DE3218312C2

DE3218312C2 - Monoklonale Antikörper, Hybridoma-Zellklone, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung zur Erkennung von Brustkrebs und maligner Lymphogranulomatose

Info

Publication number: DE3218312C2
Application number: DE3218312A
Authority: DE
Inventors: Chaya Moroz
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1981-05-15
Filing date: 1982-05-14
Publication date: 1994-11-03
Anticipated expiration: 2002-05-15
Also published as: GB2103238B; US5871735A; CA1201667A; US4882270A; FR2505871A1; IL62879A; US4954434A; JPH05260990A; DE3218312A1; JPH0751062B2; JPS57196154A; JPH0614873B2; GB2103238A; FR2505871B1; IL62879A0

Description

Gegenstand der Erfindung sind Hybridoma-Zellklone und von ihnen gebildete monoklonale Antikörper, die mit embryonalem Ferritin aus humaner Plazenta, nicht dagegen mit humanem adultem Milz- oder Leber-Ferritin reagieren. Außerdem be trifft die Erfindung monoklonale Antikörper, die mit dem embryonalen Ferritin aus humaner Plazenta reagieren und mit humanem adultem Milz-Ferritin kreuzreagieren.

Die Erfindung betrifft ferner einen Assay zur Erkennung von Brustkrebs und/oder Mb. Hodgkin (maligne Lymphogranulomatose) bei dem an Körpergeweben und/oder Lymphozyten des Patienten selektiv die Anwesenheit von onkofetalem Ferritin nachge wiesen wird.

In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung wird die Gegenwart oder Abwesenheit von humanem onkofetalem Ferritin durch einen cytotoxischen Assay bestimmt.

In einer weiteren besonderen Ausführungsform der Erfindung wird die Gegenwart oder Abwesenheit von humanem onkofetalem Ferritin durch einen Radio-Immunoassay bestimmt.

Die Assays der vorliegenden Erfindung gründen sich auf die Verwendung bestimmter monoklonaler Antikörper, die in allen geeigneten Tests zur Bestimmung der Gegenwart oder Abwesenheit von humanem onkofetalem Ferritin eingesetzt werden können. Die Gegenwart von onkofetalem Ferritin weist beim Menschen auf einen Brustkrebs im Stadium I oder II oder auf Mb. Hodgkin hin.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Gegenwart von humanem onkofetalem Ferritin auf der Oberflä che von peripheren Lymphozyten im Kreislauf des Patienten bestimmt. Auch die Gegenwart dieser Art von Ferritin weist auf Brustkrebs oder auf Mb. Hodgkin hin.

Ferritin ist das bedeutendste Eisen-Speicherprotein im Gewe be. Geringe Mengen (65 bis 150 ng/ml) werden auch im Plas ma gefunden. Die Analyse von normalem Gewebe-Ferritin durch isoelektrische Fokussierung hat eine beträchtliche Heterogeni tät der Verbindung aufgezeigt. Marcus und Zimberg (Arch. Biochem. Biophysic. Bd. 162 (1974), S. 493) zeigten, daß Ferritin, welches aus Brusttumor-Gewebe isoliert wurde, saures Isoferritin enthält, das nicht in adultem Leber- Ferritin gefunden wurde. Drysdale und Singer (Cancer Res., Bd. 34 (1974), S. 3352) wiesen das saure Isoferritin in Hela- Tumorzellen und in Plazentazellen nach. Sie schlugen die Bezeichnung "carcinofetales" Isoferritin für solches Iso ferritin vor.

Marcus und Zimberg (Clin. Res. Bd. 23, (1975), S.447) und Jacobs und Mitarb. (Br. J. Cancer, Bd. 34, (1976), S. 286) berichteten über erhöhte Serum-Ferritinkonzentrationen bei Patienten mit Brustkrebs. Sie schlugen einen Assay auf die sen Stoff als möglichen Indikator zur Erkennung von Brust krebs vor. Da jedoch alle heterologen Anti-Ferritin-Sera mit den antigenen Determinanten kreuzreagieren, die sowohl mit adultem als auch mit carcinofetalem Ferritin assoziiert sind, können sie nicht zwischen den zwei Isoferritinen unterschei den.

