DE3486404T2

DE3486404T2 - Verfahren und produkte zur feststellung von menschlichem t-zellen-leukämie-virus.

Info

Publication number: DE3486404T2
Application number: DE3486404T
Authority: DE
Inventors: Myron E. Sharon Ma 02356 Essex; Tun-Hou Newton Ma 02159 Lee
Original assignee: Harvard College
Current assignee: Harvard College
Priority date: 1983-04-27
Filing date: 1984-04-13
Publication date: 1996-02-01
Anticipated expiration: 2004-04-14
Also published as: AU2826184A; FI845061A0; WO1984004327A1; EP0151579B1; EP0151579A1; ATE127517T1; JPS60501179A; DE3486404D1; JP2780020B2; FI845061L; AU583473B2; EP0151579A4; FI89175B; FI89175C

Description

Die Erfindung betrifft neue gereinigte Formen eines Glykoproteins, das an der Zelloberflächenmembrane von Zellen gefunden wird, die mit einem menschlichen T-Zellen- Leukämie-Virus infiziert sind, sowie einen Test, um zu erkennen, ob in einer biologischen Probe ein Antiköroper gegen die antigenen Determinanten vorliegt, die bei den Glokoproteinen vorhanden sind.
Der menschliche T-Zellen-Leukämie-Virus (HTLV) ist bekanntermaßen stark mit einer speziellen Art der Leukämie beim Menschen assoziiert, nämlich dem T-Zellen-Typ bei Erwachsenen. Es hat sich außerdem gezeigt, daß alle Menschen, deren Körper Antikörper gegen diesen Virus enthalten, offensichtlich latent mit dem Virus infiziert sind. Essex, J.N.C.I., Vol. 69, 981-5 (1982). Die größten Kernproteine des Virus wurden untersucht und es wurden Immunofluoreszenstestverfahren für Antikörper gegen die infizierten Zellen beschrieben, wobei es Bestandteil des Verfahrens ist, die Zellen von einer Zellinie infizierter menschlicher Zellen, wie MT1 oder MT2, zu fixieren, die zu testenden fixierten Zellen mit dem Testserum in Berührung zu bringen und festzustellen, ob ein Anhaften des Serums an der Zelloberfläche aufgetreten ist, indem sie nachfolgend mit einem fluoreszenzmarkierten Antikörper gegen menschliches IgG in Berührung gebracht werden. Hinuma et al, Proc Natl. Acad. Sci., Vol. 78, 6476-6480 (1981). Dieser Test ist mühsam und schwierig in der Anwendung, weil nur 1 bis 5% der fixierten Zellen die nötigen antigenen Charakteristiken zeigen. Es wurde außerdem vorgeschlagen, einen in gewisser Weise analogen Immunofluoreszenztest für die Zelloberfläche zu verwenden, wobei eine Kultur von infizierten Zellen mit dem Testserum und sodann mit fluoreszenzmarkierten Karnickelantikörpern gegen menschliches IgG inkubiert wird, um festzustellen, ob ein Anhaften des Serums an den Zellen aufgetreten ist. Robert- Guroff et al., Science, Vol. 215, 975-978 (1982). Ein Radioimmuntest für die Antikörper gegen p24 und p19, zwei der Kernproteine von HTLV, wurde außerdem beschrieben. Posner et al., J. Exp. Med., Vol. 154, 333-344 (1981). Dieser Test ist jedoch nicht in der Lage, für alle Individuen, die dem infizierenden Virus ausgesetzt waren, positive Ergebnisse zu liefern, und enthalten insofern ein Risiko bei denjenigen, die keine erkennbaren Mengen von Antikörpern gegen diese zwei Antigene haben.

