CN102161983B - Ⅰ-iv型登革病毒ns1单克隆抗体杂交瘤细胞株及其试剂盒 - Google Patents
Ⅰ-iv型登革病毒ns1单克隆抗体杂交瘤细胞株及其试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了Ⅰ-IV型登革病毒NS1单克隆抗体杂交瘤细胞株，即小鼠杂交瘤细胞株3H06、单克隆抗体及检测登革病毒的试剂盒。小鼠杂交瘤细胞株3H06，保藏号为CCTCCNO:C201105。所分泌的抗体为抗Ⅰ-IV型登革病毒NS1抗原的型交叉单克隆抗体，并应用其所分泌的单克隆抗体开发了一种快速检测登革病毒抗原NS1的免疫诊断试剂盒。该诊断试剂盒包括96孔微量反应板、捕获抗体、检测抗体、阳性参照物、阴性参照物、浓缩洗涤液、显色液及终止液。该试剂盒能特异性地检测Ⅰ-IV型登革病毒NS1抗原，与其他黄病毒属病毒抗原无交叉反应。操作时采用一步法。与同类商品化试剂盒同时检测健康人血清和登革病毒病人血清，其敏感度与特异性大致相当。但与传统商品化试剂盒相比，简化了操作流程，缩短了检测时间，尤其适合批量快速诊断。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种Ⅰ-IV型登革病毒NS1单克隆抗体杂交瘤细胞株及其所分泌的单克隆抗体的制备，以及用于检测登革病毒病的试剂盒。
背景技术
登革病毒是一组单链RNA病毒，属黄病毒属，黄病毒家族。成熟的登革病毒颗粒呈球形，由包膜、衣壳和核糖核酸组成。登革病毒RNA大小约11kb，包含有一个开放读码框，编码三种结构蛋白（核蛋白C、膜蛋白M和包膜蛋白E）和七种非结构蛋白（NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5）。根据E蛋白免疫原性的差异，可将登革病毒分为四个血清型，各型之间存在有交叉反应。其中登革病毒的非结构蛋白1(nonstructural protein 1，NSl)是一种相对保守的糖蛋白，分子量约48kDa，常以二聚体形式存在。NS1蛋白大量存在于感染细胞的表面，在病毒的装配和成熟和病理作用上有重要作用。NS1蛋白具有较强的免疫原性，可刺激宿主机体产生较高滴度的特异性抗体。并且在登革病毒感染的早期（1-3天）患者血中即存在高浓度的NS1抗原，因此检测急性期病人血清中的NS1抗原可用于登革病毒感染的早期诊断。
登革病毒病是蚊媒传播的传染病，主要传播媒介为埃及伊蚊和白纹伊蚊，全球约有25亿人居住在登革热流行区域。东南亚，大洋洲和美洲约有9.75亿农村人口居住在热带亚热带地区，非洲、地中海东部的感染人数逐年增加。据统计，每年超过5000万感染者中约有50万住院病例发展为登革出血热，儿童占多数，死亡率超过5%。据世界卫生组织报告近年来登革热/登革出血热病例增加迅速，1990-1999年有479,848报告病例，2000-2004年增加到925,896例。2001年全球有69个国家报告登革病例。2002年，仅美洲就有100万登革感染者。近年登革热地理流行区也在逐年扩大，所以登革热已经成为严重的全球性公共卫生问题，严重威胁着人类的健康。另外登革热临床表现复杂多样、传播迅速、发病率高、人群易感染，严重影响了人们的生活质量和身体健康。目前对登革病毒感染仍缺乏疫苗及特效药物治疗，因此加强登革病毒致病机制研究、加强登革病毒疫苗的研制及登革病毒快速诊断试剂盒的制备等对登革热的流行和预防控制有着非常重要意义。
目前诊断登革病毒感染主要有以下方法：病毒分离、病毒核酸检测、血清学检查及抗原分离。病毒分离虽然是感染登革病毒的金标准，但是诊断周期较长，病毒核酸检测通常用 RT-PCR，但是诊断成本较高，实验条件要求严格，故以上两种检测均不适合于常规临床诊断。血清血检查包括检查登革病毒特异性IgG和IgM，目前常用的商业化试剂盒MAC-ELISA就是该种方法，但是不适合于早期诊断，因为初次感染登革的病人在5-10天方达到可检测水平IgM，对于继发感染登革的病人4-5天后才可检出特异性IgG抗体，并且由于4个血清型登革病毒之间以及与其它病毒属间存在血清学交叉反应，特别是接种乙型脑炎病毒疫苗的人群易发生假阳性反应。所以检测登革病毒特异性抗原成为许多科研工作者关注的焦点。
