CN102778565A - 1型登革热快速金标诊断试纸条 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于1型登革热诊断的重组抗原及其快速金标诊断试纸条。其主要针对于1型登革热诊断的外膜蛋白DIII区重组抗原及可同时检测1型登革病毒感染者血清中IgM、IgG抗体的快速金标诊断试纸条。利用基因克隆技术获得1型登革病毒的外膜蛋白DIII区重组抗原，纯化后即可用于免疫学诊断。快速金标诊断试纸条可同时检测1型登革病毒感染者血清中IgM、IgG抗体，可判断患者的感染状态，并对患者作出早期诊断，这对于控制传染源，减少疾病的传播起着重要的作用。此外，由于金标试纸条无需特殊仪器，无需训练有素的专业人员，可以满足基层医院、农村卫生院等临床检测的需要，而且大大的降低了成本，方便了患者，适用于大规模的血清流行病学调查。

Description

1型登革热快速金标诊断试纸条

技术领域

本发明涉及疾病诊断的抗原，具体说是一种用于1型登革热血清学诊断的重组抗原及其快速金标诊断试纸条。

背景技术

登革热是一种由伊蚊传播的病毒性传染病，主要流行于东南亚、美州等热带、亚热带国家和地区，一百多个国家有地方性登革热传播，每年均出现几百万病例，是全球性公共卫生问题。近年来，我国东南沿海省份常年有输入性病例报告，且由此造成的本地扩散及暴发流行越来越频繁。由于登革热主要的传播媒介-白蚊伊蚊在国内分布广泛，因此其传播速度快，容易造成不良的社会影响，同时对当地的经济发展，特别是旅游业的发展造成冲击，我国已将登革热列为重点控制的传染病之一。由于缺乏有效的登革疫苗，加强登革热实验室准确快速的检测，及时发现、控制传染源，对于控制疫情起着至关重要的作用。

目前登革热的实验室诊断主要包括病毒分离、基因诊断技术和血清学检测。由于登革热的病毒血症期很短，通常在发热前2-3天到发热开始4-5天内，因此病毒分离和基因诊断受到标本采集时间的限制，同时对设备、实验室条件及人员素质要求很高，不利于推广。传统的血清学方法主要包括血凝抑制实验、补体结合实验、中和实验和免疫荧光法。但这些方法大多敏感性和特异性不高，且操作繁烦，有的需要特殊检测设备，目前已较少应用。而ELISA法、免疫层析法具有较高的敏感性和特异性，且操作简便快速，是目前大多数实验室采用的主要方法。国外已有多个国家生产销售此类试剂盒，但大多数质量不尽人意，仅以澳大利亚Panbio公司生产的检测试剂盒质量最好，该试剂也是目前国内实验室采用的主要试剂。但其价格昂贵，一般实验室难以承受，且运送时间长，难以应对突发事件。而国内尚没有商业化的试剂盒面市。

登革病毒属于黄病毒科黄病毒属，可分为四种血清型。早期的诊断试剂盒主要采用全病毒或病毒裂解液作为捕获抗原，检测血清中的登革病毒抗体，但由于与其它虫媒病毒存在交叉反应，特异性差，已逐渐被重组抗原所替代。外膜蛋白(E蛋白)是登革病毒主要的结构蛋白，全长500个氨基酸左右，E蛋白能和宿主细胞表面受体相互作用从而在病毒入侵过程中起至关重要的作用，还能诱导宿主产生保护性的中和抗体。E蛋白可分为三个结构区(DI、DII、DIII)，DIII区包括残基300～400，由唯一的一个二硫键稳定其结构，含有多个中和表位和宿主细胞受体识别位点，能诱导病毒中和抗体和血凝抑制抗体的产生。该多肽区不仅含有群特异性表位，还含有登革病毒型特异性表位，可用于病毒血清型的鉴别。

胶体金是一种处于半还原状态的悬浮颗粒，能迅速吸附蛋白质等大分子而不影响其活性，胶体金具有易分辨的红至紫红色，在与大分子结合后，易于用肉眼识别，不需二级放大即可直接观察结果，胶体金诊断产品因而可直接进入没有复杂检测设备的诊所甚至家庭里。近年来，以早孕检测试纸为代表的胶体金免疫诊断试剂已进入千家万户，给人们的生活带来很大的方便。

