CN113337543A - Gcgr报告基因稳转细胞株及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了GCGR报告基因稳转细胞株及其构建方法和应用，该细胞株细胞膜表达GCGR受体，该细胞株包含多聚核苷酸，该多聚核苷酸有CRE结合的结合序列，连接下游的启动子，该启动子连接一个开放阅读框，该阅读框表达一个报告基因蛋白。本申请的发明人构建了GCGR报告基因稳转细胞株，并利用该细胞株开发出不限于GCGR激动剂类和拮抗剂类药物的生物活性测定方法，生物分析定量方法和中和抗体测定方法。解决了检测步骤繁琐时间成本高，试剂耗材成本较高，实验数据解读复杂，方法不够灵敏、抗干扰能力差、不能完全表征GCGR激活/拮抗机理和效果，不具备通用性等难题。

Description

GCGR报告基因稳转细胞株及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种GCGR报告基因稳转细胞株构建方法和应用。
背景技术
GCGR(UniProt ID：P47871)是胰高血糖素(glucagon)的受体，属于G蛋白偶联受体家族的一员，该受体在调节血糖的水平，保持血糖的稳态上发挥了关键的作用。GCGR通过胰高血糖素激活后发挥生理功能，胰高血糖素具有很强的促进糖原分解和糖异生作用，使血糖明显升高，1mol/L的激素可使3×106mol/L的葡萄糖迅速从糖原分解出来。胰高血糖素通过cAMP-PK系统，激活肝细胞的磷酸化酶，加速糖原分解。在GCGR的信号通路中，胰高血糖素通过和细胞膜表面的GCGR结合激活胞内的信号，导致细胞内的腺苷酸环化酶活化和胞内cAMP浓度的上升，cAMP浓度的上升激活蛋白激酶A(cyclic-AMP dependent proteinkinase A)，最终磷酸化CRE转录因子，磷酸化CRE处于活化状态，进入细胞核激活胰岛素基因和促胰岛生长抑素基因的转录翻译，最终调节血糖的稳态(KEGG PATHWAY:ko04922)。
在调节血糖的稳态的药物研发过程，GCGR的激动剂和拮抗剂发挥着各自的作用。目前上市或者处于临床研发阶段的GCGR的激动剂，包括GlucaGen HypoKIt，GlucagonEmergency Kit，BAQSIMI，Gvoke(G-Pen)等用于治疗低血糖相关的症状。GCGR的胰高血糖素拮抗剂用于1型糖尿病，2型糖尿病和肥胖等高血糖相关疾病的药物研发目前还未有药物上市，药物研发前景广阔，同时竞争也十分的激烈，包括目前正在进行临床实验的研发管线包括小分子拮抗剂RVT 1502(LGD 6972)，抗体拮抗剂PF 6293620，Volagidemab，反义核苷酸药物ISIS-449884，GCGR/GCGR双功能激动剂，GLP-1R/GCGR/GIPR三功能激动剂，MK-8521，BI456906，Cotadutide，HM15211，SAR441255等。GCGR的药物研发前景广阔，竞争激烈，GCGR激动剂，拮抗剂的生物学分析方法(包括活性测试方法，浓度定量方法，中和抗体检测方法)是靶向GCGR药物研发重要的工具，有着极大的市场应用场景。
生物治疗药物的研发主要包括药物发现，临床前和临床研究和商业化生产三个大的阶段。在药物发现的过程中，药物相对于靶点体外的生物学活性测定和筛选是必不可少的过程。具体到GCGR激动剂的药物发现过程，需要开发候选药物和GCGR蛋白的结合测定方法，由于GCGR为七次跨膜蛋白，基于现有的实验技术限制，市场上无提供有活性重组GCGR的蛋白，构建GCGR受体高峰度表达的稳转细胞株进行结合活性的测定是较优的选择；有结合活性的候选药物是否有细胞学激动剂或者拮抗剂的效果，需要在细胞上验证其活性，现有检测技术对候选药物活性测定均是建立在表达GCGR受体的稳转细胞株基础之上，测定激动剂激活GCGR稳转细胞或者拮抗剂拮抗GCGR稳转细胞的激活，采用试剂盒检测新增的cAMP浓度如(R&D KGE002B，Cisbio 62AM4PEB)来测定活性，两个检测方法试剂成本较高，灵敏度相对较差，信号和检测的目的产物cAMP之间为非线性相关，数据的解读比较复杂，信号和背景的倍比较低区分度差，信号稳定性较差等不利影响。检测的变化是细胞激活后信号通路中间过程的产物cAMP，该方法不能完全反应候选药物的激活效果。
