CN104846061A - 一种glp-1受体激动剂的受体亲和力测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种GLP-1受体激动剂的受体亲和力测定方法。本发明基于工具细胞株——CHO-GLP-1R-CRE-Luc⁺，当待测样品与该细胞表面的GLP-1受体结合后，可激活受体所介导的信号级联反应，特异性激活cAMP响应元件(CRE)并促进荧光素酶报告基因的表达，通过检测细胞溶质中荧光素酶的量来绘制并拟合得到样品与GLP-1受体作用的量效曲线，并计算其半数有效浓度(EC₅₀)。本发明通过对测定过程中各影响因素的考察与优化，最终建立了一种GLP-1受体激动剂受体亲和力的测定方法。其具有专属性强，精密度和准确度高，耐用性良好，操作简便等优点。可用于GLP-1受体激动剂受体亲和力的测定，以对该类药物进行快速评价与筛选。

Description

一种GLP-1受体激动剂的受体亲和力测定方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及受体亲和力测定方法，具体涉及一种GLP-1受体激动剂的受体亲和力测定方法。

背景技术

肠促胰岛素是指人体在进食后由肠道分泌的一类可引起降血糖效应多肽的总称。由肠促胰岛素引起的胰岛素分泌约占其分泌总量的50％～70％。近年来，以胰高血糖素样肽-1(GLP-1)为代表的肠促胰岛素类药物在糖尿病治疗领域受到广泛关注。GLP-1与其受体结合后可激活与之偶联的G蛋白，增加细胞内cAMP浓度并激活蛋白激酶A(PKA)，由此上调β细胞内胰岛素基因的转录和翻译，从而增加胰岛素分泌量并增强葡萄糖刺激信号的敏感性，发挥降糖效果。由于其降血糖效应具有血糖依赖性，因而将GLP-1用于II型糖尿病治疗时所诱发低血糖的风险极低，是一项非常重要的安全特性。此外，GLP-1还可以通过抑制胰高血糖素的分泌、抑制肠蠕动、减少胃排空、促进胰岛β细胞的增殖与分化并抑制其凋亡等方式来调节血糖。然而，GLP-1在人体内易被二肽基肽酶IV(DPP-IV)降解，体内半衰期不足5min，这在很大程度上限制了其在临床上的应用。GLP-1受体激动剂可与体内广泛分布的GLP-1受体(GLP-1R)结合，发挥与GLP-1类似的药理作用，这使得GLP-1R激动剂成为一类治疗II型糖尿病的理想的候选药物分子。

Exendin-4是从美洲巨蜥的唾液中提取的一种由39个氨基酸构成的GLP-1类似物，与哺乳动物体内的GLP-1具有53％的同源性，是一种天然的能够抵抗DPP-4降解的GLP-1R激动剂。由于Exendin-4与GLP-1R具有更高的亲和力，因而能发挥更为显著的降血糖作用；同时Exendin-4在体内能够发挥比GLP-1更持久的生物学活性。人工合成的Exendin-4，商品名为Byetta，是由美国艾美林公司(Amylin)和礼来公司(EliLilly)联合开发的皮下注射液，于2005年获FDA批准上市，作为磺脲类及二甲双胍等药物治疗不能达标的II型糖尿病患者的辅助用药。但由于该药物仍然存在着体内半衰期较短(2.4h)，用药次数频繁(一天用药两次)等问题，使其在临床上的应用也受到了一定程度的限制。