NS1蛋白在早期感染登革的病人血清中即可检测到，所以发展NS1检测试剂盒对于早期诊断登革感染具有重要意义，并且已经有成熟的商业化试剂盒上市，Dengue Early ELISA test kit (Panbio, Queensland, Australia)和Platelia Dengue NSl Ag kits (Bio-Rad, France)就属于这种NS1抗原检测法。但是这些试剂盒采用常规的ELISA 方法，操作步骤较多，价格较昂贵，所以我们仍然需要发展更加方便迅速，适宜大规模使用的诊断试剂盒，以此达到早期快速诊断诊断登革感染的目的，使病人及早接受干预治疗，降低发展为登革出血热/登革休克综合征的风险。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种用于检测Ⅰ- Ⅳ型登革病毒NS1抗原的免疫诊断试剂盒，该试剂盒能够早期快速诊断登革病毒。
本发明的用于检测Ⅰ- Ⅳ型登革病毒NS1抗原的免疫诊断试剂盒包括：
96孔微量反应板、捕获抗体、检测抗体、阳性参照物、阴性参照物、浓缩洗涤液、显色液及终止液；
所述捕获抗体为NS1兔多抗；
所述检测抗体为Ⅰ-IV型登革病毒NS1单克隆抗体杂交瘤细胞株，即小鼠杂交瘤细胞株3H06分泌的单克隆抗体，杂交瘤细胞3H06，于2011年2月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏号为CCTCC NO: C201105。
在上述免疫诊断试剂盒中，所述NS1兔多抗的制备方法为：采用登革病毒重组NS1加弗氏不完全佐剂，免疫新西兰大白兔，然后分离兔血清进行鉴定，并浓缩纯化得到。
在上述免疫诊断试剂盒中，所述捕获抗体包被在96孔微量反应板中，并同时加入冻干HRP标记的检测抗体。
本发明利用目前已经较为成熟的小鼠杂交瘤及单克隆抗体制备技术，建立了能够稳定分泌单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株3H06。该细胞株用重组登革病毒NS1蛋白免疫Balb/c小鼠，三次免疫后，取小鼠脾脏细胞同小鼠骨髓瘤细胞SP20融合，然后用HAT选择性培养基筛选得到。然后用ELISA方法筛选到与登革病毒四个血清型NS1蛋白均具有高亲和力，且与乙型脑炎病毒无交叉反应的细胞株。所分泌的抗体为抗Ⅰ- IV型登革病毒NS1抗原的型交叉单克隆抗体。该两种单克隆抗体与乙型脑炎病毒的NS1抗原无交叉反应。
本发明应用小鼠杂交瘤细胞株3H06所分泌的单克隆抗体，对传统的双抗体夹心ELISA方法进行改良，开发了一种快速检测登革病毒抗原NS1的免疫诊断试剂盒。本发明在已有技术优势的基础上进行优化改良，直接检测登革病毒的NS1抗原，并减化了操作步骤，制备成具有较高灵敏度和特异性，使用方便的快速免疫诊断试剂盒，达到早期诊断登革病毒感染的目的。
本发明中，采用的标记物及显色液为市售的辣根过氧化物酶（简称HRP）和四甲基联苯胺(TMB)以及H2O2。HRP标记到抗体上后不会影响抗体的活性，并可以进行定量分析。H2O2经HRP作用后产生O2 -，还原型TMB作为供氢体，极易被O2 - 氧化，氧化型TMB溶液由无色变为蓝色。该试剂盒中所述浓缩洗涤液和终止液均为双抗体夹心法中所使用的常规试剂。所述阳性参照物为登革病毒重组NS1蛋白，购于美国Genway公司，所述阴性参照物为正常人稀释血清。
