CN101726593B

CN101726593B - 一种检测登革病毒ns1抗原的免疫诊断试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN101726593B
Application number: CN200910040560A
Authority: CN
Inventors: 车小燕; 丁细霞; 潘玉先; 丘立文
Original assignee: Southern Medical University
Current assignee: Southern Medical University
Priority date: 2009-06-25
Filing date: 2009-06-25
Publication date: 2012-10-17
Anticipated expiration: 2029-06-25
Also published as: CN101726593A

Abstract

本发明公开了一种检测登革病毒NS1抗原的免疫诊断试剂盒，该试剂盒包括捕获抗体和与标记物结合的检测抗体，其特征在于所述的捕获抗体由单抗2E8A5、单抗DV2-M6和单抗4B14A1组成，所述的检测抗体是单抗3B1A15，所述的标记物可以是生物素、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、胶体金或荧光素。该试剂盒能特异性的检测4个血清型登革病毒的NS1蛋白，与其他黄病毒属病毒，如黄病毒和乙型脑炎病毒无交叉反应，其灵敏度比国外商品化试剂盒检测的灵敏度至少高出4倍，可有效降低临床应用中的漏检现象。

Description

一种检测登革病毒NS1抗原的免疫诊断试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及一种医用配制品，特别是用于诊断登革病毒的试剂盒。

背景技术

登革热是目前仅次于疟疾的重要虫媒性传染病，主要流行于热带和亚热带地区；由于旅游业和国际贸易的发展、生态环境的改变、全球人口的增长并向城市集中化以及全球气候变暖等因素的改变，登革病毒的传播已不再局限于部分地区，而是随着人口的流动在全球大部分地区迅速传播。据WHO统计，每年发生登革病毒感染患者超过1亿人，其中50万人发展成为登革出血热，每年死亡人数高达3万人。目前，全球有将近25亿的人口生活在登革热的疫区中，备受登革病毒感染的威胁。总而言之，登革病毒所引起的登革热和登革出血热已成为热带、亚热带地区的一个非常严重的公共卫生问题。

登革病毒有4个血清型，分别为I型、II型、III型和IV型(DV1、DV2、DV3和DV4)。任何一种血清型的感染均可引起一系列的临床症状，包括隐匿性感染、典型登革热以及导致高死亡率发生的登革出血热或登革休克综合征。初次感染登革病毒对于同型病毒的再次感染可产生长久的免疫力，但对其他血清型的再次感染仅能产生部分而且短暂的免疫保护作用。由于存在抗体依赖的病毒感染增强作用，异型登革病毒再次感染是发生登革出血热或登革休克综合征的主要危险因素。由于在一个地区存在不同血清型登革病毒的交替流行，人群普遍易感，这就更增加了登革出血热发生的可能性。

目前，具有保护性的登革病毒疫苗尚未研制成功，临床上对于登革病毒的感染亦未有特异性的治疗措施。但实践表明及时采取临床救治措施可以大大减少登革出血热的发病率和死亡率，因此登革热的治疗很大程度上取决于早期感染的诊断。由于多数登革病毒感染者早期缺乏特异的临床表现，仅有发热、寒战等流感样症状，难以和其它发热疾病和出血热疾病区分，因此，登革病毒感染的确诊依赖于实验室的诊断手段。目前，登革病毒的实验室诊断方法主要包括病毒分离、血清学检测和核酸检测。其中病毒分离是登革病毒感染诊断和血清型鉴定的金标准，但该方法费时而且对于实验室的条件要求较高。尽管病毒核酸的检测方法比传统的病毒分离法更灵敏、快速，但分子诊断操作相对繁琐，对技术水平要求较高，并较易发生污染导致假阳性结果，同时由于毒株变异、潜在突变等序列改变也可能引起假阴性结果。而抗体检测试剂不能用于早期诊断，而且由于4个血清型登革病毒之间以及与其它黄病毒存在血清学交叉反应，特别是接种乙型脑炎病毒、黄热病毒疫苗的人群易发生抗体假阳性反应结果。因此，建立一种快速、可靠、标准化的实验室诊断登革病毒以及各血清型别感染的早期检测试剂显得非常必要。