Die Ergebnisse mit diesen Antisera sind deshalb nur bei Patienten signifikant, bei denen der Ferritinspiegel über dem normalen Bereich liegt (< 200 ng/ml). In einer neueren Untersuchung haben Moroz und Mitarb. (Cancer Immunol. and Immunotherapy, Bd. 3 (1977), S. 101) bei Brustkrebs-Patienten eine Lymphozyten-Subpopulation identifiziert, die Ferritin an ihrer Oberfläche trägt. Das Ferritin ist vom carcino fötalem Typ und diese Ferritin-positiven Lymphozyten erschei nen in den frühen Stadien des Brustkrebses (Stadium I und II). Bei Patienten mit benignen Brusterkrankungen oder bei gesunden Menschen werden diese Lymphozyten nicht festge stellt (Giller und Mitarb., Surgery Gyn. Obst, Bd. 149 (1979), S. 655).

Der Nachweis von an Lymphozyten gebundenem Ferritin oder von seiner Anwesenheit in Gewebeflüssigkeiten ist die Grundlage des Assays zur Früherkennung von Brustkrebs beim Menschen.

In jüngster Zeit wurde ein Verfahren entwickelt, bei dem Myeloma-Zellen der Maus mit Milz-Zellen der hyperimmuni sierten Maus hybridisiert werden (Köhler und Milstein, Nature, Bd. 256 (1975), S. 495). Eine dabei erhaltene Hy bridzelle kann einen einzelnen Antikörper produzieren, der gegen eine einzelne antigene Erkennungsstelle (Determinante) gerichtet ist. Nach dem Klonieren einer derartigen Hybrid zelle wird ein Klon von Hybridzellen erhalten, die alle den gleichen monoklonalen Antikörper produzieren. Die Ver wendung der monoklonalen Antikörper, die gegen eine einzel ne antigene Derterminante gerichtet sind, die sich nur an humanem carcinofetalem Ferritin, nicht aber an adultem Ferritin befindet, macht die Identifizierung dieses Iso ferritins beim Erwachsenen (im Plasma oder auf Lymphozyten) zu einem besonders spezifischen und empfindlichen Mittel für die Erkennung einer malignen Erkrankung. Die Wahrschein lichkeit, eine benigne Erkrankung aufzufinden, die mit einer Erhöhung des adulten Ferritins im Serum verbunden ist, ist dagegen erheblich vermindert.

Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, Hybridoma zellen zu schaffen, die monoklonale Antikörper bilden, die jeweils spezifisch für eine bestimmte unterschiedliche antigene Determinante an humanem Plazenta-Ferritin sind, nämlich den Zellklon

1) CM-OF-H9, dessen monoklonaler Antikörper gegen eine antigene Determinante gerichtet ist, die spezifisch für humanes embryonales Ferritin ist, und
2) CM-OF-3, dessen monoklonaler Antikörper gegen eine De terminante gerichtet ist, die sowohl bei humanem embryonalem Ferritin als auch bei humanem adultem Milz- Ferritin vorhanden ist.

Eine weitere Aufgabe ist die Herstellung der Zellklone und der monoklonalen Antikörper. Schließlich ist es eine Auf gabe, mittels dieser monoklonalen Antikörper einen empfind lichen Assay zur Früherkennung von Brustkrebs und Mb. Hodgkin zu entwickeln. Der Test beruht auf der Identifi zierung von "onkofetalem" Ferritin, das im Serum oder in einer anderen Körperflüssigkeit enthalten oder an Lymphozy ten gebunden ist. Damit dient der Test zur Früherkennung von Brustkrebs und zur Erkennung von Mb. Hodgkin.

Diese Aufgaben werden durch die Erfindung gelöst. Die Er findung betrifft somit die in den Patentansprüchen gekenn zeichneten Gegenstände.

Die besondere Spezifizität des monoklonalen Antikörpers von CM-OF-H9 für Ferritin vom onkofetalem Typ ermöglicht die Unterscheidung zwischen der Erhöhung des Serum-Ferritin- Spiegels, die durch eine maligne Erkrankung verursacht wird, und dem normalen Ferritin oder der mit benignen Er krankungen (beispielsweise Thalassaemia) verbundenen Erhöhung. Der monoklonale Antikörper von CM-OF-3 kann die Erhöhung des Ferritinspiegels in den zwei Gruppen von Erkrankungen fest stellen. Ein Test mit beiden Antikörpern läßt zwischen malig nen und benignen Erkrankungen unterscheiden.

