CN107462559A - Glp‑1样化合物的生物学活性的体外检定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及了一种GLP‑1样化合物体外生物学活性检定的方法。该方法是在U2OS/GLP‑1R细胞种上加入梯度稀释的GLP‑1样化合物、然后检测并分析。本申请用高内涵对结果进行图像采集、数据输出,确保结果快速分析;用Soft Max(v4.8)软件对高内涵输出数据进行四参数曲线拟合,实验结果有较高准确度。本发明方法能够高效率、高特异、低成本、高稳定性的对GLP‑1样化合物进行活性检定,实现了药品的高内涵检测。
Description
技术领域
本申请涉及GLP-1样化合物的生物学活性的体外检定方法。
背景技术
GLP-1是胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like peptide-1)。其由160个氨基酸的胰高血糖素原前体,经不同组织的特异性翻译和修饰,形成不同的终产物。例如,肠粘膜L细胞能形成37个氨基酸的GLP-1(1~37),水解除去N端6个氨基酸就成为GLP-1(7~37),或酰胺化为GLP-1(7~37)-NH2,后两者是目前已知的在机体内具有药理作用的主要GLP-1结构。
GLP-1通过与细胞膜上的受体GLP-1R结合而发挥功能,例如,促进胰岛素分泌、抑制胰高血糖素分泌等,因此,GLP-1R是治疗II型糖尿病的一个关键靶受体。GLP-1R属于B族GPCR(G蛋白偶联受体),其包括1个胞外N端结构域(N-terminal domain,NT)、3个胞外环状结构域(EC1~3)、3个胞内环状结构域(IC1~3)、7个跨膜结构域(TM1~7)、以及1个胞内C端结构域(CT)。人的GLP-1R有463个氨基酸。
GLP-1的体内半衰期很短,只有约5min,它易被二肽基肽酶IV(Dipeptidyl-peptidase IV,DPP-IV)降解成无活性的GLP-1(9~36)酰胺或者GLP-1(9~37)。为了延长作用时间,已有人研发了多种GLP-1类似物(本文称GLP-1样化合物),这些化合物通过影响GLP-1R信号通路,象GLP-1一样发挥促胰岛素分泌和/或抑制胰高血糖素分泌等作用,由此可以达到治疗II型糖尿病的目的。
CN103966171A披露了一种骨肉瘤U2OS细胞株,该细胞株在细胞膜上表达GLP-1R与荧光蛋白的融合体,该申请证实,这种U2OS/GLP-1R细胞株能用荧光强度指示促胰岛素分泌肽Exendin-4的浓度。
发明内容
本申请的一个目的是建立一种检测GLP-1样化合物体外生物学活性的方法。所述方法能够以低成本、高特异性、高效地大规模检测GLP-1样化合物的体外活性。
根据本申请,GLP-1样化合物与U2OS/GLP-1R细胞表面的受体GLP-1R结合,可导致与受体偶联的荧光蛋白由原本相对均匀地散布于细胞上而变得聚集、甚至形成斑点,表现为平均的单细胞荧光强度增强。GLP-1样化合物的浓度不同,荧光强度的增强也不同。通过捕捉这种荧光强度的变化,可以表征GLP-1样化合物的活性大小。
在本文中,GLP-1样化合物是指能与GLP-1R受体结合的化合物。所述化合物例如,GLP-1,首个从动物体液提取出的GLP-1类似物exendin-4及其合成形式艾塞那肽(Exenatide),另外例如利拉鲁肽(Liraglutide),利司那肽(Lixisenatide),阿必鲁肽(Albiglutide),度拉糖肽(Dulaglutide),索玛鲁肽(Semeglutide),以及各种在研的GLP-1模拟物,等等。
在本文中,骨肉瘤U2OS细胞或骨肉瘤U-2OS细胞可互换使用,并可以从ATCC等细胞保藏中心购买得到。
在本文中,U2OS/GLP-1R-荧光细胞、或U2OS/GLP-1R细胞、或U-2OS/GLP-1R细胞、、或U-2OS/GLP-1R-荧光细胞可互换使用,都是指在细胞表面表达GLP-1R-荧光标记偶联体的骨肉瘤U2OS细胞,其中所述荧光标记偶联在GLP-1R的C端。已知GLP-1与GLP-1R的跨膜区结合,而像Exendin-4之类的GLP-1样化合物与GLP-1R的胞外N端结合。本申请的偶联蛋白是在GLP-1R的胞内C端偶联荧光标记,实验表明,这种偶联形式不干扰GLP-1R与GLP-1样化合物的结合。至于荧光标记,可以选用本领域常用的荧光蛋白,例如绿色荧光蛋白(GFP),黄色荧光蛋白(YFP),红色荧光蛋白(RFP),荧光素酶,等。
本申请的U2OS/GLP-1R细胞可以通过构建GLP-1R-荧光标记偶联体的表达载体,并用其转染U2OS细胞而获得(参见,例如CN103966171A)。转染可通过常规方法完成,例如脂转染胺法,如Lipofectamine 2000。成功转染的细胞通过表达载体携带的抗性进行筛选。更简便地,本申请的U2OS/GLP-1R细胞也可以通过直接购买他人已经构建好的稳定细胞株而获得。
获得的U2OS/GLP-1R细胞可直接用于GLP-1样化合物的活性测定,也可选传代后再将细胞用于GLP-1样化合物的活性测定。当细胞量不足以满足测定需求,不匹配实际测定样品数量时,就需要传代培养,以增加细胞数量。多余的细胞冻存保存,需要用时再复苏,复苏的方法可以是常规的。
