CN107384869A - 一种单克隆细胞株及其在测定il‑6r抑制剂相对生物学活性中的应用 - Google Patents

一种单克隆细胞株及其在测定il‑6r抑制剂相对生物学活性中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种单克隆细胞株，其为携带有受SIE调控的荧光素酶基因且能稳定表达荧光素酶的人肾上皮细胞293T细胞，命名为293T‑SIE(保藏编号为CGMCC No.13816，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)；本发明还涉及一种上述单克隆细胞株的构建方法、应用及采用上述单克隆细胞株测定IL‑6R抑制剂相对生物学活性的方法。本发明以IL‑6相关信号通路的激活情况为研究对象，设计一种能够稳定表达SIE‑荧光素酶报告基因的人肾上皮细胞株，培养简单，重复性较好，更接近样品在体内作用的实际情况，保证了测定结果的稳定性和准确度；同时本发明建立的IL‑6R抑制剂的活性测定方法，测定周期短，有利于IL‑6R抑制剂类药物的研究开发、质量控制和临床应用，具有较高的应用价值。

Description

一种单克隆细胞株及其在测定IL-6R抑制剂相对生物学活性 中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种单克隆细胞株及其构建方法，以及利用该单克隆细胞株测定IL-6R抑制剂相对生物学活性的方法。
背景技术
白细胞介素-6(IL-6)是调节免疫反应和炎症反应的一种多效性细胞因子，与IL-6受体(IL-6R)结合后，可诱导软骨细胞和滑膜细胞产生基质金属蛋白酶(MMP)-1、MMP-3和MMP-13(Hashizume M，Mihara M.Osteoarthritis Cartilage， 2009，17(11)：1513-1518)，还可通过诱导表达RANKL，从而促进破骨细胞的破骨作用，造成软骨的损伤(Hashizume M，Hayakawa N，Mihara M.Rheumatology，2008，47(11)：1635-1640)，在类风湿性关节炎患者的关节骨和软骨组织破坏方面显示出强大的作用。IL-6R抑制剂通过与IL-6竞争结合位点而抑制IL-6向胞内转导信号，阻断IL-6的生物学活性，从而起到治疗类风湿性关节炎的作用。
早在1988年，Shimizu等人就发现IL-6与IL-6R相结合之后可通过信号转导过程促进KT-3细胞的增殖，IL-6R抑制剂可通过竞争性地阻断IL-6与IL-6R 的结合从而抑制上述增殖反应(Shimizu S，Hirano T，Yoshioka R et al.Blood. 1988；5：1826-8)。因此，通过对该增殖反应的抑制程度进行测定，可有效评价IL-6R抑制剂的相对生物学活性。但KT-3细胞为悬浮细胞，且生长依赖特定的细胞因子，培养要求高，且该方法耗时长，重复性较差，导致测定结果不稳定。
IL-6可经一条直接通道JAKs(just another kinase,JAK)/STATs(signaltransclucers and activators of transcription STAT)途径将信号从细胞表面受体转导至核，调控基因的转录，这一过程主要包括胞浆JAKs、STATs先后磷酸化，SIF (sis-inducing factor)复合物的形成、核转位及与c-fos启动区SIE(sis-inducing element)的结合(王小丹等，细胞生物学杂志，2003，1)，其中SIF复合物与 SIE的结合是IL-6信号通路的关键环节。但目前还没有应用此原理进行IL-6R抑制剂药物筛选及测定IL-6R抑制剂的相对生物学活性的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，基于现有技术中直接通道JAKs /STATs途径的原理，本发明构建了一种能够稳定表达SIE-荧光素酶报告基因的人肾上皮细胞株，上述细胞株在给予外源IL-6刺激的情况下可稳定表达荧光素酶，通过检测该细胞株所表达的荧光素酶的活性可以测定IL-6R抑制剂的相对生物学活性，本发明提供的方法将现有方法的耗时从72小时缩短至6小时，而且重复性更好，结果更稳定。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一个目的是提供一种单克隆细胞株，其为携带有受SIE调控的荧光素酶基因且能稳定表达荧光素酶的体外培养的哺乳动物细胞。
