CN101226196B - 一种检测ⅱ型登革病毒ns1抗原的免疫诊断试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测II型登革病毒抗原的免疫诊断试剂盒，该试剂盒包括包被单抗DV2-M6的微孔反应板、样品处理液、标记有标记物的单抗DV2-M14、阳性对照、阴性对照、浓缩洗液、显色液和终止液。该试剂盒中所用的单抗DV2-M6和单抗DV2-M14都能特异性结合II型登革病毒的NS1蛋白，与其他3种血清型登革病毒NS1无交叉反应，并且分别结合NS1不同抗原位点，检测II型登革病毒的NS1蛋白的灵敏度可高达3ng/ml，检测II型登革病毒感染细胞的培养上清的敏感度是试剂盒Pan-E Dengue Early ELISA test kit的8倍，大大提高了临床血清样本检测的灵敏度。

Description

一种检测Ⅱ型登革病毒NS1抗原的免疫诊断试剂盒

技术领域

本发明涉及一种医用配制品，具体涉及一种检测登革病毒的试剂盒。

背景技术

近半个世纪以来，由于旅游和贸易的显著增长、生态环境的改变、全球人口增长并向城市集中化以及全球气候变暖等因素，一些蚊媒传染病，特别是由登革病毒引起的登革热和登革出血热，其发病率在逐年上升，WHO统计每年发生登革病毒感染患者超过1亿人，50万人发展成为登革出血热，每年死亡人数超过25000人。目前，全球有25-30亿的人口生活在登革热疫区，将受到登革病毒感染的威胁。我国广东、海南、广西、云南和福建等省区随时可能发生地方性或输入性的爆发流行。因此，登革热已经成为了热带、亚热带地区的一个非常严重的公共卫生问题。

登革病毒有4个血清型：I型、II型、III型和IV型(简称DV1、DV2、DV3和DV4)，任何一种血清型的感染均可引起一系列的临床症状，包括隐匿性感染、典型登革热以及危胁生命的登革出血热或登革休克综合征。初次感染登革病毒对于同型病毒的再次感染可产生长久的免疫力，但4个血清型的登革病毒之间缺乏交叉免疫保护作用，因而生活在疫区的每一个人一生中都有可能面临4型登革病毒感染的危胁。流行病学调查结果显示第二次感染异型登革病毒是导致登革热患者发生登革出血热的首要危险因素，由于在一个地区存在不同血清型登革病毒的交替流行，人群普遍易感，这就更增加了登革出血热发生的可能性。

然而，人类对登革热的防治仍面临着许多难题，没有特异性的治疗药物，没有安全有效的疫苗，但及时采取临床救治措施可以大大减少登革出血热的发病率和死亡率，因此登革热的治疗很大程度上取决于早期感染的诊断。可是多数登革病毒感染者早期缺乏特异的临床表现，仅有发热、寒战等流感样症状，难以和其它发热疾病和出血热疾病区分，必须依赖实验室的诊断加以确认。

目前登革热的实验室诊断方法主要包括病毒分离、抗体检测和核酸检测。病毒分离是登革病毒感染实验室诊断和血清型鉴定的金标准，但该方法费时而且对于实验室的条件要求较高。尽管病毒核酸的检测方法比传统的病毒分离法更灵敏快速，但分子诊断操作相对繁琐，对技术水平要求较高，易发生实验室污染导致假阳性结果，而且其敏感性取决于探针或引物与基因靶序列同源性，往往因毒株变异、潜在突变等序列改变引起的假阴性结果。抗体检测试剂不能用于早期诊断，而且由于登革病毒4种血清型之间以及与其它黄病毒如日本脑炎病毒、黄热病毒、西尼罗脑炎病毒等存在血清学的交叉反应，特别是接种乙型脑炎病毒、黄热病毒疫苗的人群易发生抗体假阳性反应结果。

登革病毒中的非结构蛋白1(nonstructural protein 1，NS1)是一种相对保守的糖蛋白，分子量为45～50kDa，有膜型和分泌型两种形式，在感染细胞中高度表达，在登革病毒的研究中已经将它作为诊断登革热的靶抗原。由于NS1抗原同时拥有属特异性和型特异性决定簇，因此检测急性期病人血清中的循环NS1抗原可用于早期诊断登革病毒感染或者预警DHF的发生。目前已报道的几种检测登革病毒NS1的抗原捕获ELISA法，如Young P.R.等人报道的用兔抗II型登革病毒NS1多克隆抗体作为捕获抗体来检测II型登革病毒(Young P.R.，et al.J.Clin.Microbiol.2000；38：1053-1057.)以及用鼠抗I型登革病毒NS1和兔抗I型登革病毒NS1多克隆抗体分别作为捕获抗体和检测抗体来检测I型登革病毒(Alcon S.，et al.J.Clin.Microbiol.2002；40：376-381.)，但是这种方法都是在多克隆抗体的基础上建立的，在不同批次的抗血清中存在差异，导致实验室内部和不同实验室之间的结果往往不同，难以重复和实现实验室标准化；另一种是利用NS1的单克隆抗体来检测登革病毒，如商品化的试剂盒(Pan-E Dengue Early ELISA test kit，Panbio，Queensland，Australia；PLATELIATM DENGUE NS1AG，Bio-Rad，France)，该试剂盒含有抗I～IV型登革病毒NS1的单克隆抗体，通过ELISA方法来实现登革病毒感染的早期诊断，其敏感度、特异性和稳定性都有较大的提高。但本发明人进一步研究发现，该试剂盒对I～IV型的登革病毒的敏感度不同，分别为26.4PFU/0.1mL、46.8PFU/0.1mL、367.2PFU/0.1mL、5000PFU/0.1mL，而早期感染登革病毒的患者的血液样本中的病毒含量较低，用该试剂盒检测II型、III型和IV型的感染有可能会出现漏检。再者，该试剂盒不能区分四种血清型的登革病毒，由于不同的血清型的登革病毒感染所引起的临床症状是不同的，临床医师必须尽早确定哪种血清型的登革病毒感染，以便于快速采取有效治疗措施，因此，就需要及时确定感染的登革病毒的类型，该试剂盒无法实现这个目的。