在临床前和临床研究中，药物的药代动力学是评估药物安全性和有效性必不可少的检测项目，药物的药代动力学依赖定量分析方法，具体到GCGR激动剂药物，采用受体配体结合实验(LBA)进行生物分析，由于市面上无活性的GCGR重组蛋白，需要通过候选药物免疫动物通过杂交瘤技术获得抗候选药物特异性抗体进行方法开发，时间周期需要3-6个月时间周期较长，且每一种候选药物均需要制备特异性抗体，不具备通用性，且定量方法的稳定性和灵敏性受特异性抗体的特点影响较大。
在临床前和临床研究中，抗药抗体和中和抗体的检测是评估药物安全性和有效性必不可少的步骤，特别是对于需要长期用药的糖尿病治疗领域。在长期的用药过程中，机体在产生的抗药抗体和中和抗体会逐渐的增强，最终导致药物的失活和不良反应的产生，在用药初期微弱的中和抗体可能会在长期的药用过程中随着机体的免疫应答而逐渐增强，中和抗体的测定方法对方法的灵敏度度有很高的要求。目前针对中和抗体的检测，现有检测技术对候选药物中和抗体的测定均是建立在表达GCGR受体的稳转细胞株基础之上，测定中和抗体和激动剂药物反应后，是否能够继续激活GCGR稳转细胞，采用试剂盒检测新增的cAMP浓度(R&D KGE002B，Cisbio 62AM4PEB)来测定中和抗体的，此类方法容易受到以血清为基质的检测样品中其他细胞因子的干扰，特异性相对较差，对抗干扰能力更强的中和抗体的检测方法有着迫切的需求。
为解决GCGR激动剂/拮抗剂药物研发过程中生物活性测定方法，生物分析定量方法和中和抗体测定方法，检测步骤繁琐时间成本高，试剂耗材成本较高，实验数据解读复杂，方法不够灵敏、抗干扰能力差、不能完全表征GCGR激活/拮抗机理和效果，不具备通用性等难题，本申请的发明人构建了GCGR报告基因稳转细胞株，并利用该细胞株开发出不限于GCGR激动剂类药物的生物活性测定方法，生物分析定量方法和中和抗体测定方法。
发明内容
本发明的目的提供一种GCGR报告基因稳转细胞株及其构建方法和应用，解决上述现有技术问题中的一个或者多个，如检测步骤繁琐时间成本高，试剂耗材成本较高，实验数据解读复杂，方法不够灵敏、抗干扰能力差、不能完全表征GCGR激活/拮抗机理和效果，不具备通用性等难题等。
根据本发明的一个方面，提供了一种GCGR报告基因稳转细胞株的构建方法，构建步骤如下：
S1，使用CRE报告基因质粒转染293T细胞，通过加入真核抗生素筛选和单克隆挑选，经过功能学评价，挑选得到合适的CRE报告基因稳转细胞株单克隆；
S2，使用GCGR慢病毒感染含CRE报告基因稳转细胞株单克隆细胞，通过加入真核抗生素筛选和单克隆挑选，经过功能学评价得到合适的GCGR报告基因稳转细胞株。
在一些实施方式中，步骤S1中，将CRE报告基因质粒和X-tremeGENE HP DNA转染试剂使用opti-MEM培养基混合均匀，室温静置后加入有1ml DMEM 60％汇合度的293T细胞的6孔板单孔中，第二天进行细胞换液，第三天转入T25细胞培养瓶中进行传代并且加入0.5μg/ml puromycin的DMEM培养基中进行加压培养；细胞大部分死亡，维持0.5μg/ml puromycinDMEM生长传代3次后，将细胞以1个/孔，200ul/孔进行96孔板单克隆铺板，96孔板单克隆铺板14天后，显微镜下观察每个孔的细胞状况，并挑选出单克隆进入24孔板，24孔板细胞经过1周培养后转入6孔板，然后经T25,T75,T175放大培养得到单克隆。
