CN101443460B - 利用降低亲和力酶互补报告分子系统检测分子间相互作用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于检测分子间相互作用的方法和组合物。本发明的方面包括使用降低亲和力酶互补报告分子系统。还提供的是用于实施所述方法的实施方式的系统和试剂盒。
Description
政府权益
本发明是国家卫生研究所授权、以联邦拨款号T32GM08412;T32AG0259;AF051678;HD018179;AG009521;AG024987;AG020961;DAMD17-00-1-0442在政府支持下完成的。美国政府可以享有本发明的一定权益。
相关申请的交叉引用
根据35 U.S.C.§119(e),本申请要求2006年3月13日提交的美国临时申请No.60/782,054的优先权;该申请的内容并入本申请作为参考。
发明背景
活细胞中几乎每一种细胞代谢过程均涉及分子相互作用,例如蛋白质-蛋白质相互作用。因此,阐明蛋白质的功能是了解作为生物途径基础的机制的重要步骤。而且,用于治疗人类疾病和失调的治疗学的发展也取决于对在上述疾病或失调相关的生物学过程中起作用的蛋白质的功能的了解。此外,随着人类基因组测序工程的完成,所鉴定出的功能未知的蛋白质的数量急剧增加。鉴定某种蛋白质与其它蛋白质之间的相互作用对于阐明蛋白质的功能是很有帮助的。
例如,鉴定和表征蛋白质-蛋白质相互作用以及其调节物的系统广泛应用于诸多不同应用领域。
发明概述
本发明提供了检测分子相互作用的方法和组合物。本发明的方面包括降低了亲合力的酶互补报告分子系统(reduced affinity enzymecomplementation reporter system)的用途。在某些实施方式中,所述的降低了亲合力的酶互补报告系统是降低了亲合力的β-半乳糖苷酶互补报告分子系统。还提供的是用于在实践所述方法的实施方式中使用的系统和试剂盒。
本发明的方面还包括确定第一和第二蛋白质是否发生相互作用的方法。所述方法的实施方式包括:(a)提供细胞,其包含(i)所述第一蛋白质和第一β-半乳糖苷酶片段的第一融合蛋白,其中所述第一β-半乳糖苷酶片段是变异的最小N-末端β-半乳糖苷酶肽;和(ii)所述第二蛋白质和第二β-半乳糖苷酶片段的第二融合蛋白;其中,所述第一和第二β-半乳糖苷酶片段之间具有亲和力,其在不存在所述第一和第二蛋白质之间的相互作用的情况下提供已知水平的β-半乳糖苷酶活性,所述活性低于在存在所述第一和第二蛋白质之间的相互作用的情况下所观察到的活性,和(b)评估所述细胞的β-半乳糖苷酶活性以确定所述第一和第二蛋白质是否相互作用。在某些实施方式中,所述提供步骤包括向细胞中导入编码所述第一和第二融合蛋白的核酸,其中,所述核酸可以被顺序地或同时地导入细胞。在某些实施方式中,所述方法进一步包括在所述评估步骤前使细胞与候选的相互作用调节剂作用。在某些实施方式中,所述的评估步骤包括将所观察到的β-半乳糖苷酶活性与已知的β-半乳糖苷酶活性水平相比较。在某些实施方式中,所述第一β-半乳糖苷酶片段具有对所述第二β-半乳糖苷酶片段的结合亲和力,其低于由野生型大肠杆菌β-半乳糖苷酶的氨基酸3-92组成的β-半乳糖苷酶片段的结合亲和力。在某些实施方式中,与由野生型大肠杆菌β-半乳糖苷酶氨基酸3-92组成的β-半乳糖苷酶片段相比,所述第一β-半乳糖苷酶片段至少包含一个氨基酸变异。在某些实施方式中,所述至少一个氨基酸变异是取代或者缺失。在某些实施方式中,所述的变异出现在第31和41位残基之间。在某些实施方式中,所述细胞是哺乳动物细胞。在某些实施方式中,所述相互作用在细胞内的部位发生。在某些实施方式中,所述相互作用在质膜部位发生。
本发明的方面还包括细胞,其包含(a)第一蛋白质和第一β-半乳糖苷酶片段的第一融合蛋白,其中,所述第一β-半乳糖苷酶片段是变异的最小N-末端β-半乳糖苷酶肽;和(b)第二蛋白质和第二β-半乳糖苷酶片段的第二融合蛋白;其中,所述第一和第二β-半乳糖苷酶片段具有相互的低亲和力,其在不存在所述第一和第二蛋白质之间的相互作用的情况下提供已知水平的β-半乳糖苷酶活性,所述活性低于在存在所述第一和第二蛋白质之间的相互作用的情况下所观察到的活性。在某些实施方式中,所述第一和第二融合蛋白质是细胞内蛋白质。在某些实施方式中,所述第一和第二融合蛋白中的至少一种是膜结合蛋白。在某些实施方式中,所述的第一和第二融合蛋白都是膜结合蛋白。
还提供试剂盒,其包括(a)细胞,其包含(i)第一蛋白质和第一β-半乳糖苷酶片段的第一融合蛋白,其中,所述的第一β-半乳糖苷酶片段是变异的最小N-末端β-半乳糖苷酶肽;和(ii)第二蛋白质和第二β-半乳糖苷酶片段的第二融合蛋白;其中,所述第一和第二β-半乳糖苷酶片段具有相互的低亲和力,其在不存在所述第一和第二蛋白质之间的相互作用的情况下提供已知水平的β-半乳糖苷酶活性,所述活性低于在存在所述第一和第二蛋白质之间的相互作用的情况下所观察到的活性;和(b)β-半乳糖苷酶底物。还提供试剂盒,其包含(a)编码第一β-半乳糖苷酶片段的第一核酸;和(b)编码第二β-半乳糖苷酶片段的第二核酸;其中,所述第一β-半乳糖苷酶片段是变异的最小N-末端β-半乳糖苷酶肽,并具有对所述第二β-半乳糖苷酶片段的结合亲和力,其低于由野生型大肠杆菌β-半乳糖苷酶的氨基酸3-92组成的β-半乳糖苷酶片段的结合亲和力。在某些实施方式中,所述第一和第二核酸存在于载体上。在某些实施方式中,所述载体包含位于所述载体上的限制性位点,从而当蛋白质编码序列经由所述限制性位点插入到所述载体中时,所述载体编码所述蛋白质与β-半乳糖苷酶片段的融合蛋白。在某些实施方式中,所述试剂盒进一步包含细胞。在某些实施例方案中,所述试剂盒进一步包含β-半乳糖苷酶底物。
附图的简要说明
图1.通过β-半乳糖苷酶的降低亲和力的α-互补所监视的、可诱导的蛋白质相互作用。A)低亲和力α互补系统的示意图。两个嵌合蛋白质的物理缔合使得突变的β-gal片段、M15(ω)和H31Rα(α*)相互接近,产生β-半乳糖苷酶活性。B)低亲和力α-互补监视了强的蛋白相互作用。在暴露于雷帕霉素(Rap)之后,表达FRBα*和FKBP12ω的细胞展现了提高的β-半乳糖苷酶活性。C)低亲和力α-互补定量地监视了蛋白质相互作用,例如在表达B2ARω和β-抑制蛋白2α*嵌合体的细胞中监视膜结合的β2-肾上腺素能受体(B2AR)和胞质β-抑制蛋白2的可诱导的相互作用。α*代表由感兴趣的黄色荧光蛋白(YFP)-H31Rα的融合物组成的嵌合蛋白质。D)B2ARω和β-抑制蛋白2α*嵌合体的相互作用在暴露于激动剂异丙肾上腺素(isoproteronol)之后45分钟的剂量反应被分析为β-gal活性的。E)B2ARω和β-抑制蛋白2α*相互作用以剂量依赖性的方式被拮抗剂心得安阻止。在添加10μM异丙基肾上腺素之前10分钟向细胞添加增高剂量的心得安,在45分钟之后测量到β-gal活性。F-G)低亲和力α-互补监视EGFR和ErbB2之间的异源二聚体形成。EGFR和ErbB2的细胞外和跨膜结构域用于产生两种嵌合体,EGFRω和ErbB2α*。G)表达EGFRω和ErbB2α*的细胞用100ng/ml的EGF刺激,测量酶活性,随着时间的推移展现了提高的异源二聚体形成。H)低亲和力α-互补监视EGFR和ErbB2的以动态和可逆的方式的相互作用。在用EGF或TGF-α刺激细胞之后,除去过量的配体(洗去),测量异源二聚体解离作为酶活性的函数。在存在配体的情况下,将在细胞中稳定状态的β-gal活性标准化为100%,将在不存在配体的情况下细胞中的β-gal活性指定为零。
图2.基础β-gal活性取决于α和ω嵌合体的表达的水平。A)B2ARω-β-抑制蛋白2α*和EGFRω-ErbB2α*细胞系通过流式细胞计根据YFP荧光的水平来辨别,其作为α*肽水平的指标。B)在分选之后,来自每种细胞系的等量的细胞平铺到96-孔平皿中,在不存在诱导物的情况下测量β-gal活性。酶活性与荧光强度相比较,最低的表达者的荧光和β-gal活性标为1。随着α*肽的表达水平提高,背景β-gal活性提高。
图3.具有可比较的α*和ω、用于描绘EGFR、ErbB2和ErbB3受体的配对的基础的和诱导的相互作用的细胞系的产生。A)为了确定所有的嵌合体类似地表达并定位在质膜上,将α*融合物构建体转染到HEK293细胞中,通过共焦显微镜检查对YFP荧光来成像。B)从表达EGFRω或ErbB2ω的C2C12细胞产生两种亲本细胞系。用α*嵌合体转导亲本系,针对相似的YFP表达水平来分选。C)每个细胞系的平均荧光的定量显示了在所有六个系之中低于15%的变异。
图4.在EGFR、ErbB2和ErbB3之间基础的和诱导的相互作用的比较分析。A)将等量的、表达不同的ErbB受体嵌合蛋白组合的六种细胞系的每一种以20,000个细胞每孔的密度平铺在96孔平皿中。细胞用指示(indicated)配体刺激45分钟,测量β-gal活性。在暴露于EGF时,仅形成了EGFR同源二聚体和EGFR-ErbB2异源二聚体,而调蛋白(Heregulin)处理仅仅引起了ErbB2-ErbB3异源二聚体的形成。B)对于每种细胞系,在不存在配体的情况下测量的β-gal活性指示出基础的二聚体形成水平。注意到,相对于EGFR或ErbB3,ErbB2没有展现提高的形成同源二聚体的倾向。
图5.单克隆抗体对ErbB2二聚体形成的不同影响。A)ErbB2ω-ErbB3α*和EGFRω-ErbB2α*细胞系暴露于1μg/ml的指示抗体30分钟,用合适的配体刺激,分析β-gal活性。对照IgG和L87抗体对ErbB2相互作用没有影响。2C4抗体完全地抑制全部ErbB2相互作用,曲妥单抗(Herceptin)强烈地抑制EGFR和ErbB2的相互作用,但是仅最低限度地影响ErbB2和ErbB3的相互作用。B)通过曲妥单抗和2C4对ErbB2相互作用的抑制在相似的抗体浓度下发生。在添加100ng/ml的EGF或调蛋白(HRGβ1)之前,用不同剂量的指示单克隆抗体预处理细胞系。如对图1H描述将A和B中的数据标准化。
图6.通过β-gal活性测量的、曲妥单抗介导的EGFR-ErbB2二聚体形成的抑制与用于产生嵌合蛋白的β-gal片段(ω或α*)无关。图3显示了在存在EGF的情况下EGFRω和ErbB2α*异源二聚体形成的抑制。为了确保这不是β-gal互补系统的结果,还测试了EGFRα*ErbB2ω细胞系。在EGF处理之前,用不同剂量的曲妥单抗将细胞处理30分钟。
图7.通过曲妥单抗和2C4对EGFR-ErbB2异源二聚体形成的抑制提高了EGFR同源二聚体形成和内在化。A)表达EGFRω、EGFRα*以及过量表达的野生型ErbB2(没有β-gal片段)的C2C12细胞用增高的浓度的EGF处理。在存在过量的ErbB2的情况下,异源二聚体形式是有利的,在不存在抗体(无Ab)的情况下酶活性没有相应于EGF而提高。曲妥单抗和2C4抑制ErbB2与EGFR的缔合。在EGF处理之前用1μg/ml的每种抗体孵育,恢复了EGFR形成同源二聚体的能力。(B-C)相应于抗体处理的EGFR内在化的分析。过量表达野生型EGFR和ErbB2的C2C12细胞(B)或表达这两种受体的乳腺癌细胞系SKBR3(C)在不同的时点用EGF刺激,与抗EGFR抗体(Ab-11)孵育,并用流式细胞计分析。对于曲妥单抗和2C4曲线,在EGF之前10分钟的每个时点添加5μg/ml的每种抗体。在两种细胞系中,与对照(无Ab)相比,每种抗体都引起了细胞表面存在的EGFR的快速降低。
定义
根据本发明,可以采用的由本领域技术人员能力之内的常规的分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这些技术已经在文献中完整地说明了。参见,例如,Maniatis,Fritsch & Sambrook,″MolecularCloning:A Laboratory Manual(1982);″DNA Cloning:A PracticalApproach,″Volumes I and II(D.N.Glover ed.1985);″OligonucleotideSynthesis″(M.J.Gait ed.1984);"Nucleic Acid Hybridization″(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.(1985));″Transcription and Translation″(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.(1984));″Animal Cell Culture″(R.I.Freshney,ed.(1986));″Immobilized Cells and Enzymes″(IRL Press,(1986));B.Perbal,″A Practical Guide To Molecular Cloning″(1984)。