发明内容

本发明要解决的技术问题是进一步提高检测II型登革病毒的敏感度。

本发明解决上述技术问题的技术方案是：

一种检测II型登革病毒NS1抗原的免疫诊断试剂盒，该试剂盒包括包被捕获抗体的微孔反应板、样品处理液、标记有标记物的检测抗体、阳性对照、阴性对照、浓缩洗液、显色液和终止液，其特征在于捕获抗体是单克隆抗体DV2-M6，检测抗体是单克隆抗体DV2-M14。

本发明试剂盒中，所述的单抗DV2-M6和单抗DV2-M14均是免疫球蛋白，能特异性结合II型登革病毒的分子量为45千道尔顿的非结构蛋白1(nonstructural protein 1，NS1)，其中单抗DV2-M6属IgG1，由杂交瘤细胞株DV2-M6分泌；单抗DV2-M14属IgG2b，由杂交瘤细胞株DV2-M14分泌。所述的杂交瘤细胞株DV2-M6和DV2-M14是用重组的NS1蛋白和天然的NS1蛋白交叉免疫小鼠，然后用免疫后的小鼠脾细胞和商品化的小鼠骨髓瘤细胞融合，最后用HAT筛选得到。所述的杂交瘤细胞株DV2-M6和DV2-M14已于2007年11月29日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号分别为C200736和C200737。

本发明试剂盒中，所述的标记物可以是生物素、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、胶体金、荧光素等，优选生物素。当本发明所述的检测抗体上结合的标记物为生物素时，本发明试剂盒还含有标记有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的亲和素。所述的亲和素能与生物素以1∶4的比例结合，起到放大检测信号的作用，进一步提高敏高度。

本发明试剂盒是一种基于双抗体夹心ELISA方法的检测试剂盒，其中所用的捕获抗体DV2-M6和检测抗体DV2-M14是从一组抗II型登革病毒的NS1蛋白的单克隆抗体中筛选出来的，能特异性结合II型登革病毒的NS1蛋白，分别结合不同的抗原结合位点，可以实现准确、快速地检测出II型登革病毒，而与其它I型、III型和IV型登革病毒以及乙型脑炎病毒、黄热病毒无交叉反应，且对II型登革病毒具有很高的敏感度，检测II型登革病毒的NS1蛋白的灵敏度可高达3ng/ml，检测II型登革病毒的敏感度是Pan-E Dengue Early ELISA test kit的8倍，大大降低了漏检的几率，有利于早期诊断早期治疗；此外，本发明试剂盒能特异地检测II型登革病毒，有利及时判断登革病毒感染的血清型和登革病毒的流行情况。

附图说明

图1是单抗DV2-M6和DV2-M14的免疫印迹图，其中A显示的是重组DV2NS1蛋白与杂交瘤细胞培养上清的反应，B显示的是天然DV2病毒中的NS1蛋白与杂交瘤细胞培养上清的反应，条带1为杂交瘤细胞株DV2-M6培养上清，条带2为杂交瘤细胞株DV2-M14培养上清，条带3为无关单抗杂交瘤细胞培养上清。

图2是实施例1所述的试剂盒检测II型登革病毒的NS1蛋白的标准曲线图，其中

为检测II型登革病毒的NS1蛋白的曲线，

为BSA对照。

图3是实施例1所述的试剂盒检测DV2感染病人血清中的DV2 NS1抗原和其他的病毒感染病人血清及正常人血清的结果，其中A为30例DV2感染病人急性期血清，B为301例DV1感染病人急性期血清和1例DV3感染病人急性期血清，C为50例出血热病人急性期血清，D为13例乙型脑炎病人急性期血清，E为18例20份钩端螺旋体感染病人急性期血清，F为49例麻疹病人急性期血清，G为504例正常人血清。

