CN104977408B - 一种筛选分泌特异性单克隆抗体杂交瘤细胞的方法与应用 - Google Patents

一种筛选分泌特异性单克隆抗体杂交瘤细胞的方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种筛选分泌特异性单克隆抗体杂交瘤细胞的方法与应用。该方法通过将Oleyl‑PEG4000‑NHS与Ag偶联，得到Oleyl‑PEG4000‑NHS‑Ag；在待筛选的杂交瘤细胞克隆中加入Oleyl‑PEG4000‑NHS‑Ag培养，弃上清，清洗；再加入荧光物质标记的抗鼠二抗孵育，弃上清，清洗；加入不完全培养基，用倒置荧光显微镜观察可见光和荧光下的细胞团，做好阴阳性的标记，在含有阳性细胞团的板孔中加入甲基纤维素半固体培养基，将阳性标记细胞移入到新的细胞培养板中培养，得到分泌特异性单克隆抗体杂交瘤细胞。该方法快速简便、准确率高，可用于快速筛选得到分泌特异性单克隆抗体杂交瘤细胞。

Description

一种筛选分泌特异性单克隆抗体杂交瘤细胞的方法与应用
技术领域
本发明属于免疫学检测领域，特别涉及一种筛选分泌特异性单克隆抗体杂交瘤细胞的方法与应用。
背景技术
1975年德国学者Kohler和Milstein发明了杂交瘤技术。他们成功将骨髓瘤细胞和产生抗体的B淋巴细胞融合为杂交瘤细胞，这种合成的杂交瘤细胞可产生只针对某一特定抗原决定簇的单克隆抗体。杂交瘤技术的的创建，开创了抗体制备的新纪元，为临床疾病的诊断、预防和治疗提供了新的工具，促进了免疫学、基础与临床医学等众多学科的发展。
单克隆抗体具有纯度高、特异性强、效价高、少或无交叉反应等特性，已广泛应用于疾病的诊断、特异性抗原或蛋白的检测和鉴定、疾病的被动免疫治疗和生物导向制药的制备等。单克隆抗体在理论和实践上的应用，成为解决生物学、医学等诸多重大问题的重要手段。
尽管单克隆抗体具有重要的作用，可传统的单克隆抗体制备过程中杂交瘤细胞的筛选比较繁琐。融合后的杂交瘤经HAT培养基培养一周后，然后将每个板孔中的细胞上清取出来，通过ELISA检测其是否分泌特异性抗体，是否为分泌能力强的抗体，若检测出为阳性且分泌能力强的细胞，则需要把此阳性细胞至少进行三次亚克隆，才能得到阳性单克隆杂交瘤细胞株。这种方法不仅耗时耗力，还具有以下几个缺点：(1)在多细胞克隆(融合孔)孔筛选时，ELISA方法仅能评价孔内是否含有阳性克隆，不能评价究竟哪个克隆是阳性克隆；(2)在克隆化过程中，ELISA仅能评价细胞孔内所有细胞分泌抗体后的总体情况，不能直接评价板孔中的细胞变异情况，需经再次克隆化后才能大致反推评价前代原始孔中细胞的变异情况；(3)在再次克隆化过程中，ELISA结合有限稀释法克隆细胞时，仅留下极少量的细胞(50-100个细胞)用于铺板筛选，而大部分的细胞被抛弃了，在这个过程中，由于细胞变异和竞争，强阳性细胞很可能被漏选；(4)单个杂交瘤细胞孔经过数次克隆化后，将产生大量的需处理和检测细胞孔，工作量庞大，琐碎。以上这些因素都不利于阳性细胞株的筛选。
发明内容
本发明首要的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种筛选分泌特异性单克隆抗体杂交瘤细胞的方法。
本发明的另一目的在于提供所述筛选分泌特异性单克隆抗体杂交瘤细胞的方法的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种筛选分泌特异性单克隆抗体杂交瘤细胞的方法，包括如下步骤：
(1)将Oleyl-PEG4000-NHS与抗原偶联，得到Oleyl-PEG4000-NHS-Ag；
(2)将待筛选的杂交瘤细胞克隆清洗；接着加入Oleyl-PEG4000-NHS-Ag，37℃、5％CO2培养；然后弃上清，清洗杂交瘤细胞克隆；
(3)将荧光物质标记的抗鼠二抗加入到步骤(2)处理好的杂交瘤细胞克隆，37℃、5％CO2培养；然后弃上清，清洗杂交瘤细胞克隆；
(4)加入不完全培养基，用倒置荧光显微镜观察可见光和荧光下的细胞团，并拍照做好阴阳性的标记；
(5)在含有阳性细胞团的板孔中加入甲基纤维素半固体培养基，观察位置并做好标记，将阳性标记细胞移入到新的细胞培养板中培养，得到分泌特异性单克隆抗体杂交瘤细胞。
步骤(1)中所述的抗原优选为呋喃唑酮代谢物(AOZ)或肌酸激酶同工酶(CKMB)。
所述的呋喃唑酮代谢物优选为衍生的CPAOZ。
