JPS6230965A - 非a非b肝炎誘発因子から得た精製抗原 - Google Patents
非a非b肝炎誘発因子から得た精製抗原Info
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/29—Hepatitis virus
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- A—HUMAN NECESSITIES
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
この発明は、NANBHに対する特異的血清マーカーの
単離、精製および特徴に関する。更に特には、生体外検
出キットに使用するため、およびNANBHに対するワ
クチンとして使用するために、NANBH誘発因子に関
連する抗原の単離、精製法に関する。
単離、精製および特徴に関する。更に特には、生体外検
出キットに使用するため、およびNANBHに対するワ
クチンとして使用するために、NANBH誘発因子に関
連する抗原の単離、精製法に関する。
〔従来技術とその問題点〕
NANBHは、米国の成人中にて散発性肝炎の20ない
し40%を占める。この種の肝炎は輸血後肝炎の90優
におよぶ。これらの症例のうち50%は慢性NANBH
に進行し、そのような成人が潜在的感染原となることは
憂慮すべきことである。この病気に感染物質が存在する
ことは、慢性NANBH患者の血清をチン・!ンジーへ
の接種で感染させること、および更にチン・ぞンジーに
継代することにより証明された。注目すべきことに、チ
ンノ9ン・ノーがこの試験の目的の々−め、ヒトの代わ
りに使用され、通常NANBHの診断は他の肝炎ウィル
スに特異的な血清試験により、他のヒト肝炎ウィルスの
存在を否定することに基づいている。
し40%を占める。この種の肝炎は輸血後肝炎の90優
におよぶ。これらの症例のうち50%は慢性NANBH
に進行し、そのような成人が潜在的感染原となることは
憂慮すべきことである。この病気に感染物質が存在する
ことは、慢性NANBH患者の血清をチン・!ンジーへ
の接種で感染させること、および更にチン・ぞンジーに
継代することにより証明された。注目すべきことに、チ
ンノ9ン・ノーがこの試験の目的の々−め、ヒトの代わ
りに使用され、通常NANBHの診断は他の肝炎ウィル
スに特異的な血清試験により、他のヒト肝炎ウィルスの
存在を否定することに基づいている。
とりわけ、シラチ等[Lancet 853−856(
1978)]およびティパー等[J、Med、Vjro
l、、 4 r 161−169(1979)〕の報告
によれは、抗原−抗体試験のすべては非特異的かつ低感
度という欠点があり、更に重要なことには、ウィルスま
たは宿主超厚の抗原および抗体がはっきりとした特異性
を示さない。この発明では、他のウィルスまたは宿主抗
原と交叉反応を起さずにNANBHを直接検出する手段
をはじめて可能とした精製抗原が開示されている。
1978)]およびティパー等[J、Med、Vjro
l、、 4 r 161−169(1979)〕の報告
によれは、抗原−抗体試験のすべては非特異的かつ低感
度という欠点があり、更に重要なことには、ウィルスま
たは宿主超厚の抗原および抗体がはっきりとした特異性
を示さない。この発明では、他のウィルスまたは宿主抗
原と交叉反応を起さずにNANBHを直接検出する手段
をはじめて可能とした精製抗原が開示されている。
従来、この病気の診断は、A型肝炎ウィルス、B型肝炎
ウィルス、サイトメガロウィルスおよびニブシュタイン
−バールウィルスといっり他のヒト肝炎ウィルスが血清
中に存在しないことによって下されていたことは注目に
値する。
ウィルス、サイトメガロウィルスおよびニブシュタイン
−バールウィルスといっり他のヒト肝炎ウィルスが血清
中に存在しないことによって下されていたことは注目に
値する。
従って、この発明の目的は、NANBHを直接検出し、
または診断するための特異的血清マーカーを提供するこ
とである。
または診断するための特異的血清マーカーを提供するこ
とである。
この発明のもう一つの目的は、NANBHに特異的に関
連した単離、精製抗原を調製することである。
連した単離、精製抗原を調製することである。
この発明のまた別の目的は、NANB)(に対する宿主
免疫応答(例えば、抗体)を誘導させることである。こ
こでは、生体外検出キットを使用し、およびNANBH
に対する免疫処理を実施するためにこの発明の精製抗原
を利用する。
免疫応答(例えば、抗体)を誘導させることである。こ
こでは、生体外検出キットを使用し、およびNANBH
に対する免疫処理を実施するためにこの発明の精製抗原
を利用する。
この発明の更にもう一つの目的は、キャリヤーにNAN
BH因子が存在することを検出することによりNANB
)(の伝染を防止することである。ここで、この発明の
精製抗原またはそれの製品を利用する。
BH因子が存在することを検出することによりNANB
)(の伝染を防止することである。ここで、この発明の
精製抗原またはそれの製品を利用する。
この発明の更に別の目的は免疫原として精製抗原を利用
して、特異的有効抗体を誘導してNANBH感染を防ぐ
ことである。
して、特異的有効抗体を誘導してNANBH感染を防ぐ
ことである。
この発明の尚更に別の目的は、血液センターまたはプラ
ズマフェレーシス施設において、血液または血漿製剤中
にNANBH因子が存在するかどうかのスクリーニング
を可能にすることである。
ズマフェレーシス施設において、血液または血漿製剤中
にNANBH因子が存在するかどうかのスクリーニング
を可能にすることである。
このために、単離、精製抗原またはその製品が利用され
る。
る。
〔問題点を解決するだめの手段〕
この発明の様々な目的は、単離、精製したNANBH関
連抗原により達成される。この抗原は、密度1.14g
7m1でウィルス粒子の表面に存在し、可溶性で以下の
性質を有する。
連抗原により達成される。この抗原は、密度1.14g
7m1でウィルス粒子の表面に存在し、可溶性で以下の
