DE69224134T2

DE69224134T2 - Monoklonale Antikörper gegen Hepatitis-C-Virus

Info

Publication number: DE69224134T2
Application number: DE69224134T
Authority: DE
Inventors: Winand Johannes Antoniu Habets; Miriam Francisca Hen Klein-Rot; Theodorus Adrianus Oosterlaken; Sing Hiem Yap
Original assignee: Akzo Nobel NV
Current assignee: Akzo Nobel NV
Priority date: 1991-10-15
Filing date: 1992-10-14
Publication date: 1998-07-02
Anticipated expiration: 2012-10-15
Also published as: JP3335387B2; EP0537856A1; AU2707992A; AU670541B2; US5595868A; ZA927837B; ATE162553T1; FI924641A; DE69224134D1; ES2114547T3; KR930008155A; JPH05260960A; FI105275B; KR100238559B1; CA2080548C; CA2080548A1; FI924641A0; EP0537856B1

Description

Die Erfindung betrifft eine Hybridoma-Zelllinie, die einen monoklonalen Antikörper mit einer Bindungsspezifität für Epitope auf dem Hepatitis C Virus-Kernprotein (HCV-Kernprotein) herstellt, und einen ebenfalls von der Hybridoma-Zelllinie hergestellten monoklonalen Antikörper.
Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zum Nachweis von HCV in einer Probe und ein Testset, um das genannte Nachweis- Ver fahren durchzuführen.
HCV ist vor kurzem als einer der Verursacher von NANB-Hepatitis (Non-A, Non-B) erkannt worden. Es kann von anderen Formen virusassoziierter Lebererkrankungen unterschieden werden, zu denen jene gehören, die durch bekannte Hepatitisviren verursacht werden, wie beispielsweise Hepatitis A Virus (HAV), Hepatitis B Virus (HBV) und Delta Hepatitis Virus (HDV) sowie die durch den Cytomegalovirus (CMV) oder den Epstein-Barr Virus (EBV) verursachte Hepatitis. Non-A, Non-B-Hepatitis wurde zuerst bei Individuen, die mit einer Infusion behandelt wurden, identifiziert. Die Übertragung vom Menschen zum Schimpansen und mehrere Passagen in Schimpansen ergaben den Beweis, dass Non-A, Non-B-Hepatitis durch einen oder mehrere übertragbare infektiöse Verursacher entsteht.
Der epidemiologische Beweis deutet darauf hin, dass drei Typen des Non-A, Non-B-Virus existieren: der durch Wasser übertragene epidemische Typ,; der blut- oder nadelassoziierte Typ; und der sporadisch auftretende Typ (in Gemeinschaften übertragen). Die Anzahl der Agenzien, die Non-A, Non-B Hepatitis verursachen können, ist jedoch noch immer unbekannt.
Die klinische Diagnose und Identifikation von Non-A, Non-B Hepatitis wurde bis anhin vor allem mittels Ausschluss anderer viraler Marker erreicht. Zu den Verfahren, um mögliche Antigene und Antikörper gegen Non-A, Non-B Hepatitis nachzuweisen, gehören Agargel- Diffusion, Gegen-Immunelektrophorese, Immunfluoreszenz-Mikroskopie, Immunelektronenmikroskopie, Radioimmunassay und enzymgebundene Immunadsorbtions-Assays. Keiner dieser Assays erwies sich jedoch als ausreichend empfindlich, spezifisch und wiederholbar, um als diagnostischer Test für Non-A, Non-B Hepatitis verwendet werden zu können. Vor kurzem sind serologische Tests für HCV- Infektionen entwickelt worden und sind im Handel erhältlich. Für die Entwicklung eines spezifischen und empfindlichen Verfahrens, das eine in den verschiedenen Stadien der Infektion notwendige zuverlässige Diagnose erlaubt, ist es jedoch von grösster Wichtigkeit, dass HCV nachgewiesen werden kann anstatt die gegen HCV gerichteten Antikörper, wie dies in den zur Zeit im Handel erhältlichen Tests der Fall ist.
Es versteht sich von selbst, dass eine frühe Diagnose einer möglichen HCV-Infektion bei einem Patienten wichtig ist, da dadurch so früh wie möglich mit der Behandlung des an der Krankheit leidenden Patienten begonnen werden kann.
Vor der vorliegenden Erfindung gab es keine überzeugenden Beweise für die Existenz von gegen HCV gebildeten monoklonalen Antikörpern. J. Med. Virol. 8, 1981, Seiten 31 bis 47, beschreibt ein NANB(HCV)-Kernantigen und ein Antiserum, das polyklonale anti- NANB-c-Antikörper enthält. Die EP-A-0 363 025 offenbart die Synthese eines NANB Hepatitis Virus-Antigenpeptids, das als Immunogen für die Herstellung eines NANB-spezifischen monoklonalen Antikörpers dient. Obwohl Anmeldungen wie die EP 318,216, EP 445 801 und die EP 388,232 aussagen, dass monoklonale Antikörper gegen HCV von einem Fachmann hergestellt werden können, konnte in dem Jahr, das seit diesen Publikationen vergangen ist, niemand die Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen HCV offenbaren. Dies liegt wahrscheinlich daran, dass keine Informationen über die dreidimensionale Struktur des Virus vorhanden ist. Kein Fachmann kennt bis anhin die Verfügbarkeit der Antikörper bindenden Epitope.