步骤(1)中所述的偶联可为常规的偶联方法，当抗原是非完全抗原时，先将Oleyl-PEG4000-NHS与载体蛋白偶联，再与抗原偶联；当抗原是完全抗原时，将Oleyl-PEG4000-NHS与抗原偶联即可。偶联的具体步骤优选如下：当所述的抗原为呋喃唑酮代谢物，将Oleyl-PEG4000-NHS与BSA偶联后，再与呋喃唑酮代谢物衍生物偶联；当所述的抗原为肌酸激酶同工酶，将Oleyl-PEG4000-NHS直接与肌酸激酶同工酶直接偶联。
步骤(2)中所述的Oleyl-PEG4000-NHS-Ag的加入量优选为按48孔板的每孔添加0.01mg计算。
步骤(2)中所述的培养的时间优选为30～90min；更优选为60min。
步骤(3)中所述的荧光物质包括异硫氰酸荧光素(FITC)、四乙基罗丹明(RB200)和四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)。
步骤(3)中所述的抗鼠二抗优选为羊抗鼠IgGFc二抗。
步骤(3)中所述的培养的时间优选为30～60min；更优选为40min。
步骤(2)和(3)中所述的清洗优选通过磷酸盐缓冲液(PBS)或是不完全培养基进行清洗。
所述的不完全培养基的组成如下：链霉素和青霉素混合液与RPMI1640培养基按体积比1：99配比混合得到，其中，链霉素和青霉素混合液中，链霉素和青霉素的浓度分别为1U/ml。
步骤(5)中所述的甲基纤维素半固体培养基优选为通过如下步骤得到：将RPMI1640培养基和质量体积比2.7％的甲基纤维素溶液按体积比1：1混合均匀，得到甲基纤维素半固体培养基。
步骤(5)中所述的甲基纤维素半固体培养基的体积用量优选为相当于步骤(4)中所述的不完全培养基的体积的4/3倍。
所述的筛选分泌特异性单克隆抗体杂交瘤细胞的方法在免疫学领域中进行应用，用于快速筛选得到分泌特异性单克隆抗体杂交瘤细胞。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明通过一种两亲性物质(Oleyl-PEG4000-NHS)能够快速简便筛选分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，缩短阳性细胞株的筛选时间，减少克隆化的次数和阳性细胞株的丢失，准确率高。Oleyl-PEG4000-NHS是一种两亲性物质，其一端是亲脂性的，能与细胞膜结合，另一端的PEG聚合物是亲水性的，其末端连接的-COO-NHS是经NHS活化过的羧基，可以与抗原上的氨基相结合，细胞克隆化后培养4-5天后，先用不完全培养基洗涤细胞两次，可以把原有的抗体洗去，排除了假阳性；把偶联的特定抗原偶联物加入到相应的细胞，孵育后偶联物的一端连接到细胞膜上，偶联的抗原与分泌的抗体结合，洗去未结合的抗体，加入荧光二抗孵育，洗去未结合的二抗，观察荧光，做好标记，加入甲基纤维素半固体培养基直接挑取有荧光的挑选细胞。直接能挑取阳性细胞，克隆化时不易漏选强阳性细胞株。进行2-3次克隆阳性率就能达到90％以上的，这种方法半个月内就能筛选到阳性细胞株，缩短筛选的时间；可精准评价孔内每个细胞的抗体分泌情况和细胞克隆的变异情况，结合半固体培养基有利于挑选到稳定的阳性细胞株；再次克隆化时不易漏选强阳性细胞株；而常规单克隆筛选一般至少需要一个月才能筛选到阳性细胞株，不能确定阳性克隆，克隆化时容易漏选阳性细胞株。
附图说明
图1是Oleyl-PEG4000-NHS-BSA-CPAOZ的SDS-PAGE检测结果图；其中，泳道1是Marker，泳道2是Oleyl-PEG4000-NHS-BSA，泳道3是BSA，泳道4是Oleyl-PEG4000-NHS-BSA-CPAOZ。
图2是Oleyl-PEG4000-NHS-BSA-CPAOZ的紫外可见分光扫描检测结果图。
图3是Oleyl-PEG4000-NHS-CKMB的SDS-PAGE检测结果图；其中，泳道1是CKMB，泳道2是Marker，泳道3是Oleyl-PEG4000-NHS-CKMB。
图4是Oleyl-PEG4000-NHS-CKMB的紫外可见分光扫描检测结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
(1)Oleyl-PEG4000-NHS与抗原的偶联和鉴定
1)Oleyl-PEG4000-NHS与BSA的偶联