性質を有する。
(a) ドテシル硫酸ナトリウム含有ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動(SDS −PAGE)による分子量
が約77.000の単蓋体であり、 (b) アカグザルの免疫血清と反応し、(c)主に
マンノースおよびほぼ同じ比率のフ6一 コースおよびガラクトースからなる炭水化物を約2チ含
む糖蛋白質であり、 (d) 芳香族アミノ酸組成は、フェニルアラニン、
チロシンおよびトリプトファンの分子数比が3:3:1
であり、および (e) 免疫原である。
ミドゲル電気泳動(SDS −PAGE)による分子量
が約77.000の単蓋体であり、 (b) アカグザルの免疫血清と反応し、(c)主に
マンノースおよびほぼ同じ比率のフ6一 コースおよびガラクトースからなる炭水化物を約2チ含
む糖蛋白質であり、 (d) 芳香族アミノ酸組成は、フェニルアラニン、
チロシンおよびトリプトファンの分子数比が3:3:1
であり、および (e) 免疫原である。
いくつか代わりとなる若しくは相当する方法および物質
をこの発明に用いることができないわけではないが、次
のものが好ましい具体例である。
をこの発明に用いることができないわけではないが、次
のものが好ましい具体例である。
慢性NANBA患者の血清(接種物I)を用いたが、前
にその血液または血清はNANBHが偶発的にヒトへ伝
染し、また一連の実験でチン/4’ンジーに接種された
。この血清10dを、5mM )リス−リン酸緩衝液(
d(s、 5 )で総量40m1に希釈した。この血清
を、あらかじめトリス−リン酸緩衝液で平衡化しておい
たDEAE−セルロースカラム(DE52.1.5cI
nX 22cr/L)に吸着させた。続いて、ンーパー
等がFed、Proc、 17 、1115−1126
゜(1958)K記載しているようにトリス−リン酸緩
衝液で段階的濃度勾配をかけて分画した。
にその血液または血清はNANBHが偶発的にヒトへ伝
染し、また一連の実験でチン/4’ンジーに接種された
。この血清10dを、5mM )リス−リン酸緩衝液(
d(s、 5 )で総量40m1に希釈した。この血清
を、あらかじめトリス−リン酸緩衝液で平衡化しておい
たDEAE−セルロースカラム(DE52.1.5cI
nX 22cr/L)に吸着させた。続いて、ンーパー
等がFed、Proc、 17 、1115−1126
゜(1958)K記載しているようにトリス−リン酸緩
衝液で段階的濃度勾配をかけて分画した。
すなわちその緩衝液として(a) 5mM トリス−リ
ン酸(pH8,5) 81 ml、 (b) 20mM
)リス−リン酸(pH8,0)?2d 、 (c
) 3 0 mM ) リ ス −
リ ン 酸(pl(7,6) 6 3tnl 、
(d)50mM ) リ ス − リ ン酸(pi
(7,1) 270ral、および(a) 80 mM
)リス−リン酸(PI(6,6) 315mlを用い
た。それぞれ4、5 txlO分画の吸光度を日立10
0−8OA分光光度計により280mにて測定した。
ン酸(pH8,5) 81 ml、 (b) 20mM
)リス−リン酸(pH8,0)?2d 、 (c
) 3 0 mM ) リ ス −
リ ン 酸(pl(7,6) 6 3tnl 、
(d)50mM ) リ ス − リ ン酸(pi
(7,1) 270ral、および(a) 80 mM
)リス−リン酸(PI(6,6) 315mlを用い
た。それぞれ4、5 txlO分画の吸光度を日立10
0−8OA分光光度計により280mにて測定した。
他の血清も同じように分画した。これらはNANB)(
感染性の明らかに血清4検体、B型肝炎の患者からの血
清3検体、および肝炎にかかっていない患者の血清l@
体である。ヒト血清をDEAE−セルロースクロマトグ
ラフィーにかけて得られた結果の要約を第1表に示す。
感染性の明らかに血清4検体、B型肝炎の患者からの血
清3検体、および肝炎にかかっていない患者の血清l@
体である。ヒト血清をDEAE−セルロースクロマトグ
ラフィーにかけて得られた結果の要約を第1表に示す。
第 ■ 表
n1lV
NANBH5*5 5 4*5 80チB型肝炎
3 3303 0%正 常 1’
1101 0チ*4検体の血清は他人また
はチンノfンジ若しくは両方にNANBT(を発生させ
、すべてピーク■を含んでいた。
3 3303 0%正 常 1’
1101 0チ*4検体の血清は他人また
はチンノfンジ若しくは両方にNANBT(を発生させ
、すべてピーク■を含んでいた。
ConA−セファロース了フイニテイクロマトグラフィ
ー DEAEカラムからの溶出後、NANBA血清特有のピ
ークであるタンノ9りのピーク■(第1表および第1図
参照)を集め、PMIOアミコンフィルターを用いて濃
縮した。濃縮物を50mMIJン酸カルシウム緩衝液(
47,1)で平衡化し、続いて5dのConAセファロ
ースカラムに吸着させた。
ー DEAEカラムからの溶出後、NANBA血清特有のピ
ークであるタンノ9りのピーク■(第1表および第1図
参照)を集め、PMIOアミコンフィルターを用いて濃
縮した。濃縮物を50mMIJン酸カルシウム緩衝液(
47,1)で平衡化し、続いて5dのConAセファロ
ースカラムに吸着させた。
このカラムは前もって1mMCILCt2を含む同じ緩
衝液で平衡化させておいたものである。そして−9= 初めに10 mM a−メチルマンノシドを、次に20
mM a−メチルマンノシドを含むリン酸カリウム緩
衝液で2段階溶出させた。
衝液で平衡化させておいたものである。そして−9= 初めに10 mM a−メチルマンノシドを、次に20
mM a−メチルマンノシドを含むリン酸カリウム緩
衝液で2段階溶出させた。
DEAE−セルロースによる再りロマトグラフィーCo
NA−セファロースカラムから溶出した第2のタンノ9
クビークを、更にもう一度DEAE カラムで精製した
。この際、20 mMと50mMのリン酸カリウム緩衝
液(p)17.1)それぞれ100m/で直線濃度勾配
をかけた。
NA−セファロースカラムから溶出した第2のタンノ9
