JPS60501179A

JPS60501179A - ヒトｔ細胞白血病ウイルスの検出方法及び検出用物品

Info

Publication number: JPS60501179A
Application number: JP59502043A
Authority: JP
Inventors: エセクス，マイロン　イー; リー，トウン‐ホウ
Original assignee: プレジデント　アンド　フエロウズ　オブ　ハ−バ−ド　カレツジ
Priority date: 1983-04-27
Filing date: 1984-04-13
Publication date: 1985-07-25
Anticipated expiration: 2013-07-23
Also published as: AU2826184A; DE3486404D1; EP0151579A1; FI89175B; EP0151579A4; FI89175C; ATE127517T1; FI845061A0; EP0151579B1; FI845061L; WO1984004327A1; DE3486404T2; JP2780020B2; AU583473B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ヒ）Ｔ細胞白血病ウィルスの検出方法及び検出用物品本発明は、ヒ）Ｔ細胞伯血病ウィルスに感染した細胞の細胞表面膜に見い出される糖蛋白質の新規な精製形態に関し、さらにこの糖蛋白質に存在する抗原決定子に対する抗体の存在を生物学的試料中で検出するための分析に関するものである。

と）Ｔ細胞白血病ウィルス（ＨＴＬＶ）は、特定種類のヒト白血病、すなわち成人におけるＴｌ１Ｂ胞型と密接に関連することが知られている。さらに、人体がこのウィルスに対する抗体を有するヒトは全て、明らかにこのウィルスに潜在的に感染していることも示され゛ている〔エセックス（Ｅｓ５ｅｘ　）、Ｊ　、Ｎ、Ｃ１Ｉ　、第６９巻、第９８１−５頁（１９８２））。このウィルスの主たる核蛋白質が研究されかつ感染細胞に対する抗体の免疫螢光分析法が記載されており、この方法は、たとえばＭＴＩ又はＭＴＺのような感染ヒト細胞の細胞ラインからの細胞を固定し、コレら固定細胞と分析すべき試験血清とを接触させ、かつ細胞表面に対する血清の結合が、ヒ）ＩｇＧに対する螢光標識された抗体とその後に接触させることにより生じたかどうかを決定することからなっている〔ヒヌマ（Ｈｉｎｕｍａ　）　等、グロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス、第７８巻、第６４７．６−６４８０号（１９８１））。ご・′ン分析は面倒かつ使用困難である。

何故なら、固定細胞の僅か１〜５％のみが、必要な抗原特性を示すに過ぎないからである。さらに、若干類似した細胞表面免疫螢光分析法を使用することも提案されており、この分析法においては感染細胞の培養物を試験血清と共に培養し、次いでヒ）　ＩｇＧに対する螢光標識されたウサギ抗体と共に培養して、細胞に対する血清の結合が生じたかどうかを決定する〔ｐノクートーグロフ（Ｒｏｂｅｒｔ−Ｇｕｒｏｆｆ　）等、サイエンス、第２１５巻、第９７５−９７８頁（１９８２））。）（ＴＬＶの核蛋白質の２種であるｐ２４及びｐ１９に対する抗体の放射線免疫分析も記載されている〔ボスナー（Ｐｏ５ｎｅｒ　）　等、ジャーナル・エキスベリメンタル・メソッド、第１５４巻、第３３３−３４４頁（１９８１）。しかしながら、この分析は、感染性ウィルスに露呈され、したがって危険状態にあるが、これら２種の抗原に対する検出可能なレベルの抗体を持たない全ての個人についてはプラスの結果を与えない。