Zusammenfassung der Erfindung

Es wurde nun festgestellt, daß spezielle Polypeptide oder Glykoproteine, die an der Zelloberfläche von menschlichen T-Zellen präsent sind, die mit HTLV infiziert sind, eine antigene Determinante oder Determinanten aufweisen, die, wenn sie gereinigt und isoliert sind, ein hohes Maß an Empfindlichkeit und Immunospezifität für die Antikörper gegen menschliche, mit HTLV infizierte Zellen, gegen menschliche T-Zellen-Leukämie-Zellen und/oder gegen HTLV aufweisen. Folglich sind die im wesentlichen reinen Glykoproteine oder ihre unglykolysierten Teile als diagnostisches Werkzeug zum Testen von biologischen Proben verwendbar, um festzustellen, ob sie Zellen enthalten, die mit HTLV infiziert sind. Andere Polypeptide, die immunologisch kreuzreagierende antigene Determinanten enthalten, sind für denselben Zweck brauchbar. Mit "Polypeptiden, die immunologisch kreuzreagierende antigene Determinanten enthalten", sind Poiypeptide gemeint, die antigene Determinanten gemeinsam haben, mit denen ein gegebener Antikörper reagiert. Zu diesen anderen Polypeptiden gehören unglykolysierte Teile der Glykoproteine. Andere brauchbare Polypeptide oder Proteine, die die notwendigen immunogenen Determinanten aufweisen, sind synthetische Polypeptide. Zu diesen gehören auch Antikörper oder Fragmente hiervon, die anti-idiotypisch gegen die aktive Determinante oder Determinanten auf dem erfindungsgemäßen Glykoprotein sind. Es wurde jüngst gezeigt, daß anti-idiotypische monoklonale Antikörper eine Immunantwort gegen infektiöse Organismen, die diese antigenen Determinanten tragen, induzieren und gegen eine Infektion durch diese infektiösen Organismen schützen, wobei die antigenen Determinanten dieselben oder im wesentlichen dieselben sind, wie die auf den anti- idiotypischen Antikörpern (Fields et al., Nature, 300:19- 23 (1982); Sacks et al., J. Exp. Med. 4:1108-1119 (1982)). Es wurde außerdem gezeigt, daß anti-idiotypische Reagentien als diagnostisches Werkzeug zum Erkennen von Antigenen brauchbar sind, die Stellen tragen, die mit denen auf den Antikörpern immunologisch kreuzreagieren (Potocnjak et al., in Science 215: 1637-1639 (1982), worauf hier ausdrücklich Bezug genommen ist). Somit kann ein Test auf HTLV mit Hilfe eines anti-idiotypischen Antikörpers oder eines immunologisch wirksamen Fragments hiervon durchgeführt werden, der bzw das eine antigene Stelle oder antigene Stellen trägt, die der antigenen Stelle oder den antigenen Stellen auf dem erfindungsgemäßen Glykoprotein immunologisch ähnlich sind. Solche anti-idiotypischen Antikörper können gegen erste Antikörper gezüchtet werden, die ein Spezifität gegen die antigenen Stellen auf dem erfindungsgemäßen Glykoprotein haben (d.h. die anti-idiotypischen Antikörper sind Anti-Antikörper). Vorzugsweise werden monoklonale anti-idiotypische Antikörper verwendet.
Ein Test auf das Vorliegen einer HTLV-Infektion ist wichtig, weil der Virus leicht von den peripheren Blutleukozyten von antikörperpositiven Menschen auf Leukozyten von antikörpernegativen Menschen übertragen werden kann, wenn diese beiden Leukozyten gemeinsam kultiviert werden. Popovic et al., Science, -Vol. 219, 856-859 (1983). Konsequenterweiser ist ersichtlich, daß ein großes Infektionsrisiko bei Vollbluttransfusionen besteht, wenn das zu übertragende Blut infizierte Zellen enthält. Zusätzlich ist dieser Test von Bedeutung, weil biologische Proben von Menschen, die AIDS (acquired immunodeficient syndrome) zeigen, auf ein positives Testergebnis für Antikörper gegen die antigenen Determinanten des neuen Glykoproteins liefern, womit sich die Diagnose dieser Krankheit vereinfacht.
Folglich umfaßt die Erfindung auch ein Verfahren zum Testen von biologischen Proben auf das Vorhandensein von Antikörpern gegen HTLV-infizierte Zellen, wobei es dazu gehört, diese Proben mit einem Polypeptid zu inkubieren, das eine antigene Determinante oder antigene Determinanten aufweist, die mit denen eines Glykoproteins immunologisch kreuzreagieren, das ein Molekulargewicht von etwa 61 000- 68 000 Dalton aufweist, wobei näherungsweise 46 000-48 000 Dalton der unglykolysierte Anteil ist und das Glykoprotein auf der Zelloberfläche von Zellen auftritt, die mit HTLV infiziert sind und wobei ermittelt wird, ob zwischen dem Antikörper und dem Polypeptid ein Immunokomplex gebildet wird oder nicht.
