JP2555118B2 - ヒトｂ親リンパ性ウイルス（ｈｂｌｖ）の分子クローニング及びクローン類 - Google Patents

ヒトｂ親リンパ性ウイルス（ｈｂｌｖ）の分子クローニング及びクローン類

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Description

【発明の詳細な説明】 ヒトＢ親リンパ性ウィルス（Human B Lymphotropic V
irus）（HBLV）と称される新しいDNAウィルスが、リン
パ増殖性障害を有する患者の血液白血球から単離されて
いる。このウィルスは形態学的には、下記に示すように
ウィルス類のヘルペス族、HBLVに属するものであるが、
このウィルスは従来特性化されていない。HBLVはAIDSお
よび非−AIDS患者における、ある悪性に伴うものである
がしかしAIDSの病原体であるヒトＴ−細胞親リンパ性ウ
ィルスタイプIII（HBLV−III）とは明確に異なるもので
ある。HBLVは大きい二本鎖DNAゲノムを含み、Ｂ細胞を
選択的に感染するのに対し、HBLV−IIIは一本鎖RNAゲノ
ムを含み、Ｔ細胞に対して選択的に感染し、および細胞
溶解性である。
HBLVウィルスのヌクレオキャプシドは162個のキャプ
ソメアと20面体対称であり、脂質膜内にエンベロープさ
れている。ウィルスエンベロープの外表面は短いスパイ
クで覆われている。エンベロープされたビリオンの直径
は約180nmであり、ヌクレオキャプシドは直径が約100nm
である。キャプシドとエンベロープの間の空間30〜40nm
は非晶質物質で満たされている。ヌクレオタンパク質芯
即ちヌクレオイドは直径が約65nmであり、随時、桿状或
いは非対称となる。
一次細胞或いは帯血液細胞の感染は、感染後４〜10日
後に特徴的大細胞を生成する。これらの細胞は小さい白
血球の直径の２〜４倍であり、培養液中約１週間後に細
胞病原性および細胞溶解性変化を示す。これらの細胞の
核はしばしば高度に回旋状であり、顕著な特徴なしに主
として真正染色質クロマチンおよび核小体を含有する。
殆んどの感染細胞により、多数のビリオンが放出され
る。
発明の一般的説明 本発明はヒトＢ親リンパ性ウィルス（HBLV）の分子ク
ローンの製造、及び診断及び治療操作におけるそのクロ
ーンの使用である。
新しいヒトＢ親リンパ性ウィルス（HBLV）は次の六人
の個人の末梢血液白血球から単離した；即ち、三人の後
天性免疫不全症候群（AIDS）関連リンパ腫瘍を有するヒ
トＴ−細胞白血病ウィルス（HBLV−III）血清陽性患
者、二人のアンギオー免疫芽球リンパ節疾患を有するHB
LV−III血清陽性患者及び一人の急性リンパ芽球白血病
を有する患者。全ての六つの単離体は抗原及び分子分析
により密接に関連し、又全ての六人のウィルス−陽性患
者からの血清は各ウィルス単離体と免疫的に反応する。
これに対して、200名を超えるランダムに選択された健
常供与者からの僅かに四つの血清のみが、血清陽性であ
った。HBLVは大きな二本鎖DNAゲノムを含み、ヘルペス
ウィルス群のあるものと形態学的に類似している。HBLV
は新たに単離されたヒトＢ細胞を感染し、それはそこで
核及び細胞質封入体を含有する特徴的な大きな屈折性の
単核或いは二核細胞の出現を誘発する。しかしながら、
HBLVは宿主範囲、感染細胞に及ぼす生物学的影響及び抗
原或いはゲノム関連性の欠乏により、あらゆる公知のヒ
ト及び亜ヒト霊長類ヘルペスウィルス類から区別され得
る。
本発明の一つの好ましい実施態様においては、分子ク
ローンpZVH14が培養液中におけるin situハイブリダイ
ゼーションにより臍帯血液リンパ球及び脾臓細胞の早期
ウィルス感染の検出に用いられる。
本発明はウィルスの目標細胞中に遺伝子を組換えDNA
ウィルスベクター系として導入することができるものと
思われる。
HBLVウィルスの超構造的特徴並びにその形態形成は、
このウィルスをヘルペスウィルス族に置くが…この族の
如何なる公知のものとも類似性及び相違点を有する。免
