JP2635946B2 - 抗ガングリオシドＧＤ１ａ単クローン性抗体ＭＺを産生する細胞 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、ガングリオシドＧＤ
_1aに対する単クローン性抗体を産生する細胞に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来ガングリオシドに対する単クローン
性抗体としては、ＧＤ_1aに対するものは未知である。

【０００３】糖脂質は細胞の発生、分化、癌化の研究に
おいて特に注目を浴びている生体物質である。糖脂質の
中でシアル酸を含有するスフィンゴ糖脂質を総称して、
特にガングリオシドと呼び、ガングリオシドＧＤ_1a（以
下、単にＧＤ_1aという）もその１つである。

【０００４】ＧＤ_1aはヒト及び種々の動物において特に
神経系組織に多く存在する物質である。癌患者または自
己免疫疾患の１種である全身性エリテマトーデス（以
下、ＳＬＥという）患者の血中のガングリオシド組成が
健常人のそれとは顕著に異なることが報告されている
（Journal of Biochemistry ９８巻、８４３頁、１９８
５年）。

【０００５】すなわち、血中に免疫複合体の形で存在す
るガングリオシドは、健常人ではその主たるものがＧＭ
₃ であるのに対し、癌またはＳＬＥの患者ではＧＭ₃ は
殆どみられず、代りにＧＭ₁ やＧＤ_1aが主たるガングリ
オシドである。したがって、血中のＧＤ_1aを正確に定量
することができれば癌またはＳＬＥにかかっているか否
かを予想することができる。

【０００６】さらにＧＤ_1aはＧＭ₁ 等とともに脳神経系
の主たるガングリオシドである。そのため脳神経系に脱
髄等の器質的障害を伴う諸疾患が発現した場合には、Ｇ
Ｄ_1aが血液中や脳脊髄液中へ移行することが想定され
る。

【０００７】そこで、それらにおけるＧＤ_1aの濃度を定
量することにより、器質的障害を伴った脳神経系諸疾患
にかかっているか否かをも予想することができる。

【０００８】ＧＤ_1aの定量、同定および精製のための手
段として、従来の化学的及び生化学的方法に加えて、Ｇ
Ｄ_1aに対する特異的な抗体を用いる免疫学的方法が用い
られるようになった。

【０００９】従来、ＧＤ_1aに対する抗体は、それを適当
な担体及び免疫アジュバントと共にウサギに免疫するこ
とにより得られる抗血清由来のものが使用されてきた。

【００１０】それはいわゆる多クローン性抗体であり、
作られる抗体のロット、または免疫に用いられる個体に
より特異性が必ずしも一定していないので、その欠点の
ない単クローン性抗体の取得が望まれていた。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本願発明者らは、鋭意
研究の結果、従来技術では得られていなかったＧＤ_1aに
対し極めて特異的で高い抗体価を有する抗ＧＤ_1a単クロ
ーン性抗体を作製することに成功し、この発明を完成す
るに至った。

【００１２】すなわち、この発明は、ＧＤ_1aのみを特異
的に認識する抗ＧＤ_1a単クローン性抗体を提供する。

【００１３】さらにまた、この発明は、ＧＤ_1aで免疫化
した動物由来の抗体産生細胞と骨髄腫細胞との融合細胞
であって、上記抗ＧＤ_1a単クローン性抗体を産生するハ
イブリドーマを提供する。

【００１４】また、この発明は、ＥＢウイルスに感染し
たリンパ球に由来し、上記抗ＧＤ_1a単クローン性抗体を
産生する細胞株を提供する。

【００１５】さらに、この発明は、上記抗ＧＤ_1a単クロ
ーン性抗体からなるガングリオシドＧＤ_1a検出または定
量用試薬を提供する。

【００１６】

【発明の効果】この発明により、ＧＤ_1aに対し、極めて
特異的で高い抗体価を有する抗ＧＤ_1a単クローン性抗体
が提供された。この単クローン性抗体は、後の実施例に
おいて明らかになるように、ＧＤ_1aに類似した糖鎖を有
する他のガングリオシドとは反応せず、ＧＤ_1aに対して
極めて特異的に反応する。

【００１７】したがって、この発明の抗ＧＤ_1a単クロー
ン性抗体を用いてＧＤ_1aを極めて感度よく定量すること
ができる。

【００１８】したがって、この発明の単クローン性抗体
を用いて血中のＧＤ_1aを感度よく定量することができる
ので、この発明の単クローン性抗体を含むこの発明の試
薬により、被検者が癌またはＳＬＥ、さらには脳神経系
の器質的障害を伴う諸疾患にかかっている蓋然性を感度
よく知ることができる。

【００１９】さらにまた、この発明により、上記単クロ
ーン性抗体を産生する新規な細胞が提供された。

【００２０】

【発明の具体的説明】この明細書において、糖質、脂質
の名称及び結合様式の表示等は、この分野の研究におけ
る一般名あるいは慣用名にしたがった。また用いた糖脂
質の構造は末尾の第３表に示した。

