1 (en) Method of measuring protein-protein interactions in living cells
McNeish Stem cells as screening tools in drug discovery
Berg et al. XRCC4 controls nuclear import and distribution of Ligase IV and exchanges faster at damaged DNA in complex with Ligase IV
Rodriguez et al. 14‐3‐3 regulation of cell spreading and migration requires a functional amphipathic groove
CN101182535A (zh) 一种与TGF-β信号通路相关药物的筛选模型及其专用载体
Norris et al. Hypothesis: hyperstructures regulate bacterial structure and the cell cycle
Castillo et al. A circadian clock translational control mechanism targets specific mRNAs to cytoplasmic messenger ribonucleoprotein granules
French et al. The Power of Xenopus Egg Extract for Reconstitution of Centromere and Kinetochore Function
Rey et al. Vasopressin‐induced intracellular redistribution of protein kinase D in intestinal epithelial cells
Akiyoshi et al. Reconstituting the kinetochore–microtubule interface: what, why, and how
Wagner et al. Cardiac hypertrophy: signal transduction, transcriptional adaptation, and altered growth control

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Open date: 20080521