在本文中,U2OS/GLP-1R第一代细胞(p1)是指经过遗传构建后被筛选出来、未经扩增的U2OS/GLP-1R细胞。第2代(p2)是将p1代细胞制成细胞悬液后加培养液分散并再培养至超过50%汇集的U2OS/GLP-1R细胞,以此类推,每当细胞加培养液分散并再培养至超过50%汇集一次,细胞的传代数就增加一次。所谓“汇集”,是指贴壁生长的细胞在培养容器的底部长满的程度。例如,50%汇集,可以是指多孔板每个孔的50%底部面积长满细胞,但不是指整个多孔板50%的孔都长满细胞。汇集的程度可以在倒置显微镜下观察。在一个具体实施方案中,用于活性测定的U2OS/GLP-1R细胞是传代至第25代(p25)的细胞。在另一个具体实施方案中,用于活性测定的U2OS/GLP-1R细胞例如是传代至第35代(p35)的细胞。在又一个具体实施方案中,U2OS/GLP-1R细胞传代至第47代(p47)仍能在本申请的检测方法中表现出良好的检定活性。
细胞代数越大,越容易出现荧光自聚集现象,从而干扰活性检测。判断细胞能不能用于本申请的活性检测,并不是简单地看细胞代数,而是要看细胞群体中的荧光细胞含量,以及有无荧光自聚集现象。如果细胞超出50代以上,仍然有足够多的荧光细胞含量,并且仍然不出现荧光自聚集现象,也可以用于本申请的活性检测。相比于Promega公司的cAMP活性测定采用RIN-m-5F细胞进行测定,本申请是采用U2OS细胞进行GLP-1样化合物的活性测定。本申请人发现,对于同一批GLP-1样化合物,RIN-m-5F细胞用到第33代数据尚能稳定,到第35代时,开始出现数据不均匀,且最小浓度与最大浓度的效力差值缩小;而本申请的方法中,U2OS细胞分别测试了第25代、第33代、第47代,数据一直保持稳定(图4)。
为了进行GLP-1样化合物的活性测定,需要将U2OS/GLP-1R细胞接种于多孔板中。用于该接种的细胞最好是,荧光细胞含量50%以上、且无荧光自聚集。
对于多孔板各孔的细胞接种量,过少则可能不足以用于活性分析,过多则可能细胞间相互干扰,对实际结果有不利影响。在放大20倍的条件下,优选每个视野有30~50个细胞,这对于例如96孔板而言,是约6000~10000个细胞/孔的接种量。故,在具体实施方案中,本申请所用的96孔板按约8000个细胞/孔接种。合适的细胞接种量/孔可生成较好的四参数曲线拟合效果,整条曲线中的上平台期、上升期、下平台期分别都很明显。但是,本申请的方法不要求上述细胞个数十分准确,这不同于现有方法例如Promega试剂盒方法的严苛。相应地,进行本申请方法的细胞计数时,不强求精密仪器设备,简单的人工计数可以满足要求。这样一来,本申请方法的成本可明显降低。
用于本申请方法的多孔板可以是商购的,例如,8、12、24、48、96、384、1536孔板等等,根据具体测样需求而定。多孔板优选具有透明洁净的底部,以便于荧光扫描。在本文中,“细胞板”是指生长有细胞的多孔板。例如,U2OS细胞板是指生长有U2OS细胞的多孔板。
U2OS/GLP-1R细胞接种多孔板后,一般培养至大多数孔超过50%汇集后,就可用于化合物的GLP-1样活性检测。根据样品检测量的需求,可选将细胞培养至超过三分之二汇集、超过四分之三汇集、完全汇集,等等。汇集的程度,由细胞培养人员经显微镜检后判定,也无需用特定仪器精密测量。
用于检测的GLP-1样化合物可以是原料药粉末、原液、注射液等不同状态,在测活性之前,一般都用稀释液稀释,以便具有不同原始含量水平的化合物在检测时处于相同的含量水平。
在本文中,用于GLP-1样化合物的稀释液是磷酸盐缓冲液(PBS),其中包含3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)和牛血清白蛋白(BSA)。
PBS可以自配,也可以购买商品,例如DPBS(Dulbecco's PBS)。
IBMX已知具有磷酸二酯酶抑制剂活性,可减少细胞内第二信使(cAMP或cGMP)的水解,从而提升相应信使的浓度水平,因此在基于cAMP活性来检测GLP-1样化合物活性的试剂盒中是常见的组分。虽然本申请的方法不依赖cAMP的活性进行检测(参见,例如实施例4和图6),但申请人意外发现,IBMX的存在,大大提高了本申请方法的检测灵敏度(实施例1)。因此,本申请涉及IBMX用于U2OS/GLP-1R细胞检测GLP-1样化合物活性的用途。在本申请的方法中,IBMX可以是例如0.2~5.0mmol/L,或者0.3~3.0mmol/L,优选0.5~1.5mmol/L。在具体实施方案中,IBMX为1mmol/L。
BSA已知可发挥营养作用,故其含量可由本领域技术人员依据细胞培养的经验而定,例如0.02~10%重量的BSA,在本申请的一个实施方案中采用0.1%BSA,但不限于此。
优选地,本申请的稀释液是只含有IBMX和BSA的PBS。换而言之,本申请涉及IBMX和BSA一起用于U2OS/GLP-1R细胞检测GLP-1样化合物活性的用途。
优选地,所述稀释液不过夜放置,即,当天现配,更优选配好后1小时内使用,更优选配好后30分钟内使用。