疫電子顕微鏡研究は、ウィルスを単離した患者はこのウ
ィルスのウィルスエンベロープ及び内部成分の両者に対
して極めて特異的な抗体を作ることを示している。免疫
学的、分子的、生物学的、及び宿主範囲研究は、HBLVウ
ィルスが従来説明されていないことを示す。
感染血液試料からの単核細胞の培養液は一次細胞或い
は帯液細胞での培養後４〜10日で相当数の特徴的な大細
胞を発達する。電子顕微鏡分析はHBLVウィルス粒子は大
細胞中に存在するが、小リンパ球中には不存在であるこ
とを示す。感染細胞は小リンパ球の直径の２〜４倍であ
り、如何なる初期の細胞変性変化を示さない。しかしな
がら、培養１週間後に、細胞変性及び細胞溶解性変化が
容易に観察される。特に、感染細胞の核はしばしば高度
に回旋されており、クロマチンは主として真正染色質で
あり、顕著な特徴なしに核小体を含んだ。細胞質は、か
なり大きいゴルジ（Golgi）装置、異なった大きさの小
胞、粗い細胞質内細胞の突起した配列及び豊富なミトコ
ンドリアを示した。これらの細胞の一般的外観はリンパ
起源の高度に多形の増殖芽球のそれである。
外部細胞ウィルスの特異的免疫標識化は予備吸収され
た患者の血清及びヤギ中で産出されたヒトガンマグロブ
リンに対する抗血清を用いて超構造的レベルで生じ、フ
ェルチン或いはペルオキシダーゼを用いて標識化され
る。殆んどの感染細胞により多数のビリオンが放出さ
れ、細胞の表面に緊密なプラスターとして出現する。実
質的に全てのビリオンは、それらの周辺において標識化
されている。ある場合には、標識はビリオン中に侵入
し、ビリオンのあるもののエンベロープが無傷ではな
く、又、患者の血清のあるものはウィルスの内部成分並
びにウィルスエンベロープに対する抗体を含むことを示
している。
本発明のHBLVウィルスは、具体的な開示においてより
詳細に説明されるように、ヒト血液帯細胞をHBLVで感染
させることにより、増殖される。
寄託の陳述 本発明の主題物、分子クローンpZVH14はメリーランド
州、ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクションにATCC No.40247として寄託され、本出願の
許可後、30年間或いはその様な寄託に対する最終の要請
後５年間、或いは特許の有効期間の内最長の期間維持さ
れる。寄託物は、寄託期間内に培養物が突然異するか或
いは成育不能となった場合には、取換えられる。
図面の説明 図面は、ヒトＢ親リンパ性ウィルスゲノムDNAのサザ
ーンブロット分析である。
有用性の陳述 本発明の分子クローンはHBLVで感染された宿主細胞と
のin situハイブリダイゼーションを行なうことができ
る。従って、このクローンはHBLV−感染細胞のための診
断プローブとして、並びに血液試料中のウィルス抗原或
いは抗体の検出のために（ウィルス核酸を用いる免疫蛍
光アッセイ或いは他の如何なる抗原或いは抗体のアッセ
イを用いて）有用である。分子クローンpZVH14は又培養
におけるin situハイブリダイゼーションにより臍帯血
液リンパ球及び脾細胞の早期ウィルス感染の検出におい
ても用いられる。
本発明は又、ウィルスの目標細胞中に遺伝子を組換え
DNAウィルスベクター系として導入することもできる。
発明の詳細な説明 一般的に、ヒトＢ親リンパ性ウィルス（HBLV）ゲノム
の一つのクローニング方法は、一次細胞或いは帯血液細
胞をHBLVウィルスで感染後に、未一体化ウィルスDNAを
単離することを含むものである。この未一体化ウィルス
DNAを次いでラムダファージラィブラリー中でクローン
化し、ウィルスcDNAを用いてスクリーニングする。
感染一次細胞及び培養末梢帯血液細胞は、HBLVウィル
スを産出し、ヒト血清におけるウィルス特異的抗原及び
抗体を検出するために用いられる。免疫学的アッセイの
ための主たる産出体として役立つ。感染細胞の培養物を
増殖及び取得後、新たに感染された細胞から低分子量DN
Aを抽出する。これにより未一体化ウィルスDNAが生成さ