クビークを、更にもう一度DEAE カラムで精製した
。この際、20 mMと50mMのリン酸カリウム緩衝
液(p)17.1)それぞれ100m/で直線濃度勾配
をかけた。
クロマトグラフィー操作から得られるすべての分画に対
して、NANBH関連抗原の有無を調べた。これは、接
種物i中のヒ) NANBH因子を前もって接種してお
いたチンノ4ンジー(チンi9ンジー916)から得た
血清を用いて、米国特許第4.395.395号にティ
パーが記載したようなカウンター電、気泳動試験によっ
て行なった。
して、NANBH関連抗原の有無を調べた。これは、接
種物i中のヒ) NANBH因子を前もって接種してお
いたチンノ4ンジー(チンi9ンジー916)から得た
血清を用いて、米国特許第4.395.395号にティ
パーが記載したようなカウンター電、気泳動試験によっ
て行なった。
分子量決定
単量体の分子量をSDS −PAGEにより決定した(
Naturs 、227.680−685にレムリーに
より一1〇− 記されたレムリー法に従って、精製糖タンノPりを対象
として実施した。)01係SDSを含む9チポリアクリ
ル了ミドの平板ダルに25時間25mAの電、流を流し
た。続いて10%酢酸の0.1係のクマシブルー液でダ
ルを染色した。標準品として次のような分子量既知のタ
ンパクマーカーを用いた。すなわち、ミオシン(2(1
0r< )、ホスホリラーゼb (92,5K)、ウシ
血清アルブミン(68K)、オブアルプミン(43K)
、α−キモトリデシノーrン(25,7K) 、ラクト
グロブリン(18,4K )、およびチトクロムC(1
2K)である。
Naturs 、227.680−685にレムリーに
より一1〇− 記されたレムリー法に従って、精製糖タンノPりを対象
として実施した。)01係SDSを含む9チポリアクリ
ル了ミドの平板ダルに25時間25mAの電、流を流し
た。続いて10%酢酸の0.1係のクマシブルー液でダ
ルを染色した。標準品として次のような分子量既知のタ
ンパクマーカーを用いた。すなわち、ミオシン(2(1
0r< )、ホスホリラーゼb (92,5K)、ウシ
血清アルブミン(68K)、オブアルプミン(43K)
、α−キモトリデシノーrン(25,7K) 、ラクト
グロブリン(18,4K )、およびチトクロムC(1
2K)である。
ウェスタン法
糖タン/?りである単量体を12%SO8−PAGEに
かけ、基本的にはトウビン等[Proc Natl、A
cad。
かけ、基本的にはトウビン等[Proc Natl、A
cad。
Set、USA 、76−4350−4354(197
6)]の方法に準じてニトロセルロースにすい取った。
6)]の方法に準じてニトロセルロースにすい取った。
当該分野では周知の標準法により抗体を誘発させるため
に、適当な宿主を用いることができるが、試験の目的に
はアカゲザルを用いた。3週間に2匹のアカゲザル(8
774! 、245号)から血液を採取した。それぞれ
のサルに、初めて精製抗原(糖タン・9り)を接稽して
から、3週[1および100週目同じ抗原を合計180
μg接種したが、初回の抗原は完全フロインドアツユバ
ンドで浮濁させ、次からのは不完全ソロインドアジ−バ
ンドで浮濁させたものである。アカゲザルの血清を毎週
固相放射線免疫検定(RIA)により、接種した抗原に
対する抗体の有無を調べた。
に、適当な宿主を用いることができるが、試験の目的に
はアカゲザルを用いた。3週間に2匹のアカゲザル(8
774! 、245号)から血液を採取した。それぞれ
のサルに、初めて精製抗原(糖タン・9り)を接稽して
から、3週[1および100週目同じ抗原を合計180
μg接種したが、初回の抗原は完全フロインドアツユバ
ンドで浮濁させ、次からのは不完全ソロインドアジ−バ
ンドで浮濁させたものである。アカゲザルの血清を毎週
固相放射線免疫検定(RIA)により、接種した抗原に
対する抗体の有無を調べた。
この目的のために、この糖タン・ンクを、ラフトノ9−
オキシダーゼおよびグルコースオキシダーゼ固定(tビ
ーズ〔エンザイモビーズ (ENZYMOBEAr)S )、カリフォルニア州、
リッチモンド、パイオーラード研究所〕を用い放射性ヨ
ウ素化した。この手法は製造元の手引に従った。
オキシダーゼおよびグルコースオキシダーゼ固定(tビ
ーズ〔エンザイモビーズ (ENZYMOBEAr)S )、カリフォルニア州、
リッチモンド、パイオーラード研究所〕を用い放射性ヨ
ウ素化した。この手法は製造元の手引に従った。
両アカデザルはこの糖タン・ぐりに対する抗体を産生じ
ていたが、アカゲザル877号の抗血清を選んで使用し
た。アカゲザル877号の抗血清かまたはその抗血清か
ら潤製した7 S IgG分画を試験し、抗体力価を放
射性ラベル抗原との結合百分率として表わした。放射活
性のある結合の最大値は7週目で85チであった。
ていたが、アカゲザル877号の抗血清を選んで使用し
た。アカゲザル877号の抗血清かまたはその抗血清か
ら潤製した7 S IgG分画を試験し、抗体力価を放
射性ラベル抗原との結合百分率として表わした。放射活
性のある結合の最大値は7週目で85チであった。
性
アカゲザル877号から得た7 S IgGをエンザイ
モビーズを使って放射性ヨウ素化した。そしてそれを同
相放射線免疫検定により、NANBH患者の血清と、B
型肝炎患者の血清と、正常血清と、および接種物■のシ
ョ糖密度勾配分画と反応させた。
モビーズを使って放射性ヨウ素化した。そしてそれを同
相放射線免疫検定により、NANBH患者の血清と、B
型肝炎患者の血清と、正常血清と、および接種物■のシ
ョ糖密度勾配分画と反応させた。
定義によれば当然のことであるが、抗体とは特定の抗原
に対して特異的に反応するものである。故に、了カケ1
ザル免疫血清中の抗体は、単離、精製NANBH糖タン
パクと同一の抗原またはそれと類似の抗原とのみ反応す
る。従って、ここで記載したNANBH糖タンパクと異
なる抗原は、アカゲザル免疫血清とは反応しないであろ
うし、同定でき区別し得る。どちらの場合でも、アカゲ
ザルの免疫前血清は、抗原と反応しない。