【００２１】この発明の単クローン性抗体は、ＧＤ_1aの
みと特異的に結合し、その特異性は極めて高い。すなわ
ち、後の実施例で明らかになうように、この発明の単ク
ローン性抗体はＧＤ_1aに対する抗体価が２¹⁶以上と極め
て高く、一方、ＧＤ_1aの糖鎖と類似の糖鎖またはそれを
有する他の糖脂質、すなわち、ＧａｌＣｅｒ，ＬａｃＣ
ｅｒ，Ｇｂ₃ ，Ｇｂ₄ ，ＧＡ₂ ，ＧＡ₁ ，ＧＭ₃ ，ＧＭ
₂ ，ＧＭ₁ ，ＧＤ_1b，ＧＴ_1b，ＧＱ_1b，Ｆｕｃ−ＧＭ
₁ ，ｎＬｃ₄ ，及びシアロシルｎＬｃ₄ （ただし、Ｇａ
ｌはガラクトース、Ｃｅｒはセラミド、Ｌａｃはラクト
ース、Ｆｕｃはフコース、ｎＬｃ₄ はパラグロボシドを
示す）に対しては実質的に特異的な反応を示さず、その
抗体価は２² 以下である。

【００２２】この発明の単クローン性抗ＧＤ_1a抗体ＭＺ
は、以下単にＭＺと略称するが、ＧＤ_1aで免疫した哺乳
動物の抗体産生細胞と骨髄腫細胞との融合によりハイブ
リドーマを作る方法（以下、ハイブリドーマ法と呼ぶ）
または、ヒトのＢリンパ球にＥＢウイルス（以下、ＥＢ
Ｖという）を感染させて形質転換を起こさせる方法（以
下、ＢＥＶ形質転換法と呼ぶ）のいずれによっても作製
することができる。

【００２３】すなわち、上記の方法で増殖性を与えられ
た抗体産生細胞から抗ＧＤ_1a抗体を産生するクローンの
みを選別し、単クローンとした後、これにより上記特性
を有する単クローン性抗体を分離することにより製造す
ることができる。

【００２４】ハイブリドーマ法について次に詳細に説明
する。この発明において、ハイブリドーマの作製は、公
知の方法、例えばNature２５６巻、４９５頁、１９７５
年に記載の方法またはその変法(Journal of Experiment
al Medicine １５０巻、１００８頁、１９７９年）等に
準じて行うことができる。

【００２５】免疫原として用いるＧＤ_1aを調製する動物
種及び臓器は特定されないが、一般にはＧＤ_1aはそれを
多量に含有する、例えばウシのような動物の脳から調製
される。

【００２６】この明細書で後に記載される実施例及び試
験例で使用されたＧＤ_1aも、特に断らない限り、ウシ脳
から公知の方法で分離、精製されたものである。

【００２７】また、免疫原としては、精製ＧＤ_1aに加え
て、それを表面に有する種々の細胞、さらにはＧＤ_1aの
抗原決定基である糖鎖部分を含有する物質または細胞の
いずれを用いてもよい。

【００２８】ＧＤ_1aを免疫する哺乳動物の種類は特に限
定されないが、細胞融合に使用する骨髄腫細胞との適合
性を考慮して選択するのが望ましく、一般にはヒト、マ
ウス、ラットまたは場合によってはウサギ等が使用され
る。

【００２９】ＧＤ_1aの免疫にはin vivo 及びin vitroの
方法のいずれもが使用できる。in vivo の免疫の場合は
ＧＤ_1aを生理食塩液、リン酸緩衝液（以下、ＰＢＳとい
う）等に適当濃度に希釈後、これを動物に静脈内、皮下
または腹腔内注射等により投与すればよい。

【００３０】より具体的に述べると、例えば精製したＧ
Ｄ_1aを用いる場合には、これをＰＢＳ等で適当濃度に希
釈し、サルモネラ菌ミネソタ株、ウシ血清アルブミン
（以下、ＢＳＡと略）等の通常用いられる担体と共に、
これを動物に４〜１４日毎に数回から十数回投与し、動
物１個体の総投与量が１０〜３００μｇ程度になるよう
にするのが好ましい。また、in vivo の免疫に膜成分ま
たは細胞自体を用いる場合も同様にして行われ、例えば
膜成分を用いる場合は総投与量が１〜１００ｍｇ／個
体、細胞自体を用いる場合は総投与量が１０⁶ 〜１０⁹
個／個体となるようにするのが好ましい。

【００３１】この場合、必要に応じては適当な免疫アジ
ュバント、例えばフロイントの完全アジュバントを用い
ることができる。

【００３２】このin vivo の免疫の場合、抗体産生細胞
は脾細胞、リンパ節細胞、腹腔内リンパ球、または末梢
血リンパ球のいずれであってもよいが最終免疫４日後の
脾細胞を用いるのが最も好ましい。

【００３３】また、in vitroの系における免疫の場合に
は、いわゆるin vitro感作の方法を用いることができ
る。

【００３４】これは脾細胞、リンパ節細胞、腹腔内リン
パ球及び末梢血リンパ球のうちから適宜選ばれたリンパ
球を免疫原であるＧＤ_1aと共に約１週間in vitroで培養
することにより、ＧＤ_1aに対する抗体産生細胞を出現さ
せることを意図したものである。

【００３５】この場合、ＧＤ_1aが精製品であれば細胞培
養培地に溶解させるか、あるいはヒツジ赤血球、リポソ
ームまたはサルモネラ菌ミネソタ株等の適当な担体に吸
着させ、リンパ球と共に培養する。

【００３６】また、ＧＤ_1aを含有する細胞自体、または
その膜成分を免疫原とする場合には、培地に溶解または
懸濁させ、リンパ球と共に培養する。

【００３７】また、細胞自体を用いる場合は、マイトマ
イシン処理または放射線照射等の処理を行った後に、リ
ンパ球と培養することが望ましい。

【００３８】リンパ球の培養用培地はＰＲＭＩ １６４
０、ダルベッコーのＭＥＭ（以下、Ｄ−ＭＥＭという）
等のリンパ球培養に通常使用されるものであれば、いず
れを用いてもかまわないが、それらは使用時にウシ胎児
血清（以下、ＦＣＳという）を５〜２０％の濃度に添加
することが望ましい。

