CN111996172A - 一种用于测定il-4靶向治疗性抗体生物学活性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于测定IL‑4靶向治疗性抗体生物学活性的方法，该方法包括：将载体pSecCAG‑hSTAT6‑hygro和pGL4‑5×STAT6‑luc‑puro依次转染到HEK293细胞中，构建得到稳定细胞株HEK293‑hSTAT6/5×STAT6‑luc；用IL‑4刺激激活hSTAT6/5×STAT6‑luc报告基因的表达，并用IL‑4靶向治疗性抗体阻断IL‑4信号通路，根据测定的报告基因信号值拟合四参数曲线确定抗体的生物学活性，该方法操作简便、周期短、成本低，结果稳定可靠、准确度高，对IL‑4靶向治疗性抗体药物的质量控制和临床应用具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于生物药物的活性检测领域，具体而言，本发明涉及一种用于测定IL-4靶向治疗性抗体生物学活性的方法。
背景技术
单克隆抗体作为全球医药市场的重要组成部分，在治疗肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病和移植排斥反应等多种疾病方面具有广阔的应用前景。单抗类药物一般相对分子质量大，并且具有结构多样性和可变性等特点，结构的细微变化将会影响药物的活性和质量，单纯的理化分析不能满足单抗类药物质量评价的需要，作为生物技术药物特殊检测方法的生物学活性检测方法可以对药物的有效成分、含量以及药物效价进行评定，是确保抗体类药物有效性的重要质控指标。目前生物学活性检测方法多采用基于细胞的生物活性测定方法，包括细胞增殖抑制法、细胞毒性法、补体依赖的细胞毒法、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性法、细胞ELISA法和报告基因法。
Dupilumab(商品名Dupixent)是一种靶向IL-4受体的单克隆抗体药物，于2017年3月28日首次获得FDA批准，Dupilumab可以结合IL-4和IL-13共同的受体模块IL-4Rα，同时阻断IL-4和IL-13信号及其介导的下游信号通路，对多种2型免疫相关的炎性疾病具有很好的控制作用，如抑制哮喘气道炎症、气道高反应性和气道重塑的发生发展。目前，Dupilumab已经获批3项适应症，分别为哮喘、慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉和特应性皮炎。
目前报道的Dupilumab生物学活性测定方法主要有ELISA、表面等离子共振(SPR)和细胞增殖抑制。ELISA和SPR虽然操作简单，灵敏度高，但不能提供生物学效应的信息，且方法耐用性和重复性较差；而细胞增殖抑制方法实验周期长，变异性大。随着抗IL-4单克隆抗体的快速发展，迫切需要一种特异性、高效、快速、准确的生物学活性检测方法。
本发明通过构建HEK293-hSTAT6/5×STAT6-luc基因工程细胞株，开发了一种新的抗IL-4单克隆抗体生物学活性测定的方法，并研究该方法的专属性、准确性和精密度。该方法专属性强，准确性好，快速准确，可用于IL-4单克隆抗体的研制和质量控制。
发明内容
为了弥补现有技术的上述缺陷，本发明的目的之一在于提供一种能够用于快速简便地检测IL-4靶向治疗性抗体生物学活性的稳定细胞株。
本发明的目的之二在于提供一种用于测定IL-4靶向治疗性抗体生物学活性的稳定细胞株的构建方法。
本发明的目的之三在于提供一种快速简便、稳定准确的用于IL-4靶向治疗性抗体生物学活性检测的报告基因法(RGA)。
本发明的上述目的通过以下技术方案实现：
本发明的第一方面提供了一种能够用于快速简便地检测IL-4靶向治疗性抗体生物学活性的稳定细胞株。
本发明的第二方面提供了一种用于测定IL-4靶向治疗性抗体生物活性的稳定细胞株的构建方法，所述方法包括以下步骤：将载体pSecCAG-hSTAT6-hygro和pGL4-5×STAT6-Luc-puro依次转染到细胞中，筛选后得到稳定细胞株。