优选地，所述哺乳动物细胞为人肾上皮细胞293T细胞，也可采用其他类型的哺乳动物细胞，但采用人肾上皮细胞293T细胞效果最佳。
优选地，所述单克隆细胞株命名为293T-SIE，其分类命名为人肾上皮细胞系，其保藏编号为CGMCC No.13816，保藏日期为2017年3月22日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明的第二个目的是提供一种上述单克隆细胞株的构建方法，其包括如下步骤：
a)构建携带有受SIE调控的荧光素酶基因的质粒；
b)利用阳离子脂质体将步骤a)所述的质粒转染入人肾上皮细胞293T细胞；
c)在步骤b)转染后的细胞中加入潮霉素b，经过加压筛选，分离获得单克隆细胞株293T-SIE并冻存。
为了进一步优化上述技术方案，本发明所采取的技术措施还包括：
优选地，上述单克隆细胞株的构建方法还包括单克隆细胞株293T-SIE的荧光素酶活性的鉴定步骤。
优选地，所述潮霉素b的浓度为0～1mg/ml；更优选为0.2～0.6mg/ml；最优选为0.4mg/ml。
优选地，所述单克隆细胞株293T-SIE置于液氮介质中进行冻存，也可选择其他合适的冻存方式。
优选地，当293T细胞融合度达70％-90％时，才可实施转染步骤。
优选地，所述转染按照LipofectamineTM 2000试剂操作指南进行。
本发明的第三个目的是提供一种上述单克隆细胞株在筛选IL-6R抑制剂类药物中的应用，该应用包括IL-6R抑制剂类药物的研究开发、质量控制和临床应用等；优选地，所述IL-6R抑制剂类药物为托珠单抗。
本发明通过建立相应的检测方法，采用上述单克隆细胞株，可实现对IL-6R 抑制剂的活性进行定量测定。
本发明的第四个目的是提供一种采用上述单克隆细胞株测定IL-6R抑制剂相对生物学活性的方法，其用于非诊断和治疗目的，其包括如下步骤：
(1)单克隆细胞株293T-SIE的复苏、传代及接种：取出冻存的293T-SIE 细胞，将细胞快速融化复苏后，于培养箱中培养；取处于对数生长期的细胞用胰酶消化，离心弃上清液，将细胞重悬于细胞培养液中，将细胞悬液稀释并接种至孔板；优选地，将细胞悬液稀释至0.2×106～0.8×106cells/ml(更优选为0.8× 106cells/ml)后，以50μl/孔接种。
(2)配制IL-6工作液、参比品溶液及待测样品溶液，根据测定需求分别将 IL-6工作液、参比品溶液及待测样品溶液加入已接种单克隆细胞株293T-SIE的孔板中；
(3)将化学发光底物与含有细胞裂解液的底物缓冲液混匀，加至孔板，室温震荡一定时间；
(4)使用酶标仪读取各孔的化学发光强度，并对测定的数据进行处理，计算参比品及待测样品的半数有效浓度(IC50)，并计算IL-6R抑制剂的相对生物学活性。
为了进一步优化上述技术方案，本发明所采取的技术措施还包括：
优选地，所述步骤(2)IL-6工作液、参比品溶液及待测样品溶液的配制过程如下：
IL-6工作液：取预订量的人重组IL-6粉末，加入无菌水溶解，得到IL-6储存液；取IL-6储存液，用细胞培养液稀释，得到特定浓度的IL-6工作液；优选地，IL-6工作液的浓度为0.13～2000ng/ml，更优选为400ng/ml。
参比品溶液：取IL-6R抑制剂参比品，以细胞培养液对参比品按预定比例依次稀释，得到多个不同浓度梯度的参比品溶液；
待测样品溶液：取待测样品，以细胞培养液对待测样品按预定比例依次稀释，得到多个不同浓度梯度的待测样品溶液。
优选地，所述步骤(4)中IL-6R抑制剂的相对生物学活性的计算公式如下：
待测IL-6R抑制剂相对生物学活性(％)＝参比品IC50/待测样品IC50×100％。