登革病毒的非结构蛋白1(nonstructural protein 1，NS1)是一种相对保守的糖蛋白，分子量为45～50kDa，有膜型和分泌型两种形式，在感染细胞中高度表达，在登革病毒的研究中已经将它作为诊断登革热的靶抗原。研究发现在登革热患者的早期血中存在高浓度的NS1循环抗原，因此检测急性期病人血清中的循环NS1抗原可用于早期诊断登革病毒感染。目前已报道了几种基于多克隆抗体的检测登革病毒NS1的抗原捕获ELISA法，但是这些方法都是在多克隆抗体的基础上建立的，在不同批次的抗血清中存在很大差异，难以重复和实现实验室的标准化；而利用抗NS1的单克隆抗体来检测登革病毒的商品化试剂盒只有两种：Pan-EDengue Early ELISA test Kit，Panbio，Queensland，Australia；PLATELIATM DENGUE NS1 AG，Bio-Rad，France，该试剂盒含有抗I～IV型登革病毒NS1的单克隆抗体，通过ELISA方法来实现登革病毒感染的早期诊断，其敏感度、特异性和稳定性都比较好。但本发明人进一步研究发现，试剂盒(Pan-E Dengue Early ELISA test kit，Panbio，Queensland，Australia)对I～IV型的登革病毒的敏感度不同，尤其对III型和IV型登革病毒检测的敏感性很低，而早期感染登革病毒的患者血液样本中的病毒含量相对较低，用该试剂盒检测III型和IV型登革病毒的感染有可能会出现漏检现象，不利于临床实践应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提高检测登革病毒NS1抗原的免疫诊断试剂盒的灵敏度，缩小登革病毒四个血清型NS1抗原检测敏感度间的差异性。

本发明解决上述问题的技术方案是：

一种检测登革病毒NS1抗原的免疫诊断试剂盒，该试剂盒包括捕获抗体和与标记物结合的检测抗体，其特征在于所述的捕获抗体由质量比为1∶1∶1的单抗2E8A5、单抗DV2-M6和单抗4B14A1组成，所述的检测抗体是单抗3B1A15。

本发明试剂盒中，所述的单抗组合2E8A5、DV2-M6、4B14A1和单抗3B1A15均是免疫球蛋白，其中单抗2E8A5能同时与IV和III型登革病毒的非结构蛋白1(nonstructural protein1，NS1)结合，属IgG1，由保藏号为CCTCC-C200855的杂交瘤细胞株分泌；单抗4B14A1能同时与I型和III型登革病毒NS1蛋白结合，属IgG1，由保藏号为CCTCC-C200857的杂交瘤细胞株分泌；单抗DV2-M6能特异性结合II型登革病毒NS1蛋白，属IgG1，由保藏号为CCTCC-C200736的杂交瘤细胞株分泌，记载于国知局2008年7月23日公布的发明专利“一种检测II型登革病毒NS1抗原的免疫诊断试剂盒”(申请号为200810026250.7)；单抗3B1A15能同时与四个血清型登革病毒NS1蛋白结合，属IgG2a，由保藏号为CCTCC-C200859的杂交瘤细胞株分泌。其中，保藏号为CCTCC-C200855的杂交瘤细胞株、保藏号为CCTCC-C200857的杂交瘤细胞株和保藏号为CCTCC-C200859的杂交瘤细胞株均于 2008年11月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址为中国武汉大学)。

本发明试剂盒中，所述的标记物可以是生物素、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、胶体金、荧光素等，当本发明所述的检测抗体上结合的标记物为生物素时，本发明试剂盒还含有标记有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的亲和素。所述的亲和素能与生物素以1∶4的比例结合，起到放大检测信号的作用，进一步提高敏感度。

当所述的标记物为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶时，本发明试剂盒是一种基于双抗体夹心ELISA方法的酶联免疫诊断试剂盒，由包被了单抗组合2E8A5、DV2-M6和4B14A1的微孔反应板、样品处理液、标记了辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的单抗3B1A15、阳性对照物、阴性对照物、浓缩洗液、显色液和终止液组成。其中所述的显色液中含有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的底物。该试剂盒对I型和II型登革病毒的敏感性均为49PFU/ml，是商品化进口试剂盒Pan-E Dengue Early ELISA test kit的4倍；对III型和IV型登革病毒的敏感性分别为49PFU/ml和781PFU/ml，为进口试剂盒Pan-E Dengue Early ELISA test kit的32倍。

本发明所用的捕获抗体和检测抗体3B1A15是从一组抗登革病毒的NS1蛋白的单克隆抗体中筛选出来的，其中，捕获抗体是一组由单抗2E8A5、DV2-M6和4B14A1组成的多克隆抗体，分别结合不同血清型的登革病毒NS1蛋白，不仅有效地提高了登革病毒检测的特异性和敏感性，更保证了试剂盒的稳定性，使得该试剂盒能更准确、快速地检测出四个血清型登革病毒，而与其他黄病毒属，如乙型脑炎病毒、黄热病毒无交叉反应，且对四个血清型登革病毒都具有很高的敏感度，可有效降低临床应用中的漏检现象。本发明试剂盒既克服了多克隆抗血清难以重复和实现实验室的标准化的缺点，同时又兼有多克隆抗体的放大效应，提高了检测的敏感性，对登革病毒四个血清型NS1蛋白检测的敏感性均高于国外同类产品。