进一步，所述的转染载体的细胞为能够内源性表达IL-4Rα的HEK293细胞。
进一步，所述的筛选后得到的稳定细胞株为稳定表达hSTAT6/5×STAT6-荧光素酶报告基因的稳定细胞株。
在本发明的实施方案中，该构建方法包括，取HEK293细胞、950μF所述载体、电压220V条件下来转染所述HEK293细胞。
本发明的第三方面提供了一种快速简便、稳定准确的用于IL-4靶向治疗性抗体生物学活性检测的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)按照本发明第二方面所述的构建方法构建本发明第一方面所述的稳定细胞株；
(2)用IL-4刺激激活稳定细胞株中报告基因的表达；
(3)再将IL-4靶向治疗性抗体药物作用于稳定细胞株；
(4)测定报告基因信号值。
进一步，步骤(4)中所述的测定报告基因信号值是通过向步骤(3)中加入荧光素酶底物后，根据得到的相对化学发光单位值(RLU)拟合四参数曲线来确定的。
在本发明的实施方案中，步骤(1)中构建的稳定细胞株按照1×104-8×104个/mL的细胞密度进行接种，优选地，按照1×104个/mL的细胞密度接种。
在本发明的实施方案中，所述方法还包括将步骤(1)中的稳定细胞株按照1×104-8×104个/孔的细胞密度制备成细胞悬液，优选地，按照4×104个/孔的细胞密度制备成细胞悬液。
在本发明的实施方案中，步骤(2)中的IL-4刺激终浓度为1-20ng/mL；优选地，所述IL-4刺激终浓度为1ng/mL。
在本发明的实施方案中，步骤(3)中所述IL-4靶向治疗性抗体药物包括Dupilumab、pascolizumab、pascolizumab、CBP-201、611，优选地，本研究选择了Dupilumab。
在本发明的实施方案中，步骤(3)中IL-4靶向治疗性抗体药物的初始浓度为300μg/mL，等比例稀释的比例为1:2-1:5；优选地，等比例稀释的比例为1:3。
在本发明的实施方案中，经步骤(3)处理的细胞在37℃，5％CO2的培养箱中孵育，孵育时间为2-24小时；优选地，所述孵育时间为6小时。
在本发明的实施方案中，对优化后的IL-4靶向治疗性抗体生物学活性检测的方法进行验证，包括专属性、准确性和精密度的验证。
进一步，所述专属性通过将HEK293-hSTAT6/5×STAT6-luc细胞、HEK293细胞、Dupilumab、变性Dupilumab和其他靶点的抗体同时用上述优化后的方法检测得到的结果来验证。
进一步，所述的其他靶点的抗体包括：美泊利单抗(mepolizumab，靶点为IL-5)、纳武单抗(nivolumab，靶点为PD1)、托珠单抗(Tocilizumab，靶点为IL-6R)、利妥昔单抗(Rituximab，靶点为CD20)、巴利昔单抗(basiliximab，靶点为CD25)和英夫利昔单抗(靶点为TNFα)。
在本发明的实施方案中，优化后的方法能够用于筛选IL-4靶向治疗性抗体药物。
在本发明的实施方案中，在酶标仪上读取相对化学发光单位值(relative lightunit,RLU)通过数据处理拟合四参数曲线，根据得到的相对化学发光单位值拟合四参数曲线确定所述抗体的生物活性。四参数曲线，可反映出上下渐近线、IC50值和斜率等指标。优选为，使用SoftMax软件进行数据处理拟合四参数曲线。
除非另有定义，本发明上下文中的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。此外，对部分术语解释如下。
本文中使用的术语“IL-4”是指白细胞介素4，在人类中主要由活化T细胞产生。
本文中使用的术语“HEK293-hSTAT6/5×STAT6-luc细胞”是指表达hSTAT6/5×STAT6-荧光素酶报告基因的HEK293细胞。
本文中使用的术语“抗IL-4/IL-4R抗体”是指能够抑制IL-4/IL-4R通路信号转导的抗体，其通过与IL-4或IL-4受体结合从而阻断IL-4和IL-4受体之间的相互作用，使得IL-4/IL-4R通路信号转导被抑制，本发明所用的抗IL-4/IL-4R抗体包括但不限于：Dupilumab、AMG317。
