JPS6230965A - 非ａ非ｂ肝炎誘発因子から得た精製抗原 - Google Patents

非ａ非ｂ肝炎誘発因子から得た精製抗原

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JPS6230965A
JPS6230965A JP61050284A JP5028486A JPS6230965A JP S6230965 A JPS6230965 A JP S6230965A JP 61050284 A JP61050284 A JP 61050284A JP 5028486 A JP5028486 A JP 5028486A JP S6230965 A JPS6230965 A JP S6230965A
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nanbh
antigen
serum
hepatitis
approximately
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JP61050284A
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ベンリダ．ピク−ラン・セト
ロバート・ジヨン　ゲレテイ
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Original Assignee
US Department of Health and Human Services
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、ＮＡＮＢＨに対する特異的血清マーカーの
単離、精製および特徴に関する。更に特には、生体外検
出キットに使用するため、およびＮＡＮＢＨに対するワ
クチンとして使用するために、ＮＡＮＢＨ誘発因子に関
連する抗原の単離、精製法に関する。
〔従来技術とその問題点〕 ＮＡＮＢＨは、米国の成人中にて散発性肝炎の２０ない
し４０％を占める。この種の肝炎は輸血後肝炎の９０優
におよぶ。これらの症例のうち５０％は慢性ＮＡＮＢＨ
に進行し、そのような成人が潜在的感染原となることは
憂慮すべきことである。この病気に感染物質が存在する
ことは、慢性ＮＡＮＢＨ患者の血清をチン・！ンジーへ
の接種で感染させること、および更にチン・ぞンジーに
継代することにより証明された。注目すべきことに、チ
ンノ９ン・ノーがこの試験の目的の々−め、ヒトの代わ
りに使用され、通常ＮＡＮＢＨの診断は他の肝炎ウィル
スに特異的な血清試験により、他のヒト肝炎ウィルスの
存在を否定することに基づいている。
とりわけ、シラチ等［Ｌａｎｃｅｔ　８５３−８５６（
１９７８）］およびティパー等［Ｊ、Ｍｅｄ、Ｖｊｒｏ
ｌ、、　４　ｒ　１６１−１６９（１９７９）〕の報告
によれは、抗原−抗体試験のすべては非特異的かつ低感
度という欠点があり、更に重要なことには、ウィルスま
たは宿主超厚の抗原および抗体がはっきりとした特異性
を示さない。この発明では、他のウィルスまたは宿主抗
原と交叉反応を起さずにＮＡＮＢＨを直接検出する手段
をはじめて可能とした精製抗原が開示されている。
従来、この病気の診断は、Ａ型肝炎ウィルス、Ｂ型肝炎
ウィルス、サイトメガロウィルスおよびニブシュタイン
−バールウィルスといっり他のヒト肝炎ウィルスが血清
中に存在しないことによって下されていたことは注目に
値する。
従って、この発明の目的は、ＮＡＮＢＨを直接検出し、
または診断するための特異的血清マーカーを提供するこ
とである。
この発明のもう一つの目的は、ＮＡＮＢＨに特異的に関
連した単離、精製抗原を調製することである。