Die Erfindung umfaßt außerdem ein Verfahren zum Testen einer biologischen Probe auf das Vorhandensein einer antigenen Determinante oder von antigenen Determinanten, die mit den Determinanten des Glykoproteins mit einem Molekulargewicht von 61 000-68 000 Dalton immunologisch kreuzreagieren. Die Determinanten, die zu testen sind, können auf dem erwähnten Glykoprotein selbst oder auf anderen Polypeptiden auftreten. Sie können in den Körperflüssigkeiten oder in Lymphocyten frei zirkulieren. Der Test kann mittels bekannter Immunotestverfahren, die monoklonale oder polyvalente Antikörper verwenden, durchgeführt werden, die mit den antigenen Determinanten, die auf den erwähnten Glykoproteinen gefunden werden, immunologisch kreuzreagieren. Beispielsweise können konkurrierende Immunotests oder immunometrische Tests (sandwich) verwendet werden.
Das erfindungsgemäße Glykoprotein hat ein Molekulargewicht von näherungsweise 61 000-68 000 Dalton, wie dies mittels Natriumdodecylsulfat-Gel-Elektrophorese (SDS) ermittelt wurde, und es ist in einem SDS-Puffer löslich, der aus 0,15 M Natriumchlorid, 0,05 M Tris Hydrochlorid mit einem pH-Wert von 7,2 , 1% Triton X-100, 1% Natrium Desoxycholat, 0,1% Natrium Dodecylsulfat und 1 mM Penylmethylsulfonylfluorid besteht. Triton X-100 ist ein nichtionisches Detergentium (Octylpenoxypolyethoxy (9-10) Ethanol). Der unglykolysierte Teil des 61 000-68 000 Dalton schweren Glykoproteins hat ein Molekulargewicht von etwa 46 000-48 000 Dalton und enthält im wesentlichen dieselbe antigene Determinante oder dieselben Determinanten, wie das Glykoprotein selbst.
Das Glykoprotein kann aus HTLV infizierten Zellen gewonnen werden. Eine Varietät von Zellinien wurde erzeugt die permanent oder durchgehend mit HTLV infiziert wurde; von diesen seien erwähnt: MJ, C5-MJ, C91PL und HUT- 102. Es ist möglich, daß die genaue Größe des neuen Glykoproteins in den unterschiedlichen Linien geringfügig voneinander abweicht; jedoch ist der ihnen gemeinsame immunologisch kreuzreagierende Teil des Glykoproteins unabhängig von der Zellinie, da es sich um ein Protein handelte das durch HTLV induziert ist. Somit kann jede Zelle, die den Virus beherbergt, eine geeignete Quelle für das neue Glykoprotein sein. Um das Protein aus einer infizierten Zelle, die den Virus trägt zu erhalten, werden die Zellen metabolisch markiert (beispielsweise mit ³&sup5;S-Methionin) und mit Antiseren, die aus HTLV infizierten Probanden gewonnen wurden, immunopräzipitiert. Das neue Glykoprotein kann mittels Gelelektrophorese erkannt und isoliert werden. Unter "HTLV", wie es in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen verwendet wird, ist der Virus generisch zu verstehen. Somit sollen alle beliebigen Formen, Unterarten und Varietäten des Virus umfaßt sein.
Beispielsweise ist das Glykoprotein auf den Zelloberflächen der menschlichen T-Zellen-Leukämie-Zellkulturen MJ, C5-MJ, C91PL und HUT-102 vorhanden. Eine Probe von MJ und von C5-MJ wurde bei der American Type Culture Collection am 26. April 1983 unter der Hinterlegungsnummer ATCC CRL-8294 bzw. CRL-8293 hinterlegt. Das Glykoprotein kann leicht aus den Zellen dieser Zellinien durch Lyse der Zellen und SDS-Gelelektrophorese abgetrennt werden.
Das gereinigte und isolierte Glykoprotein oder jedes damit immunologisch kreuzreagierende Antigen kann als Standard-Antigen bei jedem konventionellen Testverfahren zur Erkennung des Vorliegens von dagegen spezifischen Antikörpern in biologischen Proben eingesetzt werden, und somit verwendet werden, um das Vorhandensein von mit HTLV infizierten Zellen und/oder für AIDS-symptomatischen Zellen in der Probe zu erkennen. Die Antikörper, die für solche HTLV-Antigene spezifisch sind, werden nicht in Patienten gefunden, die unter Krankheiten leiden, wie Hepatitis, die nicht von einer HTLV-Infektion begleitet ist.