从包括中国专利等有关资料检索表明，目前尚未有利用基因工程方法获得高表达、高活性的外膜蛋白DIII区重组抗原用于同时检测登革病毒感染者血清中IgM、IgG抗体的金标快速诊断试纸条的相关报道。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的是要提出一种用于1型登革热诊断的外膜蛋白DIII区重组抗原及可同时检测1型登革病毒感染者血清中IgM、IgG抗体的快速金标诊断试纸条。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一.溶液配方：

(1)重组抗原溶解液：SDS        0.1％

                   甘氨酸     250mmol/L

                   Tris.Cl    25mmol/L

(2)胶体金溶液：0.03～0.05％的四氯金酸，加1～2％柠檬酸三钠制备成胶体金颗粒；

(3)二抗：羊抗人IgG单抗、羊抗人μ链单抗，羊抗鼠IgG单抗由厦门波生生物技术有限公司研制；

(4)包被缓冲液：含1～3％蔗糖的磷酸盐缓冲液；

(5)基础缓冲液：由厦门波生生物技术有限公司研制，主要含牛血清白蛋白的缓冲液；

(6)反应缓冲液：含0.01～0.05％NaN₃的磷酸盐缓冲液；

(7)磷酸盐缓冲液(PBS)：为在800ml蒸馏水中溶解8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na₂HPO₄和0.24g KH₂PO₄，用盐酸调节溶液的pH值至7.2～7.6，加水定容至1L。

二.本发明重组抗原的工艺流程：

(1)本研究所用的1型登革病毒株为Hawaii株；

(2)以1型登革病毒基因组为模板，以F1/R1为PCR扩增引物，用一步法RT-PCR扩增得到E基因全长片段，其大小为2065bp，用TA克隆技术将此大片段克隆入TA载体pMD 18-T中，获得重组质粒T-DEN1E；

(3)以该重组质粒T-DEN1E为模板，以F1D、R1D为引物(F1D为正向引物，添加了BamHI酶切位点；R1D为反向引物，添加了Xho I酶切位点)，从中扩增出长度约378bp的E蛋白DIII区片段(DEN1EDIII)，将此片段定向插入原核表达载体pET-30a，转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达；Western blot证实该重组抗原pro-DEN1EDIII能被1型登革病毒感染者阳性血清所识别，以上所用引物见表1；

表1 1型登革病毒E蛋白DIII区克隆、表达所应用的引物

(4)克隆基因DEN1EDIII的核苷酸序列及其所编码的氨基酸序列：

核苷酸序列：

gacaaactga ccttaaaagg gatgtcatat gtgatgtgca caggctcatt caagttagag 60

aaagaagtgg ctgagaccca gcatggaact gttctagtgc aggttaaata cgaaggaaca 120

gatgcaccat gcaagatccc cttttcgacc caagatgaga aaggagtaac ccagaatggg 180

agattgataa cagccaaccc catagtcact gacaaagaaa aaccagtcaa cattgaggca 240

gaaccacctt ttggtgagag ttacatcgtg gtaggagcag gtgaaaaagc tctgaaacta 300

agctggttca agaaaggaag cagcataggg aaaatgcttg aagcaactgc ccgaggagca 360

cgaaggatgg ccatccta                                               378

氨基酸序列：

Asp Lys Leu Thr Leu Lys Gly Met Ser Tyr Val Met Cys Thr Gly Ser

1               5                   10                  15

Phe Lys Leu Glu Lys Glu Val Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Val Leu

            20                  25                  30

Val Gln Val Lys Tyr Glu Gly Thr Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe

        35                  40                  45

Ser Thr Gln Asp Glu Lys Gly Val Thr Gln Asn Gly Arg Leu Ile Thr

    50                  55                  60

Ala Asn Pro Ile Val Thr Asp Lys Glu Lys Pro Val Asn Ile Glu Ala

65                  70                  75                  80

Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Tyr Ile Val Val Gly Ala Gly Glu Lys