この発明のまた別の目的は、ＮＡＮＢ）（に対する宿主
免疫応答（例えば、抗体）を誘導させることである。こ
こでは、生体外検出キットを使用し、およびＮＡＮＢＨ
に対する免疫処理を実施するためにこの発明の精製抗原
を利用する。
この発明の更にもう一つの目的は、キャリヤーにＮＡＮ
ＢＨ因子が存在することを検出することによりＮＡＮＢ
）（の伝染を防止することである。ここで、この発明の
精製抗原またはそれの製品を利用する。
この発明の更に別の目的は免疫原として精製抗原を利用
して、特異的有効抗体を誘導してＮＡＮＢＨ感染を防ぐ
ことである。
この発明の尚更に別の目的は、血液センターまたはプラ
ズマフェレーシス施設において、血液または血漿製剤中
にＮＡＮＢＨ因子が存在するかどうかのスクリーニング
を可能にすることである。
このために、単離、精製抗原またはその製品が利用され
る。
〔問題点を解決するだめの手段〕 この発明の様々な目的は、単離、精製したＮＡＮＢＨ関
連抗原により達成される。この抗原は、密度１．１４ｇ
７ｍ１でウィルス粒子の表面に存在し、可溶性で以下の
性質を有する。
（ａ）　　ドテシル硫酸ナトリウム含有ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（ＳＤＳ　−ＰＡＧＥ）による分子量
が約７７．０００の単蓋体であり、 （ｂ）　　アカグザルの免疫血清と反応し、（ｃ）主に
マンノースおよびほぼ同じ比率のフ６一 コースおよびガラクトースからなる炭水化物を約２チ含
む糖蛋白質であり、 （ｄ）　　芳香族アミノ酸組成は、フェニルアラニン、
チロシンおよびトリプトファンの分子数比が３：３：１
であり、および （ｅ）　　免疫原である。
いくつか代わりとなる若しくは相当する方法および物質
をこの発明に用いることができないわけではないが、次
のものが好ましい具体例である。
慢性ＮＡＮＢＡ患者の血清（接種物Ｉ）を用いたが、前
にその血液または血清はＮＡＮＢＨが偶発的にヒトへ伝
染し、また一連の実験でチン／４’ンジーに接種された
。この血清１０ｄを、５ｍＭ　）リス−リン酸緩衝液（
ｄ（ｓ、　５　）で総量４０ｍ１に希釈した。この血清
を、あらかじめトリス−リン酸緩衝液で平衡化しておい
たＤＥＡＥ−セルロースカラム（ＤＥ５２．１．５ｃＩ
ｎＸ　２２ｃｒ／Ｌ）に吸着させた。続いて、ンーパー
等がＦｅｄ、Ｐｒｏｃ、　１７　、１１１５−１１２６
゜（１９５８）Ｋ記載しているようにトリス−リン酸緩
衝液で段階的濃度勾配をかけて分画した。
すなわちその緩衝液として（ａ）　５ｍＭ　トリス−リ
ン酸（ｐＨ８，５）　８１　ｍｌ、　（ｂ）　２０ｍＭ
　）リス−リン酸（ｐＨ８，０）？２ｄ　　、　　（ｃ
）　　３　０　　ｍＭ　　　）　　　リ　　ス　−　　
リ　　ン　酸（ｐｌ（７，６）　　６　３ｔｎｌ　、　
（ｄ）５０ｍＭ　　）　　リ　ス　−　リ　ン酸（ｐｉ
（７，１）　２７０ｒａｌ、および（ａ）　８０　ｍＭ
　）リス−リン酸（ＰＩ（６，６）　３１５ｍｌを用い
た。それぞれ４、５　ｔｘｌＯ分画の吸光度を日立１０
０−８ＯＡ分光光度計により２８０ｍにて測定した。
他の血清も同じように分画した。これらはＮＡＮＢ）（
感染性の明らかに血清４検体、Ｂ型肝炎の患者からの血
清３検体、および肝炎にかかっていない患者の血清ｌ＠
体である。ヒト血清をＤＥＡＥ−セルロースクロマトグ
ラフィーにかけて得られた結果の要約を第１表に示す。
第　　■　　表 ｎ１ｌＶ ＮＡＮＢＨ５＊５　５　４＊５　　８０チＢ型肝炎　　
３　　　３３０３　　　　０％正　　常　　　１’　　
　　１１０１　　　　　０チ＊４検体の血清は他人また
はチンノｆンジ若しくは両方にＮＡＮＢＴ（を発生させ
、すべてピーク■を含んでいた。
ＣｏｎＡ−セファロース了フイニテイクロマトグラフィ