GLP-1样化合物经过上述稀释液预稀释,达到一个起始反应浓度,就可以进一步进行梯度稀释。该起始反应浓度是待测化合物开始与细胞接触的最大浓度。在比该起始反应浓度更高的浓度,化合物只是进行稀释,不接触U2OS/GLP-1细胞。自该起始反应浓度起,以后的每个稀释梯度都与细胞接触,即,每个稀释梯度都有试样被加入细胞孔。根据本申请的方法,该起始反应浓度在50~1000ng/ml范围内,优选100~900ng/ml,更优选200~600ng/ml。化合物的活性越高,起始反应浓度可以越低。
稀释梯度的个数可能影响最终数据分析。一般地,稀释梯度的个数可以为7个以上,例如7~10个左右,优选8个,即,从起始反应浓度开始,经过稀释,一共有8个梯度进行反应。梯度从前向后,浓度水平由高变低,化合物越来越被稀释。更具体举例地,每个稀释梯度与其前一个稀释梯度的浓度比可以是1:2、1:4、1:5、或1:10等等。1:2是将前一梯度的溶液取1个体积与1个该体积的稀释液混合而成,1:4是将前一梯度的溶液取1个体积与3个该体积的稀释液混合而成,依此类推。每一组的7个以上稀释梯度,并不限于执行统一的稀释比例,可以例如是前面1个或几个梯度执行1:2稀释、中间1个或几个梯度执行1:4稀释、后面1个或几个梯度执行1:10稀释,又或者前面1个或几个梯度执行1:2稀释、中间1个或几个梯度执行1:5稀释、后面1个或几个梯度执行1:4稀释、最后1个或几个梯度执行1:2稀释,等等。具体的梯度变化取决于获得最佳曲线拟合效果的要求。
在一个具体实施方案中,将GLP-1样化合物加载至细胞板上的步骤,是将细胞板清空,各孔同步加入待测GLP-1样化合物的稀释液。所谓同步,是尽量快速地加样,使得加样总耗时小于5分钟。优选地,所述同步是在1~4分钟之内完成一个96孔板上所有孔的加样,优选2~3分钟。在一个具体实施方案中,所述同步是在2分钟内完成加样。
完成加样后,就开始计算反应时间。经利拉鲁肽测试,虽然从反应5分钟时,利拉鲁肽就已出现荧光聚集,但到反应20分钟时,四参数拟合曲线完全达到平台期,而且不再因反应时间的改变而变。Exendin-4的表现略有不同,其在5~60分钟内,平均荧光强度与时间成线性关系,但细胞内荧光颗粒最多的时点也是在20分钟左右。故,在本申请的方法中,反应时间可以是4~25分钟,优选5~22分钟,更优选15~20分钟,最优选约20分钟。反应的终止可以按常规方法进行,例如添加固定剂,将反应固定在终止当时的状态。
为了便于观察,可以在终止反应后再对细胞核进行染色,使细胞核染出与GLP-1R受体偶联的荧光不相同的颜色。细胞核染色方法可以是本领域常规的。
已终止反应的细胞板,或者进一步完成了细胞核染色的细胞板,如果不立即检测,可以在避光环境下保存,例如常温保存。在一个实施方案中,是通过锡箔包裹保存。在另一个实施方案中,可放入暗箱或暗室保存。保存期如果较长,可将细胞板封闭,例如缠上封口膜,以避免细胞孔水分蒸发,细胞形态改变。在本申请的方法中,反应终止后的细胞板保存期可长达100小时。
虽然用普通的倒置荧光显微镜可以观察到荧光的改变,但高内涵系统(HighContent System,HCS)可以获得清晰的细胞形态学变化图像,对图像进行快速分析,并输出荧光强度数据(如Spotavgarea)。而且,高内涵检测可以快速检测大批量样品,或者同时摸索多个浓度梯度。故,本申请的方法优选用高内涵设备获取荧光强度的数据,例如与96孔板相配的高内涵检测设备。HCS设备例如有,Molecular Devices公司的Transfluor和ImageXpress系列,Thermo Fisher Scientific公司的ArrayScan XTI系列,等等。
HCS设备获得的荧光强度结果,可以通过四参数拟合曲线进行分析。以样品浓度梯度为横坐标(x),以平均荧光强度为纵坐标(y),就可得出EC50(半数有效浓度)。EC50是化合物、药品、生物制品的体外活性检定常用的指标。药物的研发、申请注册和上市过程中都必须要进行体外活性的检定,例如,参照标准品的EC50,检测各批次样品的EC50波动,按照标准品EC50/批次样品EC50,将波动控制在一定的范围内(如±30%、±20%和±10%等),可以保证流通到市场的药品的质量不会参差不齐。这类体外活性检定方法要求简易性、较强可操作性、低成本、以及数据稳定性和可靠性。
所谓四参数拟合,是指用含有四个参数的方程表示y随x变化的规律,该方程为:y=(A-D)/[1+(x/C)^B]+D,其中:
x:横坐标,在本文中表示化合物浓度
y:纵坐标,在本文中表示荧光强度
A:稀释起点端渐近线估值
B:曲线斜率
C:EC50值
D:稀释终点端渐近线估值
较好的四参数曲线拟合可以得出较为准确的EC50值。一般地,曲线拟合的效果可用相关系数R2评价,R2值越接近1,曲线拟合效果越好。在本申请中,R2值优选不小于0.95,更优选不小于0.98,最优选不小于0.99。
已有多种软件可以通过一组(x,y)值来计算A~D,并生成四参数拟合曲线,例如Soft Max 4.8,或Graph Pad Prism 5,等。故,浓度值(x)的选取对四参数拟合曲线有影响。对于一种具体的化合物,不同来源的制品有可能活性水平不同,需要摸索出提供最佳拟合曲线的相应浓度梯度。本申请的GLP-1样化合物可在,例如,50~1000ng/ml范围内选取起始反应浓度,经梯度稀释、检测和四参数曲线拟合,依据R2值确定最佳的起始反应浓度和梯度个数及水平,使得从该起始反应浓度进行梯度稀释时,在拟合曲线上优选有下平台2~3个梯度、上升期2~3个梯度、以及上平台2~3个梯度。