本发明试剂盒是一种基于双抗体夹心ELISA方法的检测试剂盒，所述捕获抗体经ELISA和间接免疫荧光法检测，证实是与登革病毒四个血清型NS1反应的多克隆抗体。所述检测抗体与四个血清型登革病毒NS1特异性结合，但与同为黄病毒属的乙型脑炎病毒无结合反应。敏感性、特异性实验表明：本发明检测登革病毒敏感性与同类试剂盒大体相当，并且与乙型脑炎病毒无交叉反应。本发明的检测步骤采用一步法，即加样、孵育、洗板和加底物显色。与传统ELISA检测相比之下，检测时间则缩短约30-60分钟。省略了3-6步操作步骤，减低了人为操作带来的误差。
具体实施方式：
1、免疫原
Ⅱ型登革病毒重组NS1抗原(本实验室制备)，加弗氏佐剂(Sigma-Aldrich, Inc., Saint Louis, MO., USA)，以搅拌法混匀。
2、多克隆抗体的制备和纯化
（1）兔抗登革NS1多克隆抗体的制备
本发明中用于免疫新西兰大白兔购于中山大学医学院实验动物中心。成年雄性新西兰白兔，颈背部皮下多点注射，每次重组NS1蛋白用量为1mg/只，首次免疫间隔2周，之后免疫间隔1周，共免疫4次。首次免疫加弗氏完全佐剂，第二次、第三次免疫加弗氏不完全佐剂。最后一次加强免疫不加佐剂，静脉注射NS1抗原。以双向免疫扩散实验检测抗体的效价，一般可达32以上，即可从耳中央静脉采血，室温自然凝固，然后放置4℃过夜，待凝块收缩。吸取血清，加入叠氮化钠至终浓度0.2‰，暂时存放于4℃。
（2）多克隆抗体的纯化与保存
采用DEAE-纤维素离子交换层析法纯化特异性IgG抗体。具体操作如下：DE52纤维素经酸、碱处理，0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl平衡。将层析柱固定于滴定架上，柱底垫一圆形尼龙纱，出口接一细塑料管并关闭出水。将浸泡于0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl中的DE52纤维素沿玻璃棒倒入柱中，待DE52自然沉降3～5cm高时，吸除0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl，或松开出水口螺旋夹，控制流速1～2ml/min，同时连续加入DE52纤维素至所需高度。待DE52纤维素完全沉降后，柱面放一圆形滤纸片。松开出水口螺旋夹，以0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl平衡，控制流速为15滴/min，待流出液与洗脱液之pH值达到一致时，停止平衡。将多抗血清装入透析袋里，置4℃冰箱，0.01mol/L pH8.6 Tris-Cl透析过夜。用吸管吸去柱面液体，以毛细吸管沿柱壁加入样品，样品体积相当于柱床体积的1％～2％，蛋白浓度为50～70mg。启开出水口螺旋夹使样品缓慢进入柱床内，并用少量洗脱液清洗柱壁；待液体进入柱床后，以0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl洗脱，控制流速为14～16滴/min。分步收集器收集，人工收集，以紫外分光光度计分别测定每管280nm OD值，描绘洗脱液峰。将洗脱液的280nm OD上峰段与下峰段各管分别合并，装入透析袋，以PEG浓缩至所需体积。以BCA法定量后的多克隆抗体加入终浓度50%的甘油于-80℃保存。
（3）多克隆抗体的与登革病毒NS1抗原反应性鉴定：
① 间接ELISA法：
分别用四个血清型重组DV NS1抗原(GenWay Biotech, Inc., San Diego, CA., USA)和天然的DV抗原包被微孔板，4℃过夜后洗板，每孔加入约350ul PBST洗5次，加入5%BSA 200 ul/孔，37℃ 2h以封闭多余的蛋白结合位点。每孔加入约350ul PBST洗5次。每孔加入纯化稀释多克隆抗体100ul，37℃温育1h，弃上清，洗板5次。再加入1：5000稀释的HRP标记羊抗兔lgG 100ul/孔，37℃温育30min，弃上清，洗板5次。每孔加显色液A液和B液各1滴，室温避光显色5-15min，加2M H2S04终止显色反应，测A450nm。表1和表2中的数据是本专利发明的兔抗登革病毒 NS1多克隆抗体与四个血清型病毒的NS1及天然病毒的抗原抗体反应情况：