Die in den Ansprüchen definierten monoklonalen Antikörper gemäss der vorliegenden Erfindung stellen deshalb ein neues Mittel zur Diagnose der HCV-Infektion zur Verfügung.
In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung einen monoklonalen Antikörper zur Verfügung, der über eine Spezifität für ein Epitop auf dem Hepatitis C Virus-Kernprotein verfügt, wobei der monoklonale Antikörper aus einer Hybridoma- Zelllinie gebildet wird, welche durch die Fusion einer Myelomzelle mit einem Lymphozyten, der aus einer vorgängig mit einem HCV- Kernpeptid geimpften Maus stammte, gebildet wurde, wobei die genannte Hybridoma-Zelllinie jener in den Ansprüchen definierten entspricht.
Zusätzlich zu der bevorzugten Ausführungsform betrifft ein Teil der Erfindung einen monoklonalen Antikörper, der gegen ein HCV- Kernpeptid (A1327) mit der Aminosäurensequenz (Einbuchstabencode) RTQQRKTKRSTNRRR oder Fragmente davon oder analoge Peptide und Fragmente davon gerichtet ist. Der monoklonale Antikörper mit dem Code HCV-OT-1F2 wird von einer Hybridoma-Zelllinie hergestellt. Die genannte Hybridoma-Zelllinie wurde bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) in Porton Down, GB unter der Nummer 91101711 am 17.10.1991 unter den Bedingungen des Budapester Vetrags 1977 hinterlegt.
Die Erfindung umfasst ebenfalls ein Verfahren zum Nachweis von HCV in einer Probe, indem eine Probe mit dem oben beschriebenen monoklonalen Antikörper in Kontakt gebracht wird, wonach die Anwesenheit von gebildeten Immunkomplexen nachgewiesen und dadurch die Anwesenheit von HCV in der Probe bestimmt wird. Ein in einem Immunassay anwendbares Testset ist ebenfalls ein Bestandteil der Erfindung. Ein solches Testset enthält mindestens einen monoklonalen Antikörper gemäss der Erfindung.
Die Herstellung der die monoklonalen Antikörper gemäss der Erfindung produzierenden Hybridoma-Zelllinie kann beispielsweise durch die Köhler und Milstein-Technik erfolgen. So können durch Zellfusion immortale Antikörper produzierende Zelllinien gebildet werden, während auch andere Techniken wie direkte Transformation von 13-Lymphozyten mit onkogener DNA oder Transfektion mit dem Epstein Barr Virus möglich sind. Das bevorzugteste Verfahren ist jedoch die Technik von Köhler und Milstein.
Allgemein gesagt ist es das Verdienst von Köhler und Milstein, Techniken ausgearbeitet zu haben, mit denen erfolgreich die ersten monoklonalen Antikörper produzierenden Hybridoma-Zelllinien hergestellt werden konnten (G. Köhler und C. Milstein, 1975, Nature 256: 495-497; 1976, Eur. J. Immunol. 6: 511-519). Indem sie Antikörper bildende Zellen (Milz-Lymphozyten) mit Myelomazellen (bösartige Zellen primärer Knochenmarktumore) fusionierten, bildeten sie eine Hybrid-Zelllinie, die aus einem einzigen fusionierten Zellhybrid (Hybridoma oder Klon genannt) hervorging, die bestimmte Merkmale des Lymphozyten und der Myeloma-Zelllinen geerbt hatte. Wie die Lymphozyten (die Tieren entnommen wurden, denen rote Blutzellen von geprimerten Schafen verabreicht wurden) sonderten auch die Hybridome einen einzelnen Typ des für das Antigen spezifischen Immunglobulins ab; zudem verfügten die Hybridzellen wie die Myelomazellen über das Potential zur unbestimmten Zellteilung. Die Kombination dieser zwei Merkmale hat gegenüber konventionellen Antiseren deutliche Vorteile. Während aus geimpften Tieren abgeleitete Antiseren variable Mischungen aus polyklonalen Antikörpern sind, die nie identisch reproduziert werden können, sind monoklonale Antikörper äusserst spezifische Immunglobuline eines einzelnen Typs. Der von einem Hybridom ausgeschiedene einzelne Typ des Immunglobuuns ist nur für eine einzige antigene Determinante oder ein Epitop auf dem Antigen spezifisch, während ein komplexes Molekül mehrere antigene Determinanten hat. Wenn das Antigen beispielsweise ein Protein ist, kann die antigene Determinante eine der vielen Peptidsequenzen (allgemein 6 bis 7 Aminosäuren lang; M.Z. Atassi, 1980, Molec. Cell. Biochem. 32: 21-43) im ganzen Proteinmolekül sein. Somit können gegen ein einzelnes Antigen gerichtete Antikörper je nach Determinante, die ihre Bildung veranlasst hatte, voneinander unterschieden werden; für jeden gegebenen Klon jedoch sind alle Antikörper, die er produziert, identisch. Ausserdem vermehrt sich die Hybridoma-Zelllinie einfach und ergibt monoklonale Antikörper in äusserst hoher Konzentration.