本文中使用的术语“JAK/STAT6”是指JAK/STAT6信号转导通路，主要由IL-4和IL-13激活，IL-4和(或)IL-13与受体结合后，可诱导受体聚集，形成二聚体，并影响与之耦联的JAK，使之处于适当的空间位置，激活JAK的自磷酸化，JAK/STAT6信号转导通路被激活。
本文中使用的术语“生物学活性”是指基于生物制品实现确定的生物学效应的特定能力或潜力，可采用特定细胞株的生物学效应来评估生物制品相应的活性。
本文中使用的术语“四参数曲线”是指按照四参数方程Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogEC50-X)*HillSlope))进行拟合的曲线。
HEK293细胞是属于人胚胎肾细胞293的衍生株，不仅能够内源性表达IL-4Rα，而且具有转染效率高、易于培养的优点。IL-4与HEK293细胞表面的IL-4Rα结合，激活STAT6信号转导和酪氨酸磷酸化，STAT6通过磷酸化、二聚化和核易位与特定的DNA位点结合，从而维持细胞的存活和增殖。将hSTAT6/5×STAT6和荧光素酶报告质粒导入到HEK293细胞内，IL-4与IL-4Rα结合后，激活JAK/STAT6信号通路，并驱动荧光素酶报告基因的表达。抗IL-4R抗体Dupilumab与IL-4竞争性结合IL-4受体，阻断IL-4信号通路，从而降低荧光素酶的表达，因此抗IL-4R抗体Dupilumab的浓度与效应细胞中荧光素酶的表达量成反比。
本发明的优点和有益效果：
本发明提供了一种用于测定IL-4靶向治疗性抗体生物学活性的稳定细胞株及其构建方法，使用该稳定细胞株检测IL-4靶向治疗性抗体，具有较高的稳定性、敏感性和准确性。
本发明提供了一种快速简便、稳定准确地用于IL-4靶向治疗性抗体生物学活性检测的方法，该方法操作简便、成本低、周期短，结果稳定可靠、准确度高，有利于IL-4靶向治疗性抗体药物的质量控制与临床应用，具有较高的应用价值。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1显示的是pSec CAG-hSTAT6-Hygro质粒图；
图2显示的是pGL4-5xSTAT6-Luc-puro质粒图；
图3显示不同克隆的效应细胞荧光素酶活性测定的结果图；
图4显示HEK293-hSTAT6/5×STAT6-luc细胞不同IL-4刺激浓度下四参数曲线图；
图5显示HEK293-hSTAT6/5×STAT6-luc细胞不同细胞接种密度下四参数曲线图；
图6显示HEK293-hSTAT6/5×STAT6-luc细胞不同细胞铺板密度下四参数曲线图；
图7显示HEK293-hSTAT6/5×STAT6-luc细胞不同抗体不同稀释比例下四参数曲线图；
图8显示的是Dupilumab/IL-4预孵育时间对结果的影响图；
图9显示HEK293-hSTAT6/5×STAT6-luc细胞不同孵育时间下四参数曲线图；
图10显示的是HEK293-hSTAT6-5×STAT6-luc细胞信号通路特异性结果图；
图11显示的是加热变性的Dupilumab抗体的剂量效应曲线图；
图12显示的是不同靶点抗体的剂量效应曲线图；
图13显示的是不同浓度Dupilumab相对生物学活性测量值与理论值线性拟合图；
图14显示的是不同代次HEK293-hSTAT6-5×STAT6-luc细胞剂量效应曲线图；
图15显示的是本研究建立的方法检测IL-4靶点单抗AMG317生物学活性剂量效应曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1构建和筛选稳定细胞株HEK293-hSTAT6/5×STAT6-luc
1.1实验材料
HEK293细胞购买于ATCC；DMEM培养基购买于Excell公司；FBS(胎牛血清)、EDTA-胰蛋白酶、谷氨酰胺、嘌呤霉素、潮霉素B购自Roche公司；Bio-GloTM荧光素酶试剂盒购买于Promega公司；培养用重组人白介素-4(IL-4)购买于Peprotech公司；Dupilumab抗体由本实验室保存。