発明の要点今回、ＨＴＬＶに感染したヒ）Ｔ細胞の細胞表面に存在する特定のポリペプチド若しくは糖蛋白質は、精製しかつ単離すると、ＨＴＬＶに感染したヒト細胞、ヒトＴ細胞白血病細胞及び（又は）ＨＴＬＶに対する抗体に関し高度の感受性と免疫特異性とを示す抗原決定子を有することが見い出された。したがって、はぼ純粋な楯蛋白又はその非グリコジル化成分は、ＨＴＬＶにより感染されている細胞を有するかどうかを決定するため生物学的試料を分析する診断用具として有用である。免疫学的に交叉反応性の抗原決定子を有する他のポリペプチドも同じ目的に有用である。「免疫学的に交叉反応性の抗原決定子を有するポリペプチド」という表現は、所定の抗体が反応する抗原決定子を共通して有するポリペプチドを意味する。この種の他のポリペプチドは、糖蛋白質の非グリコジル化成分を包含する。必要な免疫学的決定子を有する他の有用なポリペプチド若しくは蛋自質は、合成ポリペプチドを包含する。さらに、これらは本発明の糖蛋白質における活性決定子に対し反遺伝型（ａｎｔ　１−ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ）である抗体又はその断片をも包含する。近年、反遺伝型のモノクローナル抗体は、この反遺伝型抗体におけると同じ又はほぼ同じ抗原決定子を有する感染性生物による感染に対し免疫反応を誘発し、かつこの感染に対し保護しうろことが示された〔フイールズ（Ｆｉｅｌｄｓ　）　等、ネイチャー、第３００巻、第１９−２３頁（１９ａ２）；サックス（５ａｃｋｓ　）等、ジャーナル・エキスベリメンタル・メソッド、第４巻、第１１０８−１１１’９頁（１９８２））。

さらに、反遺伝型の試薬は、抗体上の部位と免疫学的に交叉反応性の部位をもった抗原を検出するための診断用具として有用であることも示されている〔ホトニヤツク（Ｐｏｔｏｃｎｊａｋ　）等、サイエンス、第２１５巻、第１６３７−１６３９頁（１９８２）。これを参考のためここに引用する〕。かくして、ＨＴＬＶの分析は、本発明の糖蛋白質における抗原部位と免疫学的に類似した抗原部位を有する反遺伝型の抗体、又はその免疫学上活性な断片を用いて行なうことができる。この種の反遺伝型抗体は、本発明の糖蛋白質における抗原部位に対し特異性を有する第１の抗体に対し生ぜしめることができる（すなわち、反遺伝型抗体は反−抗体である）。好ましくは、モノクローナルの反遺伝型抗体を使用する。

ＨＴＬＶ感染の分析は、このウィルスが抗体プラス型のヒトの末梢血液白血球から抗体マイナス型のヒトの白血球へこれら２種の白血球を一緒に培養すると容易に移行し得るので重要である〔ポボビツク（Ｐｏｐｏｖｉｃ　）等、サイエンス、第２１９巻、第８５６−８５９頁（１９８３）ｌ。

したがって、輸血される血液が感染細胞を含有すれば、全血輸血には感染の危険が高いと思われる。さらに、この分析は、後天的免疫欠損症候群（ＡＩＤＳ）を示す個人からの生物学的試料が新規な糖蛋白質の抗原決定子に対する抗体に関しプラスの試験結果を与え、したがってこの病気の診断を容易化させるので重要である。

したがって、さらに本発明は、ＨＴＬＶ感染細胞に対する抗体の存在に関する生物学的試料の分析方法をも包含し、この方法は前記試料を分子量約６１，０００〜６８，０００ダルトンの糖蛋白質、分子量約４６−４８．０００ダルトンの非グリコジル化成分又は分子量約４５，０００〜５２，０００ダルトンの糖蛋白質（これら糖蛋白質はＨＴＬＶに感染した細胞の細胞表面に生ずる）に対し免疫学的に交叉反応性である抗原決定子を有するポリペプチドと共に培養し、かつ前記抗体と前記ポリペプチドとの間に免疫複合体が形成されるかどうかを決定することからなっている。

さらに、本発明は、分子！６１，０００〜６８．０００ダルト／又は４５．０００〜５２．０００ダルトンの糖蛋白質の決定子に対し免疫学上交叉反応性である抗原決定子の存在につき生物学的試料を分析する方法をも包含する。

分析すべき決定子は、上記糖蛋白質自身、或いは他のポリペプチドに生じうる。

これらは、体液又はリンパ球において自由に循環することができる。この分析は、上記糖蛋白質に見い出される抗原決定子に対し、免疫反応性を有するモノクローナル又はポリクローナルな抗体を用いて公知の免疫分析法により行なうことができる。たとえば、競合免疫分析又は免疫測定（サンドインチ）分析を使用することができる。