に対して特異的に反応するものである。故に、了カケ1
ザル免疫血清中の抗体は、単離、精製NANBH糖タン
パクと同一の抗原またはそれと類似の抗原とのみ反応す
る。従って、ここで記載したNANBH糖タンパクと異
なる抗原は、アカゲザル免疫血清とは反応しないであろ
うし、同定でき区別し得る。どちらの場合でも、アカゲ
ザルの免疫前血清は、抗原と反応しない。
固相放射 免疫検定
クルサグト等[J9Med、Vlrol、、 6 、5
3−60(1980)]の変法は次の通りである。
3−60(1980)]の変法は次の通りである。
NANB H関連抗原を検出するために、未標識抗糖タ
ン、?クアカrザル抗血清(1:20希釈)でコートし
たポリスチレン製ビーズ(直径3.2 m)を、被験血
清50μlとともに4℃にて一晩インキユペーションし
た。そのビーズを塩添加リン酸緩衝液(…7,4)で3
回洗い、続いて37℃で3時間、そして放射標識抗−糖
タンパクIgG(1:20希釈)50μlとともに4℃
にて一晩インキエベーシソンシタ。そのビーズを再U洗
イ、放射活性をガンマ−カウンターで測定した。
ン、?クアカrザル抗血清(1:20希釈)でコートし
たポリスチレン製ビーズ(直径3.2 m)を、被験血
清50μlとともに4℃にて一晩インキユペーションし
た。そのビーズを塩添加リン酸緩衝液(…7,4)で3
回洗い、続いて37℃で3時間、そして放射標識抗−糖
タンパクIgG(1:20希釈)50μlとともに4℃
にて一晩インキエベーシソンシタ。そのビーズを再U洗
イ、放射活性をガンマ−カウンターで測定した。
対照血清に対して2倍以上のCPMを示す試料を陽性と
した(第■表参照) 第 ■ 表 慢性NANBI(1515 急性NANBH283 B型肝炎 11 0 A型肝炎 40 正常 862 分光分析 更に、NANBH糖タンノ9りの特徴は、その中の芳香
族アミノ酸残基を定量的に分光分析して決められた。こ
れは、レビン等、Biochem・、21゜2600−
2606(1982)に従って行なった。このために、
70μgのタンパクを20 mMリン酸カリウム緩衝液
で調製したグアニジン−HCl液(pH6,5)Ilに
対して室温にて一晩透析した。
した(第■表参照) 第 ■ 表 慢性NANBI(1515 急性NANBH283 B型肝炎 11 0 A型肝炎 40 正常 862 分光分析 更に、NANBH糖タンノ9りの特徴は、その中の芳香
族アミノ酸残基を定量的に分光分析して決められた。こ
れは、レビン等、Biochem・、21゜2600−
2606(1982)に従って行なった。このために、
70μgのタンパクを20 mMリン酸カリウム緩衝液
で調製したグアニジン−HCl液(pH6,5)Ilに
対して室温にて一晩透析した。
吸光スペクトルは、ヘラレット−パラカード8450A
分光分析機により測定し、フェニルアラニン、チロシン
およびトリプトファンの相対濃度は約3:3:1であっ
た。実際のデータを次に示す。
分光分析機により測定し、フェニルアラニン、チロシン
およびトリプトファンの相対濃度は約3:3:1であっ
た。実際のデータを次に示す。
NANBH糖タンノ9り(70μg)を、155℃にて
45分間100μlの沸騰6 N HClで真空加水分
解した。加水分解物を乾燥し、分析のために三フッ化酢
酸中に再懸濁した。アミノ酸組成は、カラム分画後0−
フタルアルデヒドで誘導体を調製して決定した。そして
、この螢光誘導体をジッーン等[J、Chromat、
266 : (1983))が記載したようにIBM
9533高速液体クロマトグラフィー装置に取付けたC
−18逆相カラムにかけ分離した。第111ffにNA
NBH抗原のアミノ酸組成の相対値を示す。
45分間100μlの沸騰6 N HClで真空加水分
解した。加水分解物を乾燥し、分析のために三フッ化酢
酸中に再懸濁した。アミノ酸組成は、カラム分画後0−
フタルアルデヒドで誘導体を調製して決定した。そして
、この螢光誘導体をジッーン等[J、Chromat、
266 : (1983))が記載したようにIBM
9533高速液体クロマトグラフィー装置に取付けたC
−18逆相カラムにかけ分離した。第111ffにNA
NBH抗原のアミノ酸組成の相対値を示す。
第 ■ 表
Asp 12.9
Glu 9.5
Ser’ 7.3
Hlm 1.5Gly
9.8 Thr 4.9 Arg 5.6 Alm 9.5 Tyr 6.2 M@t Q・9 Val 5.7 ph・ 788 It・ 1.9 Leu 9.5 Lys 4.6 Pro*N、D。
9.8 Thr 4.9 Arg 5.6 Alm 9.5 Tyr 6.2 M@t Q・9 Val 5.7 ph・ 788 It・ 1.9 Leu 9.5 Lys 4.6 Pro*N、D。
Cal” N、D。
合計 98
*N、D、:この加水分解では測定し得ない。
0−フタルアルデヒドは、プロリンのような二級アミン
とは反応しないことが予測され、6NHC1の加水分解
ではトリプトファンやシスティンは分解する。
とは反応しないことが予測され、6NHC1の加水分解
ではトリプトファンやシスティンは分解する。
中性糖の分析
NANBH糖タン・母り(4,2μg)の試料を、4N
メタンスルフオン酸20μlとダウエックス40X8(
200〜400メツシユ、H+型)10■を含む水50
0μlで100℃にて20時間加水分解した。加水分解
物をミリポアフィルタ−(0,45μm) K通して濾
過し、4.5 mlの無水 1アルコールを加
えた。中性糖の分析は、カラム溶出後の分画をテトラゾ
リウム・ブルー(Tetrazol lumBlu・)
Kよυ誘導体に調製し、がイキンス、R,A、等がJ、
Biocham41ophys、Medoda+ 27
l−78(1980)に記載したようにウォーターズ製
クロマトグラフィー装置に覗付けたW3P陽イオン交換
カラムでその誘導体を分離することにより行なった。
メタンスルフオン酸20μlとダウエックス40X8(
200〜400メツシユ、H+型)10■を含む水50
0μlで100℃にて20時間加水分解した。加水分解