Herstellung von humanem onkofetalem Ferritin

Ferritin wird aus der Plazenta des Menschen nach einer Mo difikation des Verfahrens von Beamish und Mitarb. (J. Clin. Path., 24 (1971), s. 581) hergestellt. Dazu zerkleinert man 500 g Plazentagewebe und ergänzt mit Wasser auf ein Gesamt volumen von 200 ml. Nach der Homogenisierung erhitzt man die Gewebesuspension 20 Minuten auf 75°C. Nach dem Abkühlen und 15 Minuten Zentrifugieren bei 10 000 U.p.M. behandelt man den Rückstand mit Essigsäure und stellt den pH-Wert auf 4,6 ein. Das ausgefällte Protein entfernt man durch 15 Mi nuten Zentrifugieren bei 10 000 U.p.M. Sodann wird der erhaltene klare Überstand mit verdünnter Natronlauge auf einen neutralen pH-Wert eingestellt. Durch 240 Minuten Ultrazentrifugieren des klaren braunen Überstands bei 100 000 × g sammelt sich das suspendierte Ferritin als kleines Pellet am Boden des Zentrifugengefäßes. Man löst den Niederschlag in 0,9% Kochsalzlösung wieder auf und reinigt das Produkt weiter durch Chromatographie an einer mit Sephadex G 200 gefüllten Säule.

Hierauf führt man die Ferritin-Fraktion aus der Säule durch ein DEAE-Cellulose-Anionenaustauscherharz, wobei man Tris- HCl-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,5 und einem Gradien ten von 0,02 bis 0,5 M verwendet. Man erhält drei Protein- Peaks, von denen man den am stärksten sauren Peak pI = 4,8 (Nr. III) sammelt und zur Analyse verwendet. Die Reinheit der erhaltenen Fraktion bestimmt man durch isoelektrische Fokusierung und Immunelektrophorese gegen Antikörper-Ferri tin-Serum und Anti-Human-Vollserum. Das erhaltene Produkt ver wendet man gemäß nachstehender Beschreibung zur Immunisie rung von Mäusen.

Herstellung von Hybridomazellen Myelomazellen:

Die zur Hybridisierung eingesetzten Myelomazellen pB/NSl/l-Ag4-1 werden in RPMI-1640 mit 20% fetales Käl berserum (FCS) gezüchtet.

Mäuse:

Es werden weibliche, 4 bis 6 Wochen alte Balb/c-Mäuse verwendet.

Immunisierungsprotokoll:

Im Abstand von je einer Woche führt man drei Immunisierungen mit 50 µg saurem Ferritin in Freund′s komplettem Adjuvans durch und hybridi siert 3 Tage nach der letzten Injektion von 10 µg Ferritin. Den hyperimmunisierten Mäusen gewährt man vor der letzten Boosterimmunisierung mindestens 1 Monat Ruhe.

Zellpräparation: Milzzellen:

a) Man entnimmt den Mäusen die Milz in RPMI-O;
b) in der Petrischale spült man zweimal mit RPMI-O;
c) man zerteilt die Milz in RPMI-O mit Nr. 18 Nadeln;
d) die Zellsuspension überführt man in ein Reagensglas und trennt größere Gewebestücke ab;
e) die Einzelzell-Suspension verbringt man in ein anderes Reagensglas und zentrifugiert 5 Minuten bei 800 U.p.M. (160 × g); anschließend lysiert man die roten Blutzel len mit 0,83% NH₄Cl vom pH 7,5;
f) man wäscht die Zellen dreimal mit RPMI-O und suspen diert sie wieder im gleichen Medium;
g) man zählt die Zellen mit Trypan Blau.

Myeloma-Zellen:

a) Man entnimmt die Zellen aus dem Kulturgefäß und pipet tiert sie vorsichtig in ein 50 ml fassendes Falcon/ Corning-Reagensglas;
b) sodann zentrifugiert man 5 Minuten bei 900 U.p.M. (200 × g);
c) man wäscht einmal mit RPMI-O, suspendiert wieder im gleichen Medium und zählt mit Trypan Blau.