在一些实施方式中，步骤S2中，将GCGR基因慢病毒载体加入有1ml DMEM45％汇合度的CRE报告基因单克隆细胞株功能单克隆GP2-6的6孔板单孔中，第四天进行细胞换液并传代到新的6孔板中并且加入puromycin和Hygromycin B的DMEM培养基中进行加压培养；细胞部分死亡，维持puromycin和Hygromycin B生长传代2次后，将细胞铺以2个/孔，200ul/孔进行96孔板单克隆铺板，96孔板单克隆铺板19天后显微镜下观察每个孔的细胞状况，并挑选出单克隆进入24孔板，24孔板细胞经过1周培养后转入6孔板，然后经T75,T175放大培养得到较优的单克隆GP2-6-5。
根据本发明的另一个方面，提供了一种如上所述的GCGR报告基因稳转细胞株的构建方法得到的细胞株，所述细胞株的保藏编号为CCTCC NO：C2021122，保藏日期为2021年5月14日。
该细胞株细胞膜表达GCGR受体，该细胞株包含多聚核苷酸，该多聚核苷酸有CRE结合的结合序列，连接下游的启动子，该启动子连接一个开放阅读框，该阅读框表达一个报告基因蛋白。
根据本发明的另一个方面，还提供了一种GCGR报告基因稳转细胞株的构建方法在测定GCGR激动剂或者拮抗剂的生物学活性的检测方法。
根据本发明的另一个方面，还提供了一种GCGR报告基因稳转细胞株的构建方法在定量GCGR激动剂或者拮抗剂的浓度检测方法中的应用。
根据本发明的另一个方面，还提供了一种GCGR报告基因稳转细胞株的构建方法在测定GCGR激动剂或者拮抗剂中和抗体的检测方法中的应用。
本发明的有益效果：通过检测报告基因翻译出来的蛋白或者酶的活性，报告基因如荧光素酶基因(luciferase)经常用于表征细胞内转录活性；启动子或者增强子对基因表达的影响可以通过特定的实验检测报告基因来测得；在萤火虫素酶检测方法中，萤火虫素酶以ATP，氧气和萤火虫素luciferin为底物，催化化学反应，释放出可以被仪器检测到光，化学发光的强弱能够代表萤火虫素酶多少；萤火虫素酶报告基因检测方法相对于其他荧光类报告基因方法有极低的背景信号，有极高的灵敏程度，检测到的萤火虫素酶的浓度下限能够达到10–11M数量级别，被广泛应用于细胞内信号通路的研究。
本发明构建GCGR报告基因稳转细胞株，同时额外插入了荧光素酶基因表达体系组成了GCGR报告基因稳转细胞株，荧光素酶基因表达体系由CRE转录因子核苷酸结合位点，minipromoter和荧光素酶基因三部分组成，GCGR激动的激活效果可以由信号通路更下游的转录因子CRE的活性来表征，荧光素酶基因表达体系能够结合有活性的转录因子CRE启动荧光素酶的表达，因此可以通过检测荧光素酶的量来表征GCGR激动剂的激活效果，从而进一步用于GCGR受体激动剂活性测定的方法，利用该细胞株对GCGR受体激动剂的定量方法。
进一步涉及到GCGR受体激动剂的中和抗体的测定方法；使用该检测体系，当激动剂中加入拮抗剂时，可利用该细胞株对GCGR受体拮抗剂的活性测定方法，GCGR受体拮抗剂的浓度测定方法。
进一步涉及到GCGR受体激动剂的中和抗体的测定方法；鉴于荧光素酶检测方法的高灵敏性，该方法有极高的灵敏程度，GCGR报告基因稳转细胞株表征的是GCGR信号通路下游信号分子转录因子CRE的活性，相对于信号通路中游的信号分子cAMP，其更加能够代表GCGR激活机理和效果，信号传递的特异性进一步增强从而抗干扰能力增强。
采用GCGR报告基因稳转细胞株进行药物浓度的分析方法是通用性方法，可以对所有的GCGR激动剂/拮抗剂候选药物进行定量分析，灵敏程度高。在临床前和临床研究中评估动物/人血液样品中抗药抗体对候选药物的影响即中和抗体检测是药物安全和有效性的一部分，中和抗体检测方法是将药物发现过程中活性检测方法进行条件的调整转换而来，其检测体系和活性检测方法基本一致，构建GCGR报告基因稳转细胞株利用其荧光报告检测系统进行GCGR受体激动剂/拮抗剂的中和抗体的检测是较优的选择。在商业化生产阶段，对于药物的质量放行过程中，药物的生物活性检测方法和药物研发阶段活性检测方法类似，也可用GCGR报告基因稳转细胞株进行生物活性放行方法的开发。利用GCGR报告基因稳转细胞株进行形式多样的方法学开发可用于GCGR激动剂/拮抗剂生物治疗药物的研发的各个流程，是该类型药物研发过程中得力的工具。
附图说明
图1为本发明的CRE报告基因质粒转染效率评估检测结果；
图2为本发明的GCGR转染效率评估的检测结果；