物をミリポアフィルタ−(0,45μm) K通して濾
過し、4.5 mlの無水 1アルコールを加
えた。中性糖の分析は、カラム溶出後の分画をテトラゾ
リウム・ブルー(Tetrazol lumBlu・)
Kよυ誘導体に調製し、がイキンス、R,A、等がJ、
Biocham41ophys、Medoda+ 27
l−78(1980)に記載したようにウォーターズ製
クロマトグラフィー装置に覗付けたW3P陽イオン交換
カラムでその誘導体を分離することにより行なった。
この糖タン・ぐりは約2±05%の中性糖を含んでいた
が、マンノースが主成分であり、フコースとガラクトー
スがほぼ等しい比で構成されていた。
が、マンノースが主成分であり、フコースとガラクトー
スがほぼ等しい比で構成されていた。
第1A図はNANBH血清をDEAE−セルロースのカ
ラムにかけた際の特徴的な溶出曲線を示し、第1B図は
NANBHではない患者または正常人の血清のそれを示
す。接種物Iでは4つの主なタンノ9りのピークが現わ
れ(第1A図)、他の3人のNANBH血清でも同様で
あった(第1表)。
ラムにかけた際の特徴的な溶出曲線を示し、第1B図は
NANBHではない患者または正常人の血清のそれを示
す。接種物Iでは4つの主なタンノ9りのピークが現わ
れ(第1A図)、他の3人のNANBH血清でも同様で
あった(第1表)。
ピークIは血清グロブリンを含んでいたが、これは抗ヒ
) IgGに対する免疫拡散法により証明された。ピー
ク■はクロマトグラフィーにかけたすべての血清におい
て常に現われた。ピーク■にはアルブミンが含まれてい
ることがrルミ気泳動にて示された。ピーク■はNAN
BAH患者の血清に特有のものであった。このピークは
、NANBHをヒトまたはチンパン・ノー若しくは双方
に伝染させる4つの血清すべてにおいて現われた。とこ
ろが、NANBHと診断された1人の患者の血清にはこ
のピークが見られなかったが、かといってその血清によ
り病気が伝染しないと証明されたわけではない(第1表
)。
) IgGに対する免疫拡散法により証明された。ピー
ク■はクロマトグラフィーにかけたすべての血清におい
て常に現われた。ピーク■にはアルブミンが含まれてい
ることがrルミ気泳動にて示された。ピーク■はNAN
BAH患者の血清に特有のものであった。このピークは
、NANBHをヒトまたはチンパン・ノー若しくは双方
に伝染させる4つの血清すべてにおいて現われた。とこ
ろが、NANBHと診断された1人の患者の血清にはこ
のピークが見られなかったが、かといってその血清によ
り病気が伝染しないと証明されたわけではない(第1表
)。
クロマトグラフィー操作から得た各タンパク分画にNA
NBAH関連抗原があるかどうかをカウンター電気泳動
(cEP )により調べた。抗原活性は、NANBHを
伝染させることが知られている4検体すべてのタンノ9
クビーク1.■および■に見出された。接種物Iから得
られたタン/?クビーク■ヲ、ConA−セファロース
クロマトグラフィーにより更に精製した。すると主タン
・9クビークが2つに分かれた。最初のピークは、カラ
ムのマトリクスに吸着せずに溶出した。更に、この部分
はCEP検定によると免疫沈降線を示さなかった。第2
のピークは、20 mM a−メチルマンノシドを含む
緩衝液で溶出したが、CEP検定では陽性であった。こ
のことから、NANBH関連の可溶性抗原は糖タンパク
であることが示された。
NBAH関連抗原があるかどうかをカウンター電気泳動
(cEP )により調べた。抗原活性は、NANBHを
伝染させることが知られている4検体すべてのタンノ9
クビーク1.■および■に見出された。接種物Iから得
られたタン/?クビーク■ヲ、ConA−セファロース
クロマトグラフィーにより更に精製した。すると主タン
・9クビークが2つに分かれた。最初のピークは、カラ
ムのマトリクスに吸着せずに溶出した。更に、この部分
はCEP検定によると免疫沈降線を示さなかった。第2
のピークは、20 mM a−メチルマンノシドを含む
緩衝液で溶出したが、CEP検定では陽性であった。こ
のことから、NANBH関連の可溶性抗原は糖タンパク
であることが示された。
中性糖を分析したところ、糖タンノ?りの2±05チが
マンノース、ガラクトースおよびフコースから成ってい
た。Con A−セファロースカラムからの第2ピーク
は更にDEAE−セルロースに吸着した。単一で対称な
タンノ!クピークハ、 20mMから50 mM I
Jン酸カリウム緩衝液の直線濃度勾配をかけて溶出した
。精製抗原の全段階後の回収率は血清10m1から約7
20μgすなわち全血清タンノ!りの0.2チである。
マンノース、ガラクトースおよびフコースから成ってい
た。Con A−セファロースカラムからの第2ピーク
は更にDEAE−セルロースに吸着した。単一で対称な
タンノ!クピークハ、 20mMから50 mM I
Jン酸カリウム緩衝液の直線濃度勾配をかけて溶出した
。精製抗原の全段階後の回収率は血清10m1から約7
20μgすなわち全血清タンノ!りの0.2チである。
精製糖タンパク(NANBH関連抗原)の5O8−PA
GE上での移動度を第2図に示す。ここでは、様々な分
子量のマーカータンiJ?りの移動度を比較の対象とし
た。この図で1分子量既知のマーカータンパクの位置は
右側の数字で示す。列a、bおよびCの染色バンドは、
試料濃度がそれぞれ19.2μN、9.6μgおよび2
.4μgのときの抗原サブユニット(単量体)の位置を
示す。マーカータンパクの移動度に基づき各タン・譬り
の分子量の対数をとって作った検量線は直線を示し、こ
れからこの糖タン・ヤク単量体の分子量は77.000
と計算された。
GE上での移動度を第2図に示す。ここでは、様々な分
子量のマーカータンiJ?りの移動度を比較の対象とし
た。この図で1分子量既知のマーカータンパクの位置は
右側の数字で示す。列a、bおよびCの染色バンドは、
試料濃度がそれぞれ19.2μN、9.6μgおよび2
.4μgのときの抗原サブユニット(単量体)の位置を
示す。マーカータンパクの移動度に基づき各タン・譬り
の分子量の対数をとって作った検量線は直線を示し、こ