本発明の糖蛋白質は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ゲル電気泳動により測定して約６１．０００〜６８．０００ダルトン及び約４５．０００〜５２，０００ダルトンの分子量を有し、（Ｌｌ　５Ｍ塩化ナトリウムと、ｏ、　ｏ　５　Ｍ　トリス塩酸塩（ｐＨ７，２）と、１％トリトンＸ−１００，１％デオキシコール酸ナトリウムと０．１％ドデシル硫酸ナトリウムと１ｍＭ弗化フェニルメチルスルホニルとよりなるＳＤＳ緩衝液に可沼性である。トリトンＸ−１ｏｏは非イオン性表面活性剤（オクチルフエノキシボリエトキシ（９−１０）エタノール）である。６１，０００〜６８，０００ダルトンの糖蛋白質の非グリコジル化成分は約４６．０００〜４８．０００ダルトンの分子量を有し、糖蛋白質自身とほぼ同じ抗原決定子を含有する。

糖蛋白質はＨＴＬＶ感染細胞から得ることができる。

ＨＴＬＶが永久的かつ持続的に感染した各種の細胞ラインが調製されており、それらのうちＭＪ、Ｃｓ−ＭＪ。

Ｃ９１ＰＬ及びＨＵＴ−１０２を挙げることができる。恐らく、新規な糖蛋白質の正確な寸法は種々異なる細胞ラインにおいて僅か異なっているが、これら糖蛋白質の共通する免疫学的に交叉反応性の部分は細胞ラインに関係なく同じである。何故なら、これはＨＴＬＶにより誘発された蛋白質であるからである。したがって、ウィルスを有する任意の細胞を、新規な糖蛋白質の適当な原料とすることができる。ウィルスを有する任意の感染細胞からこの蛋白質を得るには、細胞を代謝標識しくたとえは、５Ｂ５−メチオニンにより）かつＨＴＬＶ感染した患者から得られる抗体で免疫沈殿させる。次いで、新規な糖蛋白質をゲル電気泳動により検出し、かつ単離することができる。本発明で使用される［ＨＴＬＶＪという用語は、ウィルスを一般的に包含することを意味する。したがって、全ゆる形態、亜型又は変態のウィルスが包含される。

たとえば、これら糖蛋白質はヒ）Ｔ細胞白血病細胞培養物ＭＪ　、Ｃｓ−ＭＪ　、ＣｑｌＰＬ及びＨＵ’ｌ’−１０２の細胞表面に存在する。ＭＪ及びＣｓ−ＭＪの試料は１９８３年４月２６日付けでアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにそれぞれＡＴＣＣｍＣＲＬ−［２９４及びＣＲＬ−８２９５として寄託されている。

これら糖蛋白質は、これら細胞ラインの細胞からその溶菌及びＳＤＳゲル電気泳動により容易に分離することが・できる。

精製されかつ単離された糖蛋白質或いはそれに対し免疫学的に交叉反応性の任意の抗原を、これに対して特異性の抗体の存在、すなわちＨＴＬ、Ｖに感染した細胞の試料及び（又は）ＡＩＤＳの徴候の存在につき生物学的試料で検出する任意慣用の分析法に標準抗原として使用することができる。この種のＨＴＬＶ抗原に対し特異性の抗体は、たとえばＨＴＬＶ感染を伴なわない肝炎のような病気に罹患した患者では見られない。

糖蛋白質又はそれに対し免疫学的に交叉反応性のポリペプチドは、常法によって放射線免疫分析に使用するために１１２５若しくはＳ３５若しくはＨ３で標識することができ、或いは螢光免疫分析のためにフルオレセインで標識し、或いは酵素免疫分析法のために酵素で標識し、或いはビオチン−アビジン結合分析のためにビオチンで標識することができる。競合免疫分析並びに２種の抗体を使用する二重抗体分析において、これは所望に応じて標識したものでも或いは標識されないものでも使用することができ、遺伝型二反遺伝型種類、より詳細には抗−Ｆｃ抗体を使用する第２抗体型、或いは他の分析法のいずれで使用することもできる。