Nach der Immunisierung von Mäusen mit synthetischem rekombinantem oder natürlichem HCV-Kernantigen, vorzugsweise Peptid A1327 wie weiter oben erwähnt, unter Verwendung der oben erwähnten Hybridoma-Technik, scheint es möglich zu sein, eine einen monoklonalen Antikörper produzierende Hybridoma-Zelllinie zu erhalten, die eine Spezifität für ein Epitop auf dem Hepatitis C Virus Kernprotein hat.
Zu der Erfindung gehört ebenfalls das "Humanisieren" der betreffenden monoklonalen Antikörper. Techniken zur Züchtung der "humanisierten" monoklonalen Antikörpern sind dem Fachmann bekannt.
Die Herstellung des erwähnten Peptids wird mittels eines der bekannten organischen chemischen Verfahren für die Peptidsynthese durchgeführt oder mit Hilfe rekombinierter DNA-Techniken. Zur letzteren gehört die Herstellung des gewünschten Peptids mittels Expression eines rekombinanten Polynukleotids mit einer Polynukleotidsequenz, die das betreffende Peptid in einem als Wirtzelle geeigneten Mikroorganismus codiert.
Zu den organischen chemischen Verfahren zur Peptidsynthese zählt man die Kupplung der benötigen Aminosäuren mittels Kondensationsreaktion entweder in einer homogenen Phase oder mit Hilfe einer sogenannten Festphase.
Wie bereits zuvor bemerkt, kann das betreffende Peptid gegebenenfalls mit Hilfe rekombinanter DNA-Techniken hergestellt werden. Diese Möglichkeit ist vor allem dann wichtig, wenn das Peptid in eine sich wiederholende Sequenz ("in tandem") eingefügt wird oder wenn das Peptid als ein Bestandteil eines (viel grösseren) Proteins oder Polypeptids hergestellt werden kann. Zu diesem Zweck wird als Bestandteil der rekombinierten DNA ein das Polynukleotid codierendes Peptid verwendet.
Die monoklonalen Antikörper gemäss der Erfindung eignen sich sehr gut für die Verwendung in sogenannten Immunassays, um HCV oder HCV-Fragmente in einer Testprobe nachzuweisen. Je nach Art und weiteren Merkmalen der monoklonalen Antikörper ist die stattfindende immunchemische Reaktion eine sogenannte Sandwich-Reaktion, eine Agglutinationsreaktion, eine Kompetitionsreaktion oder eine Inhibitionsreaktion.
Wenn beispielsweise eine Sandwich-Reaktion zum Nachweis von HCV in einer Testprobe stattfindet, umfasst das verwendete Testset einen monoklonalen Antikörper gemäss der Erfindung, der auf einer festen Trägersubstanz geschichtet ist wie beispielsweise die innere Wand einer Microtest-Vertiefung, und einen markierten monoklonalen Antikörper oder ein Fragment davon als Konjugat.
Verwendbare Trägersubstanzen können beispielsweise die innere Wand einer Microtest-Vertiefung sein oder einer Küvette, ein Reagenzgefäss oder Kapillare, eine Membran, ein Filter, ein Teststreifen oder die Oberfläche eines Partikels wie beispielsweise eines Latexpartikels, ein Erythrozyt, ein Farb-Sol, ein Metall-Sol oder einer Metallverbindung als Sol-Partikel, ein Trägerprotein wie BSA oder KLH.
Verwendbare Markierungssubstanzen sind unter anderen ein radioaktives Isotop, eine fluoreszierende Verbindung, ein Enzym, ein Farb-Sol, Metall-Sol oder oder eine Metallverbindung oder ein anderes Sol oder ein anderer Partikel.
Wie bereits erwähnt, eignen sich monoklonale Antikörper gemäss der Erfindung sehr gut zu Diagnosezwecken, während neutralisierende Antikörper in der passiven Immuntherapie sehr nützlich sind. Monoklonale Antikörper können verwendet werden, um anti-idiotypische Antikörper zu züchten. Verfahren zum Züchten von antiidiotypischen Antikörpern sind bekannt.
Anti-idiotypische Antikörper sind ebenfalls nützlich bei der Vorbeugung und/oder Behandlung von Non-A, Non-B Hepatitis sowie bei der Ermittlung wichtiger epitopischer Regionen von HCV-Antigenen.