Das Glykoprotein oder die damit immunologisch kreuzreagierenden Polypeptide können durch übliche Verfahren mit ¹²&sup5;I oder ³&sup5;S oder ³H zur Verwendung in Radioimmuntestes, mit Fluoreszein zum Fluoreszenzimmuntest, mit einem Enzym für einen Enzymimmunotest oder mit Biotin markiert werden, für Biotin-Avidin gekoppelte Tests. Es kann je nach Wunsch markiert oder unmarkiert in konkurrierenden Immunotests ebenso wie in Doppel-Antikörpertestes mit zwei Antikörpern, von denen einer von der Idiotyp:Anti-Idiotypvarietät oder speziell von dem zweiten Antikörpertyp unter Verwendung eines Anti-Fc-Antikörpers ist, oder in anderer Tests verwendet werden.
Alternativ kann das neue Glykoprotein oder können die damit immunologisch kreuzreagierenden Polypeptide in einer unlöslichen Phase immobilisiert sein, beispielsweise einem unlöslichen Harz und die Erkennung der Antiglykoprotein- Antikörper wird ausgeführt, indem ihre Bindung an die unlösliche Phase gemessen wird. Die unlösliche Phase umfaßt außerdem Latexpartikel, die, wenn sie mit dem neuen Glykoprotein oder seinen immunologisch kreuzreagierenden Polypeptiden beschichtet und dem Antiglykoprotein-Antikörper ausgesetzt sind, agglutinieren. Noch andere unlösliche Phasen umfassen Teströhrchen, Violen, Titrationsplatten u.dgl., an die das neue Glykoprotein und seine immunologisch kreuzreagierenden Polypeptide gebunden werden können, sowie Antikörper hierfür, die mittels doppelter Antikörpertechniken oder Protein-A-abhängiger Technik erkannt werden.
Der Test nach Antikörpern gegen HTLV kann das Glykoprotein oder Glykoproteine mit dem Molekulargewicht von 61 000-68 000 Dalton in roher Form verwenden und ist nicht auf die Verwendung des Protein in im wesentlichen reiner Form beschränkt. Gemäß einem Ausführungsbeispiel kann der Test auf das Vorhandensein von Antikörpern gegen HTLV die Erkennung von zusätzlichen Antikörpern in der Probe, wie jenen gegen die HTLV-Kernproteine p19, p24 oder Mischungen von beiden letztgenannten umfassen. Bei diesem Ausführungsbeispiel gehört es zu dem Verfahren, daß die Probe mit einem Reagens inkubiert wird, das 1) Glykoprotein gemäß der Erfindung (d.h. 61 000 bis 68 000 d oder immunologisch kreuzreagierende Polypeptide) und optional 2) die HTLV-Kernproteine p24 oder p19 oder beide enthält, wobei festgestellt wird, ob zwischen den Antikörpern in der Probe und dem Reagens ein Immunkomplex hergestellt wird oder nicht.
Die zur Durchführung der oben beschriebenen diagnostischen Methoden notwendigen Elemente können in einer Zusammenstellung enthalten sein. Derartige Zusammenstellungen umfassen einen Träger, der in Kammern aufgeteilt ist, um darin einen oder mehrere Behälter aufzunehmen, wobei jeder Behälter ein oder mehrere Elemente enthält, die notwendig sind, um die Tests durchzuführen.
Beispielsweise kann der erste Behälter das gereinigte Glykoprotein oder seine immunologisch kreuzreagierenden Polypeptide in erkennbar markierter oder unlöslicher Form enthalten.
Ein zweiter Container kann einen Anti-IgG-Antikörper, entweder polyklonal oder monoklonal, enthalten, der für Doppel-Antikörperbindungstests brauchbar ist, oder Elemente, die für die Erkennung der Markierungen auf dem Glykoprotein oder seinen immunologisch kreuzreagierenden Polypeptiden gebraucht wird (beispielsweise chromogene Substrate).
Weitere Behälter können unterschiedliche Mengen von Glykoprotein oder seinen immunologisch kreuzreagierenden Polypeptiden enthalten, wie sie verwendet werden, um eine Standardkurve zu erzeugen, aus der die experimentellen Ergebnisse interpolierbar sind. Die Materialien können selbst in der Zusammenstellung vorhanden sein, in gefriergetrockneter Form oder in einer Mischung mit anderen inerten Materialien, wie inerten Proteinen u.dgl.
Zu den zu testenden biologischen Proben gehören Blut, Serum, Lymphozyten, Urin, Gewebe, Speichel, Stuhl u.dgl. Von speziellem Interesse ist die Durchmusterung von Blut in Blutbänken, um sicherzustellen, daß das Blut nicht mit HTLV kontaminiert ist. Auch das Screening von aus Blut abgeleiteten Produkten, wie Impfstoffen, kann mit Hilfe der erfindungsgemäßen Verfahren ausgeführt werden.
Die folgenden speziellen Beispiele sollen genauer die Natur der Erfindung erläutern, ohne begrenzend für den Schutzumfang zu wirken.