                85                  90                  95

Ala Leu Lys Leu Ser Trp Phe Lys Lys Gly Ser Ser Ile Gly Lys Met

            100                 105                 110

Leu Glu Ala Thr Ala Arg Gly Ala Arg Arg Met Ala Ile Leu

        115                 120                 125

(5)采用电洗脱方法纯化重组蛋白：对大量诱导时收集的菌体进行超声粉碎后，离心后分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE凝胶电泳，沉淀用2M、4M、8M尿素依次进行洗涤，尿素溶解的重组蛋白用电洗脱法进行纯化。纯化蛋白进行SDS-PAGE，确定纯度并进行蛋白定量。

三.本发明的试纸条制作工艺

(1)以胶体金标记重组抗原pro-DEN1EDHI和鼠IgG；

(2)两种金标抗原溶液混合后充分浸润玻璃纤维纸，置冻干机冻干；

(3)羊抗人μ链单抗1.0～5.0mg/ml、羊抗人IgG单抗1.0～5.0mg/ml与羊抗鼠IgG单抗1.0～5.0mg/ml包被NC膜，自然晾干；

(4)将吸水纸、NC膜和吸附了金标抗原的玻璃纤维组装成检测IgM、IgG的金标试纸条。

用本发明制作的重组抗原pro-DEN1EDIII及利用重组抗原制作成的1型登革热快速金标诊断试纸条就可以用于1型登革热临床诊断。

本发明的有益效果是：本发明利用基因工程技术，将1型登革病毒具有免疫疫优势的E基因DIII区片段在大肠杆菌内表达，以方便地获得大量廉价的重组抗原，纯化后即可用于免疫学诊断。由此方法得到的重组抗原及快速诊断试纸条具有很高的灵敏度、特异度，而且可以同时检测1型登革病毒感染者血清中IgM、IgG抗体。这对判断患者的感染状态，及对患者作出早期诊断，从而有效地控制传染源、防止疾病的扩散具有重要的意义。此外，由于金标试纸条无需特殊仪器，无需训练有素的专业人员，可以满足基层医院、农村卫生院等临床检测的需要，而且大大的降低了成本，方便了患者，适用于大规模的血清流行病学调查。

具体实施方式

实施例1：

一、重组抗原的制备

1、本研究所用的1型登革病毒株为Hawaii株；

2、取病毒感染上清，用Viral RNAMini Kit(QIAGEN公司)提取试剂盒提取病毒RNA。

3、以P1/R1为PCR扩增引物用一步法RT-PCR从1型登革病毒株基因组中扩增出全长的E基因2065bp。一步法RT-PCR反应体系如下：

PCR扩增反应条件：50℃30min；94℃2min；94℃30s，55℃30s，72℃2min，35cycles；72℃10min。

4、采用QIAquick Gel extraction试剂盒对扩增产物进行纯化。用TA克隆技术将纯化后的PCR产物直接克隆入TA载体pMD 18-T中，获得重组克隆质粒，命名为T-DEN1E；

5、以该重组克隆质粒T-DEN1E为模板，用引物F1D/R1D扩增出长度约378bp的片段DEN1EDIII，将扩增得到的片段及原核表达载体pET-30a分别用BamHI和Xho I双酶切，并用QIAquickGel extraction试剂盒纯化回收产物。

6、将目的基因片段与表达载体pET-30a进行定向连接，从而构建重组表达质粒，命名为pET30a-DEN1EDIII：

按TaKaRa DNA连接试剂盒(Version2.1)操作说明书进行。

①将质粒载体DNA(0.03pmol)与插入DNA片段(0.1～0.3pmol)混合制备成体积为5μl～10μl的DNA溶液。

②向上述DNA溶液中加入等体积的Solution I，混合均匀。

③16℃反应30min～2h。

④取10～20μl上述连接反应液转化100μl相应的感受态细胞BL21(DE3)。

7、重组表达质粒的鉴定：筛选阳性克隆，BamHI和Xho I双酶切对重组表达质粒进行酶切鉴定，筛选阳性克隆。

8、重组蛋白的诱导表达：

(1)挑单菌落于5ml含Kan+(30ug/ml)的LB培养液中，37℃250rpm/min过夜培养；

(2)将过夜培养的含重组质粒的表达菌以1∶100扩种。

(3)表达菌生长到OD值约0.8时，加入IPTG使终浓度为1mM，37℃诱导4h。

(4)菌液用4℃8000rpm/min，离心5min收集菌体，沉淀倒置扣干备用。

9、对诱导前后的表达产物进行SDS-PAGE鉴定表达效果

10、对重组抗原进行Western blot鉴定表达产物的抗原活性

11、用电洗脱方法纯化重组抗原：

(1)细菌的裂解(超声波粉碎法)