具体实施方式

例1

1、本发明试剂盒由以下试剂组成：

(1)包被单抗DV2-M6的微孔反应板；

(2)样品处理液：由样品处理液A和样品处理液B组成，其中A为1.5M甘氨酸溶液(PH2.8)，B为1.5M Tris-Hcl溶液(PH9.7)；

(3)生物素标记的单抗DV2-M14；

(4)辣根过氧化物酶标记的亲和素，购自Zymed公司；

(5)浓缩洗液：含有2％Tween-20的20×PBS，即1L溶液中含有4.56g NaH₂PO₄，58.02gNa₂HPO₄.12H₂O，175.3gNaCl，15磅20min高压灭菌后，加入20ml Tween-20搅匀，使用时20倍稀释；

(6)阳性对照：DV2NS1抗原1∶1000稀释液；

(7)阴性对照：含0.1％Tween-20的10mM PH7.4PBS，即1L溶液中含有4.56gNaH₂PO₄，58.02g Na₂HPO₄.12H₂O，175.3g NaCl，15磅20min高压灭菌，20倍稀释后加入0.1％Tween-20；

(8)显色液：由显色液A和B组成，使用时取二者等量混匀使用。其中显色液A、B的组成成分如下：

显色液A：

将0.89g柠檬酸和0.16g EDTA二钠溶于1000ml水中，115℃高压30min，降至90℃后加TMB 0.25g，摇匀于4℃闭光保存；

显色液B：

将9.33g柠檬酸和14.6g EDTA二钠溶于1000ml水中，115℃高压30min后，降至90℃后加0.75％过氧化氢尿素12.8ml，摇匀于4℃闭光保存；

(9)终止液：1M H₂SO₄。

上述试剂中，

A、所述的单抗DV2-M6和CCTCC-C200737的制备方法和鉴定结果：

a.免疫抗原的制备

本发明用于制备单克隆抗体的免疫原为基因重组DV2 NS1蛋白和已灭活天然的病毒抗原。基因重组DV2 NS1蛋白是用携带DV2 NS1蛋白基因的工程菌株为一种大肠杆菌菌株进行制备的，其制备按常规方法进行，经用镍-次氮基三醋酸金属亲和层析的方法进行纯化获得NS1抗原，详细的制备方法可参照使用手册。将NS1蛋白纯化后，以考马斯亮蓝(Coomassie)蛋白分析试剂(PIERCE，Cat，No.ED62976)定量。Western blot对纯化的重组蛋白鉴定结果显示，DV2免疫兔血清和小鼠抗his MAb均在分子量约45KDa处出现特异性的反应条带，与预测的DV2NS1分子量大小一致。已灭活天然的病毒抗原，是从DV2感染的病毒宿主细胞(C6/36，一种白蚊伊蚊细胞)获得。

b.免疫小鼠

取4-6周龄雌性BALB/c小鼠，第一次采用弗氏完全佐剂与等体积DV2NS1抗原混匀乳化，每只小鼠皮下多点注射30μg，以后每10天以弗氏不完全佐剂与天然的DV2抗原或重组的DV2NS1抗原交替免疫共4次后，于融合前3天每只小鼠腹腔注射DV2NS1抗原100μg进行加强免疫。

c.免疫血清抗体效价测定

建立间接ELISA法测定免疫血清抗体效价。配制1μg/ml重组NS1蛋白的50mM pH9.6碳酸盐缓冲液，包被聚苯乙烯微96孔板，100μl/孔，4℃过夜。次日，用含0.25％酪蛋白(Sigma)的封闭液300μl/孔4℃过夜，弃液并拍干后真空干燥2～12小时，用铝膜袋真空包装4℃保存，用于鼠免疫血清抗体效价测定。于第四次免疫后10天眼眶采血，鼠免疫血清用含0.1％BSA 10mM PBS以10³～10⁶倍稀释，加入96孔板，100μl/孔37℃30分钟，10mM PBS含0.1％Tween-20洗涤液洗板五次后，加入1∶1000倍稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗小鼠IgG(Sigma，INC.)，100μl/孔37℃30分钟，同上洗板后，加入TMB显色液，100μl/孔，室温避光显色10分钟，加100μl/孔1M H₂SO₂终止反应，测450nm吸光值，以免疫前小鼠血清作为阴性对照，以测定值与对照值之比≥2.1为阳性来判断免疫血清的抗体效价。

d.杂交瘤制备和筛选

选择血清抗体效价达1×10⁶的小鼠，于融合前3天腹腔注射DV2NS1抗原100μg。无菌取小鼠脾脏，制成脾细胞悬液与对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株NS-1按10∶1的比例混合，45％聚乙二醇(PEG，MW4000，Sigma)作用下进行融合。按下述步骤将聚乙二醇溶液加入细胞。在37℃水浴中，在1min内缓慢加入1.0ml PEG，边加边轻轻摇匀，分别于1min、2min、3min、4min、5min内加1ml、2ml、3ml、4ml、5ml无血清RPMI-1640培养基终止融合，最后加入10ml含15％胎牛血清的RPMI-1640培养基，室温800rpm离心5min，弃上清，用60ml含15％胎牛血清的RPMI-1640培养基轻轻悬起细胞。将此细胞悬液加入6块96孔培养板上，在二氧化碳培养箱中温度为37℃、5％CO2的培养箱中。次日于每孔加入100μl含次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶脱氧核苷(HAT，Sigma)筛选培养基。以后每3天用此筛选培养基给培养物换液一次，直到细胞克隆形成。