由此可见，开发亲和力更高、性质更优良，作用时间更长的新型GLP-1R激动剂具有重要的临床意义和巨大的市场潜力。为此，药物研发人员针对GLP-1和Exendin-4分子，进行了大量的化学改构与修饰等方面的研究，同时非肽类的小分子GLP-1受体激动剂的研发也取得了一定的成果。随着大量来源不同，物理化学性质各异的GLP-1受体激动剂被开发出来，对高效、准确地评价和筛选GP1-R激动剂类药物的方法提出了新的要求，而基于GP1-R激动剂的受体亲和力的测定是快速，高通量筛选此类药物的一项重要依据。常用的测定方法包括以下三类：(1)基于放射性同位素受体配体结合的原理，将同位素标记的药物分子和原型分子共同作用于高表达GLP-1R的细胞，通过检测最总结合到细胞上的放射性强度来计算出药物的亲和力，但该方法依赖于同位素标记技术，且对人体有一定的伤害。(2)以酶联免疫分析吸附试验(ELISA)、均相放射免疫闪烁迫近分析法为代表的针对GPCR信号通路中第二信使cAMP/cGMP的检测，能够实现对单一靶点的单一功能分析，但专属性较差，可能会存在细胞内源性的干扰作用。(3)报告基因测定法：基于GLP-1R及相关信号通路的功能测定可作为高通量筛选GLP-1R激动剂类药物的重要手段。与传统的受体功能检测法相比，该法能够区分激动剂和拮抗剂，是筛选受体激动剂和拮抗剂的有效方法。目前常用的报告基因有：氯霉素乙酞转移酶，碱性磷酸化酶，p-半乳糖昔酶，绿色荧光蛋白和荧光素酶等。荧光素酶(Luciferase)是一类能够催化不同底物发生氧化作用并伴随发出生物荧光的酶，其检测速度快，灵敏度高、稳定性好、线性范围广等优点，具有其他报告基因无可替代的优势。

本实验室前期研究中，基于G蛋白偶联受体介导的信号通路和荧光素酶报告基因检测技术，通过重组质粒构建、脂质体转染及加压筛选等手段，获得了能稳定共表达萤火虫荧光素酶与GLP-1R，并能特异性响应GLP-1R介导的cAMP响应元件(CRE)的工具细胞株——CHO-GLP-1R-CRE-Luc⁺。

利用荧光素酶报告基因法所构建的细胞筛选模型，建立GLP-1R激动剂的受体亲和力测定方法，从而对其进行评价与筛选，可作为此类药物早期研发与筛选过程中的一种有效措施。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种GLP-1受体激动剂的受体亲和力测定方法。本发明基于荧光素酶报告基因法，通过因素考察与优化，建立了一种测定GLP-1R激动剂的受体亲和力的方法，可用于GLP-1R激动剂的快速评价与筛选。

本发明是通过以下技术方案实现的：

利用CHO-GLP-1R-CRE-Luc⁺细胞，测定GLP-1R激动剂的受体亲和力的实验步骤如下：

(1)细胞的复苏及传代：

从液氮罐中取出冻存的CHO-GLP-1R-CRE-Luc⁺细胞，将细胞快速融化复苏后，转入含5mL细胞生长培养基的培养瓶中，于37℃、5％CO₂培养箱中培养。待细胞贴壁生长后，用0.25％胰蛋白酶消化传代，每3天按1∶3比例传代1次。

(2)细胞接种与培养：

取处于对数生长期的细胞用0.25％胰酶消化，1000r/min离心5min，弃上清，将细胞重悬于含0.25％FBS(胎牛血清)的DMEM/F12基础培养基中，记数。将细胞悬液稀释至一定浓度后，以100μL/孔接种于96孔板。于37℃、5％CO₂培养箱培养4h。

(3)待测样品溶液的配制与稀释：

配制待测样品溶液，通过BCA法测定其浓度，以含有0.25％FBS的DMEM/F12培养基对对待测样品按倍比依次稀释，得到10-11个不同浓度梯度。

(4)待测样品作用于细胞：

将上述不同浓度梯度的待测样品，按每孔20μL加至细胞培养板中，每个待测样品的浓度设置3个平行复孔，于37℃、5％CO₂培养箱培养。

(5)荧光素酶与化学发光底物作用：

将化学发光底物与含有细胞裂解液的底物缓冲液(均购自Promega公司)混匀。以每孔100μL加至上述孵育后的细胞板中。室温下，在振荡器上震荡一定时间后转移至96孔酶标板中。