Beispiel 1

Herstellung von markiertem Glykoprotein

A. Menschliche T-Zell-Leukämie-Zellen aus den beiden Zellinien MJ und C5-MJ werden getrennt voneinander während ihrer logarithmischen Wachstumsphase geerntet. Nach einmaligem Waschen mit methioninfreiem McCoy 5A-Medium wird jede Probe der Zellen mit einem Markierungsmedium erneut suspendiert, das methioninfreies McCoy 5A, 10% phosphatgepufferte physiologische Salzlösung (PBS), dialysiertes Rinderserum und 100 mCi/ml von ³&sup5;S-Methionin enthält. Am Ende eines 2 bis 4 Stunden dauernden Pulsens werden die radioaktiv markierten Zellen drei Mal mit kaltem PBS gewaschen. Das Zellpellet wurde in einem kalten Lysepuffer (RIPA) von 0,6 ml bis 1,0 ml lysiert (0,15 M Natriumchlorid, 0,05 M Trishydrochlorid, pH-Wert, 7,2, 1% Triton X- 100 als Netzmittel, 1% Natriumdesoxycholat, 0,1% Natriumdedecylsulfat und 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid). Nach 19 Minuten intermittierender Durchwirbelung wurde die Mischung 1 Stunde lang mit 100 000 xg bei 4º C zentrifugiert. Der Lysatüberstand wurde von unspezifischen Bindungskomponenten durch einstündige Absorption bei 4º C an Kohlehydratkugeln (Sepharose CL-4B) befreit, die mit Protein-A beschichtet sind.
B. Die Markierung der Membranproteine der Zelloberfläche wurde durch Lactoperoxidase katalysierte Radioiodierung ausgeführt. Drei Aliquote von 5 x 10&sup6; Zellen jeder Linie mit einer Wachstums fähigkeit von größer 99% wurden getrennt mit 1 mCi eines trägerfreien Natrium-¹²&sup5;Iodids in Anwesenheit von 50 ml trägergestützter Lactoperoxidase und Glukosydase (Enzymobeads, Bio-Rad Labs.) und 25 ml von 1%-iger beta-D-Glukose iodiert. Nach der Reaktion wurde terminiert, die drei Aliquoten der iodierten Zellen zusammengeführt und demselben Lyse- und Vorreinigungsverfahren unterzogen, wie es unter (A) oben beschrieben ist.
C. MJ und C5-MJ-Zellen wurden an dem Scheitelpunkt ihrer logarithmischen Wachstumsphase getrennt geerntet, sodann in glykosefreiem RPMI-1640 Medium, das mit 1 mg/ml von Natriumpyruvat ergänzt war, 2 Stunden lang resuspendiert. Nach diesem Glukosenährstoffmangel wurden die Zellen 5 bis 6 Stunden lang mit 100 mCi/ml von ³H-Glukosamin (New England Nuclear) markiert. Das Verfahren führt zu einer Tritiummarkierung lediglich der Glykoproteine in den Zellen. Die markierten Zellen wurden dann einem Lyse- und einem Vorreinigungsvberfahren unterzogen, wie dies in (A) oben beschrieben ist.

Herstellung des markierten unglykolysierten Anteils von Glykoprotein

D. MJ und C5-MJ-Zellen wurden am Scheitelpunkt ihrer logarithmischen Wachstumsphase getrennt geerntet und in McCoy 5A-Medium 2 Stunden lang resuspendiert, das mit 10% fötalem Rinderserum, 1% einer antibiotisch-antimycotischen Mischung und 20 mg/ml von Tunicamycin ergänzt war. Nach diesem Einstellungsschritt wurden die Zellen 2 Stunden lang mit 100 mCi/ml von ³&sup5;S-Methionin in Anwesenheit von 20 mg/ml von Tunicamycin markiert. Das markierte Material wurde dann demselben Lyse- und Vorreinigungsverfahren unterzogen, wie es oben unter (A) beschrieben ist.