本申请方法是检测GLP-1样化合物与GLP-1R受体的结合导致受体聚集,与受体偶联的荧光亦发生聚集。单位面积的荧光强度越强,表明受体结合越多,意味着GLP-1样化合物的活性越强,即荧光强度与GLP-1样化合物的活性正相关。
与本申请方法不同,Promega试剂盒方法是检测GLP-1样化合物刺激细胞消耗ATP后剩余的ATP量。具体地,GLP-1样化合物与GLP-1R结合,使胞内cAMP水平升高,从而激活蛋白激酶A,导致其底物磷酸化。在此磷酸化过程中,ATP将磷酸基团转给底物,自身变成ADP。剩余的ATP可使荧光素酶催化荧光素氧化并发光。故,光强度越强,说明剩余的ATP越多,则前面的激活反应水平越低,意味着GLP-1样化合物的活性越低,即光强度与GLP-1样化合物的活性负相关。
本申请的方法有超强稳定性。例如,本申请方法中使用的U2OS/GLP-1R细胞直至第50代细胞都可以保持检测能力,而Promega试剂盒方法使用的RIN-5mF细胞到第35代就已经不能胜任药物活性检测了。又例如,本申请方法中的反应固定后可以延迟100小时再进行荧光检测,而像Promega试剂盒方法需在反应后1小时内完成荧光检测。
本申请的方法是基于化合物与GLP-1R受体的特异性识别,并不受cAMP信号通路变化的影响。对于不识别GLP-1R且不刺激cAMP生成的药物(例如,生长激素),以及不识别GLP-1R但能刺激cAMP生成的药物(例如,胰岛素),本申请的方法都检测不到荧光强度的改变(实施例4,表2)。即使将这些药物与已知的GLP-1样化合物混合,本申请的方法得到的检测数据也与单独的该GLP-1样化合物的检测数据一致(实施例4,图5),说明即使在混合物的状态中,本申请的方法也特异性地反映GLP-1样化合物的活性。因此,与Promega试剂盒方法只检测纯品不同,本申请的方法对样品纯度没有过高的要求,能检测混合物(例如,GLP-1样化合物、生长激素、胰岛素等的混合制剂)中的GLP-1样化合物活性,这为开发诸如中药材等复杂成分物质中的GLP-1样活性成分提供了极大便利。
更具体举例地,本申请涉及以下多个方面。
在一个方面,本申请涉及体外检定GLP-1样化合物的生物学活性的方法,其包括将待测化合物加载至U2OS/GLP1R细胞板、并检测细胞板的荧光强度,其中,所述细胞在其表面表达GLP-1R与荧光蛋白的偶联蛋白,所述荧光蛋白偶联在GLP-1R的C末端;所述细胞板的孔中的U2OS/GLP1R细胞已生长至50%以上汇集;所述待测化合物已用添加了IBMX和BSA的PBS溶液作为稀释液进行梯度稀释。
在另一方面,本申请涉及体外检定GLP-1样化合物的生物学活性的方法,其包括将经过梯度稀释的待测化合物加载至U2OS/GLP1R细胞板、并检测细胞板的荧光强度数据和用四参数拟合曲线分析所述数据,其中,所述细胞在其表面表达GLP-1R与荧光蛋白的偶联蛋白,所述荧光蛋白偶联在GLP-1R的C末端;所述细胞板的孔中的U2OS/GLP1R细胞已生长至50%以上汇集;所述梯度稀释确保四参数曲线的R2≥0.95,优选R2≥0.98,更优选R2≥0.99。
在另一方面,本申请涉及体外检定GLP-1样化合物的生物学活性的方法,其包括将经过梯度稀释的待测化合物加载至U2OS/GLP1R细胞板、并检测细胞板的荧光强度数据和用四参数拟合曲线分析所述数据,其中,所述细胞在其表面表达GLP-1R与荧光蛋白的偶联蛋白,所述荧光蛋白偶联在GLP-1R的C末端;所述细胞板的孔中的U2OS/GLP1R细胞已生长至50%以上汇集;所述梯度稀释中的最大梯度,也即起始反应浓度,是落在50~1000ng/ml的范围内。
在另一方面,本申请涉及体外检定GLP-1样化合物的生物学活性的方法,其包括将待测化合物加载至U2OS/GLP1R细胞板、并检测细胞板的荧光强度数据和用四参数拟合曲线分析所述数据,其中,所述细胞在其表面表达GLP-1R与荧光蛋白的偶联蛋白,所述荧光蛋白偶联在GLP-1R的C末端;所述细胞板的孔中的U2OS/GLP1R细胞已生长至50%以上汇集;所述梯度稀释一共有7~9个梯度,在四参数拟合曲线上为下平台2~3个梯度、上升期2~3个梯度、以及上平台2~3个梯度。
在一个优选方面,本申请的荧光强度数据用高内涵设备获得。
在一个优选方面,本申请的细胞板是将含有50%以上荧光细胞、且无荧光自聚集的U2OS/GLP1R细胞接种在多孔板上而获得的。
在一个更优选方面,本申请的U2OS/GLP1R细胞在多孔板上的接种量是6000~10000个/孔。
在一个优选方面,本申请的U2OS/GLP1R细胞是传代不超过50代的细胞。
在一个优选方面,本申请的稀释液含有0.5~1.5mmol/L IBMX。在一个更优选方面,本申请的IBMX为1mmol/L。
在一个优选方面,本申请的稀释液含有0.02~2%重量的BSA。在一个更优选方面,所述BSA为0.1%重量。
在一个更优选方面,本申请的稀释液含有0.5~1.5mmol/L IBMX和0.02~2%重量的BSA。在一个更优选方面,本申请的稀释液含有1mmol/L IBMX和0.1%重量的BSA。