更具体的说，本发明所述的用于非诊断和治疗目的的测定IL-6R抑制剂相对生物学活性的方法包括如下步骤：
1)细胞的复苏及传代：
从液氮罐中取出冻存的293T-SIE细胞，将细胞快速融化复苏后，转入5ml 含10％FBS的DMEM培养基中，于37℃、5％CO2培养箱中培养。
2)细胞接种：
取处于对数生长期的细胞用0.25％胰酶消化，1000rpm离心2min，弃上清，将细胞重悬于细胞培养液(含10％胎牛血清的无酚红DMEM培养基)中，计数。将细胞悬液稀释至0.8×106cells/ml后，以50μl/孔接种于96孔白板。
3)IL-6工作液的配制：
取人重组IL-6粉末100μg，加入1ml无菌水溶解，得到IL-6储存液。取IL-6 储存液，用细胞培养液稀释至400ng/ml，得到IL-6工作液。
4)参比品溶液的配制：
取IL-6R抑制剂参比品，以细胞培养液对参比品按3倍比例依次稀释，得到 9个不同浓度梯度的参比品溶液。
5)待测样品溶液的配制：
取待测样品，以细胞培养液对待测样品按3倍比例依次稀释，得到9个不同浓度梯度的待测样品溶液。
6)加入参比品与待测样品溶液：
将上述不同浓度的参比品与待测样品溶液，按每孔25μl加至已接种细胞的 96孔白板中。
7)加入IL-6工作液：
将IL-6工作液加入上述96孔白板中，每孔25μl。另设阴性对照与空白对照：两者均不加参比品或待测样品溶液，且阴性对照孔每孔加50μl IL-6稀释液，空白对照孔每孔加50μl细胞培养液。每个实验组均设置3个平行复孔，于37℃、 5％CO2培养箱中培养6h。
8)荧光素酶与化学发光底物作用：
将化学发光底物与含有细胞裂解液的底物缓冲液(均购自Promega公司)混匀。以每孔100μl加至上述细胞板中。室温下，在振荡器上震荡一定时间。
9)化学发光强度测定：
使用酶标仪，以0.5s/孔的速度读取各孔的化学发光强度，以相对光单位 (RLU)表示。
10)数据处理：
以参比品或待测样品的浓度的对数值为横坐标，各样品孔的RLU与空白对照RLU的平均值之差为纵坐标分别绘制参比品与待测样品的量效曲线。通过软件GraphPadPrism5.0非线性拟合中的Dose-response-Stimulaiton模式下的 log[agonist]vs.response—variable slope进行数据回归分析。计算参比品及待测样品的半数有效浓度(IC50)，按下式计算IL-6R抑制剂的相对生物学活性。
待测IL-6R抑制剂相对生物学活性(％)＝参比品IC50/待测样品IC50×100％。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)细胞培养简单，对试剂要求较低，重复性较好，以利于保证测定结果的稳定性；
(2)测定周期短，在保证测定质量的基础上可以在6h内完成全部实验；
(3)本发明以IL-6相关信号通路的激活情况为研究对象，设计一种能够稳定表达SIE-荧光素酶报告基因的人肾上皮细胞株，其更接近样品在体内作用的实际情况，测定结果更为准确。
本发明建立一种更加快速、简便、重复性好的IL-6R抑制剂的相对生物学活性测定方法，可有利于IL-6R抑制剂类药物的研究开发，质量控制和临床应用，具有较高的应用价值。
附图说明
图1是不同293T-SIE细胞单克隆的荧光素酶活性鉴定结果；其中，
T2、T6、T8、T9、T10、T11、T12、T13、T14、T15：不同细胞单克隆的编号；
图2是荧光素酶报告基因法测定生物学活性的条件优化结果图；其中，
Sample 1：细胞密度为4×104个/孔；
Sample 2：细胞密度为2×104个/孔；
Sample 3：细胞密度为1×104个/孔；
图3是托珠样品活性测定的化学发光强度结果图；其中，
Std：托珠参比品；
Sample：待测样品。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
本发明使用的单克隆细胞株293T-SIE为为携带有受SIE调控的荧光素酶基因且能稳定表达荧光素酶的体外培养的人肾上皮细胞293T细胞，其已进行保藏，其保藏编号为CGMCC No.13816，保藏日期为2017年3月22日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例1