(6)荧光强度测定：

使用化学发光分析仪(Luminoskan Ascent，Thermo Scientific)，以1s/孔的速度读取各孔的荧光强度，以相对光单位(RLU)表示。

(7)数据处理：以所测样品的摩尔浓度的对数值(Log[M])为横坐标，所测各样品孔的荧光强度(RL值)为纵坐标绘制量效曲线。并通过软件GraphPad Prism 5.0非线性拟合中的Dose-response-Stimulation模式对量效曲线进行参数拟合，计算样品的半数有效浓度(EC₅₀)。

其中，步骤(1)中的细胞生长培养基是在DMEM/F12基础培养基中，添加10％FBS、0.6mg/mL潮霉素B和1mg/mL G418配制而成的。

其中，步骤(2)中的DMEM/F12基础培养基的配制方法如下：DMEM/F12培养基干粉一袋(Gibco)，碳酸氢钠1.201g、链霉素钠0.1g、氨苄西林0.06g，溶解于超纯水中并定容至1L，于超净工作台内过滤除菌。

其中，步骤(2)中接种于96孔板中的细胞密度的范围为：2×10⁴-4×10⁴个/mL，优选为3×10⁴个/mL。

其中，步骤(3)中待测样品的浓度范围为：1×10^-4-2.4×10⁴nM。

其中，步骤(4)中加入的待测样品与细胞的作用时间范围为2-6h，优选为4h。

其中，步骤(5)中细胞经裂解后，其与化学发光底物的作用时间范围为：10min-1h，优选为15min。

其中，步骤(7)中由原始数据绘制而成的量效曲线采用四参数法拟合并计算EC₅₀值。

本方法的精密度和准确度较高，同时专属性强，耐用性良好，可用于测定GLP-1R激动剂的受体亲和力，以实现对该类药物的快速评价与筛选。

附图说明：

图1为几种不同的GLP-1受体激动剂的受体亲和力测定的拟合曲线。

图2为以mPEG_20k-Ex4C为测试样品，本方法的方法学验证中专属性考察试验所得的拟合曲线。其中，a：不添加CHO-GLP-1R-CRE-Luc+细胞试验；b：阴性对照细胞株试验；c：空白溶剂试验；d：PEG干扰试验。

图3为以mPEG_20k-Ex4C为测试样品，本方法的方法学的方法学验证中线性与范围考察试验所得的拟合曲线。

图4为以mPEG_20k-Ex4C为测试样品，本方法的方法学验证中准确度考察试验所得的拟合曲线。

图5为以mPEG_20k-Ex4C为测试样品，本方法的方法学验证中耐用性考察试验所得的拟合曲线。其中，a：细胞密度考察试验；b：药物与细胞作用时间考察试验；c：细胞裂解液与发光底物不同作用时间考察试验；d：细胞代数考察试验。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但不意味着以任何方式限制本发明的范围。

实施例

用本法测定5种不同种类的GLP-1R激动剂的受体亲和力

5种GLP-1R激动剂为：Exendin-4和4种不同分子量的聚乙二醇定点修饰Exendin-4类似物的产物。通过在Exendin-4的C端加入一个半胱氨酸等到Exendin-4类似物(简称Ex4C)，分别使用分子量为5kDa、10kDa、20kDa和40kDa的单甲氧基聚乙二醇-马来酰亚胺(mPEG-MAL)与Ex4C反应后经纯化得到4种修饰产物，分别为mPEG_5k-Ex4C、mPEG_10k-Ex4C、mPEG_20k-Ex4C和mPEG_40k-Ex4C。以上5种GLP-1R激动剂的受体亲和力的测定步骤如下：

(1)从液氮罐中取出冻存的CHO-GLP-1R-CRE-Luc⁺细胞，将细胞快速融化复苏后，转入含5mL细胞生长培养基的培养瓶中，于37℃、5％CO₂培养箱中培养。待细胞贴壁生长至80％左右时，用0.25％胰蛋白酶消化传代，每3天按1∶3比例传代1次。