Verschmelzung der Milz- und Myelomazellen:

a) Milz- und Myelomazellen kombiniert man im Verhältnis 10 : 1 in einem einzelnen, konischen, 50 ml fassenden Falcon/Corning-Einweg-Zentrifugengefäß;
b) danach werden die Zellen 5 Minuten bei 900 U.p.M. (200 × g) zentrifugiert;
c) man saugt das Medium so vollständig wie möglich ab;
d) alle Lösungen und Medien, die man von jetzt an verwen det, haben Raumtemperatur;
das Zentrifugengefäß mit dem Zellpellet taucht man in ein Bad von 37°C, gibt dann unter leichtem Rühren in 1 Minute 0,2 ml 33% PEG 1500 zu und zentrifugiert 5 Mi nuten bei 200 × g. Danach suspendiert man die Zellen wie der, rührt 1 Minute leicht und gibt hierauf 5 ml RMPI-O unter leichtem Rühren und anschließend 5 ml RPMI-O mit 20% fetales Kälberserum zu. Das Hybridgemisch sieht jetzt wie eine schlecht resuspendierte Zellsus pension mit vielen kleinen Klümpchen aus;
e) das Gemisch wird 5 Minuten bei 200 × g zentrifugiert;
f) danach suspendiert man die Zellen wieder bei 37°C in RPMI-HY-HATP in einer Konzentration von 3 × 10⁶/cm³, wo bei man das Medium auf das Zellpellet spritzt;
g) man verbringt die Hybridzellen in eine Titrierplatte mit flachem Boden und 96 Näpfchen, wobei man 2 Tropfen Zellsuspension aus einer 5 ml Pipette oder einem Multi pipettor unter Verwendung eines Tropfenabstreichers (etwa 65 µl) zufügt, die 100 bis 120 RPMI-HY-HADT ent halten (etwa 2 × 10⁵ Zellen);
h) man legt Kontrollproben an mit einem Gehalt von NS-1 Zellen und RPMI-HY-HATD mit einer Konzentration von 1 × 10⁶ Zellen/ml;
i) die Platten kultiviert man 7 Tage;
j) am 8. Tag und danach zweimal wöchentlich saugt man die Hälfte des Kulturmediums sorgfältig ab und ergänzt mit 80 bis 100 µl RPMI-HY-HT-Medium;
k) die Untersuchung auf positive Proben (Näpfchen) führt man 3 bis 4 Wochen nach der Hybridisierung durch.

Medien und Lösungen 1. RPMI-O (kein FCS) 2. RPMI 1640-HY

600 ml keimfreies destilliertes Wasser
55 ml 10 × RPMI-1640
6 ml 1,0 N Natriumhydroxid
14 ml 7,5% Natriumbicarbonat

3. RMPI-HY-HATD - Tag 0 → Tag 7

Für 100 ml des Mediums:
95 ml RPMI-1640 + 20% FCS
1,0 ml Pyruvat (100×)
2,0 ml 50 3× HAT
2,0 ml 50 × Desoxycytidin

4. RPMI-HY-HT - Tag 8 → Tag 14 für 100 ml Medium:

97 ml RPMI-1649 + 20% FCS
2,0 ml 50 × HT
1,0 ml Pyruvat (100×)

Für die Hybridzellen vom Tag 15 an verwendet man RPMI-1640 + 20% FCS und Pyruvat oder hält sie in RPMI-HY-HT.

5. PEG 33 und 25% Gew./Vol.

Es muß geruch- und farblos sein. Für 100 ml wird die entsprechende Gewichtsmenge 10 bis 15 Minuten in einer Glasflasche bei 1,055 atü sterilisiert. Wenn die Fla sche genug abgekühlt ist, um in der Hand gehalten zu werden (etwa 50°C), wird mit RPMI 1640-O auf 100 ml aufgefüllt und durch Schütteln vermischt. Das Produkt wird bei Raumtemperatur aufbewahrt.

6. HATD - Endkonzentrationen der Reagentien

H = Hypoxanthin\|10^-4M
A = Aminopterin	10^-6M
T = Thymidin	2 × 10^-5M
D = Desoxycytidin	2 × 10^-6M

HT Vorrat 100× - 100 cm³

Thymidin MG. 242,33\|0,04846 g
Hypoxanthin MG. 136,1	0,1361 g

Man füllt mit doppelt destilliertem Wasser auf 100 ml auf und erwärmt zur Lösung auf 60 bis 70°C. Danach stellt man das Endvolumen mit doppelt destilliertem Wasser ein. Die erhaltene Lösung wird auf das 50-fache verdünnt und dann durch ein 0,2 µ Filter sterilfiltriert. Das Filtrat wird in Mengen von 2 ml unterteilt und bei -20°C ge lagert.