本实施例为单克隆细胞株293T-SIE的构建，其包括如下步骤：
(1)潮霉素b最佳筛选浓度的确定；
293T细胞培养于含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基。取对数生长期细胞，调整细胞浓度为1×106/ml，每孔2ml接种于6孔板中，置于细胞培养箱常规培养。在细胞接种24h后，稀释潮霉素b，建立0-1mg/ml共10个浓度梯度，加入6孔板中，每天观察细胞生长情况，在10-14d内使细胞全部死亡的最低潮霉素b浓度，即为筛选转染293T细胞的工作浓度。所述的稳定表达由SIE 所调控的荧光素酶的人肾上皮细胞293T-SIE细胞株中，潮霉素b对293T细胞株的最佳工作浓度为0.4mg/ml。
(2)携带有受SIE调控的荧光素酶基因的质粒的构建；
质粒pGL 4.47的基因ID为JQ858512.1，购买于普洛麦格生物技术有限公司。将pGL4.47转化大肠杆菌DH5α，阳性克隆按1:1000比例转接共20ml含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃振荡培养12小时，采用碱裂解法提取质粒，经紫外- 可见分光光度法测定DNA浓度为0.6mg/ml，260nm及280nm波长吸光值之比为 1.88。
(3)细胞转染；
取对数生长期的293T细胞，转染前1天将细胞接种于6孔板，24h内待细胞融合度达到70％-90％，吸尽培养上清，加入1.5ml无血清DMEM培养液。另取2支1.5ml EP管，分别加入0.25ml无血清DMEM培养液，然后在其中1支 EP管中加入2μl pGL4.47质粒，另1支EP管中加入5μl LipofectamineTM 2000阳离子质脂体，室温孵育10分钟后将2支EP管中的液体混匀，继续室温孵育15 分钟。将0.5ml混合溶液缓慢加入细胞培养液中，温和混匀，即完成转染操作，转染后细胞置于培养箱常规培养。
(3)潮霉素b筛选抗性细胞及其单克隆化；
质粒转染后48h，加入含有0.4mg/ml潮霉素b的DMEM培养液，继续培养，根据细胞死亡情况和培养基的营养并及时换液。以未转染的细胞作为对照，待对照细胞全部死亡后，消化转染组存活细胞，制备成单细胞悬液，接种于96孔板，加入含有0.4mg/ml潮霉素b的DMEM培养液，继续培养。挑选生长状态良好的单细胞克隆依次转入24孔板、6孔板、75mm2细胞培养瓶用含有0.4mg/ml潮霉素b的DMEM培养液进行连续扩大培养，得到稳定表达由SIE所调控的荧光素酶的人肾上皮细胞293T-SIE细胞株，可置于液氮罐中长期保存。
(4)细胞克隆荧光素酶活性鉴定；
293T-SIE细胞克隆消化并计数，然后稀释至6×105个细胞/ml，每孔50μl加入96孔白板中，共接种6个孔。其中3个孔加入50μl培养基，作为对照组，另 3个孔加入50μl IL-6(500ng/μl)，作为实验组，混匀后常规培养。培养6h后取出白板，向每孔中加入100μl化学发光底物(Promega)，混匀后室温振荡5min。使用发学发光分析仪，以0.5s/孔的速度读取各孔的荧光强度。
相对发光强度＝实验组发光强度的平均值/对照组发光强度的平均值
结果如图1所示，编号为T12、T14、T15的细胞克隆具有显著的荧光素酶活性。
实施例2
此实施例为荧光素酶报告基因法测定IL-6R抑制剂的相对生物学活性方法的条件优化，其包括如下步骤：
(1)细胞的复苏及传代：从液氮罐中取出冻存的293T-SIE细胞，将细胞快速融化复苏后，转入5ml含10％FBS的DMEM培养基中，于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(2)细胞接种：取处于对数生长期的细胞用0.25％胰酶消化，1000rpm离心2min，弃上清，将细胞重悬于细胞培养液(含10％胎牛血清的无酚红DMEM 培养基)中，计数。分别将细胞悬液稀释至0.8×106cells/ml、0.4×106cells/ml、 0.2×106cells/ml，以50μl/孔接种于96孔白板。