1.2质粒转染
采用NEONTM电穿孔转染系统对HEK293细胞进行pSecCAG-hSTAT6-hygro质粒载体的转染，转染48小时后，加入200μg/mL潮霉素B进行筛选，两周后，筛选培养基中存活的单克隆细胞，即为HEK293-hSTAT6-hygro细胞；将pGL4-5×STAT6-Luc-puro质粒载体以上述同样的方法转染到HEK293-hSTAT6-hygro细胞中，加入1μg/mL嘌呤霉素进行筛选，一周后，筛选培养基中存活的单克隆细胞，即为HEK293-hSTAT6/5×STAT6-luc细胞；将上述HEK293-hSTAT6/5×STAT6-luc细胞在含有100μg/mL潮霉素B和0.5μg/mL嘌呤霉素的培养基中培养，100μg/mLIL-4刺激6h。其中，所述的pSecCAG-hSTAT6-hygro质粒载体和pGL4-5×STAT6-Luc-puro质粒载体均为本发明所构建的，分别为图1和图2所示。
1.3 HEK293-hSTAT6-5×STAT6-luc稳定细胞株筛选
将1.2中得到的HEK293-hSTAT6-5×STAT6-luc转移至96孔板，1个细胞/孔，37℃、5％CO2培养，然后将单克隆细胞转移至24孔板，检测化学发光值，评估各孔的荧光信号强度，结果见图3，选择信号强度最高的HEK293-hSTAT6-5×STAT6-luc细胞，即3C10细胞。
实施例2检测方法的优化
1.1浓度优化
本实施例首先测定了HEK293-hSTAT6-5×STAT6-luc细胞的活性，用初始浓度为1μg/mL、稀释倍比为1:10的IL-4刺激细胞，孵育后，记录的剂量-响应曲线显示IL-4影响HEK293-hSTAT6-5×STAT6-luc细胞的活性，因此首先优化了用于刺激的IL-4的浓度。设置20、10、5和1ng/mL四个不同的IL-4浓度，分别进行IL-4R单抗的抑制实验，根据测定的化学发光值拟合的四参数曲线确定IL-4的最佳刺激浓度。
方法：将HEK293-hSTAT6-5×STAT6-luc细胞按5×104个/孔加入到96孔板中；Dupilumab(由中国食品药品检定研究院单克隆抗体产品室留存)初始浓度为600μg/mL，1:3梯度稀释10个浓度点，加入上述细胞板中；IL-4分别稀释至20、10、5和1ng/mL，分别转移到上述细胞板中；37℃，5％CO2培养。6h后加入Bio-Glo，检测化学发光值。
结果：结果显示，IL-4刺激浓度为1ng/mL时，能够得到较好的剂量效应曲线(见图4)，也能节省IL-4用量，提高该方法的成本效益，因此选择1ng/mL作为IL-4的最佳刺激浓度。
1.2细胞接种密度优化
不同接种密度的细胞会对最终的细胞生长状态产生一定程度的影响，进而细胞对IL-4刺激后的响应值产生差别，所以对细胞接种密度进行优化，以保证后续实验所用的细胞状态稳定。设置1×104个/mL、2×104个/mL、4×104个/mL和8×104个/mL四个不同的细胞接种密度，分别进行IL-4R单抗的抑制实验，根据测定的化学发光值拟合的四参数曲线确定最优细胞接种密度。
方法：分别将接种密度为1×104个/mL、2×104个/mL、4×104个/mL、8×104个/mL的HEK293-hSTAT6-5×STAT6-luc细胞加入到96孔板中；加入1ng/mL的IL-4；Dupilumab初始浓度为300μg/mL，1:3梯度稀释10个浓度点，转移至上述细胞板中；37℃，5％CO2培养。6h后加入Bio-Glo，检测化学发光值。
结果：结果显示，接种细胞越少，RLU越高(见图5)，因此选择1×104个/mL作为最佳细胞接种密度进行后续实验。
1.3细胞铺板密度优化
设置1×104个/孔、2×104个/孔、4×104个/孔、8×104个/孔四个不同的细胞密度，分别进行IL-4R单抗的抑制实验，根据测定的化学发光值拟合的四参数曲线确定最优的细胞密度。