图3为本发明的GCGR报告基因稳转细胞株单克隆GP2-6-5细胞株的活性测定方法的检测结果；
图4为本发明的GCGR报告基因稳转细胞株单克隆GP2-6-5细胞株的GCGR激动剂浓度测定方法的检测结果；
图5为本发明的GCGR报告基因稳转细胞株单克隆GP2-6-5细胞株的GCGR拮抗剂的活性测定方法的检测结果；
图6为本发明的GCGR拮抗剂的浓度测定方法的检测结果；
图7为本发明的GCGR报告基因稳转细胞株人血清耐受测定结果；
图8为本发明的GCGR拮抗剂的中和抗体检测方法的检测结果。
具体实施方式
下面对本发明进行进一步详细的说明。
实施例1
CRE报告基因稳转细胞株构建过程
4μg CRE报告基因质粒(生工定制，含有CRE结合区域，minipromoter SEQ ID NO.:1和luciferase基因)和4ul X-tremeGENE HP DNA转染试剂(Roche-06366244001)使用opti-MEM培养基(Thermo 31985-070)100ul混合均匀，室温静置半小时后加入有1ml DMEM60％汇合度的293T细胞的6孔板单孔中，第二天进行细胞换液，第三天转入T25细胞培养瓶中进行传代并且加入0.5μg/ml puromycin的DMEM培养基中进行加压培养。细胞大部分死亡，维持0.5μg/ml puromycin DMEM生长传代3次后，将细胞以1个/孔，200ul/孔进行96孔板单克隆铺板。
96孔板单克隆铺板14天后，显微镜下观察每个孔的细胞状况，并挑选出单克隆进入24孔板，24孔板细胞经过1周培养后转入6孔板，然后经T25,T75,T175放大培养得到单克隆。
SEQ ID NO.:1CRE DNA binding sequence and minipromoter
GCACCAGACAGTGACGTCAGCTGCCAGATCCCATGGCCGTCATACTGTGACGTCTTTCAGACACCCCATTGACGTCAATGGGAGAACAGATCTGGCCTCGGCGGCCAAGCTTAGACACTAGAGGGTATATAATGGAAGCTCGACTTCCAG
实施例2
CRE报告基因质粒转染效率评估
取报告基因表达质粒转染过的293T细胞，经1μg/ml puromycin DMEM加压培养两代后，取80uL消化后的细胞悬液(10000cells/孔)到白色不底透的96孔板每孔中，加入20ul浓度为150uM的Forskolin或者20ul的培养基，混合均匀后，放入37℃ 5％CO2的培养箱培养孵育5小时。加入100ul Bright-GloTMLuciferase Assay试剂(Promega E2620)，室温1000rpm混匀5分钟，放入化学发光检测仪检测。
检测结果见图1，Forskolin处理的信号值相对于培养基处理的背景组后，转染后的细胞均有很强的信号响应，信噪比大于50倍，实验结果表明CRE报告基因已插入293T细胞中。
实施例3
24孔板中CRE报告基因单克隆细胞株功能评价
从单克隆铺板的96孔板中选取单克隆转移到24孔板中，待24孔板中的克隆基本长满后，100ul胰酶消化细胞2-3分钟后,加入400ul培养基重悬细胞，取320uL消化后的细胞悬液(10000cells/孔)到白色不底透的96孔板3个孔中，分别20ul浓度为150uM的Forskolin或者20ul的培养基，混合均匀后，放入37℃ 5％CO2的培养箱培养孵育5小时。加入100ulBright-GloTMLuciferase Assay试剂，室温1000rpm混匀5分钟，放入化学发光检测仪检测。
单克隆的检测结果见下表1，实验结果表明不同单克隆用培养基或者Forskolin进行处理，产生的非常不一样的信号值，选取Forskolin/培养基信噪比较优的克隆GP2-6进行进一步扩增培养，作为母细胞进行GCGR报告基因稳转细胞的构建。
表1单克隆检测结果
编号 克隆号 Signal Background S/N
1 GP1-4 21 17 1