①将1500ml表达菌液于4℃，6 000r/min，离心10min。

②Buffer I 100ml悬浮沉淀，置冰浴上，350W超声粉碎20min(2sec超声，5sec间隔)。

Buffer I(pH 7.2)：    5mM    EDTA

                     20mM    Tris.Cl

                    150mM    NaCl

③4℃，12000r/min，离心10min，上清和沉淀各取50μl，加入50μl 2×SDS凝胶加样缓冲液，12％SDS-PAGE进行分析。确定目标蛋白位置及纯度，重组蛋白存在于包涵体中。

(2)包涵体的溶解：

①上述用Buffer I悬起的沉淀加入等量4％Triton，37℃摇床振荡30min。4℃，12000rpm/min离心10min，弃上清。

②沉淀用Buffer I悬起，4℃，12000rpm/min离心10min，弃上清。

③重复步骤1、2。

④沉淀用2mol/L尿素(溶于Buffer I)悬起，37℃摇床振荡30min。4℃，12000rpm/min离心10min，留上清。

⑤按照步骤4的操作方法，沉淀依次用4mol/L、8mol/L尿素(溶于Buffer I)溶解，留上清。

⑥分别从2mol/L、4mol/L、8mol/L尿素溶解的上清中取出10μl，加入等量2×SDS凝胶加样缓冲液，12％SDS-PAGE进行分析。

(3)电洗脱法纯化重组蛋白

①固定胶板，用0.7％琼脂糖凝胶封住胶板的底部及两侧。

②配制12％SDS-PAGE。

③尿素溶解的包涵体加入5×SDS凝胶加样缓冲液，每板上样6ml。

④100V电泳过夜。

⑤切胶：根据折光效果，用小刀沿折光线划出一条线(勿切断)，在胶的中间纵向切出一条小胶，用0.3mol/L CuCl2染色。根据染色后蛋白带的宽度，切下目的蛋白。

⑥电洗脱：将切下的胶条置于透析袋中，加入1×SDS电泳缓冲液，置于水平电泳槽上电泳。110V电洗脱2h后，收集透析袋中的溶液，更换新的电泳缓冲液，继续电洗脱2h，再次收集电洗脱液。收集的溶液即为纯化的蛋白。

⑦纯化的蛋白进行SDS-PAGE分析，鉴定其纯度。

⑧蛋白定量：参照DU530核酸蛋白分析仪说明书进行。

①在主菜单上选择蛋白分析程序。

②选择UV280方法测定蛋白浓度。

③以牛血清白蛋白(BSA)为参考蛋白，以溶解待测定蛋白的溶液配制一系列浓度的BSA溶液，测定其OD值，建立标准曲线。

④以溶解BSA的溶液调零。

实施例2：

1型登革热金标快速诊断试纸条的制作

(1)取0.03％四氯金酸1000ml，加热至沸腾，加入1％柠檬酸三钠溶液25ml，继续煮沸5分钟，待胶体金溶液颜色由有蓝经紫变红后，自然冷却后备用；

(2)取胶体金溶液1ml，加入0.2M K₂CO₃10μl、50μg纯化抗原，搅匀后静置1h；

(3)加入20％牛血清白蛋白25μl、20％PEG 20,00015μl，8,000r/min，离心8min，弃上清；

(4)将沉淀悬浮于1ml基础缓冲液中，即为金标抗原溶液；

(5)同法标记鼠IgG；

(6)两种金标抗原溶液混合后充分浸润玻璃纤维纸，置冻干机冻干；

(7)羊抗鼠IgG单抗3.0mg/ml、羊抗人μ链单抗2.0mg/ml、羊抗人IgG单抗2.0mg/ml，分别在NC膜的上、中、下位置包被NC膜，自然晾干；

(8)在约10cm宽的底板上，将吸水纸、NC膜、吸附了金标抗原的玻璃纤维和未吸附抗原的玻璃纤维组装成检测IgM与IgG的试纸条。

评价：将血清或血浆10ul+90ul PBS进行1∶10稀释后，取至少60ul的样本稀释液加到样品吸收处，5-10分钟内观察金标抗原释放后NC膜上检测线和对照线的反应情况，检测线和对照线同时出现红色条带判为阳性，仅对照线出现红色条带判为阴性，对照线未出现条带为无效试验，具体判断方法见表2。