术语“聚合物”是指由相互共价结合的两个或更多个单体单位组成的任何化合物,其中,所述单体单位可以是相同或不同的,从而所述聚合物可以是同聚物或异聚物。代表性的聚合物包括肽、多糖、核酸等等,聚合物可以是自然出现的或合成的。
在此使用的术语“肽”是指通过在一个氨基酸的α-羧基和另一个基团的α-氨基之间的酰胺形成而产生的任何聚合物。
在此使用的术语“寡肽”是指具有少于约10到20个残疾,即氨基酸单体单位的肽。
在此使用的术语“多肽”是指具有超过10到20个残基的肽。
在此使用的术语“蛋白质”是指超过约50个残基的特定序列的多肽。
如在此使用的,术语“氨基酸”不仅包括L、D-和非手性形式的自然出现的氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸),还包括修饰的氨基酸、氨基酸类似物和可以掺入常规的寡肽合成中的其他化合物,例如,4-硝基苯基丙氨酸、异谷氨酸、异谷氨酰胺、ε-烟酰基-赖氨酸、异哌啶酸、tetrahydroisoquinoleic acid、α-氨基异丁酸、肌氨酸、瓜氨酸、半胱磺酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、4-氨基丁酸,等等。氨基酸序列按照单字母代码给出(A:丙氨酸;C:半胱氨酸;D:天冬氨酸;E:谷氨酸;F:苯丙氨酸;G:甘氨酸;H:组氨酸;I:异亮氨酸;K:赖氨酸;L:亮氨酸;M:甲硫氨酸;N:天冬酰胺;P:脯氨酸;Q:谷氨酰胺;R:精氨酸;S:丝氨酸;T:苏氨酸;V:缬氨酸;W:色氨酸;Y:酪氨酸;X:任何残基)。NH2是指存在于多肽的氨基末端的游离氨基。COOH是指存在于多肽的羧基末端的游离羧基。为了与标准的多肽命名一致,应用J Biol.Chem.,243(1969),3552-59。
在此使用的术语“核酸”是指由核苷酸,例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸组成的聚合物,或合成地产生的化合物(例如,在美国专利NO.5,948,902和其中引用的参考文献中描述的PNA),其可以类似于两种自然出现的核酸,以序列特异性的方式与自然出现的核酸杂交,例如,可以参与Watson-Crick碱基配对相互作用。
在此使用的术语“核糖核酸”和“RNA”是指由核糖核苷酸组成的聚合物。
在此使用的术语“脱氧核糖核酸”和“DNA”是指由脱氧核糖核苷酸组成的聚合物。因而,“DNA分子”是指脱氧核糖核苷酸(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶)的多聚形式,处于单链形式或双链螺旋中。该术语仅指分子的一级和二级结构,不对任何特定的三级结构进行限制。因而,该术语包括特别地以线性DNA分子(例如,限制性片段)、病毒、质粒和染色体存在双链DNA。
DNA“编码序列”是一种DNA序列,当置于合适的调节序列的控制下时其在体内被转录和翻译成多肽。编码序列的边界由5'(氨基)末端的起始密码子和3'(羧基)末端的翻译终止密码子确定。编码序列可以包括,但不限于,原核序列、来自真核mRNA的cDNA、来自真核(例如哺乳动物)DNA的基因组DNA序列,和合成的DNA序列。多腺苷酸化信号和转录终止序列可以位于编码序列的3'。
在此使用的术语“寡核苷酸”代表长度从约10个到约100个核苷酸和直到200个核苷酸的单链核苷酸多聚体。
在此使用的术语“多核苷酸”是指由长度一般大于约100个核苷酸的核苷酸单体组成的单链或双链的聚合物。
术语“核苷”和“核苷酸”包括不仅含有已知的嘌呤和嘧啶碱基、还含有经修饰的其他的杂环碱基的那些部分。这些修饰包括甲基化的嘌呤或嘧啶、酰化的嘌呤或嘧啶、烷基化的核糖或其他杂环。此外,术语“核苷”和“核苷酸”包括不仅含有常规的核糖和脱氧核糖糖类、还包括其他糖类的那些部分。经修饰的核苷或核苷酸还包括对糖部分的修饰,例如,其中一个或多个羟基被卤素原子或脂肪基替换,或被功能化为醚、胺,等等。
“载体”是一种复制子,例如质粒、噬菌体或粘粒,另一DNA节段可以连接于其上,从而引起所述连接的节段的复制。
如在此使用的,“DNA调节序列”是转录和翻译控制序列,例如,启动子、增强子、多腺苷酸化信号、终止子,等等,其提供了和/或调节编码序列在宿主细胞中的表达。
“启动子序列”是能够在细胞中结合RNA聚合酶并启动下游的(3'方向)编码序列的转录的DNA调节区域。对于定义本发明,启动子序列在它的3'末端由转录起始位点作为边界,并向上游延伸(5'方向)来包括在高于背景的可检测水平下启动转录所必需的最少数量的碱基或元件。在启动子序列之内存在转录起始位点,以及负责RNA聚合酶结合的蛋白结合结构域。真核的启动子通常、但非总是含有“TATA”框和“CAT”框。各种启动子,包括可诱导启动子,可以用于驱动本发明的各种载体。
如在此使用的,术语“限制性核酸内切酶”和“限制性酶”是指细菌酶类,它们的每一种在特定的核苷酸序列处或附近切割双链DNA。
细胞被外源的或异源的DNA“转化”或“转染”,此时这种DNA被导入细胞内部。转化DNA可以或可以不被整合(共价连接)到细胞的基因组中。在例如原核生物、酵母和哺乳动物细胞中,转化DNA可以位于游离的元件,例如质粒上。对于真核细胞,稳定转化的细胞是其中转化DNA已经整合到染色体中的细胞,从而转化DNA通过染色体复制被子代细胞继承。通过真核细胞建立细胞系或克隆的能力来证明这种稳定性,所述细胞系或克隆包括含转化DNA的子代细胞群体。“克隆”是通过有丝分裂衍生自单个细胞或共同祖先的细胞的群体。“细胞系”是能够在体外稳定生长许多世代的原代细胞的克隆。
DNA构建体的“异源”区域是更大的DNA分子中的可鉴别的DNA的节段,其未被发现与所述更大的分子相关。因而,当异源区域编码哺乳动物基因时,所述基因通常包括侧翼DNA,所述侧翼DNA在上述基因的来源有机体的基因组中不侧翼于哺乳动物基因组DNA。在另一个实例中,异源DNA包括构建体内的编码序列,在其中两种不同来源的基因的部分放置在一起从而产生融合蛋白产物。等位基因变异或自然出现的突变事件不产生在此定义的DNA的异源区域。
如在此使用的,术语“报告分子”是指附着于异源启动子或增强子元件的编码序列,当所述构建体被导入组织或细胞中时,其产物可以被容易地和可定量地分析。
“任选”或“任选地”是指随后描述的状况可以发生也可以不发生,从而该描述包括了所述状况发生的情况和所述状况不发生的情况。
“接触”是指带至或放置在一起。因而,当两个物品被带至或放置在一起时,例如,通过使其相互触碰,第一项与第二项接触。
发明内容
本发明提供了用于检测分子间相互作用的方法和组合物。本发明的方面包括使用降低亲和力酶互补报告分子系统,例如,降低亲和力β-半乳糖苷酶互补报告分子系统。还提供用于实践所述方法的实施方式的系统和试剂盒。
在更详细地描述本发明之前,要理解的是,本发明不限于所描述的特定实施方式,这些可以变化。还需要理解的是,在此使用的专有名词仅用于描述特定实施方式的目的,不是限制性的,因为本发明的范围将仅由附随的权利要求限定。
当涉及数值的范围时,要理解的是,在所述范围的上限和下限之间的每个中间值,除非上下文有明确的相反说明,直到所述下限的单位的十分之一,在提及的范围内其他提及的值或中间值均包含于本发明的范围内。这些更小的范围的上限和下限可以独立地包括在所述更小的范围之内,但其也受在所涉及的范围内特别排除任何值的限制。当声明的范围包括一个或两个限值时,排除了所包括的限值之一或两者的范围也包括在本发明的范围之内。
在此,某些范围用之前带有术语“约”的数字值来表示。在此使用术语“约”来提供对其之后的精确数值、以及接近或靠近其之后的数字的数字的字面支持。在确定某一数字是否接近或靠近特别叙述的数字时,接近或靠近的未引述的数字可以是在上下文中提供所述特别叙述的数字基本上相等的数值。
除非另外定义,此处使用的所有技术和科学术语与本发明所属技术领域普通技术人员通常所理解的含义相同。本说明书中仅描述了代表性、示例性的方法和材料,但类似于或等同于在此描述的任何方法和材料也可以用于本发明的实践或测试。
在本说明书中引用的所有公开出版物和专利在此作为参考并入本发明,其程度与特别地或单独地指示通过引用来引证每个单独的公开出版物或专利相同,作为参考并入来公开和描述与所述公开出版物所引证的相关的方法和/或材料。所引用的任何公开出版物均是在本身起提交日之前的公开内容,但从作为在先发明的角度来讲,上述内容不影响本发明作为先于上述公开出版物的发明的权利。进一步的,所提供的公开出版物的日期可能不同于实际的出版日期,其可能需要被独立地确认。
注意的是,在此使用的和在附随的权利要求中,除非上下文中有明确的相反说明,英文中的单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括了复数的含义。进一步地,权利要求可以撰写成排除任何可选的元素。因而,这一声明旨在充当先行的基础,用于与权利要求元素的叙述一起来使用排他性术语如“单独地”、“仅”等等,或用于“否定的”限制。
在阅读本说明书时,对于本领域技术人员显而易见的是,在此描述和说明的每个单独的实施方式具有独立的元素和特征,其可以容易地与任何其他几个实施方式的任何元素或特征分离或组合,而不背离本方面的范围和精神。任何引用的方法可以按照所叙述的事件的顺序、或按照逻辑上可能的任何其他顺序来进行。
在进一步描述的本发明的主题中,首先更详细地综述了所述方法方面,随后是所述方法的实施方式的不同应用的综述,以及在实践本发明的某些实施方式中有用的各种试剂盒的综述。
方法
如以上概述的,本发明的实施方式提供了检测第一和第二分子之间的分子间相互作用,例如,蛋白质-蛋白质相互作用,的方法。因而,本发明的实施方式提供了确定第一和第二分子是否相互结合,即,相互作用的方法。可以使用所述的方法检测的分子间相互作用可以包括不同类型的分子,其中所述的分子可以是相同或不同种类的分子。因而,在某些实施方式中,感兴趣的分子间相互作用是在作为相同类型的分子的第一和第二分子之间的相互作用,即,所述第一和第二分子都是多肽(例如,蛋白质)。在其他的实施方式中,所述第一和第二分子可以是不同类型的分子,例如,其中第一分子是多肽,第二分子是核酸。在某些实施方式中,所述第一和第二分子是多肽,例如,蛋白质,从而所述方法是检测蛋白质-蛋白质相互作用的方法。
如上文概述的,本发明的实施方式涉及确定第一和第二结合成员是否相互作用的方法。所述方法包括提供细胞,其中感兴趣的每个结合成员用降低亲和力酶互补报告分子系统的不同成员来标记。然后评估所述细胞的报告分子的酶活性,采用评估的结果来确定所述第一和第二结合成员是否相互作用。
所述方法的方面包括使用降低亲和力酶互补报告分子系统。“降低亲和力”酶互补报告分子系统是指一种系统,其由酶的两个或更多个片段(即,报告分子亚单位)组成,所述片段本身缺乏在它们的亲本酶中所观察到的任何可检测的活性(其可以是直接或间接地检测的),但是当置于足够靠近时,例如,通过随机的相互作用或结合成员介导的相互作用,它们产生可检测数量的亲本酶的活性。本发明的降低亲和力酶互补报告分子系统的一个方面是,在所述系统中采用的至少一种所述的报告分子亚单位是它的野生型亲本酶中相应结构域的变体,从而它与系统的另一个亚单位的相互作用在分析条件下是可逆的,缺乏由感兴趣的结合部分所介导的相互作用。因而,本发明的降低亲和力酶互补报告分子系统在不存在感兴趣的相互作用的情况下提供了第一可检测信号,其低于在存在感兴趣的相互作用的情况下观察到的第二可检测信号。例如,当所述系统是β-半乳糖苷酶系统时(如下文中更详细地综述的),所述系统提供了在不存在感兴趣的相互作用的情况下的第一可检测信号,其低于在存在感兴趣的相互作用的情况下所观察到的第二可检测信号。此外,本发明的方面包括一些实施方式,其中在给定的感兴趣的分析条件组合下所述第一信号的量是已知的,可以在是第二信号被检测时或之前的时间进行测定,其中先前的检测的值被用作参考。降低亲和力酶互补报告分子系统的实施方式的特征在于提供了高的信噪比。