2 GP1-7 21389 3162 7
3 GP1-8 77976 1029 76
4 GP1-10 15766 92 171
5 GP1-19 7479 170 44
6 GP1-21 1075 352 3
8 GP1-22 42332 225 188
9 GP2-1 26019 1411 18
10 GP2-2 16 16 1
11 GP2-3 20 24 1
12 GP2-4 4636 311 15
13 GP2-6 571530 1873 305
14 GP2-7 33 16 2
15 GP2-8 8 13 1
16 GP2-9 7 8 1
17 GP2-14 13 9 1
18 GP2-15 30 15 2
19 GP2-16 177650 1875 95
实施例4
GCGR报告基因稳转细胞株构建过程
15ul GCGR基因慢病毒载体(金唯智定制，GCGR基因SEQ ID NO.：2)加入有1mlDMEM 45％汇合度的CRE报告基因单克隆细胞株功能单克隆GP2-6的6孔板单孔中，第四天进行细胞换液并传代到新的6孔板中并且加入1μg/ml puromycin和200μg/ml Hygromycin B的DMEM培养基中进行加压培养。
细胞部分死亡，维持1μg/ml puromycin和200μg/ml Hygromycin B生长传代2次后，将细胞铺以2个/孔，200ul/孔进行96孔板单克隆铺板，96孔板单克隆铺板19天后显微镜下观察每个孔的细胞状况，并挑选出单克隆进入24孔板，24孔板细胞经过1周培养后转入6孔板，然后经T75，T175放大培养得到较优的单克隆GP2-6-5。
SEQ ID NO.：2 GCGR DNA sequence
atgcccccctgccagccacagcgacccctgctgctgttgctgctgctgctggcctgccagccacaggtcccctccgctcaggtgatggacttcctgtttgagaagtggaagctctacggtgaccagtgtcaccacaacctgagcctgctgccccctcccacggagctggtgtgcaacagaaccttcgacaagtattcctgctggccggacacccccgccaataccacggccaacatctcctgcccctggtacctgccttggcaccacaaagtgcaacaccgcttcgtgttcaagagatgcgggcccgacggtcagtgggtgcgtggaccccgggggcagccttggcgtgatgcctcccagtgccagatggatggcgaggagattgaggtccagaaggaggtggccaagatgtacagcagcttccaggtgatgtacacagtgggctacagcctgtccctgggggccctgctcctcgccttggccatcctggggggcctcagcaagctgcactgcacccgcaatgccatccacgcgaatctgtttgcgtccttcgtgctgaaagccagctccgtgctggtcattgatgggctgctcaggacccgctacagccagaaaattggcgacgacctcagtgtcagcacctggctcagtgatggagcggtggctggctgccgtgtggccgcggtgttcatgcaatatggcatcgtggccaactactgctggctgctggtggagggcctgtacctgcacaacctgctgggcctggccaccctccccgagaggagcttcttcagcctctacctgggcatcggctggggtgcccccatgctgttcgtcgtcccctgggcagtggtcaagtgtctgttcgagaacgtccagtgctggaccagcaatgacaacatgggcttctggtggatcctgcggttccccgtcttcctggccatcctgatcaacttcttcatcttcgtccgcatcgttcagctgctcgtggccaagctgcgggcacggcagatgcaccacacagactacaagttccggctggccaagtccacgctgaccctcatccctctgctgggcgtccacgaagtggtcttcgccttcgtgacggacgagcacgcccagggcaccctgcgctccgccaagctcttcttcgacctcttcctcagctccttccagggcctgctggtggctgtcctctactgcttcctcaacaaggaggtgcagtcggagctgcggcggcgttggcaccgctggcgcctgggcaaagtgctatgggaggagcggaacaccagcaaccacagggcctcatcttcgcccggccacggccctcccagcaaggagctgcagtttgggaggggtggtggcagccaggattcatctgcggagacccccttggctggtggcctccctagattggctgagagccccttctga
实施例5
GCGR转染效率评估
取GCGR基因转染的CRE报告基因细胞，经1μg/ml puromycin和200μg/mlHygromycin B加压培养两代后，取80uL消化后的细胞悬液(10000cells/孔)到白色不底透的96孔板每孔中，加入20ul浓度5uM的Glucagon或者20ul的Forskolin或培养基，混合均匀后，放入37℃ 5％CO2的培养箱培养孵育5小时。加入50ul Bright-LumiTMLuciferase Assay试剂(碧云天RG052M)，室温800rpm混匀5分钟，放入化学发光检测仪检测。
检测结果见图2，实验结果表明转染过GCGR基因的CRE报告基因细胞经Forsklin或者Glucagon刺激后均有明显的剂量响应，培养基组为背景信号值，Glucagon信噪比大于100倍，有较好的转染效率，说明GCGR基因已插入CRE报告基因细胞中，并且细胞表面有具有生物学活性的GCGR的表达。
实施例6
24孔板中单克隆细胞株功能评价
从单克隆铺板的96孔板中选取单克隆转移到24孔板中，待24孔板中的克隆基本长满后，120ul胰酶消化细胞1-2分钟后,加入480ul培养基重悬细胞，取重悬后的细胞悬液调整浓度后加入(10000cells/孔)到白色不底透的96孔板3个孔中，分别加入20ul浓度为5uM的Glucagon，20ul浓度为150uM的Forskolin或者20ul的培养基，混合均匀后，放入37℃ 5％CO2的培养箱培养孵育5小时。加入50ul Bright-LumiTMLuciferase Assay试剂，室温800rpm混匀5分钟，放入化学发光检测仪检测。
单克隆的检测结果见下表2，实验结果表明不同单克隆在培养基，Forskolin和Glucagon产生的较大差异的信号值，选取Forskolin/培养基，Glucagon/培养基信噪较优的克隆GP2-6-5进行进一步扩增培养和进行方法学开发。
表2为不同单克隆在不同培养基中的信号值
Figure BDA0003101399240000101
实施例7
GCGR报告基因稳转细胞株激动剂活性测定方法的方法开发和测定
选取GCGR报告基因稳转细胞株单克隆GP2-6-5，1E5个/每孔，80ul/孔种入白色不底透的96孔板；将GCGR靶点的激活剂Glucagon进行梯度稀释，初始工作浓度为50000nM的Glucagon,3倍梯度稀释共13个点，20ul每孔加入有稳转细胞株克隆的孔中，37℃5％CO2的培养箱孵育5小时，加入50ul Bright-LumiTMLuciferase Assay试剂，室温800rpm混匀5分钟，放入化学发光检测仪检测。
GP2-6-5细胞株的检测结果见图3，随着Glucagon的浓度递增，GCGR报告基因稳转细胞株单克隆GP2-6-5有递增的信号值，可用于GCGR激动剂的活性测定。
实施例8
GCGR报告基因稳转细胞株用于GCGR激动剂浓度测定方法的方法开发和测定