【００３９】また、培地には必要に応じて２−メルカプ
トエタノール（以下、２−ＭＥという）及びポークウィ
ードマイトジェン（以下、ＰＷＭという）をそれぞれ５
×１０^-5Ｍ及び５〜３０μｇ／ｍｌの最終濃度に加えて
おくと、効率よくＧＤ_1aのinvitro感作を成立させるこ
とができる。

【００４０】リンパ球の培養時の細胞濃度は、培養に用
いる器具によっても異なるが、一般には１０⁶ 〜１０⁷
個／ｍｌが好ましい。

【００４１】免疫原である精製ＧＤ_1a，ＧＤ_1a含有細胞
及びその膜成分は、それぞれ１〜２０μｇ／ｍｌ、１〜
１００ｍｇ／ｍｌ、及び０．１〜１０ｍｇ／ｍｌの最終
濃度で使用することが好ましい。

【００４２】続いて、上記のようにin vivo またはin v
itroの系での免疫により得られた抗体産生細胞と骨髄腫
細胞を融合する。

【００４３】骨髄腫細胞としては、既に公知の種々の細
胞、例えばマウスにおけるＮＳ−１、Ｐ３、Ｐ３−Ｕ
１、Ｘ４５、Ｘ６３．６．５．３．，ＳＰ２，ラットに
おけるＹ３，Ａｇ１．２．３等を使用することができ
る。

【００４４】細胞融合は公知の方法に準じて行うことが
でき、例えば融合促進剤含有倍地中で保温することによ
り行われる。

【００４５】融合促進剤としては、例えばポリエチレン
グリコール（以下、ＰＥＧという）、センダイウイルス
等が使用され、さらに融合効率を高めるためにジメチル
スルホキシド等の補助剤を添加することができる。

【００４６】リンパ球と骨髄腫細胞との使用比は一般の
方法と変りがなく、例えば骨髄腫細胞に対しリンパ球を
約１〜１０倍程度用いればよい。

【００４７】上記融合時の培地としては、細胞培養に利
用される通常の各種培地が利用でき、通常はＦＣＳ等の
血清を抜いておくことが好ましい。

【００４８】融合は、上記免疫細胞と骨髄腫細胞の所定
量を上記培地内でよく混ぜ、遠心後上清を除去し、予め
３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液（ＰＥＧは例えば平均
分子量１０００〜６０００程度のものを使用）を、通
常、培地に約３０から６０ｗ／ｖ％の最終濃度で加えて
混合することにより行われる。

【００４９】以後、適当な培地を逐次添加して遠心し、
上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドー
マが形成される。

【００５０】所望のハイブリドーマの分離は、上記細胞
融合の細胞を、通常のハイブリドーマ選択用培地で培養
することにより行われる。

【００５１】前記した骨髄腫細胞株はヒポキサンチング
アニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲ
Ｔ）欠損株であり、したがって、ＨＡＴ培地の（ヒポキ
サンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培地）中
では生育できない。

【００５２】それ故、ＨＡＴ培地中で増殖してくる細胞
を選択すればよい。該ＨＡＴ培地での細胞の培養は、目
的とするハイブリドーマ以外の細胞が死滅するのに十分
な時間、通常数日から数週間行えばよい。

【００５３】このようにして得られるハイブリドーマは
通常のクローニング方法、例えば限界希釈法または軟寒
天法を用いて、目的とする抗体産生株の検索及び単クロ
ーン化が行われる。

【００５４】該抗体産生株の検索は、例えばＥＬＩＳＡ
法(Jpanese Journal of Experimental Medicine ５１
巻、３０９頁、１９８１年）及びプラーク法、凝集反応
法、オクターロニー法、ＲＩＡ法等の一般に抗体の検出
に用いられている種々の方法によって行われる。

【００５５】このようにしてハイブリドーマ法により単
クローン性抗ＧＤ_1a抗体産生細胞株が得られる。

【００５６】次に、ＥＢＶ形質転換法による単クローン
性抗ＧＤ_1a抗体の作製について述べる。

【００５７】本法はヒトＢリンパ級ＥＢＶを感染させる
と、その各々のＢリンパ球において増殖のみならず、抗
体産生が引き起こされるという原理に基づくものであ
る。

【００５８】その場合、ＥＢＶは特定のＢリンパ球のク
ローンのみに働いて上記の効果をもたらすのではなく、
基本的には全てのクローンに働き、それらに増殖及び抗
体産生を引き起こすのである。

【００５９】それ故、本法ではヒトＢリンパ球にＥＢＶ
を感染させた後、所望の抗体を産生するクローンのみを
選別し、これを用いて所望の単クローン性抗体を得るこ
とができる。

【００６０】この方法によるヒトリンパ球の形質転換
は、公知の方法、例えば Nature ２６７巻、５２頁、１
９７９年に記載の方法等に準じて行うことができる。

【００６１】Ｂリンパ球を得る臓器は、それがリンパ系
臓器であれば特に限定されないが、ヒト由来の材料とい
う特殊性を考慮すると、一般には健常人の末梢血リンパ
球が用いられる。

【００６２】ウイルス源としてはＥＢＶ持続産生細胞、
例えばＥＢＶ感染マーモセット白血球細胞株であるＢ−
９５−８細胞(Proceedings of the National Academyof
Science of USA ７０巻、１９０頁、１９７３年）の培
養上清等を用いることができる。