在一个优选方面,本申请的稀释液是现配现用。
在一个优选方面,本申请的方法中GLP-1样化合物有7~9个稀释梯度,其中,2~3个梯度处在拟合曲线的下平台、2~3个梯度处在拟合曲线的上升期、2~3个梯度处在拟合曲线的上平台。
在一个优选方面,梯度稀释的起始反应浓度是在100~900ng/ml的范围内。
在一个更优选方面,梯度稀释的起始反应浓度是在100~900ng/ml的范围内,一共有7~9个梯度,为在拟合曲线上有下平台2~3个梯度、上升期2~3个梯度、以及上平台2~3个梯度。
在一个更优选方面,本申请的起始反应浓度在200~600ng/ml范围内。
在一个更优选方面,本申请的稀释梯度为8个梯度。
在一个优选方面,将待测化合物添加至细胞板的步骤,是将细胞板清空,各孔同步加入经过梯度稀释的待测化合物来完成。
在一个更优选方面,本申请的同步是在不到5分钟之内完成多孔板所有孔的添加。
在一个优选方面,本申请的U2OS/GLP1R细胞与待测化合物的反应时间是5~20分钟。
在一个优选方面,本申请的U2OS/GLP1R细胞与待测化合物反应的状态被固定。
在一个优选方面,本申请的U2OS/GLP1R细胞与待测化合物的反应被固定后,在高内涵检测之前,将细胞板密封并避光保存。
在一个更优选方面,所述密封包括在多孔板的孔中添加诸如PBS等常规溶液封孔。
在一个更优选方面,本申请的密封保存的时间是0~100小时。
在一个优选方面,多孔板是底部透明的多孔板。
如实施例所示,本申请的方法在标准品±50%范围内线性回归优异,R2≥0.98;准确度高,在相当于标准品的50%、80%、100%、120%、150%五个水平的样品测定值与理论值之间差值小于8%;精密度较高,测定结果的相对标准偏差(RSD%)均≤10%;特异性好,经检测与调节胰岛素分泌相关的六种药物(胰高血糖素、利拉鲁肽、生长激素、艾塞那肽),证明本申请的方法仅对GLP-1样化合物有反应,且剂量依赖关系明显。本申请方法的检测结果可稳定保持近100小时(h),远高于稳定期仅1h的Promega试剂盒方法;U2OS/GLP-1R细胞株可连续使用47代以上,而Promega法仅可使用至33代。本申请的方法,以单块96孔板计,每次实验成本仅人民币200元左右,显著低于成本近1,000元人民币的Promega法。用本申请方法检测三个不同厂家12批次的不同GLP-1样化合物的原液及注射液,结果证明了该方法的可靠性。对U2OS/GLP-1R细胞株的cAMP检测(使用R&D试剂盒)表明,GLP-1R的C端标记GFP并没有妨碍下游信号传递。
下面通过附图和实施例对本发明作进一步详细的描述,但本发明保护范围不局限于所述内容,实施例中所使用的方法如无特殊说明,均为常规方法;实施例中所使用的材料、试剂如无特殊说明,均可通过商业途径获得。
附图说明
图1.两种稀释液对比:(A)PBS,(B)PBS含IBMX和BSA。R^2即相关系数R2(^表示指数)。
图2.本申请方法测定GLP-1样化合物的四参数曲线拟合图。x轴是GLP-1样化合物的浓度,由高内涵设备输出多孔板每个孔的荧光数据,经软件将各平行孔的数据取均值,由此得到y轴(以下各图同此)。(A)厂家1利拉鲁肽注射液;(B)厂家2贝那鲁肽原液;(C)厂家2贝那鲁肽注射液;(D)厂家3利拉鲁肽原液和注射液。ST为标准品,原液1为厂家3的第1批次原液,原液2为厂家3的第2批次原液。如图2A~2D所示,GLP-1样化合物经本申请方法拟合四参数曲线线性较好,相对于标准品的波动基本都在±20%。
图3.与GLP-1样化合物的反应终止后,细胞板放置不同时间再检测出的结果:(A)~(E)为本申请方法,其中(A)当天,(B)第二天,(C)第三天,(D)第四天,(E)第五天;(F)~(H)为Promega试剂盒方法,其中(F)1h,(G)3h,(H)48h。如图所示,本申请方法的数据稳定性要高于Promega试剂盒方法(100h比对1h)。
图4.用传代不同代次的细胞测定利拉鲁肽:(A)~(C)为Promega试剂盒方法,其中(A)p30,即第30代,(B)p33,(C)p35;(D)~(F)为本申请方法,其中(D)p25,(E)p35,(F)p47。如图所示,U2OS/GLP-1R细胞的使用寿命长于Promega试剂盒方法所用细胞(p47比对p33),可见本申请方法的稳定性较高。
图5.测定混合制剂中的利拉鲁肽:(A)本申请方法第一次,(B)本申请方法第二次,(C)Promega试剂盒方法一次。由图5可知,本申请的方法能从混合制剂中测出GLP-1样化合物,Promega试剂盒方法检测GLP-1样化合物易受杂质干扰。
图6.用R&D试剂盒测定RIN-m5F细胞和U2OS/GLP-1R细胞实际产生cAMP的量。(A)RIN-m5F,(B)U2OS/GLP-1R。6MIX,6种药物混合。如图6示,在使用RIN-m5F细胞的情形下,6种药物的混合制剂比利拉鲁肽纯品产生更多的cAMP;在使用U2OS/GLP-1R细胞的情形下,6种药物的混合制剂实际产生cAMP的量就是由利拉鲁肽所致,说明混合制剂中那些能刺激cAMP生成的药物未能引起骨肉瘤U2OS细胞的cAMP水平升高,可见本申请的方法是特异性针对GLP-1受体识别的。
实施例
材料:
U2OS/GLP-1R细胞按CN103966171A构建。