为检测产生抗体克隆的存在，用上述间接ELISA法检测细胞培养上清。选择强阳性杂交瘤细胞进行了克隆化，用有限稀释法连续克隆化2～3次，共获得一组稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株，其中包含本发明所述的DV2-M6和DV2-M14。将克隆化后阳性率达100％的细胞扩增培养后液氮冻存。

e.抗DV2NS1蛋白单克隆抗体亚类检测

用上述的间接ELISA法检测在本实施例中获得的阳性克隆以确定其产生的抗体亚类。即DV2NS1抗原包被微孔板，封闭后与杂交瘤细胞培养上清孵育，再分别与为1∶1000倍稀释HRP标记的兔抗小鼠不同亚类特异性免疫球蛋白，这些抗体包括兔抗小鼠IgG1(美国ZYMEDLABORATORIES，INC，目录号61-0120)，兔抗小鼠IgG2a(同上，目录号61-0220)，兔抗小鼠IgG2b(同上，目录号61-0320)，兔抗小鼠IgG3(同上，目录号61-0420)，兔抗小鼠IgM(同上，目录号61-6820)。检测结果显示，杂交瘤细胞株DV2-M6为IgG1阳性，杂交瘤细胞株DV2-M14为IgG2b阳性。

f.抗DV2NS1蛋白单克隆抗体腹水的制备和抗体纯化

采用体内诱生法制备本发明中单克隆抗体，即在小鼠体内接种杂交瘤细胞制备腹水。简述如下：每只小鼠腹腔内注射0.5ml弗氏不完全佐剂(Sigma公司)，使瘤细胞能以腹水瘤形式在腹腔内生长。大约1～2周后，将2×10⁶个杂交瘤细胞悬浮于无血清RPMI 1640培养基中，注入小鼠腹腔。注射杂交瘤细胞大约1～2周后，用9号针头放腹水，可反复收集数次。腹水经离心澄清后4℃存放备用。

腹水抗体的纯化采用辛酸-硫酸铵沉淀法，腹水用60mM、pH5.0醋酸缓冲液稀释2倍，用0.1N盐酸调pH值至4.8，液体由清亮变混浊，室温下于30分钟内边搅拌边逐滴缓慢加入辛酸，为每毫升稀释前腹水加33μl辛酸，出现大量沉淀，4℃静置2小时，10000g，4℃离心30分钟，取上清，加入1/10体积的pH7.4100mM磷酸盐缓冲液，并用O.1N氢氧化钠调pH值至7.4，冰浴搅拌下缓慢加入硫酸铵，为每毫升液体加入0.277硫酸铵即为45％饱和度，4℃静置过夜，10000g，4℃离心30分钟，弃上清，沉淀溶于适量10mM磷酸盐缓冲液，用同样的液体，4℃透析过夜，换液三次。以考马斯亮蓝(Coomassie)蛋白分析试剂(PIERCE，Cat，No.ED62976)定量。测定浓度后的抗体加入终浓度50％的甘油于-80℃保存。

g.鉴定DV2NS1蛋白单克隆抗体的特异性

(1)间接ELISA法进行单克隆抗体特异性分析

分别用四个血清型重组DV NS1抗原和天然的DV抗原包被微孔板，按照常规的间接ELISA法进行检测。即在包被的微孔板中加入本专利发明的杂交瘤细胞培养上清液，37℃孵育1h，加入1∶1000稀释辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG(Sigma，Inc)，100μl/孔37℃孵育30min，加TMB显色液室温避光显色10min，加1M H₂SO₂终止反应，测450nm吸光值(A₄₅₀)。表1结果显示本专利发明的单克隆抗体与重组的DV2NS1抗原和天然的DV2抗原均产生很强的特异性的免疫反应，与另外三个血清型的重组DV NS1抗原和天然的DV抗原无交叉反应。

表1DV2NS1单克隆抗体与重组的DV2NS1抗原和天然的DV2抗原反应间接ELISA结果

	DV2NS1单克隆抗体		无关抗体
				DV2-M6	DV2-M14
	重组的DV1NS1抗原检测A450	0.062	0.088				0.074
重组的DV2NS1抗原检测A450				2.285	2.191	0.087
	重组的DV3NS1抗原检测A450	0.069	0.112				0.078
重组的DV4NS1抗原检测A450				0.061	0.067	0.065
	天然的DV1抗原检测A450	0.061	0.079				0.072
天然的DV2抗原检测A450				1.009	0.914	0.068
	天然的DV3抗原检测A450	0.065	0.095				0.059
天然的DV4抗原检测A450				0.06	0.115	0.073