Beispiel

Die Herstellung des beim ECACC in Porton Down U.K unter der Nummer 91101711 hinterlegten Antikörpers HCV-OT 1F2 wurde bereits weiter oben in dieser Anmeldung beschrieben.
In einem Versuch, das HCV-Antigen nachzuweisen, wurde die Antikörper-Reaktivität der monoklonalen Antikörper, die durch immunhistochemisches Anfärben einer Leberbiopsie eines mit NANB infektiösen Agenzien infizierten Schimpansen durchgeführt wurde, untersucht. Dieser Schimpanse hatte keine serologischen Marker von HBV-, CMVund EBV-Infektion. Neben der HCV Antikörper Seroreaktivität war die HCV-RNA, wie sie mittels PCR unter Verwendung von Primern nachgewiesen wurde, wie von Garson et al. (Lancet 336, 1022, 1990) beschrieben, positiv in Seren und Lebergewebe.
Das Lebergewebe wurde zu einem Zeitpunkt erhalten, während dem die Leberenzyme (ASAT-ATLAT) erhöht waren.
Leberbiopsie-Proben wurden auch aus 10 Patienten mit einer HCV- Infektion (alle waren für die HCV serologischen Marker und die HCV-RNA positiv) und 4 Kontrollpatienten erhalten, welche sich wie folgt zusammensetzten:
2 Patienten mit HBV-Infektion
1 Patient mit PBC
1 Patient mit chronischer Autoimmun-Hepatitis
Alle Kontrollpatienten waren negativ für die HCV serologischen Marker und für die durch PCR nachgewiesene HCV-RNA.

Immunhistochemie

Die Immunhistochemie wurde auf 4 µm dicken Kryostatschnitten von frischen gefrorenem Material durchgeführt. Die endogene Peroxidase-Aktivität wurde in einer Lösung aus 0,3 % H&sub2;O&sub2; in Methanol 30 Minuten bei Raumtemperatur inhibiert. Die Schnitte wurden danach mit normalen Schweineserum (1/20 während 7 Minuten) bei Raumtemperatur inkubiert. Der Überschuss an Schweineserum wurde abgewischt und das erste spezifische monoklonale IGG (oder Kaninchen- Antiserum oder Maus-Antiserum) 30 Minuten bei Raumtemperatur aufgetragen. Nach dem Spülen in PBS (3 x 5 Minuten) wurden die Objektträger mit Kaninchen-Antiserum gegen Maus-Immunglobulin (oder Ziegen anti-Kaninchen Immunglobulin) in einer 1/20 PBS-NHS (10%) Lösung 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach einem nochmaligen Spülen wurden sie mit einem löslichen Komplex aus Meerrettich-Peroxidase Anti-Meerrettich-Peroxidase (PAP, Dakopatts) 30 Minuten bei Raumtemperatur in einer 1/300 Verdünnung inkubiert. Nach dem Waschen wurde das Peroxidase Immunreaktionsprodukt in einer Diaminbenzidin (DAB)-H&sub2;O&sub2;-Lösung 5 Minuten bei Raumtemperatur (60 mg DAB wurden in 100 ml PBS aufgelöst; nach dem Filtrieren wurden 100 µl 30 % H&sub2;0&sub2;-Lösung zugegeben) entwickelt. Nach der Reinigung in Leitungswasser und Differenzierung in Säurealkohol wurden die Schnitte auf DPX aufgebracht.