表2 金标诊断试纸条的判断原则

用1型登革热金标试剂条检测96份急性期和48份恢复期1型登革病毒感染者血清，48份正常人血清和16份日本脑炎阳性的人血清。以IFAT为参照标准，该金标条对1型登革病毒感染者IgG的检出率为93.3％，对IgM的检出率为100％。与澳大利亚PanBio公司生产的捕获法ELISA检测试剂盒进行比较，对IgG的检出率两者符合率为95.6％，对IgM的检出率两者符合率为100％。对48份正常人血清和16份日本脑炎阳性的人血清检测结果均为阴性。这充分显示出该金标试剂条具有很高的灵敏度、特异度，而且具有操作简便、快速，不需要特殊仪器设备，结果易于观察，便于保存和运输等优点，非常适用于各种层次尤其是基层医疗单位、农村卫生院等缺乏实验条件和专业人员的地方开展此项工作。同时适用出入境检验检疫机构对出入境人员进行快速检测。

Claims (7)

1.一组1型登革热快速金标诊断试纸条的溶液组分，其特征是：

(1)重组抗原溶解液：SDS         0.1％

                   甘氨酸      250mmol/L

                   Tris.C1     25mmol/L

其中，重组抗原为重组抗原pro-DEN1EDIII，其核苷酸序列为：

gacaaactga ccttaaaagg gatgtcatat gtgatgtgca caggctcatt caagttagag 60

aaagaagtgg ctgagaccca gcatggaact gttctagtgc aggttaaata cgaaggaaca 120

gatgcaccat gcaagatccc cttttcgacc caagatgaga aaggagtaac ccagaatggg 180

agattgataa cagccaaccc catagtcact gacaaagaaa aaccagtcaa cattgaggca 240

gaaccacctt ttggtgagag ttacatcgtg gtaggagcag gtgaaaaagc tctgaaacta 300

agctggttca agaaaggaag cagcataggg aaaatgcttg aagcaactgc ccgaggagca 360

cgaaggatgg ccatccta                                               378

其所编码的氨基酸序列为：

Asp Lys Leu Thr Leu Lys Gly Met Ser Tyr Val Met Cys Thr Gly Ser

1               5                   10                  15

Phe Lys Leu Glu Lys Glu Val Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Val Leu

            20                  25                  30

Val Gln Val Lys Tyr Glu Gly Thr Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe

        35                  40                  45

Ser Thr Gln Asp Glu Lys Gly Val Thr Gln Asn Gly Arg Leu Ile Thr

    50                  55                  60

Ala Asn Pro Ile Val Thr Asp Lys Glu Lys Pro Val Asn Ile Glu Ala

65                  70                  75                  80

Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Tyr Ile Val Val Gly Ala Gly Glu Lys

                85                  90                  95

Ala Leu Lys Leu Ser Trp Phe Lys Lys Gly Ser Ser Ile Gly Lys Met

            100                 105                 110

Leu Glu Ala Thr Ala Arg Gly Ala Arg Arg Met Ala Ile Leu

        115                 120                 125

(2)胶体金溶液：0.03～0.05％的四氯金酸，加1～2％柠檬酸三钠制备成胶体金颗粒；

(3)二抗：羊抗人IgG单抗、羊抗人μ链单抗，羊抗鼠IgG单抗；

(4)包被缓冲液：含1～3％蔗糖的磷酸盐缓冲液；

(5)基础缓冲液：由厦门波生生物技术有限公司研制，主要含牛血清白蛋白的缓冲液；

(6)反应缓冲液：0.01～0.05％NaN₃的磷酸盐缓冲液；

(7)磷酸盐缓冲液：为在800ml蒸馏水中溶解8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na₂HPO₄和0.24gKH₂PO₄，用盐酸调节溶液的pH值至7.2～7.6，加水定容至1L。