代案として、新規な糖蛋白質又はこれに対し免疫学的に交叉反応性のポリペプチドは、たとえば不溶性樹脂のような不溶相に固定化することができ、かつ抗−糖蛋白質抗体の検出をこの不溶相に対するその結合を測定して行なう。不溶相はさらにラテックス粒子をも包含する。

これは新規な糖蛋白質又はその免疫学的に交叉反応性のポリペプチドで被覆し、かつ抗−糖蛋白質抗体に露呈すると凝固する。さらに他の不溶相は試験管、壜、滴定穴などをも包含し、これらに新規な糖蛋白質又はその免疫学的に交叉反応性のポリペプチドを結合させ、その抗体を二重抗体技術又は蛋白質−Ａ依存性技術により検出することができる。

ＨＴＬＶに対する抗体の分析は、それぞれ分子量６１−６８．０００ダルトン及び４６−５２．０００ダルトンの糖蛋白質を粗製型で使用することができ、これら蛋白質を実質的に純粋な形態で使用することに限定されない。

たとえば、糖蛋白質は先ず最初に実質的に精製し、次いでこれらを混合することができる。或いは、粗製混合物を使用することもできる。１具体例において、ＨＴＬＶに対する抗体の存在に関する分析は、試料中の付加的抗体、たとえばＨＴＬＶ核蛋白質ｐ１？、ｐ２４又はこれら両者の混合物に対する抗体の検出を包含する。この具体例において、方法は試料を１）本発明の一方若しくは両方の糖蛋白質（すなわち６１．０００〜６８．０００ダルトン及び（又は）４へｏｏｏ〜５２．０００ダルトン又はその免疫学的に交叉反応性のポリペプチド）と、必要に応じ２）ＨＴＬＶ核蛋白質ｐ２４若しくはｐ１９又はその両者とからなる試薬と共に培養し、かつ試料中の抗体とこの試薬との間で免疫複合体が形成されるかどうかを決定することからなっている。

上記診断法を実施するのに必要な要素をキットに存在させることができる。この種のキットは分室を形成して、そこに１種若しくはそれ以上の容器を収容するキャリヤを備え、前記容器のそれぞれは試験を実施するのに必要な１種若しくはそれ以上の要素を含む。

たとえば、第１の容器は精製された糖蛋白質又はその免疫学的に交叉反応性のポリペプチドの一方若しくは両方を、検出可能に標識され或いは不溶化された形態で含有することができる。

第２の容器は、二重抗体結合分析に有用な抗ＩｇＧ抗体（ポリクローナル若しくはモノクローナル）、すなわち糖蛋白質又はその免疫学的に交叉反応性のポリペプチドにおける標識の検出に必要とされる要素（たとえば発色性基質）を含むことができる。

他の容器は、糖蛋白質の一方又はその免疫学的に交叉反応性のポリペプチドを種々異なる量で含み、これを使用して標準曲線を作成し、これに実験結果を内挿させることができる。これら材料自身は溶液、凍結乾燥或いはたとえば不活性蛋白質などの他の不活性材料と混合してキット中に存在させることができる。

試験する生物学的試料は血液、血清、リンパ球、尿、組織、唾液、大便などを包含する。特に興味あるものは、血液がＨＴＬＶで汚染されていないことを確証するための血液銀行における血液のスクリーニングである。血液から得られる物質、たとえばワクチンのスクリーニングも本発明の方法で行なうことができる。

以下、特定例により本発明をさらに充分説明するが、これらのみに限定されない。

Ａ、２種の細胞ラインＭＪ及びＣｓ−ＭＪからのヒトＴ細胞白血病細胞を、別々に対数増殖期の際に収穫した。

メチオニンを含まないマツコイの（ＭｃＣｏｙ’ｓ　）　ｓ　Ａ培地で１回洗浄した後、細胞の各試料をメチオニンを含有しないマツコイ５Ａと１０Ｘ’Ｊン酸塩緩衝塩水（ＰＢＳ）と透析胎児牛血清とＳリメチオニン１００μＣｉ／ｍＪとよりなる標識用培地に再懸濁させた。２〜４時間脈動させた後、放射線標識した細胞を冷ＰＢＳで３回洗浄した。