方法：将HEK293-hSTAT6-5×STAT6-luc细胞分别按1×104个/孔、2×104个/孔、4×104个/孔、8×104个/孔的细胞密度加入到96孔板中；加入1ng/mL的IL-4；Dupilumab初始浓度为300μg/mL，1:3梯度稀释10个浓度点，转移至上述细胞板中；37℃，5％CO2培养。6h后加入Bio-Glo，检测化学发光值。
结果：随着孵育时间的延长，RLU也逐渐增加，4×104个/孔细胞铺板密度的RLU满足RGA的要求并最大限度地利用了细胞(见图6)，因此选择细胞铺板密度4×104个/孔进行后续实验。
1.4抗体稀释倍数比优化
Dupilumab的初始浓度300μg/mL，设置1:2、1:3、1:4、1:5四个不同的稀释倍数，根据测定的化学发光值拟合的四参数曲线确定最优的Dupilumab抗体稀释倍数。
方法：将HEK293-hSTAT6-5×STAT6-luc细胞按4×104个/孔加入到96孔板中；IL-4稀释至1ng/mL，转移到上述细胞板中；Dupilumab初始浓度为300μg/mL，设置1:2、1:3、1:4、1:5四个不同的稀释倍数梯度稀释10个浓度点，将稀释后的抗体转移至细胞板中；37℃，5％CO2培养。6h后加入Bio-Glo，检测化学发光值。
结果：见图7，Dupilumab的稀释倍数比为1:3时，所选取的十个浓度点能够较好的覆盖上下平台，且线性部分良好，因此确定1:3为Dupilumab的最佳稀释倍数比。
1.5 Dupilumab和IL-4孵育时间优化
在本实施例中，最终检测的荧光素酶是由Dupilumab/IL-4混合物中未被Dupilumab结合的IL-4刺激细胞后表达产生。针对两者作用一段时间预先充分结合后再与细胞共孵育和三者同时加入到96孔板这两种方式是否会对最终产生不同的影响，本实施例进行了加样顺序的优化。
方法：Dupilumab/IL-4混合物提前孵育30分钟和即刻加入细胞中，检测荧光素酶的表达量。
结果：结果显示经过提前30分钟孵育的四参数曲线和直接加入细胞的四参数曲线基本一致(见图8)，说明这两种加样方式对最终结果的影响无显著差别。
1.6孵育时间优化
由于HEK293-hSTAT6-5×STAT6-luc细胞为IL-4依赖细胞，缺乏IL-4细胞不能生长，因此要探索一个较为合适的孵育时间。
方法：将HEK293-hSTAT6-5×STAT6-luc细胞按4×104个/孔加入到96孔板中；IL-4稀释至1ng/mL，转移至上述细胞板中，37℃，5％CO2培养。分别在2h、4h、6h、8h和24h加入BioGlo，检测化学发光值，根据测定的化学发光值拟合的四参数曲线以及信噪比，确定一个较为合适的孵育时间。
结果：随着孵育时间的增长，得到了更好的拟合曲线图(见图9)，本实施选择6h作为孵育时间，以保证信噪比的同时，也能优化时间和成本效益。
根据以上参数优化的实验结果，整理得到用于检测抗IL-4/IL-4R抗体生物学活性的方法的实验参数优化见表1。
表1用于检测抗IL-4/IL-4R抗体生物学活性的方法的实验参数优化
实施例3检测方法的验证
1.1专属性验证
专属性是指待测样品中如果含有其他成分时，所用的分析方法能够准确地、快速地将被测组分检测出来的能力，又被称为特异性。本研究建立的新的方法是针对抗IL-4/IL-4R抗体的生物学活性方法，为了评估所建方法的特异性，本实施分别验证了HEK293-hSTAT6/5×STAT6-luc细胞基于完整STAT6信号通路的特异性、HEK293-hSTAT6/5×STAT6-luc细胞对变性Dupilumab抗体和其他靶点抗体的特异性。
所述的其他靶点抗体包括：美泊利单抗(mepolizumab，靶点为IL-5)、纳武单抗(nivolumab，靶点为PD1)、托珠单抗(Tocilizumab，靶点为IL-6R)、利妥昔单抗(Rituximab，靶点为CD20)、巴利昔单抗(basiliximab，靶点为CD25)和英夫利昔单抗(靶点为TNFα)，在优化后的实验条件下，利用本研究建立的方法，测定这六种单抗药物的活性。
方法：将HEK293-hSTAT6-5×STAT6-luc细胞和HEK293细胞分别按4×104个/孔加入到96孔板中，在实施例2优化的条件下检测化学发光值；将Dupilumab抗体在100℃条件下加热15分钟，然后冷却至室温，制备得到变性Dupilumab抗体，分别用Dupilumab抗体和变性Dupilumab抗体，在实施例2优化的条件下检测化学发光值；将HEK293-hSTAT6-5×STAT6-luc细胞按4×104个/孔加入到96孔板中，加入1ng/mL的IL-4，将六种单抗分别稀释至初始浓度300μg/mL，1:3梯度稀释10个浓度梯度，分别转移至上述细胞板中；37℃，5％CO2培养。6h后加入Bio-Glo，检测化学发光值。
结果：HEK293-hSTAT6/5×STAT6-luc细胞随着Dupilumab浓度的增加，RLU随之减小，表现出较好的剂量效应曲线，而无hSTAT6/5×STAT6-luc的HEK293细胞却不能表达荧光素酶(见图10)，表明构建的转基因HEK293-hSTAT6/5×STAT6-luc细胞信号通路特异性良好；将具有活性的Dupilumab、加热变性的Dupilumab和其他不同靶点的抗体(靶点分别为IL-5、PD1、IL-6R、CD20、CD25和TNFα的抗体)同时用本研究建立的方法进行生物学活性的检测，结果显示变性抗体和其他靶点的抗体均不能产生抑制作用(见图11和图12)，表明本研究建立的方法特异性较好。
1.2准确性验证
准确性是用来评价分析方法检测结果的实际测得值与参考值相近或者一致的程度，测量值与参考值越接近，方法的准确度也越高。
方法：将初始浓度为300μg/mL的Dupilumab作为方法准确性验证的参比品，然后制备成5个不同起始浓度效价水平的样品，分别为150μg/mL、225μg/mL、300μg/mL、375μg/mL和450μg/mL，对应的理论相对生物学活性值分别为50％、75％、100％、125％和150％，用本研究建立的方法在优化后的实验条件下对上述每个效价水平进行检测，根据实验结果拟合四参数曲线方程，并得到EC50值，最后根据得到的结果计算5个样品组各自的相对生物学活性和回收率。相对生物活性(％)＝参比品EC50/样品EC50×100％。回收率(％)＝相对活性实测相对活性值/相对活性理论值×100％。
结果：见表2，5个不同效价水平的相对生物学活性的平均值分别为43.6％、81.9％、103.0％、124.2％和124.2％，CV％值都小于15％，回收率的范围在87.2％-109.2％之间。对于线性的验证，将测得的5组样品相对生物学活性测定平均值与理论值进行拟合(见图13)，R2值为0.9934，线性拟合结果较好，相对生物学活性的平均值和对应的理论值具有很好的一致性，表明本研究建立的方法准确性良好。
表2不同效价Dupilumab相对生物学活性和回收率
1.3精密度验证
精密度是指实际测定值之间的一致性或者接近程度，通常用变异系数(CV％)来表示，包括日内精密度、日间精密度和重现性。日内精密度表示同一实验在相同条件下，同一天多次检测结果之间的变异系数；日间精密度表示同一实验在不同日期、不同操作人员检测结果的变异系数；重现性是精密度测定的重要组成部分，它需要通过不同实验室之间的实验来完成，一般用于协作研究使方法标准化。为了验证方法的精密度，我们对其进行了重复性和日间精密度的研究。
方法：取初始浓度为300μg/mL的Dupilumab作为样品，在3天内对样品进行检测，每天测试3块板，每个样品平行2个复孔，根据四参数拟合曲线，计算样品的IC50值和相对标准偏差。
结果：见表3，三次不同生物学活性结果的IC50值的平均值分别为2.43ng/mL、2.49ng/mL和2.52ng/mL，标准差SD值都小于1.0，变异系数CV％都小于10％，实验数据证明本研究建立的方法具有较好的精密度。
表3用本研究建立的RGA法检测Dupilumab得到的IC50(ng/mL)结果
1.4细胞代次稳定性验证
对于报告基因而言，不同代次细胞株剂量效应曲线的稳定性与一致性至关重要。