2.制备1型登革热快速金标诊断试纸条重组抗原pro-DEN1EDIII的工艺流程，其特征是：

(1)以1型登革病毒株为Hawaii株基因组为模板，以F1/R1为PCR扩增引物，用用一步法RT-PCR扩增得到外膜蛋白基因全长片段，其大小为2065bp，用TA克隆技术将此片段克隆入TA载体pMD 18-T中，获得重组质粒T-DEN1E；

(2)以该重组质粒T-DEN1E为模板，以F1D、R1D为引物，从中扩增出长度约378bp的E基因DIII区片段，将片段定向插入原核表达载体pET-30a，构建重组表达质粒pET30a-DEN1EDIII，转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达；蛋白免疫印迹实验证实该重组抗原pro-DENIEDIII能被1型登革病毒感染者血清所识别；

E基因DIII区片段DEN1EDIII表达的重组抗原pro-DEN1EDIII的核苷酸序列为：

gacaaactga ccttaaaagg gatgtcatat gtgatgtgca caggctcatt caagttagag 60

aaagaagtgg ctgagaccca gcatggaact gttctagtgc aggttaaata cgaaggaaca 120

gatgcaccat gcaagatccc cttttcgacc caagatgaga aaggagtaac ccagaatggg 180

agattgataa cagccaaccc catagtcact gacaaagaaa aaccagtcaa cattgaggca 240

gaaccacctt ttggtgagag ttacatcgtg gtaggagcag gtgaaaaagc tctgaaacta 300

agctggttca agaaaggaag cagcataggg aaaatgcttg aagcaactgc ccgaggagca 360

cgaaggatgg ccatccta                                               378

其所编码的氨基酸序列为：

Asp Lys Leu Thr Leu Lys Gly Met Ser Tyr Val Met Cys Thr Gly Ser

1               5                   10                  15

Phe Lys Leu Glu Lys Glu Val Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Val Leu

            20                  25                  30

Val Gln Val Lys Tyr Glu Gly Thr Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe

        35                  40                  45

Ser Thr Gln Asp Glu Lys Gly Val Thr Gln Asn Gly Arg Leu Ile Thr

    50                  55                  60

Ala Asn Pro Ile Val Thr Asp Lys Glu Lys Pro Val Asn Ile Glu Ala

65                  70                  75                  80

Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Tyr Ile Val Val Gly Ala Gly Glu Lys

                85                  90                  95

Ala Leu Lys Leu Ser Trp Phe Lys Lys Gly Ser Ser Ile Gly Lys Met

            100                 105                 110

Leu Glu Ala Thr Ala Arg Gly Ala Arg Arg Met Ala Ile Leu

        115                 120                 125

(3)采用电洗脱方法纯化重组蛋白：对大量诱导时收集的菌体进行超声粉碎后，离心后分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE凝胶电泳，沉淀用2M、4M、8M尿素依次进行洗涤，尿素溶解的重组蛋白用电洗脱法进行纯化，纯化蛋白进行SDS-PAGE，确定纯度并进行蛋白定量。