选取GCGR报告基因稳转细胞株单克隆GP2-6-5，1E5个/每孔，80ul/孔种入白色不底透的96孔板；将GCGR靶点的激活剂Glucagon进行梯度稀释，初始工作浓度为5555.55nM的Glucagon,3倍梯度稀释共11个点，20ul每孔加入有稳转细胞株克隆的孔中，37℃5％CO2的培养箱孵育5小时，加入50ul Bright-LumiTMLuciferase Assay试剂，室温800rpm混匀5分钟，放入化学发光检测仪检测。
GP2-6-5细胞株的检测结果见图4，标准曲线的浓度点的回测偏差在35％以内，且检测的灵敏度可达到0.02nM，可用于GCGR激动剂的浓度测定。
实施例9
GCGR报告基因稳转细胞株用于GCGR拮抗剂的活性测定方法开发和测定
选取GCGR报告基因稳转细胞株单克隆GP2-6-5，5E4个/每孔，80ul/孔种入白色不底透的96孔板；将GCGR的拮抗剂抗GCGR抗体(泰州市百英生物科技有限公司定制，项目编号B483901)稀释，从初始工作浓度1000μg/ml梯度稀释，2倍稀释11个点，10ul加入有稳转细胞株克隆GP2-5-6的孔中，混合均匀，放入37℃ 5％CO2的培养箱培养孵育30min，再将Glucagon进行稀释，初始工作浓度为100nM，10ul加入GCGR抗体共孵育的稳转细胞株克隆GP2-5-6的孔中，混合均匀；96孔板放入37℃ 5％CO2的培养箱培养孵育5小时，加入50ulBright-LumiTMLuciferase Assay试剂，室温800rpm混匀5分钟，放入化学发光检测仪检测。
详细结果见图5，随着GCGR抗体的浓度的增加，GCGR报告基因稳转细胞株产生的信号值逐渐下降，有明显的剂量响应曲线，可用于GCGR拮抗剂的活性测定。
实施例10
GCGR报告基因稳转细胞株用于GCGR拮抗剂的浓度测定方法开发和测定
选取GCGR报告基因稳转细胞株单克隆GP2-6-5，5E4个/每孔，80ul/孔种入白色不底透的96孔板；将GCGR的拮抗剂抗GCGR抗体(泰州市百英生物科技有限公司定制，项目编号B483901)稀释，从初始工作浓度250μg/ml梯度稀释，2倍稀释8个点，10ul加入有稳转细胞株克隆GP2-5-6的孔中，混合均匀，放入37℃ 5％CO2的培养箱培养孵育30min，再将Glucagon进行稀释，初始工作浓度为100nM，10ul加入GCGR抗体共孵育的稳转细胞株克隆GP2-5-6的孔中，混合均匀；96孔板放入37℃ 5％CO2的培养箱培养孵育5小时，加入50ul Bright-LumiTMLuciferase Assay试剂，室温800rpm混匀5分钟，放入化学发光检测仪检测。
详细结果见图6，标准曲线的浓度点的回测偏差在35％以内，可用于GCGR拮抗剂的浓度测定。
实施例11
GCGR报告基因稳转细胞株人血清耐受测定
选取GCGR报告基因稳转细胞株单克隆GP2-6-5，5E4个/每孔，80ul/孔种入白色不底透的96孔板；将抗GCGR抗体稀释，从初始工作浓度1000μg/ml梯度稀释，2倍稀释11个点，10ul加入有稳转细胞株克隆GP2-5-6的孔中，混合均匀，放入37度5％CO2的培养箱培养孵育30min，将Glucagon用培养基或者50％的人Pool血清稀释到初始工作浓度100nM，10ul/孔加入细胞悬液中，混合均匀；96孔板放入37℃ 5％CO2的培养箱培养孵育5小时，加入50ulBright-LumiTMLuciferase Assay试剂，室温800rpm混匀5分钟，放入化学发光检测仪检测。
剂量曲线实验结果见图7。在这个检测体系中，反应基质为培养基或者5％的人Pooled血清，有相似的剂量响应曲线，说明GCGR报告基因稳转细胞株单克隆GP2-6-5对5％的人血清耐受，可用于人血清基质环境的样品分析检测。
实施例12
GCGR报告基因稳转细胞株用于GCGR拮抗剂的中和抗体检测方法的开发