ー ＤＥＡＥカラムからの溶出後、ＮＡＮＢＡ血清特有のピ
ークであるタンノ９りのピーク■（第１表および第１図
参照）を集め、ＰＭＩＯアミコンフィルターを用いて濃
縮した。濃縮物を５０ｍＭＩＪン酸カルシウム緩衝液（
４７，１）で平衡化し、続いて５ｄのＣｏｎＡセファロ
ースカラムに吸着させた。
このカラムは前もって１ｍＭＣＩＬＣｔ２を含む同じ緩
衝液で平衡化させておいたものである。そして−９＝ 初めに１０　ｍＭ　ａ−メチルマンノシドを、次に２０
　ｍＭ　ａ−メチルマンノシドを含むリン酸カリウム緩
衝液で２段階溶出させた。
ＤＥＡＥ−セルロースによる再りロマトグラフィーＣｏ
ＮＡ−セファロースカラムから溶出した第２のタンノ９
クビークを、更にもう一度ＤＥＡＥ　カラムで精製した
。この際、２０　ｍＭと５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝
液（ｐ）１７．１）それぞれ１００ｍ／で直線濃度勾配
をかけた。
クロマトグラフィー操作から得られるすべての分画に対
して、ＮＡＮＢＨ関連抗原の有無を調べた。これは、接
種物ｉ中のヒ）　ＮＡＮＢＨ因子を前もって接種してお
いたチンノ４ンジー（チンｉ９ンジー９１６）から得た
血清を用いて、米国特許第４．３９５．３９５号にティ
パーが記載したようなカウンター電、気泳動試験によっ
て行なった。
分子量決定 単量体の分子量をＳＤＳ　−ＰＡＧＥにより決定した（
Ｎａｔｕｒｓ　、２２７．６８０−６８５にレムリーに
より一１〇− 記されたレムリー法に従って、精製糖タンノＰりを対象
として実施した。）０１係ＳＤＳを含む９チポリアクリ
ル了ミドの平板ダルに２５時間２５ｍＡの電、流を流し
た。続いて１０％酢酸の０．１係のクマシブルー液でダ
ルを染色した。標準品として次のような分子量既知のタ
ンパクマーカーを用いた。すなわち、ミオシン（２（１
０ｒ＜　）、ホスホリラーゼｂ　（９２，５Ｋ）、ウシ
血清アルブミン（６８Ｋ）、オブアルプミン（４３Ｋ）
、α−キモトリデシノーｒン（２５，７Ｋ）　、ラクト
グロブリン（１８，４Ｋ　）、およびチトクロムＣ（１
２Ｋ）である。
ウェスタン法 糖タン／？りである単量体を１２％ＳＯ８−ＰＡＧＥに
かけ、基本的にはトウビン等［Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ、Ａ
ｃａｄ。
Ｓｅｔ、ＵＳＡ　、７６−４３５０−４３５４（１９７
６）］の方法に準じてニトロセルロースにすい取った。
当該分野では周知の標準法により抗体を誘発させるため
に、適当な宿主を用いることができるが、試験の目的に
はアカゲザルを用いた。３週間に２匹のアカゲザル（８
７７４！　、２４５号）から血液を採取した。それぞれ
のサルに、初めて精製抗原（糖タン・９り）を接稽して
から、３週［１および１００週目同じ抗原を合計１８０
μｇ接種したが、初回の抗原は完全フロインドアツユバ
ンドで浮濁させ、次からのは不完全ソロインドアジ−バ
ンドで浮濁させたものである。アカゲザルの血清を毎週
固相放射線免疫検定（ＲＩＡ）により、接種した抗原に
対する抗体の有無を調べた。
この目的のために、この糖タン・ンクを、ラフトノ９−
オキシダーゼおよびグルコースオキシダーゼ固定（ｔビ
ーズ〔エンザイモビーズ （ＥＮＺＹＭＯＢＥＡｒ）Ｓ　）、カリフォルニア州、
リッチモンド、パイオーラード研究所〕を用い放射性ヨ
ウ素化した。この手法は製造元の手引に従った。
両アカデザルはこの糖タン・ぐりに対する抗体を産生じ
ていたが、アカゲザル８７７号の抗血清を選んで使用し
た。アカゲザル８７７号の抗血清かまたはその抗血清か
ら潤製した７　Ｓ　ＩｇＧ分画を試験し、抗体力価を放
射性ラベル抗原との結合百分率として表わした。放射活
性のある結合の最大値は７週目で８５チであった。