称取33mg BSA，溶于3.3mL 15mM、pH 7.4的PBS(下面所用的PBS同此处)中，搅拌器搅拌均匀，得到BSA溶液。接着称取10mg Oleyl-PEG4000-NHS(购买于日本NF公司)，溶于1mL PBS，得到Oleyl-PEG4000-NHS溶液。将Oleyl-PEG4000-NHS溶液缓慢加入到搅拌状态的BSA溶液中，常温下搅拌3小时，得到Oleyl-PEG4000-NHS-BSA溶液。
2)Oleyl-PEG4000-NHS-BSA与CPAOZ的偶联
①吸取500μl Oleyl-PEG4000-NHS-BSA溶液，加入到500μl PBS中，置于冰盒中搅拌。
②将衍生好的CPAOZ(按文献“周克楠等.呋喃唑酮代谢物单克隆抗体及其新型免疫层析检测试纸条的制备[J].中国生物制品学杂志,2014,7:017.”提供的方法制备得到)溶解后缓慢加入步骤①最终得到的的溶液中搅拌过夜，12h后3000rpm、4℃离心5min，取上清，用30KD的超滤管超滤，得到Oleyl-PEG4000-NHS-BSA-CPAOZ。再进行过滤除菌，置于4℃保存。
3)Oleyl-PEG4000-NHS-BSA和Oleyl-PEG4000-NHS-BSA-CPAOZ的鉴定
通过SDS-PAGE和紫外可见分光扫描进行鉴定。SDS-PAGE电泳鉴定(如图1所示)和紫外可见分光扫描鉴定(如图2所示)的结果表明，的确获得Oleyl-PEG4000-NHS-BSA和Oleyl-PEG4000-NHS-BSA-CPAOZ。
(2)呋喃唑酮代谢物(AOZ)杂交瘤细胞团的筛选
在进行细胞团实验之前对Oleyl-PEG4000-NHS-BSA-CPAOZ工作浓度和孵育时间、FITC标记羊抗鼠IgGFc二抗工作浓度和孵育时间进行摸索，下面操作所用的条件都是摸索得到的条件。
1)将CPAOZ杂交瘤细胞和CKMB杂交瘤细胞制备成检测细胞
①CPAOZ杂交瘤细胞的制备：按文献“周克楠等.呋喃唑酮代谢物单克隆抗体及其新型免疫层析检测试纸条的制备[J].中国生物制品学杂志,2014,7:017.”中提供的方法制备。
②CKMB杂交瘤细胞的制备：按文献“Leickt L,Grubb A,Ohlson S.Development of monoclonal antibodies against creatine kinase MB2.Scand J Clin LabInvest 2002；62:423-430”中提供的方法制备。
③CPAOZ杂交瘤细胞和CKMB杂交瘤细胞用于检测本发明的可行性，只要CPAOZ杂交瘤细胞和CKMB杂交瘤细胞经传代2-3代，经传统的ELISA方法验证为阳性即可(传统的ELISA方法按照《酶联免疫分析技术及应用》中记载步骤操作)。将CPAOZ杂交瘤细胞和CKMB杂交瘤细胞按1:1混合，得到混合细胞。将CPAOZ杂交瘤细胞、CKMB杂交瘤细胞和混合细胞分别单独在96孔细胞板进行克隆化，克隆化第四或五天后选取大小合适的细胞团弃细胞上清用不完全培养基(每100mL由1ml链霉素和青霉素混合液(链霉素和青霉素的浓度分别为1U/ml)+99ml RPMI 1640，下同)洗两次；
2)加入100μl 0.05mg/ml Oleyl-PEG4000-NHS-BSA-CPAOZ，置于细胞培养箱孵育60min，弃上清，用不完全培养基洗两次；
3)加入100μl稀释100倍的FITC标记羊抗鼠IgGFc(原液浓度为0.78mg/ml，下同)，置于细胞培养箱孵育40min，弃上清，用不完全培养基洗两次；
4)加入150μl不完全培养基，用荧光显微镜观察可见光和荧光下的细胞团，并拍照做好阴阳性的标记，阴性标记为不产生荧光的细胞团，阳性标记为具有荧光的细胞团；
5)在含有阳性细胞团的板孔中加入200μl甲基纤维素半固体培养基(按体积比1:1将RPMI 1640和质量体积比2.7％的甲基纤维素溶液充分混匀得到，下同)，观察位置并做好标记，用移液器吸取阳性标记细胞加入到新的细胞培养板中培养。
6)结果：CPAOZ杂交瘤细胞在荧光显微镜下观察到荧光，CKMB杂交瘤细胞在荧光显微镜下没有看到荧光。通过混合细胞分离得到的阳性单克隆经1次传代、2次验证(分别用本发明荧光方法和传统的ELISA方法验证)，仍然为CPAOZ杂交瘤细胞，正确率95％以上。
实施例2
(1)Oleyl-PEG4000-NHS与抗原的偶联和鉴定
1)Oleyl-PEG4000-NHS与CKMB的偶联