れからこの糖タン・ヤク単量体の分子量は77.000
と計算された。
固相RIA検定によれば、アカグザル877から得た7
S IgGはNANBH患者の血清とのみ反応した。
S IgGはNANBH患者の血清とのみ反応した。
また、これはDEAEクロマトグラフィーから溶出した
ピーク■とのみ反応し、他のピーク■側または■とは反
応しなかった。更に、放射標識した7 S IgGは、
感染性のNANBH物質を含むことが知られている接種
物Iのショ糖密度勾配分画と反応した(第3図)。第3
図は、感染性の証明されたNANBH接種物をショ糖密
度勾配にかけて得られた曲線を示す。放射標識したアカ
rザル877の免疫血清が、可溶型として血清に遊離し
ているNANBH関連抗原と密度1.14.!i’AI
/!で粒子表面に存在しているNANBH関連抗原双方
に結合することを示している。更に100mMNaC1
および1mM EDTAを含む100mM)リスーHC
1緩衝液(FJ(7,4)に10ないし60重量%のシ
ョ糖勾配をかけた液上に血清300μlを重層し、5W
41Tio−ターに入れ30.00 Orpmにて19
時間遠心した。各分画を、ショ糖を除くために透析した
後、NANBH関連抗原に対する放射標識抗体と反応さ
せた。抗体は、密度1.14 、!i’/mlのショ糖
勾配分画に結合した。この密度は、セト等によりLan
cet、2.941−943(1984)に記載された
これら血清中のNANBH物質を検体として調べたとき
のものと等しいようであった。更に、結合は、糖タンパ
クの密度と一致するショ糖勾配の先端分画で見られた。
ピーク■とのみ反応し、他のピーク■側または■とは反
応しなかった。更に、放射標識した7 S IgGは、
感染性のNANBH物質を含むことが知られている接種
物Iのショ糖密度勾配分画と反応した(第3図)。第3
図は、感染性の証明されたNANBH接種物をショ糖密
度勾配にかけて得られた曲線を示す。放射標識したアカ
rザル877の免疫血清が、可溶型として血清に遊離し
ているNANBH関連抗原と密度1.14.!i’AI
/!で粒子表面に存在しているNANBH関連抗原双方
に結合することを示している。更に100mMNaC1
および1mM EDTAを含む100mM)リスーHC
1緩衝液(FJ(7,4)に10ないし60重量%のシ
ョ糖勾配をかけた液上に血清300μlを重層し、5W
41Tio−ターに入れ30.00 Orpmにて19
時間遠心した。各分画を、ショ糖を除くために透析した
後、NANBH関連抗原に対する放射標識抗体と反応さ
せた。抗体は、密度1.14 、!i’/mlのショ糖
勾配分画に結合した。この密度は、セト等によりLan
cet、2.941−943(1984)に記載された
これら血清中のNANBH物質を検体として調べたとき
のものと等しいようであった。更に、結合は、糖タンパ
クの密度と一致するショ糖勾配の先端分画で見られた。
このことは、この抗原がウィルス粒子表面上に存在して
いるばかりでなく可溶性タンパクとしても存在している
ことを示している。
いるばかりでなく可溶性タンパクとしても存在している
ことを示している。
実施例I
NANBH関連抗原に対する了カダザル抗体を利用する
固相放射性免疫検定法を用いて、パルチモアおよびメリ
ーランドに住んでいるウィルス性肝炎の患者から診断時
に得られた血清について、NANBH関連糖タンノJ?
りの有無を調べた。結果を第■表に示す。この糖タン・
9りは、A型またはB型肝炎にかかっている15人の全
ての患者からのどの血清にも検出されなかった。一方、
この抗原は86検体の対照血清のうち2検体、慢性NA
NBH患者からの15検体の血清のうち15m体、慢性
に進行していなかったNANBT(患者からの血清28
検体のうち3検体に検出された。急性NANBH患者の
ほとんどの血清にこの抗原が検出されなかった説明とし
て次のことが考えられる。
固相放射性免疫検定法を用いて、パルチモアおよびメリ
ーランドに住んでいるウィルス性肝炎の患者から診断時
に得られた血清について、NANBH関連糖タンノJ?
りの有無を調べた。結果を第■表に示す。この糖タン・
9りは、A型またはB型肝炎にかかっている15人の全
ての患者からのどの血清にも検出されなかった。一方、
この抗原は86検体の対照血清のうち2検体、慢性NA
NBH患者からの15検体の血清のうち15m体、慢性
に進行していなかったNANBT(患者からの血清28
検体のうち3検体に検出された。急性NANBH患者の
ほとんどの血清にこの抗原が検出されなかった説明とし
て次のことが考えられる。
(1)他の中毒性肝疾患をともなった多くのNANB)
(症例を除くことにより診断が下されるために生じる誤
診。
(症例を除くことにより診断が下されるために生じる誤
診。
(2)第2の試薬が原因で抗原陰性となる。
(3)慢性に進行していない症例の初期の血清から抗原
が消失する。
が消失する。
(4)抗原検出感度の欠如。
しかし、慢性NANBAHの15例すべてに抗原が存在
することは、この疾病にこの抗原が特異的であること、
およびNANBAHキャリヤーまたは血清若しくは血漿
由来でNANBHウィルスが夾雑した製品の検出のため
にこの抗原をスクリーニングに利用できることを示して
いる。
することは、この疾病にこの抗原が特異的であること、
およびNANBAHキャリヤーまたは血清若しくは血漿
由来でNANBHウィルスが夾雑した製品の検出のため
にこの抗原をスクリーニングに利用できることを示して
いる。
抗原陽性と診断されたすべての患者は、急性疾患後その
血清中に抗原が検出され続ける(6週間追試)ことに注
意する必要がある。
血清中に抗原が検出され続ける(6週間追試)ことに注
意する必要がある。
実施例■
この糖タンノJ?り抗原のワクチンとしての利用性を試
べるために、アカゲザルを抗原で免疫し、その血清を以
下に記する「受動免疫」によりNANBH感染に対して
チンパンジーを保護するために使われた。(アカグデル
自身はNANBH感染に非感受性であるため、この技法