性 アカゲザル８７７号から得た７　Ｓ　ＩｇＧをエンザイ
モビーズを使って放射性ヨウ素化した。そしてそれを同
相放射線免疫検定により、ＮＡＮＢＨ患者の血清と、Ｂ
型肝炎患者の血清と、正常血清と、および接種物■のシ
ョ糖密度勾配分画と反応させた。
定義によれば当然のことであるが、抗体とは特定の抗原
に対して特異的に反応するものである。故に、了カケ１
ザル免疫血清中の抗体は、単離、精製ＮＡＮＢＨ糖タン
パクと同一の抗原またはそれと類似の抗原とのみ反応す
る。従って、ここで記載したＮＡＮＢＨ糖タンパクと異
なる抗原は、アカゲザル免疫血清とは反応しないであろ
うし、同定でき区別し得る。どちらの場合でも、アカゲ
ザルの免疫前血清は、抗原と反応しない。
固相放射　免疫検定 クルサグト等［Ｊ９Ｍｅｄ、Ｖｌｒｏｌ、、　６　、５
３−６０（１９８０）］の変法は次の通りである。
ＮＡＮＢ　Ｈ関連抗原を検出するために、未標識抗糖タ
ン、？クアカｒザル抗血清（１：２０希釈）でコートし
たポリスチレン製ビーズ（直径３．２　ｍ）を、被験血
清５０μｌとともに４℃にて一晩インキユペーションし
た。そのビーズを塩添加リン酸緩衝液（…７，４）で３
回洗い、続いて３７℃で３時間、そして放射標識抗−糖
タンパクＩｇＧ（１：２０希釈）５０μｌとともに４℃
にて一晩インキエベーシソンシタ。そのビーズを再Ｕ洗
イ、放射活性をガンマ−カウンターで測定した。
対照血清に対して２倍以上のＣＰＭを示す試料を陽性と
した（第■表参照） 第　　■　　表 慢性ＮＡＮＢＩ（１５１５ 急性ＮＡＮＢＨ２８３ Ｂ型肝炎　　　１１　　　　０ Ａ型肝炎　　　４０ 正常　　　　　８６２ 分光分析 更に、ＮＡＮＢＨ糖タンノ９りの特徴は、その中の芳香
族アミノ酸残基を定量的に分光分析して決められた。こ
れは、レビン等、Ｂｉｏｃｈｅｍ・、２１゜２６００−
２６０６（１９８２）に従って行なった。このために、
７０μｇのタンパクを２０　ｍＭリン酸カリウム緩衝液
で調製したグアニジン−ＨＣｌ液（ｐＨ６，５）Ｉｌに
対して室温にて一晩透析した。
吸光スペクトルは、ヘラレット−パラカード８４５０Ａ
分光分析機により測定し、フェニルアラニン、チロシン
およびトリプトファンの相対濃度は約３：３：１であっ
た。実際のデータを次に示す。
ＮＡＮＢＨ糖タンノ９り（７０μｇ）を、１５５℃にて
４５分間１００μｌの沸騰６　Ｎ　ＨＣｌで真空加水分
解した。加水分解物を乾燥し、分析のために三フッ化酢
酸中に再懸濁した。アミノ酸組成は、カラム分画後０−
フタルアルデヒドで誘導体を調製して決定した。そして
、この螢光誘導体をジッーン等［Ｊ、Ｃｈｒｏｍａｔ、
　２６６　：　（１９８３））が記載したようにＩＢＭ
９５３３高速液体クロマトグラフィー装置に取付けたＣ
−１８逆相カラムにかけ分離した。第１１１ｆｆにＮＡ
ＮＢＨ抗原のアミノ酸組成の相対値を示す。
第　　■　　表 Ａｓｐ　　　　１２．９ Ｇｌｕ　　　　　９．５ Ｓｅｒ’　　　　７．３ Ｈｌｍ　　　　　　　　　　　　　　　　１．５Ｇｌｙ
　　　　　９．８ Ｔｈｒ　　　　　４．９ Ａｒｇ　　　　　５．６ Ａｌｍ　　　　　９．５ Ｔｙｒ　　　　　６．２ Ｍ＠ｔ　　　　　Ｑ・９ Ｖａｌ　　　　　５．７ ｐｈ・　　　　７８８ Ｉｔ・　　　　１．９ Ｌｅｕ　　　　　９．５ Ｌｙｓ　　　　　４．６ Ｐｒｏ＊Ｎ、Ｄ。
Ｃａｌ”　　　　Ｎ、Ｄ。
合計　　　　　　　　９８ ＊Ｎ、Ｄ、：この加水分解では測定し得ない。
０−フタルアルデヒドは、プロリンのような二級アミン
とは反応しないことが予測され、６ＮＨＣ１の加水分解
ではトリプトファンやシスティンは分解する。
中性糖の分析 ＮＡＮＢＨ糖タン・母り（４，２μｇ）の試料を、４Ｎ
メタンスルフオン酸２０μｌとダウエックス４０Ｘ８（