选取GCGR报告基因稳转细胞株单克隆GP2-6-5，5E4个/每孔，80ul/孔种入白色不底透的96孔板；将抗GCGR抗体用培养基稀释到初始工作浓度120μg/ml，加入人独立血清或者人混合血清中对半稀释，室温静置15min；孵育结束后的溶液以10ul/孔加入含80ul/孔细胞悬液中，混合均匀，放入37℃ 5％CO2的培养箱培养孵育30min；将Glucagon用培养基稀释到工作浓度100nM，待孵育结束后10ul/孔加入96孔板中，混合均匀；96孔板放入37℃ 5％CO2的培养箱培养孵育5小时，加入50ul Bright-LumiTMLuciferase Assay试剂，室温800rpm混匀5分钟，放入化学发光检测仪检测。
通过人独立血清/人混合血清(NC)的比值进行统计学分析，如图8，经初步测定GCGR拮抗剂的中和抗体检测方法cut point为0.86。
以上所述仅是本发明的优选方式，应当指出，对于本领域普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干相似的变形和改进，这些也视为发明保护之内。

Claims (8)

1.一种GCGR报告基因稳转细胞株的构建方法，其特征在于，构建步骤如下：
S1，使用CRE报告基因质粒转染293T细胞，通过加入真核抗生素筛选和单克隆挑选，经过功能学评价，挑选得到合适的CRE报告基因稳转细胞株单克隆；
S2，使用GCGR慢病毒感染含CRE报告基因稳转细胞株单克隆细胞，通过加入真核抗生素筛选和单克隆挑选，经过功能学评价得到合适的GCGR报告基因稳转细胞株。
2.根据权利要求1所述的一种GCGR报告基因稳转细胞株的构建方法，其中，步骤S1中，将CRE报告基因质粒和X-tremeGENE HP DNA转染试剂使用opti-MEM培养基混合均匀，室温静置后加入有1ml DMEM 60％汇合度的293T细胞的6孔板单孔中，第二天进行细胞换液，第三天转入T25细胞培养瓶中进行传代并且加入0.5μg/ml puromycin的DMEM培养基中进行加压培养；细胞大部分死亡，维持0.5μg/ml puromycin DMEM生长传代3次后，将细胞以1个/孔，200ul/孔进行96孔板单克隆铺板，96孔板单克隆铺板14天后，显微镜下观察每个孔的细胞状况，并挑选出单克隆进入24孔板，24孔板细胞经过1周培养后转入6孔板，然后经T25,T75,T175放大培养得到单克隆。
3.根据权利要求1所述的一种GCGR报告基因稳转细胞株的构建方法，其中，步骤S2中，将GCGR基因慢病毒载体加入有1ml DMEM 45％汇合度的CRE报告基因单克隆细胞株功能单克隆GP2-6的6孔板单孔中，第四天进行细胞换液并传代到新的6孔板中并且加入puromycin和Hygromycin B的DMEM培养基中进行加压培养；细胞部分死亡，维持puromycin和Hygromycin B生长传代2次后，将细胞铺以2个/孔，200ul/孔进行96孔板单克隆铺板，96孔板单克隆铺板19天后显微镜下观察每个孔的细胞状况，并挑选出单克隆进入24孔板，24孔板细胞经过1周培养后转入6孔板，然后经T75,T175放大培养得到较优的单克隆GP2-6-5。
4.权利要求1～3任一项所述的一种GCGR报告基因稳转细胞株的构建方法得到的细胞株，所述细胞株的保藏编号为CCTCC NO：C2021122，保藏日期为2021年5月14日。
5.根据权利要求4所述的细胞株，其特征在于，该细胞株细胞膜表达GCGR受体，该细胞株包含多聚核苷酸，该多聚核苷酸有CRE结合的结合序列，连接下游的启动子，该启动子连接一个开放阅读框，该阅读框表达一个报告基因蛋白。
6.权利要求1～3任一项所述的一种GCGR报告基因稳转细胞株的构建方法在测定GCGR激动剂或者拮抗剂的生物学活性的检测方法。
7.权利要求1～3任一项所述的一种GCGR报告基因稳转细胞株的构建方法在定量GCGR激动剂或者拮抗剂的浓度检测方法中的应用。
8.权利要求1～3任一项所述的一种GCGR报告基因稳转细胞株的构建方法在测定GCGR激动剂或者拮抗剂中和抗体的检测方法中的应用。
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