Ergebnisse:

Für das erste Screenen von Antikörpern zum Nachweis von HCV- Antigenen in Lebergewebe wurde Lebergewebe verwendet, das aus einem mit Non-A, Non-B Hepatitis infizierten Schimpansen stammte.
Von den getesteten Antikörpern wies der monoklonale Antikörper HCV-OT 1F-2 auf diesem Lebergewebe eine "spezfisches" cytoplasmische Färbung auf.
Alle anderen Antikörper reagierten entweder "nicht spezifisch" oder wiesen gar keine Färbung auf. Die Ergebnisse der 14 untersuchten Patienten sind in Tabelle 1 dargestellt.

Tabelle 1

Immunhistochemischer Nachweis des HCV-Antigens in Leberbiopsien unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers HCV-OT 1F-2.
Diese Studie erbringt den überzeugenden Beweis, dass der monoklonale Antikörper HCV-OT 1F-2 das HCV-Antigen im Cytoplasma von Leberzellen spezifisch nachweisen kann, trotz der negativen Befunde bei drei Patienten mit Non-A, Non-B Hepatitis, die über positive serologische Marker einer HCV-Infektion verfügten und in denen auch HCV-RNA im Serum nachgewiesen wurde. Die negativen Befunde bei diesen drei Patienten können auf eine niedrige Konzentration eines in den Leberzellen vorhandenen viralen Antigens oder auf eine relativ schwache Empfindlichkeit des vorliegenden Assays für den Antigennachweis zurükgeführt werden. Die immunologische Spezifität des vorliegenden Assays wurde bemerkt, da in aus Patienten mit Hepatitis 13 und PBC erhaltenem Lebergewebe keine Reaktion gefunden werden konnte. Nach einer "Immun-Absorption" mit einem Homogenat aus normalem menschlichen Lebergewebe ist die Reaktion durchgehend positiv.

Claims

1. Hybridoma-Zelllinie, die Antikörper produzieren kann, wobei die genannten Antikörper die gleiche Immunreaktivität gegen HCV-Proteine aufweisen wie die Antikörper, die von der bei der ECACC unter der Nr. 91101711 hinterlegten Zelllinie produziert werden.

2. Hybridoma-Zelllinie, die beim ECACC unter der Nr. 91101711 hinterlegt ist.

3. Antikörper mit der gleichen Immunreaktivität gegen HCV-Proteine wie monoklonale Antikörper, die von der bei der ECACC unter der Nr. 91101711 hinterlegten Zelllinie produziert werden.

4. Monoklonale Antikörper, die von der Hybridoma- Zelllinie nach Anspruch 2 erhalten werden können.

5. Verfahren zum Nachweisen von HCV in einer Probe, worin die Probe mit den Antikörpern gemäss Anspruch 3 oder 4 in Kontakt gebracht wird, wonach die Anwesenheit von gebildeten Immunkomplexen nachgewiesen und daraus die Anwesenheit von HCV bestimmt wird.

6. Testset zur Ausführung des Verfahrens nach Anspruch 5, umfassend eine Festphase, auf der die Antikörper immobilisiert werden, die von der Zelllinie, die bei der ECACC unter der Nr. 91101711 hinterlegt wurde, produziert werden, und Mittel zum Nachweisen beliebiger Immunkomplexe, die zwischen den Antikörper auf der Festphase und den in einer Probe gegebenenfalls vorhandenen HCV gebildet wurden, nachdem die Probe mit der Festphase in Kontakt gebracht worden ist.