(2)取处于对数生长期的细胞，用0.25％胰酶消化，1000r/min离心5min，弃上清，将细胞重悬于含0.25％FBS的DMEM/F12基础培养基中，记数。将细胞悬液的密度稀释至3×10⁴个/mL，以100μL/孔接种于96孔板。于37℃、5％CO₂培养箱培养约4h。

(3)分别配制5种样品的溶液并通过BCA法测定浓度，以含有0.25％FBS的DMEM/F12培养基对样品进行稀释。将Exendin-4的起始浓度调整为250nM；mPEG_5k-Ex4C、mPEG_10k-Ex4C和mPEG_20k-Ex4C的起始浓度调整为1500nM，以上4种样品均按4倍倍比稀释至10个浓度梯度；mPEG_40k-Ex4C的起始浓度调整为24000nM，按4倍倍比稀释至11个浓度梯度。

(4)按上述配置好的不同浓度梯度的样品，按每孔20μL向中加至上述细胞板，每个浓度梯度设置3个复孔，于37℃、5％CO₂培养箱继续孵育4h。

(5)将化学发光底物与含有细胞裂解液的底物缓冲液(均购自Promega公司)混匀。以每孔100μL加至上述孵育后的细胞板中。室温下，在振荡器上震荡15min后转移至96孔酶标板中。

(6)使用化学发光分析仪(Luminoskan Ascent，Thermo Scientific)，以1s/孔的速度读取各孔的荧光强度，以相对光单位(RLU)表示。

(7)数据处理：以所测样品的摩尔浓度的对数值(Log[M])为横坐标，以所测各样品孔的荧光强度(RLU值)为纵坐标绘制量效曲线。并通过软件GraphPad Prism 5.0的Dose-response-Stimulation模式对量效曲线进行四参数拟合，计算各样品的半数有效浓度(EC₅₀)。

结果如图1所示，本法测得的Exendin-4的EC₅₀约为0.539nM，mPEG_5k-Ex4C、mPEG_10k-Ex4C、mPEG_20k-Ex4C的EC₅₀的平均值分别为0.896nM，3.392nM和3.766nM，相比Exendin-4分别增加了1.64、6.23、6.91倍。而mPEG_40k-Ex4C的量效曲线相较于Exendin-4明显右移，EC₅₀为64.205nM，是Exendin-4的118.03倍。说明PEG修饰会影响到Exendin-4与GLP-1R结合，使其受体亲和力下降。

验证例

以mPEG_20k-Ex4C为例，对本方法进行方法学验证。

除下述各项中的特殊说明外，实验材料、方法与实施例中的操作基本相同。

(1)专属性：

分别考察了以下四种情况对荧光素酶表达活性的影响及测定结果的影响。(a)不添加CHO-GLP-1R-CRE-Luc⁺细胞试验：考察无细胞体系对测定结果的影响。(b)阴性对照细胞株试验：以仅转染荧光素酶报告基因而未转染GLP-1R基因的CHO-CRE-Luc⁺照细胞株作为阴性对照，考察mPEG_20k-Ex4C对其作用。(c)空白溶剂试验：以不含mPEG_20k-Ex4C的PBS缓冲液作为空白对照。(d)PEG干扰试验：以相同浓度梯度的20kDa的mPEG-MAL溶液作为对照，分别考察PBS和PEG对测定结果的影响。

结果如图2所示，当不添加CHO-GLP-1R-CRE-Luc⁺细胞时，所测荧光的RLU值近乎为0，说明荧光产生的前提是细胞中荧光素酶的表达。当mPEG_20k-Ex4C与阴性对照细胞作用时，其RLU维持在较低水平，且无剂量依赖性，表明内源性干扰值较小，荧光素酶表达的增加依赖于样品与GLP-1R的作用。而当只加入空白溶剂或PEG溶液时，所测得的RUL值与mPEG_20k-Ex4C的量效曲线的低平台区相当，且无剂量依赖性，对mPEG_20k-Ex4C的量效曲线无影响。上结果证明了mPEG_20k-Ex4C是通过其多肽部分与工具细胞株表面高表达的GLP-1R结合后，激活其介导的信号通路后，促进了荧光素酶的表达，也表明该方法的专属性良好。