附图说明

图1是单抗2E8A5、4B14A1、DV2-M6和3B1A15的免疫印迹图，其中A、B、C、D显示的是重组DV1NS1、DV2NS1、DV3NS1、DV4NS1蛋白与杂交瘤细胞培养上清的反应；E、F、G和H分别显示的是天然DV1、DV2、DV3和DV4病毒中的NS1蛋白与杂交瘤细胞培养上清的反应，条带1为杂交瘤细胞株DV2-M6培养上清；条带2为杂交瘤细胞株2E8A5培养上清；条带3为杂交瘤细胞株4B14A1培养上清；条带4为杂交瘤细胞株3B1A15培养上清；条带5为无关杂交瘤细胞培养上清。

具体实施方式：

下面通过具体的例子和实验报告进一步阐明本发明的试剂盒：

1、所述的单抗2E8A5、4B14A1、DV2-M6和3B1A15的制备方法和鉴定结果：

(1)免疫抗原的制备

本发明用于制备单克隆抗体的免疫原为基因重组DV2NS1、DV3NS1、DV4NS1蛋白和已灭活天然的病毒抗原。基因重组DVNS1蛋白是用一种携带DVNS1基因的工程菌株进行制备的，其制备按常规方法进行，经用镍-次氮基三醋酸金属亲和层析的方法进行纯化获得NS1抗原，详细的制备方法可参照使用手册。将NS1蛋白纯化后，以考马斯亮蓝(Coomassie)蛋白分析试剂(PIERCE，Cat，No.ED62976)定量。Western blot对纯化的重组蛋白鉴定结果显示，小鼠抗his mAb在分子量约45KDa处出现特异性的反应条带，与预测的DVNS1分子量大小一致。已灭活天然的病毒抗原，是从DV2、DV3、DV4感染的病毒宿主细胞(C6/36，一种白蚊伊蚊细胞)获得。

(2)免疫小鼠(三种免疫方案)

第一种免疫方案：取4-6周龄雌性BALB/c小鼠，第一次采用弗氏完全佐剂与等体积DV2NS1抗原混匀乳化，每只小鼠皮下多点注射30μg，以后每10天以弗氏不完全佐剂与天然的DV2抗原或重组的DV2 NS1抗原交替免疫共4次后，于融合前3天每只小鼠腹腔注射DV2 NS1抗原100μg进行加强免疫。

第二种免疫方案：取4-6周龄雌性BALB/c小鼠，第一次采用弗氏完全佐剂与等体积DV3NS1抗原混匀乳化，每只小鼠皮下多点注射30μg，以后每10天以弗氏不完全佐剂与天然的DV3抗原或重组的DV3 NS1抗原交替免疫共4次后，于融合前3天每只小鼠腹腔注射DV3 NS1抗原100μg进行加强免疫。

第三种免疫方案：取4-6周龄雌性BALB/c小鼠，第一次采用弗氏完全佐剂与等体积DV4NS1抗原混匀乳化，每只小鼠皮下多点注射30μg，以后每10天以弗氏不完全佐剂与天然的DV4抗原或重组的DV4NS1抗原交替免疫共4次后，于融合前3天每只小鼠腹腔注射DV4NS1抗原100μg进行加强免疫。

(3)杂交瘤细胞的制备和鉴定

加强免疫3天后，无菌操作取小鼠脾脏，制成脾细胞悬液与对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株NS-1按10∶1的比例混合，45％聚乙二醇(PEG，MW4000，Sigma)作用下进行融合。按下述步骤将聚乙二醇溶液加入细胞。在37℃水浴中，在1min内缓慢加入1.0ml PEG，边加边轻轻摇匀，分别于1min、2min、3min、4min、5min内加1ml、2ml、3ml、4ml、5ml无血清RPMI-1640培养基终止融合，最后加入10ml含15％胎牛血清的RPMI-1640培养基，室温800rpm离心5min，弃上清，用60ml含15％胎牛血清的RPMI-1640培养基轻轻悬起细胞。将此细胞悬液加入6块96孔培养板上，在37℃、5％CO₂的二氧化碳培养箱中培养。次日于融合细胞中加入120μl 2×HAT筛选培养基。以后每3天用1×HAT培养基换液一次，当克隆长至占孔底面积的1/10时，取培养上清经间接ELISA法用重组的DVNS1蛋白和DV病毒进行双筛选。阳性克隆转至24孔培养板中扩大培养，经ELISA和免疫荧光(DV感染细胞抗原片)复测仍为强阳性的克隆用有限稀释法进行克隆化。克隆化2～3次至阳性率达100％，选择分泌抗体效价高的细胞株扩增培养后置液氮保存，记为杂交瘤细胞株2E8A5、4B14A1、3B1A15和杂交瘤细胞株DV2-M6。杂交瘤细胞株2E8A5于2008年11月24日在在中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉大学)保藏，保藏号为CCTCC-C200855；杂交瘤细胞株4B14A1于2008年11月24日在在中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉大学)保藏，保藏号为CCTCC-C200857；杂交瘤细胞株3B1A15于2008年11月24日在在中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉大学)保藏，保藏号为CCTCC-C200859；杂交瘤细胞株DV2-M6于2007年11月29日在中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉大学)保藏，保藏号为CCTCC-C200736。