【００６３】この方法では、まずＢリンパ球をＥＢＶに
感染させるのであるが、この場合、リンパ球画分からＢ
リンパ級のみを特に分離する必要はなく、常法にしたが
って得られるリンパ球にＥＢＶを感染させればよい。

【００６４】まず、リンパ球のペレットにウイルス液を
リンパ球１×１０⁷ 個に対して１０ｍｌ程度加えて混合
し、３７℃、５％ＣＯ₂ の条件下で１時間保温し、リン
パ球をＥＢＶに感染させる。

【００６５】このようにして得られた感染リンパ球を細
胞培養用培地に分散し、２〜５週間、３７℃、５％ＣＯ
₂ の条件下で培養する。

【００６６】培養用培地は特に限定されず、ＲＰＭ１
１６４０、Ｄ−ＭＥＭ等の通常のリンパ球培養用のもの
であればいずれを用いてもかまわないが、それらに使用
時にＦＣＳを１０〜２０％の濃度に添加することが好ま
しい。

【００６７】また、その培地には０．５〜１ｍｇ／ｍｌ
の最終濃度にグルタミンを加えるとさらに効率よく細胞
を増殖させることができる。

【００６８】このようにして得られる形質転換Ｂリンパ
球は、前記ハイブリドーマ法の場合と同様な方法で、目
的とする抗体産生株の検索及び単クローン化が行われ
る。

【００６９】該抗体産生株の検索は、ハイブリドーマ法
の場合と同様、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法等の一般に抗体
の検出に用いられている種々の方法で行うことができ
る。

【００７０】このようにして、ＥＢＶ形質転換によって
もＭＺを産出する細胞株を得ることができる。

【００７１】上記のこの発明のＭＺを産生する細胞株
は、その取得法がハイブリドーマ法またはＥＢＶ形質転
換法のいずれであっても、通常の培地で継代培養が可能
であり、また、液体窒素中で容易に長期保存が可能であ
る。

【００７２】本願発明者は、ＭＺ産生株の一例として、
後述の実施例１で得られたハイブリドーマＨｂＭＺ−１
を「ＭＺ−１」の名称で財団法人発酵研究所（大阪市淀
川区十三本町２−１７−８５）に寄託している（受入番
号ＩＦＯ ５０１３４）。

【００７３】上記のようにして得た特定の細胞株からこ
の発明のＭＺを得るには、それらの細胞株を常法にした
がって大量培養し、その培養上清から分離する方法、あ
るいはそれらの細胞株をそれと適合性のある哺乳動物に
投与し増殖させ、その血清または腹水から分離する方法
を採用することができる。

【００７４】この発明のＭＺは、ＧＤ_1aのみを特異的に
極めて高感度に認識するので、ＧＤ_1aの高感度検出また
は定量試薬としての用途を有する。

【００７５】上記したように、癌患者またはＳＬＥとい
う患者の血中のガングリオシド組成が健常人のそれとは
顕著に異なることが報告されている(Journal of Bioche
mistry ９８巻、８４３頁、１９８５年）。したがっ
て、この発明のＭＺはまた、ガン及びＳＬＥ診断試薬と
しての用途を有する。

【００７６】ＭＺからなるこの発明の定量試薬を用いた
ＧＤ_1aの免疫学的同定及び定量は、一般の生体内物質の
免疫学的定量の場合と同様な方法で行うことができる。

【００７７】その方法は特に限定されないが、例えば、
ラジオイミュノアッセイ（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、薄層
クロマトグラフィー（以下、ＴＬＣという）−免疫染
色、または免疫組織化学等が使用できる。

【００７８】また、ＲＩＡ及びＥＬＩＳＡでは、いわゆ
る競争法またはサンドウィッチ法等が使用できるが、そ
れらに限定されるものではない。

【００７９】さらに、この発明の試薬を用いたＧＤ_1aの
免疫学的同定及び定量は、癌患者、ＳＬＥ患者、及び脳
神経系に器質的障害を有する患者血中のＧＤ_1aのみに適
用されるものではなく、広く、ヒト及び各種実験材料の
血中、体液中、臓器中または排泄物中ＧＤ_1aにも適用可
能であることは言うまでもない。

【００８０】また、後述の試験例３で示されるように、
この発明のＭＺは、他の糖脂質に対する単クローン性抗
体と同様に、それにより認識されるエピトープはＧＤ_1a
の糖鎖構造である。

【００８１】したがって、この発明の試薬は、ＧＤ_1aの
みならず、ＧＤ_1aの糖鎖構造を有する分子の検出及び定
量にも有用である。

【００８２】後述の試験例４で明らかなように、癌患者
及びＳＬＥ患者の体液中のＧＤ_1a濃度は上昇するが、そ
の変化は正常状態に比して、精々数倍から１０数倍程度
である。

【００８３】この程度の変化は、従来の多クローン性抗
体を用いては感度よく検出することができなかった。

【００８４】また、従来の化学的分析による場合には、
ガングリオシドが大量に必要であるので、例えば、上記
Journal of Biochemistry ９８巻、８４３頁、１９８５
年では患者の血液を体外回路により固定化プロテインＡ
カラムに通じさせ、そのカラムに免疫グロブリンＧをガ
ングリオシドとの免疫複合体の形で吸着させた後、その
複合体を回収し、ガングリオシドを得ている。