报告分子亚单位具有足够低的结合亲和力,从而在缺乏结合部分介导的相互作用的情况下展现相互的可逆结合,但是一旦结合分子与之结合,即能够缔合并产生可检测信号,报告分子亚单位可以使用许多不同的方法来产生。在某些实施方式中,采用了推理的方法,其中研究由高亲和力亚单位组成的第一报告分子系统来鉴定负责亚单位的高亲和力缔合的那些亚单位的区域。然后以某些方式来改变鉴定的区域,例如,通过向该区域引入点突变、插入或缺失,来获得适合的低亲和力亚单位,从而获得降低亲和力报告分子系统,其中在不存在任何结合成员介导的缔合的情况下所述亚单位可逆地相互作用。参见,例如,以下的实验部分,以及我们的2005年5月18日提交的美国专利申请系列号NO.11/132,764,关于采用高亲和力β-半乳糖苷酶互补报告分子系统的合理方法的综述。可以使用的报告分子亚单位包括能够缔合来产生可检测信号的任何降低结合亲和性的亚单位。在一个实施方式中,所述的报告分子亚单位是蛋白质,其能够缔合,并且当缔合时能够催化产生可直接或间接检测的产物的反应。
在本发明的某些实施方式中使用的降低亲和力酶互补报告分子系统可以采用衍生自许多不同的酶的报告分子亚单位。可以衍生报告分子亚单位的感兴趣的酶包括,但不限于:β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸酶(GUS)、β-内酰胺酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、cre-重组酶和荧光素酶。
在某些实施方式中,降低亲和力酶互补报告分子系统所基于的酶是野生型大肠杆菌β-半乳糖苷酶,其由E.coli lacZ基因编码。β-半乳糖苷酶活性可以通过许多方法来测量,包括活细胞流式细胞计和利用产色底物5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-吡喃型半乳糖苷(X-Gal)的组织化学染色。参见,例如,Nolan et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,85:2603-2607(1988);和Lojda,Z.,Enzyme Histochemistry:ALaboratory Manual,Springer,Berlin,(1979)。
仅为了说明的目的,现在首先就实施方式进一步地描述本发明,在所述实施方式中降低亲和力酶互补报告分子系统是β-半乳糖苷酶酶互补报告分子系统,即,其中报告分子亚单位是β-半乳糖苷酶片段,其中所述片段可以具有在它们的相应野生型β-半乳糖苷酶分子中存在的氨基酸序列,或具有在它们的相应野生型β-半乳糖苷酶分子中存在的序列的变体的序列。
在某些实施方式中,采用的降低亲和力的β-半乳糖苷酶互补报告分子系统是一种由两个或更多β-半乳糖苷酶片段或其变体组成的系统。例如,在某些实施方式中,报告分子系统包括β-半乳糖苷酶的第一和第二片段(例如,α和ω片段)。在其他的实施方式中,报告分子系统可以包括两个以上β-半乳糖苷酶片段,例如,第一、第二和第三β-半乳糖苷酶片段(例如,α、μ和ω片段)。
在某些实施方式中,在当前方法的实施方式中采用的降低亲和力的β-半乳糖苷酶互补信号产生系统是由β-半乳糖苷酶的第一和第二片段(即,第一和第二β-半乳糖苷酶片段)组成的系统,其中第一和第二片段之间具有亲和力,其根据感兴趣的多肽-多肽相互作用是否发生而提供了不同水平的β-半乳糖苷酶活性。因而,第一和第二β-半乳糖苷酶片段之间具有亲和力,其提供了在不存在感兴趣的相互作用的情况下的、已知的、第一β-半乳糖苷酶活性水平,以及在存在感兴趣的相互作用的情况下的不同的、第二β-半乳糖苷酶活性水平。据此,通过测定所述信号转导生产系统的活性水平,可以确定是否发生感兴趣的相互作用。
所述第一和第二β-半乳糖苷酶片段具有低亲和力的片段,其中所述低亲和力足以提供以上综述的不同的相互作用依赖性活性水平。由于信号生产系统的片段彼此之间具有低亲和力,在不存在感兴趣的多肽相互作用的情况下,由所述片段组成的系统中观察到的活性水平(如使用在下文的实验小节中报道的分析所测定的)低于在不存在感兴趣的相互作用的情况下用Langley et al.,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA(1975)72:1254-1257中所报道的β-半乳糖苷酶互补系统所观察到的活性水平。
这些实施方式的方面包括使用第一β-半乳糖苷酶片段(也成为酶供体或α片段),其是变异的最小N-末端β-半乳糖苷酶肽。最小N-末端β-半乳糖苷酶肽是指,所述肽具有在野生型β-半乳糖苷酶的N-末端区域中存在的氨基酸序列,例如,从N-末端的约10个残基内,例如,野生型β-半乳糖苷酶蛋白的N-末端的约5个残基内开始的序列。由于这个实施方式的第一β-半乳糖苷酶片段是最小的,在某些实施方式中,它们长度是约60个氨基酸或更少,例如长度约55个氨基酸或更少,包括长度约50个氨基酸或更少,例如长度49个氨基酸或更少、长度48个氨基酸或更少,等等。
由于最小N-末端β-半乳糖苷酶肽是变异的,与相应的野生型β-半乳糖苷酶蛋白质的N-末端结构域中的相应序列相比,它们包括至少一个序列变异。所述序列变异可以是插入、缺失或取代,例如,以点突变的形式。所述变异可以是单变异(例如,插入、缺失或点突变)或两个或更多个不同的变异,例如两个或更多个点突变,等等。在某些实施方式中,所述第一β-半乳糖苷酶片段具有对所述第二β-半乳糖苷酶片段(下文中更详细地描述)的结合亲和力,其低于具有野生型大肠杆菌β-半乳糖苷酶的氨基酸残基3到92(例如,在Langley et al.,J.Biol.Chem.(1975)250:2587-2592中描述的)的完整序列的片段与所述第二β-半乳糖苷酶片段的亲和力,例如,其中所述结合亲和力低于所述野生型片段对所述第二β-半乳糖苷酶片段的结合亲和力。
在某些实施方式中,发生在β-半乳糖苷酶片段的区域中的任何序列变异,在所述片段与系统的第二片段互补时,均处于所述第二β-半乳糖苷酶片段内的“包埋(buried)”的位置中。在某些实施方式中,这个结构域包括野生型序列的氨基酸残基29到41的序列,因而所述片段包括在该区域中的变异,例如从氨基酸残基29到41,例如从氨基酸残基31到41。例如,其中变异是点突变时,所述变体可以包括在氨基酸残基29到41处的一个或多个点突变,从而这13个氨基酸残基的一个或多个可以被取代,包括这些氨基酸残基的2个或更多个、三个或更多个、四个或更多个可以被取代。感兴趣的特定的氨基酸点突变包括但不限于:H31(例如,H31R);F34(例如,F34Y);E41(例如,E41Q);和N39(例如,N39Q、N39D)。
α肽序列的示例包括:
SEQ ID NO:1(H31R)
MGVITDSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAARPPFASWRNSEEARTDRPSQQL
SEQ ID NO:2(F34Y)
MGVITDSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRCAAHPPYASWRNSEEARTDRPSQQL
SEQ ID NO:3(E41Q)
MGVITDSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSQEARTDRPSQQL
SEQ ID NO:4(N39D)
MGVITDSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRDSEEARTDRPSQQL
SEQ ID NO:5(截短的)
MGVITDSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRDSEEA
如上文综述的,在第一片段是变异的最小N-末端β-半乳糖苷酶片段的实施方式中,所述第一片段可以与一种或多种其他的片段一起使用,如上文所综述的。在上文综述的某些实施方式中,报告分子系统由第一和第二β-半乳糖苷酶片段组成。所述第二β-半乳糖苷酶片段可以是任何片段,其能够与所述第一β-半乳糖苷酶片段相互作用以提供可检测的β-半乳糖苷酶活性。所述第二β-半乳糖苷酶片段可以包括β-半乳糖苷酶的主要部分,根据全长β-半乳糖苷酶的分子量,相应于所述全长β-半乳糖苷酶的大于约60%、大于约80%、或大于约90%。在某些实施方式中,所述第二β-半乳糖苷酶片段是缺失突变体,其缺失了野生型大肠杆菌β-半乳糖苷酶蛋白(例如,在Langley et al.,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA(1975)72:1254-1257中描述的)的氨基酸11-41,所述片段被成为M15接受体或ω片段。感兴趣的其他特定接受体(即,ω片段)包括但不限于:M112二聚体,一种β-半乳糖苷酶内氨基酸23-31的缺失(Lin,Villarejo and Zabin,1970,Biochem.Biophys.Res.Common.40:249;Celeda and Zabin,1979,Blochem.18:404;Welphy,Fowler and Zabin,1981,J.Biol.Chem.256:6804;Langley et al.,1975,Proc.Natl.Acad.Sci.USA72:1254)。ω肽序列的示例在下文列出(SEQID NO:6):
MGVITDSLAVVARTDRPSQQLRSLNGEWRFAWFPAPEAVPESWLECDLPEAD
TVVVPSNWQMHGYDAPIYTNVTYPITVNPPFVPTENPTGCYSLTFNVDESWLQ
EGQTRIIFDGVNSAFHLWCNGRWVGYGQDSRLPSEFDLSAFLRAGENRLAVM
VLRWSDGSYLEDQDMWRMSGIFRDVSLLHKPTTQISDFHVATRFNDDFSRAVL
EAEVQMCGELRDYLRVTVSLWQGETQVASGTAPFGGEIIDERGGYADRVTLRL
NVENPKLWSAEIPNLYRAVVELHTADGTLIEAEACDVGFREVRIENGLLLLNGKP
LLIRGVNRHEHHPLHGQVMDEQTMVQDILLMKQNNFNAVRCSHYPNHPLWYTL
CDRYGLYVVDEANIETHGMVPMNRLTDDPRWLPAMSERVTRMVQRDRNHPS
VIIWSLGNESGHGANHDALYRWIKSVDPSRPVQYEGGGADTTATDIICPMYARV
DEDQPFPAVPKWSIKKWLSLPGETRPLILCEYAHAMGNSLGGFAKYWQAFRQ
YPRLQGGFVWDWVDQSLIKYDENGNPWSAYGGDFGDTPNDRQFCMNGLVFA
DRTPHPALTEAKHQQQFFQFRLSGQTIEVTSEYLFRHSDNELLHWMVALDGKP
LASGEVPLDVAPQGKQLIELPELPQPESAGQLWLTVRVVQPNATAWSEAGHIS
AWQQWRLAENLSVTLPAASHAIPHLTTSEMDFCIELGNKRWQFNRQSGFLSQ
MWIGDKKQLLTPLRDQFTRAPLDNDIGVSEATRIDPNAWVERWKAAGHYQAEA
ALLQCTADTLADAVLITTAHAWQHQGKTLFISRKTYRIDGSGQMAITVDVEVASD
TPHPARIGLNCQLAQVAERVNWLGLGPQENYPDRLTAACFDRWDLPLSDMYT
PYVFPSENGLRCGTRELNYGPHQWRGDFQFNISRYSQQQLMETSHRHLLHAE
EGTWLNIDGFHMGIGGDDSWSPSVSAEFQLSAGRYHYQLVWCQK.