RIN-m5F细胞来自ATCC。
利拉鲁肽来自诺和诺德中国制药有限公司(厂家1,注射液3批),以及北京凯茵科技股份有限公司(厂家3,原液共2批,注射液1批)。
贝那鲁肽来自上海仁会生物制药股份有限公司(厂家2,原液及注射液各3批)。
实施例1缓冲液优化
配置两种稀释液:
缓冲液1,即PBS,是向300ml水中加入8g NaCl、0.2g KCl、0.2g KH2PO4、3.62gNa2HPO4·12H2O,搅拌溶解后,再加500ml水,灭菌。
缓冲液2,是向PBS中加入IBMX(Sigma)和BSA(北京欣经科),使终浓度分别为1mmol/L和0.1%重量。
利拉鲁肽(分子量3751.2KD,厂家1)用缓冲液1或用缓冲液2稀释成以下浓度梯度(ng/ml):200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.563。
U2OS/GLP-1R-荧光细胞板(96孔,Costar)中加入上述两种缓冲液稀释的8种浓度的利拉鲁肽进行反应,4%多聚甲醛固定,PBS清洗,DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)染核;孔中留PBS缓冲液,封膜。
用自动细胞成像分析仪(Thermo ScientificTM ArrayScanTM XTI Live HighContent Platform)采集荧光图像并输出数据,用Soft Max 4.8版(Perkin Elmer多功能酶标仪自带软件)进行四参数曲线拟合。结果发现,使用缓冲液1的检测下限EC50约为45nmol/L,使用缓冲液2的检测下限EC50约为6nmol/L(图1),缓冲液2大大提高了检测灵敏度。
实施例2检测不同来源的GLP-1样化合物
利用本申请方法对厂家1利拉鲁肽注射液、厂家2贝那鲁肽原液及注射液、厂家3利拉鲁肽原液及注射液的活性进行测定。
(1)材料准备:
无菌DPBS、0.25%胰酶、DMEM高糖培养基、双抗、胎牛血清(FBS)均购自GIBCO公司;4%多聚甲醛、G418/Geneticin均购自Solarbio公司;DAPI、IBMX均购自SIGMA公司;BSA购自北京欣经科生物技术有限公司。
IBMX贮液:称IBMX干粉66.67mg,用3ml DMSO(二甲基亚砜)溶解,分装,-20℃保存备用(浓度为100mmol/L),有效期1年。
10%BSA:称2.0015g BSA用20ml超纯水溶解,分装,-20℃保存备用,有效期1年。
稀释液:向100ml DPBS中加入100mmol/L IBMX 1ml、10%BSA 1ml,混合均匀,每次现用现配。
(2)细胞种板
将冻存的U2OS/GLP-1R细胞复苏后,用完全培养基(450ml DMEM,加50ml胎牛血清(FBS),加5ml青霉素、链霉素双抗混合液,加G418至终浓度200μg/ml)传代,再用试验培养基(高糖DMEM+10%FBS+1%双抗)稀释至80000个/ml,接种透明底96孔板,每孔100μl,37℃、5%CO2培养过夜。
(3)药物稀释
厂家1利拉鲁肽
利拉鲁肽标准品(0.48mg/ml)及各批次利拉鲁肽注射液(浓度均为5.6mg/ml),预稀释浓度:1mg/ml、100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml,上板浓度(ng/ml):200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.563。一式两份进行测定。
厂家2贝那鲁肽
贝那鲁肽标准品(1.0856mg/支)预稀释浓度:1mg/ml、100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml,上板浓度(ng/ml):400、200、50、25、12.5、6.25、0.625、0.3125。一式四份进行测定。
各批次贝那鲁肽原液(浓度约为3.0mg/ml),预稀释浓度:100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml,上板浓度(ng/ml):400、200、50、25、12.5、6.25、0.625、0.3125。一式四份进行测定。
各批次贝那鲁肽注射液(浓度为2.0mg/ml),预稀释浓度:100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml,上板浓度(ng/ml):400、200、50、25、12.5、6.25、1.25、0.625。一式两份进行测定。
厂家3利拉鲁肽
利拉鲁肽标准品(0.96mg/支)稀释至1mg/ml,另有第1批次利拉鲁肽原液(9.269mg/ml)、第2批次利拉鲁肽原液(9.136mg/ml)、利拉鲁肽注射液(6mg/ml)。该厂家的上述标准品、原液、注射液均预稀释至以下浓度:100μg/ml、10μg/ml,然后,上板浓度(ng/ml):600、300、150、75、37.5、18.75、3.75、1.875。一式三份进行测定。
(4)反应和检测