【００８５】しかしながら、体外回路を形成してこれに
血液を循環させるようなことは癌患者のように体力の低
下した者に対して頻繁に行うことは実際上不可能であ
る。

【００８６】この発明の試薬は、感度が極めて高いの
で、患者から微量の血液を採取してＧＤ_1aの定量を行う
ことができる。したがって、この発明により癌及びＳＬ
Ｅの実用的な診断が初めて可能になった。

【００８７】

【実施例】

実施例１ 精製したＧＤ_1a１００μｇとホルマリン処理サルモネラ
菌ミネソタ株（ＡＴＣＣ ９７００）４００μｇを４０
℃に保温した生理食塩液４ｍｌに加え、よく攪拌し、均
一な懸濁液とした。得られた懸濁液を、マウス及びラッ
トに４日毎に１回当りＧＤ_1a１０μｇ含有分づつ、合計
４〜１５回静脈内投与した。

【００８８】最終投与の４日後に脾臓を摘出し、脾細胞
３×１０⁸ 個とＮＳ−１マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ
ＴＩＢ１８）３×１０⁷ 個を５０％ポリエチレングリコ
ール存在下で細胞融合を行わせた。

【００８９】このハイブリドーマを９６ウェル平底の培
養用プラスチックプレート（ファルコン（登録商標））
に分注し、ＨＡＴ培地を含む１０％ＦＣＳ添加Ｄ−ＭＥ
Ｍ倍地中で３７℃、５％ＣＯ₂ の条件下で培養した。

【００９０】ハイブリドーマの増殖が認められたウェル
について、以下に記載するＥＬＩＳＡ法を用いて、培養
上清中の抗ＧＤ_1a抗体の存在の有無を検索した。

【００９１】ＥＬＩＳＡ法は９６ウェルプラスチックプ
レート（ファルコン（登録商標）を用い、まずエチルア
ルコールに１０μｇ／ｍｌの濃度に溶解したＧＤ_1a液
０．０５ｍｌずつを各ウェルに分注し、溶媒を自然蒸発
させ、ＧＤ_1aをプレートに吸着させた。

【００９２】その各ウェルに一次抗体としての被検培養
上清を反応させ、よく洗浄の後、二次抗体としてのパー
オキシダーゼで標識された抗マウス免疫グロブリン抗体
（免疫動物にマウスを用いた場合）、または抗ラット免
疫グロブリン抗体（免疫動物にラットを用いた場合）を
反応させた。

【００９３】引き続き２，２’−アジノビス（３−エチ
ルベンズ−チアゾリンスルフォン酸）の２アンモニウム
塩（以下、ＡＢＴＳ）を基質としたパーオキシダーゼ反
応を行わせ、各ウェルの発色度を肉眼で、あるいは９６
ウェルＥＬＩＳＡ用自動光度計（波長４１４ｎｍ）を用
いて読み取った。

【００９４】培養上清中に抗ＧＤ_1a抗体価が認められた
ウェルのハイブリドーマは、さらに限界希釈法でクロー
ニングを行い、単クローンとした。

【００９５】このようにして得られた単クローン性のハ
イブリドーマはプラスチック培養フラスコで大量培養を
行い、所望の単クローン性抗ＧＤ_1a抗体産生細胞株を得
た。これらの細胞株を免疫抑制剤のプリスタン（２，
６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン、アルドリ
ッチ社製）で前処理したヌードマウスに移植し、得られ
た腹水から５０％飽和硫酸アンモニウム法により抗体を
精製した。

【００９６】このようにして、単クローン性抗ＧＤ_1a抗
体を得ることができこのものをＭＺと命名した。

【００９７】後述の試験例で抗体として用いたＭＺは、
マウス由来の単クローン性抗ＧＤ_1a抗体であるＭＺ−１
及びラット由来のものでＭＺ−２を用いた。

【００９８】また、このようなＭＺを産生するハイブリ
ドーマをＨｂＭＺと命名し、この実施例のマウス細胞を
用いたハイブリドーマをＨｂＭＺ−１，ラット細胞を用
いたものをＨｂＭＺ−２と付番した。

【００９９】実施例２ ヒト抹梢血から、フィコールパック（ファルマシア社登
録商標）を用いて常法通りリンパ球（単核細胞）を調製
した後、培地に１×１０⁷ ／ｍｌの濃度に懸濁した。

【０１００】培地は１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ １６４
０培地を用い、使用時に、さらに２−ＭＥ及びＰＷＭを
それぞれ５×１０^-5Ｍ、及び３０μｇ／ｍｌの最終濃度
に含有させて使用した。

【０１０１】続いて、マールブルック型培養瓶（Lancet
２巻、１２７９頁、１９６７年）の内筒に１×１０⁷ ／
ｍｌの濃度のリンパ球懸濁液を１ｍｌ、外筒にＰＷＭを
含まない培地１０ｍｌをそれ加え、内筒液と外筒液の境
界に透析チューブを張った。

【０１０２】ＧＤ_1aは内田らの方法（Journal of Bioch
emistry ８７巻、１８２９頁、１９８０年）に準じて作
製した卵黄レシチン及びコレステロールから構成される
リポソームに取り込ませ、５μｇ／ｍｌのＧＤ_1aの最終
濃度で培養瓶の内筒に加えた。

【０１０３】かくして、リンパ球をＧＤ_1aと共に３７
℃、５％ＣＯ₂ の条件下で６日間培養した。続いて、実
施例１に記載したもの同様な方法でマウス骨髄腫細胞Ｎ
Ｓ−１との細胞融合及びＭＺ産生ハイブリドーマのクロ
ーニングを行い、ＭＺ産生株１クローンを得、これには
ＨｂＨＺ−１と付番した。