２００〜４００メツシユ、Ｈ＋型）１０■を含む水５０
０μｌで１００℃にて２０時間加水分解した。加水分解
物をミリポアフィルタ−（０，４５μｍ）　Ｋ通して濾
過し、４．５　ｍｌの無水　　　　　１アルコールを加
えた。中性糖の分析は、カラム溶出後の分画をテトラゾ
リウム・ブルー（Ｔｅｔｒａｚｏｌ　ｌｕｍＢｌｕ・）
Ｋよυ誘導体に調製し、がイキンス、Ｒ，Ａ、等がＪ、
Ｂｉｏｃｈａｍ４１ｏｐｈｙｓ、Ｍｅｄｏｄａ＋　２７
ｌ−７８（１９８０）に記載したようにウォーターズ製
クロマトグラフィー装置に覗付けたＷ３Ｐ陽イオン交換
カラムでその誘導体を分離することにより行なった。
この糖タン・ぐりは約２±０５％の中性糖を含んでいた
が、マンノースが主成分であり、フコースとガラクトー
スがほぼ等しい比で構成されていた。
第１Ａ図はＮＡＮＢＨ血清をＤＥＡＥ−セルロースのカ
ラムにかけた際の特徴的な溶出曲線を示し、第１Ｂ図は
ＮＡＮＢＨではない患者または正常人の血清のそれを示
す。接種物Ｉでは４つの主なタンノ９りのピークが現わ
れ（第１Ａ図）、他の３人のＮＡＮＢＨ血清でも同様で
あった（第１表）。
ピークＩは血清グロブリンを含んでいたが、これは抗ヒ
）　ＩｇＧに対する免疫拡散法により証明された。ピー
ク■はクロマトグラフィーにかけたすべての血清におい
て常に現われた。ピーク■にはアルブミンが含まれてい
ることがｒルミ気泳動にて示された。ピーク■はＮＡＮ
ＢＡＨ患者の血清に特有のものであった。このピークは
、ＮＡＮＢＨをヒトまたはチンパン・ノー若しくは双方
に伝染させる４つの血清すべてにおいて現われた。とこ
ろが、ＮＡＮＢＨと診断された１人の患者の血清にはこ
のピークが見られなかったが、かといってその血清によ
り病気が伝染しないと証明されたわけではない（第１表
）。
クロマトグラフィー操作から得た各タンパク分画にＮＡ
ＮＢＡＨ関連抗原があるかどうかをカウンター電気泳動
（ｃＥＰ　）により調べた。抗原活性は、ＮＡＮＢＨを
伝染させることが知られている４検体すべてのタンノ９
クビーク１．■および■に見出された。接種物Ｉから得
られたタン／？クビーク■ヲ、ＣｏｎＡ−セファロース
クロマトグラフィーにより更に精製した。すると主タン
・９クビークが２つに分かれた。最初のピークは、カラ
ムのマトリクスに吸着せずに溶出した。更に、この部分
はＣＥＰ検定によると免疫沈降線を示さなかった。第２
のピークは、２０　ｍＭ　ａ−メチルマンノシドを含む
緩衝液で溶出したが、ＣＥＰ検定では陽性であった。こ
のことから、ＮＡＮＢＨ関連の可溶性抗原は糖タンパク
であることが示された。
中性糖を分析したところ、糖タンノ？りの２±０５チが
マンノース、ガラクトースおよびフコースから成ってい
た。Ｃｏｎ　Ａ−セファロースカラムからの第２ピーク
は更にＤＥＡＥ−セルロースに吸着した。単一で対称な
タンノ！クピークハ、　　２０ｍＭから５０　ｍＭ　Ｉ
Ｊン酸カリウム緩衝液の直線濃度勾配をかけて溶出した
。精製抗原の全段階後の回収率は血清１０ｍ１から約７
２０μｇすなわち全血清タンノ！りの０．２チである。
精製糖タンパク（ＮＡＮＢＨ関連抗原）の５Ｏ８−ＰＡ
ＧＥ上での移動度を第２図に示す。ここでは、様々な分
子量のマーカータンｉＪ？りの移動度を比較の対象とし
た。この図で１分子量既知のマーカータンパクの位置は
右側の数字で示す。列ａ、ｂおよびＣの染色バンドは、
試料濃度がそれぞれ１９．２μＮ、９．６μｇおよび２
．４μｇのときの抗原サブユニット（単量体）の位置を
示す。マーカータンパクの移動度に基づき各タン・譬り
の分子量の対数をとって作った検量線は直線を示し、こ
れからこの糖タン・ヤク単量体の分子量は７７．０００
と計算された。
固相ＲＩＡ検定によれば、アカグザル８７７から得た７