称取10mg Oleyl-PEG4000-NHS溶于1ml PBS，用PBS稀释到1mg/ml，得到1mg/ml Oleyl-PEG4000-NHS溶液；接着取500μl 1mg/ml Oleyl-PEG4000-NHS加入瓶中置于冰盒上搅拌，取500μl 1mg/ml CKMB抗原缓慢加入上面的溶液中搅拌过夜，12h后30KD的超滤管超滤，得到Oleyl-PEG4000-NHS-CKMB溶液。接着进行过滤除菌，置于4℃保存。
2)Oleyl-PEG4000-NHS-CKMB的鉴定
同实施例1。结果：SDS-PAGE电泳(如图3所示)和紫外可见分光扫描鉴定(如图4所示)表明，得到Oleyl-PEG4000-NHS-CKMB。
(2)肌酸激酶同工酶MB(CKMB)杂交瘤细胞团的筛选
在进行细胞团实验之前对Oleyl-PEG4000-NHS-CKMB工作浓度和孵育时间进行摸索，下面操作所用的条件都是摸索得到的条件。
1)将CPAOZ杂交瘤细胞和CKMB杂交瘤细胞(同实施例1)按1:1混合，得到混合细胞。将CPAOZ杂交瘤细胞、CKMB杂交瘤细胞和混合细胞分别单独在96孔细胞板进行克隆化，克隆化第四或五天后选取大小合适的细胞团弃细胞上清用不完全培养基洗两次；
2)加入100μl 0.05mg/ml Oleyl-PEG4000-NHS-CKMB，置于细胞培养箱孵育60min，弃上清，用不完全培养基洗两次；
3)加入100μl稀释100倍的FITC标记羊抗鼠IgGFc，置于细胞培养箱孵育40min，弃上清，用不完全培养基洗两次；
4)加入150μl不完全培养基，用荧光显微镜观察可见光和荧光下的细胞团，并拍照做好阴阳性的标记，阴性标记为不产生荧光的细胞团，阳性标记为具有荧光的细胞团；
5)在含有阳性细胞团的板孔中加入200μl甲基纤维素半固体培养基，观察位置并做好标记，用移液器吸取阳性标记细胞加入到新的细胞培养板中培养。
6)结果：CKMB杂交瘤细胞在荧光显微镜下观察到荧光，CPAOZ杂交瘤细胞在荧光显微镜下没有看到荧光。通过混合细胞分离得到的阳性单克隆经1次传代、2次验证(分别用荧光方法和传统的ELISA方法验证)，仍然为CPAOZ杂交瘤细胞，正确率为95％以上。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种筛选分泌特异性单克隆抗体杂交瘤细胞的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将Oleyl-PEG4000-NHS与抗原偶联，得到Oleyl-PEG4000-NHS-Ag；
(2)将待筛选的杂交瘤细胞克隆清洗；接着加入Oleyl-PEG4000-NHS-Ag，37℃、5％CO2培养；然后弃上清，清洗杂交瘤细胞克隆；
(3)将荧光物质标记的抗鼠二抗加入到步骤(2)处理好的杂交瘤细胞克隆，37℃、5％CO2培养；然后弃上清，清洗杂交瘤细胞克隆；
(4)加入不完全培养基，用倒置荧光显微镜观察可见光和荧光下的细胞团，并拍照做好阴阳性的标记；
(5)在含有阳性细胞团的板孔中加入甲基纤维素半固体培养基，观察位置并做好标记，将阳性标记细胞移入到新的细胞培养板中培养，得到分泌特异性单克隆抗体杂交瘤细胞。
2.根据权利要求1所述筛选分泌特异性单克隆抗体杂交瘤细胞的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的抗原为呋喃唑酮代谢物或肌酸激酶同工酶。
3.根据权利要求1所述筛选分泌特异性单克隆抗体杂交瘤细胞的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的偶联的具体步骤如下：当所述的抗原为呋喃唑酮代谢物，将Oleyl-PEG4000-NHS与BSA偶联后，再与呋喃唑酮代谢物偶联；当所述的抗原为肌酸激酶同工酶，将Oleyl-PEG4000-NHS直接与肌酸激酶同工酶直接偶联。
4.根据权利要求1所述筛选分泌特异性单克隆抗体杂交瘤细胞的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的Oleyl-PEG4000-NHS-Ag的加入量为按48孔板的每孔添加0.01mg计算。
5.根据权利要求1所述筛选分泌特异性单克隆抗体杂交瘤细胞的方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的培养的时间为30～90min；
步骤(3)中所述的培养的时间为30～60min；
步骤(2)和(3)中所述的清洗为通过磷酸盐缓冲液或不完全培养基进行清洗。