が必要である。)この研究のために、−匹のチンパンジ
ー(Na1292)に感染性が証明されたNANBH接
種物(接種物I) 1mg (to2−y−ン、+ンシ
ー感染量)とアカゲザルの[免疫血清J 1 rnlの
混合物を静注した。このチンパンジーはいかなる感染の
症候を示さなかった。一方、上記の接種物Iの1mlと
アカゲザルの[免疫前血清Jim/の混合物を接種した
対照チンパンジー(N+11290)は肝炎を発症し、
接種12週後から血清アミノトランフェラーゼ(肝酵素
)の上昇が認められた。
べるために、アカゲザルを抗原で免疫し、その血清を以
下に記する「受動免疫」によりNANBH感染に対して
チンパンジーを保護するために使われた。(アカグデル
自身はNANBH感染に非感受性であるため、この技法
が必要である。)この研究のために、−匹のチンパンジ
ー(Na1292)に感染性が証明されたNANBH接
種物(接種物I) 1mg (to2−y−ン、+ンシ
ー感染量)とアカゲザルの[免疫血清J 1 rnlの
混合物を静注した。このチンパンジーはいかなる感染の
症候を示さなかった。一方、上記の接種物Iの1mlと
アカゲザルの[免疫前血清Jim/の混合物を接種した
対照チンパンジー(N+11290)は肝炎を発症し、
接種12週後から血清アミノトランフェラーゼ(肝酵素
)の上昇が認められた。
双方における混合物は、各チン・fンジーに静注する前
に、37℃で1時間続いて4℃にて18時間インキュベ
ーションして調製したものである。「免疫血清」はNA
NBH関連糖タ関連量タン対する抗体を含んでいたが、
「免疾前血清」はNANBA関連糖タンノ4りでの免疫
化に先立って同じアカゲザルより採取されたものである
。従りて、それはその糖タン・や夕に対する特異抗体以
外すべての血清成分を含んでいた。
に、37℃で1時間続いて4℃にて18時間インキュベ
ーションして調製したものである。「免疫血清」はNA
NBH関連糖タ関連量タン対する抗体を含んでいたが、
「免疾前血清」はNANBA関連糖タンノ4りでの免疫
化に先立って同じアカゲザルより採取されたものである
。従りて、それはその糖タン・や夕に対する特異抗体以
外すべての血清成分を含んでいた。
この発明には様々な応用面があり、 NANBHまたけ
その感染因子を有するキャリヤーを検出し、固定するた
めの特異性の高いキットを製造することもその一つであ
る。そのキットは、特に上記の如く単離精製した糖タン
・ぐりおよび免疫原として前記糖タンパクを使って調製
した抗体あるいはそのうちどちらか一方を含む容器がら
成る。もちろん、そのキットには、一般的がっ共通の他
の付属品(例えば、試薬および緩衝液、マイクロタイタ
ープレート、プレートリーダー、 ;マイクロビ
イット、螢光または放射活性マーカー等)が含まれてい
てもよい。
その感染因子を有するキャリヤーを検出し、固定するた
めの特異性の高いキットを製造することもその一つであ
る。そのキットは、特に上記の如く単離精製した糖タン
・ぐりおよび免疫原として前記糖タンパクを使って調製
した抗体あるいはそのうちどちらか一方を含む容器がら
成る。もちろん、そのキットには、一般的がっ共通の他
の付属品(例えば、試薬および緩衝液、マイクロタイタ
ープレート、プレートリーダー、 ;マイクロビ
イット、螢光または放射活性マーカー等)が含まれてい
てもよい。
製剤、例えば、NANBT(を防ぎまたは調節するため
のワクチンを、この発明の手法に従って製造することも
可能である。この際、この発明の単離精製抗原を、それ
に対する抗体を誘導するに適した量で被験者に投与する
ために、その抗原を薬理学的に許容し得る担体(fll
えば、生理食塩等に加えておくとよい。
のワクチンを、この発明の手法に従って製造することも
可能である。この際、この発明の単離精製抗原を、それ
に対する抗体を誘導するに適した量で被験者に投与する
ために、その抗原を薬理学的に許容し得る担体(fll
えば、生理食塩等に加えておくとよい。
環元剤を加えずに行なったNANBH糖タンノ9りの目
?リアクリルアミド電気泳動パターン(挿入図)、およ
び高速液体クロマトグラフィ=(HPLC)溶出曲線を
示し、このNANBH糖タンパクが均−fあることを表
している。NANBH糖タンパクを、SDS tたは2
−メルカプトエタノールを加えない変法に従って8%の
ポリ了クリルアミドグル上で電気泳動にかけた。また、
NANB AH糖タンパク(7μg)をrル排除HPL
Cにがけた。タンパクの溶出を280 nmの吸光度(
フルスケール50mAV)で検出した。
?リアクリルアミド電気泳動パターン(挿入図)、およ
び高速液体クロマトグラフィ=(HPLC)溶出曲線を
示し、このNANBH糖タンパクが均−fあることを表
している。NANBH糖タンパクを、SDS tたは2
−メルカプトエタノールを加えない変法に従って8%の
ポリ了クリルアミドグル上で電気泳動にかけた。また、
NANB AH糖タンパク(7μg)をrル排除HPL
Cにがけた。タンパクの溶出を280 nmの吸光度(
フルスケール50mAV)で検出した。
第4図は、NANBH糖タンパクおよびHTLV II
I抗原に対する反応性を示すケ゛ル電気泳動図を示す。
I抗原に対する反応性を示すケ゛ル電気泳動図を示す。
左側のノeネルは、グルをクマシブルーで染色シたもの
で、左端はマーカータンパク、(a)は4.2μgのN
ANB)T糖タンパク、()))は33μyのHTLV
■抗原の各電気泳動図である。右側のパネルは、アカケ
9デルの免疫血清を用いた(a) NANBA糖タンノ
ンク、(b)74にダルトンのHTLV Illllタ
ンクのイムノプロット図である。
で、左端はマーカータンパク、(a)は4.2μgのN
ANB)T糖タンパク、()))は33μyのHTLV
■抗原の各電気泳動図である。右側のパネルは、アカケ
9デルの免疫血清を用いた(a) NANBA糖タンノ
ンク、(b)74にダルトンのHTLV Illllタ
ンクのイムノプロット図である。
第1A図は、NANBH患者血清を試料とした、第1B
図はB型肝炎患者血清を試料としだr)EAE−セルロ