(4)抗DVNS1蛋白单克隆抗体亚类检测

采用间接ELISA，DV1NS1、DV2NS1、DV3NS1和DV4NS1抗原包被的微孔板，封闭后与杂交瘤细胞培养上清孵育，再分别与1∶1000倍稀释的HRP标记的兔抗小鼠不同亚类特异性免疫球蛋白反应，其中包括兔抗小鼠IgG1(美国ZYMED LABORATORIES，INC，目录号61-0120)，兔抗小鼠IgG2a(同上，目录号61-0220)，兔抗小鼠IgG2b(同上，目录号61-0320)，兔抗小鼠IgG3(同上，目录号61-0420)，兔抗小鼠IgM(同上，目录号61-6820)。检测结果显示，本专利发明的4株单克隆抗体中3B1A15为IgG2a阳性；其余3株单克隆抗体均为IgG1阳性。

(5)单克隆抗体腹水制备和纯化

腹水制备：采用体内诱生法制备本发明中单克隆抗体，即在小鼠体内接种杂交瘤细胞制备腹水。简述如下：每只小鼠腹腔内注射0.5ml弗氏不完全佐剂(Sigma公司)，使瘤细胞能以腹水瘤形式在腹腔内生长。大约1～2周后，将2×10⁶个对数生长期的杂交瘤细胞悬浮于无血清RPMI 1640培养基中，注入小鼠腹腔。约1～2周后，用7号针头放腹水，离心后收集腹水上清，立即加入叠氮钠至终浓度为0.1％，存放于4℃备用。

单抗纯化：采用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水中的抗体，操作方法如下：腹水用60mM、pH5.0醋酸缓冲液稀释2倍，室温下于30分钟内边搅拌边逐滴缓慢加入辛酸，为每毫升稀释前腹水加33μl辛酸，出现大量沉淀，4℃静置2小时，10000g，4℃离心30分钟，取上清，加入1/10体积的pH7.4 100mM磷酸盐缓冲液，并用1N氢氧化钠调pH值至7.4，冰浴搅拌下缓慢加入硫酸铵，为每毫升液体加入0.277硫酸铵即为45％饱和度，4℃静置过夜，10000g，4℃离心30分钟，弃上清，沉淀溶于适量10mM磷酸盐缓冲液，用同样的液体，4℃透析过夜，换液三次。以考马斯亮蓝(Coomassie)蛋白分析试剂(PIERCE，Cat，No.ED62976)定量。测定浓度后的抗体加入终浓度50％的甘油于-80℃保存。

(6)单克隆抗体的特异性鉴定

a.间接ELISA法鉴定单克隆抗体的特异性

分别用四个血清型重组DV NS1抗原和天然的DV抗原包被微孔板，按照常规的间接ELISA法进行检测。即在包被的微孔板中加入本专利发明的杂交瘤细胞培养上清液，37℃孵育1h，加入1∶1000稀释的HRP标记羊抗小鼠IgG(Sigma，Inc)，100μl/孔37℃孵育30min，加TMB显色液室温避光显色10min，加1M H₂SO₄终止反应，测450nm吸光值(A₄₅₀)。表1结果显示本专利发明的单克隆抗体DV2-M6为DV2NS1的特异性单抗；与其它三型登革病毒均无交叉反应；单克隆抗体2E8A5、、4B14A1和3B1A15为DV NS1的交叉单抗。