经细胞种板并培养后,当细胞汇集面积达到板底总面积的约三分之二以上、且无荧光自聚集(镜检目测)时,加入各稀释度的GLP-1样化合物100μl/孔,在2分钟内加满整块板,常温反应20min;弃去反应液,加4%多聚甲醛溶液100μl/孔,常温固定15min;弃去固定液,加1×PBS溶液洗板;加预冷的1μg/ml DAPI溶液100μl/孔,常温避光染核20min;弃去染核液,加1×PBS溶液100μl/孔,避光保存或者锡箔纸包裹常温保存,如不立即检测结果,在板周边缠上封口膜,以免孔内液体蒸发。
在高内涵设备(ArrayScan XTI,Thermo Fisher Scientific Inc.)中选用Cellmobility assay模块检测实验结果,采集荧光强度变化的图像信息,输出Spotavgarea数据,用Soft Max软件(v 4.8)对高内涵数据进行四参数曲线拟合,分析各批次产品EC50与标准品EC50之间的差异,用以下公式评价体外生物学活性:
体外生物学活性=标准品EC50/批次样品EC50
结果见图2。
实施例3稳定性
厂家3的利拉鲁肽原液及注射液活性用本申请方法或Promega试剂盒方法进行测定,考察:(1)反应终止后不同时间点采集数据进行分析的结果差异;(2)使用不同传代代次的细胞进行测定的结果差异,即细胞寿命对方法稳定性的影响。
本申请的方法如下:按实施例2之厂家3部分,用第25、35、47代细胞对厂家3利拉鲁肽的活性进行检测,用Graph pad Prism(5.0)软件进行分析。用Soft Max(v 4.8)软件对第35代次的实验结果在反应终止后的1-100h内不同时间点进行数据采集和四参数曲线拟合分析。
Promega试剂盒(V1682)方法如下:
胰岛瘤RIN-m5F细胞购自ATCC,用RPMI培养基+10%FBS+1%青霉素/链霉素双抗+1%丙酮酸钠培养传代,取第30、33、35代细胞,按7000个/孔接种透明底96孔板。
利拉鲁肽的标准品(0.96mg/支)和原液1(9.269mg/支)来自厂家3,用对照稀释液进行稀释,预稀释浓度:100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml,上板浓度(ng/ml):300、100、33.3、11.1、3.70、1.23、0.41、0.14、0.05。对照稀释液为:向30ml DPBS中加入0.3ml 100mmol/LIBMX、0.3ml 10%BSA,混合均匀,每次现用现配。
取汇集度约四分之三、且无荧光自聚集的RIN-m5F细胞板,按40μl/孔加利拉鲁肽37℃刺激细胞5分钟,同时按试剂盒说明书配制含有蛋白激酶A的cAMP检测液;按10μl/孔加该cAMP检测液,25℃反应20分钟;按50μl/孔加蛋白激酶A的底物的反应液,25℃避光10分钟;用Enspire多功能酶标仪读取荧光值(单位为RLU),每次测定的结果对应一个assay ID。
用第30代RIN-m5F细胞进行上述反应后,在1-100h内进行多次扫描。
对比不同时间点检测结果和不同细胞代次测定结果时,均采用Soft Max(v 4.8)软件对检测结果进行四参数曲线拟合。
结果见图3(时间稳定性)和图4(细胞代次稳定性)。
实施例4特异性
利拉鲁肽、生长激素、甘精胰岛素、胰高血糖素、特立帕肽、激动剂AR231453(针对受体GPR119),这6种注射液用实施例2所述本申请方法检测,结果如下:
表2
另外,将上述6种药物混合后进行检测。
利拉鲁肽:6mg/ml(对应于1600μmol/L);
生长激素:3.33mg/ml(对应于150μmol/L);
甘精胰岛素:0.1mg/ml(对应于16μmol/L);
胰高血糖素:1mg/ml(对应于290μmol/L);
特立帕肽:0.25mg/ml(对应于50μmol/L);
激动剂AR231453(溶于DMSO、不溶于水):10mmol/L;
混合液1(mix 1):各品种均预稀释至16μmol/L,然后等量混合。
混合液2(mix 2):各品种均预稀释至1.6μmol/L,然后等量混合。
将单独的利拉鲁肽以及混合液按以下8个利拉鲁肽梯度(nmol/L)加载96孔细胞板:160、80、40、20、10、5、1、0.5。其中,160nmol/L利拉鲁肽对应于600ng/ml利拉鲁肽。采用nmol/L更确保每一种药物是以相等的分子个数进行混合。
用第40代U2OS/GLP-1R-荧光细胞按实施例2进行本申请方法的检测;用第31代Rin-m5F细胞按实施例3进行Promega试剂盒方法的检测。两种方法实验结果均采用SoftMax(v 4.8)软件进行四参数曲线拟合(图5)。
另外,分别用U2-OS/GLP-1R细胞、Rin-m-5F细胞通过Promega试剂盒方法检测单独的利拉鲁肽纯品、以及混合液的活性,最后用R&D试剂盒(SKGE002B)检测两种细胞受药物刺激后实际产生的cAMP量。
结果发现,本申请的方法能检测出混合液中利拉鲁肽的体外活性,而Promega试剂盒方法不行。在Promega试剂盒方法中,对于Rin-m-5F细胞而言,混合液刺激的发光值比单独利拉鲁肽刺激的发光值高出25%左右,而对于U2-OS/GLP-1R细胞而言,混合液刺激的发光值和单独利拉鲁肽刺激的发光值相同。