(3)加入IL-6梯度溶液：取人重组IL-6粉末100μg，加入1ml无菌水溶解，得到IL-6储存液。取IL-6储存液，用无酚红DMEM培养基分别稀释至2000ng/ml、 400ng/ml、80ng/ml、16ng/ml、3.2ng/ml、0.61ng/ml、0.13ng/ml，得到IL-6梯度溶液。将IL-6梯度溶液加入上述细胞培养板中，每孔50μl，每个实验组均设置3 个平行复孔，将细胞培养板置于37℃、5％CO2培养箱中培养6h。
(4)荧光素酶与化学发光底物作用：将化学发光底物与含有细胞裂解液的底物缓冲液(均购自Promega公司)混匀。以每孔100μl加至上述细胞板中。室温下，在振荡器上震荡5min。
(5)化学发光强度测定：使用酶标仪，以0.5s/孔的速度读取各孔的化学发光强度，以相对光单位(RLU)表示。
(6)数据处理：以IL-6溶液的刺激终浓度的对数值为横坐标，各样品孔的 RLU的平均值为纵坐标分别绘制各样品的量效曲线。
结果如图2所示，当每孔细胞数量为4×104个，且IL-6溶液的刺激终浓度为100ng/μl时，可获得最强的发光信号，在上述条件下，测定方法的结果较好。
实施例3
此实施例为荧光素酶报告基因法测定托珠单抗的相对生物学活性。
采用293T-SIE细胞株测定IL-6R抑制剂托珠单抗相对生物学活性的方法包括如下步骤：
(1)细胞的复苏及传代：从液氮罐中取出冻存的293T-SIE细胞，将细胞快速融化复苏后，转入5ml含10％FBS的DMEM培养基中，于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(2)细胞接种：取处于对数生长期的细胞用0.25％胰酶消化，1000rpm离心2min，弃上清，将细胞重悬于细胞培养液(含10％胎牛血清的无酚红DMEM 培养基)中，计数。将细胞悬液稀释至0.8×106cells/ml后，以50μl/孔接种于96 孔白板。
(3)IL-6工作液的配制：取人重组IL-6粉末100μg，加入1ml无菌水溶解，得到IL-6储存液。取IL-6储存液，用无酚红DMEM培养基稀释至200ng/ml，得到IL-6工作液。
(4)参比品溶液的配制：取托珠参比品，用细胞培养液将参比品稀释至 200μg/ml，然后向下3倍倍比稀释9个浓度，得到参比品溶液。
(5)待测样品溶液的配制：取待测样品，用细胞培养液将待测样品稀释至200μg/ml，然后向下3倍倍比稀释9个浓度，得到待测样品溶液。
(6)参比品与待测样品溶液作用于细胞：将上述不同浓度的参比品与待测样品溶液，按每孔25μl加至细胞培养板中。
(7)加入IL-6工作液：将IL-6工作液加入上述细胞培养板中，每孔25μl。另设阴性对照与空白对照：两者均不加参比品或待测样品溶液，且阴性对照孔每孔加50μlIL-6稀释液，空白对照孔每孔加50μl细胞培养液。每个实验组均设置 3个平行复孔，于37℃、5％CO2培养箱中培养6h。
(8)荧光素酶与化学发光底物作用：将化学发光底物与含有细胞裂解液的底物缓冲液(均购自Promega公司)混匀。以每孔100μl加至上述细胞板中。室温下，在振荡器上震荡5min。
(9)化学发光强度测定：使用酶标仪，以0.5s/孔的速度读取各孔的化学发光强度，以相对光单位(RLU)表示。
(10)数据处理：以参比品或待测样品的浓度的对数值为横坐标，各样品孔的RLU与空白对照RLU的平均值之差为纵坐标分别绘制参比品与待测样品的量效曲线。通过软件GraphPadPrism 5.0非线性拟合中的Dose-response-Stimulaiton 模式下的log[agonist]vs.response—variable slope进行数据回归分析。计算参比品及待测样品的半数有效浓度(IC50)，按下式计算相对生物学活性：
待测样品相对生物学活性(％)＝参比品IC50/待测样品IC50×100％。
所述步骤(10)中进一步利用GraphPadPrism软件的四参数回归进行处理，当参比品和待测样品的拟合曲线平行性假设得到确认(P值>0.05)后，且曲线拟合系数R>0.9，使用constrained的曲线最大值、最小值、斜率，计算参比品和待测样品的半效量浓度IC50。