　Ｓ　ＩｇＧはＮＡＮＢＨ患者の血清とのみ反応した。
また、これはＤＥＡＥクロマトグラフィーから溶出した
ピーク■とのみ反応し、他のピーク■側または■とは反
応しなかった。更に、放射標識した７　Ｓ　ＩｇＧは、
感染性のＮＡＮＢＨ物質を含むことが知られている接種
物Ｉのショ糖密度勾配分画と反応した（第３図）。第３
図は、感染性の証明されたＮＡＮＢＨ接種物をショ糖密
度勾配にかけて得られた曲線を示す。放射標識したアカ
ｒザル８７７の免疫血清が、可溶型として血清に遊離し
ているＮＡＮＢＨ関連抗原と密度１．１４．！ｉ’ＡＩ
／！で粒子表面に存在しているＮＡＮＢＨ関連抗原双方
に結合することを示している。更に１００ｍＭＮａＣ１
および１ｍＭ　ＥＤＴＡを含む１００ｍＭ）リスーＨＣ
１緩衝液（ＦＪ（７，４）に１０ないし６０重量％のシ
ョ糖勾配をかけた液上に血清３００μｌを重層し、５Ｗ
４１Ｔｉｏ−ターに入れ３０．００　Ｏｒｐｍにて１９
時間遠心した。各分画を、ショ糖を除くために透析した
後、ＮＡＮＢＨ関連抗原に対する放射標識抗体と反応さ
せた。抗体は、密度１．１４　、！ｉ’／ｍｌのショ糖
勾配分画に結合した。この密度は、セト等によりＬａｎ
ｃｅｔ、２．９４１−９４３（１９８４）に記載された
これら血清中のＮＡＮＢＨ物質を検体として調べたとき
のものと等しいようであった。更に、結合は、糖タンパ
クの密度と一致するショ糖勾配の先端分画で見られた。
このことは、この抗原がウィルス粒子表面上に存在して
いるばかりでなく可溶性タンパクとしても存在している
ことを示している。
〔実施例〕
実施例Ｉ ＮＡＮＢＨ関連抗原に対する了カダザル抗体を利用する
固相放射性免疫検定法を用いて、パルチモアおよびメリ
ーランドに住んでいるウィルス性肝炎の患者から診断時
に得られた血清について、ＮＡＮＢＨ関連糖タンノＪ？
りの有無を調べた。結果を第■表に示す。この糖タン・
９りは、Ａ型またはＢ型肝炎にかかっている１５人の全
ての患者からのどの血清にも検出されなかった。一方、
この抗原は８６検体の対照血清のうち２検体、慢性ＮＡ
ＮＢＨ患者からの１５検体の血清のうち１５ｍ体、慢性
に進行していなかったＮＡＮＢＴ（患者からの血清２８
検体のうち３検体に検出された。急性ＮＡＮＢＨ患者の
ほとんどの血清にこの抗原が検出されなかった説明とし
て次のことが考えられる。
（１）他の中毒性肝疾患をともなった多くのＮＡＮＢ）
（症例を除くことにより診断が下されるために生じる誤
診。
（２）第２の試薬が原因で抗原陰性となる。
（３）慢性に進行していない症例の初期の血清から抗原
が消失する。
（４）抗原検出感度の欠如。
しかし、慢性ＮＡＮＢＡＨの１５例すべてに抗原が存在
することは、この疾病にこの抗原が特異的であること、
およびＮＡＮＢＡＨキャリヤーまたは血清若しくは血漿
由来でＮＡＮＢＨウィルスが夾雑した製品の検出のため
にこの抗原をスクリーニングに利用できることを示して
いる。
抗原陽性と診断されたすべての患者は、急性疾患後その
血清中に抗原が検出され続ける（６週間追試）ことに注
意する必要がある。
実施例■ この糖タンノＪ？り抗原のワクチンとしての利用性を試
べるために、アカゲザルを抗原で免疫し、その血清を以
下に記する「受動免疫」によりＮＡＮＢＨ感染に対して
チンパンジーを保護するために使われた。（アカグデル
自身はＮＡＮＢＨ感染に非感受性であるため、この技法
が必要である。）この研究のために、−匹のチンパンジ
ー（Ｎａ１２９２）に感染性が証明されたＮＡＮＢＨ接
種物（接種物Ｉ）　１ｍｇ　（ｔｏ２−ｙ−ン、＋ンシ
ー感染量）とアカゲザルの［免疫血清Ｊ　１　ｒｎｌの
混合物を静注した。このチンパンジーはいかなる感染の
症候を示さなかった。一方、上記の接種物Ｉの１ｍｌと
アカゲザルの［免疫前血清Ｊｉｍ／の混合物を接種した