本发明的方面包括使用以上描述的降低亲和力报告分子系统来检测分子间相互作用,即,两个或更多个分子之间的相互作用(其中所述分子在此被称为结合部分或推定的结合部分)。在使用所述报告分子系统来检测两个或更多个结合部分之间的分子间相互作用时,在某些实施方式中,提供了细胞,其中包括了与报告分子系统中的不同成员稳定地缔合的感兴趣的每一个、不同结合部分。换句话说,提供了细胞,其中每个感兴趣的结合部分与报告分子系统的不同亚单位稳定地缔合。例如,当采用所述系统来检测第一和第二蛋白质之间的相互作用时,提供了细胞,其中包括与第一报告分子亚单位稳定缔合的第一蛋白质,例如,如上所述的变异的最小N-末端β-半乳糖苷酶片段,而第二蛋白质与第二报告分子亚单位,例如如上所述的M15ω片段,稳定缔合。
稳定缔合的意思是,报告分子亚单位和分子实体共价地或非共价地相互结合,例如,经由足够高亲和力的相互作用,从而,它们在应用它们的分析条件下不相互解离,如下文进一步说明的。
可以使用本发明来分析许多不同的结合部分相互之间的结合亲和力,其中结合部分包括能够结合相互作用的任何分子。在两个或更多个结合部分之间的结合相互作用可以是直接的、或是与一种或多种其他的结合种类的复合物的形式,例如带电的离子或分子、配体或大分子。
与报告分子亚单位稳定缔合(即,连接)的结合部分可以是包括碳水化物、脂质、蛋白质和核酸,以及其部分、聚合物或类似物的不同分子中的任一种,只要它们能够与报告分子亚单位连接即可。在某些实施方式中,感兴趣的结合部分是细胞内部分,从而被检测的结合相互作用是细胞内的相互作用,例如,以非空间约束性的方式发生的相互作用。在其他的实施方式中,感兴趣的结合部分是质膜部分,从而被检测的结合相互作用是在质膜位置以空间约束性(例如,二维)的方式发生的相互作用。
示范性的蛋白质包括信号转导级联的成员、调节细胞凋亡的蛋白质、调节细胞周期或肿瘤的发育的蛋白质、转录调节蛋白、翻译调节蛋白、影响细胞相互作用的蛋白质、细胞粘附分子(CAMs)、配体-受体对、参与其他蛋白质的折叠的蛋白,以及涉及靶向特定的细胞内区室的蛋白质,所述区室例如高尔基体、内质网、核糖体、叶绿体和线粒体。其他示范性的蛋白质包括蛋白质激素和细胞因子。细胞因子包括涉及信号转导的那些,例如干扰素、趋化因子和造血生长因子。其他示范性的蛋白质包括白细胞介素、淋巴细胞毒素、转化生长因子-α和β,以及巨噬细胞和粒细胞集落刺激因子。其他蛋白质包括细胞内的酶,例如蛋白激酶、磷酸酶和合酶。涉及细胞凋亡的示范性的蛋白质包括肿瘤坏死因子(TNF)、Fas配体、白细胞介素-1β转化酶(ICE)蛋白酶,和TNF相关的细胞凋亡诱导配体(TRAIL)。细胞周期中涉及的蛋白质包括脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶、增殖细胞核抗原、端粒酶、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶、肿瘤抑制物和磷酸酶。涉及转录和翻译的蛋白质包括核糖核酸(RNA)聚合酶、转录因子、增强子结合蛋白和核糖体蛋白。涉及细胞相互作用例如细胞对细胞信号转导的蛋白质包括受体蛋白和肽激素,或它们的强化或抑制性模拟型。
分子的结合将取决于溶液中的因素,例如pH值、离子强度、试验组分的浓度和温度。在使用在此描述的报告分子系统的结合分析中,结合部分的结合亲和力应当是足够高的,以允许报告分子亚单位之间的互补。在试验溶液例如缓冲系统中或细胞内部结合部分的离解常数的非限制性实例,是低于约10-8M的数量级,例如,低于约10-9M,或任选地,在约10-9到10-12M之间,取决于特定分析系统的蛋白质的性质。
如上所述,报告分子亚单位和结合成员是稳定缔合的。在某些实施方式中,所述报告分子亚单位和一个或多个结合部分直接地或经由接头连接在一起,其中所述连接可以是也可以不是共价键。例如,当所述报告分子亚单位和结合部分是蛋白质时,它们可以通过本领域已知的用于连接肽的方法来连接,例如,从核酸序列表达为融合蛋白,如在下文中更详细地综述的。
在本发明中采用的给定的细胞可以使用任何方便的方案来提供。例如,不同的结合成员与报告分子亚单位的结合物(conjugate)可以使用多种不同的方案来导入细胞,例如,显微注射、电穿孔或各种批量加载技术,或通过在细胞中提供编码不同元件的核酸,例如以融合蛋白的形式。
在某些实施方式中,所述报告分子亚单位和所述结合部分可以构成融合蛋白,其包括报告分子亚单位,例如变异的最小N-末端β-半乳糖苷酶肽或上文综述的ω肽。因而融合蛋白可以由编码核酸在细胞内表达。这种系统在某些实施方式中是有益的,因为使得基于报告分子亚单位的酶互补,可以在细胞,例如哺乳动物细胞中进行蛋白质-蛋白质相互作用的检测和定量。例如,在包括两个互补报告分子亚单位和感兴趣的“测试”蛋白质的嵌合融合蛋白在细胞内产生的实施方式中,由于两种感兴趣的嵌合蛋白质之间的相互作用而检测到的活性,将与报告分子亚单位(例如,非酶的)蛋白质组分的相互作用的强度成比例。因而,相互作用是由感兴趣的测试蛋白质驱动的,而不是互补报告分子亚单位驱动的。酶活性充当了相互作用的指标。这个系统的另一个优点是,检测结合仅需要低水平的测试蛋白质的表达。
在某些实施方式中,构建融合基因构建体并转化到细胞中来产生第一个,例如,低水平的表达,其中这种低水平表达是报告分子亚单位的非结合部分介导的可逆缔合的结果。然后,利用该系统可以监测在存在内源性竞争蛋白质配偶体的情况下,给定细胞中的相互作用,其中融合蛋白将作为结合/缔合反应的“示踪物”起作用。这种系统不倾向于是从导入的蛋白质的过量表达产生的人工制品。融合基因构建体的表达的降低可以通过合适的启动子、核糖体结合位点和其他调节元件的选择来实现。例如,可将融合基因构建体导入载体中,其中它们位于抗生素抗性基因的上游,所述抗生素抗性基因的翻译由脑心肌炎病毒内部核糖体进入序列(IRES)调节,其含有处在负责融合基因的翻译起始的ATG序列上游的剪接供体/接受体序列中的突变。这种类型的构建体引起降低的双顺反子信息中第一编码序列的翻译效力,但是不影响第二(抗生素抗性)序列的翻译,其独立地取决于IRES。作为这种降低的表达水平的结果,浓度依赖性的报告分子亚单位的自发性相互作用的频率将显著地降低。
本发明的方面包括推定的结合部分和本发明的报告分子亚单位之间的融合蛋白。推定的结合部分可以包括任何蛋白质或其他分子,它们结合第二分子的能力有待测试。报告分子亚单位可以是任何分子,其中单体亚单位是无活性的,但是两个或更多个相同的或不同的单体的缔合恢复了活性,例如,其中活性提供了可检测的信号。
本发明的实施方式中的融合蛋白包括单个的氨基酸连续线性聚合物,其包括两种或更多种不同蛋白质的全部或部分序列。两种或更多种氨基酸序列可以化学地连接,例如,通过交联剂的居间性(intermediacy)。在某些实施方式中,融合蛋白通过在细胞中表达融合基因构建体来产生。融合基因构建体包括单个的核苷酸连续线型聚合物,其在相同的不间断的阅读框中编码两种或更多种不同蛋白质的全部或部分序列。融合基因构建体还可以含有真核和/或原核细胞中的复制起点活性,以及编码药物抗性之类的一个或多个选择性标记。它们还可以含有病毒包装信号,以及转录和/或翻译调节序列和RNA加工信号。
在某些实施方式中,将本发明的融合基因构建体导入细胞中来分析所述融合基因构建体编码的推定的结合部分之间的结合。融合基因构建体还可以含有启动子和其他转录和/或翻译调节序列,它们通常与编码推定的结合部分的基因相关。融合基因构建体可以通过本领域已知的任何核酸转移方法来导入细胞,包括但不限于,病毒载体、转化、共沉淀、电穿孔、中性或阳离子脂质体介导的转移、显微注射或基因枪。感兴趣的病毒载体包括但不限于:逆转录病毒、痘病毒、疱疹病毒、腺病毒和腺病毒相关病毒。在某些实施方式中,采用逆转录病毒载体,其能够稳定整合到宿主细胞的基因组中。例如,编码整合和包装信号、药物抗性标记物和一个或多个感兴趣的融合基因的逆转录病毒构建体在本发明的实施方式的实践中是有用的。
编码单一的融合蛋白的不同的融合基因构建体可以存在于独立的核酸分子或同一核酸分子上。在某些实施方式中,采用同一载体,从而细胞仅摄取一种类核酸就足以将编码两种推定的结合配偶体的序列导入细胞。对于导入的顺序而言,在编码序列处在不同载体上的那些实施方式中,在此可以同时地或次序地导入细胞中。
本发明的融合基因构建体或融合蛋白可以被导入培养的细胞、体内的动物细胞、体外的动物细胞、或期望在其中研究蛋白质-蛋白质相互作用的任何其他类型的细胞。因而,在本发明的实践中有用的细胞包括原核和真核细胞,其中示范性的真核细胞包括哺乳动物细胞(例如,鼠的、猫的、犬的、人类的,等等)、酵母细胞、寄生虫细胞,等等。在某些实施方式中,所述细胞是具有特定表型的细胞,包括基本上正常的、赘生的或癌性的细胞和建立的细胞系(例如,无限增殖化的肿瘤细胞系)。
在提供了包含用报告分子系统的不同亚单位标志(即,标记)的、感兴趣的不同结合成员的细胞之后,评估细胞的报告分子系统的活性,其中这种评估步骤的结果提供了关于感兴趣的结合相互作用是否发生的信息。在某些实施方式中,评估包括检测活性然后将观察到的活性与参考或对照值比较,所述参考或对照值例如,早先测定的背景活性值,例如作为降低亲和力报告分子系统的不同亚单位的可逆相互作用的结果单独地观察到的β-半乳糖苷酶活性的水平(例如,早先测定的已知的背景水平)。如以下更详细地展开的,评估可以包括在给定观察期的两个或多个时间上观察活性,例如,在用测试试剂接触细胞之前或之后,等等,这可能是给定的分析方案所要求的。这个评估步骤可以包括提供所述系统的酶的适合的底物,检测所述酶介导的可检测产物的产生,如以下更详细地展开的。
在此公开的报告分子系统可以用于通过产生可检测信号的报告分子亚单位之间的互补来分析附着在报告分子亚单位上的、推定的结合部分的结合相互作用。除了测试推定的结合部分之间的直接结合相互作用之外,可以评估依赖于一种或多种其他分子或离子的相互作用。进一步的,可以在活的动物细胞中评估多个分子间的相互作用,以及各种药、肽和药物对这些相互作用的影响。
在一个实施方式中,一种或多种推定的结合部分的结合亲和力可以通过提供报告分子系统来测量,所述报告分子系统包括具有结合到第一报告分子亚单位的部分之一的一个组分、以及具有结合到第二报告分子亚单位的另一个推定的结合部分的至少一个其他的组分。结合部分可以是不同的也可以是相同的。在所述系统中,仅当被置于相互接近时,例如通过一种或多种推定的结合部分的结合,报告分子亚单位能够结合并产生可检测信号。信号可以被直接地或间接地检测和定量,例如,通过使信号与对照值(例如,在适合的对照分析中获得的)比较。
在本发明的一个实施方式中,蛋白质-蛋白质相互作用可以被检测和定量。互补的报告分子亚单位产生的信号可以作为推定的结合部分之间的结合的指标,所述结合是直接地或经由第三物质间接地。可以被检测的信号包括光发射和吸光度。示范性的信号包括产色的、荧光的和发光的信号。这些信号可以通过目测或使用分光光度计、荧光计、显微镜、闪烁计数器、或其他本领域已知的测试设备来检测和定量。
在此公开的报告分子系统的组分的结合将取决于溶液中的因素,例如pH值、离子强度、分析的组分的浓度和温度。可以对特定的系统设计和开发分析溶液。在此公开的报告分子系统可以用于在溶液中进行分析,例如,缓冲的无细胞溶液、细胞内部、细胞的溶液、细胞溶胞产物的溶液、细胞级分的溶液,例如核级分、细胞质级分、线粒体级分和膜级分。可以使用本领域已知的用于制备分析溶液,例如酶分析溶液、细胞提取物和细胞悬液的方法。例如,可以使用生理学相容的缓冲液,例如磷酸盐缓冲盐水。参见,例如,Methods inEnzymology,Academic Press,New York的系列。
在一个实施方式中,所述报告分子亚单位能够相互互补来形成酶学活性的复合物,其能够催化底物向可直接或间接地检测的产物的转化。在一个实施方式中,所述报告分子系统可以包括两个或更多个组分,各组分均是融合蛋白,其中所述融合蛋白各自包含与低亲和力报告分子亚单位融合的推定的结合蛋白。因而,可以构建编码融合蛋白的核酸,将其导入细胞中并在细胞中表达。做为选择,结合的报告分子单位或结合的结合部分可以通过检测标记的特异性结合部分,例如针对结合复合物的抗体的结合来检测。
在一个实施方式中,所述低亲和力报告分子亚单位可以是β-gal的互补亚单位,如上文综述的。所述系统可以包括三个或更多个报告分子亚单位,它们所有的都是产生可检测信号的缔合所需的。可以使用本领域中已经开发的检测活性β-gal的反应产物的方法。例如,β-半乳糖苷酶活性可以通过一系列方法来测量,包括活细胞流式细胞计和使用产色底物5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D吡喃型半乳糖苷(X-Gal)的组织化学染色。Nolan et al.,Proc.Natl.Acad.Sci,USA,85:2603-2607(1988);和Lojda,Z.,Enzyme Histochemistry:A Laboratory Manual,Springer,Berlin,(1979)。β-gal的组织化学染色可以通过在暴露于X-gal之后细胞的固定来实现。