(2)间接免疫荧光法进行单克隆抗体特异性分析

分别用DV1、DV2、DV3和DV4感染C6/36细胞，当有2/3细胞出现病变时，收集细胞，用预冷的1×PBS洗细胞二遍，然后将细胞滴于无菌干燥的玻片上，干燥后，制备成涂片，充分干燥，用冷丙酮固定10分钟后吹干，将杂交瘤细胞培养上清按不同的稀释度分别用10μl滴在不同的孔中，同时设阴性和阳性对照，置37℃水浴箱中，孵育45分钟后，取出将抗原片放于染色缸中用10mM pH7.2PBS洗3次，吹干，加入荧光标记羊抗小鼠IgG抗体，置37℃水浴箱中，孵育45分钟后，取出将抗原片洗涤4次，吹干，荧光显微镜下观察荧光图像，以荧光的强度和染色形态进行结果判定，检测抗体强度以(+～++++)计为阳性，抗体强度(±)和(-)计为阴性。如表2结果显色DV2 NS1单克隆抗体与固定在玻片上DV2抗原特异性结合，与另外三个血清型DV无交叉反应。

表2DV2NS1单克隆抗体的免疫荧光检测结果

	DV感染C6/36细胞涂片				正常C6/36细胞涂片
							DV1	DV2	DV3	DV4
CCTCC-C200736	-	++++	-	-							-
					CCTCC-C200737	-	+++	-	-	-

(3)免疫印迹分析法进行单克隆抗体特异性分析

将灭活DV2培养液或重组的DV2NS1蛋白，用2×SDS加样缓冲液稀释一倍，将样品加到10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中，电泳分离蛋白质，通过电洗脱使在凝胶上分离出来的蛋白质转印到硝酸纤维膜上，转印膜用含7％脱脂奶和3％BSA的10mM PBS于4℃封闭6小时，将转印膜装在专门的反应板中，分别加入杂交瘤细胞培养上清中，4℃反应过夜，用含有0.5％Tween 20的10mM PBS洗涤膜后，加入1∶500倍稀释的HRP标记羊抗鼠IgG，室温反应1小时，用同样的洗涤液洗涤膜后，DAB显色后，用去离子水终止显色。

免疫印迹结果如图1所示，本发明的2株单克隆抗体与重组DV2NS1蛋白特异性结合，结合蛋白相对分子质量为45千道尔顿。灭活DV2培养液在分子量为45千道尔顿同样可见一条很强的蛋白质免疫结合带，特异性蛋白质结合带与预测分子量为45千道尔顿相一致。说明获得的单克隆抗体能够特异性识别重组的和天然的DV2 NS1抗原。

h.单克隆抗体识别位点分析

重组DV2NS1蛋白以5μg/ml加入50mM pH9.6碳酸盐缓冲液，0.1ml/孔包被聚苯乙烯微96孔板，4℃过夜。次日，加入含0.25％酪蛋白(Sigma)的封闭液0.3ml/孔4℃过夜后，先加0.15mg/ml单抗50μl/孔，再加1∶500稀释的生物素标记单抗50μl/孔，室温孵育1小时，0.5％Tween 20的PBS洗涤五次后加入1∶1000稀释的HRP标记亲和素100μl/孔，室温孵育30分钟，洗涤后加入TMB显色液室温显色10分钟，测450吸光值。以单抗对同一生物素标记的单抗抑制为100％，以已知无关单抗对标记单抗的抑制为阴性对照，计算各单抗间的抑制率。即抑制率为(1-测定值/阴性对照值)×100。抑制率＞75％为相关，＞50％为不完全相关，＜50％为不相关，＜25％为完全不相关。表3结果显示2株单抗识别2个不完全相同的抗原位点。

表3抗DV2 NS1单克隆抗体识别抗原位点测定

单抗(0.15mg/ml)	生物素标记单抗稀释度为1∶500(抑制率％)
			DV2-M6	DV2-M14
	DV2-M6	90.9			0
DV2-M14			0	97.6

B、所述包被单抗DV2-M6的微孔反应板的制备方法：将本发明单抗DV2-M6用10mM磷酸盐缓冲液(pH7.6)稀释至10μg/ml，用150μl/孔包被聚苯乙烯96孔微孔板，于4℃过夜。拍干后，每孔加入300μl/孔的0.25％酪蛋白(Sigma)的封闭液，于4℃过夜以封闭非特异性结合位点。甩干板条，真空干燥12～24h，用铝膜袋真空包装4℃保存备用。

C、所述生物素标记的单抗DV2-M14的制备方法：将2.2mg生物素溶解于0.5ml蒸馏水中，取其30μl加入到1ml单抗DV2-M14(浓度为2mg/ml)中，4℃静置2h后装入透析袋中，于PBS中4℃透析过夜，换液三次。收集结合物加入终浓度50％甘油保护剂，最后用磷酸盐缓冲液稀释500倍，即为工作液。

2、使用方法：

取待测的样品33μl，加入样品处理液A 33μl，混匀后置37℃1h，再加样品处理液B 33μl混匀，加入CCTCC-C200736包被的聚苯乙烯96孔微量测试板中，同时设阴性对照和阳性对照，37℃温育1h，浓缩洗涤液20倍稀释后洗涤板条，洗板五次后，加入1∶500稀释的生物素标记的单抗DV2-M14，100μl/孔，室温30min，同上洗板五次后，加入1∶1000稀释的辣根过氧化物酶标记的亲和素，100μl/孔，室温30min，同上洗板八次后加显色液(显色液A和B等量混合，现用现配)，100μl/孔，室温避光10min后，加入终止液，100μl/孔，终止反应。