A Vorrat 1000× - 100 cm³

Aminopterin MG. 440,3|0,44 g

Man setzt doppelt destilliertes Wasser bis zu einem Vo lumen von 50 ml zu und versetzt dann tropfenweise mit 0,1 nNaOH, bis sich das Aminopterin löst. Danach bringt man das Endvolumen mit doppelt destilliertem Wasser auf 100 ml. Nach der Volumeneinstellung wird sterilfiltriert (0,2 µ Filter) und das Filtrat bei -20°C gelagert.

D Vorrat 100× - 100 cm³

Desoxycytidin MG. 227,2|0,00454 g

Man löst in doppelt destilliertem Wasser, stellt auf ein Volumen von 100 cm³ ein, verdünnt 50×, führt eine Sterilfiltration durch und lagert die Lösung bei -20°C. (0,2 µ Filter).

HAT - 50× - 200 ml

Man vereinigt 100 ml 100 × HT mit 10 ml 1000 × A + 90 ml dop pelt destilliertem Wasser = 50 × HAT. Sodann wird sterilfil triert (0,2 µ Filter). Man unterteilt das Filtrat in Mengen von 2 ml und friert es bei -20°C ein.

Die Prüfung und Bestimmung der Spezifizität der monoklonalen Antikörper führt man mit Hilfe eines Hämmagglutinationstestes durch. Dazu wird embryonales Plazenta- und adultes Milz-Ferri tin durch CrCl₂ an Ox rote Blutzellen (Ox RBC) gebunden. Man vermischt je 50 µl Überstand des Hybridomakulturmediums in steigender Verdünnung - ausgehend vom Verhältnis 1 : 10 - mit 10 µl adultes oder embryonales Ferritin Ox RBC und bestimmt die Hämagglutination. Man selektioniert die Überstände von Klonen, die einen Hämagglutinationstiter von mindestens 1 : 1000 ergeben.

Auf diese Weise wird ein Klon mit der Bezeichnung CM-OF-3 aus gewählt. Der Klon CM-OF-3 bzw. der von ihm gebildete monoklo nale Antikörper ist spezifisch für embryonales Ferritin und liefert sowohl mit adultem als auch mit embryonalem Ferritin eine Kreuzreaktion.

Den erhaltenen monoklonalen Antikörper des Klons CM-OF-3 verwendet man zur Blockierung der kreuzreaktiven Determinan ten von fetalem und adultem Ferritin, um einen Zellklon mit der Bezeichnung CM-OF-H9 herzustellen, der einen anderen mo noklonalen Antikörper erzeugt, welcher nur gegen eine spezifi sche Determinante von fetalem Ferritin gerichtet ist. Dazu benutzt man folgendes Immunisierungsverfahren:

A. Immunisierungs- und Verschmelzungsprotokoll

Man setzt embryonales Ferritin aus menschlicher Plazenta, ein Protein vom Protein-Peak pI 4,8 (vgl. oben) mit dem monoklona len Antikörper des Klons CM-OF-3 in folgendem Verhältnis um: 90 µg embryonales Ferritin in PBS wird mit Ascitesflüssigkeit von BALB/c Mäusen vermischt, die 10 mg/ml CM-OF-3 Antiferritin monoklonale Antikörper enthält.

Danach inkubiert man das Gemisch 30 Minuten bei 37°C und anschließend etwa 15 Stunden bei 4°C. Das Gemisch zentri fugiert man hierauf bei 10 000 × g, verwirft den entstande nen Niederschlag und verwendet den Überstand zur Immunisie rung. Man immunisiert die BALB/c Mäuse mit einem Gemisch aus dem vorstehend erhaltenen Überstand und Freund′s komplettem Adjuvans, das man intradermal 1× wöchentlich während 3 Wo chen injiziert. Eine Booster-Immunisierung mit 1/5 der vor stehend genannten Dosis wird intraperitoneal gegeben.