可以使用在Mohler and Blau,Proc.Natl.Acad.Sci.,93:12423-12427(1996)中描述的β-gal活性的分析。在一个实施方式中,细胞内分析可以通过固定细胞并用生靛蓝(indigogenic)底物X-gal染色来进行。通过使用与X-gal或5-溴-6-氯-3-吲哚基β-D-吡喃型半乳糖苷(5-6-X-Gal)组合的偶氮染料通过荧光组织化学来分析β-gal活性,也可以分析固定的细胞。感兴趣的组合是偶氮染料红紫色LB(Sigma Chemical,St.Louis,Mo.)和称为Fluor-X-gal的5-6-X-Gal。对于这种组合,可以使用罗丹明/Texas Red滤镜组在荧光显微镜上获得荧光显微照片。使用这些底物可使β-gal依赖性荧光与两种或更多中其他的荧光信号同时地显现。
可以在活细胞中使用的、β-gal的重要的底物,也包含于本发明。例如,已经描述了重要的荧光底物试卤灵β-半乳糖苷二氨基丙基聚乙二醇1900(RGPEG)。Minden(1996)BioTechniques20(1):122-129.这种化合物可以通过显微注射、电穿孔或各种批量加载技术递送给细胞。一旦处在细胞内部,所述底物不能通过质膜或通过间隙连接(gapjunction)逃逸。可以用于本发明的实践的另一种重要的底物是荧光素二-β-D-吡喃型半乳糖苷(FDG),其对于通过荧光活化的细胞分选(FACS)和流式细胞计的分析是特别便利的。Nolan et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2603-2607和Rotman et al.(1963)Proc.Natl.Acad.Sci.US A50:1-6。
β-gal也可以使用化学发光分析来检测。例如,含有β-gal融合物的细胞在缓冲液的混合物中被裂解,所述缓冲液含有来自GalactolightPlus分析试剂盒(Tropix,Bedford Mass.)的Galacton Plus底物。Bronstein et al,J.Biolumin.Chemilumin.,4:99-111(1989)。在添加Light Emission Accelerator溶液之后,在光度计或闪烁计数器中测量发光。
适合于分光光度法或荧光分析的代表性的底物包括但不限于:对氨基苯基-β-D-吡喃型半乳糖苷;2'-N-(十六醇)-N-(氨基-4'-硝基苯基)-β-D-吡喃型半乳糖苷;4-methylumbel-liferyl-β-D-吡喃型半乳糖苷;萘基-AS-B1-β-D-吡喃型半乳糖苷;1-萘基-β-D-吡喃型半乳糖苷;2-萘基-β-D-吡喃型半乳糖苷一水合物;O-硝基苯基-β-D-吡喃型半乳糖苷;间硝基苯基-β-D-吡喃型半乳糖苷;对硝基苯基-β-D-吡喃型半乳糖苷;和苯基-β-D-吡喃型半乳糖苷,5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-galactopynanosiredse,试卤灵-β-D-吡喃型半乳糖苷,7-羟基-4-三氟甲基香豆素,Ω-硝基苯乙烯基-β-D-吡喃型半乳糖苷和荧光素-β-D-吡喃型半乳糖苷。参见,例如美国专利No.5,444,161。
除了β-gal以外的报告分子系统也可以用于本发明的实践。例如,酶β-葡糖醛酸酶(GUS)可以用作报告分子,已经开发了产色的和发荧光的GUS底物。GUS底物5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-葡糖醛酸(X-gluc)可以用于产生和发荧光应用中,如下。在产色染色的一种方法中,固定的细胞在PBS中洗涤,用2mM X-gluc(Molecular Probes,EugeneOR)、10mM EDTA、0.5mM K3Fe(CN)6、0.5mM K4Fe(CN)6、0.1%Triton X-100、0.1M NaPO4染色。发荧光染色可以通过使用5-溴-6-氯-3-吲哚基β-D-葡糖醛酸(5,6-X-gluc,Molecular Probes,Eugene,Oreg.)和Fast Red Violet LB(Sigma Chemical,St.Louis,Mo.)的组合来实现。固定的细胞用PBS清洗,在50μg/ml的5,6X-gluc和100μg/ml的Fast Red Violet LB中染色,然后在PBS中清洗。在被调整以检测罗丹明荧光的荧光显微镜上检测荧光。在本发明的一个实施方式中,报告分子亚单位包括酶和酶的抑制物。在这些实施方式中,所述抑制物具有对酶的低亲和力。在这种情况下,在推定的结合部分之间的缔合通过酶活性的抑制被证明。示范性的酶包括β-gal、GUS、β-内酰胺酶,等等。
在此公开的方法可以进行在细胞溶胞产物中、以及在完整细胞中结合事件的检测和定量。因而,在完全折叠的蛋白质之间的相互作用是可检测的,结合部分的共翻译表达不是要检测的结合所必需的。
在本发明的实践中,反应产物可以被间接地检测,例如,通过免疫技术,例如免疫荧光法标记。
蛋白质-蛋白质相互作用可以在包括一种或多种融合蛋白的报告分子系统中测量。融合蛋白各自包括与低亲和力报告分子亚单位结合的推定的结合蛋白。对于融合蛋白的细胞内表达,制备了一种或多种融合基因构建体,其包括编码所述融合蛋白的序列。可以通过本领域可获得的任何核酸转移方法来将融合基因构建体导入细胞,其包括但不限于,病毒载体、转化、共沉淀、电穿孔、中性或阳离子脂质体介导的转移、显微注射或基因枪。
各种基于细胞的分析可以使用含有融合基因构建体的细胞来进行。在细胞中表达的融合蛋白中的推定的结合部分的结合可以通过检测经历独立结合成员介导的互补的报告分子亚单位产生的信号来确认。因而,例如,当报告分子亚单位是互补β-gal亚单位时,展现β-gal活性的细胞表明了在这些细胞内推定的结合部分之间的结合。
融合基因构建体还可以含有启动子和其他转录和/或翻译调节序列,它们通常与编码推定的结合部分的基因相关。这可以使得在体内推定的结合蛋白的生理学相关水平的研究进行,与其中测试蛋白过量表达的系统相反。进一步的,这允许研究随着时间的推移在结合活性的水平方面自然出现的改变,可以揭示内源或外源的物质对结合相互作用的影响。
本发明的方法和组合物也可以用于研究其他分子,所述分子影响两个推定的结合配偶体之间的相互作用,例如,在筛选分析,包括高通量筛选分析中。蛋白质、肽、核酸、碳水化物、脂质、离子、小分子、合成化合物或其他物质(对于细胞是内源的或外源地添加的)可以作为结合相互作用的激动剂或拮抗剂。通过测量这些分子对,例如含有代表特定测试蛋白质配对的两种或更多融合物的细胞所产生的β-gal活性的影响,可以测定这些分子的激动剂或拮抗剂活性。使用本发明的方法和组合物将可以进行高通量分析来测试特定的结合相互作用的激动剂或拮抗剂。在筛选影响医学上相关的蛋白质-蛋白质相互作用的药物中,这种高通量分析将是特别有价值的。
在本发明中使用的推定的结合配偶体或推定的结合部分可以包括一些通常情况下不相互作用的分子,但是在存在第三分子的情况下所述分子各自与第三分子作用,推定的结合配偶体被带至一起。因而,影响推定的结合配偶体之间的相互作用的物质包括刺激推定的结合配偶体之间的弱相互作用的那些,以及介导通常相互不作用的分子之间的相互作用的一种或多种分子。此外,影响推定的结合配偶体之间的相互作用的物质可以包括直接或间接地影响上游事件的那些,所述上游事件引起推定的结合配偶体之间的缔合。例如,如果推定的结合配偶体之一的磷酸化为它赋予了与另一个推定的结合配偶体缔合的能力;影响所述推定的结合配偶体的相互作用的物质包括直接或间接地影响激酶活性的那些。
可以如本发明所公开的展开试验以检查对多种组合物的分子间相互作用的影响,包括药物,例如退热剂和抗炎性药物、镇痛药、治风湿药、解痉药、抗抑郁药、抗精神病药、镇静剂、抗焦虑药、麻醉药拮抗药、抗帕金森病剂、胆碱能拮抗剂、化学治疗剂、免疫抑制剂、抗病毒剂、杀寄生物药、食欲抑制剂、止吐药、抗组胺剂、抗偏头痛试剂、冠状动脉血管扩张剂、脑血管扩张剂、周围血管扩张药、激素试剂、避孕药、抗血栓形成试剂、利尿剂、抗高血压药、心血管药物、鸦片样物质和维生素。
可以检测和定量第三分子介导的蛋白质-蛋白质相互作用。也可以研究结合的动力学。例如,在向表达第一和第二结合成员以及第一和第二报告分子亚单位的融合体的细胞的培养物添加结合介体(bindingmediator)之后,通过测量在不同时间的β-gal活性,可以测定结合的动力学。也可以获得剂量反应曲线,其中通过测定β-gal活性测量的结合的程度作为结合介体浓度的函数。这种分析可以适用于控制蛋白成分对它的融合配偶体的可能的影响,从而可以利用定量的方式研究蛋白质-蛋白质相互作用。例如,提供了包括报告分子亚单位、结合蛋白和感兴趣的蛋白质的三联的融合物构建体。可以测定β-gal活性的绝对值,其通过含有感兴趣的测试蛋白质的融合物以及含有不同的潜在相互作用配偶体的融合物的简单共表达来获得。在平行的样品中,在诱导与固定数量的测试蛋白的互补之时测量β-gal活性。在不存在和存在测试蛋白质的情况下获得的β-gal活性的比例表明了不同的蛋白质配对相互作用的相对能力。三联的融合物系统的进一步的优点是,第一和第二结合成员组分的存在提供了β-gal突变体和测试蛋白质之间的柔性铰链结构域。这降低了β-gal组分和测试蛋白质之间的干扰的可能性。此外,它容许直接测试融合物中β-gal组分的功能完整性,而不需要将其重新克隆到更有效率的病毒载体中。
也可以设计具有对照的报告分子系统以定量β-gal融合蛋白的表示水平。由此可以控制两种(或更多种)融合蛋白的潜在差异表达。例如,作为肽标记,可获得的、良好表征的单克隆抗体可以框内融合到每个β-gal突变体的C-末端。不同的标记,例如flag、HA和myc可用于不同的亚单位,由此即使两种突变体在同一细胞中共表达,也可以对它们进行差异检测。与这些细胞的溶胞产物中β-gal活性的测定并行地,ELISA分析可以测定同一溶胞产物中每种β-gal融合蛋白的精确数量。首先,多克隆抗β-gal抗血清可以用于固定抗原。然后,利用针对合适的标记的单克隆抗体,以及连接有酶的抗小鼠第二抗体对感兴趣的β-gal融合蛋白的数量进行定量。这种方法,应用已充分表征的技术,可以对每种融合蛋白的表达水平进行测定。这种修饰将是有用的,其中连接的标记不会损害所述蛋白质的结合或报告分子亚单位互补的能力。
实用性
本发明的实施方式可以用于需在活细胞中定量或定性地进行的多种蛋白和其他类型的多种分子间相互作用的广泛的研究。在下文中,提供了本发明的方法的不同应用的非限制性的实例。
本发明的方法可以用于筛选给定的目标蛋白质的新的结合配偶体。在这个实施方式中,融合到第一报告分子亚单位的目标蛋白质在已充分表征的细胞系中稳定地表达。使用例如逆转录病毒载体(例如,Kitamura et al.,Proc Natl.Acad.Sci.USA 92:9146-9150(1995))或任何本领域已知的其他基因转移方法,将含有与第二报告分子亚单位融合的cDNA的表达库导入这些细胞中。通过鉴定阳性克隆分离表达与目标蛋白质相互作用的基因产物的载体,所述的阳性克隆为具有由第一和第二报告分子亚单位的互补产生的活性的克隆。这种系统的有益之处在于所述的筛选可以在任何细胞类型中进行,不考虑细胞的内源(和潜在的竞争性)蛋白质环境(milieu)。在某些实施方式中,目标蛋白质定位于特定的细胞区室,目的是鉴定限制到特定位置的相互作用中涉及的蛋白质。使用荧光活化的细胞分选技术特别适合于本发明的这种实施方式。例如,β-gal阳性细胞可产生一种信号,籍此可使这些细胞通过细胞分选技术来纯化,所述β-gal阳性细胞含有表达与目标蛋白质作用的基因产物的cDNA。这种cDNA可以使用例如逆转录病毒载体来递送,所述逆转录病毒载体容许以高的感染效力导入高复杂度的cDNA库。
本发明的分析和方法也可以在存在细胞外信号分子、生长因子或分化因子、肽、药物或合成的类似物等等的情况下进行,它们的存在或作用可以改变特定细胞类型中两种或更多种给定蛋白质之间的相互作用。
使用本发明的方法和组合物的分子间相互作用检测不局限于在核中发生的那些,它也不限于细胞内相互作用。例如,涉及表面受体的相互作用可以利用本发明进行检测。在一个实施方式中,本发明提供了用于在活细胞中检测配体诱导的表面受体二聚体形成的新技术。细胞表面受体的二聚体形成或更高级别的寡聚反应通常是受体活化并引起信号转导的先决条件。本发明的实践不局限于两种不同的分子之间的相互作用的检测。也可以使用本发明的方法和组合物来检测分子的多聚体形成。
在某些实施方式中,采用本发明的方法结合逆转录病毒中的高滴度、高复杂度cDNA库一起鉴定在哺乳动物细胞中特定的测试蛋白质的相互作用配偶体(例如,在蛋白水平进行功能基因组学)。对于这种应用,将使用在逆转录病毒载体中构建cDNA库,在所述逆转录病毒载体中cDNA编码序列与编码第一报告分子亚单位的序列融合,例如,其存在于第一逆转录病毒载体中。在第二系列的逆转录病毒载体中,第二报告分子亚单位与多种将被测试其结合目标蛋白质的能力的不同的蛋白质相融合。所述的测试将通过使用第一逆转录病毒载体和一系列第二逆转录病毒载体之一的细胞共感染来进行。能够结合感兴趣的蛋白质的那些测试蛋白质可使得所述测试蛋白与感兴趣的蛋白质共同表达的细胞中被检出报告分子信号。这种应用在筛选医学上相关的蛋白质相互作用的激动剂和拮抗剂中也是有用的。