次いで、細胞ベレットをα６〜１０−の冷溶菌緩衝液（ＲＩ　ＰＡ）（０，１ｓＭ塩化ナトリウム、α０５Ｍトリス−塩酸塩（ｐＨ７，２）、１％トリトンＸ− １ｏｏ湿潤剤、１Ｘデオキシコール酸ナトリウム、０１％ドデシル硫酸ナトリウム及び匍Ｍ弗化フェニルメチルスルホニル：で溶菌させた。間けつ的に１０分間回動させた後、混合物を４℃にて１００，０ＯＯＸ、９で１時間遠心分離した。

溶菌物の上澄液から、蛋白質−Ａが被覆された炭水化物ビーズ（セファロースＣＬ−４Ｂ）に対する４℃で１時間の吸収により非特異性結合成分を予備除去した。

Ｂ、細胞表面膜蛋白質の標識は、ラクトペルオキシダーゼで触媒される放射性沃素化により行なう。９９％より大きい生存性を有する各ラインにつき５Ｘ１０’ 　個の細胞よりなる３つの部分を、それぞれ別々に１ｍｃｉのキャリヤを含有しないＮａ１１２５により５０μｌ　のキャリヤ支持されたラクトペルオキシダーゼとグリコシダーゼ（エンチモビーズ、ビオ−ラド・ラボラトリーズ社）及び２５μｌ　の１％β−Ｄ−グルコースとの存在下で沃素化させた。反応が終了した後、沃素化細胞の前記３つの部分を集めて、上記（Ａ）に記載したと同じ溶菌及び予備除去法にかけた。

Ｃ０対数培殖期のピークにおけるＭＪ及びＣｓ−ＭＪ細胞を別々に回収し、次いで１η／ｄのピルビン酸ナトリウムが補充されたグルコースを含有しないＲＰＭＩ−１６４０培地に２時間再懸濁した。このグルコース飢餓の後、これら細胞に１００μＣｉ／＋ｄのＨ３−グリコースアミンにュー・イングランド・ヌクレア社）を５〜６時間標識した。この方法により、細胞中に存在する１ｌｔＩＪｊｉ白質のみのトリチウム標識が得られた。次いで、これらの標識細胞を上記（Ａ）に記載したと同じ溶菌及び予備除去処理にかけた。

糖蛋白質の標識非グリコジル化成分の作成り、対数増殖期のピークにおけるＭＪ及びＣ５−ＭＪ細胞を別々に収穫し、かつ１０Ｘ胎児牛血清と、１　％抗生物質 −抗菌物質混合物と、２０μｍ／／１１４１のツニカマイシンとが補充されたマツコイ５Ａ培地に２時間再懸濁させた。このトリミング工程の後、細胞を２０μ ｇ／ＩＲＩのツニカマイシンの存在下に１００μＣｉ／ｍの３５５−メチオニンで２時間標識した。この標識した材料を、次いで上記（Ａ）で記載したと同じ溶菌及び予備除去処理にかけた。

蛋白質−抗体複合体の形成Ｅ、蛋白質−人で被覆されたビーズの各部分に、（ａ）ＨＴＬＶに感染した細胞に対する抗体を有することが知られた個人の陽性比較血清と、（ｂ）感染してない個人からの陰性比較血清と、（Ｃ）試験すべき未知の個人から得られた血清とを結合させた。次いで、被覆ビーズの各部分を上記（Ａ）からのＭＪ及びＣｓ− ＭＪから得られた各予備除去溶菌物の部分と４℃にて１〜２時間反応させて、結合溶菌蛋白質と血清中に存在する抗体との間で複合体形成又は免疫沈殿を生ぜしめた。反応終了後、これらビーズを緩衝液（ＲＩＰＡ）で４回及び１０５Ｍ　）リス−塩酸塩ｐＨ７，２と［Ｌｌ　５Ｍ塩化ナトリウムとを含有する緩衝液で１回洗浄して、複合化していない溶菌蛋白質を除去した。

次いで、これらビーズを試料緩衝液（ｏ、、１Ｍクレランド試薬、２Ｘドデシル硫酸ナトリウム、０．０８Ｍ）リス塩酸塩ｐＨ６，８，１０％グリセリン及びα ２％ブロムフェノールブルー）中に浸漬し、かつ１００℃で２分間綿とうさせて蛋白質をビーズから溶出させると共に、複合体を解離させた。