Bildung des Proteinantikörperkomplexes

E. An die Aliquoten der Protein-A-beschichteten Kugeln wurden gebunden: (a) positives Referenzblutserum von Personen, die bekanntermaßen Antikörper gegen HTLV - infizierte Zellen beherbergt haben; (b) negatives Kontrollserum von Personen, die infektionsfrei waren; und (c) Serum von unbekannten zu untersuchenden Personen. Jedes Aliquot der beschichteten Kugeln ließ man dann 1 bis 2 Stunden lang mit einem Aliquoten jeder der vorgeklärten Lysate oberhalb von 4º C reagieren, die aus den MJ- und aus den C5-MJ-Zellen nach Absatz (A) erhalten wurden, um die Bildung eines Komplexes oder die Immunopräzipitation zwischen den gebondeten Lysatproteinen und den in den Seren vorhandenen Antikörpern entstehen zu lassen. Am Ende der Reaktion wurden die Kugeln vier Mal mit dem Puffer (RIPA) und einmal mit einem Puffer gewaschen, der 0,05 M Tris-Hydrochlorid, pH-Wert 7,2 und 0,15 M Natriumchlorid enthielt, um die nicht komplex bildenden Lysatproteine zu entfernen.
Die Kugeln wurden sodann in einem Probepuffer untergetaucht (0,1 M Celand Reagens, 2% Natriumdodecylsulfat, 0,08 M Tris-Hydrochlorid, pH-Wert 6,8, 10% Glyzerol und 0,2% Bromphenolblau) und 2 Minuten lang einem Kochen bei 100º C ausgesetzt, um die Proteine von den Kugeln auszuwaschen und die Komplexe zu dissoziieren.

Charakterisierung des Proteins

F. Jede Probe der vorhergehenden Prozedur (A) wurde mittels Elektrophorese analysiert, wobei die Proteine auf einem 12,5% SDS-Polyacrylamidgel mit 3,5% Stapelgel unter Verwendung des Laemmli-Puffer-Systems getrennt wurden. Molekulargewichtsmarker liefen gleichzeitig in einer parallelen Säule. Zu den verwendeten Markern gehörten ¹&sup4;C- markierte Phosphorylase b (92 500), Rinderalbuminserum (68 000), Ovalbumin (46 000), Carboanhydrase (30 000) und Cytochrom C (12 000). Zur Sichtbarmachung mittels Fluorographie wurden die Gele mit 10% Essigsäure, 10% Trichloressigsäure und 30% Methanol 1 Stunde lang fixiert und sodann in einer Enhancer-Lösung 1 Stunde lang untergetaucht. Nach dem Spülen mit destilliertem Wasser und dem Trocknen in Vakuum wurden mit den Gelen ein Kodak SB-5- Film belichtet, um Audioradiographien zu erzeugen.
Die Flecken des gereinigten und isolierten Glykoproteins mit dem Molekulargewicht zwischen 61 000 und 68 000 erschienen auffallend in den Säulen des Serums (a) jedoch nicht in denen des Serums (b). Hingegen traten die Kernproteine p19 und p24 in keiner der Proben des Serums (a) auf. Das Auftreten des Glykoproteins in den unbekannten Seren (c) deutete auf das Vorhandensein von HTLV- infizierten Zellen in den Seren hin. Die Seren von AIDS aufweisenden Personen zeigten ebenfalls bei diesem Verfahren einen augenfälligen Hinweis auf Antikörper gegen das 61 000-68 000 MW Glykoprotein.
Ähnliche Ergebnisse wurden auch erhalten, wenn die markierten Glykoproteine nach Absatz A entweder durch jene nach Absatz B oder C ersetzt wurden. Sie konnten auch durch die markierten unglykolysierten Anteile nach Absatz D ersetzt werden, wobei der gereinigte und isoliert markierte Anteil in der Celsäule an einer Stelle auftritt, die dem Molekulargewicht 46 000-48 000 entspricht. Unmarkiertes Glykoprotein und der unmarkierte unglykolysierte Teil kann erhalten werden, indem die Markierungsschritte der vorerwähnten Verfahren weggelassen werden.
Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, indem die Zelllinie C91PL oder HUT-102 anstelle von MJ oder C5MJ verwendet wurde.