在本发明的一个实施方式中,通过流式细胞计或荧光活化的细胞分选(FACS)检出并分离下述细胞,所述细胞中由一系列第二载体之一编码的蛋白质能够与第一载体编码的、感兴趣的结合蛋白相互作用。流式细胞计和FACS的方法是本领域公知的;例如,Nolan et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA 85:2603-2607;Webster et al.,Exp.Cell Research,174:252-265(1988);以及Parks et al.(1986)in TheHandbook of Experimental Immunology,(eds.Weir,D.M.,Herzenberg,L.A.,Blackwell,C.C.& Herzenberg,L.A.),Blackwell,Edinburgh,4th edition,pp.29.1-29.21。这样,其中发生结合的克隆可以被分离和增殖用于进一步的研究。这个方面特别适合于发育机制的研究,所述研究中,可选择在其中发生特定的发育相关的相互作用的细胞的群体,并研究该细胞群体的进一步的发育,作为对比,可同时研究其中不发生相互作用的细胞的发育。按照类似的方式,实施本发明可分离和/或研究存在相互作用所涉及的蛋白质的细胞的进一步发育,所述蛋白质例如转录调节蛋白、翻译调节蛋白、DNA复制蛋白、mRNA剪接蛋白、涉及信号转导的蛋白质、涉及细胞-细胞和细胞-基质粘附的蛋白质(例如,细胞运动、轴突导引和血管生成)、癌基因产物、肿瘤抑制物、涉及细胞周期控制的蛋白质和病毒蛋白质,例如涉及病毒复制、病毒-宿主相互作用和调节病毒组装的那些蛋白,以及在细胞的细胞骨架内作为亚单位、交联剂、调节剂或分子引擎的蛋白质。
对于其基因能够与报告分子亚单位融合的、给定的目标蛋白质,通过使用本发明的组合物和方法,有可能鉴定与之相互作用的已知的和迄今未知的蛋白或其他内源的或外来的物质。按照类似的方式,对于编码未知功能的蛋白质的序列,例如可以从核酸序列数据库获得的(或大量的序列,例如cDNA库),实施本发明可以使人们鉴定与所编码的蛋白质相互作用的分子。相互作用分子的鉴定提供了关于未知蛋白质的结构和/或功能的信息。因而,本发明的实施方式有助于新近发现的蛋白质和蛋白质编码核酸序列的鉴定和表征。
在本发明的另一个方面中,用于蛋白质-蛋白质相互作用鉴定的鸟枪方法可以通过下述方式进行,即:制备第一组构建体,其表达与第一报告分子亚单位融合的一个cDNA库的编码产物;以及制备第二组构建体,其表达与第二报告分子亚单位融合的第二(或相同的)cDNA库的编码产物。两组构建体共表达并选择其中发生了互补的细胞,由此分离克隆,并鉴定编码相互作用配偶体的cDNA。相互作用配偶体之一或两者可以是已知的;做为选择,相互作用配偶体的两者也可以代表迄今未被鉴定出来的蛋白质。如果两种配偶体都是已知的,可以获得关于它们的结合特异性的新的信息。如果一种配偶体是已知的,它可以提供关于未知的结合配偶体的功能的信息。如果两者都不是已知的,观察它们的相互作用有助于最后鉴定相互作用对中之一或两者。
本发明可以应用于机制的研究,所述机制调节特定分子的同源二聚体形成、异源二聚体形成或多聚体形成,包括高效率筛选来鉴定能够影响这种二聚体形成/多聚体形成的、合成的或自然出现的化合物。
本发明可以应用于在中枢神经系统疾病中发现的异常的或病理性的蛋白聚集物的研究,例如帕金森症、阿尔茨海默症、Cruzsfeld-Jacob病等等。这些研究可以在体内或体外模型系统中进行。在体外分析中,可以采用许多的细胞类型,譬如培养的神经元细胞(例如,哺乳动物、昆虫、线虫等等)乃至被工程化以表达感兴趣的蛋白聚集物的非神经元细胞。
例如,近来采用了酵母细胞来研究α-突触核蛋白错折叠和聚集,其与包括帕金森氏病在内的神经变性失调相关(参见,例如,Cooperet al.2006Science313:324-8通过引用合并在此)。根据上文的本发明的描述,产生了可诱导地表达α-突触核蛋白、各具有相应的报告分子亚单位的两种融合蛋白的酵母细胞。当在这些细胞中存在α-突触核蛋白聚集时(即,当两种融合蛋白表达时),报告分子亚单位将相互互补来产生具有可检测活性的功能酶。在进行筛选分析时,在存在或缺少一种或多种候选试剂的情况下诱导酵母细胞中两种α-突触核蛋白融合蛋白的表达(其中,所述试剂可以在α-突触核蛋白表达的诱导之前、期间或之后添加)。与对照细胞相比,抑制、阻止和/或逆转细胞中α-突触核蛋白聚集的试剂将降低报告基因活性。进一步评估具有这种期望的活性的试剂在作为治疗剂用于治疗α-突触核蛋白聚集引起的疾病状况中的适用性。
如上所指出的,在细胞中形成病理性聚集物的其他蛋白质(或蛋白质的组合)可以是如上所述的筛选分析的目标。这些分析在治疗试剂筛选中是非常有用的,因为它们是快速的并可以经受高通量筛选(HTS)应用(例如,高通量流式细胞计筛选)。
本发明还可应用于确定在待测定的细胞中短暂的或不稳定的蛋白质/蛋白质相互作用的存在。因为利用本发明可以在体内读出细胞中蛋白/蛋白的缔合,它们可以被用于检测不稳定的或短暂的蛋白质/蛋白质相互作用,而标准的细胞分级分析不行(即,由于在检测之前的样品加工期间蛋白质/蛋白质相互作用被破坏)。
例如,可以采用本发明来研究多种细胞类型中的热激蛋白(HSP,例如,HSP-90)侣伴蛋白复合物形成,包括酵母、昆虫、哺乳动物、植物等等(参见,例如,Queitsch et al.2002Nature417:618;Cowen andLindquist,2005Science309:2185;和Rutherford and Lindquist1998Nature396:336通过引用将每一个合并在此)。在这些分析中,构建HSP/报告分子亚单位融合蛋白和相应的目标蛋白质/报告分子亚单位融合蛋白并在细胞中表达。体外的或在生物体(例如转基因动物)中的细胞经历一种或多种感兴趣的条件(例如,药物/抗生素处理、温度压力、氧化压力、营养压力、用细胞因子/激素/生长因子等等处理),HSP融合蛋白和目标融合蛋白的蛋白质/蛋白质相互作用受到监视(即,监视复合物的形成和解离)。筛选也可以设置为,其中在特定条件下测试报告分子融合物库(例如,核酸库)中HSP缔合成员的存在。例如,表达HSP融合蛋白和库融合蛋白(例如,表达由来自库的核酸编码的蛋白质)的细胞可以用药物处理和/或将其置于特定条件下,分析HSP与库蛋白的缔合/解离。这些分析可用于测定野生型和突变形式的蛋白质的活性在不同的条件下是如何被调控的。
本发明可以用于涉及在完整细胞或完整动物之内定位特定复合物相关的研究。可以使用的细胞的类型是原代的或建立的细胞系和其他类型的胚胎的、新生儿的或成年人的细胞,或转化的细胞(例如,自发地或病毒转化的)。这些包括但不限于成纤维细胞、巨噬细胞、成肌细胞、破骨细胞、破骨细胞、造血细胞、神经元、胶质细胞、原代B-和T-细胞、B-和T-细胞系、软骨细胞、角质形成细胞、脂肪细胞和肝细胞。
通过本发明还可以设计用于通过调节互补突变体的缔合来调节酶活性的系统。本发明的这个方面作为以酶驱动的形式调节前体药物向它们的活性形式的转化的方法,对于人类治疗具有潜在的应用。
可以通过实施本发明研究的涉及分子间相互作用、特别是蛋白质-蛋白质相互作用的过程,其包括但不限于,转录、翻译、复制、有丝分裂、生长控制、细胞周期的发展和调节、细胞凋亡、细胞-细胞、细胞-基质和细胞-配体相互作用、细胞内信号转导级联、肿瘤发生、细胞谱系和胚胎发育。细胞配体的实例包括瘦蛋白和生长因子,例如表皮生长因子(EGF)、神经生长因子(NGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、和胰岛素样生长因子I和II(IGF-I和IGF-II)、转化生长因子α和β(TGF-α和TGF-β)、内啡肽和内啡肽受体、前列腺素及其受体、细胞因子及其受体、神经递质及其受体、肾上腺素能受体和胆碱能受体。可以与配体相互作用的受体包括但不限于:EGF、NGF和PDGF受体和瘦蛋白受体。
可以通过实施本发明研究的其他相互作用包括涉及细胞代谢和细胞结构的相互作用。这些包括但不限于,涉及能量代谢的相互作用,或者建立或修饰细胞的膜、细胞质、细胞骨架、细胞器、核、核基质或染色体的相互作用。在细胞外基质的成分之间、或在细胞外基质和细胞的成分之间的相互作用,也可以用本发明的方法和组合物来研究。
降低亲和力酶互补报告分子系统的其他的实用性包括但不限于,在公开的美国专利申请系列号Nos.20030219848;以及在美国专利Nos.4,378,428;4,708,929;5,037,735;5,106,950;5,362,625;5,464,747;5,604,091;5,643,734;和PCT申请WO96/19732;WO98/06648;WO92/03559;WO01/0214;WO01/60840和WO00/039348中描述的那些,它们的公开内容作为参考并入本申请。
试剂盒
本发明还提供用于实施一种或多种上述用途的试剂盒。在某些实施方式中,所述试剂盒至少包括细胞,其组成型地或可诱导地表达一种或多种融合蛋白,所述融合蛋白包括结合成员和报告分子亚单位,如上文所综述的。在某些实施方式中,所述试剂盒包含用于产生所述细胞的元件,例如,存在于相同或不同载体上的、编码第一和第二融合蛋白的第一和第二核酸,和/或编码报告分子亚单位的核酸,如上文所综述的,感兴趣的蛋白质可以使用标准的分子生物学技术融合到所述报告分子亚单位上。所述试剂盒可以进一步包括一种或多种其他的组分,包括但不限于,酶底物、细胞生长培养基,等等,其在本发明的实施方式中具有用途。
除了上述组分之外,所述试剂盒可以进一步包括用于实践当前方法的说明书。这些说明书可以以各种形式存在于当前的试剂盒中,试剂盒中可以包含一份或多份。这些说明书的一种形式是在适合的介质或基质,在试剂盒的包装中、在包装插入物中,等等上印刷的信息,例如,印刷了信息的一张或数张纸。另一种方式将是计算机可读的介质,例如,磁盘、CD等等,在上面已经记录了信息。另一种方式是网址,其可以通过因特网使用来在移动的位置访问信息。任何方便的方式均可应用于所述试剂盒。
仅通过举例而不是限制性的方式提供了以下实施例。
实验
I.降低亲和力β-半乳糖苷酶系统
我们近来描述了基于邻近(proximity-based)的低亲和力酶互补系统,用于利用β-gal监视蛋白易位。为了实现低亲和力互补,将由Jacob和Monod(1961)首先描述的经典的α肽截短并根据晶体结构使特定的残基突变,以产生与ω片段微弱地互补的α肽(α*)。为了分析蛋白质运动,将一个酶片段ω定位在特定的亚细胞区域中,将小的、互补α*肽与感兴趣的蛋白质相融合。在ω的紧密邻近处的α*的浓度以剂量和时间依赖性的方式与所获得的酶活性的数量相关,其作为局部蛋白质浓度的遗传编码的生物传感器(T.S.Wehrman,C.LCasipit,N.M.Gewertz,H.M.Blau,Nat Methods2,521(Ju,2005))。由于它们的低亲和力,α*和ωβ-gal片段的相互作用强度不足以维持互补的酶。结果,在任何给定时间获得的β-gal活性可作为两种片段的动态相互作用的量度,也反映了它们的局部浓度。在2005年5月18日提交的美国申请系列号NO.11/132,764中进一步描述了这种降低亲和力系统,在该申请中描述的所述系统的内容以及的实验部分中描述的其方法和产品均作为参考引入本发明。
利用这种系统,两种蛋白质的相互作用作为与受体蛋白质融合的、β-半乳糖苷酶(β-gal)低亲和力突变亚单位的互补作用的函数进行测量(图1A)。可以分析可逆的和可诱导的相互作用,信噪比高,受体同源和异源二聚体可以在大的多克隆细胞群体的质膜上以定量的方式来比较。
这种特征的组合在其他蛋白质相互作用检测系统中没有发现,所述其他蛋白质相互作用检测系统基于能量转移(Y.Xu,D.W.Piston,C.H.Johnson,Proc Natl Acad SciUSA96,151(Jan5,1999);B.A.Pollok,R.Heim,Trends Cell Biol9,57(Feb,1999))、或基于分裂酶(split enzyme),包括二氢叶酸还原酶(J.N.Pelletier,F.X.Campbell-Valois,S.W.Michnick,Proc Natl Acad Sci U S A95,12141(Oct 13,1998))、β-内酰胺酶(A.Galarneau,M.Primeau,L.E.Trudeau,S.W.Michnick,Nat Biotechno20,619(Jun,2002);T.Wehrman,B.Kleaveland,J.H.Her,R.F.Balint,H.M.Blau,Proc NatlAcad Sci U S A99,3469(Mar19,2002))、荧光素酶(R.Paulmurugan,S.S.Gambhir,Anal Chem75,1584(Apr1,2003))和之前所述的β-半乳糖苷酶(F.Rossi,C.A.Charlton,H.M.Blau,Proc Natl Acad SciU S A94,8405(Aug5,1997);F.Rossi,C.A.Charlton,H.M.Blau,Proc Natl Acad Sci U S A94,8405(Aug5,1997))。这种新的降低亲和力β-半乳糖苷酶系统可以使与乳腺癌相关的ErbB家族成员的组合相互作用的比较分析得以进行,如下文即将综述的。
II.使用降低亲和力β-半乳糖苷酶系统来研究EGFR、ErbB2和ErbB3同源和异源二聚体化的能力