表1 多克隆抗体与重组NS1抗原、天然登革病毒和乙型脑炎病毒抗原反应的间接ELISA
| DV1 | DV2 | DV3 | DV4 | 乙型脑炎病毒 | |
| 重组NS1 | 1.577 | 2.104 | 2.001 | 1.973 | - |
| 天然病毒抗原 | 1.459 | 1.976 | 1.893 | 1.485 | 0．0973 |
表2 未免疫兔血清与重组NS1抗原、天然登革病毒和乙型脑炎病毒抗原反应的间接ELISA
| DV1 | DV2 | DV3 | DV4 | 乙型脑炎病毒 | |
| 重组NS1 | 0.0548 | 0.0769 | 0.0836 | 0.07 | - |
| 天然病毒抗原 | 0.0764 | 0.09 | 0.0624 | 0.042 | 0.083 |
② 间接免疫荧光法：
首先制备抗原片：用四种血清型的登革病毒感染长成单层的C6/36细胞，当病变++ ～ +++ 时，将细胞轻轻吹下，用0.01M PBS，pH7.4洗两次后，用PBS调整至所需浓度滴片。放入湿盒内，37℃2h。将抗原片放入盛有冷丙酮的玻片缸内，-20℃放置15min，取出抗原片晾干。每孔滴加10ul稀释的多克隆兔抗血清，同时设阳性对照（4G2）和阴性对照（未免疫兔血清）及空白对照（PBS），并设立未感染病毒的C6/36抗原片对照。将抗原片放入湿盒内，37℃1h，用0.01M PBS洗3次，晾干，每孔滴加5ul用0.25%伊文思蓝1:2000稀释FITC标记的羊抗小鼠IgG，将抗原片放入湿盒内，37℃45min，用0.01MPH7.4洗三遍，晾干，50%甘油盐水封片，荧光显微镜下观察荧光强度并记录。结果见表3：
表3 兔多克隆抗体的免疫荧光检测结果
| DV1 | DV2 | DV3 | DV4 | 未感染病毒的C6/36抗原片 | |
| 兔抗血清 | +++ | ++++ | +++ | ++++ | （—） |
| 4G2 | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ | （—） |
| 未免疫兔血清 | （—） | （—） | （—） | （—） | （—） |
| PBS | （—） | （—） | （—） | （—） | （—） |
3、鼠单克隆检测抗体的制备
（1）免疫小鼠
免疫动物为购于中山大学医学院实验动物中心的8～10周龄雌性Balb/c小鼠。免疫方案为3次免疫，相邻两次免疫间隔14天。免疫途径为皮下多点注射，腹腔注射。第一次免疫用弗氏完全佐剂与重组NS1蛋白0.4g共同乳化，第2次及第3次免疫用弗氏不完全佐剂与重组NS1蛋白0.4g共同乳化乳化。末次免疫后3～4 天，常规分离小鼠脾细胞。
（2）骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备
① Sp20细胞在含8氮杂鸟嘌呤( 0.02 mg/ml)和含15% FBS的RPMI 1640培养液中筛选培养1周后，再在含15% FBS普通RPMI 1640培养液中培养2周。在细胞融合的前一天用新鲜培养基调细胞浓度为2′105/ml，次日一般即为对数生长期细胞，即可用于细胞融合。
② 饲养细胞的制备：将Balb/c小鼠拉颈处死，于75%乙醇中浸泡消毒5min。无菌环境下打开小鼠腹腔，不剪开腹膜，将无血清RPMI1640培养液注入小鼠腹腔，轻揉腹部数次，再用该注射器反复抽吸数次后吸出液体，1000rpm离心10min，弃上清。将细胞沉淀以HAT培养液重悬，计数，调节细胞浓度至2′105/ml。
（3）杂交瘤细胞的制备和鉴定