3 Tage nach der Booster-Injektion entfernt man die Milz der Maus aseptisch und führt die Verschmelzung durch Inkubation von 10⁸ Milzzellen mit 10⁷/P3-NSI/1-Ag4 Myelomazellen gemäß dem vorstehend beschriebenen Hybridisierungsverfahren und mit den gleichen Maßnahmen zur Identifizierung positiver Klone durch. Dabei erhält man einen als CM-OF-H9 bezeichne ten Klon.

B. Charakterisierung des erhaltenen monoklonalen Antikörpers

Eigenschaften des monoklonalen Antikörpers des Klons CM-OF-H9: Der monoklonale Antikörper des Klons CM-OF-H9 gehört zur Klasse IgG; er bildet keine Präzipitate mit Ferritin und bindet Kanin chen-Komplement. Die Antikörperkonzentration in der erhal tenen Ascitesflüssigkeit beträgt etwa 7 mg/ml. 1 ml Asci tesflüssigkeit bindet etwa 2 mg embryonales Ferritin, aber kein adultes Milz- oder Leber-Ferritin.

Reaktivität der monoklonalen Antikörper

Die beiden Antikörper ermöglichen eine schnelle und einfache Erkennung von malignen Brusterkrankungen und Mb. Hodgkin und eine Unterscheidung dieser Erkrankungen von Thalassaemia, die ebenfalls eine Ferritinerhöhung ergibt.

Grundlage der serologischen Testverfahren Bestimmung des an Lymphozyten gebundenen Ferritins (LBF)

Die Anwesenheit von an Lymphozyten gebundenem Ferritin weist bei menschlichen Patienten auf Brustkrebs hin. Die Bestim mung dieser Art von Ferritin wird folgendermaßen durchge führt:

a) Man isoliert die Lymphozyten aus dem peripheren Blut;
b) man bestimmt das an Lymphozyten gebundene Ferritin durch einen herkömmlichen Assay unter Verwendung der monoklo nalen Antikörper der Erfindung, die spezifisch gegen Ferritin gerichtet sind, das aus menschlicher Plazenta stammt.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Test folgen dermaßen durchgeführt:

a) Man isoliert die Lymphozyten durch Ficoll-Hypaque- Gradientenzentrifugierung aus dem peripheren Blut;
b) man bestimmt die Gegenwart oder Abwesenheit von LBF mit irgendeinem üblichen Assay, beispielsweise einem cyto toxischen Test oder Radioimmunoassay. Diese Assays kann man auch mit Serum oder einer anderen Körperflüssigkeit durchführen.

Test zur Früherkennung von Brustkrebs und Hb. Hodgkin Sammeln und Herrichten der Zellen

1. Heparin enthaltende Blutsammelröhrchen mit einem Fassungs vermögen von 15 ml;
2. konische Zentrifugenröhrchen mit einem Fassungsvermögen von 25 ml;
3. Pasteur-Pipetten und Küvetten;
4. mit Natriumphosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit dem pH-Wert 7,2;
5. Ficoll-Hypaque-Dichtelösung mit der Dichte 1,077 g/ml.

Zell-Sammelverfahren

1. Man sammelt 15 ml Blut in ein Heparin enthaltendes Blut- Sammelröhrchen und verdünnt im Verhältnis 1 : 2 in PBS vom pH-Wert 7,2;
2. man unterschichtet die Zellsuspension mit 10 ml Ficoll- Hypaque-Dichtelösung;
3. man zentrifugiert 30 Minuten bei Raumtemperatur und 300 × g;
4. man sammelt die mononukleären Zellen aus der Medium- Ficoll-Hypaque-Grenzfläche mit einer Pasteur-Pipette und überführt in ein neues 15 ml fassendes Röhrchen;
5. man wäscht die Zellen 3mal durch Suspendieren in 15 ml Waschmedium und 10 Minuten Zentrifugieren bei 4°C und 300 × g;
6. man suspendiert erneut im Waschmedium und bestimmt die Zahl der Zellen.

Radioimmunoassay (RIA) Zusätzlich benötigtes Material

1. Minisorp-Teströhrchen 100 × 15 mm;
2. RPMI 1640;
3. Rinder-Serumalbumin (BSA) 5% in PBS, pH-Wert 7,2, mit einem Gehalt von 0,025% Natriumazid;
4. Normales Kaninchenserum (NRS);
5. Monoklonale Antikörper CMH-9
6. Weiße Ascitesflüssigkeit;
7. ¹²⁵J Anti-Maus IgG.