対照チンパンジー（Ｎ＋１１２９０）は肝炎を発症し、
接種１２週後から血清アミノトランフェラーゼ（肝酵素
）の上昇が認められた。
双方における混合物は、各チン・ｆンジーに静注する前
に、３７℃で１時間続いて４℃にて１８時間インキュベ
ーションして調製したものである。「免疫血清」はＮＡ
ＮＢＨ関連糖タ関連量タン対する抗体を含んでいたが、
「免疾前血清」はＮＡＮＢＡ関連糖タンノ４りでの免疫
化に先立って同じアカゲザルより採取されたものである
。従りて、それはその糖タン・や夕に対する特異抗体以
外すべての血清成分を含んでいた。
この発明には様々な応用面があり、　ＮＡＮＢＨまたけ
その感染因子を有するキャリヤーを検出し、固定するた
めの特異性の高いキットを製造することもその一つであ
る。そのキットは、特に上記の如く単離精製した糖タン
・ぐりおよび免疫原として前記糖タンパクを使って調製
した抗体あるいはそのうちどちらか一方を含む容器がら
成る。もちろん、そのキットには、一般的がっ共通の他
の付属品（例えば、試薬および緩衝液、マイクロタイタ
ープレート、プレートリーダー、　　　　；マイクロビ
イット、螢光または放射活性マーカー等）が含まれてい
てもよい。
製剤、例えば、ＮＡＮＢＴ（を防ぎまたは調節するため
のワクチンを、この発明の手法に従って製造することも
可能である。この際、この発明の単離精製抗原を、それ
に対する抗体を誘導するに適した量で被験者に投与する
ために、その抗原を薬理学的に許容し得る担体（ｆｌｌ
えば、生理食塩等に加えておくとよい。
環元剤を加えずに行なったＮＡＮＢＨ糖タンノ９りの目
？リアクリルアミド電気泳動パターン（挿入図）、およ
び高速液体クロマトグラフィ＝（ＨＰＬＣ）溶出曲線を
示し、このＮＡＮＢＨ糖タンパクが均−ｆあることを表
している。ＮＡＮＢＨ糖タンパクを、ＳＤＳ　ｔたは２
−メルカプトエタノールを加えない変法に従って８％の
ポリ了クリルアミドグル上で電気泳動にかけた。また、
ＮＡＮＢ　ＡＨ糖タンパク（７μｇ）をｒル排除ＨＰＬ
Ｃにがけた。タンパクの溶出を２８０　ｎｍの吸光度（
フルスケール５０ｍＡＶ）で検出した。
第４図は、ＮＡＮＢＨ糖タンパクおよびＨＴＬＶ　ＩＩ
Ｉ抗原に対する反応性を示すケ゛ル電気泳動図を示す。
左側のノｅネルは、グルをクマシブルーで染色シたもの
で、左端はマーカータンパク、（ａ）は４．２μｇのＮ
ＡＮＢ）Ｔ糖タンパク、（）））は３３μｙのＨＴＬＶ
■抗原の各電気泳動図である。右側のパネルは、アカケ
９デルの免疫血清を用いた（ａ）　ＮＡＮＢＡ糖タンノ
ンク、（ｂ）７４にダルトンのＨＴＬＶ　Ｉｌｌｌｌタ
ンクのイムノプロット図である。
【図面の簡単な説明】
第１Ａ図は、ＮＡＮＢＨ患者血清を試料とした、第１Ｂ
図はＢ型肝炎患者血清を試料としだｒ）ＥＡＥ−セルロ
ースクロマトグラフィー図。第２図は、ヒト血清からの
ＮＡＮＢＨ関連抗原のｓＤｓ　−ＰＡＧＥ図。第３図は
ＮＡＮＢＨ関連抗原をショ糖密度勾配遠心した後の分画
とその抗原に対する放射標識抗体との結合曲線図。第４
図はＮＡＮＢＨ糖タンノ’？り抗原およびＨＴＬＶ■抗
原とぞれらに対する抗体との反応性を示す図。￥ワ（４
１よ、目へ１Ｊｆ３Ｈ”ｌＮ　９−／八”　’７　　Ｘ
　　４Ａ　　’Ｆ”Ｆ　　’　ｌ−了−Ｈｅｔｃ−ン＠
ｖ　　１ｆｊｈ　　を東１町出願人代理人　　弁理士　
鈴　江　武　彦図面の浄書（内容に変更なし） Ｏｂ ＦＩＧ、４ ｂ 手続補正書（方式）　５１．８．１９ 昭和　年　月　日 特許庁長官　黒　１）明　雄　殿　　　　　今生４恰旧
＝２、発明の名称 非Ａ非Ｂ肝炎誘発因子から得た精製抗原３、補正をする
者 事件との関係　　特許出願人 名称　アメリカ合衆国 ４、代理人 住所　東京都千代田区霞が関３丁目７番２号　ＵＢＥビ