れる。cDNAライブラリーをHBLVcDNAを用いて形成する。
このcDNAを次いで未一体化ウィルスDNAを測定するため
のプローブとして用いる。次いで、本発明のHBLVゲノム
を含有する未一体化線状DNA（プロウィルスDNA）が得ら
れる。このDNAを次いで適当なプラスミド中で消化し
て、クローンpZVH14を形成する。
上記方法の二つの要素は良く知られた組換えDNA操
作、即ちDNAライブラリー及びcDNAプローブである。こ
のライブラリーは、感染された一次或いは末梢血液細胞
から全DNAを取出し、DNAを適当な制限酵素で断片に切断
し、これらの断片を放射標識化cDNAプローブにハイブリ
ダイズさせ、これらの断片をプラスミドベクターに連結
し、及び次いで組換えDNAを適当な宿主中に導入するこ
とにより形成される。
このcDNAプローブは二重帯HBLV mRNAから作られるHBL
V cDNAプローブである。。短オリゴーdT鎖をmRNA鎖のポ
リーＡ尾部にハイブリダイズさせる。このオリゴーdTセ
グメントは、mRNAを相補的DNA鎖の合成のための鋳型と
して用いる逆転写酵素の作用のためのプライマーとして
の役割を果す。得られたcDNAは末端がヘアピンループと
なる。一度mRNA鎖がNaOHでの処理により分解されると、
ヘアピンループは対形成されたDNA鎖を完結するDNAポリ
メラーゼＩのためのプライマーとなる。このループを次
いでs1ヌクレアーゼにより切断して二本鎖cDNA分子を生
成する。次いで、この二本鎖cDNAにDNAリガーゼを用い
てリンカーを添加する。リンカーを制限酵素で切断開放
し、このcDNAを同一酵素により切断された適当なプラス
ミド中に挿入する。その結果、cDNA−含有組換えプラス
ミドが得られる。
例５に示す如く、HBLVゲノムの分子クローンpZVHはT7
RNAポリメラーゼを用いる放射標識化RNA、Ｓ−標識化d
GTP、及び未標識化リボトリホスフェートのための鋳型
として有用である。
本発明の好ましい実施態様において、HBLV感染臍帯血
液細胞からの上澄液を20％グリセロールクッション上に
重層し、ベックマンSW41ローター中において４℃で25,0
00rpmにおいて３時間遠心分離することによりペレット
化される。このペレットをTNE緩衝液（10mM、Tris−C
l、pH9、100mM NaCl:1mM EDTA）中に懸濁させ、PC19
（フェノール：クロロポルム：イソアミルアルコール;5
0mM、Tris−Cl、pH9::100:100:1:10::v:v:v:v）で抽出
後、クロロホルム：イソアミルアルコール（24:1::v:
v）で抽出する。豊化ウィルスDNAを２容の95％エタノー
ルを添加することにより沈澱させる。DNAをHind IIIで
消化し、ブルースクリブベクター（ベクター・クローニ
ング・システムズ・カリフォルニア州から市販）中にク
ローン化する。標識化豊化DNAでスクリーニング後に得
られる幾つかのクローンについて、感染ヒト臍帯血液細
胞DNAに対するハイブリダイゼーションの特異性を、感
染細胞に対するin situハイブリダイゼーションにより
検査した。HBLVクローンZVH14のペレット化ウィルスか
らのDNAの特異的ハイブリダイゼーションをHind III
（第１図、パネルＡ）及びEco R I（第１図、パネル
Ｂ）で消化した。細胞外ウィルスをレーン１に示し、ウ
ィルス感染ヒト臍帯血液細胞をレーン２に示し、及びAI
DS患者の皮膚から単離した陰性対称DNAをレーン３に示
した。これらのアッセイにおいて陽性であったクローン
ZVH14は未感染対照体にはハイブリダイズしかなかっ
た。レーン２に示された感染細胞DNAはヒト臍体血液細
胞における数ラウンドの細胞なしのウィルス伝播後に単
離された。
例 例１ 上記の如く得られた精製ウィルスから抽出された
核酸から得られた幾つかのDNAクローンの特異性を調
べ、その他のDNAウィルスと比較した。これらの研究の
ために9.0KbHind III断片を含有するpZVH14と称される
一つのHBLVクローンを用いた。サザーンブロット分析は