表1DVNS1单克隆抗体与重组的DVNS1抗原和天然的DV抗原反应间接ELISA结果

b.间接免疫荧光法鉴定单克隆抗体的特异性

分别用DV1、DV2、DV3和DV4感染C6/36细胞，当有2/3细胞出现病变时，收集细胞，用预冷的1×PBS洗细胞二遍，然后将细胞滴于无菌干燥的玻片上，干燥后，制备成涂片，充分干燥，用冷丙酮固定10分钟后吹干，分别与阳性杂交瘤细胞培养上清和FITC标记的羊抗小鼠IgG孵育，并设立未感染病毒的C6/36细胞抗原片作为阴性对照，最后用0.25％的伊文氏蓝染色后，荧光显微镜下观察荧光图像，以荧光的强度和染色形态进行结果判定，检测抗体强度以(+～++++)计为阳性，抗体强度(±)和(-)计为阴性。如表2结果显示本专利发明的单克隆抗体4D41A6与II型登革病毒结合的特异性单抗；2E8A5与III型和IV型登革病毒同时结合的交叉性单抗；4B14A1与I型和III型登革病毒同时结合的交叉单抗；而3B1A15与4个血清型的登革病毒NS1蛋白同时结合的交叉单抗。

表2 DVNS1单克隆抗体的免疫荧光检测结果

Figure DEST_PATH_GA20176706200910040560901D00031

c.免疫印迹鉴定单克隆抗体的特异性

将灭活DV培养液或重组的DVNS1蛋白，用2×SDS加样缓冲液稀释一倍，将样品加到10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中，电泳分离蛋白质，通过电洗脱使在凝胶上分离出来的蛋白质转印到硝酸纤维膜上，转印膜用含7％脱脂奶和3％BSA的10mM PBS于4℃封闭24小时，将转印膜装在专门的反应板中，分别加入杂交瘤细胞培养上清中，室温反应1小时，用含有0.5％Tween 20的10mM PBS洗涤膜后，加入1∶500倍稀释的HRP标记羊抗鼠IgG，室温反应1小时，用同样的洗涤液洗涤膜后，DAB显色后，用去离子水终止显色。

免疫印迹结果如图1所示，本发明的特异性单克隆抗体DV2-M6与重组DV2NS1蛋白和灭活DV2培养液在分子量为45千道尔顿可见一条很强的蛋白质结合带，与预测分子量相一致；单克隆抗体2E8A5与重组DV3NS1、DV4NS1蛋白和灭活DV4培养液在分子量为45千道尔顿可见一条很强的蛋白质结合带，与预测分子量相一致；单克隆抗体4B14A1与重组DV1NS1、DV3NS1蛋白和灭火DV3培养液在分子量为45千道尔顿可见一条很强的蛋白质结合带，与预测分子量相一致；交叉单抗3B1A15与4个血清型的重组DVNS1蛋白和灭火的DV培养液在分子量为45千道尔顿可见一条很强的蛋白质结合带，与预测分子量相一致；无关单克隆抗体与各抗原均不产生反应。

2、本发明试剂盒的组成及制备

例1

(1)所用试剂的配制

a.样品处理液：由样品处理液A和样品处理液B组成，其中A为1.5M甘氨酸溶液(PH2.8)，B为1.5M Tris-Hcl溶液(PH9.7)；

b.浓缩洗液：含有2％Tween-20的20×PBS，即1L溶液中含有4.56g NaH2PO4，58.02gNa2HPO4.12H₂O，175.3g NaCl，15磅20min高压灭菌后，加入20ml Tween-20搅匀，使用时20倍稀释；

c.阳性对照物：重组DVNS1蛋白1∶1000稀释液；

d.阴性对照物：含0.1％Tween-2的10mM PH7.4PBS，其制备方法是：将4.56g NaH₂PO4，58.02g Na₂HPO4·12H₂O，175.3g NaCl溶于水中并定量至1L，在15磅压力下高压灭菌20min，20倍稀释后加入0.1％Tween-20；

e.显色液：由显色液A和B组成，使用时取二者等量混匀使用。其中显色液A、B的组成成分如下：

显色液A：

将0.89g柠檬酸和0.16g EDTA二钠溶于1000ml水中，115℃高压30min，降至90℃后加TMB 0.25g，摇匀于4℃闭光保存；

显色液B：

将9.33g柠檬酸和14.6g EDTA二钠溶于1000ml水中，115℃高压30min后，降至90℃后加0.75％过氧化氢尿素12.8ml，摇匀于4℃闭光保存；

f.终止液：1M H₂SO₄。

(2)所述包被捕获抗体的微孔反应板的制备方法：将本发明单抗2EgA5、DV2-M6和4B14A1用10mM pH7.6的磷酸盐缓冲液稀释至每株单抗的终浓度为6μg/ml，用150μl/孔包被聚苯乙烯96孔微孔板，于4℃过夜。拍干后，每孔加入300μl/孔的0.25％酪蛋白(Sigma)的封闭液，于4℃过夜以封闭非特异性结合位点。甩干板条，真空干燥12～24h，用铝膜袋真空包装4℃保存备用。