拉颈处死免疫小鼠，置于酒精中浸泡5 min消毒，无菌条件下先剪开腹部皮肤暴露腹膜，不能接触腹膜,无菌取出脾脏，铜网碾磨得到细胞悬液，以无血清1640培养液洗涤1次，离心后弃上清，用无血清1640培养液重悬。台盼蓝染色计数活细胞百分比，分别吸取1′108个脾细胞与3′107个Sp20细胞混匀。离心后弃上清，置37℃水浴，缓慢加入500g/L的PEG4000 0.7 ml，进行细胞融合约2 min。加入无血清1640培养液25 ml。低速离心后弃上清，用10 ml含HAT的1640培养液重悬融合细胞，按每孔约0.1 ml加入含饲养细胞的96孔培养板中培养，每日观察。融合后的细胞经过HAT的筛选，生长约10～12 d后能进入对数生长期。取培养上清进行ELISA检测，阳性孔细胞则进一步扩大培养为克隆化准备，同时冻存备份。通过有限稀释法将融合细胞单克隆化，再ELISA检测，与四个血清型反应均为阳性株细胞进一步克隆化，反复进行。有限稀释过程如下：对融合细胞进行细胞记数，然后稀释到约100个/10 ml滴加96孔板，每孔0.1 ml，即每孔约1个细胞。培养时严密观察记录，只保留I个细胞克隆生长孔。将筛选到的杂交瘤细胞命名为小鼠杂交瘤细胞株3H06，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO: C201105。
（4）单克隆抗体腹水制备和纯化
① 腹水制备：Balb/c小鼠预处理：腹腔注射降植烷，0.5 ml/只。将筛选到的杂交瘤细胞株扩大培养，腹腔接种给预处理l0天的小鼠(1′107个/只)诱生腹水，约8～10 天后，小鼠腹部膨隆，大量腹水产生。注射器收取腹水，12 000 rpm离心30 min和0.45 um虑膜过滤除去杂质，获得腹水单克隆抗体，加入叠氮钠至终浓度为0.05%，分装后存放于4℃备用。
② 单抗纯化：本发明用蛋白A柱纯化抗体，具体操作如下：加入1/10体积的1 mol/LTris(pH8.0)调腹水抗体的pH值至8.0，将腹水抗体溶液通过蛋白A微球柱。这些柱中，每毫升的湿微球能结合大约10～20m1抗体(1个蛋白A微球分子结合2分子抗体)。记录装柱微球的体积。用10倍柱体积的100 mmol/L Tris (pH8.0)洗涤微球。用50mmol/L甘氨酸((pH3.0)洗脱微球柱，每次加入约1/2柱体积的缓冲液，分次加入。用含1/10柱体积的lmol/LTris(pH8.0)的试管收集洗脱液，将各管缓慢摇匀，使其pH值恢复至中性，将各收集管的抗体经SDS-PAGE后考马斯亮蓝染色。纯化的样品应有清晰的轻、重链带。
（5）单克隆抗体的特异性鉴定
① 间接ELISA法鉴定单克隆抗体的特异性
分别用四个血清型重组DV NS1抗原和天然的DV抗原包被微孔板， 4℃过夜后洗板，每孔加入约350ul PBST洗5次，加入5%BSA 200 ul/孔，37℃ 2h以封闭多余的蛋白结合位点。每孔加入约350ul PBST洗5次。每孔加入杂交瘤细胞培养上清100ul，37℃温育1h，弃上清，洗板5次。再加入1：5000稀释的HRP标记羊抗兔lgG100ul/孔，37℃温育30min，弃上清，洗板5次。每孔加显色液A液和B液各1滴，室温避光显色5-15min，加2M H2S04终止显色反应，测A450nm。表4和表5数据是本专利发明的单克隆抗体与四个血清型病毒的NS1及天然病毒的抗原抗体反应情况：
表4 小鼠单克隆抗体与重组NS1抗原、天然登革病毒和乙型脑炎病毒抗原反应的间接ELISA
| DV1 | DV2 | DV3 | DV4 | 乙型脑炎病毒 | |
| 重组NS1 | 2.445 | 3.452 | 2.752 | 3.113 | - |
| 天然病毒抗原 | 2.794 | 2.843 | 2.321 | 2.345 | 0.080 |
表5 SP20培养上清与重组NS1抗原、天然登革病毒和乙型脑炎病毒抗原反应的间接ELISA
| DV1 | DV2 | DV3 | DV4 | 乙型脑炎病毒 | |
| 重组NS1 | 0.050 | 0.038 | 0.041 | 0.074 | |