ースクロマトグラフィー図。第2図は、ヒト血清からの
NANBH関連抗原のsDs −PAGE図。第3図は
NANBH関連抗原をショ糖密度勾配遠心した後の分画
とその抗原に対する放射標識抗体との結合曲線図。第4
図はNANBH糖タンノ’?り抗原およびHTLV■抗
原とぞれらに対する抗体との反応性を示す図。¥ワ(4
1よ、目へ1Jf3H”lN 9−/八” ’7 X
4A ’F”F ’ l−了−Hetc−ン@
v 1fjh を東1町出願人代理人 弁理士
鈴 江 武 彦図面の浄書(内容に変更なし) Ob FIG、4 b 手続補正書(方式) 51.8.19 昭和 年 月 日 特許庁長官 黒 1)明 雄 殿 今生4恰旧
=2、発明の名称 非A非B肝炎誘発因子から得た精製抗原3、補正をする
者 事件との関係 特許出願人 名称 アメリカ合衆国 4、代理人 住所 東京都千代田区霞が関3丁目7番2号 UBEビ
ル昭和61年5月27日 6、補正の対象 適正な願書(代表者の氏名、特許出願人の欄の住所)1
、補正の内容 (1)委任状およびその訳文については別紙の通り(2
)特許出願人の欄の住所を別紙訂正願書の通り訂正する
。 (3)明細書の第28頁第13行目ないし第14行目に
於て、rNANBH関連抗原の5DS−PAGE図。」
とあるをrNANBH関連抗原生物形態の電気泳動写真
図。」と訂正する。 (4)同頁第18行目に於て、「抗体との反応性を。 示す図。」とあるを「抗体との反応性を示す生物形態の
電気泳動写真図。」と訂正する。 (5)同頁第19行目に於て、rHPLc溶出曲線図。 」とあるを、rHPLC溶出曲線図であり、同図中の挿
入図は生物形態の電気泳動写真図である。」と訂正する
。 (6)図面の浄書(内容に変更なし) (−1) メ嬶Aンイ唖所5あL明4tのM7J+=
〈2・・71才 勾in略60−卒o’/ 7.!;g
1:偵ん緊#■る。 8、添付書類の目録
図はB型肝炎患者血清を試料としだr)EAE−セルロ
ースクロマトグラフィー図。第2図は、ヒト血清からの
NANBH関連抗原のsDs −PAGE図。第3図は
NANBH関連抗原をショ糖密度勾配遠心した後の分画
とその抗原に対する放射標識抗体との結合曲線図。第4
図はNANBH糖タンノ’?り抗原およびHTLV■抗
原とぞれらに対する抗体との反応性を示す図。¥ワ(4
1よ、目へ1Jf3H”lN 9−/八” ’7 X
4A ’F”F ’ l−了−Hetc−ン@
v 1fjh を東1町出願人代理人 弁理士
鈴 江 武 彦図面の浄書(内容に変更なし) Ob FIG、4 b 手続補正書(方式) 51.8.19 昭和 年 月 日 特許庁長官 黒 1)明 雄 殿 今生4恰旧
=2、発明の名称 非A非B肝炎誘発因子から得た精製抗原3、補正をする
者 事件との関係 特許出願人 名称 アメリカ合衆国 4、代理人 住所 東京都千代田区霞が関3丁目7番2号 UBEビ
ル昭和61年5月27日 6、補正の対象 適正な願書(代表者の氏名、特許出願人の欄の住所)1
、補正の内容 (1)委任状およびその訳文については別紙の通り(2
)特許出願人の欄の住所を別紙訂正願書の通り訂正する
。 (3)明細書の第28頁第13行目ないし第14行目に
於て、rNANBH関連抗原の5DS−PAGE図。」
とあるをrNANBH関連抗原生物形態の電気泳動写真
図。」と訂正する。 (4)同頁第18行目に於て、「抗体との反応性を。 示す図。」とあるを「抗体との反応性を示す生物形態の
電気泳動写真図。」と訂正する。 (5)同頁第19行目に於て、rHPLc溶出曲線図。 」とあるを、rHPLC溶出曲線図であり、同図中の挿
入図は生物形態の電気泳動写真図である。」と訂正する
。 (6)図面の浄書(内容に変更なし) (−1) メ嬶Aンイ唖所5あL明4tのM7J+=
〈2・・71才 勾in略60−卒o’/ 7.!;g
1:偵ん緊#■る。 8、添付書類の目録
Claims (8)
- (1)(a)ドテシル硫酸ナトリウム含有ポリアクリル
アミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)による分子量
が約77,000の単量体であり、 (b)アカゲザルの免疫血清と反応し、 (c)主にマンノースおよびほぼ同じ比率のフコースお
よびガラクトースからなる炭水化物を約2%含む糖蛋白
質であり、 (d)芳香族アミノ酸組成は、フェニルアラニン、チロ
シンおよびトリプトファンの分子数比が3:3:1であ
り、および (e)免疫原である、 単離、精製した非A非B肝炎(NANBH)関連抗原。 - (2)キャリヤーまたは感染原中にNANBH因子の存
在を検出するための特異的マーカーである特許請求の範
囲第1項記載の抗原。 - (3)血液センターまたはプラスマフェレーシス施設で
血液をスクリーニングするための特異的血清マーカーで
ある特許請求の範囲第2項記載の抗原。 - (4)前記抗原に特異的に反応する宿主抗体を誘導し得
る特許請求の範囲第1項記載の抗原。 - (5)NANBH感染を阻害し得る特許請求の範囲第4
項記載の抗体。 - (6)他の抗原から前記抗原を識別するに適する特許請
求の範囲第4項記載の抗体。 - (7)(a)ドテシル硫酸ナトリウム含有ポリアクリル
アミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)による分子量
が約77,000の単量体であり、 (b)アカゲザルの免疫血清と反応し、 (c)主にマンノースおよびほぼ同じ比率のフコースお
よびガラクトースからなる炭水化物を約2%含む糖蛋白
質であり、 (d)芳香族アミノ酸組成は、フェニルアラニン、チロ
シンおよびトリプトファンの分子数比が3:3:1であ
り、および (e)免疫原である、 単離、精製した非A非B肝炎(NANBH)関連抗原が
入った容器を含み、NANBH因子のキャリヤー、病原
または発生原をスクリーニングまたは検出するためのキ
ット。 - (8)前記抗原と特異的に反応する抗体が入った容器を
含む特許請求の範囲第7項記載のキット。
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