(3)所述辣根过氧化物酶标记的单抗3B1A15的制备方法：

采用改良过碘酸钠法，操作方法如下：将5mg HRP搅拌溶解于1mL双蒸水中，加入0.2mL新配0.1M过碘酸钠避光室温搅拌30min，置1mM pH4.4醋酸钠缓冲液中，4℃透析过夜；次日加入0.2M pH9.5碳酸盐缓冲液使PH值达9.0～9.5后，加入到预先调节pH至9.5的抗体(10mg)中，在室温避光轻轻搅拌2～3小时，然后加入100μl新配4mg/mL硼氢化钠，4℃避光轻搅过夜；次日将过夜的抗体溶液用1×PBS稀释5～10倍，冰浴搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵(硫酸铵用前先用氨水调pH至7.4)，置4℃避光过夜；12000rpm 4℃离心30min，弃上清，沉淀溶于适量1×PBS缓冲液，并置1×PBS中4℃透析过夜，换液三次。收集结合物加入终浓度50％的2％BSA甘油-PBS保护剂，最后用磷酸盐缓冲液稀释1000倍，即为工作液。

3、用本发明试剂盒检测血清样品中的登革病毒NS1抗原

(1)使用方法：

取待测的样品50μl，加入样品处理液A 50μl，混匀后37℃作用1h，再加样品处理液B 50μl混匀，取100μl加入多克隆抗体(2E8A5、DV2-M6和4B14A1)包被的聚苯乙烯96孔微量测试板中，同时设阴性对照和阳性对照，37℃温育1h，浓缩洗涤液20倍稀释后洗涤板条，洗板6次后，加入1∶1000稀释的HRP标记的单抗3B1A15，100μl/孔，37℃温育30min，同上洗板8次后，加显色液(显色液A和B等量混合，现用现配)，100μl/孔，室温避光显色10min后，加入终止液，100μl/孔，终止反应。

(2)结果判定：以空白孔调零，于450nm波长测定吸光度(A值)。阳性对照平均值≥0.50，阴性对照平均值≤0.10，实验成立。样品A值≥阴性对照A值平均值×2.1，则判为阳性，反之为阴性。

(3)本发明试剂盒检测相关病毒的特异性和灵敏度分析

a.灵敏度分析

通过对DV1、DV2、DV3、DV4进行空斑实验确定病毒滴度分别为2.6×10⁵PFU/mL、6.88×10⁴PFU/mL、2.37×10⁵PFU/mL、7.84×10⁵PFU/mL。采用上述建立的方法检测灭活的DV1、DV2、DV3、DV4，从1×10⁵开始倍比稀释多个梯度进行检测，同时以检测四个血清型DV NS1抗原的商品化试剂盒“pan-E DENGUE EARLYELISA”(Panbio，Australia)进行同步检测比较，操作步骤按照试剂盒说明书进行。本发明试剂盒的检测结果显示对DV1、DV2、DV3培养上清的检测灵敏度高达49PFU/ml；对DV4培养上清的检测灵敏度为782PFU/ml；而对其他病毒的检测结果均为阴性，如表3所示。商品化的pan-E DENGUE EARLY ELISA检测结果显示，对四个血清型的DV培养上清的检测敏感性不同，详见表4结果。pan-E DENGUEEARLY ELISA试剂盒对DV1、DV2培养上清的检测灵敏度均为195PFU/ml；对DV3培养上清的检测灵敏度为1563PFU/ml；对DV4培养上清的检测灵敏度为25000PFU/ml；明显低于本发明的试剂盒检测4个血清型登革病毒培养上清的灵敏度。

表3 本发明试剂盒检测四个血清型DV培养上清结果

Figure DEST_PATH_GA20176706200910040560901D00051

表注：此试剂盒的结果判定如下：样品检测值≥阴性对照平均值的2.1倍(计算为0.062×2.1＝0.13)为阳性，反之为阴性。

表4 进口试剂盒pan-E DENGUE EARLY ELISA检测四个血清型DV培养上清结果

Figure DEST_PATH_GA20176706200910040560901D00061

表注：此试剂盒的结果判定如下：显示值＜9.0为阴性，显示值9.0-11.0为可疑阳性，显示值＞11.0为阳性。

b.特异性分析

用梯度稀释的四个血清型登革病毒培养上清及乙脑病毒和黄热病毒培养液进行检测，结果如表5显示，本发明试剂盒仅特异地检测4个血清型登革病毒培养上清，与其它黄病毒属的病毒如乙脑病毒及黄热病毒均不发生交叉反应。说明建立的双抗体夹心抗原捕获ELISA检测具有登革病毒特异性。

表5 本发明试剂盒检测登革病毒的特异性鉴定

4、临床试验

首先将临床血清标本用1.5M甘氨酸(PH2.8)进行预处理使NS1与血清中的抗体形成的复合物解离，从而释放游离的NS1抗原，再用1.5M Tris-Hcl(PH9.7)中和后用上述建立的方法进行检测。