【０１０４】なお、本実施例の場合、ＥＬＩＳＡ法にお
ける二次抗体はパーオキシダーゼ標識抗ヒト免疫グロブ
リン抗体を用いた。

【０１０５】実施例３ まず、ＥＢＶを持続的に産生放出しているＢ−９５−８
細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６１２）を、グルタミンを
０．８６ｍｇ／ｍｌの最終濃度に含有し、さらに２０％
ＦＣＳが添加されたＲＰＭＩ １６４０培地（以下、完
全培地と呼ぶ）中に３×１０⁵ ／ｍｌの濃度に懸濁し、
３７×℃、５％ＣＯ₂ の条件下で培養した。７日後に得
られる培養上清を以下に使用するウイルス液とした。

【０１０６】続いて、常法に基づき、フィコールパック
（登録商標）を用いて得られたリンパ球のペレットにウ
イルス液を、リインパ球１×１０⁷ 個に対して１０ｍｌ
の割合で加え、混合し、３７℃、５％ＣＯ₂ の条件下で
１時間保温した。

【０１０７】このＥＢＶ感染リンパ球を２×１０⁵ 〜６
×１０⁵ ／ｍｌの濃度で完全培地に懸濁し、それを平底
の９６ウェル培養用プラスチックプレート（ファルコン
（登録商標））の各ウェルに０．１ｍｌづつ分注し、３
７℃、５％ＣＯ₂ の条件下で培養を開始した。

【０１０８】その４日後に各ウェル当り０．１ｍｌづつ
新鮮な完全培地を加えた。その後、３〜４日毎に培養上
清の半量を新鮮な完全培地と交換し、培養を継続した。
２〜４週間後、細胞増殖のみられたウェルの培養上清中
の抗ＧＤ_1a抗体価を前記実施例１で述べたＥＬＩＳＡ法
を用いて測定した。

【０１０９】なお、この場合、二次抗体は、パーオキシ
ダーゼ標識抗ヒト免疫グロブリン抗体を用いた。

【０１１０】上清中に抗ＧＤ_1a抗体価の認められたウェ
ルの細胞を２４ウェル培養プレート、６ウェル培養プレ
ート、６ｃｍプラスチックディッシュの培養上清中の抗
ＧＤ_1a抗体価の認められたものについて、常法にしたが
って軟寒天法でクローニングを行い、単クローン性の抗
ＧＤ_1a産生細胞株１クローンを得、これを細胞株ＨＺ−
１と命名した。

【０１１１】この細胞株を大量培養して得られる培養上
清から、５０％飽和硫酸アンモニウム沈澱法により本発
明のＭＺを得、これにＭＺ−３と付番した。

【０１１２】試験例１ 実施例１で得られたＭＺ−１及びＭＺ−２の免疫グロブ
リン抗体のクラスをＥＬＩＳＡ法により決定した。すな
わち各ＭＺにパーオキシダーゼで標識されたマウス免疫
グロブリンの各クラスに対する抗体を反応させ、続いて
ＡＢＴＳを基質としてパーオキシダーゼ反応を行わせ
た。

【０１１３】その結果、ＭＺ−１及びＭＺ−２は、いず
れもＩｇＭのクラスに属するものと判明した。

【０１１４】試験例２ 実施例１及び３で得られた各ＭＺの種々の糖脂質に対す
る反応性をＥＬＩＳＡ法を用いて検討した。用いた糖脂
質はＧＤ_1aの他に、類縁構造を有するＧａｌＣｅｒ（ウ
シ脳由来）、ＬａｃＣｅｒ（ウシ脳由来）、Ｇｂ₃ （ヒ
ト赤血球由来）、Ｇｂ₄ （ヒト赤血球由来）、ＧＡ₂
（ウシ脳由来）、ＧＡ₁ （ウシ脳由来）、ＧＭ₃ （ウシ
脳由来）、ＧＭ₂ （ウシ脳由来）、ＧＭ₁ （ウシ脳由
来）、ＧＤ_1b（ウシ脳由来）、ＧＴ_1b（ウシ脳由来）、
ＧＱ_1b（ウシ脳由来）、Ｆｕｃ−ＧＭ₁ （ラット赤血球
由来）、ｎＬｃ₄ （ヒト赤血球由来）、及びシアロシル
ｎＬｃ₄ （ウシ赤血球由来）である（構造は末尾の第３
表に示す）。

【０１１５】各糖脂質に対する抗体価は、ＥＬＩＳＡで
発色が肉眼で認められる最大の希釈倍数（以下２の累乗
の形で表す）で示した。

【０１１６】その結果は、各ＭＺのいずれもがＧＤ_1aに
対し高い抗体価を示した。すなわち、実施例１により得
られたＭＺではＧＤ_1aに対する抗体価は２¹⁸であり、同
実施例３のもので２¹⁶であった。しかしながら、その他
の糖脂質に対しては、いずれの抗体も反応しなかった
（抗体価は、全て２² 以下）。

【０１１７】試験例３ 上記各実施例で得られた各ＭＺの糖脂質特異性をＴＬＣ
−免疫染色法を用いてさらに検討した。

【０１１８】本法はシリカゲルのＴＬＣで糖脂質を分画
した後、ＥＬＩＳＡ法と同様の原理を用いて、その薄層
プレート上で免疫染色を行うものである。

【０１１９】この方法では、糖脂質検出の感度は非常に
高く、かつ、各糖脂質に微量混入する物質への反応を否
定できる利点がある。それ故、糖脂質に対する抗体の特
異性を検討するには、最も優れた方法の１つとして現在
この分野の研究で汎用されている。