3.根据权利要求2所述的一步法RT-PCR反应体系，其特征是：

50μl反应体系包含以下成份

PCR扩增反应条件：50℃30min；94℃2min；94℃30s，55℃30s，72℃2min，35cycles；72℃10min。

4.根据权利要求2所述的1型登革病毒克隆、表达所应用的引物，F1R为正向引物，添加了BamHI酶切位点；R1D为反向引物，添加了Xho I酶切位点，其特征是：

5.根据权利要求2所述的重组蛋白pro-DEN1EDIII，其重组蛋白pro-DEN1EDIII诱导表达：

(1)挑取含重组表达质粒pET30a-DEN1EDIII的单菌落于5ml含Kanamycin，30μg/ml的LB培养液中，37℃250r/min过夜培养；

(2)将过夜培养的含重组质粒的表达菌以1∶100扩种；

(3)表达菌生长到OD值约0.8时，加入IPTG使其终浓度为1mM，37℃诱导4h；

(4)菌液用4℃8000r/min，离心5min收集菌体，沉淀倒置扣干，备用。

6.根据权利要求2所述的用电洗脱方法纯化重组抗原，其特征是：

(1)用超声波破碎法裂解细菌

①将1500ml表达菌液于4℃，6000r/min，离心10min；

②Buffer I 100ml悬浮沉淀，置冰浴上，350W超声破碎20min，2s超声，5s间隔；

Buffer I，pH 7.2：    5mM      EDTA

                     20mM     Tris.Cl

                    150mM     NaCl

③4℃，12000r/min，离心10min，取少量沉淀和上清进行SDS-PAGE，确定目标蛋白位置及纯度，重组蛋白存在于包涵体中；

(2)包涵体的溶解：

①上述用Buffer I悬起的沉淀加入等量4％Triton，37℃摇床振荡30min，4℃，12000rpm/min离心10min，弃上清；

②沉淀用Buffer I悬起，4℃，12000rpm/min离心10min，弃上清；

③重复步骤1、2；

④沉淀用2mol/L尿素(溶于Buffer I)悬起，37℃摇床振荡30min，4℃，12000rpm/min离心10min，留上清；

⑤按照步骤4的操作方法，沉淀依次用4mol/L、8mol/L尿素(溶于Buffer I)溶解，留上清；

⑥分别从2mol/L、4mol/L、8mol/L尿素溶解的上清中取出10μl，加入等量2×SDS凝胶加样缓冲液，12％SDS-PAGE进行分析；

(3)电洗脱法纯化重组蛋白

①固定胶板，用0.7％琼脂糖凝胶封住胶板的底部及两侧；

②配制12％SDS-PAGE；

③尿素溶解的包涵体加入5×SDS凝胶加样缓冲液，每板上样6ml；

④100V电泳过夜；

⑤切胶：根据折光效果，用小刀沿折光线划出一条线(勿切断)，在胶的中间纵向切出一条小胶，用0.3mol/L CuCl2染色，根据染色后蛋白带的宽度，切下目的蛋白；

⑥电洗脱：将切下的胶条置于透析袋中，加入1×SDS电泳缓冲液，置于水平电泳槽上电泳，110V电洗脱2h后，收集透析袋中的溶液，更换新的电泳缓冲液，继续电洗脱2h，再次收集电洗脱液，收集的溶液即为纯化的蛋白；

⑦纯化的蛋白进行SDS-PAGE分析，鉴定其纯度；

⑧蛋白定量：参照DU530核酸蛋白分析仪说明书进行

①在主菜单上选择蛋白分析程序；

②选择UV280方法测定蛋白浓度；

③以牛血清白蛋白(BSA)为参考蛋白，以溶解待测定蛋白的溶液配制一系列浓度的BSA溶液，测定其OD值，建立标准曲线；

④以溶解BSA的溶液调零。

7.1型登革热金标快速诊断试纸条的制作工艺，其特征是：

(1)取0.03％四氯金酸1000ml，加热至沸腾，加入1％柠檬酸三钠溶液25ml，继续煮沸5min，待胶体金溶液颜色由有蓝经紫变红后，自然冷却后备用；

(2)取胶体金溶液1ml，加入0.2M K₂CO₃10μl、50μg根据权利要求2所述工艺制备的纯化重组抗原pro-DEN1EDIII，搅匀后静置1h；

(3)加入20％牛血清白蛋白25μl、20％PEG 20,00015μl，8,000r/min，离心8min，弃上清；

(4)将沉淀悬浮于1ml基础缓冲液中，即为金标抗原溶液；

(5)同法标记鼠IgG；

(6)两种金标抗原溶液混合后充分浸润玻璃纤维纸，置冻干机冻干；

(7)羊抗鼠IgG单抗3.0mg/ml、羊抗人μ链单抗2.0mg/ml、羊抗人IgG单抗2.0mg/ml，分别在NC膜的上、中、下位置包被NC膜，自然晾干；

(8)在约10cm宽的底板上，将吸水纸、NC膜、吸附了金标抗原的玻璃纤维和未吸附抗原的玻璃纤维组装成检测IgM与IgG的试纸条。