精製ウィルス及びHBLV−感染ヒト帯血液細胞の両者から
のDNAのHind III及びEcoR I消化物中にウィルス特異性D
NAの存在を示した。同一プローブを用いてのin situハ
イブリダイゼーション実験も、又、これらの配列が感染
細胞に限定されていることを確認した。
例２ ヒトＢ親リンパ性ウィルスクローンpZHV14は下記
の如く制限酵素マッピングされた： （ここに、Ｂ＝BamH I;E＝EcoR I;Xh＝Xho I;H＝Hind I
II;P＝Pst I、及び は感染細胞及びウィルスDNA調剤中においてEcoR Iを用
いてpZVH 14インサートにより検出されるウィルス断片
を示す）。
例３ HSV−１、CMV、及びEBV（それぞれヘルペス・シ
ンプレックス・ウィルス・タイプ１、サイトメガロウィ
ルス、及びエプスタインバーウィルス）に特異的な分子
プローブを用いてHBLVと比較した。各ウィルスプローブ
がその相同核酸に特異的にハイブリダイズしたのに対
し、HBLVはこれらの形質転換ヒトDNAウィルスとは明ら
かに区別された。更に、HBLVゲノムの大きさは庶糖勾配
精製ウィルスDNAの分析により求められた110Kb一対の最
小の複雑さを含むことが示された。このゲノムの大きさ
並びにその他の特徴も又、アデノウィルス、ポリオマウ
ィルス、パポバウィルス、及びパピロマウィルス群のDN
AウィルスからHBLVを区別するものである。
ヘルペスウィルス類のあるものと同様な形態学的及び
その他の性質にも拘らず、HBLVは新しいヒトDNAウィル
スであるように思われる。それはその他のウィルスから
生物学的性質及び免疫学的及びゲノム的相同性の欠乏に
より区別され得る。HBLVはCMV、HSV、HVS、及びHVAと同
様にin vitroで高度に細胞溶解性であるが、しかしこれ
らのウィルス類或いはEBVよりもより狭い宿主範囲を有
し、Ｂ−細胞のサブセットに限定される。
例４ 臍帯血液リンパ球をAIDS患者の血清（細胞）と共
に共培養した。臍帯血液培養物中には特徴的な大きい屈
折性細胞が出現した。培養液中で６日後、細胞をペレッ
ト化し、上澄液を20％グリセロール上に重層し、遠心分
離器（ベックマンSW41或いはSW28）中で25,000〜30,000
rpmで３時間回転させた。ペレットは細胞残骸及びウィ
ルス粒子を含有した。ペレットのフェノール抽出は多量
のウィルス核酸を生成した。この核酸調剤から得られた
二本鎖DNAクローンZVH14をサザーンブロット実験及びin
situハイブリダイゼーション実験におけるウィルスの
特異的ハイブリダイゼーション検出のために用いた。
例５ HBLV−感染ヒト帯血液細胞のin situハイブリダ
イゼーション。具体的な開示において説明した。35S−
標識化RNAプローブを用いて実験を行なった。HBLVゲノ
ムのクローンpZVH14をT7 RNAを用いる放射標識RNA、35S
−標識化dGTP、及び未標識リボトリホスフェートのため
の鋳型として用いた。細胞当り１個未満の粒子が未感染
陰性対照培養液中に見られた。感染培養液の特徴的な大
きい屈折性細胞は標識化の程度が大きく、豊富なウィル
スメッセージの発現を示した。
フロントページの続き (72)発明者 ウオン‐スタール，フロシー イーチン アメリカ合衆国メリーランド州、ポトマ ック、ハーカー、ドライブ、8418 (72)発明者 サラハディン，スイド ザキ アメリカ合衆国 メリーランド州、ポト マック、ニューゲート、ドライブ、 12600

Claims (6)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ヒトＢ親リンパ性ウイルスDNAクローンで
    あって、下記の制限酵素地図： （ここで、Ｂ＝BamH I、Ｅ＝Eco I、Xh＝Xho I、Ｈ＝Hi
    nd III、およびＰ＝Pst Iであり、また、 はそれらによって挟まれる9.0kbのHind IIIフラグメン
    トの両端に場合により存在していてもよい、それぞれ6.