3、结果判定：以空白孔调零，于450nm波长测定吸光度(A值)。阳性对照平均值≥0.50，阴性对照平均值≤0.10，实验成立。样品A值≥阴性对照A值平均值×2.1，则判为阳性，反之为阴性。

4、本发明试剂盒检测DV2NS1的最高灵敏度的确定

将重组DV2-NS1从100ng/mL开始倍比稀释若干梯度，用上述建立的方法检测DV2NS1，同时稀释相同浓度的BSA作为阴性对照。以BSA的检测值作为标准，以检测值大于或等于相同BSA浓度检测值的2.1倍的DV2NS1的最低浓度作为本方法检测该抗原的灵敏度。结果如图2和表4所示，当重组DV2-NS1稀释至3.12ng/ml时，A₄₅₀＝0.175，是相应浓度的BSA对照(A₄₅₀＝0.05)的3.5倍，当重组DV2-NS1稀释至1.56ng/ml时，A₄₅₀＝0.116，是相应浓度的BSA对照(A₄₅₀＝0.05)的2.3倍，因此根据上述判断标准，本发明试剂盒检测DV2-NS1的最低浓度为1.56ng/ml，保守地说，灵敏度也可高达3ng/ml。

表4本发明试剂盒检测不同浓度重组DV2-NS1的结果

	蛋白稀释度(ng/ml)
									100	50	25	12.5	6.25	3.12	1.56
DV2-NS1/A450nm	3.000	2.123	1.255	0.631	0.321	0.175	0.116
								BSA/A450nm	0.050	0.050	0.049	0.049	0.051	0.050	0.050

5、本发明试剂盒检测相关病毒的特异性和灵敏度分析

通过对DV1、DV2、DV3、DV4进行空斑实验确定病毒滴度分别为2.7×10⁵PFU/mL、2.4×10⁵PFU/mL、4.7×10⁵PFU/mL、1.6×10⁶PFU/mL。采用上述建立的方法检测灭活的DV1、DV2、DV3、DV4，从1∶2开始倍比稀释多个梯度进行检测，即四种病毒检测的起始滴度分别为DV1为1.35×10⁴PFU/0.1ml，DV2为1.2×10⁴PFU/0.1ml，DV3为2.35×10⁴PFU/0.1ml，DV4为8×10⁵PFU/0.1ml。同时以检测四个血清型DV NS1抗原的商品化试剂盒“pan-EDENGUE EARLY ELISA”(Panbio，Australia)进行同步检测比较，操作步骤按照试剂盒说明书进行。本发明试剂盒的检测结果显示对DV2培养上清的检测灵敏度高达5.8PFU/0.1ml(即稀释4096倍时的病毒滴度)，而对其他病毒的检测结果均为阴性，如表5所示。商品化的pan-EDENGUE EARLY ELISA检测结果显示，对四个血清型的DV培养上清的检测敏感性不同，详见表6结果。商品化试剂盒对DV2培养上清的检测灵敏度为46.8PFU/0.1ml(1∶512稀释时的病毒滴度)，明显低于本发明的试剂盒检测DV2培养上清的灵敏度。