ル昭和６１年５月２７日 ６、補正の対象 適正な願書（代表者の氏名、特許出願人の欄の住所）１
、補正の内容 （１）委任状およびその訳文については別紙の通り（２
）特許出願人の欄の住所を別紙訂正願書の通り訂正する
。 （３）明細書の第２８頁第１３行目ないし第１４行目に
於て、ｒＮＡＮＢＨ関連抗原の５ＤＳ−ＰＡＧＥ図。」
とあるをｒＮＡＮＢＨ関連抗原生物形態の電気泳動写真
図。」と訂正する。 （４）同頁第１８行目に於て、「抗体との反応性を。 示す図。」とあるを「抗体との反応性を示す生物形態の
電気泳動写真図。」と訂正する。 （５）同頁第１９行目に於て、ｒＨＰＬｃ溶出曲線図。 」とあるを、ｒＨＰＬＣ溶出曲線図であり、同図中の挿
入図は生物形態の電気泳動写真図である。」と訂正する
。 （６）図面の浄書（内容に変更なし） （−１）　メ嬶Ａンイ唖所５あＬ明４ｔのＭ７Ｊ＋＝　
〈２・・７１才　勾ｉｎ略６０−卒ｏ’／　７．！；ｇ
　１：偵ん緊＃■る。 ８、添付書類の目録

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）（ａ）ドテシル硫酸ナトリウム含有ポリアクリル
    アミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分子量
    が約７７，０００の単量体であり、 （ｂ）アカゲザルの免疫血清と反応し、 （ｃ）主にマンノースおよびほぼ同じ比率のフコースお
    よびガラクトースからなる炭水化物を約２％含む糖蛋白
    質であり、 （ｄ）芳香族アミノ酸組成は、フェニルアラニン、チロ
    シンおよびトリプトファンの分子数比が３：３：１であ
    り、および （ｅ）免疫原である、 単離、精製した非Ａ非Ｂ肝炎（ＮＡＮＢＨ）関連抗原。
  2. （２）キャリヤーまたは感染原中にＮＡＮＢＨ因子の存
    在を検出するための特異的マーカーである特許請求の範
    囲第１項記載の抗原。
  3. （３）血液センターまたはプラスマフェレーシス施設で
    血液をスクリーニングするための特異的血清マーカーで
    ある特許請求の範囲第２項記載の抗原。
  4. （４）前記抗原に特異的に反応する宿主抗体を誘導し得
    る特許請求の範囲第１項記載の抗原。
  5. （５）ＮＡＮＢＨ感染を阻害し得る特許請求の範囲第４
    項記載の抗体。
  6. （６）他の抗原から前記抗原を識別するに適する特許請
    求の範囲第４項記載の抗体。
  7. （７）（ａ）ドテシル硫酸ナトリウム含有ポリアクリル
    アミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分子量
    が約７７，０００の単量体であり、 （ｂ）アカゲザルの免疫血清と反応し、 （ｃ）主にマンノースおよびほぼ同じ比率のフコースお
    よびガラクトースからなる炭水化物を約２％含む糖蛋白
    質であり、 （ｄ）芳香族アミノ酸組成は、フェニルアラニン、チロ
    シンおよびトリプトファンの分子数比が３：３：１であ
    り、および （ｅ）免疫原である、 単離、精製した非Ａ非Ｂ肝炎（ＮＡＮＢＨ）関連抗原が
    入った容器を含み、ＮＡＮＢＨ因子のキャリヤー、病原
    または発生原をスクリーニングまたは検出するためのキ
    ット。
  8. （８）前記抗原と特異的に反応する抗体が入った容器を
    含む特許請求の範囲第７項記載のキット。
JP61050284A 1985-03-08 1986-03-07 非ａ非ｂ肝炎誘発因子から得た精製抗原 Pending JPS6230965A (ja)

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