Analyse der Aminosäuresequenz

[³&sup5;S]-Cysteinmarkierte Glykoproteine mit einem Molekulargewicht von etwa 61 000 Dalton wurden aus 36 x 10&sup6; Hut 102-Zellen präzipitiert, die mit 5 mCi von [³&sup5;S]-Cystein (spezifische Aktivität 1011.2Ci/mmol, New England Nuclear) 10 Stunden lang in 10 ml des cysteinfreien RPMI-1640 Medien mit 15% fötalem Rinderserum (Grand Island Biological Co.) metabolisch markiert wurden. Das Glycoprotein wurde aus den NaDodSO&sub4; Polyacrylamidgelen exzisiert und sodann 12 -16 Stunden lang einer elektropheretischen Eluierung in Anwesenheit von 50 mM Tris-Acetatpuffer, pH-Wert 7,8, mit 0,01% NaDod-SO&sub4; unterzogen. Die Proben wurden 12-16 Stunden lang einmal mit 10mm Ammoniumbicarbonatpuffer mit 0,002% NaDodSO&sub4; dialysiert. Eine weiter Dialyse wurde für 12-16 Stunden mit 10mm Ammoniumbicarbonatpuffer ohne NaDodSO&sub4; ausgeführt. Jede Probe wurde sodann lyophilysiert und es wurde mit Hilfe von Verfahren, die von Coligan eta al. in J. Immun. Meth., Vol. 47, 1-11 (1981) und Meth. Enzymol., Vol. 91, 413-434 (1983) beschrieben sind, hinsichtlich der Aminosäurensequenz analysiert. Kurz gesagt wurde eine automatisierte Edman Degradation der radiomarkierten Peptide unter Verwendung eines Beckman 890C-Sequenzierers mit kalter Fallenmodifikation und 0,1 M Quadrol Programm 121078 durchgeführt. Der Butylchloridextrakt jedes Sequenzierungsschritts wurde getrocknet, indem eine N&sub2; Verdampfung in 7,0 ml Scintillationsviolen verwendet wurde. Nach der Zugabe von Biofluor (NEN) wurde die Radioaktivität auf dem Beckman LS9080 Flüssigkeitsscintillationszähler bestimmt. Bei den Bausteinen 6, 7, 21 und 28 wurden [³&sup5;S]-Spitzen gefunden, die das Vorhandensein von Cystein an diesen Stellen der Proteinsequenz des 61 000-68 000 d Glykoproteins anzeigen. Die wiederholte Ausbeute für diese Sequenz betrug 88%, was anzeigt daß alle Bausteine in derselben Sequenz vorhanden sind. Kleine Spitzen an den Stellen 4 und 13 rühren vermutlich von kleinen Mengen (weniger als 5%) kontaminierender Proteine her. Diese Ergebnisse zeigen an, daß das 61 000-68 000 mw Glykoprotein zumindest zum Teil durch das env-Gen von HTLV codiert ist und daß die führende Sequenz des env-Gens aus 20 Bausteinen besteht.
Eine ähnliche Analyse wurde mit [³&sup6;S]-cysteinmarkiertem Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von etwa 67 000 d durchgeführt. Die Cysteinbausteine wurden an den Stellen 6, 7 und 21 erkannt, wenn die ersten 22 NH&sub2;-terminalen Bausteine analysiert wurden. Dies zeigt, daß das Glykoprotein zumindest auch zum Teil durch dasselbe NH&sub2;- terminale Ende des env-Gens codiert ist.

Claims

1. Im wesentlichen reines Polypeptid mit einer antigenen Determinante oder mit Determinanten, die mit Determinanten eines Glykoproteins immunologisch kreuzreagiert bzw. kreuzreagieren, das bestimmt mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ein Molekulargewicht zwischen 61 000 und 68 000 Dalton hat, wovon näherungsweise 46 000 bis 48 000 Dalton des Molekulargewichts auf die nicht glykolysierte Komponente entfallen und wobei das Glykoprotein auf der Zelloberfläche von Zellen auftritt, die mit menschlichem T-Zellen-Leukämie-Virus infiziert sind.

2. Polypeptid nach Anspruch 1, das das HTLV-assoziierte Zelloberflächenglykoprotein nach Anspruch 1 ist.

3. Polypeptid nach Anspruch 1, das eine nicht glykolysierte Komponente des HTLV-assoziierten Zelloberflächenglykoproteins nach Anspruch 1 aufweist.

4. Polypeptid nach Anspruch 1, bei dem das Glykoprotein auf der Zelloberfläche von menschlichen T-Zell- Leukämiezellen der Linie CRL-8294 oder CRL-8293 vorhanden ist.

5. Polypeptid nach den Ansprüchen 2 oder 3, das aus MJ, C5-MJ, C91PL oder HUT-102 Zellen gewonnen ist.

6. Polypeptid nach Anspruch 1, das einen anti-idiotypischen Antikörper mit antigenen Determinanten aufweist, die mit denen des Glykoproteins immunologisch kreuzreagiert.

7. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1, 2, 3, 4 oder 6, das erkennbar markiert ist.

8. Polypeptid nach Anspruch 7, wobei die Markierung aus einer Gruppe ausgewählt ist, zu der eine radioaktive, eine fluorogene, eine enzymatische oder eine Biotinmarkierung gehört.

9. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1, 2, 3 oder 4, das mit einer unlöslichen Phase gekoppelt ist.

10. Polypeptid nach Anspruch 9, wobei die feste Phase ein Latexpartikel oder ein unlösliches Harz ist.

11. Verfahren zur Herstellung des Glykoproteins nach Anspruch 2, das es beinhaltet, MJ oder C5-MJ-Zellen unter geeigneten Kulturbedingungen zu kultivieren und

das Glykoprotein aus den Zellen zu extrahieren.