受体酪氨酸激酶的ErbB家族的成员ErbB2(HER2/Neu)在30%的乳腺癌中过量表达,并且最明显地与恶性表型和不良预后相关,特别是如果与表皮生长因子受体(EGFR)共表达(D.J.Slamon et al.,Science235,177(Jan9,1987);D.Gschwantler-Kaulich et al.,OncolRep14,305(Aug,2005):M.P.DiGiovanna et al.,J Clin Oncol23,1152(Feb20,2005))。对于肿瘤过表达ErbB2的乳腺癌患者,单克隆抗体曲妥单抗(Herceptin)以前所未有的方式延长了寿命并降低了复发率使相关治疗发生了巨大变化(M.J.Piccart-Gebhart et al.,NEngl J Med353,1659(Oct20,2005);M.A.Cobleigh et al.,J ClinOncol17,2639(Sep,1999);E.H.Romond et al.,N Engl J Med353,1673(Oct20,2005))。然而,曲妥单抗仅在其使用的病例的某个亚组中有效,迄今为止还没有预测哪种ErbB2阳性肿瘤将相应于治疗的可被接受的基础。一定程度上是由于对曲妥单抗作用的机制的了解不完全。虽然存在某些证据证明,曲妥单抗靶向肿瘤细胞并通过免疫系统对其进行破坏(R.A.Clynes,T.L.Towers,L.G.Presta,J.V.Ravetch,Nat Med6,443(Apr,2000)),但是,该抗体最初是作为独立于免疫反应的体外肿瘤细胞生长抑制物被挑选出的(R.M.Hudziak et al.,Mol Cell Biol9,1165(Mar,1989)。已知曲妥单抗不阻断ErbB2的异源二聚体的形成,然而其对细胞增殖的抑制效果表明它干扰了酪氨酸激酶的ErbB家族的信号转导。曲妥单抗的作用机制仍不清楚的一个原因在于:利用可获得的生物化学方法,包括纯化的或免疫共沉淀的受体,以定量的方式监视ErbB受体的相互作用有难度(K.M.Ferguson,P.J.Darling,M.J.Mohan,T.L.Macatee,M.A.Lemmon,Embo J19,4632(Sep1,2000);T.Horan et al.,J BiolChem270,24604(Oct13,1995);D.Karunagaran et al.,Embo J15,254(Jan15,1996)。
在此我们利用新的蛋白质相互作用检测系统研究了EGFR、ErbB2和ErbB3形成同源和异源二聚体的能力,所述检测系统使得,如在上文的小节I中描述的,在完整细胞的膜中监视受体相互作用能够进行。利用这种系统,作为与受体蛋白融合的、β-半乳糖苷酶(β-gal)低亲和力突变亚单位的互补作用的函数,测量两种蛋白质的相互作用(图1A)。可以分析可逆的和可诱导的相互作用,信噪比高,受体的同源和异源二聚体可以在大的多克隆细胞群体的质膜上以定量的方式来比较。这种特征的组合在其他蛋白质相互作用检测系统中没有发现,所述其他蛋白质相互作用检测系统基于能量转移(Y.Xu,D.W.Piston,C.H.Johnson,Proc Natl Acad Sci U S A96,151(Jan5,1999);B.A.Pollok,R.Heim,Trends Cell Biol9,57(Feb,1999))、或分裂酶,包括二氢叶酸还原酶(J.N.Pelletier,F.X.Campbell-Valois,S.W.Michnick,Proc Natl Acad Sci U S A95,12141(Oct13,1998))、β内酰胺酶(A.Galarneau,M.Primeau,L.E.Trudeau,S.W.Michnick,Nat Biotechnol20,619(Jun,2002);T.Wehrman,B.Kleaveland,J.H.Her,R.F.Balint,H.M.Blau,Proc Natl Acad Sci U S A99,3469(Mar19,2002))、荧光素酶(R.Paulmurugan,S.S.Gambhir,AnalChem75,1584(Apr1,2003))和之前所述的β-半乳糖苷酶(F.Rossi,C.A.Charlton,H.M.Blau,Proc Natl Acad Sci U S A94,8405(Aug5,1997);F.Rossi,C.A.Charlton,H.M.Blau,Proc Natl Acad Sci U SA94,8405(Aug5,1997))。我们推定我们为蛋白易位分析(T.S.Wehrman,C.L.Casipit,N.M.Gewertz,H.M.Blau,Nat Methods2,521(Jul,2005))新开发的、新β-半乳糖苷酶系统可以使与乳腺癌相关的ErbB家族成员的组合相互作用的比较分析得以进行。
对于受体的ErbB家族的相互作用的研究,最初验证了基于邻近的低亲和力β-gal互补系统分析特异性诱导的蛋白质-蛋白质相互作用的能力。首先,通过化学发光分析了可由雷帕霉素诱导的、以高亲和力缔合的细胞质蛋白FKBP12和FRB的相互作用(J.Chen,X.F.Zheng,E.J.Brown,S.L.Schreiber,Proc Natl Acad Sci U S A92,4947(May23,1995))。将表达FKBP12ω和FRBα*的细胞用雷帕霉素处理两小时,使β-gal活性提高了10倍(图1B)。为了确定β-gal系统是否也可以用于监视降低亲和力的相互作用、可逆的相互作用,评估了G蛋白偶联受体β2肾上腺素能受体(B2AR)与β-抑制蛋白2的缔合。受到刺激后,B2AR磷酸化并与β-抑制蛋白2结合。用激动剂(异丙基肾上腺素)处理表达B2AR-ω和β-抑制蛋白2α*融合蛋白的细胞使得酶活性提高了5倍,其可因用拮抗剂(心得安)预处理而阻止(图1C-E)。作为β-gal活性的函数的剂量-反应和EC50与公开的数值有良好的一致性(R.H.Oakley et al.,Assay Drug Dev Technol1,21(Nov,2002)),表明基于低亲和力的邻近α-互补可以用作自然条件下,完整细胞的膜中蛋白质-蛋白质相互作用的定量量度。
ErbB2一般被认为是各种配体结合ErbB受体、EGFR和ErbB3的优选的异源二聚体配偶体(D.Graus-Porta,R.R.Beerli,J.M.Daly,N.E.Hynes,Embo J16,1647(Apr1,1997)),然而,利用常规方法表征ErbB2相互作用的是有困难的。例如,ErbB2的胞外域在溶液中没有显示出形成异源二聚体(K.M.Ferguson,P.J.Darling,M.J.Mohan,T.L.Macatee,M.A.Lemmon,Embo J19,4632(Sep1,2000)),利用磷酸化作用作为受体相互作用的替代标记物产生了与之相矛盾的结果(D.J.Riese,2nd,T.M.van Raaij,G.D.Plowman,G.C.Andrews,D.F.Stern,Mol Cell Biol15,5770(Oct,1995);D.Graus-Porta,R.R.Beerli,J.M.Daly,N.E.Hynes,Embo J16,1647(Apr1,1997))。我们应用低亲和力β-gal系统研究质膜中EGFR、ErbB2和ErbB3。为了阻止受体聚簇和内在化,受体的胞内域没有包括在受体-α*或受体-ω嵌合体中(图1F)。暴露于EGF的引起了酶活性以时间依赖性的方式增加,表明这些受体的细胞外和跨膜域足以介导异源二聚体化(图1G)。为了证实β-gal分析可以监视这种相互作用的动态性质,进行了下述实验,其中,首先添加诱导物EGF和TGF-α,然后在分析之前从培养基中将其除去。β-gal活性随着时间降低,与暴露于EGF相比,随着TGF-α信号更快速地衰减,表明β-gal活性的损失速率表现出配体特异性(图1H)。这些结果显示了β-gal分析可以监视可逆的相互作用,其不同于迄今为止描述的其他的酶互补系统。
为了对不同的受体对进行定量比较,对细胞中受体表达水平进行了控制,β-gal融合蛋白的数量影响β-gal酶活性(图2)。为此,用C2C12细胞构建了两个亲本细胞系,其中ErbB家族成员以非常低的水平表达(S.Corti et al.,Exp Cell Res268,36(Aug1,2001))。这些细胞被工程化来表达ErbB2-ω或EGFR-ω融合蛋白。将表达ω的各亲本细胞系分裂并用编码不同的α-融合蛋白,EGFR-α*、ErbB2-α*和ErbB3-α*的三种构建体的每一种来转导。由于细胞产自同一亲本系,它们表达相同数量的ω。为了使α*嵌合蛋白表达水平的测量得以进行,YFP包含于每个构建体中,处于ErbB受体和α*之间。表达相似YFP水平的细胞通过FACS来分离,从而α*融合蛋白的水平是可比较的。通过共焦显微镜检查对YFP成像,来确保受体融合蛋白适当地定位到质膜上,这对它们的功能很重要(图3)。
评估表达受体对的六种细胞系的每一种的、配体刺激的酶活性。将细胞暴露于结合EGFR的配体EGF,或结合ErbB3受体的配体调蛋白(HRGβ1)(N.E.Hynes,H.A.Lane,Nat Rev Cancer5,341(May,2005))。观察到了所有预期的相互作用(图4A)。EGF引起了EGFR的同源二聚化,以及EGFR与ErbB2的异源二聚化,而HRGβ1未能诱导这些受体的相互作用。当比较表达EGFRω-ErbB2α*或ErbB2ω-EGFRα*的细胞时,应答是类似的。这个发现很重要,因为它表明无论受体是融合到α*还是ω,发生了相似的相互作用。虽然ErbB3通过EGFR的磷酸化已有描述了(D.J.Riese,2nd,T.M.van Raaij,G.D.Plowman,G.C.Andrews,D.F.Stern,Mol Cell Biol15,5770(Oct,1995);K.Zhang et al.,J Biol Chem271,3884(Feb16,1996)),我们没有检测到这两种蛋白质之间的显著的相互作用,表明EGFR对ErbB3的活化可能不是由它们的胞外域的二聚体形成所介导的。表达ErbB2ω和ErbB3α*的细胞仅相应于HRGβ1产生异源二聚体,而不响应EGF。表达ErbB2ω和ErbB2α*的细胞对于EGF或HRGβ1处理都没有响应,其与ErbB2不能结合任何已知配体是一致的。
ErbB2的晶体结构已经揭示了它处于组成型活性构象中,表明它可以自发地同源二聚化和传导信号(H.S.Cho et al.,Nature421,756(Feb13,2003);T.P.Garrett et al.,Mol Cell11,495(Feb,2003))。然而,这种观点没有得到观察结果的支持,使用单独的ErbB2不会发生ErbB2的完全活化,而是需要细胞中其他ErbB受体的存在(Y.Yarden,Oncology61Supp2,1(2001))。此外,生物化学研究未能在体外检测到ErbB2同源二聚体。我们的研究证实了ErbB2不比所测试其他的受体对更容易形成自发的同源二聚体,因为在缺乏诱导物的情况下,所有细胞系的酶活性是类似的(图4B)。
测试了针对ErbB2的三种单克隆抗体对ErbB受体二聚体水平的影响(图5A)。抗体L87结合ErbB2的胞外域,但是不影响受体活化(L.N.Klapper et al.,Oncogene14,2099(May1,1997))。当通过β-gal互补来分析时,L87对ErbB2与EGFR,或其与ErbB3的相互作用没有影响。发现抗体2C4阻止ErbB2与ErbB3,或其与EGFR的二聚体形成,与早先的报道有良好的一致性,早先的报道中其活性作为磷酸化的函数来分析(D.B.Agus et al.,Cancer Cell2,127(Aug,2002))。值得注意地,曲妥单抗显著地抑制了EGFRω与ErbB2α*的相互作用。通过与2C4对比,曲妥单抗展现了相对小的ErbB2ω-ErbB3α*二聚体形成的抑制作用。曲妥单抗的这种效果是剂量依赖性的,EGFRω-ErbB2α*相互作用的抑制作用在等同于2C4的剂量下发生(图5B、C)。为了证实该结果不受到受体所融合的β-gal片段的影响,用EGFRα*和ErbB2ω进行了相同的实验,获得的类似的结果(图6)。我们推定2C4对二聚体形成的更高的抑制作用是由于曲妥单抗结合ErbB2的近膜结构域,而2C4结合ErbB2的二聚体形成臂。
以上的二聚体形成研究表明,曲妥单抗主要抑制ErbB2-EGFR异源二聚体的形成。虽然还可能的是与ErbB2-ErbB3异源二聚体形成相比,曲妥单抗更强烈地抑制ErbB2-EGFR异源二聚体的形成,但这似乎是不太可能的,因为ErbB受体的胞外域在序列和结构水平上是高度同源的。我们推定,由于EGFR容易同源二聚化,而ErbB3不是这样(M.B.Berger,J.M.Mendrola,M.A.Lemmon,FEBS Lett569,332(Ju2,2004)),EGFR单体形成同源二聚体的倾向处于与ErbB2-EGFR异源二聚体形成的竞争之中。与ErbB3不能同源二聚化相反,剩余的ErbB3单体可与ErbB2异源二聚化,甚至是在存在曲妥单抗的情况下。结果,不同于ErbB3,EGFR将逐渐地在EGFR-EGFR复合物中被隔离,使其逐渐不得进行异源二聚化。