Radioimmunoassay - 1

Man isoliert die peripheren mononucleären Blutzellen durch Ficoll-Hypaque Gradienten zentrifugieren.

Der Test wird dreifach durchgeführt.
A = Blindprobe; B = Test.

1. Man bringt 2 × 10⁶ - 3 × 10⁶ Zellen in jedes der 6 Test röhrchen und pelletisiert die Zellen durch 10 Minuten Zentrifugieren bei 300 × g;
2. man fügt 20 µl NRS, verdünnt im Verhältnis 1 : 10 in PBS hinzu und inkubiert 60 Minuten bei 4°C;
3. man fügt 30 µl Ascites-Flüssigkeit (10^-5-fache Ver dünnung in 5% BSA) zu jeweils 3 Röhrchen hinzu.
- A. Kontroll-Ascitesflüssigkeit mit einem Gehalt an IgG₁ nicht spezifischem monoklonalen Antikörper, nicht reaktiv mit onkofetalem Ferritin;
- B. monoklonale Antikörper CMH-9; man vermischt sorgfältig und inkubiert 2 Stunden bei Raumtemperatur;
4. man wäscht die Zellen zweimal mit 100 ml RPMI-1640 und zentrifugiert 10 Minuten bei 4°C und 300 × g;
5. man fügt 0,1 µCi ¹²⁵J-Kaninchen Anti-Maus IgG hinzu (¹²⁵J Kaninchen IgG IµCi/µg), inkubiert 60 Minuten bei 4°C, wäscht zweimal mit kaltem RPMI-1640 gemäß Punkt 4 und zählt die Radioaktivität;
Positiver Test: Cpm A- CpmB < 500.

Radioimmunoassay - 2

Nach der Stufe 1, RIA - 1, setzt man das Testverfahren fol gendermaßen fort:

CMH-9 F(ab)₂ wird durch peptidische Verdauung von CMH-9 IgG gemäß Utsumi und Karush (Biochem., Bd. 4 (1965), S. 1766) und aus nicht spezifischem IgG₁ erhalten; vgl. Kontrolle bei RIA-1. Die F(ab)₂-Fragmente, die dabei erhalten werden, verwendet man folgendermaßen:

Rohr A: Kontrolle F(ab)₂ in 5% BSA in PBS, pH-Wert: 7,2, und 0,025% Natriumazid;
Rohr B: CMH-9 F(ab)₂ in 5% BSA in PBS, pH-Wert: 7,2, und 0,025% Natriumazid.

Man inkubiert 60 Minuten bei Raumtemperatur und wäscht ein mal mit 2 ml 1% BSA in PBS, pH-Wert 7,2. Sodann versetzt man die Röhrchen A und B mit dem ¹²⁵J-markierten Liganden (etwa 10⁵ cpm), und zwar entweder ¹²⁵J-markiertes onkofeta les Ferritin oder ein Komplex von ¹²⁵J-polyklonalem anti onkofetalem Ferritin mit onkofetalem Ferritin. Der Komplex wurde vorher hergestellt mit einem Antigen-Antikörper-Mol verhältnis von 1 : 1 bis 1 : 2. Seine Bestandteile wurden miteinander 1 Stunde bei Raumtemperatur vorinkubiert. An schließend inkubiert man den markierten Liganden zusammen mit den Zellen 1 Stunde bei Raumtemperatur, wäscht zweimal mit 1% BSA in PBS, pH-Wert 7,2, entfernt nicht gebundenen markierten Liganden und zählt die Radioaktivität. Wenn der Wert für B höher liegt als für A, ist der Test positiv.

Cytotoxischer Assay

Der Test wird zweifach durchgeführt;
A = Kontrolle, B = Test.

1. Man suspendiert PBL mit einer Dichte von 5 × 10⁶ Zellen/ ml in RPMI-1640;
2. man bringt 150 µl PBL jeweils in 4 Teströhrchen mit den Abmessungen 12 × 75 mm und fügt 30 µl Ascitesflüssig keit (Verdünnung: 10^-4) hinzu.
- A. Kontroll-Ascitesflüssigkeit (2 Röhrchen);
- B. CMH-9 (2 Röhrchen);
  man inkubiert 45 Minuten bei 4°C,
3. Sodann fügt man 100 µl Kaninchen-Komplement, verdünnt im Verhältnis 1 : 5 in PBS hinzu und inkubiert 60 Minuten bei 37°C unter langsamem Rühren;
4. man zählt die lebenden Zellen mit Trypan Blau.