    3kbおよび8.2kbのフラグメントであって、それぞれ図中
    の矢印の方向にT3プロモータおよびT7プロモータを含ん
    でなるフラグメントを表す。） で表され、かつ、このヒトＢ親リンパ性ウイルスは、 （ａ）ヘルペスウイルスの形態学的特徴を保持し、 （ｂ）約110kbの二本鎖DNAゲノムであり、 （ｃ）ヒトＢ細胞を選択的に介して宿主に感染し、 （ｄ）そのヌクレオキャプシドは162個のキャプソメア
    を有する20面体であり、脂質膜内にエンベロープされて
    いる ことを特徴とするものである、DNAクローン。
  2. 【請求項２】アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
    ション受託番号40247のもと寄託されているプラスミドp
    ZVH14である、請求項１記載のDNAクローン。
  3. 【請求項３】ウイルスDNAがクローニングベクター中に
    クローン化されるウイルスのゲノム配列のクローニング
    法であって、クローン化される配列が、ヒトＢ親リンパ
    性ウイルスDNAクローンであって、下記の制限酵素地
    図： （ここで、Ｂ＝BamH I、Ｅ＝Eco I、Xh＝Xho I、Ｈ＝Hi
    nd III、およびＰ＝Pst Iであり、また、 はそれらによって挟まれる9.0kbのHind IIIフラグメン
    トの両端に場合により存在していてもよい、それぞれ6.
    3kbおよび8.2kbのフラグメントであって、それぞれ図中
    の矢印の方向にT3プロモータおよびT7プロモータを含ん
    でなるフラグメントを表す。） を有し、かつ、このヒトＢ親リンパ性ウイルスは、 （ａ）ヘルペスウイルスの形態学的特徴を保持し、 （ｂ）約110kbの二本鎖DNAゲノムであり、 （ｃ）ヒトＢ細胞を選択的に介して宿主に感染し、 （ｄ）そのヌクレオキャプシドは162個のキャプソメア
    を有する20面体であり、脂質膜内にエンベロープされて
    いる ことを特徴とするものである、クローニング法。
  4. 【請求項４】クローン化されるDNA配列が、前記9.0kbの
    Hind IIIフラグメントである、請求項３記載のクローニ
    ング法。
  5. 【請求項５】ヒトＢ親リンパ性ウイルスDNAクローンの
    検出方法であって、検出をサザンブロット法により行
    い、かつ、検出されるクローンが下記の制限酵素地図： （ここで、Ｂ＝BamH I、Ｅ＝Eco I、Xh＝Xho I、Ｈ＝Hi
    nd III、およびＰ＝Pst Iであり、また、 はそれらによって挟まれる9.0kbのHind IIIフラグメン
    トの両端に場合により存在していてもよい、それぞれ6.
    3kbおよび8.2kbのフラグメントであって、それぞれ図中
    の矢印の方向にT3プロモータおよびT7プロモータを含ん
    でなるフラグメントを表す。） で表され、かつ、このヒトＢ親リンパ性ウイルスは、 （ａ）ヘルペスウイルスの形態学的特徴を保持し、 （ｂ）約110kbの二本鎖DNAゲノムであり、 （ｃ）ヒトＢ細胞を選択的に介して宿主に感染し、 （ｄ）そのヌクレオキャプシドは162個のキャプソメア
    を有する20面体であり、脂質膜内にエンベロープされて
    いる ものであることを特徴とする、方法。
  6. 【請求項６】検出されるDNAクローンが、前記9.0kbのHi
    nd IIIフラグメントである、請求項５記載のクローニン
    グ法。
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