我们的数据与ErbB受体的已知性质一起,促使我们测试曲妥单抗是否在表达EGFR和ErbB2的细胞中影响EGFR同源二聚化。如图4A中所示,ErbB2异源二聚体和EGFR同源二聚体以相等的效力形成。结果,曲妥单抗处理对异源二聚体形成的抑制作用应当导致更高比例的同源二聚体形成(B.S.Hendriks,H.S.Wiley,D.Lauffenburger,Biophys J85,2732(Oct,2003))。作为这种假说的测试,缺乏β-gal片段的野生型ErbB2在EGFRα*和EGFRω细胞系中过量表达。如所预期的,暴露于EGF未能刺激β-gal活性,虽然有异源二聚体形成的强烈的倾向(图7A)。然而,当细胞与曲妥单抗抗体预孵育时,EGF引起了β-gal活性的提高,因为ErbB2与曲妥单抗结合,降低了其与EGFR异源二聚化的能力。这种破坏使EGFRα*和EGFRω相互作用得以进行并同源二聚化。添加2C4更大程度地恢复了EGF诱导的细胞系中β-gal活性的提高,如所预料的,得到了相对于曲妥单抗更强力的ErbB2异源二聚体抑制作用。
我们解释为,在存在曲妥单抗的情况下,EGFR同源二聚体形式的增加将引起细胞表面上EGFR的降低,这是由于EGFR被快速地内在化并退化同源二聚体、而不是与ErbB2的异源二聚体(Z.Wang,L.Zhang,T.K.Yeung,X.Chen,Mol Biol Cell10,1621(May,1999))。为了测试这种假说,野生型EGFR和野生型ErbB2在细胞中共表达,通过流式细胞计测定细胞表面的EGFR(图7B)。与对照相比,曲妥单抗和2C4都引起了在EGF处理时EGFR从细胞表面的快速丢失。用已知过量表达EGFR和ErbB2的SKBR3乳腺癌细胞系进行了类似的实验,在存在曲妥单抗和2C4的情况下显示出EGF诱导的EGFR内在化方面的类似的提高(图7C)。这些实验显示了用曲妥单抗阻断EGFR和ErbB2的异源二聚化将不仅使ErbB2活化降低,还提高了EGFR同源二聚体形成,之后是活化的受体的更有效的下调。这些发现结合在一起,提供了曲妥单抗抑制表达ErbB2的癌细胞的生长的能力的解释。
在完整的膜中监视动态的受体相互作用的方法的开发对于研究ErbB家族成员的组合相互作用很重要。这种分析将蛋白质的相互作用作为酶活性的函数测量,所述酶活性是在与所述蛋白相融合的β-gal酶片段因被诱导而相邻近时产生的。通过控制每种片段的表达水平,受体异源二聚体和同源二聚体的整体分布可以在表达不同受体组合的细胞系之间进行比较。这种分析是敏感的、定量的、可诱导的和可逆的。虽然这项研究应用于ErbB家族相互作用,在此描述的蛋白质相互作用检测系统可容易地适合于其他感兴趣的蛋白质相互作用。
虽然曲妥单抗已经在临床上使用了十年以上,尚没有它对ErbB家族二聚体形成的影响的清楚的表征。我们在此显示了曲妥单抗主要影响ErbB2-EGFR异源二聚体水平,而不是ErbB2-ErbB3。结果,曲妥单抗暴露应当通过两种相关的机制抑制信号转导:(1)破坏ErbB2-EGFR异源二聚体,和(2)降低在细胞表面的总的EGFR表达。曲妥单抗直接阻断前者,引起EGFR同源二聚化的增加,随后是快速的内在化,并最终导致EGFR水平的降低。结合在一起,这项研究的发现表明了曲妥单抗抑制ErbB受体信号转导,并因而抑制肿瘤细胞生长的机制:靶向ErbB2-EGFR异源二聚体。
重要地,在此报道的体外发现与近来报道的来自曲妥单抗的应答者和非应答者的肿瘤样品的、ErbB2受体表达分布良好地相关。在肿瘤过量表达ErbB2的患者中,对曲妥单抗治疗的反应与EGFR和它的配体的共表达相关,而非ErbB3(G.Hudelist et al.,Int J Cancer(Sep13,2005);B.L.Smith et al.,Br J Cancer91,1190(Sep13,2004))。因而,这项研究的数据提供了用于预测反应和选择可能受益于曲妥单抗治疗的患者的机制基础。
III.材料和方法
A.β-半乳糖苷酶融合蛋白的产生
EGFR(aa1-679)、ErbB2(aa1-686)和ErbB3(aa1-693)的胞外和跨膜结构域以及全长B2AR(所有人)从具有5’MfeI和3’XhoI位点的cDNA克隆通过PCR扩增。在WZL逆转录病毒构建体和YFPH31Rα(α*)逆转录病毒构建体中,PCR产物融合到ω片段的氨基末端。使用含有EcoRI和XhoI位点的引物从cDNA克隆通过PCR扩增人β-抑制蛋白2的全长编码序列、插入到ω和α*载体的MfeI-XhoI位点中。PCR扩增FKBP12和人FRAP的aa2025-2114的完整编码序列,并作为MfeI-XhoI片段插入到ω和α*载体中。全长ErbB2和EGFR也从cDNA克隆中PCR扩增,用MfeI-XhoI限制性内切酶插入到MFG逆转录病毒载体中。
B.病毒产生和细胞培养
在6孔平皿中,将逆转录病毒载体利用lipofectamine2000转染试剂(Invitrogen,Carlsbad CA)根据厂家的说明书转染到Φnx-包装细胞系(P.L.Achacoso and G.P.Nolan)中。转染后24小时,病毒上清液通过0.45μM注射器滤过到C2C12细胞上。以4μg/ml的终浓度添加Polybrene,平板在Beckman台式离心机上以1900RPM旋转30分钟。细胞返回到37℃5%CO2潮湿培养箱中12小时,然后更换为新鲜培养基。C2C12在含有pen/strep的20%FBS DMEM中生长。此时用1μg/ml G418(Invitrogen)选择合适的细胞,或在FACSTAR流式细胞计上使用FL1通道分选YFP表达。SKBR3细胞系获自ATCC。SKBR3细胞在补充有10%FBS、pen/strep和谷氨酰胺的McCoy’s5A培养基中培养。
C.细胞处理和分析
曲妥单抗和2C4由Genentech(Sliwkowski,MX)惠赠。所有其他的抗体获自Neomarkers(Labvision)。重组的人hEGF、hHRGβ1和hTGF-α获自Peprotech,重悬于水中,以等分量迅速冷冻。异丙基肾上腺素、心得安和雷帕霉素来自Sigma。在每个实验之前将异丙基肾上腺素重悬于水中。对于β-半乳糖苷酶活性的测量,细胞以20,000细胞/孔在96孔平皿上接种过夜。适当处理之后,从细胞中除去培养基,添加与1:20稀释的Galacton-Star(Gal筛选试剂盒,AppliedBiosystems)混合的50μl缓冲液B。细胞在RT孵育45分钟。之后在Tropix TR717光度计中以1秒的积分时间(integration time)测量发光。
对于内在化分析,在分析之前至少24小时,将细胞接种到12孔平皿中。细胞在没有血清的合适的培养基中血清饥饿4小时,然后用100ng/ml EGF处理。反应孔进行胰蛋白酶化,置于冰上来阻止进一步的内吞作用。细胞在冰冷的培养基清洗,然后用与Alexa647(Molecular Probes)结合(conjugated)的抗EGFR Ab-11(Neomarkers)在5%BSA/PBS中染色20分钟,并在5%BSA/PBS中再次洗涤。根据厂家的说明书进行抗体结合,在最佳的滴度下使用。
因而,本发明对现有技术作出了重要贡献。
虽然为了清楚理解的目的,已经通过说明和实例的方式较详细地描述了本发明,本领域技术人员容易理解,在本发明的教导之下,可以对其进行某些变化和修改而不背离所附的权利要求的精神和范围。
因而,前述的仅仅是说明本发明的原则。要理解的是,本领域技术人员能够设计各种方案,其虽然没有在此明确地描述或显示,但包括了本发明的原则并被包括在本发明的精神和范围之内。此外,在此叙述的所有实例和条件性语言旨在帮助读者了解本发明的原则和发明人为改进现有技术所贡献,不应被视为限制到这种特别叙述的实例和条件。此外,在此叙述的本发明的原则、方面和实施方式的所有声明以及其特定的实例,涵盖其结构和功能等效物。另外,这种等效物包括当前已知的等效物和将来开发的等效物,即,不考虑结构而进行相同的功能所开发的任何元件。因而,本发明的范围并非限制到在此显示和描述的示范性实施方式。本发明的精神和范围包含于所附的权利要求。
Claims (26)
1.一种测定第一和第二蛋白质是否相互作用的方法,所述方法包括:
(a)提供细胞,其包含:
(i)所述第一蛋白质和第一β-半乳糖苷酶片段的第一融合蛋白,其中所述第一β-半乳糖苷酶片段是长度60个氨基酸或更少的变异的最小N-末端β-半乳糖苷酶肽;和
(ii)所述第二蛋白质和第二β-半乳糖苷酶片段的第二融合蛋白;
其中所述第一和第二β-半乳糖苷酶片段之间具有亲和力,其在不存在所述第一和第二蛋白质之间的相互作用的情况下提供已知水平的β-半乳糖苷酶活性,所述活性低于在存在所述第一和第二蛋白质之间的相互作用的情况下所观察到的活性,其中所述变异的最小N-末端β-半乳糖苷酶肽包含在SEQ ID NO:1中编号的氨基酸残基29到41之间的点突变,插入或缺失;和
(b)评估所述细胞的β-半乳糖苷酶活性来确定所述第一和第二蛋白质是否相互作用。
2.根据权利要求1的方法,其中所述提供包括向所述细胞中导入编码所述第一和第二融合蛋白的核酸。
3.根据权利要求2的方法,其中,所述核酸顺序地导入所述细胞。
4.根据权利要求2的方法,其中,所述核酸同时地导入所述细胞。
5.根据权利要求1的方法,其中,所述方法进一步包括在所述评估之前使候选相互作用调节剂与所述细胞相接触。
6.根据权利要求1的方法,其中所述评估包括将所述已知水平的β-半乳糖苷酶活性与所观察到的β-半乳糖苷酶活性相比。
7.根据权利要求1的方法,其中所述第一β-半乳糖苷酶片段具有对所述第二β-半乳糖苷酶片段的结合亲和力,其低于由野生型大肠杆菌β-半乳糖苷酶的氨基酸3到92组成的β-半乳糖苷酶片段的结合亲和力。
8.根据权利要求7的方法,其中,所述至少一个氨基酸变异是取代。
9.根据权利要求7的方法,其中,所述至少一个氨基酸变异是缺失。
10.根据权利要求7的方法,其中,所述变异在残基31和41之间发生。
11.根据权利要求1的方法,其中所述细胞是哺乳动物细胞。
12.根据权利要求1的方法,其中所述细胞是酵母细胞。
13.根据权利要求1的方法,其中所述相互作用在细胞内的位置发生。
14.根据权利要求1的方法,其中所述相互作用在质膜位置发生。
15.根据权利要求1的方法,其中所述变异的最小N-末端β-半乳糖苷酶肽具有选自SEQ ID NO:1(H31R),SEQ ID NO:2(F34Y),SEQID NO:3(E41Q),SEQ ID NO:4(N39D),和SEQ ID NO:5(截短的)的序列。
16.根据权利要求1的方法,其中所述第一蛋白质和第二蛋白质形成同源二聚体或异源二聚体。
17.一种用于测定第一和第二蛋白质是否相互作用的细胞,所述细胞包含:
(a)第一蛋白质和第一β-半乳糖苷酶片段的第一融合蛋白,其中所述第一β-半乳糖苷酶片段是长度60个氨基酸或更少的变异的最小N-末端β-半乳糖苷酶肽,其中所述变异的最小N-末端β-半乳糖苷酶肽包含在SEQ ID NO:1中编号的氨基酸残基29到41之间的点突变,插入或缺失;和
(b)第二蛋白质和第二β-半乳糖苷酶片段的第二融合蛋白;其中所述第一和第二β-半乳糖苷酶片段之间具有低亲和力,其在不存在所述第一和第二蛋白质之间的相互作用的情况下提供已知水平的β-半乳糖苷酶活性,所述活性低于在存在所述第一和第二蛋白质之间的相互作用的情况下所观察到的活性。
18.根据权利要求17的细胞,其中所述第一和第二融合蛋白是细胞内蛋白。
19.根据权利要求17的细胞,其中所述第一和第二融合蛋白中至少一种是膜结合蛋白质。
20.根据权利要求17的细胞,其中所述第一和第二融合蛋白的两者都是膜结合蛋白质。
21.一种用于测定第一和第二蛋白质是否相互作用的试剂盒,包含:
(a)细胞,其包含:
(i)所述第一蛋白质和第一β-半乳糖苷酶片段的第一融合蛋白,其中所述第一β-半乳糖苷酶片段是60个氨基酸或更少的变异的最小N-末端β-半乳糖苷酶肽;和
(ii)所述第二蛋白质和第二β-半乳糖苷酶片段的第二融合蛋白;其中所述第一和第二β-半乳糖苷酶片段之间具有低亲和力,其在不存在所述第一和第二蛋白质之间的相互作用的情况下提供已知水平的β-半乳糖苷酶活性,所述活性低于在存在所述第一和第二蛋白质之间的相互作用的情况下所观察到的活性,并且其中所述变异的最小N-末端β-半乳糖苷酶肽包含在SEQ ID NO:1中编号的氨基酸残基29到41之间的点突变,插入或缺失;和
(b)β-半乳糖苷酶底物。
22.一种用于测定第一和第二蛋白质是否相互作用的试剂盒,包含:
(a)编码第一β-半乳糖苷酶片段的第一核酸;和
(b)编码第二β-半乳糖苷酶片段的第二核酸;其中所述第一β-半乳糖苷酶片段是变异的最小N-末端β-半乳糖苷酶肽,并对所述第二β-半乳糖苷酶片段具有结合亲和力,其低于由野生型大肠杆菌β-半乳糖苷酶的氨基酸3到92组成的β-半乳糖苷酶片段的结合亲和力,并且编码60个氨基酸或更少的变异的最小N-末端β-半乳糖苷酶肽,其中所述变异的最小N-末端β-半乳糖苷酶肽包含在SEQ ID NO:1中编号的氨基酸残基29到41之间的点突变,插入或缺失。
23.根据权利要求22的试剂盒,其中所述第一和第二核酸存在于载体上。
24.根据权利要求23的试剂盒,其中所述载体包含位于所述载体上的限制性位点,从而当蛋白质编码序列利用所述限制性位点插入所述载体中时,所述载体编码所述蛋白质和β-半乳糖苷酶片段的融合蛋白。
25.根据权利要求23的试剂盒,其中所述试剂盒进一步包含细胞。
26.根据权利要求23的试剂盒,其中所述试剂盒进一步包含β-半乳糖苷酶底物。
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