用R&D试剂盒检测上述两种细胞受药物刺激后实际产生的cAMP量,结果发现,混合液刺激U2OS/GLP-1R细胞产生cAMP的量与单独利拉鲁肽刺激同样细胞的量基本相同,而混合液刺激Rin-m5F细胞的cAMP产量明显高于单独利拉鲁肽刺激同样细胞的cAMP产量(图6)。
实施例5数据可靠性
取厂家3的利拉鲁肽标准品(0.96mg/支),用实施例1的缓冲液2稀释,直至600ng/ml(设为本实施例的ST),然后配制50%ST、80%ST、100%ST、120%ST、150%ST,每个水平8个梯度,按下表的浓度(ng/ml)加载96孔U2OS/GLP-1R-荧光细胞板(3个平行板,取均值):
表3
50%ST | 300 | 150 | 75 | 37.5 | 18.8 | 9.4 | 1.9 | 0.9 |
80%ST | 480 | 240 | 120 | 60 | 30 | 15 | 3 | 1.5 |
100%ST | 600 | 300 | 150 | 75 | 37.5 | 18.8 | 3.8 | 1.9 |
120%ST | 720 | 360 | 180 | 90 | 45 | 22.5 | 4.5 | 2.3 |
150%ST | 900 | 450 | 225 | 112.5 | 56.3 | 28.2 | 5.6 | 2.8 |
ST | 600 | 300 | 150 | 75 | 37.5 | 18.8 | 3.8 | 1.9 |
每个水平经四参数曲线拟合后,计算50%ST、80%ST、100%ST、120%ST、150%ST各自的四参数曲线拟合值相对于ST的四参数曲线拟合值的百分比,即得出下表的实测值:
表4
理论值 | 实测值 | 平均值 | RSD |
50% | 48%、58%、55% | 53.7% | 9.6% |
80% | 82%、75%、81% | 79.3% | 4.8% |
100% | 103%、101%、103%、98%、102%、95% | 100.3% | 3.2% |
120% | 117%、127%、120% | 121.3% | 4.2% |
150% | 151%、158%、140% | 149.6% | 6.1% |
根据50%、80%、100%三个浓度梯度各测定三次结果的4参数拟合曲线得出,每条4参数拟合曲线的R2均在0.98以上,可见本申请方法在标准值的50%-100%范围内线性良好;根据100%、120%、150%三个浓度梯度各测定三次结果的4参数拟合曲线得出,每条4参数拟合曲线的R2均在0.98以上,可见本申请方法在标准浓度的100%-150%范围内线性良好。
由表4亦可知,50%ST、80%ST、100%ST、120%ST和150%ST的实测值分别为理论值的107.4%、99.1%、100%、101.1%、99.7%,都处于理论值±20%范围内,表明本申请方法在标准浓度的50%-150%范围内准确性较好。
50%ST、80%ST、100%ST、120%ST和150%ST的相对标准偏差(RSD)值分别为9.6%、4.8%、3.2%、4.2%、6.1%,均小于20%,表明本申请方法在标准浓度的50%-150%范围内重复性较好。
100%ST平行测3次,ST也平行测3次,共六次检测的平均值为100.3%,标准差(SD)为3.2,基于这些数据,得到相对标准偏差即精密度为3.2%。
综上,本申请方法在相对于标准浓度而言上下波动50%时仍可确保检测数据准确可靠。
Claims (10)
1.体外检定GLP-1样化合物的生物学活性的方法,包括以下步骤:
(1)将待测化合物用含有IBMX和BSA的PBS作为稀释液进行梯度稀释,
(2)将经过梯度稀释的待测化合物加载至生长有U2OS/GLP1R细胞的多孔板板中进行反应,所述细胞在其表面表达GLP-1R与荧光标记的偶联体,所述荧光标记偶联在GLP-1R的C末端;所述多孔板的孔中的U2OS/GLP1R细胞已生长至50%以上汇集;
(3)检测多孔板的荧光。
2.权利要求1的方法,其中检测到的多孔板荧光数据用四参数曲线拟合。
3.权利要求2的方法,所述梯度稀释有7~9个梯度,在四参数拟合曲线上为下平台2~3个梯度、上升期2~3个梯度、以及上平台2~3个梯度。
4.权利要求2或3的方法,所述梯度稀释中的最大梯度,也即起始反应浓度,是在100~1000ng/ml的范围内。
5.权利要求3或4的方法,所述检测荧光是通过高内涵设备进行检测。
6.权利要求1~5任一项的方法,其中U2OS/GLP1R细胞在多孔板上的接种量是6000~10000个/孔。
7.权利要求1~6任一项的方法,其中所述稀释液中的IBMX为0.5~5.0mmol/L。
8.权利要求1~7任一项的方法,其中所述稀释液中IBMX为1mmol/L,BSA为0.1%重量。
9.权利要求1~8任一项的方法,其中,将待测化合物添加至细胞板的步骤,是各孔同步加入经过梯度稀释的待测化合物来完成。
10.权利要求1~9任一项的方法,其中,在U2OS/GLP1R细胞与待测化合物的反应被固定后,在检测荧光之前,将细胞板密封并避光保存。
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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