蛋白質の特性化Ｆ、上記手順（Ａ）からの各試料を電気泳動により分析し、この場合蛋白質を３５％の積層ゲルを有する１１５ＸＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにてレムリ（Ｌａａｎｍｌ　ｉ　）緩衝系を用いて分離した。同時に平行カラムで分子量標識を行なった。使用した標識は、Ｃ１４標識されたホスホリラーゼｂ（９２，５００）と、牛血清アルブミン（６８、ｏｏｏ）と、オバリプミン（、ａ４ｏｏｏ）と、炭酸アンヒドラーゼ（３１ＪＯＯＯ）と、ヒトクｏ−ムＣ（１２，００１３）とを包含していた。螢光写真法により可視化するため、これらのゲルを先ず１０Ｘ酢酸、１０Ｘ）！Ｊジクロル酸及び３０Ｘメタノールで１時間一定し、次いでエンハンサ−（Ｅｎｈａｎｃｅｒ　）　溶液に１時間浸漬した。蒸留水で洗浄しかつ減圧乾燥した後、これらゲルをコグツク５Ｂ−ｓフイルムに露出させて、放射能写真を作成した。

精製されかつ単離された６１０００〜６８．０００ダルトンの分子量を有する糖蛋白質及び４ｓ、ｏｏｏ〜５２，０００ダルトンの分子量を有する糖蛋白質のスポットが全ての血清（ａ）のカラムに顕著に出現したが、血清（ｂ）のカラムには出現しなかった。これに対し、核蛋白質ｐ１９及びｐ２４は、全ての血清（ａ）の試料に出現しなかった。未知の血清（Ｃ）における糖蛋白質の出現は、ＨＴＬＶに感染した細胞の血清における存在を示した。ＡＩＤＳを示す個人からの血清も、この方法で６１，０００〜６８．ｏｏｏＭＷの糖蛋白質に対する抗体の顕著な証拠を示した。

上記Ａにおける標識糖蛋白質の代りに上記Ｂ又はＣの糖蛋白質のいずれかを用いて同様な結果が得られた。さらに、この代りに上記りにおける標識非グリコジル化成分を使用することもでき、この場合は精製されかつ単離された標識成分が、分子量４’４０００〜４８．０００に対応する位置においてゲルカラムに出現した。標識されていない糖蛋白質及び標識されていない非グリコジル化成分は、上記手順において標識工程を省略することにより得られる。

ＭＪ又はＣｓ−ＭＪの代りに細胞ラインＣ９１ＰＬ又はＨＵＴ−１０２を用いて同様な結果が得られた。

アミノ酸配列分析。　（ｓＡ　Ｓ　）システィン標識された分子量約６１，０００ダルトン及び４５．０００〜４６．０００ダルトンをそれぞれ有する糖蛋白質を、５ｍＣ１の〔Ｓ３５〕システイン（比活性１０１１．２　Ｃｉ　７ｍＭ　、　、＝、ニー−イングランド・ヌクレア社）が代謝標識された３６Ｘ１０’個のＨＵＴ１０２細胞から、１５％胎児牛血清（グランド・アイランド・バイオロジカル・カンパニー社）を含有する３０ｄのシスナインを含有しないＲＰＭＩ−１６４０培地において１０時間にわたり沈殿させた。２種のＳ蛋白質をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルから切除し、次いで個々にα０１％ドデシル硫酸ナトリウムを含有する５０ｍＭ）ＩＪス酢酸塩ｐＨ７，８緩衝液の存在下で１２−１６時間にわたり電気泳動溶出にかけた。