表5本发明试剂盒检测四个血清型DV培养上清结果

DV病毒

病毒稀释度

1∶64

1∶128

1∶256

1∶512

1∶1024

1∶2048

1∶4096

1∶8192

1∶16384

DV1

0.072/-a

0.074/-

0.072/-

0.072/-

0.073/-

0.069/-

0.071/-

0.072/-

0.073/-

DV2

3.0/+

3.0/+

2.029/+

1.039/+

0.552/+

0.324/+

0.208/+

0.144/-

0.106/-

DV3

0.075/-

0.072/-

0.073/-

0.073/-

0.072/-

0.071/-

0.073/-

0.072/-

0.073/-

DV4

0.073/-

0.072/-

0.072/-

0.073/-

0.074/-

0.072/-

0.074/-

0.073/-

0.073/-

Control

0.072/-

0.072/-

0.073/-

0.073/-

0.069/-

0.071/-

0.071/-

0.072/-

0.073/-

表注^a：此试剂盒的结果判定如下：样品检测值≥阴性对照平均值的2.1倍(计算为0.072×2.1＝0.151)为阳性，反之为阴性。

表6进口试剂盒pan-E DENGUE EARLY ELISA检测四个血清型DV培养上清结果

DV病毒

病毒稀释度

1∶2

1∶4

1∶8

1∶16

1∶32

1∶64

1∶128

1∶256

1∶512

1∶1024

DV1

133.3/+a

133.3/+

133.3/+

133.3/+

133.3/+

122.5/+

89.6/+

56.3/+

37.6/+

20.6/+

DV2

133.3/+

133.3/+

133.3/+

104.4/+

71.5/+

48.3/+

29.2/+

19.1/+

12.4/+

8.6/-

DV3

133.1/+

118.8/+

96.7/+

67.5/+

43.5/+

25.2/+

16.0/+

8.9/-

7.4/-

6.4/-

DV4

40.8/+

25.2/+

17.8/+

11.2/+

8.9/-

7.5/-

6.7/-

5.6/-

5.8/-

5.5/-

Control

5.8/-

5.6/-

5.2/-

5.8/-

5.8/-

5.7/-

5.4/-

5.8/-

5.2/-

5.6/-

表注：此试剂盒的结果判定如下：显示值＜9.0为阴性，显示值9.0-11.0为可疑阳性，显示值＞11.0为阳性。

6、本发明试剂盒的可重复性分析

通过将DV2培养上清按1∶100，1∶200，1∶400和1∶800四个稀释度加至正常人血清中对本方法的重复性和稳定性进行评价，结果显示，对以上四份样品同时检测10次的批内测定变异系数分别为3％，2.8％，2.7％和2.9％，对四份样品进行10次检测的批间测定变异系数分别为4.9％，5.6％，5.1％和4.3％。

7、临床试验

首先将临床血清标本用1.5M甘氨酸(PH2.8)进行预处理使NS1与血清中的抗体形成的复合物解离，从而释放游离的NS1抗原，再用1.5M Tris-Hcl(PH9.7)中和后用上述建立的方法进行检测。

(1)本发明试剂盒检测正常人血清

本发明的试剂盒检测了504例正常人血清，用此检测结果确定本方法的临界值。对检测值进行分析，计算得平均值为0.087，标准差为0.02，以平均值加上5个标准差作为本方法的检测临界值即：0.087+0.02×5＝0.187，以大于或等于临界值作为判断检测值阳性标准，504例正常人血清均为阴性，可确定本方法的特异度为100％。

(2)本发明试剂盒检测DV2感染病人急性期血清

本发明的试剂盒检测了30例的DV2感染患者急性期血清，这些血清均经病毒分离或RT-PCR确定为DV2阳性，同时与“pan-E DENGUE EARLY ELISA”进行比较。本发明建立的双抗夹心ELISA检测这30例血清，阳性的有25例，其中A₄₅₀值＞1.0的有19例，阳性率达83.3％(25/30)，见图3所示。商品化试剂盒“pan-E DENGUE EARLY ELISA”检测结果与我们的方法检测结果完全一致。

(3)本发明试剂盒检测相关病毒感染病人急性期血清

本发明的试剂盒检测了301例DV1感染患者急性期血清，这些血清同样经病毒分离或RT-PCR确定为DV1阳性，而且用我们前期工作中建立的检测DV1 NS1抗原的双抗体夹心ELISA检测为阳性；还检测了1例DV3感染患者急性期血清；检测了50例出血热、13例乙型脑炎、49例麻疹和18例20份钩端螺旋体感染患者急性期血清，这些血清样品均经血清凝集试验确诊。本发明试剂盒对以上血清的检测结果均为阴性，如图3所示，说明本发明的试剂盒特异性强。

例2

1、本发明试剂盒由以下试剂组成：

(1)包被单抗DV2-M6的微孔反应板；

(2)由样品处理液A和样品处理液B组成，其中A为1.5M甘氨酸溶液(PH2.8)，B为1.5M Tris-Hcl溶液(PH9.7)；

(3)辣根过氧化物酶标记的单抗DV2-M14；

(4)浓缩洗液：含有2％Tween-20的20×PBS，即1L溶液中含有4.56g NaH₂PO₄，58.02gNa₂HPO₄.12H₂O，175.3g NaCl，15磅20min高压灭菌后，加入20ml Tween-20搅匀，使用时20倍稀释；

(5)阳性对照：DV2NS1抗原1∶1000稀释液；

(6)阴性对照：含0.1％Tween-20的10mM PH7.4PBS，即1L溶液中含有4.56g NaH₂PO₄，58.02g Na₂HPO₄.12H₂O，175.3g NaCl，15磅20min高压灭菌，20倍稀释后加入0.1％Tween-20；