Positiver Test:

Cytotoxischer Testsatz

1. Monoklonale Antikörper CMH-9
2. Monoklonale Antikörper, nicht spezifisch
3. Komplement vom Kaninchen
4. Herkömmliche Adjuvantsin standardisierter Lösung

RIA-Testsatz

1. F(ab)₂ von CMH-9
2. F(ab)₂ von nicht-spezifischen monoklonalen Antikörpern
3. ¹²⁵J-markierter Ligand.

RIA-1 -Testsatz

1. Monoklonale Antikörper CMH-9
2. Monoklonale Antikörper, nicht spezifisch
3. ¹²⁵J-Anti-Maus-IgG₁
4. Adjuvants und standardisierte Lösungen.

Claims

1. Monoklonale Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit humanem onkofetalem Ferritin reagieren und mit hu manem Milz- oder Leber-Ferritin nicht reagieren.

2. Hybridoma-Zellklon, dadurch gekennzeichnet, daß er mono klonale Antikörper gemäß Anspruch 1 erzeugt.

3. Testsatz zur Erkennung von Brustkrebs oder maligner Lymphogranulomatose durch Bestimmung des onkofetalen Ferritins, der einen monoklonalen Antikörper gemäß Anspruch 1 enthält.

4. Testsatz nach Anspruch 3, zur Bestimmung des onkofetalen Ferritins mit einem cytotoxischen Assay.

5. Testsatz nach Anspruch 3, zur Bestimmung des onkofetalen Ferritins durch einen Immunoassay.

6. Testsatz nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß er standardisierte monoklonale Antikörper gemäß Anspruch 1, nicht spezifische monoklonale Antikörper, Komplement von Kaninchen, Adjuvants und standardisierte Lösungen enthält.

7. Testsatz nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Immunoassay ein Radioimmunoassay ist und standardi siertes F(ab)₂ von monoklonalen Antikörpern gemäß An spruch 1, F(ab)₂ von nicht spezifischen monoklonalen An tikörpern und einen ¹²⁵J-markierten Liganden enthält.

8. Testsatz nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Immunoassay ein Radioimmunoassay ist und standardi sierte monoklonale Antikörper gemäß Anspruch 1, nicht spezifische monoklonale Antikörper, ¹²⁵J-Antimaus IgG₁, Adjuvants und standardisierte Lösungen enthält.

9. Verfahren zur Herstellung eines Hybridoma-Zellklons nach Anspruch 2, bei dem man

(a) Mäuse mit embryonalem Ferritin aus humaner Plazenta, aus an Brustkrebs erkrankten Menschen oder aus der Milz von an maligner Lymphogranulomatose erkrankten Menschen immunisiert, nachdem man das Ferritin mit monoklonalen Antikörpern umgesetzt hat, die mit hu manem onkofetalem Ferritin aus der Plazenta reagieren und mit humanem adultem Milz-Ferritin kreuzreagieren;
(b) die Milz-Lymphozyten der hyperimmunen Mäuse mit Mye lomazelIen hybridisiert; und
(c) einen Klon selektioniert, der Antikörper erzeugt, welche nur mit humanem embryonalem Ferritin reagie ren.

10. Verfahren zur Herstellung der monoklonalen Antikörper gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Hybridoma-Zellklon nach Anspruch 2 in Mäuse injiziert und die Ascitesflüssigkeit gewinnt, die den monoklonalen Antikörper enthält.

11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeich net, daß man weibliche Balb/c-Mäuse einsetzt.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch ge kennzeichnet, daß man die Immunisierung der Mäuse durch eine Reihe von Injektionen mit onkofetalem Ferritin in Freund′s komplettem Adjuvants durchführt.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch ge kennzeichnet, daß die Milz- und Myeloma-Zellen in einem Verhältnis von 20 : 1 bis 1 : 1 kombiniert werden.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis etwa 10 : 1 beträgt.

15. Monoklonale Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit humanem onkofetalem Ferritin der Plazenta reagieren und mit humanem adultem Milz-Ferritin kreuzreagieren.