これら試料なＱ、００２Ｘのドデシル硫酸ナトリウムを含有する重炭酸アンモニウム緩衝液ｉｏｍＭにて１２−１６時間にわたり１回透析した。さらに、ドデシル硫酸ナトリウムを含有しない１ｏｍＭの重炭酸アンモニウム緩衝液により１２ −１６時間にわたって、さらに１回透析を行なった。次いで、各試料を凍結乾燥させ、そしてアミノ酸配列分析をコリガン（Ｃｏｌｉｇａｎ　）等によりジャーナル・イミューノロジカル・メソッド、第４７巻、第１−１１頁（１９８１）及びメソッド・エンチモロジー、第９１巻、第４１３−４３４頁（，１９８３）に記載された方法により行なった。要約すれば、放射線標識したペプチドの自動化エドマン（Ｅｄｍａｎ　）分解を、改変冷トラップとＱ、１Ｍクアドロー　／Ｌ／　（Ｑｕａｄｒｏｌ　）プログラム１２１０７Ｂとを備えたベックマン８９０Ｃ型配列決定装置を用いて行なった。各配列決定段階からの塩化ブチル抽出物を、７．０ｍのシンチレーション小壜においてＮ２蒸発を用いて乾燥させた。ビオフルオール（Ｂｉｏｆｌｕｏｒ）（ＮＥＮ）を添加した後、ベックマンＬ８９０８０型液体シンチレーションカウンターにより放射能を測定した。

（ｓ３５〕ピークが残基６．７．２１及び２８に見られ、これは（５１，０００〜６８．０００ダルトンの糖蛋白質の蛋白質配列におけるこれらの位置にシスナインが存在するととを示す。この配列の再現性は８８！Ｘであり、これは全ての残基が同じ配列であることを示している。位置４および１３における小さいピークは、恐らく少量（５％未満）の汚染性の蛋白質からのものと思われる。これらの結果は、６１，０００〜６８，０００ｍｗの糖蛋白質が少なくとも部分的にＨＴＬＶのｅｎｖ遺伝子によりコードされ、かつｅｎｖ遺伝子のリーダー配列が２０個の残基よりなっていることを示す。

（ｓ５５〕システィン標識された約６７：０００ダルトン及びｓｏ、ｏｏｏ〜５２．０００ダルトンの分子量をそれぞれ有する糖蛋白質につき同様な分析を行なった。最初の２２個のＮＨ２末端残基を分解した際、位置６．７及び２１にシスティン残基が検出された。このことは、この糖蛋白質も少なくとも部分的にｅｎｖ遺伝子の同じＮｌ２−末端によりコードされることを示している。