(1)本发明试剂盒检测正常人血清标本：

本发明的试剂盒检测了552例正常人血清，用此检测结果确定本方法的临界值。对检测值进行分析，计算得平均值为0.06，标准差为0.026，以平均值加上3个标准差作为本方法的检测临界值即：0.06+0.026×3＝0.138，以大于或等于临界值作为判断检测值阳性标准，552例正常人血清标本检测到1例为弱阳性(0.502)，可确定本方法的特异度为99.8％。

(2)本发明试剂盒检测DV1感染病人急性期血清

本发明的试剂盒检测了308例可能为DV1感染患者急性期血清，这些血清标本经MAC-ELISA确定为DV IgM/IgG抗体阳性，同时与商品化抗原检测试剂盒“pan-E DENGUEEARLY ELISA”进行比较。本发明试剂盒检测的这308例血清，其中阳性的有291例，阳性率达94.5％(291/308)，商品化试剂盒“pan-E DENGUE EARLY ELISA”检测结果显示，其中阳性的标本为285例，阳性率为92.5％(285/308)。

表6 本发明试剂盒与pan-E DENGUE EARLY ELISA试剂盒检测临床标本的比较

Figure DEST_PATH_GA20176706200910040560901D00071

(3)本发明试剂盒检测临床标本的灵敏度分析

本发明试剂盒通过对27例经梯度稀释的DV1病人血清标本进行检测，同时以商品化试剂盒“pan-E DENGUE EARLY ELISA”(Panbio，Australia)进行同步检测比较，操作步骤按照试剂盒说明书进行。结果表明，商品化试剂盒对DV1病人血清标本检测的最高稀释度为1∶1280，而本发明试剂盒检测的最高稀释度可达1∶5120，是商品化试剂盒的4倍，进一步验证了前面检测登革病毒培养上清的灵敏度实验结果(表7)，根据统计学分析，两个试剂盒检测DV1病人血清标本的敏感性具有明显的统计学差异(P＜0.05)。

表7 本发明试剂盒检测临床标本的灵敏度分析

Figure DEST_PATH_GA20176706200910040560901D00072

例2

1、本发明试剂盒由以下试剂组成：

(1)包被抗体2E8A5、DV2-M6和4B14A1的微孔反应板；

(2)样品处理液：由样品处理液A和样品处理液B组成，其中A为1.5M甘氨酸溶液(PH2.8)，B为1.5M Tris-Hcl溶液(PH9.7)；

(3)生物素标记的单抗3B1A15；

(4)辣根过氧化物酶标记的亲和素，购自Zymed公司；

(5)浓缩洗液：含有2％Tween-20的20×PBS，即1L溶液中含有4.56g NaH₂PO₄，58.02gNa₂HPO₄.12H₂O，175.3g NaCl，15磅20min高压灭菌后，加入20ml Tween-20搅匀，使用时20倍稀释；

(6)阳性对照：DV NS1抗原1∶1000稀释液；

(7)阴性对照：含O.1％Tween-20的10mM PH7.4PBS，即1L溶液中含有4.56g NaH₂PO₄，58.02g Na₂HPO₄.12H₂O，175.3gNaCl，15磅20min高压灭菌，20倍稀释后加入0.1％Tween-20；

(8)显色液：由显色液A和B组成，使用时取二者等量混匀使用。其中显色液A、B的组成成分如下：

显色液A：

将0.89g柠檬酸和0.16g EDTA二钠溶于1000ml水中，115℃30min后，降至90℃后加TMB 0.25g，摇匀于4℃避光保存；

显色液B：

将9.33g柠檬酸和14.6g EDTA二钠溶于1000ml水中，115℃30min后，降至90℃后加0.75％过氧化氢尿素12.8ml，摇匀于4℃避光保存；

(9)终止液：1M H₂SO₄。

上述试剂中，单抗2E8A5、DV2-M6和4B14A1的制备方法、包被单抗组合2E8A5、DV2-M6和4B14A1的微孔反应板的制备方法同例1；生物素标记的单抗3B1A15的制备方法为：将2.2mg生物素溶解于0.5ml蒸馏水中，取其30μl加入到1ml单抗DV2-M14(浓度为2mg/ml)中，4℃静置2h后装入透析袋中，于PBS中4℃透析过夜，换液三次。收集结合物加入终浓度50％甘油保护剂，最后用磷酸盐缓冲液稀释500倍，即为工作液。