方法：在优化的实验条件下，将三种不同传代(P10、P14和P46)转基因HEK293-hSTAT6/5×STAT6-luc细胞用本研究建立的方法进行荧光素酶表达量的检测和四参数曲线的比较。
结果：三种不同代次细胞的生物学活性四参数曲线平行度高度一致(见图14)，表明HEK293细胞连续传代至46代时，对检测的结果没有显著影响。
1.5应用范围的评估
除了将本研究建立的方法用于Dupilumab抗体的生物学活性测定外，本研究还评估了建立的方法是否可以用于抗IL-4单抗AMG317生物学活性的测定。
方法：使用优化后的实验条件，将本研究建立的方法用于AMG317生物学活性的测定。
结果：见图15，AMG317具有良好的剂量依赖性反应，表明本发明建立的方法也可以应用于其他抗IL-4单抗生物学活性的检测。
Claims (10)
1.一种稳定细胞株，其特征在于，所述细胞株稳定表达依赖STAT6活性的荧光素酶报告基因；
优选地，所述细胞株稳定表达hSTAT6/5×STAT6荧光素酶报告基因；
更优选地，所述细胞株包括HEK293。
2.根据权利要求1所述的稳定细胞株的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：将载体pSecCAG-hSTAT6-hygro和pGL4-5×STAT6-Luc-puro依次转染到细胞中，筛选后得到稳定细胞株。
3.一种用于测定IL-4靶向治疗性抗体药物生物学活性的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)按照权利要求2所述的构建方法构建权利要求1所述的稳定细胞株；
(2)用IL-4刺激激活稳定细胞株中报告基因的表达；
(3)再将IL-4靶向治疗性抗体药物作用于稳定细胞株；
(4)测定报告基因信号值；
优选地，所述IL-4靶向治疗性抗体药物包括Dupilumab、pascolizumab、pascolizumab、CBP-201、611；
更优选地，所述IL-4靶向治疗性抗体药物为Dupilumab。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将步骤(1)中的稳定细胞株按照1×104-8×104个/mL的细胞密度进行接种，优选地，按照1×104个/mL的细胞密度接种。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将步骤(1)中的稳定细胞株按照1×104-8×104个/孔的细胞密度制备成细胞悬液；优选地，按照4×104个/孔的细胞密度制备成细胞悬液。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中IL-4刺激终浓度为1-20ng/mL；优选地，所述IL-4刺激终浓度为1ng/mL。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(3)中IL-4靶向治疗性抗体药物的初始浓度为300μg/mL，等比例稀释的比例为1:2-1:5；优选地，等比例稀释的比例为1:3。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：经步骤(3)处理的细胞在37℃，5％CO2的培养箱中孵育，孵育时间为2-24小时；优选地，所述孵育时间为6小时。
9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述报告基因信号值是相对化学发光单位值；根据相对化学发光单位值拟合四参数曲线确定所述IL-4靶向治疗性抗体药物的生物学活性。
10.权利要求3-9中任一项所述的方法在靶向治疗性抗体药物质量控制中的应用，其特征在于，所述靶向治疗性抗体药物包括抗IL-4或抗IL-4受体的单克隆抗体药物；优选地，所述抗IL-4或抗IL-4受体的单克隆抗体药物包括Dupilumab、pascolizumab、pascolizumab、CBP-201、611。
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