| 天然病毒抗原 | 0.062 | 0.038 | 0.069 | 0.067 | 0.064 |
② 间接免疫荧光法鉴定单克隆抗体的特异性
首先制备抗原片：用四种血清型的登革病毒感染长成单层的C6/36细胞，当病变++ ～ +++ 时，将细胞轻轻吹下，用0.01M PBS，PH7.4洗两次后，用PBS调整至所需浓度滴片。放入湿盒内，37℃2h。将抗原片放入盛有冷丙酮的玻片缸内，-20℃放置15min，取出抗原片晾干。每孔滴加10ul10倍倍比稀释的本发明中的杂交瘤细胞上清，同时设阳性对照（4G2）和阴性对照（SP20细胞上清）及空白对照（PBS），并设立未感染病毒的C6/36抗原片对照。将抗原片放入湿盒内，37℃1h，用0.01M PBS洗3次，晾干，每孔滴加5ul用0.25%伊文思蓝1:2000稀释FITC标记的羊抗小鼠IgG，将抗原片放入湿盒内，37℃45min，用0.01M数PBS洗3次，晾干，50%甘油盐水封片，荧光显微镜下观察荧光强度并记录。结果见表6：
表6 DV4 NSI单克隆抗体的免疫荧光检测结果
| DV1 | DV2 | DV3 | DV4 | 未感染病毒的C6/36抗原片 | |
| 杂交瘤3H06 | ++++ | ++++ | +++ | +++ | （—） |
| 4G2 | ++++ | +++ | ++++ | ++++ | （—） |
| SP20 | （—） | （—） | （—） | （—） | （—） |
| PBS | （—） | （—） | （—） | （—） | （—） |
4、本发明试剂盒的组成和制备
(1) 所用试剂的配制：
① 样品稀释液：由样品处理液A和样品处理液B组成，A液为1. 5M甘氨酸溶液 (pH 2.8)，B液为为1.5M Tris-HCl溶液 (pH 9.7)。
② 浓缩洗涤液：含有2% Tween-20的20×PBS，即1L溶液中含有4.56g NaH2P04，58. 02g Na2HP04·12H2O，175. 3g NaCl，120℃20min高压灭菌后，加入20ml Tween-20混匀，使用前用去离子水20倍稀释即为工作液。
③ 阳性对照：Ⅰ- Ⅳ登革病毒重组NS1抗原 1:1000稀释液。
④ 阴性对照：为1：50稀释的正常人血清。
⑤ 显色液：由A液和B液组成，临用前将二者等量混匀后使用。配制方法如下，ELISA 显色底物A：乙酸钠13.6g，无水柠檬酸1.6g，30% H2O2 0.3ml，加去离子水至500ml。ELISA 显色底物B：EDTA Na 0.2g，无水柠檬酸0.95g，甘油50ml， 10mg/ml TMB/DMSO 20ml, 加去离子水至500ml。均于4℃闭光保存。
⑥ 终止液：2M H2S04。
(2)所述辣根过氧化物酶标记的检测抗体具体制备方法如下：
本发明中采用改良过碘酸钠法：以下操作需避光进行。首先取5mg HRP溶于0.5ml双蒸水中，加入新鲜配制的0.06mol/L NaIO4水溶液(10ml双蒸水＋128mg NaIO4) 0.5ml，混匀后4℃放置30min。 取出加入0.16mol/L乙二醇水溶液 (10ml双蒸水+0.09ml乙二醇) 0.5ml。室温放置30min后加入含5mg纯化单抗的溶液1ml，混匀，并装入透析袋，对0.05mol/L，pH 9.5碳酸盐缓冲液缓慢搅拌4℃透析过夜，使之结合。次日加入NaBH4溶液 (5mg/ml) 0.2ml，混匀后4℃放置2h。在以上溶液中逐滴缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液，混匀，4℃10 000rpm离心30min，去上清，沉淀以少许0.02mol/L pH7.4 PBS液溶解，装入透析袋，以同样液体在4℃透析除盐过夜。次日取出，4℃10 000rpm离心30min除去不溶物，即得HRP－IgG结合物，加入0.02mol/L pH 7.4 PBS至5ml，ELISA法检测抗体效价后，加入等体积甘油，分装后-80℃保存。