12. Im wesentlichen nicht glykolysierte Komponente eines Glykoproteins mit einem mittels SDS-Polyamid-Gelelektrophorese bestimmten Molekulargewicht von näherungsweise zwischen 61 000 und 68 000 Dalton, wovon näherungsweise 46 000 bis 48 000 Dalton auf die nicht glykolysierte Komponente entfallen und wobei das Glykoprotein auf der Zelloberfläche von Zellen auftritt, die mit HTLV infiziert sind.

13. Komponente nach Anspruch 12, die erkennbar markiert ist.

14. Komponente nach Anspruch 12, die an eine unlösliche Phase gekoppelt ist.

15. Verfahren zum Testen von biologischen Proben auf das Vorhandensein von Antikörpern gegen HTLV-infizierte Zellen, gemäß dem:

die Proben mit einem Polypeptid inkubiert werden, das eine antigene Determinante oder Determinanten aufweist, die mit den Determinanten eines Glykoproteins immunologisch kreuzreagiert bzw. kreuzreagieren, das ein mittels SDS-Polyacryl-Gelelektrophorese bestimmtes Molekulargewicht von näherungsweise 61 000 bis 68 000 Dalton aufweist, wovon näherungsweise 46 000 bis 48 000 Dalton auf das Molekulargewicht der unglykolysierten Komponente entfallen und wobei das Glykoprotein auf der Zelloberfläche von Zellen auftritt, die mit menschlichem T-Zell- Leukämie-Virus (HTLV) infiziert sind, nach Anspruch 1 und

festgestellt wird, ob zwischen dem Antikörper und dem Polypeptid ein Immunkomplex gebildet wird oder nicht.

16. Verfahren nach Anspruch 15, bei dem das Polypeptid das Glykoprotein mit einem mittels SDS-Polyacryl-Gelelektrophorese bestimmten Molekulargewicht von näherungsweise 61 000 bis 68 000 Dalton ist.

17. Verfahren nach Anspruch 15, bei dem das Polypeptid die unglykolysierte Komponente mit einem mittels SDS- Polyacryl-Gelelektrophorese bestimmten Molekulargewicht von näherungsweise 46 000 bis 48 000 Dalton ist.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 18, das den Schritt der Markierung des Polypeptids umfaßt.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 18, das ein enzymgekoppelter Immuntest ist.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 18, das ein Radioimmuntest ist.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 18, das ein Test mit Agglutinierung von Latexpartikeln ist.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 18, das ein Fluoreszenztest ist.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 18, das ein Doppelantikörperimmunotest ist.

24. Verfahren, um festzustellen, ob in einer biologischen Probe eine antigene Determinante oder Determinanten vorhanden sind, die mit denen des Polypeptids nach Anspruch 1 immunologisch kreuzreagieren, wobei gemäß dem Verfahren:

die Probe mit Antikörpern gegen das Polypeptid nach Anspruch 1 inkubiert wird und

festgestellt wird, ob zwischen den Antikörpern und den Polypeptiden Immunokomlexe gebildet werden oder nicht.

25. Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Proben menschliche Lymphozyten enthalten.

26. Verfahren nach Anspruch 24, bei dem die Antikörper gegen das Glykoprotein gerichtet sind, das ein mittels SDS-Polyacryl-Gelelektrophorese bestimmtes Molekulargewicht von zwischen 61 000 und 68 000 Dalton aufweist.

27. Verfahren nach Anspruch 24, bei dem die Antikörper gegen die unglykolysierte Komponente des Glykoproteins mit einem mittels SDS-Polyacryl-Gelelektrophorese bestimmten Molekulargewicht von 61 000 bis 68 000 Dalton gerichtet sind.

28. Verfahren nach Anspruch 24, bei dem die Antikörper gegen ein Glykoprotein gerichtet sind, das auf der Zelloberfläche von MJ oder C5-MJ-Zellen auftritt.

29. Zusammenstellung zur Verwendung zum Testen einer Probe auf das Vorliegen von Antikörpern gegen HTLV-infizierte Zellen, wobei die Zusammenstellung in Anteile aufgeteilt ist, um in geschlossenen Abteilungen einen oder mehrere Behälter aufzunehmen, zu denen gehört:

ein erster Behälter, der das Polypeptid nach einem der Ansprüche 1, 2, 3, 4 oder 6 enthält,

ein zweiter Behälter, der Mittel enthält, um die Bildung eines Immunokomplexes zwischen dem Antikörper und dem Polypeptid zu erkennen.