(2)线性与范围：

配制浓度为1500nM的mPEG_20k-Ex4C溶液，以含0.25％FBS的DMEM/F12培养基按4倍倍比对其稀释至10个浓度梯度。

结果如图3所示，所拟合的mPEG_20k-Ex4C量效曲线呈典型的“S”型。用GraphPad Prism 5.0非线性四参数拟合而得的曲线为：Y＝(A₁-A₂)/(1+(X/C)^B)+A₂。其中：A₁：曲线上渐近线估值即最大RLU值(10.740)；B：曲线的斜率(0.700)；C：最大有效量一半时所对应的浓度(3.853nM)；A₂：曲线下渐近线估值即最小RLU值(5.503)。

(3)精密度：

(a)重现性

根据本发明内容中具体步骤及线性与范围的要求，配置6份相同的mPEG_20k-Ex4C溶液，测定并计算每份样品的EC₅₀和RSD值。

表1本方法的重复性验证试验结果

结果如表所示，计算所得6份样品的EC₅₀的平均值为4.264nM，RSD为8.538％，RSD≤20％，符合一般生物制品活性检测精密度要求，表明该方法重复性良好。

(b)中间精密度

由3名人员分别在第1、2、3天测定，每人每次测定3份相同的mPEG_20k-Ex4C样品，计算每份样品的EC₅₀和RSD值。

表2本方法的中间精密度验证试验结果

结果如表2所示，9份样品所测得的EC₅₀值较为接近，平均值为4.333nM，RSD为10.521％，表明该方法的中间精密度良好。

(4)准确度

在本方法下，比较mPEG_20k-Ex4C对照品和供试品的量效曲线并计算EC₅₀。

结果如图4所示，mPEG_20k-Ex4C供试品与对照品的量效曲线具有平行性，两者的EC₅₀分别为4.252±1.038nM和4.462±0.956nM，无显著性差异。

(5)耐用性

分别考察了不同细胞密度(2×10⁵个/mL、3×10⁵个/mL和4×10⁵个/mL)；药物不同作用时间(2h、4h和6h)；细胞裂解液与发光底物不同作用时间(10min、30min和1h)；不同细胞代数(4、7、10代)对测定结果的影响。

结果如图5所示，随着接种细胞密度的增加，荧光素酶的表达量(RLU值)逐渐增高，但三种密度下所得的量效曲线具有平行性，计算所得EC₅₀分别为4.093、3.605和3.506nM，RSD值为8.414％。当mPEG_20k-Ex4C与细胞分别作用3.75h、4.00h和4.25h后，所得三条量效曲线间平行性良好，EC₅₀分别为3.752、3.667和4.194nM，RSD为7.309％。当细胞裂解液与发光底物的作用时间在10min-1h以内，量效曲线同样具有平行性，EC₅₀分别为4.239、4.182和3.782nM，RSD为6.122％。用第4代、第7代和第10代细胞所得mPEG_20k-Ex4C的量效曲线平行性良好，EC₅₀分别为4.949、4.257和3.855nM，RSD为12.710％。由此可见，本方法的耐用性良好，测定结果保持稳定。

综上所述，本方法的精密度和准确度较高，符合《生物制品质量控制分析方法验证技术一般原则》的要求；同时专属性强，耐用性良好，可用于GLP-1R激动剂药物亲和力的测定，实现该类药物的快速评价与筛选。

Claims (8)