结果如图3所示，利用本发明的测定方法测得托珠参比品的IC50约为 0.9272μg/ml，待测样品的IC50约为0.9825μg/ml，待测样品的相对生物学活性为 94.37％。
由上述实施例可知，本发明构建了一种能够稳定表达SIE-荧光素酶报告基因的人肾上皮细胞株，上述细胞株在给予外源IL-6刺激的情况下可稳定表达荧光素酶，通过检测该细胞株所表达的荧光素酶的活性可以测定IL-6R抑制剂的相对生物学活性，本发明提供的方法测定时间短，而且重复性更好，结果更稳定
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (10)

1.一种单克隆细胞株，其特征在于，所述单克隆细胞株为携带有受SIE调控的荧光素酶基因且能稳定表达荧光素酶的体外培养的哺乳动物细胞。
2.根据权利要求1所述的单克隆细胞株，其特征在于，所述哺乳动物细胞为人肾上皮细胞293T细胞。
3.根据权利要求1所述的单克隆细胞株，其特征在于，所述单克隆细胞株命名为293T-SIE，其保藏编号为CGMCC No.13816，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
4.一种如权利要求1～3中任一项所述的单克隆细胞株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
a)构建携带有受SIE调控的荧光素酶基因的质粒；
b)利用阳离子脂质体将步骤a)所述的质粒转染入人肾上皮细胞293T细胞；
c)在步骤b)转染后的细胞中加入潮霉素b，经过加压筛选，分离获得单克隆细胞株293T-SIE并冻存。
5.根据权利要求4所述的单克隆细胞株的构建方法，其特征在于，还包括单克隆细胞株293T-SIE的荧光素酶活性的鉴定步骤。
6.根据权利要求4所述的单克隆细胞株的构建方法，其特征在于，所述潮霉素b的浓度为0～1mg/ml。
7.一种如权利要求1～3中任一项所述的单克隆细胞株在筛选IL-6R抑制类药物中的应用。
8.一种采用如权利要求1～3中任一项所述的单克隆细胞株测定IL-6R抑制剂相对生物学活性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)单克隆细胞株293T-SIE的复苏、传代及接种：取出冻存的293T-SIE细胞，将细胞快速融化复苏后，于培养箱中培养；取处于对数生长期的细胞用胰酶消化，离心弃上清液，将细胞重悬于细胞培养液中，将细胞悬液稀释后接种至孔板；
(2)配制IL-6工作液、参比品溶液及待测样品溶液，根据测定需求分别将IL-6工作液、参比品溶液及待测样品溶液加入已接种单克隆细胞株293T-SIE的孔板中；
(3)将化学发光底物与含有细胞裂解液的底物缓冲液混匀，加至孔板，室温震荡一定时间；
(4)使用酶标仪读取各孔的化学发光强度，并对测定的数据进行处理，计算参比品及待测样品的半数有效浓度IC50，并计算IL-6R抑制剂的相对生物学活性。
9.根据权利要求8所述的测定IL-6R抑制剂相对生物学活性的方法，其特征在于，所述步骤(2)IL-6工作液、参比品溶液及待测样品溶液的配制过程如下：
IL-6工作液：取预订量的人重组IL-6粉末，加入无菌水溶解，得到IL-6储存液；取IL-6储存液，用细胞培养液稀释，得到预定浓度的IL-6工作液；
参比品溶液：取IL-6R抑制剂参比品，以细胞培养液对参比品按预定比例依次稀释，得到多个不同浓度梯度的参比品溶液；
待测样品溶液：取待测样品，以细胞培养液对待测样品按预定比例依次稀释，得到多个不同浓度梯度的待测样品溶液。
10.根据权利要求8所述的测定IL-6R抑制剂相对生物学活性的方法，其特征在于，所述步骤(4)中IL-6R抑制剂的相对生物学活性的计算公式如下：
待测IL-6R抑制剂相对生物学活性(％)＝参比品IC50/待测样品IC50×100％。
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