国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】ｔ　約６１．０００〜６８，０００ダルトンの分子量を有する糖蛋白質、約４６ −４８．０００ダルトンの分子量を有するその非グリコジル化成分、又は約４５．０００〜５２、０００ダルトンの分子量を有する糖蛋白質の決定子に対し遺伝学的に交叉反応性の抗原決定子を有し、前記糖蛋白質がヒ）Ｔ細胞白血病ウィルスに感染した細胞の細胞表面に存在することを特徴とするほぼ純粋なポリペ２、ＨＴＬＶ−関連細胞表面糖蛋白質である請求の範囲第１項記載のポリペプチド。五　ＨＴＬＶ−関連細胞表面糖蛋白質の非グリコジル化成分からなる請求の範囲第１項記載のポリペプチド。４、　糖蛋白質がヒ）Ｔ細胞白血病細胞ラインＣＲＬ−８２９４又はＣＲＬ−８２９３の細胞表面に存在する請求の範囲第１項記載のポリペプチド。ｓ、ＭＪ、Ｃ５−ＭＪ、Ｃ９１ＰＬ又はＨＵＴ−１［１２細胞から得られる請求の範囲第２項または第３項記載のポリペプチド。６　糖蛋白質の抗原決定子に対し免疫学的に交叉反応性である抗原決定子を有する反遺伝型抗体からなる請求の範囲第１項記載のポリペプチド。ｌ　糖蛋白質の抗原決定子に対し免疫学的に交叉反応性である抗原決定子を有する反遺伝型抗体からなる請求の範囲第１項記載のポリペプチド。＆　検出可能に標識された請求の範囲第１項、第２項、　。第３項、第４項、第６項または第７項のいずれかに記載のポリペプチド。９　標識が放射線標識、螢光標識、酵素標識又はビオチン標識よりなる群から選択される請求の範囲第８項記載のポリペプチド。１０、不溶相に結合された請求の範囲第１項、第２項、第３項または第４項のいずれかに記載のポリペプチド。１ｔ　固相がラテックス粒子又は不溶性樹脂である請求の範囲第１０項記載のポリペプチド。１２、ＭＪ又はＣｓ−ＭＪ細胞を適当な培養条件下で培養し、かつ糖蛋白質をこれら細胞から抽出することを特徴とする請求の範囲第２項記載の糖蛋白質の製造方法。１五約（Ｓｔ、０００〜６８．０００ダルトンの分子量を有し、そのうち約４４ｏＯｏ〜４８．０００ダルトンが非グリコジル化成分であり、前記糖蛋白質はＨＴＬＶに感染した細胞の細胞表面に生ずることを特徴と子る、糖蛋白質の一実質的にグリコジル化されてない成分。１４、検出可能に標識されている請求の範囲第１３項記載の成分。１５、不溶相に結合された請求の範囲第１３項記載の成分。１６、ＨＴＬＶ感染細胞に対する抗体の存在につき生物学的試料を分析するに際し、前記試料を約６１．０００〜６　Ｂ、　ｏ　ｏ　ｏダルトンの分子量を有する糖蛋白質、約４６−４８．０００ダルトンの分子葉を有するその非グリコジル化成分又は約４５．０００〜５２．０００ダルトンの分子量を有する糖蛋白質の決定子に対し免疫学的に交叉反応性である抗原決定子を有するポリペプチドと共に培養し、前記糖蛋白質はヒト１゛細胞白血病ウイルスに感染した細胞の細胞表面に存在し、力）つ前記抗体と前記ポリペプチドとの間に免疫複合体が形成されるかどうかを決定することを特徴とする分析方法。１１　ポリペプチドが約６１．ＯＤＤ〜６８．０００ダルトンの分子量を有する糖蛋白質である請求の範囲第１６項記載の方法。１８、ポリペプチドが約４６．０００〜４８．０００ダルトンの分子量を有する非グリコジル化成分である請求の範囲第１６項記載の方法。１９　ポリペプチドが約４５．０００〜５２．０００ダルトンの分子量を有する糖蛋白質である請求の範囲第１６項記載の方法。２［Ｌ　ポリペプチドを標識する工程を含む請求の範囲第１６項乃至第１９項のいずれかに記載の方法。２ｔ　酵素結合免疫分析である請求の範囲第１６項乃至第１９項のいずれかに記載の方法。２２、放射線免疫分析である請求の範囲第１６項乃至第１９項のいずれかに記載の方法。２五　ラテックス粒子凝固分析である請求の範囲第１６項乃至第１９項のいずれかに記載の方法。２４、螢光分析である請求の範囲第１６項乃至第１９項のいずれかに記載の方法。２５、二重抗体免疫分析である請求の範囲第１６項乃至第１９項のいずれかに記載の方法。２６、請求の範囲第１項記載のポリペプチドの抗原決定子に対し免疫学的に交叉反応性である抗原決定子の生物学的試料中における存在を検出するに際し、前記試料を請求の範囲第１項記載のポリペプチドに対する抗体と共に培養し、かつ前記抗体と前記ポリペプチドとの間に免疫複合体が形成されるかどうかを決定することを特徴とする検出方法。２７、試料がヒトリンパ球からなる請求の範囲第２６項記載の方法。２８、抗体が６１．０．００〜６８．０００ダルトンの分子量を有する糖蛋白質に対するものである請求の範囲第２６項記載の方法。２９　抗体が６１．０００〜６８．０００の分子量を有する糖蛋白質の非グリコジル化成分に対するものである請求の範囲第２６項記載の方法。５０　抗体が、ＨＴＬＶＩＣ感染した細胞の細胞表面に生ずる約４６．０００〜５２．０００の分子量を有する糖蛋白質に対するものである請求の範囲第２６項記載の方法。３１、抗体が、ＭＪ又はＣ５−ＭＪ細胞の細胞表面に生ずる糖蛋白質に対するものである請求の範囲第２６項記載の方法。ｓ２．８ＴＬＶ感染細胞に対する抗体の存在につき試料を分析するために使用し、１個若しくはそれ以上の容器を密封して収容するよう分室化してなり、前記容器は請求の範囲第１項、第２項、第３項、第４項、第６項又は第７項のいずれかに記載のポリペプチドを含有する第１容器と、前記抗体と前記ポリペプチドとの間の免疫複合体の形成を検出するための手段を含有する第２容器とからなることを特徴とするキット。