2、使用方法：

取待测的样品50μl，加入样品处理液A 50μl，混匀后置37℃1h，再加样品处理液B 50μl混匀，加入单抗组合2E8A5、DV2-M6和4B14A1包被的聚苯乙烯96孔微量测试板中，同时设阴性对照和阳性对照，37℃温育1h，浓缩洗涤液20倍稀释后洗涤板条，洗板五次后，加入1∶500稀释的生物素标记的单抗3B1A15，100μl/孔，室温30min，同上洗板五次后，加入1∶1000稀释的辣根过氧化物酶标记的亲和素，100μl/孔，室温30min，同上洗板八次后加显色液(显色液A和B等量混合，现用现配)，100μl/孔，室温避光10min后，加入终止液，100μl/ 孔，终止反应。

3、结果判定：以空白孔调零，于450nm波长测定吸光度(A值)。阳性对照平均值≥0.50，阴性对照平均值≤0.10，实验成立。样品A值≥阴性对照A值平均值×2.1，则判为阳性，反之为阴性。

例3

1、本发明试剂盒由以下试剂组成：

(1)包被单抗2E8A5、DV2-M6和4B14A1的微孔反应板；

(3)碱性磷酸酶标记的单抗3B1A15；

(4)浓缩洗液：含有2％Tween-20的20×PBS，即1L溶液中含有4.56g NaH₂PO₄，58.02gNa₂HPO₄.12H₂O，175.3g NaCl，15磅20min高压灭菌后，加入20ml Tween-20搅匀，使用时20倍稀释；

(5)阳性对照：DV2NS1抗原1∶1000稀释液；

(6)阴性对照：含0.1％Tween-20的10mM PH7.4PBS，即1L溶液中含有4.56g NaH₂PO₄，58.02g Na₂HPO₄.12H₂O，175.3g NaCl，15磅20min高压灭菌，20倍稀释后加入0.1％Tween-20；

(7)显色液为PNPP(购于PIERCE公司)，以10mg PNPP溶于10mM二乙醇胺溶液中；

(8)终止液：2M NaOH溶液。

上述试剂中，单抗2E8A5、DV2-M6和4B14A1的制备方法、包被单抗组合2E8A5、DV2-M6和4B14A1的微孔反应板的制备方法同例1；碱性磷酸酶标记的单抗3B1A15的制备方法为：采用戊二醛法，即取碱性磷酸酶5mg溶于1ml抗体(2mg/ml)溶液中，在10mM PBS(PH7.2)透析24h，期间更换透析液3次，加入2.5％的戊二醛20μl，室温静置2h，在10mM PBS(PH7.2)透析12h，期间更换透析液3次，在50mM Tris-HCl溶液(PH8.0)中透析12h，期间更换透析液3次，用含1％BSA的Tris-HCl溶液(PH8.0，含0.02％NaN3)稀释至4ml，加入等量60％中性甘油溶液，混匀后分装，-80℃冻存备用。

2、使用方法：样品处理液处理各种待测的样品后，加150μl于2E8A5、DV2-M6和4B14A1包被的聚苯乙烯96孔微量测试板中，同时设阴性对照和阳性对照，37℃温育1h，浓缩洗涤液20倍稀释后洗涤板条，洗板四次后，加入酶结合物，150μl/孔，37℃30min，同上洗板八次后，加显色液PNPP，150μl/孔，室温避光30min后，加入终止液，100μl/孔，终止反应。

3、结果判定：以空白孔调零，于405nm波长测定A值。阳性对照平均值≥0.50，阴性对照平均值≤0.10，实验成立。样品A值≥阴性对照A值平均值×2.1，则判为阳性。反之为阴性。

Claims

1.一种检测登革病毒NS1抗原的免疫诊断试剂盒，该试剂盒包括捕获抗体和与标记物结合的检测抗体，其特征在于所述的捕获抗体是由质量比为1∶1∶1的单抗2E8A5、单抗DV2-M6和单抗4B14A1组成，其中单抗2E8A5由保藏号为CCTCC-C200855的杂交瘤细胞株分泌，单抗4B14A1由保藏号为CCTCC-C200857的杂交瘤细胞株分泌，单抗DV2-M6由保藏号为CCTCC-C200736的杂交瘤细胞株分泌；所述的检测抗体是单抗3B1A15，由保藏号为CCTCC-C200859的杂交瘤细胞株3B1A15分泌；所述的标记物是生物素、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、胶体金或荧光素。

2.权利要求1所述的试剂盒，其特征在于该试剂盒是一种基于双抗体夹心ELISA方法的酶联免疫诊断试剂盒，由包被了单抗2E8A5、单抗DV2-M6和单抗4B14A1的微孔反应板、样品处理液、标记了辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的单抗3B1A15、阳性对照物、阴性对照物、浓缩洗液、显色液和终止液组成，其中所述的显色液中含有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的底物。