6.根据权利要求1或5所述筛选分泌特异性单克隆抗体杂交瘤细胞的方法，其特征在于：所有所述的不完全培养基的组成如下：链霉素和青霉素混合液与RPMI1640培养基按体积比1：99配比混合得到，其中，链霉素和青霉素混合液中链霉素和青霉素的浓度分别为1U/ml。
7.根据权利要求1所述筛选分泌特异性单克隆抗体杂交瘤细胞的方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的荧光物质为异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明或四甲基异硫氰酸罗丹明；
步骤(3)中所述的抗鼠二抗为羊抗鼠IgGFc二抗。
8.根据权利要求1所述筛选分泌特异性单克隆抗体杂交瘤细胞的方法，其特征在于：
步骤(5)中所述的甲基纤维素半固体培养基为通过如下步骤得到：将RPMI1640培养基和质量体积比2.7％的甲基纤维素溶液按体积比1：1混合均匀，得到甲基纤维素半固体培养基；
步骤(5)中所述的甲基纤维素半固体培养基的体积用量相当于步骤(4)中所述的不完全培养基的体积的4/3倍。
9.权利要求1～8任一项所述的筛选分泌特异性单克隆抗体杂交瘤细胞的方法的应用，其特征在于：将其用于快速筛选得到分泌特异性单克隆抗体杂交瘤细胞。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110016462A (zh) * 2019-02-20 2019-07-16 优睿赛思(武汉)生物科技有限公司 从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性b淋巴细胞的方法

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110879293A (zh) * 2019-11-05 2020-03-13 暨南大学 一种筛选分泌配对单克隆抗体的杂交瘤细胞株的方法与应用
CN115166241B (zh) * 2022-08-22 2023-03-24 广东忠信生物科技有限公司 一种同时筛选记忆b细胞和浆细胞的高效筛选技术及应用
CN115125251B (zh) * 2022-08-22 2023-11-03 广东忠信生物科技有限公司 一种高效获得特异性全人单克隆抗体基因的方法和应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1428537B1 (en) * 2001-08-29 2008-11-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Stabilized preparations containing antibody
WO2003074691A1 (fr) * 2002-03-01 2003-09-12 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology Cellules et liposomes immobilises et procede d'immobilisation correspondant
CN102747044B (zh) * 2012-07-24 2015-09-09 郑州后羿制药有限公司 一种抗猪伪狂犬病病毒的杂交瘤细胞系及其制备方法和一种单克隆抗体及其应用
CN102864125B (zh) * 2012-08-08 2014-11-26 南京巴傲得生物科技有限公司 一种单克隆杂交瘤的制备方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110016462A (zh) * 2019-02-20 2019-07-16 优睿赛思(武汉)生物科技有限公司 从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性b淋巴细胞的方法
CN110016462B (zh) * 2019-02-20 2020-04-24 优睿赛思(武汉)生物科技有限公司 从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性b淋巴细胞的方法

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