【０１２０】本実施例では、東らによって報告された方
法（Journal of Biochemistry ９５巻、１５１７頁、１
９３４年）に準じてＴＬＣ−酵素免疫染色を行った。

【０１２１】まず、ＧＤ_1aを始めとする各糖脂質（由来
は試験例２の項に記載に同じ）をシリカゲルの薄層プレ
ート（マッヘライ・ナーゲル社製、ポリグラム・シル
Ｇ）にスポットした。

【０１２２】クロロホルム−メチルアルコール−０．２
５％塩化カリウム（５０：４０：１０，ｖ／ｖ）の溶液
を溶媒として約２５分間の展開を行った。展開後の各糖
脂質の位置をオルシノールにより求めた。

【０１２３】オルシノール反応用と並行した免疫染色用
の展開を同時に行い、以下の方法で染色した。まず、展
開後の薄層のプレートに１次抗体として実施例１及び実
施例３で作製した各ＭＺまたは多クローン性抗ＧＤ_1aウ
サギ抗体のいずれかを反応させた。多クローン性抗ＧＤ
_1aウサギ抗体は、公知の方法でＧＤ_1aをウサギに免疫
し、追加免疫の２週間後に採血して得られた抗血清を用
いた。

【０１２４】続いてマウス、ヒトあるいはウサギの免疫
グロブリンに対する抗体（いずれもパーオキシダーゼ標
識）を適宜選択し、二次抗体としてプレートに反応させ
た、さらに、基質として、４−クロロ−１−ナフトール
を用いてパーオキシダーゼ反応による発色を行わせた。

【０１２５】その結果は第１表に示すようにこの発明の
ＭＺは、いずれもＧＤ_1aのスポットにのみ反応した。対
照に用いた多クローン性抗ＧＤ_1a抗体はＧＤ_1aのみなら
ず、ＧＭ₁ 及びＧＤ_1aとも反応した。

【０１２６】

【表１】 １）−は発色無し、＋は発色有りを示す。

【０１２７】以上の結果から、実施例１で得られたＭＺ
もさらに実施例３で得られたＭＺのいずれもＧＤ_1aのみ
の特異的なものであることが示された。さらに、その点
において、それらの単クローン性抗ＧＤ_1a抗体は、これ
までの公知の方法で作製され、使用されてきた多クロー
ン性抗ＧＤ_1aウサギ抗体に対して高い有意性を示すもの
である。

【０１２８】また、この実施例の結果から、この発明の
単クローン性抗ＧＤ_1a抗体はＳＡα２→３Ｇａ１β１→
３ＧａｌＮＡｃβ１→４［ＳＡα２→３］Ｇａｌβ１→
４Ｇｌｃの糖鎖構造を認識するものと結論される。

【０１２９】試験例４ プロテインＡを固定したポリスチレンボールをガラスの
試験管に入れ、さらにその中に癌またはＳＬＥ患者の血
清１ｍｌを入れ、４℃で１晩放置した。ポリエチレンボ
ールを洗浄後、０．３Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ
２．８）により免疫複合体がプロテインＡから解離する
と共に、免疫複合体自身もＧＤ_1aと免疫グロブリンＧに
解離する。

【０１３０】試験管からポリスチレンボールを除去し、
試験管にクロロホルム−メチルアルコールの混液（２：
１，ｖ／ｖ）１２ｍｌを加えよく振盪した。遠心後、下
層のクロロホルム層の画分を取り、蒸発乾固させた、こ
れを適当量の１％ＢＳＡ含有ＰＢＳに溶解し、下記のＧ
Ｄ_1a測定用の検体とした。

【０１３１】ＧＤ_1aの測定は次に述べるＥＬＩＳＡ法を
用いた。まず、９６ウェルのマイクロタイトレーション
プレート（以下、プレートという）の各ウェルに検体液
１００μｌを入れ、続いて、この発明のＭＺを結合した
ポリスチレンボールを加え、プレートを３７℃で３時間
保温した。

【０１３２】プレートを洗浄後、さらに１％ＢＳＡ及び
０．０５％ツイーン２０（ポリオキシエチレンソルビタ
ンモノラウレイト）含有ＰＢＳに溶解したビオチン化Ｍ
Ｚ（ビオチン化は常法により行った）１００μｌを加え
室温で１時間反応させた。

【０１３３】さらに洗浄後、１％ＢＳＡ及び０．０５％
ツイーン２０含有ＰＢＳに溶解したパーオキシダーゼ標
識アビジンを加え室温で１時間反応させた。

【０１３４】洗浄後、ＡＢＴＳを基質としてパーオキシ
ダーゼ反応を行わせ、各ウェルの発色度を９６ウェルＥ
ＬＩＳＡ用自動光度計（波長４１４ｎｍ）を用いて測定
した。前記実施例２に記載の方法でＧＤ_1aをリポソーム
に封入し、それを用いた標準曲線に基づいてＧＤ_1a濃度
を求めた。

【０１３５】その結果は図面に示す通り、癌患者及びＳ
ＬＥ患者においては健常人と比較して高い値を示した。
また、その場合、ＧＤ_1aの高値は癌の種類に関係なく認
められた。なお、図において、縦軸のＧＤ_1a濃度はある
濃度単位（Ｕ／ｍｌ）に補正して表されているので試料
相互間での相対的な関係を示しているものである。