1.一种GLP-1受体激动剂的受体亲和力测定方法。其特征在于该方法是利用工具细胞株CHO-GLP-1R-CRE-Luc⁺，通过荧光素酶报告基因法测定GLP-1受体激动剂的受体亲和力。

2.根据权利要求1所述的一种GLP-1受体激动剂的受体亲和力测定方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)细胞的复苏及传代：

从液氮罐中取出冻存的CHO-GLP-1R-CRE-Luc⁺细胞，将细胞快速融化复苏后，转入含5mL细胞生长培养基的培养瓶中，于37℃、5％CO₂培养箱中培养。待细胞贴壁生长后，用0.25％胰蛋白酶消化传代，每3天按1∶3比例传代1次。

(2)细胞接种与培养：

取处于对数生长期的CHO-GLP-1R-CRE-Luc⁺细胞，用0.25％胰酶消化，1000r/min离心5min，弃上清，将细胞重悬于含0.25％FBS的DMEM/F12基础培养基中，记数。将细胞悬液中的细胞密度稀释至2×10⁵-4×10⁵个/mL，以100μL/孔接种于96孔板，即每孔的细胞数为2×10⁴-4×10⁴个，于37℃、5％CO₂培养箱培养4h。

(3)待测样品溶液的配制与稀释：

配制待测样品溶液，通过BCA法测定其浓度，以含有0.25％FBS的DMEM/F12培养基对待测样品按倍比依次稀释，得10-11个不同浓度梯度。待测样品的浓度范围为：1×10^-4-2.4×10⁴nM。

(4)待测样品作用于细胞：

将配置好的不同浓度梯度的待测样品，按每孔20μL加至细胞培养板中，每个待测样品的浓度设置3个平行复孔，于37℃、5％CO₂培养箱培养2-6h。

(5)荧光素酶与化学发光底物作用：

将化学发光底物与含有细胞裂解液的底物缓冲液(均购自Promega公司)混匀。以每孔100μL加至上述孵育后的细胞板中。室温下，在振荡器上震荡10min-1h后转移至96孔酶标板中。

(6)荧光强度测定：

使用化学发光分析仪(Luminoskan Ascent，Thermo Scientific)，以1s/孔的速度读取各孔的荧光强度，以相对光单位(RLU)表示。

(7)数据处理：

以所测样品的摩尔浓度的对数值(Log[M])为横坐标，所测各样品孔的荧光强度(RLU值)为纵坐标绘制量效曲线。并通过软件GraphPad Prism 5.0非线性拟合中的Dose-response-Stimulation模式对量效曲线进行四参数拟合，计算样品的半数有效浓度(EC₅₀)。

3.如权利要求2中所述的一种GLP-1受体激动剂的受体亲和力测定方法，其特征在于所述的GLP-1受体激动剂为GLP-1，Exendin-4，或由它们的结构改造而成的类似物或非其它非肽类GLP-1受体激动剂。

4.如权利要求2中所述的一种GLP-1受体激动剂的受体亲和力测定方法，其特征在于步骤(2)中接种于96孔板中的细胞密度的范围为：2×10⁵-4×10⁵个/mL，即每孔接种的细胞的数目范围是：2×10⁴-4×10⁴个。

5.如权利要求2中所述的一种GLP-1受体激动剂的受体亲和力测定方法，其特征在于步骤(3)中待测样品的浓度范围为：1×10^-4-2.4×10⁴nM，所用浓度梯度为10-11个。

6.如权利要求2中所述的一种GLP-1受体激动剂的受体亲和力测定方法，其特征在于步骤(4)中加入的待测样品与细胞的作用时间范围为2-6h。

7.如权利要求2中所述的一种GLP-1受体激动剂的受体亲和力测定方法，其特征在于步骤(5)中细胞经裂解后，其与化学发光底物的作用时间范围为：10min-1h。

8.如权利要求2中所述的一种GLP-1受体激动剂的受体亲和力测定方法，其特征在于步骤(7)中由原始数据绘制而成的量效曲线采用四参数法拟合并计算EC₅₀值。