(3)所述含包被兔多克隆抗血清和酶标抗体的96孔微孔板制备方法如下：
本发明采用多聚苯乙烯反应板，将兔抗NS1多克隆抗体用包被液（Na2CO3 1.5g，NaHCO3 2.9g溶于1L单蒸水中，调pH值至9.5）稀释至10ug/ml，每孔加入100ul，4℃过夜后洗板5次，弃掉孔内液体，每孔加入200ul 5% BSA/PBS，37℃ 2h，再重复洗板4次。每孔加入用0.01M PBS 1:2000稀释的HRP标记的本发明中的鼠单克隆检测抗体100ul，冻干过夜，次日小心取出用封板膜封板，-20℃储存。
5、应用本发明试剂盒检测血清样品中的四种血清型登革病毒NS1抗原
(1)检测方法：每步操作前将所需试剂及样品取出平衡至室温。取待测样品50ul加入50ul样品稀释液，小心取出封板膜，将样品稀释后加样品加入孔内，同时做阳性对照及阴性对照及空白对照，每个样品做三个复孔，37℃温育2h。浓缩洗涤液稀释为工作液后，每孔加入350ul洗板，共洗板5次。临使用前15min取出显色液，将A液和B液等体积混合，每孔加入100ul，室温避光显色5-15min，待阴性对照孔内溶液刚刚开始变蓝后，每孔加入50ul终止液终止显色。
(2)结果判定：以空白孔调零，于450nm波长测定吸光度（A值）。阳性对照平均值≥0.50，阴性对照平均值≤0. 10，实验成立。样品A值≥阴性对照A值平均值×2.1，则判为阳性，反之为阴性。
(3)本发明试剂盒检测相关病毒的特异性和灵敏度分析
选择PFU检测阳性的临床病人血清83份，健康成人阴性血清96份用本发明试剂盒及Panbio Dengue Early ELISA(Panbio，Australia)试剂盒进行检测。首先将患者血清进行2倍倍比稀释，用本发明试剂盒检测NS1，同时设阳性对照、阴性对照、空白对照，并用乙型脑炎病毒液及流感病毒液检测该试剂盒是否与其他病毒有交叉反应。每个滴度的样品或对照作三个复孔。另外用“DENGUE EARLY ELISA” NS1商品化试剂盒做同类试剂盒的平行对照，按照所附说明书操作。检测结果表明本发明与乙型脑炎病毒和流感病毒无交叉。表7为本发明试剂盒检测结果，表8为Panbio试剂盒检测结果。
表7 本发明试剂盒检测临床样本结果
| 阳性 | 阴性 | 合计 | |
| 患者血清 | 76 | 7 | 83 |
| 正常血清 | 1 | 95 | 96 |
| 合计 | 77 | 102 | 179 |
表8 Panbio Dengue Early Elisa试剂盒检测临床样本结果
| 阳性 | 阴性 | 合计 | |
| 患者血清 | 72 | 11 | 83 |
| 正常血清 | 1 | 95 | 96 |
| 合计 | 73 | 106 | 179 |
所以，本发明试剂盒检测敏感性为91.57%，Panbio试剂盒敏感性为86.75%。两试剂盒特异性均为98.96%。
Claims (4)
1.Ⅰ-IV型登革病毒NS1单克隆抗体杂交瘤细胞株，为小鼠杂交瘤细胞株3H06，于2011年2月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:C201105。
2.抗Ⅰ- IV型登革病毒NS1抗原的单克隆抗体，其特征在于由权利要求1的小鼠杂交瘤细胞株3H06分泌得到。
3.一种用于检测Ⅰ- Ⅳ型登革病毒NS1抗原的免疫诊断试剂盒，其特征在于包括：96孔微量反应板、捕获抗体、检测抗体、阳性参照物、阴性参照物、浓缩洗涤液、显色液及终止液；
所述捕获抗体为兔抗登革病毒NS1多抗；
所述检测抗体为权利要求2所述的单克隆抗体。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述捕获抗体包被在96孔微量反应板中，并同时加入冻干HRP标记的检测抗体。
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