【０１３６】このように、この発明の単クローン性抗Ｇ
Ｄ_1a抗体及びそれを使用した血中ＧＤ_1a測定系は、癌及
びＳＬＥの診断に極めて有用なものである。

【０１３７】試験例５ 本試験例では、脳の脱髄等の器質的障害を伴うヒトの疾
患である多発性硬化症の動物モデルである実験的アレル
ギー性脳脊髄炎の発症過程における血中ＧＤ_1aの濃度
を、本明細書の実施例１で得られた単クローン性抗ＧＤ
_1a抗体を用いて測定した。

【０１３８】まず、１群５匹の体重１８０ｇ前後の雌性
ルイス（Ｌｅｗｉｓ）系ラットの両後足蹠部に、モルモ
ット脊髄とフロイントの完全アジュバント（以下、ＦＣ
Ａと呼ぶ）のエマルジョンを投与した。その１〜４週間
後に採血し、血中のＧＤ_1a濃度を定量した。ＧＤ_1aの定
量は実施例１で得られた単クローン性抗ＧＤ_1a抗体ＭＺ
−２を用いたＥＬＩＳＡ法（詳細は前記実施例４に記
載）により行った。

【０１３９】結果は第２表に示すが、表中ＧＤ_1aの濃度
はある濃度単位（Ｕ／ｍｌ）に補正された値の、５匹の
平均値であるので試験区間での相対値を示すものであ
る。

【０１４０】本試験例の動物モデルにおいては、モルモ
ット脊髄とＦＣＡによる惹起投与の約３週間後頃から、
ラット脳内に脱髄現象が起こることが知られている。

【０１４１】第２表に見られるように、血中ＧＤ_1a濃度
は、モルモット脊髄とＦＣＡの投与群において、投与の
３週間から血中にその上昇が見られた。

【０１４２】このように、本発明の単クローン性抗体は
脱髄等の脳神経系の器質的障害を伴う諸疾患の診断に応
用可能であることが示された。

【０１４３】

【表２】 １）結核菌体を含まないフロイントの不完全アジュバント。

【０１４４】また、本試験例４及び５ではポリスチレン
ボールに結合された「不溶化」抗体、及びビオチンで標
識された抗体としては、いずれもこの発明の単クローン
性抗体を用いたが、この場合は、１〜１０ｎｇ／ｍｌと
いう極めて低いＧＤ_1a濃度範囲で直線の標準線が得られ
た。

【０１４５】一方、用いた不溶化抗体及び標識抗体が、
いずれも従来より使用されてきた多クロンー性抗ＧＤ_1a
ウサギ抗体の場合は、１０〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度範
囲で直線の標準線が得られた。

【０１４６】また、不溶化抗体としてこの発明の単クロ
ーン性抗体ＧＤ_1a、標識抗体として多クローン性抗ＧＤ
_1aウサギ抗体を用いた場合は５〜５０ｎｇ／ｍｌの濃度
範囲で直線の標準線が得られた。

【０１４７】このように、本試験例４及び５に用いた、
いわゆるサンドウィッチ法によるＧＤ_1aの測定では、単
クローン性抗体を用いることにより測定感度が上昇し
た。

【０１４８】また、いわゆる競争法によるＧＤ_1aの定量
においても、多クローン性抗ＧＤ_1a抗体を用いた場合は
１０〜１００ｎｇ／ｍｌのＧＤ_1a濃度で直線の標準線が
得られたが、この発明のＭＺを用いると３〜３０ｎｇ／
ｍｌの範囲で直線の標準線が得られた。

【０１４９】上記のように、ＧＤ_1aの測定にこの発明の
単クローン性抗体を使用したところ、多クローン性抗体
使用の場合に比較して、高い測定感度の測定系が得られ
た。

【０１５０】それにより、従来、多クローン性抗体を用
いた測定系では、測定が不可能であった疾患状態におけ
る体液中ＧＤ_1a濃度の変動を検出することが可能となっ
た。このことも、従来多クローン性抗ＧＤ_1a抗体に対す
るこの発明の単クローン性抗ＧＤ_1a抗体であるＭＺの優
れている点である。

【０１５１】

【表３】

【図面の簡単な説明】

【図１】この発明の単クローン性抗ＧＤ_1a抗体ＭＺ−１
を用いたＥＬＩＳＡ法により求めた各種癌患者及びＳＬ
Ｅ患者血中のＧＤ_1a濃度の個々の値を示すものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/577 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＧＤ_1aで免疫した哺乳動物由来の抗体
   産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させて形成されるハイブ
   リドーマであって、ＧＤ_1aを認識し、ＧａｌＣｅｒ，Ｌ
   ａｃＣｅｒ，Ｇｂ₃ ，Ｇｂ₄ ，ＧＡ₁ ，ＧＡ₂ ，ＧＭ
   ₁ ，ＧＭ₂ ，ＧＭ₃ ，ＧＤ_1b，ＧＴ_1b，ＧＱ_1b，Ｆｕｃ
   −ＧＭ₁ ，ｎＬＣ₄ 及びシアロシルｎＬＣ₄ を実質的に
   認識しない抗ガングリオシドＧＤ_1a単クローン性抗体Ｍ
   Ｚを産生することを特徴とするハイブリドーマＨｂＭ
   Ｚ。
2. 【請求項２】 抗体産生細胞がマウス脾臓細胞であるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のハイブリド
   ーマＨｂＭＺ−１。
3. 【請求項３】 抗体産生細胞がラット脾臓細胞であるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のハイブリド
   ーマＨｂＭＺ−２。
4. 【請求項４】 抗体産生細胞がヒトリンパ球であること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項のハイブリドーマＨ
   ｂＨＺ−１。