(7)显色液：由显色液A和B组成，使用时取二者等量混匀使用。其中显色液A、B的组成成分如下：

显色液A：

将0.89g柠檬酸和0.16g EDTA二钠溶于1000ml水中，115℃30min后，降至90℃后加TMB 0.25g，摇匀于4℃闭光保存；

显色液B：

将9.33g柠檬酸和14.6g EDTA二钠溶于1000ml水中，115℃30min后，降至90℃后加0.75％过氧化氢尿素12.8ml，摇匀于4℃闭光保存；

(8)终止液：1M H₂SO₄。

上述试剂中，单抗DV2-M6和CCTCC-C200737的制备方法、包被单抗DV2-M6的微孔反应板的制备方法同例1；辣根过氧化物酶标记的单抗DV2-M14的制备方法为：采用改良过碘酸钠法，将5mg辣根过氧化物酶搅拌溶解于1ml蒸馏水中，加入0.2ml新配0.1M过碘酸钠避光搅拌30min，置1mM pH4.4醋酸钠缓冲液中，4℃透析过夜，次日加入20μl 0.2M pH9.5碳酸盐缓冲液后加预先在0.01M碳酸盐缓冲液中pH 9.5透析平衡的10mg抗体，在室温避光轻轻搅拌2～3h，加入0.1ml新配4mg/ml硼氢化钠，4℃避光过夜，冰浴上避光搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵(硫酸铵用前先用氨水调pH至7.0-7.2)，置4℃6h。10000g，4℃离心30min，弃上清，沉淀溶于适量10mM磷酸盐缓冲液，用同样的液体，4℃透析过夜，换液三次。收集结合物加入2％BSA PBS 50％甘油保护剂，最后用磷酸盐缓冲液稀释1000倍使用。

2、使用方法：

样品处理液处理各种待测的样品后，加150μl于单抗CCTCC-C200736包被的聚苯乙烯96孔微量测试板中，同时设阴性对照和阳性对照，37℃温育1h，浓缩洗涤液20倍稀释后洗涤板条，洗板四次后，加入酶结合物(HRP标记的单抗CCTCC-C200737)，150μl/孔，37℃30min，同上洗板八次后，加显色液(显色液A和B等量混合，现用现配)，150μl/孔，室温避光10min后，加入终止液，100μl/孔，终止反应。

3、结果判定：以空白孔调零，于450nm波长测定A值。阳性对照平均值≥0.50，阴性对照平均值≤0.10，实验成立。样品A值≥阴性对照A值平均值×2.1，则判为阳性。反之为阴性。

例3

1、本发明试剂盒由以下试剂组成：

(1)包被单抗DV2-M6的微孔反应板；

(2)样品处理液：由样品处理液A和样品处理液B组成，其中A为1.5M甘氨酸溶液(PH2.8)，B为1.5M Tris-Hcl溶液(PH9.7)；

(3)碱性磷酸酶标记的单抗DV2-M14；

(4)浓缩洗液：含有2％Tween-20的20×PBS，即1L溶液中含有4.56g NaH₂PO₄，58.02gNa₂HPO₄.12H₂O，175.3g NaCl，15磅20min高压灭菌后，加入20ml Tween-20搅匀，使用时20倍稀释；

(5)阳性对照：DV2NS1抗原1∶1000稀释液；

(6)阴性对照：含0.1％Tween-20的10mM PH7.4PBS，即1L溶液中含有4.56g NaH₂PO₄，58.02g Na₂HPO₄.12H₂O，175.3g NaCl，15磅20min高压灭菌，20倍稀释后加入0.1％Tween-20；

(7)显色液为PNPP(购于PIERCE公司)，以10mg PNPP溶于10mM二乙醇胺溶液中；

(8)终止液：2M NaOH溶液。

上述试剂中，单抗DV2-M6和CCTCC-C200737的制备方法、包被单抗DV2-M6的微孔反应板的制备方法同例1；碱性磷酸酶标记的单抗DV2-M14的制备方法为：采用戊二醛法，即取碱性磷酸酶5mg溶于1ml抗体(2mg/ml)溶液中，在10mM PBS(PH7.2)透析24h，期间更换透析液3次，加入2.5％的戊二醛20μl，室温静置2h，在10mM PBS(PH7.2)透析12h，期间更换透析液3次，在50mM Tris-HCl溶液(PH8.0)中透析12h，期间更换透析液3次，用含1％BSA的Tris-HCl溶液(PH8.0，含0.02％NaN3)稀释至4ml，加入等量60％中性甘油溶液，混匀后分装，-80℃冻存备用。

2、使用方法：样品处理液处理各种待测的样品后，加150μl于CCTCC-C200736包被的聚苯乙烯96孔微量测试板中，同时设阴性对照和阳性对照，37℃温育1h，浓缩洗涤液20倍稀释后洗涤板条，洗板四次后，加入酶结合物，150μl/孔，37℃30min，同上洗板八次后，加显色液PNPP，150μl/孔，室温避光30min后，加入终止液，100μl/孔，终止反应。

3、结果判定：以空白孔调零，于405nm波长测定A值。阳性对照平均值≥0.50，阴性对照平均值≤0.10，实验成立。样品A值≥阴性对照A值平均值×2.1，则判为阳性。反之为阴性。

Claims (3)

1.一种检测II型登革病毒NS1抗原的免疫诊断试剂盒，该试剂盒包括用于包被捕获抗体的微孔反应板、样品处理液、标记有标记物的检测抗体、阳性对照、阴性对照、浓缩洗液、显色液和终止液，其特征在于所述的捕获抗体是单克隆抗体DV2-M6，所述的检测抗体是单克隆抗体DV2-M14；其中的单克隆抗体DV2-M6由保藏号为CCTCC-C200736的杂交瘤细胞株分泌得到，单克隆抗体DV2-M14由保藏号为CCTCC-C200737的杂交瘤细胞株分泌得到。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的标记物是生物素、辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于当所述的检测抗体上结合的标记物为生物素时，该试剂盒还含有标记有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的亲和素。

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